CN103221543A - 用于玉米的激活标签化平台和所得的带标签的群体和植物 - Google Patents

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Abstract

本文中公开了用于玉米的激活标签化构建体、所得带标签的群体和植物。在一个实例中，激活标签化DNA构建体包含转座酶的编码序列、可检测的报道物(如花色素苷调节基因B-Peru和C1)、和非自主型可转座的T-DNA盒。例如，将可转座的T-DNA盒插入到可检测的报道物编码区，从而使得B-Peru和C1基因仅在该可转座盒切离时才在含有玉米激活标签化DNA构建体的细胞中表达花色素苷。生成带标签的玉米植物群体的方法包括用所公开的构建体转化玉米植物细胞或组织。

Description

用于玉米的激活标签化平台和所得的带标签的群体和植物
相关申请
本申请要求2010年8月30日提交的美国临时申请No.61/402,574的权益，其通过提述完整并入本文。
发明领域
本公开涉及植物分子生物学和遗传工程学领域，并且具体地涉及用于玉米的激活标签化化平台和从其所得的带标签的群体和植物。
发明背景
分析基因功能的常规方法涉及敲除基因表达和相应的基因功能，或过表达基因并寻找有关的表型。
常规的诱变技术的结果经常是鉴定出缺失功能的突变体和干扰天然基因的有关基因突变。然而，真核生物基因组在基因组内含有相当大数目的功能性基因，它们具有冗余的编码序列和调节区。另外，这类方法往往不导致功能缺失导致早期致死性的基因的鉴定。这两类都有可能能够通过导致获得功能的方法来鉴定。
功能获得型(gain-of-function)突变体可以缘于编码序列中的各种导致所得蛋白质的组成型活化的突变，或通过改变基因表达水平或样式的突变而得到。后一类型的突变可以是就表达水平而言启动子功能改变的结果，例如组成型对可诱导启动子，启动子或其它调节元件的组织或发育阶段特异性，或增强的天然启动子活性。
激活标签化(activation tagging)是这样一种方法，通过该方法基因在全基因组规模上被随机且强烈上调，其后可以筛选并选择特定表型。激活标签化是将转录增强子随机插入到整个基因组中，从而增加连接于增强子插入位点的基因的转录活性和/或下调或抑制其中插入增强子的转录单元(编码序列和调节序列)的功能性转录本的生成。转录增强子可以插入到基因附近，将其转录上调，由此创建改变的表型。品系被视为“带标签的”(tagged)，因为在任何单个品系中均可以测定增强子整合的位点并且可以通过遗传分析将增强子的存在与突变表型关联。
激活标签化已经在多种植物中被用来活化基因。有人在烟草细胞中使用激活T-DNA标签构建体来激活基因，从而允许细胞在缺乏植物生长激素的情况下生长(Walden等,Plant Mol.Biol.26:1521-1528,1994)。随后发表了一系列文章，包括关于从侧翼于T-DNA标签的植物基因组序列分离的、且推定牵涉植物生长激素应答的基因的报道。(参见例如Miklashevichs等,Plant J.12:489-498,1997;Harling等,EMBO J.16:5855-5866,1997;Walden等,EMBO J.13:4729-4736,1994和Schell等,Trends Plant Sci.3:130,1998，其论述对一组相关研究的调查)。在一项在拟南芥(Arabidopsis)中的类似研究中，通过质粒拯救从植物基因组DNA分离出单一的基因，鉴定并发现其含有基因CKI1，其牵涉植物中的细胞分裂素应答并且当重新引入拟南芥中时确认了其表型。(Kakimoto,Science274:982-5,1996)。在较新的一项报告中，激活T-DNA标签并筛选植物的早期开花表型导致了FT基因的分离(Kardailsky等,Science286:1962-1965,1999)。
激活标签化技术的变型包括使用土壤杆菌(Agrobacterium)基因5启动子(pg5)，其仅在增殖细胞中有活性并且必须插入到植物基因的紧邻方能影响其表达，同时使用例如最初记载于Koncz等,Proc Natl Acad Sci USA86(21):8467-8471,1989中的nos启动子/hpt选择盒(pCVHPT)。激活标签化的另一种形式利用经修饰的Ds转座子，其携带CaMV35S启动子和nos::hpt选择盒(Wilson等,Plant Cell8:659-671,1996)。将经过修饰的Ds元件插入到二元载体表达构建体中的抗生素抗性盒。一旦引入到拟南芥中，转座的Ds元件(经由存在的35S启动子)能够上调邻近的植物基因，其导致线性的功能获得型突变(Schaffer等,Cell93:1219-1229,1998;Wilson等,Plant Cell8:659-671,1996)。已经开发了可用于筛选成百上千种植物的形态学表型的激活标签化载体(Weigel等,Plant Physiology,122:1003-1013,2000)。
发明概述
本文中披露了玉米中的激活标签化平台，其使用转座子技术，使得位于数个基因组位置上、且含有增强子的转座子能够以近饱和的插入水平在玉米基因组中移动。该平台可以用于发现影响有价值性状的基因。
在一个实施方案中，玉米激活标签化DNA构建体包含转座酶的编码序列；可检测的报道物编码区，其包含可操作地连接于第一高水平的组成型启动子的编码花色素苷调节基因B-Peru的序列；和可操作地连接于第二高水平的组成型启动子的编码花色素苷调节基因C1的序列；和非自主型可转座的T-DNA盒，其插入到可检测的报道物编码区中，使得B-Peru和C1基因仅在可转座盒切离的情况下在含有玉米激活标签化DNA构建体的细胞中表达花色素苷，所述可转座盒包含成对的转座酶DNA底物，它们之间置有：转录增强元件；和任选的可操作地连接于转录增强子元件的编码可选择标志的基因。
在另一个实施方案中，玉米激活标签化DNA构建体包含玉米Spm转座酶的编码序列；报道物编码区，其包含可操作地连接于第一球蛋白1启动子的编码花色素苷调节基因B-Peru的序列；和可操作地连接于第二球蛋白1启动子的编码花色素苷调节基因C1的序列；和非自主型可转座的T-DNA盒，其插入到报道物编码区中，使其破坏B-Peru基因、C1基因或B-Peru和C1基因两者的表达，可转座的盒包含玉米5’和3’Spm末端反向重复(TIR)，在它们之间置有SCBV4X转录增强子；以及任选地，可操作地连接于该转录增强子的编码可选择标志的序列，其中Spm介导的可转座的T-DNA盒的切离恢复受破坏的B-Peru和/或C1基因的表达。
还披露了生成带标签的玉米植物群体的方法，所述方法包括用任何公开的玉米激活标签化DNA构建体来转化玉米植物细胞或组织。进一步提供了通过所披露的方法生成的带标签的玉米植物群体。此外，提供了可从带标签的玉米植物群体获得的植物细胞、颗粒(kernel)、叶、根、芽、花、种子、插条和其它可用于有性或无性繁殖的繁殖材料、包括F1杂交种的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物和植物产物。
还提供了生成带标签的玉米植物的方法，所述方法包括用任何公开的玉米激活标签化DNA构建体转化玉米植物细胞或组织。在一些实施方案中，所述方法还包括通过测量经转化的玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量并将其与对照玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量进行比较来鉴定带标签的玉米植物。此外，提供了可从带标签的玉米植物获得的植物细胞、颗粒、叶、根、芽、花、种子、插条和其它可用于有性或无性繁殖的繁殖材料、包括F1杂交种的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物和植物产物。
从下列随所附图而进展的详细描述，本公开的前述内容和其它特征将变得更加明白。
附图简述
图1显示了pEPS3004的示意图，其为Spm-ZeaTAG载体的一个例子。
图2A和2B例示了在B104中B-Peru和C1基因产物两者都是合成并累积花色素苷色素所需要的。玉米B104授粉后13天(DAP)，用Ubi:B-Peru:Nos和Ubi:C1:Nos质粒DNA一起(图2A)或球蛋白:C1:NOS-球蛋白:B-Peru:Nos单独的质粒DNA(图2B)经生物射弹(biolistically)转化的胚显示出花色素苷累积。在每一个小图上方示出了相应的经工程化改造的表达盒。
图3A例示了对B104玉米中Spm依赖性的dSpm切离的生化和分子分析。图3A是用LBA4404-pEPS3004质粒转化的B104胚授粉13天后(DAP)的图。箭头指示花色素苷累积。
图3B是展现基因组PCR分析的结果的一对琼脂糖凝胶，显示空的供体位点(EDS)。第1道，从用LBA4404-pEPS3004转化的B104胚的合并的紫色组织分离的基因组DNA。第2道，从用LBA4404-pEPS6002(GUS构建体)转化的B104胚分离的基因组DNA。第3道，从用共培养缓冲液转化的B104胚分离的基因组DNA。M,100bp梯。最上的小图显示了使用侧翼于pEPS3004的dSpm单元的引物进行的PCR。底下的小图显示了内源的GAPDH基因组PCR。
图3C提供了对EDS序列分析得到的序列。将EDS特异性的PCR产物克隆到TOPO载体中并转化到大肠杆菌(E.coli)中。从47个菌落制备质粒DNA并测序。点和带圈的字母分别指示EDS位点中的碱基对缺失和转变；该序列也列在表2中。EDS，空供体位点；FDS，满供体位点。
图4是展现出pEPS3004的ZeaTAG元件的配子转座的玉米穗的图。配子转座生成了紫色玉米粒，这是糊粉形成前转座的结果。
图5是一系列玉米穗的图，展示了含有ZeaTAG元件的植物的T1种子表型。所有的黄色颗粒表明无转座，黄色和紫色颗粒表明早期配子转座(与图4的图相同)，黄色颗粒和具有紫色部分的黄色颗粒表明体细胞转座，且紫色粒颗表明体细胞转座和晚期配子转座。在本图中，深色是紫色，浅色是黄色。
序列表
如37C.F.R.1.822中定义的，对核苷酸碱基使用标准字母缩写且对氨基酸使用三字母码来显示本公开或序列表中列出的核酸和/或氨基酸序列。仅显示了每种核酸序列的一条链，但理解通过对所展示链的任何提述也纳入了互补链。核酸序列以标准的5’-3’方向呈现，蛋白质序列以标准的氨基(N)末端至羧基(C)末端方向呈现。
SEQ ID NO:1是pEPS3004一部分的核酸序列，含有以下元件：
Figure BDA00003133816600051
Figure BDA00003133816600061
SEQ ID NO:2是从出现于甘蔗杆状病毒(SCBV)的基因组中的启动子衍生的转录激活子元件。
SEQ ID NO:3是包含人工转座子的pEPS3004DS的部分核酸序列(对应于SEQ ID NO:1的位置13982-20160)。
SEQ ID NOs:4-9是人工转座子转座后的核酸序列。
SEQ ID NOs:10-11是寡核苷酸引物。
发明详述
I.简写
AAD  芳氧基链烷酸酯双加氧酶
bp   碱基对
BP   B-Peru
DS   供体位点
EDS  空供体位点
FDS  满供体位点
IP     居间碱基
PCR    聚合酶链式反应
SCBV   甘蔗杆状病毒
T-DNA  转移DNA
Ti     肿瘤诱导性
TIR    末端反向重复
II.术语
除非另外指出的，依照常规用法来使用技术术语。可以在以下出版物中发现分子生物学中常见术语的定义：Benjamin Lewin,Genes V,由OxfordUniversity Press出版,1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew等(编),TheEncyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9);和Robert A.Meyers(编),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN1-56081-569-8)。
为了帮助评估本发明的各种实施方案，提供了对特定术语的下列解释：
5’和/或3’：称核酸分子(如DNA和RNA)具有“5’端”和“3’端”，因为将单核苷酸以使得一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸根经由磷酸二酯键以某一方向附着于其邻位的3’氧的方式反应来生成多核苷酸。因此，当多核苷酸一端的5’磷酸根未连接于单核苷酸戊糖环的3’氧时，将其称为“5’端”。当多核苷酸另一端的3’氧未连接于另一单核苷酸戊糖环的5’磷酸根时，将其称为“3’端”。不过内部核酸序列也可以称为具有5’端和3’端，尽管一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸根附着于其邻位的3’氧。
在线性或环状核酸分子中，离散的内部元件被称为“下游”或3’元件的“上游”或5’端。对于DNA，该术语反映了转录沿着DNA链以5’-3’方向进行。指导所连接基因的转录的启动子和增强子元件一般位于编码区的5’端或上游。不过，增强子元件即使位于启动子元件和编码区的3’端也可以施加其影响。转录终止和多聚腺苷酸化信号位于编码区的3’端或下游。
激活标签化：将包含增强子元件的异源核酸载体插入植物基因组中的过程。所述增强子元件可以作用于增强单一基因的转录或可以同时增强两种或更多种基因的转录。“标记”是异源核酸构建体(例如载体)的区域，其可以用于定位及由此鉴定和表征已整合到植物基因组中的引入核酸序列。激活标签化DNA构建体是为在植物中生成功能缺失和功能获得提供例示性诱变原的DNA构建体。可以将激活标签化核酸构建体稳定地引入到植物基因组中，从而增强天然(内源)植物基因的表达。(参见例如Walden等,Plant Mol.Biol.26(5):1521-1528,1994Weigel等,Plant Physiology,122:1003-1013,2000)。在一个实例中，激活标签化DNA构建体是玉米激活标签化DNA构建体。在一个特定实施例中，激活标签化DNA构建体具有对应于在SEQ ID NO.:1中列出的核酸序列(pEPS3004从右边界到左边界的T-DNA序列)。
