FR2946661A1

FR2946661A1 - Obtention de plantes a teneur reduite en lignines

Info

Publication number: FR2946661A1
Application number: FR0902812A
Authority: FR
Inventors: Lise Jouanin; Serge Berthet; Catherine Lapierre
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Genoplante Valor SAS
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Genoplante Valor SAS
Priority date: 2009-06-10
Filing date: 2009-06-10
Publication date: 2010-12-17
Anticipated expiration: 2029-06-10
Also published as: CA2765211A1; EP2440665A1; US20120192312A1; AU2010258280A1; FR2946661B1; WO2010143154A1

Abstract

La présente invention concerne l'obtention de plantes présentant une teneur réduite en lignines et dont la cellulolyse des parois est augmentée, par inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité dans ladite plante, d'une ou de deux laccases.

Description

OBTENTION DE PLANTES A TENEUR REDUITE EN LIGNINES

La présente invention concerne un procédé de sélection ou d'obtention de plantes présentant une teneur 5 en lignines réduite. Les lignines sont des polymères insolubles situés dans les parois végétales et issus de la polymérisation de 3 monomères phénoliques (ou monolignols), dérivant de la voie des phénylpropanoïdes (NEISH, 10 Constitution and Biosynthesis of Lignin, eds New York: Springer Verlag, 1-43, 1968). Leur voie de biosynthèse est complexe et comporte différentes étapes dont une partie est réalisée dans le cytoplasme (synthèse des monolignols) et une autre dans la paroi (polymérisation). Les alcools p- 15 coumarylique, coniférylique et sinapylique sont les précurseurs respectifs des unités p-hydroxyphényles (H), guaïacyles (G) et syringyles (S) constituant les lignines. Ces précurseurs sont oxydés en radicaux phénoliques qui se couplent spontanément par diverses liaisons, ce qui conduit 20 à la formation des lignines. Parmi les liaisons inter-unités, on distingue des liaisons labiles, nommées R-0-4 et des liaisons résistantes. Lors de la polymérisation, d'autres liaisons peuvent également s'établir avec d'autres composés pariétaux (polysaccharides et protéines) pour 25 former un réseau tridimensionnel complexe. La formation des radicaux phénoliques serait catalysée par des oxydases, telles que des péroxydases, des laccases ou d'autres oxydases. Un nombre important de ces enzymes en association avec des protéines de régulation serait nécessaire à 30 l'assemblage des unités H, G et S (BOUDET, Plant Physiol. Biochem., 38, 81-96, 2000 ; voir pour revue : RALPH et al., Lignins, Encyclopedia of Life Sciences, John Wiley & Sons, 2007). Toutefois ces enzymes sont encore mal identifiées car appartenant à des familles multigéniques (BARRIERE et 35 al., Genes, Genomes and Genomics ; Global Siences Books, 2007, Review).

Bien que les mécanismes impliqués in vivo dans la biosynthèse des lignines ne soient pas complètement élucidés, il est généralement considéré que les laccases pourraient intervenir dans les premières étapes de polymérisation, pour la formation de dimères ou trimères, tandis que les péroxydases permettraient d'obtenir un degré de polymérisation supérieur à partir des dimères et trimères (ROS BARCELO, International Review of Cytology, 176, 87-132, 1997).

La teneur en lignines des plantes a une influence majeure sur leurs utilisations industrielles. Par exemple, elle affecte la valeur nutritive des plantes destinées à l'alimentation animale, ainsi que les performances des procédés papetiers (rendement et qualité de la pâte à papier obtenue) et le rendement de production de biocarburant. En effet : - une composante importante de la valeur nutritionnelle des plantes fourragères, telles que le maïs fourrager, est la digestibilité. Ainsi, des vaches nourries avec des variétés plus digestibles présentent une augmentation de la production de lait et une meilleure prise de poids. En outre, ces variétés plus digestibles permettent aux animaux d'atteindre leur potentiel avec un plus faible niveau de complémentation, ce qui permet en particulier de réduire les coûts de production. Un facteur important limitant la digestibilité des plantes fourragères est lié à la présence, dans les parois des cellules végétales, de lignines : les lignines établissent différents types de liaisons avec les autres constituants pariétaux (dont les polysaccharides) et gènent l'accessibilité des enzymes digestives aux polysaccharides (glucides), principales sources d'énergie pour les herbivores ; - l'essentiel de la pâte à papier est obtenu par délignification chimique du bois, afin d'isoler les fibres végétales constituées principalement de cellulose et liées en elles par les lignines. Cependant, cette étape de délignification est très exigente en énergie et en réactifs (acides notamment), en raison de la résistance des lignines aux dégradations chimiques. Dans le cas de la production de pâte à papier par voie thermo-mécanique, les lignines qui ne sont pas éliminées sont responsables du photojaunissement du papier. Les lignines riches en unités S sont plus sensibles aux procédés papetiers de délignification dans la mesure où les unités S sont surtout liées par liaisons a-0-4 (liaisons cibles de ces procédés).

En conséquence, dans le cas des bois de feuillus employés par les industies papetières, une plus forte teneur en unités S liées en R-O-4 est recherchée dans le secteur papetier pour améliorer le rendement de la cuisson papetière (GUERRA et al., Ind. Eng. Chem. Res., 47, 8542- 8549, 2008) ; - les biocarburants sont formés à partir de bioéthanol (un produit miscible à l'essence) ou d'huile (pour fabriquer un produit diesel). La production de bioéthanol, réalisée actuellement à partir d'amidon ou de saccharose, pourrait aussi s'effectuer à partir de la cellulose du bois ou de la paille. Dans ce cas, le procédé de production comprend les étapes suivantes : prétraitement acide de la matière première pour rompre les interactions entre lignines et polysaccharides (ce prétraitement facilite l'action d'enzymes hydrolytiques qui transforment les polysaccharides de la paroi en sucres simples), suivi d'une étape de fermentation des sucres simples, conduisant à la production de bioéthanol. Cependant, le prétraitement acide initial entraîne la production de composés capables d'inhiber l'étape de fermentation. Il a donc été suggéré qu'en modifiant les lignines, les polysaccharides pariétaux seraient plus accessibles aux enzymes hydrolytiques. Cela permettrait non seulement de supprimer ou limiter le prétraitement acide et les problèmes associés d'inhibition de la fermentation, mais aussi de diminuer les impacts environnementaux liés aux résidus des traitements par l'acide.

