CN86104756A

CN86104756A - 基因性雄性不育玉米

Info

Publication number: CN86104756A
Application number: CN86104756A
Authority: CN
Inventors: 盖迪·S·布拉; 奥利弗; 纳尔逊
Original assignee: Agractus (us) 8520 University Green Middleton Wisconsin 53562 Usa
Current assignee: Agractus (us) 8520 University Green Middleton Wisconsin 53562 Usa; Agracetus Inc
Priority date: 1985-07-18
Filing date: 1986-07-18
Publication date: 1987-02-04
Also published as: FR2590445B1; IT1214692B; IT8648277A0; BR8603359A; US4654465A; FR2590445A1

Abstract

本发明揭示了创造和利用遗传性雄不育玉米进行杂交玉米生产的方法。这个方法用Spm移位因子系统并涉及创造一变异的雄能育等位基因，变异是由于Spm抑制受体基因的存在，在Spm抑剂基因存在的情况下，其表达为受抑制。此外，本发明揭示了转移这个系统到任何一个近交系中以用于杂交种子生产的方法。

Description

本发明总的涉及到玉米植株的遗传过程（方法）具体地涉及到培育和利用雄性不育玉米种子进行杂交玉米生产的方法。

在美国现有的玉米即玉蜀黍生产中，农场主或农民所用的绝大多数种子玉米是单交的，F1杂交品系。当前用作生产杂交玉米种子的商业技术要求在专门选择的雄性及雌性亲本植株之间实现可预测的杂交。这样选定的雄性的和雌性种类的植株在大田中种植在一起，使花粉可以雄的亲本植株散出传给雌性亲本植株。这个过程因玉米植株的雌雄同花（株）的性状而比较容易。每一个植株有不同的（各别的）雄性及雌性的花序，因此，为确保在所要求的母本植株和所要求的父本植株之间进行正确的（合适的）交配，这就是必须保证母本植株的花粉不可在同一植株上自身授粉或者授粉给同属的母本植株。为了确保这些不希望有的自身授粉或同属授粉不致发生。在生产中的一般做法是用手工从母本植株摘去雄花使母本植株去雄。虽然目前有机械设备可用于母本植株的去雄，但由于大田中玉米的大小不同，同时又要求不可过多地切去玉米的植株，机械去雄的效率很低，因此去雄的过程还是用手工操作，有时，则人工与机械设备联合使用。这个过程是一个劳动强度非常高而且时间又很集中的农活，在北半球，通常这段时间在六月、七月或八月的4到6个星期，因为这个生产活动必须在用作母本的近交玉米的为期极短的开花期内进行。这种去雄操作是一个很难安排的操作，因为它需要得到大量的短期劳动力，它又是一个很花钱的工作，因为它是劳动密集型的生产劳动。

因此，已花了很多的时间和许多的精力去发展雄（性）不育玉米植株。雄性不育一词通常是指植株在其雄性开花器官成熟时不产生有活性的花粉的植株，但此植株仍然具有完全的雌性繁殖的能力。在杂交生产系统中使用雄不育玉米不需要去雄，因为雄不育母本植株所能得到的花粉只能是父本植株所产生的花粉。这样就得到了预期的交配，因此就能产生可适用于大田生产的杂交的后代。不幸的是，使用雄不育玉米植株前还有一些内在的固有的不利因素。

目前有两类已知的和已用的保持玉米作物的雄不育族类的系统。一类系统是依赖于细胞质或非核的雄不育特性，另一类系统是依赖于基因性的，或核的特性遗传来保留雄不育性的。

细胞质雄不育系统依赖的是不包含在细胞核内的基因。因而得名，此系统较合适的名称应该是胞一核雄不育系统，因为它的雄不育性依靠着细胞质基因和无核修复基因，因为细胞质遗传物质在玉米中通常是从本植株单独传遗的，而且极少通过花粉传递，利用母本系的细胞质雄不育特性花粉就可以由雄不育亲本供给，所得到的后代植株是可靠的雄不育性的后代，由于细胞质基因由母本提供。一个已公开了的用细胞质雄不育性来生产杂交玉米的系统见美国专利第2，753，663号。

有一段时期，美国杂交种子工业利用细胞质雄不育玉米系生产杂交玉米种子。采用得最多的细胞质雄不育性是得克萨斯不育或T不育细胞质，此细胞质不育性在1970年以前被广泛地用于生产几种类型或种类的杂交种子供出售之用。到了1970年发生了一种T型HELM IN THO SPOR IUM MAYD IS植株流行病。当时的大多数雄不育植株和从它们产生的杂交种生了一种南方叶子枯萎病。此事件使许多玉米种植者们相信细胞质雄不育性对于得到雄不育植株不是一种适宜的机制，因为正常细胞质和带有雄不育性的细胞质之间的差别似乎不仅对花粉的繁殖力而且对疾病的敏感性也有影响。此外，这次植物流行病事件造成的严重损害引起了对使用细胞质雄不育系的普遍怀疑，因为消费者害怕植物流行病会在其他细胞质雄不育性系再次发生。至今为止已鉴定了二种其他细胞质雄不育性系，称为C和S型不育系，除了消费者和种植者们不愿使用胞雄不育系统以外，这两种不育系还具有内在的稳定性问题和近交系的胞雄不育问题。

