WO2003054229A2 - Polymorphismes du gene ccoaomt2 de mais, et leurs utilisations pour ameliorer la digestibilite des plantes. - Google Patents

Polymorphismes du gene ccoaomt2 de mais, et leurs utilisations pour ameliorer la digestibilite des plantes. Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to genetic markers associated with better digestibility of fodder plants, and in particular to variants of the second isoform of Caféoyl Coenzyme-A 3-0 M yl Transferase (CCoAOMT-2) improving the digestibility of plants which contain them.
  • Lignins establish different types of links with the other parietal constituents and form a tight mesh which hinders the accessibility of carbohydrates, the main sources of energy for herbivores, to digestive enzymes.
  • one of the preferred ways of improving the qualities of fodder plants concerns the selection or production by genetic engineering of less lignified or modified lignin plants.
  • the corn silage which is one of the fodder plants whose use is most widespread, especially in the context of production dairy. It has thus been observed that a reduction in the lignin content leads to a large improvement in the digestibility of the corn silage, which results in an increase in milk production and in weight gain compared to the animals fed. with a less digestible variety (EMILE, Annales de zootechnies, 1995).
  • Corn mutants are known, known as "bro n midrib", which have a greatly reduced lignin content.
  • bm3 maize has drawbacks limiting their exploitation, such as a lower field yield, increased susceptibility to lodging, a lack of growth and vigor at the start of vegetation and a delay in flowering (BARRIERE and ARGILLIER, Agronomie, 13, 865-876, 1993).
  • O-methyl transferases (S-adenosyl-L-methionine O-methyltransferases, EC 2.1.1.6) play an important role in the biosynthesis of monolignols. Although the mechanisms involved in vivo in this biosynthetic pathway are not completely understood, it is generally considered that the formation of the S and G subunits involves successive hydroxylation and O-methylation reactions followed by conversion of the carboxyl side chain in an alcohol function.
  • the enzymes involved in this biosynthetic pathway include:
  • O-methyltransferases caffeic acid O-methyltransferase (COMT); 5-hydroxyconiferyl aldehyde O-methyl transferase (AldOMT); Caféoyl Coenzyme A 3-0 methyltransferases (CCoAOMT)
  • cytochrome P450 ferulate 5-hydroxylase (F5H) - and several isoforms of Cinnamoyl Co A reductase (CCR) and Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD).
  • the Caféoyl Coenzyme-A O-Methyltransferases play a major role in the biosynthetic pathway of monolignols and more particularly of the G and S subunits; they seem to intervene during several stages of the lignin biosynthetic pathway (GUO et al., Plant Cell, 13, 73-88, 2001), and it has been observed that CCoAOMT activity is closely linked to the lignification of tissues in a number of dicotyledonous species (ZHONG et al., Plant Cell, 10, 2033-2045, 1998).
  • the sequence of the wild-type CCoAOMT2 gene used as a reference in the description of the present invention corresponds to the accession number AJ242981 on the basis of GenBank, and to that of CIVARDI et al. , Plant Physiol., 120, 1206, (1999).
  • the CCOA0MT2 gene described by CIVARDI et al. was obtained from variety 64A; its sequence is shown in Figure 1.
  • the fragment shown comprises 1181 base pairs and has 4 exons and 3 introns.
  • the 5 'non-coding region of this sequence is defined by 70 base pairs.
  • the intron splicing sites are as follows: for intron 1 (79 bp) AGGT .... GTA, for intron 2 (108 bp) TGGT ....
  • F4 line Polymorphisms associated with increased corn digestibility have been identified on an allele of the CCoA0MT2 gene isolated from a corn line called F4.
  • This F4 line has a very high level of digestibility, close to that of the bm3 lines, and, unlike these, produces lignins which are characterized by a significantly higher S / G ratio than that observed in lignins from varieties. corn silage classics.
  • the allele of the CCoAOMT2 gene isolated from the F4 line is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 3.
  • the subject of the present invention is a process for evaluating the digestibility of a fodder plant, and in particular corn, characterized in that it comprises the detection of the presence or absence, in biological material originating from said plant, with an allele favorable to the digestibility of the CCoAOMT 2 gene.
  • said CCoAOMT2 allele favorable for the digestibility code for a mutant Caféoyl Coenzyme A 3-0 methyltransferase-2 comprising at least one of the following mutations: a) the deletion of the Glu-Ala-Thr peptide sequence, located between positions 6 and 10 of the sequence SEQ ID NO: 2; b) the insertion of at least one copy of the Asn-Gly peptide motif between positions 26 and 27 of the sequence SEQ ID NO: 2; c) the substitution of the His residue at position 37 of the sequence SEQ ID NO: 2 with an Arg residue.
  • 1 to 3 copies of the Asn-Gly peptide motif are inserted between positions 26 and 27 of the sequence SEQ ID NO: 2.
  • Said allele favorable to digestibility may optionally further comprise: d) the substitution of the residue Asn at position 188 of the sequence SEQ ID NO: 2 with a residue Ser.
  • Said allele favorable to digestibility preferably comprises at least the mutation a) and / or the mutation b).
  • the detection of the presence of an allele of the CCoAOMT2 gene favorable to digestibility can be carried out by analysis of the CCoAOMT-2 protein, to highlight one or more of the mutations mentioned above. above, which result in the modification of the peptide sequence of this protein, and in particular at least one of the mutations a) or b)
  • polymorphisms mentioned above may be polymorphisms located in the coding regions of the CCoA0MT2 gene, and which result in modifications of the peptide sequence of the CCoAOMT-2 protein, and in particular by the mutations mentioned above. It may also be polymorphisms located in the 5 ′ non-coding region or in the introns of the CCoAOMT2 gene, or polymorphisms located in the coding regions but not resulting in a sequence modification of the CCoAOMT-2 protein. Indeed, although these polymorphisms do not appear to be directly involved in the CCoAOMT-2 mutation favorable to digestibility, they are however closely linked to it, and their presence therefore constitutes an indicator of the plant's digestibility.
  • polymorphisms can thus be used, associated with the allele of the corn CCoAOMT2 gene favorable to digestibility represented by the sequence SEQ ID NO: 3:
  • the inserted fragment has the sequence ACTGC, and corresponds to positions 56 to 60 of the sequence SEQ ID NO: 3.
  • the 5 ′ non-coding region of the allele of sequence SEQ ID NO: 3 extends from nucleotide 1 to nucleotide 75 of this sequence, which corresponds to nucleotides 1 to 70 of the reference sequence SEQ ID NO: 1.
  • Exon 1 of the allele of sequence SEQ ID NO: 3 extends from nucleotide 76 to nucleotide 228 of this sequence, which corresponds to nucleotides 71 to 214 of the reference sequence SEQ ID NO: 1.
  • the allele of sequence SEQ ID NO: 3 comprises the following polymorphisms:
  • the deleted fragment has the sequence: GGCGACCGA, and code for the peptide sequence Glu-Ala -Thr absent in the sequence SEQ ID NO: 4; an insertion of 18 base pairs between nucleotides 129 and 130 of the reference sequence SEQ ID NO: 1.
  • the inserted fragment corresponds to positions 125 to 144 of the sequence SEQ ID NO: 3.
  • This fragment has the sequence CAACGGCAACGGCAACGG, and code for the peptide sequence Asn-Gly-Asn-Gly-Asn-Gly inserted in the sequence SEQ ID NO: 4; insertions of 3 base pairs or 9 base pairs, corresponding respectively to 1 and 3 repeats of the sequence CAACGG coding for the peptide motif Asn-Gly, were also detected, at the same location, in other favorable alleles digestibility;
  • Intron 1 of the allele of sequence SEQ ID NO: 3 extends from nucleotide 229 to nucleotide 307 of this sequence, which corresponds to nucleotides 215 to 293 of the reference sequence SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 3 contains the following polymorphisms:
  • Exon 2 of the allele of sequence SEQ ID NO: 3 extends from nucleotide 308 to nucleotide 387 of this sequence, which corresponds to nucleotides 294 to 373 of the reference sequence SEQ ID NO: 1.
  • Intron 2 of the allele of sequence SEQ ID NO: 3 extends from nucleotide 388 to nucleotide 495 of this sequence, which corresponds to nucleotides 374 to 481 of the reference sequence SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 3 has the following polymorphism:
  • Exon 3 of the allele of sequence SEQ ID NO: 3 extends from nucleotide 496 to nucleotide 640, which corresponds to nucleotides 482 to 626 of the reference sequence SEQ ID NO: 1.
  • Intron 3 of the allele of sequence SEQ ID NO: 3 extends from nucleotide 641 to nucleotide 754, which corresponds to nucleotides 627 to 710 of the reference sequence SEQ ID NO: 1.
  • the allele of sequence SEQ ID NO: 3 comprises the following polymorphisms:
  • This fragment has the sequence: TGCCCCTTTCTCTCT.
  • the inserted fragment corresponds to positions 730 to 747 of the sequence SEQ ID NO: 3.
  • This fragment has the sequence: CTCTCTGTTGCTCGTCCC .
  • - a deletion of 3 base pairs, corresponding to the sequence fragment located between nucleotides 668 and 672 of the reference sequence SEQ ID NO: 1.
  • the deleted fragment has the sequence: TGA; - at least one substitution C - »T in position 635 or 648 of the reference sequence SEQ ID NO: 1, corresponding respectively to positions 664 and 677 of the sequence SEQ ID NO: 3.
  • Exon 4 of the allele of sequence SEQ ID NO: 3 extends from nucleotide 755 to nucleotide 1180, which corresponds to nucleotides 711 to 1136 of the reference sequence SEQ ID NO: 1.
  • sequence SEQ ID NO: 3 comprises the following polymorphism:
  • any polynucleotide probe which, under appropriate stringency conditions, is capable of hybridizing selectively to any allele of the CCoAOMT-2 gene containing this allelic form, compared to other alleles of the same gene, and genes of related sequence.
  • This selective hybridization results in a significantly higher hybridization signal with said allele than with other alleles of the same gene or genes of related sequence, and preferably by the presence of a hybridization signal with said allele and the absence of a hybridization signal with the other alleles of the same gene or the genes of related sequence.
  • the primers and the amplification conditions used will be defined so as to allow the amplification of the different alleles of CCoAOM 2.
  • the detection of the form of the polymorphism associated with the desired allele can for example be carried out using a polynucleotide probe according to the invention, as indicated above. It can also be carried out, in particular when the polymorphism is an insertion or a deletion of several nucleotides, on the basis of the size of the amplification fragments.
  • a selective amplification of the desired allele can be carried out, using at least one specific amplification primer for this allele.
  • the amplification conditions will be defined according to the primer chosen, so that said primer only hybridizes with its complementary sequence present in the desired allele. Under these conditions, an amplification is only observed if this allele is present in the genetic material analyzed.
  • the second primer can be common to different alleles, or specific to the allele sought.
