FR2827613A1 - Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe - Google Patents

Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe Download PDF

Info

Publication number
FR2827613A1
FR2827613A1 FR0109631A FR0109631A FR2827613A1 FR 2827613 A1 FR2827613 A1 FR 2827613A1 FR 0109631 A FR0109631 A FR 0109631A FR 0109631 A FR0109631 A FR 0109631A FR 2827613 A1 FR2827613 A1 FR 2827613A1
Authority
FR
France
Prior art keywords
nucleic acid
sep
isum2a
polypeptide
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
FR0109631A
Other languages
English (en)
Other versions
FR2827613B1 (fr
Inventor
Peter Rogowsky
Thierry Heckel
Pascual Perez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority to FR0109631A priority Critical patent/FR2827613B1/fr
Priority to PCT/FR2002/002553 priority patent/WO2003008585A2/fr
Priority to EP02760388A priority patent/EP1412500A2/fr
Priority to CA002454119A priority patent/CA2454119A1/fr
Publication of FR2827613A1 publication Critical patent/FR2827613A1/fr
Priority to US10/759,548 priority patent/US20050086716A1/en
Application granted granted Critical
Publication of FR2827613B1 publication Critical patent/FR2827613B1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Il est fourni selon l'invention des séquences d'acides nucléiques et des polypeptides dont l'expression est essentielle pour le développement de l'embryon dans une graine de plante, et dont un déficit dans l'expression conduit à la production de graines affectées dans le développement du germe.

Description

<Desc/Clms Page number 1>
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de l'amélioration des caractéristiques agronomiques des plantes, en vue de l'obtention de produits de transformation des plantes à caractéristiques améliorées pour l'industrie, tout particulièrement pour les industries agro-alimentaires, par exemple pour la production d'amidon, d'huile végétale ou de semoule.
ETAT DE LA TECHNIQUE
De manière générale, il existe un besoin dans l'état de la technique d'améliorer les qualités agronomiques, alimentaires ou industrielles des graines, en particulier pour les industries de production d'amidon, d'huile végétale ou de semoule.
L'embryon de la graine est le compartiment de la graine à partir duquel est extraite l'huile végétale. Il serait avantageux pour l'industrie d'obtenir des plantes dont les graines possèdent un embryon surdéveloppé riche en huile.
Inversement, des embryons sous-développés seraient particulièrement avantageux pour la production de semoule.
Il serait également avantageux pour l'industrie de l'amidon d'obtenir des plantes dont les graines sont dépourvues de germes, ces graines étant constituées essentiellement de l'albumen riche en amidon.
De manière générale, il existe un besoin dans l'état de la technique pour l'isolement et la caractérisation de séquences régulatrices permettant l'expression spécifique d'un acide nucléique d'intérêt dans l'embryon et/ou l'albumen, et ceci de manière précoce dans le cours du développement de la plante, afin de moduler les qualités agronomiques de la graine mature.
La production d'amidon pour de multiples applications industrielles atteint aujourd'hui environ 1 milliard de tonnes annuelles dans le monde.
L'amidon représente une matière première qui est utilisée dans des industries aussi diverses que l'alimentation, la pharmacie, les industries du papier mais aussi dans le domaine microbiologique où il peut être mis en oeuvre en tant que substrat nutritif.
<Desc/Clms Page number 2>
Classiquement, l'amidon est obtenu à partir des graines de plantes céréalières de grande culture telles que le blé, le maïs et le sorgho.
Les graines sont essentiellement constituées d'un germe associé à l'albumen. L'amidon est entièrement contenu dans l'albumen, alors que le germe est riche en huile. Il en résulte que les procédés de préparation d'amidon utilisés dans l'industrie de l'amidonnerie comprennent obligatoirement une étape de séparation du germe, riche en huile, de l'albumen qui contient en abondance l'amidon constituant la matière première d'intérêt.
Il serait donc particulièrement avantageux techniquement d'éliminer l'étape de séparation du germe de l'albumen dans les procédés de purification de l'amidon, ce qui permettrait de simplifier significativement ces procédés, et les rendre également plus rapides et moins coûteux.
Il existe aussi un besoin dans l'état de la technique d'améliorer les qualités agronomiques des grains utilisés dans les procédés de transformation de la partie vitreuse du grain de maïs (amande) en semoule.
Le process de la mouture permet de séparer finement les différents constituants du grain en vue de satisfaire les exigences des utilisateurs. Il comprend notamment une étape de séchage qui doit être le plus doux possible pour éviter une migration des lipides du germe vers l'amande, ce qui est préjudiciable à la qualité ultérieure des semoules, et une étape de dégermage, réalisée par fragmentation, qui a pour but de séparer délicatement les germes pour éviter que les lipides qu'ils contiennent ne se retrouvent dans les semoules.
L'utilisation en industrie semoulière des grains à développement de germe affecté selon l'invention, présente donc un avantage certain puisqu'elle facilite le process industriel (gain en temps et en rendement) en éliminant cette'contamination'de l'amande par les lipides du germe ; de plus elle assure une bonne qualité et une bonne durée de vie des produits, celle-ci étant fonction du résiduel de matière grasse ( < 0. 8% est une norme dans la profession pour les produits dits nobles : hominies, gritz, semoules et farines pour l'alimentation humaine).
Les semoules fabriquées sont ensuite utilisées presque exclusivement en alimentation humaine (bières, céréales petit déjeuner, biscuits apéritifs, polenta, tortilla, corn chips, farines alimentaires...).
<Desc/Clms Page number 3>
A titre d'exemples, les grains selon l'invention peuvent être utilisés pour la fabrication de céréales pour petit-déjeuner ou'corn flakes', qui constituent un marché qui connaît depuis 15 ans une augmentation moyenne annuelle de l'ordre de 20%. Deux procédés sont classiquement utilisés : un procédé classique de laminage à partir des hominys (semoules les plus grosses parfaitement dégermées et calibrées) ou un procédé par cuisson-extrusion à partir des semoules de granulométrie spécifique.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on peut obtenir des graines à gros embryons, recherchées dans l'industrie des huiles. L'huile de maïs est généralement destinée à l'alimentation humaine ; elle est parfois utilisée par l'industrie pharmaceutique et cosmétique. Les tourteaux sont eux valorisés en alimentation animale soit directement, ou encore remélangés avec des'corn-gluten feed'.
De nombreuses plantes portant des mutations affectant à la fois l'embryon et l'albumen de la graine sont connues dans l'état de la technique. Ces plantes mutantes sont classiquement désignées comme des mutants dek (pour défective kernel ).
En revanche, il existe très peu de mutants de maïs affectés d'un défaut dans le développement de l'embryon de la graine et laissant intact l'albumen.
Il s'agit essentiellement des plantes mutantes observées par Sheridan et al. (1993,1995) et de celles décrites par Elster et al. (2000). Toutefois, ces auteurs ne présentent aucun résultat de co-ségrégation de marqueurs génétiques avec le phénotype mutant.
Heckel et al. (1999) ont analysé cinq mutants de maïs affectés à différents stades du développement de l'embryon.
Un premier groupe de mutants comprend des mutants produisant des structures pro-embryonnaires ressemblant à celles produites chez les plantes sauvages, mais les pro-embryons n'atteignent pas les stades de développement ultérieurs.
Dans le second groupe de mutants, les mutants emb*-8522 et emb*-8535 sont affectés d'un déficit complet dans la différenciation apicalebasale, alors que chez le mutant emb*-8516 les auteurs ont observé des structures ressemblant à l'embryon qui provenaient du suspenseur.
<Desc/Clms Page number 4>
Figure img00040001
Une analyse de co-ségrégation des mutations emb*-8516 et emb*- 8522 a permis à Heckel et al. de déterminer que le phénotype mutant coségrégeait avec la présence d'un transposon. Toutefois, la caractérisation moléculaire des différentes mutations n'a pas été décrite. En particulier, la mutation affectant la plante mutante emb*-8516 n'a pu être localisée sur aucun des chromosomes du maïs.
SOMMAIRE DE L'INVENTION Il est fourni selon l'invention des séquences d'acides nucléiques et des polypeptides dont l'expression est essentielle pour le développement de l'embryon dans une graine de plante, et dont un déficit dans l'expression conduit à la production de graines affectées dans le développement du germe.
L'invention a pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID ? 5 et SEQ ID N'6, ou pour un fragment d'un polypeptide ISUM2A, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
De préférence, l'acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A, ou pour un fragment de ce polypeptide, comprend également un polynucléotide régulateur capable de réguler la synthèse du polypeptide ISUM2A, le polynucléotide régulateur étant de préférence sensible à l'action d'un signal inducteur.
Le polynucléotide régulateur peut être indifféremment un polynucléotide répresseur de la transcription ou de la traduction ou au contraire un polynucléotide activateur de la transcription ou de la traduction.
L'invention est également relative à des procédés d'obtention d'une plante transformée capable de produire des graines à développement de germe affecté, ainsi que les parties d'une telle plante, notamment ses semences.
L'invention a également pour objet un produit de transformation d'une graine à développement du germe affecté produite par ladite plante transformée, de préférence un amidon.
<Desc/Clms Page number 5>
L'invention a encore pour objet le polypeptide ISUM2A, ou un fragment de ce polypeptide, codé par un acide nucléique tel que défini cidessus, ainsi que des anticorps dirigés contre le polypeptide ISUM2A.
L'invention a également trait à des procédés pour détecter la présence du polypeptide ISUM2A dans un échantillon et à des procédés pour détecter la présence d'un acide nucléique codant pour ce polypeptide dans un échantillon.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Selon l'invention, on a généré une population de 25.000 plantes fortement mutagénisées par l'insertion au hasard, dans leur génome, du transposon mutator décrit par Bennetzen, J. L. P. S. Springer, A. D. Cresse, et M. Hendrickx (1993), Chandler, V. L. et K. J. Hardeman (1992). Les plantes ont été mises en culture avant analyse de leur ADN.
Pour l'une des plantes mutantes, désignée G2422, il a été montré que l'insertion du transposon mutator était localisée dans le premier intron d'un gène particulier, ce gène ayant été désigné isum2A, à une distance de 3 pb du second exon de ce gène.
Sur une autre plante mutante, les inventeurs ont observé une coségrégation entre la présence d'un phénotype graines sans germe et l'insertion du transposon mutator dans le même gène isum2A.
Le gène isum2A, dont il est montré selon l'invention qu'il est nécessaire au développement normal de l'embryon de la graine, a ensuite été isolé et caractérisé en totalité.
Le gène isum2A comprend trois exons et deux introns. Le cadre ouvert de lecture débute dans le premier exon et se termine dans le troisième exon de ce gène.
Un produit partiel de transcription du gène isum2A a aussi été isolé et caractérisé et la structure d'une grande partie de la protéine ISUM2A a été déduite de l'ADNc correspondant au produit de transcription du gène.
Il a été montré selon l'invention que le gène isum2A était exprimé dans l'embryon et l'albumen 12 jours après pollinisation, ainsi que dans la feuille et la racine.
<Desc/Clms Page number 6>
De plus, le demandeur a montré que l'insertion du transposon mutator dans l'intron n 2 du gène a provoqué un blocage de l'expression du gène isum2A, puisque la présence de son produit de transcription n'était plus détectable dans un albumen d'une plante homozygote pour l'interruption du gène isum2A (isum2A : : Mu/isum2A : : Mu).
On a ainsi montré selon l'invention que des plantes homozygotes pour une mutation dans le gène codant pour le polypeptide ISUM2A produisaient des graines essentiellement constituées de l'albumen, et ayant un développement du germe affecté. Le germe est également appelé embryon.
Le demandeur a également montré que les semences qui représentent un quart des graines produites par des plantes hétérozygotes et dont les deux copies du gène isum2A comprennent une mutation ne permettaient pas l'obtention d'une plante viable et fertile.
Il a plus particulièrement été montré selon l'invention que les semences qui représentent un quart des graines produites par des plantes hétérozygotes pour l'allèle ou les allèles mutés conduisant à la mutation récessive du type emb ne permettraient pas l'obtention d'une plante viable et fertile.
Afin de remédier à cet inconvénient, il est aussi fourni selon l'invention des systèmes de complémentation permettant l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A fonctionnel dans des plantes dans lesquelles les deux allèles du gène isum2a sont mutés, ces systèmes de complémentation pouvant être rendus inductibles de manière à contrôler précisément dans le temps l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A.
Il est ainsi possible, grâce à l'invention, d'obtenir des plantes viables produisant des graines à développement affecté du germe, ces graines étant directement utilisables dans l'industrie sans étape de séparation de l'embryon, tout particulièrement dans l'industrie de l'amidonnerie, et dans l'industrie semoulière.
Selon un autre aspect, l'invention fournit aussi les moyens d'obtention de plantes produisant des graines affectées dans le développement du germe, dans lesquelles le germe est enrichi en huile du
<Desc/Clms Page number 7>
fait d'une expression précoce ou d'une surexpression du polypeptide ISUM2A.
L'invention concerne des séquences nucléotidiques impliquées dans le développement de l'embryon et leur utilisation dans des constructions moléculaires destinées à améliorer la qualité agronomique, alimentaire, ou industrielle d'une plante, modulant notamment la taille de l'embryon et/ou son développement.
En effet, une action précoce et spécifique sur le développement des tissus de l'embryon et de l'albumen peut être recherchée : 1) Selon un premier mode de réalisation, il sera possible d'obtenir des graines ou fruits enrichis en huile (gros embryon), via l'utilisation de promoteurs dirigeant l'expression des acides nucléiques selon l'invention de façon précoce dans le développement de la graine et plus particulièrement au niveau du germe, ou de façon constitutive.
2) Selon un autre mode de réalisation, des albumens à développement de germe affecté pourraient également être obtenus selon ce modèle, pour des applications industrielles en amidonnerie et semoulerie.
L'invention vise donc également des procédés pour modifier les qualités agronomiques et/ou nutritionnelles d'une plante, par une action ciblée et précoce sur le développement de l'embryon, utilisant la transformation des plantes avec un vecteur selon l'invention. En particulier, elle s'intéresse à la modification de la taille et/ou du développement de l'embryon. Elle vise également l'altération du développement de l'embryon, en vue de produire des grains sans embryons pour les céréales notamment, présentant un intérêt pour les industries de l'amidonnerie et de la semoulerie.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une cassette d'expression telle que définie précédemment, pour l'obtention d'une plante Angiosperme transgénique présentant des qualités agronomiques ou nutritionnelles améliorées.
De manière avantageuse, la plante transgénique obtenue peut produire des graines à teneurs en huile modifiées ou à développement de germe affecté en comparaison avec une plante non transformée.
L'invention concerne également l'utilisation des plantes transgéniques obtenues selon l'invention, ou parties de ces plantes, notamment
<Desc/Clms Page number 8>
semences, grains et fruits pour la préparation de produits dérivés, notamment de produits alimentaires.
Font également partie de l'invention les produits obtenus, que ce soit des semences, farines de semences ou grains enrichis en huile ou des semences à développement de germe affecté, adaptés à l'industrie semoulière.
L'invention est aussi relative à toute composition pour l'alimentation humaine ou animale préparée à partir desdits produits obtenus.
Selon un autre aspect, l'invention est relative à l'utilisation des séquences et variants alléliques définis selon l'invention dans des programmes de sélection visant à produire des plantes à embryon modifié en taille et/ou développement influant sur le contenu en amidon/huile. Ces séquences peuvent notamment être utilisées dans des expériences de cartographie et de co-localisation de QTLs pour la teneur en huile ou la taille de l'embryon pour définir les variants alléliques les plus intéressants pour une approche sélection, comprenant : - le génotypage d'individus au moyen de sondes ou amorces nucléiques obtenues à partir des séquences et variants alléliques décrits selon l'invention ; - la sélection parmi ces individus des plantes qui comprennent une fréquence élevée d'allèles favorables associés à la taille et/ou au développement de l'embryon.
ACIDES NUCLEIQUES DU GENE isum2A
La séquence nucléotidique du gène isum2A comprend, de l'extrémité 5'vers l'extrémité 3', (i) une séquence en amont non codante portant potentiellement des éléments régulateurs de la transcription et/ou de la traduction du gène, (ii) une séquence codante comprenant les trois exons et les deux introns du gène et (iii) une séquence non codante localisée en aval du dernier exon du gène.
La séquence du gène isum2A selon l'invention est référencée comme la séquence SEQ ID N01 du listage de séquences.
Une analyse d'une population de plantes ayant le phénotype sauvage et produisant des graines contenant un embryon normal a permis d'identifier au moins deux variants du gène isum2A. Un des variants du gène est caractérisé par la substitution du nucléotide G localisé en position
<Desc/Clms Page number 9>
2234 de la séquence SEQ ID N01 par un nucléotide C. Cette substitution de nucléotide entraîne la substitution de l'acide aminé G (glycine) en position 89 de la séquence du polypeptide ISUM2A SEQ ID D ? 5 par un acide aminé R (Asparagine) qui est présent dans la séquence du polypeptide ISUM2A variant SEQ ID ? 6.
Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID ? 5 et SEQ ID N'6, ou pour un fragment d'un polypeptide ISUM2A.
L'invention concerne aussi un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et HIGGINS (1984), BERBAL (1984) et AUSUBEL et al. (1994).
De manière préférée, tout acide nucléique et tout polypeptide selon l'invention se présente sous une forme isolée ou purifiée.
Le terme" isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante est isolé.
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme"purifié"ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide ou un polypeptide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre
<Desc/Clms Page number 10>
de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression" séquence nucléotidique"peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression"séquence nucléotidique"englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Figure img00100001
Les termes"acide nudéique","poiynudéotide", "oiigonudéotide"ou encore"séquence nudéotidique"englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex.
Le terme"nucléotide"désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant"complémentaire"d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 95% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 95%, de préférence au moins 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-dessous.
Le"pourcentage d'identité"entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des"gaps") par rapport à la séquence de référence
<Desc/Clms Page number 11>
(qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides comparés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière préférée, le pourcentage d'identité de séquences est déterminé à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2.06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut.
Un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon l'invention englobe les "variants"d'un acide nucléique selon l'invention.
Par"variant"d'un acide nucléique selon l'invention, on entend un acide nucléique qui diffère de l'acide nucléique de référence par une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'un nucléotide, par rapport à l'acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique selon l'invention peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique qui existe naturellement. Un tel acide nucléique variant peut être également un acide nucléique non naturel obtenu, par exemple, par des techniques de mutagenèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique" variant" sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant ont des séquences nucléotidiques très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications nucléotidiques présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'affectent pas la séquence d'acides aminés qui peut être codée par cet acide nucléique variant.
Les modifications de nucléotides dans l'acide nucléique variant peuvent aussi résulter en des substitutions, additions ou délétions d'un ou
<Desc/Clms Page number 12>
Figure img00120001

