CN113549629A - 水稻转基因事件fg2-55 - Google Patents
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Abstract
本发明提供水稻制种技术事件FG2‑55及其检测和使用方法，并且提供包含事件FG2‑55特异性多核苷酸的植物、植物细胞、组织或其种子。本发明还提供基于插入水稻基因组中的重组构建体的DNA序列、在插入位点侧翼的DNA序列检测水稻事件FG2‑55的存在的测定法和试剂盒和一种用于制备FG2‑55事件水稻的方法。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和育种领域，具体的，涉及一种核酸、一个水稻事件FG2-55、一种检测水稻事件FG2-55的方法以及试剂盒、一种生产水稻隐性细胞核雄性不育系的方法。
背景技术
水稻是中国第一大口粮作物，生产状况直接关系到粮食安全。2015年全国水稻种植面积4.56亿亩，总产量2.01亿吨，种植面积和总产量分别占粮食的27％和36％，在所有口粮消费中占比60％左右，水稻口粮消费占水稻总消费量的85％。若按2011年人口基数13.47亿，年均增长0.5％测算，预计2020年将达到14.08亿人，按目前人均年消费140公斤水稻，总消费量将达到1.97亿吨。此外，在酿酒、制药、调味品、饲料加工等领域对稻谷的工业需求也在增长。
除产量外，人民对水稻品质的要求越来越高，尤其是沿海发达地区对高品质大米的需求增长较快，高品质大米的进口需求也在逐年增长。人口增长、耕地面积减少要求水稻总产和单产大幅提高，环境友好要求减少水资源、农药和化肥的利用，社会文明进步和生活水平提高要求产出更高品质的粮食。如何在有限的土地和友好的生态环境下生产出更多更优质的粮食，如何解决粮食安全问题，是亟待解决的中国乃至全球性问题。
水稻生产的每一次重大进步都伴随着新技术的突破。上世纪六十年代的“绿色革命”将水稻、小麦和玉米等作物的株高矮化，辅以农药和农业机械，使粮食大幅度增产，解决了发展中国家粮食自给问题。上世纪七、八十年代，以袁隆平为代表的中国科学家利用水稻野败胞质互作型不育种质资源创制了三系杂交水稻制种体系(简称“三系”)，使水稻产量提高了近20％，被称为第二次“绿色革命”，为保障我国粮食供应做出了重大贡献，也向世人展示了杂种优势的强大力量，作物杂交育种已经成为提高粮食产量的主要途径。
杂交育种是当前选育新品种主要途径之一，是近代育种的重要方法。由于杂种一代可能出现的兼具双亲优良位点的基因型，加之位点间的上位性互作效应，会筛选出现超亲的新个体，近几十年来，杂种优势作为一种提高作物产量、改良作物品质、提高作物抗生物逆境(如抗虫、病和草等)和抗非生物逆境(如抗旱、盐和低温等)的手段已被广泛利用。水稻杂交水稻育种技术有几个重要的环节：一、可用的雄性不育系；二、稳定、高效地繁殖雄性不育系；三、不育系测配并筛选出理想的杂交组合；四、低成本高效的生产杂交水稻种子。四个环节缺一不可，决定着商业化的杂交水稻育种技术体系是否能被市场接受和带来社会及经济效益。
以核质互作为核心的“三系法”不育系，受特定的恢复系和保持系关系制约，仅少部分水稻种质资源可用于杂交配组，不育系测配和筛选出理想的杂交组合受限；以光温敏基因为基础的“两系法”细胞核隐性不育系，克服了“三系”不育系受恢保关系制约，提高了水稻资源利用率，但“两系”不育系的育性受光温等环境因素的影响，育性不稳定，存在较高的繁种和制种风险。因而，目前的水稻杂交育种技术体系仍有待改进。
本发明是基于发明人的下列发现完成的：利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变建立了籼稻水稻品种黄华占突变体库，从中筛选得到隐性核雄性不育系圳18A，并克隆了控制该隐性核不育性状的基因fg2(Fertility Gene 2，文章中的名称为Os-NP1)(Chang et al.,Construction of a male sterility system for hybrid rice breeding and seedproduction using a nuclear male sterility gene(2016)PNAS.113(49):14145-14150)。将花粉失活基因PA(Pollen Amylase；SEQ ID NO:26)、种子筛选基因RFP(RedFluorecentProtein；SEQ ID NO:25)和育性恢复基因FG2(SEQ ID NO:27)通过遗传转化导入至转化受体水稻圳18A中，经过对上千个阳性转化体进行多代连续分子鉴定和蛋白表达检测、性状筛选和田间试验等，优选获得水稻事件FG2-55。水稻事件FG2-55作为保持系，同时含有水稻隐性核不育基因位点(fg2/fg2)和外源插入序列(RFP/PA/FG2)，通过自交或者与含有纯合隐性核不育基因(fg2/fg2)的不育系进行杂交，可生产不含转基因DNA成分的水稻隐性核不育系圳18A，达到批量生产水稻隐性核雄性不育系的目的。进一步，水稻隐性核雄性不育系圳18A可与水稻恢复系进行配组及杂交种的生产(图8)。该技术利用生物技术方法生产非转基因的水稻隐性核不育系，有效解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法不育系育性不稳定的问题。
外源基因在植物中的表达是受其在植物基因组中的插入位点影响的，可能是由于插入位点周围的染色质结构(如异染色质的结构)或附近的转录调节元件(如增强子)的调节引起的(Weising et al.,Foreign genes in plants:transfer,structure,expression,and applications.(1988)Ann.Rev.Genet 22:421-477)，例如，可以观察到在外源基因转化得到的插入位点不同的众多株系之间，外源基因的表达水平存在较大的差别，也可以观察到外源基因在不同转化株系中存在时空的表达差异，且这种差异不是人为选用的启动子等表达调控元件构建的表达框造成的。同时，外源基因在植物基因组的不同位置的整合会对植物的整体表型造成影响，比如，外源基因在植物基因组中的插入会使插入位点处的植物内源基因的表达受到影响。因此，在转化事件的创制过程中，有必要生产成百上千的独立转化株系，通过筛选大量的转化株系，鉴定得到符合商业化要求的一个最优转化事件，具备合乎要求的外源基因整合位点和表达水平及目标性状，同时对植物的其它表型和农艺性状不造成不良影响。进一步，可以通过回交转育方法，将该最优化事件的外源插入序列通过杂交转育到其他遗传背景的品种中去，创制更多优异的新品种。
在植物或种子或其子代或有性杂交的子代中，特异性检测转化事件的存在或不存在是非常重要的，事件特异性检测方法可以鉴定插入的外源DNA和受体基因组之间特有的接合位点(junction)，这不仅涉及转入的外源DNA，还涉及其在宿主植物或种子的基因组中的插入整合位置。此外，用于检测特定事件的方法对于转基因植物食品的上市前许可和标签的规定、环境监测和监测田地中作物的性状等也是非常有帮助的。
发明内容
为了实现上述目的，本发明提供与水稻事件FG2-55相关的重组DNA分子。这些重组DNA分子可能包含具有代表性的转基因插入侧翼的基因组DNA的区域，和/或转基因插入的区域，和/或任何这些区域的连接序列(如水稻事件FG2-55的转基因插入片段与侧翼基因组DNA之间的连接区域)的核苷酸序列的核苷酸分子。
术语“事件”是指包含插入的DNA和紧邻插入的DNA的任一侧的侧翼水稻基因组DNA的DNA分子，该DNA分子通过将转基因DNA插入到水稻植物的基因组中的行动，即转化行动来产生。因此，该DNA分子对所述事件是特异性的，并且对于其中插入有转基因DNA的水稻植物基因组有特异的核苷酸序列。因为该核苷酸序列含有水稻基因组DNA的特定区域和转基因DNA插入片段两者的序列。因此，水稻事件FG2-55中插入的DNA相对于其它水稻植物的基因组DNA的排列方式对于水稻事件FG2-55是特异性的和独有的。该DNA分子也是包含事件FG2-55的水稻染色体的整体组成部分，因此在植物中是静态的并且可以传递给植物的后代。
在本申请中，水稻事件FG2-55包含整合的转基因表达盒，其赋予了水稻植物通过自交或杂交生产水稻隐性核雄性不育系的方法。水稻事件FG2-55包含的转基因表达盒插入位点在各世代始终处于杂合状态，FG2基因的表达恢复了水稻雄性不育突变体(fg2/fg2)的育性，产生可育花粉。一半花粉即含插入基因(PA/FG2/RFP)也含有fg2基因(不育基因位点)。PA基因特异在成熟时期花粉中表达，降解花粉中的能源物质淀粉，导致含有外源基因的花粉失活(丧失授精能力)；另一半花粉含有fg2基因，正常可育。同理，FG2-55雌配子中一半含有外源基因(PA/FG2/RFP)也包含fg2基因，另一半含有fg2基因，自交产生两类种子(图8)，一类含有外源插入基因的保持系FG2-55(PA/FG2/RFP；fg2/fg2)，一类不含外源插入基因的不育系(fg2/fg2)。水稻事件FG2-55种子含有的RFP蛋白在绿光激发下发出红色荧光，而不育系种子由于不含转基因DNA序列及其表达的RFP蛋白，所以不能发出红色荧光，通过荧光镜或者色选机可以高效的分选保持系FG2-55(PA/FG2/RFP；fg2/fg2)和不育系(fg2/fg2)。
当以水稻隐性核雄性不育系(fg2/fg2)为花粉受体时，与水稻事件FG2-55杂交仅产生不含转基因DNA的水稻隐性核雄性不育系(fg2/fg2)。
当在本文中使用时，术语“重组”是指通常不存在于自然界中并且因此通过人类干预而产生的DNA和/或蛋白质和/或生物体的形式，这样的人类干预可以产生重组DNA分子和/或重组植物。当本文中使用时，“重组DNA分子”是包含在自然界中不一起出现而由于人类干预而产生的DNA分子组合的DNA分子，例如包含彼此异源的至少两个DNA分子的组合的DNA分子，和/或包含人工整合到宿主细胞的基因组DNA中的转基因和宿主细胞基因组的相关侧翼DNA的DNA分子。重组DNA分子的实例是本文中描述的通过将转基因插入到水稻基因组DNA中而得到的DNA分子，其可能最终导致重组RNA和/或蛋白质分子在该生物体中表达。当在本文中使用时，“重组植物”是通常在自然界中不存在，是人类干预的结果的植物，并且含有整合到其基因组中的转基因和/或异源DNA分子。作为这样的基因组改变的结果，重组植物与相关的野生型植物明显不同。重组植物的实例是本文中描述的包含事件FG2-55的水稻植物。
当在本文中使用时，术语“转基因”是指人工整合到宿主细胞基因组中的核苷酸分子。这样的转基因对于所述宿主细胞可能是异源的。术语“转基因植物”是指包含这样的转基因的植物。
当在本文中使用时，术语“异源的”是指在自然界中第一分子通常不与第二分子组合存在。例如，一个分子可能源自于第一物种并被插入到第二物种的基因组中。因此，所述分子对于所述宿主来说是异源的，并人工整合到宿主细胞的基因组中。
当在本文中使用时，术语“嵌合的”是指通过将第一DNA分子与第二DNA分子融合而产生的单一DNA分子，其中第一和第二DNA分子通常都不以该构造(即彼此融合)存在。因此，嵌合的DNA分子是通常不存在于自然界中的新的DNA分子。
在本文中使用时，术语“DNA”、“DNA分子”、“核苷酸分子”是指基因组或合成来源的DNA分子，即脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或多核苷酸分子，其从5'(上游)末端向3'(下游)末端阅读。当在本文中使用时，术语“DNA序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”是指DNA分子的核苷酸序列。按照惯例，作为SEQ ID NO:1-10提供的本发明的核苷酸序列及其片段仅针对两条互补核苷酸序列链中的一条链来公开。这暗示了互补序列(即互补链的序列，也称之为反向互补序列)在本发明的范围之内，并且明确在所要求保护的主题的范围之内。
插入的转基因DNA和所述插入的转基因DNA任一末端侧翼的水稻基因组DNA的核苷酸序列在本文中已提供(SEQ ID NO:10)。它的子区段是以SEQ ID NO:9提供的插入的转基因DNA。通过磷酸二酯键物理连接于插入的转基因DNA并因此邻接于其5'末端的水稻基因组DNA的核苷酸序列如图1所示，并以SEQ ID NO:1、2、3、7提供。通过磷酸二酯键物理连接于插入的转基因DNA并因此邻接于其3'末端的水稻基因组DNA的核苷酸序列如图1所示，并以SEQID NO:4、5、6和8提供。
水稻事件FG2-55还包含两个区域，一个区域跨越转基因DNA插入到基因组中的5'位置，另一区域跨越转基因DNA插入到基因组中的3'位置，在本文中分别称为5'接合部和3'接合部。“接合部序列”或“接合部区域”是指跨越插入的转基因DNA和相邻的侧翼基因组DNA的DNA序列和/或相应的DNA分子。接合部序列可以任意的用以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4提供的核苷酸序列来表示，所述序列各表示与插入的转基因DNA和相邻的侧翼基因组DNA的10个核苷酸。或者，接合部序列可以任意的用以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5提供的核苷酸序列来表示，所述序列各表示与插入的转基因DNA和相邻的侧翼基因组DNA，30个核苷酸。或者，接合部序列可以任意的用以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6提供的核苷酸序列来表示，所述序列各表示与插入的转基因DNA和相邻的侧翼基因组DNA，50个核苷酸。这些核苷酸通过磷酸二酯键相连，并且在水稻事件FG2-55中作为基因组的部分存在。在源自于水稻植物、种子或植物部分的样品中SEQ ID NO:1-10中的一个或多个的鉴定能够确定所述DNA是水稻事件FG2-55获得，并且能够诊断样品中来自于水稻事件FG2-55的DNA的存在。因此，本发明提供了含有至少一个以SEQ ID NO:1-10提供的核苷酸序列的DNA分子。足以包含至少一个以SEQ IN NO:1-10提供的序列的源自于转基因水稻事件FG2-55的任何DNA片段在本发明的范围之内。此外，包含了本段落中描述的任何序列互补的序列的任何多核苷酸在本发明的范围之内。图1示出了SEQ ID NO:1-9从5'到3'排列的相对于SEQ IN NO:10的物理排列。
本发明提供了可用作诊断水稻事件FG2-55的引物和探针的DNA分子以及诊断水稻事件FG2-55的存在的扩增子。还公开了包含这些分子的水稻植物、植物细胞、植物部分、商品、后代和种子。
上述引物或探针对于目标核酸序列是特异性的，且因此可用于通过本文中描述的本发明的方法鉴定水稻事件FG2-55的核酸序列。
“引物”通常是高度纯化的分离的多核苷酸，其被设计用于涉及热扩增的特异性退火或杂交方法。一对引物可以与模板DNA例如水稻基因组DNA样品一起使用在热扩增例如聚合酶链式反应(PCR)中，以产生扩增子。当在本文中使用时，“扩增子”是使用扩增技术合成的DNA碎片或片段。本发明的扩增子包含至少一个以SEQ ID NO:1-10提供的序列。引物通常被设计成与互补的靶DNA链杂交以在引物与靶DNA链之间形成杂交体，并且引物的存在是聚合酶使用靶DNA链作为模板开始引物延伸的识别位点。可用作引物的示例性DNA已SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20提供，以SEQ ID NO:19和SEQ IN NO:20提供的引物对可用作第一DNA分子与所述的第一DNA分子不同的第二DNA分子，并且两者各具有SEQ ID NO:10的足够长度的连续核苷酸以起到当在热扩增反应中源自于水稻事件FG2-55的模板DNA一起使用时，产生诊断样品中水稻事件FG2-55 DNA的扩增子的DNA引物的作用。
“探针”是与靶核苷酸链互补的分离的核酸。本发明的探针包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性结合于靶DNA序列的其它探针材料，并且这种结合的检测可用于诊断、辨别、确定或证实靶DNA序列在特定样品中的存在。探针可以连接于常规的可检测标记或报告分子，例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。可用作探针的示例性DNA分子已SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:24提供。