玉米的雄不育性的另外的一种基础是基因性雄不育性，它是由玉米作物的核仁基因造成雄不育性的。已做了许多鉴定玉米雄不育性基因的工作，到现在为止，至少已知道了19种能产生出雄性不育性的核仁基因的变异（变种）。雄性不育基因表可以从美国专利第3，861，079号的COLUN15等中看到。现今已知所有能产生雄不育性的遗传特性中，其不育性是由单个基因决定的，而雄不育性的等位基因是隐性的。使用基因性雄不育性系的可能性对杂交种子的生产者们来说早已存在，但是还没被证明是非常实用的。

使用常规的基因性雄不育性系的问题在于，它不可能保持对隐性等位基因是纯合性（体）的杂交物种产生雄不育性。原因很简单，这是因为这一系的植株不能产生自身授粉或授粉给对隐性等位基因是纯合体的同属植株。当然有可能进行杂交授粉，即用对雄性不育基因是杂合体的雄性能育植株给对雄不育隐性等位基因是纯合体的雄不育植株授粉，即在它们的基因对里有一个雄能育等位基因和一个雄不育等位基因（Ms/ms），从这个杂交培养的后代大约有50%是雄不育，50%左右是雄能育的。因此如果打算用从一个单基因性雄不育系得来的植株作为杂交的母本的话，所能期望得到的最好的结果是50%用于杂交种子生产的后代物可望是雄性不育的。因此，仍有必要摘去另外50%植株的雄花，由于使用此方法仍离不开要在大田中施行去雄操作。这种方法商业利益甚微。所以此法目前未被广泛使用。

另一个用在杂交种子生产中创造基因性雄不育物种的方法已见诸文献。这是由PATTERSON发展的技术。此法利用正反交移位（相互易位）和各种各样形式的染色体缺失和成倍（重复）以产生雄不育母本。这技术已在美国第3，710，511号和第3，861，079号专利中有详细描述。此法在此不必详述。只是简单提一下，尽管这两种方法的目的都是生产基因性，而不是细胞质雄不育植株进行杂交种子的生产，它所述的使用时创造基因性雄不育植株的方法完全不同于本发明所提出的方法。

本发明系统采用一种叫做移位子的遗传因子。移位子是遗传因子，它在染色体上可从一个位点自发的跳到另一个位点或跳到植株基因组中位于另一个染色体的任何地方。移位子是在BARBARA MCLINTOCK博士所开拓的工作中首先在玉米中鉴定到的。有好几种体系的移位子最初是由MCLINTOCK博士继而由其他别人鉴定的。现已鉴定出其他品种包括细菌和动物中的移位子，但以在玉米中的特征最强。

在MCLITOCK博士所鉴定的几种类型的移位子中，我们特别感兴趣的类型是抑制基因-变异基因（Spm）体系（MCLINTOCK，1955）。PETERSON（1953）也独立地分离出了这种体系。他把它们的组分称作增强剂（En）和抑制剂（I）。Spm是一个能移位（自发的）的组分，它的信息编码使它能在基因组内从一个位置被切除并再嵌入到另一个位置。它影响着它所插入的任何位点的表达。也可能存在组成一个双因子体系的第二个组分。此第二个组分已被证明是不完整的Spm，其中Spm的一部分DNA顺序已缺失（PERIRA ETAL，1985）并随之失去了催化它自己移位的能力。但是当Spm存在于基因组中时，它能被诱导而移位，这种Spm的移位不完全的衍生物有着各种各样的名称：Spm的受体：Rs及（I）。我们将称之为不完全性Spm（d Spm），因为它在分子水平上的起源现已清楚，我们也称它为受体因子（Rs），这是联系它的功能而言的。

当一个有活性的Spm存在于基因组中时，这些不完全的Spms能从一个位点移位并再整合到第二个位点。当Spm不存在时，d Spm是牢固地结合在一个位点上的，在此位点上它可能或者不能影响对此位来说是纯合性的植株的表型（MCL INTOCK1965）。当一个Spm在基因组存在时，它抑制了插入dSpm的任何位点上的所有的活性，而产生一个突变（NULL）的表型直到dspm响应Spm的转移信号从该位点切除为止。假如这种切除恢复了细胞中位点的正常结植，那么这个细胞及其无性繁殖的后代将有一个非突变型（正常或野生型）的表型。这就有可能使一个dspm能结合到一个位点上，在无活性的Spm存在时，产生非突变表型：但是在有活性Spm存在时，则基因活力受抑制而产生突变的表型。在杂交种子生产过程中这点是特别重要的。这个Spm移位子系统在种子生产过程中被用作一个开关去关闭基因的活力并产生出雄不育植株。