4 Dans ce contexte, la modification quantitative des lignines dans les plantes fait l'objet de nombreuses recherches. La modification qualitative des lignines (modification de leur structure ou de leurs interactions avec les autres polymères des parois) est également très étudiée. Par exemple, des lignines riches en unités S et en liaisons R-0-4 sont beaucoup plus faciles à éliminer lors de la production de pâte à papier par voie chimique. Une des voies privilégiées pour diminuer la teneur en lignines dans les plantes concerne la production par génie génétique de plantes. Il a ainsi été proposé d'agir sur les enzymes de la voie de biosynthèse des lignines, telles que les laccases (Demande Internationale WO 97/45549), les péroxydases (Demande Internationale WO 2004/080202) la Cinnamoyl CoA réductase (CCR ; Demandes Internationales WO 97/12982 et WO 98/39454), l'acide caféique 0-méthyltransférase (COMT ; Demande Internationale WO 94/23044 ; OBA et ALLEN, J. Dairy Sci., 82, 135-142, 1999), la Caféoyl Coenzyme A 3-0 méthyltransférase (CCoAOMT ; Demande EP 0516958 ; GUO et al., Transgenic Res. 10, 457-464, 2001), la Cinnamyl alcool déshydrogénase (CAD ; LAPIERRE et al., Plant Physiol., 119, 153-164, 1999), et la 4-coumarate:coenzyme A ligase (4CL ; HU et al., Nat. Biotech. 17, 808-812, 1999).

En ce qui concerne plus particulièrement les laccases, la Demande Internationale WO 97/45549 décrit une laccase de tabac (dont la séquence est par ailleurs décrite par KIEFER-MAYER et al., Gene, 178, 205-207, 1996), et propose d'augmenter ou de réduire la quantité de lignines produite par une plante en surexprimant ladite laccase (ou une protéine présentant au moins 50% d'acides aminés homologues à ceux de ladite laccase), ou en inhibant son expression. Chez Arabidopsis thaliana, la famille multigénique des laccases comporte 17 membres, dont 7 sont exprimés au niveau des tiges, l'organe le plus lignifié. Les gènes les plus fortement exprimés sont LAC4 (At2g38080), LAC17 (At5g60020) et LAC2 (At2g29130). Les gènes LAC2 et LAC17 appartiennent à la même sous-classe et le gène LAC4 appartient à une sous-classe proche selon les arbres phylogénétiques publiés par Pourcel et al. (Plant 5 Cell, 17, 2966-2980, 2005) et Caparros-Ruiz et al. (Plant Science, 171, 217-225, 2006). Le gène LAC17 code pour la protéine LAC17 (AtLAC17), dont la séquence est disponible sous le numéro d'accession NM 125395 dans la base de données GENBANK, et est également reproduite dans la liste de séquences en annexe sous l'identifiant SEQ ID NO : 2. Le gène LAC4 code pour la protéine LAC4 (AtLAC4), dont la séquence est disponible sous le numéro d'accession NM 129364 dans la base de données GENBANK, et est également reproduite dans la liste de séquences en annexe sous l'identifiant SEQ ID NO : 4. Le gène LAC2 code pour la protéine LAC2 (AtLAC2), dont la séquence est disponible sous le numéro d'accession NM 128470 (GI:186503951) dans la base de données GENBANK. Ils ont ainsi mis en évidence que les protéines orthologues de la protéine AtLAC17 présentent au moins 60% d'identité ou au moins 75% de similarité avec celle-ci et comprennent, de l'extrémité N-terminale vers la l'extrémité C-terminale, 4 domaines peptidiques consensus de séquence : • H-W-H-G-I/V-R-Q-L (SEQ ID NO : 12 ; acides aminés correspondant aux positions 80-87 de la séquence peptidique d'AtLAC17), • I/V-N-A-A-L-N-D-E-L-F-F (SEQ ID NO : 13 ; acides aminés correspondant aux positions 223-233) de la séquence peptidique d'AtLAC17), • E-S-H-P-L-H-L-H-G-F/Y-N/D-F-F-V-V-G-Q-G-F/Y-G-N-F/Y-D (SEQ ID NO : 14 ; acides aminés correspondant aux positions 476-498 de la séquence peptidique d'AtLAC17) et • A-D-N-P-G-V-W (SEQ ID NO : 15 ; acides aminés correspondant aux positions 539-546 de la séquence peptidique d'AtLAC17) respectivement.

6 A titres d'exemples non-limitatifs d'orthologues de la protéine LAC17 d'A. thaliana, on citera notamment les laccases de maïs (Zea mays) SEQ ID NO : 5 et 6 (séquences également disponibles sous les numéros d'accession NM 001112405.1 et EU957078 dans la base de données GENBANK), ainsi que celle de la canne à sucre (Saccharum officinarum) SEQ ID NO : 7, et celle du sorgho (Sorghum bicolor) SEQ ID NO : 8, 9, 10 et 11. La protéine LAC17 présente 55,2% d'identité avec la protéine LAC4, et 67,1% d'identité avec la protéine LAC2 mais cette dernière ne comprend pas le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 14, et 54,6% d'identité avec la laccase de tabac décrite dans la Demande Internationale WO 97/45549 ; la protéine LAC4 présente 54,0% d'identité avec la protéine LAC2 et 75,8 d'identité avec la laccase de tabac décrite dans la Demande Internationale WO 97/45549 (il apparait que ladite laccase de tabac est l'orthologue de la protéine AtLAC4) , les pourcentages d'identité étant calculés sur toute la longueur des séquences à l'aide du programme needle (NEEDLEMAN et WUNSCH, J. Mol. Biol., 48, 443-453, 1970) en utilisant les paramètres par défaut : Matrix EBLOSUM62, Gap penalty : 10,0 et Extend penalty 0,5.