根据本发明的探针和引物可以与靶序列具有完全的序列同一性，尽管可以通过常规方法来设计保持与靶序列优先杂交的能力的而与靶序列不同的引物和探针。为了使核酸分子起到引物和探针的作用，只需要在序列中足够互补以便能够在所使用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。可以使用任何常规的核酸杂交或扩增方法来鉴定样品中来自于水稻事件FG2-55的转基因DNA的存在。探针和引物的长度一般至少为11个核苷酸、至少约18个核苷酸、至少约24个核苷酸或至少约30个核苷酸或更长。这样的探针和引物在严格杂交条件下与靶DNA序列特异性杂交。常规的严格性条件描述在Sambrook等，1989和Haymes等，Nucleic Acid Hybridization，APractical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)中。当在本文中使用时，如果两个核酸分子能够形成反向平行的双链核酸结构，则这两个分子能够彼此特异性杂交。如果两个核酸分子表现出完全互补性，则一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补体”。当在本文中使用时，如果两个分子在比对时，第一分子的每个核苷酸与第二分子的每个核苷酸互补，则这两个分子表现出“完全互补性”。如果两个分子可以以足够的稳定性彼此杂交以允许它们在至少常规的“低严格性”条件下保持彼此退火，则这两个分子是“最低互补的”。同样的，如果分子能够以足够的稳定性彼此杂交以允许它们在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火，则它们是“互补的”。因此，偏离完全互补性是容许的，只要这样的偏离不完全排除分子形成双链结构的能力即可。
可以使用本领域技术人员公知的大量方法来分离和操作本发明中公开的DNA分子或其片段。例如，可以使用PCR(聚合酶链式反应)技术来扩增特定的起始DNA分子和/或产生原始分子的变体。DNA分子或其片段也可以通过其它技术获得，例如通过使用化学手段直接合成所述片段，正如通常通过使用自动化寡核苷酸合成仪所实现的。
因此，本文中提供的DNA分子和相应的核苷酸序列除了其他用途之外，可用于鉴定水稻事件FG2-55、选择包含水稻事件FG2-55的植物品种或杂种、检测样品中源自于转基因水稻事件FG2-55的DNA的存在以及监测样品中水稻事件FG2-55或源自于包含水稻FG2-55的水稻植物的植物部分的存在和/或不存在。
本发明提供的水稻植物、植物细胞、植物部分(例如花粉、果实、穗组织、花组织、根组织、茎组织和叶组织)、商品、后代和种子含有可检测量的本发明的多核苷酸，即例如具有以SEQ ID NO:1-10提供的至少一个序列的多核苷酸。本发明的植物、后代、种子、植物细胞和植物部分也可以含有一个或者多个其它的转基因。这样的转基因可以是编码赋予所需性状的蛋白质或RNA分子的任何核苷酸序列，所述性状包括但不限于提高的抗虫性、提高的水利用效率、提高的产量性能、提高的抗旱性、提高的种子品质、性状的营养品质和/或提高的除草剂耐受性，其中所述所需性状相对于缺少这样的其它转基因的水稻植物测定。
本发明的植物可以将事件DNA(包括转基因)传递给后代。当在本文中使用时，“后代”包括包含源自于祖先植物的事件DNA和/或包含具有选在SEQ ID NO:1-10的至少一个序列的DNA分子的任何植物、种子、植物细胞和/或可再生植物部分。植物、后代和种子对于所述转基因可以是纯合的或杂合的。可以从由含有水稻事件FG2-55的植物产生的种子和/或从用来自于含有水稻事件FG2-55的植物的花粉授粉的植物所产生的种子来生长后代。
后代植物可以自花授粉也可以异花授粉，例如与另一种无亲缘关系的植物杂交，以产生变种或杂种种子或植物。所述另外的无亲缘关系的植物可以是转基因的或非转基因的。因此，本发明的变种或杂种种子或植物可以通过将缺少水稻事件FG2-55的特异性和独特的DNA的第一亲本与包含水稻事件FG2-55的第二亲本杂交来产生，从而产生包含水稻事件FG2-55的特异性的和独特的DNA的杂种。各个亲本可以是杂种或近交系/变种，只要杂交或育种产生本发明的植物或种子，即具有含有水稻事件FG2-55的DNA的至少一个等位基因和/或具有选自SEQ IN NO:1-10的至少一个序列的DNA分子的种子。因此，可以将两种不同的转基因植物杂交以产生含有两个独立地分离的添加的外源基因的杂种后代。
当在本文中使用时，本发明提供的源自于包含事件FG2-55的水稻植物的植物部分指有源自于包含事件FG2-55的水稻植物的材料构成的植物的任何部分。植物部分包括但不限于花粉、果实、穗组织、花组织、根组织、茎组织和叶组织。植物部分可以是有可存活的、非存活的、可再生的和/或不可再生的。
当在本文中使用时，本发明提供的“商品”是指由源自于含有水稻事件FG2-55的植物、种子、植物细胞或植物部分的材料构成的任何组合物或产品。商品可以销售给消费者，并且可以是存活的或非存活的。非存活的商品包括但不限于非存活的种子，加工的种子、种子部分和植物部分，用于饲料和食品、油。存活的商品包括但不限于种子、植物和植物细胞。因此，包含事件FG2-55的水稻植物可用于制造通常从水稻获得的任何商品。任何这样的源自于包含事件FG2-55的水稻植物的商品可能含有至少可检测的对应于水稻事件FG2-55的特异性和独特性的DNA，并且具体来说可能含有可检测的包含具有选自SEQ ID NO:1-10的至少一个序列的DNA分子的多核苷酸。可以使用检测核苷酸分子的任何标准方法，包括本文公开的检测方法。如果商品中存在任何可检测的具有选自SEQ ID NO:1-10的至少一个序列的DNA分子，则所述商品在本发明的范围之内。
因此，本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分和商品，除了其他用途之外，可用于生长植物，其目的在于生产包含水稻事件FG2-55的种子和/或植物部分以实现农业目的，生产包含水稻事件FG2-55的后代用于植物育种和研究目的，采用生物学技术用于工业和研究应用，以及销售给消费者。
本发明提供了可用于检测源自于水稻事件FG2-55的DNA的存在和/或不存在的方法，并因此提供了可用于检测水稻事件FG2-55存在和/或不存在的方法、组合物和试剂盒。本发明提供了一种包含了水稻事件FG2-55植物或种子的基因组DNA的核酸扩增反应中，与可产生诊断水稻事件FG2-55的扩增子的引物组相接触，进行核酸扩增反应并由此产生所述扩增子，以及检测所述扩增子的存在和/或不存在而检测水稻事件FG2-55的方法。
上述方法由下述步骤构成：(Ⅰ)从至少一个水稻细胞、组织、种子和植物提取DNA样品，(Ⅱ)将所述DNA样品与对事件FG2-55特异性的DNA探针相接触，(Ⅲ)允许所述探针和DNA样品再严格杂交条件下杂交，然后(Ⅳ)检测所述探针与靶DNA样品之间的杂交。对事件FG2-55 DNA特异性的DNA探针的序列的实例以SEQ ID NO:24提供。其他探针可以由本领域技术人员容易地设计，并且包含SEQ ID NO:10的至少一个片段，检测到探针与DNA样品的杂交对样品中水稻事件FG2-55特异性DNA的存在是诊断性的。或者，不存在杂交对样品中水稻事件FG2-55特异性DNA的不存在是诊断性的。
本发明还提供了一种包含了水稻事件FG2-55植物或种子的基因组DNA的核酸杂交反应中，与可诊断水稻事件FG2-55的DNA分子杂交探针相接触，从而进行杂交反应的方法，以及检测上述探针与上述DNA分子的杂交情况而检测水稻事件FG2-55是否存在的方法。本发明还提供了可用于检测源自于水稻事件FG2-55的DNA的存在方法和组合物的试剂盒。
上述方法由下述步骤构成：(Ⅰ)从至少1个水稻细胞、组织、种子或植物提取DNA样品，(Ⅱ)将所述DNA样品与能够在适合于DNA扩增的条件下产生事件FG2-55的扩增子的引物对相接触，(Ⅲ)进行DNA扩增反应，然后(Ⅳ)检测所述扩增子分子和/或证实所述扩增子的核苷酸序列包含事件FG2-55特异性的核苷酸序列，例如选自SEQ IN NO:1-10的一个核苷酸序列。扩增子应该是对事件FG2-55特异性的扩增子，例如选自SEQ ID NO:1-10的一个核苷酸序列。扩增子中对事件FG2-55特异性的核苷酸序列的检测对于样品中水稻事件FG2-55特异性DNA的存在是确定性的和/或诊断性的。能够在适合于DNA扩增的条件下产生事件FG2-55 DNA的扩增子的引物对的实例以SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20提供。其他引物对可以由本领域技术人员容易的设计，并且应该包含SEQ IN NO:10的至少一个片段。
上述两种方法提供的DNA检测试剂盒，其可用于鉴定样品中的水稻事件FG2-55DNA。这样的试剂盒含有包含SEQ ID NO:1-10的片段的DNA引物和/或探针。这样的试剂盒的一个实例包含具有SEQ ID NO:10的足够长度的连续核苷酸的至少一个DNA分子，以起到可用于检测样品中源自于包含事件FG2-55的转基因水稻植物的DNA的存在和/或不存在的DNA的探针的作用。所述源自于包含事件FG2-55的转基因水稻植物的DNA包含具有选自SEQ IDNO:1-10的至少一个序列的DNA分子。提供了足以用作DNA探针的DNA分子，其可用于确定、检测或诊断样品中水稻事件FG2-55的存在和/或不存在。其它探针可以由本领域技术人员容易地设计，并且应该包含SEQ ID NO:10的至少15个连续核苷酸和对于水稻事件FG2-55足够独特，以便鉴定源自于所述事件的DNA。另一种类型的试剂盒包含可用于产生扩增子的引物对，所述扩增子可用于检测样品源自于转基因水稻事件FG2-55的DNA的存在和/或不存在。这样的试剂盒将利用包含下列步骤的方法：将靶DNA样品与本文中所描述的引物对接触，然后进行足以产生包含具有选自SEQ IN NO:1-10的至少一个序列的DNA分子的扩增子的核酸扩增反应，然后检测所述扩增子的存在和/或不存在。这样的方法还可以包括对扩增子的或其片段进行测序，其对靶DNA样品中水稻事件FG2-55特异性DNA的存在是确定性的，即诊断靶DNA样品中水稻事件FG2-55特异性DNA的存在。其他引物对可以由本领域技术人员容易地设计，并且应该包含SEQ ID NO:10的至少15个连续核苷酸和对水稻事件FG2-55 DNA足够独特以便鉴定源自于所述事件的DNA。
核酸扩增可以通过本领域已知的各种核酸扩增方法中的任一种来进行，包括热扩增方法。在本领域中已知许多用于对通过这些方法产生的扩增子进行检测、定量和/或测序的技术。可用于实施本发明的一种示例性技术是TAQMAN(PE Applies Biosystems，FosterCity，CA)。
本发明的试剂盒和检测方法除了其他方面之外，可用于鉴定水稻事件FG2-55，选择包含水稻事件FG2-55的植物品种，检测样品中源自于包含事件FG2-55的转基因水稻植物的DNA的存在，以及监测样品中包含事件FG2-55的水稻植物或源自于包含事件FG2-55的水稻植物的植物部分的存在和/或不存在。
来自于水稻事件FG2-55的异源DNA插入片段的序列、接合序列或侧翼序列可以通过使用源自于本文提供的序列的引物扩增这样的来自于事件的序列，然后对扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序来验证。
当在本文中使用时，术语“包含”意味着“包括但不限于”。
本发明上述提供的源自于包含插入到植物基因组的特定位置中的水稻事件FG2-55的植物、植物细胞或种子的水稻植物、种子、植物细胞、后代植物、植物部分或商品，这样的后代可以通过水稻事件FG2-55或其后代与另一植物之间的有性杂交来产生。这样的其它植物可以是包含相同或不同转基因的转基因植物和/或非转基因植物。即使与轮回亲本重复回交后，来自于被转化亲本的插入DNA和侧翼DNA也存在于杂交后代中的相同基因组位置处。具体地，本发明提供包含重组DNA分子的水稻植物、种子、植物细胞、后代植物、植物部分或商品，所述重组DNA分子具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10及其互补序列和片段的核苷酸序列。本发明还提供了源自于包含水稻事件FG2-55并包含重组DNA分子的植物或种子的水稻植物、种子、植物细胞、后代植物、植物部分或商品，所述重组DNA分子在DNA扩增方法中产生包含选自SEQ ID NO：1-10的序列的扩增的DNA分子。
本发明还提供了一种通过水稻事件FG2-55生产水稻种子的方法，更具体一点的是提供一种生产水稻隐性核雄性不育系的方法。所述事件包含转基因DNA在水稻种质的染色体/基因组中的单一插入。“事件”是通过下述的步骤产生：(Ⅰ)用包括目标转基因的核酸构建体转化植物细胞，(Ⅱ)再生由转基因在植物基因组中的插入获得的植物群体；以及(Ⅲ)选择以转基因插入到植物基因组中的特定位置为特征的特定植物。具体地，所述方法为种植包含事件FG2-55的水稻植物在田地中，其中所述包含事件FG2-55的水稻植物含有突变并丧失育性功能的fg2/fg2基因，然后通过包含事件FG2-55的水稻植物自交，或以水稻事件FG2-55作为父本与第二水稻植物进行有性杂交，所述第二水稻植物包含突变并丧失育性功能的fg2/fg2基因；从所述田地收获水稻自交或杂交种子；通过荧光分选机和/或人工选择非红色荧光的后代种子。因为在绿光下，含有转基因水稻事件FG2-55的种子发出红色荧光，而非红色荧光种子由于含fg2/fg2基因突变位点，为水稻的隐性核雄性不育系，不发出红色荧光。
当在本文中使用时，术语“水稻”是指籼稻(Oryza sativa L.ssp.indica)，并包含可以与水稻育种的所有植物品种，包含野生稻物种和属于稻属(Oryza L.)的允许种间繁育的植物。
本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分的商品可评估其DNA组成、基因表达和/或蛋白质表达。这样的评估可以通过使用任何标准方法来进行，例如PCR、Northernblot、Southernblot、Western blot、免疫沉淀和ELISA，或使用本文中提供的检测方法和/或检测试剂盒。
本发明提供了一种诊断含有水稻事件FG2-55的植物或种子的接合性的方法，所述方法包括将水稻DNA样品与包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17的引物组及包含SEQ ID NO 12和SEQ ID NO：16的探针组相接触；然后进行所述样品、引物组和探针组的核酸扩增反应；然后在所述核酸扩增反应中检测诊断事件FG2-55的第一荧光信号以及与所述第一荧光信号不同而诊断水稻基因组DNA的第二荧光信号；以及分析所述核酸扩增反应中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的存在和/或不存在，其中两种荧光信号的存在表明所述所检测的样品中包含事件FG2-55。
本发明还提供了诊断含有水稻事件FG2-55的植物或种子的接合性的方法，所述方法包括将水稻DNA样品与包含SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的引物组相接触；然后进行所述样品和引物组的核酸扩增反应；然后在所述核酸扩增反应中产生诊断事件FG2-55的扩增的DNA分子，所述扩增的DNA分子可以通过凝胶电泳或者DNA测序技术进行确定来所述扩增子的存在和/或不存在，扩增子的存在表明所述所检测的样品中包含事件FG2-55。
本发明还提供了一种诊断含有水稻事件FG2-55植物或种子的基因组DNA的基于Southern杂交的方法，所述方法包括将水稻DNA样品与包含SEQ ID NO:24的探针相接触；与可诊断水稻事件FG2-55的DNA分子杂交探针相接触，从而进行杂交反应，以及检测所述探针与所述DNA分子的杂交而检测水稻事件FG2-55的方法。本发明还提供了可用于检测源自于水稻事件FG2-55的DNA的存在的方法和组合物的试剂盒。
本发明取得的有益效果为：
1)提供了一种能够有效稳定繁殖水稻隐性核雄性不育系的方法；