  • the present invention also relates to a
  • Mutant CCoAOMT-2 characterized in that it differs from CCoAOMT-2 of sequence SEQ ID NO: 2 by at least one of the following mutations: a) the deletion of the Glu-Ala-Thr peptide sequence between the positions 6 and 10 of the sequence
  • SEQ ID NO: 2 b) the insertion of at least one copy, preferably 1 to 3 copies of the Asn-Gly peptide motif between positions 26 and 27 of the sequence SEQ ID NO: 2; c) the substitution of the His residue at position 37 of the sequence SEQ ID NO: 2 with an Arg residue;
  • said mutant CCoAOMT-2 may further comprise the following mutation: d) the substitution of the residue Asn at position 188 of the sequence SEQ ID NO: 2 with a residue Ser.
  • said mutant CCoAOMT-2 comprises at least the mutation a) and / or the mutation b).
  • An example of a mutant CCoAOMT-2 in accordance with the invention is illustrated by the sequence SEQ ID NO: 4.
  • the present invention also relates to an isolated polynucleotide encoding a Caféoyl Coenzyme A 3-0 methyltransferase-2 (CCoAOMT-2) from mutant corn according to the invention.
  • said polynucleotide responds to a sequence chosen from:
  • the present invention also relates to any fragment of more than 10 bp, preferably of more than 15 bp, and very preferably more than 20 bp, of a polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 3, said fragment comprising at least one of the polymorphisms mentioned above, as well as the complement of said fragment.
  • the polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 3, or its fragments defined above can in particular be used, for the detection in fodder plants, in particular in monocots, and in particular in corn, of an allele favorable to digestibility of the gene coding for CCoAOMT-2. In particular, they can be used for obtaining polynucleotide probes or amplification primers allowing this detection.
  • polynucleotide probes specific for the allelic form of a polymorphism of CCoAOMT-2 present on the allele of sequence SEQ ID NO: 3, can notably comprise:
  • fragments of the polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 3 in a method for detecting a polymorphism constituted by the deletion of several nucleotides, the region of exon 1 comprising a deletion of 9 bp in the allele SEQ ID NO: 3, using the primers defined respectively by the sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the amplification product obtained from the genetic material derived from a plant of the reference line 64A (comprising the allele SEQ ID NO: 1), has a length of 85 base pairs, while the amplification product obtained from the genetic material obtained from a plant of the line F4 (comprising the allele SEQ ID NO: 3) has a length of 76 bp.
  • the position of the primers SEQ ID NO: 5 and 6 is indicated in Figure 2.
  • a pair of amplification primers in which at least one of the primers represents a fragment of at least 10 bp, preferably at least 15 bp, and very preferably at least 20 bp, of the polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 3, said fragment comprising at minus one of the polymorphisms mentioned above, or the complement of said fragment.
  • the amplification conditions will be defined according to the primer chosen, as indicated above.
  • the primer SEQ ID NO: 7 consists of a fragment of the sequence SEQ ID NO: 3 surrounding the location deletion of 9 bp in the first exon, to which 4 additional bases have been added (the first 4 bases of the sequence SEQ ID NO: 7), to increase the T m (melting temperature) of the primer, and therefore the specificity of hybridization.
  • the primer SEQ ID NO: 8 is common to the various alleles of the CCoAOMT2 gene; it is located just before the stop codon of this gene.
  • the present invention also relates to oligonucleotide primers which can be used for the implementation of the detection methods defined above.
  • the subject of the present invention is: any pair of primers allowing the amplification of a region of the CCOAOMT2 gene comprising at least one of the polymorphisms mentioned above; by way of example, mention may be made of the pair of primers defined by the sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the invention also relates to a method for identifying a fodder plant, and in particular a corn, comprising an allele of CCoAOMT2 favorable to digestibility, characterized in that it comprises the detection of the presence, in a sample derived from said plant , a mutant CCoAOMT-2 as defined above.
  • the detection of a mutant CCoAOMT-2 according to the invention can be carried out for example, using polyclonal or monoclonal antibodies selectively recognizing said protein, that is to say showing no cross-reactions with other corn proteins, and in particular not showing cross-reactions with wild-type CCoAOMT-2 or with CCoAOMT -1.
  • antibodies which also form part of the subject of the invention, can be easily obtained by conventional methods for the preparation of polyclonal or monoclonal antibodies, by immunizing an animal with a mutant CCoAOMT-2 in accordance with the invention, or a fragment of the latter carrying at least one of the mutations identified above, and in particular a fragment carrying at least the mutation a) and / or the mutation b), and by selecting, from the antibodies obtained, those which, in the same reaction conditions, form an antibody / antigen complex detectable with a mutant CCoAOMT-2 according to the invention, but not with other corn proteins, and in particular wild type CCoAOMT-2 or CCoAOMT-1.
  • the antibodies according to the invention can optionally be labeled, in order to allow the revelation of the antibody / antigen complex.
  • kits for implementing a method according to the invention for detecting an allele of CCoAOMT2 favorable to digestibility.
  • kits include, in addition to one or more reagents in accordance with the invention (in particular antibodies, polynucleotide probe or primers), means suitable for carrying out the reaction used for detection, and / or means suitable for revealing the product. of this reaction.
  • Kits comprising at least one polynucleotide probe according to the invention, optionally associated with reagents allowing the implementation of a hybridization reaction, with means for detecting the hybrid formed, and / or with positive controls and / or negative hybridization controls; Kits comprising at least one pair of primers according to the invention, optionally associated with reagents allowing the implementation of an amplification reaction, with means for detecting the amplification product, and / or with positive controls and / or negative amplification controls;
  • Kits comprising at least one antibody in accordance with the invention, optionally associated with reagents allowing the implementation of an antibody / antigen reaction, with means for detecting an antibody / antigen complex, and / or with controls positive and / or negative reaction controls.
  • kits can comprise, in addition to the reagents in accordance with the invention allowing the detection of a CCoA0MT2 allele favorable to digestibility, other reagents allowing the detection of other agronomic characteristics of interest.
  • the present invention can be implemented in the context of the selection of plants, in particular corn, having improved digestibility.
  • SAM marker-assisted selection
  • the present invention can also be used in the context of phylogenetic studies, the characterization of genetic relationships among plant varieties, the identification of somatic crosses or hybridizations, the location of chromosomal segments affecting monogenic characters, cloning based on genetic maps, and identification of QTL and / or PQL.
  • polynucleotides in accordance with the invention and in particular the polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 3, or their fragments comprising at least one of the polymorphisms defined above can also be used for the production, in recombinant form, of CCoAOMT- 2 mutant in accordance with the invention, or fragments thereof, as well as to improve the digestibility of fodder plants, in particular monocots, and in particular corn, by the expression in said plants of a mutant CCoAOMT-2 according to the invention.
  • a subject of the present invention is thus: a recombinant expression cassette comprising a polynucleotide according to the invention or a fragment thereof, comprising at least one of the polymorphisms defined above placed under the control of heterologous regulatory sequences transcription and translation (especially promoter and terminator of transcription).
  • the present invention also encompasses a process for the production of a recombinant polypeptide, characterized in that it comprises the transformation of a host cell, prokaryotic or eukaryotic, by a sequence polynucleotide encoding a mutant CCoAOMT-2 according to the invention, or for a fragment thereof comprising at least one of the mutations identified above, and the recovery of said mutant CCoAOMT-2 or of said fragment produced by said cell.
  • the present invention also encompasses host cells genetically transformed with a polynucleotide according to the invention.
  • Host cells can be eukaryotic or prokaryotic cells.
  • bacteria in particular E. coli or Agrobacterium, yeasts, for example Saccharomyces, animal cells or, preferably, plant cells.
  • the present invention also encompasses transgenic plants genetically transformed with a polynucleotide according to the invention. They are preferably monocots, and in particular corn.
  • the choice of the host vector and of the sequences for regulating the expression will be carried out as a function of the host cell or of the host organism chosen and of the envisaged application.
  • host cells of bacteria in particular E. coli or of yeasts in particular, are frequently used.
  • Saccharomyces cerevisiae many expression systems in either of these two organisms are known per se and commercially available.
  • the endogenous promoter of the CCoAOMT2 gene may be used.
  • a heterologous promoter can also be used; very many promoters usable for the transformation of plant cells are known in themselves. Examples include: constitutive promoters, such as the CaMV 35S promoter, or its derivatives, or the ubiquitin promoter; inducible promoters, for example the Hsp70 promoter which is inducible by thermal shock; - tissue-specific promoters.
  • constitutive promoters such as the CaMV 35S promoter, or its derivatives, or the ubiquitin promoter
  • inducible promoters for example the Hsp70 promoter which is inducible by thermal shock
  • - tissue-specific promoters Among the transcription terminators that can be used, there may be mentioned in particular the polyA 35S terminator of the cauliflower mosaic virus, or the polyA NOS terminator, which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the nopaline synthase gene of Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens nopaline strain.
  • the transformation of plant cells can be carried out by various methods such as, for example, the transfer of the polynucleotide of interest into the plant protoplasts after incubation of the latter in a polyethylene glycol solution in the presence of divalent cations (Ca 2+), l electroporation (FROMM et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 82, 5824, 1985), the use of a particle gun, in particular according to the method described by FINER et al. (Plant Cell Report, 11, 323-328, 1992), or cytoplasmic or nuclear micro-injection (NEUHAUS et al., Theor. Appl. Genêt., 75 (1), 30-36, 1987).
  • Plant cells can also be infected with a bacterial cell host comprising the vector containing the sequence of interest.
  • the cell host can be Agrobacterium tumefaciens (AN et al., Plant Physiol., 81, 86-91, 1986), or A. rhizogenes (GUERCHE et al., Mol. Gen. Genêt., 206, 382, 1987) .
  • the transformation of the plant cells is carried out by the transfer of the T region of the extrachromosomal circular plasmid which induces Ti tumors of A. tumefaciens, using a binary system (WATSON et al., recombinant DNA, Ed. De Boeck University, 273-292, 1994).
  • T-DNA region was deleted by with the exception of the right and left edges, a marker gene being inserted between them to allow selection in plant cells.
  • the other partner in the binary system is a helper Ti plasmid, a modified plasmid which no longer has T-DNA but still contains the vir virulence genes necessary for the transformation of the plant cell. This plasmid is maintained in Agrobacteriu-m.
  • the genetic transformation of plants with a polynucleotide coding for a mutant CCoAOMT-2 in accordance with the invention makes it possible to obtain transgenic plants, and in particular corn, having an increased digestibility.
  • the allele naturally present in the plant is inactive.
  • the inactivation of this allele can be obtained for example by insertion into the CCoAOMT2 gene (preferably in the coding region) of a T-DNA or any other transposable element.
  • a more particular subject of the present invention is therefore a process for the production of transgenic maize having an increased digestibility rate, characterized in that it comprises the following stages:
  • CCoAOMT2 of the plant to be transformed b) the genetic transformation of the plant resulting from step a) with a polynucleotide coding for a mutant CCoAOMT-2 in accordance with the invention.
  • maize with increased digestibility can be obtained by site-directed mutagenesis, in order to introduce into the natural allele of the CCoAOMT2 gene the modifications necessary for the expression of a mutant CCoAOMT-2 in accordance with the invention.