在这方面，人们希望（尽管可能不必要）产生和利用减弱或完全消除变异活力的Spm以消除这样的可能性，即：Spm催化切除嵌入到Ms等位基因的dspm（并在有活性的Spm存在时产生一个雄性不育表型）在植株发育中发生得太早因而在雄花中产生雄能育的部分。因此我们期望有部分不完全（部分缺失）的Spm，它们失去突变基因活力但保留抑制基因活力，MCCLINTOCK已报导了一些关于部份不完全的Spm。

概括地说，本发明玉米种子经栽培后将获得遗传上稳定的雄不育玉米作物。这种玉米种子在它的基因组内包括：能够激活（活化）基因组内的任何地方的受体因子的一个抑制因子，一个雄不育等位基因，和一个与雄不育等位基因等位的插入突变雄能育等位基因，通过插入针对雄能育等位基因的受体因子而突变（变异）以便在抑制因子不存在时允许雄能育性而在抑制因子存在时抑制雄能育性。

本发明的另一个目的是提供一个生产雄不育的玉米种子的方法这个方法包括这样一些步骤：

对一选择的雄不育位点的雄不育性是纯合的以及对它的基因组中别处的一个抑制因子是纯合的植株授粉。花粉来自对同一雄不育位点的一变异雄能育等位基因是纯合的玉米植株。该变异雄能育等位基因通过插入一抑制接受因子后当在基因组内抑制因子存在时抑制雄能育等位基因的表达以及从纯合的雄不育植株来收获所产生的种子。

本发明的目的之一是在生产杂交玉米种的过程中生产和使用稳定而可靠不育的、以及不易感染发病的（基因性）雄不育植株。

本发明的又一个目的是在繁殖系统中生产和利用能够使递到任何所需近交玉米系的雄不育植株。

本发明的再一个目的是提供一个为产生基因性雄不育植株的系统，其中的雄不育性是与胚颜色或与其他易于辨别的种子的表型紧密联系的，因此，只要用视觉就可以很容易地挑选出雄不育性种子。

本发明的另外的目的、优点、和特征将从以下的详细描述和所提供的实例中变得更为明显。

这里所叙述的系统是让作物的种植者们通过在一个协同配合的步骤中，使用Spm移位因子系统的组分（抑制组分和变异组分）得到确实可靠的繁殖基因性雄不育性玉米，在这个步骤中，其中，能繁殖并能保持的亲本可以直接用来为杂交玉米生产并创造一个基因性雄不育的后代。这个亲本需要有对所选择的雄不育位点是专一性的等位基因。这两个亲本之一，带有一个移位因子系统的不完全拷贝。其功能是作为一个受体。而另一个亲本带有一个完整的抑制基因-突变基因因子的拷贝最好是一个无活性突变基因。这里所揭示的系统包括从同一近交玉米系产生所需要的亲本植株的方法，从而雄不育植物能可靠地从单一近交玉米系产生，这样，这种玉米系或再扩大一点，任何其他近交玉米系能在杂交生产中用作母本，它的其他的基因组则保留不动。在这里还同时揭示了利用这种亲本创造雄不育作物的步骤。

生产雄不育玉米所需的亲本的生产步骤是从创造一个插入突变雄能育等位基因开始的。要创造此等位基因，首先必须选择一个移位因子系统和一个能被利用的雄不育位点。移位因子系统需要包括二个功能性因子。它们可以位于植株基因组内不同地点。一个功能性因子是一个受体因子。假如插入得当，则只有当一个分开的功能抑制因子是位于该植株基因组内的另一处时，具有它才能阻止它被放于其中的等位基因的表达的能力。这些功能性因子中的每一个都是一个完整的或不完整的Spm因子的拷贝，其受体因子用于抑制功能，而这两个因子都希望它们有无活性的突变基因。这个不完整的、作为受体因子的Spm（dSpm）它必须适当地插在雄能育等位基因中以得到所需的可控雄不育性。

我们将在以后的细节中看到，当抑制因子位于基因组中时，抑制因子必须能够激活受体因子去阻正雄能育基因的表达这一点是十分关键的。当受体插入得适当而不管抑制因子在基因组的什么位置时，使用Spm系统去创造受体和抑制因子就可以阻止基因的表达。在当前，限于我们对玉米的移位因子的现有知识，限于当前所知的因子系统，只有Spm系统才能在本发明的系统内起作用，但是应该理介，其他移位因子也可能在玉米中发现，可能有其他具有两个组合的因子系统也具有本发明中所揭示的Spm因素的功能。类似的系统也可能用在其他谷物或园艺植物，因此，虽然本发明是专门着重于详细叙述玉米中的Spm抑制基因-突变基因移位因子系统，希望今后发现其他类似的移位因子系统。这不仅也可以用于本发明范围，而且还可用于玉米以外的其他植物中。

将在开始利用这种方法时，选择一个用于本系统的雄不育位点还是十分必要的。目前雄不育基因中有19个不同染色体位点已被确认。在所有已知的雄不育位点，隐性等位基因调节（决定）、雄不育性、显性等位基因决定了雄能育性，本发明可以使用这些位点的任何点。本发明现在所叙述的是（ms）雄不育性位点。这个msl的位点被选用于本发明的系统中，因为它是与玉米种子控制胚乳颜色的基因有紧密的联系。这个紧密联系只允许大约0.5%的重组，并能被用于本系统中使一个隐性的雄不育基因与一个特定的胚乳颜色相关联，通过筛选合适的胚乳颜色而方便地选择纯合的雄不育性植株。但是，应该理解，其他雄不育位点也是可用于在发明中的。