2)提供了一种充分利用水稻种质资源用于水稻杂交育种及其提高杂交水稻育种效率的方法。
附图说明
图1为转基因插入片段在包含事件FG2-55的水稻植物的基因组中的组构。其中[A]对应于SEQ ID NO:1的相对位置；[B]对应于SEQ ID NO:2的相对位置；[C]对应于SEQ IDNO:3的相对位置；[D]对应于SEQ ID NO:4的相对位置；[E]对应于SEQ ID NO:5的相对位置；[F]对应于SEQ ID NO:6的相对位置；[G]对应于SEQ ID NO:7的相对位置；[H]对应于SEQ IDNO:8的相对位置；[I]对应于SEQ ID NO:9的相对位置；[J]对应于SEQ ID NO:10的相对位置；[K]对应于SEQ ID NO:11的相对位置；[L]对应于SEQ ID NO:12的相对位置；[M]对应于SEQ ID NO:13的相对位置；[N]对应于SEQ ID NO:14的相对位置；[O]对应于SEQ ID NO:19的相对位置；[P]对应于SEQ ID NO:20的相对位置；[Q]对应于SEQ ID NO:21的相对位置；[R]对应于SEQ ID NO:22的相对位置；[S]对应于SEQ ID NO:23的相对位置；[T]对应于SEQID NO:24的相对位置；[U]对应于SEQ ID NO:25的相对位置(RFP基因表达框)；[V]对应于SEQ ID NO:26的相对位置(PA基因表达框)；[W]对应于SEQ ID NO:27的相对位置(FG2基因表达框)。
图2为RFP探针序列(SEQ ID NO:24)的Southern杂交示意图。
图3为RFP探针Southernblot特异性检测水稻事件FG2-55。其中泳道1：分子量标准；泳道2：黄华占(PvuⅠ)+1*p3N(StuⅠ)；泳道3：黄华占(PvuⅠ)+0.1*p3N(StuⅠ)；泳道4：圳18A(ClaⅠ)；泳道5：FG2-55(ClaⅠ)；泳道6：圳18A(PvuⅠ)；泳道7：FG2-55(PvuⅠ)；泳道8：圳18A(StuⅠ)；泳道9：FG2-55(StuⅠ)。
图4为特异性PCR检测水稻事件FG2-55。其中M：分子量标准；1：玉米(郑58)；2：小麦(中国春)；3：油菜(中双11)；4：圳18A；5：武运粳7号；6：转化体FG2-47；7：转化体FG2-205；8：转化体FG2-55。
图5为右边界特异性引物对灵敏度检测结果。其中M：分子量标准；1：100％水稻事件FG2-55基因组DNA；2：10％水稻事件FG2-55基因组DNA；3：1％水稻事件FG2-55基因组DNA；4：0.1％水稻事件FG2-55基因组DNA；5：0.01％水稻事件FG2-55基因组DNA；6：0.001％水稻事件FG2-55基因组DNA；7：0.0001％水稻事件FG2-55基因组DNA。
图6为水稻事件FG2-55种子分别在白光状态和激发状态下的对比，其中水稻事件FG2-55种子在激发状态下呈红色荧光。
图7为水稻事件FG2-55(左)和对照黄华占(右)花粉碘化钾染色。
图8为水稻事件FG2-55生产水稻隐性核不育系和杂交水稻原理示意图。
序列简述
SEQ ID NO:1是20个核苷酸的序列，其表示水稻基因组DNA与整合的转基因表达盒的5'连接区域。SEQ ID NO:1位于SEQ ID NO:10中957～976bp核苷酸位置处。
SEQ ID NO:2是60个核苷酸的序列，其表示水稻基因组DNA与整合的转基因表达盒的5'连接区域。SEQ ID NO:2位于SEQ ID NO:10中937～996bp核苷酸位置处。
SEQ ID NO:3是100个核苷酸的序列，其表示水稻基因组DNA与整合的转基因表达盒的5'连接区域。SEQ ID NO:3位于SEQ ID NO:10中917～1016bp核苷酸位置处。
SEQ ID NO:4是20个核苷酸的序列，其表示水稻基因组DNA与整合的转基因表达盒的3'连接区域。SEQ ID NO:4位于SEQ ID NO:10中13555～13574bp核苷酸位置处。
SEQ ID NO:5是60个核苷酸的序列，其表示水稻基因组DNA与整合的转基因表达盒的3'连接区域。SEQ ID NO:5位于SEQ ID NO:10中13535～13594核苷酸位置处。
SEQ ID NO:6是100个核苷酸的序列，其表示水稻基因组DNA与整合的转基因表达盒的3'连接区域。SEQ ID NO:6位于SEQ ID NO:10中13515～13614核苷酸位置处。
SEQ ID NO:7是1386个核苷酸的序列，其表示水稻基因组DNA与整合的转基因表达盒的5'连接区域。SEQ ID NO:7位于SEQ ID NO:10中1～1386bp核苷酸位置处。
SEQ ID NO:8是1440个核苷酸的序列，其表示水稻基因组DNA与整合的转基因表达盒的3'连接区域。SEQ ID NO:8位于SEQ ID NO:10中13002～14441bp核苷酸位置处。
SEQ ID NO:9是12598个核苷酸的序列，其表示整合的转基因表达盒序列。SEQ IDNO:9位于SEQ ID NO:10中967～13564bp核苷酸位置处。
SEQ ID NO:10是侧邻插入DNA的5'序列、整合的转基因表达盒序列和侧邻插入的DNA的3'序列的连续核苷酸序列，SEQ ID NO：10包含SEQ ID NO：1-9。
SEQ ID NO:11是用TAQMAN方法鉴定水稻事件FG2-55的引物TTY-55F的核苷酸序列，与3'端插入的表达盒序列互补。引物组合TTY-55F和TTY-55R(SEQ ID NO:13)在TAQMAN(Applied Biosystems)扩增产生PCR扩增子并诊断水稻事件FG2-55。
SEQ ID NO:12是用TAQMAN方法鉴定水稻事件FG2-55的探针TP55的核苷酸序列，它与3'端接合部区域的序列互补，TP55探针5'端进行6-FAMTM标记，3'进行MGB(Minor GrooveBinder)标记，引物组合TTY-55F和TTY-55R(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13)与TP55探针结合的扩增反应中，释放荧光信号并诊断水稻事件FG2-55。
SEQ ID NO:13是用TAQMAN方法鉴定水稻事件FG2-55的引物TTY-55R的核苷酸序列，与3'端的水稻基因组序列互补。引物组合TTY-55F(SEQ ID NO:11)和TTY-55R在TAQMAN(Applied Biosystems)扩增产生PCR扩增子并诊断水稻事件FG2-55。
SEQ ID NO:14是指引物TTY-55F和TTY-55R的组合从TAQMAN(AppliedBiosystems)扩增产生的PCR扩增子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15是用TAQMAN方法鉴定水稻内源SPS基因(Sucrose PhosphateSynthase)的引物TSPS-F的核苷酸序列。引物组合TSPS-F和TSPS-R(SEQ ID NO:17)的组合从TAQMAN(Applied Biosystems)扩增产生PCR扩增子，并鉴定是否存在水稻基因组序列。
SEQ ID NO:16是用TAQMAN方法鉴定水稻内源SPS基因的探针TPSPS的核苷酸序列，TPSPS探针5'端进行VICTM标记，3'进行MGB(Minor Groove Binder)标记，在使用TSPS-F和TSPS-R(SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17)与TP55探针结合的扩增反应中，释放荧光信号并诊断是否存在水稻基因组序列。
SEQ ID NO:17是用TAQMAN方法鉴定水稻内源SPS基因的引物TSPS-R的核苷酸序列。使引物TSPS-F和TSPS-R的组合从TAQMAN(AppliedBiosystems)扩增产生的PCR扩增子，并鉴定是否存在水稻基因组序列。
SEQ ID NO:18是指引物TSPS-F和TSPS-R(SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17)的组合从TAQMAN(AppliedBiosystems)扩增产生PCR扩增子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19是用PCR方法鉴定水稻事件FG2-55的引物PTY-55F的核苷酸序列，SEQ ID NO:19与3'端插入的表达盒序列互补。引物组合PTY-55F和PTY-55R(SEQ ID NO:20)在PCR反应中扩增产生PCR扩增子，并鉴定是否存在水稻事件FG2-55。
SEQ ID NO:20是用PCR方法鉴定水稻事件FG2-55的引物PTY-55R的核苷酸序列，SEQ ID NO:20与3'水稻基因组序列互补。引物组合PTY-55F和PTY-55R在PCR反应中扩增产生PCR扩增子，并鉴定是否存在水稻事件FG2-55。
SEQ ID NO:21是引物组合PTY-55F和PTY-55R(SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20)从PCR反应中产生的PCR扩增子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22是引物PRFP-F的核苷酸序列，用于制备RFP探针。
SEQ ID NO:23是引物PRFP-R的核苷酸序列，用于制备RFP探针。
SEQ ID NO:24是用Southern blot方法鉴定水稻事件FG2-55的探针SPRFP的核苷酸序列，在引物组合PRFP-F和PRFP-R(SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23)的PCR扩增反应中应用DIG-11-dUTP部分替代dTTP，以地高辛(digoxin)标记探针SPRFP。
SEQ ID NO:25是RFP基因表达框核苷酸序列。
SEQ ID NO:26是PA基因表达框核苷酸序列；
SEQ ID NO:27是FG2基因表达框核苷酸序列；
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。例如，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd edition)》(Sambrook，J.，Russell,David W.，2001，Cold Spring Harbor)，《PlantPropagationby Tissue Culture》(Edwin F.George,Michael A.Hall,Geert-JanDeKlerk,2008,Springer)。
包含了下面的实施例以阐明本发明的某些优选实施方式的实例。本领域技术人员应该认识到，在后面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现在本发明的实施中表现良好且因此被认为构成其优选实施方式的实例的方式。然而，根据本公开，本领域技术人员应该认识到，可以在所公开的特定实施方式中做出许多改变并仍获得类似或相似结果而不背离本发明的精神和范围。
实施例1：水稻转化和FG2-55事件的选择
本实施例描述了水稻事件FG2-55的产生、分析和选择。具体地，利用农杆菌介导法对水稻进行共转化(Hiei et al.,Efficient transformation of rice mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.(1994)PlantJ6(2):271-282，通过参照将其并入本文)，以圳18A为转化受体材料，利用农杆菌将RFP(SEQ ID NO:25)、PA(SEQ ID NO:26)和FG2基因(SEQ ID NO:27)核苷酸序列导入至圳18A中(Chang et al.,Construction of a male sterility system for hybrid ricebreeding and seed production using anuclear male sterility gene(2016)PNAS.113(49):14145-14150.Fig.S7)，得到阳性转基因材料1000株以上。然后通过拷贝数分析、载体骨架分析、插入位点分析，以及结合田间农艺性状(包含结实率、种子荧光分离比、花粉失活率、株高、生育期等)，从中优选出水稻事件FG2-55。
实施例2：转化事件的花粉育性检测
对实施例1中水稻事件FG2-55及非转基因对照水稻(合美占和黄华占)进行花粉活力观察分析。具体地，在水稻开花晚期，从上述三个品种中个随机抽取单株，各株取一朵充分成熟将要开花的花蕾，每朵花取1个花药，置于载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子释放花粉粒后，再加1～2滴I2-KI(2g KI与1g I2溶于300ml蒸馏水)溶液，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察、计数可染色花粉数和不可染花粉数。凡花粉粒呈蓝色，说明该花粉粒含有淀粉且活力较强；凡花粉粒呈黄褐色，说明为发育不良的花粉粒。本实验统计并分析材料10次重复，即10张载玻片，每片取一个视野，统计10次重复的平均数的标准差(见表1)，并测量可染花粉的直径。
实验结果表明，水稻事件FG2-55花粉经I2-KI染色的概率为51.68±2.89％，远低于合美占(98.02±1.19％)和黄华占(98.28±1.47％)。在理论上，水稻事件FG2-55的转基因元件在各个世代中均处于杂合状态，因此有一半花粉不含外源基因(可育)，一半花粉含有转基因元件(不育)，且元件中所含PA基因在花粉中特异表达，从而有效地降解花粉中的淀粉，使含有转基因元件的花粉不能被I2-KI染色，显著降低了花粉活力和受精能力，造成转基因花粉失活。
表1花粉I2-KI染色试验数据统计
实施例3：荧光种子和非荧光种子分离比例的统计分析
RFP基因在水稻事件FG2-55的种子中可高效表达红色荧光蛋白RFP，在绿光激发下，RFP蛋白发出红色荧光可用以区分水稻事件FG2-55和水稻隐性核不育系圳18A种子(图6)。水稻事件FG2-55自交结实，经脱粒、除杂和色选后，把FG2-55自交结实种子中的红色荧光种子(FG2-55)和非荧光种子(圳18A)分开，并统计其粒数。
随机选取通过实施例1中所得到的水稻事件FG2-55的T4、T5和T6代单株(每世代统计30个单株)，对其所收获的荧光种子和非荧光种子的分离比进行计算。结果如表3所示，所有单株的荧光分离比例卡方X2值(df＝1)均低于临界值3.81，说明T4、T5和T6这3个世代水稻事件FG2-55中荧光种子和非荧光种子分离比均符合1:1。
表2转化体FG2-55的T4-T6代荧光分离比数据统计分析(卡方检验)
注：★表示当df＝1时，χ2 0.05＝3.84。
由上述实施例2和3可以看出，本发明实现了稳定创制水稻雄性不育系和保持系的发明目的。
实施例4：水稻事件FG2-55的侧翼序列分析
通过对插入到包含FG2-55的水稻基因组中的DNA和该插入片段侧翼的基因组序列进行详细的分析，来分析了解水稻事件FG2-55的分子特征。这些分析包括：插入片段序列、插入数目(水稻基因组内整合位点的数量)、插入片段的拷贝数(一个基因座内插入片段的拷贝数)、插入的基因盒的完整性以及插入片段的侧翼序列等。
利用Tail-PCR和DNA测序技术确定插入片段和水稻基因组的5'和3'接合部，并确定包含事件FG2-55的水稻中插入片段的完整DNA序列(SEQ ID NO:9)。
