FR2823063A1

FR2823063A1 - Procede d'obtention de plantes c4 a metabolisme carbone modifie

Info

Publication number: FR2823063A1
Application number: FR0104602A
Authority: FR
Inventors: Jean Vidal; Matthieu Jeanneau; Pascual Perez; Denise Gerentes
Original assignee: Biogemma SAS
Current assignee: Biogemma SAS
Priority date: 2001-04-04
Filing date: 2001-04-04
Publication date: 2002-10-11
Anticipated expiration: 2021-04-04
Also published as: FR2823063B1; ZA200300065B

Abstract

Cette invention concerne un procédé d'obtention d'une plante de type C4 présentant un métabolisme carboné modifié, comprenant les étapes consistant à : - introduire dans au moins une cellule de plante C4 une cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour une phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC);- cultiver la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante C4 contenant dans son génome ladite cassette d'expression.

Description

La présente invention concerne un procédé d'obtention de plantes C4 à métabolisme carboné modifié, leur conférant des qualités agronomiques améliorées.

En conditions hydriques limitantes, les plantes C4 ont su adapter leur métabolisme carboné en concentrant le milieu avoisinant la RUBISCO en CO2 pour favoriser l'activité carboxylase de cet enzyme au détriment de son activité oxygénase (et son corollaire : la photorespiration), et donc le rendement photosynthétique. Ce mécanisme implique l'activité du cycle C4 dont la première étape est catalysée par une carboxylase, la phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC EC 4.1. 1. 31) possédant une affinité pour le C02 (sous forme hydratée) et une vitesse catalytique fortes. Les plantes C3, en revanche, ne disposent pas d'un tel système de concentration du CO2 et la photorespiration limite sensiblement le rendement photosynthétique. En outre, chez ces plantes, l'utilisation de l'eau est moins efficace (d'un facteur 2). Ainsi les plantes C4 ontelles, en condition de stress hydrique, un avantage sélectif par rapport aux plantes C3.

D'où les nombreux travaux publiés depuis 1992 visant à surexprimer

chez les plantes C3 une PEPC de type C4 pour tenter d'augmenter la concentration en CO2 au niveau de la RUBISCO et ainsi limiter la photorespiraton au profit du rendement photosynthétique et de la biomasse (Hudspeth et al., 1992 ; Kogami et al., 1994 ; Gehlen et al., 1996 ; Ku et al, 1999 ; Lipka et al., 1999).

Dans le cadre de la présente demande, les inventeurs se sont proposés d'apporter un concept original par rapport aux travaux précédents puisqu'il vise à surexprimer une PEPC de plante C4 dans une plante C4 qui en contient de façon endogène, en vue d'optimiser un métabolisme carboné déjà très efficace et notamment en condition de stress hydrique. Dans la feuille, en conditions normales, il s'agit de corriger un niveau de photorespiration par ailleurs très faible et dont l'impact attendu sur le fonctionnement photosynthétique est certainement limité en amplitude.

Cependant, le stress hydrique entraîne une diminution significative de l'assimilation nette duC02, notamment par réduction de l'ouverture stomatique. Dans ces conditions de culture où l'eau et la disponibilité du CO2 sont limitantes, la surexpression de la PEPC pourrait contribuer à maintenir une concentration du gaz au niveau de la

RUBISCO supérieure à celle des plantes contrôles et de la sorte, une assimilation du carbone inorganique améliorée.

Par ailleurs, il existe chez toutes les plantes, C4 ou C3, différentes isoformes de l'enzyme équipant notamment, outre les feuilles, la racine et les grains. Une des fonctions majeures de ces isoformes est dévolue au maintien de la production d'énergie cellulaire quand des intermédiaires du cycle de Krebs (en particulier l'a-cétoglutarate) sont utilisés par d'autres voies métaboliques, comme la synthèse des acides aminés (aspartate, glutamate et acides aminés apparentés). Cette fonction, dite anaplérotique, est en particulier opérationnelle dans les grains où elle contribue au remplissage protéique (Gonzalez et al., 1998 ; Macnicol et al., 1998). Par ailleurs, dans cet organe, la PEPC est impliquée dans la fourniture des squelettes carbonés nécessaires à la synthèse des acides gras, ainsi à l'élaboration des réserves lipidiques (Smith et al., 1992).

Dans le grain, la surexpression de la PEPC est donc susceptible d'améliorer significativement la capacité de remplissage protéique et lipidique, en conditions normales, si d'autres étapes limitantes des voies métaboliques concernées ne s'y opposent pas, plus sûrement en conditions de stress hydrique altérant le fonctionnement des puits et les relations source-puits de la plante. A cet égard, il convient également de souligner qu'une meilleure capacité photosynthétique (due à une surexpression de PEPC foliaire) peut avoir un impact positif sur les grains dont le remplissage dépend d'une remobilisation de l'azote et du carbone dans les feuilles lors de la maturation.

L'invention vise à pallier les inconvénients de l'art antérieur et a pour objet un procédé d'obtention d'une plante de type C4 présentant un métabolisme carboné modifié, comprenant les étapes consistant à :

- introduire dans au moins une cellule de plante C4 une cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour une phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC) ; - cultiver la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante C4 contenant dans son génome ladite cassette d'expression.

Le métabolisme carboné modifié est associé à une surexpression ou une sousexpression de la PEPC par rapport à une plante non transformée. Avantageusement le procédé concerne une surexpression de la PEPC dans les plantes transformées régénérées.

Selon un mode de réalisation le procédé comprend en outre l'identification et la sélection des cellules transformées capables de régénérer des plantes présentant un métabolisme carboné modifié par rapport à une plante non transformée. Une telle sélection fait typiquement intervenir un gène marqueur.

De manière avantageuse, la dite cellule transformée selon la première étape est également transformée par un ou plusieurs acides nucléiques choisis parmi : un acide nucléique codant pour un composant protéique de modulation de la chaîne de transduction et de phosphorylation de la PEPC, comme par exemple une phosphoinositol phospholipase C (PIPLC) (Coursol et al., 2000) ou une phosphoénolpyruvate carboxylase kinase (PEPCK) (Hartwell et al., 1999 ; Taybi et al., 2000) ; un acide nucléique codant pour une autre protéine du cycle C4, comme par exemple la pyruvate-phosphate dikinase (PPDK) (Imaizumi et al., 1997).

Par"séquence codant pour une PEPC", on entend une séquence codant pour un enzyme exprimé naturellement par une plante C4, qui catalyse la p-carboxylation quasiirréversible du phosphoénolpyruvate en présence de bicarbonate et d'un cation bivalent pour former de l'oxaloacétate et du phosphate inorganique (Bandurski et Greiner, 1953. ). Parmi les types de PEPC retrouvés dans les plantes C4, on peut utiliser selon

l'invention les séquences nucléotidiques codant pour les enzymes de forme PEPC C3 (fonction anaplérotique) ou PEPC C4 (fonction photosynthétique + anaplérotique).

