CN111118053B - 水稻育性调控构建体及其转化事件和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻育性调控构建体及其转化事件和应用。具体地，本发明涉及一种构建体，一种水稻细胞、组织或器官，一种构建水稻雄性不育系的方法，一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法，一种制备水稻种子的方法，水稻转化事件7R‑949D/7R‑1425D，一种用于检测水稻转化事件的引物，一种用于检测水稻转化事件的试剂盒，利用该试剂盒鉴定插入的T‑DNA和植物基因组DNA的结合区域并进一步鉴定转化事件的种子及其它组织的方法，一种用于制备杂交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。

Description

水稻育性调控构建体及其转化事件和应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和育种领域。具体地，本发明的实施方案涉及含有制种技术事件和位于转基因序列侧翼的植物基因组DNA的转基因水稻植物。更具体地，本发明涉及纯合隐性核雄性不育水稻植株的育性恢复及其用途。进一步本发明涉及构建水稻雄性不育系、保持系的方法以及转化事件，更具体地，本发明涉及一种构建体，一种水稻细胞、组织或器官，一种构建水稻雄性不育系的方法，一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法，一种制备水稻种子的方法，一种转化事件，一种水稻转化事件7R-949D，一种水稻转化事件7R-1425D，一种用于检测水稻转化事件的引物，一种用于检测水稻转化事件的试剂盒，具体地，利用该试剂盒鉴定插入的T-DNA和植物基因组DNA的结合区域并进一步鉴定转化事件的种子及其它组织的方法，一种用于制备杂交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。

背景技术

水稻杂交育种中常用的是“三系”和“两系”杂交。“三系”杂交需要有特定的恢复系和保持系，育种程序和生产环节复杂，选育新不育系及新组合的周期长、效率低，种质资源的利用率低于5％。另外，三系杂交稻杂种优势较弱，不育细胞质较单一，存在某种毁灭性病虫害暴发的潜在危险。“两系”杂交水稻由于不受恢复系、保持系之间关系的制约，亲本的遗传多样性得到明显改善，选育出高产杂交稻组合的速度明显加快，促进了超级杂交稻的研究和生产。但目前“两系”杂交中采用的不育系多为“光温敏”不育系，其育性受环境中的温度和光照影响。这些环境因素的不稳定会直接影响杂交种子的纯度和数量，加大制种风险，严重时会使企业和农民造成重大经济损失，限制“两系”杂交稻的大面积推广。而且利用目前技术所能选用的两系杂交稻不育系十分有限，例如粳稻品种中几乎没有很好的两系杂交组合，限制了品种资源的充分利用。因而，培育不受环境影响且可自主繁殖的稳定不育系已成为限制“两系”杂交技术广泛应用的技术瓶颈。

因而，目前的水稻杂交技术仍有待改进。

外源基因在植物中的表达是受其在植物基因组中的插入位点影响的，这有可能是由于插入位点周围的染色质结构(如异染色质的结构)或附近的转录调节元件(如增强子)的调节引起的(Weising et al.，Foreign genes in plants：transfer，structure，expression，and applications.(1988)Ann.Rev.Genet 22：421-477)，例如，可以观察到在外源基因转化得到的插入位点不同的众多株系之间，外源基因的表达水平存在较大的差别，也可以观察到外源基因在不同转化株系中存在时空的表达差异，且这种差异不是人为选用的启动子等表达调控元件构建的表达框造成的。同时，外源基因在植物基因组的不同位置的整合会对植物的整体表型造成影响，比如，外源基因在植物基因组中的插入会使插入位点处的植物内源基因的表达收到影响。因此，在转化事件的创制过程中，有必要生产成千上万的独立转化株系，通过筛选大量的转化株系，鉴定得到符合产业化要求的一个最优化事件，具备合乎要求的外源基因整合位点和表达水平/模式，同时对植物的其它表型不造成影响。进一步，可以通过回交转育的常规育种方法，将该最优化事件的外源基因通过杂交转育到其他遗传背景的品种中去，而这些杂种的子代被赋予了最初转化体的转基因表达特性，同时，还保持了原有品种的各种优良性状。

在植物或种子或其子代或有性杂交的子代中，特异性检测特定转化事件的存在或不存在是非常重要的，事件特异性检测方法可以鉴定插入的外源DNA和受体基因组之间独特的接合(junction)，这不仅涉及转基因自身，还涉及其在宿主植物或种子的基因组中的插入整合位置。此外，用于检测特定事件的方法对于植物食品的上市前许可和标签的规定、或环境监测及监测田地中作物的性状等也是非常有帮助的。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有能够有效构建新型稳定的隐性水稻雄性不育系和充分利用水稻种质资源用于杂交育种、提高杂交种纯度的手段。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：发明人以纯合隐性核雄性不育水稻突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育水稻突变体受体植株中。所述3个目标基因分别是水稻育性恢复基因、花粉失活基因和颜色标记筛选基因。其中，育性恢复基因可使不育的转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有转化的外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。例如，根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性不育ms26/ms26突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育系：其中，育性恢复基因OsCYP704B2(对应野生型的水稻MS26基因)可使转化受体育性恢复；花粉失活基因Zm-AA1可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力；荧光色选基因DsRed(r)用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生产不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。

由此，在本发明的一个实施例，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括：第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码水稻雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码花粉失活基因。利用该构建体，能够有效地将水稻雄性不育恢复基因和花粉失活基因引入到纯合隐性核雄性不育水稻突变体植株中，从而得到携带外源基因的可育株作为保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交的母本。由此，可以有效地用于水稻杂交，得到的杂交种也为非转基因。

由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到水稻的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，在本发明的第二方面，本发明提出了一种水稻细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该水稻细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建水稻雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体引入到第一水稻纯合隐性雄性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能够产生可育雄性配子，因此能够进行自体受精，可以得到携带外源基因的种子和不携带外源基因的种子，两者各占50％。其中，不携带外源基因的种子可以作为水稻雄性不育系。从而，可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交的亲本。由此，可以有效地用于水稻杂交。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将前面所述的构建体引入到水稻植株中；以及将所述水稻植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。在本发明的第六方面，本发明提出了一种转化事件。根据本发明的实施例，所述转化事件是通过将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中获得的，其中，所述构建体包括：第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码水稻雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码花粉失活基因。利用该构建体，能够有效地将水稻雄性不育恢复基因和花粉失活基因引入到纯合隐性核雄性不育水稻突变体植株中，从而得到携带外源基因的可育株作为保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交的母本。由此，可以有效地用于水稻杂交。由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到水稻的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。

在本发明的第七方面，本发明提出了一种水稻转化事件7R-949D。根据本发明的实施例，该水稻转化事件7R-949D的基因组中包含选自SEQ ID NO：13、14、17、18和53的至少一种DNA序列。由此，根据本发明的实施例，本发明提出了一种植物，其中，所述植物包含水稻转化事件7R-949D。即在该植物的基因组中包含了选自SEQ ID NO：13、14、17、18和53的至少一种DNA序列或其互补序列。并且本发明提出了由该植物衍生得到的种子、细胞和组织。

在本发明的第八方面，本发明提出了一种水稻转化事件7R-1425D。根据本发明的实施例，该水稻转化事件7R-1425D的基因组中包含选自SEQ ID NO：15、16、19、20和54的至少一种DNA序列。由此，根据本发明的实施例，本发明提出了一种植物，其中，所述植物包含水稻转化事件7R-1425D。即在该植物的基因组中包含了选自SEQ ID NO：15、16、19、20和54的至少一种DNA序列或其互补序列。并且本发明提出了由该植物衍生得到的种子、细胞和组织。

在本发明的第九方面，本发明提出了一种用于检测水稻转化事件的引物。根据本发明的实施例，用于检测水稻转化事件7R-949D的引物，其特征在于，所述引物包含选自SEQID NO：13、14、17、18、53或其互补序列的至少一种。用于检测水稻转化事件7R-1425D的引物，其特征在于，所述引物包含选自SEQ ID NO：15、16、19、20、54或其互补序列的至少一种。

在本发明的第十方面，本发明提出了一种用于检测水稻转化事件的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前面所述的引物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明一个实施例的植物表达载体p7R的结构示意图。其中，自右边界，依次包含了PG47启动子：：ZM-BT1导肽：：ZM-AA1基因：：IN2-1终止子表达框，OsCYP704B2基因表达框，和END2启动子：：DsRed(r)基因：：PINII终止子表达框。

图2显示了根据本发明一个实施例的可育花粉粒和败育花粉粒(不可育)的I2-IK染色结果，其中7R-949D表示7R-949D的染色结果；7R-1425D表示7R-1425D的染色结果。

图3是转化事件7R-949D中的T-DNA插入位点及整合方式示意图。在该转化事件的基因组中，整合了2个T-DNA，分别为图示的T-DNA1和T-DNA2。

图4是转化事件7R-949D中T-DNA插入序列与邻近基因位置关系及验证引物示意图，其中SP3为根据T-DNA序列设计的引物，A949B-L-1和A949B-R为根据插入位点侧翼的基因组序列设计的引物，其中引物A949B-L-1和SP3进行PCR扩增获得的片段大小为981bp，其具体的核苷酸序列如SEQ ID NO：74所示；引物A949B-R和SP3进行PCR扩增获得的片段大小为540bp，其具体的核苷酸序列如SEQ ID NO：75所示。

图5是转化事件7R-1425D中的T-DNA插入位点及插入方式示意图。在该转化事件的基因组中，整合了1个T-DNA，其右边界为RB，左边界为LB。

图6是转化事件7R-1425D中T-DNA插入序列与邻近基因位置关系及验证引物示意图。其中7RB-3和SP3为根据T-DNA序列设计的引物，A1425RB-2和A1425LB-2为根据插入位点侧翼的基因组序列设计的引物，其中引物A1425RB-2和SP3进行PCR扩增获得的片段大小为864bp，其具体的核苷酸序列如SEQ ID NO：76所示；A1425LB-2和SP3进行PCR扩增获得的片段大小为954bp，其具体的核苷酸序列如SEQ ID NO：77所示。

图7是转化事件7R-949D中T-DNA上探针位置及酶切位点示意图，7A显示了目的基因上探针序列位置及Hind III酶切位点；7B显示了色选基因上探针序列位置及EcoRI酶切位点。

图8是转化事件7R-1425D以OsCYP704B2为探针的预期杂交片段大小及Hind III酶切位点示意图。

图9是转化事件7R-1425D以Zm-AA1和DsRed(r)为探针预期杂交片段大小及EcoR I酶切位点示意图。

图10是转化事件7R-949D T2、T3和T4代植株以目的基因为探针的Southern blot结果，其中电泳泳道1、7和13：分子量标准；2、8和14：阳性对照(质粒DNA)+武运粳7号DNA-BamHI；3、9和15：阴性对照(武运粳7号ms26/ms26突变体DNA-BamHI)；4、5和6：7R-949D-HindIII-T2代3个独立的转基因单株；10、11和12：7R-949D-Hind III-T3代3个独立的转基因单株；16、17和18：7R-949D-Hind III-T4代3个独立的转基因单株。

图11是转化事件7R-949D T2、T3和T4代植株以色选基因为探针的Southern blot结果，其中电泳泳道1、7和13：分子量标准；2、8和14：阳性对照(质粒DNA)+武运粳7号DNA-BamHI；3、9和15：阴性对照(武运粳7号ms26/ms26突变体DNA-BamHI)；4、5和6：7R-949D-EcoRI-T2代3个独立的转基因单株；10、11和12：7R-949D-EcoR I-T3代3个独立的转基因单株；16、17和18：7R-949D-EcoR I-T4代3个独立的转基因单株。

图12是转化事件7R-1425D T2、T3和T4代植株以OsCYP704B2基因为探针的Southern blot结果，其中电泳泳道1、7和13：分子量标准；2、8和14：阳性对照(质粒DNA)+武运粳7号DNA-BamHI；3、9和15：阴性对照(武运粳7号ms26/ms26突变体DNA-BamHI)；4、5和6：7R-1425D-Hind III-T2代3个独立的转基因单株；10、11和12：7R-1425D-Hind III-T3代3个独立的转基因单株；16、17和18：7R-1425D-Hind III-T4代3个独立的转基因单株。

图13是转化事件7R-1425D T2、T3和T4代植株以Zm-AA1基因为探针的Southernblot结果，其中电泳泳道1、7和13：分子量标准；2、8和14：阳性对照(质粒DNA)+武运粳7号DNA-BamHI；3、9和15：阴性对照(武运粳7号ms26/ms26突变体DNA-BamHI)；4、5和6：7R-1425D-EcoR I-T2代3个独立的转基因单株；10、11和12：7R-1425D-EcoR I-T3代3个独立的转基因单株；16、17和18：7R-1425D-EcoR I-T4代3个独立的转基因单株。

图14是转化事件7R-1425D T2、T3和T4代植株以DsRed(r)基因为探针的Southernblot结果，其中电泳泳道1、7和13：分子量标准；2、8和14：阳性对照(质粒DNA)+武运粳7号DNA-BamHI；3、9和15：阴性对照(武运粳7号ms26/ms26突变体DNA-BamHI)；4、5和6：7R-1425D-EcoR I-T2代3个独立的转基因单株；10、11和12：7R-1425D-EcoR I-T3代3个独立的转基因单株；16、17和18：7R-1425D-EcoR I-T4代3个独立的转基因单株。

图15是RT-PCR鉴定T2代转化事件7R-949D 3个目标基因表达模式图，其中根为苗期根；茎为苗期茎；叶为苗期叶；P3期为颖花原基分化期幼穗；P6期为花粉母细胞减数分裂时期幼穗；P8期为花粉成熟期幼穗；种子为籽粒成熟期的种子；突变体为武运粳7号ms26/ms26；野生型为武运粳7号；空白对照为以水为扩增模板；阳性对照为以转化体基因组DNA为扩增模板。

图16是RT-PCR鉴定T2代转化事件7R-1425D 3个目标基因表达模式图，其中根为苗期根；茎为苗期茎；叶为苗期叶；P3期为颖花原基分化期幼穗；P6期为花粉母细胞减数分裂时期幼穗；P8期为花粉成熟期幼穗；种子为籽粒成熟期的种子；突变体为武运粳7号ms26/ms26；野生型为武运粳7号；空白对照为以水为扩增模板；阳性对照为以转化体基因组DNA为扩增模板。

图17显示了根据本发明一个实施例，水稻核隐性不育ms26/ms26突变体为转化受体材料，通过转基因所得到的转化体通过自交得到不育系的示意图，其中受体(ms/ms)指纯合隐性核雄性不育转基因受体材料；保持系含有纯合隐性核雄性不育位点和转基因杂合位点，因此为可育；不育系含有纯合隐性核雄性不育位点且不含转基因，因此为雄性不育；保持系产生的花粉一半含有转基因，一半不含有转基因；保持系结实产生50％的不育系种子和50％的保持系种子。

发明详细描述

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。

术语“事件”指包括异源DNA的原始转化体和该转化体包括但不限于通过自交或杂交或无性繁殖产生的子代。通过用异源DNA，即，包括目标转基因的核酸构建体对植物细胞进行转化，由转基因插入到特定植物基因组中产生的植物群体的再生，和选择以对特定基因组位置的插入为特征的特定的植物，来产生转基因“事件”。因而，术语“事件”还指通过在转化体和另一个包括异源转基因DNA和侧翼基因组DNA的品种之间进行有性的异型杂交生产的子代。术语“事件”还指来自原始转化体的、包含插入的DNA和紧密邻近于插入的DNA的侧翼基因组序列的DNA，期待着将其转移到子代中，该子代作为包括插入的DNA的一个亲本系(例如，原始转化体和自交或无性繁殖的子代)与不含有该插入的DNA的亲本系进行有性杂交的结果，接受了包括目标转基因的插入DNA。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：发明人以水稻核隐性不育突变体为转化受体材料，通过将紧密连锁的3个目标基因转化至不育突变体中，其中，育性恢复基因可使转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。例如，根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性不育ms26/ms26突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至不育系：育性恢复基因OsCYP704B2可使转化受体育性恢复，花粉失活基因Zm-AA1可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，荧光色选基因DsRed(r)用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。

由此，在本发明的一个实施例，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括：第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码水稻雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码花粉失活基因。利用该构建体，能够有效地将水稻雄性不育恢复基因和花粉失活基因引入到水稻植株例如水稻纯合隐性雄性不育植株中，从而得到携带外源基因的可育株作为保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系。另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交之中的亲本。由此，可以有效地用于水稻杂交。

在本文中，构建体的形式不受特别限制，根据本发明的具体示例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体(有时也称为表达载体、遗传载体或载体)呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。根据本发明的实施例，可以采用Ti载体，例如可以采用将第一和第二表达盒设置在表达载体p7R的T-DNA之左右边界之间。由此，可以通过农杆菌介导的转化方法将第一和第二表达盒转化至受体植株，例如水稻ms26隐性核雄性不育突变体中。由此，可以获得不含除草剂抗性标记基因和抗生素抗性标记基因的水稻转化株系。如此获得的转化株系有如下特点：(1)转化位点在各世代始终处于杂合状态，因此有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)，所以外源基因仅通过雌配子传递至下一代，不会通过花粉漂移到环境中；(2)转化体自交可结实，所结可育种子(带荧光标记)与不育种子(不带荧光标记)的比例为1∶1，可育株(带有外源基因)用作保持系，可以通过自交方便地、源源不断地生产不育系和保持系，不育株(不含转基因成分)在生产上用作杂交制种的亲本；(3)因为不育株不含转基因，因此用其生产的杂交种子不含转基因，用此杂交种生产的水稻商品粮食更不含转基因，从而消除了转基因生物安全的隐患。该新型杂交育种体系为充分利用水稻杂种优势提供了切实可行的技术新突破。

在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的载体，优选核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的实施例，水稻雄性不育恢复基因的类型并不受特别限制。在本发明的一个实施例中，所述水稻雄性不育恢复基因编码具有如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的蛋白质。即，可以采用的水稻雄性不育恢复基因为OsCYP704B2，由此，可以将其作为水稻受体ms26纯合突变体(完全雄性不育)的野生型育性恢复基因。OsCYP704B2基因编码的蛋白属于细胞色素P-450家族，在花药发育的P8到P10阶段的绒粘层和小孢子中特异表达。该基因突变后会导致绒粘层膨胀，花粉外壁残缺而发育终止及花药角质层终止发育，从而导致植株雄性不育，而雌性育性正常。进一步的化学成分分析发现，在该基因缺失突变体的花药中，几乎检测不到角质单体，进而发现该基因的功能是催化产生含有16和18个碳链的羟基脂肪酸。

根据本发明的具体实施例，在本发明的一个实施例中，所述水稻雄性不育恢复基因具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。与野生型的OsCYP704B2基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示)相比，SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列引入了三个单核苷酸突变，但不改变其编码的氨基酸序列，这三个单核苷酸突变在OsCYP704B2基因编码区上的位置及具体突变分别为：238位核苷酸A突变为C；240位的核苷酸G突变为C；243位的核苷酸G突变为C。发明人惊奇地发现，利用该SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列能够便于在各种分子鉴定中区别外源基因与内源基因，并且能够更有效地使水稻ms26/ms26不育受体植株的育性得到恢复。水稻受体ms26纯合突变体是经过辐射诱导所得，突变是由3103bp缺失(包含OsCYP704B2大部分片段)导致(缺失区段物理位置：ensembl plants oryza japonica group version64.6(MSU6)chromosome 3：3,701,319-3,704,421)。大片段缺失突变使回复突变的概率极低，因此不育性状稳定，从而保障了不育系的稳定性，降低杂交制种风险。

在本发明的一个实施例中，所述第一表达盒还可以进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地相连，所述第一启动子为雄配子特异性启动子；以及第一终止子，所述第一终止子与所述第一核酸分子可操作地相连。根据本发明的实施例，第一启动子和第一终止子的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，对于OsCYP704B2基因，可以采用OsCYP704B2的内源启动子、ORF区及终止区的序列，均为野生水稻基因组序列。在本发明的一个实施例中，所述第一启动子具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第一终止子具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，利用该启动子和终止子的组合，能够进一步显著地提高表达相应蛋白的效率，进而能够提高利用构建体构建不育系的效率，并且能够更有效地使水稻ms26/ms26不育受体植株的育性得到恢复。

根据本发明的实施例，花粉失活基因的类型并不受特别限制。根据本发明的实施例，所述花粉失活基因编码具有如SEQ ID NO：21所示氨基酸序列的蛋白质。由此，可以编码Zm-AA1所编码的α-淀粉酶。α-淀粉酶属于糖基水解酶。该基因是从授粉10天后的玉米胚和胚乳的cDNA文库中分离得到，其功能是催化水解多糖分子(例如淀粉)的(1-4)-α-D-葡萄糖苷。玉米内源的Zm-AA1基因主要在萌发的种子的盾片组织中表达，玉米花粉中检测不到该基因的表达。根据本发明的实施例，所述花粉失活基因具有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高表达相应蛋白的效率。根据本发明的实施例，第二表达盒进一步包括：第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地相连，所述第二启动子为花粉特异性启动子；以及第二终止子，所述第二终止子与所述第二核酸分子可操作地相连。由此，可以更有效的提高相应基因的表达效率。另外，根据本发明的实施例，在第二表达盒中还可以进一步包括编码导肽的序列，由此，第二表达盒可以有效地编码具有导肽的花粉失活蛋白，由此，可以使得目的基因(花粉失活基因)能够被靶向定位到特定的细胞器中。例如，根据本发明的实施例，编码导肽的序列具有如SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列(来自于玉米的brittle-1基因的编码导肽(TP)的序列)。由此，可以有效地将所表达的蛋白靶向淀粉体，分解花粉中的淀粉，从而使花粉失去活力，丧失授精能力，造成转基因花粉失活。进而，根据本发明的具体实施例，该基因在玉米花粉特异性启动子PG47驱动下，与来自于玉米的brittle-1基因的编码导肽(TP)的序列及终止子IN2-1组成表达框，可在发育后期的成熟花粉中特异性表达淀粉酶，并靶向淀粉体，分解花粉中的淀粉，从而使花粉失去活力，丧失授精能力，造成转基因花粉失活。该设计使得所有含有此基因的转基因花粉失活，不能授精还能严格防止基因漂移等生物安全问题，失活的花粉不能与周围其它植株或杂草授粉，因而转基因不能通过花粉漂移到环境中。