通过HI-TAIL PCR(Liu et al.,High-efficiency thermal asymmetricinterlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences(2007)BioTechniques 43:649-656)方法克隆水稻事件FG2-55中转基因DNA序列的侧翼DNA序列。按照中华人民共和国农业行业标准NY/T674进行操作，提取水稻基因组DNA。将该DNA适当稀释，测定并记录其在260nm和280nm的紫外光吸收率，以一个OD260值相当于50μg/mL DNA浓度来计算纯化的DNA浓度。依据测得的浓度将DNA溶液稀释到50ng/μL，4℃保存一周内使用。本领域技术人员可以对这种方法进行改进以从水稻的任何组织提取基因组DNA。依据HI-TAILPCR方法设计引物组合，以基因组DNA为模板，根据引物长短和特异性差异设计不对称的温度循环，进行TAIL-PCR，得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和纯化，随后使用标准的DNA测序方案对DNA产物进行测序。测序结果显示(图1)，转基因DNA的左边界侧翼序列中的5'侧翼序列为SEQ ID NO:7所示；转基因DNA的右边界侧翼序列中的3'侧翼序列为SEQID NO:8所示；完整整合到水稻基因组DNA中的转基因DNA部分为SEQ ID NO:9所示。
通过HI-TAIL PCR和DNA测序获得的水稻事件FG2-55的转基因DNA的侧翼序列，经与籼稻93-11基因组数据库(http://www.gramene.org/，ASM465v1)比对分析后发现，转化体FG2-55外源序列插入在水稻基因组12号染色体长臂末端。
实施例5：Southern blot检测和分析水稻事件FG2-55
本发明采用Southern blot方法对水稻事件FG2-55进行插入位点数目和插入序列的拷贝数进行分析，并将其作为一种特异性检测水稻事件FG2-55的方法，具体操作如下：
根据转基因DNA序列设计探针，其中用于检测水稻事件FG2-55中的探针序列如SEQID NO:24所示，制备探针的引物PRFP-F和PRFP-R序列如SEQ ID NO:22-23所示。
DNA提取和酶切：根据天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP350)的操作步骤提取水稻基因组DNA，-20℃保存。使用前用Nanodrop 2000测定浓度。吸取30ug水稻基因组DNA，放大体系至500ul，酶切2～4h。酶切后加入300ul去离子水和800ul25:24:1的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后室温12000rpm离心15min，吸取上清(～700ul)于新Ep管中，加入700ul氯仿，充分混匀后室温12000rpm离心15min，吸取上清(～600ul)于新Ep管中，然后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜沉淀，4℃10000rpm离心30min后弃上清，用75％的乙醇洗涤沉淀两次，室温晾干，加入50ul去离子水溶解。
目的基因探针的制备(Roche PCRDIG Probe Synthesis Kit)：根据RFP基因表达框核苷酸序列设计引物，以水稻事件FG2-55基因组DNA为模板，用引物组合PRFP-F和PRFP-R(SEQ ID NO:22-23)进行PCR扩增。PCR产物经分离、纯化和定量后，于-80℃保存备用。
电泳：制备1％琼脂糖凝胶，恒压45V电泳过夜；溴酚兰距加样孔6-8cm时停止电泳；将凝胶浸入200mL0.25M HCl溶液中进行脱嘌呤处理约5-10min；凝胶取出在去离子水中漂洗后，浸入变性液中，2×15min；将凝胶取出，在去离子水中漂洗，浸入中和液中，2×15min；将凝胶取出，在去离子水中漂洗，后进行毛细转移。
DNA的毛细转移和转膜：向大培养皿中转入20×SSC→上架玻璃板→玻璃板上铺厚滤纸→赶气泡→将凝胶加样孔朝下放在滤纸桥上→周围用Parafilm膜盖住→胶上放等大的尼龙膜→赶气泡→膜上放四层与膜等大的滤纸→赶气泡→上放10cm厚的纸巾→放玻璃板→上压500g重物；毛细转移24h，取出膜并将其在2×SSC中漂洗，夹于滤纸中，245nmUV，紫外交联3min。
预杂交：将膜浸入预热到杂交温度(57℃)的DIG Easy Hyb(10mL/100cm2膜)中，在杂交箱中57℃60rpm预杂交1h；将DNA探针(约25ng/mL DIG Easy Hyb)在100℃变性10min后，立即放到冰上冷却10min；将变性的DNA探针加到预热(57℃)的DIG Easy Hyb中(3.5mL/100cm2膜)，轻柔混匀，避免泡沫；倒掉预杂交液，将杂交液倒入杂交瓶中，57℃60rpm杂交12～16h；杂交结束，回收杂交液。
洗膜：低严谨性(高盐，低温)：充足的2×SSC+0.1％SDS，室温60rpm洗涤2×15min；高严谨性(低盐，高温)：充足的0.5×SSC+0.1％SDS(预热到68℃)，60rpm洗涤2×15min。
检测：应用化学发光法进行检测，所有的操作都在室温进行。杂交结束并洗膜后，在Washing buffer中短暂冲洗膜约1-5min；在80mL Blocking solution中封闭30min；在20mL Antibody solution中反应40min；将膜转移到新容器，用Washingbuffer洗两次，每次15min；在20mL Detection buffer中平衡2-5min；将膜DNA面朝上小心放入杂交袋中，吸取1mL CSPD ready-to-use(Kit瓶5)至膜上，立即将杂交袋的上层盖在膜上，使底物均匀布满膜表面，并且避免气泡产生，室温反应5min；挤出多余的CSPD液体，将杂交袋的边缘封住(防止膜干燥)；将膜放在37℃，10min，以强化发光反应；暗室中曝光X-胶片15-25min后，洗片后分析结果。
试验结果与试验预期吻合，如图2所示的信息包括了水稻事件FG2-55与探针的结合位置，StuⅠ、PvuⅠ和ClaⅠ等3个限制性内切酶及其酶切位点，以及Southernblot所产生的预期片段大小分别为13.5kb、12.6kb和6.0kb。
实施例6：水稻事件FG2-55的定性PCR检测方法
水稻事件FG2-55基因组DNA的提取方法参照实施例5进行，并根据实施例4中获得的水稻事件FG2-55的左边侧翼序列和右边侧翼序列，分别依据插入片段DNA序列部分和水稻基因组序列部分设计特异性引物，优选的，引物组合为PTY-55F和PTY-55R(SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20)。
分别以玉米(郑58)、小麦(中国春)、油菜(中双11)和水稻(圳18A、武运粳7号、转化体FG2-47、FG2-205和FG2-55)的基因组DNA样品为模板，进行定性PCR检测。PCR反应体系如表4所示，扩增程序：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。PCR产物用3％的琼脂糖凝胶电泳进行分析。实验结果显示，常规玉米、小麦、油菜、水稻、水稻事件FG2-47和FG2-205均未获得扩增，只有水稻事件FG2-55扩增到长度为252bp的目标条带(SEQID NO:20)，实验说明该定性PCR体系能稳定和特异的检测FG2-55(图4)。
表3特异性定性PCR扩增体系
| 试剂 | 终浓度 | 单样品体积 |
| ddH<sub>2</sub>O | 15μL | |
| 10×PCR缓冲液 | 1× | 2μL |
| dNTP | 0.3mmol/L | 0.6μL |
| PTY-55F | 0.3μmol/L | 0.6μL |
| PTY-55R | 0.3μmol/L | 0.6μL |
| 2.5U/μLTaq酶* | 0.025U/μL | 0.2μL |
| 50ng/μLDNA模板 | 2.5ng/μL | 1.0μL |
| 总体积 | 20μL |
注：*Taq酶为全式金公司的TransStart Taq DNA Polymerase，货号AP141-03
实施例7：水稻事件FG2-55的定性PCR灵敏度检测
事件FG2-55和转化受体圳18A的基因组DNA的提取方法参照实施例5进行。然后将水稻事件FG2-55基因组DNA定量至50ng/μL，用50ng/μL的圳18A基因组DNA作为稀释液将转化体FG2-55的基因组DNA按照10倍梯度连续进行稀释(100％、10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％和0.0001％)，并以此稀释液作为模板分别进行特异性PCR扩增，用以检测定性PCR检测体系的最低检测限。PCR扩增体系和PCR扩增程序按照实施例6进行。
检测结果如图5所示，定性PCR检测体系的最低检测限为0.05ng(0.1％)，即在上样量为50ng的水稻基因组DNA样品中，实验说明该定性PCR检测体系最低能检出水稻事件FG2-55 DNA含量为0.1％的DNA样品。
实施例8：水稻事件FG2-55的TAQMAN检测方法
水稻事件FG2-55和对照样本(水稻FG2-47、FG2-205、FG2-525、FG2-670和圳18A、玉米郑58、小麦中国春、油菜中双9号和大豆)的基因组DNA的提取方法参照实施例5进行。使用ABI 7500FAST检测系统，对每份样品进行实时PCR。用Taqman探针TP55(AppliedBiosystems，Inc.)和引物组合TTY-55F/TTY-55R(SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13)来检测来自水稻事件FG2-55的靶序列。此外，针对水稻内源蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthetase，SPS)基因的第二Taqman探针和引物组合用来证实每个实时PCR反应中存在可扩增的DNA(SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ IDNO：18)。该分析由实时PCR定性阳性和/或阴性样品的存在和/或不存在。
确定水稻事件FG2-55的阳性和阴性是基于事件特异性靶PCR的Ct值，当水稻基因组DNA上样量为50ng时，内源靶和事件靶同时获得扩增，且事件靶扩增Ct值小于或等于36时，则将植物评定为对该事件呈阳性；当内源靶和事件靶同时扩增，且事件靶扩增Ct值大于36而小于40时，则将植物重新提取DNA和并重复进行实时PCR分析；如果内源靶扩增而事件靶不扩增(无扩增曲线)，则将植物评定为阴性；如果对于对于特定样品，两种靶均不扩增，则确定该样品是质量低劣的DNA样品或测试失败，并且重复分析。
实验结果显示，水稻事件FG2-55对事件特异性PCR结果呈阳性，而对照水稻(FG2-47、FG2-205、FG2-525、FG2-670和圳18A)、玉米(郑58)、小麦(中国春)、油菜(中双9号)和大豆对事件特异性PCR结果均为阴性(表4)。
表4水稻事件FG2-55和对照植物中事件特异性PCR分析总结
| 事件特异性PCR | 水稻内源SPS基因 | |
| FG2-55 | + | + |
| FG2-47 | — | + |
| FG2-205 | — | + |
| FG2-525 | — | + |
| FG2-670 | — | + |
| 圳18A | — | + |
| 武运粳7号 | — | + |
| 玉米(郑58) | — | — |
| 油菜(中双9号) | — | — |
| 小麦(中国春) | — | — |
| 大豆 | — | — |
注：水稻事件FG2-55的事件特异性PCR测定总结，其中阳性(+)指示存在水稻事件FG2-55；阴性(-)指示不存在水稻事件FG2-55。
序列表
<110> 深圳市作物分子设计育种研究院
深圳广三系农业科技有限公司
<120> 水稻转基因事件FG2-55
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
tgaatgatgg tgtaaacaaa 20
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
acaactattt aagtcgcatg tgaatgatgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa 60
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 3
tattttttta aaatttttct acaactattt aagtcgcatg tgaatgatgg tgtaaacaaa 60
ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt 100
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 4
cagtgtttga gtgtagaaaa 20
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 5
ttcaattgag tttaaactat cagtgtttga gtgtagaaaa tccttatccg ttctcaccat 60
<210> 6
<211> 100
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 6
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tccttatccg ttctcaccat atctggctta ttcctcaaat 100
<210> 7
<211> 1386
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 7
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gttccagtgt ggttccagcg gatgaggcta tccttgcttt atgcaatttt cagttgtgtg 540
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tcacaaacaa tcttactatt tttttaaaat ttttctacaa ctatttaagt cgcatgtgaa 960
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gtactgaatt aacgccgaat tggccgcatt cgcaaaacac acctagacta gatttgtttt 1080
gctaacccaa ttgatattaa ttatatatga ttaatattta tatgtatatg gatttggtta 1140
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cattaattaa gttggccaat ccagaagatg gacaagtcta ggttaaccat gtggtaccta 1380
cgcgtt 1386
<210> 8
<211> 1440
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 8
agtggtggct agggcttgac tatttgtttg tattggaggg tggagataaa atgtagattt 60
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gcacccccgg gttagtagcg gcgccgacca gtaaaatatg gttgtttctc ctctacaggc 1440
<210> 9
<211> 12598
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt taatgtactg 60
aattaacgcc gaattggccg cattcgcaaa acacacctag actagatttg ttttgctaac 120
ccaattgata ttaattatat atgattaata tttatatgta tatggatttg gttaatgaaa 180
tgcatctggt tcatcaaaga attataaaga cacgtgacat tcatttagga taagaaatat 240
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agtcctcgtt gtgggaggtg atgtccagct tggcgtccac gtagtagtag ccgggcagct 540
