WO2010143154A1 - Obtention de plantes a teneur reduite en lignines - Google Patents

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WO2010143154A1
WO2010143154A1 PCT/IB2010/052590 IB2010052590W WO2010143154A1 WO 2010143154 A1 WO2010143154 A1 WO 2010143154A1 IB 2010052590 W IB2010052590 W IB 2010052590W WO 2010143154 A1 WO2010143154 A1 WO 2010143154A1
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WO
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seq
sequence
plant
peptide
laccase
Prior art date
Application number
PCT/IB2010/052590
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English (en)
Inventor
Lise Jouanin
Serge Berthet
Catherine Lapierre
Emmanuel Guiderdoni
Oumaya Bouchabke-Coussa
Richard Sibout
Jean-Charles Leple
Original Assignee
Genoplante-Valor
Institut National De La Recherche Agronomique
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8255—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving lignin biosynthesis
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    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting or obtaining plants having a reduced lignin content.
  • Lignins are insoluble polymers located in the plant walls and resulting from the polymerization of 3 phenolic monomers (or monolignols), derived from the phenylpropanoids route (NEISH, Constitution and Biosynthesis of Lignin, New York editions: Springer Verlag, 1-43 , 1968). Their biosynthetic pathway is complex and involves different steps, part of which is carried out in the cytoplasm (synthesis of monolignols) and another in the wall (polymerization).
  • the p-coumaryl, coniferyl and sinapyl alcohols are the respective precursors of the p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) and syringyl (S) units constituting the lignins.
  • phenolic radicals which spontaneously couple by various bonds, which leads to the formation of lignins.
  • interunit links there are labile bonds, called ⁇ -O-4 and resistant bonds.
  • bonds can also be established with other parietal compounds (polysaccharides and proteins) to form a complex three-dimensional network.
  • oxidases such as peroxidases, laccases or other oxidases.
  • lignin content of plants has a major influence on their industrial uses. For example, it affects the nutritional value of plants for animal feed, as well as the performance of paper processes (yield and quality of the pulp obtained) and the production yield of biofuel. Indeed: An important component of the nutritional value of forage plants, such as forage corn, is digestibility.
  • lignins establish different types of linkages with other parietal constituents (including polysaccharides) and hinder the accessibility of digestive enzymes polysaccharides (carbohydrates), the main sources of energy for herbivores;
  • biofuels are formed from bioethanol (a product miscible with gasoline) or oil
  • the production of bioethanol could also be made from the cellulose of wood or straw.
  • the production process comprises the following steps: acid pretreatment of the raw material to break the interactions between lignins and polysaccharides (this pretreatment facilitates the action of hydrolytic enzymes which transform the polysaccharides of the wall into simple sugars), followed by a fermentation step of simple sugars, leading to the production of bioethanol.
  • acid pretreatment of the raw material to break the interactions between lignins and polysaccharides
  • this pretreatment facilitates the action of hydrolytic enzymes which transform the polysaccharides of the wall into simple sugars
  • a fermentation step of simple sugars leading to the production of bioethanol.
  • the initial acid pretreatment results in the production of compounds capable of inhibiting the fermentation step. It has therefore been suggested that by modifying the lignins, the parietal polysaccharides would be more accessible to the hydrolytic enzymes.
  • One of the preferred ways to reduce the lignin content in plants is the production of plants by genetic engineering. It has thus been proposed to act on the enzymes of the lignin biosynthetic pathway, such as laccases (International Application WO 97/45549), peroxidases (International Application WO 2004/080202) Cinnamoyl CoA reductase (CCR; WO 97/12982 and WO 98/39454), caffeic acid O-methyltransferase (COMT International Application WO 94/23044, OBA and ALLEN, J.
  • the multigene family of laccases has 17 members, 7 of which are expressed in the stems, the most lignified organ.
  • the most highly expressed genes are LAC4 (At2g38080), LAC11 (At5g60020) and LAC2 (At2g29130).
  • the LAC2 and LAC11 genes belong to the same subclass and the LAC4 gene belongs to a close subclass according to the phylogenetic trees published by POURCEL et al. (Plant Cell, 17, 2966-2980, 2005) and CAPARROS-RUIZ et al. (Plant Science, 171, 217-225, 2006).
  • the LAC11 gene codes for the LAC17 protein (AtLAC17), the sequence of which is available under the accession number NM_125395 in the GENBANK database, and is also reproduced in the attached sequence listing under the identifier SEQ ID NO: 2.
  • the LAC4 gene codes for the LAC4 protein (AtLAC4), the sequence of which is available under the accession number NM_129364 in the GENBANK database, and is also reproduced in the attached sequence listing under the identifier SEQ ID NO: 4.
  • the LAC2 gene encodes the LAC2 protein (AtLAC2), the sequence of which is available under accession number NM_128470 (GI: 186503951) in the GENBANK database.
  • AtLAC17 is expressed at interfascicular fibers.
  • the inventors have thus demonstrated that the orthologous proteins of the AtLAC17 protein have at least 60% identity or at least 75% similarity with it and comprise, from the N-terminus to the C-terminus. terminal, at least one of the four sequence consensus peptide domains:
  • HWHGI / VRQL (SEQ ID NO: 12, amino acids corresponding to positions 80-87 of the peptide sequence of AtLAC17) or HWHGI / VR / LQL / M / V (SEQ ID NO: 38), • I / VNAALNDELFF ( SEQ ID NO: 13, amino acids corresponding to positions 223-233 of the peptide sequence of AtLAC17) or INA / SALN / ED / N / EELFF (SEQ ID NO: 39),
  • ESHPLHLHGF / YN / DFFVVGQGF / YGNF / YD (SEQ ID NO: 14, amino acids corresponding to positions 476-498 of the peptide sequence of AtLAC17), or ESHPL / FHL / MHGF / YN / DF / YF / YVV / IGQ / T / E-GF / V / TGNF / YD / N (SEQ ID NO: 40) and
  • A-D-N-P-G-V-W (SEQ ID NO: 15, amino acids corresponding to positions 539-546 of the peptide sequence of AtLAC17), or A / V-D-N-P-G-V / O-W / O (SEQ ID No.
  • sorghum (Sorghum bicoior) of sequences SEQ ID NO: 8, 9, 10 and 11, of Brachypodium, such as the sequences Bradilg66720 (SEQ ID NO: 48), Bradi2g54680 (SEQ ID NO: 49), Bradilg24910 (SEQ ID NO: 50), Bradilg24880 (SEQ ID NO: 51), Bradi2g54740 (SEQ ID NO: 52), Bradi2g23370 (SEQ ID NO: 53), Bradi2g23350 (SEQ ID NO: 54) and Bradi2g54690 (SEQ ID NO: 55), rice, such as the sequences available in the GENBANK database under the accession numbers GI: 113548170 (SEQ ID NO: 56), GI.113534304
  • GI.113579297 (SEQ ID NO: 59), GI: 113534303 (SEQ ID NO: 60), GI.113579295 (SEQ ID NO: 61), GI.255673866 (SEQ ID NO.
  • PtLACl gene POPTR_0001sl4010.1, SEQ ID NO: 63
  • PtLAC40 POPTR_0001s41160.1, SEQ ID NO: 64
  • PtLAC41 POPTR_0001s41170.1, SEQ ID NO: 65
  • PtLAC6 POPTR_0001s41170.1, SEQ ID NO: 66
  • PtLAC24 POPTR_0011sl2010.1, SEQ ID NO: 67
  • PtLAC25 POPTR_0011sl2100.1, SEQ ID NO: 68.
  • AtLAC17 shows the presence (indicated in the table by the sign "X") of the consensus peptide domains as defined above in the orthologous sequences of the AtLAC17 protein in Zea mays, S. officinarum, Sorghum bicolor, Brachypodum, poplar and rice, as well as the respective percentages of identity and similarity to AtLAC17.
  • the LAC17 protein has 55.2% identity with the LAC4 protein, and 67.1% identity with the LAC2 protein, but the latter does not include the consensus peptide domain of sequence SEQ ID NO: 14, and 54.6. % identity with the tobacco laccase described in International Application WO 97/45549; the LAC4 protein has 54.0% identity with the LAC2 protein and 75.8 identity with the tobacco laccase described in the International Application WO 97/45549 (it appears that said tobacco laccase is the orthologue of the AtLAC4 protein), the percentages of identity being calculated over the entire length of the sequences using the needle program (NEEDLEMAN and WUNSCH, J. Mol Biol., 48, 443-453, 1970) using the default parameters.
  • AtLAC4 is expressed at the level of the xylem vessels and interfascicular fibers.
  • orthologs of the LAC4 protein of A. thaliana we will mention in particular the laccases of: Brachypodium, such as the sequence
  • Lines of A. thaliana of the SALK collection in the CoIO (Columbia) accession with T-DNA insertions at the LACI1 gene (line SALK_016748), LAC4 (line SALK_051892) and LAC2 (line SALK_025690) have been identified.
  • the mutants Iac4 and Iac2 have in particular been described by BROWN et al. (Plant Cell, 17, 2281-2295, 2005). These mutants show strongly reduced or zero mutated gene expression but do not exhibit a particular phenotype in the greenhouse.
  • the inventors have investigated whether these mutations have an effect on the amount of lignins of the mutated plants, and their qualitative (structural) properties. They found that the Iac2 mutant did not differ significantly from the CoIO wild line, but that the Iac4 and lacII mutants contained lignin (determined on mature dry stems) reduced from 6 to 8. % and had an increased cellulolytic yield of 17% in the case of lac11 and 52% in that of Iac4, relative to the wild line CoIO (cellulolysis carried out without acid pretreatment).
  • mutants Iac4 and lac11 obtained by crossing, from mutants Iac4 and lac11, double mutants Iac4 / lac17. They found that these double mutants had a very small amount of lignin (about 19% compared to the CoIO wild line), and a better cellulolytic yield compared to the CoIO wild line (+ 25% to + 42% ) and the simple lacll mutant (+ 6% to + 21%) approximately.
  • the subject of the present invention is a process for reducing the lignin content of a plant and increasing cellulolysis of the walls of said plant, characterized in that the expression and / or the activity in said plant: a) a laccase of which the polypeptide sequence has at least 60% identity, and in order of increasing preference at least 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity, or at least 75% similarity, and in order of increasing preference at least 78%, 79%, 80%, 83%, 85%, 90% %, 95%, 97%, 98% and 99% of similarity with the sequence SEQ ID NO: 2 (LAC17), and comprises, from its N-terminal end to its C-terminal end, at least one of the 4 , preferably at least 2 of 4, more preferably at least 3 of 4 and more preferably the 4 consensus peptide domains i) to iv) respectively, i) the sequence consensus peptide domain SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 15 or 41 and b) a laccase whose polypeptide sequence has at least 65% identity, and in order of increasing preference at least 70%, 75%, 80%, 85%,
  • lignin content means the Klason lignin content. This content can be measured by the assay of the acid-insoluble lignin fraction (LAS) present in the parietal residue (RP) of a plant, as described in Example 3 below.
  • LAS acid-insoluble lignin fraction
  • RP parietal residue
  • laccase refers to a copper (EC 1.10.3.2) enzyme that catalyzes the oxidation of a phenolic substrate by using dioxygen as the final acceptor of electrons. Unless otherwise specified, the identity percentages shown here are set, as above, using the needle program using the default settings.
  • the present invention is applicable to dicotyledonous or monocotyledonous plants. As non-limiting examples, it can be applied to corn, wheat, barley, rye, triticale, oats, rice, sorghum, sugar cane, poplar and pine.