plusieurs acides aminés dans la séquence du polypeptide qui peut être codé par cet acide nucléique variant.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention comportant une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la même fonction ou la même activité biologique que le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention et qui comporte une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la capacité d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
Font partie des variants d'un acide nucléique codant le polypeptide ISUM2A les acides nucléiques des gènes orthologues à ISUM2 inclus dans le génome de plantes autres que le maïs, et possédant une identité en nucléotides d'au moins 95% avec un acide nucléique codant le polypeptide ISUM2A.
Par"fragment"d'un acide nucléique selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence, le fragment d'acide nucléique possédant une séquence nucléotidique identique à la séquence nucléotidique de l'acide nucléique de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un acide nucléique selon l'invention possèdent au moins 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de référence, la longueur maximale en nucléotides d'un fragment d'un acide nucléique selon l'invention étant bien entendu limitée par la longueur maximale en nucléotides de l'acide nucléique de référence.
Par fragment d'un polypeptide ISUM2A selon l'invention, on entend un fragment polypeptidique d'une longueur réduite par rapport au polypeptide de référence, le fragment polypeptidique possédant une séquence en acides aminés identique à la séquence en acides aminés du polypeptide de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un polypeptide ISUM2A selon l'invention possèdent au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide ISUM2A de référence.
<Desc/Clms Page number 13>
ACIDES NUCLEIQUES GENOMIQUES isum2A
Comme indiqué ci-dessus, il a été caractérisé selon l'invention deux variants alléliques de l'acide nucléique génomique du gène isum2A, les deux acides nucléiques génomiques variants étant respectivement référencés comme les séquences nucléotidiques SEQ ID N01 et SEQ ID ? 2 du listage de séquences.
En conséquence, la présente invention a pour objet un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, ou pour un fragment de ce polypeptide, ledit acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N01 et SEQ ID N'2, ou avec un fragment de l'une des séquences SEQ ID N01 et SEQ ID ? 2.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de l'invention est un acide nucléique consistant en un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N01 et SEQ ID N'2, ou avec un fragment de l'une des séquences SEQ ID N01 ou SEQ ID N'2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 12, de préférence au moins 15 et de manière tout à fait préférée au moins 20 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N01 ou SEQ ID N'2, étant entendu qu'un tel acide nucléique englobe dans sa définition les fragments d'un acide nucléique selon l'invention tel que défini dans la présente description.
Figure img00130001
Le gène isum2A, défini par la séquence SEQ ID N01 comprend, de l'extrémité 5'vers l'extrémité 3', respectivement : a) une séquence non codante portant potentiellement des éléments régulateurs de la transcription et/ou de la traduction de ce gène, localisée en amont du premier exon, du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 1812 de la séquence SEQ ID N01 ; b) une région dite codante qui comprend les trois exons et les deux introns du gène isum2A, cette région codante étant localisée du
<Desc/Clms Page number 14>
nucléotide en position 1813 jusqu'au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N01 ; et c) une région non codante localisée en aval de la région codante, du nucléotide en position 4075 jusqu'au nucléotide en position 5620 de la séquence SEQ ID N 1.
La séquence SEQ ID N'2, qui illustre un variant du gène isum2A, ne contient pas la totalité du cadre ouvert de lecture codant pour un polypeptide ISUM2A. La séquence SEQ ID N02 comprend une partie localisée du côté 3'de l'exon n01, ainsi que la totalité des exons n 2 et n 3.
Le nucléotide en position 1 de la séquence SEQ D ? 2 correspond au nucléotide en position 2063 de la séquence SEQ ID N'l. Le nucléotide en position 2004 de la séquence SEQ ID N02 correspond au nucléotide en position 4062 de la séquence SEQ ID N'l.
Toutefois, la connaissance de la séquence SEQ ID N02 par l'homme du métier, et sa comparaison avec la séquence SEQ ID N'l, permet d'accéder directement à la totalité de la séquence codante du gène isum2A défini par la séquence SEQ ID N 2, par exemple en complétant les bases manquantes de l'exon n01 de la séquence SEQ D ? 2 par) es bases correspondantes de l'exon n01 de la séquence SEQ D N 1, en se basant sur les correspondances données ci-dessus et également dans le tableau 1 ci-dessous.
De même, l'homme du métier peut obtenir l'acide nucléique du gène isum2A, par exemple en isolant, à partir des informations de la séquence SEQ ID N 1, les régions nucléotidiques équivalentes ou encore en produisant un acide nucléique hybride, obtenu en fusionnant les acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 2, sur la base des correspondances données ci-dessus et également dans le tableau 1 cidessous.
Les caractéristiques structurales des trois introns et des deux exons du gène ISUM2A sont détaillées dans le tableau 1 ci-après.
<Desc/Clms Page number 15>
TABLEAU 1 Séquences des exons du gène Isum2A
Figure img00150001
<tb>
<tb> Exon <SEP> n <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 5'sur <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 3'sur
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N01 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N02 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N01 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N02
<tb> 1 <SEP> 1813 <SEP> < <SEP> 1 <SEP> 2099 <SEP> 37
<tb> 2 <SEP> 2207 <SEP> 146 <SEP> 2323 <SEP> 262
<tb> 3 <SEP> 3646 <SEP> 1588 <SEP> 4074 <SEP> > <SEP> 2004
<tb>
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène Isum2A, tel que les polynucléotides 1 à 3 décrits dans le tableau 1 ci-dessus, qui sont inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ etSEQIDN 2.
Un tel acide nucléique code pour au moins une partie du polypeptide codé par le gène Isum2A et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant.
Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans le gène Isum2A dans un échantillon, le cas échéant de séquences du gène Isum2A portant une ou plusieurs mutations, préférentiellement une ou plusieurs mutations de nature à modifier le phénotype d'une plante portant un tel gène Isum2A muté, en provoquant la production de graines affectées dans le développement du germe.
<Desc/Clms Page number 16>
TABLEAU 2 Séquences des introns du gène Isum2A
Figure img00160001
<tb>
<tb> ! <SEP> ntron <SEP> n <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 5'sur <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 3'sur
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N 1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 2 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 2
<tb> 1 <SEP> 2100 <SEP> 38 <SEP> 2206 <SEP> 145
<tb> 2 <SEP> 2324 <SEP> 263 <SEP> 3645 <SEP> 1587
<tb>
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène Isum2A, tel que les polynucléotides 1 et 2 décrits dans le tableau 2 ci-dessus, qui sont inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ) D N 1 et SEQ ID N 2.
Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène Isum2A dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène Isum2A
Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène isum2A ou l'inhiber par une approche sens ou co-suppression, ou par l'utilisation d'ARN double brin (Wassenegger et al. 1996 ; Kooter et al. 1999) pour interférence. Un tel acide nucléique peut également être utilisé pour rechercher des variants alléliques fonctionnels du gène ISUM2, qui pourront être utilisés dans une méthode de sélection de plantes à embryon modifié en taille et/ou développement.
La région génomique du gène Isum2A essentiellement restreinte à la région dite"codante"comprenant les 3 exons et les 2 introns est définie comme la séquence débutant au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N01.
Une partie de l'exon n 1, la totalité des exons n 2 et 3 ainsi que les deux introns d'un variant du gène isum2A sont compris dans la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 2004 de la séquence SEQ ID N02.
<Desc/Clms Page number 17>
Il est précisé que, sur leur région commune, les séquences SEQ ID N01 et SEQ ID D ? 2 ont un pourcentage d'identité en nucléotides supérieur à 95%, ce pourcentage étant en fait supérieur à 99%.
L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N01 ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention concerne aussi un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N"1, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N01 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a également trait à un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N01 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nucléotidiques suivantes : a) la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 1812 de la séquence SEQ ID Nol, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; b) la séquence allant du nucléotide en position 1813 jusqu'au nucléotide en position 2099 de la séquence SEQ ID N"1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; c) la séquence allant du nucléotide en position 2100 jusqu'au nucléotide en position 2206 de la séquence SEQ ID Nol, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ;
<Desc/Clms Page number 18>
Figure img00180001

d) la séquence allant du nucléotide en position 2207 jusqu'au nucléotide en position 2323 de la séquence SEQ ID N'l, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; e) la séquence allant du nucléotide en position 2324 jusqu'au nucléotide en position 3645 de la séquence SEQ ID Nol, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; f) la séquence allant du nucléotide en position 3646 jusqu'au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N'l, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; et g) la séquence allant du nucléotide en position 4075 jusqu'au nucléotide en position 5620 de la séquence SEQ ID N01 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID N01 est représenté à la figure 1, dans laquelle sont également détaillées les positions des différents exons et introns du gène Isum2A.
PRODUITS DE TRANSCRIPTION DU GENE Isum2A Il a été montré selon l'invention que le gène Isum2A est transcrit sous la forme d'un ARN messager. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert codant pour la protéine ISUM2A.
La partie de l'ADNc du gène Isum2A comprenant le cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID NO 5 a une longueur de 833 nucléotides et est référencé comme la séquence SEQ ID ? 3 du listage de séquences. L'ADNc de séquence SEQ ID N03 dérive du variant de plante sauvage désigné HD5xHD7. Cet ADNc est représenté sur la Figure 2.
La partie de l'ADNc du gène Isum2A comprenant une partie du cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID ? 6 a une longueur de 621 nucléotides et est référencé comme la séquence SEQ ID N04 du listage de séquences. L'ADNc de séquence SEQ ID ? 4 dérive du variant de plante sauvage désigné A188. Cet ADNc partiel est représenté sur la Figure 3.
Les acides nucléiques de séquences SEQ ID ? 3 et SEQ ID ? 4 présentent des similarités avec une séquence d'EST référencée dans la
<Desc/Clms Page number 19>
base de données GENBANK sous le numéro d'accès Al001298 et désignée ISUM2 . C'est la raison pour laquelle il a été attribué la désignation isum2A au gène nouvellement découvert selon l'invention.
La séquence de l'EST N AI001298 possède un degré d'identité en nucléotides de 94% et 95% avec les séquences SEQ ID ? 3 et SEQ ID N"4, respectivement. Aucun cadre de lecture ouvert n'est décrit pour cet EST.
Les acides nucléiques de séquences SEQ ID N03 et SEQ ID N04 présentent aussi des similarités avec une séquence d'EST référencée dans la base de données GENBANK sous le numéro d'accès A1374506. Cette séquence a été obtenue à partir du même clone MEST6-D3 que la séquence AI 001298. La séquence de l'EST n A1374506 possède un degré d'identité en nucléotides de 92% et 98% avec les séquences SEQ ID ? 3 et SEQ ID N04, respectivement. Aucun cadre de lecture ouvert n'est décrit pour cet EST.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A et possédant au moins 99% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID ? 3 ou SEQ ID N'4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à ces acides nucléiques.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A et possédant au moins 99% d'identité en nucléotides
Figure img00190001

avec la séquence nucléotidique SEQ ID N03 ou SEQ ID ? 4 ou un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à ces acides nucléiques.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en
Figure img00190002

ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N03 ou SEQ ID N04 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID ? 3 ou SEQ ID N'4, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Le gène Isum2A code pour un polypeptide de 143 acides aminés de longueur dont deux variants alléliques ont été identifiés selon l'invention,
<Desc/Clms Page number 20>
respectivement les polypeptides variants de séquence SEQ ID D ? 5 et SEQ ID N06, qui possèdent entre eux un degré d'identité de plus de 99%.
En conséquence, l'invention est également relative à un acide nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 95% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID ? 5 ou SEQ ID ? 6.
L'invention a également trait à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide de séquence SEQ ID ? 5 ou SEQ ID ? 6.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique codant pour un"fragment"d'un polypeptide possédant au moins 95% d'identité en
Figure img00200001

nucléotides avec un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID ? 5 ou SEQ ID N06.
L'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un fragment d'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID ? 5 ou SEQ ID N06.
Un polypeptide ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence comprend au moins 96%, 97%, 98%, 99%, 99, 1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99, 5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en acides aminés avec le polypeptide de référence.
Sont englobés dans la définition d'un polypeptide ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence selon l'invention, les polypeptides dits"variants". Par"variant"d'un polypeptide selon l'invention, on entend un polypeptide dont la séquence en acides aminés comprend une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'acides aminés peuvent être de nature conservative ou non conservative.
Un variant d'un polypeptide de référence selon l'invention consiste en un polypeptide qui conserve la fonction ou l'activité biologique du polypeptide de référence et/ou qui est reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide de référence. Ces variants polypeptidiques peuvent résulter de variations alléliques caractérisées par des différences dans les séquences nucléotidiques du gène codant pour ces polypeptides. De tels variants polypeptides peuvent aussi résulter d'épissages alternatifs ou de modifications post-traductionnelles.
<Desc/Clms Page number 21>
Par"fragment"d'un polypeptide de référence selon l'invention, on entend un polypeptide possédant au moins 10, 15,20, 25,30, 40,50, 60, 70,80, 90,100, 110,120, 130,135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide tel que défini dans la présente description.
SONDES ET AMORCES SELON L'INVENTION
Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nucléotidiques SEQ ID N01 à SEQ ID N'4, leurs fragments d'au moins 12 nucléotides, les séquences ayant au moins 95% d'identité en nucléotides avec au moins une partie des séquences SEQ ID N01 à SEQ ID N"4, ainsi que les acides nucléiques de séquence complémentaire, sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène Isum2A ou encore d'un fragment ou d'un variant allélique de cette dernière dans un échantillon.
Font également partie de l'invention les sondes et amorces nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N01 à SEQ ID N04.
Les conditions d'hybridation ci-dessous sont mises en oeuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique, sonde ou amorce, de 20 bases de longueur.
Le niveau et la spécificité d'hybridation dépend de différents paramètres, tels que : a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; b) la composition en bases de la sonde ou de l'amorce, les paires de base G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de bases A-T ou A-U ; c) la longueur de la séquence de bases homologues entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ; d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; e) la température d'incubation ;
<Desc/Clms Page number 22>
f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; g) la présence d'agents dénaturants tels que des agents favorisant la rupture des liaisons hydrogène, comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ; h) le temps d'incubation, le taux d'hybridation augmentant avec la durée de l'incubation ; i) la présence d'agents d'exclusion de volume, tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils accroissent les concentrations effectives de la sonde ou l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation.
Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation :
Tm= 81,5 + 0,41 (% G+C) +16,6 Log (concentration en cations)- 0,63 (% formamide)- (600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54-9. 62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4 (G+C) + 2 (A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en-dessous de Tm.
Par conditions d'hybridation de forte stringence selon l'invention, on entend des conditions d'hybridation telles que l'on se place à une température d'hybridation de 50C au-dessous du Tm.
Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur et de la composition en bases de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).
<Desc/Clms Page number 23>
A titre illustratif, les conditions d'hybridation utilisées pour un acide nucléique de 200 bases de longueur sont les suivantes : Préhybridation : mêmes conditions que pour l'hybridation durée : 1 nuit.
Hybridation :
5 x SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA)
5 x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB)
100 ug/m ! ADN de sperme de saumon
0.1% SDS durée : 1 nuit.
Lavages :
2 x SSC, 0. 1% SDS 10 min 65 C
1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 650C
0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C
0.1 x SSC, 0. 1% SDS 10 min 65 C.
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N01 à 4 ou de sa séquence complémentaire, d'un acide nucléique ayant 95% d'identité en nucléotides avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N01 à 4 ou de sa séquence complémentaire ou encore d'un acide nucléique hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N01 à 4 ou de sa séquence complémentaire.
De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur d'au moins 12,15, 18,20, 25,30, 35,40, 45,50, 60,100, 150,200, 300,400, 500,1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15,18, 20,25, 30,35, 40,45, 50,60, 100,150, 200,300, 400,500, 1000,
<Desc/Clms Page number 24>
2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier un fragment d'acide nucléique du gène Isum2A de séquence
Figure img00240001

