CN109750060B - 一种提高小麦ms1雄性不育系纯度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高小麦ms1雄性不育系纯度的方法，属于生物技术领域。本发明通过对多个ms1雄性不育突变体的不育度分析和对小麦Ms1同源基因Ms‑A1和Ms‑D1的表达分析，发现小麦育性基因Ms1的同源基因Ms‑A1和Ms‑D1的低量表达可导致植株不育度降低。本发明利用CRISPR/Cas9技术对ms1突变体中Ms‑A1和Ms‑D1基因进行定点突变，获得了Ms1、Ms‑A1和Ms‑D1基因的三重突变体，且突变体的不育度达到了100%，对于建立高效的小麦杂交种制种技术和杂种优势具有重要的理论和实践意义。

Description

一种提高小麦ms1雄性不育系纯度的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术育种领域，具体涉及一种通过突变提高小麦ms1雄性不育系纯度的方法。

背景技术

杂种优势是生物界的普遍现象，杂交种育种是选育新品种的主要途径，是近代育种工作最重要方法。小麦是自花授粉作物，小麦杂种优势利用的核心问题是高效生产小麦杂交种的技术体系。综合近50年来的研究进展，小麦杂种优势利用研究主要集中于：核质互作雄性不育的利用(“三系法”)、化学杀雄技术的利用(“化杀法”)和光温敏核雄性不育的利用(“两系法”)。三系法由于不育系难以繁殖、恢复源较窄、细胞质副效应等原因，未能在生产上大面积应用。化杀法避开了恢复与保持间的相互关系，但由于其在制种过程中稳定性差、制种成本高及环境污染等多方面原因，在实际生产上也难以推广利用。基于光温敏的两系法虽然具有制种成本低、恢复源广泛，较易获得优势组合等优点，但也面临着两大关键问题——环境因素的不稳定性对不育系育性的影响和利用光温敏特性所选育的小麦不育系十分有限。

隐性核雄性不育突变体用于作物杂种优势利用，其不育性具有易被恢复而不易被保持的特性。与细胞质雄性不育杂交小麦体系相比，隐性核雄性不育突变体具有不受外源细胞质的负面影响、父本系对杂种F₁的育性恢复度高、选材范围广、种质资源利用率高等优点。但与细胞质雄性不育突变体和光温敏雄性不育突变体一样，隐性核雄性不育突变体用于杂交制种时，突变体的雄性不育度直接影响杂交种的纯度，进而影响杂交小麦的产量。突变体的雄性不育度越高，杂交种的纯度越高。

本发明在不同时间地点对多个ms1雄性不育突变体的不育度进行了调查，结果不育度都不到100％，且不同时间地点的不育度差异较大，这将对杂交制种技术开发造成不利影响。分析其原因可能是与Ms1基因高度同源且具有相同功能的Ms-A1基因和Ms-D1基因的低量表达所致，因此，稳定突变Ms-A1基因和Ms-D1基因是必须的。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统，通过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，包括噬菌体和外源质粒，致使目的基因功能的缺失或部分缺失。CRISPR/Cas系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高效，是近两年来新发现并广泛用于基础研究的基因编辑新技术。2013年，科学家首次报道CRISPR/Cas系统在细胞上应用成功，随后，在斑马鱼、果蝇、小鼠、大鼠、猪中迅速得到应用。CRISPR/Cas系统在靶位点产生双链DNA断裂(doublestrand break,DSB)，细胞可通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)进行修复，导致基因发生移码突变，丧失功能。除此之外，该系统还能与同源重组载体、寡聚核苷酸共同作用，使靶基因发生高效的精确修饰。CRISPR/Cas系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基因功能研究等领域得到广泛的应用。

小麦是由A、B、D三套基因组组成的异源六倍体，基因的平均拷贝数为2.8个，其中88％的基因拷贝数大于等于3个，但并非每个拷贝都同时表达。有些单基因控制的突变体，之所以表现为对某些性状单基因控制，是由于其基因组中的同源基因由于某些原因被沉默而没有正常表达，而这类单基因控制的突变体的性状往往会由于其同源基因在某种条件下的泄露表达而变得不稳定，要想获得这类单基因控制的突变体的性状稳定的突变株系，对其同源基因进行稳定敲除是必要手段。