另外，根据本发明的实施例，构建体还可以进一步包括：第三表达盒，所述第三表达盒包含第三核酸分子，所述第三核酸分子编码筛选基因，所述筛选基因为发光基因。由此，便于通过筛选基因的表达来确定植物及其部分是否含有构建体所引入的基因。

根据本发明的实施例，可以采用选自红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1基因和草丁膦乙酰转移酶编码基因的至少一种作为筛选基因。在本发明的一个实施例中，可以采用红色荧光蛋白作为筛选基因。红色荧光蛋自基因(DsRed)，来源于礁珊瑚(Discosoma sp.)，是表达框内唯一非粮食作物来源的基因序列。红色荧光蛋白最大吸收波长为558nm，最大发射波长为583nm。将DsRed编码的氨基酸序列通过与过敏原及毒蛋白序列比对显示，相似性极低，无毒性及致敏性。DsRed常用作遗传转化的筛选基因，从未发生过转基因生物安全事题。在本发明的一个实施例中，所述筛选基因具有如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。由此，可以更加有效地表达红色荧光蛋白，增强DsRed基因在水稻中的表达。SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列与野生型DsRed基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示)相比，具有两个单核苷酸突变，命名为DsRed(r)。这两个单核苷酸突变分别为：由第21位碱基C转换为G、由第315位碱基G转换为C。发明人惊奇地发现，可以更加有效地表达红色荧光蛋白，增强红色荧光蛋白基因在水稻中的表达。

在本发明的一个实施例中，所述第三表达盒进一步包括：第三启动子，所述第三启动子与所述第三核酸分子可操作地相连，所述第三启动子为愈伤组织或种子特异性的启动子；第三终止子，所述第三终止子与所述第三核酸分子可操作地相连。在本发明的一个实施例中，所述第三启动子具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第三终止子具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，DsRed(r)的开放读码框连接于来自玉米且为愈伤组织和种子(胚和胚乳)特异性启动子END2和来自马铃薯的终止子Pin II之间，重组成DsRed(r)基因表达盒(END2：：DsRed(r)：：PINII)。含有该表达框的水稻种子在荧光激发下呈现非常容易辨认的红色，因此该表达框在本发明中用于辨认和分选保持系和不育系种子。

由此，根据本发明的实施例，可以利用根据本发明的实施例的构建体，以非转基因隐性核雄性不育水稻(ms26/ms26)作为转化的受体，进行遗传转化，得到整合含有以下紧密连锁的三个外源基因DsRed(r)，Ms26，Zm-AA1的水稻保持系，Ms26即OsCYP704B2育性基因。外源基因的插入与内源雄性不育位点(ms26/ms26)是非连锁的，因此得到的转基因水稻保持系含有独立的纯合的ms26隐性不育位点及杂合的外源基因(包括OsCYP704B2基因)整合位点。

由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到水稻的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，在本发明的第二方面，本发明提出了一种水稻细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该水稻细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。在本发明的一个实施例中，所述水稻细胞、组织或器官来自水稻纯合隐性雄性不育植株。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。由此，本发明的水稻细胞、组织或器官，可以有效地用于构建雄性不育株。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该水稻细胞、组织或器官，不再赘述。

由此，在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建水稻雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，参考图17，该方法包括：将前面所述的构建体引入到第一水稻纯合隐性雄性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能够产生可育雄性配子，并且第二水稻植株中的外源基因处于杂合状态，因此第二水稻植株中有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)。进而培育所得到的第二水稻植株，通过第二水稻植株即转化体的自交受精，可以得到不携带外源基因的种子，从而构建水稻雄性不育系。根据本发明的实施例，第一水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。另外，根据本发明的实施例，可以通过荧光检测进行分拣的步骤，即通过检测水稻种子是否携带发光基因，例如是否发出荧光来进行分拣，区分其是否携带外源基因。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将前面所述的构建体引入到水稻植株中；以及将所述水稻植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。在本发明的一个实施例中，所述水稻植株为水稻纯合隐性雄性不育植株。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种转化事件。根据本发明的实施例，所述转化事件是通过将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中获得的。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。在本发明的一个实施例中，所述转化事件为选自7R-949D和7R-1425D的至少一种。在本发明的一个实施例中，通过农杆菌介导法引入所述构建体。

根据本发明的实施例，本发明利用农杆菌转化法将紧密连锁的OsCYP704B2、ZM-AA1及DsRed(r)基因转化到水稻中，获得了遗传稳定的7R-949D和7R-1425D转基因水稻株系。采用TAIL-PCR技术，对T1代植株T-DNA插入位置的旁侧序列进行了扩增，获得旁侧序列；将获得的旁侧序列进行测序分析，并与数据库(MSU Rice Genome Annotation ProjectRelease 7，发布时间2011年10月31日，卸：//卸.plantbiology.msu.edu/pub/data/Eukaryotic_Projects/o_sativa/annotation_dbs/pseudomolecules/version_7.0/)中水稻基因组序列进行比对，发现7R-949D和7R-1425D的T-DNA插入位点分别定位在第3号染色体短臂近着丝粒处(物理位置为Chr3：14,746,015-14,746,027)和第1号染色体长臂远端(物理位置为Chr1：42,215,016-42,215,095)，两者均未插入水稻内源基因内部；而后，对接合区域进行PCR扩增以验证外源T-DNA插入位置并初步推测T-DNA整合方式，即以旁侧序列及T-DNA侧序之间为靶序列进行PCR扩增，结果与预期相符，进一步证实了T-DNA插入位点的正确性，并且显示7R-949D为反向串联的双拷贝整合，而7R-1425D内T-DNA为单拷贝插入。

由此，在本发明的第七方面，本发明提出了一种水稻转化事件7R-949D。根据本发明的实施例，该水稻转化事件7R-949D的基因组中包含选自SEQ ID NO：13、14、17、18和53的至少一种DNA序列。另外，根据本发明的实施例，本发明提出了一种植物，其中，所述植物包含水稻转化事件7R-949D。即在该植物的基因组中包含了选自SEQ ID NO：13、14、17、18和53的至少一种DNA序列或其互补序列。并且本发明提出了由该植物衍生得到的种子、细胞和组织。在本发明的第八方面，本发明提出了一种水稻转化事件7R-1425D。根据本发明的实施例，该水稻转化事件7R-1425D的基因组中包含选自SEQ ID NO：15、16、19、20和54的至少一种DNA序列。另外，根据本发明的实施例，本发明提出了一种植物，其中，所述植物包含水稻转化事件7R-1425D。即在该植物的基因组中包含了选自SEQ ID NO：15、16、19、20和54的至少一种DNA序列或其互补序列。并且本发明提出了由该植物衍生得到的种子、细胞和组织。

另外，本发明还提供了一种转基因检测方法及其组合物，用于检测来自水稻事件7R-949D的植株或种子，或来自该转基因植株的部分或种子的产物的转基因/基因组DNA连接区的检测。转化事件7R-949D，其完整外源插入序列为如SEQ ID NO：53所示，其T-DNA区与插入位点的5’侧翼序列构成的连接序列(又称嵌合DNA分子)如SEQ ID NO：17所示，其中第1-10位的核苷酸序列为水稻内源基因组DNA，第11-20位的核苷酸序列为外源插入的T-DNA序列；与3’端侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO：18所示，其中第1-10位的核苷酸序列为外源插入的T-DNA序列，第11-20位的核苷酸序列为水稻内源基因组DNA。在本发明中，上述连接序列还可以在SEQ ID NO：17和18的基础上，包括更长的基因组DNA序列和外源插入的T-DNA序列，更具体的，所述外源插入T-DNA序列与插入位点的5’侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO：13所示，其中SEQ ID NO：13的第884-903位核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；所述外源插入T-DNA序列与插入位点的3’侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO：14所示，其中SEQ ID NO：14的第497-516位核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。所有这些序列以及包含这些序列的植物和种子构成本发明的一个方面。由此，本发明提供了一种新的DNA序列，该序列来自转化事件7R-949D的DNA转基因/基因组区域的SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：14或其互补DNA分子。在其基因组中包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：53、SEQID NO：14或其互补DNA分子的水稻植株和种子均在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一组PCR引物用于转化事件7R-949D的DNA检测，其中，该一组PCR引物包含第一PCR引物和第二PCR引物，其中第一PCR引物包含SEQ ID NO：13的T-DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，第二PCR引物来自SEQ ID NO：13的5’侧翼水稻基因组DNA区域的任何部分的的类似长度的连续多核苷酸，这些核酸分子作为引物分子在一起进行PCR扩增时是有效的。或是第一PCR引物包含SEQ ID NO：14的T-DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，第二PCR引物来自SEQ ID NO：14的3’侧翼水稻基因组DNA区域的任何部分的的类似长度的连续多核苷酸，该一组PCR引物在一起进行PCR扩增时是有效的。或是第一PCR引物和第二PCR引物均来自SEQ ID NO：53，包含序列SEQ IDNO：53的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，该一组PCR引物在一起进行PCR扩增时是有效的。通过使用上述引物进行PCR获得的扩增产物，可以用于检测出水稻转化事件7R-949D。所述DNA扩增产物中包含部分或全部的SEQ ID NO：13、14、17、18或53所示的DNA序列。

本发明还提供了一种转基因检测方法及其组合物，用于检测来自水稻事件7R-1425D的植株或种子，或来自该转基因植株的部分或种子的产物的DNA转基因/基因组连接区的检测。转化事件7R-1425D，其完整外源插入序列如SEQ ID NO：54所示，其外源插入T-DNA序列与插入位点的5’侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO：19所示，其中第1-10位的核苷酸序列为水稻内源基因组DNA，第11-20位的核苷酸序列为外源插入的T-DNA序列；外源插入T-DNA序列与插入位点的3’端侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO：20所示，其中第1-10位的核苷酸序列为外源插入的T-DNA序列，第11-20位的核苷酸序列为水稻内源基因组DNA。在本发明中，上述连接序列还可以在SEQ ID NO：19和20的基础上，包括更长的基因组DNA序列和外源插入的T-DNA序列，更具体的，所述外源插入T-DNA序列与插入位点的5’侧翼序列构成的连接序列可以如SEQ ID NO：15所示，其中SEQ ID NO：15的第817-836位核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；所述外源插入T-DNA序列与插入位点的3’侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO：16所示，其中SEQ ID NO：16的第398-417位核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。所有这些序列以及包含这些序列的植物和种子构成本发明的一个方面。由此，本发明提供了一种新的DNA序列，该序列来自转化事件7R-1425D的DNA转基因/基因组区域的SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：54或其互补DNA分子。在其基因组中包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16或其互补DNA分子的水稻植株和种子均在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一组PCR引物用于转化事件7R-1425D的DNA检测，该组PCR引物包括第三PCR引物和第四PCR引物。其中第三PCR引物包含SEQ ID NO：15的T-DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，第四PCR引物来自SEQ ID NO：15的5’侧翼水稻基因组DNA区域的任何部分的的类似长度的连续多核苷酸，这些核酸分子作为引物分子在一起进行PCR扩增时是有效的。或是第三PCR引物包含SEQ ID NO：16的T-DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，第四PCR引物来自SEQ ID NO：16的3’侧翼水稻基因组DNA区域的任何部分的的类似长度的连续多核苷酸，该组PCR引物作为引物分子在一起进行PCR扩增时是有效的。或是第三PCR引物和第四PCR引物均来自SEQ ID NO：54，包含序列SEQ IDNO：54的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，该组PCR引物在一起进行PCR扩增时是有效的。通过使用上述引物进行PCR获得的扩增产物，可以用于检测水稻转化事件7R-1425D。所述扩增产物中包含部分或全部的SEQ ID NO：15、16、19、20或54所示的DNA序列。

在本文中所使用的术语“引物”是分离的多核酸，其通过核酸杂交与互补的目标多核酸链退火形成引物和目标多核酸链的杂交体，然后通过聚合酶，例如DNA聚合酶沿目标多核酸链延伸。本发明的引物对涉及它们用于扩增目标多核酸分子的扩增的用途，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。

本发明的引物可以在严格条件下与目标DNA序列杂交。可使用任何常规的核酸杂交或扩增方法可以用于鉴定样品中来自7R-949D事件或7R-1425D的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下与其他核酸分子特异性杂交。如此处使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构并且有足够长度以在高严格条件下维持这种结构，则称为两个核酸分子能相互特异性地杂交。如果核酸分子显示出完全的互补性，则称核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如此处使用的，当一个分子的每一个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，称为分子显示出“完全的互补性”。如果分子的相互杂交具有足够的稳定性以允许它们在至少常规的“低严格”条件下保持相互的退火，称两个分子是“最低度互补的”。类似地，如果分子的相互杂交具有足够的稳定性以允许它们在常规的“高严格”条件下保持相互的退火，称所述分子是“互补的”。Sambrook et al.，1989，and by Haymes et al.(1985)描述了常规的严格条件。因而从完全互补性的偏离是可允许的，只要这种偏离不完全地排除分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子作为引物或探针，仅需在序列中充分的互补，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

如此处使用的，基本上同源的序列是在高度严格条件下与其相比较的核酸序列的互补物特异性杂交的核酸序列。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)约45℃，之后是在50℃用2.0×SSC洗涤，对本领域的技术人员是公知的。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格的约2.0×SSC、50℃到高度严格的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度可以从低度严格条件的室温下约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度和盐度可以都变化，或者温度或盐浓度保持不变而另一个变量发生改变。在优选的实施方式中，本发明的核酸将在中度严格条件下，例如在约2.0×SSC和约65℃下特异性地杂交需要扩增的核酸分子。

关于使用特定的扩增引物对进行目标核酸序列的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”是允许引物对仅与目标核酸序列杂交的条件，具有相应的野生型序列(或其互补物)的引物将与所述目标核酸序列结合，优选的在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物，扩增子。

术语“特异于(目标序列)”是指引物在严格杂交条件下仅与包含目标序列的样品中的目标序列杂交。

如在此使用的，“扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板的部分的目标核酸序列的核酸扩增的产物。例如，为了确定产自有性杂交的植物是否含有转基因事件7R-949D，或采集自田间的样品是否包含7R-949D，或植物提取物是否包含7R-949D。从植物组织样品或提取物中提取的DNA可以使用包括引物对的核酸PCR扩增方法，所述引物对包括来源于邻近插入的异源转基因DNA的插入位点的基因组区域的引物，和来源于插入的异源转基因DNA的第二引物，来产生对于事件DNA的存在是诊断性的扩增子。扩增子具有一定长度并具有序列，所述序列对所述事件也是诊断性的。扩增子的长度可根据引物对加上一个核苷酸碱基对、或加上约五十个核苷酸碱基对，或加上约两百五十个核苷酸碱基对，或加上约三百五十个核苷酸碱基对或更多的组合长度而变化。

做为选择，引物对可以来源于插入的T-DNA两侧的侧翼基因组序列，以获得包括整个T-DNA插入核苷酸序列的扩增子。来自植物基因组序列的引物对的成员可以选自距插入的转基因T-DNA分子一定距离内，该距离可以从一个核苷酸碱基对到约两万个核苷酸碱基对间变化。术语“扩增子”的使用要特别排除可在DNA热扩增反应中形成的引物二聚物。

可以通过本领域已知的各种核酸扩增反应方法的任一种，包括聚合酶链式反应(PCR)来实现核酸扩增。各种扩增方法是本领域已知的，这些方法以及本领域的其他DNA扩增方法可以用于本发明的实践中。可以提供多种技术来检测这些方法产生的扩增子。一个这种方法是Genetic Bit Ananlysis(Nikiforov，et al.，1994)，其中设计一DNA寡核苷酸，其覆盖邻近的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA转基因序列。将寡聚核苷酸固定在微孔平板的孔中。在对目标区域进行PCR之后(使用T-DNA插入序列中的一个引物，和邻近侧翼基因组序列中的一个引物)，单链PCR产物可与固定的寡聚核苷酸杂交并充当模板，用于利用DNA聚合酶和特异于期待的下一个碱基的标记的ddNTP进行单碱基延伸反应。读出过程可以是基于荧光的或基于ELISA的信号。信号指示了由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸导致的插入物/侧翼基因组序列的存在。

另一种方法是Winge(2000)描述的Pyrosequencing技术。在这个方法中设计一寡核苷酸，其覆盖邻近的基因组DNA和插入物DNA接点。使寡核苷酸与来自目标区域的单链PCR产物(一个引物在插入的序列中，一个在侧翼基因组序列中)杂交，在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷酸5’磷酸和萤光素的情况下孵育。分别地添加DNTPs，测量产生光信号的掺入。光信号指示了由于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸导致的转基因插入物/侧翼序列的存在。

Chen等(1999)描述的荧光偏振是可以用于检测本发明的扩增子的一种方法。使用这种方法设计一寡核苷酸，其覆盖基因组侧翼和插入的DNA接点。使寡核苷酸与来自目标区域的单链PCR产物(一个引物在插入的DNA序列中，一个在侧翼基因组DNA序列中)杂交，在存在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的情况下孵育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。利用荧光计测量偏振的变化可以测量掺入。偏振的变化指示了由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸导致的转基因插入物/侧翼基因组序列的存在。

(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)被描述为一种对DNA序列的存在进行检测和定量的方法，可以根据厂家提供的说明完全理解。简要地，设计一寡核苷酸探针，其覆盖基因组侧翼和插入的DNA接点。在存在热稳定聚合酶和dNTP的情况下，FRET探针和PCR引物(一个引物在插入的DNA序列中以及一个在侧翼基因组序列中)进行循环。FRET探针的杂交引起FRET探针上荧光部分从淬灭部分裂解和释放。荧光信号指示了由于成功的扩增和杂交产生的侧翼基因组/转基因插入物序列的存在。

在如Tyangi et al.(1996)中描述的，Molecular Beacons已经被用于序列检测中。简要地，设计一FRET寡核苷酸探针，其覆盖侧翼基因组和插入物DNA接点。该FRET探针的独特的结构造成其含有二级结构，该二级结构使荧光和淬灭部分保持邻近。在存在热稳定聚合酶和dNTP的情况下，FRET探针和PCR引物(一个引物在插入的DNA序列中以及一个在侧翼基因组序列中)进行循环。在成功的PCR扩增之后，FRET探针对目标序列的杂交引起探针二级结构的消除和荧光部分与淬灭部分的空间分隔，产生荧光信号。荧光信号指示了由于成功的扩增和杂交产生的侧翼基因组/转基因插入物序列的存在。

其他描述的方法，例如microfluidics提供了分离和扩增DNA样品的方法和设备。光染料用于检测和测定特定的DNA分子。包含用于检测DNA分子的电子传感器或结合特定DNA分子的纳珠并因而可被检测的纳试管(nanotube)设备(WO/06024023)对于检测本发明的DNA分子也是有用的。

由此，在本发明的第九方面，本发明提出了一种用于检测水稻转化事件的引物。根据本发明的实施例，该引物包括选自SEQ ID NO：13、14、15、16及其互补序列的至少一种。由此，可以通过PCR反应有效地对水稻转化事件进行检测，尤其是可以有效地检测水稻转化事件7R-949D和7R-1425D的至少一种。在本发明的第十方面，本发明提出了一种用于检测水稻转化事件的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前面所述的引物。

在本发明的第十一方面，本发明提出了一种用于制备杂交水稻的方法。根据本发明的实施例，该方法采用水稻雄性不育系，该水稻雄性不育系是通过前面构建水稻雄性不育系的方法构建的。由此，可以进一步利用本发明的水稻雄性不育系进行水稻杂交，提高水稻杂交的效率。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。

在本发明的第十二方面，本发明提出了水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。根据本发明的实施例，所述水稻雄性不育系是通过前面构建水稻雄性不育系的方法构建的。由此，可以进一步利用本发明的水稻雄性不育系进行水稻杂交，提高水稻杂交的效率。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该用途，不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明还提出了一种构建水稻雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，该方法包括采用水稻纯合隐性雄性不育植株作为母本，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因；将母本与轮回亲本进行回交转育，以便获得具有所述轮回亲本性状的水稻雄性不育系，其中，所述轮回亲本不具有Ms26基因的纯合隐性等位基因。由此，利用本发明的方法，可以在MS26纯合隐性雄性水稻不育系的基础上，发展更多的不同遗传背景的不育系。根据本发明的实施例，利用常规回交育种方法，所有不同类型的水稻都可以创制成相应的智能不育系(即可以源源不断地生产相应的不育系品种)，使杂种优势资源利用达到95％以上。

本发明还提出了一种含有特定外源DNA序列的转基因水稻的组合物和方法，所述特定外源DNA序列通过水稻转化的方法引入受体植株中，并获得在本文中被称为“事件7R-949D”或“7R-949D”或“949D”或“事件949D”的事件。转化的植株或种子也可以称为“水稻7R-949D”或“水稻949D”等。本发明还提供了用于鉴定由事件7R-949D所衍生出的子代或是含有所述事件DNA的植株的材料和方法。

本发明提出了含有特定外源DNA序列的转基因水稻的组合物和方法，所述特定的外源DNA序列通过水稻转化的方法引入受体植株中，并获得在本文中被称为“事件7R-949D”或“7R-1425D”或“1425D”或“事件1425D”的事件。转化的植株或种子也可以称为“水稻7R-1425D”或“水稻1425D”等。本发明还提供了用于鉴定由事件7R-1425D所衍生出的子代或是含有所述事件DNA的植株的材料和方法。