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cggtggaggc ctcccagccc atggtcttct tctgcatcac ggggccgtcg gaggggaagt 720
tcacgccgat gaacttcacc ttgtagatga agcagccgtc ctgcagggag gagtcctggg 780
tcacggtggc cacgccgccg tcctcgaagt tcatcacgcg ctcccacttg aagccctcgg 840
ggaaggacag cttcttgtag tcggggatgt cggcggggtg cttaacgtac accttggagc 900
cgtactggaa ctggggggac aggatgtccc aggcgaaggg cagggggccg cccttggtca 960
ccttcagctt cacggtgttg tggccctcgt aggggcggcc ctcgccctcg ccctcgatct 1020
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tcacgttctc ggaggaggcc attactcggc tacactcaca cgctcgctct cgcagttgca 1140
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ttccgtctct tgttacgagg agtacaattt tttcttatac acgaacgtta ctttatgtca 1500
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ggcataaaca gaatttctag agtggcattt gtgatacatt gtgaaagcta agagtggtaa 1620
aagtaaaata aaattgtttt gcttttgccg cggaatggaa attatttgtc aaaacctaag 1680
agtggcaaaa ctgaaatgtc aaaacctaga gtgacataaa caaaatttac ccatcactaa 1740
atgagcacaa aatatttcac cacaatggag gtatgtgagg tccgatgtac tactagagct 1800
catcggaaaa gcatcctctt gatgagtaaa cctcttgaag tactgtacca ccacatttta 1860
tttatcctca tcggcttatt tttaggccac ggttattctc acgaagagac ggttggcgcg 1920
ccatcacatc aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg 1980
ctcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc ttcaacgatg 2040
gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg taggagccac cttccttttc cactatcttc 2100
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tgttgaaaag tctcaattgc cctttggtct tctgagactg tatctttgat atttttggag 2220
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ctcaggattt ggccgcgtcg acgtggagat ataggggaaa gagaacgctg atgtgacaag 2400
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ggacccaaag cactctgttc gggggttttt ttttttgtct ttcaactttt tgctgtaatg 2520
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tacagtgtat tatcaatggc ataaaaaaca acccttacag cattgccgta ttttattgat 2640
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tgtcagatct caaggaaaag acgttatgca gtgtcgtgct gctgtgtttg caatgcagca 2760
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tgctcacgcc gtaccttgtc ccgatcttca ccatgacctt ctcgtcgacg acggccacgt 2940
acgcgtccgc gtccgccacg aggatccgca gcttgctccc ggcgcggatg ccgttccgcg 3000
ccctgatggc agacagcgtg gatatctcct gcttcaggtt ccagtcgaac atgtggtcgt 3060
agaaaatgca ggggactcct ggatgggtga ggatgtaggc gtagccctgc atgaccttgt 3120
ctgatgggaa cggccagagc ttctgcgtcg acccggtgtc atggttgtcg acgaaggtga 3180
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gccacagctc cccctgcacg cccgcctgca gcaggccctt ggtggggaag tcgaacgcca 3300
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tgggcgccgg cttgccgtcc ccgctgtagc tcagcgagtt ccatatctcc gcgacgacga 3420
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cgaagtcgag gcgccagccg tcgaacccca cggcgtcgga cctgagccag ttgagccagg 3540
cggagagctc ccgctgcacg cgcgggttga ggtggtcgat gtcgggcgcc gccgcgaacc 3600
cctcgcccgt gtcgcggtgc cccgtcccgt ccgagtactg cgtgtcgtcg ctgcagatca 3660
tcccggggcc ccagtccagg cggtcgtcgg gagtcccgcc ctcgaagatg cagtacacgc 3720
cgcgcgcgtc cttcttttcc gcgcaccggt ggttgatgac gatgtccgcc acgcactgca 3780
cgcccctgcc gtggaacgcc gctatcaggg acttgagctc cgccgccgtg ccgtacttgg 3840
acgcgtccag gtcgtatagg cggcctggca tgtagccttg tggcgagacg gagtgcgagg 3900
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<210> 10
<211> 14441
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 10
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ggacaccatg cctttgcatc gctattttta gggcagactt cttgtcctca aactcttcat 5400
gcattatttg gacccttcag aagtaaccac taaccaccgt ggaaagcata aattaaataa 5460
caaaagaaag aatgaacaat gccaacattt aaactatact ctactatctt atatatatct 5520
tggtattact aattgaaggt tctaatagag cctctggatt aattttcact ctattattaa 5580
ttcaggaccc aattgagcct ttatgttaat tctcatcaga catgataaaa aattaaaaaa 5640
tatcataaat tcttagatta attagaaata tctggccatt aaacaagaga ctctaaatta 5700
tacataacta ttagatcctg aaggaccaaa aaagtgatca aatggggtga ataggtctat 5760
gttgagcaac ctctcggctt tgaagatagt gagtacccta accatgttta taaactctca 5820
aaggcgcttt atgggctcaa gcaagcccca acagcatggt atgaatgcct aagagatttt 5880
cttatcacta atggcttcag agtcagtaaa gccgatccta ctctctttac taaaaccatt 5940
tcaaaagttt tgtttgtatg ccaaatttat gttgatgata ttatatttgg gtctactaac 6000
aaatctactt gtgaagagtt tagtaggatc atgattccga aattcgagat gtctatgatg 6060
gggaagttga aatattttct aggatttcaa gtcaagcaac tccaagatgg caccttcatc 6120
agccaaacaa agtacattca agacatactc aacaagtttg gaatgaagga tgccaagccc 6180
atcaggacac ccatgggaac taatgggcat ctcgacctcg acacgggagg taaatccgta 6240
gaccaaaagg tataccggtc gatgatagga tctttactct atttatgtgc atctcgacca 6300
gatagtatgc tttctatatg catgtgtgca agattccaag ccgatcctaa ggaagttcac 6360
cttagggccg tgaaaagaat catgagatat ttagtttaca ctcctaaatt tggtctttgg 6420
taccccaagg gatccacctt tgatttaata ggatattcag atgccgattg ggcagggtgt 6480
aaaattgata ggaagagcac atcagggact tgtcagtttc tagggagatc cctggtgtct 6540
tggacttcaa agaaacaaaa ctcaatagct ctttctaccg ccgaagccaa gtatattgcc 6600
gcaggacatt gttgtgtgca attactttgg atgaggcaaa accttaggga ctatggctac 6660
aaattgagca aagtccctct cctatgtgac aatgagagtg ctatctgcat ggcggataat 6720
cccgttgaac acagccgcac taagcacata gacattcggt atcacttttt gagggatcac 6780
caacaaaggg gtgatatcga gattgcttat gttagcacca aagaacaatt agtcgatatc 6840
tttaccaaac cattagatga taaaaccttt agcaaactta ggaatgagct aaatattctt 6900
gattctcgaa actttgattg aaacattaca cacatagctc atttgtatac ctttgatcat 6960
atctctttcg tggctacgac taatgtgttt tcaagtgtat ttctatgcta agtcgtagat 7020
tgaaagggaa atggagtctt cggcgaagac aaggcttcca ctccactcta acggtatcgt 7080
ttatccttcg ccgtcactcc gcatcactgt ccaaatttgg tataatcttt cactcatatt 7140
tcatttacca atggggagaa agtataaatg gctcacaaag tctccgtttt tggcgattaa 7200
tgccaaaggg ggagaaatat taagcccaaa gcaaaaggac cgcaccacca ctttttgaaa 7260
ttttttaaat tggtatgttt aatttcaaat tggtatgttg attttcaatt ggtatatttt 7320
caaaattagc atctaaatat atttccaatt gatatctatt taaaaccctc ttgaaagcta 7380
agaggagaat tttattcagg gggagttttg tttagtcaaa ggaaaagcat ttgaaacagg 7440
gggagaaatt tcaaatcttg aaaatgcttc ttacaatctt attcatatac ctttgactat 7500
ttgcaaaaga ctttgaaaaa gaatttccaa aaagatttgc aaaaaacaaa acaagtggtg 7560
caaatgtggt ccaaaatgtt aaaataaaag aaagcaacca tgcatatcaa gtaaaagtat 7620
aaattgattt aattctaagt aacctatgca cttaccttat gcaaactagt tcaattctgc 7680
acttatatat tttctttggt ttgtgttggc atcaatcacc aaaaaggggg agattgaaag 7740
ggaaataagg tttaaccttt tcctataaat aattttggtg gttgaatgcc caacacaaat 7800
gattggacta actagtttgt tctagattat atattccaca ggtgcataaa ggttcaacac 7860
aaaccaataa acgatcaaag ttagggttca aaagcaaagg agcaaaggaa ccgaagggtg 7920
ccctgatctg gcacaccgga ctgtctggta tgccaccaga cagtgtccgg tgcagatcct 7980
ctagagtcga cctgcaggca tgcaagctta atccagccat atatatttgt tgcaattatc 8040
ttttgttttg gcagagtaac ctaaagggaa attcgtaccc tatcaatcat atttttttag 8100
ataaggctaa aaaaaagcta ccactcactc ttaagaatat gttaattgga agaaaaaaag 8160
agaagctacc attcattctc aagaatatgt taattgaaga aaaagagagc tatctacacc 8220
atccatcatg gtgggaccag attgtagcta caaatgtatg gaaaatacaa atgtatttgt 8280
agaaatagag aaaaagttgc atatcaagta cagtcatatt tcaaatagcc ctgtacaact 8340