发明内容

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。

在杂交育种领域，判断一个雄性不育突变体的指标有两个，一是不育株率，二是不育度。不育株率是指突变基因型的植株中雄性不育株所占的比例，不育度的统计方法是：不育度(％)＝(小花总数-结实小花总数)/小花总数×100％。本发明通过研究发现，ms1雄性不育突变体的不育株率为100％，但其雄性不育度为97.79％-99.83％，通过表达分析实验发现，Ms1的同源基因Ms-A1和Ms-D1存在低量的表达，推测ms1突变体的不育度不到100％的原因是由于其同源基因Ms-A1和Ms-D1的低量表达所致。

本发明提供了一种获得高不育度的ms1雄性不育系的方法，所述方法通过突变小麦内源的Ms-A1、Ms-B1和Ms-D1基因，从而获得不育度更高的ms1雄性不育系。或是在ms1雄性不育系的基础上突变Ms-A1和Ms-D1基因，从而获得不育度更高的ms1雄性不育系。

其中，上述的Ms-A1、Ms-B1和Ms-D1基因的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示。其中所述的突变包括在Ms-A1、Ms-B1和Ms-D1基因的核苷酸序列上进行取代、缺失或添加一个或多个核苷酸。更具体的，所述的“突变”包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法所导致的基因突变，化学方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变，或是通过基因编辑等方法，所述基因编辑方法包括但不限于ZFN、TALEN、和/或CRISPR/Cas9等基因编辑方法。

其中所述的CRISPR/Cas9基因编辑方法所用的靶标选自下组：

(a)序列为SEQ ID NO:1-3所示核苷酸序列中符合5’-N_X-NGG-3’序列排列规则的片段，其中N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的核苷酸；

(b)核苷酸序列与(a)中多核苷酸的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(c)与(a)-(b)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

并且其中CRISPR/Cas9基因编辑方法所用的靶标序列的特征是长度为20bp且末端具有NGG三个碱基的序列。更具体的，靶标序列包括但不限于SEQ ID NO:4-23所示的任一个所示的多核苷酸序列。

在其中一种编辑方法中，CRISPR/Cas9基因编辑方法所用的靶标序列的长度是20bp左右，并且末端具有NGG三个碱基，更具体的，所述靶序列如SEQ ID NO：4-23所示。

本发明还公开了一种获得ms1雄性不育系的方法，将通过上述方法获得的ms1雄性不育系与目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得ms1雄性不育的性状和基因突变。

本发明还包括通过上述任一方法获得的ms1不育系在杂交育种中的应用。所述在杂交育种中的应用是指将ms1不育系作为母本与其他父本进行杂交制种，或是将获得的ms1雄性不育系与其他目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得ms1雄性不育的性状和基因突变。

本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑方法对ms1突变体中的Ms-A1基因和Ms-D1基因进行了定点突变，获得了Ms1基因、Ms-A1基因和Ms-D1基因的三重突变体。三重突变体的不育度达到了100％，能够更高效地应用于小麦杂交制种技术。

附图说明

图1、Ms1及其同源基因Ms-A1和Ms-D1的表达模式，即通过半定量RT-PCR分析Ms1及其同源基因的表达模式。Root，萌发7天的根；Stem，减数分裂期的茎；leaf，萌发7天的叶；5-10mm，长度为5-10毫米小穗；10-20mm，长度为10-20毫米小穗；20-30mm，长度为20-30毫米小穗；30-40mm，长度为30-40毫米小穗；>40mm，长度大于40毫米小穗；gDNA，基因组DNA对照；Le&Pa，外稃和内稃；pistil，雌蕊；Meiosis，减数分裂期花药；UM，单核期花药；BP，双核期花药；MP，三核期花药。括号内为PCR扩增循环数。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的材料、生物化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知常规手段。

实施例1、ms1突变体的不育度结果统计

虽然ms1突变体的不育株率达到了100％，但不育度具体数值不确定。为了了解小麦ms1突变体的不育度，我们在河北邯郸和北京两个地点、多个不同时间、对三个ms1等位突变体——ms1d.1、ms1g和ms1l进行了雄性不育度调查。具体做法，是将小麦ms1纯合突变体及其相应的野生型同时种植于田间，抽穗后套袋，严格自交，待种子成熟后，单穗统计种子数，利用野生型的平均穗粒数，计算突变体的不育度＝【1-种子总数/(平均穗粒数×穗数)】×100％。不育度调查结果如表1所示，三个ms1等位突变体在不同地点不同时间的不育度为97.79％-99.83％，均不能达到100％的雄性不育，且在不同时间不同地点的不育度存在较大差异，使ms1突变体应用于小麦杂交制种时，很难控制杂交种的纯度。