SEQ ID N01 ou SEQ ID ? 2 sont par exemple les amorces SEQ ID ? 10 à 13 et 17 à 23.
L'utilisation des amorces de séquences SEQ ID D ? 10 à 13 et 17 à 23 dans des réactions d'amplification est décrite dans les exemples.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen n EP 0 707 592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant une molécule détectable, c'est-à-dire un marqueur détectable, par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs zip 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5'ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n FR 78 10 975 ou encore dans les articles de URDEA et al. (1988) ou SANCHEZ PESCADOR et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par URDEA et al ; (1991) ou encore dans le brevet européen n EP 0 225 807 (Chiron).
<Desc/Clms Page number 25>
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique du gène Isum2A ou encore dans des hybridations à l'ARN messager de ce gène lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de micro-titration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose ou encore des microparticles telles que des particules de latex.
En conséquence, l'invention a encore pour objet un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, en particulier d'un acide nucléique de séquences nucléotidiques SEQ ID N01 à SEQ ID D ? 4.
L'invention est également relative à un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il consiste en un polynucléotide d'au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, de manière tout à fait préférée d'un acide nucléique de séquences choisies parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N01 à SEQ ID N04.
Comme décrit ci-dessus, un tel acide nucléique peut en outre être caractérisé en ce qu'il est marqué par une molécule détectable.
Un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique pour la détection ou l'amplification d'une séquence génomique, de l'ARNm ou de l'ADNc du gène Isum2A peut en outre être caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences suivantes : a) les séquences nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N01 ou SEQ ID N02 ; et
<Desc/Clms Page number 26>
b) les séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N01 ou SEQ ID ? 2.
La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène Isum2A dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de :
1) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.
Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites cidessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui vont être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt du gène Isum2A ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes du gène Isum2A, plus particulièrement des acides nucléiques de séquence SEQ ID N01 à SEQ ID ? 4 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
On entend par"séquence cible"au sens de l'invention, une séquence nucléotidique comprise dans un acide nucléique, ladite séquence
<Desc/Clms Page number 27>
nucléotidique hybridant, dans les conditions d'hybridation spécifiées dans la description, avec une sonde ou une amorce nucléotidique de l'invention.
Une séquence cible peut être par exemple une séquence comprise dans un acide nucléique régulateur du gène Isum2A ou encore une séquence comprise dans une région codante génomique ou de l'ADNc de ce gène.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg, ADNc, ARNm) du gène Isum2A, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N01 à SEQ ID N'4, ou encore un fragment ou un variant de ces séquences.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N01 à SEQ ID ? 4 ou un fragment ou un variant allélique de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3'de la région de l'acide nucléique cible du gène Isum2A dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini cidessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-après.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N01 à 4, ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conforme à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3' de l'acide nucléique cible du gène Isum2A dont l'amplification est recherchée ;
<Desc/Clms Page number 28>
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telle que décrite ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID ? 10 à 13 et 17 à 23.
CONSTRUCTIONS D'ACIDE NUCLEIQUE SELON L'INVENTION
L'isolement et la caractérisation du gène isum2A selon l'invention
Figure img00280001

et la démonstration de la nécessité de l'expression du gène isum2A à un niveau détectable dans la plante pour obtenir un développement normal de l'embryon de la graine, après pollinisation, ont permis aux inventeurs de réaliser des constructions d'acide nucléique permettant l'expression d'au moins une copie fonctionnelle du gène isum2A dans un hôte cellulaire, particulièrement dans une cellule de plante transformée avec de telles constructions d'acide nucléique.
De préférence, ladite cellule porte au moins un allèle isum2A non fonctionnel. De manière tout à fait préférée, ladite cellule porte les deux allèles isum2A non fonctionnels.
Il a été mis au point selon l'invention des constructions d'acide nucléique permettant l'obtention d'une expression contrôlée d'au moins une copie fonctionnelle d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A dans un hôte cellulaire, particulièrement dans une cellule de plante.
En conséquence, l'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A tel que défini dans la présente description, ou pour un fragment de ce polypeptide, ledit acide nucléique comprenant de plus un polynucléotide régulateur capable de réguler la transcription ou la traduction du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, ou le fragment de ce polypeptide.
<Desc/Clms Page number 29>
Fait également partie de l'invention l'acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Une construction d'acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A ainsi qu'un polynucléotide régulateur est également désignée cassette d'expression dans la présente description. De manière générale, une cassette d'expression selon l'invention comprendra au moins un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A, les autres éléments fonctionnels permettant l'expression du polypeptide ISUM2A pouvant être portés par un vecteur dans lequel la cassette d'expression peut être insérée.
Une cassette d'expression selon l'invention peut aussi contenir, de manière non limitative, outre un polynucléotide régulateur, également d'autres éléments fonctionnels tels que des séquences leader ou une séquence terminateur ou encore des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription.
Selon un autre mode de réalisation d'une construction d'acides nucléiques de l'invention, on utilise des promoteurs connus pour diriger l'expression de la séquence d'acide nucléique fusionnée de façon constitutive ou tissu spécifique (graine) ou stade développement.
A titre d'exemple, on peut citer : a) des promoteurs constitutifs : - le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, ou le promoteur 19S ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (pd35S), décrits dans l'article de Kay et al., 1987 ; - le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (pAR-IAR) contenu dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Mc Elroy et al.,
1991 ; - le promoteur constitutif EF-1a du gène codant pour le facteur d'élongation végétale décrit dans la demande PCT n WO 90/02172 ou encore dans l'article de AXELOS et al. (1989) ; - le superpromoteur chimérique PSP (NI et al., 1995) constitué de la fusion de trois copies de l'élément d'activité transcriptionnelle du promoteur du gène de la octopin synthase de Agrobacterium tumefaciens et de l'élément d'activation de la transcription du
<Desc/Clms Page number 30>
promoteur du gène de la mannopin synthase de Agrobacterium tumefaciens ; et le promoteur ubiquitine du tournesol (BINET et al., 1991) ; le promoteur de l'ubiquitine 1 de maïs (CHRISTENSEN et al.,
1996).
- le promoteur de l'ubiquitine 1 de maïs (Christensen et al., 1996) b) des promoteurs spécifiques : - des promoteurs spécifiques des graines (Datla, R. et al., 1997), notamment les promoteurs de la napine (EP 255 378), de la phaseoline (Riggs et al., 1989). , de la glutenine, de l'héliantinine (WO 92/17580), de l'albumine (WO 98/45460), de l'oléosine (WO 98/45461), de l'ATS1 ou de l'ATS3 (WO 99/20775).
- des promoteurs Esr tels que décrits dans la demande PCT/FROO/02596 qui permettent une expression à la fois spécifique à l'interface entre l'embryon et l'albumen et précoce au cours du développement de l'albumen.
- le promoteur du gène Vp1 décrit par Mc Carty et al. (1989).
Les acides nucléiques régulateurs ci-dessus peuvent être utilisés pour surexprimer le polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A ou encore un fragment du polypeptide ISUM2A, en particulier lorsque l'obtention de plantes possédant des graines à gros embryons riches en huile est recherchée.
Ainsi, l'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A ou pour un fragment d'un polypeptide ISUM2A tel que défini ci-dessus et comprenant un polynucléotide régulateur régulant la transcription et/ou la traduction de la séquence codante, dans lequel le polynucléotide régulateur permet un haut niveau de transcription de l'ARNm correspondant et/ou un haut niveau de traduction du polypeptide correspondant dans l'organisme hôte, y compris cellule hôte ou plante, dans lequel il est exprimé.
L'invention est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, d'un vecteur recombinant comprenant cet acide nucléique ou encore d'une cellule hôte transfectée ou transformée avec cet
<Desc/Clms Page number 31>
acide nucléique pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines riches en huile.
Dans un mode de réalisation préférée, on recherche une expression contrôlée du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, tout particulièrement lorsque la production de graines à développement de germe affecté est recherchée.
Comme indiqué précédemment, un défaut dans l'expression du gène isum2A provoque la production de graines sans germe, ces graines
Figure img00310001

n'étant pas fertiles et ne permettant pas la multiplication des plantes mutées dans le gène isum2A.
De plus, l'expression du gène isum2A semble nécessaire à une croissance normale de la plante avant la pollinisation.
La pollinisation est le moment où le pollen mature entre en contact avec une soie réceptive.
Il en résulte que l'obtention d'une production de graines à développement de germe affecté par une plante implique : a) une expression normale d'au moins une copie fonctionnelle d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A depuis le stade de germination de la graine jusqu'à la pollinisation de la plante ; et b) une absence de la transcription ou de la traduction de cet acide nucléique dès la pollinisation de la plante, afin de produire des graines affectées dans le développement du germe.
L'absence de transcription ou de traduction de l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A dès le stade de la pollinisation affecte ou bloque le développement de l'embryon de la graine afin d'aboutir à l'objectif recherché.
Lorsqu'on cherchera à reproduire et multiplier les plantes d'intérêt, et que la production de graines normales et fertiles sera recherchée, l'expression normale du polypeptide ISUM2A sera poursuivie pendant tout le développement de la plante, y compris après la pollinisation.
Pour poursuivre l'objectif de l'invention, il est donc particulièrement avantageux d'utiliser des constructions d'acides nucléiques dans lesquelles le polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A est placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur dont l'activité peut être contrôlée dans le temps.
<Desc/Clms Page number 32>
L'invention est donc également relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N05 et SEQ ID N06 et qui comprend aussi un polynucléotide régulateur sensible à l'action, directe ou indirecte, d'un signal inducteur, aussi désigné polynucléotide régulateur inductible.
Selon un premier aspect, le polynucléotide régulateur est un polynucléotide répresseur de la transcription ou de la traduction.
Par polynucléotide régulateur répresseur , on entend selon l'invention une séquence régulatrice dont l'activité constitutive peut être bloquée par un signal externe. Un tel signal externe peut être l'absence de fixation d'un facteur de transcription reconnu par le polynucléotide régulateur répresseur. L'absence de fixation du facteur de transcription peut être induite sous l'effet du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible.
Selon ce premier mode de réalisation particulier, l'expression de la séquence codant pour un polypeptide ISUM2A est constitutive dans l'hôte cellulaire choisi, en l'absence du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est directement ou indirectement sensible.
La mise en contact de l'hôte cellulaire avec le signal inducteur répresseur a pour effet, grâce à une action directe ou indirecte sur le polynucléotide régulateur répresseur, d'inhiber et/ou de bloquer l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A.
Pour réaliser les constructions d'ADN selon l'invention comprenant un polynucléotide régulateur répresseur, l'homme du métier aura recours à ses connaissances générales techniques dans le domaine de l'expression de gènes chez les végétaux.
Selon un second mode de réalisation d'une construction d'acide nucléique de l'invention, le polynucléotide régulateur est un polynucléotide activateur de la transcription ou de la traduction.
De manière tout à fait préférée, le polynucléotide régulateur activateur de la transcription ou de la traduction est sensible, directement ou indirectement, à l'action d'un signal inducteur activateur. Il s'agit alors d'un polynucléotide activateur inductible au sens de l'invention.
<Desc/Clms Page number 33>
Selon l'invention, un polynucléotide régulateur du type activateur inductible est une séquence régulatrice qui n'est activée qu'en présence d'un signal externe. Un tel signal externe peut être la fixation d'un facteur de transcription, la fixation d'un facteur de transcription pouvant être induite sous l'effet du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur est directement ou indirectement sensible.
Lorsqu'une telle construction d'acides nucléiques est utilisée dans un hôte cellulaire, l'expression du polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A selon l'invention peut être induite en mettant en contact l'hôte cellulaire transformé avec le signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est, directement ou indirectement, sensible.
Lorsque l'on recherche l'absence d'expression du polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A chez cet hôte cellulaire transformé, il suffit alors d'éliminer ou supprimer la présence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur de la transcription ou de la traduction est sensible.
L'homme du métier aura recours à ses connaissances générales techniques dans le domaine des polynucléotides régulateurs, en particulier ceux actifs chez les végétaux, pour définir les constructions répondant à la définition du second mode de réalisation ci-dessus.
Pour les besoins d'une bonne clarté dans l'exposé des caractéristiques des constructions nucléotidiques qui sont
Figure img00330001

