WO2003076632A1 - Procede de production de semences hybrides de mais - Google Patents

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WO2003076632A1
WO2003076632A1 PCT/FR2003/000711 FR0300711W WO03076632A1 WO 2003076632 A1 WO2003076632 A1 WO 2003076632A1 FR 0300711 W FR0300711 W FR 0300711W WO 03076632 A1 WO03076632 A1 WO 03076632A1
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WO
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ams
gene
transgene
seeds
phenotype
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PCT/FR2003/000711
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English (en)
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Pascual Perez
Denise Gerentes
Sylvain Levadoux
Original Assignee
Biogemma
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing and propagating corn plants homozygous for a transgene conferring male sterility, useful for the production of hybrid corn seeds.
  • hybrids via "sexual hybridization" of parents with different genetic backgrounds is of great importance in the practice of modern agriculture. Indeed, the crossing between plants of the same species but not related produces a progeny which manifests characteristics, such as yield or resistance to diseases, superior to those of the parents: it is the effect of heterosis or hybrid vigor. Thus, the production of hybrids is often used to improve both the quality and the yield of cultivated plants. In addition, these descendants are genetically uniform, in particular for the characteristics of productivity, sensitivity to pours and drought, vigor at the start and susceptibility to diseases and pests, and therefore interesting for farmers.
  • hybrids Without human intervention, the production of hybrids is limited by self-fertilization phenomena.
  • the production of hybrid seeds therefore requires favoring cross-fertilization by preventing self-pollination by mechanical, chemical or genetic techniques.
  • the different ways to prevent self-fertilization by controlling pollination include - manual, mechanical "castration” or chemical inactivation of the male organs of the plant,
  • AMS artificial male sterility
  • nuclear sterile recessive male plant is not easy to implement, in particular because of the maintenance of the sterile male character which requires the reselection of sterile male plants in the descendants obtained by self-fertilization of a heterozygous plant for the male recessive sterility gene.
  • this system therefore involves the use of a marker closely linked to the male sterility gene and easily identifiable.
  • Male sterility can be "acquired”, that is, it is independent of any genetic manipulation by the recombinant DNA pathway. We can distinguish cytoplasmic male sterility from nuclear male sterility.
  • CMS Cytoplasmic male sterility
  • AMS artificial male sterility
  • AMS gene a gene conferring male sterility
  • the AMS system avoids problems associated with other methods.
  • the AMS system does not depend on the existence of a mutant. Maintaining the sterile character of the male line can be obtained through the use of a dominant male sterility gene linked to a marker gene which allows the selection of artificial sterile male plants.
  • the general application of this technology is limited to the extent that the choice of the color marker is conditioned by the genotype of the plant containing the fertility restoration gene.
  • the general application of this technology is limited to the extent that the choice of the color marker is conditioned by the genotype of the plant containing the fertility restoration gene.
  • only plants whose genotype does not condition visible production of anthocyanin in seeds can be used.
  • the present invention therefore provides a process for the production and multiplication of homozygous corn plants for a transgene conferring artificial nuclear male sterility, allowing production of hybrid seeds, and easily applicable on a large scale.
  • An advantage of the proposed method is that its application is not conditioned by the genotype of the plants used.
  • the "petit grain” phenotype is preferably obtained by the expression of the shrunken 2 and brittle 2 genes in antisense orientation.
  • the brittle 2 gene codes for one of the 2 subunits of ADP glucose pyrophosphorylase, an enzyme involved in the synthesis of starch.
  • the fragment was obtained by the RT-PCR technique from an extract of total RNA from the ear of corn and from the data of Genbank (acc. No. S72425). This fragment represents an incomplete cDNA of the brittle 2 gene.
  • the shrunken 2 gene codes for the other subunit of ADP glucose pyrophosphoryrlase.
  • the fragment was obtained by the RT-PCR technique from an extract of total RNA from the ear of corn and according to the data from Genbank (ace no. S72425). This fragment contains the complete sequence of the coding region of the shrunken 2 gene.
  • the term "heterozygous for the AMS transgene” means a corn plant made male sterile by incorporating into its genome a single copy of a transgene conferring artificial nuclear male sterility ("AMS") . In the absence of any other indication, this plant does not contain the fertility restoration gene linked to a marker of the "small grain” phenotype.
  • the term “homozygous for the AMS transgene” denotes a corn plant made male sterile by incorporating into its genome two copies located at the same location on each of the sister chromosomes of a transgene conferring male sterility artificial nuclear (AMS). In the absence of any other indication, this plant does not contain the fertility restoration gene linked to a marker of the "small grain” phenotype.
  • fertility restoring corn plant comprising in its genome a fertility restoration gene linked to a marker of" small grain "phenotype” is meant a heterozygous or homozygous corn plant for said fertility restoration gene linked to a small grain phenotype marker.
  • said corn plant is heterozygous. In the absence of any other indication, this plant does not contain a transgene conferring artificial nuclear male sterility (AMS).
  • corn plant comprising in its genome an AMS transgene is meant a heterozygous or homozygous corn plant for said AMS transgene.
  • wild genotype corn plant is meant a corn plant which contains in its genome neither a transgene conferring artificial nuclear male sterility (AMS), nor a fertility restoration gene linked to a phenotype marker " small grain ".
  • AMS artificial nuclear male sterility
  • said corn plant of wild genotype belongs to an elite line.
  • small grain phenotype is meant grains whose density and / or size and / or mass is (are) less than that of a grain of normal size, preferably 40 to 50% lower. In the context of the present invention, these grains may be called “depressed grains” or “wrinkled grains”.
  • marker of small grain phenotype or “gene which confers a small grain phenotype” or “gene coding a small grain phenotype”, is meant any gene, in sense orientation or in antisense orientation, which, when expressed in the plant gives a "petit grain” phenotype.
  • shrunken 2, brittle 2, shrunken 1 genes, the miniature locus 1 which codes for an invertase can be cited in particular; and more generally any gene which makes it possible to reduce the starch content and does not alter the viability of the grains.
  • grain of normal size or "grain normal” or “grain of normal phenotype” means in particular a grain whose size and / or density and / or mass has (have not been) changed (s), in particular by integration into the genome of the plant of a marker of "small grain” phenotype.
  • lite line is meant a line with significant agronomic and commercial potential, at a given period.
  • linkage or “genetic linkage” is meant a sufficiently small genetic distance so that the frequencies of recombination during meiosis are negligible.
  • protein of interest is meant a protein of human or animal origin which may be of therapeutic and / or prophylactic interest, such as collagen, gastric lipase, antibodies, etc.
  • One of the aims of the invention is therefore to propose a method for producing hybrid corn seeds by crossing a heterozygous corn plant for a transgene conferring artificial nuclear male sterility ("AMS") with a corn plant. of wild genotype.
  • AMS artificial nuclear male sterility
  • the system according to the present invention which advantageously makes it possible to maintain the sterile male character of corn plants is applicable independently of the genotype of the corn plants used.
  • the solution provided by the invention consists in first producing corn seeds that are homozygous for a transgene conferring artificial nuclear male sterility ("AMS") and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a phenotype marker " small grain ". From these seeds, breeders can easily introgress the homozygous genotype for the AMS transgene and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a “small grain” phenotype marker in a wild-type corn line, and in particular in an elite line of interest, by successive backcrosses.
  • AMS transgene conferring artificial nuclear male sterility
  • a reconverted elite line homozygous for a transgene conferring artificial nuclear male sterility (“AMS”) and heterozygous for a gene for restoring fertility linked to a marker of "small grain” phenotype can thus be obtained.
  • Self-fertilization of corn plants from these seeds then makes it possible to produce: seeds homozygous for the AMS transgene generating sterile male corn plants which, crossed with wild genotype corn plants, and in particular plants belonging to a Elite line used for conversion, where appropriate, will produce heterozygous seeds for the AMS transgene.
  • the AMS transgene when the AMS transgene is genetically linked to a gene encoding a protein of interest, hybrid seeds homozygous for the AMS transgene prove to be particularly useful for generating corn plants producing said protein of interest.
  • a selection of corn seeds by the “small grain” phenotype can in particular be implemented by a dimensional or densimetric sorting method.
  • a dimensional sorting can be carried out so as to separate the grains according to their length, using for example a cell sorter, their width, with for example a disc sorter, or their thickness, using for example a sizer .
  • the principle of a densimetric sorting is based on a separation of the grains according to their density and uses in particular a densimetric column or a densimetric table, or a flotation system.
  • the cell sorter consists of a horizontal rotating cylinder. The separation is done by centrifugal force. The smallest grains enter the cells (which line the inside of the cylinder) and are held there by centrifugal force.
  • the disc sorter consists of thick discs arranged vertically and hollowed out in their thickness of cells of suitable size.
  • the most conventional calibrators are the calibrators by thickness composed of flat or cylindrical sieves with elongated perforations forcing the seed to appear at its smallest thickness to pass through.
  • the calibrator with round perforations is of the same principle but the round orifices and small "redents" inside the cylinder force the seed to appear vertically to pass through the sieve.
  • the densimetric column includes a vibrating distributor which introduces the mixture of grains to be sorted halfway up a hollow column in which a homogeneous air flow rises. Heavy particles descend while the lighter particles rise. The separation is thus carried out.
  • Test weight is a measure of the mass of a quantity of seeds in relation to its volume.
  • the principle of the device is a work plan (often made up of a wire or textile network) crossed by a uniform air flow which fluidizes the seed mixture and causes it to stratify schematically in two layers. Heavy products stay close to the table, light products above. The separation of the two layers is obtained by adjusting the inclination of the work surface (in two directions) and by a transverse back and forth stirring movement.
  • a densimetric table such as that sold by the company Cimbria Heid GmbH (Stockerau, Austria).
  • the flotation system is a system which makes it possible to separate the grains according to their density and / or mass based on their capacity of flotation on a liquid, in particular water.
  • the heaviest grains (with the lowest buoyancy) are found at the bottom and the lightest grains (with the highest buoyancy) are found on the surface of the liquid, which allows separation.
  • the seeds When this system is used, the seeds must remain as short as possible in contact with water so as not to alter their germination capacity. A drying step may sometimes be necessary.
  • the present invention therefore provides a method of producing corn seeds homozygous for a transgene conferring artificial nuclear male sterility ("AMS") and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a marker of "small grain” phenotype, comprising the steps of; a) cross a sterile male corn plant heterozygous for the AMS transgene with a fertility restoring corn plant comprising in its genome a fertility restoration gene linked to a marker of "small grain” phenotype, b) select by "small grain” phenotype corn seeds comprising in their genome a fertility restoration gene linked to a marker of "small grain” phenotype, c) self-fertilize the corn plants from the seeds selected according to step b), d ) select seeds that are homozygous for the AMS transgene and heterozygous for the fertility restoration gene linked to a “small grain” phenotype marker.
  • AMS transgene conferring artificial nuclear male sterility
  • At least one step of selecting the method comprises a densimetric sorting, in particular using a densimetric table or column, or a flotation system.
  • the selection step thus carried out has the advantage of allowing an easily achievable and automated sorting of the grains according to their "small grain” or "normal” phenotype.
  • step b) of the method described above can advantageously be replaced by a genotyping step.
  • the present invention therefore also provides a method for producing corn seeds homozygous for a transgene conferring artificial nuclear male sterility ("AMS") and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a marker of "small grain” phenotype, comprising the steps of: a) crossing a sterile male corn plant heterozygous for the AMS transgene with a fertility restoring corn plant comprising in its genome a fertility restoration gene linked to a “small grain” phenotype marker, b) genotyping the seeds obtained by crossing according to step a), and selecting corn seeds comprising in their genome a gene for restoration of fertility linked to a marker of "small grain” phenotype, c) self-fertilize the maize plants derived from gen ⁇ typed seeds according to step b), d) select seeds homozygous for the AMS transgene and heterozygous for the restoration gene fertility linked to a marker
  • the implementation of the methods described above makes it possible to produce a corn seed that is homozygous for an AMS transgene and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a marker of “small grain” phenotype.
  • the present invention therefore relates to a corn seed homozygous for an AMS transgene and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a marker of “small grain” phenotype capable of being obtained by one of the preceding methods.
  • the homozygous and heterozygous AMS genotype for a fertility restoration gene linked to a marker of “small grain” phenotype can be introgressed in a corn line of wild genotype, and in particular in an elite line of interest. , by successive backcrosses.
  • the present invention therefore provides a process for the production of homozygous corn seeds for a transgene-conferring artificial nuclear male sterility ("AMS"), comprising the steps consisting in: a) self-fertilizing corn plants derived from homozygous seeds for the AMS transgene and heterozygotes for a fertility restoration gene linked to a marker of “small grain” phenotype, capable of being obtained by one of the methods previously described, b) selecting seeds homozygous for the AMS transgene.
  • AMS transgene-conferring artificial nuclear male sterility
  • the selection step comprises a densimetric sorting, in particular using a densimetric table or column, or a flotation system.
  • This step advantageously makes it possible to sort the seeds homozygous for the AMS transgene by their normal grain phenotype.
  • the method for producing seeds of homozygous corn for a transgene conferring artificial nuclear male sterility comprises the steps consisting in: a) crossing a sterile male corn plant heterozygous for the transgene AMS with a fertility restorer corn plant comprising in its genome a fertility restoration gene linked to a marker of "small grain” phenotype, b) selecting by the "small grain” phenotype corn seeds comprising in their genome a fertility restoration gene linked to a “small grain” phenotype marker, c) self-fertilize corn plants from seeds selected according to step b), d) select seeds homozygous for the AMS transgene and heterozygous for the fertility restoration gene linked to a small grain phenotype marker, e) self-fertilize corn plants from seeds according to the step d), f) select seeds homozygous for the AMS transgene.
  • said heterozygous corn plant for a transgene conferring artificial nuclear male sterility further contains a gene encoding a protein of interest, preferably genetically linked to the AMS transgene.
  • a successive backcrossing step with a corn plant of wild genotype, and in particular, a corn plant belonging to an elite line, so as to convert this plant from corn of wild genotype with the homozygous genotype for the AMS transgene and heterozygous for the fertility restoration gene linked to a “small grain” phenotype marker.
  • the seeds from this backcrossing step are then used to continue the process.
  • At least one selection step comprises a densimetric sorting, in particular using a densimetric table or column, or a flotation system.
  • This step advantageously makes it possible to sort the seeds homozygous for the AMS transgene by their normal grain phenotype.
  • step b) of the above method is replaced by a genotyping step.
  • the present invention therefore also relates to a process for producing seeds of homozygous corn for a transgene conferring artificial nuclear male sterility ("AMS") comprising the steps consisting in: a) crossing a sterile male corn plant heterozygous for the transgene AMS with a fertility restorer corn plant comprising in its genome a fertility restoration gene linked to a “small grain” phenotype marker, b) genotyping the seeds obtained by crossing according to step a), and select the corn seeds comprising in their genome a fertility restoration gene linked to a marker of "small grain” phenotype, c) self-fertilize the corn plants derived from the seeds genotyped according to step b), d) select the seeds homozygous for the AMS transgene and heterozygous for the fertility restoration gene linked to a “small grain” phenotype marker, e) self-fertilize corn plants from seeds according to step d),
  • said heterozygous corn plant for a transgene conferring artificial nuclear male sterility further contains a gene encoding a protein of interest, preferably genetically linked to the AMS transgene.
  • Step e) of this process may possibly be preceded by a successive backcrossing step with a corn plant of wild genotype, and in particular, a corn plant belonging to an elite line, so as to convert this corn plant wild-type genotype with the homozygous genotype for the AMS transgene and heterozygous for the fertility restoration gene linked to a “small grain” phenotype marker.
  • the seeds from this backcrossing step are then used to continue the process.
  • At least one selection step comprises a densimetric sorting, in particular using a densimetric table or column, or a flotation system.
  • This step advantageously makes it possible to sort the seeds homozygous for the AMS transgene by their normal grain phenotype.
  • the cultivation of seeds homozygous for the AMS transgene then makes it possible to generate sterile male corn plants which, crossed with plants of wild genotype, and in particular with plants belonging to an elite line, produce heterozygous seeds for the transgene AMS.
  • the elite line used for this crossing can in particular be that used for the backcrossing step possibly implemented in the preceding methods.
  • the seeds produced can be used to produce commercial seeds from a corn hybrid.
  • the elite sauvate type line can be replaced by a corn hybrid to obtain seeds which will be used to produce a three-way hybrid.
  • the process for producing corn seeds homozygous for the AMS transgene can be used for the production of proteins of interest, in particular therapeutic and / or prophylactic.
  • the protein of interest can be produced throughout the plant or preferentially concentrated in specific organs, such as seeds.
  • the method according to the invention has the advantage of making it possible to produce such proteins under controlled conditions and on a large scale. It is therefore of great interest in the pharmaceutical field.
  • a vector containing the barnase gene, conferring male sterility, under the control of the A9 promoter and a gene of therapeutic interest and / or prophylactic can be built.
  • This vector can be used to obtain plants, containing the gene conferring male sterility and the gene of therapeutic and / or prophylactic interest, which can then be used according to the production system as described in order to produce seeds expressing the protein of therapeutic and / or prophylactic interest.
  • such a vector can be used to obtain a heterozygous corn plant for an AMS transgene (and therefore for the gene coding for the protein of interest), which corn plant can then be crossed with a corn plant.
  • the gene of therapeutic and / or prophylactic interest is genetically linked to the AMS transgene.
  • Such a system makes it possible to produce only the protein of therapeutic and / or prophylactic interest in the seed for example or in an organ of the plant and this whatever the stage of development as a function of the regulatory sequence used in the gene coding said protein of interest, since the protein conferring male sterility is not produced in the organs of the plant.
  • This system thus makes it possible to avoid the dissemination of the transgene of therapeutic and / or prophylactic interest via pollen, since the plants are completely male sterile,
  • the present invention therefore also relates to a method for producing a heterozygous seed for an AMS transgene comprising the crossing of a corn plant derived from a homozygous seed for an AMS transgene, capable of being obtained by one of the methods for producing a seed homozygous for the AMS transgene described above, with a corn plant of wild genotype.
  • the method for producing a seed heterozygous for an AMS transgene is characterized in that one of the methods for producing a • seed homozygous for the AMS transgene described above further comprises the crossing of a corn plant derived from said homozygous seed for an AMS transgene with a corn plant of wild genotype.
  • the fertilization of sterile male corn plants from these seeds by a wild genotype corn plant, unrelated, advantageously produces hybrid seeds benefiting from the vigor effect (heterosis).
  • the system proposed by the present invention advantageously makes it possible to maintain corn plants homozygous for an AMS transgene and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a marker of "small grain” phenotype.
  • the corn seed production processes homozygous for the AMS transgene described above indeed comprise a final selection of seeds in particular on the basis of their normal grain phenotype.
  • the seeds of the “small grain” phenotype not selected by these methods can be sown, then the plants generated self-fertilizing, thus producing in particular seeds homozygous for the transgene AMS and heterozygous for the gene for restoring fertility linked to a marker. of "petit grain” phenotype.
  • the invention therefore relates to a method of propagating a corn plant homozygous for an AMS transgene and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a marker of “small grain” phenotype comprising the steps consisting in: a) self-fertilizing corn plants homozygous for an AMS transgene and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a marker of "small grain” phenotype, capable of being obtained from a seed from one of the homozygous seed production processes for an AMS transgene and heterozygotes for a fertility restoration gene linked to a marker of “small grain” phenotype previously described, b) selecting seeds homozygous for the AMS transgene and of “small grain” phenotype, c) selecting seeds homozygous for the AMS transgene and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a marker of "small grain” phenotype obtained by self-fertilization of seedlings of.
  • step b) of the above method comprises a densimetric sorting, in particular using a densimetric table or column, or a flotation system.
  • the present invention also relates to nucleotide constructs, called expression cassettes, comprising a promoter nucleotide sequence operably linked to at least one gene of interest.
  • Said gene of interest can also be associated with other regulatory elements such as activators and transcription termination sequences (terminators).
  • Other elements such as introns, enhancers, polyadenylation sequences and derivatives "may also be present in the nucleic sequence of interest, to improve the expression or the functioning of the transforming gene.
  • the expression cassette may also contain so-called "leader" 5 'sequences that can improve translation.