实施例2、Ms1和Ms-A1、Ms-D1基因的表达分析

Ms1基因位于4B染色体短臂，在小麦的4A和4D染色体上各有一个高度同源基因Ms-A1和Ms-D1。我们用半定量RT-PCR检测了这3个基因的表达模式。Ms1基因呈现减数分裂期花药特异表达的模式：在小麦营养器官根、茎和叶中，均检测不到Ms1基因的表达；进入生殖生长后，随着小穗发育的进程，Ms1基因的表达逐渐增强，至减数分裂期(>40mm小穗)Ms1基因的表达达到顶峰；进一步在不同的花器官中检测Ms1基因的表达，发现Ms1基因在外稃/内稃和雌蕊中均不表达，在减数分裂期的花药中高量表达，单核期花药中该基因的表达显著减弱，双核期和三核期均不表达(图1)。相比Ms1基因来说，Ms-A1和Ms-D1的表达则明显低，Ms-A1在不同发育时期的小穗中以及雌蕊、减数分裂期花药和单核期花药有微量表达，Ms-D1则仅在单核期花药中有微量表达。

实施例3、Ms-A1和Ms-D1蛋白的功能分析

由于小麦Ms-A1基因和Ms-D1基因与Ms1基因蛋白序列同源性均达到95％以上，推测如果Ms-A1基因和Ms-D1基因在花药中表达，很可能具有与Ms1基因类似的功能。为了证实这种推测，我们分别构建了两个表达载体pAHC20-Ms1p::Ms-A1和pAHC20-Ms1p::Ms-D1，用Ms1基因的启动子分别驱动Ms-A1基因和Ms-D1基因在小麦花药中特异表达。将pAHC20-Ms1p::Ms-A1和pAHC20-Ms1p::Ms-D1载体分别转化转化小麦ms1g突变体的幼胚，并对ms1g纯合背景下的转基因阳性植株进行花粉染色观察，结果转基因阳性植株的花粉发育正常、植株表现为可育。说明Ms-A1基因和Ms-D1基因的核酸和蛋白序列的确具有与Ms1基因类似的功能。

实施例4、CRISPR敲除实验

Ms-A1基因和Ms-D1基因的表达分析和功能分析表明，ms1雄性不育突变体的不育度达不到100％的原因，很可能是由于Ms-A1基因和Ms-D1基因的低量表达造成的。

为了获得不育度为100％的雄性不育突变体，我们决定利用CRISPR/Cas9技术对Ms-A1基因和Ms-D1基因进行定点突变。根据CRISPR/Cas9技术对靶序列的要求(靶序列长度20bp并且末端具有NGG)，在Ms-A1基因、Ms-D1基因和Ms1基因序列完全相同的区段选取了20个靶序列(SEQ ID NO：4-23)，构建CRISPR载体，转化小麦叶片原生质体进行突变率检测，并将其中突变率最高的载体转化ms1杂合植株的幼胚，利用PCR和测序的方法筛选Ms-A1基因和Ms-D1基因为纯合突变而ms1为杂合突变的株系，收获种子后用于后续不育度分析。

为了获得小麦优良母本品种的不育度为100％的雄性不育系，将靶向Ms1基因、Ms-A1基因和Ms-D1基因的CRISPR载体转化小麦优良母本品种的幼胚获得了Ms1基因和Ms-A1基因、Ms-D1基因同时突变的雄性不育突变体。

实施例5、ABD同时敲除的株系的不育度分析

利用dCAPs marker鉴定出Ms1基因和Ms-A1基因、Ms-D1基因均为纯合突变的植株与相应的野生型植株同时种植于田间，抽穗后套袋，严格自交，待种子成熟后，单穗统计种子数，利用野生型的平均穗粒数，计算三重突变体的不育度＝【1-种子总数/(平均穗粒数×穗数)】×100％。三重突变体共套袋2753个，种子总数为0，表明Ms1基因和Ms-A1基因、Ms-D1基因均发生突变，三重突变体的不育度为100％。