  • laccases By way of nonlimiting examples of laccases, as defined in paragraph a) above, mention may be made, in maize (Zea mays), of the peptide sequences SEQ ID NO: 5, 6 and 42 to 47, in cane sugar (Saccharum officinarum), the sequence SEQ ID NO: 7, in sorghum (Sorghum bicolor), the peptide sequences SEQ ID NO: 8 to 11, in Brachypodium, the peptide sequences SEQ ID NO: 48 to 55), in rice, the peptide sequences SEQ ID NO: 56 to 62, and in poplar, the peptide sequences SEQ ID NO: 63 to 68.
  • laccases whose polypeptide sequence has at least 60% identity or at least 75% similarity with the sequence SEQ ID NO: 2 and comprises, from its N-terminal end towards at its C-terminal end, the 4 consensus peptide domains of SEQ ID NO: 12, 13, 14 and 15, respectively, in maize, the peptide sequences SEQ ID NO: 5, 6, 42, 43, 44 and 45, in the sugar cane, the peptide sequence SEQ ID NO: 7, in the sorghum, the peptide sequences SEQ ID NO: 8 (partial sequence of the protein), 9, 10 and 11, in Brachypodium, the SEQ peptide sequences ID NO: 50 and 51, in rice, the peptide sequence SEQ ID NO: 58, and in poplar, the peptide sequences SEQ ID NO: 63, 67 and 68.
  • laccases whose polypeptide sequence has at least 65% identity with the sequence SEQ ID NO: 4, mention may be made in Brachypodium, the peptide sequence SEQ ID NO: 69, in rice, the peptide sequence SEQ ID NO: 70 and in poplar, the peptide sequences SEQ ID NO: 71 to 74.
  • the total or partial inhibition of the expression and / or the activity of a laccase as defined above can be obtained in various ways, by methods known per se.
  • this inhibition can be obtained by intervening upstream of the production of said laccase, by mutagenesis of the gene coding for this protein, or by inhibition or modification of the transcription or translation of this laccase.
  • Mutagenesis of the gene coding for said laccase may occur at the level of the coding sequence or of the expression regulation sequences, in particular of the promoter. For example, it is possible to delete all or part of said gene and / or to insert an exogenous sequence.
  • insertional mutagenesis a large number of individuals derived from an active plant are produced for the transposition of a transposable element (AC element or Mutator), and selected by example by PCR, the plants in which an insertion was carried out in the gene of said laccase.
  • This exogenous sequence may also be a T-DNA (fragment of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid).
  • mutated alleles of the gene of said laccase can be identified for example by PCR using primers specific for said gene.
  • TILLING Targeting Induced Local In Genomes lesions, McCALLUM et al, Plant Physiol., 123, 439-442, 2000.
  • the inhibition or the modification of the transcription and / or the translation can be obtained by the expression of sense, antisense or double-stranded RNA derived from the gene of said laccase, or the cDNA of this protein, or else by the use of interfering RNAs (for review on antisense inhibition techniques see for example: WATSON and GRIERSON, Transgenic Plants: Fundamentals and Applications (HIATT, A, ed) New York: Marcel DEKKER, 255-281, 1992 CHICAS and MACINO, EMBO reports, 21, 992-996, 2001, for a review relating more specifically to the use of interfering RNAs (HANNON, Nature, 418, 244-251, 2002).
  • the present invention also relates to a recombinant DNA construct comprising one or more polynucleotides capable of inhibiting the expression of the two laccases as defined above.
  • said polynucleotides can encode antisense RNAs, interfering RNAs (non-coding double-stranded RNA with a length of approximately 21 to 25 nucleotides), microRNAs (non-coding single-stranded RNAs of a length of about 21 to 25 nucleotides) (OSSOWSKI et al., The Plant Journal, 53, 674-690, 2008; SCHWAB et al., Methods Mol Biol., 592, 71-88, 2010, WEI et al., Funct Integr Genomics, 9, 499-511, 2009) or ribozymes targeting the gene encoding a laccase as defined above.
  • said polynucleotides capable of inhibiting the expression of LAC4 and LA17 laccases as defined above are microRNAs, such as microRNAs miR397 and miR408, preferably miR397.
  • micro-RNAs those of the following sequences can be used:
  • SEQ ID NO: 75 (AtmiR397a) or SEQ ID NO: 76 (AtmiR397b), obtained from Arabidopsis thalina (ABDEL-GHANY and PILON, J Biol Chem., 283, 15932-15945, 2008);
  • SEQ ID NO: 78 (Bdi-miR397a) or SEQ ID NO: 79 (Bdi-miR397b), obtained from Brachypodium distachyon
  • the recombinant DNA construct is chosen from:
  • a DNA construct comprising a fragment of at least 15 consecutive nucleotides, preferably at least 20 consecutive nucleotides of the cDNA of the gene encoding a laccase as defined above, a DNA construct of 200 to 1000 bp, comprising a fragment of the cDNA of the gene coding for a laccase as defined above, or a complementary polynucleotide, which when it is transcribed forms a hairpin RNA (hairpine RNA or ribozyme) targeting said gene ; a DNA construct, capable, when transcribed, of forming a microRNA targeting the gene coding for a laccase as defined above.
  • said recombinant DNA construct comprises a fragment of at least 15 consecutive nucleotides, preferably at least 20, and most preferably at least 50 consecutive nucleotides of a polynucleotide. of sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or of a polynucleotide complementary to a polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • expression cassettes comprising one or more recombinant DNA constructs as defined above, under transcriptional control of a suitable promoter.
  • These expression cassettes may also advantageously comprise other regulatory elements, in particular transcription regulation elements such as terminators, amplifiers, and the like.
  • recombinant vectors comprising one or more recombinant DNA constructs as defined above, or advantageously an expression cassette as defined above.
  • Recombinant DNA constructs in accordance with the invention may also comprise other elements, for example one or more selection markers.
  • promoters usable in the context of the present invention, mention may be made of: constitutive promoters, such as the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) described by KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), or its derivatives, the promoter of the cassava vein mosaic virus (CsVMV) described in the International Application WO 97/48819, the corn ubiquitin promoter or the rice "Actin-Intron-actin" promoter (McELROY et al., Mol Gen. Genet., 231, 150-160, 1991; GenBank no.
  • constitutive promoters such as the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) described by KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), or its derivatives, the promoter of the cassava vein mosaic virus (CsVMV) described in the International Application WO 97/48819, the corn ubiquitin promoter or the rice "Actin-Intron-actin” promoter (McELRO
  • inducible or tissue-specific promoters in order to modify the lignin content or composition only at certain stages of the development of the plant, under certain environmental conditions, or in certain target tissues, for example, the stems, leaves, seeds, husks, cortex or xylem (eg, the cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) promoter or the 4 coumarate-CoA ligase (4CL)).
  • CAD cinnamyl alcohol dehydrogenase
  • 4CL 4 coumarate-CoA ligase
  • terminators such as the 3'NOS terminator of nopaline synthase (DEPICKER et al., J. Mol Appl., Genet., 1, 561-573, 1982), or the 3'CaMV terminator (FRANCK et al., CeIl, 21, 285-294, 1980, GenBank accession number V00141).
  • selection marker genes that can be used in the context of the present invention, mention will be made in particular of genes conferring resistance to an antibiotic (HERRERA-ESTRELLA et al., EMBO J., 2, 987-995 , 1983) such as hygromycin, kanamycin, bleomycin or streptomycin, or a herbicide (EP 0 242 246) such as glufosinate, glyphosate or bromoxynil, or the NPTII gene which confers kanamyine resistance. (BEVAN et al., Nucleic Acid Research, 11, 369-385, 1984).
  • Plant transformation can be carried out by many methods, known in themselves to those skilled in the art.
  • transformation can thus be carried out, by way of non-limiting examples: by transfer of the vectors according to the invention in protoplasts, in particular after incubation of the latter in a solution of polyethylene glycol (PEG) in the presence of divalent cations
  • PEG polyethylene glycol
  • Agrobacterium tumefaciens can also be used, in particular according to the methods described in the articles by BEVAN et al. (Nucleic Acid Research, 11, 369-385, 1984) and AN et al. (Plant Phydiol., 81, 86-91, 1986), or Agrobacterium rhizogenes, in particular according to the method described in the article by JOUANIN et al. (Plant Sci., 53, 53-63, 1987).
  • plant cell transformation can be effected by transferring the T region of the Agrobacterium tumefaciens Ti tumor-inducing extrachromosomal circular plasmid, using a binary system (WATSON et al., Ed.
  • Agrobacterium tumefaciens can also be used on whole plants, for example by depositing, at the level of the wound of a monocotyledonous plant, the bacterium harboring the DNA to be transferred, in the presence of substances released at the level of the wound of a plant. dicotyledonous.
  • the present invention also relates to a plant cell comprising an expression cassette as defined above or a recombinant vector as defined above.
  • the subject of the present invention is also the plants which can be obtained by a process according to the invention, with the exception of A. thaliana mutants SALK_016748 and SALK_051892.
  • Said plants may carry mutations inhibiting laccase LAC4 and LA17 as defined above or express one or more polynucleotides capable of inhibiting the expression of said laccase LAC4 and LA17 as defined above.
  • the present invention includes descendants, including hybrids derived from a cross involving at least one plant according to the invention, obtained by sowing or vegetative propagation, plants directly obtained by the method of the invention.
  • Plant material such as protoplasts, cells, calli, leaves, stems, roots, flowers, fruits, cuttings and / or seeds, obtained from the plants in accordance with the invention (with the exception of A. thaliana mutants).
  • SALK_016748 and SALK_051892) is also part of the object of the present invention.
  • the present invention also relates to the use of plants according to the invention or plant material obtained from said plants for the production of forage plants, biofuels or pulp.
  • Figure 1 agarose gel electrophoresis analysis 1% PCR products obtained from DNA genomic lines SALK_016748 (lacll mutant) ( Figure 1
  • FIG. 1 A: Well 1: IKb + size marker (Invitrogen); Well 2: Tubulin from the CoIO wild line; Well 3: laccase 17 of the wild line; Wells 4 and 6: tubulin of 2 plants of line SALK_016748 (lacll); Wells 5 and 7: laccase 17 of 2 plants of the SALK__016748 (lacll) line.
  • B Well 1: IKb + size marker (Invitrogen), Well 2: empty; Well 3: tubulin the wild line CoIO; Well 4: empty; Wells 5 to 7: tubulin of 3 plants of line SALK__051892 (laced); Well 8: empty; Well 9: laccase 4 of the CoIO wild line; Well 10: empty; Wells 11 to 13: laccase 4 of 3 plants of the line SALK_051892 (Iac4).
  • C Wells 1 and 12: IKb + size marker
  • Figure 3 observation under optical microscope (200X magnification) of cross sections of 70 microns thick primary stem of 20 cm stained with phloroglucinol-HCl, from the wild line CoIO and the line SALK 016748 (lac11);
  • Figure 4 Agarose gel electrophoresis analysis 1% of PCR products obtained from genomic DNA of a double mutant of A. thaliana Kim (Iac4 / lac17).
  • Well 1 IKb + size marker (Invitrogen);
  • Well 2 tubulin from the wild line;
  • Well 3 tubulin of mutant Kim;
  • Well 4 laccase 4 of the wild line;
  • Well 5 laccase 4 of the Kim mutant;
  • Well 6 laccase 17 of the wild line;
  • Well 7 laccase 17 of the mutant Kim.
  • EXAMPLE 1 SELECTION, GENOTYPING AND
  • A. thaliana laccase mutants A. thaliana strains of the SALK collection in the CoIO accession showing T - DNA insertions at the LACl 7, LAC4 and LAC2 genes (respectively SALK_016748, SALK_051892 and SALK_025690) have been identified and characterized.