Des lignées d'A. thaliana de la collection SALK dans l'accession ColO (Columbia) présentant des insertions d'ADN-T au niveau des gènes LAC17 (lignée SALK 016748), LAC4 (lignée SALK 051892) et LAC2 (lignée SALK 025690) ont été identifiées. Les mutants lac4 et lac2 ont notamment été décrits par BROWN et al. (Plant Cell, 17, 2281-2295, 2005). Ces mutants présentent une expression du gène muté fortement réduite ou nulle mais ne présentent pas de phénotype particulier en serre. Les Inventeurs ont recherché si ces mutations avaient un effet sur la quantité de lignines des plantes mutées, et leurs propriétés qualitatives (structurales). Ils ont constaté que le mutant lac2 ne présentait pas de

7 différence notable par rapport à la lignée sauvage ColO, mais qu'en revanche, les mutants lac4 et lac17 contenaient une quantité de lignines (déterminée sur des tiges sèches matures) réduite de 6 à 8% et présentaient un rendement en cellulolyse augmenté de 17% dans le cas de lac17 et de 52% dans celui de lac4, par rapport à la lignée sauvage ColO (cellulolyse effectuée sans prétraitement acide). En outre, les Inventeurs ont obtenu par croisement, à partir des mutants lac4 et lacl7, des double- mutants lac4/lacl7. Ils ont constaté que ces double-mutants présentaient une quantité de lignines très réduite (de 19% environ par rapport à la lignée sauvage ColO), et un meilleur rendement en cellulolyse par rapport à la lignée sauvage ColO (+ 25% à + 42%) et au simple mutant lacl7 (+ 6% à + 21%) environ. En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé pour réduire la teneur en lignines d'une plante et augmenter la cellulolyse des parois de ladite plante, caractérisé en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité dans ladite plante, d'une laccase choisie parmi : a) une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 60% d'identité, et par ordre de préférence croissant au moins 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, ou au moins 75% de similarité, et par ordre de préférence croissant au moins 78%, 79%, 80%, 83%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2 (LAC17), et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, 4 domaines peptidiques consensus de séquence SEQ ID NO : 12, 13, 14 et 15 respectivement, et b) une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 75% d'identité, et par ordre de préférence croissant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, avec la séquence SEQ ID NO: 4 (LAC4). On entend par teneur en lignines , la teneur en lignines Klason. Cette teneur peut être mesurée par le

8 dosage de la fraction de lignine acido-insoluble (LAS) présente dans le résidu pariétal (RP) d'une plante, tel que décrit à l'Exemple 3 ci-dessous. On entend par laccase une enzyme (EC 1.10.3.2) à cuivre qui catalyse l'oxydation d'un substrat phénolique en utilisant le dioxygène comme accepteur final d'électrons. Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité indiqués ici sont établis, comme indiqué ci- dessus, à l'aide du programme needle en utilisant les paramètres par défaut. La présente invention s'applique aux plantes dicotylédones ou monocotylédones. A titre d'exemples non limitatifs, elle peut s'appliquer au maïs, blé, orge, seigle, triticale, avoine, sorhgo, canne à sucre, peuplier et pin. A titre d'exemples non limitatifs de laccases, dont la séquence polypeptidique possède au moins 60% d'identité ou au moins 75% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, les 4 domaines peptidiques consensus de séquence SEQ ID NO : 12, 13, 14 et 15 respectivement, on peut citer chez le maïs, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 5 et 6, chez la canne à sucre, les séquence peptidique SEQ ID NO : 7 et chez le sorgho, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 8 (séquence partielle de protéine), 9, 10 et 11. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de la présente invention, la réduction de la teneur en lignines d'une plante et l'augmentation de la cellulolyse des parois de ladite plante sont obtenues en inhibant totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité dans ladite plante : - d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 70% d'identité, et par ordre de préférence croissant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, et 99% d'identité ou au moins 75% de similarité, et par ordre

9 de préférence croissant au moins 78%, 79%, 80%, 83%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% de similarité, avec la séquence SEQ ID NO: 2, et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, 4 domaines peptidiques consensus de séquence SEQ ID NO : 12, 13, 14 et 15 respectivement, et - d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 75% d'identité, et par ordre de préférence croissant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, et 99% d'identité, avec la séquence SEQ ID NO: 4. L'inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité d'une laccase telle que définie ci-dessus peut être obtenue de diverses manières, par des méthodes connues en elles mêmes.

De manière particulièrement avantageuse, cette inhibition peut être obtenue en intervenant en amont de la production de ladite laccase, par mutagenèse du gène codant pour cette protéine, ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de cette laccase.

La mutagenèse du gène codant pour ladite laccase peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression, notamment du promoteur. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène. A titre d'exemple, pour le maïs, on citera la mutagenèse insertionnelle : on produit un grand nombre d'individus dérivant d'une plante active pour la transposition d'un élément transposable (élément AC ou Mutator), et on sélectionne, par exemple par PCR, les plantes chez lesquelles une insertion s'est effectuée dans le gène de ladite laccase. Cette séquence exogène peut aussi être un ADN-T (fragment du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens). On peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles avec des agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Ces mutations ont pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou de modifier le niveau de la transcription et/ou de la traduction du gène et/ou de rendre l'enzyme moins active que la protéine sauvage. Les allèles mutés du gène de ladite laccase peuvent être identifiés par exemple par PCR à l'aide d'amorces spécifiques dudit gène. Dans ce cadre, on peut notamment utiliser des techniques de type TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes ; McCALLUM et al, Plant Physiol., 123, 439-442, 2000). On peut aussi effectuer une mutagenèse dirigée, ciblant le gène codant pour ladite laccase. L'inhibition ou la modification de la transcription et/ou de la traduction peuvent être obtenues par l'expression d'ARN sens, antisens ou double-brin dérivés du gène de ladite laccase, ou de l'ADNc de cette protéine, ou bien par l'utilisation d'ARNs interférents (pour revue sur les techniques d'inhibition antisens voir par exemple : WATSON et GRIERSON, Transgenic Plants : Fundamentals and Applications (HIATT, A, ed) New York : Marcel DEKKER, 255-281, 1992 ; CHICAS et MACINO, EMBO reports, 21, 992-996, 2001 ; pour revue concernant plus spécifiquement l'utilisation des ARNs interférents voir HANNON, Nature, 418, 244-251, 2002). La présente invention a également pour objet une construction d'ADN recombinant, comprenant un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression d'une ou deux laccase(s) telle(s) que définie(s) ci-dessus. A titre d'exemples non limitatifs, lesdits polynucléotides peuvent coder pour des ARN antisens, des ARN interférents, des micro-ARN ou des ribozymes ciblant le gène codant pour une laccase telle que définie ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la construction d'ADN recombinant est choisie parmi . - une construction d'ADN comprenant un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence au

11 moins 20 nucléotides consécutifs de l'ADNc du gène codant pour une laccase telle que définie ci-dessus, - une construction d'ADN de 200 à 1000 pb, comprenant un fragment du l'ADNc du gène codant pour une laccase telle que définie ci-dessus, ou un polynucléotide complémentaire, qui lorsqu'elle est transcrite forme un ARN en épingle à cheveux (ARN hairpine ou ribozyme) ciblant ledit gène ; - une construction d'ADN, capable, lorsqu'elle est transcrite, de former un micro-ARN ciblant le gène codant pour une laccase telle que définie ci-dessus. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite construction d'ADN recombinant comprend un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 20, et de manière tout à fait préférée au moins 50 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 3, ou d'un polynucléotide complémentaire d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 3.