préférentiellement utilisées pour l'obtention d'une production de graines sans germe, plusieurs systèmes inductibles et contrôlables de l'expression d'un polypeptide ISUM2A dans des plantes sont définis ci-après. Les caractéristiques générales de systèmes d'expression appropriés sont tout d'abord résumés dans le Tableau 3 ci-dessous, puis leurs aspects fonctionnels sont ensuite détaillés.
<Desc/Clms Page number 34>
Tableau 3 : Exemples de systèmes d'expression inductibles de ISUM2A.
Figure img00340001
<tb>
<tb>
Système <SEP> d'induction <SEP> Système <SEP> d'expression
<tb> Fond <SEP> génétique <SEP> de <SEP> Promoteur <SEP> Gène <SEP> Promoteur <SEP> Gène
<tb> l'hôte <SEP> cellulaire <SEP> ou <SEP> de <SEP> la
<tb> plante
<tb> I <SEP> isum2A-/isum2A-a- <SEP> Constitutif <SEP> Activateur <SEP> Sous <SEP> contrôle <SEP> Isum2A
<tb> régulable <SEP> de <SEP> l'activateur
<tb> par
<tb> inducteur
<tb> II <SEP> isum2A-/isum2A- <SEP> Constitutif <SEP> ou <SEP> Répresseur <SEP> Sous <SEP> contrôle <SEP> Isum2A
<tb> spécifique <SEP> de <SEP> régulable <SEP> du <SEP> répresseur
<tb> l'embryon <SEP> par
<tb> inducteur
<tb> III <SEP> Isum2A+/Isum2A+a <SEP> Constitutif <SEP> ou <SEP> Activateur <SEP> Sous <SEP> contrôle <SEP> Polynucléotide
<tb> spécifique <SEP> de <SEP> régulable <SEP> de <SEP> l'activateur <SEP> antisens <SEP> de
<tb> l'embryon <SEP> par <SEP> Isum2A
<tb> inducteur
<tb>
a isum 2A/isum2A : homozygote pour une copie non fonctionnelle du gène isum2A, par exemple une mutation.
'Isum 2A+/lsum2A+ : homozygote portant deux copies fonctionnelles du gène isum2A.
Description du système d'expression inductible 1 du tableau 3
Le système d'expression inductible 1 du tableau 3 constitue une illustration d'une construction d'acides nucléiques dans laquelle le polynucléotide régulateur est un polynucléotide activateur inductible de la transcription et/ou de la traduction, selon le second mode de réalisation défini précédemment.
Le système d'expression 1 comprend :
<Desc/Clms Page number 35>
(i) une première cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un promoteur dont l'activité est induite uniquement en présence d'un composé activateur, lorsque ce composé activateur, en général un facteur de transcription, est lié à un composé inducteur.
(ii) une seconde cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur, par exemple le facteur de transcription ci-dessus, placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression constitutive du composé activateur.
Selon le système l, la transcription ou la traduction de la séquence codant pour un polypeptide ISUM2A est induite uniquement lorsque le composé activateur est complexé au composé inducteur. Le complexe entre le composé activateur et le composé inducteur se fixe sur le promoteur contrôlant l'expression de l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, et active l'expression de ce dernier.
Un exemple du système 1 est illustré à l'exemple 3, dans lequel, le système comprend : (i) un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un promoteur contenant la séquence UAS, qui est reconnue par le composé activateur GVG. Le composé activateur GVG est une protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de la protéine GAL4, le domaine activateur du gène VP16 et le récepteur au glucocorticoïde du rat (GR).
(ii) un acide nucléique codant pour la protéine de fusion GVG définie ci-dessus, qui est placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
Dans l'exemple 3, la protéine de fusion GVG est exprimée constitutivement dans la plante, mais n'active pas le promoteur contrôlant l'expression du polypeptide ISUM2A, en l'absence de glucocorticoïde.
En revanche, lorsque la plante est mise en présence du composé inducteur représenté par un glucocorticoïde, le glucocorticoïde se fixe sur la protéine de fusion GVG, et le complexe ainsi formé entre le composé inducteur activateur (glucocorticoïde) et le composé activateur (la protéine de fusion GVG) va se fixer sur la séquence UAS du promoteur contrôlant l'expression d'un polypeptide ISUM2A, ce qui active le promoteur contenant la séquence UAS et induit la synthèse du polypeptide ISUM2A.
<Desc/Clms Page number 36>
Dans le système d'expression inductible ci-dessus, le glucocorticoïde constitue le composé inducteur.
Le signal inducteur activateur est la fixation du complexe composé activateur/composé inducteur (polypeptide de fusion GVG/glucocorticoïde) sur le polynucléotide régulateur activateur (promoteur contenant la séquence UAS).
On utilisera le système d'expression 1 préférentiellement dans un hôte cellulaire végétal ou dans une plante dont les deux copies du gène isum2A sont non fonctionnelles, par exemple dont les deux copies du gène isum2A sont mutées.
Système d'expression inductible Il du tableau 3.
Le système d'expression inductible Il est une illustration du mode de réalisation d'une construction d'acides nucléiques selon l'invention, selon le premier mode de réalisation exposé précédemment, dans lequel le polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A est placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur répresseur .
Dans le système Il selon le tableau 3, le système d'expression contient deux cassettes d'expression, respectivement : (i) une première cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, placé sous le contrôle d'une région régulatrice dont l'activité est constitutive parce qu'elle est induite en présence d'un composé activateur produit de manière constitutive ; (ii) une seconde cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur actif sur la région régulatrice de la cassette d'expression (i) ci-dessus, ledit acide nucléique codant pour le composé activateur étant placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif, préférentiellement un promoteur constitutif fort, ou encore un promoteur actif spécifiquement dans les cellules de l'embryon de la graine.
Dans le système i),) le composé activateur perd sa fonction d'activation de la région régulatrice contrôlant l'expression de l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, lorsque ce composé activateur est mis en présence d'un ligand spécifique, qui est ici désigné composé inducteur répresseur.
<Desc/Clms Page number 37>
Ainsi, en l'absence du ligand spécifique constituant le composé inducteur répresseur, le composé activateur est exprimé de manière constitutive et active l'expression d'un polypeptide ISUM2A.
En revanche, lorsque le composé activateur est mis en présence du composé inducteur répresseur avec lequel il se lie, le composé activateur est désactivé et ne se fixe plus sur la région régulatrice contrôlant l'expression de l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A.
Dans cette situation, le polypeptide ISUM2A n'est plus exprimé.
L'exemple 2 illustre un mode de réalisation particulier d'un système Il tel que défini ci-dessus. Le système Il présenté à l'exemple 2 comprend respectivement : (i) une première cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur tTA, placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif fort, le promoteur du gène de l'actine 1 du riz ; et (ii) une seconde cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un promoteur contenant un motif TRE, le promoteur étant activé lorsque l'activateur tTA se fixe sur l'élément TRE.
Ainsi, en l'absence de tout composé inducteur répresseur, le composé activateur tTA est produit de manière constitutive et active le promoteur contrôlant la séquence codant pour un polypeptide ISUM2A.
En revanche, en présence du composé inducteur répresseur, qui dans ce cas est la tétracycline ou un dérivé de la tétracycline, l'activateur tTA est désactivé et ne se fixe plus sur le motif TRE du promoteur contrôlant l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A. Dans cette situation, en présence de tétracycline, le polypeptide ISUM2A n'est plus exprimé.
Le signal inducteur répresseur est l'absence de fixation du complexe composé activateur/composé inducteur répresseur (activateur tTA/tétracycline) sur le polynucléotide régulateur répresseur (promoteur contenant le motif TRE).
Préférentiellement, un système d'expression Il tel que défini cidessus sera utilisé dans un hôte cellulaire végétal ou dans une plante pour laquelle les deux copies du gène isum2A sont mutées ou inactivées.
<Desc/Clms Page number 38>
*Système d'expression //
Le système d'expression lil, qui est résumé dans le tableau 3, est très similaire, au regard des éléments de régulation de l'expression des cassettes d'expression qu'il contient, au système d'expression 1 ci-dessus.
Avec le système d'expression lil, il est possible de contrôler l'expression d'un polynucléotide antisens susceptible d'inhiber la production d'un polypeptide ISUM2A dans une plante comprenant au moins une copie fonctionnelle du gène isum2A, préférentiellement dans une plante comprenant les deux copies du gène isum2A fonctionnelles.
Le système lil d'expression comprend deux cassettes d'expression, respectivement : (i) une cassette d'expression contenant un acide nucléique codant pour un polynucléotide antisens ou RNAi inhibant la traduction du polypeptide ISUM2A, cet acide nucléique étant placé sous le contrôle d'un promoteur qui est activé par un composé activateur donné lorsque ce composé activateur est lié à un composé inducteur ; et (ii) une cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur, cet acide nucléique étant placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif ou spécifique de l'embryon, préférentiellement un promoteur fort.
Selon le système d'expression lil, en l'absence de liaison du composé activateur avec le composé inducteur, le promoteur contrôlant l'expression du polynucléotide antisens ou RNAi est inactif et le polynucléotide antisens n'est pas produit.
En revanche, en présence du composé inducteur capable d'activer le composé activateur, par exemple en se complexant avec celui-ci, le composé activateur activé se fixe sur le promoteur contrôlant l'expression du polynucléotide antisens isum2A ce qui active l'expression du polynucléotide antisens entraînant une inhibition de la traduction du gène isum2A.
Grâce au système d'expression lit, la synthèse du polypeptide ISUM2A est donc inhibée en présence du composé inducteur activant le composé activateur.
<Desc/Clms Page number 39>
Un tel système d'expression permet de contrôler précisément le moment ou l'on désire bloquer la synthèse du polypeptide ISUM2A, en mettant en présence le composé activateur désactivé avec le composé inducteur activant le composé activateur, par exemple dès le début de la pollinisation.
Un exemple illustratif d'un système d'expression i ! i peut être directement dérivé de celui décrit à l'exemple 3, lorsqu'on substitue l'acide nucléique codant un polypeptide ISUM2A par un acide nucléique codant un polynucléotide antisens inhibant la traduction du polypeptide ISUM2A ou tout autre méthode d'inhibition de gènes endogènes utilisant un transgène et connues de l'homme du métier (co-suppression, ribozyme, ARN double brin...).
Les systèmes d'expression inductibles d'un polypeptide ISUM2A comprennent plusieurs cassettes d'expression qui peuvent indifféremment être incluses dans un seul vecteur d'expression, ou au contraire dans des vecteurs d'expression distincts.
Un système d'expression inductible tels que les systèmes l, Il et ii) décrits ci-dessus comprennent avantageusement au moins un gène marqueur de sélection comme par exemple un gène de résistance à l'herbicide BASTA, bien connu de l'homme du métier.
Selon un premier mode de réalisation, le gène marqueur de sélection est porté par le vecteur comprenant la ou les cassettes d'expression constituant le système d'expression inductible.
Selon un second mode de réalisation, le gène marqueur de sélection est porté par un vecteur distinct d'un vecteur comprenant la ou les cassettes d'expression constituant le système d'expression inductible.
Pour réaliser une construction d'acide nucléique de l'invention, on utilisera un polynucléotide régulateur activateur inductible choisi parmi ceux décrits ci-dessous. polynucléotides régulateurs inductibles préférés selon l'invention.
La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A selon l'invention peut être une séquence régulatrice inductible par un métabolite particulier, tel que :
<Desc/Clms Page number 40>
- une séquence régulatrice inductible par les glucocorticoïdes telle que décrite par AOYAMA et al. (1997) ou telle que décrit par McNELLYS et al. (1998) ; - une séquence régulatrice inductible par l'éthanol, telle que celle décrite par SALTER et al. (1998) ou encore telle que décrite par CADDICK et al. (1998) ; - une séquence régulatrice inductible par la tétracycline telle que celle commercialisée par la Société CLONTECH.
- une séquence de promoteur inductible par un pathogène ou par un métabolite produit par un pathogène.
- une séquence régulatrice de gènes de type PR, inductible par l'acide salicylique ou le BTH ou l'aliette (Gorlach et al., 1996, Molina et al., 1998) ; - une séquence régulatrice de type récepteur Ecdysone (Martinez et al., 1999) inductible par le tebufenozide (référence produit RH5992, commercialisé par ROHM & HAAS) par exemple, appartenant à la famille des dibenzoylhydrazines.
Autres séquences contenant des signaux régulateurs
De manière avantageuse, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A peut aussi contenir une ou plusieurs autres séquences contenant des signaux régulateurs de l'expression de la région codant ISUM2A, ou alternativement être placé sous le contrôle de telles séquences régulatrices.
Séquences" leader 11
Les autres séquences contenant des signaux régulateurs englobent des séquences 5'non traduites dites"leader". De telles séquences peuvent augmenter la traduction de l'ARNm codant ISUM2A. Parmi cellesci, on peut citer, à titre illustratif mais non limitatif : - le leader EMCV (EncephaloMyoCarditis VIRUS 5'non coding region) (ELROY-STEIN et al., 1989) ;
<Desc/Clms Page number 41>
- le leader TEV (Tobacco Etch Virus) (CARRINGTON AND FREED, 1990) ; - le leader du gène BiP codant pour la protéine de liaison à la chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine (MACEJACK et al., 1991) ; - le leader AMV RNA 4 provenant de l'ARNm de la protéine du virus de la mosaïque de la luzerne (JOBLING et al. 1987) ; - le leader du virus de la mosaïque du tabac (GALLIE et al., 1989).
Séquences""terminateur-"
L'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A, ou le vecteur dans lequel est inséré cet acide nucléique peut aussi comprendre des séquences dites"terminateurs".
Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer, à titre illustratif mais non limitatif : - le polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de FRANCK et al. (1980) ; - le terminateur nos correspondant à la région 3'non-codante du gène de la opaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens (DEPICKER et al., 1992).
- le terminateur du gène histone (EP 0 633 317).
Selon une autre alternative, la cassette d'expression selon l'invention peut comprendre un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A fusionné à une séquence régulatrice de gènes de type fragment GR récepteur aux glucocorticoïdes (Aoyma et ai. 1997), ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle d'une séquence promotrice de type promoteur natif d'ISUM2 ou promoteur constitutif. En présence de l'hormone, la protéine hybride résultante n'est plus retenue dans le cytoplasme et peut donc rentrer dans le chloroplaste et s'intégrer au ribosome.
VECTEURS RECOMBINANT DE L'INVENTION
Un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A peut être inséré dans un vecteur approprié.
<Desc/Clms Page number 42>
Par"vecteur"au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme simple brin ou double brin.
Un vecteur recombinant selon l'invention est de préférence un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration.
Il peut s'agir notamment d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale.
Dans tous les cas, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A est placé sous le contrôle d'une ou plusieurs séquences contenant des signaux de régulation de son expression dans la plante considérée, soit que les signaux de régulation soient tous contenus dans l'acide nucléique codant ISUM2A, comme c'est le cas dans les constructions d'acides nucléiques décrites dans la section précédente, soit que l'un, plusieurs d'entre eux, ou encore tous les signaux de régulation soient contenus dans le vecteur receveur dans lequel l'acide nucléique codant ISUM2A a été inséré.
Un vecteur recombinant selon l'invention comprend avantageusement des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent inclure une ou plusieurs origines de réplication fonctionnelles dans les cellules hôtes dans lesquelles leur expression est recherchée, ainsi que, le cas échéant, des séquences nucléotidiques marqueurs de sélection.
Les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent aussi inclure un ou plusieurs des signaux de régulation de l'expression tels que définis cidessus dans la description.
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC n 37 017) ou encore les vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, Etats-Unis).
On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psi174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI et pSG (Stratagene).
<Desc/Clms Page number 43>
Figure img00430001

Il peut s'agir également de vecteurs du type Baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N CRL 1711) dérivée de Spodoptera frugiperda.
De manière préférée, et pour l'application principale des vecteurs de l'invention consistant à obtenir une expression stable, et préférentiellement inductible, d'une séquence codant pour un polypeptide ISUM2A dans une plante, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquences d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants : - vecteur pBIN19 (BEVAN et al.), commercialisé par la Société CLONTECH (Palo Alto, Californie, USA) ; - vecteur pBI 101 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pBI121 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pEGFP ; Yang et al. (1996), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994) - vecteurs intermédiaires et superbinaires dérivés des vecteurs pSB12 et pSB1 décrits par Japan Tobacco (EP 672 752 et Ishida et al., 1996).
Font également partie de l'invention les vecteurs pRDP5 et pRDP4 décrits à l'exemple 2 ainsi que les vecteurs pRDP2 et pRDP3 décrits à l'exemple 3, avec l'ensemble de leurs caractéristiques définies dans ces exemples.
CELLULES HOTES TRANSFORMEES SELON L'INVENTION.
Pour permettre l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A selon l'invention placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice appropriée, les acides nucléiques ou les vecteurs recombinants définis dans la présente description doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier.
<Desc/Clms Page number 44>
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'invention ou par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
Une telle cellule hôte transformée est préférentiellement d'origine bactérienne, fongique ou végétale.
Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes souches de Escherichia coli ou encore d'Agrobacterium
Figure img00440001

tumefaciens.
Avantageusement, la cellule hôte transformée est une cellule de plante ou encore un protoplaste de plante.
Parmi les cellules susceptibles d'être transformées selon le procédé de l'invention, on peut citer à titre d'exemples des cellules de plantes de grandes cultures (maïs, blé, colza, tournesol, pois, soja, orge..).
Préférentiellement, on peut choisir des plantes connues pour contenir de grandes réserves (protéiques, glucidiques et lipidiques), notamment les plantes céréalières ou les plantes oléagineuses.
Les plantes hybrides obtenues par le croisement de plantes selon l'invention, font aussi partie de l'invention.
Préférentiellement, il s'agit d'une cellule ou d'un protoplaste d'une plante céréalière. La cellule ou le protoplaste est préférentiellement originaire du maïs, du blé, de l'orge, du sorgho, du millet, du seigle ou du riz.
De manière tout à fait préférée, il s'agit d'une cellule originaire du maïs.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A, le cas échéant sous la forme d'une construction d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, pour fabriquer une plante transformée capable de produire des graines à développement du germe affecté.
L'invention est également relative à l'utilisation d'un vecteur recombinant tel que défini dans la présente description pour fabriquer une plante transformée capable de produire des graines à développement du germe affecté.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un hôte cellulaire transformé par un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un
<Desc/Clms Page number 45>
polypeptide ISUM2A, le cas échéant sous la forme d'une construction d'acide nucléique ou cassette d'expression telle que définie ci-dessus, pour fabriquer une plante transformée capable de produire des graines à développement du germe affecté.
L'invention concerne aussi une plante transformée comprenant une pluralité de cellules hôtes telles que définies ci-dessus.
PLANTES TRANSFORMEES PAR UN ACIDE NUCLEIQUE PERMETTANT LA SYNTHESE DU POLYPEPTIDE ISUM2A ET PROCEDES POUR LEUR OBTENTION.
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées par un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A tel que défini dans la présente description ou encore par un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique.
L'invention a encore pour objet une plante transformée comprenant, sous une forme artificiellement intégrée dans son génome, un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2-A, tel que défini dans la présente description.
La plante transformée peut contenir une pluralité de copies d'un acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A, dans les situations dans lesquelles une surexpression du polypeptide ISUM2A est recherchée.
Une surexpression du polypeptide ISUM2A est recherchée notamment lorsque l'on souhaite obtenir des plantes produisant des graines dont le germe a une taille significativement plus grande que dans les plantes sauvages et qui est enrichi en huile.
Selon un autre aspect, la surexpression du polypeptide ISUM2A peut être obtenue en transformant une cellule hôte ou une plante avec un acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A et dans lequel le polynucléotide comprenant le cadre ouvert de lecture est placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur permettant un haut niveau de transcription de l'ARNm correspondant ou un haut niveau de traduction du polypeptide ISUM2A dans la cellule hôte ou dans la plante.
L'invention est donc également relative à une plane transformée telle que définie ci-dessus dont les graines sont riches en huile.
<Desc/Clms Page number 46>
Elle est également relative à une plante transformée telle que définie ci-dessus et qui possède des qualités agronomiques et/ou nutritionnelles améliorées.
Elle concerne aussi un procédé d'obtention d'une telle plante transformée.
Parmi les plantes susceptibles d'être transformées selon l'invention, on peut citer à titre d'exemple illustratif mais non limitatif des plantes de grande culture, préférentiellement le maïs, le blé, le colza, le tournesol, le pois, le soja et l'orge.
Compte-tenu du but poursuivi par l'invention, qui consiste principalement à obtenir des graines à développement de germe affecté riches en amidon, les plantes préférées selon l'invention sont celles dont les graines possèdent une forte teneur en amidon ou une forte quantité d'amidon et de manière tout à fait préférée le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le millet, le seigle ou le riz.
Les plantes hybrides obtenues par le croisement de plantes transformées selon l'invention font également partie de l'invention.
L'invention concerne aussi toute partie d'une plante transformée telle que définie dans la présente description, telle que la racine, mais aussi les parties aériennes comme la tige, la feuille, la fleur et surtout la graine.
L'invention a encore pour objet une semence ou une graine de plante produit par une plante transformée telle que définie ci-dessus.
Typiquement, une telle semence transformée ou un tel grain transformé comprend une ou plusieurs cellules comprenant dans leur génome une ou plusieurs copies d'un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A, le cas échéant de manière contrôlée et inductible.
Lorsqu'une surexpression du polypeptide ISUM2A a été obtenue dans la plante, les semences ou graines de plantes sont enrichies en huile.
L'invention a donc aussi pour objet des semences et des grains enrichis en huile, préparés ou obtenus à partir d'une plante transformée surexprimant le polypeptide ISUM2A.
Les graines riches en huile sont utilisées pour la préparation de semences ou des farines de semences enrichies en huile utilisables dans l'agriculture et dans l'industrie agro-alimentaire.
<Desc/Clms Page number 47>
Selon un mode de réalisation préférentiel d'une plante transformée selon l'invention, on cherche à exprimer de manière contrôlée le polypeptide ISUM2A, ce qui implique que la plante transformée ne contient, en tant que copie fonctionnelle d'un polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, uniquement la ou les copies qui ont été artificiellement introduites dans leurs cellules, et préférentiellement dans leur génome, alors que les séquences du gène isum2A retrouvées naturellement dans la plante sauvage portent au moins une mutation provoquant un défaut dans l'expression du gène isum2A.
De telles plantes mutées dans le gène isum2A sont par exemple les plantes mutantes G2422 ou les plantes mutantes emb*-8516 décrites par HECKEL et al. (1999). L'homme du métier peut, grâce à l'invention, produire d'autres plantes mutées dans le gène isum2A, par exemple par insertion au hasard du transposon Mutator dans une population de plantes de phénotype sauvage (Isum2A+/lsum2A+), puis en détectant chez les mutants obtenus, ceux d'entre ces mutants qui n'expriment plus le gène isum2A, par exemple à l'aide des sondes ou des amorces nucléotidiques décrites dans les exemples.
Selon ce mode de réalisation préférentiel, la plante transformée selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle dérive d'une plante dans laquelle les deux copies du gène isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans son expression, au niveau transcriptionnel ou traductionnel.
Selon un second mode de réalisation préférentiel selon l'invention, on cherche à inhiber de manière contrôlée la synthèse du polypeptide ISUM2A, par exemple au travers de l'expression d'un polynucléotide antisens.
Dans ce cas, la plante transformée comprend au moins une copie fonctionnelle du gène isum2A et préférentiellement les deux copies du gène isum2A sont fonctionnelles.
L'invention est également relative à un procédé pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines affectées dans le développement du germe, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformation d'au moins une cellule végétale ;
<Desc/Clms Page number 48>
- par un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID ? 5 et SEQ ID N06, ledit acide nucléique comprenant également un polynucléotide régulateur tel que défini dans la présente description ; ou - par un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique ; b) sélection des cellules transformées à l'étape a) ayant intégré dans leur génome au moins une copie d'un acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A. c) régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b) ;
Par graines affectées dans le développement du germe , on entend selon l'invention des graines dont le développement du germe est anormal , c'est-à-dire diffère significativement du germe d'une graine de plante dite sauvage .
Selon un premier aspect, le développement du germe peut être affecté de telle sorte que sa taille est significativement plus grande que celle du germe retrouvé dans les graines de plantes sauvages non affectées dans l'expression du gène isum2A. Une taille significativement plus grande du germe peut être obtenue en surexprimant le polypeptide ISUM2A, par exemple soit en introduisant une pluralité de copies d'un acide nucléique codant ce polypeptide dans une cellule hôte ou dans une plante, soit en plaçant une copie du gène isum2A ou de son ADNc sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur permettant la surexpression du polypeptide ISUM2A dans la cellule hôte ou dans la plante.
En surexprimant le polypeptide ISUM2A du stade précoce du développement de l'embryon, on obtient des graines de grande taille riches en huile.
L'invention a encore pour objet un mode de réalisation particulier du procédé ci-dessus pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines à développement du germe affecté dans lequel au moins une cellule végétale est transformée à l'étape a) par Agrobacterium tumefaciens contenant : - un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95%
<Desc/Clms Page number 49>
d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID ? 5 et SEQ ID D ? 6 et comprenant un polynucléotide régulateur tel que défini dans la présente description ; ou - un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique ;
Chacun des procédés d'obtention d'une plante transformée selon l'invention peut comprendre les étapes supplémentaires suivantes : d) croisement d'une plante sélectionnée à l'étape c) avec une plante hétérozygote comprenant une copie fonctionnelle du gène isum2A et une copie inactive du gène isum2A ; e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) qui sont homozygotes et portent deux copies inactives du gène isum2A.
De préférence, le polynucléotide régulateur est sensible à l'action d'un signal inducteur ; on dit aussi que le polynucléotide régulateur est inductible.
Selon un premier mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide régulateur inductible consiste en un polynucléotide régulateur répresseur tel que défini dans la présente description.
Selon un second mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide régulateur inductible est un polynucléotide régulateur
Figure img00490001