  • the corn plant comprising an AMS transgene conferring artificial nuclear male sterility is characterized in that the AMS transgene, preferably the barase gene (Hartley, 1988; Gene Bank n ° X 12871), is included in an expression cassette, under the control of a promoter specific for pollenogenesis and of a terminator, genetically linked to a gene encoding a selection agent under the control of a promoter and d 'a terminator.
  • said expression casette can also comprise a gene coding for a protein of interest.
  • said gene encoding a protein of interest is genetically linked to the AMS transgene, in particular the barnase gene.
  • the gene encoding a protein of interest is not under the control of said specific promoter of pollenogenesis.
  • the specific promoter of pollenogenesis is in particular a promoter allowing specific expression in the anther chosen from the group consisting of the promoter A3 (WO 92 11379), the promoter A6, the promoter A9 (WO 92 11379), corresponding to the region 5 'non-coding of the A9 gene of Arabidopsis thaliana, and the specific promoters of the anther carpet such as TA29, TA26, TA13 (WO 89 10396) or Mac2 (WO 00 68 403).
  • genes coding for a selection agent also called selection marker genes
  • genes which confer resistance to an antibiotic can be used in particular (Herrera-Estrella et al., 1983), such as hygromycin, kanamycin, bleomycin or streptomycin or herbicides (EP 242 246), such as glufosinate, glyphosate or bromoxynil.
  • said gene encoding a selection agent is selected from the bar gene (White et al., 1990; Gene Bank No. X 17220), which confers resistance to the herbicide Basta ® (glufosinate) and the NPTII gene which confers resistance to kanamycin (Bevan et al., 1983).
  • the excision system for eliminating the gene encoding a selection agent can be a transposition system, such as in particular the Ac / Ds system of corn (WO
  • a recombination system such as in particular the Cre / lox system of bacteriophage P1, the FLP / FRT system of yeast (Lyzrik et al., 1997), the Gin recombinase of phage Mu, the Pin recombinase of E. coli or the R RS system of the plasmid pSR1.
  • a co-transformation system Komari et al., 1996) can also be used.
  • the system used will be the Ac / Ds system of corn.
  • said gene is included inside the transposable element Ds (also called dissociating element or mobilizable sequence of a transposon).
  • the Ds element is an Ac element which has undergone significant mutations or deletions in the sequence encoding the transposase. H can only excise itself from its insertion site in the presence of an active Ac transposase source. It is therefore Ac dependent.
  • a preferred system for eliminating a gene encoding a selection agent can have two components:
  • a first plant having no active transposase in which a construct comprising the expression cassette of the gene of interest and that of the gene coding for a selection agent framed by the mobilizable sequences of a transposon can be integrated therein.
  • the promoter associated with the gene. encoding a selection agent is a constitutive promoter, such as the Actin-lntron- promoter actin, corresponding to the 5 ′ non-coding region of the actin 1 gene of rice and its first intron (Me Elroy et al., 1991; Gene Bank n ° S 44221).
  • the presence of the first actin intron makes it possible to increase the level of expression of a gene when it is fused 3 'to a promoter.
  • This promoter sequence allows for example the constitutive expression of the bar gene.
  • terminators which can be used with the AMS transgene of the gene encoding a selection agent, there may be mentioned in particular:
  • the present invention relates to an expression cassette comprising a fertility restorer gene genetically linked to at least one gene coding for a "small grain" phenotype, associated with elements allowing their expression in plant cells, in particular a promoter and a transcription terminator.
  • transcription promoters which can be used in association with the gene coding for a “small grain” phenotype, there may be mentioned in particular:
  • HMWG High Molecular Weight Glutenin promoter corresponding to the 5 ′ non-coding region of the wheat glutenin gene (Triicum aes ⁇ vum), an albumen reserve protein. This seed-specific promoter is described in the publication by Robert et al. (1989)
  • said expression cassette comprising a fertility restorer gene genetically linked to at least one gene coding for a "small grain" phenotype is characterized in that said fertility restorer gene is the barstar gene (Hartley, 1998 ) placed under the control of a specific promoter of pollenogenesis, in particular a specific promoter of the anther such as pA3, pA6, pA9, pTA29, or of the Mac2 promoter, and of the 3'CaMV terminator or 3'Nos, genetically linked to a gene encoding a selection agent under the control of the Actin-intron actin promoter and the 3'CaMV or 3'Nos terminator.
  • a specific promoter of pollenogenesis in particular a specific promoter of the anther such as pA3, pA6, pA9, pTA29, or of the Mac2 promoter, and of the 3'CaMV terminator or 3'Nos, genetically linked to a gene encoding a selection agent under the
  • genes coding for a selection agent genes which confer resistance to an antibiotic such as hygromycin, kanamycin, bleomycin or streptomycin or to herbicides such as glufosinate, glyphosate or bromoxynil can be used in particular.
  • said gene encoding a selection agent is selected from the bar gene which confers resistance to the herbicide Basta ® and the NPTII gene which confers resistance to kanamycin.
  • the gene coding for a “small grain” phenotype is chosen from the shrunken 2 and brittle 2 genes in antisense orientation.
  • the invention relates to a vector, in particular a plasmid, characterized in that it contains at least one expression cassette as described above.
  • the invention further relates to a cellular host, in particular a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens, transformed by said vector.
  • a cell host is useful for transfecting corn cells with a vector according to the invention.
  • the invention therefore also relates to a corn cell transformed by at least one vector as described above.
  • the transformation of plant cells can be carried out by transfer of the abovementioned vectors into the protoplasts, in particular after incubation of the latter in a polyethylene glycol (PG) solution in the presence of divalent cations (Ca 2+ ) according to the method described in the article of Krens et al. (1982).
  • the transformation of plant cells can also be carried out by electroporation, in particular according to the method described in the article by Fromm et al.
  • the transformation of plant cells can also be carried out by using a gene gun allowing the projection, at very high speed, of metallic particles covered with DNA sequences of interest, thus delivering genes inside the cell nucleus , in particular according to the technique described in the article by
  • Another method of transforming plant cells is that of cytoplasmic or nuclear micro-injection.
  • the plant cells are transformed by a vector according to the invention, said cellular host being capable of infecting said plant cells by allowing integration into the genome of the latter, DNA sequences of interest originally contained in the genome of the above vector.
  • the above-mentioned cell host used is Agrobacterium tumefaciens, in particular according to the methods described in the articles by Bevan (1984) and An et al. (1986), or even Agrobacterium rhizogenes, in particular according to the method described in the article by Jouanin et al, (1987).
  • the transformation of plant cells is carried out by the transfer of the T region of the extra-chromosomal circular plasmid inducing Ti tumors of Agrobacterium tumefaciens, using a binary system (Watson
  • T-DNA region was deleted, with the exception of the right and left edges, a marker gene being inserted between them to allow selection in plant cells.
  • the other partner of the binary system is a helper Ti plasmid, a modified plasmid which no longer has T-DNA but still contains the virulence genes vir, necessary for the transformation of the plant cell. This plasmid is maintained in Agrobacterium.
  • Another object of the present invention is to produce transgenic corn plants, plant parts or plant extracts, characterized in that they are regenerated from the transformed plant cell.
  • the invention relates in particular to a fertility restoring corn plant characterized in that it comprises in its genome a fertility restoring gene linked to a marker of "small grain” phenotype or a corn plant homozygous for an AMS transgene and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a "small grain” phenotype marker, obtained from a corn seed homozygous for an AMS transgene and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a phenotype marker "petit grain”.
  • the invention also relates to a kit for implementing a method of propagating a homozygous corn plant for an AMS transgene and heterozygous for a fertility restoration gene linked to a previously described "small grain" phenotype marker, characterized in that it comprises corn seeds homozygous for an AMS transgene and heterozygotes for a fertility restoration gene linked to a marker of “small grain” phenotype, and oligonucleotides specific for the AMS transgene useful as primers for the detection by PCR of seeds homozygous for an AMS transgene and heterozygotes for a fertility restoration gene linked to a phenotype marker "petit grain”.
  • FIG. 1 represents the block diagram of a succession of steps leading to the production of a hybrid seed according to the invention.
  • 2 shows the plasmid pRec 274 comprising the barnase gene conferring male sterility, and the bar gene conferring resistance to the herbicide Basta ®.
  • FIG. 3 represents the donor plasmid pBIOS 274 comprising the spectinomycin resistance gene as well as the T-DNA carrying the barnase gene, under the control of the A9 promoter, and of the bar gene, under the control of the rice actin promoter.
  • FIG. 4 represents the donor plasmid pBIOS 424 comprising the promoter A9-bamase-terminator 3 'CaMV and the gene for resistance to kanamycin Npt11 in a dissociating element Ds.
  • FIG. 5 represents the plasmid p3222 comprising the antisense sequence of the brittle 2 gene as well as the barstar gene restoring fertility.
  • Figure 6 represents the plasmid p3223 comprising the antisense sequence of the shrunken 2 gene as well as the barstar fertility restorer gene.
  • FIG. 7 represents the plasmid p4962 comprising the antisense sequences of the shrunken 2 and brittle 2 genes as well as the barstar fertility restorer gene.
  • FIG. 8 represents the plasmid pDM 302 comprising the expression cassette for the bar gene.
  • FIG. 9 represents the donor plasmid pBIOS 273 which comprises an expression cassette comprising the rice actin promoter, the Bar gene, and the 3'Nos terminator.
  • FIG. 1 A non-limiting illustration of one of the methods according to the present invention is described in FIG. 1.
  • EXAMPLE 1 Built AMS.
  • the vector used for the transformation of maize by Agrobacterium tumefaciens is in the form of a superbinary plasmid of approximately 50 kb (pRec 274).
  • the superbinary vector used for the transformation contains:
  • origin of Col E1 plasmid replication necessary for the maintenance and multiplication of the plasmid in Escherichia coli. This origin of replication is not functional in Agrobacterium tumefaciens,
  • the barnase gene is under the control of the A9 promoter and the 3 'CaMV terminator; the bar gene being under the control of the actin-intron rice actin promoter and of the 3 'Nos terminator.
  • the bar gene of Streptomyces hygroscopicus encodes a Phosphinothricin Acyl Transferase (PAT) which detoxifies phosphinothricin (agent for selection of the herbicide Basta ® ) by acetylation (White et al., 1990). It is generally used to select transformed plants which contain both the gene of interest and this gene encoding a selection agent, and which are therefore resistant to the herbicide.
  • Phosphinothricin Acyl Transferase Phosphinothricin Acyl Transferase
  • the barnase gene which confers male sterility, codes for a Ribonuclease (RNase). This gene was isolated from Bacillus amyloliquefasciens and is described in the publication by Hartley (1988).
  • the superbinary plasmid pRec 274 is shown in Figure 2.
  • This superbinary vector is obtained by homologous recombination of an acceptor plasmid pSB1 (EP 672 752) derived from a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens with a donor plasmid pBIOS 274 (FIG. 3), derived from pUC (Messing, 1983).
  • the donor plasmid has the spectinomycin resistance gene as well as the T-DNA carrying the barnase gene, under the control of the A9 promoter, and of the bar gene, which is also a selection gene, under the control of the Actin promoter. rice.
  • the donor and acceptor plasmids have a region of homology sufficient to allow homologous recombination and to obtain the vector known as superbinary.
  • the transformation technique with Agrobacterium tumefaciens allows the integration of the only T-DNA consisting of the right (RB) and left (LB) borders surrounding the gene of interest (barnase) and the gene encoding a selection agent.
  • RB right
  • LB left
  • ase gene of interest
  • pRec 424 Construction of a plasmid (pRec 424) comprising the barnase gene conferring male sterility linked to. NPT-II gene conferring resistance to kanamycin.
  • the vector used for the transformation of maize by Agrobacterium tumefaciens is in the form of a superbinary plasmid of approximately 50 kb (pRec 424).
  • the superbinary vector used for the transformation contains:
  • origin of Col E1 plasmid replication necessary for maintaining and multiplying the plasmid in Escherichia coli. This origin of replication is not functional in Agrobacterium tumefaciens,
  • the barnase gene is under the control of the A9 promoter and the 3 'CaMV terminator; the Nptll gene inserted into a Ds element being under the control of the Actin promoter and of the 3 'Nos terminator and terminator.
  • the Npt11 gene was isolated from the Tn5 transposon of Escherichia coli (Berg et al. 1983). This gene codes for the enzyme neomycin phosphotransferase type 11 which catalyzes the O-phosphorylation of aminoglycoside antibiotics such as neomycin, kanamycin, gentamycin and G418 (Davies and Smith, 1978). This gene confers resistance to kanamycin, which is used as a selection agent during plant genetic transformation. It is described by Bevan et al. (Genbank No. U00004).
  • the barnase gene which confers male sterility, codes for a Ribonuclease as mentioned in Example 1.a above.
  • This superbinary vector is obtained by homologous recombination of an acceptor plasmid pSB1 (EP. 672 752) derived from a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens with a donor plasmid pBIOS 424 (FIG. 4) derived from pUC (Messing, 1983).
  • the donor plasmid pBIOS 424 has the spectinomycin resistance gene as well as the T-DNA carrying the barnase gene under the control of the A9 promoter and of the Npt11 gene placed under the control of the Actin promoter inserted into a Ds element.
  • the donor plasmid pBIOS 424 (A9 promoter-barnase-terminator 3 'CaMV and the kanamycin resistance gene Npt11 in a dissociative element Ds) was generated in the following way: The fragment containing the A9 promoter cassette - barnase gene - terminator
  • 3 'CaMV was isolated by: a) restriction with hol, b) treatment with T4 DNA Polymerase to generate blunt ends, and c) restriction with XI a from the plasmid pBIOS 274 (FIG. 3). This fragment (X / iol / blunt - Xba ⁇ ) was then introduced into the vector pBIOS
  • the EcoRV-X al fragment thus generated contains the plasmid sequences of the vector pSB12 (Japan Tobacco, EP 672 752) and the cassette element Ds - Actin promoter - actin intron - NPTII gene - Nos terminator - Ds element.
  • Plasmid pBIOS 415 contains the GFP gene under the control of the promoter
  • the vector pBIOS 340 is a vector containing the plasmid sequences of the vector pSB12 (Japan Tobacco, EP 672 752) and the cassette Ds element - Actin promoter - actin intron - NPTII gene - terminator
  • the donor and acceptor plasmids have a region of homology sufficient to allow the production of the so-called superbinary vector by homologous recombination.
  • the transformation technique with Agrobacterium tumefaciens allows the integration of the only T-DNA consisting of the right (RB) and left (LB) borders surrounding the gene of interest (barnase gene) and the gene coding for a selection agent.
  • EXAMPLE 2 Constructed Phenotypic Restorer-Marker linked to grain size.
  • the brittle 2 gene codes for a subunit of ADP Glucose Pyrophosphorylase, an enzyme involved in the synthesis of starch. In antisense orientation, it inhibits the synthesis of this subunit, which produces a mutant phenotype whose grain size is 50% smaller than normal size.
  • the barstar gene codes for a specific Barnase inhibitor. It was isolated from Bacillus amyloliquefaciens and is described in Hartley (1998) (Genbank N ° X1 5545). Plasmid p3222 carries two individually cloned expression cassettes. The first cassette comprising the HMWG promoter, the brittle 2 gene in antisense orientation and the Nos terminator. The second cassette comprising the A9 promoter, the Barstar gene and the CaMV terminator.
  • the brittle 2 gene was synthesized by PCR from corn albumen cDNA with the oligonucleotides Bt5 (CCGGATCCATGTGACAGACAGTGTTA, SEQ ID No. 1) containing a BamHI site, and Bt3 (AAGCCCGGGACTTGTACTAACTGTTTC, SEQ ID No. 2) Smal site.
  • Bt5 CCGGATCCATGTGACAGACAGTGTTA, SEQ ID No. 1
  • Bt3 AAGCCCGGGACTTGTACTAACTGTTTC, SEQ ID No. 2
  • the 600 bp PCR fragment thus obtained was digested with SmaI and BamHI and cloned between the HMWG promoter and the nos terminator region of the plasmid p3214 opened by Smal and BamHI.
  • the plasmid p3215 thus obtained contains the HMWG-brittle 2 promoter expression cassette (antisense orientation) -nos.
  • a 270 bp fragment containing the barstar gene was amplified by PCR from the plasmid pWP127 with the oligonucleotides BPR5 (TATCGGATCCAAATCATAAGAAAGGAG, SEQ ID No. 3) containing a BamHI site, and BPR4 (GAAGATCTATATTGTTCATCCCATTG, SEQ ID No. 4) Bglll site.
  • the PCR fragment thus obtained was digested with BamHI and Bgl11 and cloned between the A9 promoter and the CaMV terminator region of the plasmid p1415 opened with BamHI.
  • the plasmid p3072 thus obtained contains the barstar gene under the control of the A9 promoter and of the CaMV terminator region.
  • the plasmid p3222 according to Example 2.a) corresponds to the insertion of the HMWG-brittle 2 promoter cassette (antisense orientation) -nos (Kpnl-Sacl fragment) from p3215 into p3072 opened with Kpnl and Sacl.
  • the shrunken 2 gene codes for the other subunit of ADP Glucose Pyrophosphorylase, an enzyme involved in the synthesis of starch. In antisense orientation, it inhibits the synthesis of this subunit which produces a mutant phenotype whose grain size is 40% smaller than normal size.
  • Plasmid p3223 carries two individually cloned expression cassettes.
  • the first cassette comprising the HMWG promoter, the shrunken 2 gene in antise ⁇ s orientation and the Nos terminator.
  • the second cassette comprising the A9 promoter, the Barstar gene and the CaMV terminator.
  • the shrunken 2 gene was synthesized by PCR from corn albumen cDNA with the oligonucleotides New Sh5 (GCACCCGGG AGGAGATATGCAGTTTG, SEQ ID no 5) containing a Smal site, and Sh3 (GACTGCAGCACAAATGGTCAAG, SEQ ID no 6) containing a Pstl site.
  • the 1800 bp PCR fragment thus obtained was digested with SmaI and PstI and cloned between the HMWG promoter and the nos terminator region of the plasmid p3214 opened by SmaI and PstI.
  • the plasmid p3217 thus obtained contains the HMWG-shrunken 2 promoter expression cassette (antisense orientation) -nos.
  • a 270 bp fragment containing the barstar gene was amplified by PCR from the plasmid pWP127 with the oligonucleotides BPR5 (TATCGGATCCAAATCATAAGAAAGGAG, SEQ ID No. 7) containing a BamHI site, and BPR4 (GAAGATCTATATTGTTCATCCCATTG, SEQ ID No. 8) Bglll site.
  • the PCR fragment thus obtained was digested with BamHI and Bgl11 and cloned between the A9 promoter and the CaMV terminator region of the plasmid p1415 opened with BamHI.
  • the plasmid p3072 thus obtained has the barstar gene under the control of the A9 promoter and of the CaMV terminator region.
  • the plasmid p3223 according to Example 2.b) corresponds to the insertion of the HMWG-shrunken 2 promoter cassette (antisense orientation) -nos (Kpnl-Sacl fragment) from p3217 into p3072 opened with Kpnl and Sacl.
  • Plasmid p4962 ( Figure 7) carries two individually cloned expression cassettes.
  • the first cassette comprising the HMWG promoter, the shrunken 2 gene in antisense orientation, the brittle 2 gene in antisense orientation and the Nos terminator.
  • the second cassette comprising the Mac2.1 promoter, the Barstar gene and the CaMV terminator. This plasmid was constructed by conventional molecular biology techniques known to those skilled in the art.
  • the plasmid p4962 is in the form of a donor vector derived from the vector pSB12 (Japan Tobacco, EP 672 752) of approximately 11.7 kb comprising: - an ori region: origin of plasmid replication Col E1, necessary for maintaining and multiplication of the plasmid in the bacteria,
  • T-DNA comprising the male fertility restoration gene (barstar gene) and the antisense sequences of the shrunken 2 and brittle 2 genes conferring a v phenotype
  • the barstar gene is under the control of the Mac2.1 promoter and of the 3'CaMV terminator, the shrunken 2 and brittle 2 genes in antisense orientation being under the control of the HMWG promoter and of the 3'Nos terminator.
  • the superbinary vector pRec 4962 is obtained by homologous recombination of an acceptor plasmid pSB1 (Japan Tobacco, EP 672 752) derived from a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens with the donor plasmid p4962.