Ces constructions peuvent être notamment : - des cassettes d'expression, comprenant une ou plusieurs constructions d'ADN recombinant telles que définies ci-dessus, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ces cassettes d'expression peuvent également comprendre, avantageusement, d'autres éléments de régulation, en particulier des éléments de régulation de la transcription tels que terminateurs, amplificateurs, etc. ; - des vecteurs recombinants, comprenant une ou plusieurs constructions d'ADN recombinant telles que définies ci-dessus, ou avantageusement une cassette d'expression telle que définie ci-dessus. Des constructions d'ADN recombinant conformes à l'invention peuvent également comprendre d'autres éléments, par exemple un ou plusieurs marqueurs de sélection.

L'homme du métier dispose d'un très large choix d'éléments utilisables pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant conformes à l'invention.

12 A titre d'exemples non-limitatifs de promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera : - des promoteurs constitutifs, tels que le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), ou ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande Internationale WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine ou le promoteur Actine-Intron-actine du riz (McELROY et al., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160, 1991 ; GenBank numéro d'accès S 44221). - des promoteurs inductibles ou tissu- spécifiques, afin de ne modifier la teneur ou la composition en lignines qu'à certains stades du développement de la plante, dans certaines conditions environnementales, ou dans certains tissus-cibles, comme par exemple, les tiges, les feuilles, les graines, les spathes, le cortex ou le xylème.

A titre d'exemples non-limitatifs d'autres éléments de régulation de la transcription utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera des terminateurs, tels que le terminateur 3'NOS de la nopaline synthase (DEPICKER et al., J. Mol. Appl. Genet., 1, 561- 573, 1982), ou le terminateur 3'CaMV (FRANCK et al., Cell, 21, 285-294, 1980 ; GenBank numéro d'accès V00141). A titre d'exemples non-limitatifs de gènes marqueurs de sélection utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera notamment des gènes conférant une résistance à un antibiotique (HERRERA-ESTRELLA et al., EMBO J., 2, 987-995, 1983) tel que l'hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine, ou à un herbicide (EP 0 242 246) tels que le glufosinate, le glyphosate ou la bromoxynil, ou le gène NPTII qui confère la résistance à la kanamyine (BEVAN et al., Nucleic Acid Research, 11, 369-385, 1984).

La transformation des plantes peut s'effectuer par de nombreuses méthodes, connues en elles-mêmes de l'homme du métier. On peut par exemple transformer des cellules végétales, des protoplastes ou des explants, et régénérer une plante entière à partir du matériel transformé. La transformation peut ainsi être réalisée, à titre d'exemples non-limitatifs . - par transfert des vecteurs conformes à l'invention dans des protoplastes, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol (PEG) en présence de cations divalents (Ca2+) selon la méthode décrite dans l'article de KRENS et al. (Nature, 296, 72-74, 1982) ; - par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article de FROMM et al. (Nature, 319, 791-793, 1986) ; - par utilisation d'un canon à gène permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, délivrant ainsi des gènes à l'intérieur du noyau cellulaire, notamment selon la technique décrite dans l'article de FINER et al. (Plant Cell Report, 11, 323-328, 1992) ; par micro-injection cytoplasmique ou nucléaire. On peut également utiliser Agrobacterium tumefaciens, notamment selon les méthodes décrites dans les articles de BEVAN et al. (Nucleic Acid Research, 11, 369- 385, 1984) et d'AN et al. (Plant Phydiol., 81, 86-91, 1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de JOUANIN et al. (Plant Sci., 53, 53-63, 1987). Par exemple, la transformation de cellules végétales peut être effectuée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extra-chromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al., Ed. De Boeck

14 Université, 273-292, 1994). On peut aussi utiliser Agrobacterium tumefaciens sur des plantes entières, par exemple par dépôt au niveau de la blessure d'une plante monocotylédone, de la bactérie hébergeant l'ADN à transférer, en présence de substances libérées au niveau de la blessure d'une plante dicotylédone. La présente invention a également pour objet une cellule végétale comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet les plantes susceptibles d'être obtenues par un procédé conforme à l'invention, à l'exception des mutants d'A. thaliana SALK 016748 et SALK 051892. Bien entendu, la présente invention englobe les descendants, notamment les hybrides issus d'un croisement impliquant au moins une plante selon l'invention, obtenus par semis ou par multiplication végétative, des plantes directement obtenues par le procédé de l'invention.