A titre d'exemple, on peut citer préférentiellement la PEPC C4 de sorgho (Sorghum vulgare) décrite par Crétin et al. (1990), ayant une séquence d'acides nucléiques identique ou homologue à la séquence SEQ ID ? 1 du sorgho
Avantageusement on utilisera un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : a) la séquence nucléotidique SEQ ID ? 1

b) une séquence nucléotidique homologue à la séquence de a) codant pour une protéine présentant une activité phosphoénolpyruvate carboxylase c) une séquence nucléotidique complémentaire de la SEQ ID ? 1 ou d'une séquence définie en b) d) un fragment représentatif d'une séquence définie en a), b) ou c) e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) ; et f) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c), d) ou e).

De façon alternative, on peut utiliser une PEPC C4 mutée (Ser8/Asp8) (Wang et al., 1992) qui possède les propriétés (non réversibles) de l'enzyme phosphorylée, forme la plus efficace en termes de vitesse de catalyse et de sensibilité à l'inhibiteur, le L-malate.

On peut également utiliser de façon avantageuse des séquences codant pour des PEPC C3, par exemple des PEPC C3 ayant des séquences d'acides nucléiques identiques ou homologues à celles décrites par Crétin et al., (1991) ou Lepiniec et al., (1991).

. Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs.

Par"séquence nucléotidique homologue", on entend toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID no 1 par substitution, délétion, et/ou insertion d'un nucléotide ou d'un nombre réduit de nucléotides, à des positions telles que ces séquences nucléotidiques homologues codent pour des polypeptides homologues tels que définis ci-après.

De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue est identique à au moins 75 % de la séquence SEQ ID no 1, de préférence au moins 85 %, de préférence encore au moins 95 %.

Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par"meilleur alignement"ou"alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981, Ad. App. Math. 2 : 482), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48 : 443), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250.

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement à la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID no l, dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).

Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 81, 5 + 0, 41 (% G+C) + 16, 6 Log (concentration en cations)-0, 63 (% formamide)- (600/nombre de bases) (Sambrook et al, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989, pages 9.54-9. 62).

Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T).

Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques

n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30oC, de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.

Par fragment nucléotidique , on entend tout fragment de la séquence SEQ ID no l, ou des séquences nucléotidiques homologues de la séquence SEQ ID no 1, qui code (nt) pour un peptide ou une protéine présentant une activité enzymatique de phosphoénolpyruvate carboxylase, telle que définie précédemment. Ces fragments nucléotidiques présentent au moins 15 nucléotides, de préférence au moins 30,75, 150, 300 et 450 nucléotides consécutifs de la séquence dont ils sont issus.

Par séquence nucléotidique modifiée, on entend toute séquence nucléotidique obtenue par mutagénèse selon des techniques bien connues de l'homme du métier, et comportant des modifications par rapport aux séquences normales, par exemple des mutations dans les séquences régulatrices et/ou promotrices de l'expression du polypeptide, notamment conduisant à une modification du taux d'expression ou de l'activité dudit polypeptide.

Par séquence nucléotidique modifiée, on entend également toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide modifié.

Les fragments représentatifs selon l'invention peuvent également être des sondes ou amorces, qui peuvent être utilisées dans des procédés de détection,

d'identification, de dosage ou d'amplification de séquences nucléiques. Ces procédés peuvent faire intervenir des techniques d'amplification du type PCR (décrite par exemple dans le document US 4,683, 202) ou PCR like, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20 : 1691), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. (1989, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 86,1173), la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication) décrite par Guatelli et al. (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 1874), la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. (1991, J. Virol. Methods, 35,273), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. (1988, Science 241,1077), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev (1992, Kessler C. Springer Verlag, Berlin, New-York, 197-205), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. (1990, Biotechniques, 9,142), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al. (1983, J. Mol.

Biol., 171,281).

Une sonde ou amorce se définit, au sens de l'invention, comme étant un fragment d'acide nucléique simple brin ou un fragment double brin dénaturé comprenant par exemple de 12 bases à quelques kb, notamment de 15 à quelques centaines de bases, de préférence de 15 à 50 ou 100 bases, et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible.

Selon un mode de réalisation de l'invention, l'acide nucléique codant pour la protéine PEPC est inséré en orientation sens dans une construction d'acide nucléique, appelée cassette d'expression ou construit, et est lié à des éléments permettant son expression et éventuellement sa régulation. La préparation d'une cassette d'expression ADN peut être réalisée de différentes manières appropriées par l'homme du métier. Un construit ADN inclut typiquement des séquences régulatrices 5'et 3' liées opérationnellement au gène de la PEPC."Lié opérationnellement"fait référence à un lien fonctionnel entre les séquences régulatrices 5'et 3'et la séquence d'acide

nucléique contrôlée. La séquence régulatrice 5'est typiquement un promoteur sélectionné. La transcription contrôlée par un promoteur lié opérationnellement produit un ARN messager fonctionnel dont la transcription produit la PEPC. Une cassette d'expression comprend typiquement une séquence d'acide nucléique pour la PEPC lié opérationnellement dans la plante transformée à une région d'initiation à la transcription (une séquence promotrice) et à une région de terminaison de la transcription.

Parmi les promoteurs, on peut utiliser préférentiellement un promoteur constitutif tel que le promoteur actine de riz suivi de l'intron actine de riz (PAR-IAR) contenu dans le plasmide pActl-F4 (Mc Elroy et al., 1991) ou le promoteur 35S (Kay et al., 1987), ou un promoteur tissu spécifique. Avantageusement, on peut utiliser le promoteur High Molecular Weight Glutenin HMGW de blé (Blechl et al., 1994) ou encore le promoteur PEPC du gène de la phosphoénolpyruvate carboxylase de sorgho (Crétin et al., 1991), qui permettent respectivement une expression de la protéine d'intérêt dans les graines ou les feuilles. On peut également utiliser des séquences promotrices induisant l'expression en condition de stress hydrique (Kasuga et al., 1999). Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer notamment l'extrémité 3'du gène de la nopaline synthétase d'Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982). On peut citer également le terminateur polyA 35S du virus de la mosaïque de chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de Franck et al. (1980).

L'expression de la protéine PEPC peut encore être régulée par l'utilisation de séquences appropriées de type : introns, par exemple le l'intron du maïs adhlS (Callis et al., 1987), l'intron DSV de la mosaïque jaune du tabac (Morris et al., 1992), l'intron actine-l du riz (McElroy et al., 1990) ; séquences enhancers , par exemple l'activateur de transcription du virus de la mosaïque du tabac TEV (Carrington et Fred-1990) ; - séquences leaders , par exemple le leader EMCV (Encephalomyocarditis 5' noncoding region) (elroy-Stein, O., Fuerest, T. R., et Moss B. (1989) PNAS USA,

86 : 6126-6130), le leader TEV (Tobacco etch Virus) (Allison et al. (1986) ; le leader MDMV (Maize DwarfMozaic Virus) (Virology, 154 : 9-20) ; le leader BiPprotéine de liaison humaine (Macejack, D. G., et P. Sarnow (1991) Nature, 353 : 90-

94), le leader AMV RNA 4 (Jobling, S. A., et Gehrke, L., (1987) Nature, 325 : 622- 625), le leader TMV (Gallie, D. R. et al. (1989) Molecular Biology of RNA, pages
237-256).