本发明的实施例中还提出了一种特异的侧翼序列，所述“侧翼序列”又称为“旁侧序列”，在本发明中，所述侧翼序列可用于开发生物样品中的事件7R-949D和7R-1425D的特异性鉴定方法。在一些实施方案中，还公开了7R-949D和7R-1425D的左边界和右边界的侧翼区域序列，这些侧翼序列可用于设计特定的引物和探针。本发明还提供了基于上述特异性引物和探针，对生物样品中是否包含7R-949D和7R-1425D进行鉴定的方法。

根据本发明的实施方案记载，本发明还提供了检测样品中与事件7R-949D和7R-1425D对应的DNA是否存在的方法。具体地，所述方法包括：(a)将包含DNA的样品与DNA引物接触，所述DNA引物与从包含事件7R-949D或7R-1425D的植株中提取出的基因组DNA进行核苷酸扩增反应时，可以产生用于鉴定事件7R-949D或7R-1425D的特定扩增子；(b)进行核酸扩增反应，产生扩增子；(c)检测鉴定所述扩增子。

含有事件7R-949D和7R-1425D中特定的外源插入序列与插入位点处的基因组旁侧序列所构成的连接序列的DNA分子，及与所述DNA分子同源或互补的序列，均在本发明的保护范围之内。

本发明实施方案中还提出了一种包含事件7R-949D中特定的侧翼序列或连接序列，具体如SEQ ID NO：13、14、17或18所示的DNA分子，和包含事件7R-1425D中特定的侧翼序列或连接序列，具体如SEQ ID NO：15、16、19或20所示的DNA分子。本发明实施方案中包括DNA序列，所述DNA序列由一条转基因插入序列和一条来自插入位点处的侧翼水稻基因组DNA组成，所述DNA序列可用于设计引物，所述引物可扩增出用于检测植物或植物材料中是否含有事件7R-949D或7R-1425D的扩增子产物。

本发明的实施方案中进一步提出了一种含有事件7R-949D的外源插入T-DNA区(其核苷酸序列如SEQ ID NO：53所示)的至少11个或更多个核苷酸的DNA序列，和含有事件7R-1425D的外源插入T-DNA区(其核苷酸序列如SEQ ID NO：54所示)的至少11个或更多个核苷酸的DNA序列，或上述DNA序列的互补序列，以及与7R-949D的SEQ ID NO：13、14、17或18所示的侧翼水稻基因组DNA序列具有相似长度的DNA序列或其互补序列，或是与7R-1425D的SEQID NO：15、16、19或20所示的侧翼水稻基因组DNA序列具有相似长度的DNA序列或其互补序列。上述DNA序列可作为DNA扩增中的引物序列。由上述引物所产生的扩增子可分别用于检测事件7R-949D或7R-1425D。因此，本发明的实施方案也包括由DNA引物产生的扩增子，所述DNA引物与7R-949D或7R-1425D的转基因T-DNA区或其特定的侧翼序列同源或互补。

本发明的实施方案中还提出了一种检测样品中对应于事件7R-949D或7R-1425D的DNA分子的方法，所述方法包括：(a)将从植物中提取出的DNA样品与DNA探针接触，所述探针包含在严谨杂交条件下能与从事件7R-949D或7R-1425D中提取的DNA杂交但在严谨杂交条件下不与对照植株DNA杂交的分子；(b)使样品和探针处于严谨杂交条件；(c)检测探针与DNA的杂交情况。更具体的，本发明实施方案中还提供了检测样品中对应于7R-949D或7R-1425D的特定DNA分子的方法，所述方法包括(a)将探针与样品接触，所述样品为从水稻植株中提取出的DNA，所述DNA探针分子选自事件中特定的序列如连接序列的部分序列，所述DNA探针分子在严谨杂交条件下可以与事件7R-949D或7R-1425D的DNA杂交，并且在严谨杂交条件下不能与对照水稻植株的DNA杂交；(b)使样品和探针处于严谨杂交条件下；(c)检测探针和DNA的杂交情况。

本发明实施方案进一步提供了一种生物样品中事件7R-949D或7R-1425D的DNA的检测试剂盒。所述试剂盒包含可用于PCR鉴定程序的第一引物和第二引物，所述第一引物可以特异性识别事件7R-949D或7R-1425D的左边界或右边界侧翼序列，所述第二引物可以特异性识别事件7R-949D或7R-1425D中的外源插入DNA序列。本发明实施方案还提出了另一种检测生物样品中事件7R-949D或7R-1425D的试剂盒，所述试剂盒包含一条特异性探针，所述特异性探针具有对应于以下序列或与以下序列互补的序列：与事件7R-949D或7R-1425D的特异性区域具有80％-100％的相似性的序列。对应于特异性区域的探针序列包含事件7R-949D或7R-1425D的部分5’或3’侧翼部分序列。

本发明实施方案还提出了一种为了其他目的而使用本发明已述及的实施方案中的方法和试剂盒，所述其他目的包括但不限于以下：鉴定植物、植物材料或产品中的事件7R-949D或7R-1425D，所述产品包括但不限于含有或源自植物的食品或饲料产品(新鲜的或加工过的)；为了区分出转基因材料和非转基因材料中的转基因材料；以及为了确定包含水稻事件7R-949D或7R-1425D的植物材料的质量。所述试剂盒还可以含有为了实施检测方法所必需的其他试剂和材料。

另一方面，本发明还提供了一种生产含有事件7R-949D或7R-1425D的子代植株的方法。所述子代植株可以是自交或杂交植株。在其他实施方案中，本发明提出了一种用于事件7R-949D或7R-1425D的标记辅助育种的方法。另一方面，本发明还提出了一种包含事件7R-949D或7R-1425D的稳定转化的水稻植株。

创制种子生产技术事件7R-949D和7R-1425D的多核苷酸序列连在同样的DNA载体上，所述多核苷酸序列插入到水稻基因组的特定位置后获得事件7R-949D和7R-1425D。在已述染色体位置上携带7R-949D事件的植物含有如SEQ ID NO：13、14、17或18所示的基因组/转基因插入序列构成的连接序列，在已述染色体位置上携带7R-1425D事件的植物含有如SEQ ID NO：15、16、19或20所示的基因组/转基因插入序列构成的连接序列。具有事件7R-949D或7R-1425D的基因组插入位点的特性是可以增强育种效率，并且使利用分子标记在育种群体及其子代中追踪转基因插入序列成为可能。本发明还提供了用于水稻事件7R-949D或7R-1425D的植物、植物部分、种子和谷类产品的鉴定、检测和使用的多种方法和组合物。

在一些实施方案中，创制水稻7R-949D或7R-1425D事件的多核苷酸序列还可以通过基因工程的方法进行分子聚集(molecular stack)。在其他实施方案中，所述分子聚集体还可以进一步包含至少一条其他的转基因多核苷酸序列。所述多核苷酸序列可以赋予制种技术其他的特性或赋予转化植株其他植物性状。

在某些实施方案中，可以将目的多核苷酸序列进行任意组合创建分子聚集体，并转化植物以创制出具有所需性状组合的植株，以实现植物性状的聚集。本发明中所述的“性状”，是指特定DNA序列或DNA序列群组表达后所呈现出的表型。所述生成的组合还可以包括任何一个或多个目的多核苷酸序列的多个拷贝。所述性状聚集组合可以通过任何一种方法创制，包括但不限于通过传统方法进行植物育种，或是通过遗传转化的方法获得。如果序列是通过植物遗传转化来聚集的，则目的多核苷酸可以在任意时间、以任意方向进行组合。所述性状可以通过转化表达盒提供的目的多核苷酸序列在共转化操作步骤中引入。例如，如果要引入两条序列，那么两条序列可以包含在不同的转化表达盒(反式)中，或包含在同一个转化表达盒(顺式)中。所述序列的表达可以由同一个或是不同的启动子驱动。在某些情况，可能希望引入抑制目的多核苷酸序列表达的转化表达盒。也可以通过将抑制表达盒或过表达盒进行任意组合，以产生具有所需性状组合的植株。本领域技术人员还应该意识到，多核苷酸序列还可以通过位点特异性重组系统在所需的基因组位置进行聚集。上述技术参见专利WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，以上全部在此通过引用并入。

需要说明的是，根据本发明实施例的构建体及其用途是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。具体实施方式述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

具体实施方式

下面根据具体的实施例对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式解释为对本发明的限制。另外，除非特别说明，在下面的实施例中所涉及的方法为常规方法，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：载体构建

通过装配下述DNA元件，构建如图1所示的被称为p7R的表达载体：

1)以pCAMBIA1300载体为基础，利用Xmn I和Bgl II酶切去除pCAMBIA1300质粒上的潮霉素抗性基因和花椰菜花叶病毒35S启动子序列；

2)基因表达盒END2：DsRed(r)-PINII，DsRed(r)基因(SEQ ID NO：1)的开放读码框连接于END2启动子(SEQ ID NO：2)和PINII终止子(SEQ ID NO：3)之间，重组成DsRed(r)的基因表达盒(END2：DsRed(r)：PINII)；

3)OsCYP704B2基因，目标基因OsCYP704B2及其启动子和终止子的全长核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其中OsCYP704B2基因的启动子序列如SEQ ID NO：7所示，其终止子序列如SEQ ID NO：8所示，OsCYP704B2基因的基因组DNA序列如SEQ ID NO：5所示，其核苷酸序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

4)基因表达盒PG47：ZM-BT1：ZM-AA1：IN2-1，目标基因ZM-AA1(其核苷酸序列如SEQID NO：9所示)的开放读码框连接于启动子PG47(其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示)、转运肽ZM-BT1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示)的下游，终止子IN2-1(其核苷酸序列如SEQID NO：12所示)的上游。

具体地，载体p7R的构建流程具体描述如下：

第一步，从玉米愈伤组织的cDNA中扩增花粉失活基因ZM-AA1和编码导肽的ZM-BT1，从玉米基因组DNA中扩增获得PG47启动子。其中，用于扩增ZM-AA1的扩增引物为：

F3：

方框内为Bgl II酶切位点，

R3：AAGGTCGTCCGGGCGGCCTGCGGCCTGGTCCAGGCAC(SEQ ID NO：38)，其中下划线标示的核苷酸序列为15bp的重叠序列；

用于扩增ZM-TP的扩增引物为：

F4：CGCCCGGACGACCTTGGGATCG(SEQ ID NO：39)；

R4：ATGGCGGCGACAATGGCAGTGAC(SEQ ID NO：40)；

用于扩增PG47启动子的引物为：

F5：CATTGTCGCCGCCATGGTGTCGTGATCGATGCTTTAT(SEQ ID NO：41)，

R5：CGACTCTAGAGGATCTGCACCGGACACTGTCTGGTGG(SEQ ID NO：42)，其中下划线标示的核苷酸序列为15bp重叠序列)。

采用In-Fusion的方法将扩增所得到的ZM-AA1基因，ZM-BT1导肽，PG47启动子三个片段连入BamHI酶切开的双元载体pCAMBIA1300上，得到中间载体A。

第二步，PCR扩增人工合成的红色荧光蛋白基因PINII-DsRed(r)序列，其中人工合成的PINII-DsRed(r)序列为如SEQ ID NO：43所示，其扩增引物为：

F1：

R1：

其中斜体下划线标示的核苷酸序列为15bp的重叠序列。

从玉米基因组DNA中扩增END 2序列，其扩增引物为：

F2：

R2：

其中斜体下划线标示的核苷酸序列为15bp的重叠序列。

采用In-Fusion的方法将扩增得到的PIN II-DsRed(r)片段与来自玉米且为愈伤组织和种子(胚和胚乳)特异性启动子END 2片段同时连入Xmn I与Bgl II酶切的中间载体A，得到中间载体B。

第三步，人工合成IN2-1的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO：48所示。用EcoR I与Bgl II双酶切人工合成的IN2-1序列，其中，人工合成的IN2-1序列如下所示：

其中下划线序列为IN2-1序列，其余序列为载体连接区序列，方框标示的序列依次分别为：Bgl II，Asc I，Nru I和EcoR I酶切位点，其中Bgl II酶切位点后五个碱基在IN2-1序列上，另外有Asc I，Nru I和EcoR I三个酶切位点在载体连接区序列上。酶切人工合成的IN2-1序列所在的质粒，连入同时用EcoR I与Bgl II双酶切的中间载体B，得到中间载体C。

第四步，将OsCYP704B2基因分为两段，分别是CYP1和CYP2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61所示。从水稻基因组DNA中，分别扩增CYP1和CYP2。

其中，CYP1的扩增引物为：

F6：

方框内为Nru I酶切位点；

R6：

方框内为Sal I酶切位点，下划线标识的碱基是为了区分水稻内源的OsCYP704B2基因序列，并且提高表达效率而特意引入的三个SNP；

CYP2的扩增引物为：

F7：

方框内为Sal I酶切位点，下划线标识的是为了区分水稻内源CYP序列，并且提高表达效率而特意引入的三个SNP；

R7：

方框内为Asc I酶切位点

将所得到的两个扩增产物，连T-载体测序正确后，再分别用Nru I与Sal I，以及Sal I和Asc I双酶切，同时连入用Nru I和Asc I双酶切的中间载体C，即得到7R载体，也称为p7R。

实施例2：水稻转化

利用热激法将质粒p7R转入农杆菌AGL0菌株，利用农杆菌介导法对水稻进行共转化(Hiei，et al.Efficient transformation of rice mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.

(1994)Plant J6(2)：271-282，通过参照将其并入本文)。具体的转化受体材料为水稻ms26完全雄性不育纯合突变体，该突变体是经过辐射诱导所得，突变是由3103bp缺失(包含OsCYP704B2大部分片段)导致(缺失区段物理位置：ensembl plants oryza japonicagroup version 64.6(MSU6)chromosome 3：3,701,319-3,704,421)。大片段缺失突变使回复突变的概率极低，因此不育性状稳定，从而保障了不育系的稳定性，降低杂交制种风险。利用农杆菌将质粒p7R转化水稻受体材料，利用载体中的DsRed(r)基因编码的红色荧光蛋白作为筛选标记，通过3-4轮的愈伤荧光筛选切割后，分化得到转基因植株，该构建体经过水稻转化得到阳性转基因材料1000株以上，进一步通过插入位点、拷贝数、载体骨架污染等分析后，结合田间观察到的花粉失活效果、结实率、种子分离比例等结果，从中优选出两个转基因事件7R-949D和7R-1425D。

实施例3：转化事件的花粉育性检测

对实施例2中所得到的两个转基因事件7R-949D和7R-1425D进行观察分析发现，本发明所得到的转基因植株和非转基因对照植株之间没有观察到明显的形态上的不同。

以转化受体品系对应的野生型非转基因水稻品种武运粳7号(可育，下面简称为CK1)和转基因水稻对应的非转基因水稻品系武运粳7号ms26突变体(不育，下面简称为CK2)为对照，进行花粉可染率检测。

在水稻开花晚期，从大田的转基因水稻、CK1及CK2小区各随机抽取单株，各株取一朵花，每朵花取1个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1％的I2-IK溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数(图2显示了染色后的可育花粉粒和不可育花粉粒)。分别计算转基因水稻、CK1及CK2花粉可染率各材料3次重复的平均数的标准差。在CK1正常可育和CK2正常不育的前提下，通过χ2测验，分析转基因水稻的花粉可染率与理论值(50％)有无显著差异。

结果显示，7R-949D株系T2代植株上的花粉(T3代基因型)的可染率如下表1所示。本试验利用I2-KI染色法对随机抽取的17个植株的花粉分离比例(3次重复的平均数)进行了调查，从表1中可以看出，可育对照(CK1)的可育率在98.6％～100％之间；不育对照(CK2)可育率为0；通过χ2-检验(自由度为1)，17个7R-949D单株中，除单株9的卡方值(7.454)微高于临界值(3.81)外，其它16朵花朵中可育花粉与不育花粉分离比例均在P≤0.05水平，符合1∶1的比例。

7R-1425D株系T2代植株上的花粉(T3代基因型)的可染率如表2所示。随机抽取的17个植株，计算3次重复的平均数。从表2中可以看出，可育对照(CK1)的可育率在95.0.1％～99.8％之间；不育对照(CK2)可育率为0；通过χ2-检验(自由度为1)，17个7R-949D单株中，除单株3的卡方值(6.426)高于临界值(3.81)外，其它16朵花朵中可育花粉与不育花粉分离比例均在P≤0.05水平，符合1∶1的比例。

该结果表明，转化事件7R-949D和7R-1425D中的T-DNA外源基因在各世代均处于杂合状态，因此有一半花粉不含外源基因(可育)，一半含有外源基因(不育)，且ZM-AA1表达框可以有效地分解花粉中的淀粉，从而使含有外源基因的花粉失去活力，丧失授精能力，造成转基因花粉失活。该设计使得上述两个转化事件中，含有ZM-AA1基因的转基因花粉全部失活，不能授精还能严格防止基因漂移等生物安全问题，失活的花粉不能与周围其它植株或杂草授粉，因而转基因也不能通过花粉漂移到环境中。

表1：转化体7R-949D T₂代植株上花粉I₂-KI染色分析

注：X² _0.05(1)＝3.81，*表示显著水平0.05下认为符合1∶1比例。

表2：转化体7R-1425D T₂代植株上花粉I2-KI染色分析

注：X² _0.05(1)＝3.81，*表示显著水平0.05下认为符合1∶1比例。

实施例4：荧光种子与非荧光种子分离比例

随机选取通过实施例2中所得到的7R-949D和7R-1425D的各24个T2代植株单株，对其上所结荧光与非荧光种子的分离比例进行了调查，结果如下表3所示。其中，χ2值(df＝1)低于临界值3.81，表明2个转化体每个植株上所结种子均符合1∶1分离比。说明本发明中所提供的表达载体各元件作为整体表达良好，即转化位点在转化事件的各个世代始终处于杂合状态，因此有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的一半花粉失活(即失去授精能力)，所以外源基因仅通过雌配子传递至下一代，不含有外源基因的另外一半花粉可以使转化体自交结实，所结荧光可育种子与非荧光不育种子的比例为1∶1，可育株(带有外源基因)用作保持系，可以通过自交方便地、源源不断地生产不育系和保持系，不育株(不含转基因成分)在生产上用作杂交制种的亲本。

表3：株系7R-949D和7R-1425D上自交所结荧光种子与非荧光种子数比例

注：X² _0.05(1)＝3.81，*表示显著水平在0.05以下，认为符合1∶1比例。

由上述实施例3和实施例4可以看出，本发明实现了其稳定创制水稻雄性不育系和保持系的发明目的。

实施例5：转化事件的侧翼序列分析

以实施例2中所得到的转基因水稻品系7R-949D和7R-1425D植株的基因组DNA为模板，p7R载体和水稻转化受体武运粳7号ms26突变体(不育)植株作为阴性对照，利用TAIL-PCR扩增T-DNA旁侧序列，获得转化事件7R-949D及7R-1425D的T-DNA旁侧序列，并分析验证T-DNA的整合方式。利用普通PCR验证推测的T-DNA整合方式，并分析外源基因是否插入已知水稻内源基因内部。

实验分析过程中所用的引物信息见表4。

表4 PCR扩增过程中用到的引物信息

将提取的水稻基因组DNA适当稀释，测定并记录其在260nm和280nm的紫外光吸收率，以一个OD260值相当于50μg/mL DNA浓度来计算纯化的DNA浓度。DNA溶液OD260/OD280的比值在1.7～2.0之间。4℃保存一周内使用。

根据刘耀光等人设计的改进过的热不对称交错PCR法(THERMAL ASYMMETRICINTERLACED PCR TAIL-PCR)(Liu et al.，Efficient amplification of insert endsequences from bacterial artificial chromosome clones by thermal asym-metricinterlaced PCR，(1998)Plant Molecular Biology Reporter 16(2)：175-181，通过参照将其并入本文)，在外源插入的T-DNA上设计3条嵌套的特异引物(SPECIALPRIMER，分别为SP1，SP2，SP3)，将SP1与随机简并引物(LONG ARBITRARYDEGENERATE PRIMER，LAD)组合，而SP2和SP3分别与锚定引物AC1组合，以基因组DNA为模板，根据引物长短和特异性差异设计不对称的温度循环，进行TAIL-PCR。其中，反应流程如表5所示。

表5 TAIL-PCR实验流程

制备1％的琼脂糖凝胶，将TAIL-PCR第二轮和第三轮的产物点入样品槽，120V恒压电泳20分钟，在紫外灯下观察凝胶，并将大小嵌套的产物切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN，北京)将PCR产物回收。利用T4连接酶(New England Biolabs，美国)将纯化回收的PCR产物连接到T-载体(Promega，美国)上，该体系于16℃反应过夜。连接体系如表6所示。

表6 T-载体连接体系

试剂	体积
		T4连接酶10X Buffer	2μl
T4连接酶	0.4μl
		PCR产物	2μl
pGEM-T	0.4μl
		去离子水	15.2μl

将上述16℃反应过夜的连接液转化大肠杆菌，挑取获得的单菌落，于含氨苄的LB培养液中37℃振荡培养(150rpm)5小时，提取DNA测序。

根据TAIL-PCR的结果，依据T-DNA插入位置的旁侧序列设计引物，与T-DNA内引物组合，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系如表7所示。

表7 PCR反应体系(20μl体系)

根据不同的引物设定PCR扩增条件，并将PCR产物跑琼脂糖凝胶检测。

将获得的旁侧序列进行测序分析，并与数据库(MSU Rice Genome AnnotationProject Release 7，发布时间2011年10月31日，ftp：//ftp.plantbiology.msu.edu/pub/data/Eukaryotic_Projects/o_sativa/annotation_dbs/pseudomolecules/version_7.0/)中水稻基因组序列进行比对，发现在7R-949D转化事件中，T-DNA插入在水稻第3号染色体短臂近着丝粒处，物理位置为Chr3：14，746，015-14，746，027，未插入已知水稻内源基因编码区，距上游基因LOC_Os03g25760的起始密码子4411bp，距下游基因LOC_Os03g25770的终止密码子5804bp(图3，图4)。T-DNA整合导致整合位点处基因组序列缺失11个碱基，缺失序列如SEQ ID NO：63所示，为5’GGGGGTCGGTG 3’，该缺失序列未破坏水稻内源基因编码区。