  • Methods of site-directed mutagenesis which can be used in the context of the present invention are known in themselves to those skilled in the art; they are for example described in the work of D. TAGU (eds INRA 1999).
  • the plants containing the gene coding for a mutant CCoAOMT-2 according to the invention can be selected by detection of this gene using one of the detection methods in accordance to the invention described above.
  • the invention also relates to the transformed plants obtained by a process of transgenesis or of directed mutagenesis according to the invention, as well as the descendants of these plants.
  • the invention also encompasses the products obtained from these plants, such as plant organs or tissues, cells, seeds, etc.
  • the invention also relates to the derived products, and in particular the fodder, obtained from these plants.
  • Alleles of the CCoA0MT2 gene favorable to digestibility, and containing polymorphisms different from those identified in the allele SEQ ID NO: 3 can be identified from maize lines with high digestibility, and producing lignins having an S / G ratio higher than that of lignins from conventional varieties of corn silage.
  • the CCoAOMT2 alleles present in these lines can be isolated and sequenced and their sequences compared with that of the wild-type CCoAOMT2 gene, in order to detect the polymorphisms associated with these alleles. Polynucleotides reproducing the sequence of these alleles, as well as mutant CCoAOMT-2 produced by these can be used in all the applications described above.
  • EXAMPLE 1 DEVELOPMENT OF A DETECTION TEST OF A POLYMORPHIC MARKER ASSOCIATED WITH DIGESTIBILITY.
  • Line F4 is that from which the allele SEQ ID NO: 3 was obtained. Primers used
  • the marker chosen is the deletion of 9 nucleotides between nucleotides 86 and 87 of the sequence SEQ ID NO: 3 which corresponds to nucleotides 81 to 91 of the sequence SEQ ID NO: 1. 2 pairs of primers have been defined:
  • the first is intended to allow selective amplification of the allele carrying the desired deletion. If this allele is not present in the sample, no amplification is observed.
  • the second frames the location of the desired deletion. The presence or absence of an allele carrying this deletion is detected by the size of the amplification product.
  • the first pair of primers includes: - a selective sense primer, located astride the location of the deletion. This sequence is represented by the sequence SEQ ID NO: 7; the first 4 bases of this sequence correspond to additional bases added to increase the melting temperature of the primer and therefore increase the specificity of the PCR; an antisense primer, non-selective: This primer, located immediately before the stop codon of the gene, is common to the various alleles of the CCoAOM 2 gene. Its sequence is represented under the number SEQ ID NO: 8.
  • the second pair of primers comprises a sense primer defined by the sequence SEQ ID NO: 5 and an antisense primer defined by the sequence SEQ ID NO: 6. Each of these primer pairs was tested on genetic material obtained from lines E, D, F, G and F4 (30 ng of genomic DNA from each line).
  • the PCR is carried out in a volume of 50 ⁇ l of mixture having the following composition:
  • Matrix 30 ng genomic DNA primers: 0.2 ⁇ M from each dNTPs: 200 ⁇ M from each
  • Buffer 5 ⁇ l of 10 X buffer containing 100 mM tris-HCl, 500 mM Kcl, 15 mM MgCl 2 and 0.01% gelatin pH: 8.3
  • Polymerase REDTaq GENOMIC DNA POLYMERASE (SIGMA). 2.5 Units of polymerase are added to the 50 ⁇ l of reaction mixture.
  • sense primer 5 min at 72 ° C.
  • the results are illustrated in Figure 3:
  • the first 5 deposits correspond to the amplifications obtained with the pair of primers SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 on the lines (from left to right) G (track 1), F (track 2), E (track 3), D (track 4) and F4 (track 5).
  • the central deposit (lane 6) corresponds to the 1 kb molecular size marker.
  • the last 5 deposits correspond to the positive controls, obtained with the pair of control primers SEQ ID NO: 1
  • the line F4 is characterized by a clear band of approximately 1 kb, corresponding to the amplification product obtained with the primers SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • a clear band of approximately 1 kb, corresponding to the amplification product obtained with the primers SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • the bands have a very low intensity.
  • Other experiments were carried out using a temperature of hybridization of the primers varying from 66 ° C to 68 ° C. The same amplification specificity was observed for the pair of primers SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8. Amplification by the pair of primers SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6
  • the pair of primers defined by the sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 was tested on the lines E, D, F, G and F4.
  • the reaction medium is the same as that used above, but the reaction volume is doubled, ie 100 ⁇ l in order to be able to deposit 70 ⁇ l of the PCR product on a 4% agarose-metaphor (TEBU) gel supplemented with ethidium bromide. This gel has a high resolving capacity, making it possible to highlight a size difference of 4 bp for DNA fragments whose size is between 200 and 16 bp. Cycle:
  • the migration takes place for 4 h at 90 V.
  • the results are illustrated in Figure 4.
  • the first deposit (lane 1) corresponds to the 100 bp molecular size marker.
  • the CCoAOMT2 gene was obtained from cDNA extracted from this line by PCR amplification, using the primers SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
  • the cloning of the PCR fragments obtained corresponding to the coding region of CCoAOMT-2 was carried out using the PGEM-T EASY vector system according to the instructions of the supplier (PROMEGA).
  • the PCR fragment is ligated into the vector pGEM-T EASY (PROMEGA).
  • the competent E. coli JM109 bacteria (marketed by PROMEGA) are transformed using this construct.
  • ISHIDA et al. (1996, supra) The transformation technique described by ISHIDA et al. (1996, supra) is used from embryos immature 10 days after fertilization. All the media used are described in this publication.
  • a superbinary vector is constructed by homologous recombination between an intermediate vector (pBSll or pBS12) carrying a resistance marker, and into which has been previously inserted the mutated CCoAOMT2 gene excised from the pGEM-T EASY vector, and the pSB1 vector from JAPAN TOBACCO
  • EP 672 752 which contains: the virB and virG genes of the plasmid pTiBo542 present in the supervirulent strain A281 of Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349).
  • the vectors pBS11, pBS12, and pSB1 are described in Application EP 672 752 in the name of JAPAN TOBACCO.
  • the transformation is carried out by bringing the immature embryos of the corn plants into contact for at least 5 minutes with Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 containing the superbinary vector.
  • the embryos are then placed on LSAs medium for 3 days in the dark and at 25 ° C.
  • a first selection is made on the transformed calluses: the embryogenic calluses are transferred to LSD5 medium containing phosphinotricin at 5 mg / 1 and cefotaxime at 250 mg / 1
  • Agrobacterium tumefaciens This stage is carried out for 2 weeks in the dark and at 25 ° C.
  • the second selection step is carried out by transfer of the embryos which have developed on LSD5 medium, on LSD10 medium (phosphinotricin to
  • the third selection step consists in excising the type I calluses (fragments of 1 to 2 mm) and transferring them for 3 weeks in the dark and at
  • the regeneration of the seedlings is carried out by excising the type I calluses which have proliferated and by transferring them to LSZ medium in the presence of phosphinotricin at 5 mg / 1 and cefotaxime for 2 weeks at 22 ° C. and under continuous light.
  • the regenerated seedlings are transferred to RM + G2 medium containing 100 mg / 1 of AUGMENTIN ® for 2 weeks at 22 ° C and under continuous illumination for the development stage.
  • the plants obtained are then transferred to the phytotron for their acclimatization.
  • Transformation of plant cells by bombarding Calluses 2 months old, obtained after the cultivation of immature embryos on a callogenesis medium are used for transformation.
  • a plasmolyzing treatment makes it possible to reduce the volume of the vacuole and thus limits the cell bursts during firing (pretreatment for 4 hours and a post-treatment for 16 hours on a Sorbitol 0.2M medium and
  • the plant material is distributed evenly across all of the boxes. 15 mg of sterile tungsten microbeads are mixed in 150 ⁇ l of water sterilized by microfiltration.
  • the mutant CCoAOMT2 gene is inserted into a plasmid pDM302 carrying a selection marker.
  • the following mixture is prepared: 25 ⁇ l of tungsten microbeads,
  • This mixture is left to settle in ice for at least 5 minutes.
  • the shooting is started.
  • the helium pressure in the barrel is 8 bars.
  • the bombarded plant material is returned to its original Petri dish (Mannitol / Sorbitol).
  • the boxes are placed at 26 ° C and in the dark for 16 hours for a post-bombardment plasmolyzing treatment (mannitol / sorbitol).
  • the selection pressure is applied 16 hours after firing and is maintained at the same concentration of the selective agent (BIALAPHOS at 5 mg / L) during all the regeneration steps.
  • the seedlings are then transplanted into potting soil (small pots) for 1 week then transferred to 20-liter pots (peat-poudzolane mixture) in the transgenic greenhouse or in an air-conditioned room (Temperature 24 ° C day / 20 ° C night; photoperiod 16 h day / 8 h night, humidity 80%).
  • the plants are self-fertilized or crossed.

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Abstract

L'invention est relative à des polymorphismes du gène CCoAOMT-2 de maïs, et à l'utilisation de ces polymorphismes pour l'évolution et l'amélioration de la digestibilité des plantes fourragères.

Description

POLYMORPHISMES DU GENE CC0A0MT2 DE MAIS, ET LEURS UTILISATIONS POUR AMELIORER LA DIGESTIBILITE DES PLANTES.
La présente invention est relative à des marqueurs génétiques associés à une meilleure digestibilité des plantes fourragères, et notamment à des variants de la seconde isoforme de la Caféoyl Coenzyme-A 3-0 Mét yl Transférase (CCoAOMT-2) améliorant la digestibilité des plantes qui les contiennent.
Un facteur important limitant la digestibilité des plantes fourragères est lié à la présence dans les parois des cellules végétales, de composés phénoliques, en particulier des lignines. Les lignines établissent différents types de liaisons avec les autres constituants pariétaux et forment un maillage serré qui gène l'accessibilité des glucides, principales sources d'énergie pour les herbivores, aux enzymes digestives.
Par conséquent, une des voies privilégiées d'amélioration des qualités des plantes fourragères concerne la sélection ou la production par génie génétique de plantes moins lignifiées ou à lignines modifiées. Parmi les plantes qui ont fait l'objet du plus grand nombre d'études dans ce but figure le mais d'ensilage, qui est l'une des plantes fourragères dont l'usage est le plus répandu, notamment dans le cadre de la production laitière. II a ainsi été observé qu'une diminution de la teneur en lignine conduit à une forte amélioration de la digestibilité du mais d'ensilage, qui se traduit par une augmentation de la production de lait et de la prise de poids par rapport aux animaux nourris avec une variété moins digeste (EMILE, Annales de zootechnies, 1995) .
On connaît des mutants de mais, dénommés « bro n midrib », qui ont une teneur en lignine fortement réduite
(jusqu'à 40%) ; et une lignine de structure différente par rapport aux maïs normaux, . Ces maïs, et notamment ceux des lignées dénommées « bm3 » dont le gène codant pour l'acide caféique O-méthyltransfêrase est muté (VIGNOLS et al., The Plant Cell, 7, 407-416, 1995), possèdent une digestibilité fortement augmentée par rapport aux mais de type sauvage, et améliorent significativement la production laitière lorsqu'ils sont utilisés en tant que fourrage.