  • Mutant SALK_016748 [lac11] contains two inverted Tandem T-DNAs in the LB17 gene promoter, 146 base pairs of the ATG initiation codon.
  • Mutant SALK_051892 contains T-DNA inserted into the promoter of the gene encoding LAC4 at 127 base pairs of the ATG initiation codon.
  • the mutant SALK_025690 (Iac2) contains a T-DNA inserted into its coding sequence.
  • Lac 17 FST dir Lac 17 FST rev: TCG AAG AGG GTC AAA TCT TAG CCA TGA AAT amplification of the LACl 7 GAG TT gene (SEQ ID NO: GTG AGC (SEQ ID NO:
  • the plant DNA was extracted according to the protocol described by EDWARDS et al. (Nucleic Acid Research, 19, 1349, 1991).
  • PCRs were carried out in 25 ⁇ l on 30 ng of genomic DNA, with 2 mM MgCl 2, 0.4 mM of each dNTP, 0.4 mM of each primer, 1.25 units of Taq DNA polymerase (Invitrogen). PCR cycles for genotyping lacII mutants were (95 ° C 30 sec, 50 ° C dry, 72 ° C 1 min) 28 times, with a final extension of 10 min at 72 ° C.
  • PCR cycles for genotyping laced mutants were (95 ° C dry, 58 ° C dry, 72 ° C dry) 30 times, with a final extension of 10 min at 72 ° C.
  • the PCR cycles for genotyping the Iac2 mutants are (95 ° C dry, 54 ° C dry, 72 ° C 1 min 30 sec) 30 times, with a final extension of 10 min at 72 ° C.
  • the 2 plants of the line SALK_016748 tested are homozygous for the mutation in the LACl7 gene: the presence of T-DNAs on the two coding strands of this gene prevents the amplification of a fragment of the LACl7 gene (FIG. ;
  • the 3 plants of the line SALK_051892 tested are homozygous for the mutation in the LAC4 gene: the presence of the T-DNA on the two coding strands of this gene prevents the amplification of a fragment of the LAC4 gene (FIG. ;
  • the plant of the line SALK__025690 tested is homozygous for the mutation in the LAC2 gene: the presence of T-DNA on the two strands coding for this gene prevents the amplification of a fragment of the LAC2 gene (FIG. 1C).
  • the primers used are described in Table 2 below:
  • the so-called “FST” (Flanking Sequence Tag) primer pairs have been drawn on either side of the T-DNA; they were used to amplify on DNA (genomic).
  • the so-called “RT” primer pairs have been defined in the coding sequence and make it possible to amplify on cDNAs.
  • the RT-PCR cycles on the lac11, Iac4 and wild-type mutants are (95 ° C. 30 sec, 50 ° C. dry, 72 ° C. 1 min 30) 26 times, with a final extension of 10 min at 72 ° C. for laccases 2, 4, 6, 12, 17 and tubulins.
  • the RT-PCR cycles on the lacI r Iac4 mutants and the wild-type line are (95 ° C. 30 sec, 55 ° C. 30 sec, 72 ° C. 1 min 30) 26 times, with a final extension of 10 min at 72 ° C. for laccases 5 and 10.
  • the RT-PCR cycles on lac11, Iac4 and wild-type mutants are (95 ° C 30 sec, 58 ° C dry, 72 ° C 1 min 30) 26 times, with a final extension 10 min at 72 0 C for laccase 11.
  • FIG. 3 The results of the cytological observation are shown in FIG. 3. A delay and / or a decrease in the amount of lignin deposited on the cell walls is observed in the lac11 mutant but not in the wild line (FIG. 3).
  • the lignin content was measured by the determination of the acid-insoluble lignin fraction present in the RP and called Klason lignin (LK).
  • LK Klason lignin
  • This LK fraction gravimetrically measured by treating the parietal residue with concentrated sulfuric acid (which allows the polysaccharides to be hydrolysed and a LK residue to be rinsed, dried and weighed), represents most of the parietal lignins.
  • a very small fraction of the lignins can be solubilized during the treatment with sulfuric acid: it is the fraction called acid-soluble lignin (LAS) which is evaluated by measuring the absorbance of the sulfuric supernatant in the ultraviolet.
  • LAS acid-soluble lignin
  • the lignin structure was evaluated by thioacidolysis.
  • the thioacidolysis of lignins liberates H, G or S thioethylated monomeric products from p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) or syringyl (S) units bound only by ⁇ -O-4 bonds (major interunit linkages in lignins natives) .
  • H p-hydroxyphenyl
  • G guaiacyl
  • S syringyl
  • Monomers trimethylsilyl H, G or S were assayed from chromatograms reconstructed respectively on ions 239, 269 or 299 (ions the most intense of their mass spectrum obtained in electronic impact).
  • the protocol that has been employed is similar to that described by LAPIERRE et al. (Res Chem Interm, 21, 397-412, 1995) and by MIR DERIKVAND et al. (Planta 227, 943-956, 2008).
  • the monomers H are most often minor (less than 1% of the total monomers) and were therefore not considered (except in the case of mutant plants affected in the formation of G and S units, or in the case of lignins of stress) .
  • thioacidolysis yield difference between 2 independent analytical thioacidolysis repeats S / G t hio molar ratio of G and S monomers released by thioacidolysis of lignins.
  • This ratio reflects the proportion of S units and G units in native lignins.
  • the importance of S units varies according to the stage of development (S units being deposited mainly at the end of lignification) as well as tissues (the fibers are richer in S units than the vessels). Therefore, when a mutant plant has a S / G ratio different from that of the control line (grown under the same conditions), this difference may be due to the fact that the mutation affects lignification over time (at the beginning or in the end) or in a tissue-specific way (affects the lignification of the fibers or that of the vessels).
  • RP treated with a commercial preparation of cellulase and hemicellulase enzymes; e-m cellulolysis average difference between 2 independent analytical cellulolytic repeats; the Kim 1 and Kim 2 mutants are 2 biological repeats of the same line. Kim 1 and Kim 2 were grown on 2 separate culture trays, which may explain the variations between these replicates.
  • mutant SALK 025690 (Iac2) does not show a decrease in the level of lignins relative to the wild line (CoIO).
  • Table 3 Lignin study of wild-type (CoIO) and mutant strains for laccases 4 and / or 17.
  • the homogeneity of the RP levels (60.3 to 62.6%) indicates that the mutations do not affect the rate of lignocellulosic walls of the mature stems. As mutant lines do not show a reduction in size, this suggests that mutant plants have the same productivity in terms of lignocellulosic biomass recoverable in fiber or biofuel for example;
  • the mutants have a Klason lignin level which is significantly lower than that of the control: the decrease is moderate for the simple mutants (decrease of 8 and 6% for the mutants Iac4 and lac11 respectively) and more marked for the double mutants. (about 19%).
  • This decrease in lignin content which does not affect the growth and development of the plant, is sought in the context of chemical pulp production from angiosperm lignocelluloses. It also facilitates enzymatic hydrolysis, lignins acting as barriers between enzymes and polysaccharides;
  • the level of acid-soluble lignin (LAS) of the mutant lines is lower than the level of LAS of the wild line.
  • the reduced Klason lignin content (or acid-insoluble lignin) is therefore not offset by an increase in acid-soluble lignin;
  • the thioacidolysis yields calculated on the basis of the LK level, are close between the wild line and the mutant lines. This result indicates that the lignins of the mutant lines contain as many labile bonds as the lignins of the wild lines. The mutations therefore did not accentuate the frequency of the inter-unit resistant bonds, which would be unfavorable in view of the production of pulp by chemical means for example;
  • GROSSNIKLAUS Plant Physiology, 133, 462-469, 2003
  • GROSSNIKLAUS Plant Physiology, 133, 462-469, 2003
  • the 2x35S promoter is excised from the above plasmid pMDC32 by digestion with HindIII-KpnI enzymes (unique restriction sites) and replaced with the EuCAD "lignin-specific" promoter.
  • the genetic transformation of the poplar is carried out according to the method described in LEPLE et al. (Plant Cell Rep. 11, 137-141, 1992), ie by co-cultivation of poplar stem explants with agrobacteria containing a binary vector for the expression of miR397, isolation of transgenic calli and regeneration of transformed seedlings.
  • Transgenic calli are selected for the regeneration step. Seedlings are regenerated at from these different calluses, thus corresponding to different transformation events. Each seedling is cloned by multiplication.
  • each transgenic line is used for: the study of lignin structure by thioacidolysis (see above) on a stem fragment; to identify spatial variations in the amount of lignins, by infra-red imaging in FTIR-ATR ("Fourier Transformed! InfraRed Spectroscopy - Attenuated Total Reflectance") and histochemical staining with phloroglucinol.
  • Gateway compatible and specific binary vectors for the transformation of monocotyledons containing a sequence coding a micro-RNA of sequence SEQ
  • a constitutive promoter for example the maize ubiquitin promoter (ZmUbi), or a "specific lignin” promoter, and a selection gene such as the gene pat (conferring resistance to basta), are used for the genetic transformation of Brachypodium distachyon.
  • a constitutive promoter for example the maize ubiquitin promoter (ZmUbi), or a "specific lignin” promoter
  • a selection gene such as the gene pat (conferring resistance to basta)
  • a vector as described for the genetic transformation of Brachypodium can be used for the genetic transformation of maize.
  • the integrative vector L1038 (represented by the sequence SEQ ID NO: 80), which contains an expression cassette comprising a gene for resistance to a herbicide (Basta resistance gene), an expression cassette comprising a gene encoding a fluorescent protein to track the transgene without genotyping (gene encoding a GFP under the control of a Actin promoter), a "Gateway triple" cassette attR4-ccdB-attR3 (where attR4 and attR3 are recombination sites and ccdB is a negative selection gene), which makes it possible to recombine a promoter of choice (attL4-attR1 ends), a gene of choice (attL1-attL2 ends) (in this case a microRNA miR397) and a mock (attR1 -attL3) (see the User Manual published by Invitrogen, "MultiSite Gateway Pro", Version B, October 3, 2006).

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Abstract

La présente invention concerne l'obtention de plantes présentant une teneur réduite en lignines et dont la cellulolyse des parois est augmentée, par inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité dans ladite plante, de deux laccases.

Description

OBTENTION DE PLANTES A TENEUR REDUITE EN LIGNINES
La présente invention concerne un procédé de sélection ou d'obtention de plantes présentant une teneur en lignines réduite.