  • the bar gene is used to select the transformed plants which are resistant to the herbicide Basta ®.
  • the plasmid pDM302 (Cao et al., 1992) carries the expression cassette comprising the promoter Actin-lntron-actin, the Bar gene and the terminator Nos.
  • This plasmid pDM302 was obtained in the following manner:
  • the coding region of the bar gene of Streptomyces hygroscopicus coding for PAT activity was excised from the plasmid plJ4104 (White et al., 1990) by the restriction enzyme Smal (fragment of 600 bp) and cloned in the expression vector pCOR113 (McEIroy et al., 1991) behind the 5 ′ fragment (promoter and first intron) of the rice Actin 1 (Act-1) gene. This generated the 4.9 kb plasmid pDM301 containing the Act1-bar expression cassette.
  • the Act1-bar expression cassette of pDM301 was excised as a 2.0 kb Xhol-Xbal restriction fragment and cloned between the SalI and Xbal sites upstream of the terminator sequence of the nos gene coding for nopaline synthase (plasmid pNOS72) .
  • the 4.7 kb plasmid pDM302 thus obtained contains the Act1-bar-nos expression cassette.
  • the plasmid pBIOS 273 (FIG. 9) carries an expression cassette comprising the rice actin promoter, the Bar gene, and the 3 'Nos terminator. This plasmid was constructed by conventional molecular biology techniques known to those of skill in the art.
  • the plasmid pBIOS 273 is in the form of a donor vector derived from the vector pSB12 (Japan Tobacco, EP 672 752), of about 8.6 kb comprising:
  • ori origin origin of Col E1 plasmid replication, necessary for the maintenance and multiplication of the plasmid in the bacteria
  • the plasmid pBIOS 273 was generated in two stages:
  • the vector obtained, having a unique Xhol site, is named pBIOS 273.
  • the superbinary vector pRec 273 is obtained by homologous recombination of an acceptor plasmid pSB1 (Japan Tobacco, EP 672 752) derived from a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens with the donor plasmid pBIOS 273.
  • AMS / + Production of a sterile male corn line heterozygous for the AMS transgene (AMS / +) by transformation of the corn with the plasmid described according to Example 1a (pRec 274).
  • a heterozygous sterile male corn line expressing the barnase (conferring male sterility) and bar (glufosinate resistance) genes respectively under the control of the A9 promoters (Paul et al., 1992) and actin-intron (Me Elroy et al., 1991 ) is obtained by transformation with Agrobacterium tumefaciens according to the method described by Ishida et al. (1996).
  • AMS / + sterile heterozygous male corn line
  • Agrobacterium tumefaciens Other transformation techniques known to those skilled in the art can be used.
  • Corn on the cob is decontaminated for 15 to 20 minutes in 20% Domestos with stirring and then rinsed with sterile water before taking the immature embryos which are placed in LSinf medium.
  • the optimal size of immature embryos is 1 to 1.2 mm, which corresponds to 10 +/- 2 days after fertilization.
  • the embryos are then vortexed, the LSinf medium is removed, and rinsing in LSinf medium is performed before vortexing again.
  • Agrobacterium tumefaciens bacteria (strain LBA 4404) containing the super binary plasmid pRec 274 (as described according to example 1a) are cultured in YP medium supplemented with a selective agent suitable for the strain. 2 to 3 days later, the bacteria are suspended in LSinf medium + 100 ⁇ M acetosyringone. The concentration of the inoculum is considered to be 1.10 9 bacteria / ml.
  • the embryos are transferred to LSD5 medium and placed in numbers of 25 per box sealed with Urgopore. Incubation for 2 weeks at 25 ° C in the dark (1 st selection) is performed. A 2 nd selection involves transferring the embryos on medium LSD10 by cutting germination. Incubation for three weeks is carried out in the same conditions as 1 st selection. A 3 ee selection is carried out by excising the type I calluses -jolis- so as to obtain fragments of 1-2 mm. A culture on LSD10 medium, then an incubation of 3 weeks under the same conditions as in first and second selection are carried out.
  • Type I calli proliferated are placed on medium LSZ2 and the cans are sealed with film ® and placed in a culture chamber at 27 ° C for 2 weeks.
  • the type I calluses which have proliferated are again subcultured, separated and placed on RM + G4C100 medium.
  • the dishes are sealed with scellofrais ® and placed in a culture chamber at 27 ° C.
  • the regenerated seedlings are subcultured on T1 G4 medium and placed under continuous illumination, at 27 ° C for one to two weeks. The seedlings having reached sufficient development are transferred to the phytotron.
  • a selection step is carried out with a Basta F1 solution (Agri ⁇ vo France).
  • the application of this solution is done by "Leaf Painting” (ie by brushing the leaves) on corn plants at the 4-5 leaf stage.
  • the concentration of ammonium glufosinate in the treatment solution is 0.75 grams per liter.
  • Resistant plants have a non-necrotic area 5 days after the application of the herbicide. Sensitive plants show necrosis in the treated area; we then observe the death of chlorophyll tissues. The plants thus regenerated are acclimatized and then cultivated in a greenhouse where they can be crossed or self-fertilized. 4.b) Production of a sterile male corn line heterozygous for the AMS transgene (AMS / +) by transformation of the corn with the plasmid described according to Example 1b (pRec 424).
  • a sterile heterozygous male corn line expressing the barnase gene conferring male sterility, under the control of the A9 promoter (Paul et al., 1992), is obtained by transformation with A. tumefasciens according to the method described by Ishida et al. (1996).
  • the transformation technique with Agrobacterium tumefaciens, non-limiting, used in this example is identical to that used in Example 4. a.
  • Transformation with the A9-Bamase-3'CaMV-Ds : NPTII expression cassette comprising the barnase gene under the control of the A9 promoter and of the 3'CaMV terminator (according to Example 1 b) on a vector usable in transformation via Agrobacterium and comprising the selection marker "Kanamycin" inside the transposable element Ds has the advantage of eliminating the marker gene which will not be found in the transformed corn line.
  • the identification of the seedlings having integrated the transgene is done as follows:
  • Regeneration of transformed seedlings Calluses of type I which have proliferated are placed on LSZ2 medium and the boxes are sealed with scellofrais ® and placed in a culture chamber at 27 ° C for 2 weeks. The type I calluses which have proliferated are again subcultured, separated and placed on RM + G4C100 medium. The dishes are sealed with scellofrais ® and placed in a culture chamber at 27 ° C. The regenerated seedlings are subcultured on T1 G4 medium and placed under continuous illumination, at 27 ° C for one to two weeks. The seedlings having reached sufficient development are transferred to the phytotron.
  • a selection step (by the cornet drop test) is carried out with a kanamycin solution at a concentration of 500 mg / l added with 1% of
  • Tween. 2 to 3 drops of this solution are applied to corn plants at the 4-5 leaf stage.
  • the plants are analyzed 5 days after the application of kanamycin.
  • Sensitive plants show the appearance of whitish areas (death of chlorophyll tissues).
  • Resistant plants do not show the appearance of whitish areas 5 days after the application of kanamycin.
  • the plants thus regenerated are acclimatized and then cultivated in a greenhouse where they can be crossed or self-fertilized.
  • Fertilization is carried out manually by a technique known to those skilled in the art by depositing pollen from the source of transposase Ac on the bristles of the transformants, preferably in the sense of the male plant having the transposase in the female plant containing l 'element Ds :: Nptll.
  • the F1 grains are put to germinate to obtain seedlings.
  • the seedlings are evaluated for their resistance to kanamycin (the resistant plants are preserved) and a PCR test is carried out to detect somatic excisions (somatic excision does not generally affect the gametes and leads to the formation of seeds and chimeric individuals most of whose cells still have the gene encoding the selection agent).
  • the primers used for this PCR test which makes it possible to search for somatic excisions on F1 plants resistant to the selection agent are the following:
  • the pair of primers Barn5 / EM11 makes it possible to visualize the excision (other suitable primers can also be used).
  • the amplification is different depending on whether or not there has been excision.
  • the F1 plants where somatic excision has taken place are therefore selected, then crossed with a wild genotype plant (WT).
  • WT wild genotype plant
  • the F2 plants are screened in order to identify the plants with the gene of interest without a gene encoding the selection agent (a germline excision affects the gametes and leads to the formation of seeds and individuals made up of cells which no longer possess the gene encoding the selection agent).
  • the Southern methodology (1975) is used to demonstrate the insertion of the transgene into the plant genome and to assess the number of copies and characterize the integration profile.
  • Plant genomic DNA (8 ⁇ g) is extracted from plant leaves following a CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) extraction protocol, according to the Keller J protocol (DNAP 6701 San Pablo Ave Oakland CA 94608 USA) modified by Bancroft I. (Department of MolecularGenetics, Cambridge Laboratory,
  • the DNA obtained was digested with different restriction enzymes, separated by agarose gel electrophoresis and transferred to nylon membrane N + hybond and then hybridized with radioactive probes.
  • the Bar probe for molecular analyzes is prepared in the following manner.
  • the plasmid pDM302 (described in Example 3a) of the present invention) is digested with the enzyme Sma I.
  • the fragment of interest of 0.6 Kb is recovered after migration of the digestion product on electrophoresis gel and purification with the Gene Clean kit (Bio 101, Ozyme). After labeling with P32 30 ng of fragment, this is used as a probe to hybridize the different blots.
  • the sterile male transformation event (STB27b) is a transformant obtained by transformation via Agrobacterium tumefaciens according to Example 4a) described above, and which has a single copy insertion of the T-DNA as described according to example 1a.
  • the results of hybridization of the DNA digested with different restriction enzymes (Ncol, Spel, EcoR V, Hindlll and Ecor I), then hybridized with the Bar probe show that a single fragment is highlighted whatever the enzyme used.
  • the size of the fragment revealed by Hind III digestion is 1.7 kb. This same type of molecular characterization is carried out for the transformants obtained by transformation via Agrobacterium tumefaciens according to Example 4b).
  • a method of genetic transformation is used which leads to the stable integration of the modified genes into the genome of the plant.
  • This method is based on the use of a particle gun.
  • other transformation techniques known to those skilled in the art can be used.
  • the ear samples are taken when the immature embryos have reached a size of 1.5 mm to 2 mm, that is to say 10 to 11 days after fertilization in our culture conditions (temperature of 25 ° C on day and 18 ° C at night, photoperiod 16/8). Disinfection:
  • the harvested ears are stripped of their husks and their bristles and are then disinfected with Domestos ® 20% (v / v) for 15 minutes with stirring.
  • the ears of corn will be rinsed three times with sterile water.
  • the upper part of the grain is cut to reveal the albumen, then a light pressure on the grain allows to release the albumen.
  • the immature embryo which is still in the grain (against the pericarp) is extracted and then deposited on the N6P6 callogenesis medium, orienting it flat side on the agar. Thirty six embryos per dish are cultured for 4 days in a culture chamber at 26 ° C and in the dark. This is the initiation period.
  • the embryos are deposited 4 hours before firing on the 0.4 M N6P6 osmotic shock medium and are arranged by 36 in a small square of 2 cm 2 in the center of the dish.
  • the dishes are sealed with fresh seal and incubated in a culture chamber (dark at 26 ° C).
  • the plasmids carrying the genes to be introduced are purified on a Qiagen ® column according to the manufacturer's instructions. They are then precipitated on tungsten particles (M 10) following the protocol described by Klein (1987). The particles thus coated are projected towards the target cells using the cannon and according to the protocol described by J. Finer (1992).
  • Suitable selective agents generally consist of active compounds of certain herbicides (Basta ®, Roundup ®) or certain antibiotics (Hygromycin, Kanamycin ).
  • the gene for resistance to the herbicide Basta ® be used.
  • MM + G2 maturation medium which promotes the development of somatic embryos.
  • the callus is spread over the surface of the medium MM + G2.
  • the dishes are placed in a culture chamber in the dark and at 26 ° C. After 15 days (minimum) on the MM + G2 medium, somatic embryos appear. These are subcultured on RM + G2 regeneration medium (20 to 25 per dish) and cultured at 28 ° C and in the light (16h / 24h). It is considered that 4 boxes in regeneration are sufficient to obtain regenerants.
  • the embryos After approximately 15 days on the RM + G2 medium, the embryos have developed into seedlings which are then subcultured in tubes on the T1 + G2 rooting medium. It is considered that 5 seedlings per event are necessary for successful acclimatization to the phytotron and shipments. These seedlings are placed in a culture chamber in the light.
  • calluses including. growth is not inhibited by the selection agent (ammonium glufosinate), usually and mainly composed of cells resulting from the division of a cell having integrated into its genetic heritage one or more copies of the selection gene.
  • the transformation efficiency is 10%.
  • calluses are identified, individualized, amplified and then cultivated so as to regenerate seedlings. In order to avoid any interference with untransformed cells, all these operations are carried out on culture media containing the selective agent.
  • the acclimatization of the seedlings is carried out when the latter have sufficiently developed on T1 + G2, that is to say when the roots reach the bottom of the tube and when the hill axis is sufficiently rigid and developed.
  • the seedlings are acclimated to the phytotron in pots with slightly enriched potting soil.
  • the buckets are arranged on a shelf located 1.5 meters from the lamps.
  • the acclimatization of 2 seedlings to the phytotron is necessary. On average, two weeks are required for weaning the seedlings.
  • the plants thus regenerated and acclimatized are then cultivated in a greenhouse where they can be crossed or self-fertilized.
  • This embodiment consisting in producing a heterozygous fertility restoring corn line for the fertility restoring gene (SSB / +) by co-transformation of a corn plant with the plasmids of examples 2a, 2b and 3a is the first embodiment.
  • a second embodiment consisting in producing a corn line restoring heterozygous fertility for the fertility restoring gene (SSB / +) consists in co-transforming a corn plant with the plasmids of examples 2a and 3a according to the same protocol as described above.
  • a third embodiment consisting in producing a corn line restoring heterozygous fertility for the fertility restoring gene (SSB / +) consists in co-transforming a corn plant with the plasmids of examples 2b and 3a according to the same protocol as described above.
  • the production of the fertility restoring corn line according to the present example 5b is carried out by co-transformation of a corn plant with the plasmids described according to examples 2c and 3b according to the technique of co-transformation by Agrobacterium tumefaciens known from one skilled in the art.
  • the bar gene (gene encoding the selection agent) is eliminated during co-transformation. 10% of the transformants obtained contain the 2 expression cassettes contained in the plasmids of Examples 2c and 3b. There will be segregation in the offspring.
  • This embodiment (4 th mode) consisting in producing a corn line restoring heterozygous fertility for the fertility restoring gene (SSB / +) is the preferred mode according to the present invention. However, other transformation techniques known to those skilled in the art can be used. 5, c) Molecular characterization of the transformants.
  • the transformant SSB-001a obtained according to Example 5a) was characterized by the same methodology as that described according to Example 4c of the present invention.
  • Hybridizations with probes pA9 and pHMWG reveal a large number of bands, reflecting an integration in several copies of the plasmids p3222 and p3223.
  • Hybridization with the Bar probe shows a simple profile, a major band is revealed for the 2 enzymes Eco RV and Hind III. The size of the fragment revealed by Hind III digestion is 8 kb. The very low intensity bands correspond to the very intense signals revealed previously with the pA9 and pHMWG probes.
  • the male-sterile corn line heterozygous (AMS / +) resistant to the herbicide Basta ® obtained according to Example 4a is crossed with the restorer corn lines heterozygous for the fertility restorer gene of fertility (SSB / +), plant resistant to the herbicide Basta ®, obtained according to example 5 to obtain F1 plants.
  • the same type of cross can be carried out between the heterozygous sterile male corn line (AMS / +), obtained according to Example 4b, and the heterozygous fertility restoring corn line for the fertility restorer gene (SSB / + ), obtained according to example 5.
  • the fertilization is carried out manually by a technique known to those skilled in the art.
  • the sterile male plant is led to flowering, the pollen of the plant (SSB / +) is deposited on the bristles of the sterile male line.
  • genetic analyzes are carried out on F1 plants. Genetic analyzes consist of counting, in relation to the presence of the different markers, among the descendants.
  • F1 is therefore composed of half of normal grains, the other half being depressed grains (phenotype 'petit grain' caused by the shrunken2 and brittle2 genes in antisense orientation).
  • the depressed grains are selected by visual sorting on the ear of corn. These grains are all resistant to Basta ® herbicide.
  • the depressed seeds which have the genotype (AMS / +; SSB / +) or (+ / +; SSB / +), are selected, then sown and germinated.
  • EXAMPLE 7 Self-fertilization of F1 plants for production of F2.
  • F1 plants resistant to Basta ® herbicide from depressed grains according to Example 6 are self-fertilized in order to obtain the F2 plants.
  • the F1 plants derived from depressed grains being made up of both genotype plants (SSB / +; + / +) and genotype plants (SSB / +; AMS / +), two cases of self-fertilization then arise:
  • the F1 plants of genotype (SSB / +; + / +) obtained according to Example 6 are self-fertilized. At the end of this self-fertilization, genetic analyzes are carried out on F2 plants:
  • This self-fertilization step of plants of genotype can be advantageously eliminated by a genotyping step by carrying out a specific PCR of the AMS transgene on F1 plants derived from depressed grains according to Example 6.
  • the depressed kernels are germinated, corn plants self-fertilized, and molecular sorting is performed by PCR. Only plants positive for the detection of the AMS transgene by PCR are conserved.
  • the specific primers of the AMS gene of interest pA9-Barnase-3'CaMV) allowing its amplification by PCR are the following:
  • the F1 plants of genotype (AMS / +; SSB / +) obtained according to Example 6 are self-fertilized in order to obtain the F2 progeny.
  • genetic analyzes are carried out on the F2 progeny:
  • EXAMPLE 8 Sowing of the depressed grains of the F2 progeny and genotyping of the plants (AMS / AMS; SSB / +).
  • AMS / AMS homozygous for the transgene from STB-27b
  • SSBOOIa heterozygous for the transgene from SSBOOIa
  • the genomic DNA of the offspring was extracted from 50 mg of leaves according to the protocol and use of the Qiagen Dneasy 96 plant kit extraction kit (Qiagen SA, 91974 Courtaboeuf cedex, France).
  • the Southern methodology is used to identify molecular profiles.
  • the genotype sought in this study is homozygosity for the T-DNA of STB-27b (“2 copies” of the Bar gene) and heterozygosity for the Bar gene SSB-001a (“1 copy” of the Bar gene).
  • Southern blots were carried out with the DNA of 8 daughter plants coming from an ear and this, on the 9 selected ears. 58 plants were genotyped according to the protocol described above. All the expected genotypes are represented among the 9 plants analyzed (2 different ears).
  • a total of 10 plants have the genotype of interest, namely: homozygosity for the T-DNA of STB-27b ("2 copies" of the Bar gene) and heterozygosity for the Bar gene SSB-001 a ("1 copy" of the gene Bar).
  • the observed frequencies are very close to the expected theoretical frequencies whatever the genotype considered (Ta ' bleau
  • EXAMPLE 9 Obtaining pre-basic seeds (AMS / AMS; + / +), basic seeds (AMS / +; + / +), and hybrid seeds.
  • the advantage of this cross is to multiply the line with the genotype (AMS / AMS; SSB / +) as well as to produce seeds with the genotype (AMS / AMS; + / +) or pre-basic seeds.
  • AMS / AMS; + / + All normal grains have the genotype (AMS / AMS; + / +). These are pre-basic seeds. 75% of the depressed grains have the genotype (AMS / AMS; SSB / +). Plants from these depressed seeds can be self-fertilized to multiply (maintain) genotype plants (AMS / AMS; SSB / +). The genotype plant (AMS / AMS; SSB / +) is also called a sterility maintenance plant.
  • Plants from depressed grains are crossed with an elite WT line. At the end of this crossing, the genetic analyzes are carried out:
  • Plants from genotype seeds are crossed with an elite line.
  • this elite line is identical to that used in the successive backcrossing step in order to introgress the genotype (AMS / AMS; SSB / +).
  • Plants from genotype seeds (AMS / +; + / +) are crossed with an elite male line.
  • the elite line used in this cross is different from that used in the cross described in Example 9.c).
  • EXAMPLE 10 Sort by densimetric table of depressed grains.
  • the densimetric table used makes it possible to divide into six fractions, grains of equivalent size and surface quality, but which differ between them by their specific weight.