Le matériel végétal, tel que protoplastes, cellules, cals, feuilles, tiges, racines, fleurs, fruits, boutures et/ou graines, obtenu à partir des plantes conformes à l'invention (à l'exception des mutants d'A. thaliana SALK 016748 et SALK 051892) fait également partie de l'objet de la présente invention. La présente invention a également pour objet l'utilisation des plantes conformes à l'invention ou de matériel végétal obtenu à partir desdites plantes pour la production de plantes fourragères, de biocarburants ou de pâte à papier. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la réduction de la teneur en lignines et l'augmentation de la cellulolyse des parois d'une plante dont l'expression des laccases LAC17 et/ou LAC4 est inhibée, ainsi que des figures annexées : Figure 1 : analyse par électrophorèse sur gel d'agarose 1% des produits de PCR obtenus à partir d'ADN génomique des lignées SALK 016748 (mutant lac17) (Figure A), SALK 051892 (mutant lac4) (Figure B) et SALK 025690 (mutant lac2) d'A. thaliana (Figure C). A : Puits 1 marqueur de taille lKb+ (Invitrogen) ; Puits 2 : tubuline de la lignée sauvage ColO ; Puits 3 : laccase 17 de la lignée sauvage ; Puits 4 et 6 : tubuline de 2 plantes de la lignée SALK 016748 (lac17) ; Puits 5 et 7 : laccase 17 de 2 plantes de la lignée SALK 016748 (lac17). B : Puits 1 marqueur de taille lKb+ (Invitrogen), Puits 2 : vide ; Puits 3 : tubuline la lignée sauvage ColO ; Puits 4 vide ; Puits 5 à 7 : tubuline de 3 plantes de la lignée SALK 051892 (lac4) ; Puits 8 : vide ; Puits 9 : laccase 4 de la lignée sauvage ColO ; Puits 10 : vide ; Puits 11 à 13 : laccase 4 de 3 plantes de la lignée SALK 051892 (lac4). C : Puits 1 et 12 : marqueur de taille lKb+ (Invitrogen) ; Puits 2 à 6 et 11 : vides ; Puit 7 : laccase 2 de la lignée sauvage ColO (ADNc) ; Puit 8 : laccase 2 d'l plante de la lignée sauvage ColO (ADNg) ; Puits 9 : laccase 2 d'l plante de la lignée SALK 025690 ; Puits 10 : témoin, laccase 2 amplifiée sur ARN de plante de la lignée sauvage ColO ayant subi le même traitement que les autres plantes à la différence qu'au cours de l'étape de rétro- transcription, la réverse transcriptase n'a pas été ajoutée ; Figure 2 : analyse du profil d'expression de laccases (LAC 2, 4, 5, 6, 10, 11, 12 et 17) d'A. thaliana par électrophorèse sur gel d'agarose 1% dans du tampon TAE des produits de RT-PCR obtenus à partir d'ADNc des cellules de la hampe florale de la lignée sauvage ColO, de la lignée SALK 051892 (lac4) et de la lignée SALK 016748 (lac17). Tub = tubuline ; Figure 3 : observation au microscope optique (grossissement 200X) de coupes transversales de 70 microns d'épaisseur de hampe primaire de 20 cm colorées au phloroglucinol-HC1, à partir de la lignée sauvage ColO et de la lignée SALK 016748 (lac17) ; Figure 4 : analyse par électrophorèse sur gel d'agarose 1% des produits de PCR obtenus à partir d'ADN génomique d'un double mutant d'A. thaliana Kim (lac4/lac17). Puits 1 : marqueur de taille lKb+ (Invitrogen) ; Puits 2 : tubuline de la lignée sauvage ; Puits 3 : tubuline du mutant Kim ; Puits 4 : laccase 4 de la lignée sauvage ; Puits 5 : laccase 4 du mutant Kim ; Puits 6 : laccase 17 de la lignée sauvage ; Puits 7 : laccase 17 du mutant Kim. EXEMPLE 1 : SELECTION, GENOTYPAGE ET CARACTERISATION DE MUTANTS lacl7, lac4 ET lac2 D'ARABIDOPSIS THALIANA 1) Sélection des mutants laccase d'A. thaliana Des lignées d'A. thaliana de la collection SALK dans l'accession ColO présentant des insertions de l'ADN-T au niveau des gènes LAC17, LAC4 et LAC2 (respectivement les lignées SALK 016748, SALK 051892 et SALK 025690) ont été identifiées et caractérisées. Le mutant SALK 016748 (lac17) contient deux ADN-T insérés en tandem inversé dans le promoteur du gène codant pour LAC17, à 146 paires de bases du codon d'initiation ATG.

Le mutant SALK 051892 (lac4) contient un ADN-T inséré dans le promoteur du gène codant pour LAC4, à 127 paires de bases du codon d'initiation ATG. Le mutant SALK 025690 (lac2) contient un ADN-T inséré dans sa séquence codante. 2) Génotypage des mutants lac17 (SALK 016748), lac4 (SALK 051892) et lac2 (SALK 025690) d'A. thaliana a) Matériel et Méthodes Des amorces pour les gènes LAC17, LAC4 et LAC2 ont été définies à l'aide du logiciel OLIGO 4 (National Biosciences Inc., Plymouth, USA). Leurs séquences (5'->3') sont représentées dans le Tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 : Séquence de l'amorce Séquence de l'amorce antisens sens Amorces pour Lac 17 FST dir: AAA Lac 17 FST rev: AAT l'amplification TCG NO : NO du gène LAC17 GAG AAG AGG GTC TCT TAG CCA TGA TTT (SEQ ID GTG AGC (SEQ ID 16) 17) Amorces pour irxl2 FST dir : AAT irx12 FST rev TGA GCA l'amplification GCA NO : ID NO du gène LAC4 ID ATT GTG TAA TGG CTT GCT CGG CAC (SEQ TAA TCT (SEQ 19) 18) Amorces pour Lac 2 RT dir : CAA Lac 2 RT rev : TGG l'amplification NO : GAA ATC TGA GGG NO du gène LAC2 AGG AAG (SEQ ID 21) GCA AGA CAA AAA TCG TGA (SEQ ID 20) L'ADN des plantes a été extrait selon le protocole décrit par EDWARDS et al. (Nucleic Acid Research, 19, 1349, 1991). Les PCR ont été réalisées dans 25 pl sur 30 ng d'ADN génomique, avec 2 mM de MgCl2, 0,4 mM de chaque dNTP, 0,4 mM de chaque amorce, 1,25 unités de Taq DNA polymérase (Invitrogen) Les cycles PCR pour le génotypage des mutants lac17 sont (95°C 30 sec, 50°C 30 sec, 72°C 1 mn) 28 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C. Les cycles PCR pour le génotypage des mutants lac4 sont (95°C 30 sec, 58°C 30 sec, 72°C 30 sec) 30 fois, 15 avec une extension finale de 10 mn à 72°C. Les cycles PCR pour le génotypage des mutants lac2 sont (95 °C 30 sec, 54 °C 30 sec, 72 °C 1 mn 30 sec) 30 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C. Les produits de PCR sont ensuite séparés sur 20 des gels d'agarose 1% dans du tampon TAE. 17

18 b) Résultats 2 plantes de la lignée SALK 016748, 3 plantes de la lignée SALK 051892 et 1 plante de la lignée SALK 025690 ont été testées.

