CN105018475B - 基于Ms1基因构建的介导玉米雄性生育力的多控不育载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术中的基因工程领域，公开了一种能恢复玉米雄性不育植株育性的多控不育构建体及其应用。该构建体包含四种类型基因表达盒：第一种表达盒为玉米雄性不育的育性恢复基因表达盒；第二种表达盒的作用为抑制玉米的雄配子体的形成或功能；第三种表达盒为标记玉米种皮颜色的表达盒；第四种表达盒为除草剂抗性基因的表达盒。将所述构建体导入玉米细胞、愈伤组织或器官中,可用于介导恢复雄性不育玉米的雄性生育力，用于保持雄性不育系的雄性不育等位基因的纯合隐性状态并获得非转基因的玉米多控不育系种子，以及含有所述构建体的植株通过自交来繁殖获得多控不育保持系种子。本发明应用于玉米不育化杂交育种和杂交制种，具有巨大的农业生产应用价值。

Description

基于Ms1基因构建的介导玉米雄性生育力的多控不育载体及 其应用

技术领域

一般地，本发明涉及分子生物学和植物基因工程领域。具体地，本发明涉及用于恢复雄性不育玉米育性的育性恢复基因Ms1的构建体、包含所述构建体的重组载体、以及用所述构建体或重组载体转化的宿主细胞、转基因植物细胞和转基因玉米制备方法，且由此产生的玉米雄性不育系种子和保持系种子。

背景技术

杂种优势是杂合体在一种或多种性状上优于它的两个亲本的现象。例如不同品系、不同品种、甚至不同种属间进行杂交所得到的杂种一代往往比它的双亲表现更强大的生长速率和代谢功能，从而导致器官发达、体型增大、产量提高，或者表现在抗病、抗虫、抗逆力、成活力、生殖力、生存力等的提高。这是生物界普遍存在的现象。利用植物杂种优势可以显著地提高作物的产量和品质。

在作物中，存在着自花授粉作物和异花授粉作物。自花授粉是指一株植物的花粉，对同一个体的雌蕊进行授粉的现象。与此相反，一株植物的花粉给另一植株的雌蕊授粉就称作异花授粉。水稻的雄蕊和雌蕊在同一器官中，通常以自花授粉方式进行繁殖。对水稻进行杂交育种和杂种优势利用，获得雄性不育系是关键。上世纪70年代“杂交水稻之父”袁隆平等人在野外发现了雄花败育的普通野生稻，这一雄性不育系的发现，为应用“三系”（雄性不育系、保持系、恢复系）配套选育杂交水稻的成功，打开了一个突破口，从而为我国甚至世界的粮食生产做出了重大的贡献。

对于异花授粉的作物玉米，因为缺乏良好的雄性不育系，目前对其进行杂交育种和制种主要采用人工去雄或机械去雄的方法。这种方法存在诸多弊端，比如成本高、纯度不稳和易受环境影响等问题，制约了杂种优势在玉米实际生产中的应用和发展。

玉米隐性核雄性不育材料不存在去雄的问题，但由于缺乏有效的保持和繁殖技术，很难应用于实际生产当中。现代生物技术的发展为玉米隐性核雄性不育材料的利用创造了条件。本发明旨在将隐性核雄性不育材料的育性恢复基因表达盒、抑制雄配子体形成的基因表达盒、荧光蛋白标记基因表达盒和除草剂抗性基因表达盒串联起来，构建高效的玉米多控不育遗传转化载体，导入相应的隐性核雄性不育材料中，获得玉米不育系的保持系，从而有效地解决玉米隐性核雄性不育系的保持和繁殖问题，以实现高效的不育化杂交育种和杂交制种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于Ms1基因的能恢复雄性不育玉米生育力的多控不育载体（构建体）及其应用的方法。

本发明所述的多控不育载体是指用于恢复雄性不育玉米生育力的遗传转化载体，其含有多个功能元件（4种不同类型表达盒的元件），这些功能元件的组装和表达，使转化植株得以可控地（通过雄性育性、种皮颜色和除草剂抗性）用于玉米雄性不育系的繁殖和保持。

本发明所述的多控不育载体的4种不同类型表达盒元件，包含玉米雄性育性相关基因的表达盒、抑制植物雄配子体的形成或功能的表达盒、除草剂抗性基因表达盒和颜色标记基因表达盒。

（1）具体地，玉米雄性育性相关基因的表达盒中，从上游至下游依次包括雄性器官特异表达启动子或组成型表达启动子、育性相关基因和终止子。

进一步，上述育性相关基因即玉米Ms1基因。

上述启动子可以是雄性器官特异表达启动子5126、Ms1的启动子或组成型表达的Ubiquitin启动子。

5126启动子是玉米花药特异性启动子。

Ubiquitin启动子来自于玉米多聚泛素蛋白基因(maize poly ubi gene)，由Ubi基因的启动子区，5’非翻译区和第一内含子组成。

（2）抑制植物雄配子体的形成或功能的表达盒中，从上游至下游依次包括花药或雄蕊器官特异启动子、抑制植物雄配子体的形成或功能的基因以及终止子。

具体地，上述花药或雄蕊器官特异启动子可以为Pg47启动子或Zm13启动子；抑制植物雄配子体的形成或功能的基因为玉米α淀粉酶基因或Dam甲基化酶基因；终止子为In2-1终止子或PinⅡ终止子。

Pg47和Zm13都是花粉特异性启动子，Pg47启动子来自玉米花粉特异性聚半乳糖醛酸酶(Pg47)基因的5’调节区(Allen和Lonsdale，Plant J(1993) 3:261-271)。

玉米α淀粉酶基因，可以是玉米α淀粉酶-1 基因，该基因在雄性组织表达时会导致花粉粒能量来源崩溃进而花粉发育被遏制。

Dam甲基化酶基因(Brooks et al., Nucleic Acids Res(1983)11: 837-851)的表达产物催化对植物DNA中腺嘌呤残基的甲基化。经甲基化的腺嘌呤会影响到细胞存活。

终止子为In2-1终止子（玉米In2-1基因的终止子）或PinⅡ终止子（马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的终止子，An et al., Plant Cell (1989)1: 115-122）。

（3）除草剂抗性基因表达盒为35S启动子驱动Bar基因的表达盒，终止子是35S终止子。

35S启动子来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区（Franck et al., Cell(1980)21:285-294）。

（4）颜色标记基因表达盒为由Ltp2启动子、红色荧光蛋白DsRed2基因或mCherry基因以及pinⅡ终止子依次串联构成的表达盒。

Ltp2启动子是大麦脂质转移蛋白基因的启动子，在种子的糊粉层特异表达（Kallaet al., Plant J(1994) 6: 849-860）。

上述含多基因表达盒的构建体是以来自pCambia系列载体的pCambia3301（信息见网址：http://www.cambia.org/daisy/cambia）为骨架进行依次构建的。

