CN108950046A - 玉米隐性核雄性不育突变基因ms1的功能标记及其应用 - Google Patents

玉米隐性核雄性不育突变基因ms1的功能标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种玉米核雄性不育基因ms1的功能标记、功能标记开发方法及其应用。本发明根据突变体基因ms1的突变位点设计了包括但不限于ms1‑IN1、ms1‑IN2两个功能标记，可以特异性检测玉米突变体ms1‑alb及由其转育的玉米不育材料中的突变基因ms1。利用ms1‑IN1、ms1‑IN2或其它类似的功能标记，与对应的野生型等位基因Ms1的功能标记Ms1‑1、Ms1‑2或其它类似的功能标记，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳检测即能快速鉴定样本中核雄性不育基因Ms1等位基因的情况。利用本发明设计的功能标记能够准确检测和标记玉米核雄性不育基因ms1或可育基因Ms1的等位基因型，可用于雄性不育株系的鉴定、目标单株的筛选，在玉米雄性不育系培育、不育化杂交制种和分子标记辅助选择中具有重要的应用价值，对提高玉米杂交育种和制种效率、保障制种质量等方面具有重要意义。

Description

玉米隐性核雄性不育突变基因ms1的功能标记及其应用
技术领域
一般地，本发明属于作物分子育种、分子生物学和基因工程领域。具体涉及一种玉米隐性核雄性不育基因ms1的功能标记、功能标记开发方法及与应用。
背景技术
植物雄性不育(male sterility, MS)是指在高等植物中，雄性器官发育异常，无法产生有功能的雄配子（花粉），但雌性器官发育正常，能接受正常雄配子而受精结实，并能将该不育性遗传给后代的现象。
玉米是重要的粮食作物，其雄性不育材料对玉米的雄花发育机理研究、遗传育种应用、杂种优势研究和应用方面都有重要价值。玉米雄性不育按照不育性遗传方式的差异，可分为3类：细胞质雄性不育、细胞核雄性不育和质核互作雄性不育，其中细胞核雄性不育还可分为显性核不育和隐性核不育，而且以后者为主。由于细胞质母体遗传的原因，细胞质不育基因的F1不能自交结实，因而不能在育种和生产上利用；利用常规杂交育种技术，细胞核雄性不育系的保持和繁殖存在困难，也不能在育种和生产上有效利用；质核互作不育基因，理论和实践上都可以被育种利用，但是该类基因的广泛利用会导致杂交种细胞质单一化，易受专一性病原小种的侵染而导致杂交玉米生产存在巨大的风险。因此，目前国内外玉米杂交育种的父母本大多是可育的自交系，杂交制种时需要对母本进行人工或机械除雄，大大增加了制种成本，同时杂交种纯度也难以得到保障。
随着现代生物技术的快速发展，利用作物分子设计技术，并结合常规育种方法，有望将隐性核不育基因有效利用起来。为了能够使核不育基因得到育种利用，必须找到核不育后代早期诊断不育性的标记性状从而尽早区分核不育系。因此，从发现玉米隐性核不育材料时起，人们就利用传统育种技术途径，对核不育基因进行了多种标记性状的探索研究，如利用标记性状与不育性的紧密连锁关系，开发了粒色标记系统法、黄绿苗连锁标记法和多花丝连锁标记体系等，但是由于标记性状与不育性连锁不完全、标记性状鉴定困难、鉴定时期滞后等问题，这些方法和尝试在玉米生产上并没有得到推广应用。分子标记，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，狭义的分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特定DNA片段。随着分子标记技术的发展，通过定位克隆获得与玉米重要性状连锁的分子标记或者功能性共分离分子标记，对玉米的基因型鉴定、品种的遗传背景选择、目标单株筛选、品种的遗传改良和纯度鉴定以及克隆雄性器官分化控制基因等方面有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组能够准确检测和标记玉米隐性核雄性不育基因ms1的分子标记，所提供的分子标记是根据不育突变体的基因突变位点设计，属于功能性共分离分子标记，与不育基因ms1共分离，可用于植株的育性等位基因鉴定、分子标记辅助育种中目标单株的筛选和种子纯度鉴定等。