Cependant, les maïs bm3 présentent des inconvénients limitant leur exploitation, tels qu'un rendement en champ moindre, une susceptibilité à la verse accrue, un manque de croissance et de vigueur en début de végétation et un retard a la floraison (BARRIERE et ARGILLIER, Agronomie, 13, 865-876, 1993).
L'obtention de plantes fourragères et notamment de maïs, plus digestes suite à une modification de la voie de biosynthèse des lignines, possédant de bons rendements et peu sensibles aux divers stress (pathologique, hydrique, mécanique...) est un des axes privilégiés d'amélioration des végétaux. Les lignines sont des polymères insolubles de
3 monomères d'alcools ou monolignols, dérivant de la voie des phénylpropanoïdes (NEISH, Constitution and Biosynthesis of Lignin, eds New York: Springer Verlag pp. 1-43, 1968) : l'alcool p-coumarylique (sous-unités H), l'alcool coniférylique (sous-unités G) et l'alcool sinapylique (sous- unités S) .
Les O-méthyl transférases (S-adénosyl-L- méthionine O-méthyltransférases, EC 2.1.1.6) jouent un rôle important dans la biosynthèse des monolignols. Bien que les mécanismes impliqués in vivo dans cette voie de biosynthèse ne soient pas complètement élucidés, il est généralement considéré que la formation des sous-unités S et G fait intervenir des réactions successives d'hydroxylation et de O-méthylation suivies de la conversion de la chaîne latérale carboxyl en une fonction alcool.
Les enzymes impliquées dans cette voie de biosynthèse incluent :
- différentes O-méthyltransférases : l'acide caféique O-méthyltransférase (COMT) ; la 5-hydroxyconiferyl aldéhyde O-méthyl transférase (AldOMT) ; les Caféoyl Coenzyme A 3-0 mêthyltransférases (CCoAOMT)
- des hydroxycinnamate coenzyme A ligases (4CL)
- une férulate 5-hydroxylase (F5H) à cytochrome P450 - et plusieurs isoformes de Cinnamoyl Co A réductase (CCR) et de Cinnamyl alcool déhydrogenase (CAD) .
Les propriétés de ces différentes enzymes ont fait l'objet de revues (BOUDET et al . , New Phytol . , 129, 203- 236, 1995 ; DIXON et al . , Phytochemistry, in press, 2001 ; HETTEN et al . , Annu. Rev. Plant. Physiol . Plant. Mol. Biol . , 49, 585-609, 1998 ; LI et al . , J. Biol. Chem., 275, 6537- 6545, 2000) .
Les Caféoyl Coenzyme-A O-Méthyltransférases jouent un rôle majeur dans la voie de biosynthèse des monolignols et plus particulièrement des sous-unités G et S ; elles semblent intervenir au cours de plusieurs étapes de la voie de biosynthèse des lignines (GUO et al . , Plant Cell, 13, 73-88, 2001), et il a été observé que l'activité CCoAOMT est étroitement liée à la lignification des tissus dans un certain nombre d'espèces de dicotylédones (ZHONG et al . , Plant Cell, 10, 2033-2045, 1998) .
Chez le maïs, deux gènes différents codant pour deux isoformes de CCoAOMT ont été identifiés (CIVARDI et al . , Plant Physiol., 120, 1206, 1999) : le gène CCoAOMTl (AJ242980) et le gène CCoA0MT2 (AJ242981) .
La séquence du gène CCoAOMT2 de type sauvage utilisée comme référence dans l'exposé de la présente invention, correspond au numéro d'accession AJ242981 sur la base GenBank, et à celle de CIVARDI et al . , Plant Physiol., 120, 1206, (1999). Le gène CCOA0MT2 décrit par CIVARDI et al . a été obtenu à partir de la variété 64A ; sa séquence est représentée sur la Figure 1. Le fragment représenté comprend 1181 paires de bases et comporte 4 exons et 3 introns . La région 5' non codante de cette séquence est définie par 70 paires de bases. Les sites d'épissage des introns sont les suivants : pour l'intron 1 (79 pb) AGGT.... GTA, pour l'intron 2 (108 pb) TGGT....AGGA, et pour l'intron 3 (84 pb) CGGT....AGAT. La séquence de ce fragment est également représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, et la séquence de son produit de traduction est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 2. Les Inventeurs ont mis en évidence la colocalisation du gène CCOA0MT2 , situé sur le chromosome 9, avec un QTL de digestibilité et un QTL de teneur en lignine dans les parois. Ils ont en outre identifié des mutations du gène CCoAOMT2 créant des allèles polymorphes associés à la digestibilité du maïs.
Des polymorphismes associés à une digestibilité accrue du maïs ont été identifiés sur un allèle du gène CCoA0MT2 isolé à partir d'une lignée de maïs dénommée F4. Cette lignée F4 possède un niveau de digestibilité très élevé, voisin de celui des lignées bm3, et, contrairement à celles-ci, produit des lignines qui se caractérisent par un rapport S/G nettement plus élevé que celui observé dans les lignines issues des variétés classiques de maïs d'ensilage. L' allèle du gène CCoAOMT2 isolé à partir de la lignée F4 est représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 3.
Certains des polymorphismes identifiés sur cet allèle sont localisés au niveau des régions codantes du gène, et se traduisent par des mutations dans la Caféoyl Coenzyme A 3-0 méthyltransférase-2 (CCoAOMT-2) résultant de l'expression de ce gène. D'autres sont localisés dans la région 5' non codante et dans les introns, en particulier l'intron 3.
La mise en évidence par les Inventeurs de l'implication de la CCoAOMT-2 dans la digestibilité, ainsi que l'identification dans le gène CCoA0MT2 de polymorphismes associés à la digestibilité, fournit un ensemble de moyens permettant d'obtenir des plantes fourragères, notamment des monocotylédones, et en particulier des maïs ayant une digestibilité améliorée.
La présente invention a pour objet un procédé d'évaluation de la digestibilité d'une plante fourragère, et notamment de maïs, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence ou de l'absence, dans du matériel biologique provenant de ladite plante, d'un allèle favorable à la digestibilité du gène CCoAOMT 2.
Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, ledit allèle de CCoAOMT2 favorable à la digestibilité code pour une Caféoyl Coenzyme A 3-0 méthyltransférase-2 (CCoAOMT-2) mutante comportant au moins l'une des mutations suivantes : a) la délétion de la séquence peptidique Glu-Ala-Thr, située entre les positions 6 et 10 de la séquence SEQ ID NO: 2 ; b) l'insertion d'au moins une copie du motif peptidique Asn-Gly entre les positions 26 et 27 de la séquence SEQ ID NO: 2 ; c) la substitution du résidu His en position 37 de la séquence SEQ ID NO: 2 par un résidu Arg.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, 1 à 3 copies du motif peptidique Asn-Gly sont insérées entre les positions 26 et 27 de la séquence SEQ ID NO: 2.
Ledit allèle favorable à la digestibilité peut éventuellement comprendre en outre : d) la substitution du résidu Asn en position 188 de la séquence SEQ ID NO: 2 par un résidu Ser. Ledit allèle favorable à la digestibilité comprend de préférence au moins la mutation a) et/ou la mutation b) .
Pour la mise en œuvre de la présente invention, la détection de la présence d'un allèle du gène CCoAOMT2 favorable à la digestibilité peut s'effectuer par analyse de la protéine CCoAOMT-2, pour mettre en évidence une ou plusieurs des mutations mentionnées ci-dessus, qui se traduisent par la modification de la séquence peptidique de cette protéine, et en particulier au moins l'une des mutations a) ou b)
Elle peut également s'effectuer par analyse de polymorphismes du gène CCoA0MT2 de la plante à tester, pour déterminer si un ou plusieurs de ces polymorphismes sont présents sous leur forme associée à l' allèle favorable à la digestibilité recherché.
Les polymorphismes mentionnés ci-dessus peuvent être des polymorphismes situés dans les régions codantes du gène CCoA0MT2 , et qui se traduisent par des modifications de la séquence peptidique de la protéine CCoAOMT-2, et notamment par les mutations mentionnées ci-dessus. Il peut également s'agir de polymorphismes situés dans la région 5' non codante ou dans les introns du gène CCoAOMT2, ou de polymorphismes situés dans les régions codantes mais ne se traduisant pas par une modification de séquence de la protéine CCoAOMT-2. En effet, bien que ces polymorphismes n'apparaissent pas directement impliqués dans la mutation de CCoAOMT-2 favorable à la digestibilité, ils sont toutefois étroitement liés à celle-ci, et leur présence constitue donc un indicateur de digestibilité de la plante.
Dans le cadre de la mise en œuvre de la présente invention, on peut ainsi utiliser un ou plusieurs des polymorphismes suivants, associés à l' allèle du gène CCoAOMT2 de maïs favorable à la digestibilité représenté par la séquence SEQ ID NO: 3 :
- une insertion de 5 paires de bases dans la région 5' non codante entre les nucléotides 55 et 56 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1. Le fragment inséré a pour séquence ACTGC, et correspond aux positions 56 à 60 de la séquence SEQ ID NO: 3. La région 5' non codante de l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 s'étend du nucléotide 1 au nucléotide 75 de cette séquence, ce qui correspond aux nucléotides 1 à 70 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1.
L'exon 1 de l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 s'étend du nucléotide 76 au nucléotide 228 de cette séquence, ce qui correspond aux nucléotides 71 à 214 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1. Dans l'exon 1, l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 comporte les polymorphismes suivants :
- une délétion de 9 paires de bases, correspondant au fragment de séquence situé entre les nucléotides 81 et 91 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1. Le fragment délété a pour séquence : GGCGACCGA, et code pour la séquence peptidique Glu-Ala-Thr absente dans la séquence SEQ ID NO: 4 ; - une insertion de 18 paires de bases entre les nucléotides 129 et 130 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1. Le fragment inséré correspond aux positions 125 à 144 de la séquence SEQ ID NO: 3. Ce fragment a pour séquence CAACGGCAACGGCAACGG, et code pour la séquence peptidique Asn-Gly-Asn-Gly-Asn-Gly insérée dans la séquence SEQ ID NO: 4 ; des insertions de 3 paires de bases ou de 9 paires de bases, correspondant respectivement à 1 et 3 répétitions de la séquence CAACGG codant pour le motif peptidique Asn-Gly, ont également été détectées, à la même localisation, dans d'autres allèles favorables à la digestibilité ;
- une substitution C —»G en position 178 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1, correspondant à la position 192 de la séquence SEQ ID NO: 3 ;
- une substitution A —» G en position 180 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1, correspondant à la position 194 de la séquence SEQ ID NO: 3. Cette substitution se traduit par la substitution du résidu His en position 37 de la séquence SEQ ID NO: 2 par un résidu Arg.