农艺性状：植物的属性，所述属性包括但不限于，植物形态学、生理学、生长和发育、产量、营养增加、疾病或害虫抗性、或环境或化学耐受性。“改善的农艺性状”指在农艺性状中可测量的改进，所述农艺性状包括但不限于产量增加，包括在无胁迫条件下的产量增加和环境胁迫条件下的产量增加。胁迫条件可以包括，例如干旱、阴蔽、真菌性疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、昆虫侵袭、线虫侵袭、冷温暴露、热暴露、渗透胁迫、减少的氮养分可获得性、减少的磷营养可获得性和高植物密度。“产量”可以受到许多特性影响，包括但不限于，植物高度、荚果数目、荚果在植物上的位置、节间数目、荚果破碎的发生率、颗粒大小、结瘤和氮固定的效率、营养物同化的效率、对生物和非生物胁迫的抗性、碳同化、植物体系结构、对倒伏的抗性、种子萌发百分比、幼苗活力、和幼态性状。产量还可以受到下列因素的影响：萌发(包括在胁迫条件下的萌发)效率、生长速率(包括在胁迫条件下的生长速率)、穗数目、每穗的种子数目、种子大小、种子组成(淀粉、油、蛋白质)和种子填充的属性。增加的产量可能起因于对关键的生物化学化合物如氮、磷和碳水化合物的改善的利用，或起因于对环境胁迫如冷、热、干旱、盐、和害虫或病原体攻击的改善的应答。在本公开中使用的重组DNA也可以用于提供这样一种植物，其具有改善的生长和发育，并且作为植物生长调节物的经修饰的表达或对细胞周期或光合作用途径进行修饰的结果，具有最终增加的产量。农艺性状以及在植物中改变这类性状的其他例子已在本文中提供并且/或者会被本领域中的普通技术人员认识到。
扩增：当用于指核酸时，它指增加样品或标本中核酸分子拷贝数的技术。扩增的一个例子是聚合酶链式反应，其中使从受试者收集的生物学样品与成对的寡核苷酸引物在允许引物与样品中的核酸模板杂交的条件下接触。所述引物在合适的条件下延伸，与模板解离，然后重新退火、延伸并解离以扩增核酸的拷贝数。使用标准技术，可以通过电泳、限制内切酶切割样式、寡核苷酸杂交或连接、和/或核酸测序，来表征体外扩增的产物。体外扩增技术的其它例子包括链置换扩增(参见美国专利No.5,744,311)；无转录等温扩增(参见美国专利No.6,033,881)；修复链反应扩增(参见WO90/01069)；连接酶链反应扩增(参见EP-A-320308)；缺口填充连接酶链反应扩增(参见美国专利No.5,427,930)；偶联的连接酶检测和PCR(参见美国专利No.6,027,889)；和NASBATM无RNA转录扩增(参见美国专利No.6,025,134)。
花色素苷：赋予植物的叶或其它器官粉色/红色到紫色的一组水可溶性黄酮类化合物。常见花色素苷包括花青素(cyanidin)、翠雀定(delphinidin)、二甲翠雀素(malvidin)和花葵素(pelargonidin)的衍生物。在一个实例中，花色素苷色素是在520nm处具有吸收光谱的色素。
盒：在一组或多组限制位点之间携带(且能够表达)一种或多种目的基因的DNA的可操作片段。通过使用限制酶将片段‘切下’并将其‘粘贴’到新背景中，可以将盒从一条DNA序列(通常在载体上)转移到另一条上。
可转座的盒是能够在基因、染色体或基因组中通过转座酶转移或移动的盒。在一个实例中，可转座的盒包含转座酶的一对DNA底物，两者之间置有转录增强子；以及任选地，编码可选择标志的序列可操作地连接于该转录增强子。
cDNA(互补DNA)：缺少内部非编码区段(内含子)和转录调节序列的DNA片段。cDNA还可以含有负责相应RNA分子中翻译控制的不翻译区(UTRs)。通常在实验室中通过自细胞或其它样品所提取的信使RNA的逆转录来合成cDNA。
构建体：自任意来源衍生的能够进行基因组整合或自主复制的任何重组多核苷酸分子，如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体、或线性或环状的单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，其包含其中已经可操作地连接一种或多种可转录的多核苷酸分子的多核苷酸分子。
对照植物：不含有赋予(例如)转基因植物中增强或改变的农艺性状的重组DNA的植物，例如在为了鉴定转基因植物中增强或改变的农艺性状时，它被用作比较的基线。合适的对照植物可以是用于生成转基因植物的亲本系的非转基因植物，或至少对于所检查的特定性状为非转基因的植物(换言之，对照植物可能经过工程改造而含有其它异源序列或重组DNA分子)。由此，对照植物在一些情况下可以是包含空载体或标志基因，但不含有测试植物中的重组DNA，或不含有测试植物中的全部重组DNA的转基因植物。
DNA(脱氧核糖核酸)：DNA是包含大多数生物体(一些病毒具有包含核糖核酸(RNA)的基因)的遗传材料的长链聚合物。DNA聚合物中的重复单元是4种不同的核苷酸，其中每一种都包含结合至附着有磷酸根基团的脱氧核糖的4种碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶之一。核苷酸的三联体(称为密码子)编码多肽中的每个氨基酸或终止信号。术语“密码子”也用于DNA所转录的mRNA中的3个核苷酸的相应的(以及互补的)序列。
除非另外说明，任何对DNA分子的提述都包含该DNA分子的反向互补体。除了在本文中需要单链性的情况外，DNA分子虽然书面上仅描述了一条链，但涵盖了双链DNA分子的两条链。
编码：如果一种多核苷酸在其天然状态或当通过本领域中技术人员已知的方法对其进行操作时，可以被转录生成用于多肽或其片段的mRNA和/或翻译生成多肽或其片段，则称该多核苷酸编码多肽。反义链是这类核酸的互补体，并且可以从其推导出编码序列。
增强子域：一种顺式作用的转录调节元件(又称为顺式元件)，其赋予对基因表达的总体控制的一个方面。增强子域可以起着结合转录因子(其为调节转录的反式作用蛋白因子)的作用。一些增强子域结合超过一种转录因子，并且转录因子可以与超过一种增强子域以不同的亲和力相互作用。可以通过许多技术来鉴定增强子域，包括缺失分析(从启动子的5’端或内部删除一个或多个核苷酸)；使用DNase I足迹法的DNA结合蛋白分析、甲基化干扰、电泳迁移率改变测定法、通过连接介导的PCR的体内基因组足迹法、和其它常规测定法；或通过使用常规的DNA序列比较方法与已知的顺式元件基序进行DNA序列比较。可以对增强子域的精细结构进行进一步研究，其通过对一个或多个核苷酸的诱变(或取代)或通过其它常规方法。可以通过化学合成或通过从包含这类元件的启动子分离来获得增强子域，并且可以加以额外的侧翼核苷酸来合成它们，所述侧翼核苷酸含有有用的限制酶位点来协助后续操作。
(基因)表达：DNA分子到转录的RNA分子的转录。更一般地，基因表达涵盖了将基因的编码信息转换成在细胞中存在且运行的结构的过程。表达的基因包括那些转录成mRNA然后翻译成蛋白质的，以及那些转录成RNA但不翻译成蛋白质的(例如siRNA、转运RNA和核糖体RNA)。由此，靶序列(如基因或基因的启动子区)的表达可能导致mRNA、蛋白质或两者的表达。可以抑制或增强(降低或增加)靶序列的表达。可以将基因表达描述为与时间、空间、发育或形态学性质以及定量或定性指征有关。
基因调节活性：多核苷酸影响可操作连接的、可转录的多核苷酸分子的转录或翻译的能力。分离的具有基因调节活性的多核苷酸分子可以提供可操作连接的、可转录的多核苷酸分子的时间或空间的表达、或调控其表达水平和速率。分离的具有基因调节活性的多核苷酸分子可以包含启动子、内含子、前导区或3’转录终止区。
遗传材料：该短语包含了所有的基因、核酸、DNA和RNA。
分离的：“分离的”生物学组分(如核酸、肽或蛋白质)是已经从该组分所天然存在的生物体细胞中的其它生物学组分(例如其它染色体和染色体外的DNA和RNA、和蛋白质)实质性分开的、分开产生的、或纯化出来的。因此，已经“分离的”核酸、肽和蛋白质包含通过标准的纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。
玉米(玉蜀黍)：玉米是单子叶植物，是禾本科的成员。玉米具有独特的生长形态；低处叶像宽旗，50–100厘米长且5–10厘米宽(2–4英尺乘以2–4英寸)；茎直立，通常高为2–3米(7–10英尺)，具有许多节，在每个节展开旗叶(flag-leaf)。穗在这些叶下面且靠近茎的地方生长。它们一天约长3毫米。已经培育出一些玉米变种以生成许多另外开发的穗。玉米粒具有果实的果皮与种皮融合(禾本科植物的典型特征)，且完整的粒经常被称为籽。除了单独的果实(粒)从不融合到单个块中以外，玉米穗轴在结构上与多个果实类似。颗粒(粒)约为豌豆大小，并且以规则的行粘附在白色髓质物(pithy substance)附近，这样形成穗。穗含有200至400个粒，并且长度从10–25厘米(4–10英寸)。它们具有各种颜色：黑色、蓝灰色、紫色、绿色、红色、白色和黄色。
可操作地连接：该术语指组件特别是核苷酸序列的并置，从而使组件的正常功能可以得到发挥。由此，当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列是可操作地连接的。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作地连接。一般地，可操作地连接着的DNA序列是连续的，且在必须连接两个蛋白质编码区时，可操作地连接着的DNA序列处于同一阅读框中。“可操作地连接”于调节序列的编码序列指核苷酸序列的一种配置，其中编码序列可以在该调节序列的调节控制(例如转录和/或翻译控制)下表达。
任选的：“任选的”或“任选地”意味着其后描述的事件或情形可以但不必要发生，且该描述包括了其中所述事件或情形发生的情况和其中不发生的情况。
ORF(开放阅读框)：编码氨基酸而无终止密码子的一系列核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可翻译成肽。
百分比序列同一性：当将参照(“查询”)多核苷酸分子的线性多核苷酸序列与测试(“受试”)多核苷酸分子(或其互补链)进行最佳联配(具有合适的核苷酸插入、缺失、或缺口，其总共少于沿比较窗口参照序列的20%)时，前者与后者相比其中等同核苷酸的百分比。用于联配比较窗口的最佳序列比对是本领域中技术人员公知的，并且可以使用工具来进行，如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法。优选地，利用这些算法的计算机化执行如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(作为
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Wisconsin包
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(Accelrys Inc.,Burlington,Mass.)的部分可获)来实施这类比较。测试序列和参照序列联配区段的“同一性分数”是两条联配序列间共有的等同组分数目除以参照序列区段中的总组分数目(即完整的参照序列或参照序列的较小的限定部分)。百分比序列同一性由同一性分数乘以100代表。一个或多个多核苷酸序列可以与全长多核苷酸序列或其部分比较，或与更长的多核苷酸序列比较。实质性百分比序列同一性是至少约80%的序列同一性、至少约90%的序列同一性、或甚至更高的序列同一性，如约98%或约99%的序列同一性。
植物：任何植物或其后代。该术语还包括植物的部分，包含种子、插条、块茎、果实、花等。在各个实施方案中，该术语植物指栽植的植物物种，如玉米/谷物、棉花、油菜、向日葵、大豆、高粱、苜蓿、小麦、稻、生成果实和蔬菜的植物、以及草坪和观赏性植物物种。如本文中使用的，术语植物细胞指植物的结构和生理单元，其由原生质体和周围细胞壁组成。如本文中使用的，术语植物器官指植物的独特且明显分化的部分，如根、茎、叶或胚。
更一般地，术语植物组织指在植物体内或培养物中的任何植物组织。该术语包括完整的植物、植物细胞、植物器官、原生质体、细胞培养物或任何组织成结构和功能性单元的植物细胞组。
多核苷酸分子：来源于基因组或合成的单链或双链DNA或RNA；即分别的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的聚合物，其从5’端(上游)向3’端(下游)阅读。
多肽分子：一种聚合物，其中的单体是通过酰胺键结合在一起的氨基酸残基。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体，优选L-异构体。如用于本文的，术语多肽或蛋白质涵盖任何氨基酸序列且包括经修饰的序列如糖蛋白。术语多肽特定地意图涵盖天然存在的蛋白质以及那些重组或合成生成的。
启动子：通过识别并结合例如RNA聚合酶II和其它蛋白质(反式作用转录因子)来启动转录，指导核酸转录的一排核酸对照序列。启动子包括在转录起始位点附近的必要核酸序列，如在聚合酶II型启动子的情况中是TATA元件。在最小程度上，启动子通常包括至少一个RNA聚合酶结合位点连同一个或多个转录因子结合位点，其应答转录因子的占据而调控转录。在本文中描述了启动子的代表性例子(和可以装配以产生启动子的元件)。可以通过启动子的时间、空间、或发育的表达样式对其进行定义。
植物启动子是在植物细胞中有功能的天然或非天然的启动子。在一个实例中，启动子是高水平组成型启动子，如组织特异性的启动子(例如在糊粉组织中表达的球蛋白1启动子)。
蛋白质：由基因表达且由氨基酸构成的生物学分子，例如多肽。
原生质体：分离的没有细胞壁的植物细胞，其具有再生成细胞培养物或全植物的潜力。
纯化的：术语“纯化的”不要求绝对纯度，而意图是一个相对的术语。因此，例如纯化的蛋白质制备物是其中该蛋白质相比于其生成环境中(例如在细胞中或在生化反应室中)的蛋白质更富集的。优选地，纯化蛋白质的制备物从而使该蛋白质代表制备物总蛋白含量的至少50%。
重组：重组核酸分子具有非天然存在的序列或通过将两个分开的序列区段人工组合而产生的序列。经常通过化学合成，或者更普遍地，通过对分离的核酸区段的人工操作(例如通过遗传工程改造技术)来完成该人工组合。
类似地，重组蛋白是由重组核酸分子编码的重组蛋白质。
可调节的启动子：其活性受到某介质(agent)调节(直接或间接地)的启动子，所述介质如转录因子、化学化合物、环境条件或核酸分子。
调节基因表达：通过增加或降低影响基因表达的介质的表达、生成或活性来控制基因表达的过程。所述介质可以是蛋白质如转录因子，或者是核酸分子如miRNA或siRNA分子，当与基因或其上游调节序列或由该基因编码的mRNA接触时，其增加或降低基因表达。