利用本发明所述的构建体，本发明还提供了一种用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态，并能繁殖玉米雄性不育系的保持系植株的方法，其中还包括鉴定玉米保持系种子和植株的方法。

本发明提供的获得上述雄性不育系和保持系的培育方法是将恢复雄性不育玉米育性的多控不育构建体导入目的植物—玉米隐性核不育系中获得的。

上述导入目的植物的方法是通过花粉管或农杆菌导入植物细胞、愈伤组织、组织或器官中获得植株。

本发明所述的用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，包含：

a)提供第一植株，所述第一植株包含雄性不育基因ms1的纯合隐性等位基因（ms1ms1），且所述第一植株是雄性不育的；

b)向上述第一植株中引入权利要求1所述的构建体以获得第二植株，所述第二植株只在同源染色体的其中一条染色体上含有所述构建体，即所述构建体为半合子状态。

半合子（hemizygote）指的是具有二组相同的染色体组，但有一个或多个基因是单价的，只存在于一个染色体组，另一个染色体组没有与之相对应的等位基因，这种合子称为半合子。所述第二植株包含与所述第一植株相同的雄性不育基因ms1的纯合隐性等位基因，当其构建体中的玉米雄性育性控制基因Ms1表达时将恢复第二植株雄性生育力；当抑制植物雄配子体的形成或功能的基因（如淀粉酶基因或细胞毒素基因）表达时，所述第二植株抑制可育雄性配子的形成或功能，从而使得在所述第二植株中只能产生不包含所述构建体的可育雄性配子，其基因型为ms1；

c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以保持并产生所述第一植株纯合隐性状态的后代。

本发明所述的用于繁殖玉米不育系的保持系植株的方法，包含：

通过权利要求21所述的第二植株自花受精，产生50%的含有所述构建体的种子（即保持系种子）；产生50%的正常不育系种子。

鉴定保持系种子和植株的方法，具体为：

将所述第二植株的种子播种后，其产生的花粉作为供体（父本），与其它正常育性植株（作为母本）杂交，所获得F1种子全部是正常颜色种子（非荧光种子）。

将所述第二植株自交后产生的种子在荧光显微镜下观察，具有红色荧光的种子即为保持系。

种植所述第二植株自交后产生的种子，使所述种子长成待鉴定植株，用除草剂喷洒所述待鉴定植株，保持系植株与非保持系植株相比，没有植物损伤症状或具有的损伤症状程度更轻。

附图说明

图1所示为玉米多控不育载体pMCS0101和pMCS0103构建流程图。

图2所示为玉米多控不育载体pMCS0101的T-DNA区域图谱。T-DNA的大小为11,336bp，其中包含4个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒，雄性育性恢复基因Ms1的表达盒以及颜色标记基因DsRed的表达盒。

图3所示为玉米多控不育载体pMCS0101的质粒图谱

图4所示为玉米多控不育载体pMCS0101的酶切鉴定图。M 为1 kb plus DNAmarker；1，2，3分别为pMCS0101质粒用BglII/HindIII、KpnI和BamHI进行酶切。用BglII/HindIII双酶切的产物大小为12.3 kb/4.3 kb/960 bp；KpnI酶切产物大小为9.3 kb/4.6kb/3.6 kb；BamHI酶切产物大小为10.8 kb/4.2 kb/2.5 kb。

图5所示为pMCS0103的T-DNA区域图谱。T-DNA的大小为12,904 bp，其中包含5个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，2个抑制花粉形成的表达盒（α淀粉酶基因表达盒和Dam甲基化酶基因表达盒），雄性育性恢复基因Ms1的表达盒，以及颜色标记基因DsRed的表达盒。

图6所示为玉米多控不育载体pMCS0103的质粒图谱。

图7所示为玉米多控不育载体pMCS0103的酶切鉴定图。M 为1 kb plus DNAmarker；1，2，3分别为pMCS0103质粒用BglII/HindIII、BamHI和KpnI进行酶切。用BglII/HindIII双酶切的产物大小为12.3 kb/4.3 kb/1.6 kb/960 bp；BamHI酶切产物大小为10.8kb/3.6 kb/2.5kb/2.3kb； KpnI酶切产物大小为9.3kb/5.2 kb/4.6 kb。

图8所示为玉米多控不育载体pMCS0104构建流程图

图9所示为玉米多控不育载体pMCS0104的T-DNA区域图谱。T-DNA的大小为12,418bp，其中包含5个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，雄性育性恢复基因Ms1的表达盒，2个抑制花粉形成的表达盒（α淀粉酶基因表达盒和Dam甲基化酶基因表达盒），以及颜色标记基因mCherry的表达盒。

图10所示为玉米多控不育载体pMCS0104的质粒图谱。

图11所示为玉米多控不育载体pMCS0104的酶切鉴定图。M 为1 kb plus DNAmarker；1，2，3分别为pMCS0104质粒用EcoRI/HindIII、KpnI和BglII进行酶切。用EcoRI/HindIII双酶切的产物大小为10.0 kb/4.6 kb/3.1 kb/960 bp；KpnI酶切产物大小为10.0kb/5.8 kb/2.8 kb；BglII酶切产物大小为12.8 kb/5.2 kb/700 bp。

图12所示为多控不育载体的玉米转化流程和植株的再生。

图13所示为多控不育转基因玉米植株的PCR阳性鉴定。M 为DL2000 DNA marker，1至21为不同的转基因植株，CK为非转基因对照植株，P为质粒阳性对照。H₂O为水对照。

图14所示为多控不育转基因玉米植株的RT-PCR检测结果。M 为DL2000 DNAmarker，1至10样品为随机取样的转基因植株，其中1、7、8为转基因阴性植株，2、3、4、5、6、9、10为转基因阳性植株。H₂O为水对照。

图15所示为收获的转基因玉米植株穗子表型。A为转基因株系在正常白光下的穗子表型，B为A在蓝色激发光下的穗子表型。其中，在蓝色激发光下发红色荧光的种子，在正常白光下表皮呈红色；而在蓝色激发光下不发荧光的种子，在正常白光下表皮为黄色（正常的玉米种子颜色）。

具体实施方式

下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

如无特殊说明，实施例中所用的内切酶等酶试剂购自宝生物（大连）有限公司，引物及基因的合成和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：多控不育载体pMCS0101、pMCS0103和pMCS0104的构建