gtgaaggaat ctcgactagt tgtctcttgg tttgagggat atacctattt taggatgact 8400
gatatttcta gaaccacact ctaattcaaa tctgctgatt tcatgtgtag atttatgggt 8460
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ttgataatga ggtgactgag atgagaggcc acctaatgaa gtaccctgta agtgttgacc 8640
gtaagggcaa ggtgaaaccc ttgccaggat gtacgtcatt cccagacatg ggtggtaaca 8700
tctgtggatc attccgagcc atccaagaaa acctcacaat atgaatttcg attatctgta 8760
agtatacaat tgctagtgat tctgagctat tctgcttcct gaggttatag atagcgtgaa 8820
aattttgcta gcaatatagg ttgaaaccaa gtaggacatg acaagaaaag gttattaccc 8880
tgcatttttt atgcctttct taagagaatt caacatttcc atcttaatag gttttctttt 8940
tatgtatact ttttatcaat gtatagaaga ttaagaatgt ttgaaagccc ggaaccctct 9000
gtttagggaa catggctttg gtagcaactt tgattgattt aagtatgtag cgacatgtaa 9060
agccattaaa ataagtttct agtgtaatta ttttcagcct tgatttgctg gttccatttt 9120
ctaagtgtca atgaaatcta atccatttat ttcttcgtca tgcccttggt aacataagtt 9180
tccgctttgt ttttgcaatg cttcttcaag gttacataat caacaagcag atactgaacc 9240
tatgtctaga gaagagtaaa aattaagtgg gtgcaaataa aatctactct aaactctaaa 9300
gacagttgaa cattttcttt tccttgaatt acatgcattt ttttgctcct gaaacgaaat 9360
tatcttttgt tcatcatttc ttccatctct cggactgaat cttcacaccc atatacctgc 9420
ccagtgtcca tattgaaaac tatactgtta gtgtgttgtt actcatggca atgcactttc 9480
atgagctaaa atgatgccag ttacctgccg agcatcatga cggtggcctg agggttggtg 9540
ccgggggagt acttgaaggt ggagctgtcg atcaccctga gcccctgcac cccgaacacc 9600
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gtgaagttgg agaaggcccg cgactggatc acccgctcga tcgtctcgat gccatggacg 9840
caccgctcca gatcctctgc ctcgcggaag tagttgaacg tcaccgacgg gttcgccctc 9900
gggtcggtgg ttcgcagctc gacgtggccg gaggacaccg gcccgaggat cttctccagg 9960
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gagagctcca ccggcaccgg cgacgggatg aacaccgagt tcatcgggtt gtcggcgacg 10260
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tctgtatcca tgcggcgtag cgcgtgaaat cttttttagt agctctgaaa caaacaaatg 14220
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<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttctacactc aaacac 16
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agatatggtg agaacggata aggat 25
<210> 14
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtaaattct tcaattgagt ttaaactatc agtgtttgag tgtagaaaat ccttatccgt 60
tctcaccata tct 73
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttgcgcctga acggatat 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tccgagccgt ccgtgcgtc 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cggttgatct tttcgggatg 20
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttgcgcctga acggatatct ttcagtttgt aaccaccgga tgacgcacgg acggctcgga 60
tcatcccgaa aagatcaacc g 81
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggtgaggtcc gggtgacat 19
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcctttgttt tcaaatcgct aa 22
<210> 21
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggtgaggtcc gggtgacatt taggaatgaa tatttgggag agtggcattt gagcactagt 60
attttggtag agtgacaaat ggtaaattct tcaattgagt ttaaactatc agtgtttgag 120
tgtagaaaat ccttatccgt tctcaccata tctggcttat tcctcaaata agccaaacgg 180
tatatttgca taaaaaataa tttatgaata aaacttttat atgtgtgttc ttagcgattt 240
gaaaacaaag gc 252
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tacaggcgct cggtggaggc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aaacccccga acagagtgct 20
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<211> 1838
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tacaggcgct cggtggaggc ctcccagccc atggtcttct tctgcatcac ggggccgtcg 60
gaggggaagt tcacgccgat gaacttcacc ttgtagatga agcagccgtc ctgcagggag 120
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cacattctgt ggcataaaca gaatttctag agtggcattt gtgatacatt gtgaaagcta 960
agagtggtaa aagtaaaata aaattgtttt gcttttgccg cggaatggaa attatttgtc 1020
aaaacctaag agtggcaaaa ctgaaatgtc aaaacctaga gtgacataaa caaaatttac 1080
ccatcactaa atgagcacaa aatatttcac cacaatggag gtatgtgagg tccgatgtac 1140
tactagagct catcggaaaa gcatcctctt gatgagtaaa cctcttgaag tactgtacca 1200
ccacatttta tttatcctca tcggcttatt tttaggccac ggttattctc acgaagagac 1260
ggttggcgcg ccatcacatc aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt 1320
ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc 1380
ttcaacgatg gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg taggagccac cttccttttc 1440
cactatcttc acaataaagt gacagatagc tgggcaatgg aatccgagga ggtttccgga 1500
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atttttggag tagacaagcg tgtcgtgctc caccatgttg acgggcgcgc caattcgagc 1620
tcggtacccg gccgctctag aactagtgga tcccccgtcc gatatcccgg gtccttagga 1680
agaccagatc ctcaggattt ggccgcgtcg acgtggagat ataggggaaa gagaacgctg 1740
atgtgacaag tgagtgagat atagggggag aaatttaggg ggaacgccga acacagtcta 1800
aagtagcttg ggacccaaag cactctgttc gggggttt 1838
<210> 25
<211> 2178
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc 60
agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 120
attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 180
ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 240
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ccccgcatgc atggcggcac atggcgagct cagaccgtgc gtggctggct acaaatacgt 1080
accccgtgag tgccctagct agaaacttac acctgcaact gcgagagcga gcgtgtgagt 1140
gtagccgagt aatggcctcc tccgagaacg tgatcaccga gttcatgcgc ttcaaggtgc 1200
gcatggaggg caccgtgaac ggccacgagt tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc 1260
cctacgaggg ccacaacacc gtgaagctga aggtgaccaa gggcggcccc ctgcccttcg 1320
cctgggacat cctgtccccc cagttccagt acggctccaa ggtgtacgtt aagcaccccg 1380
ccgacatccc cgactacaag aagctgtcct tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga 1440
tgaacttcga ggacggcggc gtggccaccg tgacccagga ctcctccctg caggacggct 1500
gcttcatcta caaggtgaag ttcatcggcg tgaacttccc ctccgacggc cccgtgatgc 1560
agaagaagac catgggctgg gaggcctcca ccgagcgcct gtacccccgc gacggcgtgc 1620
tgaagggcga gacccacaag gccctgaagc tgaaggacgg cggccactac ctggtggagt 1680
tcaagtccat ctacatggcc aagaagcccg tgcagctgcc cggctactac tacgtggacg 1740
ccaagctgga catcacctcc cacaacgagg actacaccat cgtggagcag tacgagcgca 1800
ccgagggccg ccaccacctg ttcctgtagt tcgaacgcgt aggtaccaca tggttaacct 1860
agacttgtcc atcttctgga ttggccaact taattaatgt atgaaataaa aggatgcaca 1920
catagtgaca tgctaatcac tataatgtgg gcatcaaagt tgtgtgttat gtgtaattac 1980
tagttatctg aataaaagag aaagagatca tccatatttc ttatcctaaa tgaatgtcac 2040
gtgtctttat aattctttga tgaaccagat gcatttcatt aaccaaatcc atatacatat 2100
aaatattaat catatataat taatatcaat tgggttagca aaacaaatct agtctaggtg 2160
tgttttgcga atgcggcc 2178
<210> 26
<211> 4681
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatctgcacc ggacactgtc tggtggcata 60
ccagacagtc cggtgtgcca gatcagggca cccttcggtt cctttgctcc tttgcttttg 120
aaccctaact ttgatcgttt attggtttgt gttgaacctt tatgcacctg tggaatatat 180
aatctagaac aaactagtta gtccaatcat ttgtgttggg cattcaacca ccaaaattat 240
ttataggaaa aggttaaacc ttatttccct ttcaatctcc ccctttttgg tgattgatgc 300
caacacaaac caaagaaaat atataagtgc agaattgaac tagtttgcat aaggtaagtg 360
cataggttac ttagaattaa atcaatttat acttttactt gatatgcatg gttgctttct 420
tttattttaa cattttggac cacatttgca ccacttgttt tgttttttgc aaatcttttt 480