  • a densimetric sorting is carried out on a batch of F3 ear seeds, coming from the self-fertilization of plants of genotype (+ / +; SSB / +). Theoretically, these ears have a proportion of 75% of depressed grains and 25% of normal grains. 33 ears were seeded so as to obtain approximately 500 grams of seeds. 6 grain fractions were formed by densimetric sorting.
  • Fractions 1 and 2 contain only depressed grains. In fractions 3, 4 and 5 we mainly have depressed grains but we also find some normal grains (ie 6.1, 8.2 and 19.1% respectively for fractions 3, 4 and 5).
  • Fractions 1 to 5 therefore correspond to depressed grains and fraction 6 to normal grains. There is also a small amount of unsorted grain. This small amount corresponds to both normal and depressed grains. However, visually, the depressed grains are larger in number compared. with normal grains.
  • the results of genetic analyzes confirm those of the sorting done on the grain phenotype for each of the fractions.
  • Fractions 1 to 5 correspond to depressed grains and fraction 6 to normal grains.
  • Example 11 Evaluation of the various stages of the production of hybrid seeds of corn starting from this new process.
  • AMS / AMS; + / + The production of pre-basic seeds (genotype (AMS / AMS; + / +)) was ensured by the cultivation of plants of genotype (AMS / AMS; SSB / +). These plants have been observed to be fertile males.
  • Plants of genotype (AMS / AMS; SSB / +) are self-fertilized. About 25% of the grains obtained in the offspring correspond to pre-basic seeds.
  • AMS / +; + / + The production of basic seeds (genotype (AMS / +; + / +)) was ensured by the cultivation of plants of genotype (AMS / AMS; + / +). These plants have been observed sterile males and have no deleterious effect on the vegetative aspect of the plant attesting that the use of an AMS transgene in the homozygous state is compatible with the hybrid corn seed production system such as as described in the present invention.
  • the genotype plants (AMS / AMS; + / +) were crossed with a wild genotype plant. 100% of the grains obtained in the offspring correspond to basic seeds.
  • hybrid seeds were obtained by crossing between sterile male plants of genotype (AMS / +; + / +) derived from basic seeds with a wild elite line. All plants of genotype (AMS / +; + / +) did show complete male sterility (100% sterility).
  • These grains can be separated by a densimetric sorting, preferably using a densimetric table.
  • All normal grains have the genotype (AMS / +; + / +). These grains can be separated by densimetric sorting, preferably using a densimetric table. This crossing saves time in obtaining hybrid seeds (6 to 12 months less) compared to the crossing described in the example.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de production et de multiplication de plants de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle, utiles pour la production de semences hybrides de maïs.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE SEMENCES HYBRIDES DE MAIS
La présente invention concerne un procédé de production et de multiplication de plants de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle, utiles pour la production de semences hybrides de maïs.
La production d'hybrides via « l'hybridation sexuelle » des parents ayant des fonds génétiques différents est de grande importance dans la pratique de l'agriculture moderne. En effet, le croisement entre plantes de même espèce mais non apparentées produit une descendance qui manifeste des caractères, tels que le rendement ou la résistance aux maladies, supérieurs à ceux des parents : il s'agit de l'effet d'hétérosis ou de vigueur hybride. Ainsi (a production d'hybrides est-elle souvent utilisée afin d'améliorer à la fois la qualité et le rendement des plantes cultivées. De plus, ces descendants sont génétiquement uniformes, notamment pour les caractères que sont la productivité, la sensibilité à la verse et à la sécheresse, la vigueur au départ et la sensibilité aux maladies et aux ravageurs, et donc intéressants pour les agriculteurs.
Sans intervention humaine, la production d'hybrides est limitée par les phénomènes d'autofécondation. La production de semences hybrides nécessite donc de privilégier la fécondation croisée en empêchant l'autopollinisation par des techniques mécaniques, chimiques ou génétiques. Les différentes voies permettant d'empêcher l'autofécondation en contrôlant la pollinisation incluent notamment - la "castration" manuelle, mécanique ou l'inactivation chimique des organes mâles de la plante,
- l'utilisation d'une plante modifiée présentant une stérilité mâle nucléaire récessive,
- l'utilisation d'une plante modifiée présentant une stérilité mâle cytopiasmique récessive,
- l'utilisation d'une plante mâle stérile nucléaire dominante (stérilité mâle artificielle ou AMS).
Cependant, certaines de ces techniques ne sont pas totalement efficaces et parfois même difficiles à mettre en œuvre. La "castration" coûte cher et peut provoquer des pertes de rendement en cas d'erreur.
L'efficacité de l'emploi d'agents chimiques, moins onéreux, dépend des conditions environnementales au moment de l'application du gamétocide, ce qui amène le producteur de semences à prendre des risques considérables à chaque saison.
L'utilisation d'une plante mâle stérile nucléaire récessive n'est pas facile à mettre en oeuvre, notamment en raison du maintien du caractère mâle stérile qui nécessite la resélection de plantes mâles stériles dans les descendants obtenus par autofécondation d'une plante hétérozygote pour le gène de stérilité mâle récessif. Pour être efficace, ce système implique donc l'utilisation d'un marqueur étroitement lié au gène de stérilité mâle et facilement identifiable.
La stérilité mâle peut être "acquise", c'est-à-dire qu'elle est indépendante d'une quelconque manipulation génétique par la voie de l'ADN recombinant. On peut distinguer la stérilité mâle cytoplasmique de la stérilité mâle nucléaire.
La stérilité mâle "cytoplasmique" ("CMS") est liée à des changements dans l'organisation et l'expression du génome mitochondrial, la stérilité mâle nucléaire résulte de mutations dans le génome du noyau de la cellule. Cependant la CMS n'est pas complète, 2/1000 des plantes restant fertiles. La perte de la diversité génétique cytoplasmique lorsque les sélectionneurs utilisent le même cytoplasme dans leurs programmes de sélection peut être par ailleurs un handicap.
La stérilité mâle peut être "artificielle" ("AMS"), c'est-à-dire qu'elle est induite par l'expression d'un gène conférant la stérilité mâle (gène AMS) qui est inséré soit dans le génome mitochondrial (stérilité mâle cytoplasmique), soit dans le génome nucléaire (stérilité mâle nucléaire).
Le système AMS permet d'éviter les problèmes associés aux autres méthodes.
En effet, contrairement à la CMS, le système AMS ne dépend pas de l'existence d'un mutant. Le maintien du caractère stérile de la lignée mâle peut être obtenu grâce à l'utilisation d'un gène de stérilité mâle dominant lié à un gène marqueur qui permet la sélection des plantes mâles stériles artificielles.
Le problème du maintien du caractère mâle stérile dans une lignée de plantes a été en partie résolu dans la demande de brevet WO 95/34634 qui prévoit le croisement entre une plante hétérozygote pour un gène dominant de stérilité mâle et une plante restauratrice de la fertilité puis la sélection des semences mâles stériles. Dans cette demande, l'utilisation d'un marqueur, lié au gène restaurateur de la fertilité, influant sur la régulation des gènes codant les enzymes de régulation de la synthèse des anthocyanes permet de différencier par la couleur les semences mâles stériles des semences mâles fertiles.
Cependant, le système de tri décrit dans cette demande de brevet ne permet pas de réaliser de façon fiable un tri de semences hybrides à grande échelle.
D'autre part, l'application générale de cette technologie est limitée dans la mesure où le choix du marqueur de coloration est conditionné par le génotype de la plante contenant le gène de restauration de la fertilité. En particulier, seules des plantes dont le génotype ne conditionne pas une production visible d'anthocyanine dans les semences peuvent être utilisées.
La présente invention propose donc un procédé de production et de multiplication de plants de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle, permettant une production de semences hybrides, et facilement applicable à grande échelle. Un avantage du procédé proposé est que son application n'est pas conditionnée par le génotype des plantes utilisées.
Cette approche repose notamment sur l'association du caractère de fertilité à un phénotype "petit grain". Le phénotype "petit grain" est préférentiellement obtenu par l'expression des gènes shrunken 2 et brittle 2 en orientation antisens. Le gène brittle 2 code l'une des 2 sous-unités de l'ADP glucose pyrophosphorylase, une enzyme intervenant dans la synthèse de l'amidon. Le fragment a été obtenu par la technique de RT-PCR à partir d'un extrait d'ARN totaux d'épi de maïs et d'après les données de Genbank (n°acc. S72425). Ce fragment représente un ADNc incomplet du gène brittle 2. Le gène shrunken 2 code l'autre sous-unité de l'ADP glucose pyrôphosphoryrlase. Le fragment a été obtenu par la technique de RT-PCR à partir d'un extrait d'ARN totaux d'épi de maïs et selon les données de Genbank (n° ace. S72425). Ce fragment contient la séquence complète de la région codante du gène shrunken 2.
L'inhibition de ces deux gènes de mutants ridés de taille et de poids inférieurs permet d'obtenir des grains de maïs de densité et/ou de taille inférieure. De tels grains peuvent être facilement triés par tamisage et/ou tri densimétrique, par exemple à l'aide d'une table ou colonne densimétrique, ou par flottaison, ce qui permet. la mise en œuvre d'une sélection fiable, simple, et automatisée et donc applicable à grande échelle.
Dans le cadre de la présente invention, on désigne par "hétérozygote pour le transgène AMS" un plant de maïs rendu mâle stérile par incorporation dans son génome d'une seule copie d'un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS"). En l'absence d'autre indication, ce plant ne contient pas le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain".
Dans le cadre de la présente invention, on désigne par "homozygote pour le transgène AMS" un plant de maïs rendu mâle stérile par incorporation dans son génome de deux copies situées au même endroit sur chacun des chromosomes frères d'un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle (AMS). En l'absence d'autre indication, ce plant ne contient pas le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain". Par "plant de maïs restaurateur de la fertilité comprenant dans son génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain"" on entend un plant de maïs hétérozygote ou homozygote pour ledit gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain". Préférentiellement, ledit plant de maïs est hétérozygote. En l'absence d'autre indication, ce plant ne contient pas de transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle (AMS).
Par "plant de maïs comprenant dans son génome un transgène AMS" on entend un plant de maïs hétérozygote ou homozygote pour ledit transgène AMS.
Par "plant de maïs de génotype sauvage", on entend un plant de maïs qui ne contient dans son génome ni un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle (AMS), ni un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain". De manière préférentielle, ledit plant de maïs de génotype sauvage appartient à une lignée élite.
Par phénotype "petit grain" on entend des grains dont la densité et/ou la taille et/ou la masse est (sont) inférieure(s) à celle(s) d'un grain de taille normale, préférentiellement de 40 à 50 % inférieure. Dans le cadre de la présente invention, ces grains pourront être appelés "grains déprimés" ou "grains ridés".
Par "marqueur de phénotype petit grain" ou "gène qui confère un phénotype petit grain" ou "gène codant un phénotype petit grain", on entend tout gène, en orientation sens ou en orientation antisens, qui, lorsqu'il est exprimé dans la plante confère un phénotype "petit grain". Parmi ces marqueurs peuvent être notamment cités les gènes shrunken 2, brittle 2, shrunken 1 , le locus miniature 1 qui code une invertase ; et plus généralement tout gène qui permet de diminuer le contenu en amidon et n'altère pas la viabilité des grains. Par "grain de taille normale" ou "grain normal" ou "grain.de phénotype normal", on entend notamment un grain dont la taille et/ou la densité et/ou la masse n'a(n'ont) pas été modifiée(s), en particulier par intégration dans le génome de la plante d'un marqueur de phénotype "petit grain".
Par "lignée élite", on entend une lignée présentant un potentiel agronomique et commercial important, à une période donnée.
Par "liaison" ou "liaison génétique", on entend une distance génétique suffisamment faible pour que les fréquences de recombinaison au cours de la méiose soient négligeables.
Par "protéine d'intérêt", on entend une protéine d'origine humaine ou animale pouvant présenter un intérêt thérapeutique et/ou prophylactique, telle que le collagène, la lipase gastrique, des anticorps, etc.
L'un des buts de l'invention est donc de proposer un procédé de production de semences hybrides de maïs par croisement d'un plant de maïs hétérozygote pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS") avec un plant de maïs de génotype sauvage. Le système selon la présente invention, qui permet avantageusement de maintenir le caractère mâle stérile de plants de maïs est applicable indépendamment du génotype des plants de maïs utilisés.
La solution apportée par l'invention consiste à produire dans un premier temps des semences de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS") et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain". A partir de ces semences, les sélectionneurs peuvent aisément introgresser le génotype homozygote pour le transgène AMS et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain" dans une lignée de maïs de génotype sauvage, et en particulier dans 'une lignée élite d'intérêt, par rétrocroisements successifs. Une lignée élite reconvertie homozygote pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS") et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain" peut ainsi être obtenue. L'autofécondation de plants de maïs issus de ces semences permet ensuite de produire : des semences homozygotes pour le transgène AMS générant des plants de maïs mâles stériles qui, croisés avec des plants de maïs de génotype sauvage, et en particulier des plants appartenant à une lignée élite utilisée pour la reconversion, le cas échéant, produiront des semences hétérozygotes pour le transgène AMS. La fécondation ' de plants de maïs mâle stériles issus de ces semences par un plant de maïs de génotype sauvage, non-apparenté, produit alors des semences hybrides bénéficiant de l'effet de vigueur (hétérosis), des semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes ou homozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", générant des plants de maïs non mâles stériles dont l'autofécondation produit notamment des semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", assurant ainsi le renouvellement des plants de maïs mâles stériles d'intérêt.
Avantageusement, lorsque le transgène AMS est lié génétiquement à un gène codant une protéine d'intérêt, les semences hybrides homozygotes pour le transgène AMS s'avèrent particulièrement utiles pour générer des plants de maïs produisant ladite protéine d'intérêt.
Dans le cadre de la présente invention, une sélection des semences de maïs par le phénotype "petit grain" peut notamment être mise en œuvre par une méthode de tri dimensionnel ou densimétrique.
Un tri dimensionnel peut être réalisé de manière à séparer les grains en fonction de leur longueur, en utilisant par exemple un trieur à alvéoles, de leur largeur, avec par exemple un trieur à disques, ou de leur épaisseur, en utilisant par exemple un calibreur. Le principe d'un tri densimétrique repose sur une séparation des grains selon leur densité et utilise notamment une colonne densimétrique ou une table densimétrique, ou un système de flottaison.
Plus particulièrement, - le trieur à alvéoles est composé d'un cylindre horizontal tournant. La séparation se fait par la force centrifuge. Les plus petits grains entrent dans les alvéoles (qui tapissent l'intérieur du cylindre) et y sont maintenus par la force centrifuge. - le trieur à disques se compose de disques épais disposés verticalement et creusés dans leur épaisseur d'alvéoles de dimension adaptée.
- les calibreurs les plus classiques sont les calibreurs par épaisseur composés de tamis plans ou cylindriques à perforations allongées obligeant la graine à se présenter selon sa plus faible épaisseur pour passer au travers. Le calibreur à perforations rondes est du même principe mais les orifices ronds et de petits «redents» à l'intérieur du cylindre obligent la graine à se présenter verticalement pour traverser le tamis.
- la colonne densimétrique comprend un distributeur vibrant qui introduit le mélange de grains à trier à mi-hauteur d'une colonne creuse dans laquelle monte un flux d'air homogène. Les particules lourdes descendent alors que les plus légères remontent. La séparation est ainsi effectuée.
- une table densimétrique permet de séparer des corps de mêmes dimensions mais de poids spécifique différent. Le poids spécifique correspond à une mesure de la masse d'une quantité de semences par rapport à son volume. Le principe de l'appareil est un plan de travail (souvent constitué d'un réseau en fil métallique ou textile) traversé par un flux d'air uniforme qui fluidifie le mélange de semences et en provoque la stratification schématiquement en deux couches. Les produits lourds restent près de la table, les produits légers au-dessus. La séparation des deux couches est obtenue par réglage de l'inclinaison du plan de travail (dans deux directions) et par un mouvement d'agitation de va-et-vient transversal. On pourra par exemple utiliser une table densimétrique telle que celle commercialisée par la société Cimbria Heid GmbH (Stockerau, Autriche).
- le système de flottaison est un système qui permet de séparer les grains en fonction de leur densité et/ou masse en se basant sur leur capacité de flottaison sur un liquide, en particulier l'eau. Les grains les plus lourds (ayant la capacité de flottaison la plus faible) sont retrouvés au fond et les grains les plus légers (ayant la capacité de flottaison la plus élevée) sont retrouvés en surface du liquide, ce qui permet la séparation. Lorsque ce système est utilisé, les semences doivent rester le moins longtemps possible au contact de J'eau afin de pas altérer leur capacité de germination. Une étape de séchage peut parfois être nécessaire.
La présente invention propose donc un procédé de production de semences de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS") et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", comprenant les étapes consistant à ; a) croiser un plant de maïs mâle stérile hétérozygote pour le transgène AMS avec un plant de maïs restaurateur de la fertilité comprenant dans son génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", b) sélectionner par le phénotype "petit grain" les semences de maïs comprenant dans leur génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", c) autoféconder les plants de maïs issus des semences sélectionnées selon l'étape b), d) sélectionner les semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain".
De façon préférentielle, au moins une étape de sélection du procédé comprend un tri densimétrique, notamment à l'aide d'une table ou d'une colonne densimétrique, ou d'un système de flottaison.
L'étape de sélection ainsi effectuée présente l'avantage de permettre un tri facilement réalisable et automatisable des grains en fonction de leur phénotype "petit grain" ou "normal".
Selon un mode particulier de réalisation, l'étape b) du procédé décrit ci-dessus peut être avantageusement remplacée par une étape de génotypage. La présente invention propose donc également un procédé de production de semences de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS") et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", comprenant les étapes consistant à : a) croiser un plant de maïs mâle stérile hétérozygote pour le transgène AMS avec un plant de maïs restaurateur de la fertilité comprenant dans son génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", b) réaliser un génotypage des semences obtenues par le croisement selon l'étape a), et sélectionner les semences de maïs comprenant dans leur génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", c) autoféconder les plants de maïs issus des semences génσtypées selon l'étape b), d) sélectionner les semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain". Selon un mode particulier de réalisation, ledit plant de maïs hétérozygote pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle contient en outre un gène codant une protéine d'intérêt, de préférence lié génétiquement au transgène AMS.
La mise en œuvre des procédés décrits ci-dessus permet de produire une semence de maïs homozygote pour un transgène AMS et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain". La présente invention vise donc une semence de maïs homozygote pour un transgène AMS et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain" susceptible d'être obtenue par l'un des procédés précédents. De manière préférentielle, le génotype AMS homozygote et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain" peut être introgresse dans une lignée de maïs de génotype sauvage, et en particulier dans une lignée élite d'intérêt, par rétro-croisements successifs.
La mise en culture, puis l'auto-fécondation des plants de maïs obtenus à partir de semences ci-dessus (homozygotes pour un transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain") produit des semences de maïs homozygotes pour le transgène AMS, ainsi que des semences de maïs homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes ou homozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain". Les semences de maïs homozygotes pour le transgène AMS sont facilement différentiables des autres semences ainsi produites car elles seules présentent des grains de phénotype normal.
La présente invention propose donc un procédé de production de semences de maïs homozygotes pour un transgène- conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS"), comprenant les étapes consistant à : a) auto-féconder des plants de maïs issus de semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", susceptibles d'être obtenues par l'un des procédés précédemments décrits, b) sélectionner des semences homozygotes pour le transgène AMS.
De façon préférentielle l'étape de sélection comprend un tri densimétrique, notamment à l'aide d'une table ou d'une colonne densimétrique, ou d'un système de flottaison. Cette étape permet avantageusement de trier les semences homozygotes pour le transgène AMS par leur phénotype de grain normal. Selon un autre mode de réalisation, le procédé de production de semences de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS"), comprend les étapes consistant à : a) croiser un plant de maïs mâle stérile hétérozygote pour le transgène AMS avec un plant de maïs restaurateur de la fertilité comprenant dans son génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain ", b) sélectionner par le phénotype "petit grain" les semences de maïs comprenant dans leur génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", c) autoféconder les plants de maïs issus des semences sélectionnées selon l'étape b), d) sélectionner des semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", e) autoféconder des plants de maïs issus de semences selon l'étape d), f) sélectionner des semences homozygotes pour le transgène AMS. Selon un mode particulier de réalisation, ledit plant de maïs hétérozygote pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle contient en outre un gène codant une protéine d'intérêt, de préférence lié génétiquement au transgène AMS. L'étape e).de ce procédé pourra éventuellement être précédée d'une étape de rétrocroisements successifs avec un plant de maïs de génotype sauvage, et en particulier, un plant de maïs appartenant à une lignée élite, de manière à reconvertir ce plant de maïs de génotype sauvage avec le génotype homozygote pour le transgène AMS et hétérozygote pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain". Les semences issues de cette étape de rétro- croisement sont alors utilisées pour la poursuite du procédé.