Les lignines sont des polymères insolubles situés dans les parois végétales et issus de la polymérisation de 3 monomères phénoliques (ou monolignols) , dérivant de la voie des phénylpropanoïdes (NEISH, Constitution and Biosynthesis of Lignin, eds New York: Springer Verlag, 1-43, 1968) . Leur voie de biosynthèse est complexe et comporte différentes étapes dont une partie est réalisée dans le cytoplasme (synthèse des monolignols) et une autre dans la paroi (polymérisation) . Les alcools p- coumarylique, coniférylique et sinapylique sont les précurseurs respectifs des unités p-hydroxyphényles (H) , guaïacyles (G) et syringyles (S) constituant les lignines. Ces précurseurs sont oxydés en radicaux phénoliques qui se couplent spontanément par diverses liaisons, ce qui conduit à la formation des lignines. Parmi les liaisons interunités, on distingue des liaisons labiles, nommées β-O-4 et des liaisons résistantes. Lors de la polymérisation, d'autres liaisons peuvent également s'établir avec d'autres composés pariétaux (polysaccharides et protéines) pour former un réseau tridimensionnel complexe. La formation des radicaux phénoliques serait catalysée par des oxydases, telles que des péroxydases, des laccases ou d'autres oxydases. Un nombre important de ces enzymes en association avec des protéines de régulation serait nécessaire à l'assemblage des unités H, G et S (BOUDET, Plant Physiol. Biochem., 38, 81-96, 2000 ; voir pour revue : RALPH et al., Lignins, Encyclopedia of Life Sciences, John Wiley & Sons, 2007). Toutefois ces enzymes sont encore mal identifiées car appartenant à des familles multigéniques (BARRIERE et al., Gènes, Génomes and Genomics ; Global Siences Books, 2007, Review) . Bien que les mécanismes impliqués in vivo dans la biosynthèse des lignines ne soient pas complètement élucidés, il est généralement considéré que les laccases pourraient intervenir dans les premières étapes de polymérisation, pour la formation de dimères ou trimères, tandis que les péroxydases permettraient d' obtenir un degré de polymérisation supérieur à partir des dimères et trimères (ROS BARCELO, International Review of Cytology, 176, 87-132, 1997) . La teneur en lignines des plantes a une influence majeure sur leurs utilisations industrielles. Par exemple, elle affecte la valeur nutritive des plantes destinées à l'alimentation animale, ainsi que les performances des procédés papetiers (rendement et qualité de la pâte à papier obtenue) et le rendement de production de biocarburant. En effet : une composante importante de la valeur nutritionnelle des plantes fourragères, telles que le maïs fourrager, est la digestibilité . Ainsi, des vaches nourries avec des variétés plus digestibles présentent une augmentation de la production de lait et une meilleure prise de poids. En outre, ces variétés plus digestibles permettent aux animaux d'atteindre leur potentiel avec un plus faible niveau de complémentation, ce qui permet en particulier de réduire les coûts de production. Un facteur important limitant la digestibilité des plantes fourragères est lié à la présence, dans les parois des cellules végétales, de lignines : les lignines établissent différents types de liaisons avec les autres constituants pariétaux (dont les polysaccharides) et gênent l'accessibilité des enzymes digestives aux polysaccharides (glucides), principales sources d'énergie pour les herbivores ;
- l'essentiel de la pâte à papier est obtenu par délignification chimique du bois, afin d'isoler les fibres végétales constituées principalement de cellulose et liées en elles par les lignines. Cependant, cette étape de délignification est très exigente en énergie et en réactifs
(acides notamment), en raison de la résistance des lignines aux dégradations chimiques. Dans le cas de la production de pâte à papier par voie thermo-mécanique, les lignines qui ne sont pas éliminées sont responsables du photojaunissement du papier. Les lignines riches en unités
S sont plus sensibles aux procédés papetiers de délignification dans la mesure où les unités S sont surtout liées par liaisons β-0-4 (liaisons cibles de ces procédés). En conséquence, dans le cas des bois de feuillus employés par les industies papetières, une plus forte teneur en unités S liées en β-0-4 est recherchée dans le secteur papetier pour améliorer le rendement de la cuisson papetière (GUERRA et al., Ind. Eng. Chem. Res., 47, 8542- 8549, 2008) ;
- les biocarburants sont formés à partir de bioéthanol (un produit miscible à l'essence) ou d'huile
(pour fabriquer un produit diesel) . La production de bioéthanol, réalisée actuellement à partir d'amidon ou de saccharose, pourrait aussi s'effectuer à partir de la cellulose du bois ou de la paille. Dans ce cas, le procédé de production comprend les étapes suivantes : prétraitement acide de la matière première pour rompre les interactions entre lignines et polysaccharides (ce prétraitement facilite l'action d'enzymes hydrolytiques qui transforment les polysaccharides de la paroi en sucres simples), suivi d'une étape de fermentation des sucres simples, conduisant à la production de bioéthanol. Cependant, le prétraitement acide initial entraîne la production de composés capables d'inhiber l'étape de fermentation. Il a donc été suggéré qu'en modifiant les lignines, les polysaccharides pariétaux seraient plus accessibles aux enzymes hydrolytiques. Cela permettrait non seulement de supprimer ou limiter le prétraitement acide et les problèmes associés d' inhibition de la fermentation, mais aussi de diminuer les impacts environnementaux liés aux résidus des traitements par 1' acide . Dans ce contexte, la modification quantitative des lignines dans les plantes fait l'objet de nombreuses recherches. La modification qualitative des lignines (modification de leur structure ou de leurs interactions avec les autres polymères des parois) est également très étudiée. Par exemple, des lignines riches en unités S et en liaisons β-0-4 sont beaucoup plus faciles à éliminer lors de la production de pâte à papier par voie chimique.
Une des voies privilégiées pour diminuer la teneur en lignines dans les plantes concerne la production par génie génétique de plantes. Il a ainsi été proposé d' agir sur les enzymes de la voie de biosynthèse des lignines, telles que les laccases (Demande Internationale WO 97/45549) , les péroxydases (Demande Internationale WO 2004/080202) la Cinnamoyl CoA réductase (CCR ; Demandes Internationales WO 97/12982 et WO 98/39454), l'acide caféique O-méthyltransférase (COMT ; Demande Internationale WO 94/23044 ; OBA et ALLEN, J. Dairy Sci . , 82, 135-142, 1999) , la Caféoyl Coenzyme A 3-0 méthyltransférase (CCoAOMT ; Demande EP 0516958 ; GUO et al., Transgenic Res. 10, 457-464, 2001), la Cinnamyl alcool déshydrogénase (CAD ; LAPIERRE et al., Plant Physiol., 119, 153-164, 1999), et la 4-coumarate : coenzyme A ligase (4CL ; HU et al., Nat. Biotech. 17, 808-812, 1999). En ce qui concerne plus particulièrement les laccases, la Demande Internationale WO 97/45549 décrit une laccase de tabac (dont la séquence est par ailleurs décrite par KIEFER-MAYER et al., Gène, 178, 205-207, 1996), et propose d'augmenter ou de réduire la quantité de lignines produite par une plante en surexprimant ladite laccase (ou une protéine présentant au moins 50% d'acides aminés homologues à ceux de ladite laccase), ou en inhibant son expression .
Chez Arabidopsis thaliana, la famille multigénique des laccases comporte 17 membres, dont 7 sont exprimés au niveau des tiges, l'organe le plus lignifié. Les gènes les plus fortement exprimés sont LAC4 (At2g38080), LACll (At5g60020) et LAC2 (At2g29130). Les gènes LAC2 et LACll appartiennent à la même sous-classe et le gène LAC4 appartient à une sous-classe proche selon les arbres phylogénétiques publiés par POURCEL et al. (Plant CeIl, 17, 2966-2980, 2005) et CAPARROS-RUIZ et al. (Plant Science, 171, 217-225, 2006). Le gène LACll code pour la protéine LAC17 (AtLAC17), dont la séquence est disponible sous le numéro d'accession NM_125395 dans la base de données GENBANK, et est également reproduite dans la liste de séquences en annexe sous l'identifiant SEQ ID NO : 2. Le gène LAC4 code pour la protéine LAC4 (AtLAC4), dont la séquence est disponible sous le numéro d'accession NM_129364 dans la base de données GENBANK, et est également reproduite dans la liste de séquences en annexe sous l'identifiant SEQ ID NO : 4. Le gène LAC2 code pour la protéine LAC2 (AtLAC2), dont la séquence est disponible sous le numéro d'accession NM_128470 (GI : 186503951) dans la base de données GENBANK. Chez Arabidopsis AtLAC17 est exprimée au niveau des fibres interfasciculaires . Les Inventeurs ont ainsi mis en évidence que les protéines orthologues de la protéine AtLAC17 présentent au moins 60% d'identité ou au moins 75% de similarité avec celle-ci et comprennent, de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale, au moins l'un des 4 domaines peptidiques consensus de séquence :
• H-W-H-G-I/V-R-Q-L (SEQ ID NO : 12 ; acides aminés correspondant aux positions 80-87 de la séquence peptidique d'AtLAC17) ou H-W-H-G-I/V-R/L-Q-L/M/V (SEQ ID NO : 38) , • I/V-N-A-A-L-N-D-E-L-F-F (SEQ ID NO : 13 ; acides aminés correspondant aux positions 223-233 de la séquence peptidique d'AtLAC17) ou I-N-A/S-A-L-N/E-D/N/E-E-L-F-F (SEQ ID NO : 39) ,
• E-S-H-P-L-H-L-H-G-F/Y-N/D-F-F-V-V-G-Q-G-F/Y-G-N-F/Y-D (SEQ ID NO : 14 ; acides aminés correspondant aux positions 476-498 de la séquence peptidique d'AtLAC17), ou E-S-H-P-L/F-H-L/M-H-G-F/Y-N/D-F/Y-F/Y-V-V/I-G-Q/T/E- G-F/V/T-G-N-F/Y-D/N (SEQ ID NO : 40) et
• A-D-N-P-G-V-W (SEQ ID NO : 15 ; acides aminés correspondant aux positions 539-546 de la séquence peptidique d'AtLAC17), ou A/V-D-N-P-G-V/0-W/0 (SEQ ID
NO : 41), où « 0 » indique qu'un acide aminé est absent, respectivement .
A titres d'exemples non-limitatifs d' orthologues de la protéine LAC17 d'Λ. thaliana , on citera notamment les laccases de :
-maïs ( Zea mays) de séquences SEQ ID NO : 5 et
6 (séquences également disponibles sous les numéros d'accession NM_001112405.1 et EU957078 dans la base de données GENBANK) et les séquences disponibles dans la base de données GENBANK sous les numéros d'accession
GI:162461426 (SEQ ID NO : 42), GI:226503958 (SEQ ID NO :
43), GI:226494660 (SEQ ID NO : 44), GI:212721074 (SEQ ID
NO : 45), GI.162463584 (SEQ ID NO : 46) et GI.162461268
(SEQ ID NO : 47) , - de la canne à sucre (Saccharum offieinarum) de séquence SEQ ID NO : 7,
- du sorgho {Sorghum bicoior) de séquences SEQ ID NO : 8, 9, 10 et 11, de Brachypodium, telles que les séquences Bradilg66720 (SEQ ID NO : 48), Bradi2g54680 (SEQ ID NO : 49), Bradilg24910 (SEQ ID NO : 50), Bradilg24880 (SEQ ID NO : 51), Bradi2g54740 (SEQ ID NO : 52), Bradi2g23370 (SEQ ID NO : 53), Bradi2g23350 (SEQ ID NO : 54) et Bradi2g54690 (SEQ ID NO : 55) , - de riz, telles que les séquences disponibles dans la base de données GENBANK sous les numéros d'accession GI:113548170 (SEQ ID NO : 56), GI.113534304
(SEQ ID NO : 57), GI:113579298 (SEQ ID NO : 58),
GI.113579297 (SEQ ID NO : 59), GI:113534303 (SEQ ID NO : 60), GI.113579295 (SEQ ID NO : 61), GI.255673866 (SEQ ID
NO : 62) (ces séquences possèdent le domaine référencée sous le numéro d'accès IPR017761 dans la base de données InterPro) , et
- de peuplier, telles que les séquences PtLACl (gène POPTR_0001sl4010.1 ; SEQ ID NO : 63), PtLAC40 (POPTR_0001s41160.1 ; SEQ ID NO : 64), PtLAC41 (POPTR_0001s41170.1 ; SEQ ID NO : 65), PtLAC6 (POPTR_0001s41170.1 ; SEQ ID NO : 66), PtLAC24 (POPTR_0011sl2090.1 ; SEQ ID NO : 67) et PtLAC25 (POPTR_0011sl2100.1 ; SEQ ID NO : 68). Le tableau représenté à la Figure 5 montre la présence (notée dans le tableau par le signe « X ») des domaines peptidiques consensus tels que définis ci-dessus dans les séquences des orthologues de la protéine AtLAC17 chez Zea mays, S. officinarum, Sorghum bicolor, Brachypodîum, le peuplier et le riz, ainsi que les pourcentages d'identité et de similarité respectifs par rapport à AtLAC17.