ggaaattctt tttcaaagtc ttttgcaaat agtcaaaggt atatgaataa gattgtaaga 540
agcattttca agatttgaaa tttctccccc tgtttcaaat gcttttcctt tgactaaaca 600
aaactccccc tgaataaaat tctcctctta gctttcaaga gggttttaaa tagatatcaa 660
ttggaaatat atttagatgc taattttgaa aatataccaa ttgaaaatca acataccaat 720
ttgaaattaa acataccaat ttaaaaaatt tcaaaaagtg gtggtgcggt ccttttgctt 780
tgggcttaat atttctcccc ctttggcatt aatcgccaaa aacggagact ttgtgagcca 840
tttatacttt ctccccattg gtaaatgaaa tatgagtgaa agattatacc aaatttggac 900
agtgatgcgg agtgacggcg aaggataaac gataccgtta gagtggagtg gaagccttgt 960
cttcgccgaa gactccattt ccctttcaat ctacgactta gcatagaaat acacttgaaa 1020
acacattagt cgtagccacg aaagagatat gatcaaaggt atacaaatga gctatgtgtg 1080
taatgtttca atcaaagttt cgagaatcaa gaatatttag ctcattccta agtttgctaa 1140
aggttttatc atctaatggt ttggtaaaga tatcgactaa ttgttctttg gtgctaacat 1200
aagcaatctc gatatcaccc ctttgttggt gatccctcaa aaagtgatac cgaatgtcta 1260
tgtgcttagt gcggctgtgt tcaacgggat tatccgccat gcagatagca ctctcattgt 1320
cacataggag agggactttg ctcaatttgt agccatagtc cctaaggttt tgcctcatcc 1380
aaagtaattg cacacaacaa tgtcctgcgg caatatactt ggcttcggcg gtagaaagag 1440
ctattgagtt ttgtttcttt gaagtccaag acaccaggga tctccctaga aactgacaag 1500
tccctgatgt gctcttccta tcaattttac accctgccca atcggcatct gaatatccta 1560
ttaaatcaaa ggtggatccc ttggggtacc aaagaccaaa tttaggagtg taaactaaat 1620
atctcatgat tcttttcacg gccctaaggt gaacttcctt aggatcggct tggaatcttg 1680
cacacatgca tatagaaagc atactatctg gtcgagatgc acataaatag agtaaagatc 1740
ctatcatcga ccggtatacc ttttggtcta cggatttacc tcccgtgtcg aggtcgagat 1800
gcccattagt tcccatgggt gtcctgatgg gcttggcatc cttcattcca aacttgttga 1860
gtatgtcttg aatgtacttt gtttggctga tgaaggtgcc atcttggagt tgcttgactt 1920
gaaatcctag aaaatatttc aacttcccca tcatagacat ctcgaatttc ggaatcatga 1980
tcctactaaa ctcttcacaa gtagatttgt tagtagaccc aaatataata tcatcaacat 2040
aaatttggca tacaaacaaa acttttgaaa tggttttagt aaagagagta ggatcggctt 2100
tactgactct gaagccatta gtgataagaa aatctcttag gcattcatac catgctgttg 2160
gggcttgctt gagcccataa agcgcctttg agagtttata aacatggtta gggtactcac 2220
tatcttcaaa gccgagaggt tgctcaacat agacctattc accccatttg atcacttttt 2280
tggtccttca ggatctaata gttatgtata atttagagtc tcttgtttaa tggccagata 2340
tttctaatta atctaagaat ttatgatatt ttttaatttt ttatcatgtc tgatgagaat 2400
taacataaag gctcaattgg gtcctgaatt aataatagag tgaaaattaa tccagaggct 2460
ctattagaac cttcaattag taataccaag atatatataa gatagtagag tatagtttaa 2520
atgttggcat tgttcattct ttcttttgtt atttaattta tgctttccac ggtggttagt 2580
ggttacttct gaagggtcca aataatgcat gaagagtttg aggacaagaa gtctgcccta 2640
aaaatagcga tgcaaaggca tggtgtccaa gccatacata tagcgcacta attttatcag 2700
cagaacaatg gtatttatag gtcctagtgc ccaggcaaca agagacacga ataaagcatc 2760
gatcacgaca ccatggcggc gacaatggca gtgacgacga tggtgacgag gagcaaggag 2820
agctggtcgt cattgcaggt cccggcggtg gcattccctt ggaagccacg aggtggcaag 2880
accggcggcc tcgagttccc tcgccgggcg atgttcgcca gcgtcggcct caacgtgtgc 2940
ccgggcgtcc cggcggggcg cgacccgcgg gagcccgatc ccaaggtcgt ccgggcggcc 3000
tgcggcctgg tccaggcaca agtcctcttc caggggttta actgggagtc gtgcaagcag 3060
cagggaggct ggtacaacag gctcaaggcc caggtcgacg acatcgccaa ggccggcgtc 3120
acgcacgtct ggctgcctcc accctcgcac tccgtctcgc cacaaggcta catgccaggc 3180
cgcctatacg acctggacgc gtccaagtac ggcacggcgg cggagctcaa gtccctgata 3240
gcggcgttcc acggcagggg cgtgcagtgc gtggcggaca tcgtcatcaa ccaccggtgc 3300
gcggaaaaga aggacgcgcg cggcgtgtac tgcatcttcg agggcgggac tcccgacgac 3360
cgcctggact ggggccccgg gatgatctgc agcgacgaca cgcagtactc ggacgggacg 3420
gggcaccgcg acacgggcga ggggttcgcg gcggcgcccg acatcgacca cctcaacccg 3480
cgcgtgcagc gggagctctc cgcctggctc aactggctca ggtccgacgc cgtggggttc 3540
gacggctggc gcctcgactt cgccaagggc tactcgccgg ccgtcgccag aatgtacgtg 3600
gagagcacgg ggccgccgag cttcgtcgtc gcggagatat ggaactcgct gagctacagc 3660
ggggacggca agccggcgcc caaccaggac cagtgccggc aggagctgct ggactggacg 3720
cgggccgtcg gcgggcccgc catggcgttc gacttcccca ccaagggcct gctgcaggcg 3780
ggcgtgcagg gggagctgtg gcggctgcgc gacagctccg gcaacgcggc cggcctgatc 3840
gggtgggcgc ccgagaaggc cgtcaccttc gtcgacaacc atgacaccgg gtcgacgcag 3900
aagctctggc cgttcccatc agacaaggtc atgcagggct acgcctacat cctcacccat 3960
ccaggagtcc cctgcatttt ctacgaccac atgttcgact ggaacctgaa gcaggagata 4020
tccacgctgt ctgccatcag ggcgcggaac ggcatccgcg ccgggagcaa gctgcggatc 4080
ctcgtggcgg acgcggacgc gtacgtggcc gtcgtcgacg agaaggtcat ggtgaagatc 4140
gggacaaggt acggcgtgag cagcgtggtc ccgtcggatt tccacccggc ggcgcacggc 4200
aaggactact gcgtctggga gaaagcgagc ctccgcgtcc cggcggggcg ccacctatag 4260
cagctcagat tgctcagtct tgtgctgcat tgcaaacaca gcagcacgac actgcataac 4320
gtcttttcct tgagatctga caaagcagca ttagtccgtt gatcggtgga agaccactcg 4380
tcagtgttga gttgaatgtt tgatcaataa aatacggcaa tgctgtaagg gttgtttttt 4440
atgccattga taatacactg tactgttcag ttgttgaact ctatttctta gccatgccaa 4500
gtgcttttct tattttgaat aacattacag caaaaagttg aaagacaaaa aaaaaaaccc 4560
ccgaacagag tgctttgggt cccaagctac tttagactgt gttcggcgtt ccccctaaat 4620
ttctccccct atatctcact cacttgtcac atcagcgttc tctttcccct atatctccac 4680
g 4681
<210> 27
<211> 5534
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 27
tcaattgaag aatttaccat ttgtcactct accaaaatac tagtgctcaa atgccactct 60
cccaaatatt cattcctaaa tgtcacccgg acctcaccac ttatgtttga atgaaaagtg 120
aggctgacat gtgcgttcgg atggcatttg ggaatgaaaa tttaggagag tggtatttga 180
gtgctatcat tttggtagtt gcaaatagta aattctcccc ctattttcta tgacactaaa 240
ctcagcccaa tactataaat tggactaaaa tatattttga aacggaggta gtagtataac 300
atatactatg tcctaaggct aaaaaggtgt gggggcgaag caaacattta cctagaaaac 360
tacgccataa tcaaaatgtg gcattacaaa gtgaagcaac taaccaaata accccaagta 420
atattagtaa gaaaatcccc caccagattt ttcaaattct caatcgcaag atctgtcatc 480
taaaatctac attttatctc caccctccaa tacaaacaaa tagtcaagcc ctagccacca 540
cttccacatc gctcctccta acctcaccct gtgctacgct gaaccaatca tgccctctgc 600
accaccacca tttagcctca atggcatctc cctcaacgct ggtgatgctc gccgacaagc 660
acctccatcg ccatccctat tgccatcatc ctccttgaga tggcttctca tgtgccatca 720
ccatttctta tgtccttacg ctgttgtctt cctcgtctct aatggtcttg tcgctgaatt 780
catgaccacc accacctaac caatctagcg aggtgcctga ccctattctc atcttccgtc 840
tcgagcaact caccatcacc taattacatg atcgggattc tctcgccata accactatcc 900
attgtcctcg tagctacgac ggcgtcactg tcatctcgtt gccttcccaa tgccaccgtc 960
caccatcagg ccgctatctc cttagcctca ctctaagcgg aggaacctat gctctctcta 1020
actggtcaga ccactgtcaa tgtctctgga cataatcaac attgttggag aggcagagag 1080
cagaaattgt gaggtagata taaaggttag atatttgtaa gattttcctc ttaattttca 1140
atcgaatgtg gtttagggaa atggatattt tttttactag actggcgtat agcaatccga 1200
agacgaagaa agaaggagga ggagtaaaac acaaaaaaag aaaccaaccg tcttaaaact 1260
tacaacttta ccattgggca atacaactgc aatgggccaa gaagttaatt taaagttaag 1320
agcaaattca tttggaccac cttttgttac agatgcttca ctttggacca cataccaccc 1380
atctctcttc tcgagcatga acaatctcga ttacattggc tcctactcat caataaactc 1440
tcacatatat atgtaaaacc attcatcggt atatgacaag ttatatatgg ataaaagagt 1500
tgaggatggg taagaataat aaccggtata aagtgagaac attgataaac atcgctaata 1560
aaagttcgtc tatagtaaaa tttactctaa aattaaatca cctaatattt taatattttt 1620
ttgtacaaat ggaccgtttc aatggggctt tatcagattt agttgagatg catacatggt 1680