1、构建含有4个表达盒的多控不育载体pMCS0101

1）构建含有花粉致死基因ZmAA表达盒的重组载体pCZmAA

质粒pMA-Pg47-ZmAA含有ZmAA的表达盒（Pg47pro:ZmAA-In2-1，SEQ ID NO.1），委托上海英骏生物技术有限公司合成，以此为模板扩增 ZmAA的表达盒，得到片段Pg47PRO:ZmAA-In2-1。PCR引物为：

oligo01： 5’- cccaagctttgcaccggacactgtctggtg (AAGCTT为HindIII酶切位点)；

oligo02：5’-ccgaattccgtggagatataggggaaagagaacg (gaattc为EcoRI酶切位点)。

将上述花粉致死基因ZmAA表达盒与pCambia3301载体的骨架相连。pCambia3301是pCambia系列载体之一，含有除草剂抗性基因Bar的表达盒（CaMV35SPRO:Bar, SEQ IDNO.2）

用HindIII和EcoRI双酶切Pg47-BT1-ZmAA-In2-1片段和pCAMBIA3301载体后，将ZmAA表达盒连入pCAMBIA3301大片段中，获得载体命名为pCZmAA。

2）构建含有育性恢复基因Ms1表达盒（Ubiquitin:Ms1-Ocs, SEQ ID NO.3）的重组载体pTUMs1

玉米自交系B73是目前广泛应用于玉米遗传研究及育种实践的开放性玉米种质，能够从种子公司直接购买获得。从玉米自交系B73 提取RNA，反转录PCR扩增Ms1基因，得到650 bp的Ms1基因片段。所用引物如下：

oligo03：5’-cgcggtaccatgaccggcggcggccgc (GGTACC为KpnI酶切位点)

oligo04：5’-gccggatcctcacctgcaggcgctgctc (GGATCC为BamHI酶切位点)

pCAMBIA2300-Ubi-Ocs载体含有Ubiquitin启动子和Ocs终止子，在Ubiquitin启动子后含多克隆位点，载体的骨架是pCAMBIA系列的pCAMBIA2300（信息见网址：http://www.cambia.org/daisy/cambia）。pCAMBIA2300-Ubi-Ocs载体由发明人所在公司实验室保存。用KpnI和BamHI双酶切Ms1片段和pCAMBIA2300-Ubi-Ocs载体。将Ms1片段连入pCAMBIA2300-Ubi-Ocs酶切片段中，获得pCUMs1。

以pCUMs1为模板扩增Ubi-Ms1-Ocs片段，所用引物为:

oligo05：5’-aagcttaattagcttgcatgcctgcagtg(AAGCTT为Hind III酶切位点)

oligo06: 5’- gGtcaccctgcagtgatcatcaatcagtaaattGAAcg

gagAATATTA (GGTCACC为BstEII酶切位点，TGATCA为BclI酶切位点)

将以上扩增片段Ubi-Ms1-Ocs连入T载体pEASYT3中，获得载体命名为pTUMs1。

3）构建荧光标记基因表达盒（Ltp:DsRed2-Nos, SEQ ID NO.4）载体pT-LD

pMD18-Ltp2含有Ltp2启动子，Ltp2的5’端和3’端分别含有BclI和XhoI酶切位点。DsRed2-FL-19T含有DsRed2基因。pMD18-Ltp2和DsRed2-FL-19T均委托上海英骏生物技术有限公司合成。以DsRed2-FL-19T载体为模板扩增DsRed2片段，所用引物为：

oligo07：5’- gtgatcacatctcgagatggcctcctccgagaacgtc(TGATCA为BclI酶切位点、CTCGAG为XhoI酶切位点)；

oligo08：5’- gggtcaccctacaggaacaggtggtggc(GGTCACC为BstEII酶切位点)。

将以上扩增片段DsRed2连入T载体pEASYT3中，获得pTDsRed2。

用BclI和XhoI双酶切pMD18-Ltp2和pTDsRed2载体，胶回收后将Ltp2片段连入pTDsRed2片段中，获得含有荧光标记基因表达盒的载体pT-LD。

4）构建pMCS0101载体

用BclI和BstEII双酶切上述获得的中间载体pTUMs1和pT-LD，胶回收Ltp2-DsRed2片段和pTUMs1片段，将Ltp2-DsRed2片段连入pTUMs1，获得pTUMs-LD。

用HindIII和BstEII双酶切pCZmAA和pTUMs-LD，将Ubi-Ms1-Ocs-Ltp2-DsRed2片段连入pCZmAA大片段中，获得的载体命名为pMCS0101。该载体包含4个表达盒，如图2所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒，雄性育性恢复基因Ms1的表达盒以及颜色标记基因DsRed的表达盒。pMCS0101载体图谱如图3所示。pMCS0101载体的专利保藏号为CGMCC No.10442，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101；生物保藏的分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；保藏日期：2015年1月27日。

2、构建含有5个表达盒的多控不育载体pMCS0103

用HindIII酶切以上构建得到的pMCS0101载体，并进行去磷酸化处理。载体pMD18-Dam含有Dam表达盒(Dam基因表达盒Zm13:Dam, SEQ ID NO.5），将该载体用HindIII酶切后得到Dam表达盒片段。将以上pMCS0101载体酶切片段和Dam表达盒片段分别胶回收后进行连接，获得的载体命名为pMCS0103。该载体包含5个表达盒，如图5所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒和Dam表达盒，雄性育性恢复基因Ms1的表达盒以及颜色标记基因DsRed的表达盒。pMCS0103载体图谱如图6所示。pMCS0103载体的专利保藏号为CGMCC No.10443，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101；生物保藏的分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；保藏日期：2015年1月27日。

3、构建含有5个表达盒的多控不育载体pMCS0104

1）构建含有荧光蛋白标记基因mCherry表达盒（Ltp:mCherry, SEQ ID NO.6）的中间载体pCLC

以pMD18-Ltp2为模板扩增Ltp2片段，所用引物为：

oligo07：5’- caaagcttctctagaactagtggatctcgatgtgtag(AAGCTT为HindIII酶切位点)；

oligo08：5’- ctggtcaccagatcttactcggctacactcacac(GGTCACC为BstEII酶切位点)。

将以上扩增产物Ltp2片段和pCAMBIA3301用HindIII和BstEII酶切、胶回收后连接得到pCLtp。

质粒pMD18-mCherry含有mCherry基因（由上海英骏生物技术有限公司合成），以此质粒为模板扩增mCherry片段，所用引物为：

oligo09引物：5’- cggagatctatggtgagcaagggcgaggag(AGATCT为BglII 酶切位点)

oligo10引物：5’- cggagatcttacttgtacagctcgtccatg(AGATCT为BglII 酶切位点)

将以上扩增产物mCherry片段用BglII酶切，质粒pCLtp经BglII酶切后去磷酸化处理，胶回收后连接得到pCLC。

2）中间载体pCLCAA的构建(含有α淀粉酶基因表达盒)