La protéine LAC17 présente 55,2% d'identité avec la protéine LAC4, et 67,1% d'identité avec la protéine LAC2 mais cette dernière ne comprend pas le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 14, et 54,6% d' identité avec la laccase de tabac décrite dans la Demande Internationale WO 97/45549 ; la protéine LAC4 présente 54,0% d'identité avec la protéine LAC2 et 75,8 d'identité avec la laccase de tabac décrite dans la Demande Internationale WO 97/45549 (il apparait que ladite laccase de tabac est l'orthologue de la protéine AtLAC4) , les pourcentages d' identité étant calculés sur toute la longueur des séquences à l'aide du programme needle (NEEDLEMAN et WUNSCH, J. Mol. Biol., 48, 443-453, 1970) en utilisant les paramètres par défaut : « Matrix » : EBLOSUM62, « Gap penalty » : 10,0 et « Extend penalty » : 0,5. Chez Arabidopsis, AtLAC4 est exprimée au niveau des vaisseaux du xylème et dans les fibres interfasciculaires . A titres d'exemples non-limitatifs d' orthologues de la protéine LAC4 d'A. thaliana , on citera notamment les laccases de : Brachypodium, telle que la séquence
Bradilg74320 (SEQ ID NO : 69), qui présente 67% d'identité et 83% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 4,
- riz, telle que la séquence disponible dans la base de données GENBANK sous le numéro d'accession
GI: 150383842 (QOIQUl ; SEQ ID NO : 70), qui présente 69% d'identité et 83% de similarité avec la séquence SEQ ID
NO : 4, et peuplier, les séquences PtLAC14 (POPTR_0006s09830.1 ; SEQ ID NO : 71, qui présente 75% d' identité et 87% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 4), PtLAC15 (POPTR_0006s09840.1 ; SEQ ID NO : 72, qui présente 76% d'identité et 87% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 4), PtLAC32 (POPTR_0016sll950.1 ; SEQ ID NO : 73, qui présente 78% d'identité et 88% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 4) et PtLAC33
(POPTR_0016sll960.1 ; SEQ ID NO : 74, qui présente 77% d' identité et 87% de similarité avec la séquence SEQ ID
NO : 4) . Des lignées d'A. thaliana de la collection SALK dans l'accession CoIO (Columbia) présentant des insertions d'ADN-T au niveau des gènes LACIl (lignée SALK_016748 ) , LAC4 (lignée SALK_051892 ) et LAC2 (lignée SALK_025690) ont été identifiées. Les mutants Iac4 et Iac2 ont notamment été décrits par BROWN et al. (Plant CeIl, 17, 2281-2295, 2005). Ces mutants présentent une expression du gène muté fortement réduite ou nulle mais ne présentent pas de phénotype particulier en serre.
Les Inventeurs ont recherché si ces mutations avaient un effet sur la quantité de lignines des plantes mutées, et leurs propriétés qualitatives (structurales) . Ils ont constaté que le mutant Iac2 ne présentait pas de différence notable par rapport à la lignée sauvage CoIO, mais qu'en revanche, les mutants Iac4 et lacll contenaient une quantité de lignines (déterminée sur des tiges sèches matures) réduite de 6 a 8% et présentaient un rendement en cellulolyse augmenté de 17% dans le cas de lacll et de 52% dans celui de Iac4, par rapport à la lignée sauvage CoIO (cellulolyse effectuée sans prétraitement acide) .
En outre, les Inventeurs ont obtenu par croisement, à partir des mutants Iac4 et lacll, des double- mutants Iac4/lacl7. Ils ont constaté que ces double-mutants présentaient une quantité de lignines très réduite (de 19% environ par rapport à la lignée sauvage CoIO), et un meilleur rendement en cellulolyse par rapport à la lignée sauvage CoIO (+ 25% à + 42%) et au simple mutant lacll (+ 6% à + 21%) environ.
En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé pour réduire la teneur en lignines d'une plante et augmenter la cellulolyse des parois de ladite plante, caractérisé en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité dans ladite plante : a) d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 60% d'identité, et par ordre de préférence croissant au moins 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, ou au moins 75% de similarité, et par ordre de préférence croissant au moins 78%, 79%, 80%, 83%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2 (LAC17), et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, au moins l'un des 4, de préférence au moins 2 des 4, de préférence encore au moins 3 des 4 et plus préférentiellement les 4 domaines peptidiques consensus i) à iv) respectivement, suivants : i) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 12 ou 38, ii) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 13 ou 39, iii) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 14 ou 40, iv) le domaine peptidique consensus de séquence
SEQ ID NO : 15 ou 41, et b) d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 65% d'identité, et par ordre de préférence croissant au moins 70%, 75%, 80%, 85%,
90%, 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, avec la séquence SEQ ID NO: 4 (LAC4) .
On entend par « teneur en lignines », la teneur en lignines Klason. Cette teneur peut être mesurée par le dosage de la fraction de lignine acido-insoluble (LAS) présente dans le résidu pariétal (RP) d'une plante, tel que décrit à l'Exemple 3 ci-dessous.
On entend par « laccase » une enzyme (EC 1.10.3.2) à cuivre qui catalyse l'oxydation d'un substrat phénolique en utilisant le dioxygène comme accepteur final d' électrons . Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité indiqués ici sont établis, comme indiqué ci- dessus, à l'aide du programme needle en utilisant les paramètres par défaut.
La présente invention s'applique aux plantes dicotylédones ou monocotylédones . A titre d'exemples non limitatifs, elle peut s'appliquer au maïs, blé, orge, seigle, triticale, avoine, riz, sorhgo, canne à sucre, peuplier et pin.
A titre d'exemples non limitatifs de laccases, telles que définies au paragraphe a) ci-dessus, on peut citer, chez le maïs {Zea mays) , les séquences peptidiques SEQ ID NO : 5, 6 et 42 à 47, chez la canne à sucre (Saccharum officinarum) , la séquence SEQ ID NO : 7, chez le sorgho (Sorghum bicolor) , les séquences peptidiques SEQ ID NO : 8 à 11, chez Brachypodium, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 48 à 55), chez le riz, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 56 à 62, et chez le peuplier, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 63 à 68.
A titre d'exemples non limitatifs de laccases, dont la séquence polypeptidique possède au moins 60% d'identité ou au moins 75% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, les 4 domaines peptidiques consensus de séquence SEQ ID NO : 12, 13, 14 et 15 respectivement, on peut citer chez le maïs, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 5, 6, 42, 43, 44 et 45, chez la canne à sucre, la séquence peptidique SEQ ID NO : 7, chez le sorgho, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 8 (séquence partielle de la protéine), 9, 10 et 11, chez Brachypodium, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 50 et 51, chez le riz, la séquence peptidique SEQ ID NO : 58, et chez le peuplier, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 63, 67 et 68.
A titre d'exemples non limitatifs de laccases, dont la séquence polypeptidique possède au moins 65% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 4, on peut citer chez Brachypodium, la séquence peptidique SEQ ID NO : 69, chez le riz, la séquence peptidique SEQ ID NO : 70 et chez le peuplier, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 71 à 74.
L' inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité d'une laccase telle que définie ci-dessus peut être obtenue de diverses manières, par des méthodes connues en elles mêmes.
De manière particulièrement avantageuse, cette inhibition peut être obtenue en intervenant en amont de la production de ladite laccase, par mutagenèse du gène codant pour cette protéine, ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de cette laccase.
La mutagenèse du gène codant pour ladite laccase peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression, notamment du promoteur. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène. A titre d'exemple, pour le maïs, on citera la mutagenèse insertionnelle : on produit un grand nombre d'individus dérivant d'une plante active pour la transposition d'un élément transposable (élément AC ou Mutator) , et on sélectionne, par exemple par PCR, les plantes chez lesquelles une insertion s'est effectuée dans le gène de ladite laccase. Cette séquence exogène peut aussi être un ADN-T (fragment du plasmide Ti d' Agrobacterium tumefaciens) .
On peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles avec des agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Ces mutations ont pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou de modifier le niveau de la transcription et/ou de la traduction du gène et/ou de rendre l'enzyme moins active que la protéine sauvage. Les allèles mutés du gène de ladite laccase peuvent être identifiés par exemple par PCR a l'aide d'amorces spécifiques dudit gène.
Dans ce cadre, on peut notamment utiliser des techniques de type « TILLING » (Targeting Induced Local Lésions IN Génomes ; McCALLUM et al, Plant Physiol., 123, 439-442, 2000) .
On peut aussi effectuer une mutagenèse dirigée, ciblant le gène codant pour ladite laccase. L'inhibition ou la modification de la transcription et/ou de la traduction peuvent être obtenues par l'expression d'ARN sens, antisens ou double-brin dérivés du gène de ladite laccase, ou de l'ADNc de cette protéine, ou bien par l'utilisation d'ARNs interférents (pour revue sur les techniques d' inhibition antisens voir par exemple : WATSON et GRIERSON, Transgenic Plants : Fundamentals and Applications (HIATT, A, ed) New York : Marcel DEKKER, 255-281, 1992 ; CHICAS et MACINO, EMBO reports, 21, 992-996, 2001 ; pour revue concernant plus spécifiquement l'utilisation des ARNs interférents voir HANNON, Nature, 418, 244-251, 2002).
La présente invention a également pour objet une construction d'ADN recombinant, comprenant un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression des deux laccases telles que définies ci-dessus. A titre d'exemples non limitatifs, lesdits polynucléotides peuvent coder pour des ARN antisens, des ARN interférents (ARN double brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides) , des micro-ARN (ARN simple brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides) (OSSOWSKI et al., The Plant Journal, 53, 674-690, 2008 ; SCHWAB et al., Methods Mol Biol . , 592, 71-88, 2010 ; WEI et al., Funct Integr Genomics . , 9, 499-511, 2009) ou des ribozymes ciblant le gène codant pour une laccase telle gue définie ci-dessus .
De préférence, lesdits polynucléotides capables d'inhiber l'expression des laccases LAC4 et LA17 telles que définies ci-dessus, sont des micro-ARN, tels que les micro- ARN miR397 et miR408, de préférence miR397. A titre d'exemples non limitatifs de tels micro-ARN, on peut utiliser ceux de séquences suivantes :
- SEQ ID NO : 75 (AtmiR397a) ou SEQ ID NO : 76 (AtmiR397b) , obtenues chez Arabidopsis thalina (ABDEL-GHANY et PILON, J Biol Chem. , 283, 15932-15945, 2008) ;
- SEQ ID NO : 77 (ptc-miR397 ) , obtenues chez le peuplier ; ou
- SEQ ID NO : 78 (Bdi-miR397a) ou SEQ ID NO : 79 (Bdi-miR397b) , obtenues chez Brachypodium distachyon
(ZHANG et al., BMC Genomics., 23, 10:449, 2009 ; UNVER et BUDAK, Planta, 230, 659-669, 2009) .