调节性序列或元件：这些术语一般指一类多核苷酸分子(如DNA分子，具有DNA序列)，其影响或控制可操作地连接的、可转录的多核苷酸分子的转录或翻译及由此的基因表达。该术语包括启动子、增强子、前导区、内含子、基因座控制区、边界元件/绝缘子、沉默子、基质附着区(也称为支架附着区)、阻遏子、转录终止子(又称为转录终止区)、复制起点、着丝粒、和减数分裂重组热点。启动子是在基因5’端附近的DNA序列，其充当RNA聚合酶的结合位点，并且从此处启动转录。增强子是升高从启动子的转录水平的对照元件，其通常不依赖于增强子的取向或与启动子间的距离。基因座控制区(LCR)赋予其所连接的基因组织特异性的或在时间上受调节的表达。LCR不依赖于其相对于基因的位置，但依赖于拷贝数而发挥功能。据信它们发挥着打开核小体结构从而使其它因子可以结合至DNA的功能。LCR还可以影响复制时间安排和起点使用。绝缘子(也称为边界元件)是通过阻断周围染色质的影响来阻止基因转录活化(或失活)的DNA序列。沉默子和阻遏子是抑制基因表达的对照元件；它们不依赖于其取向或与基因的距离而作用于基因。基质附着区(MAR，也称为支架附着区)是结合核支架的DNA内的序列。它们可以影响转录，可能通过将染色体分开到调节域中。据信MAR介导染色体中更高级的、成环的结构。转录终止子是RNA酶从模板释放的基因邻近内的区域。复制起点是在细胞分裂的DNA合成或复制阶段期间，开始DNA复制过程的基因组区。减数分裂重组热点是在减数分裂期间比平常更经常地重新组合的基因组区。调节区中的特定核苷酸可以发挥多种功能。例如，特定的核苷酸可以是启动子的一部分并且参与对转录激活子蛋白的结合。
在细胞中(例如在植物或植物细胞中)发挥功能的分离的调节元件可用于经由例如遗传工程改造来修饰植物表型。
RNA:由磷酸二酯键连接的核糖核酸单体的、通常为线性的聚合物。天然存在的RNA分子分成三个通常的类，信使RNA(编码蛋白质的mRNA)、核糖体RNA(rRNA，核糖体组分)、和转运RNA(tRNA，在蛋白质合成期间负责将氨基酸单体转移到核糖体的分子)。信使RNA包括异核RNA(hnRNA)和结合膜的多核糖体RNA(附着于粗内质网)。总RNA指所有类型的RNA分子的异质混合物。
可筛选的标志：赋予通过观察或测试而鉴别出的性状的标志。
可选择的标志：赋予可以通过化学手段，例如经由选择剂(例如除草剂、抗生素等)的使用进行选择的性状的标志。可选择的标志包括但不限于抗生素抗性基因，如卡那霉素(nptII)、G418、博来霉素、潮霉素、氯霉素、氨苄青霉素、四环素等。其它可选择的标志包括编码双丙氨膦(bialaphos)抗性的bar基因；编码草甘膦(glyphosate)抗性的突变EPSP合酶基因；赋予对溴苯腈(bromoxynil)抗性的腈水解酶基因；赋予对咪唑啉酮(imidazolinone)或磺酰脲(sulfonylurea)抗性的突变的乙酰乳酸合酶基因(ALS)；或甲氨蝶呤抗性的DHFR基因。在一个实例中，所述可选择的标志是AAD1。
序列同一性：两条核酸序列或两条氨基酸序列之间的相似性表达为序列之间的相似性或称为序列同一性。序列同一性经常以百分比同一性(或相似性或同源性)衡量；百分比越高，两条序列就越相似。当使用标准方法联配时，本文中披露或提述的序列的同源物(如SCBV增强子元件的同源物)会拥有相对高的序列同一性程度。
用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。各种程序和比对算法记载于：Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2:482,1981);Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:443,1970);Pearson和Lipman(PNAS.USA85:2444,1988);Higgins和Sharp(Gene,73:237-244,1988);Higgins和Sharp(CABIOS5:151-153,1989);Corpet等(Nuc.Acids Res.16:10881-90,1988);Huang等(Comp.Appls Biosci.8:155-65,1992);和Pearson等(Methods in Molecular Biology24:307-31,1994)。Altschul等(Nature Genet.,6:119-29,1994)提供了对序列比对方法和同源性计算的详细考量。
可以使用比对工具ALIGN(Myers和Miller,CABIOS4:11-17,1989)或LFASTA(Pearson和Lipman,1988)来实施序列比较(Internet 1996,W.R.Pearson和the University of Virginia,“fasta20u63”版本2.0u63,发布日1996年12月)。ALIGN将完整的序列彼此间进行比较，而LFASTA比较区域的局部相似性。这些比对工具及其相应教程可在网络地址biology.ncsa.uiuc.edu处获得。
指定序列的直系同源物(Ortholog)或并系同源物(paralog)(更一般地，同源物)通常表征为使用设置为缺省参数的ALIGN，具有与指定蛋白质的氨基酸序列(或指定核酸分子的核酸序列)的全长比对计算出的超过75%的序列同一性。当用该方法评估时，与参照序列具有甚至更高的相似性的序列会显示增加的百分比同一性，如至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少98%的序列同一性。在此情况下，百分比同一性基本上类似于就全长序列同一性所论述的百分比同一性。
当对完整序列的显著小于全部的部分的序列同一性进行比较时，同源物在10-20个氨基酸的小窗口上通常会拥有至少80%的序列同一性，并且根据其与参照序列的相似性，可能具有至少85%、至少90%、至少95%、至少99%的序列同一性。可以使用LFASTA来测定这类小窗口上的序列同一性；可以在万维网地址biology.ncsa.uiuc.edu上描述了方法。本领域中的技术人员会领会这些序列同一性范围的提供仅用于指引；在给出的范围外能够获得非常显著的同源物是完全可能的。本公开不仅提供了上文所描述的肽同源物，还提供了编码这类同源物的核酸分子。
两种核酸分子紧密相关的另一指示是这两种分子在严格条件下彼此杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。一般地，严格条件选择为比特定序列在限定的离子强度和pH处的热解链点(Tm)低约5°C至20°C。Tm是50%的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。核酸杂交条件和严格性的计算可以在Sambrook等(于Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989)和Tijssen(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology第I部分，第2章，Elsevier,New York,1993)中发现。在严格条件下与指定的蛋白质序列杂交的核酸分子通常会基于蛋白编码序列、完整域、或编码序列的其它选择部分在0.2x SSC,0.1%SDS、于65°C的清洗条件下与探针杂交。
但是由于遗传密码子的简并性，不显示高度同一性的核酸序列也可能编码相似的氨基酸序列。理解的是，可以使用此简并性来改变核酸序列以生成各编码基本相同的蛋白质的多种核酸序列。
底物：受酶作用的分子。在一个实例中，底物是转座酶的DNA底物(例如玉米Spm可转座元件的5’和3’末端反向重复(TIR))。
末端反向重复：在一些转座子的相对末端存在的、处于反向形式的相近或相同的DNA序列。末端反向重复可以是5’或3’末端反向重复，如玉米Spm可转座元件的5’或3’末端反向重复。
转座酶：结合转座子的末端并通过“切割”和“粘贴”机制或复制性转座机制催化转座子移动到基因组的另一部分的酶。
转座子：能够在基因、染色体或基因组中转移位置或移动的核苷酸序列，如DNA或RNA序列。例示性的转座子如Ac,Ds,Mu和Spm是可以将其自身插入到基因中并导致突变的元件。由于转座子在植物或种子发育期间从突变基因座中后续切离，该突变可能是不稳定的。(参见例如Doring&Starlinger,Ann.Rev.Genet.20:175-200,1986;Federoff,“Maize Transposable Elements”inMobile DNA.Wowe,M.M.和Berg,D.E.编,Amer.Soc.Microbiol.,Wash.,D.C.,第377页-第411页,1989.)已经描述了一种例示性的转座子标记策略，其用于鉴定影响植物高度、下胚轴延伸、和能育性的半显性突变(参见Wilson K等,Plant Cell8(4):659-71,1996)。可以将转座子序列纳入到激活标签化核酸构建体中，从而使增强子在植物基因组范围内移动。转座子又称可转座元件。
转基因植物：含有插入到其核基因组或细胞器基因组的外来(异源)核苷酸序列的植物。
转基因：通过转化技术插入到一种或多种宿主细胞的核酸序列。
载体：引入到宿主细胞中由此生成经转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还可以包含一种或多种治疗性基因和/或可选择的标志基因以及本领域中已知的其它遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此使得细胞表达其天然核酸和/或蛋白质以外的核酸和/或蛋白质。任选地，载体包括帮助实现核酸进入细胞的材料，如病毒颗粒、脂质体、蛋白质包被等。
为了对多核苷酸、DNA、RNA、寡核苷酸、和引物的核苷酸残基命名，且为了对蛋白质的氨基酸残基命名，在本文件中贯穿采用标准的IUPAC缩写。
除非另外解释的，本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常的理解相同的含义。除非另外指出的，通过标准的方法学来实施描述的分子生物学和生化操作，所述方法学如披露在例如Sambrook等(于Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,New York,1989)和Tijssen(Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology第I部分,第2章,Elsevier,New York,1993)，和其在本申请提交日以前的更新内容。除非明确指示或暗示的，术语“一个/一种/该”如本文中使用的表示“至少一个”。类似地，除非上下文另外清楚指出的，词“或/或者”意图包含“和/及/以及”。因此“包含A或B”意味着包含A或B，或A和B。还应理解的是，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小、和所有分子量或分子质量值都是大概的，并且提供以用于描述。除非另外记载的，所有百分数都按重量且所有溶剂混合物比例都按体积。所有温度都是摄氏度。
尽管可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等同于本文中所描述的那些的方法和材料，但在下文中描述了合适的方法和材料。本文中所提述的所有出版物、专利申请、专利和其它引用都通过提述以不会与本说明书的清楚教导不一致的程度完整并入。在有冲突的情况下，参照本说明书内容，包括对术语的解释。另外，材料、方法和实施例仅为例示性的并且不意图限制。
III.对数个实施方案的概述
本文中披露了玉米中的激活标签化平台，其使用转座子技术，该技术使位于数个基因组位置且含有增强子的转座子能够在玉米基因组以插入的近饱和水平移动。该平台可用于发现影响有价值的性状的基因。
在一个实施方案中，玉米激活标签化DNA构建体包含转座酶的编码序列；可检测的报道物编码区，其包含可操作地连接于第一高水平组成型启动子的编码花色素苷调节基因B-Peru的序列；和可操作地连接于第二高水平组成型启动子的编码花色素苷调节基因C1的序列；非自主型可转座的T-DNA盒，其插入到可检测的报道物编码区中，使得B-Peru和C1基因仅在切离可转座盒时才在含有玉米激活标签化DNA构建体的细胞中表达花色素苷，所述可转座的盒包含成对的转座酶DNA底物，它们之间布置有转录增强子元件，以及任选的可操作地连接于该转录增强子的编码可选择标志的序列。在一个实例中，所述成对的转座酶DNA底物是玉米Spm可转座元件的5’和3’末端反向重复(TIR)，且该转座酶是玉米Spm。在一些实施方案中，所述转录增强子元件包含至少2个拷贝的SCBV增强子。在一个特定实施例中，所述转录增强子元件包含4个拷贝的SCBV增强子。在一些实施例中，所述玉米激活标签化DNA构建体包含第一和/或第二高水平组成型启动子，其为组织特异性的启动子。在其它实例中，所述玉米激活标签化DNA构建体包含第一和/或第二高水平组成型组织特异性的启动子，其为球蛋白1启动子。在一些实施例中，所述玉米激活标签化DNA构建体包含可选择的标志AAD1。
在一个特定的实施方案中，公开的玉米激活标签化DNA具有如SEQ IDNO:1列出的核酸序列。
在另一个实施方案中，玉米激活标签化DNA构建体包含玉米Spm转座酶的编码序列；报道物编码区，其包含可操作地连接于第一球蛋白1启动子的编码花色素苷调节基因B-Peru的序列；和可操作地连接于第二球蛋白1启动子的编码花色素苷调节基因C1的序列；和非自主型可转座的T-DNA盒，其插入到报道物编码区中，使得其破坏B-Peru基因、C1基因、或B-Peru和C1基因两者的表达，所述可转座的盒包含玉米5’和3’Spm末端反向重复(TIR)，它们之间置有SCBV4X转录增强子；和任选地，可操作地连接于该转录增强子的编码可选择标志的序列，其中Spm介导的可转座T-DNA盒的切离恢复受破坏的B-Peru和/或C1基因的表达。
还提供了生成带标签的玉米植物群体的方法。在一个实施方案中，所公开的方法包括用任何一种公开的DNA构建体来转化玉米植物细胞或组织。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定带标签的玉米植物群体。在一个实例中，鉴定带标签的玉米植物群体包括测量经转化的玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量并将其与对照玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量进行比较。在另一个实施例中，鉴定带标签的玉米植物群体包括在带标签的群中鉴定配子转座、体细胞转座或其组合。