aagcaccgtc ataatcttgc ccaagagctg acccaactca ttaaaattac gcttctttta 1740
cgacttaata aatcaagaag aaaccattga aatccagcct gccccgactg tctcgtaaca 1800
gaaaaataac tcagcaacga ctaaattatg attttaaaat ggcaaaaata tcaaagcacg 1860
ttcgaaacaa tcgcaagatt ggcaagtaaa ctctcctgct tgcttgctta caaccacatc 1920
agatcattga tcaatgtttc atcagctcat cacttctgca tgcatgttat attcttctca 1980
gggctccaca atttacaaag ctgctcgaag atcttctttg cagtgcaaag caatctgcaa 2040
gattattcaa gacatctact cttgatctac cattgagcta actccggata tataaacaga 2100
ccgaacgttt cgtcccaggg gaatgtgaaa gttagcgaat ttgcccggcg aaaatggcag 2160
cacttggccg cgcgagctcg tcggcgccgg tgcttgccgc cgccgccgcc gtgctcctct 2220
cgctctgcct cgccgcgctc tcggaagagc aaggtgcgta aacgttgcgt tgtatctttg 2280
cgttgatgcg tgttgcgtcg tcgtcgtgtt catggcgtgc gatggcgttg tgcagagcaa 2340
ctggagaacc tgcggttcgt gcggcacgcg caggacgcgc cgctggtgtc gagctacaac 2400
tacatcgtca tcggcggcgg cacggcgggg tgcccgctgg cggcgacgct gtcggagcac 2460
tcgcgcgtgc tgctgctgga gcgcggcggc ctgccgtacg ccaacatgtc gagcgagcag 2520
cacttcacgg acgcgctggc cgacacgtcg ccggcgtcgc cggcgcagcg gttcatctcg 2580
gaggacggcg tggtgaacgc ccgggcgcgg gtgctcggcg gcgggagctg cctcaacgcc 2640
gggttctaca cgcgggcgag caacgagtac gtgcgcgcct ccgggtggga cgcgcggctg 2700
gtgaactcgt cgtaccggtg ggtggagcgc tcgctggtgt tccgccccga cgtgccgccg 2760
tggcaggcgg cgctccgcga cgcgctgctc gaggtcggcg tcacgcccga caacggcttc 2820
accttcgacc acgtcaccgg caccaagatc ggcggcacca tcttcgacaa ctccggccag 2880
cgccacaccg ccgccgactt cctccgccac gcccgccccc gcggcctcac cgtcctcctc 2940
tacgccaccg tctcccgtat cctcttcaaa agccaaggta cacagctacg atgaaaatgg 3000
aaaatgtgct gtgcgccgaa gaagcttgac ctcacgacgg cgagcttttg ccatggcgtg 3060
cagacggcgt cccatacccg gtggcgtacg gggtggtgtt ctcggacccg ctgggggtgc 3120
agcaccgggt gtacctccgc gacggcgaca agaacgaggt gatcgtgtcg gcggggacgc 3180
tggggagccc gcagctgctg atgctgagcg gcgtcgggcc gcaggcgcac ctggaggcgc 3240
acggcatcga ggtgatcgtg gaccaaccca tggtcgggca gggcgtcgcc gacaacccga 3300
tgaactcggt gttcatcccg tcgccggtgc cggtggagct ctccctggtg caggtcgtcg 3360
gcatcacccg ctccggcagc ttcatcgagg gggtgagcgg gtcggagttc ggcatgccgg 3420
tgtcggacgg cgcgctccgg tgggcgcgca gcttcgggat gctgtcgccg cagacggggc 3480
agctcggcac gctgccgccg aagcagagga cgccggaggc gctgcagcgg gcggcggagg 3540
cgatgatgcg gctggacagg agggcgttcc ggggaggctt catcctggag aagatcctcg 3600
ggccggtgtc ctccggccac gtcgagctgc gaaccaccga cccgagggcg aacccgtcgg 3660
tgacgttcaa ctacttccgc gaggcagagg atctggagcg gtgcgtccat ggcatcgaga 3720
cgatcgagcg ggtgatccag tcgcgggcct tctccaactt cacctacgcc aacgcctccg 3780
tcgagtccat cttcaccgat tccgccaact tccccgtcaa cctgctgccg cgccatgtca 3840
acgactcgcg ctcgccggag cagtactgca tggacaccgt catgaccatc tggcactacc 3900
acggcggctg ccatgtcggc gccgtcgtcg acgacgatta ccgggtgttc ggggtgcagg 3960
ggctcagggt gatcgacagc tccaccttca agtactcccc cggcaccaac cctcaggcca 4020
ccgtcatgat gctcggcagg taactggcat cattttagct catgaaagtg cattgccatg 4080
agtaacaaca cactaacagt atagttttca atatggacac tgggcaggta tatgggtgtg 4140
aagattcagt ccgagagatg gaagaaatga tgaacaaaag ataatttcgt ttcaggagca 4200
aaaaaatgca tgtaattcaa ggaaaagaaa atgttcaact gtctttagag tttagagtag 4260
attttatttg cacccactta atttttactc ttctctagac ataggttcag tatctgcttg 4320
ttgattatgt aaccttgaag aagcattgca aaaacaaagc ggaaacttat gttaccaagg 4380
gcatgacgaa gaaataaatg gattagattt cattgacact tagaaaatgg aaccagcaaa 4440
tcaaggctga aaataattac actagaaact tattttaatg gctttacatg tcgctacata 4500
cttaaatcaa tcaaagttgc taccaaagcc atgttcccta aacagagggt tccgggcttt 4560
caaacattct taatcttcta tacattgata aaaagtatac ataaaaagaa aacctattaa 4620
gatggaaatg ttgaattctc ttaagaaagg cataaaaaat gcagggtaat aaccttttct 4680
tgtcatgtcc tacttggttt caacctatat tgctagcaaa attttcacgc tatctataac 4740
ctcaggaagc agaatagctc agaatcacta gcaattgtat acttacagat aatcgaaatt 4800
catattgtga ggttttcttg gatggctcgg aatgatccac agatgttacc acccatgtct 4860
gggaatgacg tacatcctgg caagggtttc accttgccct tacggtcaac acttacaggg 4920
tacttcatta ggtggcctct catctcagtc acctcattat caacaaatcg ttcccagttc 4980
tgttcaccga tttggcgaac tcgtctcatg cattccatgg tctctggata gttgaagcct 5040
tcctcaacca ctccaatatg ctccgcccaa agagacattc tgtacccata aatctacaca 5100
tgaaatcagc agatttgaat tagagtgtgg ttctagaaat atcagtcatc ctaaaatagg 5160
tatatccctc aaaccaagag acaactagtc gagattcctt cacagttgta cagggctatt 5220
tgaaatatga ctgtacttga tatgcaactt tttctctatt tctacaaata catttgtatt 5280
ttccatacat ttgtagctac aatctggtcc caccatgatg gatggtgtag atagctctct 5340
ttttcttcaa ttaacatatt cttgagaatg aatggtagct tctctttttt tcttccaatt 5400
aacatattct taagagtgag tggtagcttt tttttagcct tatctaaaaa aatatgattg 5460
atagggtacg aatttccctt taggttactc tgccaaaaca aaagataatt gcaacaaata 5520
tatatggctg gatt 5534
Claims (16)
1.一种重组DNA分子，其特征在于，所述重组DNA分子为
a）插入水稻基因组DNA的异源核酸分子及其侧翼水稻基因组序列，以及所述异源核酸分子与所述水稻基因组的5’端侧翼序列和3’端侧翼序列的连接区域，其中，所述异源核酸分子、其侧翼序列和所述连接区域如SEQ ID NO:10所示，其中， SEQ ID NO:10的部分序列为SEQ ID NO:1-9；5’端的连接区域如SEQ ID NO：1、2、3或7所示，3’端的连接区域如4、5、6或8的序列所示；或
b）序列如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或8所示的多核苷酸分子，所述DNA分子包含部分异源核酸分子；或
c）与（a）互补的序列。
2.根据权利要求1所述的重组DNA分子，其特征在于，所述异源核酸分子包含DsRed/ZmAA/OsNP1基因，序列如SEQ ID NO：9所示。
3.根据权利要求1所述的重组DNA分子，其特征在于，所述重组DNA分子源自于包含事件FG2-55的转基因水稻植物。
4.根据权利要求1所述的重组DNA分子，其特征在于，所述重组DNA分子包含在水稻植物、植物细胞、种子、植物部分中。
5.根据权利要求4所述的重组DNA分子，其特征在于，所述水稻种子在激发状态下产生红色荧光。
6.根据权利要求2所述的重组DNA分子，其特征在于，所述重组DNA分子是由事件FG2-55的模板分子产生的扩增子。
7.一种用于鉴定生物学样品中的事件FG2-55的存在的DNA探针或引物对，其特征在于，所述DNA探针或引物对根据SEQ ID NO:10的序列设计，用于诊断SEQ ID NO: 1-10的核苷酸序列或其互补序列的存在。
8.根据权利要求7所述的探针或引物对，其特征在于，所述探针或引物的长度至少为10个核苷酸；优选的，至少为18个核苷酸；更优选的，至少为24个核苷酸。
9.根据权利要求7或8所述的探针或引物对，其中，所述的探针或引物对具有SEQ IDNO：10的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列，从而在与来自事件FG2-55的模板一起在扩增反应中使用时，作为DNA探针或引物发挥功能，以产生用于诊断样品中是否存在事件FG2-55的扩增子，所述扩增子包含选自SEQ ID NO：1-10及其互补序列的核苷酸序列。
10.一种DNA检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求7或8或9中的用于鉴定生物学样品中的事件FG2-55的DNA探针或引物对。
11.根据权利要求10所述的DNA检测试剂盒，其中，所述试剂盒采用的方法包括：
a)使生物学样品接触权利要求7-9所述的引物对；
b)进行核酸扩增反应，该核酸扩增反应足以产生包含SEQ ID NO：1-10或其互补序列的扩增子；和
c)检测所述扩增子。
12.根据权利要求11所述，其中所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO： 11、13、15或17所示。
13.根据权利要求10的DNA检测试剂盒，其中，所述试剂盒采用的方法包括：
a)使生物学样品接触权利要求7-9所述的DNA探针，其中，所述DNA探针在严格杂交条件下与包含选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的DNA分子杂交，且在该严格杂交条件下不与不包含选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的DNA分子杂交；
b)使所述生物学样品和所述DNA探针经受该高严格杂交条件；和
c)检测所述DNA探针与包含选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的所述DNA分子的杂交。
14.根据权利要求13所述，其中所述DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：12或16所示。
15.一种检测生物样品中事件FG2-55的DNA分子的存在的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）从所述生物学样品中提取DNA样品；
b）采用如权利要求7-9中任一项所述的DNA探针或引物对对所述DNA样品进行检测；
c）若检测到包含SEQ ID NO:1-10中任一种核苷酸序列的存在，则判定所述生物学样品中存在所述事件FG2-55或其子代。
16.一种生产水稻种子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）将包含事件FG2-55的水稻种子种植在田地中；
b）含所述事件FG2-55的水稻自交，或以含所述事件FG2-55的水稻为父本，与第二水稻植物进行有性杂交；
c）收获水稻自交或杂交种子；
d）选择在激发状态下种子呈非红色荧光的后代植物；
其中，所述第二水稻植物含有突变并丧失育性功能的fg2/fg2基因。
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| CN202010297986.9A CN113549629A (zh) | 2020-04-16 | 2020-04-16 | 水稻转基因事件fg2-55 |
Applications Claiming Priority (1)
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2020
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