本发明的目的之一：在于提供一种由于育性相关转录因子Ms1突变获得的完全雄性不育材料。
本发明的目的之二：在于提供这种突变材料的基因突变位点。具体的，其基因突变是由于在转录起始位点之前启动子区有一段3980bp的转座子插入引起。
本发明的目的之三：在于提供根据上述ms1突变位点开发ms1功能性分子标记的方法。
本发明的目的之四：在于提供根据上述突变位点开发的一组功能性分子标记，包括但不限于ms1-IN1、ms1-IN2和Ms1-1、Ms1-2，其中ms1-IN1、ms1-IN2能特异检测突变等位基因ms1，而Ms1-1或Ms1-2能鉴别野生型等位基因Ms1。
进一步地，开发的分子标记ms1-IN1、ms1-IN2和Ms1-1、Ms1-2以及其它类似的功能性共分离标记包括但不限于以下六条引物序列：
ms1-IN-1F：TGAGCGGCTTGTTGGGCGAG
ms1-IN-1.2R：GGCTGCATCTGGAGCGGTGG
ms1-IN-2F：AAGCACGGCCCGGATCAAGC
ms1-IN-2.2R: CACCTGCAGGCGCTGCTCTT
ms1-IN-2.1R：CAGAGCTGCTGCCGGTGCAT
ms1-IN-2.3R：CCTGCAGGCGCTGCTCTTGT
其中ms1-IN-1.2R和ms1-IN-2F根据ms1的插入序列所设计，分子标记ms1-IN1（ms1-IN-1F/ms1-IN-1.2R）和ms1-IN2（ms1-IN-2F/ms1-IN-2.2R）能够特异性检测突变型ms1位点，分别扩增出602bp和945bp大小的条带，从而确定不育基因ms1的存在。Ms1-1（ms1-IN-1F/ms1-IN-2.1R）和Ms1-2（ms1-IN-1F/ ms1-IN-2.3R）可特异性检测野生型Ms1基因，分别扩增出763bp和937bp大小的条带。
本发明的目的之五：在于提供一种利用上述突变材料开发和选择不同遗传背景下的玉米雄性不育材料的方法。具体的，利用带有上述突变ms1基因的材料做母本，不同优良遗传背景的自交系作为父本，杂交后代与父本自交系连续回交多代，每次回交之前用标记选择带有ms1基因的单株，以获得不同遗传背景下的玉米ms1雄性不育材料，提高杂种优势的利用范围。
本发明的目的之六：在于在开发和选择不同遗传背景下ms1雄性不育材料过程中，利用上述开发的分子标记进行分子标记辅助选择，加快玉米不育材料的选育进程和提高选择效率。
本发明的目的之七：在于利用上述开发的分子标记在上一批种子收获后或下一代苗期快速检测玉米Ms1等位基因，筛选特定ms1雄性不育单株；
本发明的目的之八：在于上述开发的功能性分子标记在玉米ms1雄性不育亲本纯度鉴定中的应用，以及检测玉米杂交种是否带有ms1不育等位基因，以判断杂交种的纯度。
附图说明
图1为玉米Ms1野生型（左）和ms1突变体ms1-alb（右）的雄穗、小花（花药）表型比较图及花粉碘-碘化钾染色对比图。
图2为玉米Ms1野生型和ms1-alb突变型基因的结构示意图，ms1-alb的突变基因ms1在启动子区-51位点有一段3980bp的转座子序列插入。