还公开了通过所公开的任意一种方法生成的带标签的玉米植物群体。另外的实施方案提供了可从带标签的玉米植物群体获得的植物细胞、颗粒、叶、根、芽、花、种子、插条和其它可用于有性或无性繁殖的繁殖材料、包括F1杂交种的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物和植物产物。
IV.激活标签化(activation tagging)
激活标签化是将包含增强子元件的异源核酸构建体插入到植物基因组中的过程。所述增强子元件可以作用以增强单一基因的转录或可以同时增强两种或更多种基因的转录。“标签”是异源核酸构建体(例如载体)的区域，其可以用于定位及由此鉴定和表征已整合到植物基因组中的引入的核酸序列。可以将激活标签化核酸构建体稳定地引入到植物基因组中，从而增强天然(内源)植物基因的表达。(参见例如Walden等,Plant Mol Biol26(5),1521-8,1994Weigel等,Plant Physiology,122:1003-1013,2000)。已经在许多不同的生物体中使用激活标签化，包括拟南芥、番茄、稻、矮牵牛(petunia)和大麦(Weigel等,Plant Physiol.122:1003-1014,2000;Jeong等,Plant Physiol.130:1636-1644,2002,首先发表于12/1/2002,10.1104/pp.014357;Zubko等,ThePlant Journal29:797-808,2002;Ayliffe等,Plant Mol.Biol.64:329-347,2007;Mathews等,Plant Cell15:1689-1703,2003)。已经将其用于鉴定影响多个植物性状的基因。迄今为止，还未有记载任何经激活标签化的玉米群体。
本文中披露了玉米中的经激活标签化的群体，其可以用于发现影响有价值性状的基因。所述玉米基因组为约2500Mbp，但基因聚集在总长为约450Mbp的“基因富集”区域的岛中(Myers等,Genomic Research11:1660-1676,2001;Wendl等,Bioinformatics6:245-257,2005)。一个高概率激活所有玉米基因的经激活标签化的植物群体需要约100,000个单独的插入事件。为了生成这样大的经激活标签化的玉米群体，发明人开发了使用转座子技术的策略。经修饰的转座子可以用于扩增从数种初始转化物生成的插入事件的数目(Marsch-Martinez等,Plant Physiol.129:1544-1556,2002;Kumar等,Plant J.44:879-892,2005)。由于几乎80%的玉米基因组由重复DNA构成，激活标签化元件需要优先整合到“基因富集”区中，而且已经显示转座子就是这样做的(Tissier等,Plant Cell11:1841-1852,1999;Speulman等,Plant Cell11:1853-1866,1999;Greco等,Mol.Gen.Genet.270:514-523,2004)。
在一个实施方案中，披露的激活标签化DNA构建体利用了玉米转座子来扩增激活标签化群体。例如，例示性的激活标签化DNA构建体包含下列组件：(1)转座酶的编码序列；(2)可检测的报道物编码区；和(3)非自主型可转座的T-DNA盒。在所披露平台的一个例示性的实施方案中，所述非自主型可转座的T-DNA盒被插入到可检测的报道物编码区中，从而使得调节基因(如B-Peru和C1基因)仅在切离可转座盒时才在含有玉米激活标签化DNA构建体的细胞中表达可检测的标志(如花色素苷)。
在一个实例中，例示性构建体包含玉米增强子或玉米的阻抑基因-增变基因(suppressor-mutator,En/Spm)转座子，以扩增激活标签化群。所述构建体还含有由4个拷贝的甘蔗杆状病毒(SCBV)增强子构成的转录增强子元件和AAD1可选择标志，它们已经被克隆到Spm可转座元件的末端反向重复(TIR)之间。这是一种非自主的转座子，其需要转座酶来“跳跃”。所述Spm转座酶位于同一转化载体上但在转座子的TIR以外。当转座子被转座酶移动时，它可能会移动到不与该转座酶紧密连锁的位置(图1)。通过使用包含花色素苷调节基因B-Peru和C1的可筛选标志来监测转座。这些构建体中的B-Peru(BP)和C1基因受到玉米球蛋白启动子(在种子的糊粉组织中表达的启动子)的调节。
在一个特定的实施方案中，例示性构建体具有这样的安排，使得B-Peru编码区在一个玉米球蛋白1启动子拷贝的下游(在转录意义上)，但与其相距6256个碱基的居间DNA。这些居间碱基(本文中称为IB)阻止了由球蛋白1启动子启动的、编码BP蛋白的功能性mRNA的转录。因此，为了使得BP蛋白在球蛋白启动子第二拷贝的控制下生成，必须以一定的方式除去IB以创建活性基因(例如通过球蛋白1启动子和BP蛋白编码区的合适并置)。还有，IB包含部分源自玉米En/Spm转座子的人工转座子。在天然的En/Spm转座子系统中，由Spm编码的转座酶蛋白TpnA和TpnD作用于5’和3’末端反向重复(TIR)序列，通过从供体染色体基因座切离并插入到远端位置来使转座子移动。将球蛋白启动子和BP编码区分开的6256bp的IB包含侧翼于编码植物可选择标志蛋白的活性基因(AAD1)的5'和3'TIR序列，所述活性基因在(组成型)稻肌动蛋白启动子的表达控制下(图1)。因此，该特定实例的人工转座子包含一对侧翼于植物可选择的标志基因的TIR元件。自出现于SCBV基因组中的启动子衍生的转录激活子元件(SEQ ID NO:2)的4个串联拷贝被置于5'TIR元件和控制AAD1基因表达的稻肌动蛋白启动子之间(参见图1)。
当通过土壤杆菌介导的转化将pEPS3004的T-DNA(如SEQ ID NO:1和图1中披露的)引入到玉米细胞中时，其整合到玉米染色体中的随机位置。T-DNA中组成型表达的AAD1可选择标志基因提供对经转化的玉米细胞的选择。在一个实施方案中，携带SCBV激活子元件的串联拷贝的人工转座子可从其在原始整合位点中的位置(供体位点)被切离，并可以重新插入到其它染色体基因座(受体位点)中。强力的SCBV转录增强子元件引入到邻近于天然玉米基因的受体位点导致那些附近基因的异常表达，由此在某些情况下，为从经转化的组织再生的植物提供了新的可鉴定的性状。可利用现代分子生物学方法来帮助分离和鉴定受体位点附近受影响的基因，由此为进一步开发提供分离基因。
人工转座子自供体整合位点的切离和移动受到TnpA和TpnD蛋白的介导，这两种蛋白由也位于质粒pEPS3004(图1)的T-DNA中且位于人工转座子TIR元件外的Spm转座酶基因提供。为了监测人工转座子何时离开整合的供体位点，C1/BP标志系统提供了可筛选的视觉标志，其在人工转座子自供体位点精确切离之前都是无活性的。当人工转座子被切离时，无功能的BP基因被修复且可以容易地检测到可筛选的标志表型(种子糊粉中的红色色素沉着)。可以选出这类种子并使其发芽，并可以表征所得植物由于受体位点附近基因的异常表达而产生的任何新的期望性状，例如干旱耐受性、提高的产量等。
例示性的激活标签化DNA构建体pEPS3004具有如SEQ ID NO:1列出的核酸序列且包含上文所描述的各种元件。该构建体作为例子提供，且不意图为限制的。例如，本公开涵盖了另外的激活标签化DNA构建体。例如，可以使用另外的或备选的转座子、转录增强子、启动子、可选择的和/或可筛选的标志来形成依照本文中教导的激活标签化构建体，包括本领域中普通技术人员设想的和如下文中描述的那些。另外，设想可以用本领域中普通技术人员已知的方法，根据构建体的用途如期望的来变化元件。还有，还可以通过使用本领域中普通技术人员已知的方法来确认合适的构建体的形成，所述方法包括但不限于限制性消化和测序。
i.转座酶的编码序列
所披露的构建体包含转座酶的编码序列。转座酶是结合转座子的末端并通过切割和粘贴机制或复制性转座机制催化转座子移动到基因组的另一部分的酶。例示性转座酶是本领域中普通技术人员已知的，且包括但不限于Ac,Ds,Mu,Spm,TAM1和TAG转座酶。在一个特定的实例中，转座酶的编码序列是包含玉米Spm转座酶的TpnA和TpnD编码序列(如由GenBank登录号M25427.1(基因座MZETNENSPM)的碱基400-8045所披露的)的序列互补体的等同物(Pereira等,EBMO J.5:835-841,1986，其通过提述完整据此并入)。例如转座酶的编码序列对应于SEQ ID NO:1的核酸483-8132。
ii.可检测的报道物编码区
所公开的激活标签化DNA构建体包含可检测的报道物编码区以监测转座。在一个实施方案中，可检测的报道物编码区包含可操作地连接于启动子的至少一个编码调节/报道基因的序列。
a)报道基因
报道基因是通常不存在于受体生物体或组织中，且通常编码导致一些表型变化或酶特性的蛋白质的基因。这类基因的例子在Weising等,1988中提供。公认的报道基因包括大肠杆菌的uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、来自大肠杆菌的Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来自生物发光水母维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(及其众多种工程化改造的衍生物)、来自其它动物的绿色荧光蛋白(例如Rinella或Ptilosarcus;参见美国专利No.7,528,242)、和来自萤火虫(Photinus pyralis)的萤光素酶基因(及其众多种工程化改造的衍生物)。然后，在已经将基因引入到受体细胞中后，可以在合适的时间实施检测所述报道基因表达的测定。在一些情况下，可以使用有或无可选择标志的报道基因。
在一个实施方案中，可检测的报道物编码区包含可操作地连接于高水平组成型启动子的编码花色素苷调节基因B-Peru的序列和可操作地连接于启动子，如高水平组成型启动子的编码花色素苷调节基因C1的序列。在其它实例中，将花色素苷调节基因表达用作表型标志，如记载于Shen和Petolino(Mol.Breeding,DOI10.1007/s11032-006-9018-1,2006)和国际专利公开No.WO91/02059(各通过提述据此完整并入)中的。Shen和Petolino(Mol.Breeding,DOI10.1007/s11032-006-9018-1,2006)采用了在玉米种子的糊粉和胚中表达的球蛋白启动子。在一些实例中，花色素苷生物合成的转录激活子在表达盒中可操作地连接于合适的启动子，并将其用作植物细胞转化的无植物毒性的标志物。
至少两类调节基因，R1/B1和C1/Pl1，控制花色素苷生物合成途径。这两类调节基因都是玉米中植物和种子组织的发育及组织特异性的色素沉着所需要的。R1/B1家族编码与myC癌蛋白中发现的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)DNA结合/二聚化域具有序列同源性的功能上可互换的蛋白质。C1/Pl1家族编码与myB相关的癌蛋白的DNA结合域具有序列同源性的蛋白质。花色素苷色素产生牵涉至少20种结构性基因座。C1牵涉种子组织，如糊粉、盾片(scutellum)、胚轴中的花色素苷合成，而Pl1牵涉植物体的数种组织和果皮的色素沉着。B-Peru(Bp)(B1的等位基因)可以取代R1在糊粉组织中的功能。
在一些实施例中，使用B-Peru/C1载体构建体来指示植物细胞转化(如记载于本文中和Shen和Petolino,Mol.Breeding,DOI10.1007/s11032-006-9018-1,2006中的)。商业化生长的田间玉米基因型通常包括R1/B1和C1/Pl1调节基因的隐性等位基因，使得在正常条件下它们的种子是无色素的，尽管它们含有途径中的结构性基因的显性等位基因。通过构建包含在种子特异性启动子控制下的B-Peru和C1基因、以及与之组合的处于其自身的合适调节元件控制下目的基因的转化载体，为视觉标志和性状的共分离提供了条件；由此使得能够容易地鉴定转基因分离。
在一个实例中，将花色素苷调节基因B-Peru和C1用作可筛选的标志。这些基因当异位表达时诱导花色素苷生物合成基因的表达。例如为了筛选其中发生转座事件的颗粒，使用玉米启动子，如玉米球蛋白1启动子(一种在种子的糊粉组织中表达的启动子)来表达B-Peru和C1。在一个特定的实例中，将非自主型转座子克隆到编码B-Peru的基因的5’UTR区。此插入阻止B-Peru蛋白的表达且花色素苷不在糊粉中累积。然而，当转座子被切离时，B-Peru基因被恢复为功能形式且导致花色素苷在糊粉组织中的累积。
b)启动子
启动子通常包含至少一个RNA聚合酶结合位点连同一个或多个转录因子结合位点，转录因子结合位点响应于应答转录因子的占据而调控转录。有多种可用于异源基因表达的启动子。植物启动子是在植物细胞中有功能的天然或非天然的启动子。植物启动子调节元件包括但不限于核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)启动子、β-菜豆蛋白(phaseolin)启动子、ADH启动子、热激启动子、和组织特异性的启动子。除了植物启动子调节元件外，在植物细胞中还可以有效使用来自多种来源的启动子调节元件以表达外来基因。例如，可以使用起源于细菌的启动子调节元件如章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子；起源于病毒的启动子如花椰菜花叶病毒(35S和19S),35T(一种经重新工程化改造的35S启动子；参见美国专利No.6,166,302)等等。在一个实例中，启动子是组成型启动子。例示性的组成型启动子包括但不限于树莓E4启动子(美国专利Nos.5,783,393和5,783,394)、多聚化的35S CaMV(Jones等,Transgenic Res.1:285-297,1992)、CsVMV启动子(Verdaguer等,Plant Mol.Biol.37:1055-1067,1998)和甜瓜肌动蛋白启动子。在某些情况下，可能期望使用可诱导的启动子，其负责基因的应答特定信号的表达，所述信号如：物理刺激(热激基因)、光照(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代谢物、化学物(响应四环素的)、和胁迫。在另外的实施方案中，还可以使用组织特异性的启动子，其负责特定细胞或组织类型如叶或种子中基因的表达(例如玉米醇溶蛋白、油质蛋白、油菜籽蛋白、ACP、球蛋白等)。例如，组织特异性启动子包括番茄E4和E8启动子(美国专利No.5,859,330)、番茄2AII基因启动子(Van Haaren等,Plant Mol.Bio.21:625-640,1993)和在糊粉和胚组织中表达的球蛋白1启动子。启动子调节元件也可以在植物发育的某个阶段有活性(无活性)以及在植物组织和器官中有活性。这样的例子包括但不限于花粉特异性、胚特异性、玉米穗丝特异性、棉花纤维特异性、根特异性、种子胚乳特异性、或营养生长期(vegetative phase)特异性的启动子调节元件等。