activateur de la transcription ou de la traduction tel que défini dans la présente description.
La présente invention concerne aussi une plante transformée, telle qu'obtenue par l'un des procédés d'obtention défini ci-dessus.
L'invention a également trait à une plante transgénique hybride obtenue par le croisement d'une plante transformée telle que définie cidessus.
L'invention est encore relative à une partie d'une plante transformée selon l'invention.
L'invention a encore pour objet un procédé pour l'obtention de grains de plantes à développement du germe affecté, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver, jusqu'à pollinisation, une plante dont les deux copies du gène isum2A portent au moins une mutation provoquant un défaut dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit artificiellement un acide nucléique comprenant : - un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID D ? 5 et SEQ ID ? 6 ; et
<Desc/Clms Page number 50>
- un polynucléotide régulateur inductible du type répresseur contrôlant l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, la culture de la plante étant effectuée en l'absence du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible ; b) mettre en contact la plante transformée définie en a) avec le signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible, pendant une période allant de la pollinisation jusqu'à la fin de la formation des grains ; c) récupérer les grains matures, caractérisés en ce qu'ils sont affectés dans le développement du germe.
Le développement du germe peut être affecté de telle sorte que sa taille est significativement réduite par rapport à celui des graines provenant de plantes sauvages, voire inexistant, comme cela a été montré lorsque la plante possède un gène isum2A non fonctionnel ou encore lorsqu'on introduit un acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur permettant de bloquer la transcription ou la traduction de manière contrôlée afin d'affecter le développement du germe.
La présente invention a aussi pour objet un procédé pour l'obtention de grains de plantes à développement du germe affecté, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver, jusqu'à la pollinisation, une plante dont les deux copies du gène isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit artificiellement un acide nucléique comprenant : - un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec
Figure img00500001

les séquences SEQ ID N05 et SEQ ID ? 6 ; et - un polynucléotide régulateur du type activateur inductible contrôlant l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, la culture de la plante étant effectuée en présence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est sensible ;
<Desc/Clms Page number 51>
b) poursuivre la culture de la plante tranformée définie en a) en l'absence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est sensible, à partir de la période suivant la pollinisation ; c) récupérer les grains matures, caractérisés en ce qu'ils sont affectés dans le développement du germe.
L'invention concerne aussi une semence à développement du germe affecté telle qu'elle est obtenue selon l'un des procédés définis cidessus.
L'invention est également relative à une semence à développement du germe affecté, caractérisée en ce que chacune de ses cellules constitutives comprenne sous une forme artificiellement intégrée dans leur génome, un acide nucléique comprenant : - un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID ? 5 et SEQ ID N06 ; et - un polynucléotide régulateur.
Selon un premier mode de réalisation le polynucléotide régulateur consiste en un polynucléotide régulateur inductible du type répresseur.
Selon un second mode de réalisation préférentielle, le polynucléotide régulateur consiste en un polynucléotide régulateur du type activateur inductible.
Fait également partie de l'invention tout produit de transformation d'une semence telle que définie dans la présente description, en particulier une semence ou une huile.
De préférence, le produit de transformation est un amidon.
Pour obtenir de l'amidon à partir d'une semence à développement du germe affecté selon l'invention, l'homme du métier aura avantageusement recours aux techniques décrites dans l'ouvrage Handbuch der Starke (vol. 1 ; Max Ullmann (ed.), Paul Varey Verlag,
Berlin) ou encore dans l'article de Morrison et Karkalas (Methods in Plant
Biochemistry, 1990, vol. 2 : 323-352, Academic Press Ltd ; Londres).
L'amidon obtenu à partir des semences à développement du germe affecté selon l'invention peut être utilisé par l'industrie agro- alimentaire, l'industrie pharmaceutique, l'industrie du papier ou encore dans le domaine microbiologique où il peut être mis en oeuvre en tant que substrat nutritif.
<Desc/Clms Page number 52>
La transformation de cellules végétales peut être réalisée par les techniques connues de l'homme du métier.
On peut citer notamment les méthodes de transfert direct de gènes telles que la microinjection directe dans des embryoïdes de plante (NEUHAUS et al., 1987), l'infiltration sous vide (BECHTOLD et al., 1993) ou l'électroporation (CHUPEAU et aL, 1989) ou encore la précipitation directe au moyen de PEG (SCHOCHER et al., 1986) ou le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt (FROMM M. et al. 1990).
On peut également infecter la plante par une souche bactérienne notamment d'Agrobacterium. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées par un vecteur selon l'invention, ledit hôte cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques d'intérêt initialement contenues dans l'ADN du vecteur susmentionné. Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'AN et al., (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de GUERCHE et al., (1987) ou encore dans la demande PCT N'WO 00 22.148.
Par exemple, la transformation des cellules végétales peut être réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al. 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans l'un de ces vecteurs, la région T a été éliminée par délétion, à l'exception des bordures droite et gauche, entre eux le gène d'intérêt, ainsi qu'un gène marqueur sont insérés pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus de région T mais contient toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de la cellule végétale.
Selon un mode préféré, on peut utiliser la méthode décrite par ISHIDA et al. (1996) pour la transformation des Monocotylédones.
<Desc/Clms Page number 53>
Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par FINER et al. (1992) utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or.
L'homme du métier est capable de mettre en oeuvre de nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obtenir des plantes transformées par un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A.
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par BECHTOLD et al. (1993) afin de transformer une plante à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Des techniques utilisant d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées, telles que les techniques décrites par BOUCHEZ et al. (1993) ou encore par HORSCH et al. (1994).
A titre illustratif, une plante transgénique selon l'invention peut être obtenue par des techniques de biolistique telles que celles décrites par FINER et al. (1992) ou encore celles décrites par VAIN et al. (1993).
D'autres techniques préférées de transformation d'une plante conformément à l'invention par Agrobacterium tumefaciens sont celles décrites par ISHIDA et al. (1996) ou encore dans la demande PCT publiée sous le n'WO 95/06 722 au nom de JAPAN TOBACCO.
POLYPEPTIDES CODES PAR LE GENE ISUM2A
Comme déjà décrit précédemment, le gène isum2A code pour un polypeptide possédant une longueur de 143 acides aminés, pour lequel il a pu être observé au moins deux polypeptides variants.
Le premier polypeptide variant codé par le gène isum2A possède la séquence en acides aminés SEQ ID N05 et est codé par le gène isum2A présent dans le génome du plant de maïs désigné HD5x HD7.
Le second polypeptide variant ISUM2A est codé par le gène isum2A présent dans le génome du plant de maïs désigné A188.
Les polypeptides ISUM2A de séquences SEQ ID N05 et SEQ ID N06 se différencient uniquement par la substitution d'un résidu d'acide aminé, le polypeptide de séquence SEQ ID ? 5 possédant un résidu glycine en position 89 et le polypeptide de séquence SEQ ID ? 6 ayant un résidu d'acide aminé asparagine à cette position.
<Desc/Clms Page number 54>
L'expression de l'un ou l'autre des variants polypeptidiques ISUM2A conduit dans tous les cas à l'expression d'un phénotype sauvage chez la plante, ladite plante produisant des grains matures et fertiles comprenant un embryon complètement développé.
Une recherche d'homologie dans la base de données PROSITE a permis de montrer des similarités de structure entre les polypeptides ISUM2A selon l'invention et les protéines L35 du chloroplaste.
Le polypeptide ISUM2A de séquence en acides aminés SEQ ID ? 5 possède un poids moléculaire calculé de 15112 daltons, un point isoélectrique calculé de 11, 75 et une charge à pH 7 de 28,19.
Le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID N05 possède 40 résidus d'acides aminés chargés (R, K, H, Y, C, D, E), 3 résidus d'acides aminés acides (D, E), 31 résidus d'acides aminés basiques (K, R), 31 résidus d'acides aminés polaires (N, C, Q, S, T, Y) et 55 résidus d'acides aminés hydrophobes (A, I, L, F, W, V).
Compte-tenu de la présence d'une seule substitution d'un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence SEQ ID N05, le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID ? 6 possède des caractéristiques très similaires à celles décrites ci-dessus pour le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID ? 5.
L'invention a donc encore pour objet le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID ? 5 ou SEQ ID N06 ainsi qu'un polypeptide possédant au moins 95% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N05 ou SEQ ID N'6, ou un fragment ou un variant de celui-ci.
Un fragment d'un polypeptide ISUM2A selon l'invention comprend au moins 10,15, 20,25, 30,40, 50,60, 70,80, 90,100, 120,130, 135 ou
Figure img00540001

140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquence SEQ ID N05 ou SEQ ID ? 6.
Fait également partie de l'invention, un polypeptide comprenant 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquence SEQ ID N05 ou SEQ ID ? 6.
L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 95% d'identité en acides
<Desc/Clms Page number 55>
aminés avec la séquence d'un polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID ? 5 ou SEQ ID D ? 6.
Avantageusement, fait aussi partie de l'invention un polypeptide ayant au moins 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide de séquence SEQ ID N05 ou SEQ ID N'6, ou un fragment peptidique de ce dernier.
De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
Un autre objet de l'invention consiste en un polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1,2, 3,4 ou 5 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés d'un polypeptide de séquence SEQ ID ? 5 ou SEQ ID ? 6 ou encore d'un fragment ou d'un variant de celui-ci.
Un polypeptide selon l'invention peut être obtenu par recombinaison génétique selon des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple des techniques décrites dans AUSUBEL et al.
(1989).
Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par des techniques classiques de synthèse chimique, indifféremment en solution homogène ou en phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique en solution homogène décrite par HOUBEN WEIL (1974) ou encore par la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a ; 1965b).
De préférence, les polypeptides variants d'un polypeptide selon l'invention conservent leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides de séquences SEQ ID N05 ou 6.
Un polypeptide codé par le gène Isum2A selon l'invention, tel qu'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N05 ou 6, ou encore un variant ou un fragment peptidique de ce dernier est utile notamment pour la préparation d'anticorps destinés à la détection de la présence et/ou de l'expression d'un polypeptide de séquences SEQ ID N05 ou 6 ou d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon.
<Desc/Clms Page number 56>
Outre la détection de la présence d'un polypeptide codé par le gène Isum2A ou encore d'un fragment peptidique d'un tel polypeptide dans un échantillon, des anticorps dirigés contre ces polypeptides sont utilisés pour quantifier la synthèse d'un polypeptide de séquences SEQ ID D ? 5 ou 6, par exemple dans des cellules d'une plante, et déterminer ainsi le développement de l'embryon.
Par"anticorps"au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F (ab)'2, F (ab)) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.
Des anticorps monoclaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN (1975)
La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N"4, 946,778 ou encore par MARTINEAU et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages telles que décrites par RIDDER et al. (1995) ou encore des anticorps humanisés tels que décrits par REINMANN et al. (1997) et LEGER et al. (1997). Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité d'un polypeptide de séquences SEQ ID N05 ou 6, ou d'un fragment peptidique de celui-ci, présent dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de :
<Desc/Clms Page number 57>
a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus ; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.
L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) un anticorps tel que défini ci-dessus ; b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps formé.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un variant allélique d'un acide nucléique tel que défini cidessus dans des programmes de sélection pour l'obtention de plantes à embryon modifié en taille et/ou développement influant sur le contenu en amidon et/ou en huile.
L'invention concerne aussi une méthode de sélection de plantes à embryon modifié en taille et/ou en développement comprenant les étapes de : a) génotyper des plantes (individus) au moyen de sondes ou amorces nucléotidiques obtenues à partir des acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 5 ou de variants de ces acides nucléiques ; b) sélectionner, parmi ces plantes (individus), celles qui comprennent une fréquence élevée d'allèles favorables associées à la taille et/ou au développement de l'embryon.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants :
FIGURES
La figure 1 illustre la séquence nucléotidique génomique du gène isum2A présent dans le plant de maïs désigné HD5 x HD7 référencé comme la séquence SEQ ID N01 du listage de séquences. Les trois exons du gène isum2A sont représentés sous la forme de boîtes, sous la séquence nucléotidique correspondante. Les différents sites de reconnaissance pour les endonucléases de restriction sont indiqués, au- dessus de la séquence nucléotidique correspondante.
La figure 2 illustre une séquence nucléotidique de l'ADNc du gène isum2A dans le plant de maïs désigné HD5 x HD7, cette séquence étant référencée comme la séquence SEQ ID N03 du listage de séquences
Les séquences dérivées des trois exons du gène sont représentées par des boîtes localisées sous la séquence nucléotidique correspondante.
La séquence en acides aminés déduite est représentée au- dessous des boîtes représentant les exons.
La boîte désignée RL35 domain correspond à la partie de la séquence du polypeptide ISUM2A qui est homologue avec certaines protéines du chloroplaste. Le polypeptide ISUM2A représenté sur la figure 2 est référencé comme la séquence SEQ ID ? 5 du listage de séquences.
<Desc/Clms Page number 58>
La figure 3 illustre une séquence d'ADNc partiel correspondant à l'ARN messager retrouvé dans le plant de maïs désigné A188, cette séquence nucléotidique étant référencée comme la séquence SEQ ID D ? 4 du listage de séquences.
La séquence déduite de la protéine codée par l'ADNc est représentée au-dessous de la séquence nucléotidique correspondante, et est référencée comme la séquence SEQ ID D ? 6 du listage de séquences.
Les boîtes localisées au-dessous de la séquence peptidique représentent les trois exons dérivés du gène isum2A retrouvés dans la lignée de maïs A188.
La boîte désignée RL35 domain correspond à la partie du polypeptide ISUM2A possédant une homologie avec des protéines du chloroplaste.
La figure 4 illustre la structure en exons et introns du gène isum2A, les boîtes représentant les exons du gène. La base A du codon ATG est le nucléotide en position 51 du premier exon et la base T du codon TGA d'arrêt de la traduction et le nucléotide en position 76 du troisième exon.
Les boîtes situées au-dessous de la structure du gène isum2A représentent les différents clones d'ADN génomique utilisés dans les exemples. Les boîtes situées au-dessus de la structure du gène isum2A représentent les différents clones d'ADNc utilisés dans les exemples.
La figure 5 illustre une carte du plasmide pRDP5.
La figure 6 illustre la carte du plasmide pTRE commercialisé par la Société CLONTECH LABORATORIES Inc. et dont la structure est accessible dans la base des données GENBANK sous le numéro d'accès U89931.
La figure 7 illustre la carte du plasmide pDM302 décrit par CAO et al. (1992).
La figure 8 illustre la carte du plasmide pTet-Off commercialisé par la Société CLONTECH (référence catalogue année 2000 : K1620-A).
La figure 9 illustre la carte du plasmide pRDP4.
La figure 10 illustre la carte du plasmide pTA7001 décrit par AOYAMA et al. (1997).
La figure 11 illustre la carte du plasmide pRDP2.
La figure 12 illustre la carte du plasmide pRDP3.
La figure 13 illustre le principe de fonctionnement du système d'expression Il résumé dans le tableau 3 et objet de l'exemple 2.
<Desc/Clms Page number 59>
La figure 13A illustre l'expression constitutive du polypeptide ISUM2A sous l'effet de l'activation du promoteur contenant la séquence TRE par l'activateur tTA, qui est lui-même exprimé de manière constitutive.
La figure 13B illustre la répression de la synthèse du polypeptide ISUM2A lorsque l'activateur tTA est mis en contact avec la tétracycline, qui le désactive et l'empêche d'activer le promoteur contenant la séquence TRE.
La figure 14 illustre un schéma de fonctionnement d'un système d'expression 1 résumé dans le tableau 3 et objet de l'exemple 3.
La figure 14A illustre la synthèse du polypeptide ISUM2A lorsque le promoteur contenant la séquence UAS est activé par la protéine de fusion GVG, en présence d'un glucocorticoïde.
La figure 14B illustre l'absence de production de polypeptide ISUM2A dans une situation dans laquelle la protéine de fusion GVG est produite en l'absence de glucocorticoïde et n'active pas la séquence UAS du promoteur contrôlant l'expression du gène isum2A.
EXEMPLES : EXEMPLE 1 : Clonage de la séquence génomique du gène isum2A.
A. MATERIELS ET METHODES Al. Matériel végétai
Les plantes de la lignée A188 (Gerdes et Tracy, 1993), ont été utilisées pour le"genomic walk"et l'isolement d'ARN. Les fragments d'ADN contenus dans la banque génomique criblée proviennent quant à eux de la lignée hybride HD5xHD7 (Barloy et coll., 1989). Le mutant emb*-8516 et le parent recurrent Rscm2 ont été décrits dans Heckel et coll. (1999).
A2. Culture des plantes Les plantes ont été cultivées soit en chambre climatique, avec une période d'éclairement de 16 h (100 Wm-2), une humidité relative de 80 % et une alternance 24 C/19 C (jour/nuit), soit en serre sous les mêmes conditions mais sans contrôle de l'humidité, soit en plein champ à Lyon. Toutes les plantes ont été pollinisées à la main.
<Desc/Clms Page number 60>
A3. Isolement d'ADN génomique de plante
Une jeune feuille de maïs de 10 cm de long a été prélevée, mise dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et broyée avec un pilon adapté dans de l'azote liquide. 500 pi de tampon d'extraction (Tris-HCI pH8 100 mM, EDTA
Figure img00600001