图3为玉米Ms1与ms1 DNA序列比对图及本发明中开发的分子标记ms1-IN1、ms1-IN2和Ms1-1、Ms1-2涉及到的6条引物在基因中的位置示意图以及各标记名称对应的引物序列及扩增产物大小。
图4和图5为分子标记ms1-IN1、ms1-IN2和Ms1-1、Ms1-2的可行性验证，利用Ms1/ Ms1纯合野生型、Ms1/ms1杂合型和ms1/ms1纯合突变型材料进行分子标记的多态性验证。
其中，图4为分子标记ms1-IN1和Ms1-2的验证结果，M为Marker，1、2、3、4为Ms1/Ms1纯合可育株，5、6、7、8为Ms1/ms1杂合可育株，9、10、11、12为ms1/ms1纯合隐性不育株，分子标记ms1-IN1（引物组合ms1-IN-1F/ms1-IN-1.2R）在ms1纯合隐性不育株（基因型ms1/ms1）DNA中可特异扩增一条602bp的条带，Ms1-2（引物组合ms1-IN-1F/ms1-IN-2.3R）在纯合可育株（基因型Ms1/Ms1）基因组DNA中的PCR扩增产物分子量大小为937bp，在杂合可育株（基因型Ms1/ms1）中则同时检测出上述两种分子量大小的条带，图5为分子标记ms1-IN2和Ms1-1的验证结果，B73为野生型，ms1-alb为ms1/ms1纯合不育系，F1为二者杂交获得的杂合可育系，其中，A为使用Ms1-1扩增结果，B为ms1-IN2扩增结果，标记ms1-IN2（引物组合ms1-IN1-2F/ms1-IN1-2.2R）在ms1位点的纯合隐性不育株（基因型ms1/ms1）基因组DNA中可特异扩增一条945bp的条带，而Ms1-1（引物组合ms1-IN1-1F/ms1-IN1-2.1R）在纯合可育株（基因型Ms1/Ms1）基因组DNA中的PCR扩增产物分子量大小为763bp，在杂合可育株（基因型Ms1/ms1）中则能够同时检测出上述两种分子量大小的条带。
图6为利用分子标记ms1-IN2与Ms1-1对杂合可育株（基因型Ms1/ms1）自交F2群体部分材料在苗期进行Ms1等位基因的检测结果，其中，A为使用Ms1-1的扩增结果，B为使用ms1-IN2的扩增结果，只能扩增出945bp条带的材料为纯合不育系（ms1/ms1），只能扩增出763bp的材料为纯合可育系（Ms1/Ms1），两条带都能扩增出的材料为杂合可育型（Ms1/ms1），其中，材料3、4、6、7、11、18育性检测为完全雄性不育，与苗期基因型鉴定结果一致。
图7为利用分子标记ms1-IN1与Ms1-2对杂合可育株（基因型Ms1/ms1）自交F2群体部分材料在苗期进行Ms1等位基因检测的结果，每个材料A泳道为Ms1-2扩增结果，B泳道为ms1-IN1扩增结果，只能扩增出602bp条带的材料为纯合不育系ms1/ms1，只扩增出937bp的材料为纯合野生型可育系Ms1/Ms1，两条带都能扩增出的材料为杂合型Ms1/ms1。根据扩增结果对材料进行了标注，S代表材料为纯合不育系（ms1/ms1），F代表材料为纯合可育系（Ms1/Ms1），H代表材料为杂合可育系（Ms1/ms1）。其中，经过后期育性鉴定发现，所有基因型为S的单株都表现为完全雄性不育，F和H基因型的单株都雄性可育，证明共分离标记的有效性。
图8为利用分子标记辅助选择的方法通过回交转育创制新遗传背景的玉米ms1核雄性不育系的过程示意图。
图9为利用分子标记ms1-IN1和ms1-IN2检测回交转育过程中带有ms1突变等位基因材料（Ms1/ms1）的部分结果，本发明中，需要检出的是带有ms1等位基因的杂合基因型材料，因此使用开发的两个分子标记ms1-IN1和ms1-IN2进行了双重验证。每个材料A泳道为ms1-IN1扩增结果，B为ms1-IN2扩增结果，其中材料2、5、6、7、10、11的两个标记均检测为阳性，为带有ms1的杂合型材料(Ms1/ms1)。