L'intron 1 de l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 s'étend du nucléotide 229 au nucléotide 307 de cette séquence, ce qui correspond aux nucléotides 215 à 293 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1. Dans l'intron 1, l' allèle de séquence
SEQ ID NO: 3 comporte les polymorphismes suivants :
- une substitution G —»A en position 227 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1, correspondant à la position 241 de la séquence SEQ ID NO: 3 ; - une substitution A -»G en position 237 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1, correspondant à la position 251 de la séquence SEQ ID NO: 3 ;
- une substitution CG—-TT aux positions 259-260 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1, correspondant aux positions 273-274 de la séquence SEQ ID NO: 3 ;
L'exon 2 de l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 s'étend du nucléotide 308 au nucléotide 387 de cette séquence, ce qui correspond aux nucléotides 294 à 373 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1.
Dans l'exon 2, l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 ne comporte aucun polymorphisme par rapport à la séquence de référence SEQ ID NO: 1.
L'intron 2 de l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 s'étend du nucléotide 388 au nucléotide 495 de cette séquence, ce qui correspond aux nucléotides 374 à 481 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1. Dans l'intron 2, l' allèle de séquence
SEQ ID NO: 3 comporte le polymorphisme suivant :
- une substitution A—»G en position 466 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1, correspondant à la position 480 de la séquence SEQ ID NO: 3. L'exon 3 de l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 s'étend du nucléotide 496 au nucléotide 640, ce qui correspond aux nucléotides 482 à 626 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1.
Dans l'exon 3, l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 ne comporte aucun polymorphisme par rapport à la séquence de référence SEQ ID NO: 1.
L'intron 3 de l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 s'étend du nucléotide 641 au nucléotide 754, ce qui correspond aux nucléotides 627 à 710 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1.
Dans l'intron 3, l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 comporte les polymorphismes suivants :
- une insertion de 15 paires de bases entre les nucléotides 631 et 632 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1. Le fragment inséré correspond aux positions
646 à 660 de la séquence SEQ ID NO: 3. Ce fragment a pour séquence : TGCCCCTTTCTCTCT .
— une insertion de 18 paires de bases entre les nucléotides 703 et 704 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1. Le fragment inséré correspond aux positions 730 a 747 de la séquence SEQ ID NO: 3. Ce fragment a pour séquence : CTCTCTGTTGCTCGTCCC . - une délétion de 3 paires de bases, correspondant au fragment de séquence situé entre les nucléotides 668 et 672 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1. Le fragment délété a pour séquence : TGA ; - au moins une substitution C -»T en position 635 ou 648 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1, correspondant respectivement aux positions 664 et 677 de la séquence SEQ ID NO: 3.
- au moins une substitution T —C en position 638, 672 ou 692 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1, correspondant respectivement aux positions 667, 698 et 718 de la séquence SEQ ID NO: 3 ;
- une substitution A —> C en position 667 de la séquence de référence SEQ ID N°l, correspondant à la position 696 de la séquence SEQ ID NO: 3 ;
- une substitution C —-> G en position 698 de la séquence de référence SEQ ID N°l, correspondant à la position 724 de la séquence SEQ ID NO: 3 ;
- une substitution TG — CC aux positions 664-665 de la séquence de référence SEQ ID N°l, correspondant aux positions 693-694 de la séquence SEQ ID NO: 3 ;
L'exon 4 de l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 s'étend du nucléotide 755 au nucléotide 1180, ce qui correspond aux nucléotides 711 à 1136 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1.
Dans l'exon 4, l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3 comporte le polymorphisme suivant :
- une substitution A-G en position 904 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1, correspondant à la position 948 de la séquence SEQ ID NO: 3. Cette substitution se traduit par la substitution du résidu Asn en position 188 de la séquence SEQ ID NO: 2 par un résidu Ser.
Des polymorphismes dont l'utilisation dans le cadre de la mise en œuvre du procédé conforme à 1 ' invention est particulièrement avantageuse sont les suivants :
- une délétion de 9 paires de bases entre les nucléotides 81 et 91 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1. - une insertion de 6 ou 18 paires de bases, correspondant à 1 ou 3 répétitions de la séquence CAACGG, entre les nucléotides 129 et 130 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1. •„ On peut par exemple détecter chez une plante, la présence d'un polymorphisme de CCoAOMT- 2 sous sa forme associée à un allèle favorable à la digestibilité, à partir d'un échantillon contenant du matériel génétique issu de la plante à tester, par hybridation sélective d'une sonde polynucléotidique spécifique de cette forme allelique.
On définit ici comme sonde spécifique d'une forme allelique d'un polymorphisme, toute sonde polynucléotidique qui, dans des conditions de stringence appropriées, est capables de s'hybrider de manière sélective à tout allèle du gène CCoAOMT-2 contenant cette forme allelique, par rapport aux autres allèles du même gène, et aux gènes de séquence apparentée. Cette hybridation sélective se traduit par un signal d'hybridation significativement plus important avec ledit allèle qu'avec les autres allèles du même gène ou les gènes de séquence apparentée, et de préférence par la présence d'un signal d'hybridation avec ledit allèle et l'absence de signal d'hybridation avec les autres allèles du même gène ou les gènes de séquence apparentée.
Les principes généraux de conception et d'utilisation de sondes spécifiques permettant l'analyse de polymorphismes ne concernant qu'un petit nombre de nucléotides, voire un seul nucléotide, ont été initialement décrits par SAIKI et al . (Nature, 324, 163-166, 1986), et sont bien connus en eux-mêmes . Des conditions de stringence appropriées à une hybridation sélective peuvent être facilement déterminées par l'homme du métier pour un polynucléotide donné ; elles dépendent notamment de la longueur du polynucléotide, de sa composition en bases, et du pourcentage de différences entre les allèles à discriminer, au niveau de la portion du gène ciblée par l'hybridation.
On peut par exemple amplifier, à partir de matériel génétique issu de la plante à tester, le gène CCoAOMT2 ou une région de celui-ci comprenant au moins l'un des polymorphismes définis ci-dessus, et détecter la présence ou l'absence, dans le produit d'amplification, de la forme dudit polymorphisme associée à l' allèle recherché. Dans ce cas, les amorces et les conditions d'amplification utilisées seront définies de manière à permettre l'amplification des différents allèles de CCoAOM 2.
La détection de la forme du polymorphisme associée à l' allèle recherché peut par exemple s'effectuer à l'aide d'une sonde polynucléotidique conforme à l'invention, comme indiqué ci-dessus. Elle peut également s'effectuer, notamment lorsque le polymorphisme est une insertion ou une délétion de plusieurs nucléotides, sur la base de la taille des fragments d'amplification. Alternativement, on peut effectuer une amplification sélective de l' allèle recherché, en utilisant au moins une amorce d'amplification spécifique de cet allèle. Les conditions d'amplification seront définies selon l'amorce choisie, de manière à ce que ladite amorce ne s 'hybride qu'avec sa séquence complémentaire présente dans l' allèle recherché. Dans ces conditions, on n'observe une amplification que si cet allèle est présent dans le matériel génétique analysé. La seconde amorce peut être commune à différents allèles, ou spécifique de l' allèle recherché. La présente invention a également pour objet une
CCoAOMT-2 mutante, caractérisée en ce qu'elle diffère de la CCoAOMT-2 de séquence SEQ ID NO: 2 par au moins l'une des mutations suivantes : a) la délétion de la séquence peptidique Glu-Ala-Thr entre les positions 6 et 10 de la séquence
SEQ ID NO: 2 ; b) l'insertion d'au moins une copie, de préférence 1 à 3 copies du motif peptidique Asn-Gly entre les positions 26 et 27 de la séquence SEQ ID NO: 2 ; c) la substitution du résidu His en position 37 de la séquence SEQ ID NO: 2 par un résidu Arg ;
Éventuellement, ladite CCoAOMT-2 mutante peut comprendre en outre la mutation suivante : d) la substitution du résidu Asn en position 188 de la séquence SEQ ID NO: 2 par un résidu Ser.
De préférence, ladite CCoAOMT-2 mutante comprend au moins la mutation a) et/ou la mutation b) . Un exemple de CCoAOMT-2 mutante conforme à l'invention est illustré par la séquence SEQ ID NO: 4.
La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé codant pour une Caféoyl Coenzyme A 3-0 méthyltransférase-2 (CCoAOMT-2) de maïs mutante conforme à l'invention.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit polynucléotide répond à une séquence choisie parmi :
-la séquence d'ADN génomique représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 3 ; cette séquence est également représentée sur la Figure 2.
- la séquence d'ADNc dérivée de ladite séquence génomique .
La présente invention a également pour objet tout fragment de plus de 10 pb, de préférence de plus de 15 pb, et de manière tout à fait préférée de plus de 20 pb, d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 3, ledit fragment comprenant au moins l'un des polymorphismes mentionnés ci- dessus, ainsi que le complémentaire dudit fragment. Le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 3, ou ses fragments définis ci-dessus peuvent notamment être utilisés, pour la détection dans des plantes fourragères, en particulier dans des monocotylédones, et notamment dans le maïs, d'un allèle favorable à la digestibilité du gène codant pour la CCoAOMT-2. En particulier, ils peuvent être utilisés pour l'obtention de sondes polynucléotidiques ou d'amorces d'amplification permettant cette détection.
Par exemple, des sondes polynucléotidiques spécifiques de la forme allelique d'un polymorphisme de CCoAOMT- 2 présente sur l' allèle de séquence SEQ ID NO: 3, peuvent comprendre notamment :
- le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 3 ou son complémentaire ; - les fragments dudit polynucléotide de plus de
10 pb, de préférence de plus de 15 pb, et de manière tout à fait préférée de plus de 20 pb, comprenant au moins l'un des polymorphismes mentionnés ci -dessus, ainsi que les complémentaires desdits fragments.
A titre d'autre exemple d'utilisation de fragments du polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 3, dans un procédé de détection d'un polymorphisme constitué par la délétion de plusieurs nucléotides, on peut amplifier la région de l'exon 1 comportant une délétion de 9 pb dans l' allèle SEQ ID NO: 3, à l'aide des amorces définies respectivement par les séquences SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6. Le produit d'amplification obtenu à partir du matériel génétique issu d'un plant de la lignée de référence 64A (comprenant l'allèle SEQ ID NO: 1), a une longueur de 85 paires de bases, alors que le produit d'amplification obtenu à partir du matériel génétique issu d'un plant de la lignée F4 (comprenant l'allèle SEQ ID NO: 3) a une longueur de 76 pb. La position des amorces SEQ ID NO: 5 et 6 est indiquée sur la Figure 2.
Pour effectuer une amplification sélective d'un allèle du gène CCoAOMT-2 contenant la forme allelique d'un polymorphisme de CCoAOMT-2 présente sur l'allèle de séquence SEQ ID NO: 3, on pourra utiliser un couple d'amorces d'amplification dans lequel au moins une des amorces représente un fragment d'au moins 10 pb, de préférence au moins 15 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 20 pb, du polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 3, ledit fragment comprenant au moins l'un des polymorphismes mentionnés ci-dessus, ou le complémentaire dudit fragment.
Les conditions d'amplification seront définies selon l'amorce choisie, comme indiqué ci -dessus.