L'invention a également pour objet un vecteur comprenant une cassette d'expression définie précédemment.

Selon un mode de réalisation, la cassette d'expression est insérée dans un vecteur nucléotidique, tel qu'un plasmide, qui peut en outre comprendre un gène marqueur, par exemple un gène permettant de sélectionner une plante transformée d'une plante qui ne contient pas l'ADN étranger transfecté. Comme gène marqueur, on peut citer un gène conférant une résistance à un antibiotique, par exemple à l'hygromycine (Herrera-Estrella et al., 1983) ou une résistance à un herbicide comme le sulfonamide asulam (WO 98/49316). On utilisera préférentiellement la séquence codante du gène Bar de Streptomyces hygroscopicus (NO d'accès X 17220) codant pour une Phosphinotricine Acétyltransférase qui détoxifie la phosphinotricine (agent sélectif de l'herbicide Basta/Liberty&commat;) par acétylation (White et al., 1990).

Les cellules végétales sont transformées par un vecteur tel que défini précédemment, transféré dans un hôte cellulaire susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences

nucléotidiques d'intérêt initialement contenues dans le génome du vecteur susmentionné. Avantageusement, l'hôte cellulaire utilisé est une souche bactérienne, telle que Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'An et al., (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Guerche et al., (1987). A titre d'exemple les cellules transformées sont typiquement des cellules de cals, d'embryons, de tissu méristématique, de cultures cellulaires en suspension.

La transformation des plantes peut être obtenue par différentes techniques appropriées connues de l'homme du métier, par exemple décrites dans Methods in Enzymology Vol. 153 ("Recombinant DNA Part D") 1987. Le terme transformation fait référence à une manipulation génétique d'une plante, d'une cellule, d'une ligne cellulaire, d'un cal, d'un tissu, d'une partie de plante ou analogue. Un tel

élément est transformé en présence d'un ADN recombinant qui est introduit dans le matériel génétique de cet élément, de manière chromosomique ou extrachromosomique.

L'ADN recombinant peut être un ADN étranger, un ADN hétérologue, un ADN chimère. L'ADN recombinant peut être inclus au hasard ou de manière ciblée à un site spécifique de recombinaison homologue selon les techniques connues de l'homme du métier.

Par exemple, la transformation des cellules végétales peut être réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extra chromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (Watson et al., 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans l'un de ces vecteurs, la région T a été éliminée par délétion, à l'exception des bordures gauche et droite, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes.

L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus de région T mais qui contient toujours les gènes de virulence viT, nécessaire à la transformation de la cellule végétale.

Selon un mode préféré, on peut utiliser la méthode décrite par Ishida et al. (1996), pour la transformation des Monocotylédones.

On peut citer aussi d'autres modes de réalisation pour introduire la cassette d'expression dans une cellule végétale, notamment les méthodes de transfert direct de gènes aux cellules végétales telles que la microinjection directes dans des embryoïdes de plante (Neuhaus et al, 1987), l'infiltration sous vide (Bechtold et al.

1993) ou l'électroporation (Chupeau et al, 1989) ou encore la précipitation directe au moyen de PEG (Schocher et al, 1986) ou le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt (Fromm et al., 1990).

Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par Finer et al. (1992), utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or.

Le virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) peut également être utilisé comme vecteur pour introduire l'acide nucléique étranger dans les cellules de plantes (Hohn et al., (1982) "Molecular Biology of Plant Tumors", Académie Press, New York, pp. 549-560 ; Howell, United States Patent NO 4, 407,956). L'ADN viral CaMV est inséré dans un plasmide bactérien parent créant une molécule d'ADN recombinant qui peut être multipliée dans la bactérie. Après clonage, le plasmide

recombinant peut à nouveau être cloné puis modifié par l'introduction de la séquence d'ADN souhaitée à un site de restriction unique. La portion virale modifiée du plasmide recombinant est alors coupée du plasmide bactérien parent, et utilisée pour être inoculée dans des plantes ou cellules de plantes.

L'invention a également pour objet une cellule hôte transformée avec les séquences nucléiques décrites ci-dessus, ainsi qu'une plante ou partie de plante, notamment fruit, semence, grain, pollen, feuille ou tubercule, susceptibles d'être obtenues par l'un des procédés exposés précédemment. La descendance ou un clone de telles plantes font également partie de l'invention.

Il peut s'agir de plantes de grandes cultures ou potagères et fleurs, qui appartiennent aux plantes de type C4, comme le maïs et le sorgho.

Les plantes transgéniques hybrides, obtenues par le croisement d'au moins une plante selon l'invention avec une autre, font aussi partie de l'invention.

La cassette d'expression est typiquement intégrée de manière stable dans le génome de la cellule.

L'invention a également pour objet selon un autre aspect :

l'utilisation d'un acide nucléique codant pour une protéine PEPC pour l'obtention d'une plante transgénique de type C4 à teneur modifiée en assimilats carbonés, favorisant la maturation du fruit et le remplissage de la graine ; l'utilisation d'un acide nucléique codant pour une protéine PEPC pour l'obtention d'une plante transgénique de type C4 à teneur modifiée en assimilats carbonés, lui conférant une meilleure tolérance au stress hydrique.

L'invention a également pour objet selon un autre aspect l'utilisation d'un acide nucléique codant pour une protéine PEPC ou un fragment de celui-ci, comme sonde ou amorce pour amplification pour la sélection de plantes transformées telles que décrites précédemment, présentant une meilleure résistance au stress hydrique et/ou un remplissage du grain modifié.

L'invention concerne notamment une plante présentant une augmentation de l'expression de la protéine PEPC par rapport à une plante non transformée, d'un facteur 2 à 3 par exemple, dans les feuilles et dans les grains.

La surexpression de la PEPC dans les plantes transformées permet de concentrer le C02 au site de la RUBISCO et faciliter l'assimilation du CO2 malgré sa faible disponibilité en condition de stress hydrique (ouverture stomatique réduite). Les auteurs de la présente demande ont montré qu'il était possible d'améliorer l'assimilation du C02 (activité carboxylase) en condition de stress hydrique : en effet, la surexpression de la PEPC en condition de stress hydrique et pour une résistance stomatique forte permet d'augmenter le flux de carbone photosynthétique et l'activité de la Rubisco.

Cette meilleure tolérance au stress hydrique des plantes transformées selon l'invention, par rapport aux plantes témoins, peut être mesurée par des méthodes physiologiques, morphologiques et/ou biochimiques. A titre d'exemple, on peut citer des mesures d'activité PEPC (propriétés fonctionnelles), d'activité PEPCk et de niveau de phosphorylation de la PEPC in planta, des mesures d'assimilation nette en CO2, de

point de compensation en CO2, d'efficacité photosynthétique en atmosphère appauvrie en Crû2, des mesures d'efficience d'utilisation en eau, et des mesures de poids frais et sec, en condition normale et de stress hydrique.

L'invention concerne également une augmentation de l'expression de la protéine PEPC (fonction photosynthétique et anaplérotique) conférant aux plantes transformées une teneur modifiée en assimilats carbonés, favorisant le remplissage du grain.