图10为利用开发的功能标记进行ms1不育系种子纯度鉴定的部分材料的检测结果，利用Ms1的功能标记Ms1-2和ms1的功能标记ms1-IN1对每一个材料进行检测，其中，箭头标记的材料中，Ms1-2和ms1-IN1都检测出阳性，为不育系（ms1/ms1）种子中混入的杂合型可育种子（Ms1/ms1）。
具体实施方式
下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：获得玉米雄性不育突变材料
本发明的供试材料是玉米B73自交系的Ms1基因突变获得的不育株，由转座子插入的方法获得。获得的不育系表现为完全无花粉型雄性不育，如图1所示，其表现具体为：花药变小、发白、花粉不能被碘-碘化钾染色。该不育系材料命名为ms1-alb。
实施例2：ms1突变位点分析及其功能标记的开发
雄性不育材料ms1-alb是Ms1位点突变所致。如图2所示，突变基因ms1的编码区与野生型没有任何差异，但是在ms1基因起始密码子上游-51位点处插入了一段长度为3980bp的转座子序列DTA-ZM00023。
根据转座子插入的位置和序列，利用引物设计软件，可开发出一系列针对野生型Ms1和突变型ms1基因的特异的功能性共分离分子标记。引物序列包含在插入的转座子序列DTA-ZM00023中或者跨越转座子边界都能够作为ms1突变基因的分子标记。PCR产物在转座子侧翼的引物序列，或者PCR产物跨越整个转座子的引物序列，由于插入的转座子片段太长而不能进行有效的扩增，因而可以作为Ms1特异的功能标记。
实施例3：功能标记ms1-IN1、ms1-IN2和Ms1-1、Ms1-2的开发
在本发明中，针对ms1突变位点，利用Primer5.0软件进行引物设计，开发出4对功能性分子标记：ms1-IN1、ms1-IN2和Ms1-1、Ms1-2。其中，ms1-IN1、ms1-IN2均能够特异性检测核雄性不育材料ms1-alb的突变基因ms1。Ms1-1、Ms1-2为野生型Ms1基因的检测标记。各个标记扩增引物的位置示意图如图3A所示，各个标记扩增引物在ms1基因序列中对应的具体位置如图3B所示，标记名称对应的引物序列及扩增产物大小如图3C所示。
突变体功能标记ms1-IN1包括第一引物ms1-IN-1F和第二引物ms1-IN-1.2R，能够在ms1突变基因中扩增出602bp的条带：ms1-IN-1F：TGAGCGGCTTGTTGGGCGAG
ms1-IN-1.2R：GGCTGCATCTGGAGCGGTGG
突变体功能标记ms1-IN2包括第一引物ms1-IN-2F和第二引物ms1-IN-2.2R，能够在ms1突变基因中扩增出945bp的条带：ms1-IN-2F：AAGCACGGCCCGGATCAAGC
ms1-IN-2.2R: CACCTGCAGGCGCTGCTCTT
野生型功能标记Ms1-1包括第一引物ms1-IN-1F和第二引物ms1-IN-2.1R，能够在野生型Ms1基因中扩增出763bp的条带：
ms1-IN-1F：TGAGCGGCTTGTTGGGCGAG
ms1-IN-2.1R：CAGAGCTGCTGCCGGTGCAT
野生型功能标记Ms1-2包括第一引物ms1-IN-1F和第二引物ms1-IN-2.3R，能够在野生型Ms1基因中扩增出937bp的条带：
ms1-IN-1F：TGAGCGGCTTGTTGGGCGAG
ms1-IN-2.3R：CCTGCAGGCGCTGCTCTTGT