在7R-1425D转化事件中，T-DNA插入在水稻第1号染色体长臂远端，物理位置为Chr1：42，215，016-42，215，095，且未插入已知水稻内源基因编码区，距上游基因LOC_Os01g72760终止密码子1343bp，距下游基因LOC_Os01g72780起始密码子1953bp(图5，图6)。T-DNA整合导致基因组序列缺失78个碱基，缺失序列如SEQ ID NO：62所示，该缺失序列未破坏水稻内源基因编码区。

在两个转化事件中，T-DNA均未插入已知的水稻内源基因内部。对外源T-DNA与插入位置的基因组DNA的接合区域进行PCR扩增来验证外源T-DNA插入位置并推测T-DNA整合方式，即以旁侧序及T-DNA侧序列之间为靶序列进行PCR扩增，结果进一步证实了T-DNA插入位点的正确性，并且显示7R-949D为反向串联的双拷贝单位点整合，其结果如图4所示，所插入的外源T-DNA的5’端和3’端旁侧序列的具体核苷酸序列分别如SEQ ID NO：13和SEQ IDNO：14所示；而7R-1425D的T-DNA为单拷贝插入，其结果如图6所示，插入的外源T-DNA的5’端和3’端旁侧序列的具体核苷酸序列分别如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示。

进一步，通过测序分析获得了插入转化事件7R-949D和7R-1425D的完整的外源T-DNA序列，该具体序列分别如SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54所示。通过分析两个转化事件中外源T-DNA片段的测序结果，证实转化事件7R-949D的基因组中整合有两个拷贝的外源T-DNA，且反向串联，其中一个拷贝与载体相同，另外一个拷贝内的PG47启动子缺失1965bp，该缺失不影响各元件及表达框的正常生物学功能，转化事件7R-1425D的基因组中则只整合有一个完整拷贝的T-DNA。

实施例6：转化事件中外源基因整合稳定性分析

为了验证上述转化事件中外源基因插入物的拷贝数和完整性，本发明采用Southern blot印记分析的方法对上述转化事件进行分析。

根据载体中的T-DNA序列设计探针，其中用于检测转化事件7R-949D中目的基因(包含OsCYP704B2和ZM-AA1表达框)的探针序列如SEQ ID NO：55所示，检测色选基因DsRed(r)的探针序列如SEQ ID NO：56所示。转化事件7R-949D中外源T-DNA上的探针结合位置及酶切位点如图7所示，其中图7A显示了目的基因上探针序列位置及Hind III酶切位点；图7B显示了色选基因上探针序列位置及EcoR I酶切位点。

用于检测转化事件7R-1425D中OsCYP704B2的探针序列如SEQ ID NO：57所示，检测花粉失活基因ZM-AA1的探针序列如SEQ ID NO：58所示，检测色选基因DsRed(r)的探针序列如SEQ ID NO：59所示。转化事件7R-1425D中外源T-DNA上的探针结合位置及酶切位点如图8和图9所示，其中图8显示了转化事件7R-1425D以OsCYP704B2为探针，HindIII酶切后，进行Southern blot所产生的预期片段大小；图9显示了转化事件7R-1425D分别以Zm-AA1和DsRed(r)为探针，EcoR I酶切后，进行Southern blot所产生的预期片段大小。

以转基因水稻株系7R-949D和7R-1425D的T2、T3和T4代植株，和转化受体材料武运粳7号ms26/ms26突变体为实验材料，通过以下的实验流程进行Southern blot印记分析。

1、DNA提取

按中华人民共和国农业行业标准NY/T674操作，提取水稻基因组DNA。将DNA适当稀释，测定并记录其在260nm和280nm的紫外光吸收率，以一个OD260值相当于50μg/mLDNA浓度来计算纯化的DNA浓度。DNA溶液OD260/OD280的比值在1.7～2.0之间。依据测得的浓度将DNA溶液稀释到100ng/μL，4℃保存一周内使用。

2、地高辛标记探针(随机引物法)

1ug(至少300ng)模板DNA，用无菌ddH2O稀释到16ul；

沸水浴煮10min，立即放入冰中；

混匀DIG-High Prime(瓶1)，加4ul到变性DNA中，混匀，稍加离心；

37℃反应过夜(约20小时)；

加入2ul 0.2M EDTA(Ph8.0)或65℃10min终止反应。

3、检测探针效率

将对照探针和标记好的探针进行一系列稀释后，直接点在膜上，通过标准检测来确定目的探针的标记效率。

4、电泳和转膜

(1)制备1％琼脂糖凝胶，恒压45V电泳过夜；

(2)溴酚兰距加样孔6-8cm左右时停止电泳。切掉加样孔及多余的胶，切掉左下角作标记；

(3)将凝胶浸入200ml，0.25M HCl中进行脱嘌呤处理约5-10min；

(4)将凝胶取出在去离子水中漂洗一下后，浸入变性液中，2×15min；

(5)将凝胶取出，在去离子水中漂洗一下，然后浸入中和液中，2×15min；

(6)将凝胶取出在去离子水中漂洗一下后，进行毛细转移；

(7)DNA的毛细转移：大培养皿中盛20×SSC→上架玻璃板→玻璃板上铺厚滤纸→赶气泡→将凝胶加样孔朝下放在滤纸桥上→周围用Parafilm膜盖住→胶上放等大的尼龙膜→赶气泡→膜上放四层与膜等大的滤纸→赶气泡→上放10cm厚的纸巾→放玻璃板→上压500g重物；

(8)毛细转移24h，取出膜在2×SSC中洗一下，夹于滤纸中，夹于滤纸中，254nmUV，紫外交联3min。

5、杂交

(1)预杂交：将膜浸入预热到杂交温度的(52℃)DIG Easy Hyb中(10ml/100cm²膜)，在杂交箱中52℃，60rpm，预杂交1h；

(2)将DNA探针(约25ng/ml DIG Easy Hyb)在100℃变性10min后，立即放到冰上，冷却10min；

(3)将变性的DNA探针加到预热的(52℃)DIG Easy Hyb中(3.5ml/100cm²膜)，轻柔混匀，避免泡沫；

(4)倒掉预杂交液，将杂交液倒入杂交瓶中，52℃，60rpm，杂交12-16小时；

(5)杂交结束，回收杂交液，-20℃可保存1年，再用时68℃加热10min重新变性探针。

6、洗膜

1)低严谨性(高盐，低温)：充足的2×SSC+0.1％SDS，室温60rpm洗涤2×15min；

2)高严谨性(低盐，高温)：0.5×SSC+0.1％SDS(预热到洗涤温度)，60rpm洗涤2×15min。

注：如果探针＞150bp且G/C％较高，应当在68℃洗膜；短于100bp时，洗涤温度同杂交温度。

7、检测

应用化学发光检测法，所有操作都在室温进行。

1)杂交结束并洗膜后，在Washing buffer中短暂冲洗膜约1-5min；

2)在80ml Blocking solution中封闭30min(轻摇)；

3)在20ml Antibody solution中反应40min；

4)转移膜入新容器，用Washing buffer洗两次，每次15min；

5)在20ml Detection buffer中平衡2-5min。

6)将膜DNA面朝上小心放入杂交袋中，吸取1ml CSPD ready-to-use(Kit瓶5)均匀应用到膜上，立即将杂交袋的上层盖在膜上，使底物均匀布满膜表面，并且避免气泡产生，室温反应5min；

7)挤出多余液体，将杂交袋的边缘封住(防止膜干燥)；

8)将膜放在37℃，10min，以强化发光反应；

9)曝光X-胶片15-25min，观察结果。

结论1、转化体7R-949D的T₂、T₃和T₄代植株中外源基因整合稳定性的Southernblot分析结果

以转化受体武运粳7号ms26/ms26突变体DNA作为阴性对照，将质粒DNA加入到武运粳7号野生型基因组DNA中作为阳性对照，探针在此杂交条件下能够与靶标序列顺利结合。

目的基因的整合稳定性结果分析

用Hind III消化转化体7R-949D T2、T3和T4代植株基因组DNA，根据目的基因设计探针进行Southern blot。结果显示该株系T2、T3和T4代植株的单株中均有～5.6kb和～7.9kb的信号条带(图10)，实际观察片段与转化体上预期片段大小(即5574bp和7921bp)相符(表8)，表明均为2个拷贝。代际间条带大小相同，拷贝数一致，表明转化体7R-949D的目的基因在T2、T3和T4代之间稳定遗传。

色选基因整合稳定性结果分析

用EcoR I消化转化体7R-949D T2、T3和T4代植株基因组DNA，根据色选基因序列设计探针进行Southern blot检测。结果显示，该株系的T2、T3和T4代植株的三个单株中都有～18kb和～8.4kb的信号条带(图11)。实际观察片段与转化体上预期片段大小(即18184bp和8425bp)相符(表8)。3代间杂交信号条代数目相同，条带大小一致，表明转化体7R-949D的色选基因在T2、T3和T4代之间稳定遗传。

综上所述，根据转化体7R-949D上T-DNA序列、插入位点旁侧序列、探针位置及酶切位点，可以预测杂交片段大小。将实际观察与预测相比较，从而证实外源基因的拷贝数。从表8可以看出，所有杂交的实际观察片段与相应的预测片段大小相符。因此，外源基因在7R-949D的T2、T3和T4代之间稳定整合，且保持2个拷贝不变。

表8转化体7R-949D的T2、T3和T4代植株中外源基因的Southern blot预测片段及实际观察片段大小

根据目的基因序列和色选基因序列设计探针，对转化体7R-949D的T2、T3和T4代植株基因组DNA进行Southern blot，结果显示，3代间外源基因均为2拷贝，杂交条带的数目相同，条带大小一致，表明该转化体的外源基因在三代之间稳定遗传。

结论2、转化体7R-1425D的T₂、T₃和T₄代植株中外源基因的整合稳定性的Southernblot分析

以转化受体武运粳7号ms26/ms26突变体DNA作为阴性对照，将质粒DNA加入到武运粳7号野生型基因组DNA中作为阳性对照，探针在此杂交条件下能够与靶标序列顺利结合。

OsCYP704B2基因的整合稳定性结果分析

用Hind III消化转化体7R-1425D T2、T3和T4代植株基因组DNA，根据OsCYP704B2基因设计探针进行Southern blot。结果显示该株系的T2、T3和T4代植株的单株中都有～8.3kb的信号条带(图12)。实际观察片段与转化体上预期片段大小(即8348bp)相符(表9)，表明均为1个拷贝。代际间条带大小相同，拷贝数一致，表明转化体7R-1425D的OsCYP704B2基因在T2、T3和T4代之间稳定遗传。

ZM-AA1基因的整合稳定性结果分析

用EcoR I消化转化体7R-1425D T2、T3和T4代植株基因组DNA，根据ZM-AA1基因设计探针进行Southern blot检测。结果显示该株系的T2、T3和T4代植株的三个单株中都有～5.9kb的信号条带(图13)，实际观察片段与转化体上预期片段大小(即5934bp)相符(表9)，表明均为1个拷贝。3代间杂交信号条代数目相同，条带大小一致，表明转化体7R-1425D的ZM-AA1基因在T2、T3和T4代之间稳定遗传。

DsRed(r)基因的整合稳定性结果分析

用EcoR I消化转化体7R-1425D T2、T3和T4代植株基因组DNA，根据DsRed(r)基因序列设计探针进行Southern blot检测。结果显示该株系的T2、T3和T4代植株的三个单株中都有～4.8kb的信号条带(图14)。实际观察片段与转化体上预期片段大小(即4824bp)相符(表9)，均为1个拷贝。3代间杂交信号条代数目相同，条带大小一致，表明转化体7R-1425D的DsRed(r)基因在T2、T3和T4代之间稳定遗传。

综上所述，根据转化体7R-1425D上T-DNA序列、插入位点旁侧序列、探针位置及酶切位点，预测杂交片段大小。将实际观察与预测相比较，从而证实外源基因的拷贝数。从下表9可以看出，所有杂交的实际观察片段与相应的预测片段大小相符。因此，外源基因在7R-1425D的T2、T3和T4代之间稳定整合，且保持1个拷贝不变。

表9转化体7R-1425D的T2、T3和T4代植株中外源基因的Southern blot预测片段及实际观察片段大小

根据OsCYP704B2、Zm-AA1和DsRed(r)基因序列设计探针，对转化体7R-1425的T2、T3和T4代植株基因组DNA进行Southern blot，结果显示，3代间外源基因均为1个拷贝，杂交条带的数目相同，条带大小一致，表明该转化体的外源基因在三代之间稳定遗传。

实施例7：转化事件中外源基因的表达分析(RT-PCR检测)

以转基因水稻株系T2代苗期根、苗期茎、苗期叶、颖花原基分化期幼穗(P3期)、花粉母细胞减数分裂时期幼穗(P6期)、花粉成熟期幼穗(P8期)、籽粒成熟时期种子的cDNA为模板，分别对目标基因OsCYP704B2、Zm-AA1和DsRed(r)进行扩增，研究目标基因在水稻不同生长阶段不同组织中的表达水平。

取材时期、组织和检测目标基因见表10。

取100mg样品加液氮于研钵中研磨成粉状，迅速加Trizol(每100mg加1ml)再次研磨至组织均匀，然后将研磨液转移至离心管(每管1ml)，每管加入0.2ml氯仿，激烈震荡，直到混匀。离心6min，14000rpm，取400ul上清至新离心管，加500ul异丙醇，上下轻微摇匀，于室温静置2min，室温离心5min，14000rpm，去上清，加500ul 75％乙醇(DEPC处理)洗涤沉淀2次，室温离心2min，12000rpm，自然晾干(大概15min)后加40μl去离子水(DEPC处理)溶解RNA沉淀。最后用DNase酶消化半小时。反转录按照Fermentas的RevertAidTM First StrandcDNA Synthesis Kit的操作步骤，将RNA反转录成cDNA。

表10试验材料的取样阶段、部位及所检测的基因

引物及扩增产物

以OsCYP704B2基因、DsRed(r)基因、Zm-AA1基因和Actin基因的表达序列为模板设计引物(表11)。Actin基因和OsCYP704B2基因的引物均跨内含子设计，这两个基因的cDNA为模板扩增产物长度理论上小于以基因组DNA(gDNA)为模板的扩增产物的长度。

表11目标基因和内参基因定性PCR引物信息

注：括号内碱基数为相应引物和模板PCR扩增产物大小

PGR扩增

PCR体系据Taq酶说明书提供的体系建立(表12)。扩增程序均为：94℃5min；94℃0.5min，60℃0.5min，72℃1min，30循环；72℃10min。PCR扩增后，每个反应体系取10μL扩增产物用于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

表12 PCR扩增体系

7R-949D转化事件中3个目标基因的表达模式

分别提取7R-949D T2代植株和对照武运粳7号ms26/ms26(突变体)、武运粳7号(野生型)的苗期根、苗期茎、苗期叶、P3期、P6期、P8期以及籽粒成熟时期种子的RNA并反转录获得cDNA，以这些cDNA为模板对目标基因OsCYP704B2、Zm-AA1、DsRed(r)及内参基因Actin分别进行扩增(图15)。

(1)空白对照中无扩增条带，表明PCR扩增体系无目标序列污染；

(2)阳性对照以转基因株系基因组DNA为模板，都能扩增出目的条带，且大小与预期相符，表明PCR扩增体系能有效对目标序列进行扩增；

(3)以上述转基因株系材料的cDNA为模板，扩增出大约554bp的内参基因Actin片段和344bp的目标基因OsCYP704B2片段，小于以基因组DNA为模板的PCR扩增产物(大小分别为803bp和432bp)，表明RNA提取和反转录成功，且无DNA污染。

(4)以武运粳7号(野生型)不同时期不同组织的cDNA为模板，只有P6期幼穗cDNA中扩增出大约344bp大小的OsCYP704B2片段。表明水稻内源基因OsCYP704B2在P6期特异性表达。

(5)以武运粳7号ms26/ms26(突变体)不同时期不同组织的cDNA为模板，未扩增到OsCYP704B2基因产物，表明突变造成了水稻内源OsCYP704B2基因的表达缺失。

(6)以7R-949D不同时期不同组织的cDNA为模板对目标基因进行扩增，在P6期幼穗cDNA扩增出大约344bp大小的OsCYP704B2片段，在P8期幼穗cDNA扩增出大约882bp大小的ZmAA1片段，在籽粒成熟时期期种子中扩增出大概365bp大小的DsRed(r)片段；实验结果证明OsCYP704B2基因在P6期特异性表达，Zm-AA1基因在P8期特异性表达，DsRed(r)基因在种子中特异性表达。

7R-1425D转化体3个目标基因的表达模式

分别提取7R-1425D T2代植株和对照材料武运粳7号ms26/ms26(突变体)、武运粳7号(野生型)的苗期根、苗期茎、苗期叶、P3期、P6期、P8)以及籽粒成熟时期种子的RNA并反转录获得cDNA，以这些cDNA为模板对目标基因OsCYP704B2、Zm-AA1、DsRed(r)及内参基因Actin分别进行扩增(图16)。

(1)空白对照中无扩增条带，表明PCR扩增体系无目标序列污染；

(2)阳性对照以转基因株系基因组DNA为模板，都能扩增出目的条带，且大小与预期相符，表明PCR扩增体系能有效对目标序列进行扩增；

(3)以上述转基因株系材料的cDNA为模板，扩增出大约554bp的内参基因Actin片段和344bp的目标基因OsCYP704B2片段，小于以基因组DNA为模板的PCR扩增产物(大小分别为803bp和432bp)，表明RNA提取和反转录成功，且无DNA污染。

(4)以武运粳7号(野生型)不同时期不同组织的cDNA为模板，只有P6期幼穗cDNA中扩增出大约344bp大小的OsCYP704B2片段。表明水稻内源基因OsCYP704B2在水稻P6期特异性表达。

(5)以武运粳7号ms26/ms26(突变体)不同时期不同组织的cDNA为模板，未扩增到OsCYP704B2基因产物，表明突变造成了水稻内源OsCYP704B2基因的表达缺失。

(6)以7R-1425D不同时期不同组织的cDNA为模板对目标基因进行扩增，在P6期的幼穗cDNA扩增出大约344bp大小的OsCYP704B2片段，在P8期的幼穗cDNA扩增出大约882bp大小的ZmAA1片段，在籽粒成熟时期期种子中扩增出大概365bp大小的DsRed(r)片段；实验结果证明OsCYP704B2基因在P6期特异性表达，Zm-AA1基因在P8期特异性表达，DsRed(r)基因在种子中特异性表达。

工业实用性

本发明的构建体，能够有效地应用于水稻雄性不育系和保持系的构建，进而获得的育性稳定的水稻雄性不育系和保持系能够高效地应用于杂交种子的生产，从而能够获得安全、优质的杂交水稻种子。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

序列表

<110> 北京未名凯拓作物设计中心有限公司

铁岭先锋种子研究有限公司

<120> 水稻育性调控构建体及其转化事件和应用

<130>

<150> 201310097416.5

<151> 2013-03-25

<160> 77

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggcctcct ccgagaacgt gatcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

cacaacaccg tgaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggccaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360

aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480

acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660

caccacctgt tcctgtag 678

<210> 2

<211> 944

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 2

gatccagctt cgcttagttt ttagtttttg gcagaaaaaa tgatcaatgt ttcacaaacc 60

aaatattttt ataacttttg atgaaagaag atcaccacgg tcatatctag gggtggtaac 120

aaattgcgat ctaaatgttt cttcataaaa aataaggctt cttaataaat tttagttcaa 180

aataaatacg aataaagtct gattctaatc tgattcgatc cttaaatttt ataatgcaaa 240

atttagagct cattaccacc tctagtcata tgtctagtct gaggtatatc caaaaagccc 300

tttctctaaa ttccacaccc aactcagatg tttgcaaata aatactccga ctccaaaatg 360

taggtgaagt gcaactttct ccattttata tcaacatttg ttattttttg tttaacattt 420

cacactcaaa actaattaat aaaatacgtg gttgttgaac gtgcgcacat gtctccctta 480

cattatgttt ttttatttat gtattattgt tgttttcctc cgaacaactt gtcaacatat 540

catcattggt ctttaatatt tatgaatatg gaagcctagt tatttacact tggctacaca 600

ctagttgtag ttttgccact tgtctaacat gcaactctag tagttttgcc acttgcctgg 660

catgcaactc tagtattgac acttgtatag catataatgc caatacgaca cctgccttac 720

atgaaacatt atttttgaca cttgtatacc atgcaacatt accattgaca tttgtccata 780

cacattatat caaatatatt gagcgcatgt cacaaactcg atacaaagct ggatgaccct 840

ccctcaccac atctataaaa acccgagcgc tactgtaaat cactcacaac acaacacata 900

tcttttagta acctttcaat aggcgtcccc caagaactag taac 944

<210> 3

<211> 318

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum）

<400> 3

agacttgtcc atcttctgga ttggccaact taattaatgt atgaaataaa aggatgcaca 60

catagtgaca tgctaatcac tataatgtgg gcatcaaagt tgtgtgttat gtgtaattac 120

tagttatctg aataaaagag aaagagatca tccatatttc ttatcctaaa tgaatgtcac 180

gtgtctttat aattctttga tgaaccagat gcatttcatt aaccaaatcc atatacatat 240

aaatattaat catatataat taatatcaat tgggttagca aaacaaatct agtctaggtg 300

tgttttgcga atgcggcc 318

<210> 4

<211> 3810

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa)