Cette modification du remplissage du grain des plantes transformées selon l'invention, par rapport aux plantes non transformées, peut être mesurée par des méthodes morphologiques, physiologiques et/ou biochimiques. A titre d'exemple, on peut citer préférentiellement des techniques de spectrophotométrie infra-rouge, des techniques d'analyse élémentaire en phase gazeuse (méthode de Dumas par combustion et chromatographie en gazeuse) ou des techniques analytiques des lipides (Metcalfe et al, 1966 ; Bligh et Dyer, 1959).

Rentre également dans le cadre de l'invention l'utilisation d'un acide nucléique codant pour une PEPC ou un fragment de celui-ci, comme sonde ou amorce pour une amplification de type PCR, pour la sélection de plantes transformées présentant un métabolisme carboné modifié, et donc une meilleure tolérance au stress hydrique et un remplissage du grain modifié.

La séquence d'acides nucléiques codant pour une PEPC, telle que celle désignée SEQ ID NO l, ainsi que tout oligonucléotide obtenu à partir de cette séquence peut ainsi être utilisée comme sonde dans des programmes de sélection assistée par marqueur, par exemple pour suivre l'introgression du gène codant pour la protéine PEPC dans une plante. Pour cela au moins une de ces sondes est marquée, par exemple par un isotope radioactif, puis mise en contact avec de F ADN génomique de la plante, préalablement digéré par des enzymes de restriction, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique de la sonde marquée à l'ADN en question.

On peut également utiliser un acide nucléique codant pour une protéine PEPC ou un fragment de celui-ci, comme sonde ou amorce pour amplification, pour la sélection de plantes surexprimant naturellement une PEPC, et présentant donc une meilleure résistance au stress hydrique et/ou un remplissage du grain modifié.

D'autres avantages de l'invention apparaîtront lors de la description qui suit illustrées par les dessins dans lesquels :
La figure 1 représente une carte de restriction du plasmide pMj26 contenant le construit proPEPc-PEPC311-Nos PolyA.

La figure 2 représente une carte de restriction du plasmide pMjl9 contenant le construit 35S-PEPC3 10-Nos PolyA
La figure 3 représente une carte de restriction du plasmide pWP 280 contenant le construit pActin intron-barnase-Nos PolyA.

La figure 4 représente une carte de restriction du plasmide pBIOS298 contenant le construit pActin intron-site de clonage multiple-Nos PolyA.

La figure 5 représente une carte de restriction du plasmide pMj30 contenant le construit pActin intron-PEPC311-Nos PolyA.

La figure 6 représente une carte de restriction du plasmide pMj31 contenant le construit pHMWG-PEPC311-Nos PolyA.

La figure 7 est un diagramme représentatif de l'activité et l'immunodétection de la PEPC dans les extraits protéiques solubles de feuille de plantes T2 transformées avec le construit proPEPC-PEPC.

La figure 8 est un diagramme représentatif de l'activité et l'immunodétection de la PEPC d'extraits protéiques solubles de grains individualisés issus d'épis T2 et T3 de plantes transformées avec le construit proHMWG-PEPC.

EXEMPLES
1-Construction de vecteurs recombinants
Un ADNc de PEPC de sorgho (plante C4), a été isolé suivant une méthode décrite dans la littérature (Crétin et al, 1990). Le numéro d'accession de la séquence complète de l'ADNc de PEPC de forme C4 de sorgho (cv Tamaran) est : X17379.

Dans un premier temps est opérée la construction de 4 vecteurs plasmidiques de base pMj-26, pMj-19, pMj-30, et pMj-31 contenant respectivement le

promoteur PEPC, ou le promoteur 35S, ou le promoteur actine-intron actine (pAct), ou le promoteur HMWG, avec l'ADNc du gène PEPC dans toutes ces constructions ainsi que le terminateur de la nopaline synthétase (terNos) qui amène un signal de polyadénylation fonctionnel chez de nombreuses espèces végétales.

Des vecteurs intermédiaires sont ensuite réalisés pour la recombinaison homologue avec le vecteur pSBl de Japan Tobacco (EP 672 752) dans Agrobacterium tumefaciens souche LBA 4404 (Hoekema et al, 1983).

Le transfert suivi de l'expression des gènes (gène de sélection et gène d'intérêt) dans le maïs est basée sur les propriétés naturelles d'Agrobacterium tumefaciens (Zambrisky et al. 1989) et sur la stratégie du plasmide superbinaire (Hiei et al ; 1994 et Ishida et al ; 1996).

Les enzymes de restriction utilisées pour les clonages sont fournies par New England Biolabs (New England Biolabs, UK). Les réactions enzymatiques sont réalisées en suivant les protocoles décrits par Sambrook et al., dans le manuel Molecular cloning (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

1-1-Vecteurs plasmidiques de base 1-1-1-Le construit pMJ-26 : pPEPC-PEPC

Le terminateur Nos (insert BamHI/HindIII de 0. 4kb du pCaMVNeo (Fromm et al, 1986) est cloné dans le plasmide pUC9 (Vieira & Messing, 1982) digéré par BamHI et HindIII. Le plasmide est ouvert par BamHI et les bords rendus francs avec la polymerase Klenow. L'ADNc PEPC CP311 (insert SmaI/HindIII rendu bords francs par remplissage à la polymérase Klenow, comportant une mutation silencieuse au site Ncol ATG+120pb ; Wang et al, 1992) y est lié. L'orientation du terminateur Nos, de l'ADNc et leur jonction sont vérifiées par digestions et séquençage. L'insert Ncol de 1530bp du clone génomique CP46 (Lepiniec et al, 1992) dont la séquence complète est présentée ci-dessous en SEQ ID ? 2 (séquence promotrice proPEPc) est cloné au site Ncol du plasmide précédemment obtenu. L'orientation est vérifiée par digestions et séquençage. La carte du pMJ-26 est présentée Figure. 1
1-1-2-Le construit pMJ-19 : p35S-PEPC L'ADNc PEPC CP310 (insert SmaI/HindIII rendu bords francs par remplissage à la polymérase Klenow, Crétin et al, 1991) est cloné au site BamHI du pCaMVNeo rendu bords francs entre le promoteur 35S (0. 4kb) et le terminateur Nos (0.25kb). L'insert HindIII (3.7kb) est alors cloné au site HindIII du pSK+ (Genbank nO52325). L'orientation du promoteur 35S et du cDNA ainsi que leur jonction sont vérifiées par digestions et séquençage. La carte du pMJ-19 est présentée Figure 2
1-1-3-Le construit pMj-30 : pactine intron-PEPc
Le clonage du construit promoteur actine-PEPC-Nos 3'utilise comme plasmide de base le plasmide pWP280 contenant la cassette pActin-intron-Barstar-Nos polyA (Figure 3), dans laquelle on remplace le fragment Barstar par le fragment PEPC.