开发的四个功能标记ms1-IN1、ms1-IN2和Ms1-1、Ms1-2在Ms1纯合可育株（基因型Ms1/ Ms1）、杂合可育株（基因型Ms1/ms1）和纯合不育株（基因型ms1/ms1）基因组DNA的Ms1等位基因位点扩增的条带大小总结如表1所示。其中，Ms1-1和Ms1-2标记由于正向引物和反向引物之间跨越了突变体的整个插入片段，因而理论上在ms1突变基因中应该分别扩增出4582bp和4917bp的产物，而实际上，在一般PCR体系中扩增不出这么长的片段，因而表现为无扩增产物。利用PCR和琼脂糖凝胶电泳检测的方法，根据获得的条带及大小情况即可判断Ms1位点等位基因的情况。
表1. 四个功能标记扩增的条带大小总结
Ms1/Ms1 Ms1/ms1 ms1/ms1
ms1-IN1 - 602bp 602bp
ms1-IN2 - 945bp 945bp
Ms1-1 763bp 763bp -
Ms1-2 937bp 937bp -
实施例4：功能标记ms1-IN1、ms1-IN2和Ms1-1、Ms1-2的可行性验证
对实施例3中开发的4个功能标记进行验证。
首先，利用ms1-IN1结合Ms1-2进行Ms1等位基因的检测。所用材料包括：纯合ms1突变材料ms1-alb、以ms1-alb（母本）×昌7-2（父本）获得的杂交F1代、纯合野生型材料昌7-2。
其中，玉米叶片DNA提取方法如下。1）剪取适量叶片并剪碎，放入事先写好编号的2.0ml离心管中，加入一颗钢珠。2）按顺序将已放入叶片和钢珠的离心管摆放在打样仪专用的离心管架（8×5）上，整体浸泡在盛有液氮的保鲜盒中1-2min（注：液氮以刚没过离心管架少许为宜）。3）将冷冻好的离心管架放入打样仪（Thmorgan cell killer ck-1000）的卡槽中，拧紧，关盖，1200转/min的速度打样20s。4）用吸铁石吸出离心管中的钢珠。5）加入700μLCTAB提取液（65℃预热），65℃水浴30min，中间取出颠倒1-2次。6）加入700μL氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀，小心标记不要被擦掉（注：氯仿为腐蚀性试剂，需要带PE一次性手套在通风橱中操作）。7）12000 rpm离心5min至清晰分相。吸取上清液400μL，转入新的1.5mL微量离心管中(预先加入800μl预冷的无水乙醇)，弃枪头，盖紧盖子，写好编号并检查无误，上下颠倒混匀。-20℃冰箱中放置30min。8）12000 rpm离心10min至沉淀附于离心管底部，弃上清液。9）70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5mL微量离心管倒置于平铺于桌上的纸上，自然干燥。10）加入100-200μL的1×TE缓冲液或ddH2O溶解沉淀。11）样品置于-20℃冰箱中保存备用。
利用设计的引物对所获得的DNA进行PCR扩增，方法和程序如下：1）先打开制冰机的水源开关，再打开制冰机的电源开关，制冰。2）将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：PCR缓冲液、dNTP溶液、正反向引物溶液以及模板DNA（注：当某一试剂完全解冻，即放置于冰上。经常用的ddH2O、引物工作液、模板DNA 以及少量PCR缓冲液、dNTP溶液可放于4℃冰箱中）。3）所有试剂解冻完毕后，8000 rpm离心数秒，放回冰上待用。4）配制PCR反应的混合液，按照下表依次加入各试剂（反应体系为10μL）。下表2同时列出了1个反应（1R）、10个反应（10R）、50个反应（50R）、100个反应（100R）的混合液配方。配好后将所有试剂放回4℃或-20℃冰箱（注：Taq聚合酶需小心操作，临用前从-20℃冰箱中取出，用时需置于冰上，用完后立即放回-20℃冰箱中）。5）混匀，8000 rpm离心数秒。6）将混合液分装至200μL PCR反应管中，再加入1μL模板DNA，做好标记（注：如果不使用热盖功能，为防止样品蒸干，需最后加入约20μL石蜡油或盖上PCR管盖）。7）将PCR反应板（管）插入PCR扩增仪的200μL 孔中，合上热盖，旋紧。8）打开PCR扩增仪电源开关，选择预设的反应程序(如表3)，开始扩增。9）扩增完后，退出反应程序，回到主菜单，关闭电源开关。打开热盖，取出PCR反应管，置于PCR管架上，放入4℃冰箱中，待用。