De façon préférentielle, au moins une étape de sélection, et en particulier l'étape f), comprend un tri densimétrique, notamment à l'aide d'une table ou d'une colonne densimétrique, ou d'un système de flottaison. Cette étape permet avantageusement de trier les semences homozygotes pour le transgène AMS par leur phénotype de grain normal.
Selon une autre variante, l'étape b) du procédé ci-dessus est remplacée par une étape de génotypage. La présente invention a donc également trait à un procédé de production de semences de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS") comprenant les étapes consistant à : a) croiser un plant de maïs mâle stérile hétérozygote pour le transgène AMS avec un plant de maïs restaurateur de la fertilité comprenant dans son génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", b) réaliser un génotypage des semences obtenues par le croisement selon l'étape a), et sélectionner les semences de maïs comprenant dans leur génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", c) autoféconder les plants de maïs issus des semences génotypées selon l'étape b), d) sélectionner les semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", e) autoféconder des plants de maïs issus de semences selon l'étape d), f) sélectionner des semences homozygotes pour le transgène AMS. Selon un mode particulier de réalisation, ledit plant de maïs hétérozygote pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle contient en outre un gène codant une protéine d'intérêt, de préférence lié génétiquement au transgène AMS. L'étape e) de ce procédé pourra éventuellement être précédée d'une étape de rétrocroisements successifs avec un plant de maïs de génotype sauvage, et en particulier, un plant de maïs appartenant à une lignée élite, de manière à reconvertir ce plant de maïs de génotype sauvage avec le génotype homozygote pour le transgène AMS et hétérozygote pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain". Les semences issues de cette étape de retro- croisement sont alors utilisées pour la poursuite du procédé.
De façon préférentielle, au moins une étape de sélection, et en particulier l'étape f), comprend un tri densimétrique, notamment à l'aide d'une table ou d'une colonne densimétrique, ou d'un système de flottaison. Cette étape permet avantageusement de trier les semences homozygotes pour le transgène AMS par leur phénotype de grain normal.
La mise en culture de semences homozygotes pour le transgène AMS permet alors de générer des plants de maïs mâles stériles qui, croisés avec des plants de génotype sauvage, et en particulier avec des plants appartenant à une lignée élite, produisent des semences hétérozygotes pour le transgène AMS. La lignée élite utilisée pour ce croisement peut en particulier être celle utilisée pour l'étape de rétro- croisement éventuellement mise en œuvre dans les procédés précédents. Dans ce cas, les semences produites peuvent servir à produire des semences commerciales issues d'un hybride de maïs. Selon un autre mode de réalisation, la lignée élite de type sauvate peut être remplacée par un hybride de maïs pour obtenir des semences qui serviront à produire un hybride trois voies.
Selon un autre aspect de l'invention, le procédé de production de semences de maïs homozygotes pour le transgène AMS peut être utilisé pour la production de protéines d'intérêt, notamment thérapeutique et/ou prophylactique. La protéine d'intérêt peut être produite dans toute la plante ou alors préférentiellement concentrée dans des organes spécifiques, comme les graines. Le procédé selon l'invention a l'avantage de permettre de produire de telles protéines dans des conditions contrôlées et à grande échelle. Il est donc d'un grand intérêt pour le domaine pharmaceutique.
Pour se faire, un vecteur contenant le gène barnase, conférant la stérilité mâle, sous le contrôle du promoteur A9 et un gène d'intérêt thérapeutique et/ou prophylactique peut être construit. Ce vecteur peut servir à l'obtention de plantes, contenant le gène conférant la stérilité mâle et le gène d'intérêt thérapeutique et/ou prophylactique, qui ensuite pourront être utilisées selon le système de production tel que décrit afin de produire des graines exprimant la protéine d'intérêt thérapeutique et/ou prophylactique.
En particulier, un tel vecteur peut servir à l'obtention d'un plant de maïs hétérozygote pour un transgène AMS (et donc pour le gène codant la protéine d'intérêt), lequel plant de maïs peut ensuite être croisé avec un plant de maïs restaurateur de fertilité de génotype (+/+ ; SSB/+). Avantageusement, le gène d'intérêt thérapeutique et/ou prophylactique est lié génétiquement au transgène AMS.
Un tel système permet de produire uniquement la protéine d'intérêt thérapeutique et/ou prophylactique dans la graine par exemple ou dans un organe de la plante et ce quelque soit le stade de développement en fonction de la séquence régulatrice utilisée dans le gène codant ladite protéine d'intérêt, puisque la protéine conférant la stérilité mâle n'est pas produite dans les organes de la plante. Ce système permet ainsi d'éviter la dissémination du transgène d'intérêt thérapeutique et/ou prophylactique via le pollen, puisque les plantes sont complètement mâle stériles,
La présente invention concerne donc également un procédé de production d'une semence hétérozygote pour un transgène AMS comprenant le croisement d'un plant de maïs issu d'une semence homozygote pour un transgène AMS, susceptible d'être obtenue par l'un des procédés de production d'une semence homozygote pour le transgène AMS décrits précédemment, avec un plant de maïs de génotype sauvage.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé de production d'une semence hétérozygote pour un transgène AMS est caractérisé en ce que l'un des procédés de production d'une • semence homozygote pour le transgène AMS décrits précédemment comprend en outre le croisement d'un plant de maïs issu de ladite semence homozygote pour un transgène AMS avec un plant de maïs de génotype sauvage. La fécondation de plants de maïs mâle stériles issus de ces semences par un plant de maïs de génotype sauvage, non-apparenté, produit avantageusement des semences hybrides bénéficiant de l'effet de vigueur (hétérosis).
Selon un autre aspect, le système proposé par la présente invention permet avantageusement de maintenir des plants de maïs homozygotes pour un transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain". Les procédés de production de semences de maïs homozygotes pour le transgène AMS décrits ci-dessus comprennent en effet une sélection finale de semences notamment sur la base de leur phénotype de grain normal. Les semences de phénotype "petit grain" non sélectionnées par ces procédés peuvent être semées, puis les plants générés auto-fécond es, produisant ainsi notamment des semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain".
L'invention concerne donc un procédé de multiplication d'un plant de maïs homozygote pour un transgène AMS et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain" comprenant les étapes consistant à : a) autoféconder des plants de maïs homozygotes pour un transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", susceptibles d'être obtenus à partir d'une semence d'un des procédés de production de semences homozygotes pour un transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain" précédemment décrits, b) sélectionner des semences homozygotes pour le transgène AMS et de phénotype "petit grain ", c) sélectionner les semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain" obtenues par autofécondation des plants de. maïs obtenus à partir des semences obtenues selon l'étape b). De façon préférentielle, l'étape b) du procédé ci-dessus comprend un tri densimétrique, notamment à l'aide d'une table ou d'une colonne densimétrique, ou d'un système de flottaison. La présente invention a également pour objet des constructions nucléotidiques, appelées cassettes d'expression, comprenant une séquence nucléotidique promotrice liée de manière opérante à au moins un gène d'intérêt. Ledit gène d'intérêt peut être également associé à d'autres éléments de régulation tels que des activateurs et des séquences de terminaison de transcription (terminateurs). D'autres éléments tels que les introns, enhancers, séquences de polyadénylation et dérivées "peuvent également être présents dans la séquence nucléique d'intérêt, pour améliorer l'expression ou le fonctionnement du gène transformant. La cassette d'expression peut aussi contenir des séquences 5' non traduites dites "leader". De telles séquences peuvent améliorer la traduction.
De façon préférentielle, dans les procédés de production de semences précédemment décrits, le plant de maïs comprenant un transgène AMS conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle est caractérisé en ce que le transgène AMS, de préférence le gène bàrnase (Hartley, 1988 ; Gène Bank n°X 12871 ), est compris dans une cassette d'expression, sous le contrôle d'un promoteur spécifique de la pollénogenèse et d'un terminateur, lié génétiquement à un gène codant un agent de sélection sous le contrôle d'un promoteur et d'un terminateur. De manière avantageuse, ladite casette d'expression peut comprendre en outre un gène codant une protéine d'intérêt. Préférentiellement, ledit gène codant une protéine d'intérêt est lié génétiquement au transgène AMS, en particulier le gène barnase. De manière préférentielle encore, le gène codant une protéine d'intérêt n'est pas sous le contrôle dudit promoteur spécifique de la pollénogenèse. Le promoteur spécifique de la pollénogenèse est notamment un promoteur permettant une expression spécifique dans l'anthère choisi parmi le groupe consistant en le promoteur A3 (WO 92 11379), le promoteur A6, le promoteur A9 (WO 92 11379), correspondant à la région 5' non codante du gène A9 d'Arabidopsis thaliana, et les promoteurs spécifiques du tapis de l'anthère tels que TA29, TA26, TA13 (WO 89 10396) ou Mac2 (WO 00 68 403).
Parmi les gènes codant un agent de sélection (également appelés gènes marqueurs de sélection), peuvent être notamment utilisés des gènes qui confèrent une résistance à un antibiotique (Herrera-Estrella et al., 1983), tel que l'hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine ou à des herbicides (EP 242 246), tels que le glufosinate, le glyphosate ou le bromoxynil.
Préférentiellement, ledit gène codant un agent de sélection est choisi parmi le gène bar (White et al., 1990 ; Gène Bank n° X 17220) qui confère la résistance à l'herbicide Basta® (glufosinate) et le gène NPTII qui confère la résistance à la kanamycine (Bevan et al., 1983).
Le système d'excision pour éliminer le gène codant un agent de sélection peut être un système de transposition, tel que notamment le système Ac/Ds du maïs (WO
02 101061 ), ou un système de recombinaison, tel que notamment le système Cre/lox du bactériophage P1 , le système FLP/FRT de la levure (Lyzrik et al., 1997), la recombinase Gin du phage Mu, la recombinase Pin de E. coli ou le système R RS du plasmide pSR1. Un système de co-transformation (Komari et al., 1996 ) peut également être utilisé. Préférentiellement, le système utilisé sera le système Ac/Ds du maïs. Selon un mode préféré, ledit gène est compris à l'intérieur de l'élément transposable Ds (également appelé élément dissociant ou séquence mobilisable d'un transposon).
Le transposon Ds utilisé est décrit dans la publication de Yoder et al., (1993).
L'élément Ds est un élément Ac qui a subi d'importantes mutations ou délétions dans la séquence codant la transposase. H ne peut s'exciser de son site d'insertion qu'en présence d'une source de transposase active Ac. Il est donc Ac dépendant. Un système préféré d'élimination de gène codant un agent de sélection peut comprendre deux composantes :
- une première plante ne possédant aucune transposase active, dans laquelle un construit comprenant la cassette d'expression du gène d'intérêt et celle du gène codant un agent de sélection encadré par les séquences mobilisables d'un transposon peut y être intégré.
- une deuxième plante contenant dans son génome un gène codant une transposase active endogène. Le croisement de ces deux plantes conduit à l'obtention de régénérants, obtenus à partir de plantes F1 ou de plantes F2 sélectionnées pour la présence du gène d'intérêt sans gène codant un agent de sélection.
Préférentiellement selon l'invention, le promoteur associé au gène . codant un agent de sélection est un promoteur constitutif, tel que le promoteur Actine-lntron- actine, correspondant à la région en 5' non codante du gène de l'actine 1 du riz et son premier intron (Me Elroy et al., 1991 ; Gène Bank n° S 44221). La présence du premier intron actine permet d'augmenter le niveau d'expression d'un gène lorsqu'il est fusionné en 3' d'un promoteur. Cette séquence promotrice permet par exemple l'expression constitutive du gène bar.
Parmi les terminateurs pouvant être utilisés avec le transgène AMS du le gène codant un agent de sélection, on peut notamment citer :
- le terminateur 3' Nos, terminateur de la nopaline synthase qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase provenant du plasmide Ti d'Agrobacteirum tumefaciens souche à nopaline (Depicker et al.,
1982), et
- le terminateur 3' CaMV, correspondant à la région 3' non codante de la séquence du virus à ADN bicaténaire circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 35S (Franck et al. 1980 ; Gène Bank n° V 00141).
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une cassette d'expression comprenant un gène restaurateur de la fertilité lié génétiquement à au moins un gène codant un phénotype "petit grain", associés à des éléments permettant leur expression dans les cellules végétales, notamment un promoteur et un terminateur de transcription.
Parmi les promoteurs de transcription pouvant être utilisés en association avec le gène codant un phénotype "petit grain", on peut notamment citer :
- le promoteur HMWG (High Molecular Weight Glutenin) correspondant à la région 5' non codante du gène de la gluténine du blé (Triïicum aesϋvum), une protéine de réserve de l'albumen. Ce promoteur, spécifique de la semence, est décrit dans la publication de Robert et al. (1989),
- le promoteur B32, décrit dans la publication de Di Fonzo N et ai. (1988).
De façon préférentielle, ladite cassette d'expression comprenant un gène restaurateur de la fertilité lié génétiquement à au moins un gène codant un phénotype "petit grain", est caractérisée en ce que ledit gène restaurateur de la fertilité est le gène barstar (Hartley, 1998) placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique de la pollénogenèse, notamment un promoteur spécifique de l'anthère tel que pA3, pA6, pA9, pTA29, ou du promoteur Mac2, et du terminateur 3'CaMV ou 3'Nos, lié génétiquement à un gène codant un agent de sélection sous le contrôle du promoteur Actine-intron actine et du terminateur 3'CaMV ou 3'Nos.
Parmi les gènes codant un agent de sélection, peuvent être notamment utilisés des gènes qui confèrent une résistance à un antibiotique tel que l'hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine ou à des herbicides tels que le glufosinate, le glyphosate ou le bromoxynil. Préférentiellement, ledit gène codant un agent de sélection est choisi parmi le gène bar qui confère la résistance à l'herbicide Basta® et le gène NPTII qui confère la résistance à la kanamycine.
Préférentiellement, lé gène codant un phénotype "petit grain" est choisi parmi les gènes shrunken 2 et brittle 2 en orientation antisens.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un vecteur, notamment un plasmide, caractérisé en ce qu'il contient au moins une cassette d'expression telle que décrite précédemment. L'invention porte en outre sur un hôte cellulaire, notamment une bactérie telle que Agrobacterium tumefaciens, transformé par ledit vecteur. Un tel hôte cellulaire est utile pour transfecter des cellules de maïs avec un vecteur selon l'invention.
L'invention concerne donc également une cellule de maïs transformée par au moins un vecteur tel que décrit précédemment. La transformation de cellules végétales peut être réalisée par transfert des vecteurs susmentionnés dans les protoplastes, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol (PG) en présence de cations divalents (Ca2+) selon la méthode décrite dans l'article de Krens et al. (1982). La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article de Fromm et al.
(1986).
La transformation des cellules végétales peut encore être réalisée par utilisation d'un canon à gène permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, délivrant ainsi des gènes à l'intérieur du noyau cellulaire, notamment selon la technique décrite dans l'article de
Finer et al. (1992).
Une autre méthode de transformation des cellules végétales, est celle de la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées par un vecteur selon l'invention, ledit hôte cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences d'ADN d'intérêt initialement contenues dans le génome du vecteur susmentionné.
Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon les méthodes décrites dans les articles de Bevan (1984) et d'An et al. (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Jouanin et al, (1987). De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extra-chromosomique inducteur de tumeurs Ti d' Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (Watson
Figure imgf000021_0001
Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Ce plasmide est maintenu dans Agrobacterium.
La présente invention a également pour objet de produire des plants de maïs transgéniques, parties de plante ou extraits de plante, caractérisés en ce qu'ils sont régénérés à partir de la cellule de plante transformée. L'invention concerne notamment un plant de maïs restaurateur de la fertilité caractérisé en ce qu'il comprend dans son génome un gène restaurateur de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain" ou un plant de maïs homozygote pour un transgène AMS et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", obtenu à partir d'une semence de maïs homozygote pour un transgène AMS et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain".
L'invention vise également un kit pour la mise en œuvre d'un procédé de multiplication d'un plant de maïs homozygote pour un transgène AMS et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain" précédemment décrit, caractérisé en ce qu'il comprend des semences de maïs homozygotes pour un transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", et des oligonucléotides spécifiques du transgène AMS utiles en tant qu'amorces pour la détection par PCR des semences homozygotes pour un transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain".
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée :
LEGENDE DES FIGURES
La figure 1 représente le schéma de principe d'une succession d'étapes conduisant à la production d'une semence hybride selon l'invention. La figure 2 représente le plasmide pRec 274 comprenant le gène barnase, conférant la stérilité mâle, et le gène bar, conférant la résistance à l'herbicide Basta®.
La figure 3 représente le plasmide donneur pBIOS 274 comprenant le gène de résistance à la spectinomycine ainsi que l'ADN-T porteur du gène barnase, sous le contrôle du promoteur A9, et du gène bar, sous le contrôle du promoteur Actine de riz.
La figure 4 représente le plasmide donneur pBIOS 424 comprenant le promoteur A9-bamase-terminateur 3' CaMV et le gène de résistance à la kanamycine Nptll dans un élément dissociant Ds. La figure 5 représente le plasmide p3222 comprenant la séquence antisens du gène brittle 2 ainsi que le gène barstar restaurateur de fertilité.
La fiαure 6 représente le plasmide p3223 comprenant la séquence antisens du gène shrunken 2 ainsi que le gène barstar restaurateur de fertilité.
La figure 7 représente le plasmide p4962 comprenant les séquences antisens des gènes shrunken 2 et brittle 2 ainsi que le gène barstar restaurateur de fertilité.
La figure 8 représente le plasmide pDM 302 comprenant la cassette d'expression du gène bar. La figure 9 représente le plasmide donneur pBIOS 273 qui comporte une cassette d'expression comprenant le promoteur Actine de riz, le gène Bar, et le terminateur 3'Nos.
EXEMPLES :
Une illustration non limitante d'un des procédés selon la présente invention est décrite dans la figure 1.
La construction des différents plasmides ainsi que leur ligation et la transformation des bactéries Escherichia coli XLI blue rendues préalablement compétentes, est réalisée grâce aux techniques usuelles d'ADN recombinant (Sambrook et al., 1989).
La construction des vecteurs d'expression et les techniques de transformation utilisées sont à la portée de l'homme du métier suivant les techniques standard.
EXEMPLE 1 : Construit AMS.
La) Construction d'un plasmide (pRec 274) comprenant le gène barnase, conférant la stérilité mâle, lié au gène bar, conférant la résistance à l'herbicide Basta®.
Le vecteur utilisé pour la transformation du maïs par Agrobacterium tumefaciens se présente sous la forme d'un plasmide superbinaire d'environ 50 kb (pRec 274). Le vecteur superbinaire utilisé pour la transformation contient :
- une région ori : origine de réplication plasmidique Col El, nécessaire au maintien et à la multiplication du plasmide dans Escherichia coli. Cette origine de réplication n'est pas fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens,
- une origine de réplication fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens et dans Escherichia coli,
- la région cos du bactériophage lambda, pouvant présenter une utilité pour la manipulation du vecteur in vitro,
- les régions virB, virC et virG supplémentaires d' Agrobacterium tumefaciens qui augmentent l'efficacité de transformation, - les gènes de résistance à la tétracycline (Tetra) et à la spectinomycine (Spect) qui s'expriment uniquement dans les bactéries,
- un ADN-T porteur des gènes barnase, conférant la stérilité mâle, et bar, conférant la résistance à l'herbicide Basta®, ces deux gènes étant opérationnellement liés à des éléments permettant leur transcription. Dans le présent exemple, le gène barnase est sous le contrôle du promoteur A9 et du terminateur 3' CaMV ; le gène bar étant sous le contrôle du promoteur actine-intron actine de riz et du terminateur 3' Nos.