Le plasmide de base a été obtenu selon les étapes suivantes : le gène barstar (Hartley, 1988, J. Mol. Biol., 202,913-915) a été transféré en tant que fragment XbaI/HincII dans un site XbaI/Smal du plasmide pW90, dérivé du plasmide pJIT30 décrit par Guérineau et al, 1990, Plant Mol. Biol., 15 : 127-136) (promoteur 35SCaMV remplacé par le promoteur double 35S et la région polylinker entre les sites Xbal et EcoRI remplacée par les sites Sped, BamHI, Smal et PstI). La région polyA CaMV du plasmide obtenu est remplacée par la région polyA de pED23 (Dale et al., 1990, Gene, 91 : 79-85) formant le plasmide pWP266. La région promotrice double 35S CaMV est

enfin remplacée par le promoteur actine du riz et l'intron issu de pCOR 113 (Mc Elroy et al., 1991, Mol. Gen. Genet., 231 : 150-160) formant le plasmide pWP280.

Le fragment barstar a ensuite été excisé de ce plasmide pWP280 par digestion avec l'enzyme PstI, puis religaturé sur lui-même pour donner le vecteur pBIOS298 contenant le fragment promoteur actine-intron-site de clonage multiple-terminateur Nos3' (Figure 4). Le construit pBIOS-298 est ouvert au site EcoRV entre l'intron Actine et le terminateur Nos puis déphosphorylé. L'insert NcoI-EcoRV du pMJ-26 est rendu

bords francs par remplissage à la polymérase Klenow puis cloné au site du pBIOS-298. L'orientation du construit a été vérifiée par digestion et la jonction IntronActine-PEPC séquencée. La carte du pMJ-30 est présentée Figure 5.

1-1-4-Le construit pMj-31 : pHMWG-PEPc
Le vecteur pBL 3214 est dérivé d'un plasmide pBluescript II SK+ (Stratagene) dans lequel on a inséré, par le choix d'enzymes de restriction spécifiques à la portée de l'homme du métier, la séquence promotrice HMWG (High Molecular Weight Glutenin) de blé (Robert et al., 1989), spécifique de l'albumen des semences et une séquence terminatrice 3'Nos de Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982).

Le construit pBL 3214 est ouvert au site Smal entre le promoteur HMWG et le terminateur Nos puis déphosphorylé. L'insert NcoI-EcoRV du pMJ-26 est rendu bords

francs par remplissage à la polymérase Klenow puis cloné au site du p3214.

L'orientation du construit a été vérifiée par digestion et la jonction pHMWG-PEPC séquencée. La carte du pMJ-31 est présentée Figure 6.

1-2-Construction des vecteurs intermédiaires pour la recombinaison homologue avec pSB 1 (obtention de plasmides superbinaires)
Les vecteurs servant à la recombinaison homologue dans Agrobacterium tumefaciens sont dérivés du vecteur pBIOS 273.

1-2-1-Construction des plasmides pBIOS 273, 274, et 308 Le vecteur de base pour la recombinaison homologue est le vecteur pBIOS- 273. Ce vecteur a été généré en 2 étapes :

- clonage du fragment BspDI/XhoI (pAct-Bar-terNos) du vecteur pDM 302 (Cao et al. 1992) dans les sites Smal et BspDI du vecteur pSB12 (Japan Tobacco).

Le vecteur résultant de ce clonage est appelé pBIOS 272.

- délétion du site Xhol en position 3363 du vecteur pBIOS 272 par digestion partielle avec Xhol et action de l'ADN Polymerase I, large (Klenow) fragment. Le vecteur obtenu, possédant un site unique Xhol, est nommé pBIOS 273.

* Construction du plasmide pBIOS 274 - clonage du fragment (Pro A9-Bamase-terCaMV) Xhol du vecteur pWP 128 (Paul et AI 1992) dans le vecteur pBIOS 273 restreint à Xhol # Construction du plasmide pBIOS 308 -le pBIOS 308 dérive du pBIOS 306, qui a été obtenu par clonage du fragment I/XhoI de 795 PB (ADNc Asrl) dans le vecteur pBIOS 298 précédemment décrit, restreint à ECOR V.

- le clonage du fragment SalI/XhoI de 2970 pb du vecteur pBIOS 306 dans les sites BspDI/XhoI du vecteur pBIOS 274 génère le pBIOS 308.

1-2-2-Génération des vecteurs intermédiaires de recombinaison contenant l'ADNc de PEPC Ces construits ont été générés à partir des vecteurs pBIOS 274, pBIOS 273, pBIOS 308.

# Le e vecteur pBIOS 326
Ce vecteur a été obtenu par clonage du fragment ApaI/BstBI du vecteur pMJ-30 dans les sites PmeI/BstBI du vecteur pBIOS 308.

e Le vecteur PBIOS 327
Ce vecteur a été obtenu par clonage du fragment Xhol du vecteur pMJ-31 dans les sites Xhol du vecteur pBIOS 274.

# Le vecteur PBIOS 356

Ce vecteur a été obtenu par clonage du fragment SmaI/HindIII du vecteur pMJ-26 dans les sites Pmel du vecteur pBIOS 273.

2-Transformation du maïs
2-1-Canon à particules
La méthode utilisée repose sur l'utilisation d'un canon à particules identique à celui décrit par J. Finer (1992). Les cellules cibles sont des cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal embryogène (dit de type II) de maïs.

Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hill selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (Maize Handbook ; 1994 M. Freeling, V.

Walbot Eds ; pp. 665-671). Ces fragments des cals d'une surface de 10 à 20 mm ont été disposés, 4h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boite au centre d'une boîte de Petri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation des cals, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides décrits dans les exemples précédents et portant les séquences PEPc à introduire, sont purifiés sur colonne QiagenR en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (MIO) en suivant le protocole décrit par Klein (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrits par Finer (1992). Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de ScellofraisR puis cultivées à l'obscurité à 27OC. Le premier repiquage a lieu 24h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélectif, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boîte bombardée.

Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de façon à régénérer des plantules, en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées pour l'obtention d'hybrides ou autofécondées.

De façon préférentielle, on utilise un protocole apparenté dont le principe est décrit dans l'ouvrage Methods of Molecular Biology : Plant gene transfer and expression protocols (1995, vol. 49, Pol13-123), et dans lequel les embryons immatures de génotype Hill sont directement bombardés avec des particules d'or enrobées des plasmides PEPC à introduire, préparées selon le protocole décrit par Barcelo et Lazzeri (1995). Les étapes de transformation, sélection des événements, maturation et régénération sont sensiblement analogues à celles décrites dans le protocole précédent.

2-2-Transformation par Agrobacterium
Une autre technique de transformation utilisable dans le cadre de l'invention utilise Agrobacterium tumefaciens, selon le protocole décrit par Ishida et al (1996), notamment à partir d'embryons immatures prélevés 10 jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la référence citée. La transformation débute avec une phase de co-culture où les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact pendant au moins 5 minutes avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN-T contenant le gène d'intérêt et/ou le marqueur de sélection dérivé des plasmides décrits dans les exemples précédents, et le vecteur pSBl de Japan Tobacco (EP 672 752) qui contient : les gènes virB et virG du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281 d'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette recombinaison homologue. Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25OC. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés : les cals embryogènes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg/1 et de la céfotaxime à 250 mg/1 (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium tumefaciens). Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25OC. La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSD5, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/1) en présence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type 1

(fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 25 C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime.