pH8 50 mM, NaCI100 mM, SDS 1 %) a été ajouté et le tube incubé 5 min à 55 C. Après deux extractions au phénol/chloroforme le surnageant a été précipité à l'aide de 50 1-11 acétate de sodium et 350 L l'isopropanol (froid) pendant 10 min à température ambiante. Le culot d'ADN a été rincé avec 1
Figure img00600002

ml éthanol 70 %, séché et repris dans 50 pl TEIO. 01 (Tris-HCI pH8 10 mM, EDTA pH8 0,1 mM) additionné de 20 ug/m ! de RNAse A.
A4. PCR sur ADN génomique
L'ADN génomique a été dilué 10 fois et 2 pl ont été utilisé dans
Figure img00600003

une réaction de 20 1-11 contenant chaque amorce 1 uM, dNTP 100 uM et 1 u Taq polymérase dans le tampon fourni avec l'enzyme (Pharmacia). La réaction a été réalisée dans un amplificateur PCR Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 2400 ou 9700 de la façon suivante : après dénaturation de l'ADN 2 min à 94 C, les échantillons ont subit 30 cycles de 30 s de dénaturation à 94 C/45 s d'hybridation à 60 C/1 min d'élongation à 72 C.
Toutes les amorces avaient des Tm entre 60 et 62 C.
A5. Clonage
L'ADN plasmidique a été préparé suivant le protocole de lyse alcaline décrit par Sambrook et coll. (1989). Les digestions d'ADN génomique, d'ADN plasmidique ou d'ADN du phage lambda par des enzymes de restriction ont été réalisées selon les conseils des fabricants (Gibco, Boehringer Mannhein, Promega). Les produits de digestion ou d'amplification par PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose dans du tampon TAE (Sambrook et coll., 1989). Les fragments de restriction ont été ligués dans le vecteur pBluescript et les produits PCR dans pGEM-T-easy, à l'aide de la T4-DNA ligase suivant les conseils du fournisseur (Promega), en utilisant 50 ng de vecteur, et un rapport molaire insert/vecteur de l'ordre de 3/1. Ces constructions ont été introduites dans
<Desc/Clms Page number 61>
la souche bactérienne DH5-a par transformation par choc thermique, selon le protocole de Hanahan (1983).
A. 6. Hybridation d'ADN
Des membranes pour hybridation d'ADN ont été obtenues soit par transfert de fragments de restriction de gels d'agarose sur des membranes Hybond N+ (Amersham) par capillarité, en présence de soude 0,4 N, soit par transfert de plages de lyse de phage lambda sur des membranes Hybond N (Amersham). Les membranes ont été préhybridées selon les conseils du fournisseur, pendant 4 à 12 h à 65 C en présence de SSPE 5 x (SSPE 20 x contient NaCI 3,6 M, phosphate de sodium 0,2 M, EDTA pH 7,7 ; 0,02 M). Puis elles ont été hybridées pendant 16 h dans les mêmes conditions. Les sondes utilisées pour l'hybridation ont été marquées radioactivement avec 50 pCi de a32P-dCTP, en utilisant le kit Ready-ToGOT'DNA labelling beads (Amersham). Après hybridation, les membranes ont subi quatre rinçages, à 65 C dans des solutions à 0, 1% de SDS et de concentrations en SSC de 2 x, 1 x, 0,5 x et 0,1 x (SSC 20 x contient NaCI3 M, Na3-citrate 0,3 M), et ont été exposées à des films pour autoradiographie (X-OMAT, Kodak).
A. 7. Criblage de banque d'ADN génomique
Une banque d'ADN génomique contenue dans le phage lambda EMBL3 SP6/T7 (Stratagene) a été étalée à la densité de 1, 5x105 plages de lyse par boîte, sur 10 boîtes, puis transférée sur membrane Hybond N selon les recommandations du fournisseur (Amersham). Après hybridation et autoradiographie, les plages de lyse donnant un signal ont été prélevées sur les boîtes et étalées à une densité moindre, ainsi deux fois de suite afin d'obtenir un clone unique par boîte, sous forme de plages isolées. Les ADN ont alors été préparés selon Sambrook et coll. (1989).
Figure img00610001
AS. /MS "amp///7cat/on of/nsef/on mutagen/sed s/tes"
L'amplification de sites mutagénisés par insertion a été obtenue selon Frey et coll. (1998). L'enzyme Tru9A (Promega) a été utilisée pour la digestion à la place de Msel. Les séquences des amorces"Mu-specific"et "Mu-nested"ont été dégénérées à des positions additionnelles. Les
<Desc/Clms Page number 62>
Figure img00620001

amorces utilisées Mu15 (SEQ ID N014) et Mu16 (SEQ ID N08) sont listées dans le tableau 4.
A. 9. "Genomic walk" Le protocole de Devic et coll. (1997) a été appliqué sans modification en utilisant les enzymes Dral, EcoRV, Pull, cal et Sspl. Les produits PCR ont été cloné dans le vecteur pGEM&commat;-T-Easy (Promega).
A. 10. RT-PCR Les ARN totaux ont été extraits de 50 mg de tissu broyé dans de l'azote liquide avec le réactif TRIZOL TM en suivant le protocole du fournisseur (Gibco). Les ARN, resuspendus dans 50 ut d'eau Versol (Aguettant), ont été dénaturés à 650C pendant 5 min et traités à la DNase 1 selon les indications du fournisseur (Promega). Ils ont ensuite été purifiés par deux extractions volume à volume au phénol/chloroforme pH 4, 5 et une précipitation à l'éthanol. 6 ug d'ARN purifiés ont été"reverse"transcrits par la MuLV reverse transcriptase (Gibco) dans un volume total de 20 ! JI comme conseillé par le fournisseur, àvec une amorce polyT à une concentration finale de 2, 5 pM. Après inactivation de la reverse transcriptase par chauffage à 95 C pendant 5 min, 2 ! JI de la réaction de transcription inverse ont été amplifiés par la Taq polymérase comme décrit ci-dessus.
A. 11. Séquençage Le séquençage a été réalisé par la société Genome Express à Grenoble (France). Les logiciels Sequencher 3. 1. 1 (Gene Codes Corporation) et DNAstar (Laser Gene) ont permis d'analyser et d'assembler les séquences obtenues.
B. RESULTATS B. 1. Clonage des séquences flanquant l'insertion de mutator dans emb*-8516
<Desc/Clms Page number 63>
a) Clonage d'une séquence flanquante
Comme décrit dans Heckel et al. (1999), un produit AIMS de 107 pb a été obtenu avec les amorces Mu16 (SEQ ID N'8) et adapMsel (SEQ ID NO 9). Ce "produit AIMS" (voir figure 4) contient 70 pb de la séquence flanquante entre les deux amorces, qui ne montre pas d'homologie significative avec les séquences référencées dans les bases de données. b) Allongement de la séquence flanquante
Pour allonger cette séquence flanquante la technique du"genomic walk" (Devic et al., 1997) a été employée sur l'ADN génomique du génotype A188. Avec les amorces "nested" GW4 (SEO ID N012) et GW4b (SEQ ID N013) et coupure par Sspl, un produit de 244 pb a été obtenu (clone L223a, Fig. 4), qui contenait 153 pb supplémentaires de la séquence flanquante.
Pour caractériser la séquence de l'autre côté de l'insertion, on a utilisé la technique de "genomic walk" avec les amorces "nested" GW3 (SEQ ID No 10) et GW3b (SEQ ID ? 11) avec coupure par Sspl. Le produit de 1532 pb (clone L223c, Fig. 4) contenait 1463 pb de séquence flanquante supplémentaire. c) Homologie de la séquence flanquante dans les bases de données
Contrairement aux séquences "produit AIMS" et du clone L223a, la séquence du clone L223c montrait une homologie dans les bases de donnée avec un EST du maïs. Deux séquences du même ADNc se trouvent dans Genebank : une séquence à partir du bout 5'dans l'accession A1001298, et une séquence à partir du bout 3'dans l'accession A1374506.
Cet EST porte le nom Isum2 sans explication de cet acronyme. L'homologie était forte mais restreinte à une petite partie de L223c.
Une réaction PCR a été effectuée sur de l'ADN génomique avec les amorces Isum2b (SEQ ID N 18) et Isum2e (SEQ ID N 20), qui sont localisées de part et d'autres de l'intron présumé. Le produit d'amplification a été cloné et séquencé. La séquence de ce clone L157a (fig. 4) a montré
<Desc/Clms Page number 64>
que la séquence présente dans le produit AIMS, dans L223a et dans une partie de L223c correspondait à un intron d'lsum2.
B. 2. Isolement d'un deuxième allèle a) Criblage d'une collection de mutants d'insertion par génétique inverse ( machine à gène ).
Une population de 25000 plantes fortement mutagénisées avec le transposon mutator a été criblée par PCR pour une insertion dans Isum2.
Les plantes ont été plantées dans 10 blocs de 50 x 50 plantes. Des pools d'ADNs des 500 lignes et 500 colonnes ont été analysés par PCR pour la présence d'une amplification avec l'amorce OMuA (SEQ ID NO 24 dans mutator) en combinaison avec une amorce dans un exon d'lsum2. Les quatre amorces Isum2b (SEQ ID N 18), Isum2c (SEQ ID N 19), Isum2k (SEQ ID N021) et 8516g (SEQ ID N023) spécifiques d'Isum2 ont été testées.
Des résultats positifs ont été obtenus avec les amorces Isum2b et Isum2k. Les plantes en question ont été identifiées et l'amplification a été confirmée sur ADN de plante individuelle. Puis leur descendance a été analysée pour distinguer des insertions somatiques (absentes dans les gamètes) des insertions germinatives (présentes dans les gamètes). De toutes les insertions seulement une a été retrouvée dans la génération suivante. Le séquençage des produits d'amplification PCR a montré qu'il s'agissait d'une insertion dans l'intron 1 d'lsum2A à 3 pb en amont de l'exon 2, retrouvée dans une plante désignée G2422.
Les grains de cette plante G2422 ont été analysés pour la présence du phénotype grains dépourvus de germe . La présence de nombreuses mutations"parasites"dans ce matériel fortement mutagénisé a rendu difficile l'évaluation d'une partie des grains. Des grains avec un phénotype grain dépourvu de germe ont été détectés. b) Manque de complémentation entre les deux allèles mutés de isum2A.
Pour prouver que le phénotype grain dépourvu de germe du mutant emb*-8516 décrit par Heckel et al. (1999) était aussi causé par
<Desc/Clms Page number 65>
l'insertion de mutator dans le gène Isum2A, une complémentation entre le mutant emb*-8516 et la descendance de la plante G2422 avec une insertion de mutator dans le même gène Isum2A a été entreprise.
16 plantes hétérozygotes +/emb*-8516 ont été pollinisées par 6 plantes hétérozygotes +/emb*-2422. Dans aucun cas, la mutation emb*- 8516 n'a été complémentée. Ceci montre que les plantes G2422 portent une mutation dans le même gène qui cause le phénotype emb du mutant emb*-8516. Comme les deux ont une insertion de mutator dans le gène
Figure img00650001

Isum2A, il est avéré que cette mutation du gène isum2A provoque le phénotype grain dépourvu de germe .
B. 3. Le gène Isum2A a) Séquences génomiques d7sum2
Pour le gène Isum2A une première séquence génomique a été obtenue par criblage d'une banque génomique de plantes du génotype HD5 x HD7 et une seconde séquence génomique a été obtenue par PCR sur des plantes du génotype A188. Les clones utilisés pour le séquençage sont présentés dans la Fig. 4.
La séquence du génotype HD5 x HD7 (Fig. 1) émane des deux sous-clones L211c1 (fragment Xhol de 9 kb) et L211 c2 (fragment Xhol de 6 kb).
La séquence du génotype A188 (Fig. 2) provient des clones L157a (PCR avec les amorces Isum2b (SEO ID N018) et Isum2e (SEQ ID N020)), L223a (genomic walk, voir ci-dessus) et L223c (genomic walk, voir cidessus). b) Séquences ADNc
La séquence ADNc partiel du génotype A188 (SEQ ID N 4, fig. 3) provient des clones L158a et L254 (fig. 4). Le premier a été obtenu par RTPCR sur embryons de 12 JAP avec les amorces Isum2b (SEQ ID N 18) et Isum 2c (SEQ ID N019), le deuxième par RT-PCR sur albumen de 7JAP avec les amorces Isum2a (SEQ ID N 17) et isum2l (SEQ ID N 22).
La séquence ADNc du génotype HD5 x HD7 (SEQ ID N03, fig. 2) a été obtenue à partir de la séquence génomique (SEO ID N01) en utilisant
<Desc/Clms Page number 66>
l'EST Isum2 (ci-dessus) pour déterminer la limite 5'du premier exon et la limite 3'du dernier exon.
Le Tableau 4 ci-dessous détaille les différentes amorces utilisées dans cet exemple.
Tableau 4 :
Amorces utilisées
Figure img00660001

1 1 1
Figure img00660002
<tb>
<tb> Nom <SEP> Séquence <SEP> 5'vers <SEP> 3'SEQ <SEP> ID <SEP> Utilisation
<tb> AT
<tb> Mu16 <SEP> TCYATAATGGCAATTATCTC <SEP> 8 <SEP> produit <SEP> AIMS
<tb> adapMseI <SEP> GATGAGTCCTGAGTAAN <SEP> 9 <SEP> produit <SEP> AIMS
<tb> GW3 <SEP> GAAACTGGAAAGGCGAAATGGAGGGACG <SEP> 10 <SEP> L223c
<tb> GW3b <SEP> GCTCGATAGGTTTATTGTGATAACGTTGCTGG <SEP> 11 <SEP> L223c
<tb> GW4 <SEP> GTCCCTCCATTTCGCCTTTCCAGTTTCC <SEP> 12 <SEP> L223a,
<tb> GW4b <SEP> CCAGCAACGTTATCACAATAAACCTATCGAGC <SEP> 13 <SEP> L223a
<tb> Mu <SEP> 15 <SEP> GAGAAGCCAACGCCAWCGCCTCYATTTCGTC <SEP> 14 <SEP> produit <SEP> AIMS
<tb> APQ <SEP> GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGC <SEP> 15 <SEP> tout <SEP> "genomic <SEP> walk"
<tb> AP2 <SEP> CTATAGGGCTCGAGCGGC <SEP> 16 <SEP> tout <SEP> "genomic <SEP> wa1k"
<tb> Isum2a <SEP> CTACCCGCAGCCAGCCTCGCATTCC <SEP> 17 <SEP> L254
<tb> Isum2b <SEP> GGCGGGGAAGAAGGGCTACAAGATGAAGAC <SEP> 18 <SEP> MAG, <SEP> L158al, <SEP> L157a
<tb> Isum2c <SEP> IGCCAAGAAGAACACCAAGCGCAAGAAGAG <SEP> 19 <SEP> MAG <SEP> a
<tb> Isum2e <SEP> CGATCTGCTGGCCATATCCTAAGAG <SEP> 20 <SEP> L158A1, <SEP> L157a
<tb> Isum2k <SEP> CATCTTCGAGAGCCTCTTCTTGCG <SEP> 21 <SEP> MAG
<tb> Isum21 <SEP> CTTCATCTTGTAGCCCTTCTTCCCCG <SEP> 22 <SEP> L254
<tb> 8516g <SEP> GCACCCGTAACATTGTCGTAGTC <SEP> 23 <SEP> MAG
<tb> OMuA <SEP> CTTCGTCCATAATGGCAATTATCTC <SEP> 24 <SEP> MAG
<tb>
Figure img00660003