Le gène bar de Streptomyces hygroscopicus code une Phosphinothricine Acyl Transferase (PAT) qui détoxifie la phosphinothricine (agent de sélection de l'herbicide Basta®) par acétylation (White et al., 1990). Il est généralement utilisé pour sélectionner des plantes transformées qui contiennent à la fois le gène d'intérêt et ce gène codant un agent de sélection, et qui sont donc résistantes à l'herbicide.
Le gène barnase, qui confère la stérilité mâle, code une Ribonucléase (RNase). Ce gène a été isolé à partir de Bacillus amyloliquefasciens et est décrit dans la publication de Hartley (1988).
Le plasmide superbinaire pRec 274 est représenté dans la Figure 2.
Ce vecteur superbinaire est obtenu par recombinaison homologue d'un plasmide accepteur pSB1 (EP 672 752) dérivé d'un plasmide Ti dAgrobacterium tumefaciens avec un plasmide donneur pBIOS 274 (Figure 3), dérivé de pUC (Messing, 1983).
Le plasmide donneur possède le gène de résistance à la spectinomycine ainsi que l'ADN-T porteur du gène barnase, sous le contrôle du promoteur A9, et du gène bar, qui est aussi un gène de sélection, sous le contrôle du promoteur Actine de riz.
Les plasmides donneur et accepteur possèdent une région d'homologie suffisante pour permettre une recombinaison homologue et obtenir le vecteur dit superbinaire.
La technique de transformation par Agrobacterium tumefaciens permet l'intégration du seul ADN-T constitué des bordures droite (RB) et gauche (LB) encadrant le gène d'intérêt (barnase) et le gène codant un agent de sélection. 1.b) Construction d'un plasmide (pRec 424) comprenant le gène barnase conférant la stérilité mâle lié au. gène NPT-II conférant la résistance à la kanamycine.
Le vecteur utilisé pour la transformation du maïs par Agrobacterium tumefaciens se présente sous la forme d'un plasmide superbinaire d'environ 50 kb (pRec 424).
Le vecteur superbinaire utilisé pour la transformation contient :
- une région ori : origine de réplication plasmidique Col El, nécessaire au maintien et à .la multiplication du plasmide dans Escherichia coli. Cette origine de réplication n'est pas fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens,
- une origine de réplication fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens et dans Eschericia coli,
- la région cos du bactériophage lambda, pouvant présenter une utilité pour la manipulation du vecteur in vitro, - les régions virB, virC et virG supplémentaires dAgrobacterium tumefaciens qui augmentent l'efficacité de transformation,
- les gènes de résistance à la tétracycline (Tetra) et à la spectinomycine (Spect) qui s'expriment uniquement dans les bactéries,
- un ADN-T porteur des gènes barnase, conférant la stérilité mâle, et Nptll inséré dans un élément Ds, conférant la résistance à la kanamycine, ces deux gènes étant opérationnellement liés à des éléments permettant leur transcription. Dans le présent exemple, le gène barnase est sous le contrôle du promoteur A9 et du terminateur 3' CaMV ; le gène Nptll inséré dans un élément Ds étant sous le contrôle du promoteur Actine et du terminateur et du terminateur 3' Nos.
Le gène Nptll a été isolé à partir du transposon Tn5 d'Escherichia coli (Berg et al. 1983). Ce gène code pour l'enzyme néomycine phosphotransférase de type 11 qui catalyse la O-phosphorylation d'antibiotiques aminoglycosides tels que néomycine, kanamycine, gentamycine et G418 (Davies et Smith, 1978). Ce gène confère la résistance à la kanamycine, qui est utilisée comme agent de sélection lors de la transformation génétique végétale. Il est décrit par Bevan et al. (Genbank n°U00004).
Le gène barnase, qui confère la stérilité mâle, code une Ribonucléase comme mentionné dans l'exemple 1.a ci-dessus. Ce vecteur superbinaire est obtenu par recombinaison homologue d'un plasmide accepteur pSB1 (EP .672 752) dérivé d'un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens avec un plasmide donneur pBIOS 424 (Figure 4) dérivé de pUC (Messing, 1983).
Le plasmide donneur pBIOS 424 possède le gène de résistance à la spectinomycine ainsi que l'ADN-T porteur du gène barnase sous le contrôle du promoteur A9 et du gène Nptll mis sous le contrôle du promoteur Actine inséré dans un élément Ds.
Le plasmide donneur pBIOS 424 (promoteur A9-barnase-terminateur 3' CaMV et. le gène de résistance à la kanamycine Nptll dans un élément dissociant Ds) a été généré de la manière suivante : Le fragment contenant la cassette promoteur A9 - gène barnase - terminateur
3' CaMV a été isolé par : a) restriction avec hol, b) traitement à la T4 DNA Polymérase pour générer des bouts francs, et c) restriction avecXi al à partir du plasmide pBIOS 274 (Figure 3). Ce fragment (X/iol/blunt - Xba\) a ensuite été introduit dans le vecteur pBIOS
415 (décrit ci-dessous) ouvert à l'aide des enzymes de restriction EcoRV et Xσal.
Le fragment EcoRV-X al ainsi généré contient les séquences plasmidiques du vecteur pSB12 (Japan Tobacco, EP 672 752) et la cassette élément Ds - promoteur Actine - intron actine - gène NPTII - terminateur Nos - élément Ds.
Le plasmide pBIOS 415 contient le gène de la GFP sous contrôle du promoteur
CsVMV (WO 97/48819) et du terminateur Nos (fragment Xba\ - Xhol) dans le vecteur accepteur pBIOS 340. Le vecteur pBIOS 340 est un vecteur contenant les séquences plasmidiques du vecteur pSB12 (Japan Tobacco, EP 672 752) et la cassette élément Ds - promoteur Actine - intron actine - gène NPTII - terminateur
Nos - élément Ds. Les plasmides donneur et accepteur possèdent une région d'homologie suffisante pour permettre l'obtention du vecteur dit superbinaire par recombinaison homologue.
La technique de transformation par Agrobacterium tumefaciens permet l'intégration du seul ADN-T constitué des bordures droite (RB) et gauche (LB) encadrant le gène d'intérêt (gène barnase) et le gène codant pour un agent de sélection.
EXEMPLE 2 : Construit Restaurateur-Marqueur phénotypique lié à la taille du grain.
2.a) Construction d'un plasmide (p3222, figure 5) comprenant la séquence antisens du gène brittle 2 ainsi que le gène barstar restaurateur de fertilité.
Le gène brittle 2 code une sous-unité de la ADP Glucose Pyrophosphorylase, enzyme intervenant dans la synthèse de l'amidon. En orientation antisens, il permet d'inhiber la synthèse de cette sous-unité ce qui produit un phénotype mutant dont la taille du grain est 50% inférieure à la taille normale.
Le gène barstar code un inhibiteur spécifique de la Barnase. Il a été isolé à partir de Bacillus amyloliquefaciens et est décrit dans Hartley (1998) (Genbank N° X1 5545). Le plasmide p3222 est porteur de deux cassettes d'expression clonées individuellement. La première cassette comprenant le promoteur HMWG, le gène brittle 2 en orientation antisens et le terminateur Nos. La seconde cassette comprenant le promoteur A9, le gène Barstar et le terminateur CaMV.
Le gène brittle 2 a été synthétisé par PCR à partir d'ADNc d'albumen de maïs avec les oligonucléotides Bt5 (CCGGATCCATGTGACAGACAGTGTTA, SEQ ID n°1 ) contenant un site BamHI, et Bt3 (AAGCCCGGGACTTGTACTAACTGTTTC, SEQ ID n°2) contenant un site Smal.
Le fragment PCR de 600 pb ainsi obtenu a été digéré par Smal et BamHI et clone entre le promoteur HMWG et la région terminatrice nos du plasmide p3214 ouvert par Smal et BamHI. Le plasmide p3215 ainsi obtenu contient la cassette d'expression promoteur HMWG-brittle 2 (orientation antisens)-nos.
Un fragment de 270 pb contenant le gène barstar a été amplifié par PCR à partir du plasmide pWP127 avec les oligonucléotides BPR5 (TATCGGATCCAAATCATAAGAAAGGAG, SEQ ID n°3) contenant un site BamHI, et BPR4 (GAAGATCTATATTGTTCATCCCATTG, SEQ ID n°4) contenant un site Bglll. Le fragment PCR ainsi obtenu a été digéré avec BamHI et Bglll et clone entre le promoteur A9 et la région terminatrice CaMV du plasmide p1415 ouvert par BamHI. Le plasmide p3072 ainsi obtenu contient le gène barstar sous le contrôle du promoteur A9 et de la région terminatrice CaMV.
Le plasmide p3222 selon l'exemple 2.a) correspond à l'insertion de la cassette promoteur HMWG-brittle 2 (orientation antisens)-nos (fragment Kpnl-Sacl) de p3215 dans p3072 ouvert avec Kpnl et Sacl.
2.b) Construction d'un plasmide (p3223, figure 6) comprenant la séquence antisens du gène shrunken 2 ainsi que le gène barstar restaurant la fertilité.
Le gène shrunken 2 code l'autre sous-unité de la ADP Glucose Pyrophosphorylase, enzyme intervenant dans la synthèse de l'amidon. En orientation antisens, il permet d'inhiber la synthèse de cette sous-unité ce qui produit un phénotype mutant dont la taille du grain est 40% inférieure à la taille normale.
Le plasmide p3223 est porteur de deux cassettes d'expression clonées individuellement. La première cassette comprenant le promoteur HMWG, le gène shrunken 2 en orientation antiseήs et le terminateur Nos. La seconde cassette comprenant le promoteur A9, le gène Barstar et le terminateur CaMV.
Le gène shrunken 2 a été synthétisé par PCR à partir d'ADNc d'albumen de maïs avec les oligonucléotides New Sh5 (GCACCCGGG AGGAGATATGCAGTTTG , SEQ ID n°5) contenant un site Smal, et Sh3 (GACTGCAGCACAAATGGTCAAG, SEQ ID n°6) contenant un site Pstl. Le fragment PCR de 1800 pb ainsi obtenu a été digéré par Smal et Pstl et clone entre le promoteur HMWG -et la région terminatrice nos du plasmide p3214 ouvert par Smal et Pstl. Le plasmide p3217 ainsi obtenu contient la cassette d'expression promoteur HMWG-shrunken 2 (orientation antisens)-nos. Un fragment de 270 pb contenant le gène barstar a été amplifié par PCR à partir du plasmide pWP127 avec les oligonucléotides BPR5 (TATCGGATCCAAATCATAAGAAAGGAG, SEQ ID n°7) contenant un site BamHI, et BPR4 (GAAGATCTATATTGTTCATCCCATTG, SEQ ID n°8) contenant un site Bglll. Le fragment PCR ainsi obtenu a été digéré avec BamHI et Bglll et clone entre le promoteur A9 et la région terminatrice CaMV du plasmide p1415 ouvert par BamHI. Le plasmide p3072 ainsi obtenu possède le gène barstar sous le contrôle du promoteur A9 et de la région terminatrice CaMV.
Le plasmide p3223 selon l'exemple 2.b) correspond à l'insertion, de la cassette promoteur HMWG-shrunken 2 (orientation antisens)-nos (fragment Kpnl-Sacl) de p3217 dans p3072 ouvert avec Kpnl et Sacl.
2.c) Construction d'un plasmide (pRec 4962) comprenant les séquences antisens des gènes shrunken 2 et brittle 2 ainsi que le gène barstar retaurateur de fertilité.
Le plasmide p4962 (figure 7) est porteur de deux cassettes d'expression clonées individuellement. La première cassette comprenant le promoteur HMWG, le gène shrunken 2 en orientation antisens, le gène brittle 2 en orientation antisens et le terminateur Nos. La seconde cassette comprenant le promoteur Mac2.1 , le gène Barstar et le terminateur CaMV. Ce plasmide a été construit par des techniques de biologie moléculaire classiques connues de l'homme de l'art.
Le plasmide p4962 se présente sous la forme d'un vecteur donneur dérivé du vecteur pSB12 (Japan Tobacco, EP 672 752) d'environ 11 ,7 kb comprenant : - une région ori : origine de réplication plasmidique Col E1 , nécessaire au maintien et à la multiplication du plasmide dans la bactérie,
- un gène de résistance à la spectinomycine s'exprimant uniquement dans les bactéries,
- un T-DNA comprenant le gène de restauration de la fertilité mâle (gène barstar) et les séquences antisens des gènes shrunken 2 et brittle 2 conférant un phénotypev
'petit grain'.
Dans le présent exemple, lé gène barstar est sous le contrôle du promoteur Mac2.1 et du terminateur 3'CaMV, les gènes shrunken 2 et brittle 2 en orientation antisens étant sous le contrôle du promoteur HMWG et du terminateur 3'Nos. Le vecteur superbinaire pRec 4962 est obtenu par recombinaison homologue d'un plasmide accepteur pSB1 (Japan Tobacco, EP 672 752) dérivé d'un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens avec le plasmide donneur p4962.
EXEMPLE 3 : Plasmide de sélection
3,a) Construction d'un plasmide (pDM 302, figure 8) comprenant le gène bar conférant la résistance à l'herbicide Basta® utilisé comme plasmide de sélection en co-transformation avec le plasmide restaurateur.
Comme indiqué dans l'exemple 1 , le gène bar permet de sélectionner les plantes transformées qui sont résistantes à l'herbicide Basta®.
Le plasmide pDM302 (Cao et al., 1992) est porteur de la cassette d'expression comprenant le promoteur Actine-lntron-actine, le gène Bar et ie terminateur Nos.
Ce plasmide pDM302 a été obtenu de la manière suivante :
La. région codante du gène bar de Streptomyces hygroscopicus codant pour l'activité PAT (Phosphinothricine Acétyl Transférase) a été excisée du plasmide plJ4104 (White et al., 1990) par l'enzyme de restriction Smal (fragment de 600 pb) et clonée dans le vecteur d'expression pCOR113 (McEIroy et al., 1991) derrière le fragment 5' (promoteur et premier intron) du gène Actine 1 (Act-1) de riz. Ceci a généré le plasmide pDM301 de 4.9 kb contenant la cassette d'expression Act1-bar. La cassette d'expression Act1-bar de pDM301 a été excisée en tant que fragment de restriction Xhol-Xbal de 2.0 kb et clonée entre les sites Sali et Xbal en amont de la séquence terminatrice du gène nos codant la nopaline synthase (plasmide pNOS72). Le plasmide pDM302 de 4.7 kb ainsi obtenu contient la cassette d'expression Act1- bar-nos.
3.b) Construction d'un plasmide pRec 273 comprenant le gène bar conférant la résistance à l'herbicide Basta® utilisé comme plasmide de sélection en co-transformation avec le plasmide restaurateur.
Le plasmide pBIOS 273 (Figure 9) est porteur d'une cassette d'expression comprenant le promoteur Actine de riz, le gène Bar, et le terminateur 3' Nos. Ce plasmide a été construit par des techniques de biologie moléculaire classiques connues de l'homme de l'art.
Le plasmide pBIOS 273 se présente sous la forme d'un vecteur donneur dérivé du vecteur pSB12 (Japan Tobacco, EP 672 752), d'environ 8,6 kb comprenant :
- une origine ori : origine de réplication plasmidique Col E1 , nécessaire au maintien et à la multiplication du plasmide dans la bactérie,
- un gène de résistance à la spectinomycine s'exprimant uniquement dans les bactéries, - un T-DNA comprenant le gène Bar conférant la résistance à l'herbicide
Basta® sous le contrôle du promoteur Actine de riz et du terminateur 3' Nos.
Le plasmide pBIOS 273 a été généré en deux étapes :
- clonage du fragment BspDI/Xhol (promoteur Actine - gène Bar - terminateur Nos) du vecteur pDM 302 (Cao et al. 1992) dans les sites Smal et BspDI du vecteur pSB12 (Japan Tobacco EP 672 752). Le vecteur résultant de ce clonage est appelé pBIOS 272.
- délétion du site Xhol en position 3363 du vecteur pBIOS 272 par digestion partielle avec Xhol et action de l'ADN Polymerase l, large (Klenow) fragment. Le vecteur obtenu, possédant un site unique Xhol, est nommé pBIOS 273.
Le vecteur superbinaire pRec 273 est obtenu par recombinaison homologue d'un plasmide accepteur pSB1 (Japan Tobacco, EP 672 752) dérivé d'un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens avec le plasmide donneur pBIOS 273.
EXEMPLE 4 : Production d'une lignée de maïs mâle stérile hétérozygote pour le transgène AMS.
4.a) Production d'une lignée de maïs mâle stérile hétérozygote pour le transgène AMS (AMS/+) par transformation du maïs avec le plasmide décrit selon l'exemple 1a (pRec 274). Une lignée de maïs mâle stérile hétérozygote exprimant les gènes barnase (conférant la stérilité mâle) et bar (résistance au glufosinate) respectivement sous contrôle des promoteurs A9 (Paul et al., 1992) et actine-intron (Me Elroy et al., 1991 ) est obtenue par transformation avec Agrobacterium tumefaciens selon la méthode décrite par Ishida et al. (1996).
Dans l'exemple suivant, la lignée de maïs mâle stérile hétérozygote (AMS/+) a été produite par la méthode de transformation par Agrobacterium tumefaciens. D'autres techniques de transformation connues de l'homme de l'art peuvent être utilisées.
Obtention et préparation du matériel végétal :
Des épis de maïs sont décontaminés durant 15 à 20 minutes dans du Domestos 20% sous agitation et ensuite rincés à l'eau stérile avant de prélever les embryons immatures qui sont placés dans du milieu LSinf. La taille des embryons immatures optimale est de 1 à 1 ,2 mm, ce qui correspond à 10 +/- 2 jours après fécondation. Les embryons sont ensuite agités au vortex, le milieu LSinf est éliminé, et un rinçage dans du milieu LSinf est effectué avant d'agiter au vortex à nouveau.
Préparation des bactéries : Des bactéries Agrobacterium tumefaciens (souche LBA 4404) contenant le plasmide super binaire pRec 274 (comme décrit selon exemple 1a) sont mises en culture dans du milieu YP supplémenté avec un agent sélectif approprié à la souche. 2 à 3 jours après, les bactéries sont mises en suspension dans du milieu LSinf + acétosyringone 100 μM. La concentration de l'inoculum est considérée à 1.109 bactéries/ml.
Inoculation et coculture :
Après avoir éliminé le milieu LSinf, les embryons sont mis en contact avec les Agrobactéries. Après avoir agité au vortex, 50 μl de Pluronic F68 à 1 % sont rajoutés et une incubation de 5 minutes à température ambiante est effectuée. L'inoculum est éliminé et les embryons sont récupérés et placés sur milieu 1 ,5LSAs, scutellum vers le haut. Après avoir scellé la boîte, une incubation de 5 jours à 25°C à l'obscurité est effectuée. Sélection de cals transformés :
A l'issue de la coculture, les embryons sont transférés sur milieu LSD5 et placés par nombre de 25 par boîte scellée avec de l'Urgopore. Une incubation de 2 semaines à 25 °C à l'obscurité (1ere sélection) est effectuée. Une 2eme sélection consiste à transférer les embryons sur milieu LSD10 en coupant les germinations. Une incubation de 3 semaines est effectuée dans les mêmes conditions qu'en 1ere sélection. Une 3e e sélection est effectuée en excisant les -jolis- cals de type I de façon à obtenir des fragments de 1-2 mm. Une mise en culture sur milieu LSD10, puis une incubation de 3 semaines dans les mêmes conditions qu'en première et seconde sélection sont effectuées.
Régénération de plantules transformées :
Les cals de type I ayant proliféré sont placés sur milieu LSZ2 et les boîtes sont scellées avec du scellofrais® et placées en chambre de culture à 27°C pendant 2 semaines. Les cals de type I ayant proliféré sont à nouveau repiqués, séparés et placés sur milieu RM+G4C100. Les boîtes sont scellées avec du scellofrais® et placées en chambre de culture à 27°C. Les plantules régénérées sont repiquées sur milieu T1 G4 et placées sous illumination continue, à 27°C pendant une à deux semaines. Les plantules ayant atteint un développement suffisant sont transférées au phytotron.