表2. PCR反应体系
成分 母液浓度 终浓度 1 R 10R 50R 100R
DNA模板 1μL 10μL 50μL 100μL
PCR缓冲液 10倍 1倍 1.5μL 15μL 75μL 150μL
dNTP溶液 10mM 0.2 mM 0.3μL 3μL 15μL 30μL
正向引物 10um/L 0.2um/L 0.3μL 3μL 15μL 30μL
反向引物 10um/L 0.2um/L 0.3μL 3μL 15μL 30μL
DMSO 0.1μL 1μL 5μL 10μL
Taq聚合酶 5U/μL 0.05U 0.2μL 2μL 10μL 20μL
灭菌水 11.3μL 113μL 565μL 1130μL
总共 15.0μL 150μL 750μL 1500μL
表3. PCR扩增条件
步骤 温度（℃） 时间 循环数 作用
1 94 5min 1 变性
2 94 30s 1 变性
3 56 30s 1 退火
4 72 30s 1 延伸
5 回到步骤2 再加30个循环
6 72 5分钟 1 延伸
7 10 10分钟 低温保存
注：不同引物的退火温度不同，一般都在56℃-60℃之间。
PCR结果如图4所示。其中，1、2、3、4为野生型材料昌7-2，5、6、7、8为杂合可育材料，9、10、11、12为纯合不育材料ms1-alb。结果表明，材料1-4只能扩增出野生型材料特异条带937bp，9-12只能扩增出突变型材料特异条带602bp，而杂合材料5-8两条带都能扩增出。PCR条带表现与预期完全相符，证明设计的分子标记ms1-IN1和Ms1-2具有很好的特异性，完全可用。
利用突变材料ms1-alb、野生型B73、二者的杂交F1代材料进行分子标记ms1-IN2和Ms1-1的可行性验证，结果如图5所示。ms1-IN2在ms1-alb突变材料和F1代材料中都检测到了945bp的特异条带，而Ms1-1在野生型B73材料以及F1材料中都检测到了763bp的特异条带。因此，分子标记ms1-IN2和Ms1-1能够分别特异性检测突变基因ms1和野生型基因Ms1。
实施例5：分别利用功能标记ms1-IN2与Ms1-1、ms1-IN1与Ms1-2在苗期鉴定Ms1位点的纯合野生型、杂合型和纯合不育系材料
将ms1的杂合型材料Ms1/ms1自交，理论上可获得分离比为1:2:1的Ms1/Ms1、Ms1/ms1和ms1/ms1单株，其中ms1/ms1为纯合隐性不育系。本发明分别利用功能性分子标记ms1-IN2与Ms1-1、ms1-IN1与Ms1-2，对上述材料在苗期进行了基因型鉴定。
杂合型Ms1/ms1自交获得F2群体。取叶片提取基因组DNA，利用诊断标记ms1-IN2和Ms1-1对874份材料进行了PCR鉴定，图6为部分材料的鉴定结果。结果发现Ms1/Ms1、Ms1/ms1和ms1/ms1分离比为217:460:197，卡方检验结果X2=1.707，P=0.4259，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms1/Ms1、Ms1/ms1和ms1/ms1分离比符合1：2：1规律。而且，仅有B条带（ms1-IN2的扩增产物）的单株在后期育性检测中表现为完全雄性不育，仅有A条带（Ms1-1的扩增产物）或同时具有A、B条带的单株在后期表现为可育。