将质粒pMA-Pg47-ZmAA和pCLC用HindIII和EcoRI酶切，将4.6 kb的ZmAA表达盒和pCLC载体片段胶回收后连接，得到pCLCAA。

3）pT5126MsOcs载体的构建(含有育性恢复基因Ms1表达盒5126:Ms1, SEQ IDNO.7）

以玉米自交系B73为材料，用PlantGen DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪公司）提取基因组DNA。以得到的基因组DNA为模板扩增5126启动子片段，所用引物如下：

oligo11： 5’-gaattcctaggatctttctgatttcaaccat(GAATTC为EcoRI酶切位点)

oligo12：5’- gccgcggccgccgccggtcatggatccgggccccgc

aaagcaactttgatttg(GCGGCCGC为NotI酶切位点)

将扩增产物1.5 kb的 5126片段连入pEASY-T5载体中，获得载体命名pT5126。

以pCUMs1为模板扩增Ms1片段，所用引物如下：

oligo13：5’- atgaccggcggcggccgcgg

oligo14：5’- ctggcatgccggatcctcacctgcaggcgctgctcttg

以pCAMBIA2300-Ubi-Ocs为模板扩增Ocs片段，所用引物如下：

oligo15：5’- ctgcaggtgaggatccggcatgccagggctctcaatg

oligo16：5’- ccggcggccgctagcgtctagatcaatcagtaaattg

aacggagaata

将得到的PCR产物各取1ul混合做模板，以引物oligo13和oligo16进行overlapPCR扩增，得到Ms1和Ocs融合的片段Ms1-Ocs ，将该片段用NotI酶切和胶回收。

将质粒pT5126用NotI酶切和去磷酸化处理，然后进行胶回收。将以上两个片段进行连接，得到pT5126MsOcs。

4）pT5126MsOcsDam载体的构建（含有Dam基因表达盒）

以pMD18-Zm13-Dam-PinⅡ为模板扩增Dam表达盒片段，所用引物如下：

oligo17：5’- ccgtctagagctgccatttaatgattctatat (下划线为XbaI酶切位点)

oligo18：5’- ggcgctagcgaattcggccgcattcgcaaaacacac(下划线为NheI酶切位点)

将以上扩增产物Dam基因表达盒片段用XbaI和NheI酶切，质粒pT5126MsOcs同样XbaI和NheI酶切，以上酶切产物胶回收后连接得到pT5126MsOcsDam。

5）构建pMCS0104载体

用EcoRI酶切步骤2得到的质粒pCLCAA，酶切产物再经去磷酸化处理；将步骤4得到的pT5126MsOcsDam用EcoRI酶切。以上两种产物分别胶回收，连接获得重组载体pMCS0104。pMCS0104包含5个表达盒，如图9所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，雄性育性恢复基因Ms1的表达盒，2个抑制花粉形成的表达盒（α淀粉酶基因表达盒和Dam甲基化酶基因表达盒），以及颜色标记基因mCherry的表达盒。pMCS0104载体图谱见图10。pMCS0104载体的专利保藏号为CGMCC No.10444，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101；生物保藏的分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；保藏日期：2015年1月27日。

实施例2：多控不育载体pMCS0101、pMCS0103和pMCS0104的应用

1、多控不育载体转化农杆菌

参照AN（Methods in Enzymology(1987)153:292-305）方法，将本发明所构建的多控不育载体pMCS0101、pMCS0103和pMCS0104转化到农杆菌EHA105（Hood et al.,Transgenic Res(1993)2:208-218）中。

取1~2μg 质粒，加到100μL于冰上溶化的农杆菌EHA105感受态细胞中，冰浴30min。置于液氮中迅速冷冻1 分钟，移入37℃水浴中5 min；迅速冰浴 2 min后将加入1000μLYEB 液体培养基，于28℃，转速为200 rpm 条件下培养2~4 hr，涂于含50 mg/L 的利福平（Rifampicin）和100 mg/L 的卡那霉素（Kanamycin）的固体YEB 平板上培养2~3天。长出单菌落后，挑取单菌落接种于含相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒。将以上质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到单菌落后接种LB培养基培养，然后提取质粒。用限制性内切酶酶切质粒验证，如图4、7和图11所示，酶切结果表明多控不育载体pMCS0101 、pMCS0103 和pMCS0104构建正确。

2、多控不育载体的玉米转化流程和植株的再生

将ms1 突变体（ms1ms1）纯合的雄性不育植株与来自玉米HiⅡ植株的花粉杂交、回交数代之后，该ms ₁ 等位基因渐渐渗入易于转化的HiⅡ玉米种质。

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的上述具有玉米Ms1ms1杂合等位基因的玉米HiⅡ的幼胚与本实施例所述的农杆菌共培养，以将本实施例构建的多控不育载体pMCS0101中的T-DNA（包含4个表达盒）、pMCS0103中的T-DNA（包含5个表达盒）或pMCS0104中的T-DNA（包含5个表达盒）转入到玉米基因组中，获得了转基因玉米植株。

对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离幼胚（见图12-1），用农杆菌悬浮液侵染幼胚（见图12-2），其中农杆菌能够将所述介导植物雄性育性的构建体传递至幼胚的细胞（步骤1 ：侵染步骤）。在此步骤中，幼胚浸入农杆菌悬浮液（OD₆₆₀=0.4~0.6，侵染培养基（MS 盐4.3g/L、MS 维生素、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L，pH5.3））中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养（见图12-3）一段时期（3天）（步骤2 ：共培养步骤）。幼胚在侵染步骤后在固体培养基（MS盐4.3g/L、MS 维生素、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）100mg/L、2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基（MS 盐4.3g/L、MS 维生素、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）中至少存在一种已知抑制农杆菌生长的抗生素（头孢霉素）（步骤3 ：恢复步骤）。幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基（MS 盐4.3g/L、MS 维生素、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上培养（见图12-4），导致转化的细胞选择性生长（步骤4 ：选择步骤）（见图12-5）。然后，愈伤组织在固体培养基（MS 分化培养基和MS 生根培养基）上培养以再生植物再生成植物（步骤5 ：再生步骤）（见图12-6）。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS 分化培养基（MS 盐4.3g/L、MS 维生素、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS 生根培养基（MS 盐2.15g/L、MS 维生素、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3- 乙酸1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实（见图12-7和12-8）。在温室中，每天于28℃下培养16 小时，再于20℃下培养8 小时。

3、转基因玉米植株的PCR阳性鉴定

取温室培养的转化阳性候选玉米植株的叶片，用PlantGen DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用质粒载体特异引物Bar基因引物进行PCR鉴定，同时以非转基因玉米DNA作为阴性对照，以多控不育载体质粒作为阳性对照。