Afin d'identifier les plantules résistantes à l'herbicide Basta®, et donc ayant intégré le transgène, une étape de sélection est effectuée avec une solution Basta F1 (Agri≡vo France). L'application de cette solution se fait par "Leaf Painting" (c'est à dire en badigeonnant les feuilles) sur les plantes de maïs au stade 4-5 feuilles. La concentration en glufosinate d'ammonium de la solution de traitement est de 0,75 grammes par litre.
Les plantes résistantes présentent une zone non nécrosée 5 jours après l'application de l'herbicide. Les plantes sensibles présentent une nécrose au niveau de la zone traitée ; on observe alors la mort des tissus chlorophylliens. Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées. 4.b) Production d'une lignée de maïs mâle stérile hétérozygote pour le transgène AMS (AMS/+) par transformation du maïs avec le plasmide décrit selon l'exemple 1b (pRec 424).
Une lignée de maïs mâle stérile hétérozygote exprimant le gène barnase conférant la stérilité mâle, sous le contrôle du promoteur A9 (Paul et al., 1992), est obtenue par transformation avec A. tumefasciens selon la méthode décrite par Ishida et al. (1996). La technique de transformation avec Agrobacterium tumefaciens, non limitante, utilisée dans cet exemple est identique à celle utilisée dans l'exemple 4. a. La transformation avec la cassette d'expression A9-Bamase-3'CaMV-Ds::NPTII comportant le gène barnase sous le contrôle du promoteur A9 et du terminateur 3'CaMV (selon l'exemple 1 b) sur un vecteur utilisable en transformation via Agrobacterium et comportant le marqueur de sélection « Kanamycine » à l'intérieur de l'élément transposable Ds a l'avantage d'éliminer le gène marqueur qui ne se retrouvera pas dans la lignée de maïs transformée.
Dans le présent exemple l'identification des plantules ayant intégrées le transgène se fait de la manière suivante :
Régénération de plantules transformées : Les cals de type I ayant proliféré sont placés sur milieu LSZ2 et les boîtes sont scellées avec du scellofrais® et placées en chambre de culture à 27°C pendant 2 semaines. Les cals de type I ayant proliféré sont à nouveau repiqués, séparés et placés sur milieu RM+G4C100. Les boîtes sont scellées avec du scellofrais® et placées en chambre de culture à 27°C. Les plantules régénérées sont repiquées sur milieu T1 G4 et placées sous illumination continue, à 27°C pendant une à deux semaines. Les plantules ayant atteint un développement suffisant sont transférées au phytotron.
Afin d'identifier les plantules résistantes à la kanamycine et donc ayant intégré le transgène, une étape de sélection (par le test goutte cornet) est effectuée avec une solution de kanamycine à une concentration de 500 mg/l additionnée de 1 % de
Tween. 2 à 3 gouttes de cette solution sont appliquées sur les plantes de maïs au stade 4-5 feuilles. L'analyse des plantes s'effectue 5 jours après l'application de la kanamycine. Les plantes sensibles présentent l'apparition de zones blanchâtres (mort des tissus chlorophylliens). Les plantes résistantes ne présentent pas l'apparition de zones blanchâtres 5 jours après l'application de la kanamycine. Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.
Une fois que les transformants (comprenant la cassette d'expression A9-
Barnase-3'CaMV-Ds::NPTI!) ont été isolés par action de l'agent de sélection et/ou par analyses moléculaires, le gène codant l'agent de sélection est éliminé. Les transformants sélectionnés sont donc croisés avec une source de transposase active
Ac.
La fécondation est réalisée manuellement par une technique connue de l'homme de l'art par le dépôt du pollen de la source de transposase Ac sur les soies des transformants, de préférence dans le sens plante mâle possédant la transposase dans la plante femelle contenant l'élément Ds::Nptll.
Les grains F1 sont mis à germer pour obtenir des plantules. Les plantules sont évaluées pour leur résistance à la kanamycine (les plantes résistantes sont conservées) et un test PCR est effectué pour détecter les excisions somatiques (une excision somatique ne touche généralement pas les gamètes et conduit à la formation de graines et d'individus chimériques dont la plupart des cellules possèdent encore le gène codant l'agent de sélection). Les amorces utilisées pour ce test PCR qui permet de rechercher les excisions somatiques sur les plantes F1 résistantes à l'agent de sélection sont les suivantes :
Figure imgf000035_0001
Le couple d'amorces Barn5/EM11 permet de visualiser l'excision (d'autres amorces adéquates peuvent également être utilisées). L'amplification est différente en fonction de s'il y a eu ou pas excision.
Les plantes F1 où il y a eu excision somatique sont donc sélectionnées, puis croisées avec une plante de génotype sauvage (WT). Les plantes F2 sont criblées afin d'identifier les plantes avec le gène d'intérêt sans gène codant l'agent de sélection (une excision germinale touche les gamètes et conduit à la formation de graines et d'individus constitués de cellules qui ne possèdent plus le gène codant l'agent de sélection).
4.c) Caractérisation moléculaire des transformants
La méthodologie Southern (1975) est utilisée pour démontrer l'insertion du transgène dans le génome de la plante et pour évaluer le nombre de copies et caractériser le profil d'intégration.
L'ADN génomique des plantes (8μg) est extrait à partir des feuilles des plantes suivant un protocole d'extraction au CTAB (Cétyltriméthylammonium bromide), selon le protocole de Keller J (DNAP 6701 San Pablo Ave Oakland CA 94608 USA) modifié par Bancroft I. (Department of MolecularGenetics, Cambridge Laboratory,
John innés Center for Plant Science Research, Colney lane, Norwich, England).
L'ADN obtenu a été digéré par différentes enzymes de restriction, séparé par électrophorèse sur gel d'agarose et transféré sur membrane de nylon hybond N+ puis hybride avec des sondes radioactives.
La sonde Bar pour les analyses moléculaires est préparée de la manière qui suit. Le plasmide pDM302 (décrit dans l'exemple 3a) de la présente invention) est digéré avec l'enzyme Sma I. Le fragment d'intérêt de 0.6 Kb est récupéré après migration du produit de digestion sur gel d'électrophorèse et purification avec le kit Gène Clean (Bio 101 , Ozyme). Après marquage au P32 de 30 ng de fragment, celui ci est utilisé comme sonde pour hybrider les différents blots.
L'événement de transformation mâle stérile (STB27b) est un transformant obtenu par transformation via Agrobacterium tumefaciens selon l'exemple 4a) décrit ci-dessus, et qui présente une insertion monocopie du T-DNA tel que décrit selon l'exempie 1a. Les résultats d'hybridation de l'ADN digéré par différentes enzymes de restriction (Ncol, Spel, EcoR V, Hindlll et Ecor I), puis hybride avec la sonde Bar montrent qu'un seul fragment est mis en évidence quelle que soit l'enzyme utilisée. La taille du fragment révélé par la digestion Hind III est de 1.7 kb. Ce même type de caractérisation moléculaire est effectué pour les transformants obtenus par transformation via Agrobacterium tumefaciens selon l'exemple 4b).
EXEMPLE 5 : Production d'une lignée de maïs restauratrice de la fertilité hétérozygote pour le gène restaurateur de la fertilité (SSB/+).
5.a) Production d'une lignée de maïs restauratrice de la fertilité (SSB/+) hétérozygote pour le gène restaurateur de la fertilité par co-transformation du maïs avec les plasmides des exemples 2a , 2b (plasmides restaurateurs) et 3a) (plasmide pDM 302 de sélection).
On utilise préférentiellement une méthode de transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifiés dans le génome de la plante. Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à particules. Cependant, d'autres techniques de transformation connues de l'homme de l'art peuvent être utilisées.
Production d'embryons immatures :
Elle consiste à l'autofécondation d'une plante de la lignée Hill ou au croisement "frère-soeur" (sib) de 2 plantes de la lignée Hill. La fécondation est réalisée à date unique après avoir isolé les organes reproducteurs.
Prélèvement de l'épi :
Le prélèvement des épis est réalisé lorsque les embryons immatures ont atteint une taille de 1 ,5 mm à 2 mm, c'est à dire 10 à 11 jours après la fécondation dans nos conditions de culture (température de 25°C le jour et 18°C la nuit, photopériode 16/8). Désinfection :
Les épis récoltés sont débarrassés de leurs spathes et de leurs soies puis sont désinfectés au Domestos® 20% (v/v) pendant 15 minutes sous agitation. Les épis seront rincés trois fois à l'eau stérile.
Extraction des embryons :
La partie supérieure du grain est coupée de façon à découvrir l'albumen, puis une légère pression sur le grain permet de dégager l'albumen. L'embryon immature qui se trouve encore dans le grain (contre le péricarpe) est extrait puis déposé sur le milieu de callogénèse N6P6 en l'orientant côté plat sur la gélose. Trente six embryons par boîte sont mis en culture pendant 4 jours en chambre de culture à 26 °C et à l'obscurité. Il s'agit de la période d'initiation.
Transformation génétigue : - Préparation des embryons :
Après la période d'initiation, les embryons sont déposés 4 heures avant le tir sur le milieu de choc osmotique N6P6 0.4 M et sont disposés par 36 en un petit carré de 2 cm2 au centre de la boîte. Les boîtes sont scellées au scello-frais et incubées en chambre de culture (obscurité à 26°C ).
Les plasmides portant les gènes à introduire (plasmides décrits dans les exemples 2a, 2b et 3a) sont purifiés sur colonne Qiagen® en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M 10) en suivant le protocole décrit par Klein (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. Finer (1992).
Les boîtes d'embryons ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de Scellofrais® puis cultivées à l'obscurité à 27°C. Le premier repiquage a lieu 24h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif dont la nature et la concentration peuvent varier selon le gène utilisé. Les agents sélectifs utilisables consistent généralement en des composés actifs de certains herbicides (Basta®, Round up®) ou certains antibiotiques (Hygromycine, Kanamycine...). De manière préférentielle, le gène de résistance à l'herbicide Basta® sera utilisé. 11
- Maturation et "régénération des cals de type II :
Lorsqu'on a suffisamment de matériel pour un événement, on le transfert sur le milieu de maturation MM+G2 qui favorise le développement d'embryons somatiques. On étale le cal à la surface du milieu MM+G2. Les boîtes sont mises en chambre de culture à l'obscurité et à 26°C. Après 15 jours (minimum) sur le milieu MM+G2, des embryons somatiques apparaissent. Ces derniers sont repiqués sur milieu de régénération RM+G2 (20 à 25 par boîte) et cultivé à 28°C et à la lumière (16h/24h). On considère que 4 boîtes en régénération sont suffisantes pour obtenir des régénérants.
Après environ 15 jours sur le milieu RM+G2, les embryons se sont développés en plantules qui sont ensuite repiquées en tubes sur le milieu d'enracinement T1+G2. On considère que 5 plantules par événement sont nécessaires pour réussir l'acclimatation au phytotron et les envois. Ces plantules sont mises en chambre de culture à la lumière.
On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la. croissance n'est pas inhibée par l'agent de sélection (glufosinate d'ammonium), habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. L'efficacité de transformation est de 10 %.
Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de façon à régénérer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif. "
- Acclimatation :
L'acclimatation des plantules est réalisée quand ces dernières se sont suffisamment développées sur T1+G2 c'est à dire lorsque les racines atteignent le fond du tube et lorsque l'axe collinaire est suffisamment rigide et développé. Les plantules sont acclimatées au phytotron en godets avec du terreau légèrement enrichi. Les godets sont disposés sur tablette située à 1 ,5 mètres des lampes. Pour maximiser l'obtention de descendance, l'acclimatation de 2 plantules au phytotron est nécessaire. En moyenne, deux semaines sont nécessaires pour le sevrage des plantules. Les plantes ainsi régénérées et acclimatées sont ensuite cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.
Ce mode de réalisation consistant à produire une lignée de maïs restauratrice de fertilité hétérozygote pour le gène restaurateur de la fertilité (SSB/+) par co- transformation d'une plante de maïs avec les plasmides des exemples 2a, 2b et 3a est le premier mode de réalisation.
Un deuxième mode de réalisation consistant à produire une lignée de maïs restauratrice de la fertilité hétérozygote pour le gène restaurateur de la fertilité (SSB/+) consiste à co-transformer une plante de maïs avec les plasmides des exemples 2a et 3a selon le même protocole que décrit ci-dessus.
Un troisième mode de réalisation consistant à produire une lignée de maïs restauratrice de la fertilité hétérozygote pour le gène restaurateur de la fertilité (SSB/+) consiste à co-transformer une plante de maïs avec les plasmides des exemples 2b et 3a selon le même protocole que décrit ci-dessus.
5.b) Production d'une lignée de maïs restauratrice de la fertilité hétérozygote pour le gène restaurateur de la fertilité (SSB/+) par co- transformation du maïs avec les plasmides des exemples 2c (plasmide pRec 4962 restaurateur) et 3b (plasmide pRec 273 de sélection).
La production de la lignée de maïs restauratrice de la fertilité selon le présent exemple 5b est réalisée par co-transformation d'une plante de maïs avec les plasmides décrits selon les exemples 2c et 3b selon la technique de co- transformation par Agrobacterium tumefaciens connue de l'homme de l'art.
Le gène bar (gène codant l'agent de sélection) est éliminé lors de la co- transformation. 10% des transformants obtenus contiennent les 2 cassettes d'expression contenues dans les plasmides des exemples 2c et 3b. Il y aura ségrégation dans la descendance. Ce mode de réalisation (4eme mode) consistant à produire une lignée de maïs restauratrice de la fertilité hétérozygote pour le gène restaurateur de la fertilité (SSB/+) est le mode préférentiel selon la présente invention. Cependant, d'autres techniques de transformation connues de l'homme de l'art peuvent être utilisées. 5,c) Caractérisation moléculaire des transformants.
Le transformant SSB-001a obtenu selon l'exemple 5a) a été caractérisé par la même méthodologie que celle décrite selon l'exemple 4c de la présente invention.
L'analyse moléculaire a été réalisée sur le transformant SSB-001a résistant à l'herbicide Basta® (n° de plante 12928), sur une plante sœur résistante à l'herbicide Basta® (n° de plante 12929), et sur 2 plantes sensibles à l'herbicide (13008 et 13061 ). Ces 4 plantes sont issues de l'épi du transformant primaire SSB-001a. L'ADN génomique (14μg) des plantes a été digéré par les enzymes de restriction Eco RV et Hind III. Trois sondes ont été utilisées pour l'analyse : promoteur A9 (pA9), promoteur HMWG (pHMWG) et Bar.
Les résultats des hybridations moléculaires avec la sonde Bar indiquent que les profils moléculaires sont identiques pour les deux plantes résistantes à l'herbicide Basta. Les hybridations avec les sondes pA9 et pHMWG révèlent un grand nombre de bandes, reflétant une intégration en plusieurs copies des plasmides p3222 et p3223. L'hybridation avec la sonde Bar montre un profil simple, une bande majeure est révélée pour les 2 enzymes Eco RV et Hind III. La taille du fragment révélé par la digestion Hind III est de 8 kb. Les bandes d'intensité très faible correspondent aux signaux très intenses révélés précédemment avec les sondes pA9 et pHMWG.
EXEMPLE 6 : Croisement de la lignée de maïs mâle stérile hétérozygote (AMS/+) avec la lignée de maïs restauratrice de la fertilité hétérozygote pour le gène restaurateur de la fertilité (SSB/+) : obtention des plantes F1.
La lignée de maïs mâle stérile hétérozygote (AMS/+) résistante à l'herbicide Basta® obtenue selon l'exemple 4a est croisée avec la lignée de maïs restauratrice de la fertilité hétérozygote pour le gène restaurateur de la fertilité (SSB/+), plante résistante à l'herbicide Basta®, obtenue selon l'exemple 5 afin d'obtenir les plantes F1. Le même type de croisement peut être réalisé entre la lignée de maïs mâle stérile hétérozygote (AMS/+), obtenue selon l'exemple 4b, et la lignée de maïs restauratrice de la fertilité hétérozygote pour le gène restaurateur de la fertilité (SSB/+), obtenue selon l'exemple 5. La fécondation est réalisée manuellement par une technique connue de l'homme de l'art. La plante mâle stérile est menée à floraison, le pollen de la plante (SSB/+) est déposé sur les soies de la lignée mâie stérile.
A l'issue de ce croisement, des analyses génétiques sont effectuées sur les plantes F1. Les analyses génétiques consistent en un comptage, en rapport à la présence des différents marqueurs, parmi la descendance.
Toutes les fréquences théoriques mentionnées sont vraies si et seulement s'il n'y a pas de liaison entre le transgène AMS et le gène restaurateur de la fertilité.
Bilan génétique de la F1.:
Figure imgf000042_0001
Bilan phénotypique de la F1
Figure imgf000042_0002
La F1 est donc composée pour moitié de grains normaux, l'autre moitié étant des grains déprimés (phénotype 'petit grain' causé par les gènes shrunken2 et brittle2 en orientation antisens).
Pour chaque F1 , nous avons évalué la ségrégation pour la résistance au glufosinate afin de détecter les lots de grains déprimés.
Les grains déprimés sont sélectionnés par un tri visuel sur l'épi de maïs. Ces grains sont tous résistants à l'herbicide Basta®.
Les grains déprimés, qui ont le génotype (AMS/+ ; SSB/+) ou (+/+ ; SSB/+), sont sélectionnés, puis semés et mis à germes.
EXEMPLE 7 : Autofécondation des plantes F1 pour production de la F2. Les plantes F1 résistantes à l'herbicide Basta® issues de grains déprimés selon l'exemple 6 sont autofécondees afin d'obtenir les plantes F2.
Les plantes F1 issues de grains déprimés étant constituées à la fois de plantes de génotype (SSB/+ ; +/+) et de plantes de génotype (SSB/+ ; AMS/+), deux cas d'autofécondations se présentent alors :
7. a) Autofécondations des plantes de génotype (SSB/+ ; +/+).
Les plantes F1 de génotype (SSB/+ ; +/+) obtenues selon l'exemple 6 sont autofécondees. A l'issue de cette autofécondation, les analyses génétiques sont effectuées sur les plantes F2 :
Bilan génétique de la F2 :
Figure imgf000043_0001
Bilan phénotypique de la F2 :
Figure imgf000043_0002
Cette étape d'autofécondations des plantes de génotype (SSB/+ ; +/+) peut être avantageusement éliminée par une étape de génotypage en effectuant une PCR spécifique du transgène AMS sur les plantes F1 issues de grains déprimés selon l'exemple 6. Les grains déprimés sont mis à germer, les plants de maïs autofécondés, et un tri moléculaire est effectué par PCR. Seules les plantes positives pour la détection du transgène AMS par PCR sont conservées. Les amorces spécifiques du gène d'intérêt AMS (pA9-Barnase-3'CaMV) permettant son amplification par PCR sont les suivantes :
Figure imgf000044_0001
La taille du fragment amplifié à l'aide des couples d'amorces A9A / A9B, Bam1 /
Barn 6 ou Bam4 / CaMVoH est 799 pb, 880 pb ou 979 pb, respectivement.
7.b) Autofécondations des plantes de génotype (AMS/+ ;SSB/+).
Les plantes F1 de génotype (AMS/+ ; SSB/+) obtenues selon l'exemple 6 sont autofécondees afin d'obtenir la descendance F2. A l'issue de cette autofécondation, les analyses génétiques sont effectuées sur la descendance F2 :
Bilan génétique de la F2 :
Figure imgf000044_0002
Bilan phénotypique de la F2 :
Figure imgf000045_0001
L'analyse génétique de la descendance F2 sur les grains normaux (25 %) pour l'expression du gène barnase avec la résistance à l'herbicide Basta®, permet de déterminer les plantes hybrides F1 qui présentaient le génotype (SSB/+ ; AMS/+). Au niveau des plantes F2 issues des grains déprimés, 1/6 ont le génotype (AMS/AMS ; SSB/+). Sur les plantes F2 qui ont des. grains normaux, ont le génotype (AMS/AMS ; +/+).
7.c) Résultats.
14 épis F2 ont été produits. Pour chacun de . ces épis, un tri par rapport au phénotype du grain (déprimé ou pas) à été effectué. 14 lots de graines transgéniques (de A à N) ont donc été analysés. Ces 14 lots de graines (lot A à lot N) ont été divisés en deux en fonction de leur phénotype normal ou déprimé. Le code utilisé pour les 28 ensembles de graines ainsi préparés est par exemple pour le lot A : A 01 = grains normaux, A02 = grains « déprimés».