EMAG signifie"Machine à genes".
<Desc/Clms Page number 67>
Figure img00670001
EXEMPLE 2 : Construction d'un vecteur comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur inductible du type represseur.
Le système d'expression décrit dans cet exemple constitue une illustration du système d'expression Il résumé dans le tableau 3 et dont le principe de fonctionnement général est détaillé dans la description.
Ce système d'expression implique la construction de deux vecteurs, respectivement : (i) le vecteur pRDP5, qui contient le gène isum2A placé sous le contrôle de la séquence TRE reconnue par l'activateur tTA ; et (ii) le vecteur pRDP4, qui contient le gène de l'activateur tTA, actif en absence de tétracycline, placé sous le contrôle du promoteur actinel du riz, qui est un promoteur fort et constitutif chez les monocotylédones.
1. Construction du vecteur pRDP5 Le vecteur pTRE, commercialisé par la Société CLONTECH Laboratories Inc., et qui est également décrit dans la base de données GENBANk sous le numéro d'accès U89931, est utilisé comme vecteur de départ (fig. 6). Le vecteur pTRE est clivé par l'endonucléase de restriction BamHI, au niveau des nucléotides 471 et 483 du vecteur, le fragment d'ADN localisé entre les deux sites BamHI précités étant alors excisé.
Après clivage et excision, on réalise un remplissage des bouts cohésifs à l'aide de la polymérase de Klenow.
On réalise ensuite une amplification du gène isum2A décrit à l'exemple 1, plus spécifiquement de la région génomique allant du codon ATG à la fin du cadre de lecture et comprenant également une séquence terminateur, par amplification PCR.
Puis, le produit d'amplification du gène isum2A est ligaturé dans le vecteur pTRE ouvert afin de construire le vecteur pRDP5 illustré à la figure 5.
Dans le vecteur pRDP5, le gène isum2A est placé sous le contrôle du promoteur prTRE, qui est reconnu par l'activateur tTA.
<Desc/Clms Page number 68>
2) Construction du vecteur pRDP4
Le vecteur pRDP4 contient le gène de l'activateur tTA sous le contrôle du promoteur actinel du riz.
Le vecteur de départ est le plasmide pDM302 qui a été décrit par CAO et al. (1992) et qui est illustré sur la figure 7.
Le plasmide pDM302 est digéré avec l'endonucléase de restriction Smal.
Puis, on utilise le vecteur pTet-Off commercialisé par la Société CLONTECH Laboratories Inc. (référence catalogue n K 1620-A, année 2000), et qui est illustré sur la figure 8, pour amplifier la séquence du gène tTA par PCR.
Puis, le produit d'amplification du gène tTA est ligaturé au niveau du site Smal ouvert du plasmide pDM302 afin de construire le plasmide pRDP4 illustré à la figure 9.
Le plasmide pRDP4 comprend le gène tTA sous le contrôle du promoteur actinel du riz.
Un schéma de fonctionnement du système d'expression inductible décrit dans le présent exemple est représenté sur la figure 13, soit en l'absence de tétracycline (figure 13A), soit en présence de tétracycline (fig. 13B).
Un résumé des caractéristiques des différents vecteurs utilisés ou préparés selon l'exemple 2 est présenté dans les tableaux 5 à 8 ci-après.
<Desc/Clms Page number 69>
TABLEAU 5
Positions des éléments caractéristiques du plasmide pDM302 (unité : kilo base) , 1 1 1
Figure img00690001
<tb>
<tb> vecteur <SEP> pSP72 <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 04
<tb> promoteur <SEP> acini <SEP> 0, <SEP> 041, <SEP> 43
<tb> polylinker <SEP> 1, <SEP> 43 <SEP> 1, <SEP> 46
<tb> Smal <SEP> 1, <SEP> 46 <SEP> 1, <SEP> 47
<tb> résistance <SEP> Basta <SEP> 1, <SEP> 47 <SEP> 2, <SEP> 03
<tb> Smal <SEP> 2, <SEP> 03 <SEP> 2, <SEP> 04
<tb> polylinker <SEP> 2, <SEP> 03 <SEP> 2, <SEP> 08
<tb> terminateur <SEP> nos <SEP> 2, <SEP> 08 <SEP> 2, <SEP> 34
<tb> vecteur <SEP> pSP72 <SEP> 2,34 <SEP> 4,74
<tb>
TABLEAU 6 Positions des éléments caractéristiques du plasmide pRDP4 (unité : kilobasel
Figure img00690002
<tb>
<tb> vecteur <SEP> pSP72 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 04
<tb> promoteur <SEP> actin1 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP> 1, <SEP> 43
<tb> polylinker <SEP> 1, <SEP> 43 <SEP> 1, <SEP> 46
<tb> tTA <SEP> 1, <SEP> 47 <SEP> 2, <SEP> 47
<tb> polylinker <SEP> 2, <SEP> 47 <SEP> 2, <SEP> 52
<tb> terminateur <SEP> nos <SEP> 2, <SEP> 52 <SEP> 2, <SEP> 78
<tb> vecteur <SEP> pSP72 <SEP> 2, <SEP> 78 <SEP> 5, <SEP> 18
<tb>
<Desc/Clms Page number 70>
TABLEAU 7 Positions des éléments caractéristiques du
Figure img00700001

plasmide pTRE2 (unité : kilo base) j
Figure img00700002
<tb>
<tb> promoteur <SEP> avec <SEP> TRE <SEP> 0,00 <SEP> 0, <SEP> 44
<tb> polylinker <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 0,49
<tb> terminateur <SEP> SV40 <SEP> 0,49 <SEP> 0,95
<tb> vecteur <SEP> oUC <SEP> 0. <SEP> 95 <SEP> 3. <SEP> 10
<tb>
Figure img00700003

TABLEAU 8 Positions des éléments caractéristiques du plasmide pRDP5 (unité : kilobase)
Figure img00700004

1 1 1 1
Figure img00700005
<tb>
<tb> promoteur <SEP> avec <SEP> TRE <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 44
<tb> polylinker <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 0,49
<tb> ! <SEP> sum2A <SEP> (ATG <SEP> à <SEP> terminateur) <SEP> 0,49 <SEP> 2,73
<tb> terminateur <SEP> SV40 <SEP> 2, <SEP> 73 <SEP> 3, <SEP> 19
<tb> vecteur <SEP> pUC <SEP> 3, <SEP> 19 <SEP> 5, <SEP> 34
<tb>
EXEMPLE 3.
Construction d'un vecteur comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur du type activateur inductible.
Le système d'expression selon l'exemple 3 constitue une illustration du système d'expression 1 résumé dans le tableau 3, et qui est commenté dans la description.
Le système d'expression selon l'exemple 3 comprend deux cassettes d'expression, respectivement : (i) une cassette d'expression comprenant le gène isum2A placé sous le contrôle d'un promoteur contenant la séquence UAS reconnue par l'activateur GVG ; et
<Desc/Clms Page number 71>
(ii) une cassette d'expression codant pour l'activateur GVG, placé sous le contrôle du promoteur actinel du riz, qui est un promoteur fort et constitutif chez les monocotylédones.
1. Construction du vecteur pRDP2
Le vecteur de départ est le plasmide pTA7001 décrit par AOYAMA et al. (1997) et qui est représenté sur la figure 10.
Le vecteur pTA7001 est soumis à une digestion par les enzymes Sse83871 et Pmel afin d'exciser le promoteur 35S du virus de la mosaïque du choufleur.
Après digestion, on remplit des bouts cohésifs à l'aide de la polymérase de Klenow.
Puis, on amplifie le promoteur actinel du riz par PCR, à partir du plasmide pDM302 illustré à la figure 7.
Puis, le produit d'amplification du promoteur actinel du riz est ligaturé dans le vecteur pTA7001 préalablement digéré, pour construire le plasmide pRDP2 illustré à la figure 11.
2. Construction du vecteur pRDP3
Le vecteur de départ est le vecteur pRDP2 construit selon le protocole ci-dessus.
Le vecteur pRDP2 est d'abord soumis à une digestion à l'aide des endonucléases de restriction Xhol et Spel.
Après digestion, on remplit des bouts cohésifs à l'aide de la polymérase de Klenow.
Puis, on amplifie la région codante du gène isum2A par PCR.
Enfin, le produit d'amplification du gène isum2A est ligaturé dans le vecteur pRDP2 ouvert afin de construire le vecteur pRDP3 illustré à la figure 12.
Le vecteur pRDP3 contient deux cassettes d'expression, respectivement : (i) une cassette d'expression contenant le gène isum2A placé sous le contrôle de la séquence UAS reconnue par l'activateur GVG ; et
<Desc/Clms Page number 72>
(ii) une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour l'activateur GVG placé sous le contrôle du promoteur constitutif de l'actine 1 du riz.
Le gène GVG code pour une protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de la protéine GAL4, le domaine activateur du gène VP16 et le récepteur au glucocorticoïde du rat (GR).
Un schéma du fonctionnement du système d'expression inductible décrit dans le présent exemple est représenté sur la figure 14, soit en présence de glucocorticoïde (figure 14A), soit en l'absence de glucocorticoïde (figure 14B).
Lorsque l'on met en oeuvre le système d'expression selon l'exemple 3, en présence du signal inducteur activateur constitué par une hormone de glucocorticoïde, le facteur de transcription hybride GVG est transporté dans le noyau et active fortement tous les promoteurs contenant la séquence UAS (figure 14B).
Les tableaux 9 à 11 ci-après présentent un résumé des caractéristiques principales des différents vecteurs utilisés ou préparés selon l'exemple 3.
<Desc/Clms Page number 73>
TABLEAU 9 Positions des éléments caractéristiques du plasmide pTA7001
Figure img00730001
<tb>
<tb> bordure <SEP> droite0, <SEP> 000, <SEP> 03
<tb> Sse83871 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 05
<tb> promoteur <SEP> 35S <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 86
<tb> Pmel <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 87
<tb> GVG <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 2, <SEP> 18
<tb> terminateur <SEP> E9 <SEP> 2, <SEP> 21 <SEP> 2, <SEP> 76
<tb> promoteur <SEP> Nos <SEP> 2, <SEP> 78 <SEP> 3, <SEP> 11
<tb> résistance <SEP> à <SEP> l'hygromycine <SEP> 3, <SEP> 12 <SEP> 4, <SEP> 15
<tb> terminateur <SEP> Nos <SEP> 4, <SEP> 15 <SEP> 4, <SEP> 40
<tb> terminateur <SEP> 3A <SEP> 4, <SEP> 89 <SEP> 4, <SEP> 42
<tb> Spel <SEP> 4, <SEP> 89 <SEP> 4, <SEP> 89
<tb> Xhol <SEP> 4, <SEP> 94 <SEP> 4, <SEP> 94
<tb> TATA <SEP> minimal <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> 4, <SEP> 94
<tb> 6 <SEP> x <SEP> GAL4 <SEP> UAS <SEP> 5, <SEP> 20 <SEP> 5, <SEP> 00
<tb> bordure <SEP> gauche <SEP> 5,84 <SEP> 5,86
<tb> pBI101 <SEP> 5, <SEP> 20 <SEP> 0, <SEP> 04
<tb>
<Desc/Clms Page number 74>
TABLEAU 10 Positions des éléments caractéristiques du plasmide pRDP2
Figure img00740001

1 1 1 1
Figure img00740002
<tb>
<tb> bordure <SEP> droite <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0,03
<tb> promoteur <SEP> actine1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 1,28
<tb> GVG <SEP> 1, <SEP> 28 <SEP> 2,60
<tb> terminateur <SEP> E9 <SEP> 2, <SEP> 62 <SEP> 3,18
<tb> promoteur <SEP> Nos <SEP> 3, <SEP> 20 <SEP> 3,53
<tb> résistance <SEP> à <SEP> l'hygromycine <SEP> 3, <SEP> 54 <SEP> 4,56
<tb> terminateur <SEP> Nos <SEP> 4, <SEP> 56 <SEP> 4,81
<tb> terminateur <SEP> 3A <SEP> 5, <SEP> 31 <SEP> 4,84
<tb> Spel <SEP> 5, <SEP> 31 <SEP> 5,31
<tb> Xhol <SEP> 5, <SEP> 36 <SEP> 5,36
<tb> TATA <SEP> minimal <SEP> 5,41 <SEP> 5,36
<tb> 6 <SEP> x <SEP> GAL4 <SEP> UAS <SEP> 5,61 <SEP> 5,41
<tb> bordure <SEP> gauche <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 6,28
<tb> pBI101 <SEP> 5, <SEP> 61 <SEP> 0,04
<tb>
<Desc/Clms Page number 75>
Tableau 11 Positions des éléments caractéristiques du plasmide pRDP3
Figure img00750001
<tb>
<tb> bordure <SEP> droite <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0,03
<tb> promoteur <SEP> actine1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 1,28
<tb> GVG <SEP> 1, <SEP> 28 <SEP> 2,60
<tb> terminateur <SEP> E9 <SEP> 2, <SEP> 62 <SEP> 3,18
<tb> promoteur <SEP> Nos <SEP> 3, <SEP> 20 <SEP> 3,53
<tb> résistance <SEP> à <SEP> l'hygromycine <SEP> 3,54 <SEP> 4,56
<tb> terminateur <SEP> Nos <SEP> 4, <SEP> 56 <SEP> 4,81
<tb> terminateur <SEP> 3A <SEP> 5, <SEP> 31 <SEP> 4,84
<tb> Isum2A <SEP> 7, <SEP> 18 <SEP> 5,31
<tb> TATA <SEP> minimal <SEP> 7,23 <SEP> 7,18
<tb> 6 <SEP> x <SEP> GAL4 <SEP> UAS <SEP> 7, <SEP> 44 <SEP> 7,23
<tb> bordure <SEP> gauche <SEP> 8, <SEP> 08 <SEP> 8,10
<tb> pBI101 <SEP> 7, <SEP> 44 <SEP> 0,04
<tb>
Figure img00750002

EXEMPLE 4 : Obtention de plantes transformées par un acide nucléique comprenant un polynucléotide permettant la production d'un polypeptide ISUM2A.
La transformation d'une plante dans le but d'obtenir une expression stable du polynucléotide d'intérêt dans la plante transformée est nécessaire pour assurer une modification durable du grain de maïs. Des essais sont réalisés avec une construction de vecteurs décrits dans les exemples 2 et 3.
4-1 CANON A PARTICULES La méthode utilisée repose sur l'utilisation d'un canon à particules identique à celui décrit par FINER (1992).
<Desc/Clms Page number 76>
Les cellules cibles sont des cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières.
Ce type de cellules compose le cal embryogène (dit de type i) de maïs.
*Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hill selon la méthode et sur les milieux décrits par ARMSTRONG (1994) MAIZE HANDBOOK ; 1994, M. FREELING, V. WALBOT EDS. ; PP 665-671. Des fragments de tels cals d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte au centre d'une boîte de Pétri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides décrits dans les exemples précédents et portant les gènes à introduire, sont purifiés sur colonne QiagenR en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le protocole décrit par KLEIN (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. FINER (1992). Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de Scellofrais'puis cultivées à l'obscurité à 27 C.
Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélectif, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, multipliés puis cultivés de façon à régénérer des plantules, en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par VAIN et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées pour l'obtention d'hybrides ou autofécondées.
5.2 Transformation par Agrobacterium
Une autre technique de transformation utilisable dans le cadre de l'invention utilise Agrobacterium tumefaciens, selon le protocole décrit par
<Desc/Clms Page number 77>
ISHIDA et al. (1996), notamment à partir d'embryons immatures de 10 jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la référence citée. La transformation débute avec une phase de c-culture où les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact pendant au moins 5 min avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADNT contenant le gène d'intérêt et/ou le marqueur de sélection dérivé des plasmides décrits dans les exemples précédents, et le vecteur pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) qui contient : les gènes virB et virG du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281 d'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette recombinaison homologue. Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25 C. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés : les cals embryogènes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg/l et de la céfotaxime à 250 mg/l (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium tumefaciens). Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25 C. La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSD5, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/1) en présence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type 1 qui restent blancs (fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 250C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime.
La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type 1 qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/l et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22 C et sous lumière continue.
Les plantes ayant régénéré sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100 mg/l d'Augmentin pendant 2 semaines à 22 C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.
<Desc/Clms Page number 78>
TABLEAU 12
Figure img00780001
<tb>
<tb> SEQUENCES <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> ? <SEP> Description
<tb> 1 <SEP> Acide <SEP> nucléique <SEP> génomique <SEP> HD5XHD7
<tb> 2 <SEP> Acide <SEP> nucléique <SEP> génomique <SEP> A188
<tb> 3 <SEP> ADNc <SEP> de <SEP> HD5 <SEP> x <SEP> HD7
<tb> 4 <SEP> ADNc <SEP> de <SEP> A188
<tb> 5 <SEP> Polypeptide <SEP> ISUM2A <SEP> de <SEP> HD5 <SEP> x <SEP> HD7
<tb> 6 <SEP> Polypeptide <SEP> SUM2A <SEP> de <SEP> A188
<tb> 7 <SEP> Séquence <SEP> insertion <SEP> G2422
<tb> 8 <SEP> Amorce <SEP> Mu16
<tb> 9 <SEP> Amorce <SEP> adap <SEP> Msel
<tb> 10 <SEP> Amorce <SEP> GW3
<tb> 11 <SEP> Amorce <SEP> GW3b
<tb> 12 <SEP> Amorce <SEP> GW4
<tb> 13 <SEP> Amorce <SEP> GW4b
<tb> 14 <SEP> Amorce <SEP> Mu15
<tb> 15 <SEP> Amorce <SEP> AP1
<tb> 16 <SEP> Amorce <SEP> AP2
<tb> 17 <SEP> Amorce <SEP> Isum2a
<tb> 18 <SEP> Amorce <SEP> Isum2b
<tb> 19 <SEP> Amorce <SEP> Isum2c
<tb> 20 <SEP> Amorce <SEP> Isum2e
<tb> 21 <SEP> Amorce <SEP> Isum2k
<tb> 22 <SEP> Amorce <SEP> Isum2l
<tb> 23 <SEP> Amorce <SEP> 8516g
<tb> 24 <SEP> Amorce <SEP> OMuA
<tb>
<Desc/Clms Page number 79>
Figure img00790001

REFERENCES.
. AN et al. 1986, Plant Physiol., 81 : 86-91. . AOYAMA, T., AND CHUA, N-H. (1997) A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. Plant J. 11 : 605-612 AOYAMA T et al., (1997) The Plant Journal, vol. 11 (3) : 605-612.
. AUSUBEL FM, BRENT R, KINGSTON RE, MOORE DD, SEIDMAN JG,
SMITH JA, STRUHL K Editors, Current prorocols in Molecular Biology,
Wiley Interscience. (1994).
AUSUBEL et T al., 1989. Current Protocols in Molecular Biology, Green
Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.
. BARLOY D, DENIS L, BECKERT M (1989) Comparison of the aptitude for anther culture in some androgenetic doubled haploid maize lines.
Maydica 34 : 303-308 . BERBAL, 1984.
BROWN et al. (1979), Methods Enzymol., 68 : 109-151.
. BEAUCAGE et al. (1981), Tetrahedron Lett., 22 : 1859-1862.
BECHTOLD et al. 1993, Comptes-Rendus de l'Académie des Sciences
Série III Sciences de la Vie. 316 : 10,1194-1199.
. BEVAN et al., Nucleic Acids Research, vol. 12 : 8711-8721.
BOUCHEZ D., Comptes Rendus de l'Académie des Sciences Série H)
Sciences de la Vie, 1993 316 : 10,1188-1193
Figure img00790002