La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type 1 qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/1 et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22 C et sous lumière continue.

Les plantules ayant régénéré sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100mg/1 d'Augmentin pendant 2 semaines à 22 C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.

3-Expression
3-1-Extraction de la PEPC de feuilles et de grains de maïs.

- Les feuilles sont prélevées et immédiatement congelées dans l'azote liquide. Le broyage s'effectue dans un mortier préalablement nettoyé à l'éthanol 100% et refroidi sur glace. Un disque foliaire de 18 mm de diamètre est extrait dans 200 L de tampon d'extraction : Tris-HCI pH 8.0, glycérol 20%, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, PVP insoluble 2% (p/v), du sable de fontainebleau et des inhibiteurs de

protéases : leupeptine 2mg. L-1, chymostatine 2mg. L-', PMSF ImM et E64 Img. L-. Quand des mesures de niveau de phosphorylation de la PEPC sont programmées, les inhibiteurs de phosphatase : acide okadaïque 0. Img. L-1 et la micro-cystine-LR 10nM sont alors ajoutés. Le broyat est ensuite centrifugé à 4 C pendant 15 minutes à 20000g pour éliminer les débris.

- Les grains sont préalablement réduits en poudre dans un broyeur à bille (Retsch). Les protéines sont extraites par mise en suspension de 100JlL de poudre dans 400 pL du tampon précédemment décrit sur glace. Ce mélange est vortexé et centrifugé

à 4 C pendant 15 minutes à 20000g pour éliminer les débris.

Dans les deux cas, le surnageant constitue l'extrait brut de protéines solubles. Il peut être utilisé immédiatement pour des mesures d'activité PEPC ou congelé à l'azote liquide et conservé à-20 C pour une détection ultérieure en Western blot.

3-2-Mesures d'expression

3-2-1-Western blot L'électrophorèse en gel de poly-acrylamide en présence de SDS permet de séparer les protéines en fonction de leur masse moléculaire. La technique est inspirée de Laemmli (1970)
La détection immunologique de la PEPC sur la membrane de nitrocellulose se fait après blocage par l'addition d'un anticorps primaire qui peut être : a) un anticorps polyclonal de la PEPC C4 de sorgho, préparé selon la méthode décrite dans Vidal et al. (1980). b) un anticorps anti-site de phosphorylation, dirigé contre un peptide synthétique de 23 acides aminés de la séquence N-terminale de la
PEPC C4 de sorgho [ERHHSIDAQLRALAPGKVSEE (YG)] (Crétin et al, 1990) qui contient le site de phosphorylation. Les anticorps ont été préparés chez le lapin et purifiés par chromatographie d'affinité sur protéine A Sépharose. Ces anticorps reconnaissent avec la même efficacité les formes phosphorylées ou non de l'enzyme. La dilution utilisée est de 1/2000. c) un anticorps anti C-terminal, dirigé contre un peptide synthétique de
20 acides aminés de la séquence C-terminale de la PEPC C4 de sorgho [ (Y) EDTLILTMKGIAAGMQNTG)]. Ces anticorps ont été obtenus dans des lapins et purifiés. La dilution utilisée est de 1/lLl15000. d) un anticorps monoclonal produit contre la forme C4 de la PEPC de
Sorgho par la technique des hybridomes. Plus de 400 hybridomes produisant des anticorps ont été produits après fusion des cellules de rate de souris immunisées, avec des cellules de myélome NSI. Les anticorps 83 et 91 ont montré une très haute spécificité pour la PEPC C4 de sorgho (Thomas et al., 1987).

La détection immunologique de la PEPC de Type C4 de sorgho dans les plantes a permis de révéler la présence significative de la protéine transgénique, notamment avec le construit proPEPC-PEPC. En outre, cette surexpression est corrélée avec les

différences d'activité observées entre les plantes transgéniques, et les plantes témoins, jusqu'à 2, 2 fois le niveau de PEPC endogène au niveau des feuilles.

Le construit proHMWG-PEPC (grains) a également donné des résultats satisfaisants, car le niveau d'expression de la PEPC est jusqu'à six fois supérieur par rapport au niveau d'expression de la PEPC endogène dans les grains issus de plantes de types C4 transformées.

3-2-2-Mesures d'activité et paramètres enzymatiques a)-Capacité de la PEPC
La mesure de l'activité maximale de la PEPC est effectuée à l'aide d'un spectrophotomètre (Cary 50, Varian). Le principe repose sur le couplage de deux réactions : la ss-carboxylation du PEP par la PEPC produit l'oxaloacétate qui est réduit en malate par la malate déshydrogénase (MDH) à NAD. On mesure la diminution de l'absorption à 340nm due à l'oxydation du NADH à 30oye. Le milieu réactionnel contient dans un volume final de ImL : Hépès/KOH 100 mM, pH 8, MgCl2 5 mM, NADH 0.2

mM, Nah03 5 mM, PEP-Na 5 à 10 mM (Roche) et 3 unités enzymatiques de MDH à NAD (Roche). La réaction est initiée par addition de 5 à 50uL d'extrait protéique brut de feuille ou de grain contenant la PEPC. Une unité enzymatique correspond à la formation d'une Fmole de produit par minute dans les conditions expérimentales définies ci-dessus.

Une étude biochimique a permis de mettre en évidence une augmentation de l'activité enzymatique maximale PEPC d'un facteur 2,2 par rapport au niveau témoin chez la feuille (Figure 7).

Pour le grain, l'activité enzymatique est multipliée jusqu'à 6 fois, entre les grains transformés et les grains non transformés à l'intérieur d'un même épi. (Figure 8). Quelle que soit la génération, la proportion des grains qui sont transformés à l'intérieur d'un même épi, issu d'un croisement entre une plante transformée et une plante non transformée ou issu d'un rétrocroisement, varie de 50 à 100 % en fonction du nombre de loci présentant le transgène. Dans la plupart de cas, cette proportion est de 50% des grains transformés à l'intérieur d'un même épi.

Dans les deux cas, l'augmentation d'activité PEPC est corrélée quantitativement à la protéine transgénique (immunodétection). b)-Détermination du SO, 5 pour le PEP et de la sensibilité au malate de la PEPC
La constante enzymatique SO. 5 est la concentration en PEP qui détermine une vitesse de catalyse égale à 50% de la vitesse maximale.

Les résultats montrent que le So. 5 pour le PEP de la PEPC dans les grains est significativement supérieur à celui de l'enzyme des grains contrôles, ce qui permet de mettre en évidence la présence d'une forme C4 (recombinante) dans les grains transformés.

Le malate est un inhibiteur physiologique de la PEPC. L'activité de la PEPC est mesurée dans des conditions sub-optimales (PEP 3mM, pH 7,3) en présence et en absence de L-malate 1.2 mM. Les résultats sont exprimés selon une activité en présence de malate/activité en absence de malate x 100. La forme déphosphorylée est plus sensible à l'inhibition par le malate (70%) que la forme phosphorylée (environ 30%). Ce test permet d'estimer les variations de l'état de phosphorylation de l'enzyme foliaire lorsque la plante est exposée à différents stimuli (lumière, obscurité, stress).