现在本发明所揭示的应用Spm系统和胚乳颜色联系的杂交玉米的生产方案要求在共同的雄不育位点具有特定的雄不育性或雄能育性等位基因的亲本植株系。

下面这些是所需要的系：

（A） (msy)/(msy) (Sp)/(Sp)

（B） (msy)/(msY) (Sp)/(Sp)

（C） (Ms（Rs）Y)/(Ms（Rs）Y)

这里Sp指的是最好没有活性的突变基因的Spm（而因只起一个抑制因子的作用），Ms（Rs）指的是有着一个无活性抑制因子的dspm（因而只起一个受体因子的作用）。它插在Ms等位基因中，当Spm抑制因子在基因组的任何地方存在时，基因表达就被阻止。（A）系和（B）系是杂交的并选择黄色的胚乳颜色（暂时忽略重组）以产生物种：

(msy)/(msY) (Sp)/(Sp)

它与（C）系杂交而产生相等比例的下列物种：

(msy)/(Ms（Rs）Y) (Sp)/(-) 和 (msY)/(Ms（Rs）) (Sp)/(Y-)

所有这一代的种子都是雄不育的，可被用来通过与任何所希望的父本系的杂交来进行杂交种子的生产。在这些作物中，MS（Rs）等位基因由于存在着Spm抑制因子而失活，从而阻止了雄能育等位基因的表达。

A系和B系杂交时，重组将导致一些雄能育植株被除掉而得到一些（＞1%）白色谷粒产物。

作为上述方法的另一种方案，也可以使（A）直接与（C）杂交以产生全部可以在杂交种子生产中用作母本的物种：

(msy)/(Ms（Rs）Y) (Sp)/(-)

这个方法在种子生产阶段将产生较多的白色的谷粒，这可能是不大合乎需要的。

在杂交种子生产可以开始之前，首先需要通过测定在带有Spm玉米系中受体因子转移到所选的雄不育的位点来生产亲本。雄不育植株被用作母本去与带Spm的物种杂交。由这个杂交而得的F1子代将通常是完全的雄能育的，因为在所需要的雄不育位点上，每一个植株都应该对雄能育性和雄不育性的等位基因（Ms/ms）是杂合的。然而由Spm系统产生的移位应该导致很小一部份百分比的F1植株是雄不育性而那些雄不育的F1植株可能有一个完整的或不完正的Spm系统的拷贝位于雄不育位点上。通过筛选F1植株的雄不育性，人们应该得到带有所预期的dSpm的一些植株，在预期的雄不育位于点上起一个受体因子的作用。在测定dSpm是否插入到预期的位点时，F1雄不育植株可以与同样的遗传背景杂交以便在同样背景植株物种的预期雄不育位点得到诱变基因。F1物种的植株然后可以与雄不育物种试杂交（ms₁Spm/ms Spm），预期的杂交结果可与实际结果相比较来决定诱变的等位基因事实上是否受Spm系统的影响。若雄不育等位基因是从随机地雄不育变异造成的，那么子代的自身杂交（F1自身杂交）和试杂交（F1′×ms₁Spm/ms Spm）产生的子代将有大约25%和50%是雄不育的。然而，若雄不育性是由于在雄能育等位基因中插入dSpm而造成的，那么自身杂交的子代（自身的F1′）在Spm不存在时，将是雄能育的，测试杂交子代（F1×ms₁Spm/ms₁Spm）将是50%或100%是雄不育的。具体百分比要看F1植株对诱变等位基因是杂合的（Ms（Rs）/Ms）抑制或纯合的（（Ms（Rs）Ms（Rs））而定。如果另一种Spm的非不完正拷贝存在于F1中，那么其结果可能在这二者之间变化。

一经测定起受体作用的dSpm拷贝是位于所选择的雄不育位点上，那么，使所用物种中的所有Spm系统的拷贝的突变基因消失或部分失活，特别是从提供抑制基因功能的育种物种中消除或使突变基因部分失活是很有帮助的。这可以分开进行，通过直接从broze-mutable-B开始从所用的物种系来生产变异的雄不育基因，或别的带有Spm的物种系。以及通过从显示了抑制功能但是他们是遗传性稳定的移位的子代植株进行培育。

到了这个阶段，有了两个重要的植株系。一个植株系包含具有受体功能的dSpm拷贝，插入在所有需要的雄不育位点，另一个物种系应该是在同一位点对雄不育性纯合的物种系统，有一个具有抑制基因的Spm拷贝最好是带失活突变基因的也位于植株基因组的其他地方。第二步是转移这两个组份到一个恰当的近交玉米系以便能用在杂交玉米生产中。这个近交系用作一个再发的亲本而在预期的雄不育位点的带有受体的系则用作一个非再发的亲本。对纯近交亲本系回交，直到变异的雄不育基因转移到背景近交系。由回交得来的子代能与测试物种杂交，此测试物种由包含抑制功能组分的杂合雄不育系组成，以选择对雄能育性是杂合的和带有dSpm受体基因功能的诱变的雄能育系位基因是杂合的植株。