EXEMPLE 8 : Semis des grains déprimés de la descendance F2 et génotypage des plantes (AMS/AMS ; SSB/+).
Un semis dirigé des grains F2 obtenus ci-dessus, en fonction du phénotype, déprimé ou normal du grain, puis la détection par génotypage des plantes (AMS/AMS ; SSB/+) ont été effectués. 8.a) Semis de la descendance F2.
Un semis dirigé des 14 familles a été effectué et au stade 3-4 feuilles un test Basta en spray 0,5%0 a été réalisé. Les résultats de ce test sont décrits dans le tableau ci-dessous :
Figure imgf000046_0001
Les résultats du test ont permis d'éliminer les familles B, F, I, J, et L qui résultaient de l'autofécondation de plantes F1 avec le génotype (SSB/+ ; +/+). Les familles A, C, D, E, G, H, K; M, et N ont été conservées. Ces épis résultaient de l'autofécondation de plantes F1 avec le génotype (SSB/+ ; AMS/ +). Les bilans génétique et phénotypique de l'autofécondation de ces plantes ont été détaillés dans l'exemple 7b. Dans ces familles sélectionnées, toutes les plantes résistantes à l'herbicide Basta® issues de grains normaux (lots finissant par 01) et jusqu'à 40 plantes résistantes à l'herbicide Basta® issues de grains déprimés ont été gardées pour culture.
8.b) Identification par génotypage et Southern Blot des plantes de génotype (AMS/AMS ; SSB/+).
Une analyse moléculaire est effectuée pour identifier les plantes homozygotes , pour le transgène issu de STB-27b (AMS/AMS) et hétérozygotes pour le transgène issu de SSBOOIa (SSB/+). L'ADN génomique de la descendance a été extrait à partir de 50 mg de feuilles suivant le protocole et utilisation du kit d'extraction Qiagen Dneasy 96 plant kit (Qiagen SA, 91974 Courtaboeuf cedex, France). La méthodologie Southern est utilisée pour identifier les profils moléculaires.
Pour chaque individu, on visualise la présence des deux gènes Bar : celui venant de STB27b et celui venant de SSBOOIa. Pour cela, les ADN ont été digérés avec l'enzyme Hind III puis hybrides avec la sonde Bar. D'après les analyses moléculaires réalisées sur les transformants parents, nous savons qu'un fragment d'une taille de 8 kb correspond à la copie du gène Bar issu du transformant SSBOOIa et un fragment d'une taille de 1.7 Kb correspond à la copie du gène Bar issu du transformant STB27b. Pour une plante donnée, l'intensité des signaux d'hybridation est également évaluée, ceci afin d'identifier la zygotie (hétérozygotie ou homozygotie) des plantes pour le gène Bar considéré (SSBOOIa ou STB27b).
Cette analyse nous permet donc d'identifier le génotype des plantes issues du croisement SSB x STB. D'après la sélection préalable des graines dont sont issues ces plantes, 6 génotypes sont attendus et présentés dans le tableau 1. Tableau 1 :
Figure imgf000048_0001
Le génotype recherché dans cette étude est l'homozygotie pour l'ADN-T de STB-27b (« 2 copies » du gène Bar) et l'hétérozygotie pour le gène Bar SSB-001a (« 1 copie » du gène Bar).
Des Southern blots ont été réalisés avec l'ADN de 8 plantes filles provenant d'un épi et ce, sur les 9 épis sélectionnés. 58 plantes ont été génotypees suivant le protocole décrit précédemment. Tous les génotypes attendus sont représentés parmi les 9 plantes analysées (2 épis différents).
Au total, 10 plantes présentent le génotype d'intérêt à savoir : homozygotie pour le T-DNA de STB-27b (« 2 copies » du gène Bar) et hétérozygotie pour le gène Bar SSB-001 a (« 1 copie » du gène Bar). Les fréquences observées sont très proches des fréquences théoriques attendues quel que soit le génotype considéré (Ta'bleau
2). Tableau 2 :
Figure imgf000048_0002
EXEMPLE 9 : Obtention de semences de pré-base (AMS/AMS ; +/+), de semences de base (AMS/+ ; +/+), et de semences hybrides.
De nombreux croisements peuvent être envisagés pour produire des semences de pré-base, des semences de base, et des semences hybrides. Les croisements décrits ci-dessous ne sont pas limitatifs :
9.a) Autofécondation des plants (AMS/AMS ; SSB/+) afin d'obtenir des semences de pré-base.
L'intérêt de ce croisement est de multiplier la lignée avec le génotype (AMS/AMS ; SSB/+) ainsi que de produire des semences avec le génotype (AMS/AMS ; +/+) ou semences de pré-base.
En effet, les autofécondations produisent de la semence homozygote pour le transgène conférant la stérilité mâle (au niveau de la F3, tous les grains normaux seront de génotype (AMS/AMS ; +/+)). A l'issue de cette autofécondation, les analyses génétiques sont effectuées :
Bilan génétique
Figure imgf000049_0001
Bilan phénotypique
Figure imgf000050_0001
La totalité des grains normaux ont le génotype (AMS/AMS ; +/+). Il s'agit des semences de pré-base. 75 % des grains déprimés ont le génotype (AMS/AMS ; SSB/+). Les plants issus de ces grains déprimés peuvent être autofécondés afin de multiplier (maintenir) les plants de génotype (AMS/AMS ; SSB/+). Le plant de génotype (AMS/AMS ; SSB/+) est également appelé plant mainteneur de la stérilité.
9.b) Croisement des plants de génotype (AMS/AMS ; SSB/+) avec la lignée élite de génotype sauvage (WT) afin d'obtenir des semences de génotype (AMS/+ ; +/+).
Lés plantes issues de grains déprimés sont croisées avec une lignée élite WT. A l'issue de ce croisement, les analyses génétiques sont effectuées :
Bilan génétique :
Figure imgf000050_0002
Bilan phénotypique :
Figure imgf000050_0003
Deux cas de figures se présentent : - dans 2/3 des cas les plantes F2 avaient le génotype (AMS/+ ; +/+). Sur ces épis F3 seuls sont obtenus des grains normaux avec une ségrégation à l'herbicide Basta® de 50/50. Ces épis ne nous intéressent pas.
- dans 1/3 des cas les plantes F2, avaient le génotype (AMS/AMS ; +/+). Sur ces épis F3 seuls sont obtenus des grains normaux avec un génotype (AMS/+ ; +/+) 100% résistants à l'herbicide Basta®. Ce sont ces épis qui nous intéressent. Les grains normaux de génotype (AMS/+ ; +/+) constituent les semences de base.
20 graines de chaque épi F3 sont semées et les épis d'intérêt sont identifiés en fonction de la résistance à l'herbicide Basta®.
9.c) Croisement des plants de génotype (AMS/AMS ; +/+) avec la lignée élite de génotype sauvage (WT) afin d'obtenir des semences de génotype (AMS/+ ; +/+).
Les plantes issues des grains de génotype (AMS/AMS ; +/+) sont croisées avec une lignée élite. De préférence, cette lignée élite est identique à celle utilisée dans l'étape de rétrocroisements successifs afin d'introgresser le génotype (AMS/AMS ; SSB/+).
L'intérêt de ce croisement est de produire de la semence de base de génotype (ÂMS/+ ; +/+).
Bilan génétique :
Figure imgf000051_0001
Bilan phénotypique :
Figure imgf000051_0002
Tous les grains (qui sont normaux) ont le génotype (AMS/+ ; +/+) et par conséquent donneront des plantes mâles stériles.
9.d) Croisement des plants de génotype (AMS/+ ; +/+) avec la lignée élite mâle (WT) afin d'obtenir des semences hybrides.
Les plantes issues des semences de génotype (AMS/+ ; +/+) sont croisées avec une lignée élite mâle. De préférence, la lignée élite utilisée dans ce croisement est différente de celle utilisée dans le croisement décrit dans l'exemple 9.c).
L'intérêt de ce croisement est de produire de la semence hybride.
Bilan génétique :
Figure imgf000052_0001
Bilan phénotypique
Figure imgf000052_0002
Tous les grains, sont normaux. La moitié d'entre eux donneront des plantes mâles stériles, l'autre moitié donneront des plantes mâles fertiles assurant ainsi la pollinisation et par conséquent la production de maïs « consommation » ou maïs « grain ». EXEMPLE 10 : Tri par table densimétrique des grains déprimés.
La table densimétrique utilisée permet de diviser en six fractions, des grains de taille et de qualité superficielle équivalentes, mais qui diffèrent entre eux par leur poids spécifique.
Un tri densimétrique est effectué sur un lot de graines d'épis F3, issues de l'autofécondation de plantes de génotype (+/+ ; SSB/+). Théoriquement, ces épis ont une proportion de 75% de grains déprimés et 25% de grains normaux. 33 épis ont été égrainés de manière à obtenir environ 500 grammes de semences. 6 fractions de grains ont été constituées par tri densimétrique.
Le tableau ci-dessous est une synthèse des résultats obtenus (triage par rapport au phénotype du grain et analyses génétiques sur l'expression du gène bar conférant la résistance au glufosinate).
Figure imgf000053_0001
Triage par rapport au phénotype du grain (normal ou déprimé) : Les fractions 1 et 2 ne comportent que des grains déprimés. Dans les fractions 3, 4 et 5 nous avons essentiellement des grains déprimés mais nous trouvons également quelques grains normaux (soit 6.1 , 8.2 et 19.1 % respectivement pour les fractions 3, 4 et 5).
Quant à la fraction 6 nous avons quasiment que des grains normaux (97%). Les fractions 1 à 5 correspondent donc aux grains déprimés et la fraction 6 aux grains normaux. On retrouve également une petite quantité de grains non triés. Cette petite quantité correspond à la fois à des grains normaux et à des grains déprimés. Cependant, visuellement, les grains déprimés sont plus importants en nombre par rapport. aux grains normaux.
Résultats d'analyses génétigues (sur l'expression du gène bar conférant la résistance à l'herbicide Basta®) :
Les résultats d'analyses génétiques confortent ceux du triage fait sur le phénotype du grain pour chacune des fractions.
Nous avons donc dans la fraction 6 une petite partie de grains déprimés (environ 3 à 4%). Cette dernière est complètement éliminée par un deuxième passage sur la table densimétrique.
Les fractions de 1 à 5 correspondent aux grains déprimés et la fraction 6 aux grains normaux.
Exemple 11 : Evaluation des différentes étapes de la production de semences hybrides de maïs à partir de ce nouveau procédé.
Trois types d'expérimentation ont été testés pour la production de semences :
• Production de semences de pré-base
• Production de semences de base • Production de semences hybrides
Production de semences de pré-base :
La production de semences de pré-base (génotype (AMS/AMS ; +/+)) a été assurée par la culture de plants de génotype (AMS/AMS ; SSB/+). Ces plants ont bien été observés mâles fertiles.
Les plants de génotype (AMS/AMS ; SSB/+) sont autofécondés. Environ 25% des grains obtenus dans la descendance correspondent à des semence de pré-base. Production de semences de base :
La production de semences de base (génotype (AMS/+ ; +/+)) a été assurée par la culture de plants de génotype (AMS/AMS ; +/+). Ces plants ont bien été observés mâles stériles et ne présentent aucun effet délétère sur l'aspect végétatif de la plante attestant que l'utilisation d'un transgène AMS à l'état homozygote est compatible avec le système de production de semences hybrides de maïs tel que décrit dans la présente invention.
Les plants de génotype (AMS/AMS ; +/+) ont, été croisés avec un plant de génotype sauvage. 100% des grains obtenus dans la descendance correspondent à des semences de base.
Production de semences hybrides :
La production de semences hybrides a été obtenue par croisement entre des plants mâle stériles de génotype (AMS/+ ; +/+) issus des semences de base avec une lignée élite sauvage. Tous les plants de génotype (AMS/+ ; +/+) ont bien montré une stérilité mâle complète (stérilité à 100 %).
EXEMPLE 12 : Production de semences hybrides.
En production de semences, deux types de croisements sont préférentiellement effectués. Ces deux croisements permettent de produire de la semence hybride.
12.a) Croisement des plants de génotype (AMS/AMS ; SSB/+) avec des plants de génotype (AMS/AMS ; +/+ .
Bilan génétique :
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
Bilan phénotypiq'ue :
Figure imgf000056_0002
50% des grains obtenus sont normaux et ont tous le génotype (AMS/AMS ;
+/+). Ces grains peuvent être séparés par un tri densimétrique, préférentiellement à l'aide d'une table densimétrique.
12.b) Croisement des plants de génotype (AMS/AMS ; SSB/+) avec une lignée élite de génotype sauvage (WT).
Bilan génétique :
AMS ; SSB AMS ; + AMS ; SSB AMS ; +
+ : + AMS/+ ; SSB/+ AMS/+ ; +/+ AMS/+ ; SSB/+ AMS/+ ; +/+
Bilan phénotypique
Figure imgf000056_0003
Tous les grains normaux ont le génotype (AMS/+ ; +/+). Ces grains peuvent être séparés par un tri densimétrique, préférentiellement à l'aide d'une table densimétrique. Ce croisement permet un gain de temps dans l'obtention des semences hybrides (6 à 12 mois en moins) par rapport au croisement décrit dans l'exemple
12.a). En revanche, il nécessite une surface de production de la lignée mainteneuse
(de génotype AMS/AMS ; SSB/+) plus importante en taille pour un nombre d'hectares de semence (hybride) équivalent.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production de semences de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS") et hétérozygotes pour .un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", comprenant les étapes consistant à : a) croiser un plant de maïs mâle stérile hétérozygote pour le transgène AMS avec un plant de maïs restaurateur de la fertilité comprenant dans son génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", b) sélectionner par le phénotype "petit grain" les semences de maïs comprenant dans leur génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", c) autoféconder les plants de maïs issus des semences sélectionnées selon l'étape b), d) sélectionner les semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain".
2. Procédé de production de semences de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS") et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", comprenant les étapes consistant à : a) croiser un plant de maïs mâle stérile hétérozygote pour le transgène AMS avec un plant de maïs restaurateur de la fertilité comprenant dans son génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", b) réaliser un génotypage des semences obtenues par le croisement selon l'étape a), c) autoféconder les plants de maïs issus des semences génotypees selon l'étape b), d) sélectionner les semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain".
3. Semence de maïs homozygote pour un transgène AMS et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 1 ou 2.
4. Procédé de production de semences de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS"), comprenant les étapes consistant à : . a) croiser un plant de maïs mâle stérile hétérozygote pour le transgène AMS avec un plant de maïs restaurateur de la fertilité comprenant dans son génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain ", b) sélectionner par le phénotype "petit grain" les semences de maïs comprenant dans leur génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", c) autoféconder les plants de maïs issus des semences sélectionnées selon l'étape b), d) sélectionner des semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", e) autoféconder des plants de maïs issus de semences selon l'étape d), f) sélectionner des semences homozygotes pour le transgène AMS.
5. Procédé de production de semences de maïs homozygotes pour un transgène conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle ("AMS") comprenant les étapes consistant à : a) croiser un plant de maïs mâle stérile hétérozygote pour le transgène AMS avec un plant de maïs restaurateur de la fertilité comprenant dans son génome un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", b) réaliser un génotypage des semences obtenues par le croisement selon l'étape a), c) autoféconder les plants de maïs issus des semences génotypees selon l'étape b), d) sélectionner les semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour le gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", e) autoféconder des plants de maïs issus de semences selon l'étape d), f) sélectionner des semences homozygotes pour le transgène AMS.
6. Procédé de production de semences de maïs homozygotes pour un transgène AMS, comprenant les étapes consistant à : a) autoféconder des plants de maïs issus de semences selon la revendication 3, b) sélectionner des semences homozygotes pour un transgène AMS.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 , 2 et 4 à 6, caractérisé en ce que au moins une étape de sélection comprend un tri densimétrique.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le tri densimétrique s'effectue à l'aide d'une table densimétrique.
9. Procédé de production d'une semence hétérozygote pour un transgène AMS comprenant le croisement d'un plant de maïs issu d'une semence homozygote pour un transgène AMS, susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 4 à 8, avec un plant de maïs de génotype sauvage.
10. Procédé de production d'une semence hétérozygote pour un transgène AMS, caractérisé en ce que le procédé selon l'une des revendications 4 à 8 comprend en outre le croisement d'un plant de maïs issu de ladite semence homozygote pour un transgène AMS avec un plant de maïs de génotype sauvage.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 , 2 et 4 à 10, dans lequel le transgène AMS conférant la stérilité mâle nucléaire artificielle est le gène barnase, lequel est compris dans une cassette d'expression, sous le contrôle d'un promoteur spécifique de la pollénogenèse, notamment un promoteur spécifique de l'anthère tel que pA3, pA6, pA9, pTA29, ou du promoteur Mac2, et du terminateur 3'CaMV ou 3'Nos, lié génétiquement à un gène codant un agent de sélection sous le contrôle du promoteur Actine-intron actine et du terminateur 3'CaMV ou 3'Nos.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que la cassette d'expression comprenant le gène barnase comprend en outre un gène codant une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou prophylactique lié génétiquement au gène barnase.
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en.ce que ledit promoteur est le promoteur spécifique de la pollénogenèse pA9.
14. Procédé selon l'une des revendications 11, 12 ou 13, caractérisé en ce que ledit gène codant un agent de sélection est choisi parmi le gène bar qui confère la résistance à l'herbicide Basta® et le gène Nptll qui confère la résistance à la kanamycine, ledit gène étant compris à l'intérieur de l'élément transposable Ds.
15. Cassette d'expression comprenant un gène restaurateur de la fertilité lié génétiquement à au moins un gène codant un phénotype 'petit grain', associés à des éléments permettant leur expression dans les cellules végétales, notamment un promoteur et un terminateur de transcription.
16. Cassette d'expression selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit gène restaurateur de la fertilité est le gène barstar placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique de la pollénogenèse, notamment un promoteur spécifique de l'anthère tel que pA3, pA6, pA9, pTA29, ou du promoteur Mac2, et du terminateur 3'CaMV ou 3'Nos, lié génétiquement à un gène codant un agent de sélection sous le contrôle du promoteur Actine-intron actine et du terminateur 3'CamV ou 3'Nos
17. Cassette d'expression selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que ledit gène codant un phénotype 'petit grain' est choisi parmi les gènes shrunken 2 et brittle 2 en orientation antisens.
18. Cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisée en ce que le promoteur associé au gène codant un phénotype 'petit grain' est choisi parmi les promoteurs HMWG et B32.
19. Cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisée en ce que ledit terminateur est choisi parmi le terminateur 3'Nos et le terminateur 3'CaMV.
20. Vecteur, notamment plasmide, caractérisé en ce qu'il contient au moins une cassette d'expression telle que décrite dans l'une des revendications 11 à 19.
21. Hôte cellulaire, notamment bactérie telle que Agrobacterium tumefaciens, transformé par un vecteur selon la revendication 20.
22. Cellule de maïs transformée par au moins un vecteur selon la revendication 20.
23. Plant de maïs restaurateur de la fertilité caractérisé en ce qu'il comprend dans son génome un gène restaurateur de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain".
24. Plant de maïs homozygote pour un transgène AMS et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", obtenu à partir d'une semence selon la revendication 3.
25. Procédé de multiplication d'un plant de maïs homozygote pour un transgène AMS et hétérozygote pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", comprenant les étapes consistant à : a) autoféconder des plants de maïs homozygotes pour un transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", susceptibles d'être obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, . b) sélectionner des semences homozygotes pour le transgène AMS et de phénotype "petit grain ", c) sélectionner les semences homozygotes pour le transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain" obtenues par autofécondation des plants de maïs obtenus à partir dés semences obtenues selon l'étape b).
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'étape b) comprend un tri densimétrique.
27. Kit pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 25 ou 26, caractérisé en ce qu'il comprend des semences de maïs homozygotes pour un transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain", et des oligonucléotides spécifiques du transgène AMS utiles en tant qu'amorces pour la détection par PCR des semences homozygotes pour un transgène AMS et hétérozygotes pour un gène de restauration de la fertilité lié à un marqueur de phénotype "petit grain".
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