Les résultats du génotypage sont représentés à la Figure 1 : - les 2 plantes de la lignée SALK 016748 testées sont homozygotes pour la mutation dans le gène LAC17 : la présence des ADN-T sur les deux brins codant de 10 ce gène empêche l'amplification d'un fragment du gène LAC17 (Figure lA) ; - les 3 plantes de la lignée SALK 051892 testées sont homozygotes pour la mutation dans le gène LAC4 : la présence de l'ADN-T sur les deux brins codant de 15 ce gène empêche l'amplification d'un fragment du gène LAC4 (Figure 1B) ; - la plante de la lignée SALK 025690 testée est homozygote pour la mutation dans le gène LAC2 : la présence de l'ADN-T sur les deux brins codant de ce gène empêche 20 l'amplification d'un fragment du gène LAC2 (Figure 1C). 3) Expression des laccases chez les mutants lac17 et lac4 Le profil d'expression de laccases d'Arabidopsis exprimées dans la hampe florale chez la 25 lignée sauvage (Columbia), le mutant lac17 (SALK 016748) et le mutant lac4 (SALK 051892) a été déterminé par RT-PCR. a) Matériel et Méthodes Une RT-PCR de 26 cycles a été effectuée sur des ADNc obtenus à partir d'1 pg d'ARN extrait à l'aide d'un 30 kit RNeasy (Qiagen), traités avec une DNase et rétro- transcrits avec la réverse-transcriptase SSRTII (Invitrogen). Les amorces utilisées sont décrites dans le Tableau 2 ci-dessous : Tableau 2 : Gène Nom de Séquence (5'->3') Tm (°C) amplifié l'amorce de l'amorce LAC2 LAC 2RT GCA AGA CAA AAA CAA TCG TGA 58 dir SEQ ID NO : 20 LAC2 LAC 2RT GAA ATC TGA GGG TGG AGG AAG 64 rev SEQ ID NO : 21 LAC4 lac4 FST AGT AAT GAA CAG TTGCGG TGG 62 dir SEQ ID NO : 22 LAC4 lac4 FST TGG TAA CTT TGG ACG ATC AGG 58 rev SEQ ID NO : 23 LAC4 LAC 4 RT GTT AGA AAC TGT CCA TCT CAA 58 dir SEQ ID NO : 24 LAC4 LAC 4 RT CTC CAC TTG TGT TGA AGT AAT 58 rev SEQ ID NO : 25 LAC4 irx 12 FST ATT GTG TAA GCA AAT CGG CAC 60 dir SEQ ID NO : 18 LAC4 irx 12 FST TGG CTT GCT TGA GCA TAA TCT 60 rev SEQ ID NO : 19 LAC5 LAC 5 RT ATC CGG TTG ATG TGT TGA GA 58 dir SEQ ID NO : 26 LAC5 LAC 5 RT AGA GAG ATC GGC TTA TGT TG 58 rev SEQ ID NO : 27 LAC6 LAC 6 RT TAT GCC AAA CAA ACG AGA T 52 dir SEQ ID NO :28 LAC6 LAC 6 RT CTG CTG GAG GAG GAG GTC 60 rev SEQ ID NO : 29 LAC10 LAC 10 RT TGT AAA GCC GGA AAC TTC TC 58 dir SEQ ID NO : 30 LAC10 LAC 10 RT TTA GGG CCT TTA CCA TTC TC 58 rev SEQ ID NO : 31 LAC11 LAC 11 RT GAG CTA TTC TTC GGG ATT 52 dir SEQ ID NO : 22 LAC11 LAC 11 RT GTC TTT AGG CGG TGG TAG 56 rev SEQ ID NO : 33 LAC12 LAC 12 RT GCC GAC GCA TCT TAC CTC 58 dir SEQ ID NO : 34 LAC12 LAC 12 RT CCA AGA ACG CCA TAG CAA 54 rev SEQ ID NO : 35 LAC17 lacl7 FST TCG AAG AGG GTC AAA GAG TTT 60 dir SEQ ID NO : 16 LAC17 lacl7 FST TCT TAG CCA TGA AAT GTG AGC 60 rev SEQ ID NO : 17 LAC17 LAC 17 RT TTC TCT TGT GTT CTT CTT CTT 56 dir SEQ ID NO : 36 LAC17 LAC 17 RT GAA CTT CTT TGT GAG GTT TAG 58 rev SEQ ID NO : 37 19

20 Les couples d'amorces dits FST (pour Flanking Sequence Tag) ont été dessinés de part et d'autre de l'ADN-T ; ils ont été utilisés pour amplifier sur de l'l'ADNg (génomique). Les couples d'amorces dits RT ont été définis dans la séquence codante et permettent d'amplifier sur des ADNc. Les cycles RT-PCR sur les mutants lacl7, lac4 et la lignée sauvage sont (95°C 30 sec, 50°C 30 sec, 72°C 1 mn 30) 26 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C pour les laccases 2, 4, 6, 12, 17 et les tubulines. Les cycles RT-PCR sur les mutants lac17, lac4 et la lignée sauvage sont (95°C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 1 mn 30) 26 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C pour les laccases 5 et 10.

Les cycles RT-PCR sur les mutants lacl7, lac4 et la lignée sauvage sont (95°C 30 sec, 58°C 30 sec, 72°C 1 mn 30) 26 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C pour la laccase 11. Les produits de RT-PCR sont ensuite séparés sur 20 des gels d'agarose 1% dans du tampon TAE pour visualiser une différence d'intensité des fragments amplifiés. b) Résultats Les résultats sont représentés à la Figure 2. Seul le taux des transcrits de la laccase 17 (LAC17) 25 diminue chez le mutant lac17 et celui de la laccase 4 (LAC4) chez le mutant lac4. Les mutants ne sur-expriment aucune autre laccase dans le but de compenser la perte d'expression de LAC17 et LAC4. 4) Analyse cytologique du mutant lac17 30 a) Matériel et Méthodes Des coupes de hampe primaire de 20 cm ont été colorées au phloroglucinol-HC1 selon le protocole décrit par SIBOUT et al. (Plant Cell, 17, 2059-2076, 2005). La coloration rouge observée correspond aux parois cellulaires 35 lignifiées. b) Résultats Les résultats de l'observation cytologique sont représentés à la Figure 3. Un retard et/ou une diminution de la quantité de lignine déposée sur les parois cellulaires est observé chez le mutant lac17 mais pas chez la lignée sauvage (Figure 3). EXEMPLE 2 : OBTENTION ET CARACTERISATION MOLECULAIRE D'UN DOUBLE MUTANT lacl7/lac4 D'ARABIDOPSIS THALIANA a) Matériel et Méthodes Des plantes de la lignée SALK 016748 (lac17) ont été croisées avec des plantes de la lignée SALK 051892 (lac4) pour obtenir un double mutant lac4/lacl7 (dénommé ci-après mutant Kim).