如前所述，在本系统下应用近交系进行杂交玉米生产必须具备两个亲本繁殖物种，一个带有变异的雄能育基因，另一个带有包含在该植株基因组中的Spm抑制基因的功能的在其他方面（除此之处）是近交系的亲本。现在，再从近交系物种。些近交系物种还是作为一个再发的亲本。一个在其基因组中含有Spm抑制基因，其所在位置不同于雄不育位点的纯合雄不育系，被用作非再发的亲本。一个由含有Spm受体的雄不育植株组成的测试物种用于分离所需的植株，这些植株将是含有的Spm系统中的抑制基因组份的纯合雄不育植株。

正如以下将描述的，应用ms₁位点能把一个胚乳色素Y1基因用作为雄不育的标记。选择有连锁的标记会大大的增加雄不育子代的比例。

以上详述的步骤是打算创造三个源物种，他们可鉴定如下：

（1） (msy)/(MSY) (Spm)/(Spm)

（2） (Msy)/(msY) (Spm)/(Spm)

（3） (Ms（Rs）Y)/(Ms（Rs）Y)

其中ms是隐性等位基因，它决定着雄不育性，Ms是显性等位基因，它决定着雄能育性，y是隐性的，它决定着胚乳的白色素;Y是显性的，它决定着胚乳的黄色素;Spm是Spm的抑制基因（最好是带有不活性突变基因的完整的，Spm拷贝）以及Ms（Rs）是雄能育变异等位基因，它在雄能育基因中具有Spm受体功能（即没有抑制基因功能的dSpm）。这些物种用上面述的步骤产生。物种（1）和（2）是通过与保持物种杂交而保持的物种。（1）是通过msy/Msy杂交而保持的;Spm/Spm产生等数的所需纯合的雄不育植株（ms₁/ms₁）并除去杂合的雄不育植株（MS/ms₁）。物种（2）是由msy/Msy杂交而保持的，Spm/Spm它也产生等数目的雄能育和雄不育植株而雄能育植株将被保存。

在实际应用中，（1）先与（2）杂交，得到的绝大多数是：

(Msy)/(msy) (Sp)/(Sp) 和 (msy)/(msY) (Sp)/(Sp)

然后筛出雄不育植株的种子并弃去白色胚乳的。1%重组率可能产生一些 (msy)/(msy) (Sp)/(Sp) 植株被淘汰，也可能产生一些（即1%） (Msy)/(msy) (Sp)/(Sp) 基因型植株，它们将通过检查，因为他们具有黄色胚乳，这些植株必须在他们散发花粉以前从大田中除去，因为他们为数极少，这样做，经济上还是可以过得去的。雄能育植株在大田里花粉散发前是显而易见的，因为在ms₁位点的雄不育植株的花卉是易于辩认的。

由此而得到的纯合的雄不育植株继而与物种（3）杂交，所有子代植株都将是杂合的，并带有等比例的下列物种：

(msy)/(Ms（Rs）Y) (Sp)/(-) 和 (msY)/(Ms（Rs）Y) (Sp)/(-)

经这样杂交而得到的种子将是黄色的并且从这个物种种子得到的全部植株将是雄不育表型的。在植株基因组内含有抑制基因功能的活性的Spm拷贝的存在将使dSpm起一个受体因子的作用，阻止了它被插入其中的雄能育等位基因的表达而得到雄不育性，这种物种的种子玉米继而可用于杂交玉米的生产中，并与任何别的选择的近交系亲本的父本Ms Y植株进行单杂交。这个杂交得到的全部F1杂交种子在农田里将是全部能育的。

实施例1

Spm受体基因功能移位到ms1位点

在这个例子中原始物种系是从在ms1位点上对隐性雄不育等位基因是纯合的和在相同位点上对不育性是杂合的混合的玉米种子中得到的。此系是通过杂合的雄能育植株与纯合的雄不育植株的杂交而得到保持的。

第二个使用的原始的物种称为bronze-mutable 13。这个系是由本发明者之一鉴定的。见NELSON KLEIN，GENTLES，1984。此系有着一个Spm系统的受体（Rs）位于青铜粉色素（B₂）的位点。得到的易变青铜等位基因，称为bz-m13，在Spm不存在时，决定着全部色素的产生，但是当完整的Spm拷贝位于基因组的其他地方时，就被抑制并且产生严重的变异。此系的种子在bz位点是杂合性的，并有一个Spm的活性拷贝位于基因组的其他地方，这可以从斑驳的种子颜色所表明。此系的全部种子在所有雄不育位点上包括ms在内推测对功能性的（雄能育）等位基因是纯合的。此系的谷粒所长出的植株继续自身授粉以维持这类品系。

这二种物种皆生长熟后，通过交错种植，二个品系的植株在同一时间同步地到达它们的性成熟期。雄不育植株的有雌蕊的花（长须）与来自Spm的花粉生育bronze-mutble 13系，即：