iii.非自主型可转座的T-DNA盒
例示性可转座的T-DNA盒包含成对的转座酶DNA底物，它们之间置有转录增强子；以及，任选的，可操作地连接于该转录增强子的编码可选择或可筛选的标志的序列。在一个实施方案中，非自主型可转座的T-DNA盒被插入到可检测的报道物编码区中，从而使得B-Peru和C1基因仅在可转座盒切离时才在含有玉米激活标签化DNA构建体的细胞中表达花色素苷。
a.转座酶的DNA底物
转座子，或称为可转座元件，是DNA的天然移动片段，为转座酶的底物。例示性转座子如Ac,Ds,Mu,Spm,TAM1和TAG1是可以将其自身插入到基因中并导致突变的元件。由于转座子随后在植物或种子发育期间从突变基因座切离，该突变可能是不稳定的。(参见例如Doring,H.P.和Starlinger Ann.Rev.Genet.20:175-200,1986;Federoff,N.“Maize Transposable Elements”inMobile DNA.Wowe,M.M.和Berg,D.E.编,Amer.Soc.Microbiol.,Wash.,D.C.,第377页-第411页,1989.)已经描述了一种例示性的转座子标记策略，其用于鉴定影响植物高度、下胚轴延伸、和能育性的半显性突变(参见Wilson K等,Plant Cell8(4):659-71,1996)。可以将转座子序列纳入到激活标签化核酸构建体中，从而使增强子在植物基因组范围内移动。在所公开的激活标签化DNA构建体的一个特定实例中，所述转座子是缺陷型转座子(例如缺乏生成其自身DNA拷贝和整合到新的染色体位置中的酶功能的转座子)，如包含增强子元件(如4X SCBV)和可选择标志(如AAD1)的缺陷型Spm转座子。例如，缺陷型Spm转座子包含4X SCBV增强子和作为可选择标志的AAD1。在一个特定的实例中，缺陷型Spm转座子具有对应于SEQ ID NO:1的核酸13986和20163的核酸序列。
b.转录增强子元件
所披露的平台包含可用于增强转录效率的增强子元件，这可以导致在该增强子控制下的DNA序列的增强的转录。特别感兴趣的是可能具有与宿主相同的遗传起源或外来起源的插入基因序列的增强的转录，所述序列可以是天然存在的序列(有义和反义方向)或合成制备的序列。增强子元件使激活标签化变得容易。
天然的增强子包含在其天然环境中处于启动子上游并且在其约600bp内的DNA序列。取mRNA的起始核苷酸作为0，在各种实施方案中含有增强子的序列是从约-50至约-1,000bp，通常从约-50至-950bp，一般包含约-100至-800bp。增强子域是顺式作用的，且期望地位于待增强的转录启动序列的约10,000bp内，通常约2,000bp内，更通常地邻近于或位于该转录启动序列的约1,000bp内。增强子相对于转录启动序列可以处于任一方向，并且相对于其所增强的启动子位于其上游或下游，不过通常在上游。
本公开的增强子域可与很多种启动序列一起使用，所述启动序列包括天然出现的在增强子控制下的启动子(例如处于顺式位置(邻近且同源的))以及通常不与特定增强子关联的那些(例如异源的)。增强子域和转录启动域可以来自相同或不同的界、科或种。感兴趣的物种包括原核生物和真核生物，如细菌、植物、昆虫、哺乳动物等。组合包括所描述的SCBV(病毒的)增强子域与以下物种的结构性基因的转录启动区：SCBV的宿主(例如来自甘蔗)、另一种植物物种(例如来自相同或不同的科)、昆虫、脊椎动物、细菌、真菌等。
例示性的转录增强子元件包含多拷贝的以前未识别的天然SCBV增强子域(其序列在SEQ ID NO:2中提供)。例如，增强子元件包含至少2个拷贝的增强子域序列，在一些实施方案中3个或4个或更多个拷贝的增强子域序列，所述拷贝串联排列。在一个实例中，转录增强子元件由4个拷贝的SCBV(4XSCBV)增强子组成。其它例示性增强子元件包括但不限于多聚体化的(4X)CaMV35S增强子，其包含在pSKI015载体中。另外的合适的增强子包括来自其它花椰菜花叶病毒，如玄参花叶病毒(FMV)和花生褪绿条纹病花椰菜花叶病毒(PClSV)，的转录增强子。已经发现，串联重复的FMV、PClSV和MMV增强子区与单拷贝的增强子相比将相关基因表达增加了数倍(Dey和Maiti,Plant Mol.Biol.40:771,1999;Maiti和Shepherd,Biochem.Biophys.Res.Commun.244:440,1998;Maiti等,Transgenic Res6:142-156,1997)。在一个实例中，转录增强子元件由4个拷贝的MMV(4X MMV)增强子组成。在一个实例中，转录增强子元件由至少一两个不同的增强子序列构成，如至少一个SCBV增强子序列和至少一个MMV增强子序列。Maiti等,1997描述了具有强启动子活性的FMV序列，其对应于见于GenBank登录号X06166的完整FMV基因组序列的位置6691至7003。PClSV全长转录本(FLt)的启动子记载于美国专利No.5,850,019和Maiti等,1998中，且对应于PClSV的完整基因组序列(见于GenBank登录号U13988)的位置5852至6101。MMV是属于花椰菜花叶病毒家族的双链DNA植物副反转录病毒。MMV的完整基因组序列还未公开。经表征的MMV启动子片段的序列已经由Dey和Maiti,Plant Mol.Biol.40:771,1999描述。具有最高启动子活性的片段从转录起始的核苷酸-297起延伸至+63。
在一个特定实施方案中，增强子(如4X SCBV增强子)和可选择标志(如AAD1)被置于所公开的构建体内的可转座元件(如Spm可转座元件)的末端反向重复(TIR)之间。这是一种非自主型转座子，其需要转座酶来“跳跃”。所述转座酶(如Spm转座酶)位于同一转化载体上但在转座子的TIR以外，这样当转座子移动时，它很可能会移动到不与该转座酶紧密连锁的位置(图1)。
c.可选择或可筛选的标志
所公开的用于转化植物的激活标签化构建体通常含有至少一个标志基因以帮助对转化体(例如基因组中插入了插入性诱变原的植物或植物细胞)的选择，且该标志基因编码用在植物细胞中的可选择或可筛选的标志。可选择的标志赋予可以通过化学手段，例如借助使用选择剂(例如除草剂、抗生素等)进行选择的性状。可筛选的标志赋予通过观察或测试鉴定的性状。可以在实施本公开时采用本领域中已知的众多合适的标志基因。
如期望的话，可以使用多种可选择的标志。例示性的可选择标志包括但不限于抗生素抗性基因，如卡那霉素(nptII)、G418、博来霉素、潮霉素、氯霉素、氨苄青霉素、四环素等，以及那些编码类似的抗性或耐受性的基因。其它可以提供对各种除草剂的抗性或耐受性的植物可选择标志的例子包括草铵膦(PAT)、草甘膦(EPSPS)、咪草烟(imazethyapyr)(AHAS)、潮霉素、甲氨蝶呤、膦丝菌素(双丙氨膦或草铵膦)、咪唑啉酮类、磺酰脲类、和三唑并嘧啶类除草剂，如氯磺隆(chlorsulfuron)；溴苯腈、茅草枯(dalapon)及许多其他的。在一个特定的实例中，AAD1充当植物转化标志。对特定标志的偏好取决于技术人员的裁量，但可以将任意所列的可选择标志与本文中未列出的任何可以充当可选择标志的其它基因一起使用。因此，采用的单独的标志应当允许相对于不含有插入DNA的细胞选择出经转化的细胞。
在一个实例中，使用载体来实施本公开的方法，所述载体包含来自链霉菌(Streptomyces)的bar基因，其编码使得除草剂双丙氨膦、膦丝菌素(PPT)中的活性成分失活的膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)。PPT抑制谷氨酰胺合成酶，这导致氨的快速累积和细胞死亡。含有该基因的转基因植物展现出对除草剂“BASTA”的耐受性。该基因还可以用作可选择的标志基因，因为携带bar基因的外植体能够在含有膦丝菌素(PPT)(双丙氨膦的活性成分)的选择性培养基上生长。
在另外的实施方案中，使用包含除草剂抗性基因的载体来实施本公开的方法，所述基因赋予对含有草甘膦的除草剂的抗性。草甘膦指N-磷酸甲基甘氨酸，处于其酸性或阴离子形式。含有该活性成分的除草剂包括“ROUNDUP”和“GLEAN”。用于赋予草甘膦抗性的例示性基因包括EPSP合酶基因(5-烯醇丙酮酰(enolpyruvyl)-3-磷酸莽草酸(phosphosshikimate)合酶)。
通过使用公知的和/或商品化的序列，可以完成对能够有效表达编码可选择标志的序列的合适的启动子和用于编码可选择标志的序列的终止元件的选择。
iv.其它元件
可以存在其它元件如基质附着区、支架附着区、内含子、增强子、聚腺苷酸化序列等，由此增强转录效率或DNA整合。这类元件可以是DNA功能所必需或不必需的，尽管它们可以通过影响转录、mRNA稳定性等提供DNA更好的表达或作用。可以如期望的将这类元件纳入到DNA中以获得经转化的DNA在植物中的最佳性能。典型的元件包括但不限于Adh-内含子1、Adh-内含子6、苜蓿花叶病毒包被蛋白前导序列、渗透蛋白UTR序列、玉米条纹病病毒包被蛋白前导序列，以及其它技术人员可用的。
V.植物转化
存在多种不同的用于将外来重组载体引入到植物细胞中、且用于获得稳定维持(至少对除了如本文中描述的转座以外是稳定的)并表达引入基因(一种或多种)的植物的技术。具体涵盖的转化技术包括使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化中介，用T-DNA转化、融合、注射、生物射弹(微粒轰击)、碳化硅晶须、气溶胶发射(aerosol beaming)、PEG、或电穿孔以及其它可能的方法。这类技术包括将包被到微粒上的遗传材料直接引入细胞中(美国专利Nos.4,945,050(属于Cornell)和5,141,131(属于DowElanco，现在的Dow AgroSciences,LLC))。另外，可以采用土壤杆菌技术来转化植物，参见美国专利Nos.5,177,010(属于University of Toledo);5,104,310(属于Texas A&M);欧洲专利申请0131624B1;欧洲专利申请120516,159418B1和176,112(属于Schilperoot);美国专利Nos.5,149,645,5,469,976,5,464,763和4,940,838以及4,693,976(属于Schilperoot);欧洲专利申请116718,290799,320500(都属于Max Planck);欧洲专利申请604662和627752，及美国专利No.5,591,616(属于Japan Tobacco);欧洲专利申请0267159和0292435，及美国专利No.5,231,019(都属于CibaGeigy,现在的Syngenta);美国专利Nos.5,463,174和4,762,785(都属于Cal基因)；以及美国专利Nos.5,004,863和5,159,135(都属于Agracetus)。其它转化技术包括晶须技术(参见美国专利Nos.5,302,523和5,464,765(都属于Zeneca,现在的Syngenta))。电穿孔技术也已经用于转化植物。参见WO87/06614(属于Boyce Thompson Institute);美国专利Nos.5,472,869和5,384,253(都属于Dekalb)；以及WO92/09696和WO93/21335(都属于Plant Genetic Systems)。此外，还可以使用病毒载体来生成表达目的蛋白的转基因植物。例如，可以用病毒载体来转化单子叶植物，其使用记载于美国专利No.5,569,597(属于Mycogen Plant Science and Ciba-Geigy(现在的Syngenta))，以及美国专利Nos.5,589,367和5,316,931(都属于Biosource,现在的Large Scale Biology)的方法。将DNA构建体引入到植物宿主中的方式并不是关键的。
例如，本文中描述了用于植物细胞转化的各种方法且包括使用Ti或Ri质粒等来实施土壤杆菌介导的转化。在许多情况下，期望使得用于转化的构建体在一侧或两侧都毗接于T-DNA边界，尤其是右边界。这在构建体使用根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌作为转化的模式时特别有用，尽管T-DNA边界可以用于其它转化模式。
在将土壤杆菌用于植物细胞转化的情况中，可以使用这样的载体，其可以被引入到宿主中用于与宿主中存在的T-DNA或Ti或Ri质粒同源重组。可以经由电穿孔、三亲本杂交和其它本领域技术人员已知的用于转化革兰氏阴性细菌的技术来实施载体的引入。载体转化到土壤杆菌宿主中的方式并不是关键的。含有用于重组的T-DNA的Ti或Ri质粒可以能或不能导致瘿瘤形成，并且只要vir基因存在于所述宿主中就并不是关键的。
如果将土壤杆菌用于转化，则将待插入的DNA克隆到特定载体中，即克隆到中间载体或二元载体中。可以通过与T-DNA中的序列同源的序列导致的同源重组来将中间载体整合到Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包含T-DNA转移必需的vir区。中间载体不能在土壤杆菌中自我复制。可以经由辅助质粒(接合)将中间载体转移到根癌土壤杆菌中。
二元载体可以在大肠杆菌和土壤杆菌两者中自我复制。它们包含选择标志基因和接头或多接头，被T-DNA右边界区和左边界区框住。可以将它们直接转化到土壤杆菌中(Holsters等,Mol.Gen.Genet.163:335-338,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌要包含携带vir区的质粒。Vir区是T-DNA转移到植物细胞中所必需的。可以含有另外的T-DNA。将这样转化的细菌用于转化植物细胞。可以和根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌一起有利地培养植物外植体，从而将DNA转移到植物细胞中。然后可以在合适的培养基(可以含有用于选择的抗生素或抗微生物剂(biocide))中从受感染的植物材料(例如叶片、茎节、根、还有原生质体或悬浮培养的细胞)再生出全植物。然后可以测试这样获得的植物中插入的DNA的存在。在注射和电穿孔的情况中对于质粒没有特殊要求。可以使用普通质粒，如例如pUC衍生物。