表1、小麦ms1雄性不育突变体的不育度测试

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司

北京大学

<120> 一种提高小麦ms1雄性不育系纯度的方法

<150> 2017110577288

<151> 2017-11-01

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1856

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivuml)

<400> 1

atggagagat cccgcgggct gctgctggtg gcggggctgc tggcggcgct gctgccggcg 60

gcggcggcgc agccgggggc gccgtgcgag cccgcgctgc tggcgacgca ggtggcgctc 120

ttctgcgcgc ccgacatgcc gacggcccag tgctgcgagc ccgtcgtcgc cgccgtcgac 180

ctcggcggcg gggtgccctg cctctgccgc gtcgccgccg agccgcagct cgtcatggcg 240

ggcctcaacg ccacccacct cctcacgctc tacagctcct gcggcggcct ccgccccggc 300

ggcgcccacc tcgccgccgc ctgcgaaggt acgttgtccg cctcctcccc tccctccctc 360

cctccctctc tctctacgtg ctcgctttcc tgcttaccta gtagtacgta gtttcccatg 420

ccttcttgac tcgctagaag tgctccggtt tgggtctgtt aatttcctcg ctgtactacc 480

ggatctgtcg tcggcacggc gcgcggcgtc gggtcctcgc cttctcccgt ggcgaccgac 540

ctgcgcagcg cgcgcgcggc ctagctagct tcataccgct gtacctcgac atacacggag 600

cgatctatgg tctactctga gtatttcctc atcgtagaac gcatgcgccg ctcgcgattg 660

tttcgtcgat tctagatccg tgcttgttcc cgcgagttag tatgcatctg cgtgcatatg 720

ccgtacgcac gcagatgcag agtctgttgc tcgagttatc tactgtcgtt cgctcgacca 780

tatttgcctg ttaatttcct gttcatcgtg catgcagtag tagtagccat gtccacgcct 840

tcttgttttg aggcgatcat cgtcgagatc catggctttg ctttctgcac tatcttctgc 900

cttgttttgt tctccgcagt acgtacgtct tgcttggtca aaactgaaaa acgctttgct 960

gtttgtttga tcggcaagag ctggccgtgc ttttggcacc gcagtgcgtc gcctctgccg 1020

cttttgcgaa acatttccat gttgatcctc tggcggaact actttttcgc gtgcggtttg 1080

cgtggccttc ctctctcgtg aaaagaggtc gggtcaaacc aaatggatcg cctcttggca 1140

gagcagcggc agcagatagc tggccgtctc gcagctttgg cagaaccggt ctgtggccat 1200

ctgtcgccgc ctgccaccgt ttccctgatg tttgtttctc tctcgcctgc cactgtttct 1260

tttcttgttg cgcacgtacg tcgtcacctc ctcctacttt tttgccagtt ttgtttactt 1320

ttgatgaaat atacggatga atcggctggt gattaacttt ggctgctgct gttaattact 1380

gtggattttg gatgcaggac ccgctccccc ggccgccgtc gtcagcagcc ccccgccccc 1440

gcctccaccg tccgccgcac ctcgccgcaa gcagccagcg cgtaagaacc tctccctctc 1500

cctctctctc tccctctcgc ctgcatctcg ctatgtttat ccatgtccat atgttgatca 1560

gccttgttta gttactaaca tgtgcaccgg atcgggttct cgcagacgac gcaccaccgc 1620

cgccaccgcc gtcgagcgag aagccgtcgt ccccgccgcc gtcccaggac cacgacggcg 1680

ccgccccccg cgccaaggcc gcgcccgccc aggcggccac ctccacgctc gcgcccgccg 1740

ccgccgccac cgccccgccg ccccaggcgc cgcactccgc cgcgcccacg gcgccgtcca 1800

aggcggcctt cttcttcgtc gccacggcca tgctcggcct ctacatcatc ctctga 1856

<210> 2

<211> 1857

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivuml)

<400> 2

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gcggcggccg ccttcgggca gcagccgggg gcgccgtgcg agcccacgct gctggcgacg 120

caggtggcgc tcttctgcgc gcccgacatg cccaccgcgc agtgctgcga gcccgtcgtc 180

gccgccgtcg acctcggcgg cggggtcccc tgcctctgcc gcgtcgccgc ggagccgcag 240

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ctccgtccct ccctctctct gtctacgtgc agattttctg tgctctcttt cctgcttgcc 420