同样，利用分子标记ms1-IN1和Ms1-2对457份F2代材料进行基因型鉴定，部分结果如图7所示。Ms1/Ms1、Ms1/ms1和ms1/ms1分离比为91:240:126，卡方检验结果X2=3.491，P=0.1745，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms1/Ms1、Ms1/ms1和ms1/ms1分离比符合1：2：1规律。而且，仅有B条带（ms1-IN1的扩增产物）的单株在后期育性检测中表现为完全雄性不育，仅有A条带（Ms1-2的扩增产物）或同时具有A、B条带的单株在后期表现为可育。
实施例6：利用功能标记ms1-IN1和ms1-IN2进行分子标记辅助选择
利用所述玉米核雄性不育突变材料，培育不同遗传背景下的优良不育系，具体方法如下：以具有玉米隐性核雄性不育基因ms1的玉米材料为母本，以不同遗传背景材料为父本进行杂交，杂交F1代（Ms1/ms1）与父本材料（Ms1/Ms1）进行回交，每一轮回交都利用上述开发的功能标记ms1-IN1和ms1-IN2同时选择带有ms1基因的后代进行回交，重复回交4-5次后，可获得既带有ms1基因同时又具有轮回亲本遗传背景的新材料（Ms1/ms1），再进行自交一次，利用功能标记ms1-IN1和ms1-IN2结合表型选择ms1纯合不育系，即可获得新的遗传背景下的ms1核雄性不育系（回交转育示意图如图8所示）。
本发明利用1428份优良玉米自交系与不育系ms1/ms1进行杂交，获得的杂交一代Ms1/ms1继续与相应的优良自交系回交。本发明中检测了回交1代BC1F1中282份材料，并利用本发明开发的ms1特异性功能标记ms1-IN1和ms1-IN2同时进行了重复检测。ms1-IN1和ms1-IN2在ms1-alb突变体中ms1等位基因中获得的条带分别为602bp和945bp。两个标记同时进行检测，部分代表结果如图9所示。其中，两条带都能检测到的是带有ms1的杂合可育株Ms1/ms1，都没有检测到条带的是纯合可育株Ms1/Ms1。结果表明，开发的两个分子标记ms1-IN1和ms1-IN2具有很好的重现性，在检测的材料中都获得了一致结果，说明二者都是稳定可靠的ms1特异性功能标记。进一步地，总结了282份材料的检测数据，Ms1/ms1和Ms1/Ms1分离比为159:123。卡方检验X2=2.307，P=0.1288，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms1/ms1与Ms1/Ms1分离比符合1：1规律。
实施例7：利用功能标记ms1-IN1和Ms1-2进行玉米不育系材料的纯度鉴定
不育系种子中混入可育材料会严重降低杂交制种获得的杂交种纯度。本发明利用开发的ms1功能标记ms1-IN1和Ms1功能标记Ms1-2在苗期对每一个材料进行检测，纯合不育系ms1/ms1只能扩增出602bp的 ms1-IN1标记产物，而可育材料会扩增出937bp的Ms1-2标记产物。部分结果如图10所示。其中，箭头标记的材料为检出的不育系ms1/ms1中混杂的杂合型种子，在这些材料中，分子标记Ms1-2和ms1-IN1都能检测出阳性条带。本实施例中共检测了239份不育系种子，检出混入的杂合型可育种子17份，表明该功能标记在种子纯度鉴定中具有重要应用价值。
总之，本发明开发的分子标记为玉米核雄性不育基因ms1的功能性分子标记，结合野生型基因Ms1的分子标记可快速检测Ms1等位基因情况。在回交转育过程中，利用分子标记辅助选择可在苗期直接检测出带有ms1基因的株系，快速筛选到目标单株，以加速回交转育进程，在利用分子标记辅助选择进行杂交种不育化制种中具有重要的应用价值。此外，开发的分子标记还可应用于杂交种不育亲本的纯度鉴定。