Des études préliminaires n'ont montré aucune différence significative de sensibilité au malate entre les plantes surexprimant beaucoup ou peu la PEPC recombinante. Ainsi la PEPC exogène serait phosphorylée dans la feuille à la lumière dans les mêmes proportions que la PEPC endogène. Cela indiquerait que sous une forte luminosité, l'augmentation d'activité PEPC n'est pas compensée par une moindre phosphorylation.

3-2-3-Dosage du malate
L'extraction des métabolites s'obtient par broyage de 10mg de matériel

(foliaire ou grain) dans lOOuL d'acide perchlorique à 5% (v/v) avec du sable et 2% (p/v) de PVP insoluble. Le broyat est centrifugé à 20000g à 4 C pendant 5 minutes. Le surnageant est ajusté à un pH de 7. 6 environ avec 16 uL de carbonate de potassium 50%. Le principe du dosage (kit Roche) consiste en l'oxydation du L-malate en

oxaloacétate par la malate déshydrogénase (MDH) en présence de NAD. La réaction est amenée à complétion dans le sens de la formation de l'oxaloacétate en couplant cette réaction à celle de la glutamate-oxaloacétate-transaminase selon le schéma réactionnel décrit ci-dessous.

MDH (1) malate + NAD+ # oxaloacétate + NADH + H+
GOT

(2) Oxaloacétate + glutamate aspartate + 2 a-cétoglutarate
La quantité de NADH formé (1 NADH pour 1 oxaloacétate) est mesurée par spectrophotométrie à 340 nm et la formule suivante permet de calculer la concentration en L-malate (C en g. L-1) des extraits analysés :
C= AAx [ (VxMW)/ (s x dxvx 1000)]
Dans laquelle :
V = volume du milieu réactionnel en mL v = volume de l'extrait en mL

MW = masse moléculaire du L-malate en g. mol'' d = longueur du trajet optique en cm # = coefficient d'absorption spécifique du NADH à 340 nm = 6.3 mmol''. cm-'
Aucune différence significative de la teneur en malate n'a pu être mesurée entre les grains transformés et les grains contrôles. Si du malate est surproduit dans les grains transformés, il est donc probablement métabolisé.

3-3-Etudes moléculaires
Parmi les transformants sont préférentiellement choisis ceux qui présentent une insertion monolocus/monocopie (1 copie du gène d'intérêt et 1 copie du marqueur de sélection) sans séquence plasmidique indésirable. La technique Southem avec plusieurs enzymes de restriction et plusieurs sondes appropriées (Southem, 1975)

peut notamment être utilisée pour identifier et caractériser l'insertion dans le génome de la plante, permettant ainsi de différencier les événements de transformation. Cette méthodologie permet en effet de mettre en évidence des différences individuelles dans la taille des fragments de restriction obtenus avec une enzyme donnée et une sonde donnée, correspondant à des emplacements définis sur le génome.

On peut utiliser les stratégies suivantes : - pro HMWG pBIOS 327 : digestion Apal ou EcoR V, utilisation de la sonde intron actine et d'une sonde BAR.

- proActine pBIOS 326 : digestion Kpnl, sonde BAR. Sur ce construit la redondance du promoteur et de l'intron actine ne facilite pas l'utilisation d'une sonde simple. Une sonde RB pourrait être utilisée comme seconde matrice d'hybridation.

- proPEPC pBIOS 356 : digestion Kpnl, sonde BAR et promoteur PEPC.

Les profils obtenus sont ceux attendus.

4-Mesures physiologiques des maïs en conditions limitantes en eau et en C02 4. 1 Assimilation du C02, et mesures de poids sec/frais en conditions de stress hydrique Le protocole utilisé comprend les étapes suivantes (d'après Pelleschi et al 1997) : Les grains (24) de lignées transformées sont semés sur perlite dans des pots (1 grain/pot) de 1 Ocm de diamètre et 25 cm de haut que l'on place en serre. La température est de 26 C le jour et 18 C la nuit, l'humidité relative est de 70% et si besoin, la lumière naturelle est supplémentée d'une lumière artificielle (lampe Philips Sun-T Agro) fournissant 400 E au minimum. La solution nutritive (Hydrocani C2) est complétée par une solution de Séquestrene (g/L) permettant de satisfaire aux besoins en fer du maïs.

Un Western blot sur un extrait protéique de la seconde feuille permet de déterminer le génotype des plantes et de distribuer aléatoirement les ségrégants dans la serre. Le stress hydrique est appliqué quand 90% des plantes ont la ligule de la 4ème feuille visible, ce qui est généralement observé environ 15 à 20 jours après semis. Les paramètres photosynthétiques sont mesurés régulièrement (appareil IRGA CIRAS 1 de PP Systems) sur chaque individu pendant 15 jours pour suivre l'établissement de la sécheresse sur les

deux lots. En fin de manipulation le potentiel hydrique de la sixième feuille, la masse fraîche et la masse sèche des parties aériennes sont mesurées et un échantillon est congelé pour les analyses biochimiques.

La mesure des paramètres photosynthétiques dans les conditions d'expérience montrent que : - l'assimilation nette en CO2 augmenterait en moyenne jusqu'à 7% par rapport aux témoins, à la fois en condition normale, et de stress hydrique.

- en fin de stress hydrique, l'efficience d'utilisation de l'eau augmente aussi, de 25% par rapport aux témoins - après 18 jours de stress hydrique, les poids frais et secs augmentent respectivement de 10% et 20% par rapport aux témoins.

4. 2 Point de compensation du CO2 et efficacité photosynthétique en atmosphère appauvrie en C02 La culture s'effectue à partir de deux pools de grains : les grains sont semés sur de la perlite imbibée d'une solution nutritive (adaptée au maïs) ou sur du terreau irradié et cultivés en serre.

Au stade 4 à 5 feuilles, après 8 à 10 jours de culture, le test Basta est effectué : on badigeonne la 3ième feuille (sur une surface de 4 cm2) à l'aide d'une éponge imbibée d'une solution aqueuse à 0, 75 g/l de glufosinate d'ammonium.

La lecture du test Basta est effectuée 5 jours plus tard : les feuilles nécrosées révèlent les plantes qui n'ont pas été transformées, et celles ci seront utilisées ultérieurement comme référence (contrôle)..

Les plantes sont ensuite transférées dans des enceintes phytotroniques et le point de compensation en C02 est déterminé après 20 à 25 jours.

Les mesures d'échange de CO2 sont réalisées pendant 21 jours à partir des plantes maintenues dans les conditions de culture suivantes : concentration en C02 de 50 2-1 ppm ; lumière de 800 à 1000 uE. m"'. s ; température 26 C jour et 20 C nuit ; hygrométrie de 80% jour et nuit. Cette concentration subatmosphérique en CO2 permet de mimer les effets d'un stress hydrique et en particulier la réduction de l'ouverture stomatique.

En fin d'expérience la masse végétale fraîche et le poids sec sont déterminés sur l'ensemble des échantillons.