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la construction d'ADN recombinant est choisie parmi :
- une construction d'ADN comprenant un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 20 nucléotides consécutifs de l'ADNc du gène codant pour une laccase telle que définie ci-dessus, - une construction d'ADN de 200 à 1000 pb, comprenant un fragment du l'ADNc du gène codant pour une laccase telle que définie ci-dessus, ou un polynucléotide complémentaire, qui lorsqu'elle est transcrite forme un ARN en épingle à cheveux (ARN hairpine ou ribozyme) ciblant ledit gène ; - une construction d'ADN, capable, lorsqu'elle est transcrite, de former un micro-ARN ciblant le gène codant pour une laccase telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite construction d'ADN recombinant comprend un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 20, et de manière tout à fait préférée au moins 50 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 3, ou d'un polynucléotide complémentaire d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 3.
Ces constructions peuvent être notamment :
- des cassettes d'expression, comprenant une ou plusieurs constructions d'ADN recombinant telles que définies ci-dessus, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ces cassettes d'expression peuvent également comprendre, avantageusement, d'autres éléments de régulation, en particulier des éléments de régulation de la transcription tels que terminateurs, amplificateurs, etc. ; - des vecteurs recombinants, comprenant une ou plusieurs constructions d'ADN recombinant telles que définies ci-dessus, ou avantageusement une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
Des constructions d'ADN recombinant conformes à l'invention peuvent également comprendre d'autres éléments, par exemple un ou plusieurs marqueurs de sélection.
L'homme du métier dispose d'un très large choix d'éléments utilisables pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant conformes à l'invention. A titre d'exemples non-limitatifs de promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera : des promoteurs constitutifs, tels que le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), ou ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande Internationale WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine du maïs ou le promoteur « Actine-Intron-actine » du riz (McELROY et al., Mol. Gen. Genêt., 231, 150-160, 1991 ; GenBank numéro d'accès S 44221) . - des promoteurs inductibles ou tissu- spécifiques, afin de ne modifier la teneur ou la composition en lignines qu'à certains stades du développement de la plante, dans certaines conditions environnementales, ou dans certains tissus-cibles, comme par exemple, les tiges, les feuilles, les graines, les spathes, le cortex ou le xylème (e.g., le promoteur de cinnamyl alcool déshydrogénase (CAD) ou de la 4 coumarate- CoA ligase (4CL) ) .
A titre d'exemples non-limitatifs d'autres éléments de régulation de la transcription utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera des terminateurs , tels que le terminateur 3'NOS de la nopaline synthase (DEPICKER et al., J. Mol. Appl. Genêt., 1, 561- 573, 1982), ou le terminateur 3'CaMV (FRANCK et al., CeIl, 21, 285-294, 1980 ; GenBank numéro d'accès V00141).
A titre d'exemples non-limitatifs de gènes marqueurs de sélection utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera notamment des gènes conférant une résistance à un antibiotique (HERRERA-ESTRELLA et al., EMBO J., 2, 987-995, 1983) tel que l' hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine, ou à un herbicide (EP 0 242 246) tels que le glufosinate, le glyphosate ou la bromoxynil, ou le gène NPTII qui confère la résistance à la kanamyine (BEVAN et al., Nucleic Acid Research, 11, 369-385, 1984).
La transformation des plantes peut s'effectuer par de nombreuses méthodes, connues en elles-mêmes de l'homme du métier.
On peut par exemple transformer des cellules végétales, des protoplastes ou des explants, et régénérer une plante entière à partir du matériel transformé. La transformation peut ainsi être réalisée, à titre d'exemples non-limitatifs : par transfert des vecteurs conformes à l'invention dans des protoplastes, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol (PEG) en présence de cations divalents
(Ca2+) selon la méthode décrite dans l'article de KRENS et al. (Nature, 296, 72-74, 1982) ; par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article de FROMM et al. (Nature, 319, 791-793, 1986) ;
- par utilisation d'un canon à gène permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, délivrant ainsi des gènes à l'intérieur du noyau cellulaire, notamment selon la technique décrite dans l'article de FINER et al. (Plant CeIl Report, 11, 323-328, 1992) ;
- par micro-injection cytoplasmique ou nucléaire.
On peut également utiliser Agrobacterium tumefaciens, notamment selon les méthodes décrites dans les articles de BEVAN et al. (Nucleic Acid Research, 11, 369- 385, 1984) et d'AN et al. (Plant Phydiol., 81, 86-91, 1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de JOUANIN et al. (Plant Sci., 53, 53-63, 1987). Par exemple, la transformation de cellules végétales peut être effectuée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extra-chromosomique inducteur de tumeurs Ti d' Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al., Ed. De Boeck Université, 273-292, 1994) . On peut aussi utiliser Agrobacterium tumefaciens sur des plantes entières, par exemple par dépôt au niveau de la blessure d'une plante monocotylédone, de la bactérie hébergeant l'ADN à transférer, en présence de substances libérées au niveau de la blessure d'une plante dicotylédone . La présente invention a également pour objet une cellule végétale comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet les plantes susceptibles d' être obtenues par un procédé conforme à l'invention, à l'exception des mutants d' A. thaliana SALK_016748 et SALK_051892. Lesdites plantes peuvent porter des mutations inhibant les laccases LAC4 et LA17 telles que définies ci-dessus ou exprimer un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression lesdites laccases LAC4 et LA17 tels que définis ci-dessus. Bien entendu, la présente invention englobe les descendants, notamment les hybrides issus d'un croisement impliquant au moins une plante selon l'invention, obtenus par semis ou par multiplication végétative, des plantes directement obtenues par le procédé de l'invention.
Le matériel végétal, tel que protoplastes, cellules, cals, feuilles, tiges, racines, fleurs, fruits, boutures et/ou graines, obtenu a partir des plantes conformes à l'invention (à l'exception des mutants d' A. thaliana SALK_016748 et SALK_051892) fait également partie de l'objet de la présente invention.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des plantes conformes à l'invention ou de matériel végétal obtenu à partir desdites plantes pour la production de plantes fourragères, de biocarburants ou de pâte à papier.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la réduction de la teneur en lignines et l'augmentation de la cellulolyse des parois d'une plante dont l'expression des laccases LAC17 et/ou LAC4 est inhibée, ainsi que des figures annexées :
Figure 1 : analyse par électrophorèse sur gel d' agarose 1% des produits de PCR obtenus à partir d'ADN génomique des lignées SALK_016748 (mutant lacll) (Figure
A), SALK_051892 (mutant Iac4) (Figure B) et SALK_025690
(mutant Iac2) d' A. thaliana (Figure C) . A : Puits 1 : marqueur de taille IKb+ (Invitrogen) ; Puits 2 : tubuline de la lignée sauvage CoIO ; Puits 3 : laccase 17 de la lignée sauvage ; Puits 4 et 6 : tubuline de 2 plantes de la lignée SALK_016748 {lacll) ; Puits 5 et 7 : laccase 17 de 2 plantes de la lignée SALK__016748 {lacll) . B : Puits 1 : marqueur de taille IKb+ (Invitrogen), Puits 2 : vide ; Puits 3 : tubuline la lignée sauvage CoIO ; Puits 4 : vide ; Puits 5 à 7 : tubuline de 3 plantes de la lignée SALK__051892 {lacé) ; Puits 8 : vide ; Puits 9 : laccase 4 de la lignée sauvage CoIO ; Puits 10 : vide ; Puits 11 à 13 : laccase 4 de 3 plantes de la lignée SALK_051892 {Iac4) . C : Puits 1 et 12 : marqueur de taille IKb+
(Invitrogen) ; Puits 2 à 6 et 11 : vides ; Puit 7 : laccase
2 de la lignée sauvage CoIO (ADNc) ; Puit 8 : laccase 2 d' 1 plante de la lignée sauvage CoIO (ADNg) ; Puits 9 : laccase
2 d' 1 plante de la lignée SALK_025690 ; Puits 10 : témoin, laccase 2 amplifiée sur ARN de plante de la lignée sauvage CoIO ayant subi le même traitement que les autres plantes à la différence qu'au cours de l'étape de rétro- transcription, la réverse transcriptase n' a pas été ajoutée ; Figure 2 : analyse du profil d'expression de laccases (LAC 2, 4, 5, 6, 10, 11, 12 et 17) d' A. thaliana par électrophorèse sur gel d' agarose 1% dans du tampon TAE des produits de RT-PCR obtenus à partir d'ADNc des cellules de la hampe florale de la lignée sauvage CoIO, de la lignée SALK_051892 {Iac4) et de la lignée SALK_016748 {lacll). Tub = tubuline ;
Figure 3 : observation au microscope optique (grossissement 200X) de coupes transversales de 70 microns d'épaisseur de hampe primaire de 20 cm colorées au phloroglucinol-HCl, à partir de la lignée sauvage CoIO et de la lignée SALK 016748 {lacll) ; Figure 4 : analyse par électrophorèse sur gel d' agarose 1% des produits de PCR obtenus à partir d'ADN génomique d'un double mutant d' A. thaliana Kim {Iac4/lacl7) . Puits 1 : marqueur de taille IKb+ (Invitrogen) ; Puits 2 : tubuline de la lignée sauvage ; Puits 3 : tubuline du mutant Kim ; Puits 4 : laccase 4 de la lignée sauvage ; Puits 5 : laccase 4 du mutant Kim ; Puits 6 : laccase 17 de la lignée sauvage ; Puits 7 : laccase 17 du mutant Kim. EXEMPLE 1 : SELECTION, GENOTYPAGE ET
CARACTERISATION DE MUTANTS Iacl7, Iac4 ET Iac2 O'ARABIDOPSIS THAiIANA
1) Sélection des mutants laccase d' A. thaliana Des lignées d' A. thaliana de la collection SALK dans l'accession CoIO présentant des insertions de l' ADN-T au niveau des gènes LACl 7, LAC4 et LAC2 (respectivement les lignées SALK_016748, SALK_051892 et SALK_025690) ont été identifiées et caractérisées.
Le mutant SALK_016748 [lacll) contient deux ADN-T insérés en tandem inversé dans le promoteur du gène codant pour LAC17, à 146 paires de bases du codon d' initiation ATG.
Le mutant SALK_051892 {lad) contient un ADN-T inséré dans le promoteur du gène codant pour LAC4, à 127 paires de bases du codon d'initiation ATG.
Le mutant SALK_025690 {Iac2) contient un ADN-T inséré dans sa séquence codante.
2) Génotypage des mutants lacll (SALK 016748), Iac4 (SALK 051892) et Iac2 (SALK 025690) d' A. thaliana a) Matériel et Méthodes
Des amorces pour les gènes LACIl1 LAC4 et LAC2 ont été définies à l'aide du logiciel OLIGO 4 (National Biosciences Inc., Plymouth, USA). Leurs séquences (5'->3') sont représentées dans le Tableau 1 ci-après : Tableau 1 :
Séquence de l' amorce Séquence de l' amorce sen∑ antisens
Amorces pour Lac 17 FST dir: Lac 17 FST rev: l' amplification TCG AAG AGG GTC AAA TCT TAG CCA TGA AAT du gène LACl 7 GAG TTT (SEQ ID NO : GTG AGC (SEQ ID NO :
16) 17)
Amorces pour irxl2 FST dir irxl2 FST
Figure imgf000021_0001
1' amplijrication ATT GTG TAA GCA AAT TGG CTT GCT TGA GCA du gène LAC4 CGG CAC (SEQ ID NO : TAA TCT (SEQ ID NO :
18) 19)
Amorces pour Lac 2 RT dir : Lac 2 RT rev :
1' amplification GCA AGA CAA AAA CAA GAA ATC TGA GGG TGG du gène LAC2 TCG TGA (SEQ ID NO : AGG AAG (SEQ ID NO :
20) 21)
L 'ADN des plantes a été extrait selon le protocole décrit par EDWARDS et al. (Nucleic Acid Research, 19, 1349, 1991) .