Bar基因引物序列如下：

Oligo19 (Bar-F)： 5’- ctcgagtctaccatgagcccagaac

Oligo20 (Bar-R)： 5’- ctcgagtcaaatctcggtgacgggca

图13为部分转基因植株的PCR鉴定。从图13可以看出，在检测的转多控不育载体的21株转基因候选株中，有10株是转化阳性植株。

4、转基因植株在RNA水平的鉴定

将以上基因组DNA检测为阳性和阴性的转基因玉米植株分别随机挑取7株和3株进行RNA水平的检测（其中2、3、4、5、6、9和10为基因组DNA PCR 阳性植株，1、7和8为基因组DNAPCR 阴性植株）。首先提取上述10棵玉米植株的叶片RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，用上述Bar基因引物进行PCR扩增，抗除草剂基因表达盒的表达水平和玉米Actin基因作为内标参照基因表达示意图见图14，引物序列如下：

Oligo21 (Actin-F)： 5’- AAATGACGCAGATTATGTTTGA

Oligo22 (Actin-R)： 5’- GCTCGTAGTGAGGGAGTACC

图14表明2、3、4、5、6、9和10植株检测到Bar基因的表达，这和基因组DNA的PCR阳性检测结果一致，表明在DNA水平检测阳性的植株都有除草剂抗性基因的表达。

5、Real time PCR验证转基因玉米植株

取上述DNA水平和RNA水平检测为阳性的转基因玉米植株Ms1（T₀）的叶片约100mg作为样品，用PlantGen DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR 方法检测Bar 基因和IVR 基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3 次重复，取平均值。

检测BAR 基因和IVR 基因拷贝数的具体方法如下：

取转基因玉米植株Ms1 和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3 个重复；

使用PlantGen DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；用Quawell Q5000超微量紫外分光光度计测定上述样品的基因组DNA 浓度；调整上述样品的基因组DNA 浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl ；

采用Taqman 探针荧光定量PCR 方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为负对照，每个样品3 个重复，取其平均值；荧光定量PCR 引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测BAR基因序列：

Oligo21：5’- TCACTCGGGATGACGATGG ；

Oligo22：5’- TGCCACCAGACAGTGTCCG ；

Probe1：5’- ccgagccgcaggaaccgcaggag （荧光基团5’6-FAM;淬灭基团3’TAMRA）；

以下引物和探针用来检测IVR 基因序列：

Oligo23 ：5’- TGGCGGACGACGACTTGT ；

Oligo24 ：5’- AAAGTTTGGAGGCTGCCGT ；

Probe2 ：5’- CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC（荧光基团5’CY5;淬灭基团3’BHQ-2）；

PCR 反应体系为：25 ul 2 X GoldStar TaqMan Mixture（With ROX）；1 ulForward Primer，10 uM（终浓度0.2uM）；1 ul Reverse Primer，10 uM（终浓度0.2 uM）；1ul Probe，10 uM（终浓度0.2 uM）；2 ul Template DNA，最终利用不含任何RNase的水稀释到50 ul。

PCR 反应条件为：步骤1：预变性，温度95℃，时间10 min；步骤2：变性，温度95℃，时间15s；步骤3：退火/延伸，温度60℃，时间1 min；重复上述40个循环。

利用SDS2.3 软件（Applied Biosystems）分析数据。

实验结果表明，所述介导植物生育力的构建体（包含完整的T-DNA区）己经整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且获得了具有单拷贝的所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株Ms1-1（转化pMCS0101）、Ms1-3（转化pMCS0103）和转基因玉米植株Ms1-4（转化pMCS0104）。

6、雄性不育保持系和不育系的鉴定和繁殖

使所述转基因玉米植株Ms1-1（T₀）自交，收获自交T₁ 种子Ms1-1（T₁）。如图12-8所示，50% 的所述自交T₁ 种子Ms1-1（T₁）表皮为红色，在荧光下观察呈现红色荧光，所述红色荧光种子标记为Ms1-1（+）；另50% 的所述自交T₁ 种子Ms1-1（T₁）表皮为黄色或乳白色，荧光下观察无红色荧光，所述无红色荧光种子标记为Ms1-1（-）。

种植上述Ms1-1（+）和Ms1-1（-）种子直至长到3叶期，用3mg/L 除草剂喷洒所述Ms1-1（+）和Ms1-1（-）植株，根据在除草剂处理后第5天观察到的叶子损伤情况来确定植株是否损伤。实验表明，所述Ms1-1（+）植株基本上没有显示出叶子损伤，所述Ms1-1（-）植株则有明显的叶子损伤。

上述荧光观察结果和除草剂抗性结果表明所述介导植物生育力构建体以预计频率传递给了后代，即Ms1-1（+）为包含所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株（保持系植株）。Ms1-1（-）为ms1 纯合隐性的不含所述构建体的植株（不育系植株）。

7、转基因植株花粉育性的分析

为确定转基因植株中抑制植物雄配子体的形成或功能的表达盒的表达效果，我们以具有单拷贝的所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株（图15）加以评估，以该转基因植株做父本，非转基因玉米对照植株HiⅡ-A做母本进行测交分析。10.78万粒杂交的种子在荧光显微镜下观察，没有发现具有红色荧光的种子。表明所授的花粉是不含转基因成分的，这也说明所述表达盒已起到抑制雄配子细胞正常发育的作用。

相关参考文献

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SEQUENCE LISTING

<110> 北京首佳利华科技有限公司

<120> 基于Ms1基因构建的介导玉米雄性生育力的多控不育载体及其应用

<130> 2015

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 4644

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tccccctttt tggtgattga tgccaacaca aaccaaagaa aatatataag tgcagaattg 300

aactagtttg cataaggtaa gtgcataggt tacttagaat taaatcaatt tatactttta 360

cttgatatgc atggttgctt tcttttattt taacattttg gaccacattt gcaccacttg 420

ttttgttttt tgcaaatctt tttggaaatt ctttttcaaa gtcttttgca aatagtcaaa 480

ggtatatgaa taagattgta agaagcattt tcaagatttg aaatttctcc ccctgtttca 540

aatgcttttc ctttgactaa acaaaactcc ccctgaataa aattctcctc ttagctttca 600

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aaaaacggag actttgtgag ccatttatac tttctcccca ttggtaaatg aaatatgagt 840