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序列表
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Claims (13)

1.一种玉米核雄性不育突变体ms1的功能标记ms1-IN1，其特征在于，所述功能标记包括但不限于第一引物ms1-IN-1F和第二引物ms1-IN-1.2R，ms1-IN-1F：TGAGCGGCTTGTTGGGCGAG；ms1-IN-1.2R：GGCTGCATCTGGAGCGGTGG。
2.一种玉米核雄性不育突变体ms1的功能标记ms1-IN2，其特征在于，所述功能标记包括但不限于第一引物ms1-IN-2F和第二引物ms1-IN-2.2R，ms1-IN-2F：AAGCACGGCCCGGATCAAGC；ms1-IN-2.2R: CACCTGCAGGCGCTGCTCTT。
3.一种编码玉米雄性发育相关转录因子的Ms1基因分子标记Ms1-1，其特征在于，所述标记包括但不限于第一引物ms1-IN-1F、第二引物ms1-IN-2.1R，ms1-IN-1F：TGAGCGGCTTGTTGGGCGAG；ms1-IN-2.1R：CAGAGCTGCTGCCGGTGCAT。
4.一种编码玉米雄性发育相关转录因子的Ms1基因分子标记Ms1-2，其特征在于，所述标记包括但不限于第一引物ms1-IN-1F、第二引物ms1-IN-2.3R，ms1-IN-1F：TGAGCGGCTTGTTGGGCGAG；ms1-IN-2.3R：CCTGCAGGCGCTGCTCTTGT。
5.权利要求1和2所述的分子标记，是根据一种玉米核雄性不育突变体ms1-alb的突变基因ms1的插入突变位点设计，是功能性分子标记，标记检出阳性代表突变基因ms1的存在。
6.权利要求3和4所述的分子标记，是野生型基因Ms1的分子标记，标记检出阳性代表野生型基因Ms1的存在。
7.权利要求5所述的核雄性不育突变体ms1-alb，其特征在于，其突变基因ms1位于玉米第6号染色体，对应野生型可育基因Ms1编码一种与玉米雄性发育相关的转录因子，其突变引起雄花败育。
8.与权力要求1、2、3、4类似的，根据本发明中的ms1基因的突变位点设计的其它与ms1基因共分离的功能标记及开发ms1功能标记的方法。
9.权利要求1、2、3、4和8所述的玉米雄性发育相关基因Ms1和突变基因ms1的分子标记分别在检测野生型Ms1和突变基因ms1中的作用。
10.权利要求1、2、3、4和8所述玉米雄性发育相关突变基因ms1的分子标记和权利要求5所述玉米核雄性不育基因ms1在玉米不育系育种和制种中的应用。
11.权利要求1、2、3、4和8所述玉米雄性发育相关突变基因ms1的分子标记应用于培育新的遗传背景下的玉米核雄性不育新品系的方法，其特征在于，以具有玉米核雄性不育基因ms1的玉米材料为母本，以其它优良性状玉米自交系为父本，通过杂交并经过多轮回交的方法获得新遗传背景下的玉米核雄性不育系，利用权力要求1或2和3或4以及8中所述的分子标记，在回交后代中选择同时具有玉米核雄性不育基因ms1、并且具有轮回亲本遗传背景的植株，经过多轮回交，最后通过自交和分子标记辅助筛选获得目标遗传背景下的ms1/ms1纯合隐性不育系，并利用该不育系与父本杂交培育玉米新品种。
12.权力要求1、2、3、4和8所述玉米雄性发育相关突变基因ms1的分子标记在快速检测玉米核不育基因ms1的等位基因中的应用。
13.权利要求1、2、3、4和8所述玉米雄性发育相关突变基因ms1的分子标记在玉米亲本纯度鉴定中的应用。
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