对于使用土壤杆菌的植物细胞转化，可以将外植体与经转化的土壤杆菌组合并温育足够的时间以允许其转化。在转化后，通过用合适的抗生素选择来杀死土壤杆菌，并用合适的选择培养基来培养植物细胞。一旦形成愈伤组织，就可以通过依照植物组织培养和植物再生领域公知的方法采用合适的植物激素来促进芽形成。然而，并非总需要愈伤组织中间阶段。在芽形成后，可以将所述植物细胞转移到促进根形成的培养基中，由此完成植物再生。然后可以使植物生长至结籽，且所述种子可以用于建立后代，或用于分析如本文中描述的转座子切离。无论转化技术如何，优选地，将编码待表达于植物中的蛋白质的基因掺入到植物转移载体中，所述转移载体通过将植物启动子调节元件以及3’非翻译转录终止区(如Nos等)纳入到该载体中而适于在植物细胞中表达所述基因；在本文中描述了具体的例子。
经转化的细胞在植物中以通常方式生长。它们可以形成生殖细胞并将转化的性状传递给后代植物中。可以以正常的方式使这类植物生长，并将其与具有相同的转化遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得的杂交个体具有相应的表型特性。
除了众多用于转化植物的技术外，与外来基因接触的组织类型也可以变化。这类组织会包括但不限于胚发生组织，I、II、和III型愈伤组织，下胚轴，分生组织，根组织，用于在韧皮部中表达的组织等。使用本文中描述的合适的技术，几乎所有的植物组织都可以在去分化期间进行转化。可以分析转化的植物中感兴趣的基因的存在以及由本文中描述的激活标签化系统赋予的表达水平和/或谱。本领域中普通技术人员有多种方法来分析转化的植物。例如，用于植物分析的方法包括Southern和Northern印迹分析、基于PCR(或其它基于核酸扩增)的办法、生化分析、表型筛选方法、田间评估、和免疫诊断测定法(例如用于蛋白质的检测、定位、和/或定量)。
VI.转化植物的用途
可以使用带标签的群体，包括用所公开的激活标签化平台转化的植物来筛选特定表型，如农艺上重要的性状、突变或其组合。可以通过实施侧翼序列标记分析来测定转座子的插入位点。使用生物信息学工具可以将这些序列定位到基因组上。一旦知道并定位了插入位点，就可以鉴定出在特定基因中或附近具有插入的种系。可以将该群体用于反向遗传分析以研究与特定基因附近的激活标签化有关的表型。
i.筛选农艺上重要的性状
可以使用带标签的群体，通过正向遗传筛选测定法来筛选农艺上重要的性状。例如可以筛选带标签的群体中为植物提供有益性状的表型，所述性状如但不限于，干旱耐受性、增强的氮使用效率、增加的种子油含量或改变的淀粉含量或其它期望的性状。对群体中其它表型，如改变的植物发育、形态学或代谢物累积的筛选可能加深对植物生物学的基础理解。这类筛选是本领域中公知的并且已经记载于出版物，如Bruce等(J.Exper.Botany,53:13-25,2002),Agrama等(Molecular Breeding5:187-195,1999),Baye等(J.CerealScience43:236–243,2006),Knutson和Grove(Cereal Chern.71:469-471,1994),Guillaumie等(Plant Physiol.143:339-363,2007),和Yamasaki等(Plant Cell17:2859-2872,2005)；其中各项引用都通过提述完整据此并入。
在一些实施方案中，实施超过一次筛选。例如，初次筛选后接着对来自展现出表型的事件的种子进行二次筛选。二次筛选使用来自在初次筛选中筛选的同一代的种子，但可以比初次筛选包含更大量的植物。
一旦已经在二次筛选中确认了表型，就可以通过筛选未转录的亲本品系和标签品系之间的杂交后代来测试该表型与标签插入的遗传连锁。当含有标签元件的植物展现出该表型(如增加的干旱耐受性)而不含有该标签元件的植物不展现时，就认为该表型与插入遗传连锁且可能由标签元件导致。为了鉴定出其表达可能受到这类元件影响的基因，可以测定经激活标签化的元件在基因组中的位置。
可以通过本领域中普通技术人员已知的方法来测定标签元件的基因组位置。在一个实例中，通过分离出侧翼于ZeaTAG元件的基因组序列并将这些序列与玉米的基因组序列进行比较来测定标签元件(如ZeaTAG，一种基于玉米的激活标签化元件)的基因组位置。可以通过许多分子生物学技术来测定侧翼于ZeaTAG元件的序列，所述技术包括但不限于反向PCR(iPCR)(Ochman等,Genetics,120:621-6231988),TAIL(Liu等,Plant Journal8:457-463,1995)和连接介导的PCR(LMPCR)(Prod'hom等,FEMS MicrobiolLett.158:75-81,1998)。通过序列比对工具如BLAST将这些序列与基因组序列比较以鉴定出ZeaTAG元件在基因组内的位置。
通过检查注释的基因组来确定侧翼于ZeaTAG元件或被其打断的基因。侧翼于ZeaTAG元件的基因的转录可能负责突变表型。可以将这些基因在野生型玉米中过表达以测试它们是否赋予类似的表型。为了对此进行测试，将这些基因克隆到由强启动子或其自身启动子驱动的转化载体中，它们侧翼有增强子序列以增强转录。将这些载体通过转化引入到野生型玉米中，并测试由此转化所得的植物的表型。
类似地，被ZeaTAG元件打断的基因可能导致表型。为了确认被该元件打断的基因负责该表型，可以破坏该基因的表达并测试含有该破坏的植物的表型。可以通过许多本领域中技术人员已知的方法来完成对特定基因表达的破坏，包括但不限于反义RNA、人工微小RNA和通过TILLING鉴定基因中的突变。
ii.筛选突变
还可以使用带标签的群体来鉴定突变，例如通过使用反向遗传筛选。反向遗传筛选寻找影响特定基因的突变并随后测试鉴定出的种系的突变表型。可以在反向遗传分析中以数种方式使用带标签的群体(如ZeaTAG群体)，包括但不限于生成群体的侧翼序列标签集(Jeong等,The Plant Journal45:123–132,2006)和从带标签的群体(如ZeaTAG群体)生成标引的(indexed)DNA集合样品集(May等,Molecular Biotechnology20:209-221,2002)。
可以生成侧翼序列标签集，其通过从已经“标签化”的植物、植物部分或细胞获得样品(如通过从ZeaTAG群进行叶组织采样)，分别从中分离DNA，鉴定侧翼于插入的序列并将序列存储到可搜索的数据库中，其中序列被连接到它们所来源的事件。可以通过搜索该数据库来鉴定出在假设导致表型的基因中或附近处含有插入的植物。可以针对该表型测试含有这些事件的植物。
使用本领域中技术人员公知的策略，可以从带标签的群体生成DNA合并样品的标引集并筛选影响特定基因表达的标签元件。这些包括但不限于从该群体中的各个植物分离DNA并将DNA布置到微滴定板中。可以合并来自板中各行和列的DNA并将这些合并物的等分试样合并在一起。来自各板的合并DNA可以合并成更大的合并集。可以使用PCR来测试在基因组位置处标签元件(如ZeaTAG元件)的插入，该PCR使用对基因组位置特异性的一种引物和对标签元件(如ZeaTAG元件)特异性的另一种引物。首先通过PCR筛选并通过扩增含有来自所研究的基因组位置和标签元件(如ZeaTAG元件)的序列的特定PCR产物来鉴定合并的DNA样品。DNA合并物可以通过下述方式解开复杂度(deconvolute)：首先筛选来自微滴定板合并物的DNA，然后限定到特定的微滴定板，接着限定到该滴定板中的特定孔。一旦鉴定出来，就可以使用本领域中技术人员公知的方法，针对特定表型来筛选含有标签元件(如ZeaTAG元件)的植物。
下列实施例例示了用于生成可用于实践本发明的质粒和植物的方法。应理解的是，本文中描述的实施例和实施方案仅用于例示性目的，且由此而来的各种修改或变化会提示本领域中的技术人员，且会包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。不应将这些实施例理解为将本发明限制到所描述的具体特征或实施方案。
实施例
实施例1：在未成熟的玉米B104胚中瞬时表达C1和B-Peru蛋白以诱导花色素苷生成的测试
本实施例演示了在玉米B104胚中共同表达编码C1和B-Peru蛋白的玉米基因导致对花色素苷生成的诱导。
在玉米遗传学和玉米基因表达领域中公知的是，C1蛋白和B-Peru(BP)蛋白协调作用来诱导控制红花色素苷色素的合成和累积的基因的表达(Christensen等,Plant Mol.Biol.18:675-689,1992)。因此，在合适的玉米遗传背景中，色素的产生揭示了C1蛋白编码区和BP蛋白编码区的共表达。
在对照实验中，分别克隆C1编码区和BP编码区以将它们置于玉米泛素1启动子的表达控制下，该启动子在大多数玉米细胞和组织类型中是有组成型活性的。分别将953bp玉米C1编码区和1921bp BP编码区克隆到质粒pBluescript SK+(Stratagene,La Jolla,CA)中1991bp玉米Ubi1启动子和254bp胭脂碱合酶转录终止子之间(参见表1对组件及其在SEQ ID NO:1中相应位置的描述)。在另一种pBluescript背景质粒中，将C1和BP编码区都克隆到1249bp玉米球蛋白1基因启动子的转录调节下(Belanger和Kriz,Genetics129:863-872,1991)。使用QiAfilterTM质粒Maxi试剂盒(Qiagen)制备质粒DNA的大量制备物，并使用标准的分子方法来分析其数量和质量。
制备玉米B104胚用于轰击
在授粉后13天(DAP)收集玉米穗并用50%漂白剂15分钟，接着用无菌蒸馏水清洗5次来进行表面消毒。使用无菌镊子分离胚，并将30个胚置于装有含3%蔗糖的MS培养基(Murashige和Skoog,Physiol.Plant.15:473-497,1962)的培养皿上，在黑暗中28°C24小时。在轰击当日，在轰击前将胚移动到含有12%蔗糖的MS培养基中并在黑暗中于28°C温育4小时。
带有质粒DNA的金颗粒的制备和轰击测定法
用70%乙醇清洗金颗粒(1μm直径)10分钟，然后用无菌水清洗3次。将颗粒以120mg/mL的浓度分散到50%甘油中。对于50μL(6mg)金颗粒，加入5μg质粒DNA、50μL2.5M CaCl2和20μL0.1M亚精胺。在室温将反应(总体积125μL)温育10分钟，伴有温和搅动，然后不搅动再温育10分钟。将DNA包被的金颗粒短暂离心、用150μL70%乙醇清洗，随后用100%乙醇清洗。将最终离心沉淀重悬于30μL100%乙醇中并用Branson1450超声波仪进行简单的超声处理。将用DNA包被的金颗粒的10μL等分试样散布到大担载体(macrocarrier)(BioRad,Hercules,CA)上，并在使用BioRad PDS1000/He系统的轰击测定法中使用。使用1100psi盘以靶距离6cm来转化胚。在轰击后，将胚移动到含有3%蔗糖的MS培养基中并在光照(约50μEm-2s-1)下于28°C温育48小时。在光学显微镜下观察花色素苷色素的累积。
C1和BP蛋白的瞬时表达
当用携带受组成型Ubi1启动子控制的玉米C1或BP编码区的质粒DNA分别瞬时转化玉米B104胚时，没有看到红色色素沉着。相比之下，当将这两种基因共转化到玉米胚中时，在约一半的胚中观察到花色素苷的生成，这证明了从该项工作中采用的相应编码区生成的C1和BP蛋白的功能性，且证明了需要这两种蛋白同时存在来诱导色素形成。
在其它构建体中，C1和BP蛋白编码区在玉米球蛋白1基因启动子的转录控制下，该启动子在玉米中优选在胚和糊粉组织中有功能(Belanger和Kriz,Genetics129:863-872,1991)。在对照研究中，当将同处于玉米球蛋白1基因启动子的转录控制下的C1蛋白编码区和BP编码区单独瞬时转化到玉米B104胚中时，没有看到红色色素沉着。两种基因的共转化生成了展现出红色色素沉着的B104胚。
这些研究证明了Ubi1启动子和球蛋白1启动子都能够驱动C1和BP花色素苷调节基因在13DAP B104未成熟胚中的表达。
实施例2：用于在玉米中激活标签化的质粒
本实施例描述了用于在玉米中激活标签化的激活标签化DNA构建体的代表性例子(pEPS3004)的构建。
土壤杆菌超二元质粒的生成
超二元系统是土壤杆菌穿梭载体/同源重组系统的一个特殊化的例子(综述见Komari等,Meth.Mol.Biol.343:15-41,2006,Komori等,Plant Physiol.114:1155-1160,2007；亦参见欧洲专利No.EP604662B1和美国专利No.7,060,876)。与超二元系统一起采用的根癌土壤杆菌宿主菌株是LBA4404(pSB1)。菌株LBA4404(pSB1)携带两个独立复制的质粒pAL4404和pSB1。pAL4404是Ti质粒衍生的辅助质粒，其含有完整的vir基因集(来自Ti质粒pTiACH5)，但不具有T-DNA区(且因此不具有T-DNA左边界和右边界重复序列)。质粒pSB1供应了自pTiBo542衍生的另一vir基因部分集。在超二元系统中使用的穿梭载体的一个例子是pSB11，其含有被T-DNA右边界和左边界重复区侧翼于的克隆多接头，该克隆多接头充当预定用于植物细胞转化的基因的引入位点。穿梭载体pSB11不能在土壤杆菌中独立复制，但在经由pSB1和pSB11上存在的共有序列之间的同源重组整合到pSB1中时作为共整合质粒稳定维持在土壤杆菌中。由此，通过自两种不同的土壤杆菌Ti质粒来源(pTiACH5和pTiBo542)衍生的Vir蛋白有效地作用于经修饰的pSB11载体上的LBA4404(pSB1)中引入的完全修饰过的T-DNA区，并将其转移到植物细胞中。已经证明超二元系统在单子叶植物物种的转化中特别有用(参见Hiei等,Plant J.6:271-282,1994,和Ishida等,Nat.Biotechnol.14:745-750,1996)。
用于生成激活标签化的玉米植物的一个代表性转化质粒是pEPS3004，其具有pSB11载体骨架(Japan Tobacco,参见欧洲专利No.EP604662B1和美国专利No.7,060,876)。由限制酶分析和对构建体所选区域的DNA序列测定验证了pEPS3004的结构。在SEQ ID NO:1中提供了与此工作相关的pEPS3004的部分DNA序列，且在图1中给出了例示有关特征的结构图。在表1中呈现了对SEQ ID NO:1中元件的说明。SEQ ID NO:1例示了一个实施方案，但植物分子生物学和植物基因表达领域中的技术人员会理解可以用某些其它的启动子、编码区、转录激活子或终止子序列等取代SEQ ID NO:1的类似元件，并且对SEQ ID NO:1的这类其它变动视为落在本公开的范围内。