<400> 4

aggtggaaga caaggtggtg aggattggga gggctaccta tggcagggta gtgaagaggc 60

aggcaatgag agctctcttc agacttacat tggatgctga cagtaacaaa agcctgtagg 120

ttttgatact cttgattgat tgtttattta gttacctagt atcttcagta acagatgaga 180

gatttattca gcaaatgctc cggtttgctc gaaggttgta ataagagtgt gggcaagaat 240

caaggtcaat ccataagagc actattttca tgctcttctg atcttggttt cagacttgtt 300

tcagtgttga cattggttat ttctcaattc attcgagtat ttgttgttac atcacaaagg 360

ataagttcta tagaaaaaat cttccttttc aagtgatgtt ctttaatttt ctgtagaatt 420

gtgccctgca atttctcaaa tctttgatag atggcttatt tgtattgact ggaaaagaaa 480

ttagttgtca ataactagaa gctttagaga tgcaaagtat tggatatatc ttggcaatag 540

tattttatat tgcttgttta tgtgagaatg ttttaactag atggcaactg atttctggga 600

caaaatcgct tctacaatag cattttatgg aactcgtact cgtcgatagc atttcttgga 660

tttgggtgtt tgtaaatggc atttcttgga ttttctcttc attaaaatag cctattcaga 720

tgaagtagaa ttcaggtgaa gtagaaacca actactttgg gttcacaatt tatatttctt 780

ttgaggatac cccatttcat tttagttgtc atcaaagact agacaatatc gacagaaaat 840

ggtaagcctg gtttcagttg gtgacaattt aacagaattc agatggatat ggttctgata 900

ttagaaggtg gcataccttt agtcgctgca aacgcttcag ttatctgaac aaaacaacga 960

acttggctga gcaggggaaa aaaatactgt agcattcatt ttgtgtttac atgagtaacg 1020

attcttttct aggtggacag atcacaaaaa gaaaactaaa gctaagatcc aactcctaag 1080

ggtgttaggt tagggacacc atatgaatga gacaatctta attcttggtc acacaaagat 1140

tgtctcaagg ttggtagcat cagtgcccaa tatatcacct aactatgcca tccaaaatgc 1200

tacatagcat ctcttgtaga ctgaaccctt catgaagagc cccatggagg aagctcatgc 1260

aatgccagtg acatcattct tcccagtagc aggaatccac aagctcatag ctatcttcct 1320

tgttgtcctc tcatggatct tggtccacaa gtggagcctg aggaaccaga aagggccaag 1380

atcatggcca atcatcggcg cgacagtgga gcaactgaag aactaccaca ggatgcatga 1440

ctggcttgtc gagtacttgt cgaaggaccg caccgtgacc gtcgacatgc ctttcacctc 1500

ctacacctac attgccgacc cggtgaacgt cgagcatgtc ctgaagacca acttcaccaa 1560

ttaccccaag gtaaaagaac cataggatct tcagtgtact gtaaaatgtg ccttgcacag 1620

tactaacact gacacaaaaa atgtctgaaa atatgcaggg tgaagtgtac aggtcttaca 1680

tggatgtgct gctcggtgat ggcatattca atgccgacgg cgagatgtgg aggaagcaaa 1740

ggaagacggc gagcttcgag tttgcctcca agaacttgag agacttcagc actgtggtgt 1800

tcagggagta ctccctgaag ctatcaagca ttctgagcca agcatgcaag gccggcagag 1860

ttgtagacat gcaggtaacc aactgaattc cttgcctaat acctaaacat ttcttgagaa 1920

accaaattgt tcagaattct gatgcaagaa ctaaccaaaa ttcaggaatt gttcatgagg 1980

atgacactgg actcgatctg caaggtcggg tttggggttg agatcgggac gctgtcacct 2040

gatctcccgg agaacagctt tgcccaggca ttcgacgctg ccaacatcat cgtcacgctg 2100

cggttcatcg atcctctgtg gcgtctgaag aagttcttgc acgtcggatc agaggctctc 2160

ctcgagcaga gcatgaagct ggttgatgac ttcacctaca gcgtgatccg ccgccgcaag 2220

gctgagatct tgcaggctcg agccagcggc aagcaagaga aggtgatcct tcctctcttg 2280

ctcaaagaat cagtagaact gaactgacat ggtaatggtg atgatcagat cggaaaaggt 2340

tttgtttctt gatatcgttg atttgtaatg gcgagcagat caagcacgac atactgtcgc 2400

ggttcatcga gctcggggag gccggcggcg acgagggggg cggcagcttc ggggacgaca 2460

agagcctccg cgacgtggtg ctcaacttcg tgatcgccgg gcgtgacacg acggcgacga 2520

cgctgtcgtg gttcacgtac atggcgatga cgcacccggc cgtcgccgac aagctccggc 2580

gcgagctggc cgcgttcgag gatgagcgcg cgcgcgagga gggcgtcgcg ctcgccgacg 2640

ccgccggcga ggcgtcgttc gcggcgcgcg tggcgcagtt cgcgtcgctg ctgagctacg 2700

acgcggtggg gaagctggtg tacctgcacg cgtgcgtgac ggagacgctc cgcctctacc 2760

cggcggtgcc gcaggacccc aaggggatcg tggaggacga cgtgctcccc gacggcacca 2820

aggtgcgcgc cggcgggatg gtgacgtacg tgccctactc catggggagg atggagtaca 2880

actggggccc cgacgcggcg agcttccggc cggagcggtg gctcagcggc gacggcggcg 2940

cgttccggaa cgcgtcgccg ttcaagttca ccgcgttcca ggccgggccg cggatctgcc 3000

tcggcaagga ctccgcctac ctccagatga agatggcgct cgccatcctc ttccgcttct 3060

acaccttcga cctcgtcgag gaccaccccg tcaagtaccg gatgatgacc atcctctcca 3120

tggctcacgg cctcaaggtc cgcgtctcca cctccgtctg acccccgccg ccgctcgccg 3180

gcagccgcgc cgccgccgcc cgtatcgctt accggagtag taaataagcc tatgtaatct 3240

ggtttgaatt tgaaatttga atgtaccatg tttgattcta ggatttgttg gtcctagacc 3300

ctgcttgaaa cggtgcgaat ttcatctaaa tggttgagaa attttatcga aagctgttcc 3360

attctacgct acaaatggtg ggactggatt taaacattgg cgacgtggac aaggccgtat 3420

caccatgttt gcacattttt aaacctgtaa tctggtttga atttgaatgt accatgacac 3480

catgtttgca aaactttaca tgaatgtttg agaaaaaata tggagaactg ttcaattagt 3540

atgcgtttaa aatgggactg gatttaaaca ttggcgacgt ggacaaggct agtggactga 3600

gactctgaga tgttgcggaa gtcggggacg cagcggcggc agccgccggc gtggcggcgg 3660

tgccggagcc tgcgacacat caagcagatg cacgcggtga tggcgctccg gggcttcctc 3720

tccgatccct ccgagctccg cgagctcctt ttcgcctccg ccgtcgcggt ccgcggcgcc 3780

atcgcgcacg cctacctcgt gttcgaccaa 3810

<210> 5

<211> 1930

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa)

<400> 5

atgaagagcc ccatggagga agctcatgca atgccagtga catcattctt cccagtagca 60

ggaatccaca agctcatagc tatcttcctt gttgtcctct catggatctt ggtccacaag 120

tggagcctga ggaaccagaa agggccaaga tcatggccaa tcatcggcgc gacagtggag 180

caactgaaga actaccacag gatgcatgac tggcttgtcg agtacttgtc gaaggaccgc 240

accgtgaccg tcgacatgcc tttcacctcc tacacctaca ttgccgaccc ggtgaacgtc 300

gagcatgtcc tgaagaccaa cttcaccaat taccccaagg taaaagaacc ataggatctt 360

cagtgtactg taaaatgtgc cttgcacagt actaacactg acacaaaaaa tgtctgaaaa 420

tatgcagggt gaagtgtaca ggtcttacat ggatgtgctg ctcggtgatg gcatattcaa 480

tgccgacggc gagatgtgga ggaagcaaag gaagacggcg agcttcgagt ttgcctccaa 540

gaacttgaga gacttcagca ctgtggtgtt cagggagtac tccctgaagc tatcaagcat 600

tctgagccaa gcatgcaagg ccggcagagt tgtagacatg caggtaacca actgaattcc 660

ttgcctaata cctaaacatt tcttgagaaa ccaaattgtt cagaattctg atgcaagaac 720

taaccaaaat tcaggaattg ttcatgagga tgacactgga ctcgatctgc aaggtcgggt 780

ttggggttga gatcgggacg ctgtcacctg atctcccgga gaacagcttt gcccaggcat 840

tcgacgctgc caacatcatc gtcacgctgc ggttcatcga tcctctgtgg cgtctgaaga 900

agttcttgca cgtcggatca gaggctctcc tcgagcagag catgaagctg gttgatgact 960

tcacctacag cgtgatccgc cgccgcaagg ctgagatctt gcaggctcga gccagcggca 1020

agcaagagaa ggtgatcctt cctctcttgc tcaaagaatc agtagaactg aactgacatg 1080

gtaatggtga tgatcagatc ggaaaaggtt ttgtttcttg atatcgttga tttgtaatgg 1140

cgagcagatc aagcacgaca tactgtcgcg gttcatcgag ctcggggagg ccggcggcga 1200

cgaggggggc ggcagcttcg gggacgacaa gagcctccgc gacgtggtgc tcaacttcgt 1260

gatcgccggg cgtgacacga cggcgacgac gctgtcgtgg ttcacgtaca tggcgatgac 1320

gcacccggcc gtcgccgaca agctccggcg cgagctggcc gcgttcgagg atgagcgcgc 1380

gcgcgaggag ggcgtcgcgc tcgccgacgc cgccggcgag gcgtcgttcg cggcgcgcgt 1440

ggcgcagttc gcgtcgctgc tgagctacga cgcggtgggg aagctggtgt acctgcacgc 1500

gtgcgtgacg gagacgctcc gcctctaccc ggcggtgccg caggacccca aggggatcgt 1560

ggaggacgac gtgctccccg acggcaccaa ggtgcgcgcc ggcgggatgg tgacgtacgt 1620

gccctactcc atggggagga tggagtacaa ctggggcccc gacgcggcga gcttccggcc 1680

ggagcggtgg ctcagcggcg acggcggcgc gttccggaac gcgtcgccgt tcaagttcac 1740

cgcgttccag gccgggccgc ggatctgcct cggcaaggac tccgcctacc tccagatgaa 1800

gatggcgctc gccatcctct tccgcttcta caccttcgac ctcgtcgagg accaccccgt 1860

caagtaccgg atgatgacca tcctctccat ggctcacggc ctcaaggtcc gcgtctccac 1920

ctccgtctga 1930

<210> 6

<211> 544

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 6

Met Lys Ser Pro Met Glu Glu Ala His Ala Met Pro Val Thr Ser Phe

1 5 10 15

Phe Pro Val Ala Gly Ile His Lys Leu Ile Ala Ile Phe Leu Val Val

20 25 30

Leu Ser Trp Ile Leu Val His Lys Trp Ser Leu Arg Asn Gln Lys Gly

35 40 45

Pro Arg Ser Trp Pro Ile Ile Gly Ala Thr Val Glu Gln Leu Lys Asn

50 55 60

Tyr His Arg Met His Asp Trp Leu Val Glu Tyr Leu Ser Lys Asp Arg

65 70 75 80

Thr Val Thr Val Asp Met Pro Phe Thr Ser Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp

85 90 95

Pro Val Asn Val Glu His Val Leu Lys Thr Asn Phe Thr Asn Tyr Pro

100 105 110

Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ser Tyr Met Asp Val Leu Leu Gly Asp Gly

115 120 125

Ile Phe Asn Ala Asp Gly Glu Met Trp Arg Lys Gln Arg Lys Thr Ala

130 135 140

Ser Phe Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Ser Thr Val Val

145 150 155 160

Phe Arg Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Ser Ile Leu Ser Gln Ala Cys

165 170 175

Lys Ala Gly Arg Val Val Asp Met Gln Glu Leu Phe Met Arg Met Thr

180 185 190

Leu Asp Ser Ile Cys Lys Val Gly Phe Gly Val Glu Ile Gly Thr Leu

195 200 205

Ser Pro Asp Leu Pro Glu Asn Ser Phe Ala Gln Ala Phe Asp Ala Ala

210 215 220

Asn Ile Ile Val Thr Leu Arg Phe Ile Asp Pro Leu Trp Arg Leu Lys

225 230 235 240

Lys Phe Leu His Val Gly Ser Glu Ala Leu Leu Glu Gln Ser Met Lys

245 250 255

Leu Val Asp Asp Phe Thr Tyr Ser Val Ile Arg Arg Arg Lys Ala Glu

260 265 270

Ile Leu Gln Ala Arg Ala Ser Gly Lys Gln Glu Lys Ile Lys His Asp

275 280 285

Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Leu Gly Glu Ala Gly Gly Asp Glu Gly

290 295 300

Gly Gly Ser Phe Gly Asp Asp Lys Ser Leu Arg Asp Val Val Leu Asn

305 310 315 320

Phe Val Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu Ser Trp Phe

325 330 335

Thr Tyr Met Ala Met Thr His Pro Ala Val Ala Asp Lys Leu Arg Arg

340 345 350

Glu Leu Ala Ala Phe Glu Asp Glu Arg Ala Arg Glu Glu Gly Val Ala

355 360 365

Leu Ala Asp Ala Ala Gly Glu Ala Ser Phe Ala Ala Arg Val Ala Gln

370 375 380

Phe Ala Ser Leu Leu Ser Tyr Asp Ala Val Gly Lys Leu Val Tyr Leu

385 390 395 400

His Ala Cys Val Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Pro Gln

405 410 415

Asp Pro Lys Gly Ile Val Glu Asp Asp Val Leu Pro Asp Gly Thr Lys

420 425 430

Val Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly Arg

435 440 445

Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro Asp Ala Ala Ser Phe Arg Pro Glu Arg

450 455 460

Trp Leu Ser Gly Asp Gly Gly Ala Phe Arg Asn Ala Ser Pro Phe Lys

465 470 475 480

Phe Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser

485 490 495

Ala Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala Leu Ala Ile Leu Phe Arg Phe Tyr

500 505 510

Thr Phe Asp Leu Val Glu Asp His Pro Val Lys Tyr Arg Met Met Thr

515 520 525

Ile Leu Ser Met Ala His Gly Leu Lys Val Arg Val Ser Thr Ser Val

530 535 540

<210> 7

<211> 1231

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa)

<400> 7

aggtggaaga caaggtggtg aggattggga gggctaccta tggcagggta gtgaagaggc 60

aggcaatgag agctctcttc agacttacat tggatgctga cagtaacaaa agcctgtagg 120

ttttgatact cttgattgat tgtttattta gttacctagt atcttcagta acagatgaga 180

gatttattca gcaaatgctc cggtttgctc gaaggttgta ataagagtgt gggcaagaat 240

caaggtcaat ccataagagc actattttca tgctcttctg atcttggttt cagacttgtt 300

tcagtgttga cattggttat ttctcaattc attcgagtat ttgttgttac atcacaaagg 360

ataagttcta tagaaaaaat cttccttttc aagtgatgtt ctttaatttt ctgtagaatt 420

gtgccctgca atttctcaaa tctttgatag atggcttatt tgtattgact ggaaaagaaa 480

ttagttgtca ataactagaa gctttagaga tgcaaagtat tggatatatc ttggcaatag 540

tattttatat tgcttgttta tgtgagaatg ttttaactag atggcaactg atttctggga 600

caaaatcgct tctacaatag cattttatgg aactcgtact cgtcgatagc atttcttgga 660

tttgggtgtt tgtaaatggc atttcttgga ttttctcttc attaaaatag cctattcaga 720

tgaagtagaa ttcaggtgaa gtagaaacca actactttgg gttcacaatt tatatttctt 780

ttgaggatac cccatttcat tttagttgtc atcaaagact agacaatatc gacagaaaat 840

ggtaagcctg gtttcagttg gtgacaattt aacagaattc agatggatat ggttctgata 900

ttagaaggtg gcataccttt agtcgctgca aacgcttcag ttatctgaac aaaacaacga 960

acttggctga gcaggggaaa aaaatactgt agcattcatt ttgtgtttac atgagtaacg 1020

attcttttct aggtggacag atcacaaaaa gaaaactaaa gctaagatcc aactcctaag 1080

ggtgttaggt tagggacacc atatgaatga gacaatctta attcttggtc acacaaagat 1140

tgtctcaagg ttggtagcat cagtgcccaa tatatcacct aactatgcca tccaaaatgc 1200

tacatagcat ctcttgtaga ctgaaccctt c 1231

<210> 8

<211> 649

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa)