(ms1)/(ms1) × (MS_')/(MS_') (（Rs）)/(（Rs）) (Spm)/(Spm)

从这杂交得到的F1种子在1982-1983年在佛罗里达的冬季生长成熟而在威斯康星则是1983年春季成熟。当植株开始开花时，对它们的穗状雄花凡是全部或部分的花粉不育性标上肉眼看得出的记号或用酸性卡红使花粉着色。如果没有移位，所有F1植株都将是雄能育的因为它们在雄不育位点上（MS₁/ms₁）将是杂合的。然而，当Spm受体的功能（Rs）移位到在ms位点上的显性等位基因的情况下，在基因组的同一位点上或在其他地方，在有Spm仰制组分的存在时，受体将抑制基因的功能。在一些插入中，Spm受体功能（RS）本身，不管Spm抑制基因存在或不存在，都可能阻止基因的表达。这是不能接受的，因为我们希望在Spm抑制基因不存在下基因是可以表达的。

F1一代的雄不育植株从威斯康星和佛罗里达的谷物中找出。但这些植株中某些可能在ms位点有d Spm，或完整的Spm的拷贝，也有一定量的天然变异以及一些非遗传性因素能产生雄不育性。为了证实移位到雄不育位点，雄不育植株与W64A（一个普遍的近交系）杂交。这个杂交将是潜在性的，可控制的等位基因带到一致的已知遗传背景中去，而后代继而自身杂交同时也与纯合的雄不育测试物种进行测试杂交（ms1/ms1;SPm/SPm）。假如F1植株是由于自然变异而成为雄不育的，则自身杂交将产生25%的雄不育植株，因为它将使一个杂合的雄不育/能育和本身杂交。测试杂交应产生50%雄不育植株，因为是一个杂合的植株和一个纯合的植株杂交的。如果F1是由于在ms1位点上插入RsSpm功能而成为雄不育的，则某些F1×W64A植株的自身及回交后代将完全是能育的，因为有些失去了Spm抑制基因从而允许基因表达。从F1×W64A杂交得到的植株将使所有的后代都是能育的后代，这一点已被确认。然而也可得到类似的结果，如果F1雄不育性是由于非遗传因素或由于植株在ms1位点上带有完全的Spm拷贝的原因，如果Spm抑制基因仍有活性，那么在植株的生长过程中，这可以使它切去它本身。为筛选出这些因素，使从F1×W64A杂交所得的的植株自身杂交以及与带Spm抑制基因的纯合雄不育植株的测试物种进行杂交。此杂交后代如果原来的不育是由于非基因性因素引起的，则至少有50%是能育的，但如果Rs是在ms₁位点，则此杂交的后代将有50%或100%是雄不育性的。究竟是50%还是100%，这取决于所测试杂交的植株对在ms1位点的Rs功能插入是纯合的还是杂合的。

实施例2

下面是曾经进行过的一个与实施例1类似的步骤，而且是在相似目的场所进行的，除了在ms₂位点上用纯合的（ms₂/ms₂Spm/Spm）雄不育植株的试验物种筛选Rs以外。

实施例3

鉴定已失去了突变基因的活力的Spm因子

使用了两类种子：

A bz-ml3 （无Spm）;和

bz-ml3

B (bz)/(bz) + (Spm)/(Spm)

在Spm抑制基因的功能（即另一个Spm拷贝）不存在时，来自A系的谷粒是统一的红色。B系的谷粒是统一的青铜色。来自A和B系的植株于1983年夏季在威斯康星以A系作为母本进行杂交。此杂交后代的穗已鉴定为可靠的青铜色的谷粒，在变异不存在的情况下，预期这些谷粒的bz-m13变异的等位基因活力将被抑制（这就是为什么它们不是红色的），但将有一个无活力突变基因，因为它们没有着色细胞的克隆。由微弱的杂色斑驳所表明的带有弱突变基因的谷粒（杂色发生在晚期并且频率较低）从这些穗中找出并且该弱突变基因通过它们与以A系物种为母本进行的逆交也被证实。这些具有少量突变基因组份但仍具有Spm的抑制基因的组份的植株，再继续与A系的物种大规模地进行逆交来鉴定，其中Spm已失去全部的突变基因的活力，但是保留着Spm抑制基因的功能的谷粒。用此方法有可能产生包括Spm抑制基因功能和无活力突变因功能的玉米系，因此Spm抑制基因的功能是稳定的，续而以如下所示的方法，通过它自身将Spm抑制基因的功能转移到另一系。

实施例4

在ms位点上转移Spm受体（Rs）的功能到预期的近交品系

一旦Rs受体的功能（实际是dSpm拷贝）插入预期的雄不育位点得到肯定以后，那么接着就可以将变异的雄能育等位基因转移到预期的近交品系中以便用于杂交种子的生产之中。这个方法可使用下列物种来实现：

A.所需的近交品系，例如，W64A.