表1.SEQ ID NO:1内的元件。
Figure BDA00003133816600361
Figure BDA00003133816600371
Figure BDA00003133816600381
通过如之前教导的方法将质粒pEPS3004引入根癌土壤杆菌菌株LBA4404(pSB1)中(Komari等,Meth.Mol.Biol.343:15-41,2006,Komori等,Plant Physiol.114:1155-1160,2007;欧洲专利No.EP604662B1和美国专利No.7,060,876)，且通过标准方法用限制酶消化分离的质粒DNA来验证pSB1::pEPS3004共整合质粒的结构。
实施例3：土壤杆菌介导的对玉米的转化
本实施例描述了用于转化玉米细胞并从如此转化的细胞生成植物和种子的代表性方法
未成熟胚的生成
将来自B104近交种的种子种植到含有Sunshine Custom 
Figure BDA00003133816600382
160(SunGro Horticulture,Bellevue,WA)的4加仑罐中。使用高压钠和金属卤化物灯与16:8小时光照：黑暗光周期的组合，使植物在温室中生长。为了获得用于转化的未成熟的胚，实施受控的近缘授粉。在授粉后10-13天当胚大小为约1.4-2.0mm时，分离未成熟的胚。
感染和共培养
在切离胚并转化前，通过将玉米穗浸没到有Tween20(每500mL1或2滴)的50%商品化漂白剂中10分钟，并用无菌水漂洗3次对其进行表面消毒。将在YEP(5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、15g/L细菌用琼脂)固体培养基(含有50mg/L壮观霉素、10mg/L利福平、和50mg/L链霉素)上于28°C生长3天或于25°C生长4天的细菌取1或2个菌环转移到含有100μM乙酰丁香酮的5mL液体感染培养基(MS盐、ISU修改的MS维生素储液(1000x，2g/L甘氨酸、硫胺HCl和吡哆醇HCl各0.5g/L、0.05g/L烟碱酸，如Che等(PlantCell Reports,25:1024-1034,2006)中提供的)、3.3mg/L麦草畏、68.4gm/L蔗糖、36gm/L葡萄糖、700mg/L L-脯氨酸,pH5.2)中，来制备含有超二元载体的土壤杆菌细胞的悬浮液。使用无菌5mL移液管将该溶液温和地吹打，直到得到均匀的悬浮液，并将浓度调节为使用Ultrospec10细胞密度仪(GEHealthcare/Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)在600nm处(OD600)测得的光密度为0.3-0.5。将未成熟的胚直接分离到含有2mL感染培养基的微离心管中。除去培养基并用1-2mL新鲜的感染培养基替换2次，然后将其除去并用1.5mL土壤杆菌溶液替换。将土壤杆菌和胚溶液在室温温育5分钟并转移到共培养培养基中，该培养基含有MS盐、ISU修改的MS维生素、3.3mg/L麦草畏、30gm/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、100mg/L肌醇、100mg/L酪蛋白酶促水解产物、15mg/L AgNO3、100μM乙酰丁香酮、和2.3-3gm/L GelzanTM(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO),pH5.8。共培养温育在黑暗下或在24小时白荧光光照条件(约50μEm-2s-1)下于25°C进行3-4天。
静息和选择
共培养后，将胚转移到无选择的基于MS的静息培养基中，该培养基含有MS盐、ISU修改的MS维生素、3.3mg/L麦草畏、30gm/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、100mg/L肌醇、100mg/L酪蛋白酶促水解产物、15mg/L AgNO3、0.5gm/L MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(ethanesulfonic acid monohydrate);Fischer Scientific,Waltham,MA)、250mg/L羧苄青霉素、和2.3gm/L GelzanTM,pH5.8。温育在黑暗下或在24小时的白荧光光照条件(约50μEm-2s-1)下于28°C进行7天。在7日静息期后，将胚转移到选择性培养基中。为了选出经超二元质粒(含有植物可表达的AAD1可选择标志基因)转化的玉米组织，使用补充有氟吡氯禾灵(Haloxyfop)的基于MS的静息培养基(如上)。将胚首先转移到含有100nM氟吡氯禾灵的选择培养基中并温育1-2周，然后转移到含有500nM氟吡氯禾灵的选择培养基中并再温育2-4周。经过在黑暗下或在24小时白荧光光照条件下(约50μEm-2s-1)于28°C约5-8周的过程，获得经转化的分离株。
玉米转化领域中的技术人员会理解当使用其它的植物可表达的、可选择的标志基因(例如除草剂耐受基因)时有其它选择经转化的植物的方法可供使用。
预再生
在选择过程后，将暴露于24小时光照方案的培养物转移到基于MS的预再生培养基中，该培养基含有MS盐、ISU修改的MS维生素、45gm/L蔗糖、350mg/L L-脯氨酸、100mg/L肌醇、50mg/L酪蛋白酶促水解产物、1mg/LAgNO3、0.25gm/L MES、0.5mg/L萘乙酸、2.5mg/L脱落酸、1mg/L6-苄氨基嘌呤、250mg/L羧苄青霉素、2.5gm/L GelzanTM、和500nM氟吡氯禾灵，pH5.8。在24小时白荧光光照条件(约50μEm-2s-1)下于28°C持续温育7天。
再生和小植株分离
为了再生，将培养物转移到基于MS的第一再生培养基中，该培养基含有MS盐、ISU修改的MS维生素、60gm/L蔗糖、100mg/L肌醇、125mg/L羧苄青霉素、2.5gm/L GelzanTM、和500nM氟吡氯禾灵，pH5.8。在黑暗下或在24小时白荧光光照条件(约50μEm-2s-1)下于28°C2周后，将组织转移到基于MS的第二再生培养基中，该培养基由以下构成：MS盐、ISU修改的MS维生素、30gm/L蔗糖、100mg/L肌醇、3gm/L GelzanTM,pH5.8(有或无500nM氟吡氯禾灵)。再生/选择在16小时或24小时白荧光光照条件(约50μEm-2s-1)下于28°C持续2周。当小植株长度达到3-5cm时，将它们切下并转移到第二再生培养基(如上，但无氟吡氯禾灵)中，并在16小时白荧光光照条件(约50μEm-2s-1)下于25°C温育以允许芽和根的进一步生长和发育。
种子生成
将植物移植到
Figure BDA00003133816600401
360无土生长培养基(Sun Gro Horticulture)中并在生长室中使其长壮(harden off)。然后将植物移植到Sunshine CustomBlend160土壤混合物中并在温室中生长至开花。进行受控的授粉以用于种子生成。
实施例4：鉴定具有串联SCBV激活子元件的转座的玉米植物
本实施例描述了对其中已经整合激活标签化构建体(由pEPS3004例示，如上文所描述的)的玉米细胞的分析，对从其衍生的植物的分析，以及从激活标签化构建体内切离非自主型可转座的T-DNA盒后对这些细胞和植物的表征。
在对照研究中，分别克隆C1编码区和BP编码区以将它们置于玉米泛素1启动子的表达控制下，该启动子在大多数玉米细胞和组织类型中是有组成型活性的。当用如此构建的C1或BP基因单独瞬时转化到玉米B104胚中时，没有看到红色色素沉着。相比之下，当将这两种基因共转化到玉米胚中时，观察到花色素苷的生成，这证明了从此项工作中采用的相应编码区生成的C1和BP蛋白的功能性，且证明了需要这两种蛋白同时存在来诱导色素形成。
如存在于pEPS3004(图1和SEQ ID NO:1)的T-DNA中的，C1蛋白编码区在玉米球蛋白基因启动子的转录控制下，该启动子在玉米中在包含种子糊粉层的细胞中有活性。在对照研究中，当将同处于玉米球蛋白基因启动子的转录控制下的C1蛋白编码区和BP编码区单独瞬时转化到玉米B104胚中时，没有看到红色色素沉着。两种基因的共转化生成了展现出红色色素沉着的B104胚，证明了在此项工作中采用的球蛋白启动子指导种子特异性表达的功能性。
如存在于pEPS3004的T-DNA中的，BP编码区在一个玉米球蛋白启动子拷贝的下游(在转录意义上)，但与其相距6177个碱基的居间DNA。这些居间碱基阻止了由球蛋白启动子启动的、编码BP蛋白的功能性mRNA的转录。因此，为了使得BP蛋白在球蛋白启动子第二拷贝的控制下生成，必须以一定方式除去这些居间碱基，这样的方式导致活性基因的创建(例如通过球蛋白启动子和BP编码区的合适并置)。
所述居间碱基包含部分来源于玉米增强子或抑制基因-增变基因(Suppressor-mutator)(En/Spm)转座子的元件的人工转座子的部分。在天然的En/Spm转座子系统中，由Spm编码的转座酶蛋白TpnA和TpnD作用于5’和3’末端反向重复(TIR)序列，通过从供体染色体基因座切离并插入到远端位置来使转座子移动。将球蛋白启动子和BP编码区分隔开的居间碱基的6177bp包含侧翼于编码植物可选择标志蛋白的活性基因(AAD1)的5'和3'TIR序列，所述活性基因在(组成型)稻肌动蛋白启动子的表达控制下(图1)。因此，本发明的人工转座子包含一对侧翼于植物可选择的标志基因的TIR元件。本发明的人工转座子的另一特征是包含自发现于甘蔗杆状病毒(SCBV)基因组中的启动子衍生的转录激活子元件(SEQ ID NO:2)的4个串联拷贝，其被置于5'TIR元件和控制AAD1基因表达的稻肌动蛋白启动子之间(参见图1)。
在通过土壤杆菌介导的转化引入到玉米细胞中时，如SEQ ID NO:1和图1中披露的pEPS3004的T-DNA整合到玉米染色体中的随机位置处。对经转化的玉米细胞的选择由T-DNA中组成型表达的AAD1可选择标志基因提供。本公开的一个特征是，携带SCBV激活子元件的串联拷贝的人工转座子可以从其在原始整合位点(供体位点)中的位置切离，并可以重新插入到其它染色体基因座(受体位点)中。将强力的SCBV转录增强子元件引入到邻近于天然玉米基因的受体位点导致那些附近基因的异常表达，由此在一些情况下，为从经转化的组织再生的植物提供了新的可鉴定的性状。有现代分子生物学方法可用来帮助分离和鉴定受体位点附近受影响的基因，由此为进一步开发分离基因提供了条件。
对来自供体整合位点的人工转座子的切离和移动受到TnpA和TpnD蛋白的介导，所述TnpA和TpnD蛋白由同样位于质粒pEPS3004的T-DNA中且位于人工转座子TIR元件外的Spm转座酶基因提供(图1)。为了监测人工转座子何时离开整合的供体位点，C1/BP标志系统提供了可筛选的视觉标志，其在人工转座子被从供体位点精确切离之前都是无活性的。当转座子被切离时，无功能的BP基因被修复，从而可以容易地检测到可筛选的标志表型(种子糊粉中的红色色素沉着)。可以使这样的种子发芽，并可以表征所得植物的任何新的期望性状，如例如干旱耐受性、提高的产量，或其组合。
在用携带pEPS3004载体(“Spm-ZeaTAG载体”)的LBA4404(pSB1)转化的玉米B104胚中获得了对人工转座子切离及C1和B-Peru基因报告该切离的能力的验证。对经转化的胚，分析作为切离后果的花色素苷色素的合成和累积。250个胚中有3个在第一实验中显示出花色素苷累积，且250个胚中有7个在第二实验中显示出花色素苷累积。由从累积花色素苷的胚发生的愈合组织分离的基因组DNA获得了人工转座子切离的分子证据。实施使用基因组DNA作为模板的聚合酶链式反应(PCR)来确认空供体位点DNA序列，所述PCR使用对应于侧翼于载体的人工转座子单元的DNA序列的相对引物。PCR反应生成了约247bp的扩增子，这是若人工转座合适地切离后的预期大小。正向引物(5’-GTACCTCTTCCTGGAGCACCAG-3’;SEQ ID NO:10)位于SEQ ID NO:1的13961bp和13982bp之间，且反向引物(5’-TGTAGAACCCGTCCGTCCGTCCACGTCAG-3’;SEQ ID NO:11)位于20359bp和20383bp之间。
将PCR产物克隆入TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)并转化到大肠杆菌细胞中。从47个分离的菌落制备质粒DNA并测序。对PCR产物的测序证明，在用EPS3004Spm-ZeaTAG载体转化的玉米B104胚中，发生了对人工转座子(对应于SEQ ID NO:的位置13982-20160)的Spm依赖性切离。表2中呈现了所测定序列的一个样本。发现了由空DS2代表的序列明显占优势。
表2.人工转座子转座后的47个空供体位点(EDS)的序列。
Figure BDA00003133816600431
在表2中，括号中的数字指示在第一和第二研究中具有所标明的序列的克隆的数目。点和双下划线的碱基分别指示EDS位点中的碱基对缺失和转换。还参见图3A-3C。
还使用pEPS3004Spm-ZeaTAG载体来生成稳定转化的玉米植物。这些植物生成了具有不同种子表型的颗粒，这是人工转座子的切离在空间和时间上的差异的结果。熟悉玉米种子发育生物学的人会理解，如果在种子发育早期，产生胚珠的减数分裂之前，从供体位点切离人工转座子(例如配子转座)，那么完整的糊粉层会累积花色素苷，从而给完整的种子相对均一的红色/紫色。相比之下，如果在授粉后且糊粉层在发育时切离人工转座子(例如体细胞转座)，那么糊粉的部分会累积花色素苷(图2A和2B)。只有配子转座会在植物生殖细胞中产生经转座子修饰的基因座，而且这些，而非体细胞转座事件，会被传递给后续世代。图2A和2B显示了由于在种子和胚发育的不同阶段进行人工转座子的切离，在种子糊粉中累积花色素苷的转基因B104种子。
实施例5：生成经激活标签化的植物的方法
本实施例描述了为了生成经激活标签化的植物，如何能将玉米激活标签化构建体如pEPS3004(上文所描述的)整合到植物(例如玉米)基因组中。
BC1穗(T0植物B104之间的杂交)的表型提供了转座的遗传学证据。具有全黄色种子的BC1穗指示了没有发生转座子的转座，而具有黄色和紫色颗粒的BC1穗指示发生了配子转座(图4)，且具有黄色和紫色斑点的种子的BC1穗指示发生了体细胞转座。具有黄色、紫色和紫色斑点种子的组合的BC1穗指示体内发生了配子转座和体细胞转座两者。对271个T0B104植物与野生型B104花粉之间的遗传杂交种的分析揭示了如表3中显示的4种切离/转座表型。
表3.