Les PCR ont été réalisées dans 25 μl sur 30 ng d'ADN génomique, avec 2 mM de MgC12, 0,4 mM de chaque dNTP, 0,4 mM de chaque amorce, 1,25 unités de Taq DNA polymérase (Invitrogen) Les cycles PCR pour le génotypage des mutants lacll sont (95°C 30 sec, 500C 30 sec, 72°C 1 mn) 28 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C.
Les cycles PCR pour le génotypage des mutants lacé sont (95°C 30 sec, 58°C 30 sec, 720C 30 sec) 30 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C.
Les cycles PCR pour le génotypage des mutants Iac2 sont (95°C 30 sec, 54°C 30 sec, 72°C 1 mn 30 sec) 30 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C.
Les produits de PCR sont ensuite séparés sur des gels d' agarose 1% dans du tampon TAE. b) Résultats
2 plantes de la lignée SALK_016748, 3 plantes de la lignée SALK_051892 et 1 plante de la lignée SALK_025690 ont été testées. Les résultats du génotypage sont représentés à la Figure 1 :
- les 2 plantes de la lignée SALK_016748 testées sont homozygotes pour la mutation dans le gène LACl 7 : la présence des ADN-T sur les deux brins codant de ce gène empêche l'amplification d'un fragment du gène LACl 7 (Figure IA) ;
- les 3 plantes de la lignée SALK_051892 testées sont homozygotes pour la mutation dans le gène LAC4 : la présence de l' ADN-T sur les deux brins codant de ce gène empêche l'amplification d'un fragment du gène LAC4 (Figure IB) ;
- la plante de la lignée SALK__025690 testée est homozygote pour la mutation dans le gène LAC2 : la présence de l' ADN-T sur les deux brins codant de ce gène empêche l'amplification d'un fragment du gène LAC2 (Figure IC).
3) Expression des laccases chez les mutants lacll et Iac4
Le profil d'expression de laccases d' Arabldopsis exprimées dans la hampe florale chez la lignée sauvage (Columbia) , le mutant lacll (SALK_016748 ) et le mutant lacé (SALK_051892 ) a été déterminé par RT-PCR. a) Matériel et Méthodes
Une RT-PCR de 26 cycles a été effectuée sur des
ADNc obtenus à partir d' 1 μg d'ARN extrait à l'aide d'un kit RNeasy (Qiagen) , traités avec une DNase et rétro- transcrits avec la réverse-transcriptase SSRTII
( Invitrogen) .
Les amorces utilisées sont décrites dans le Tableau 2 ci-après :
Figure imgf000023_0001
Les couples d'amorces dits « FST » (pour Flanking Séquence Tag) ont été dessinés de part et d'autre de l'ADN-T ; ils ont été utilisés pour amplifier sur de 1'1'ADNg (génomique) . Les couples d'amorces dits « RT » ont été définis dans la séquence codante et permettent d'amplifier sur des ADNc.
Les cycles RT-PCR sur les mutants lacll, Iac4 et la lignée sauvage sont (95°C 30 sec, 500C 30 sec, 72°C 1 mn 30) 26 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C pour les laccases 2, 4, 6, 12, 17 et les tubulines.
Les cycles RT-PCR sur les mutants lacllr Iac4 et la lignée sauvage sont (95°C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 1 mn 30) 26 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C pour les laccases 5 et 10. Les cycles RT-PCR sur les mutants lacll, Iac4 et la lignée sauvage sont (95°C 30 sec, 58°C 30 sec, 72°C 1 mn 30) 26 fois, avec une extension finale de 10 mn à 720C pour la laccase 11.
Les produits de RT-PCR sont ensuite séparés sur des gels d' agarose 1% dans du tampon TAE pour visualiser une différence d'intensité des fragments amplifiés. b) Résultats
Les résultats sont représentés à la Figure 2. Seul le taux des transcrits de la laccase 17 (LAC17) diminue chez le mutant lacll et celui de la laccase 4 (LAC4) chez le mutant lad. Les mutants ne sur-expriment aucune autre laccase dans le but de compenser la perte d'expression de LAC17 et LAC4.
4) Analyse cytologique du mutant lacll a) Matériel et Méthodes
Des coupes de hampe primaire de 20 cm ont été colorées au phloroglucinol-HCl selon le protocole décrit par SIBOUT et al. (Plant CeIl, 17, 2059-2076, 2005). La coloration rouge observée correspond aux parois cellulaires lignifiées. b) Résultats
Les résultats de l'observation cytologique sont représentés à la Figure 3. Un retard et/ou une diminution de la quantité de lignine déposée sur les parois cellulaires est observé chez le mutant lacll mais pas chez la lignée sauvage (Figure 3) .
EXEMPLE 2 : OBTENTION ET CARACTERISATION MOLECULAIRE D'UN DOUBLE MUTANT Iacl7/lac4 D' ARABJDOPSIS THAiIANA a) Matériel et Méthodes
Des plantes de la lignée SALK_016748 {lacll) ont été croisées avec des plantes de la lignée SALK_051892 {Iac4) pour obtenir un double mutant Iac4/lacl7 (dénommé ci-après mutant Kim) . Le double mutant Iac4/lacl7 a ensuite été caractérisé par génotypage en suivant le protocole décrit à l'Exemple l.a) et en utilisant les amorces Iac4 FST dir, Iac4 FST rev, irxl2 FST dir et irxl2 FST rev. b) Résultats Les résultats du génotypage pour le mutant Kim sont représentés à la Figure 4 : le mutant Kim est homozygote pour les mutations dans les gènes LACIl et LAC4. En effet, la présence des ADN-T sur les deux brins codant de ces gènes empêche l'amplification d'un fragment des gènes LACIl et LAC4.
La présence de deux ADN-T dans le promoteur du gène LACl 1 et d'un ADN-T dans le promoteur du gène LAC4 a été confirmée par amplification des séquences adjacentes aux ADN-T et séquençage des amplicons. EXEMPLE 3 : ANALYSE DE LA TENEUR EN LIGNINES ET
DE LA CELLULOLYSE DES SIMPLES MUTANTS Iacl7 ET Iac4 ET DU DOUBLE MUTANT Iacl7/lac4 O' ARABIDOPSIS THALIANA a) Matériel et Méthodes i) Dosage de la teneur en lignines Le dosage des lignines a été réalisé sur les tiges collectées à maturité, broyées et soumises à extraction exhaustive par les solvants éthanol/toluène (2/1, v/v) , éthanol, puis eau ; extractions réalisées dans un appareil de Soxhlet. Le matériel extrait et séché représente le « résidu pariétal » ou RP (car il est constitué des parois végétales). L'élimination des composés solubles par extraction au solvant est indispensable avant tout dosage de lignines (ces composés pouvant interférer avec les dosages gravimétriques ou spectrométriques) .
La teneur en lignines a été mesurée par le dosage de la fraction de lignine acido-insoluble présente dans le RP et dénommée lignine Klason (LK) . Cette fraction LK, dosée par gravimétrie en traitant le résidu pariétal par l'acide sulfurique concentré (ce qui permet d' hydrolyser les polysaccharides et de laisser un résidu LK rincé, séché et pesé), représente l'essentiel des lignines pariétales. Cependant, une très petite fraction des lignines peut être solubilisée lors du traitement par l'acide sulfurique : il s'agit de la fraction dénommée lignine acido-soluble (LAS) qui est évaluée par mesure de l'absorbance du surnageant sulfurique dans l'ultra-violet.
Ces mesures ont été réalisées en utilisant la méthode T222 om-83, connue de l'homme du métier, et mise au point pour le bois et ses dérivés par le TAPPI (Technical association of the pulp and paper industry) (DENCE, CW. The détermination of lignin ; dans: LIN, S. Y. and DENCE, C. W. (Eds.) . Methods in Lignin Chemistry. Springer-Verlag, pp. 33-61, 1992) . ii) Etude de la structure des lignines
La structure des lignines a été évaluée par thioacidolyse . La thioacidolyse des lignines libère des produits monomères thioéthylés H, G ou S à partir des unités p-hydroxyphényles (H) , guaïacyles (G) ou syringyles (S) liées uniquement par liaisons β-O-4 (liaisons interunités majeures dans les lignines natives) . Ces produits ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) de leurs dérivés triméthylsilylés (TMS) . Les monomères triméthylsilylés H, G ou S ont été dosés à partir de chromatogrammes reconstruits respectivement sur les ions 239, 269 ou 299 (ions les plus intenses de leur spectre de masse obtenu en impact électronique) . Le protocole qui a été employé est similaire à celui décrit par LAPIERRE et al. (Res. Chem. Interm. , 21, 397-412, 1995) et par MIR DERIKVAND et al. (Planta 227, 943-956, 2008) . Les monomères H sont le plus souvent minoritaires (moins de 1% du total des monomères) et n'ont donc pas été considérés (sauf dans le cas de plantes mutantes affectées dans la formation des unités G et S, ou dans le cas de lignines de stress) . iii) Mesure de la dégradabilité enzymatique par cellulolyse in vitro La susceptibilité des polysaccharides pariétaux à l'hydrolyse enzymatique a été évaluée in vitro, en soumettant les parois (c'est-à-dire le résidu pariétal RP) à une préparation d'enzymes cellulasiques et hémicellulasiques . Le protocole qui a été utilisé est décrit par
HOFFMANN et al. (Plant CeIl 16, 1446-1465, 2004), qui est un protocole adapté de la méthode de REXEN (Anim. Feed Sci. Technol., 2, 205-218, 1977). Ladite préparation enzymatique employée était la préparation Cellulase Onozuka RIO extraite de Trichoderma viride, 096i/mg (SERVA ELECTROPHORESIS GmbHD, Allemagne) . b) Résultats
Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 (présentant les valeurs moyennes entre les 2 répétitions analytiques et l'écart-moyen entre ces répétitions, sauf pour le pourcentage de RP pour lequel une seule mesure a été effectuée) ci-après, dans lequel :
% RP = pourcentage de résidu pariétal. Ce pourcentage reflète le taux de parois dans l'échantillon sec (% pondéral de l'échantillon sec) ; il est donné à titre indicatif ; % LK = taux de lignine Klason exprimé en % pondéral du RP ; e-m LK = écart moyen entre 2 répétitions analytiques indépendantes de mesure de LK ; % LAS = taux de lignine acido-soluble exprimé en % pondéral du RP et mesuré à partir de l'absorbance à 205 nm du surnageant sulfurique issu de la mesure de la lignine Klason (en utilisant un coefficient d' absorptivité de 110 l.g^.cm"1) ; e-m LAS = écart moyen entre 2 répétitions analytiques indépendantes de mesure de LAS ; rdt thio μmol/g LK = rendement en monomères (G+S) de thioacidolyse, exprimé en μmole par gramme de lignine Klason (les monomères H obtenus à l'état de traces ne sont pas considérés). Lorsqu'il est calculé sur la base de la teneur en lignine Klason, le rendement total en monomères de thioacidolyse reflète la proportion d'unités liées uniquement en β-0-4 dans les lignines. Cette information structurale est importante car elle reflète la susceptibilité des lignines aux procédés de délignification industrielle . e-m rdt thio = écart moyen du rendement de thioacidolyse entre 2 répétitions analytiques indépendantes de thioacidolyse ; S/G thio = rapport molaire des monomères G et S libérés par thioacidolyse des lignines. Ce rapport reflète la proportion des unités S et des unités G dans les lignines natives. Chez les angiospermes, l'importance des unités S varie en fonction du stade de développement (les unités S étant déposées principalement en fin de lignification) ainsi que des tissus (les fibres sont plus riches en unités S que les vaisseaux) . Par conséquent, lorsque qu'une plante mutante présente un rapport S/G différent de celui de la lignée témoin (cultivée dans les mêmes conditions), cette différence peut être imputable au fait que la mutation affecte la lignification dans le temps (en début ou en fin) ou de manière tissu-spécifique (affecte la lignification des fibres ou celle des vaisseaux) . Il est également possible que la mutation affecte plus spécifiquement une enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'alccol coniférylique (précurseur des unités G) ou de l'alcool sinapylique (précurseur des unités S) ; e-m S/G = écart moyen du rapport molaire S/G de thioacidolyse entre 2 répétitions analytiques indépendantes de thioacidolyse ; % perte par cellulolyse = perte pondérale (en
%) du RP traitée par une préparation commerciale d'enzymes cellulasiques et hémicellulasiques ; e-m cellulolyse = écart moyen entre 2 répétitions analytiques indépendantes de cellulolyse ; les mutants Kim 1 et Kim 2 sont 2 répétitions biologiques de la même lignée. Kim 1 et Kim 2 ont été cultivés sur 2 plateaux de culture séparés, ce qui peut expliquer les variations entre ces répétitions.