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ttagagtgga gtggaagcct tgtcttcgcc gaagactcca tttccctttc aatctacgac 960

ttagcataga aatacacttg aaaacacatt agtcgtagcc acgaaagaga tatgatcaaa1020

ggtatacaaa tgagctatgt gtgtaatgtt tcaatcaaag tttcgagaat caagaatatt1080

tagctcattc ctaagtttgc taaaggtttt atcatctaat ggtttggtaa agatatcgac1140

taattgttct ttggtgctaa cataagcaat ctcgatatca cccctttgtt ggtgatccct1200

caaaaagtga taccgaatgt ctatgtgctt agtgcggctg tgttcaacgg gattatccgc1260

catgcagata gcactctcat tgtcacatag gagagggact ttgctcaatt tgtagccata1320

gtccctaagg ttttgcctca tccaaagtaa ttgcacacaa caatgtcctg cggcaatata1380

cttggcttcg gcggtagaaa gagctattga gttttgtttc tttgaagtcc aagacaccag1440

ggatctccct agaaactgac aagtccctga tgtgctcttc ctatcaattt tacaccctgc1500

ccaatcggca tctgaatatc ctattaaatc aaaggtggat cccttggggt accaaagacc1560

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cttaggatcg gcttggaatc ttgcacacat gcatatagaa agcatactat ctggtcgaga1680

tgcacataaa tagagtaaag atcctatcat cgaccggtat accttttggt ctacggattt1740

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atccttcatt ccaaacttgt tgagtatgtc ttgaatgtac tttgtttggc tgatgaaggt1860

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catctcgaat ttcggaatca tgatcctact aaactcttca caagtagatt tgttagtaga1980

cccaaatata atatcatcaa cataaatttg gcatacaaac aaaacttttg aaatggtttt2040

agtaaagaga gtaggatcgg ctttactgac tctgaagcca ttagtgataa gaaaatctct2100

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ttcaccccat ttgatcactt ttttggtcct tcaggatcta atagttatgt ataatttaga2280

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tttttatcat gtctgatgag aattaacata aaggctcaat tgggtcctga attaataata2400

gagtgaaaat taatccagag gctctattag aaccttcaat tagtaatacc aagatatata2460

taagatagta gagtatagtt taaatgttgg cattgttcat tctttctttt gttatttaat2520

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acatcgtcat caaccaccgg tgcgcggaaa agaaggacgc gcgcggcgtg tactgcatct3300

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acacgcagta ctcggacggg acggggcacc gcgacacggg cgaggggttc gcggcggcgc3420

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tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca1980

ccctgttgtt tggtgttact tctgcaggtc gactctagag gatcaattcg agctcggtac2040

catgaccggc ggcggccgcg gcgcgtgcgc ggtgtgcaag caccagcggc gcaagtgcga2100

gcccaactgc gagctggccg cctacttccc ggcgcacagg atgaacgact tccgcgcgct2160

gcacctcgtc ttcggggtgg ccaacctcac caagctcatc aaggccaacg ccagcgaggc2220

cggccggcgc cgcgccgccg agacgctcac ctgggaggcc cgctggaggg agtgcgaccc2280

ctcggacggg tgctaccgcg aggtggcctg cctgcgccgc gacaacgccg tgctgcgcgc2340

cgagaacgcc gcgctgcggc ggcagctggc cgagcagcag ctgctctggt ccagcgcctg2400

cagcactggc ggcagcgcgc ttctggccga gcagcagctg ctgccgccgt gtgggggcaa2460

taataatggg cttctgacgg cgagtagcag agctcatcat gcaccggcag cagctctggc2520

ggcaacgcac accgcgctgg cctgctaccg tggcagcatg ccggtgtgta ctattactat2580

gacagcggac gacggcagcg gcaggaggcc ggcgtcggat gctgccgcca tcgccgggag2640

agggagtggt gctcaggtcg acgcttctag ggataacaag agcagcgcct gcaggtgagg2700

atcctctaga gtcgacctgc aggcatgccc tgctttaatg agatatgcga gacgcctatg2760

atcgcatgat atttgctttc aattctgttg tgcacgttgt aaaaaacctg agcatgtgta2820

gctcagatcc ttaccgccgg tttcggttca ttctaatgaa tatatcaccc gttactatcg2880

tatttttatg aataatattc tccgttcaat ttactgattg 2920

<210> 4

<211> 1818

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctctagaact agtggatctc gatgtgtagt ctacgagaag ggttaaccgt ctcttcgtga 60

gaataaccgt ggcctaaaaa taagccgatg aggataaata aaatgtggtg gtacagtact 120

tcaagaggtt tactcatcaa gaggatgctt ttccgatgag ctctagtagt acatcggacc 180

tcacatacct ccattgtggt gaaatatttt gtgctcattt agtgatgggt aaattttgtt 240

tatgtcactc taggttttga catttcagtt ttgccactct taggttttga caaataattt 300

ccattccgcg gcaaaagcaa aacaatttta ttttactttt accactctta gctttcacaa 360

tgtatcacaa atgccactct agaaattctg tttatgccac agaatgtgaa aaaaaacact 420

cacttatttg aagccaaggt gttcatggca tggaaatgtg acataaagta acgttcgtgt 480

ataagaaaaa attgtactcc tcgtaacaag agacggaaac atcatgagac aatcgcgttt 540

ggaaggcttt gcatcacctt tggatgatgc gcatgaatgg agtcgtctgc ttgctagcct 600

tcgcctaccg cccactgagt ccgggcggca actaccatcg gcgaacgacc cagctgacct 660

ctaccgaccg gacttgaatg cgctaccttc gtcagcgacg atggccgcgt acgctggcga 720

cgtgcccccg catgcatggc ggcacatggc gagctcagac cgtgcgtggc tggctacaaa 780

tacgtacccc gtgagtgccc tagctagaaa cttacacctg caactgcgag agcgagcgtg 840

tgagtgtagc cgagtactcg agatggcctc ctccgagaac gtcatcaccg agttcatgcg 900

cttcaaggtg cgcatggagg gcaccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg 960

cgagggccgc ccctacgagg gccacaacac cgtgaagctg aaggtgacga agggcggccc1020

cctgcccttc gcctgggaca tcctgtcccc ccagttccag tacggctcca aggtgtacgt1080

taagcacccc gccgacatcc ccgactacaa gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg1140

ggagcgcgtg atgaacttcg aggacggcgg cgtggccacc gtgacccagg actcctccct1200

gcaggacggc tgcttcatct acaaggtgaa gttcatcggc gtgaacttcc cctccgacgg1260

ccccgtgatg cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc accgagcgcc tgtacccccg1320

cgacggcgtg ctgaagggcg agacccacaa ggccctgaag ctgaaggacg gcggccacta1380

cctggtggag ttcaagtcca tctacatggc caagaagccc gtgcagctgc ccggctacta1440

ctacgtggac gccaagctgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggagca1500