这些遗传测试确认了对从使用Spm-ZeaTAG载体的胚转化再生而来的B104转基因植物中转座子切离的生化和分子分析的结果。
为了评估转座子是否在BC1代中保持活性且为了增加含有活性转座子的种子的量，将显示体细胞转座(有紫色斑点的黄色种子)的来自68个事件的约5000个BC1颗粒种植在Molokai,HI的田野中。约95%的种子发芽，用Assure II喷洒幼苗(AAD1除草剂抗性基因提供了对含有喹禾灵(quizalofop)的Assure II的抗性)以除去任何可能存在于群体中的非转基因幼苗。如预期的，没有幼苗对Assure II敏感。允许植物生长至成熟并与B104回交以生成BC2种子。从来自67个事件的约4000株植物收集穗。如前文所述，表征来自这些穗的粒的种子表型。表4中列出了表型；亦参见图5。
表4.
Figure BDA00003133816600442
这些结果指示了在99.7%的BC1代中，转座子在体细胞或胚组织中都在活跃地转座，并且配子的切离在26.3%的植物中发生。此外，44%的事件显示出至少30%的配子切离频率(例如至少30%来自该事件的植物生成具有至少一个紫色颗粒的穗)。
对来自展现出配子切离事件的植物的紫色颗粒进行筛选以确定它们是否含有转座子。如果切离的转座子的整合发生在不与构建体最初插入的位点遗传连锁的位点处，那么～50%的紫色种子会含有除草剂抗性基因。将来自20个事件的200个紫色颗粒(20个事件每个有10株植物)种植在温室中。用Assure II喷洒这些植物以选择含有除草剂抗性基因的植物。百分之八十五(85%)的事件(17个事件)所含的分离比与抗性对易感植物的1:1分离比(χ检验>0.05)一致，这符合以下假设，即它们所包含的含有除草剂抗性基因的可转座元件位于不连锁于转化整合位点(含有花色素苷标志基因)的位置。一个事件分离出8个抗性对1个易感(1个未发芽)，表明可转座元件整合在连锁于转化整合位点的位点。另外2个事件分离出0个抗性对10个易感和1个抗性对9个易感，表明可选择标志在这些事件中可能整合到不利的位点中，或者该抗性标志已被沉默。
这些遗传测试确认了对B104转基因植物中转座子切离的生化和分子分析的结果，所述转基因植物是从使用Spm-ZeaTAG载体的胚转化再生而来的，并且Spm-ZeaTAG载体中的转座子是从整合的最初位点转座且整合到玉米基因组中非遗传连锁的位置中。
实施例6：对ZeaTAG种群的正向遗传筛选
本实施例描述了针对改变的表型对ZeaTAG种群的正向遗传筛选。
干旱胁迫筛选
为了鉴定出含有赋予干旱耐受性的突变的ZeaTAG系，将来自单独的ZeaTAG事件的植物种植在田野中。在生长周期的繁殖阶段(reproductivephase)(在开花前约2周至开花后约2周)不给水以导致干旱胁迫。目的是在开花阶段实现4周的胁迫期。使用环境建模，基于土壤湿度监测和天气数据(空气温度、蒸汽压差、风速和净辐射)来预测准确的玉米蒸发蒸腾需求。监测植物的干旱症状，如由视觉观察看到的叶卷曲、由红外温度计测出的增加的叶温度、由叶绿素荧光测出的减少的光合作用、和通过测量谷物生产测出的减少的产量。鉴定出在水胁迫条件下显示出显著更少的叶卷曲、更低的叶温度、更高的光合作用速率或具有显著更高的产量的植物并用在后续筛选中。
将展现出显著更高的干旱耐受性的ZeaTAG事件种植到复制的田间试验中以确认干旱耐受表型。将这些事件种植在随机化的具有至少3次重复的分裂区组设计中。将一个区组用足以预防水胁迫的水灌溉。将另一个区组在如上文所描述的缺水条件下生长。监测植物的叶卷曲、增加的叶温度、降低的光合作用和降低的产量，如上文所描述的。比未经转化的对照植物具有显著更少的叶卷曲、更低的叶温度、更多的光合作用或更高的产量的植物被视为已经通过了二次筛选。
氮使用效率筛选
为了鉴定出比非转基因的对照植物具有更高的氮使用效率的ZeaTAG事件，实施初次筛选。将包含约40,000个含有ZeaTAG的事件的植物在氮缺乏条件下生长在田间。植物以每英亩少于35lbs N生长在田间。通过视觉检查缺绿症、通过红外温度计测出叶温增加、和通过谷物收获测出产量减少来监测植物。将这些参数与非转基因的对照植物进行比较。在二次筛选中评估比非转基因的对照系显示出缺绿症更少、叶温更低、光合作用速率更高或产量更高的植物。
作为二次筛选，将展现出显著更高的氮使用效率的ZeaTAG事件种植到复制的田间试验中以确认表型。将这些事件种植在随机化的具有至少3次重复的分裂区组设计中。将一个区组用足以预防氮胁迫的氮肥灌溉。将另一个区组在如上文所描述的缺氮条件下生长。通过视觉检查缺绿症、通过红外温度计测出叶温增加、和通过谷物收获测出产量减少来监测植物。比未经转化的对照植物具有更少的缺绿症、更低的叶温、更高的光合作用速率或更高产量的植物被视为已经通过二次了筛选。
一旦已经在二次筛选中确认了表型，则通过筛选经转化的亲本系和ZeaTAG系之间的杂交后代来测试表型与ZeaTAG插入的遗传连锁。当含有ZeaTAG元件的植物展现出该表型而不含有ZeaTAG元件的植物不展现该表型时，该表型被视为与插入遗传连锁并且可能是由ZeaTAG元件导致的。为了鉴定出其表达可能受ZeaTAG元件影响的基因，确定基因组内ZeaTAG元件的位置。
通过分离出侧翼于ZeaTAG元件的基因组序列并将这些序列与玉米的基因组序列进行比较测定ZeaTAG元件的基因组位置。可以通过许多分子生物学技术来测定侧翼于ZeaTAG元件的序列，包括但不限于，反向PCR(iPCR)(Ochman等,Genetics,120:621-6231988),TAIL(Liu等,Plant Journal8:457-463,1995)和连接介导的PCR(LMPCR)(Prod'hom等,FEMS MicrobiolLett.158:75-81,1998)。通过序列比对工具如BLAST将这些序列与基因组序列比较以鉴定出ZeaTAG元件在基因组内的位置。
通过检查注释的基因组来确定侧翼于ZeaTAG元件、或被其打断的基因。侧翼于ZeaTAG元件的基因的转录可能负责突变表型。可以将这些基因在野生型玉米中过表达以测试它们是否赋予类似的表型。为了对此进行测试，将这些基因克隆到由强启动子或其自身启动子驱动的转化载体中，它们侧翼有增强子序列以增强转录。将这些载体通过转化引入到野生型玉米中，并测试由此转化所得的植物的表型。
类似地，被ZeaTAG元件打断的基因可能导致表型。为了确认由该元件打断的基因负责该表型，可以破坏该基因的表达并测试含有该破坏的植物的表型。可以通过许多本领域中技术人员已知的方法来完成对特定基因表达的破坏，包括但不限于反义RNA、人工微小RNA和通过TILLING鉴定基因中的突变。
实施例7：对ZeaTAG种群的反向遗传筛选
本实施例描述了针对突变对ZeaTAG群体的反向遗传筛选。
反向遗传筛选是寻找影响特定基因的突变并随后测试鉴定出的种系的突变表型。可以以数种方式在反向遗传分析中使用ZeaTAG群体，包括但不限于生成群体的侧翼序列标签集(Jeong等,The Plant Journal45:123–132,2006)，和从ZeaTAG群体生成经标引(indexed)的DNA合并样品集(May等,Molecular Biotechnology20:209-221,2002)。
如下生成侧翼序列标签集：从ZeaTAG群体进行叶组织采样，分别从中分离DNA，鉴定侧翼于插入的序列，并将序列存储到可搜索的数据库中，其中序列被链接到它们所来源的事件。使用Qiagen DNAeasy植物试剂盒(Qiagen,Germantown,Maryland)，使用由制造商推荐的方案来分离基因组DNA。使用如由Yephremov和Saedler修改的(Plant Journal21:295-305,2000)连接介导的PCR(Mueller等,Science246:780-786,1989)来鉴定侧翼于插入序列的序列。简言之，将来自ZeaTAG系的基因组DNA用限制酶消化片段化并变性。将与ZeaTAG元件末端处的序列互补的生物素化的寡核苷酸引物杂交到片段化的DNA并通过DNA聚合酶延伸。向混合物加入链霉亲和素包被的磁珠以结合含有从该引物延伸的DNA片段的DNA片段。将已知序列的双链DNA接头连接到未知末端。将这些片段进行PCR扩增，其使用与ZeaTAG元件内序列及另一端处的DNA接头互补的寡核苷酸。然后测定PCR片段的序列并通过BLAST定位到玉米基因组序列。这些序列确定了ZeaTAG元件插入的位点的位置。～10kbp内的基因会被ZeaTAG元件内的增强子序列上调。
可以通过搜索数据库来鉴定出在假设导致表型的基因中或附近处含有插入的植物。可以测试含有这些事件的植物的表型。
考虑到可以应用所披露技术的原理的许多可能的实施方案，会认识到例示的实施方案仅仅是本发明的优选实施例，且不应理解为限制其范围。相反而言，本发明的范围由下列权利要求限定。因此，我们将所有来自这些权利要求的范围和精神中的内容作为我们的发明来要求保护。

Claims (19)

1.一种玉米激活标签化DNA构建体，包含：
转座酶的编码序列；
可检测的报道物编码区，其包含：
可操作地连接于第一高水平组成型启动子的编码花色素苷调节基因B-Peru的序列；和
可操作地连接于第二高水平组成型启动子的编码花色素苷调节基因C1的序列；和
非自主型可转座的T-DNA盒，其插入所述可检测的报道物编码区中，使得所述B-Peru和C1基因仅在所述可转座盒切离时才在含有所述玉米激活标签化DNA构建体的细胞中表达花色素苷，所述可转座盒包含：
成对的转座酶DNA底物，它们之间布置有：
转录增强子元件；以及任选地
可操作地连接于所述转录增强子元件的编码可选择标志的序列。
2.权利要求1的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述成对的转座酶DNA底物是玉米Spm可转座元件的5’和3’末端反向重复(TIR)，且所述转座酶是玉米Spm。
3.权利要求1的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述转录增强子元件包含至少2个拷贝的甘蔗杆状病毒(SCBV)增强子。
4.权利要求3的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述转录增强子元件包含4个拷贝的SCBV增强子。
5.权利要求1的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述第一或第二高水平组成型启动子是组织特异性的启动子。
6.权利要求5的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述第一或第二高水平组成型组织特异性启动子是球蛋白1启动子。
7.权利要求1的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述可选择标志是AAD1。
8.权利要求1的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述构建体具有如由SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
9.一种玉米激活标签化DNA构建体，包含：
玉米Spm转座酶的编码序列；
报道物编码区，其包含：
可操作地连接于第一球蛋白1启动子的编码花色素苷调节基因B-Peru的序列；和
可操作地连接于第二球蛋白1启动子的编码花色素苷调节基因C1的序列；和
非自主型可转座的T-DNA盒，其插入到所述报道物编码区中，使得其破坏所述B-Peru基因、C1基因或B-Peru和C1基因两者的表达，所述可转座盒包含：
玉米5’和3’Spm末端反向重复(TIR)，它们之间布置有：
4个拷贝的甘蔗杆状病毒(SCBV)转录增强子；和任选地
可操作地连接于所述转录增强子的编码可选择的标志的序列；
其中Spm介导的所述可转座的T-DNA盒的切离恢复所述受破坏的B-Peru和/或C1基因的表达。
10.生成带标签的玉米植物群体体的方法，所述方法包括用权利要求1-9中任一项的构建体来转化玉米植物细胞或组织。
11.权利要求10的方法，其进一步包括鉴定带标签的玉米植物群体。
12.权利要求11的方法，其中鉴定带标签的玉米植物群体包括测量经转化的玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量并将其与对照玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量进行比较。
13.权利要求11的方法，其中鉴定带标签的玉米植物群体包括在所述带标签的玉米植物群体中鉴定配子转座、体细胞转座或其组合。
14.权利要求13的方法，其进一步包括基于表型从带标签的群体鉴定带标签的玉米植物。
15.通过权利要求10-13中任一项的方法生成的带标签的玉米植物群体。
16.可以从权利要求15的带标签的玉米植物群体获得的植物细胞、颗粒、叶、根、芽、花、种子、插条和其它可用于有性或无性繁殖的繁殖材料、包括F1杂交种的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物和植物产物。
17.生成带标签的玉米植物的方法，所述方法包括用权利要求1-9中任一项的构建体来转化玉米植物细胞或组织。
18.权利要求17的方法，其进一步包括通过测量经转化的玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量并将其与对照玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量进行比较来鉴定出带标签的玉米植物。
19.可以从权利要求17或18的带标签的玉米植物获得的植物细胞、颗粒、叶、根、芽、花、种子、插条和其它可用于有性或无性繁殖的繁殖材料、包括F1杂交种的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物和植物产物。
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