<400> 8

cccccgccgc cgctcgccgg cagccgcgcc gccgccgccc gtatcgctta ccggagtagt 60

aaataagcct atgtaatctg gtttgaattt gaaatttgaa tgtaccatgt ttgattctag 120

gatttgttgg tcctagaccc tgcttgaaac ggtgcgaatt tcatctaaat ggttgagaaa 180

ttttatcgaa agctgttcca ttctacgcta caaatggtgg gactggattt aaacattggc 240

gacgtggaca aggccgtatc accatgtttg cacattttta aacctgtaat ctggtttgaa 300

tttgaatgta ccatgacacc atgtttgcaa aactttacat gaatgtttga gaaaaaatat 360

ggagaactgt tcaattagta tgcgtttaaa atgggactgg atttaaacat tggcgacgtg 420

gacaaggcta gtggactgag actctgagat gttgcggaag tcggggacgc agcggcggca 480

gccgccggcg tggcggcggt gccggagcct gcgacacatc aagcagatgc acgcggtgat 540

ggcgctccgg ggcttcctct ccgatccctc cgagctccgc gagctccttt tcgcctccgc 600

cgtcgcggtc cgcggcgcca tcgcgcacgc ctacctcgtg ttcgaccaa 649

<210> 9

<211> 1488

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 9

atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60

ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120

gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180

gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcggcctg cggcctggtc 240

caggcacaag tcctcttcca ggggtttaac tgggagtcgt gcaagcagca gggaggctgg 300

tacaacaggc tcaaggccca ggtcgacgac atcgccaagg ccggcgtcac gcacgtctgg 360

ctgcctccac cctcgcactc cgtctcgcca caaggctaca tgccaggccg cctatacgac 420

ctggacgcgt ccaagtacgg cacggcggcg gagctcaagt ccctgatagc ggcgttccac 480

ggcaggggcg tgcagtgcgt ggcggacatc gtcatcaacc accggtgcgc ggaaaagaag 540

gacgcgcgcg gcgtgtactg catcttcgag ggcgggactc ccgacgaccg cctggactgg 600

ggccccggga tgatctgcag cgacgacacg cagtactcgg acgggacggg gcaccgcgac 660

acgggcgagg ggttcgcggc ggcgcccgac atcgaccacc tcaacccgcg cgtgcagcgg 720

gagctctccg cctggctcaa ctggctcagg tccgacgccg tggggttcga cggctggcgc 780

ctcgacttcg ccaagggcta ctcgccggcc gtcgccagaa tgtacgtgga gagcacgggg 840

ccgccgagct tcgtcgtcgc ggagatatgg aactcgctga gctacagcgg ggacggcaag 900

ccggcgccca accaggacca gtgccggcag gagctgctgg actggacgcg ggccgtcggc 960

gggcccgcca tggcgttcga cttccccacc aagggcctgc tgcaggcggg cgtgcagggg 1020

gagctgtggc ggctgcgcga cagctccggc aacgcggccg gcctgatcgg gtgggcgccc 1080

gagaaggccg tcaccttcgt cgacaaccat gacaccgggt cgacgcagaa gctctggccg 1140

ttcccatccg acaaggtcat gcagggctac gcctacatcc tcacccatcc aggagtcccc 1200

tgcattttct acgaccacat gttcgactgg aacctgaagc aggagatatc cacgctgtct 1260

gccatcaggg cgcggaacgg catccgcgcc gggagcaagc tgcggatcct cgtggcggac 1320

gcggacgcgt acgtggccgt cgtcgacgag aaggtcatgg tgaagatcgg gacaaggtac 1380

ggcgtgagca gcgtggtccc gtcggatttc cacccggcgg cgcacggcaa ggactactgc 1440

gtctgggaga aagcgagcct ccgcgtcccg gcggggcgcc acctctag 1488

<210> 10

<211> 2737

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 10

tgcaccggac actgtctggt ggcataccag acagtccggt gtgccagatc agggcaccct 60

tcggttcctt tgctcctttg cttttgaacc ctaactttga tcgtttattg gtttgtgttg 120

aacctttatg cacctgtgga atatataatc tagaacaaac tagttagtcc aatcatttgt 180

gttgggcatt caaccaccaa aattatttat aggaaaaggt taaaccttat ttccctttca 240

atctccccct ttttggtgat tgatgccaac acaaaccaaa gaaaatatat aagtgcagaa 300

ttgaactagt ttgcataagg taagtgcata ggttacttag aattaaatca atttatactt 360

ttacttgata tgcatggttg ctttctttta ttttaacatt ttggaccaca tttgcaccac 420

ttgttttgtt ttttgcaaat ctttttggaa attctttttc aaagtctttt gcaaatagtc 480

aaaggtatat gaataagatt gtaagaagca ttttcaagat ttgaaatttc tccccctgtt 540

tcaaatgctt ttcctttgac taaacaaaac tccccctgaa taaaattctc ctcttagctt 600

tcaagagggt tttaaataga tatcaattgg aaatatattt agatgctaat tttgaaaata 660

taccaattga aaatcaacat accaatttga aattaaacat accaatttaa aaaatttcaa 720

aaagtggtgg tgcggtcctt ttgctttggg cttaatattt ctcccccttt ggcattaatc 780

gccaaaaacg gagactttgt gagccattta tactttctcc ccattggtaa atgaaatatg 840

agtgaaagat tataccaaat ttggacagtg atgcggagtg acggcgaagg ataaacgata 900

ccgttagagt ggagtggaag ccttgtcttc gccgaagact ccatttccct ttcaatctac 960

gacttagcat agaaatacac ttgaaaacac attagtcgta gccacgaaag agatatgatc 1020

aaaggtatac aaatgagcta tgtgtgtaat gtttcaatca aagtttcgag aatcaagaat 1080

atttagctca ttcctaagtt tgctaaaggt tttatcatct aatggtttgg taaagatatc 1140

gactaattgt tctttggtgc taacataagc aatctcgata tcaccccttt gttggtgatc 1200

cctcaaaaag tgataccgaa tgtctatgtg cttagtgcgg ctgtgttcaa cgggattatc 1260

cgccatgcag atagcactct cattgtcaca taggagaggg actttgctca atttgtagcc 1320

atagtcccta aggttttgcc tcatccaaag taattgcaca caacaatgtc ctgcggcaat 1380

atacttggct tcggcggtag aaagagctat tgagttttgt ttctttgaag tccaagacac 1440

cagggatctc cctagaaact gacaagtccc tgatgtgctc ttcctatcaa ttttacaccc 1500

tgcccaatcg gcatctgaat atcctattaa atcaaaggtg gatcccttgg ggtaccaaag 1560

accaaattta ggagtgtaaa ctaaatatct catgattctt ttcacggccc taaggtgaac 1620

ttccttagga tcggcttgga atcttgcaca catgcatata gaaagcatac tatctggtcg 1680

agatgcacat aaatagagta aagatcctat catcgaccgg tatacctttt ggtctacgga 1740

tttacctccc gtgtcgaggt cgagatgccc attagttccc atgggtgtcc tgatgggctt 1800

ggcatccttc attccaaact tgttgagtat gtcttgaatg tactttgttt ggctgatgaa 1860

ggtgccatct tggagttgct tgacttgaaa tcctagaaaa tatttcaact tccccatcat 1920

agacatctcg aatttcggaa tcatgatcct actaaactct tcacaagtag atttgttagt 1980

agacccaaat ataatatcat caacataaat ttggcataca aacaaaactt ttgaaatggt 2040

tttagtaaag agagtaggat cggctttact gactctgaag ccattagtga taagaaaatc 2100

tcttaggcat tcataccatg ctgttggggc ttgcttgagc ccataaagcg cctttgagag 2160

tttataaaca tggttagggt actcactatc ttcaaagccg agaggttgct caacatagac 2220

ctattcaccc catttgatca cttttttggt ccttcaggat ctaatagtta tgtataattt 2280

agagtctctt gtttaatggc cagatatttc taattaatct aagaatttat gatatttttt 2340

aattttttat catgtctgat gagaattaac ataaaggctc aattgggtcc tgaattaata 2400

atagagtgaa aattaatcca gaggctctat tagaaccttc aattagtaat accaagatat 2460

atataagata gtagagtata gtttaaatgt tggcattgtt cattctttct tttgttattt 2520

aatttatgct ttccacggtg gttagtggtt acttctgaag ggtccaaata atgcatgaag 2580

agtttgagga caagaagtct gccctaaaaa tagcgatgca aaggcatggt gtccaagcca 2640

tacatatagc gcactaattt tatcagcaga acaatggtat ttataggtcc tagtgcccag 2700

gcaacaagag acacgaataa agcatcgatc acgacac 2737

<210> 11

<211> 225

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 11

atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60

ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120

gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180

gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcg 225

<210> 12

<211> 348

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 12

gatctgacaa agcagcatta gtccgttgat cggtggaaga ccactcgtca gtgttgagtt 60

gaatgtttga tcaataaaat acggcaatgc tgtaagggtt gttttttatg ccattgataa 120

tacactgtac tgttcagttg ttgaactcta tttcttagcc atgccaagtg cttttcttat 180

tttgaataac attacagcaa aaagttgaaa gacaaaaaaa aaaacccccg aacagagtgc 240

tttgggtccc aagctacttt agactgtgtt cggcgttccc cctaaatttc tccccctata 300

tctcactcac ttgtcacatc agcgttctct ttcccctata tctccacg 348

<210> 13

<211> 1444

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 13

ttcgttacat tcttttccct cctaaattca tgacattttg ctgagagttt atactcagcc 60

cctagaccac aggaaatgct ctcataatta atcccagtgc aaagatagag agaatcatag 120

agtacagaga tgcgtattaa taccagtgtt gccaacaaaa ctgggaccgt attaatgatg 180

cagagtaatt aaagctagca gcaggaacaa acaacaaatg ctaaatgtct cttggaatta 240

aacaggcaca agacagaagg aattatatta atacctagat aaattattca tcgaaaaaga 300

aagccctaag acgttgccct ctgaacgcaa ttgctgacca gcccgacggc acacaacctc 360

cgagcccaaa aacatatcac aaaatacaga cacaaataca tatacatata tgcactaaca 420

attaattatg cagaaaagtg ccaagattat ccaagaagaa gacaccgaaa gcaccctgtt 480

taattgatct aatcgctcat ctctccgtac tctccgttgg gagcatgatg atatatacct 540

taaccagcaa catgatatgc agttttctag tccgaaatgc cagggtgttc ttgacgctaa 600

tttaatcatg cgttgaaatt aatcagctaa ccaatgcatg gcttgattat tagttagcct 660

aatgcatggt catcgatgac gtagcaaaaa ctgctatact ctcgatctcc cagctgctag 720

cgtagaatcg catggggtcg agtacgtcca aggagagaag aacacagaag aaacttccgt 780

ggaagcttcc attttggacg aattaattag ttcaggatac tcgattttat aatattatat 840

aaattgagaa gtattttata ttatagatta gtaataaatt aattaatcag acaacttaat 900

aacacattgc ggacgttttt aatgtactga attaacgccg aattggccgc attcgcaaaa 960

cacacctaga ctagatttgt tttgctaacc caattgatat taattatata tgattaatat 1020

ttatatgtat atggatttgg ttaatgaaat gcatctggtt catcaaagaa ttataaagac 1080

acgtgacatt catttaggat aagaaatatg gatgatctct ttctctttta ttcagataac 1140

tagtaattac acataacaca caactttgat gcccacatta tagtgattag catgtcacta 1200

tgtgtgcatc cttttatttc atacattaat taagttggcc aatccagaag atggacaagt 1260

ctaggttaac catgtggtac ctacgcgttc gaatatccat gggccgctac aggaacaggt 1320

ggtggcggcc ctcggtgcgc tcgtactgct ccacgatggt gtagtcctcg ttgtgggagg 1380

tgatgtccag cttggcgtcc acgtagtagt agccgggcag ctgcacgggc ttcttggcca 1440

tgta 1444

<210> 14

<211> 959

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 14

acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc caccacctgt 60

tcctgtagcg gcccatggat attcgaacgc gtaggtacca catggttaac ctagacttgt 120

ccatcttctg gattggccaa cttaattaat gtatgaaata aaaggatgca cacatagtga 180

catgctaatc actataatgt gggcatcaaa gttgtgtgtt atgtgtaatt actagttatc 240

tgaataaaag agaaagagat catccatatt tcttatccta aatgaatgtc acgtgtcttt 300

ataattcttt gatgaaccag atgcatttca ttaaccaaat ccatatacat ataaatatta 360

atcatatata attaatatca attgggttag caaaacaaat ctagtctagg tgtgttttgc 420

gaatgcggcc aattcggcgt taattcagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag 480

ttgtctaagc gtcaatttgt ttacaccaca tgagagacag cagcaaggca aatctaatct 540

acctggatca cgcgaagggc agagggattt atgggctccg acacgcacaa cctagctaat 600

gtacatgcat ctagtttaat ttggcagcat gaataaatat ataattatat atgtacagca 660

ctagtgttgc tgttgttagg cctagcttgt ttttcctgtg ggctgtggcg acgactaggg 720

ttttagacac atgaaggatc taagaaatat cctataatcc cattgttaat ttattttcat 780

gtttttctgc caacatttta ttttaaaaac agcattattt ctgttttttg tattcatata 840

atgtgtgtta tattggacca caaatttagg tcaaaaagtc attttaacaa ttaatatggc 900

gtaggggact gatcgatgag acaaatggtt ttggtgtgtg gtggaattat aagtgagag 959

<210> 15

<211> 1259

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 15

catcctagtc attgggttgg gaatggccta aacaaccaat cgaacggggg tgcaaaatcc 60

aaaaaataac ggagttgcta gaaatatggc gccatatgtt acaatcgatt tttttcagcc 120

acttacacag tagttacacc tcgtttacac cccacttaca tatgtaatta gtatgtaatt 180

ttcgaattta catatgtaat tttagtactt acatatgtaa ttttgatact tacattgtaa 240

atacactaaa attacatatg taatttacgg acttacagta taaatacatg ctgactattt 300

tttgatgaaa aatatggcgc cataaatata gctacaccca aaaataataa taataataat 360

aatcccgtac tagtagtagc tatagttagg cactgttaat acgtccaagt gttggacttg 420

cggcccatga gatcgtggac gatgggcttg agtcgacgcg gccgtgctcc gggccgggat 480

cacgcggcct tgtcgtggtc tcctctgatg cttcctactg gcccatcacg agtattgatg 540

ggccgttctt ccatctggat ttccccttag gcccggtcct gcttgacaaa tgagaaactg 600

ataatttagc tgctcatctg aaacagctgg tacatctgtg tataaactac acgcaaagga 660

atactccgag taactaataa accgatacat aatagcgtcg cggctggcga aaggtgctca 720

gcagccggtc catgcgagcg gcgagagagg cgcacgcacg cacgaattca ctccatcttg 780

ggcgccatga tccaggacca cgtcgtggac atgtagagca agggcgctga tagtttaaac 840

tgaaggcggg aaacgacaat ctgatccaag ctcaagctgc tctagcattc gccattcagg 900

ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg 960

aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga 1020

cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatct 1080

gcaccggaca ctgtctggtg gcataccaga cagtccggtg tgccagatca gggcaccctt 1140

cggttccttt gctcctttgc ttttgaaccc taactttgat cgtttattgg tttgtgttga 1200

acctttatgc acctgtggaa tatataatct agaacaaact agttagtcca atcatttgt 1259

<210> 16

<211> 1280

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 16

attcgaacgc gtaggtacca catggttaac ctagacttgt ccatcttctg gattggccaa 60

cttaattaat gtatgaaata aaaggatgca cacatagtga catgctaatc actataatgt 120

gggcatcaaa gttgtgtgtt atgtgtaatt actagttatc tgaataaaag agaaagagat 180

catccatatt tcttatccta aatgaatgtc acgtgtcttt ataattcttt gatgaaccag 240

atgcatttca ttaaccaaat ccatatacat ataaatatta atcatatata attaatatca 300

attgggttag caaaacaaat ctagtctagg tgtgttttgc gaatgcggcc aattcggcgt 360

taattcagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag cagtttaaga tgggagcata 420

gagacaaccc atactacgga ggttatctgc acgacctttt tcgtacgtgt cactctcttg 480

tacccccatc tatatctata tcgtcctccc tccgtcccat gaaaaaccga tattctaata 540

aataatttta gatatgttcc atgtcaaaac ttattgtact agaaaacatt acatcatatt 600

ttagattgat ttttatggga tggatgtagt agtccgcatg aatataaatc aggcaaaaga 660

cgagtttttt ctttgaagga gaggattttt tttaaatgtc catatagtaa gataagatta 720

aatataggca ggtagtgcca ggattaaagt tttagcatca cacatgtgtt atatatatca 780

tgatttggat ttttttttct gcgggcttga aaccacaacc acagcaacta tatgggctat 840

atgagagttt atcaaaaatc cacatgcagt ggagaaagcg caatcagata tacgaaaaat 900

ccttggaggc aaaagcattg tcgaagaggc agacatcgaa gggcaacttc attactttca 960

aatggtgaac aagagactct aagattgcat cctcctgtgc cattgcttct tccaaggtta 1020

tggtctgaac cttgtaaaat catgggttat gacatacctc aagaacacag caatatttgt 1080

gaacacatgg gcacttggta gaaaataaaa aacactggat tgatgcaagt gagttcaggc 1140

ctgaaatatt cgaggatggg catagtcgat ttcaatggtt tagacttcag gtttcttcct 1200

tgtggtgccg gtcgtaggat ttgtcttggt ttgatgtttg aactttctga tattgagctc 1260

acacttgcga gccttcttta 1280

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 17

taatcagaca acttaataac 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 18

ttgtttacac cacatgagag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 19

agcaagggcg ctgatagttt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 20

aagcagttta agatgggagc 20

<210> 21

<211> 495

<212> PRT

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 21

Met Ala Ala Thr Met Ala Val Thr Thr Met Val Thr Arg Ser Lys Glu

1 5 10 15

Ser Trp Ser Ser Leu Gln Val Pro Ala Val Ala Phe Pro Trp Lys Pro

20 25 30

Arg Gly Gly Lys Thr Gly Gly Leu Glu Phe Pro Arg Arg Ala Met Phe

35 40 45

Ala Ser Val Gly Leu Asn Val Cys Pro Gly Val Pro Ala Gly Arg Asp

50 55 60

Pro Arg Glu Pro Asp Pro Lys Val Val Arg Ala Ala Cys Gly Leu Val

65 70 75 80

Gln Ala Gln Val Leu Phe Gln Gly Phe Asn Trp Glu Ser Cys Lys Gln

85 90 95

Gln Gly Gly Trp Tyr Asn Arg Leu Lys Ala Gln Val Asp Asp Ile Ala

100 105 110

Lys Ala Gly Val Thr His Val Trp Leu Pro Pro Pro Ser His Ser Val

115 120 125

Ser Pro Gln Gly Tyr Met Pro Gly Arg Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser

130 135 140

Lys Tyr Gly Thr Ala Ala Glu Leu Lys Ser Leu Ile Ala Ala Phe His

145 150 155 160

Gly Arg Gly Val Gln Cys Val Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg Cys

165 170 175

Ala Glu Lys Lys Asp Ala Arg Gly Val Tyr Cys Ile Phe Glu Gly Gly

180 185 190

Thr Pro Asp Asp Arg Leu Asp Trp Gly Pro Gly Met Ile Cys Ser Asp

195 200 205

Asp Thr Gln Tyr Ser Asp Gly Thr Gly His Arg Asp Thr Gly Glu Gly

210 215 220

Phe Ala Ala Ala Pro Asp Ile Asp His Leu Asn Pro Arg Val Gln Arg

225 230 235 240

Glu Leu Ser Ala Trp Leu Asn Trp Leu Arg Ser Asp Ala Val Gly Phe

245 250 255

Asp Gly Trp Arg Leu Asp Phe Ala Lys Gly Tyr Ser Pro Ala Val Ala

260 265 270

Arg Met Tyr Val Glu Ser Thr Gly Pro Pro Ser Phe Val Val Ala Glu

275 280 285

Ile Trp Asn Ser Leu Ser Tyr Ser Gly Asp Gly Lys Pro Ala Pro Asn

290 295 300

Gln Asp Gln Cys Arg Gln Glu Leu Leu Asp Trp Thr Arg Ala Val Gly

305 310 315 320

Gly Pro Ala Met Ala Phe Asp Phe Pro Thr Lys Gly Leu Leu Gln Ala

325 330 335

Gly Val Gln Gly Glu Leu Trp Arg Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asn Ala

340 345 350

Ala Gly Leu Ile Gly Trp Ala Pro Glu Lys Ala Val Thr Phe Val Asp

355 360 365

Asn His Asp Thr Gly Ser Thr Gln Lys Leu Trp Pro Phe Pro Ser Asp

370 375 380

Lys Val Met Gln Gly Tyr Ala Tyr Ile Leu Thr His Pro Gly Val Pro

385 390 395 400

Cys Ile Phe Tyr Asp His Met Phe Asp Trp Asn Leu Lys Gln Glu Ile

405 410 415

Ser Thr Leu Ser Ala Ile Arg Ala Arg Asn Gly Ile Arg Ala Gly Ser

420 425 430

Lys Leu Arg Ile Leu Val Ala Asp Ala Asp Ala Tyr Val Ala Val Val

435 440 445

Asp Glu Lys Val Met Val Lys Ile Gly Thr Arg Tyr Gly Val Ser Ser

450 455 460

Val Val Pro Ser Asp Phe His Pro Ala Ala His Gly Lys Asp Tyr Cys

465 470 475 480

Val Trp Glu Lys Ala Ser Leu Arg Val Pro Ala Gly Arg His Leu

485 490 495

<210> 22

<211> 1930

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa)

<400> 22

atgaagagcc ccatggagga agctcatgca atgccagtga catcattctt cccagtagca 60

ggaatccaca agctcatagc tatcttcctt gttgtcctct catggatctt ggtccacaag 120

tggagcctga ggaaccagaa agggccaaga tcatggccaa tcatcggcgc gacagtggag 180

caactgaaga actaccacag gatgcatgac tggcttgtcg agtacttgtc gaaggacagg 240

acggtgaccg tcgacatgcc tttcacctcc tacacctaca ttgccgaccc ggtgaacgtc 300

gagcatgtcc tgaagaccaa cttcaccaat taccccaagg taaaagaacc ataggatctt 360

cagtgtactg taaaatgtgc cttgcacagt actaacactg acacaaaaaa tgtctgaaaa 420

tatgcagggt gaagtgtaca ggtcttacat ggatgtgctg ctcggtgatg gcatattcaa 480

tgccgacggc gagatgtgga ggaagcaaag gaagacggcg agcttcgagt ttgcctccaa 540

gaacttgaga gacttcagca ctgtggtgtt cagggagtac tccctgaagc tatcaagcat 600

tctgagccaa gcatgcaagg ccggcagagt tgtagacatg caggtaacca actgaattcc 660

ttgcctaata cctaaacatt tcttgagaaa ccaaattgtt cagaattctg atgcaagaac 720

taaccaaaat tcaggaattg ttcatgagga tgacactgga ctcgatctgc aaggtcgggt 780

ttggggttga gatcgggacg ctgtcacctg atctcccgga gaacagcttt gcccaggcat 840

tcgacgctgc caacatcatc gtcacgctgc ggttcatcga tcctctgtgg cgtctgaaga 900

agttcttgca cgtcggatca gaggctctcc tcgagcagag catgaagctg gttgatgact 960

tcacctacag cgtgatccgc cgccgcaagg ctgagatctt gcaggctcga gccagcggca 1020

agcaagagaa ggtgatcctt cctctcttgc tcaaagaatc agtagaactg aactgacatg 1080

gtaatggtga tgatcagatc ggaaaaggtt ttgtttcttg atatcgttga tttgtaatgg 1140

cgagcagatc aagcacgaca tactgtcgcg gttcatcgag ctcggggagg ccggcggcga 1200

cgaggggggc ggcagcttcg gggacgacaa gagcctccgc gacgtggtgc tcaacttcgt 1260

gatcgccggg cgtgacacga cggcgacgac gctgtcgtgg ttcacgtaca tggcgatgac 1320

gcacccggcc gtcgccgaca agctccggcg cgagctggcc gcgttcgagg atgagcgcgc 1380

gcgcgaggag ggcgtcgcgc tcgccgacgc cgccggcgag gcgtcgttcg cggcgcgcgt 1440

ggcgcagttc gcgtcgctgc tgagctacga cgcggtgggg aagctggtgt acctgcacgc 1500

gtgcgtgacg gagacgctcc gcctctaccc ggcggtgccg caggacccca aggggatcgt 1560

ggaggacgac gtgctccccg acggcaccaa ggtgcgcgcc ggcgggatgg tgacgtacgt 1620

gccctactcc atggggagga tggagtacaa ctggggcccc gacgcggcga gcttccggcc 1680

ggagcggtgg ctcagcggcg acggcggcgc gttccggaac gcgtcgccgt tcaagttcac 1740

cgcgttccag gccgggccgc ggatctgcct cggcaaggac tccgcctacc tccagatgaa 1800

gatggcgctc gccatcctct tccgcttcta caccttcgac ctcgtcgagg accaccccgt 1860

caagtaccgg atgatgacca tcctctccat ggctcacggc ctcaaggtcc gcgtctccac 1920

ctccgtctga 1930

<210> 23

<211> 678

<212> DNA

<213> 礁珊瑚（Discosoma sp.）

<400> 23

atggcctcct ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

cacaacaccg tgaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360

aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480

acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660

caccacctgt tcctgtag 678

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

ataatgtggg catcaaagtt gtgtg 25

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

cttatcctaa atgaatgtca cgtgtctt 28

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

taggtgtgtt ttgcgaatgc ggc 23

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 27

acgatggact ccagagcvnv nnnggaa 27

<210> 28

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

acgatggact ccagag 16

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

tcgtgactgg gaaaaccctg gc 22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

gctggcgtaa tagcgaagag gc 22

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

tcagattgtc gtttcccgcc ttca 24

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

gtggatgaaa gccttcgtta c 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

ttccaccaca caccaaaacc a 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

taaagaaggc tcgcaagtgt g 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

catcctagtc attgggttgg g 21

<210> 36

<211> 225

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 36

atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60

ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120

gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180

gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcg 225

<210> 37

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 37

cggtacccgg ggatcagatc tcaaggaaaa gacgttatgc ag 42

<210> 38

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 38

aaggtcgtcc gggcggcctg cggcctggtc caggcac 37

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

cgcccggacg accttgggat cg 22

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 40

atggcggcga caatggcagt gac 23

<210> 41

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 41

cattgtcgcc gccatggtgt cgtgatcgat gctttat 37

<210> 42

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 42

cgactctaga ggatctgcac cggacactgt ctggtgg 37

<210> 43

<211> 1040

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 43

atggcctcct ccgagaacgt gatcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

cacaacaccg tgaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggccaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360

aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480

acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660

caccacctgt tcctgtagcg gcccatggat attcgaacgc gtaggtacca catggttaac 720

ctagacttgt ccatcttctg gattggccaa cttaattaat gtatgaaata aaaggatgca 780

cacatagtga catgctaatc actataatgt gggcatcaaa gttgtgtgtt atgtgtaatt 840

actagttatc tgaataaaag agaaagagat catccatatt tcttatccta aatgaatgtc 900

acgtgtcttt ataattcttt gatgaaccag atgcatttca ttaaccaaat ccatatacat 960

ataaatatta atcatatata attaatatca attgggttag caaaacaaat ctagtctagg 1020

tgtgttttgc gaatgcggcc 1040

<210> 44

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 44

attaacgccg aattggccgc attcgcaaaa cacacc 36

<210> 45

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 45

caagaactag taaccatggc ctcctccgag aacgtga 37

<210> 46

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 46

ctcggaggag gccatggtta ctagttcttg ggggacg 37

<210> 47

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 47

cttttccttg agatcgaatt cctgcagccc gggggatcca gcttcgctta gtttttagt 59

<210> 48

<211> 520

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 48

agatctgaca aagcagcatt agtccgttga tcggtggaag accactcgtc agtgttgagt 60

tgaatgtttg atcaataaaa tacggcaatg ctgtaagggt tgttttttat gccattgata 120

atacactgta ctgttcagtt gttgaactct atttcttagc catgccaagt gcttttctta 180

ttttgaataa cattacagca aaaagttgaa agacaaaaaa aaaaaccccc gaacagagtg 240

ctttgggtcc caagctactt tagactgtgt tcggcgttcc ccctaaattt ctccccctat 300

atctcactca cttgtcacat cagcgttctc tttcccctat atctccacgt cgacgcggcc 360

aaatcctgag gatctggtct tcctaaggac ccgggatatc ggacggggga tccactagtt 420

ctagagcggc cgggtaccga gctcgaattg gcgcgccgtt taaactcgcg atcgataagg 480

gcaattccag cacactggcg gccgttacta gcgagaattc 520

<210> 49

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 49

cgatcgcgat tggtcgaaca cgaggtaggc g 31

<210> 50

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 50

tcgaaggacc gcaccgtgac cgtcgacatg 30

<210> 51

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 51

catgtcgacg gtcacggtgc ggtccttcga 30

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 52

attggcgcgc cgtttaaaca ggtggaagac aaggtggtga gg 42

<210> 53

<211> 19704

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 53

acttaataac acattgcgga cgtttttaat gtactgaatt aacgccgaat tggccgcatt 60

cgcaaaacac acctagacta gatttgtttt gctaacccaa ttgatattaa ttatatatga 120

ttaatattta tatgtatatg gatttggtta atgaaatgca tctggttcat caaagaatta 180

taaagacacg tgacattcat ttaggataag aaatatggat gatctctttc tcttttattc 240

agataactag taattacaca taacacacaa ctttgatgcc cacattatag tgattagcat 300

gtcactatgt gtgcatcctt ttatttcata cattaattaa gttggccaat ccagaagatg 360

gacaagtcta ggttaaccat gtggtaccta cgcgttcgaa tatccatggg ccgctacagg 420

aacaggtggt ggcggccctc ggtgcgctcg tactgctcca cgatggtgta gtcctcgttg 480

tgggaggtga tgtccagctt ggcgtccacg tagtagtagc cgggcagctg cacgggcttc 540

ttggccatgt agatggactt gaactccacc aggtagtggc cgccgtcctt cagcttcagg 600

gccttgtggg tctcgccctt cagcacgccg tcgcgggggt acaggcgctc ggtggaggcc 660

tcccagccca tggtcttctt ctgcatcacg gggccgtcgg aggggaagtt cacgccgatg 720

aacttcacct tgtagatgaa gcagccgtcc tgcagggagg agtcctgggt cacggtggcc 780

acgccgccgt cctcgaagtt catcacgcgc tcccacttga agccctcggg gaaggacagc 840

ttcttgtagt cggggatgtc ggcggggtgc ttcacgtaca ccttggagcc gtactggaac 900

tggggggaca ggatgtccca ggcgaagggc agggggccgc ccttggtcac cttcagcttc 960

acggtgttgt ggccctcgta ggggcggccc tcgccctcgc cctcgatctc gaactcgtgg 1020

ccgttcacgg tgccctccat gcgcaccttg aagcgcatga actcggtgat cacgttctcg 1080

gaggaggcca tggttactag ttcttggggg acgcctattg aaaggttact aaaagatatg 1140

tgttgtgttg tgagtgattt acagtagcgc tcgggttttt atagatgtgg tgagggaggg 1200

tcatccagct ttgtatcgag tttgtgacat gcgctcaata tatttgatat aatgtgtatg 1260

gacaaatgtc aatggtaatg ttgcatggta tacaagtgtc aaaaataatg tttcatgtaa 1320

ggcaggtgtc gtattggcat tatatgctat acaagtgtca atactagagt tgcatgccag 1380

gcaagtggca aaactactag agttgcatgt tagacaagtg gcaaaactac aactagtgtg 1440

tagccaagtg taaataacta ggcttccata ttcataaata ttaaagacca atgatgatat 1500

gttgacaagt tgttcggagg aaaacaacaa taatacataa ataaaaaaac ataatgtaag 1560

ggagacatgt gcgcacgttc aacaaccacg tattttatta attagttttg agtgtgaaat 1620

gttaaacaaa aaataacaaa tgttgatata aaatggagaa agttgcactt cacctacatt 1680

ttggagtcgg agtatttatt tgcaaacatc tgagttgggt gtggaattta gagaaagggc 1740

tttttggata tacctcagac tagacatatg actagaggtg gtaatgagct ctaaattttg 1800

cattataaaa tttaaggatc gaatcagatt agaatcagac tttattcgta tttattttga 1860

actaaaattt attaagaagc cttatttttt atgaagaaac atttagatcg caatttgtta 1920

ccacccctag atatgaccgt ggtgatcttc tttcatcaaa agttataaaa atatttggtt 1980

tgtgaaacat tgatcatttt ttctgccaaa aactaaaaac taagcgaagc tggatccccc 2040

gggctgcagg aattctcgct agtaacggcc gccagtgtgc tggaattgcc cttatcgatc 2100

gcgattggtc gaacacgagg taggcgtgcg cgatggcgcc gcggaccgcg acggcggagg 2160

cgaaaaggag ctcgcggagc tcggagggat cggagaggaa gccccggagc gccatcaccg 2220

cgtgcatctg cttgatgtgt cgcaggctcc ggcaccgccg ccacgccggc ggctgccgcc 2280

gctgcgtccc cgacttccgc aacatctcag agtctcagtc cactagcctt gtccacgtcg 2340

ccaatgttta aatccagtcc cattttaaac gcatactaat tgaacagttc tccatatttt 2400

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cagattacag gtttaaaaat gtgcaaacat ggtgatacgg ccttgtccac gtcgccaatg 2520

tttaaatcca gtcccaccat ttgtagcgta gaatggaaca gctttcgata aaatttctca 2580

accatttaga tgaaattcgc accgtttcaa gcagggtcta ggaccaacaa atcctagaat 2640

caaacatggt acattcaaat ttcaaattca aaccagatta cataggctta tttactactc 2700

cggtaagcga tacgggcggc ggcggcgcgg ctgccggcga gcggcggcgg gggtcagacg 2760

gaggtggaga cgcggacctt gaggccgtga gccatggaga ggatggtcat catccggtac 2820

ttgacggggt ggtcctcgac gaggtcgaag gtgtagaagc ggaagaggat ggcgagcgcc 2880

atcttcatct ggaggtaggc ggagtccttg ccgaggcaga tccgcggccc ggcctggaac 2940

gcggtgaact tgaacggcga cgcgttccgg aacgcgccgc cgtcgccgct gagccaccgc 3000

tccggccgga agctcgccgc gtcggggccc cagttgtact ccatcctccc catggagtag 3060

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tccacgatcc ccttggggtc ctgcggcacc gccgggtaga ggcggagcgt ctccgtcacg 3180

cacgcgtgca ggtacaccag cttccccacc gcgtcgtagc tcagcagcga cgcgaactgc 3240

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tgcgtcatcg ccatgtacgt gaaccacgac agcgtcgtcg ccgtcgtgtc acgcccggcg 3420

atcacgaagt tgagcaccac gtcgcggagg ctcttgtcgt ccccgaagct gccgcccccc 3480

tcgtcgccgc cggcctcccc gagctcgatg aaccgcgaca gtatgtcgtg cttgatctgc 3540

tcgccattac aaatcaacga tatcaagaaa caaaaccttt tccgatctga tcatcaccat 3600

taccatgtca gttcagttct actgattctt tgagcaagag aggaaggatc accttctctt 3660

gcttgccgct ggctcgagcc tgcaagatct cagccttgcg gcggcggatc acgctgtagg 3720

tgaagtcatc aaccagcttc atgctctgct cgaggagagc ctctgatccg acgtgcaaga 3780

acttcttcag acgccacaga ggatcgatga accgcagcgt gacgatgatg ttggcagcgt 3840

cgaatgcctg ggcaaagctg ttctccggga gatcaggtga cagcgtcccg atctcaaccc 3900

caaacccgac cttgcagatc gagtccagtg tcatcctcat gaacaattcc tgaattttgg 3960

ttagttcttg catcagaatt ctgaacaatt tggtttctca agaaatgttt aggtattagg 4020

caaggaattc agttggttac ctgcatgtct acaactctgc cggccttgca tgcttggctc 4080

agaatgcttg atagcttcag ggagtactcc ctgaacacca cagtgctgaa gtctctcaag 4140

ttcttggagg caaactcgaa gctcgccgtc ttcctttgct tcctccacat ctcgccgtcg 4200

gcattgaata tgccatcacc gagcagcaca tccatgtaag acctgtacac ttcaccctgc 4260

atattttcag acattttttg tgtcagtgtt agtactgtgc aaggcacatt ttacagtaca 4320

ctgaagatcc tatggttctt ttaccttggg gtaattggtg aagttggtct tcaggacatg 4380

ctcgacgttc accgggtcgg caatgtaggt gtaggaggtg aaaggcatgt cgacggtcac 4440

ggtgcggtcc ttcgacaagt actcgacaag ccagtcatgc atcctgtggt agttcttcag 4500

ttgctccact gtcgcgccga tgattggcca tgatcttggc cctttctggt tcctcaggct 4560

ccacttgtgg accaagatcc atgagaggac aacaaggaag atagctatga gcttgtggat 4620

tcctgctact gggaagaatg atgtcactgg cattgcatga gcttcctcca tggggctctt 4680

catgaagggt tcagtctaca agagatgcta tgtagcattt tggatggcat agttaggtga 4740

tatattgggc actgatgcta ccaaccttga gacaatcttt gtgtgaccaa gaattaagat 4800

tgtctcattc atatggtgtc cctaacctaa cacccttagg agttggatct tagctttagt 4860

tttctttttg tgatctgtcc acctagaaaa gaatcgttac tcatgtaaac acaaaatgaa 4920

tgctacagta tttttttccc ctgctcagcc aagttcgttg ttttgttcag ataactgaag 4980

cgtttgcagc gactaaaggt atgccacctt ctaatatcag aaccatatcc atctgaattc 5040

tgttaaattg tcaccaactg aaaccaggct taccattttc tgtcgatatt gtctagtctt 5100

tgatgacaac taaaatgaaa tggggtatcc tcaaaagaaa tataaattgt gaacccaaag 5160

tagttggttt ctacttcacc tgaattctac ttcatctgaa taggctattt taatgaagag 5220

aaaatccaag aaatgccatt tacaaacacc caaatccaag aaatgctatc gacgagtacg 5280

agttccataa aatgctattg tagaagcgat tttgtcccag aaatcagttg ccatctagtt 5340

aaaacattct cacataaaca agcaatataa aatactattg ccaagatata tccaatactt 5400

tgcatctcta aagcttctag ttattgacaa ctaatttctt ttccagtcaa tacaaataag 5460

ccatctatca aagatttgag aaattgcagg gcacaattct acagaaaatt aaagaacatc 5520

acttgaaaag gaagattttt tctatagaac ttatcctttg tgatgtaaca acaaatactc 5580

gaatgaattg agaaataacc aatgtcaaca ctgaaacaag tctgaaacca agatcagaag 5640

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cttcgagcaa accggagcat ttgctgaata aatctctcat ctgttactga agatactagg 5760

taactaaata aacaatcaat caagagtatc aaaacctaca ggcttttgtt actgtcagca 5820

tccaatgtaa gtctgaagag agctctcatt gcctgcctct tcactaccct gccataggta 5880

gccctcccaa tcctcaccac cttgtcttcc acctgtttaa acggcgcgcc aattcgagct 5940

cggtacccgg ccgctctaga actagtggat cccccgtccg atatcccggg tccttaggaa 6000

gaccagatcc tcaggatttg gccgcgtcga cgtggagata taggggaaag agaacgctga 6060

tgtgacaagt gagtgagata tagggggaga aatttagggg gaacgccgaa cacagtctaa 6120

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gctgtaatgt tattcaaaat aagaaaagca cttggcatgg ctaagaaata gagttcaaca 6240

actgaacagt acagtgtatt atcaatggca taaaaaacaa cccttacagc attgccgtat 6300

tttattgatc aaacattcaa ctcaacactg acgagtggtc ttccaccgat caacggacta 6360

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aatgcagcac aagactgagc aatctgagct gctagaggtg gcgccccgcc gggacgcgga 6480

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cggccacgta cgcgtccgcg tccgccacga ggatccgcag cttgctcccg gcgcggatgc 6660

cgttccgcgc cctgatggca gacagcgtgg atatctcctg cttcaggttc cagtcgaaca 6720

tgtggtcgta gaaaatgcag gggactcctg gatgggtgag gatgtaggcg tagccctgca 6780

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cgcgcagccg ccacagctcc ccctgcacgc ccgcctgcag caggcccttg gtggggaagt 6960

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tgagccaggc ggagagctcc cgctgcacgc gcgggttgag gtggtcgatg tcgggcgccg 7260

ccgcgaaccc ctcgcccgtg tcgcggtgcc ccgtcccgtc cgagtactgc gtgtcgtcgc 7320

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gggccttgag cctgttgtac cagcctccct gctgcttgca cgactcccag ttaaacccct 7680

ggaagaggac ttgtgcctgg accaggccgc aggccgcccg gacgaccttg ggatcgggct 7740

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ctgccattgt cgccgccatg gtgtcgtgat cgatgcttta ttcgtgtctc ttgttgcctg 7980

ggcactagga cctataaata ccattgttct gctgataaaa ttagtgcgct atatgtatgg 8040

cttggacacc atgcctttgc atcgctattt ttagggcaga cttcttgtcc tcaaactctt 8100

catgcattat ttggaccctt cagaagtaac cactaaccac cgtggaaagc ataaattaaa 8160

taacaaaaga aagaatgaac aatgccaaca tttaaactat actctactat cttatatata 8220

tcttggtatt actaattgaa ggttctaata gagcctctgg attaattttc actctattat 8280

taattcagga cccaattgag cctttatgtt aattctcatc agacatgata aaaaattaaa 8340

aaatatcata aattcttaga ttaattagaa atatctggcc attaaacaag agactctaaa 8400

ttatacataa ctattagatc ctgaaggacc aaaaaagtga tcaaatgggg tgaataggtc 8460

tatgttgagc aacctctcgg ctttgaagat agtgagtacc ctaaccatgt ttataaactc 8520

tcaaaggcgc tttatgggct caagcaagcc ccaacagcat ggtatgaatg cctaagagat 8580

tttcttatca ctaatggctt cagagtcagt aaagccgatc ctactctctt tactaaaacc 8640

atttcaaaag ttttgtttgt atgccaaatt tatgttgatg atattatatt tgggtctact 8700

aacaaatcta cttgtgaaga gtttagtagg atcatgattc cgaaattcga gatgtctatg 8760

atggggaagt tgaaatattt tctaggattt caagtcaagc aactccaaga tggcaccttc 8820

atcagccaaa caaagtacat tcaagacata ctcaacaagt ttggaatgaa ggatgccaag 8880

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gtagaccaaa aggtataccg gtcgatgata ggatctttac tctatttatg tgcatctcga 9000

ccagatagta tgctttctat atgcatgtgt gcaagattcc aagccgatcc taaggaagtt 9060

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aatcccgttg aacacagccg cactaagcac atagacattc ggtatcactt tttgagggat 9480

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<210> 54

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<213> 人工合成

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ctgaaaatat gcagggtgaa gtgtacaggt cttacatgga tgtgctgctc ggtgatggca 6720

tattcaatgc cgacggcgag atgtggagga agcaaaggaa gacggcgagc ttcgagtttg 6780

cctccaagaa cttgagagac ttcagcactg tggtgttcag ggagtactcc ctgaagctat 6840

caagcattct gagccaagca tgcaaggccg gcagagttgt agacatgcag gtaaccaact 6900

gaattccttg cctaatacct aaacatttct tgagaaacca aattgttcag aattctgatg 6960

caagaactaa ccaaaattca ggaattgttc atgaggatga cactggactc gatctgcaag 7020

gtcgggtttg gggttgagat cgggacgctg tcacctgatc tcccggagaa cagctttgcc 7080

caggcattcg acgctgccaa catcatcgtc acgctgcggt tcatcgatcc tctgtggcgt 7140

ctgaagaagt tcttgcacgt cggatcagag gctctcctcg agcagagcat gaagctggtt 7200

gatgacttca cctacagcgt gatccgccgc cgcaaggctg agatcttgca ggctcgagcc 7260

agcggcaagc aagagaaggt gatccttcct ctcttgctca aagaatcagt agaactgaac 7320

tgacatggta atggtgatga tcagatcgga aaaggttttg tttcttgata tcgttgattt 7380

gtaatggcga gcagatcaag cacgacatac tgtcgcggtt catcgagctc ggggaggccg 7440

gcggcgacga ggggggcggc agcttcgggg acgacaagag cctccgcgac gtggtgctca 7500

acttcgtgat cgccgggcgt gacacgacgg cgacgacgct gtcgtggttc acgtacatgg 7560

cgatgacgca cccggccgtc gccgacaagc tccggcgcga gctggccgcg ttcgaggatg 7620

agcgcgcgcg cgaggagggc gtcgcgctcg ccgacgccgc cggcgaggcg tcgttcgcgg 7680

cgcgcgtggc gcagttcgcg tcgctgctga gctacgacgc ggtggggaag ctggtgtacc 7740

tgcacgcgtg cgtgacggag acgctccgcc tctacccggc ggtgccgcag gaccccaagg 7800

ggatcgtgga ggacgacgtg ctccccgacg gcaccaaggt gcgcgccggc gggatggtga 7860

cgtacgtgcc ctactccatg gggaggatgg agtacaactg gggccccgac gcggcgagct 7920

tccggccgga gcggtggctc agcggcgacg gcggcgcgtt ccggaacgcg tcgccgttca 7980

agttcaccgc gttccaggcc gggccgcgga tctgcctcgg caaggactcc gcctacctcc 8040

agatgaagat ggcgctcgcc atcctcttcc gcttctacac cttcgacctc gtcgaggacc 8100

accccgtcaa gtaccggatg atgaccatcc tctccatggc tcacggcctc aaggtccgcg 8160

tctccacctc cgtctgaccc ccgccgccgc tcgccggcag ccgcgccgcc gccgcccgta 8220

tcgcttaccg gagtagtaaa taagcctatg taatctggtt tgaatttgaa atttgaatgt 8280

accatgtttg attctaggat ttgttggtcc tagaccctgc ttgaaacggt gcgaatttca 8340

tctaaatggt tgagaaattt tatcgaaagc tgttccattc tacgctacaa atggtgggac 8400

tggatttaaa cattggcgac gtggacaagg ccgtatcacc atgtttgcac atttttaaac 8460

ctgtaatctg gtttgaattt gaatgtacca tgacaccatg tttgcaaaac tttacatgaa 8520

tgtttgagaa aaaatatgga gaactgttca attagtatgc gtttaaaatg ggactggatt 8580

taaacattgg cgacgtggac aaggctagtg gactgagact ctgagatgtt gcggaagtcg 8640

gggacgcagc ggcggcagcc gccggcgtgg cggcggtgcc ggagcctgcg acacatcaag 8700

cagatgcacg cggtgatggc gctccggggc ttcctctccg atccctccga gctccgcgag 8760

ctccttttcg cctccgccgt cgcggtccgc ggcgccatcg cgcacgccta cctcgtgttc 8820

gaccaatcgc gatcgataag ggcaattcca gcacactggc ggccgttact agcgagaatt 8880

cctgcagccc gggggatcca gcttcgctta gtttttagtt tttggcagaa aaaatgatca 8940

atgtttcaca aaccaaatat ttttataact tttgatgaaa gaagatcacc acggtcatat 9000

ctaggggtgg taacaaattg cgatctaaat gtttcttcat aaaaaataag gcttcttaat 9060

aaattttagt tcaaaataaa tacgaataaa gtctgattct aatctgattc gatccttaaa 9120

ttttataatg caaaatttag agctcattac cacctctagt catatgtcta gtctgaggta 9180

tatccaaaaa gccctttctc taaattccac acccaactca gatgtttgca aataaatact 9240

ccgactccaa aatgtaggtg aagtgcaact ttctccattt tatatcaaca tttgttattt 9300

tttgtttaac atttcacact caaaactaat taataaaata cgtggttgtt gaacgtgcgc 9360

acatgtctcc cttacattat gtttttttat ttatgtatta ttgttgtttt cctccgaaca 9420

acttgtcaac atatcatcat tggtctttaa tatttatgaa tatggaagcc tagttattta 9480

cacttggcta cacactagtt gtagttttgc cacttgtcta acatgcaact ctagtagttt 9540

tgccacttgc ctggcatgca actctagtat tgacacttgt atagcatata atgccaatac 9600

gacacctgcc ttacatgaaa cattattttt gacacttgta taccatgcaa cattaccatt 9660

gacatttgtc catacacatt atatcaaata tattgagcgc atgtcacaaa ctcgatacaa 9720

agctggatga ccctccctca ccacatctat aaaaacccga gcgctactgt aaatcactca 9780

caacacaaca catatctttt agtaaccttt caataggcgt cccccaagaa ctagtaacca 9840

tggcctcctc cgagaacgtg atcaccgagt tcatgcgctt caaggtgcgc atggagggca 9900

ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggcc 9960

acaacaccgt gaagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc tgggacatcc 10020