Le double mutant lac4/lacl7 a ensuite été caractérisé par génotypage en suivant le protocole décrit à l'Exemple 1.a) et en utilisant les amorces lac4 FST dir, lac4 FST rev, irx12 FST dir et irx12 FST rev. b) Résultats Les résultats du génotypage pour le mutant Kim sont représentés à la Figure 4 : le mutant Kim est homozygote pour les mutations dans les gènes LAC17 et LAC4. En effet, la présence des ADN-T sur les deux brins codant de ces gènes empêche l'amplification d'un fragment des gènes LAC17 et LAC4. La présence de deux ADN-T dans le promoteur du gène LAC17 et d'un ADN-T dans le promoteur du gène LAC4 a été confirmée par amplification des séquences adjacentes aux ADN-T et séquençage des amplicons.

EXEMPLE 3 : ANALYSE DE LA TENEUR EN LIGNINES ET DE LA CELLULOLYSE DES SIMPLES MUTANTS lac17 ET lac4 ET DU DOUBLE MUTANT lacl7/lac4 D'ARABIDOPSIS THALIANA a) Matériel et Méthodes i) Dosage de la teneur en lignines Le dosage des lignines a été réalisé sur les tiges collectées à maturité, broyées et soumises à extraction exhaustive par les solvants éthanol/toluène (2/1, v/v), éthanol, puis eau ; extractions réalisées dans un appareil de Soxhlet. Le matériel extrait et séché représente le résidu pariétal ou RP (car il est constitué des parois végétales). L'élimination des composés solubles par extraction au solvant est indispensable avant tout dosage de lignines (ces composés pouvant interférer avec les dosages gravimétriques ou spectrométriques). La teneur en lignines a été mesurée par le dosage de la fraction de lignine acido-insoluble présente dans le RP et dénommée lignine Klason (LK). Cette fraction LK, dosée par gravimétrie en traitant le résidu pariétal par l'acide sulfurique concentré (ce qui permet d'hydrolyser les polysaccharides et de laisser un résidu LK rincé, séché et pesé), représente l'essentiel des lignines pariétales. Cependant, une très petite fraction des lignines peut être solubilisée lors du traitement par l'acide sulfurique : il s'agit de la fraction dénommée lignine acido-soluble (LAS) qui est évaluée par mesure de l'absorbance du surnageant sulfurique dans l'ultra-violet. Ces mesures ont été réalisées en utilisant la méthode T222 om-83, connue de l'homme du métier, et mise au point pour le bois et ses dérivés par le TAPPI (Technical association of the pulp and paper industry) (DENCE, C.W.

The determination of lignin ; dans: LIN, S. Y. and DENCE, C. W. (Eds.). Methods in Lignin Chemistry. Springer-Verlag, pp. 33-61, 1992). ii) Etude de la structure des lignines La structure des lignines a été évaluée par thioacidolyse. La thioacidolyse des lignines libère des produits monomères thioéthylés H, G ou S à partir des unités p-hydroxyphényles (H), guaïacyles (G) ou syringyles (S) liées uniquement par liaisons R-0-4 (liaisons inter-unités majeures dans les lignines natives). Ces produits ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) de leurs dérivés triméthylsilylés (TMS). Les monomères

23 triméthylsilylés H, G ou S ont été dosés à partir de chromatogrammes reconstruits respectivement sur les ions 239, 269 ou 299 (ions les plus intenses de leur spectre de masse obtenu en impact électronique).

Le protocole qui a été employé est similaire à celui décrit par LAPIERRE et al. (Res. Chem. Interm., 21, 397-412, 1995) et par MIR DERIKVAND et al. (Planta 227, 943-956, 2008). Les monomères H sont le plus souvent minoritaires (moins de 1% du total des monomères) et n'ont donc pas été considérés (sauf dans le cas de plantes mutantes affectées dans la formation des unités G et S, ou dans le cas de lignines de stress). iii) Mesure de la dégradabilité enzymatique par cellulolyse in vitro La susceptibilité des polysaccharides pariétaux à l'hydrolyse enzymatique a été évaluée in vitro, en soumettant les parois (c'est-à-dire le résidu pariétal RP) à une préparation d'enzymes cellulasiques et hémicellulasiques.

Le protocole qui a été utilisé est décrit par HOFFMANN et al. (Plant Cell 16, 1446-1465, 2004), qui est un protocole adapté de la méthode de REXEN (Anim. Feed Sci. Technol., 2, 205-218, 1977). Ladite préparation enzymatique employée était la préparation Cellulase Onozuka R10 extraite de Trichoderma viride, 096i/mg (SERVA ELECTROPHORESIS GmbHD, Allemagne). b) Résultats Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 (présentant les valeurs moyennes entre les 2 répétitions analytiques et l'écart-moyen entre ces répétitions, sauf pour le pourcentage de RP pour lequel une seule mesure a été effectuée) ci-après, dans lequel : RP = pourcentage de résidu pariétal. Ce pourcentage reflète le taux de parois dans l'échantillon sec (% pondéral de l'échantillon sec) ; il est donné à titre indicatif ;

24 % LK = taux de lignine Klason exprimé en % pondéral du RP ; e-m LK = écart moyen entre 2 répétitions analytiques indépendantes de mesure de LK ; % LAS = taux de lignine acido-soluble exprimé en % pondéral du RP et mesuré à partir de l'absorbance à 205 nm du surnageant sulfurique issu de la mesure de la lignine Klason (en utilisant un coefficient d'absorptivité de 110 1. g-1. cm-1) ; e-m LAS = écart moyen entre 2 répétitions analytiques indépendantes de mesure de LAS ; rdt thio }mol/g LK = rendement en monomères (G+S) de thioacidolyse, exprimé en pmole par gramme de lignine Klason (les monomères H obtenus à l'état de traces ne sont pas considérés). Lorsqu'il est calculé sur la base de la teneur en lignine Klason, le rendement total en monomères de thioacidolyse reflète la proportion d'unités liées uniquement en (3-0-4 dans les lignines. Cette information structurale est importante car elle reflète la susceptibilité des lignines aux procédés de délignification industrielle. e-m rdt thio = écart moyen du rendement de thioacidolyse entre 2 répétitions analytiques indépendantes de thioacidolyse ; S/G thio = rapport molaire des monomères G et S libérés par thioacidolyse des lignines. Ce rapport reflète la proportion des unités S et des unités G dans les lignines natives. Chez les angiospermes, l'importance des unités S varie en fonction du stade de développement (les unités S étant déposées principalement en fin de lignification) ainsi que des tissus (les fibres sont plus riches en unités S que les vaisseaux). Par conséquent, lorsque qu'une plante mutante présente un rapport S/G différent de celui de la lignée témoin (cultivée dans les mêmes conditions), cette différence peut être imputable au fait que la mutation affecte la lignification dans le temps (en début ou en fin) ou de manière tissu-spécifique