B.带有插在ms₁位点的Spm受体（Rs）功能（dSpm）的A品系，在Spm的抑制基因的功能不存在的情况下或在基因组的另一部位有完全的Spm组份时，它就不能控制（决定）不育性。由例1或2创造的品系用在这里是比较合适的。

C.一个在预期位点上纯合的雄不育植株的试验物种。此物种在其基因组的其他地方并带有一个完整的Spm系统（最好没有突变基因组份）。是否一个受体（Rs）的功能是位于试验物种的另一个部点这一点是无关紧要的，因此我们将使用双突变株品系（ms/ms bz-ml3/bz-ml3），其中，bz-m13等位基因起着Spm存在的指示作用。

此程序基本上涉及作为再发的亲本的A物种与一作为非再发的亲本的B物种的杂交，并用得到的后代与再发的亲本逆交（回交）五或六代。来自第一次逆交（回交）的后代称为BC₁，及其后的逆交的后后代，然后与C系异型杂交以选择包含Spm受体的功能的雄不育等位基因的植株。在最后一步逆交后代自（身）授粉以获得对变异等位基因是纯合的植株。以试验物种对纯合性植株进行测试，其中受体的纯合性等位基因与试验物的杂交（上面的C系）将得到全部的雄不育的后代，而杂合性ms/Ms植株与试验的杂交将产生50%雄能育后代。

实施例5

抑制基因组份转移到预期的近交品系。

上面例3创造的是一个带有稳定的Spm抑制基因的功能的近交物种，记为Sp。只要抑制基因的活力保留着它可以是dSpm或是一个完整的Spm拷贝，当然突变基因的活力没有是更可取的。为了在杂交作物生产中利用变异的雄不育基因，现在就必须转移这个抑制基因到预期的近交品系以备在程序中使用。此步骤需要下列的物种：

A.预期的近交品系，例如，W64A.

B. (ms1y)/(ms1y) (sp)/(sp)

C.下列的试验物种：

ms1 bz-ml3 （没有Spm）

ms1 bz-ml3

这个过程涉及A和B物种的杂交继而将得到的后代都与作为再发的亲本的A系杂交以及与C系杂交作为试验杂交以取出并筛选所需要的基因型。此过程通过五到六代的重复逆交以获得所需的物种A的近交品系的遗传组成。在最后一步中后代是自花授精，通过把自花受精的后代和试验物种杂交来选择所需的物种以测试抑制基因组份是否存在。

实施例6

雄不育种子的生产

雄不育种子的生产需要以下三种物种，它们全部被转移到所需的背景品系，这些品系将在杂交玉米生产中作为母本。

A. (ms₁y)/(ms₁y) (Sp)/(Sp)

B. (Msy)/(msY) (Sp)/(SP)

C. (Ms₁)/(Ms₁) (（Rs） Y)/(（Rs） Y)

雄不育种子的生产是由A系和B系杂交开始的，而以A系为母本。杂交的结果，忽略重组，将是各50%的下列两种基因型。

(ms₁y)/(ms₁y) (Sp)/(Sp) (Ms y)/(ms₁y) (Sp)/(Sp) 它们分别具有有黄色胚乳的雄不育和白色胚乳的雄能育性。

也有可能包含一些重组，它们能够引起纯合白谷粒的纯合雄不育或杂合黄谷粒的杂合雄能育。不论如何，一般来说对雄不育性杂合的植株，或者来自以上杂交的雄能育谷粒将是白色的，而雄不育谷粒将是黄色的。因此，通过颜色视力筛选谷粒就能把纯合的雄不育谷粒选择出来。同样，用视力筛选杂交的结也就能把雄不育种子挑选出来。重组可产生一些雄能育黄色的基因型，但是在任何情况下这些将少于总植株数的1%，因此在它们的花粉散发以前可以很容易地在大田里除去。在大田里除去它们非常容易还因为穗状雄花的外形是有差别的。

例8

杂交种子的生产-增加雄不育种子产量的方法

为了从上面例7中拿到结果以及增加雄不育种子的数量以满足大规模种子生产的需要，可以采用下列的方法。还是用上面例7中所提到的那三个原始物种。从例7的A系得到的植株与例7的C系的植株进行杂交，并以A系作为母体，这杂交将得到相等比例的下列两个物种：

(msy)/(Ms（Rs）) (Sp)/(-) (msY)/(Ms（Rs）) (Sp)/(-)

可以看出，这两个物种都将是雄不育的，因为Spm抑制基因的功能将激活位于突变体雄能育等位基因的受体的功能而阻止雄能育等位基因的表达。所有的谷粒都将是黄色的。因此来自这代的全部谷粒都能被收集并产生雄不育植株。

实施例9

杂交种子的生产

所有从上面例8中产生的种子将被收集起来并进行种植。所有的植株将是雄不育的，可以在与任何选择的父本近交系进行杂交中用作母本。由母本产生的种子将是F1杂交种子，能够出售给农民。并且所有植株将是雄能育的和雌能育的，前提是假设杂交代是纯合的雄能育的。应用Y等位基因作为记号的结果，大约1/64的农田的产品是预期有白色谷粒的。这并不是不可取的。