gtacgagcgc accgagggcc gccaccacct gttcctgtag ggtgaccagc tcgaatttcc1560

ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg1620

cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat1680

gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat1740

acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat1800

ctatgttact agatcggg 1818

<210> 5

<211> 1562

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctgccattt aatgattcta tatatactat tcacttatgg atacatttaa ctgatggcgt 60

tttgttgagc gcgtcttatt tatttttaca tagcagcata gaagattaga agtcgcatgt 120

ccaagttttg tggaccgctg agaaactcaa ccaaattcga catatttttc acctccccat 180

gccacagaac caggtcaaaa cggctttctg gccgtcgccc actatttgta cgggcagcca 240

gacaaatatt cgggtctcgc agattattta aggacaccac aggctgcgtt acgaaaccag 300

gccagatttg ccaccctcgt ctcaccctcc ctccctcaca caaataataa ggaaaggtcc 360

cgcccttttc ctccgacatc cacagagagg aggggaaaac acgtacaatg aagaaaaatc 420

gcgctttttt gaagtgggca gggggcaagt atcccctgct tgatgatatt aaacggcatt 480

tgcccaaggg cgaatgtctg gttgagcctt ttgtaggtgc cgggtcggtg tttctcaaca 540

ccgacttttc tcgttacatc cttgccgata tcaatagcga cctgatcagt ctctataaca 600

ttgtgaagat gcgtactgat gagtacgtac aggccgcacg cgagctgttt gttcccgaaa 660

caaattgcgc cgaggtttac tatcagttcc gcgaagagtt caacaaaagc caggatccgt 720

tccgtcgggc ggtactgttt ttatatttga accgctacgg ttacaacggc ctgtgtcgtt 780

acaatctgcg cggtgagttt aacgtgccgt tcggccgcta caaaaaaccc tatttcccgg 840

aagcagagtt gtatcacttc gctgaaaaag cgcagaatgc ctttttctat tgtgagtctt 900

acgccgatag catggcgcgc gcagatgatg catccgtcgt ctattgcgat ccgccttatg 960

caccgctgtc tgcgaccgcc aactttacgg cgtatcacac aaacagtttt acgcttgaac1020

aacaagcgca tctggcggag atcgccgaag gtctggttga gcgccatatt ccagtgctga1080

tctccaatca cgatacgatg ttaacgcgtg agtggtatca gcgcgcaaaa ttgcatgtcg1140

tcaaagttcg acgcagtata agcagcaacg gcggcacacg taaaaaggtg gacgaactgc1200

tggctttgta caaaccagga gtcgtttcac ccgcgaaaaa ataaagactt gtccatcttc1260

tggattggcc aacttaatta atgtatgaaa taaaaggatg cacacatagt gacatgctaa1320

tcactataat gtgggcatca aagttgtgtg ttatgtgtaa ttactagtta tctgaataaa1380

agagaaagag atcatccata tttcttatcc taaatgaatg tcacgtgtct ttataattct1440

ttgatgaacc agatgcattt cattaaccaa atccatatac atataaatat taatcatata1500

taattaatat caattgggtt agcaaaacaa atctagtcta ggtgtgtttt gcgaatgcgg1560

cc 1562

<210> 6

<211> 1856

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctctagaact agtggatctc gatgtgtagt ctacgagaag ggttaaccgt ctcttcgtga 60

gaataaccgt ggcctaaaaa taagccgatg aggataaata aaatgtggtg gtacagtact 120

tcaagaggtt tactcatcaa gaggatgctt ttccgatgag ctctagtagt acatcggacc 180

tcacatacct ccattgtggt gaaatatttt gtgctcattt agtgatgggt aaattttgtt 240

tatgtcactc taggttttga catttcagtt ttgccactct taggttttga caaataattt 300

ccattccgcg gcaaaagcaa aacaatttta ttttactttt accactctta gctttcacaa 360

tgtatcacaa atgccactct agaaattctg tttatgccac agaatgtgaa aaaaaacact 420

cacttatttg aagccaaggt gttcatggca tggaaatgtg acataaagta acgttcgtgt 480

ataagaaaaa attgtactcc tcgtaacaag agacggaaac atcatgagac aatcgcgttt 540

ggaaggcttt gcatcacctt tggatgatgc gcatgaatgg agtcgtctgc ttgctagcct 600

tcgcctaccg cccactgagt ccgggcggca actaccatcg gcgaacgacc cagctgacct 660

ctaccgaccg gacttgaatg cgctaccttc gtcagcgacg atggccgcgt acgctggcga 720

cgtgcccccg catgcatggc ggcacatggc gagctcagac cgtgcgtggc tggctacaaa 780

tacgtacccc gtgagtgccc tagctagaaa cttacacctg caactgcgag agcgagcgtg 840

tgagtgtagc cgagtaagat ctatggtgag caagggcgag gaggataaca tggccatcat 900

caaggagttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga 960

gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt1020

gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg1080

ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc tgtccttccc1140

cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac1200

ccaggactcc tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc gcggcaccaa1260

cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctcctccga1320

gcggatgtac cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa1380

ggacggcggc cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca1440

gctgcccggc gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca acgaggacta1500

caccatcgtg gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg gcatggacga1560

gctgtacaag taagatctgg tgaccagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca1620

ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct1680

gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg1740

ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata1800

gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcggg 1856

<210> 7

<211> 2393

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatctttctg atttcaacca ttaccgatga atttctattt ggattagttc attttcgtct 60