Par exemple, on peut utiliser un couple d'amorces définies respectivement par les séquences SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO: 8.
L'amorce SEQ ID NO: 7 est constituée par un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 encadrant l'emplacement de la délétion de 9 pb dans le premier exon, auquel ont été ajoutées 4 bases supplémentaires (les 4 premières bases de la séquence SEQ ID NO: 7) , pour augmenter la Tm (température de fusion) de l'amorce, et donc la spécificité d'hybridation. L'amorce SEQ ID NO: 8 est commune aux différents allèles du gène CCoAOMT2 ; elle est située juste avant le codon stop de ce gène .
La position des amorces SEQ ID NO: 7 et 8 est indiquée sur la Figure 2. Ce couple d'amorces amplifie l'allèle de séquence
SEQ ID NO: 3, sans amplifier l'allèle de référence défini par la séquence SEQ ID NO: 1.
La présente invention a également pour objet des amorces oligonucléotidiques utilisables pour la mise en œuvre des méthodes de détection définies ci-dessus.
En particulier la présente invention a pour objet : tout couple d'amorces permettant l'amplification d'une région du gène CCOAOMT2 comprenant au moins l'un des polymorphismes mentionnés ci-dessus ; à titre d'exemple, on citera le couple d'amorces défini par les séquences SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6.
- tout couple d'amorces dont au moins une amorce représente un fragment d'au moins 10 pb, de préférence au moins 15 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 20 pb, du polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 3, comprenant au moins l'un des polymorphismes mentionnés ci-dessus, ou le complémentaire dudit fragment ; à titre d'exemple, on citera le couple d'amorces défini par les séquences SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8.
L'invention a également pour objet un procédé pour identifier une plante fourragère, et notamment un maïs, comprenant un allèle de CCoAOMT2 favorable à la digestibilité, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence, dans un échantillon issu de ladite plante, d'une CCoAOMT-2 mutante telle que définie ci-dessus.
La détection d'une CCoAOMT-2 mutante conforme à l'invention peut s'effectuer par exemple, à l'aide d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant sélectivement ladite protéine, c'est à dire ne présentant pas de réactions croisées avec d'autres protéines de maïs, et notamment ne présentant pas de réactions croisées avec la CCoAOMT-2 de type sauvage ou avec la CCoAOMT-1.
Ces anticorps, qui font également partie de l'objet de l'invention, peuvent être obtenus facilement par les méthodes classiques de préparation d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, en immunisant un animal avec une CCoAOMT-2 mutante conforme à l'invention, ou un fragment de celle-ci portant au moins une des mutations identifiées ci- dessus, et notamment un fragment portant au moins la mutation a) et/ou la mutation b) , et en sélectionnant, parmi les anticorps obtenus, ceux qui, dans les mêmes conditions réactionnelles, forment un complexe anticorps/antigène détectable avec une CCoAOMT-2 mutante conforme à l'invention, mais pas avec d'autres protéines de maïs, et notamment la CCoAOMT-2 de type sauvage ou la CCoAOMT-1.
Les anticorps conformes à l'invention peuvent éventuellement être marqués, afin de permettre la révélation du complexe anticorps/antigène.
La présente invention a également pour objets des kits pour la mise en œuvre d'un procédé conforme à l'invention, de détection d'un allèle de CCoAOMT2 favorable à la digestibilité. Ces kits comprennent, outre un ou plusieurs réactifs conformes à l'invention (notamment anticorps, sonde polynucléotidique ou amorces) des moyens appropriés pour la mise en œuvre de la réaction utilisée pour la détection, et/ou des moyens appropriés pour la révélation du produit de cette réaction.
A titre d'exemple, on citera :
Des kits comprenant au moins une sonde polynucléotidique conforme à l'invention, éventuellement associée à des réactifs permettant la mise en œuvre d'une réaction d'hybridation, à des moyens de détection de l'hybride formé, et/ou à des témoins positifs et/ou des témoins négatifs d'hybridation ; Des kits comprenant au moins un couple d'amorces conforme à l'invention, éventuellement associé à des réactifs permettant la mise en œuvre d'une réaction d'amplification, à des moyens de détection du produit d'amplification, et/ou à des témoins positifs et/ou des témoins négatifs d'amplification ;
Des kits comprenant au moins un anticorps conforme à l'invention, éventuellement associé à des réactifs permettant la mise en œuvre d'une réaction anticorps/antigène, à des moyens de détection d'un complexe anticorps/antigène, et/ou à des témoins positifs et/ou des témoins négatifs de réaction.
Ces kits peuvent comprendre, outre les réactifs conformes à l'invention permettant la détection d'un allèle de CCoA0MT2 favorable à la digestibilité, d'autres réactifs permettant la détection d'autres caractères agronomiques d' intérêt .
La présente invention peut être mise en œuvre dans le cadre de la sélection de plantes, notamment de mais, possédant une digestibilité améliorée.
Elle présente un intérêt tout particulier dans le cadre de la sélection assistée par marqueurs (SAM) . Cette méthode de sélection est bien plus efficace qu'une simple évaluation phénotypique puisque tous les loci correspondant à différents caractères d'intérêt peuvent être analysés ensemble sur un seul échantillon d'ADN, indépendamment des conditions de culture de la plante d'où est issu l'échantillon. La sélection assistée par marqueurs permet de mettre en œuvre les techniques de rétrocroisements accélérés consistant à utiliser la liaison existant entre un marqueur moléculaire et un gène d'intérêt agronomique, en l'occurrence codant pour la CCoAOMT-2, pour transférer celui-ci dans différents génotypes afin de leur apporter une digestibilité accrue . La présente invention peut également être mise en œuvre pour suivre l'intégration d'un allèle du gène CCoAOMTΣ favorable à la digestibilité, par exemple dans le cadre de techniques d' introgression par croisements successifs entre plantes présentant cet allèle.
La présente invention peut également être utilisée dans le cadre d'études phylogénétiques, de la caracterisation de relations génétiques parmi les variétés végétales, de l'identification de croisements ou d'hybridations somatiques, de la localisation de segments chromosomiques affectant les caractères monogéniques, du clonage basé sur les cartes génétiques, et de l'identification de QTL et/ou de PQL.
Les polynucléotides conformes à l'invention, et notamment le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 3, ou leurs fragments comprenant au moins l'un des polymorphismes définis ci-dessus peuvent également être utilisés pour la production, sous forme recombinante, de CCoAOMT-2 mutante conforme à l'invention, ou de fragments de celle-ci, ainsi que pour améliorer la digestibilité de plantes fourragères, en particulier de monocotylédones, et notamment du maïs, par l'expression dans lesdites plantes d'une CCoAOMT-2 mutante conforme à l'invention.
La présente invention a ainsi pour objet : une cassette d'expression recombinante comprenant un polynucléotide conforme à l'invention ou un fragment de celui-ci, comprenant au moins l'un des polymorphismes définis ci-dessus placé sous contrôle de séquences hétérologues de régulation de la transcription et de la traduction (notamment promoteur et terminateur de transcription) . un vecteur recombinant résultant de l'insertion, dans un vecteur-hôte approprié, d'un polynucléotide conforme à l'invention ou d'un fragment de celui-ci, comprenant au moins l'un des polymorphismes définis ci-dessus, ou d'une cassette d'expression conforme à l' invention. La présente invention englobe également un procédé de production d'un polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une cellule hôte, procaryote ou eucaryote, par une séquence polynucléotidique codant pour une CCoAOMT-2 mutante conforme à l'invention, ou pour un fragment de celle-ci comprenant au moins l'une des mutations identifiées ci-dessus, et la récupération de ladite CCoAOMT-2 mutante ou dudit fragment produits par ladite cellule.
La présente invention englobe aussi des cellules- hôtes génétiquement transformées par un polynucléotide conforme à l'invention.
Les cellules hôtes peuvent être des cellules eucaryotes ou procaryotes . A titre d'exemples on citera des bactéries, notamment E. coli ou Agrobacterium, des levures, par exemple Saccharomyces , des cellules animales ou, préférentiellement , des cellules végétales.
La présente invention englobe également des plantes transgéniques génétiquement transformées par un polynucléotide conforme à l'invention. Il s'agit préférentiellement de monocotylédones, et en particulier du maïs.
Les techniques classiques de construction de vecteurs recombinants, de transformation de cellules ou d'organismes hôte, et de production de protéines recombinantes, sont utilisables pour la mise en œuvre de la présente invention.
Le choix du vecteur-hôte, et des séquences de régulation de l'expression seront effectuées en fonction de la cellule hôte ou de l'organisme hôte choisi et de l'application envisagée.
Par exemple, pour la production de polypeptides recombinants, on utilise fréquemment des cellules hôtes de bactéries, notamment E. coli ou de levures notamment
Saccharomyces cerevisiae : de nombreux systèmes d'expression dans l'un ou l'autre de ces deux organismes sont connus en eux-mêmes et disponibles dans le commerce.
Pour l'expression dans des cellules végétales ou des plantes on pourra utiliser le promoteur endogène du gène CCoAOMT2 .
On peut également utiliser un promoteur hétérologue ; de très nombreux promoteurs utilisables pour la transformation de cellules végétales sont connus en eux- mêmes. A titre d'exemples, on citera : des promoteurs constitutifs, tels que le promoteur 35S de CaMV, ou ses dérivés, ou le promoteur de 1 ' ubiquitine ; des promoteurs inductibles, par exemple le promoteur Hsp70 qui est inductible par un choc thermique ; - des promoteurs tissu-spécifiques. Parmi les terminateurs de transcription pouvant être utilisés, on citera notamment le terminateur polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, ou le terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d' Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline. La transformation de cellules végétales peut être réalisée par diverses méthodes telles que, par exemple, le transfert du polynucléotide d'intérêt dans les protoplastes végétaux après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol en présence de cations divalents (Ca 2+) , l' électroporation (FROMM et al . , Proc . Nat . Acad. Sci . , 82, 5824, 1985), l'utilisation d'un canon à particules, notamment selon la méthode décrite par FINER et al . (Plant Cell Report, 11, 323-328, 1992) , ou la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire (NEUHAUS et al . , Theor. Appl . Genêt., 75(1), 30-36, 1987).
On peut aussi infecter les cellules végétales par un hôte cellulaire bactérien comprenant le vecteur contenant la séquence d'intérêt. L'hôte cellulaire peut être Agrobacterium tumefaciens (AN et al . , Plant Physiol., 81, 86- 91, 1986), ou A. rhizogenes (GUERCHE et al . , Mol. Gen. Genêt., 206, 382, 1987). Dans ce cas, de manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'A. tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al . , ADN recombinant, Ed. De Boeck Université, 273-292, 1994) . Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Ce plasmide est maintenu dans Agrobacteriu-m.
Pour la transformation des monocotylédones, en particulier le maïs on pourra appliquer avantageusement la méthode décrite par ISHIDA et al . (Nature Biotechnology, 14, 745-750, 1996) .