.
CARRINGTON ET FREED. J. VIROL. (1990), 64 (4) : 1590-1597 . CHUPEAU et al. Biotechnology (1989), 7 (5) : 503-508 . CAO et al., (1992), Plant cell reports, vol. 11 (11) : 586-591.
Figure img00790003
DEPICKER et al., 1992 [A COMPLETER, S. V. P.] .
DEVIC M, ALBERT S, DELSENY M, ROSCOE TJ (1997) Efficient PCR walking on plant genomic DNA. Plant Physiol Biochem 35 : 331-339 ELROY-STEIN et al. PNAS USA (1989), 86 : 6126-6130.
. FRANCK ET AL. (1980), Cell, 21 : 285-294 . FREY M, STETTNER C, GIERL A (1998). A general method for gene isolation in tagging approaches : amplification of insertion mutagenised sites (AIMS). Plant J 13 : 717-721
<Desc/Clms Page number 80>
# FROMM M. et al. (1990), Biotechnology, 8 : 833-839 . FIN ER J. (1992) Plant Cell Report, 11 : 323-328.
. GORLACH J, VOLRATH S, KNAUF-BEITER G, HENGY G,
BECKHOVE U, KOGEL KH, OOSTENDORP M, STAUB T, WARD E,
KESSMANN H, RYALS J. (1996) Benzothiadiazole, a novel class of inducers of systemic acquired resistance, activates gene expression and disease resistance in wheat. Plant Cell 8 : 629-43 GAIT (ed.), (1984). Nucleic Acid Hybridization.
GLOVER (ed.), 1985. DNA Cloning : A Practical Approach, Volumes 1 and Il Oligonucleotide Synthesis, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K.
# GALLIE et al. Molecular Biology of RNA (1989), 237-256.
GERDES JT, Tracy WF (1993). Pedigree diversity within the Lancaster surecrop heterotic group of maize. Crop Sci 33 : 334-337 # GUERCHE ET AL. (1987), Mol. Gen. Genet., 206 : 382 # HANAHAN D (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol 166 : 557-580.
. HECKEL T, WERNER K, SHERIDAN WF, DUMAS C, ROGOWSKY PM (1999) Novel phenotypes and developmental arrest in early embryo specific (emb) mutations of maize. Planta, 210 : 1-8.
* HAMES and HIGGINS, 1985. Nucleic Acid Hybridization : a practical approach, Hames & Higgins Ed. IRL Press, Oxford.
. HAJDUKIEWICZ, P. SVAB. Z. AND MALIGA P. Plant Mol. Biol. 25 (6),
989-994 (1994).
* HORSCH R. B. Commercialization of genetically engineered crops. The production and uses of genetically transformed plants. Chapman 1 Hall
LTD. London UK 19947,99-103.
. HECKEL T et al., 1999, Planta, vol. 210 : 1-8 . HOU BEN WEIL, (1974). tn Methode der Organischen Chemie, E. Wunsh ed., volume 15-1 et 15-11, Thieme, Stuttgart.
ISHIDA ET AL. (1996), Nature Biotechnology, vol. 14 : 745-750.
* JEFFERSON, 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5 : 387-405.
* JOBLING et al. Nature (1987), 325 : 622-625.
* KADDICK MX et al., (1998), Nature Biotechnology, vol. 16 : 177-180.
<Desc/Clms Page number 81>
. KOZBOR et al., (1983), Hybridoma, vol. 2 (1) : 7-16.
. KOHLER G and MILSTEIN C ;, (1975), Nature, volume 256 : 495 # KOOTER, JM., MATZKE, MA., AND MEYER, P. (1999) Listening to the silent genes : transgene silencing, gene regulation and pathogen control.
Trends Plant Sei. 4,430-437 # LEGER OJ et al., (1997), Hum Antibodies, vol. 8 (1) : 3-16 . McCARTY, DR., CARSON, CB., STINARD, PS., AND ROBERTSON,
DS. (1989) Molecular analysis of viviparous-1 : an abscisic acid- insensitive mutant of maize. Plant Cell, 1 : 523-532 . MACEJACK et al. Nature (1991), 353 : 90-94 Molina A, Hunt MD, Ryals JA (1998) Impaired fungicide activity in plants blocked in disease resistance signal transduction. Plant Cell
10 : 1903-14 Martinez, A., Sparks, C., Hart, CA., tompson, J., and Jepson, 1. (1999)
Ecdysone agonist inducible transcription in transgenic tobacco plants.
Plant J. 19 : 97-106 # McNELLIS T W, 1998, The Plant Journal, vol. 14 (2) : 247-257 # MERRIFIELD RB, (1965a), Nature, vol. 207 (996) : 522-523 # MERRIFIELD RB, (1965b), Science, vol. 150 (693) : 178-185 # MARTINEAU P et al., (1998), J. Mol. Biol. vol. 280 (l) : 117-127.
. NARANG et al. (1979), Methods Enzymol., 68 : 90-98.
'NEUHAUS ET COLL. Theoretical and Applied Genet. (1987), 75 (1) :
30-36 # RIDDER R. et al., (1995), Biotechnology (NY), vol. 13 (3) : 255-260.
. REINMANN KA et al. (1997), Aids Res. Hum retroviruses, vol. 13 (11) : 933-943.
. SAMBROOK, J. FRITSCH, E. F., and T. Maniatis, 1989. Molecular cloning : a laboratory manual. 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New York.
* SANCHEZ PESCADOR, (1988), J. Clin. Microbiol., 26 (10) : 1934-1938.
. SALTER MG et aL, 1998, vol. 16 (1) : 127-132 # SCHOCHER ET COLL. Biotechnology (1986), 4 : 1093-1096 . URDEA et al. (1988), Nucleic Acids Research, 11 : 4937-4957.
URDEA et al. (1991), Nucleic Acids Research, 24 : 197-200.
<Desc/Clms Page number 82>
. VAIN P et al., (1989), Plant Cell Tissue and Organ Culture, 18 : 143-
151.
. WATSON et al. (1994) . WASSENEGGER, M., AND PÉLISSIER, T. (1998) A model for RNA- mediated gene silencing in higher plants Plant Mol. Biol. 37,349-362 # YANG F. MOSS LG, PHILIPS GN JR. Nat. Biotechnol. 1996 Oct.
14 (10) : 1246-51.
. YANG TT, CHENG L. KAIN SR, Nucleic acids Res. 1996, Novembre
15 ; 24 (22) : 4592-3.

Claims (41)

Revendications
1. Acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID ? 5 et SEQ ID NO 6, ou pour un fragment d'un polypeptide ISUM2-A, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N01, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N'2, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
4. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 99% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N'3, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
5. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 99% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N04, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
6. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide régulateur capable de réguler la transcription ou la traduction du polynucléotide codant pour le polypeptide
<Desc/Clms Page number 84>
ISUM2A, ou le fragment de ce polypeptide, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur permet la surexpression du polypeptide ISUM2A ou du fragment de ce polypeptide dans un organisme hôte.
8. Acide nucléique selon l'une des revendications 6 ou 7 caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur est sensible à l'action d'un signal inducteur.
9. Acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur est un polynucléotide répresseur inductible de la transcription ou de la traduction.
10. Acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur est un polynucléotide activateur inductible de la transcription ou de la traduction.
11. Acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce que le polynucléotide activateur inductible est un polynucléotide codant l'activateur GVG, placé sous le contrôle du promoteur du gène de l'actin 1 du riz.
12. Acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce hybridant spécifiquement avec un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'une des revendications
1 à 5, ou un acide de séquence complémentaire.
13. Acide nucléique selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences SEQ ID NO 10 à 13 et 17 à 23.
<Desc/Clms Page number 85>
14. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 12 ou 13 pour détecter la présence d'un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A dans un échantillon.
15. Vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13.
16. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'un des revendications 1 à 13 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 15.
17. Cellule hôte selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de plante.
18. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13, d'un vecteur recombinant selon la revendication 15 ou d'une cellule hôte transformée selon l'une des revendications 16 ou 17 pour fabriquer une plante transformée capable de produire des graines à développement affecté du germe.
19. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 6 ou 7, d'un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique ou d'une cellule hôte recombinante transfectée ou transformée avec cet acide nucléique pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines riches en huile.
20 Plante transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 15.
21. Plante transformée comprenant une pluralité de cellules hôtes selon la revendication 17.
22. Plante transformée selon l'une des revendications 20 ou 21, caractérisée en ce qu'elle dérive d'une plante dont les deux copies du gène Isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut
<Desc/Clms Page number 86>
dans la production d'un polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID ? 5 ou 6.
23. Procédé pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines à développement du germe affecté, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transformation d'au moins une cellule végétale par un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10 ; ou par un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10 ; b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant intégré dans leur génome au moins une copie d'un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10. c) Régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b) ;
24. Procédé selon la revendication 23 dans lequel au moins une cellule végétale est transformée à l'étape a) par Agrobacterium tumefaciens contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10 ou un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10.
25. Plante transformée, telle qu'obtenue par le procédé selon l'une des revendications 23 ou 24
26. Plante transgénique hybride obtenue par le croisement d'une plante selon la revendication 25.
27. Partie d'une plante transformée selon l'une des revendications 25 ou 26.
28. Procédé pour l'obtention de grains de plantes à développement affecté du germe, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
<Desc/Clms Page number 87>
a) cultiver, jusqu'à la pollinisation, une plante dont les deux copies du gène Isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit un acide nucléique selon la revendication 9 ; en l'absence du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible. b) mettre en contact la plante transformée définie en a) avec le signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible, pendant une période allant du début de la pollinisation jusqu'à la fin de la formation des grains ; c) récupérer les grains matures, caractérisés en ce qu'ils sont affectés dans le développement du germe.
29. Procédé pour l'obtention de grains de plantes à développement affecté du germe caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) Cultiver, jusqu'à la pollinisation, une plante dont les deux copies du gène Isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit un acide nucléique selon la revendication 10 ; en présence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est sensible. b) poursuivre la culture de la plante transformée définie en a) en l'absence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est sensible, à partir de la période suivant la pollinisation. c) récupérer les grains mâtures, caractérisés en ce qu'ils sont affectés dans le développement du germe.
30. Semence affectée dans le développement du germe telle qu'obtenue par le procédé selon l'une des revendications 28 ou 29.
31. Semence affectée dans le développement du germe caractérisée en ce que chacune de ses cellules constitutives comprennent, sous une forme artificiellement intégrée dans leur génome, un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10.
<Desc/Clms Page number 88>
32. Produit de transformation d'une semence selon l'une des revendications 30 ou 31.
33. Produit de transformation selon la revendication 32 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un amidon.
34. Produit de transformation selon la revendication 32, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une farine de semence ou d'une huile.
35. Polypeptide ISUM2A, ou fragment de ce polypeptide, codé par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10.
36. Polypeptide selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il possède au moins 95% d'identité en acides aminés avec l'une des
Figure img00880001
séquences SEQ ID No 5 et SEQ ID No 6.
37. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36.
38. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36 dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps selon la revendication 37 ; b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
39. Nécessaire ou kit pour la détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36 dans un échantillon, comprenant : a) un anticorps selon la revendication 37 ; b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps.
40. Utilisation d'un acide nucléique ou d'un variant allélique d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 dans des programmes
<Desc/Clms Page number 89>
de sélection pour l'obtention de plantes à embryon modifié en taille et/ou développement influant sur le contenu en amidon et/ou en huile.
41. Méthode de sélection de plantes à embryon modifié en taille et/ou en développement comprenant les étapes de : a) génotyper des plantes (individus) au moyen de sondes ou amorces nucléotidiques obtenues à partir des acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 5 ou de variants de ces acides nucléiques ; b) sélectionner, parmi ces plantes (individus), celles qui comprennent une fréquence élevée d'allèles favorables associées à la taille et/ou au développement de l'embryon.
FR0109631A 2001-07-18 2001-07-18 Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe Expired - Fee Related FR2827613B1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0109631A FR2827613B1 (fr) 2001-07-18 2001-07-18 Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe
PCT/FR2002/002553 WO2003008585A2 (fr) 2001-07-18 2002-07-17 Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe
EP02760388A EP1412500A2 (fr) 2001-07-18 2002-07-17 Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe
CA002454119A CA2454119A1 (fr) 2001-07-18 2002-07-17 Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe
US10/759,548 US20050086716A1 (en) 2001-07-18 2004-01-16 Nucleic acids coding for a ISUM2A polypeptide and use of said nucleic acids to obtain transformed plants producing seeds altered in germ development

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0109631A FR2827613B1 (fr) 2001-07-18 2001-07-18 Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FR2827613A1 true FR2827613A1 (fr) 2003-01-24
FR2827613B1 FR2827613B1 (fr) 2004-11-26

Family

ID=8865681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FR0109631A Expired - Fee Related FR2827613B1 (fr) 2001-07-18 2001-07-18 Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1412500A2 (fr)
CA (1) CA2454119A1 (fr)
FR (1) FR2827613B1 (fr)
WO (1) WO2003008585A2 (fr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100199369A1 (en) * 2005-12-16 2010-08-05 Sakai Hajime Alteration of Plant Embryo/Endosperm Size During Seed Development
FR2919465B1 (fr) * 2007-07-31 2009-10-30 Biogemma Soc Par Actions Simpl Mais presentant une digestibilite amelioree
FR2923985B1 (fr) * 2007-11-22 2010-01-08 Biogemma Fr Mais presentant une tolerance accrue aux maladies fongiques.

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000012732A2 (fr) * 1998-08-28 2000-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sequences de ciblage d'organelle

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000012732A2 (fr) * 1998-08-28 2000-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sequences de ciblage d'organelle

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EM_EST EBI Hinxton, UK; 25 January 1999 (1999-01-25), WEN T J ET AL: "Expressed sequence tags from B73 maize seedlings", XP002196434 *
HECKEL THIERRY ET AL: "Novel phenotypes and developmental arrest in early embryo specific mutants of maize.", PLANTA (BERLIN), vol. 210, no. 1, November 1999 (1999-11-01), pages 1 - 8, XP002196432, ISSN: 0032-0935 *
SHERIDAN W F AND CLARK J K: "Mutational analysis of morphogenesis of the maize embryo", PLANT JOURNAL, vol. 3, no. 2, 1993, pages 347 - 358, XP002196433 *
SMOOKER P M ET AL: "A RIBOSOMAL PROTEIN IS ENCODED IN THE CHLOROPLAST DNA IN A LOWER PLANT BUT IN THE NUCLEUS IN ANGIOSPERMS ISOLATION OF THE SPINACH L21 PROTEIN AND COMPLEMENTARY DNA CLONE WITH TRANSIT AND AN UNUSUAL REPEAT SEQUENCE", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 265, no. 27, 1990, pages 16699 - 16703, XP002196431, ISSN: 0021-9258 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003008585A3 (fr) 2004-02-12
CA2454119A1 (fr) 2003-01-30
EP1412500A2 (fr) 2004-04-28
WO2003008585A2 (fr) 2003-01-30
FR2827613B1 (fr) 2004-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RO120920B1 (ro) Inducerea sterilităţii masculine la plante, prin exprimarea de niveluri ridicate de streptavidină
EP2012579B1 (fr) Système génétique pour le contrôle du développement du type floral d&#39;une plante dicotylédone, et mise en oeuvre dans des procédés de détection et de sélection
EP2318536B1 (fr) Combinaison de deux elements genetiques pour le controle du developpement du type floral d&#39;une plante dicotyledone, et mise en oeuvre dans des procedes de detection et de selection
TW200525030A (en) A gene of unsaturated fatty acid synthetic enzyme isolated from Marchantia polymorpha and its use
EP1218510B1 (fr) Promoteurs specifiques de l&#39;albumen des graines de vegetaux
EP2627667B1 (fr) Obtention de plantes ayant une tolérance améliorée à un déficit hydrique
WO2019224324A1 (fr) Promoteurs meiotiques et leurs utilisations
WO2003076632A1 (fr) Procede de production de semences hybrides de mais
FR2827613A1 (fr) Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l&#39;obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe
EP1185669B1 (fr) Promoteur permettant l&#39;expression de transgenes dans toute la plante hormis dans la graine
WO2002036788A2 (fr) Acides nucleiques et polypeptides exprimes specifiquement dans les cellules de la zone de transfert d&#39;un grain de plante et leurs applications
US20050086716A1 (en) Nucleic acids coding for a ISUM2A polypeptide and use of said nucleic acids to obtain transformed plants producing seeds altered in germ development
EP2627772B1 (fr) Obtention de plantes ayant une tolérance améliorée à un déficit hydrique
EP1276870B1 (fr) Procede d&#39;obtention de plantes presentant une resistance accrue a un stress hydrique
EP1244792B1 (fr) Procede d&#39;obtention de plantes a teneur enrichie en cysteine et glutathion
FR2818286A1 (fr) Acides nucleiques et polypeptides exprimes specifiquement dans les cellules de la zone de transfert d&#39;un grain de plante et leurs applications
CA2793131A1 (fr) Methode pour modifier la date de floraison d&#39;une plante
FR2816320A1 (fr) Utilisation d&#39;un acide nucleique pour conferer a une plante une resistance a l&#39;agression par un pathogene, et plante transformee avec un tel acide nucleique
FR2823063A1 (fr) Procede d&#39;obtention de plantes c4 a metabolisme carbone modifie

Legal Events

Date Code Title Description
TP Transmission of property
ST Notification of lapse

Effective date: 20080331