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gcgattgttt catcgatttg agatctgtgc ttgttcccgc gagttaagat ggatctagcg 720

ccgtacgcag atgcagagtc tgttgctcga gttaccttat ctaccgtcgt tcgactatgg 780

tatttgcctg cttccttttg gctgggttta tcgtgcagta gtagtagaca tgtggacgcg 840

ttcttcttat tttgtgccga ccatcgtcga gatacttttc ctgctacagc gtttcatcgc 900

ctgcaccatc ccgttcgtga tagcactttt gtgtcaaacc gcaacgcagc tttgctttct 960

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<210> 3

<211> 1893

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivuml)

<400> 3

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gcggcggccg cgttcgggca gcagccgggg gcgccgtgcg agcccacgct gctggcgacg 120

caggtggcgc tcttctgcgc gcccgacatg cccacggccc agtgctgcga gcccgtcgtc 180

gccgccgtcg acctcggcgg cggggtgccc tgcctctgcc gcgtcgccgc ggagccgcag 240

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ctccgtcccg gcggcgccca cctcgccgcc gcctgcgaag gtacgtcgcg cacgttcacc 360

gcctccctcc ctccctcgct ctctctctct ctctctctct ctctctacgt gccgattctc 420

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tgtttacttt tgagatacgg acgaacggct ggtaattact aactttggtt gctgttgtta 1440

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gcgcccgccc aggcgaccac ctccccgctc gcgcccgctg ccgccatcgc cccgccgccc 1800

caggcgccac actccgcggc gcccacggcg tcgtccaagg cggccttctt cttcgtcgcc 1860

acggccatgc tcggcctcta catcatcctc tga 1893

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 4

cgccgtcgac ctcggcggcg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 5

gccgccgtcg acctcggcgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 6

gtcgccgccg tcgacctcgg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 7

gtcgtcgccg ccgtcgacct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 8

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<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 9

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<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 10

aggtcgacgg cggcgacgac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 11

gcggcgacgc ggcagaggca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 12

gagccgcagc tcgtcatggc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 13

aggcccgcca tgacgagctg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 14

tgaggaggtg ggtggcgttg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 15

gtagagcgtg aggaggtggg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 16

cacctcgccg ccgcctgcga 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 17

taccttcgca ggcggcggcg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 18

cttcgcaggc ggcggcgagg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 19

ttcgcaggcg gcggcgaggt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 20

ggcggcgagg tgggcgccgc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 21

gcggcgaggt gggcgccgcc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 22

cgcgctggct gcttgcggcg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesized)

<400> 23

tggctgcttg cggcgaggtg 20

Claims (10)

1.一种提高ms1雄性不育系纯度的方法，其特征在于，通过突变小麦Ms-A1、Ms-B1和Ms- D1基因，从而获得不育度更高的ms1雄性不育系；或是在ms1雄性不育系的基础上突变Ms-A1和Ms-D1基因，从而获得不育度更高的ms1雄性不育系。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的Ms-A1、Ms-B1和Ms-D1基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、2和3所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的“突变”包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法所导致的基因突变，化学方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变，或是通过基因编辑等方法，所述基因编辑方法包括但不限于ZFN、TALEN、和/或CRISPR/Cas9基因编辑方法。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的CRISPR/Cas9基因编辑方法所用的靶标选自下组：

(a)序列为SEQ ID NO:1-3所示核苷酸序列中符合5’-N_X-NGG-3’序列排列规则的片段，其中N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的核苷酸；

(b)与(a)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的CRISPR/Cas9基因编辑方法所用的靶标序列的特征是长度为20 bp且末端具有NGG三个碱基的序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的CRISPR/Cas9基因编辑方法所用的靶标序列为SEQ ID NO:4-23中任一个所示的多核苷酸序列。

7.一种获得ms1雄性不育系的方法，其特征在于将通过权利要求1-6之任一所述方法获得的ms1雄性不育系与目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得ms1雄性不育的性状和基因突变。

8.通过权利要求1-6之任一所述的方法获得的ms1不育系在杂交育种中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其中所述的杂交育种是指将ms1不育系作为母本与其他父本进行杂交制种。

10.根据权利要求8所述的应用，包括将获得的ms1雄性不育系与其他目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得ms1雄性不育的性状和基因突变。

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