La transformation génétique de plantes par un polynucléotide codant pour une CCoAOMT-2 mutante conforme à l'invention permet l'obtention de plantes transgéniques, et notamment de maïs, possédant une digestibilité accrue.
Il est toutefois nécessaire que l'allèle présent naturellement dans la plante soit inactivë. L' inactivation de cet allèle peut être obtenue par exemple par insertion dans le gène CCoAOMT2 (préférentiellement dans la région codante) d'un ADN-T ou tout autre élément transposable .
La présente invention a ainsi plus particulièrement pour objet un procédé de production de mais transgénique présentant un taux de digestibilité accru, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l' inactivation de l'allèle naturel du gène
CCoAOMT2 de la plante à transformer ; b) la transformation génétique de la plante résultant de l'étape a) par un polynucléotide codant pour une CCoAOMT-2 mutante conforme à l'invention. Alternativement, des maïs possédant une digestibilité accrue peuvent être obtenus par mutagenèse dirigée, afin d'introduire dans l'allèle naturel du gène CCoAOMT2 les modifications nécessaires pour l'expression d'une CCoAOMT-2 mutante conforme à l'invention. Des méthodes de mutagenèse dirigée utilisables dans le cadre de la présente invention sont connues en elles- mêmes de l'homme du métier ; elles sont par exemples décrites dans l'ouvrage de D. TAGU (eds INRA 1999). Avantageusement, à l'issue de la transgénèse ou de la mutagenèse dirigée, les plantes contenant le gène codant pour une CCoAOMT-2 mutante conforme à l'invention pourront être sélectionnées par détection de ce gène en utilisant l'un des procédés de détection conformes à l'invention décrits ci-dessus.
L' invention concerne également les plantes transformées obtenues par un procédé de transgénèse ou de mutagenèse dirigée conforme à l'invention, ainsi que les descendants de ces plantes. L'invention englobe également les produits obtenus à partir de ces plantes, tels qu'organes ou tissus végétaux, cellules, semences etc.
Enfin, l'invention concerne également les produits dérivés, et notamment le fourrage, obtenus à partir de ces plantes.
Des allèles du gène CCoA0MT2 favorables à la digestibilité, et contenant des polymorphismes différents de ceux identifiés dans l'allèle SEQ ID NO: 3 peuvent être identifiés à partir de lignées de mais à digestibilité élevée, et produisant des lignines possédant un rapport S/G plus élevé que celui des lignines issues des variétés classiques de maïs d'ensilage. Les allèles de CCoA0MT2 présents dans ces lignées peuvent être isolés et séquences et leurs séquences comparées avec celle du gène CCoAOMT2 de type sauvage, afin de détecter les polymorphismes associés à ces allèles. Des polynucléotides reproduisant la séquence de ces allèles, ainsi que des CCoAOMT-2 mutantes produites par ceux ci peuvent être utilisés dans toutes les applications décrites ci-dessus. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de mise en œuvre de méthodes de détection d'un allèle du gène CCoAOMT2 favorable à la digestibilité, et d'utilisation de cet allèle pour l'obtention de plantes transgéniques. EXEMPLE 1 : MISE AU POINT D'UN TEST DE DETECTION D'UN MARQUEUR POLYMORPHIQUE ASSOCIE A LA DIGESTIBILITE.
Les 9 lignées suivantes de maïs (classées par ordre de digestibilité décroissante) ont été testées pour rechercher la présence de l'un des marqueurs polymorphiques identifiés sur la séquence SEQ ID NO: 3.
Lignées F4 > A>B>C>D>E>F>G
La lignée F4 est celle à partir de laquelle a été obtenu l'allèle SEQ ID NO: 3. Amorces utilisées
Le marqueur choisi est la délétion de 9 nucléotides comprise entre les nucléotides 86 et 87 de la séquence SEQ ID NO: 3 ce qui correspond aux nucléotides 81 à 91 de la séquence SEQ ID NO: 1. 2 couples d'amorces ont été définis :
Le premier est destiné à permettre une amplification sélective de l'allèle portant la délétion recherchée. Si cet allèle n'est pas présent dans l'échantillon, aucune amplification n'est observée. Le deuxième encadre l'emplacement de la délétion recherchée. La présence ou l'absence d'un allèle portant cette délétion sont détectées par la taille du produit d' amplification.
Le premier couple d'amorces comprend : - une amorce sens sélective, située à cheval sur l'emplacement de la délétion. Cette séquence est représentée par la séquence SEQ ID NO: 7 ; les 4 premières bases de cette séquence correspondent à des bases supplémentaires ajoutées pour augmenter la température de fusion de l'amorce et donc augmenter la spécificité de la PCR ; une amorce antisens, non-sélective : Cette amorce, située immédiatement avant le codon stop du gène, est commune aux différents allèles du gène CCoAOM 2. Sa séquence est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 8. Le second couple d'amorces comprend une amorce sens définie par la séquence SEQ ID NO: 5 et une amorce antisens définie par la séquence SEQ ID NO: 6. Chacun de ces couples d'amorces a été testé sur du matériel génétique obtenu à partir des lignées E, D, F, G et F4 (30 ng d'ADN génomique de chaque lignée) .
Amplification par le couple d'amorces SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8
La PCR est effectuée dans un volume de 50 μl de mélange ayant la composition suivante :
Matrice : 30 ng ADN génomique amorces : 0,2 μM de chaque dNTPs : 200 μM de chaque
Tampon : 5 μl de tampon 10 X contenant 100 mM de tris-HCl, 500 mM Kcl, 15 mM MgCl2 et 0,01% de gélatine pH : 8,3
Polymérase : REDTaq GENOMIC DNA POLYMERASE (SIGMA) . 2,5 Unités de polymérase sont ajoutées aux 50 μl de mélange réactionnel.
Conditions d'amplification : 5 min 95°C
33 cycles :
Figure imgf000024_0001
5 min à 72°C Pour obtenir des témoins positifs d'amplification, on utilise le couple d'amorces suivant, qui amplifie le gène CCoAOMT2 pour toutes les lignées, avec une efficacité moindre d'amplification pour la lignée F4, car une partie de l'amorce sens recouvre la zone délétée dans cette lignée) : Amorce sens :
GCG ACC GAG GCG ACC AAG ACG (SEQ ID NO: 9) correspondant aux positions 83 à 103 de la séquence SEQ ID NO: 1. Amorce antisens :
CTT GAC GCG GCG GCA GAG CGT GAC GCC GTC GC (SEQ ID NO: 8) 25 μl du produit de la réaction PCR sont déposés sur mini gel d'agarose (1%) additionné de bromure d'éthidium. La migration est effectuée à 100 volts pendant 15 à 20 minutes.
Les résultats sont illustrés par la Figure 3 : Les 5 premiers dépôts correspondent aux amplifications obtenues avec le couple d'amorces SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 sur les lignées (de gauche à droite) G (piste 1), F (piste 2), E (piste 3), D (piste 4) et F4 (piste 5).
Le dépôt central (piste 6) correspond au marqueur de taille moléculaire de 1 kb. Les 5 derniers dépôts correspondent aux témoins positifs, obtenus avec le couple d'amorces témoin SEQ ID
NO: 9 et SEQ ID NO: 8 : lignées G (piste 7) , F (piste 8) , E
(piste 9) , D (piste 10) et F4 (piste 11) .
La lignée F4 se caractérise par une bande nette d'environ 1 kb, correspondant au produit d'amplification obtenu avec les amorces SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8. Pour les autres lignées, et avec ces mêmes amorces soit aucune bande n'apparaît à ce niveau, soit les bandes ont une intensité très faible. D'autres expérimentations ont été effectuées en utilisant une température d'hybridation des amorces variant de 66°C à 68°C. La même spécificité d'amplification a été observée pour le couple d'amorces SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8. Amplification par le couple d'amorces SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6
Le couple d'amorces définies par les séquences SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6 a été testé sur les lignées E, D, F, G et F4. Le milieu réactionnel est le même que celui utilisé ci-dessus mais le volume réactionnel est doublé soit 100 μl afin de pouvoir déposer 70 μl du produit PCR sur un gel agarose -métaphore (TEBU) à 4% additionné de bromure d'éthidium. Ce gel possède une forte capacité de résolution, permettant de mettre en évidence une différence de taille de 4 bp pour des fragments d'ADN dont la taille est comprise entre 200 et 16 pb. Cycle :
5 min 95°C
30 cycles : 30 s 95°C
30 s à 65°C 30 s à 72 °C
5 min à 72°C
La migration se déroule pendant 4 h à 90 V. Les résultats sont illustrés par la Figure 4. Le premier dépôt (piste 1) correspond au marqueur de taille moléculaire de 100 pb.
Les 5 dépôts suivants correspondent au produits d'amplification des lignées D (piste 2), G (piste 3), F (piste 4) , E (piste 5) , F4 (piste 6) .
Ces résultats montrent que l'amplifiât obtenu à partir de la lignée F4 est plus petit que celui obtenu à partir des autres lignées. Le couple d'amorces utilisé est donc bien distinctif du polymorphisme recherché.
EXEMPLE 2 : TRANSFORMATION DE PLANTES PAR UN ALLELE DU GENE CCOAOMT2 FAVORABLE A LA DIGESTIBILITE La lignée F4 de maïs, qui présente une digestibilité importante, a été utilisée comme matériel de départ .
Le gène CCoAOMT2 a été obtenu à partir d'ADNc extrait de cette lignée par amplification PCR, à l'aide des amorces SEQ ID NO: 8 et SEQ ID NO: 9.
Le clonage des fragments PCR obtenus correspondant à la région codante de la CCoAOMT-2 a été réalisé à l'aide du système PGEM-T EASY vector selon les instructions du fournisseur (PROMEGA) . Le fragment PCR est ligaturé dans le Vecteur pGEM-T EASY (PROMEGA) . Les bactéries compétentes E. coli JM109 (commercialisées par PROMEGA) sont transformées à l'aide de cette construction.
Transformation des cellules végétales par Agrobacterium tume-facie-ns
La technique de transformation décrite par ISHIDA et al . (1996, précité) est utilisée à partir d'embryons immatures de 10 jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont décrits dans cette publication.
On construit un vecteur superbinaire par recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire (pBSll ou pBS12) portant un marqueur de résistance, et dans lequel a été préalablement inséré le gène CCoAOMT2 mutant excisé du vecteur pGEM-T EASY, et le vecteur pSBl de JAPAN TOBACCO
(EP 672 752) qui contient : les gènes virB et virG du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281 d 'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) . Les vecteurs pBSll, pBS12, et pSBl sont décrits dans la Demande EP 672 752 au nom de JAPAN TOBACCO.
La transformation s'effectue par mise en contact des embryons immatures des plantes de maïs pendant au moins 5 minutes avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant le vecteur superbinaire.
Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25°C. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés : les cals embryogenes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg/1 et de la céfotaxime à 250 mg/1
(élimination ou limitation de la contamination par
Agrobacterium tumefaciens) . Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25°C. La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSD5, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à
10 mg/1) en présence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type I (fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à
25°C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime.
La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type I qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/1 et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22 °C et sous lumière continue.