25 (affecte la lignification des fibres ou celle des vaisseaux). Il est également possible que la mutation affecte plus spécifiquement une enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'alccol coniférylique (précurseur des unités G) ou de l'alcool sinapylique (précurseur des unités S) ; e-m S/G = écart moyen du rapport molaire S/G de thioacidolyse entre 2 répétitions analytiques indépendantes de thioacidolyse ; % perte par cellulolyse = perte pondérale (en %) du RP traitée par une préparation commerciale d'enzymes cellulasiques et hémicellulasiques ; e-m cellulolyse = écart moyen entre 2 répétitions analytiques indépendantes de cellulolyse ; les mutants Kim 1 et Kim 2 sont 2 répétitions biologiques de la même lignée. Kim 1 et Kim 2 ont été cultivés sur 2 plateaux de culture séparés, ce qui peut expliquer les variations entre ces répétitions. Il est à remarquer que le mutant SALK 025690 20 (lac2) ne présente pas de diminution du taux de lignines par rapport à la lignée sauvage (ColO). Tableau 3: Etude des lignines des hampes des lignées sauvage (ColO) et mutantes pour les laccases 4 et/ou 17. Lignées % RP % LK e-m % LAS e-m rdt e-m S/G e-m % perte par e-m LK LAS thio rdt thio S/G cellulolyse cellulolyse pmol/g thio LK ColO (sauvage) 62,0 16,91 0,16 2,43 0,04 1261 50 0,46 0,00 26,9 1,0 SALK 051892 61,4 15,51 0,07 1,76 0,03 1221 20 0,47 0,00 40,9 1,1 (lac4) SALK 016748 61,4 15,81 0,08 2,05 0,04 1291 63 0,56 0,01 31,5 1,4 (lac17) Kim 1 60,3 13,62 0,12 2,38 0,01 1265 90 0,65 0,01 38,1 1,5 (la c4/la et 7) Kim 2 62,6 13,73 0,09 2,41 0,08 1370 6 0,63 0,00 33,5 1,0 (lac4/lac17)

27 Il ressort des résultats ci-dessus que : - l'homogénéité des teneurs en RP (60.3 à 62.6%) indique que les mutations n'affectent pas le taux de parois lignocellulosiques des tiges matures. Comme les lignées mutantes ne présentent pas de réduction de taille, cela suggère que les plantes mutantes ont la même productivité en terme de biomasse lignocellulosique valorisable en fibres ou en biocarburant par exemple ; - en revanche tous les mutants présentent un taux de lignine Klason significativement plus faible que celui du témoin : la diminution est modérée pour les simples mutants (diminution de 8 et 6% pour les mutants lac4 et lac17 respectivement) et plus marquée pour les doubles mutants (environ 19%). Cette diminution de teneur en lignines, qui n'affecte pas la croissance et le développement de la plante, est recherchée dans le contexte de la production de pâte à papier par voie chimique à partir de lignocelluloses d'angiospermes. Elle facilite également l'hydrolyse enzymatique, les lignines agissant comme des barrières entre les enzymes et les polysaccharides ; - le taux de lignine acido-soluble (LAS) des lignées mutantes est inférieur au taux de LAS de la lignée sauvage. La teneur réduite en lignine Klason (ou lignine acido-insoluble) n'est donc pas compensée par une augmentation en lignine acido-soluble ; - les rendements de thioacidolyse, calculés sur la base du taux de LK, sont proches entre la lignée sauvage et les lignées mutantes. Ce résultat indique que les lignines des lignées mutantes contiennent autant de liaisons labiles que les lignines des lignées sauvages. Les mutations n'ont donc pas accentué la fréquence des liaisons inter-unités résistantes, ce qui serait défavorable dans l'optique de la production de pâte à papier par voie chimique par exemple ; - en revanche, le simple et les doubles mutants présentant la mutation lac17 ont un rapport S/G supérieur

28 par rapport à celui de la lignée sauvage. Ce résultat suggère que la mutation lac17 pourrait affecter le début de la lignification (et donc le dépôt des unités G) et/ou la lignification des vaisseaux (plus riches en unités G que les fibres) ; - le rendement de cellulolyse des lignées mutantes est augmenté par rapport à celui de la lignée sauvage. La diminution du taux de lignine Klason améliore donc l'efficacité de la cellulolyse.10

Claims

REVENDICATIONS1) Procédé pour réduire la teneur en lignines d'une plante et augmenter la cellulolyse des parois de ladite plante, caractérisé en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité dans ladite plante, d'une laccase choisie parmi : a) une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 60% d'identité ou au moins 75% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2, et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, 4 domaines peptidiques consensus de séquence SEQ ID NO : 12, 13, 14 et 15 respectivement, et b) une laccase dont la séquence polypeptidique 15 possède au moins 75% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 4.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité dans ladite 20 plante, d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 60% d'identité ou au moins 75% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, 4 domaines peptidiques consensus de séquence SEQ ID NO : 12, 25 13, 14 et 15 respectivement, et d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 75% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 4.
3) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'inhibition totale 30 ou partielle de l'expression et/ou l'activité dans ladite plante de ladite ou desdites laccase(s) est obtenue par mutagenèse du gène codant pour cette ou ces laccase(s), ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de cette ou ces laccase(s). 35
4) Construction d'ADN recombinant, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression d'une laccase dont la 30 séquence polypeptidique possède au moins 60% d'identité ou au moins 75% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, 4 domaines peptidiques consensus de séquence SEQ ID NO : 12, 13, 14 et 15 respectivement, et/ou d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 75% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 4.
5) Construction d'ADN selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit polynucléotide code pour un ARN antisens, un ARN interférent, un micro-ARN ou un ribozyme ciblant les gènes codant pour lesdites laccases.
6) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend une ou plusieurs constructions d'ADN telles que définies aux revendications 4 ou 5, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
7) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs constructions d'ADN telles que définies aux revendications 4 ou 5, ou une cassette d'expression telle que définie à la revendication 6.
8) Cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend une cassette d'expression telle que définie à la revendication 6 ou un vecteur recombinant tel que défini à la revendication 7.
9) Plante susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, à l'exception des lignées d'Arabidopsis thaliana SALK 016748 et SALK 051892.
10) Utilisation d'une plante susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou de matériel végétal obtenu à partir de ladite plante, pour la production de plantes fourragères, de biocarburant ou de pâte à papier.