从以上的例子可以看到，这个方法可用于任何现有的玉米的近交系，虽然转移和创造适当的近交系中的物种要涉及到一系列操作，但所有这些操作只涉及所需杂交的两个可能的亲本中的一个，即母本，而对杂交玉米繁殖的父本供体则没有什么特殊变动。

bronze-mutabie 13系的玉米种子已被储存在美国马里兰州Rock ville市的AMERICAN TYPE CULTURE COLLECT ION（ATCC）中，而此很容易得到。

ATCC给这个收藏品的编号是40189

可以得到这些种子并不能被解释为可使用本发明的特许来违犯承蒙任何政府根据它的专利法所给予本发明的专利权。

Claims

1、一种生产遗传性雄不育玉米种子的方法，此方法包含的步骤有：

授粉给第一玉米植株，此植株对在所选择的雄不育位点的雄不育性是纯合的，同时，对在基因的另一位点的抑制因子也是纯合的，授粉的花粉来自对与雄不育位点等位的、且由插入其中的移位受体因子变异的插入变异雄能育等位基因纯合的第二植株，插入移位受体因子与雄能育等位基因的关系是，在不存在抑制因子时，允许雄能育性，在存在抑制因子时，阻子雄能育性；

收获由纯合的雄不育植株产生的种子。

2、权利要求1所提出的一种方法，其特征在于，抑制因子以及受体因子功能性因子是Spm移位因子系统的因子或完整的拷贝。

3、权利要求2所提出的一种方法，其特征在于，Spm的突变（变异）基因是削弱的或者是无活性（失活）的。

4、权利要求1所提出的一种方法，其特征在于，雄不育位点是从包含着雄不育的ms₁和ms₂位点的组中选出来的。

5、权利要求3所提出的一种方法，其特征在于，使用了ms₁雄不育位点，同时，雄不育性的等位基因是与黄色胚乳颜色的显性等位基因相连锁的，因此，胚乳的颜色可用来筛选从纯合的雄不育植株与杂合的雄能育植株杂交所得到的雄不育种子。

6、根据权利要求1所述的方法产生了雄不育种子玉米。

7、根据权利要求2所述的方法产生了雄不育种子玉米。

8、根据权利要求4中所述的方法产生了雄不育种子玉米。

9、用一个遗传性（基因性）雄不育亲本产生杂交玉米的一种方法，其中包含着的步骤是：

培育在选择的雄不育位点是纯合的并在其基因组内带有一个抑制因子的第一玉米系;

培育第二玉米系;此玉米系对与雄不育位点等位的并由插入其中的一受体因子突变（变异）的插入变异雄能育等位基因是纯合的，插入的受体因子的位置与雄不育等位基因的关系是：在抑制因子不存在的情况下，允许雄能育等位基因能决定雄能育性，而在抑制因子存在的情况下，能阻止雄能育性的表达;

用从第二系植株来的花粉授粉给第一系植株并收获由第一系植株所产生的种子;

培养上述种子以产生雄不育成熟的玉米植株;

用从选择的第三玉米系的雄能育植株的花粉授粉给上述雄不育植株;并且

收获雄不育植株所产生的种子。

10、权利要求9所提出的一种方法，其特征在于，抑制因子及受体因子功能性因子是Spm移位因子系统的因子，完整的拷贝或不完整的拷贝。

11、权利要求10所提出的一种方法，其特征在于Spm的突变（变异）基因是减弱的或是无活性（失活）的。

12、权利要求9所提出的一种方法，其特征在于，雄不育位点是从包含着ms₁和ms₂位点的组中选择出来的。

13、权利要求11所提出的一种方法，其特征在于，使用了雄不育位点ms₁，同时，雄不育性的等位基因是与黄色胚乳颜色的显性等位基因相连锁的，因此，胚乳的颜色可用来筛选从纯合的雄不育植株与杂合的雄能育植株杂交得到的雄不育种子，同时，进一步包括在上述第一次授粉步骤之后和在所述培育步骤之前的筛选雄不育种子的黄色胚乳颜色的步骤。

14、权利要求9所提出的一种方法，其特征在于，第一个和第二个玉米系是从同样背景的近交玉米系中创造出来的。

15、用权利要求7的方法产生了玉米种子。

16、用权利要求8的方法产生了玉米种子。

17、用权利要求10的方法产生了玉米种子。

18、玉米种子在栽培后将产生遗传上稳定的雄不育玉米植株，在此玉米植株的基因组内，包括：

一个抑制因子能激活基因组内其他地方的受体因子;

一个雄不育等位基因;和

一个与雄能育等位基因等位的且由插入在其中的受体因子发生变异的插入变异雄能育等位基因，插入受体因子的位置与雄能育等位基因的关系是：在抑制因子存在时，能阻止雄能育性的表达，而在抑制因子不存在时允许雄能育性。

19、权利要求18所提出的玉米种子，其特征在于，抑制因子和受体因子是Spm移位因子系统的因子，不完整的或完整的靠贝。

20、权利要求19所提出的玉米种子，其特征在于，Spm系统的变异基因已被减弱或失活。