Les plantules régénérées sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100 mg/1 d'AUGMENTIN® pendant 2 semaines à 22 °C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.
Transformation des cellules végétales par bombardement Des cals âgés de 2 mois, obtenus après la mise en culture d'embryons immatures sur un milieu de callogénèse sont utilisés pour la transformation.
Un traitement plasmolysant permet de réduire le volume de la vacuole et limite ainsi les éclatements cellulaires lors du tir (prétraitement de 4 heures et un post-traitement de 16 heures sur un milieu Sorbitol 0.2M et
Mannitol 0,2 M) .
Le matériel végétal est réparti de façon homogène sur l'ensemble de chacune des boîtes. 15 mg de microbilles de tungstène stériles sont mélangées dans 150 μl d'eau stérilisée par microfiltration.
Le gène CCoAOMT2 mutant est inséré dans un plasmide pDM302 portant un marqueur de sélection.
Pour 5 tirs, le mélange suivant est préparé : 25 μl de microbilles de tungstène,
2,5 μl d'ADN du plasmide portant le gène d'intérêt (à 1 μg/μl) ,
2,5 μl d'ADN (à 1 μg/μl) du plasmide portant le gène CCoAOMT2 et le marqueur de sélection, 25 μl de CaCl2 à 2,5 M,
10 μl de spermidine à 0,1 M.
Ce mélange est laissé à décanter dans la glace pendant au moins 5 minutes .
Cinq boîtes de Pétri contenant le matériel à bombarder sont placées sur des boîtes Agar à 15 g/L .
50 μl de surnageant du tube décanté sont éliminés et le mélange restant est vortexé, puis 2 μl de celui-ci sont déposés sur la grille de la seringue stérile, qui est vissée sur le support dans le canon. Un filtre de gaze stérile est placé sur la boîte de Pétri qui est disposée à 19 cm dans l'enceinte du canon. Le vide est poussé à l'intérieur de l'enceinte à la pression de 25 bars
Le tir est déclenché. La pression de l'hélium dans le canon est de 8 bars. Le matériel végétal bombardé est remis sur sa boîte de Pétri d'origine (Mannitol/Sorbitol) . Les boîtes sont placées à 26°C et à l'obscurité pendant 16 heures pour un traitement plasmolysant post-bombardement (mannitol/sorbitol) .
La pression de sélection est appliquée 16 heures après le tir et est maintenue à la même concentration de l'agent sélectif (BIALAPHOS à 5 mg/L) pendant toutes les étapes de régénération. Les plantules sont ensuite repiquées dans du terreau (petits pots) pendant 1 semaine puis transférées en pots de 20 litres (mélange tourbe-poudzolane) dans la serre transgénique ou en chambre climatisée (Température 24°C jour/20°C nuit ; photopériode 16 h jour / 8 h nuit, hygrométrie 80%) . Les plantes sont autofécondées ou croisées .
EXEMPLE 3 : TEST D'ASSOCIATION ENTRE LA DIGESTIBILITE ET LES REPETITIONS DU MOTIF CAACGG
L'alignement multiple de 27 séquences du gène CCoAOMT2 de différentes lignées de maïs a permis de constater que le motif "CAACGG" (inséré entre les nucléotides 129 et 130 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1, correspondant à l'allèle de la lignée F4) pouvait être répété 3 fois, 4 fois ou 6 fois.
La digestibilité de ces variétés a été déterminée. Les résultats sont illustrés par le Tableau I ci- dessous. Tableau I
Figure imgf000030_0001
Ces résultats montrent que la répétition du motif CAACGG est liée à la digestibilité avec une probabilité de 0,037776

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé d'évaluation de la digestibilité d'une plante fourragère, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence ou de l'absence, dans du matériel biologique provenant de ladite plante, d'un allèle favorable à la digestibilité du gène CCoAOMT2.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite plante fourragère est le maïs.
3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2 , caractérisé en ce que ledit allèle favorable à la digestibilité code pour une protéine CCoAOMT-2 mutante présentant par rapport à la protéine CCoAOMT-2 de type sauvage de séquence SEQ ID NO: 2, au moins l'une des mutations suivantes : a) la délétion de la séquence peptidique
Glu-Ala-Thr, située entre les positions 6 et 10 de la séquence SEQ ID NO: 2 ; b) l'insertion d'au moins une copie du motif peptidique Asn-Gly entre les positions 26 et 27 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; c) la substitution du résidu His en position 37 de la séquence SEQ ID NO: 2 par un résidu Arg.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite CCoAOMT-2 mutante comprend au moins la mutation a) et/ou la mutation b) .
5) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la détection de la présence d'un allèle du gène CCoAOMT2 favorable à la digestibilité s'effectue par détection de la forme associée audit allèle d'au moins un polymorphisme dudit gène.
6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit polymorphisme est choisi parmi :
- une insertion de 5 paires de bases, de séquence ACTGC, entre les nucléotides 55 et 56 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ;
- une délétion de 9 paires de bases, entre les nucléotides 81 et 91 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ; - une insertion de 6 ou 18 paires de bases, correspondant à 1 ou 3 répétitions de la séquence CAACGG, entre les nucléotides 129 et 130 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ; - une substitution C —»G en position 178 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ;
- une substitution A — > G en position 180 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ;
- une substitution G— > A en position 227 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ;
- une substitution A —>G en position 237 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ;
- une substitution CG→TT aux positions 259-260 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ; - une substitution A—>G en position 466 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ;
- une insertion de 15 paires de bases, de séquence TGCCCCTTTCTCTCT, entre les nucléotides 631 et 632 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ; - une insertion de 18 paires de bases, de séquence
CTCTCTGTTGCTCGTCCC, entre les nucléotides 703 et 704 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ;
- une délétion de 3 paires de bases, entre les nucléotides 668 et 672 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ; - au moins une substitution C —» T en position 635 ou 648 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ;
- au moins une substitution T —» C en position 638, 672 ou 692 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ;
- une substitution A —» C en position 667 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ;
- une substitution C —» G en position 698 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ;
- une substitution TG —- CC aux positions 664-665 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1 ; - une substitution A —>G en position 904 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1.
7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit polymorphisme est une délétion de 9 paires de bases entre les nucléotides 81 et 91 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1.
8) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit polymorphisme est une insertion de 6 ou 18 paires de bases, correspondant à 1 ou 3 répétitions de la séquence CAACGG, entre les nucléotides 129 et 130 de la séquence de référence SEQ ID NO: 1.
9) Procédé selon une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la détection dudit polymorphisme comprend l'hybridation sélective, avec du matériel génétique issu de ladite plante, d'au moins une sonde polynucléotidique spécifique de la forme dudit polymorphisme présente dans l'allèle de CCoAOMT2 recherché.
10) Procédé selon une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend l'amplification, à partir de matériel génétique issu de ladite plante, du gène CCoA0MT2 ou d'une région de celui-ci comprenant au moins un polymorphisme à détecter, et la détermination de la forme dudit polymorphisme présente dans ladite plante.
11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la forme dudit polymorphisme présente dans ladite plante est déterminée par la taille du produit d' amplification. 12) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la détection de la présence ou de l'absence d'un allèle du gène CCoAOMT2 favorable à la digestibilité s'effectue par détection d'une protéine CCoAOMT-2 mutante présentant par rapport à la protéine CCoAOMT- 2 de type sauvage de séquence SEQ ID NO: 2, au moins l'une des mutations définies dans la revendication 3.
13) Caféoyl Coenzyme A 3-0 mêthyltransférase-2 (CCoAOMT-2) mutante, caractérisée en ce qu'elle diffère de la CCoAOMT-2 de séquence SEQ ID NO: 2 par au moins l'une des mutations suivantes : a) la délétion de la séquence peptidique Glu-Ala-Thr, située entre les positions 6 et 10 de la séquence SEQ ID NO: 2 ; b) l'insertion d'au moins une copie du motif peptidique Asn-Gly entre les positions 26 et 27 de la séquence SEQ ID NO: 2 ; c) la substitution du résidu His en position 37 de la séquence SEQ ID NO: 2 par un résidu Arg ;
14) CCoAOMT-2 mutante selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la mutation a) et/ou la mutation b) .
15) CCoAOMT-2 mutante selon une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce qu'elle répond à la séquence SEQ ID NO: 4. 16) Polynucléotide codant pour une CCoAOMT-2 mutante selon une quelconque des revendications 13 à 15.
17) Polynucléotide selon la revendication 16, caractérisé en ce que sa séquence est choisie parmi ;
-la séquence d'ADN génomique représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 3 ;
- la séquence d'ADNc dérivée de ladite séquence génomique .
18) Polynucléotide choisi parmi : un fragment de plus de 10 pb d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 3, ledit fragment comprenant au moins l'un des polymorphismes définis dans la revendication 6 ;
- le complémentaire dudit fragment .
19) Sonde polynucléotidique pour la mise en œuvre d'un procédé selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comprend un polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 3, ou son complémentaire, ou un polynucléotide selon la revendication 18.
20) Couple d'amorces pour la mise en œuvre d'un procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une amorce comprenant un polynucléotide selon la revendication 18. 21) Couple d'amorces selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : un couple d'amorces constitué par les oligonucléotides de séquence SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8. - un couple d'amorces constitué par les oligonucléotides SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6.
22) Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 18 pour la détection d'un allèle du gène CCoAOMT2 du mais favorable à la digestibilité. 23) Anticorps reconnaissant sélectivement une protéine CCoAOMT-2 mutante selon une quelconque des revendications 13 à 15, ou un fragment de celle-ci comprenant au moins une des mutations définies dans la revendication 13.
24) Cassette d'expression recombinante comprenant un polynucléotide selon une quelconque des revendications 16 à 18.
25) Vecteur recombinant résultant de l'insertion d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 16 à 18, ou d'une cassette d'expression selon la revendication 24, dans un vecteur-hôte.
26) Procédé de production d'un polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une cellule hôte, procaryote ou eucaryote, par un polynucléotide codant pour une CCoAOMT-2 mutante selon une quelconque des revendications 13 à 15, ou pour un fragment de celle-ci comprenant au moins l'une des mutations définies dans la revendication 13, et la récupération de ladite CCoAOMT-2 mutante ou dudit fragment produits par ladite cellule. 27) Cellule génétiquement transformée par un polynucléotide selon une quelconque des revendications 16 à 18.
28) Cellule selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule végétale. 29) Procédé de production d'une plante fourragère transgénique présentant un taux de digestibilité accru, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l' inactivation de l'allèle naturel du gène CCOA0MT2 de la plante à transformer ; b) la transformation génétique de la plante résultant de l'étape a) par un polynucléotide selon une quelconque des revendications 16 à 17.
30) Procédé de production d'une plante fourragère présentant un taux de digestibilité accru, caractérisé en ce qu'il comprend la mutagenèse dirigée de l'allèle du gène CCoAOMT2 présent dans la plante à transformer pour obtenir un allèle du gène CCoAOMT2 ayant la séquence d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 16 à 17.
31) Plante génétiquement transformée par un polynucléotide selon une quelconque des revendications 16 à 17.
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