tgtcccccca gttccagtac ggctccaagg tgtacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg 10080

actacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg 10140

acggcggcgt ggccaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggctgc ttcatctaca 10200

aggtgaagtt catcggcgtg aacttcccct ccgacggccc cgtgatgcag aagaagacca 10260

tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg aagggcgaga 10320

cccacaaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc aagtccatct 10380

acatggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gctactacta cgtggacgcc aagctggaca 10440

tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggagcagta cgagcgcacc gagggccgcc 10500

accacctgtt cctgtagcgg cccatggata ttcgaacgcg taggtaccac atggttaacc 10560

tagacttgtc catcttctgg attggccaac ttaattaatg tatgaaataa aaggatgcac 10620

acatagtgac atgctaatca ctataatgtg ggcatcaaag ttgtgtgtta tgtgtaatta 10680

ctagttatct gaataaaaga gaaagagatc atccatattt cttatcctaa atgaatgtca 10740

cgtgtcttta taattctttg atgaaccaga tgcatttcat taaccaaatc catatacata 10800

taaatattaa tcatatataa ttaatatcaa ttgggttagc aaaacaaatc tagtctaggt 10860

gtgttttgcg aatgcggcca attcggcgtt aattcagtac attaaaaacg tccgcaatgt 10920

gttattaagc agttta 10936

<210> 55

<211> 448

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 55

aacaccacag tgctgaagtc tctcaagttc ttggaggcaa actcgaagct cgccgtcttc 60

ctttgcttcc tccacatctc gccgtcggca ttgaatatgc catcaccgag cagcacatcc 120

atgtaagacc tgtacacttc accctgcata ttttcagaca ttttttgtgt cagtgttagt 180

actgtgcaag gcacatttta cagtacactg aagatcctat ggttctttta ccttggggta 240

attggtgaag ttggtcttca ggacatgctc gacgttcacc gggtcggcaa tgtaggtgta 300

ggaggtgaaa ggcatgtcga cggtcacggt gcggtccttc gacaagtact cgacaagcca 360

gtcatgcatc ctgtggtagt tcttcagttg ctccactgtc gcgccgatga ttggccatga 420

tcttggccct ttctggttcc tcaggctc 448

<210> 56

<211> 526

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 56

cgagaacgtg atcaccgagt tcatgcgctt caaggtgcgc atggagggca ccgtgaacgg 60

ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggcc acaacaccgt 120

gaagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccccca 180

gttccagtac ggctccaagg tgtacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg actacaagaa 240

gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt 300

ggccaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggctgc ttcatctaca aggtgaagtt 360

catcggcgtg aacttcccct ccgacggccc cgtgatgcag aagaagacca tgggctggga 420

ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg aagggcgaga cccacaaggc 480

cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc aagtcc 526

<210> 57

<211> 448

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 57

aacaccacag tgctgaagtc tctcaagttc ttggaggcaa actcgaagct cgccgtcttc 60

ctttgcttcc tccacatctc gccgtcggca ttgaatatgc catcaccgag cagcacatcc 120

atgtaagacc tgtacacttc accctgcata ttttcagaca ttttttgtgt cagtgttagt 180

actgtgcaag gcacatttta cagtacactg aagatcctat ggttctttta ccttggggta 240

attggtgaag ttggtcttca ggacatgctc gacgttcacc gggtcggcaa tgtaggtgta 300

ggaggtgaaa ggcatgtcga cggtcacggt gcggtccttc gacaagtact cgacaagcca 360

gtcatgcatc ctgtggtagt tcttcagttg ctccactgtc gcgccgatga ttggccatga 420

tcttggccct ttctggttcc tcaggctc 448

<210> 58

<211> 329

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 58

aggggaaaga gaacgctgat gtgacaagtg agtgagatat agggggagaa atttaggggg 60

aacgccgaac acagtctaaa gtagcttggg acccaaagca ctctgttcgg gggttttttt 120

ttttgtcttt caactttttg ctgtaatgtt attcaaaata agaaaagcac ttggcatggc 180

taagaaatag agttcaacaa ctgaacagta cagtgtatta tcaatggcat aaaaaacaac 240

ccttacagca ttgccgtatt ttattgatca aacattcaac tcaacactga cgagtggtct 300

tccaccgatc aacggactaa tgctgcttt 329

<210> 59

<211> 526

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 59

cgagaacgtg atcaccgagt tcatgcgctt caaggtgcgc atggagggca ccgtgaacgg 60

ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggcc acaacaccgt 120

gaagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccccca 180

gttccagtac ggctccaagg tgtacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg actacaagaa 240

gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt 300

ggccaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggctgc ttcatctaca aggtgaagtt 360

catcggcgtg aacttcccct ccgacggccc cgtgatgcag aagaagacca tgggctggga 420

ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg aagggcgaga cccacaaggc 480

cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc aagtcc 526

<210> 60

<211> 2352

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa)

<400> 60

gtcgaaggac cgcaccgtga ccgtcgacat gcctttcacc tcctacacct acattgccga 60

cccggtgaac gtcgagcatg tcctgaagac caacttcacc aattacccca aggtaaaaga 120

accataggat cttcagtgta ctgtaaaatg tgccttgcac agtactaaca ctgacacaaa 180

aaatgtctga aaatatgcag ggtgaagtgt acaggtctta catggatgtg ctgctcggtg 240

atggcatatt caatgccgac ggcgagatgt ggaggaagca aaggaagacg gcgagcttcg 300

agtttgcctc caagaacttg agagacttca gcactgtggt gttcagggag tactccctga 360

agctatcaag cattctgagc caagcatgca aggccggcag agttgtagac atgcaggtaa 420

ccaactgaat tccttgccta atacctaaac atttcttgag aaaccaaatt gttcagaatt 480

ctgatgcaag aactaaccaa aattcaggaa ttgttcatga ggatgacact ggactcgatc 540

tgcaaggtcg ggtttggggt tgagatcggg acgctgtcac ctgatctccc ggagaacagc 600

tttgcccagg cattcgacgc tgccaacatc atcgtcacgc tgcggttcat cgatcctctg 660

tggcgtctga agaagttctt gcacgtcgga tcagaggctc tcctcgagca gagcatgaag 720

ctggttgatg acttcaccta cagcgtgatc cgccgccgca aggctgagat cttgcaggct 780

cgagccagcg gcaagcaaga gaaggtgatc cttcctctct tgctcaaaga atcagtagaa 840

ctgaactgac atggtaatgg tgatgatcag atcggaaaag gttttgtttc ttgatatcgt 900

tgatttgtaa tggcgagcag atcaagcacg acatactgtc gcggttcatc gagctcgggg 960

aggccggcgg cgacgagggg ggcggcagct tcggggacga caagagcctc cgcgacgtgg 1020

tgctcaactt cgtgatcgcc gggcgtgaca cgacggcgac gacgctgtcg tggttcacgt 1080

acatggcgat gacgcacccg gccgtcgccg acaagctccg gcgcgagctg gccgcgttcg 1140

aggatgagcg cgcgcgcgag gagggcgtcg cgctcgccga cgccgccggc gaggcgtcgt 1200

tcgcggcgcg cgtggcgcag ttcgcgtcgc tgctgagcta cgacgcggtg gggaagctgg 1260

tgtacctgca cgcgtgcgtg acggagacgc tccgcctcta cccggcggtg ccgcaggacc 1320

ccaaggggat cgtggaggac gacgtgctcc ccgacggcac caaggtgcgc gccggcggga 1380

tggtgacgta cgtgccctac tccatgggga ggatggagta caactggggc cccgacgcgg 1440

cgagcttccg gccggagcgg tggctcagcg gcgacggcgg cgcgttccgg aacgcgtcgc 1500

cgttcaagtt caccgcgttc caggccgggc cgcggatctg cctcggcaag gactccgcct 1560

acctccagat gaagatggcg ctcgccatcc tcttccgctt ctacaccttc gacctcgtcg 1620

aggaccaccc cgtcaagtac cggatgatga ccatcctctc catggctcac ggcctcaagg 1680

tccgcgtctc cacctccgtc tgacccccgc cgccgctcgc cggcagccgc gccgccgccg 1740

cccgtatcgc ttaccggagt agtaaataag cctatgtaat ctggtttgaa tttgaaattt 1800

gaatgtacca tgtttgattc taggatttgt tggtcctaga ccctgcttga aacggtgcga 1860

atttcatcta aatggttgag aaattttatc gaaagctgtt ccattctacg ctacaaatgg 1920

tgggactgga tttaaacatt ggcgacgtgg acaaggccgt atcaccatgt ttgcacattt 1980

ttaaacctgt aatctggttt gaatttgaat gtaccatgac accatgtttg caaaacttta 2040

catgaatgtt tgagaaaaaa tatggagaac tgttcaatta gtatgcgttt aaaatgggac 2100

tggatttaaa cattggcgac gtggacaagg ctagtggact gagactctga gatgttgcgg 2160

aagtcgggga cgcagcggcg gcagccgccg gcgtggcggc ggtgccggag cctgcgacac 2220

atcaagcaga tgcacgcggt gatggcgctc cggggcttcc tctccgatcc ctccgagctc 2280

cgcgagctcc ttttcgcctc cgccgtcgcg gtccgcggcg ccatcgcgca cgcctacctc 2340

gtgttcgacc aa 2352

<210> 61

<211> 1486

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa)

<400> 61

aggtggaaga caaggtggtg aggattggga gggctaccta tggcagggta gtgaagaggc 60

aggcaatgag agctctcttc agacttacat tggatgctga cagtaacaaa agcctgtagg 120

ttttgatact cttgattgat tgtttattta gttacctagt atcttcagta acagatgaga 180

gatttattca gcaaatgctc cggtttgctc gaaggttgta ataagagtgt gggcaagaat 240

caaggtcaat ccataagagc actattttca tgctcttctg atcttggttt cagacttgtt 300

tcagtgttga cattggttat ttctcaattc attcgagtat ttgttgttac atcacaaagg 360

ataagttcta tagaaaaaat cttccttttc aagtgatgtt ctttaatttt ctgtagaatt 420

gtgccctgca atttctcaaa tctttgatag atggcttatt tgtattgact ggaaaagaaa 480

ttagttgtca ataactagaa gctttagaga tgcaaagtat tggatatatc ttggcaatag 540

tattttatat tgcttgttta tgtgagaatg ttttaactag atggcaactg atttctggga 600

caaaatcgct tctacaatag cattttatgg aactcgtact cgtcgatagc atttcttgga 660

tttgggtgtt tgtaaatggc atttcttgga ttttctcttc attaaaatag cctattcaga 720

tgaagtagaa ttcaggtgaa gtagaaacca actactttgg gttcacaatt tatatttctt 780

ttgaggatac cccatttcat tttagttgtc atcaaagact agacaatatc gacagaaaat 840

ggtaagcctg gtttcagttg gtgacaattt aacagaattc agatggatat ggttctgata 900

ttagaaggtg gcataccttt agtcgctgca aacgcttcag ttatctgaac aaaacaacga 960

acttggctga gcaggggaaa aaaatactgt agcattcatt ttgtgtttac atgagtaacg 1020

attcttttct aggtggacag atcacaaaaa gaaaactaaa gctaagatcc aactcctaag 1080

ggtgttaggt tagggacacc atatgaatga gacaatctta attcttggtc acacaaagat 1140

tgtctcaagg ttggtagcat cagtgcccaa tatatcacct aactatgcca tccaaaatgc 1200

tacatagcat ctcttgtaga ctgaaccctt catgaagagc cccatggagg aagctcatgc 1260

aatgccagtg acatcattct tcccagtagc aggaatccac aagctcatag ctatcttcct 1320

tgttgtcctc tcatggatct tggtccacaa gtggagcctg aggaaccaga aagggccaag 1380

atcatggcca atcatcggcg cgacagtgga gcaactgaag aactaccaca ggatgcatga 1440

ctggcttgtc gagtacttgt cgaaggaccg caccgtgacc gtcgac 1486

<210> 62

<211> 78

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa)

<400> 62

gggcggctgc cggtgacgac gcggacggtg gcggcgcgag agaaagagta tcttctcgtt 60

gtcctgctgc gtcttcag 78

<210> 63

<211> 11

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa)

<400> 63

gggggtcggt g 11

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 64

tgacatcatt cttcccagta gca 23

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 65

atcaccgagc agcacatcca 20

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 66

gacaatggca gtgacgacga t 21

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 67

ccgctgtagc tcagcgagtt 20

<210> 68

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 68

ctcgtactgc tccacgatgg t 21

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 69

agcgcgtgat gaacttcga 19

<210> 70

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 70

accttcaaca cccctgctat g 21

<210> 71

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 71

gcaatgccag ggaacatagt g 21

<210> 72

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 72

tggcatctct cagcacattc c 21

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 73

tgcacaatgg atgggtcaga 20

<210> 74

<211> 981

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 74

gtggatgaaa gccttcgtta cattcttttc cctcctaaat tcatgacatt ttgctgagag 60

tttatactca gcccctagac cacaggaaat gctctcataa ttaatcccag tgcaaagata 120

gagagaatca tagagtacag agatgcgtat taataccagt gttgccaaca aaactgggac 180

cgtattaatg atgcagagta attaaagcta gcagcaggaa caaacaacaa atgctaaatg 240

tctcttggaa ttaaacaggc acaagacaga aggaattata ttaataccta gataaattat 300

tcatcgaaaa agaaagccct aagacgttgc cctctgaacg caattgctga ccagcccgac 360

ggcacacaac ctccgagccc aaaaacatat cacaaaatac agacacaaat acatatacat 420

atatgcacta acaattaatt atgcagaaaa gtgccaagat tatccaagaa gaagacaccg 480

aaagcaccct gtttaattga tctaatcgct catctctccg tactctccgt tgggagcatg 540

atgatatata ccttaaccag caacatgata tgcagttttc tagtccgaaa tgccagggtg 600

ttcttgacgc taatttaatc atgcgttgaa attaatcagc taaccaatgc atggcttgat 660

tattagttag cctaatgcat ggtcatcgat gacgtagcaa aaactgctat actctcgatc 720

tcccagctgc tagcgtagaa tcgcatgggg tcgagtacgt ccaaggagag aagaacacag 780

aagaaacttc cgtggaagct tccattttgg acgaattaat tagttcagga tactcgattt 840

tataatatta tataaattga gaagtatttt atattataga ttagtaataa attaattaat 900

cagacaactt aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac tgaattaacg ccgaattggc 960

cgcattcgca aaacacacct a 981

<210> 75

<211> 540

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 75

taggtgtgtt ttgcgaatgc ggccaattcg gcgttaattc agtacattaa aaacgtccgc 60

aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac cacatgagag acagcagcaa 120

ggcaaatcta atctacctgg atcacgcgaa gggcagaggg atttatgggc tccgacacgc 180

acaacctagc taatgtacat gcatctagtt taatttggca gcatgaataa atatataatt 240

atatatgtac agcactagtg ttgctgttgt taggcctagc ttgtttttcc tgtgggctgt 300

ggcgacgact agggttttag acacatgaag gatctaagaa atatcctata atcccattgt 360

taatttattt tcatgttttt ctgccaacat tttattttaa aaacagcatt atttctgttt 420

tttgtattca tataatgtgt gttatattgg accacaaatt taggtcaaaa agtcatttta 480

acaattaata tggcgtaggg gactgatcga tgagacaaat ggttttggtg tgtggtggaa 540

<210> 76

<211> 864

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 76

catcctagtc attgggttgg gaatggccta aacaaccaat cgaacggggg tgcaaaatcc 60

aaaaaataac ggagttgcta gaaatatggc gccatatgtt acaatcgatt tttttcagcc 120

acttacacag tagttacacc tcgtttacac cccacttaca tatgtaatta gtatgtaatt 180

ttcgaattta catatgtaat tttagtactt acatatgtaa ttttgatact tacattgtaa 240

atacactaaa attacatatg taatttacgg acttacagta taaatacatg ctgactattt 300

tttgatgaaa aatatggcgc cataaatata gctacaccca aaaataataa taataataat 360

aatcccgtac tagtagtagc tatagttagg cactgttaat acgtccaagt gttggacttg 420

cggcccatga gatcgtggac gatgggcttg agtcgacgcg gccgtgctcc gggccgggat 480

cacgcggcct tgtcgtggtc tcctctgatg cttcctactg gcccatcacg agtattgatg 540

ggccgttctt ccatctggat ttccccttag gcccggtcct gcttgacaaa tgagaaactg 600

ataatttagc tgctcatctg aaacagctgg tacatctgtg tataaactac acgcaaagga 660

atactccgag taactaataa accgatacat aatagcgtcg cggctggcga aaggtgctca 720

gcagccggtc catgcgagcg gcgagagagg cgcacgcacg cacgaattca ctccatcttg 780

ggcgccatga tccaggacca cgtcgtggac atgtagagca agggcgctga tagtttaaac 840

tgaaggcggg aaacgacaat ctga 864

<210> 77

<211> 954

<212> DNA

<213> 水稻基因组DNA和转基因插入物的嵌合分子

<400> 77

taggtgtgtt ttgcgaatgc ggccaattcg gcgttaattc agtacattaa aaacgtccgc 60

aatgtgttat taagcagttt aagatgggag catagagaca acccatacta cggaggttat 120

ctgcacgacc tttttcgtac gtgtcactct cttgtacccc catctatatc tatatcgtcc 180

tccctccgtc ccatgaaaaa ccgatattct aataaataat tttagatatg ttccatgtca 240

aaacttattg tactagaaaa cattacatca tattttagat tgatttttat gggatggatg 300

tagtagtccg catgaatata aatcaggcaa aagacgagtt ttttctttga aggagaggat 360

tttttttaaa tgtccatata gtaagataag attaaatata ggcaggtagt gccaggatta 420

aagttttagc atcacacatg tgttatatat atcatgattt ggattttttt ttctgcgggc 480

ttgaaaccac aaccacagca actatatggg ctatatgaga gtttatcaaa aatccacatg 540

cagtggagaa agcgcaatca gatatacgaa aaatccttgg aggcaaaagc attgtcgaag 600

aggcagacat cgaagggcaa cttcattact ttcaaatggt gaacaagaga ctctaagatt 660

gcatcctcct gtgccattgc ttcttccaag gttatggtct gaaccttgta aaatcatggg 720

ttatgacata cctcaagaac acagcaatat ttgtgaacac atgggcactt ggtagaaaat 780

aaaaaacact ggattgatgc aagtgagttc aggcctgaaa tattcgagga tgggcatagt 840

cgatttcaat ggtttagact tcaggtttct tccttgtggt gccggtcgta ggatttgtct 900

tggtttgatg tttgaacttt ctgatattga gctcacactt gcgagccttc ttta 954

Claims (9)

1.用于鉴定生物样品中转化事件SPT-7R-1425D的方法，其中所述转化事件含有外源插入序列，所述外源插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：54所示，其中所述外源插入序列的5’端与内源基因组DNA构成的连接序列如SEQ ID NO：15或19所示，以及所述外源插入序列的3’端与内源基因组DNA构成的连接序列如SEQ ID NO：16或20所示，所述方法包括：

a)设计特异性识别外源T-DNA插入序列SEQ ID NO：54或其互补序列的第一探针或第一引物；和

b)设计特异性识别SEQ ID NO：15或16的侧翼部分序列的第二探针或第二引物以检测SPT-7R-1425D的特异区；

其中第一和第二探针或引物所检测的单个核酸片段少于100,000bp。

2.权利要求1所述的方法，进一步包括利用至少两条引物进行聚合酶链式反应，从所述生物样品中扩增和鉴定SPT-7R-1425D事件的DNA片段，其中所述的第一引物特异性识别外源T-DNA插入序列SEQ ID NO：54或其互补序列，第二引物特异性识别SEQ ID NO：15或16的侧翼部分序列。

3.一种检测生物样品中如权利要求1中所限定的事件SPT-7R-1425D的方法，包括：

(a)从所述生物样品提取DNA样品；

(b)提供DNA引物对，其中第一引物特异性识别外源T-DNA插入序列SEQ ID NO：54或其互补序列，第二引物特异性识别SEQ ID NO：15或16的侧翼部分序列；

(c)提供DNA扩增反应条件；

(d)进行DNA扩增反应，从而获得DNA扩增子；和

(e)检测所述DNA扩增产物，其中所述的DNA扩增子在所述DNA扩增反应中的检出表明事件SPT-7R-1425D的存在。

4.权利要求3所述的方法，其中所述的DNA扩增子包括部分或全部的选自SEQ ID NO：15、16、19、20或54的序列，所述DNA扩增子的检出表明事件SPT-7R-1425D的存在。

5.一种检测如权利要求1中所限定的事件SPT-7R-1425D中外源DNA插入序列的方法，所述方法包括：将包含DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严谨杂交条件下，可以特异性检出SPT-7R-1425D转化事件的DNA，表明SPT-7R-1425D事件的存在，其特征在于，所述探针选自SEQ ID NO：54所示的部分序列。

6.权利要求5所述的方法，其中所述的多核苷酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：57、58或59所示。

7.权利要求1中所限定的转化事件在育种中的应用。

8.用于鉴定生物样品中如权利要求1中所限定的事件SPT-7R-1425D的引物对或探针对，包含：

a)特异性靶向第一序列的第一探针或第一引物，其中所述被靶向的第一序列位于SEQID NO：54的T-DNA插入序列中；及

b)特异性靶向第二序列的第二探针或第二引物，其中所述被靶向的第二序列是包含在选自SEQ ID NO：15、16、19和20的序列中的侧翼区域；

其中在少于100,000碱基对的单个核酸片段中检测所述第一和第二靶序列。

9.一种检测如权利要求1中所限定的转化事件SPT-7R-1425D的试剂盒，其包含权利要求8的引物对或探针对。

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