tccctgtctg atcctgtttt cgacaattct gatcccgaat ccgtttttga attaaaatat 120

aaaaaataaa aacaagaaat ggtttatctc ggtcaatttc gtttttcacg aggaacatat 180

tcggtgtaca tgagcctttg gtgcacatga actaacaaag ttcacaaaaa attctgaaaa 240

aaaatcatac atattctttg catcgctact cctattatat ataaaatttc atgttcaaat 300

ttgttatatt ttagctgtaa taaaaagagt atttttagcc gattttctaa tttaaacttg 360

tcagaagttg tcttttttta ttacaactaa gtttaatgaa tttgaacttg aaacatgtat 420

ataattagag taagatgaaa agaatatgta tggatttttt caaaaaaatt gtaaaccttt 480

tttagttcat gtgcaccata tgtgaatcaa aggttcatat acaccggata tgtttccttt 540

ttcacgaacc taatctggcc tagccagtat gttgtggact tggctcctaa gtgtgaacct 600

ggcagtgatg ggcaacaaag caggcatgcc ttatgtgtga tgaataattg acacatgtac 660

cgagaggttt ggggtttttt tgtattgcat agcaaaacat ggtgaaattc ttagggtatt 720

tttgagatta catttagggc atgtttgttt cccttcattt tgaggaattg gaatctaact 780

aataaattag gctatttttt tagaatgtga cattcccaac tttctaaagt gtacatataa 840

gtctatctta aataatttat agggtggaag atgtaaattg attatataga tttataagct 900

tcttttctaa tgtaaaattt aaagctcact cttctacttg cttctctata acataatata 960

gtttataact acctctctca tatgatttag aataatatac aaatatatta cataaaaaat1020

atattaattg aattagtgtt gtctaattta taattattag aatgtaattc aattccaacg1080

aaacaacggg gccttaggtt taatatcttc cttacactgc gaaaatgttg ttacacttgc1140

caaaaaaaat caatcgcata tttaccttac aaggacatat tttagcaaaa tgctatagac1200

atgaatccaa cgtaatcaat agagtgagat ttactggtaa actaccaatt gctcatctgc1260

tcggtaccaa ccagcctttc ctattaccat gcacatgttg cctctcaact gcagcatctt1320

tcaagccgtg agcagacatg ttgcagatcg aagtaaggta tatatgtgca tagtctccta1380

attcttcatc ttcaacctct agctgattga tctctggtat ttaccactct ttccttcctt1440

ccttccttca attctaaata ccacaaatca aagttgcttt gcggggcccg gatccatgac1500

cggcggcggc cgcggcgcgt gcgcggtgtg caagcaccag cggcgcaagt gcgagcccaa1560

ctgcgagctg gccgcctact tcccggcgca caggatgaac gacttccgcg cgctgcacct1620

cgtcttcggg gtggccaacc tcaccaagct catcaaggcc aacgccagcg aggccggccg1680

gcgccgcgcc gccgagacgc tcacctggga ggcccgctgg agggagtgcg acccctcgga1740

cgggtgctac cgcgaggtgg cctgcctgcg ccgcgacaac gccgtgctgc gcgccgagaa1800

cgccgcgctg cggcggcagc tggccgagca gcagctgctc tggtccagcg cctgcagcac1860

tggcggcagc gcgcttctgg ccgagcagca gctgctgccg ccgtgtgggg gcaataataa1920

tgggcttctg acggcgagta gcagagctca tcatgcaccg gcagcagctc tggcggcaac1980

gcacaccgcg ctggcctgct accgtggcag catgccggtg tgtactatta ctatgacagc2040

ggacgacggc agcggcagga ggccggcgtc ggatgctgcc gccatcgccg ggagagggag2100

tggtgctcag gtcgacgctt ctagggataa caagagcagc gcctgcaggt gaggatccgg2160

catgccaggg ctctcaatgg agtttgaatc aaatcttcca gctgctttaa tgagatatgc2220

gagacgccta tgatcgcatg atatttgctt tcaattctgt tgtgcacgtt gtaaaaaacc2280

tgagcatgtg tagctcagat ccttaccgcc ggtttcggtt cattctaatg aatatatcac2340

ccgttactat cgtattttta tgaataatat tctccgttca atttactgat tga 2393

Claims (21)

1.一种介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于，包含四种类型基因表达盒：第一种表达盒，为雄性不育玉米育性恢复基因Ms1的表达盒；第二种表达盒，为抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达盒；第三种表达盒，为标记玉米种皮颜色的表达盒；第四种表达盒，为除草剂抗性基因表达盒，

其中，所述雄性不育玉米育性恢复基因Ms1的表达盒的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.3所示。

2.根据权利要求1所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于，所述构建体包含1个或2个抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达盒。

3.根据权利要求1所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于：所述抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达盒由启动子、抑制玉米雄配子体的形成或功能的基因和终止子可操作地相连而构成。

4.根据权利要求3所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于，所述抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达盒的启动子是聚半乳糖醛酸酶47基因的调控序列或Zm13基因的调控序列。

5.根据权利要求3所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于，所述抑制玉米雄配子体的形成或功能的基因是淀粉酶基因、DAM甲基化酶基因或细胞毒素基因。

6.根据权利要求3所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于，所述抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达盒的终止子是玉米In2-1基因的终止子或马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的终止子。

7.根据权利要求1所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于：所述标记玉米种皮颜色的表达盒由启动子、玉米种皮颜色标记基因和终止子可操作地相连而构成。

8.根据权利要求7所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，所述标记玉米种皮颜色的表达盒的启动子是玉米种皮特异表达的启动子。

9.根据权利要求7所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，所述玉米种皮颜色标记基因是红色荧光基因或绿色荧光基因。

10.根据权利要求7所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，所述标记玉米种皮颜色的表达盒的终止子是胭脂碱合成酶基因或章鱼碱合成酶基因的终止子。

11.根据权利要求1所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于：所述除草剂抗性基因的表达盒由启动子、除草剂抗性基因和终止子可操作地相连而构成。

12.根据权利要求11所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于，所述除草剂抗性基因的表达盒的启动子为花椰菜花叶病毒的35S启动子。

13.根据权利要求11所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于，所述除草剂抗性基因是EPSPS基因、PAT基因或BAR基因。

14.根据权利要求11所述的介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于，所述除草剂抗性基因的表达盒的终止子是来自花椰菜花叶病毒的35SpolyA终止子。

15.一种包含权利要求1所述构建体的重组载体。

16.一种包含权利要求1所述构建体的植物细胞，所述植物为玉米。

17.一种用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，所述方法包括：(a)提供第一植株，其包含Ms1基因的纯合隐性等位基因，并且其是雄性不育的；(b)创制第二植株，所述第二植株是向上述第一植株中引入权利要求1所述构建体，且所述构建体只存在于同源染色体的其中一条染色体上，即所述构建体为半合子状态；所述第二植株包含Ms1基因的纯合隐性等位基因；(c)用所述第二植株的雄性配子给所述第一植株受精，以保持并产生所述第一植株纯合隐性状态的后代。

18.一种用于繁殖含有权利要求1所述构建体的玉米多控不育保持系种子和不含任何转基因元件的不育系种子的方法，所述方法包括：通过权利要求17中所述的第二植株自花受精产生50％的含有所述构建体的不育保持系种子和50％的正常不育系种子。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，其还包括鉴定具有所述构建体的种子的步骤，具体为：将所述第二植株的种子播种后，其产生的花粉作为供体，与其它正常育性植株杂交，所获得子一代种子全部是正常颜色种子。

20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，其还包括鉴定具有所述构建体的种子的步骤，具体为：将所述第二植株的种子在荧光显微镜下观察，含有所述构建体的种子具有红色荧光。

21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，其还包括鉴定具有所述构建体的植株的步骤，具体为：种植所述第二植株自交后产生的种子；使所述种子长成待鉴定植株；用除草剂喷洒所述待鉴定植株，具有所述构建体的植株与不含所述构建体的植株相比，没有植物损伤症状或具有的损伤症状程度更轻。