Il est à remarquer que le mutant SALK 025690 (Iac2) ne présente pas de diminution du taux de lignines par rapport à la lignée sauvage (CoIO) .
Tableau 3: Etude des lignines des hampes des lignées sauvage (CoIO) et mutantes pour les laccases 4 et/ou 17.
K>
Figure imgf000030_0001
II ressort des résultats ci-dessus que : l'homogénéité des teneurs en RP (60.3 à 62.6%) indique que les mutations n'affectent pas le taux de parois lignocellulosiques des tiges matures. Comme les lignées mutantes ne présentent pas de réduction de taille, cela suggère que les plantes mutantes ont la même productivité en terme de biomasse lignocellulosique valorisable en fibres ou en biocarburant par exemple ;
- en revanche tous les mutants présentent un taux de lignine Klason significativement plus faible que celui du témoin : la diminution est modérée pour les simples mutants (diminution de 8 et 6% pour les mutants Iac4 et lacll respectivement) et plus marquée pour les doubles mutants (environ 19%). Cette diminution de teneur en lignines, qui n'affecte pas la croissance et le développement de la plante, est recherchée dans le contexte de la production de pâte à papier par voie chimique à partir de lignocelluloses d'angiospermes. Elle facilite également l'hydrolyse enzymatique, les lignines agissant comme des barrières entre les enzymes et les polysaccharides ;
- le taux de lignine acido-soluble (LAS) des lignées mutantes est inférieur au taux de LAS de la lignée sauvage. La teneur réduite en lignine Klason (ou lignine acido-insoluble) n'est donc pas compensée par une augmentation en lignine acido-soluble ;
- les rendements de thioacidolyse, calculés sur la base du taux de LK, sont proches entre la lignée sauvage et les lignées mutantes. Ce résultat indique que les lignines des lignées mutantes contiennent autant de liaisons labiles que les lignines des lignées sauvages. Les mutations n' ont donc pas accentué la fréquence des liaisons inter-unités résistantes, ce qui serait défavorable dans l'optique de la production de pâte à papier par voie chimique par exemple ;
- en revanche, le simple et les doubles mutants présentant la mutation lacll ont un rapport S/G supérieur par rapport à celui de la lignée sauvage. Ce résultat suggère que la mutation lacll pourrait affecter le début de la lignification (et donc le dépôt des unités G) et/ou la lignification des vaisseaux (plus riches en unités G que les fibres) ; le rendement de cellulolyse des lignées mutantes est augmenté par rapport à celui de la lignée sauvage. La diminution du taux de lignine Klason améliore donc l'efficacité de la cellulolyse. EXEMPLE 4 : OBTENTION DE PEUPLIERS TRANGENIQUES
SUR-EXPRIMANT UN MICRO-ARN CAPABLE D'INHIBER L'EXPRESSION DES LACCASES LAC17 ET LAC4
Deux constructions génétiques sont réalisées pour sur-exprimer un micro-ARN (dénommé miR397, SEQ ID NO : 77) capable d'inhiber l'expression des laccases LAC17 et LAC4 du peuplier {Populus) , sous le contrôle soit du promoteur constitutif 2x35S du CaMV soit du promoteur « lignine spécifique » de la cinnamyl alcool déshydrogénase 2 (CAD2) d'Eucalyptus (dénommé EuCAD). Le vecteur binaire Gateway pMDC32 (CURTIS et
GROSSNIKLAUS, Plant Physiology, 133, 462-469, 2003) est utilisé pour sur-exprimer les transgènes sous contrôle du promoteur constitutif 2x35S.
Pour l'expression sous le contrôle du promoteur EuCAD, le promoteur 2x35S est excisé du plasmide pMDC32 ci- dessus par une digestion par les enzymes HindIII-Kpnl (sites de restrictions uniques) et remplacé par le promoteur « lignine-spécifique » EuCAD.
La transformation génétique du peuplier est réalisée suivant la méthode décrite dans LEPLE et al. (Plant CeIl Rep. 11, 137-141, 1992), c'est à dire par co- culture d'expiants de tiges de peuplier avec des agrobactéries contenant un vecteur binaire pour l'expression de miR397, isolement de cals transgéniques et régénération de plantules transformées.
Des cals transgéniques sont sélectionnés pour l'étape de régénération. Des plantules sont régénérées à partir de ces cals différents, correspondant donc à des événements de transformation différents. Chaque plantule est clonée par multiplication.
Un exemplaire de chaque lignée transgénique est utilisée pour : l'étude de la structure des lignines par thioacidolyse (voir ci-dessus) sur un fragment de tige ; identifier des variations spatiales de quantité de lignines, par imagerie infra-rouge en FTIR-ATR (« Four1er Transformée! InfraRed Spectroscopy - Attenuated Total Réflectance ») et coloration histochimique au phloroglucinol .
Ces premières analyses de phénotypage permettent d' identifier les lignées présentant des réductions de la quantité de lignines dans le bois.
Des lignées sont ensuite analysées pour l'expression des transgènes et des gènes codants pour LAC17 et LAC4. Ces analyses d'expression sont réalisées par RT- PCR quantitative (qRT-PCR) . EXEMPLE 5 : OBTENTION DE BRACHYPODIUM
DISTACHYON TRANGENIQUES SUR-EXPRIMANT UN MICRO-ARN CAPABLE D'INHIBER L'EXPRESSION DES LACCASES LAC17 ET LAC4
Des vecteurs binaires Gateway compatibles et spécifiques pour la transformation des monocotylédones, contenant une séquence codant un micro-ARN de séquence SEQ
ID NO : 78 ou 79, sous le contrôle soit d'un promoteur constitutif, par exemple le promoteur de l'ubiquitine du maïs (ZmUbi) , soit d'un promoteur « lignine spécifique », et un gène de sélection tel que le gène pat (conférant une résistance au basta) , sont utilisés pour la transformation génétique de Brachypodium distachyon.
L'analyse de la structure et de la teneur en lignine des plantes transgéniques obtenues peut être effectuée en utilisant les mêmes méthodes que pour l'analyse des peupliers transgéniques ci-dessus. EXEMPLE 6 : OBTENTION DE MAÏS TRANGENIQUES SUR- EXPRIMANT UN MICRO-ARN CAPABLE D'INHIBER L'EXPRESSION DES LACCASES LACl7 ET LAC4
Un vecteur tel que décrit pour la transformation génétique de Brachypodium peut être utilisé pour la transformation génétique du maïs.
Il peut aussi être utilisé le vecteur intégratif L1038 (représenté par la séquence SEQ ID NO : 80), qui contient une cassette d'expression comprenant un gène de résistance à un herbicide (gène de résistance au Basta) , une cassette d'expression comprenant un gène codant une protéine fluorescente pour suivre le transgène sans génotypage (gène codant une GFP sous le contrôle d'un promoteur Actin) , une cassette "triple Gateway" attR4-ccdB- attR3 (où attR4 et attR3 sont des sites de recombinaison et ccdB est un gène de sélection négative), qui permet de recombiner un promoteur de choix (extrémités attL4-attRl) , un gène de choix (extrémités attLl-attL2 ) (en l'occurrence, un micro-ARN miR397) et un mock (attRl-attL3) (voir le Manuel d'Utilisation édité par Invitrogen, « MultiSite Gateway Pro », Version B, 3 octobre 2006) .

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé pour réduire la teneur en lignines d'une plante et augmenter la cellulolyse des parois de ladite plante, caractérisé en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité dans ladite plante : a) d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 60% d' identité ou au moins 75% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2, et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, au moins l'un des 4 domaines peptidiques consensus i) à iv) respectivement, suivants : i) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 12 ou 38, ii) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 13 ou 39, iii) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 14 ou 40, iv) le domaine peptidique consensus de séquence
SEQ ID NO : 15 ou 41, , et b) d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 65% d' identité avec la séquence SEQ ID NO: 4. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou l'activité dans ladite plante desdites laccases est obtenue par mutagenèse du gène codant pour ces laccases, ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de ces laccases.
3) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ladite laccase telle que définie au paragraphe a) est : chez le maïs {Zea mays) , choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID NO : 5, 6 et 42 à 47, de préférence les séquences SEQ ID NO : 5, 6, 42, 43, 44 et 45, chez la canne à sucre (Saccharum officinarum) , la séquence SEQ ID NO : 7, chez le sorgho (Sorghum bicolor) , choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID NO : 8 à 11, chez Brachypodium, choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID NO : 48 à 55, de préférence les séquences SEQ ID NO : 50 et 51, chez le riz, choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID NO : 56 à 62, de préférence la séquence SEQ ID NO : 58, et chez le peuplier, choisie parmi, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 63 à 68, de préférence les séquences SEQ ID NO : 63, 67 et 68.
4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite laccase telle que définie au paragraphe b) est : chez Brachypodium, la séquence peptidique SEQ ID NO : 69, chez le riz, la séquence peptidique SEQ ID NO : 70, et chez le peuplier, choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID NO : 71 à 74.
5) Construction d'ADN recombinant, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 60% d' identité ou au moins 75% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, au moins l'un des 4 domaines peptidiques consensus i) à iv) respectivement, suivants : i) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 12 ou 38, ii) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 13 ou 39, iii) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 14 ou 40, iv) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 15 ou 41, et d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 65% d' identité avec la séquence SEQ ID NO: 4.
6) Construction d'ADN selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit polynucléotide code pour un ARN antisens, un ARN interfèrent, un micro-ARN ou un ribozyme ciblant les gènes codant pour lesdites laccases . 7) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend une ou plusieurs constructions d'ADN telles que définies aux revendications 5 ou 6, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
8) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs constructions d'ADN telles que définies aux revendications 5 ou 6, ou une cassette d'expression telle que définie à la revendication 7.
9) Cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend une cassette d'expression telle que définie à la revendication 7 ou un vecteur recombinant tel que défini à la revendication 8.
10) Plante susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, à l'exception des lignées d' Arabidopsis thaliana SALK_016748 et SALK_051892.
11) Utilisation d'une plante susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou de matériel végétal obtenu à partir de ladite plante, pour la production de plantes fourragères, de biocarburant ou de pâte à papier.
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