Des résultats préliminaires ont montré que les points de compensations des plantes transgéniques (plante entière) sont inférieurs de 2 à 4 ppm (soit une réduction de 20 à 30%) à ceux des plantes non transformées.

4.3 Autres mesures au champ
La résistance au stress hydrique des plantes transformées selon l'invention, par rapport aux plantes témoins, peut être appréciée à partir de diverses méthodes d'analyses phénotypique, physiologique et/ou biochimique, pour des conditions d'irrigation particulières, en conditions normales (culture traditionnelle avec arrosage) et en conditions de stress hydrique.

Les notations effectuées aux différentes périodes de floraison et de récolte consistent à mesurer l'effet de la tolérance au stress sur la production en grain, notamment : le pourcentage de fécondation (rapport du nombre de grains par épi/ nombre d'ovules fécondables), le nombre de rangs par épi, le nombre de grains par rang, l'humidité des grains, le poids de 1000 grains.

5-Modifications quantitatives et qualitatives des teneurs en protéines et lipides.

5.1 Technique infra-rouge
L'analyse dans le proche infrarouge est une technique spectroscopique qui utilise le spectre électromagnétique naturel. La région du proche infrarouge est la zone où le spectre est défini par des longueurs d'onde comprises entre 700 nm et 2500 nm. Il est situé entre la région visible et la région de l'infrarouge moyen. La zone du proche infrarouge est idéale pour effectuer les mesures de propriétés chimiques d'échantillons liquides, solides, gazeux ou en suspension épaisse. Les appareils utilisant le proche infrarouge reposent sur des monochromateurs à grille de dispersion. Cette technique est relativement précise, rapide et non-destructive. Les molécules typiques analysées dans

le NIR contiennent des liaisons CH, OH et NH et notamment les matières grasses, les protéines, l'amidon et les sucres solubles.

Des changements d'équilibre entre les différentes voies métaboliques de synthèse des acides organiques, des acides gras et des acides aminés peuvent être étudiés grâce à cette technique sur le grain entier.

5.2 Analyseur d'éléments (C, N)
La méthode d'analyse à sec des éléments (Dumas) est basée sur une transformation des particules solides en gaz par une combustion totale et très rapide dans un four à 1200 C. Tous les gaz produits sont entraînés hors du four par un flux continu de gaz non réactif (hélium). Le carbone est converti en CO2 au cours de la combustion et les composés azotés en gaz N2 ou différents oxydes d'azote (NOx). Les

gaz passent sur une colonne de réduction composée de cuivre (600 C) dans laquelle les oxydes d'azote libèrent l'oxygène et émergent de la colonne sous forme N2. L'eau est retenue sur une colonne de perchlorate de magnésium. Le mélange entre alors sur une colonne de chromatographie en phase gazeuse (Chromosorb) séparant l'azote (élué en premier) du dioxyde de carbone. La détection par catharomètre mesure la différence de conductivité entre un flux de référence (hélium) et le flux analysé.

Une modification de la teneur en protéine totale par rapport à la teneur en glucides peut être détectée par cette méthode dans un broyat de chaque grain.

5.3 Teneur en lipides (acides gras et triglycérides) L'extraction des lipides totaux est réalisée selon la méthode de Bligh et Dyer (1959).

Les broyats de grains sont fixés dans l'éthanol bouillant puis l'extraction est faite par addition d'un volume de chloroforme, puis d'eau (1/1/1 ; V/V/V). Une quantité connue d'heptadécanoate (Cl 7 : 0) est ajoutée au milieu d'extraction. Cet acide gras absent du maïs peut donc être utilisé comme témoin interne.

L'extrait d'acides gras est méthylé et les esters méthyliques analysés par chromatographie en phase gazeuse. La méthylation est réalisée selon la méthode de Metcalfe et al (1966). Cette technique sépare les esters méthyliques d'acides gras selon le nombre d'atomes de carbone et le degré d'insaturation. Un intégrateur permet de calculer la quantité de chaque acide gras en fonction du standard interne.

Une modification de la teneur en lipides totaux par rapport au poids sec peut être détectée par cette méthode dans un extrait de chaque grain.

L'augmentation du flux d'oxaloacétate puis de malate (via la PEPC) vers les leucoplastes semblerait entraîner une augmentation de la teneur en acides gras.

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Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'une plante de type C4 présentant un métabolisme carboné modifié, comprenant les étapes consistant à : - introduire dans au moins une cellule de plante C4 une cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour une phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC) ; - cultiver la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante C4 contenant dans son génome ladite cassette d'expression.

2. Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre l'identification et la sélection des cellules transformées capables de régénérer des plantes présentant un métabolisme carboné modifié par rapport à une plante non transformée.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la PEPC est surexprimée dans les plantes transformées régénérées.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite protéine PEPC est une PEPC C4, notamment une PEPC C4 de sorgho, ou une PEPC C3.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique comprend la séquence SEQ ID NO 1 ou une séquence homologue.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique est insérée en orientation sens.
7. Procédé selon l'une des quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la dite cellule transformée selon la première étape est également transformée par un ou plusieurs acides nucléiques choisis parmi :

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un acide nucléique codant pour un composant protéique de modulation de la chaîne de transduction et de phosphorylation de la PEPC, un acide nucléique codant pour une autre protéine du cycle C4, notamment la pyruvate-phosphate dikinase.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la cassette d'expression comprend un promoteur permettant l'expression constitutive ou ciblée de la séquence codant pour la PEPC, par exemple le promoteur actine-intron, le promoteur HMWG, ou le promoteur PEPC.
9. Plante ou partie de plante, susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Plante ou partie de plante selon la revendication 9 présentant une augmentation de l'expression de la protéine PEPC par rapport à une plante non transformée.

Il. Plante selon la revendication 9 ou 10 caractérisée en ce que la cassette d'expression est intégrée de manière stable dans le génome de la cellule
12. Plante ou partie de plante selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une plante de grande culture ou de potagères ou de fleurs, ayant pour caractéristique d'appartenir aux plantes de type C4, comme le maïs et le sorgho.
13. Plante transgénique hybride susceptible d'être obtenue par le croisement de plantes telles que définies dans l'une quelconque des revendications 9 à 12.
14. Vecteur comprenant une cassette d'expression selon la revendication 1.
15. Cellule hôte comprenant un vecteur selon la revendication 14.

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16. Cellule de plante, ou clone d'une telle cellule, transformée par un vecteur selon la revendication 14.
17. Utilisation d'un acide nucléique codant pour une protéine PEPC pour l'obtention d'une plante transgénique de type C4 à teneur modifiée en assimilats carbonés, favorisant la maturation du fruit et le remplissage de la graine.
18. Utilisation d'un acide nucléique codant pour une protéine PEPC pour l'obtention d'une plante transgénique de type C4 à teneur modifiée en assimilats carbonés, lui conférant une meilleure tolérance au stress hydrique.
19. Utilisation d'un acide nucléique codant pour une protéine PEPC ou un fragment de celui-ci, comme sonde ou amorce pour amplification pour la sélection de plantes transformées selon l'une des revendications 8 à 12, présentant une meilleure résistance au stress hydrique et/ou un remplissage du grain modifié.