CA2459076A1 - Procede d'obtention de plants de mais transformes a caracteristiques de digestibilite ameliorees, plants de mais obtenus par le procede et utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide modulant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N~1, dans un procédé d'obtention de plants de maïs à caractéristiques de digestibilité améliorées ayant un rapport entre les unit és S et G de la lignine modifié et ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante. Application à l'amélioration de la digestibilité du maïs

Description

Procédé d'obtention de plants de maïs transformés à
caractéristiques de digestibilitë amëliorées, plants de maïs obtenus par le procédé et utilisations s La présente invention se rapporte au domaine de l'amélioration des caractéristiques de digestibilité du maïs, en modifiant la composition et la teneur des lignines.
ART ANTERIEUR
io ~ Le maïs ensilé est un aliment intéressant à plusieurs points de vue. Pour l'agriculteur, le rendement au champ du maïs est relativement élevé, la récolte et le stockage sont aisés. Pour les animaux, en particulier pour les vaches laitières, les qualités nutritionnelles du maïs ensilé sont stables et peuvent aisément être complémentées en 1s protéines par d'âutres ensilages de fourrage ou par des tourteaux de soja. Ces qualités nutritionnelles permettent la persistance de la production laitière. Ainsi un mélange d'ensilage de maïs et d'ensilage de fourrage permet de valoriser l'utilisation des protéines du fourrage dont la solubilité (50%) est très élevée et très rapide au niveau du rumen de la 2o vache (Léonard, 1996). Le faible contenu en calcium et en potassium de l'ensilage de maïs permet de diluer l'importante teneur de ces éléments dans l'ensilage de fourrage, notamment ceux de l'ensilage de légumineuses et d'obtenir un ëquilibre quasi parfait entre l'énergie et les protéines du début à la fin de la lactation. L'ensilage est souvent un 2s élément qui aide l'éleveur à maîtriser le synchronisme énergie-protéine.
Etant donné les qualités nutritionnelles du maïs d'ensilage, la culture de ce type de fourrage est très répandue et couvre plus de' 3 millions d'hectares dans l'Union Européenne. L'optimisation des qualités de l'ensilage de maïs consiste à augmenter l'ënergie nette fournie par ce 3o type d'alimentation en améliorant sa digestibilité.
Un facteur important de diminution de digestibilité du maïs fourrage est lié à la présence dans les parois des cellules végétales de composés phénoliques, en particulier des lignines. Les lignines établissent différents type de liaison avec les autres constituants 3s pariétaux pour former un maillage serré qui gène l'accessibilité des a glucides aux enzymes digestives, principale source d'énergie pour les herbivores. Selon leur stade de maturitë, les plantes ne possèderaient pas le même type de lignines déposées sur leurs parois cellulaires.
L'augmentation de la lignification au :cours de la maturation de la plante s provoque une diminution de la digestibilité de cette plante (Bentley,.1959 et Grabber et al., 1992). II est difficile de corréler la réduction de la digestibilité des plantes au cours de leur maturation avec le contenu en lignines, la composition en lignines, la structure des lignines, ou avec tout autre composant pariétal étant donné les changements dans les 1o constituants chimiques et la structure physique associés à la maturation de la plante.
Par conséquent, une des voies privilégiées d'amélioration des qualités du maïs d'ensilage concerne la modification de la composition et de la teneur en lignine des plantes fourragères. En effet, une faible 1s diminution de la teneur en lignine conduit à une forte amélioration de la digestibilité. . Une expérimentation menëe par Emile (1995) démontre qu'une variété plus digeste permet d'augmenter le niveau de production de lait de plus d'un kilogramme et la prise de poids des vaches de 22 kg par rapport à une variétë moins digeste. Ainsi, plus la variété est digeste 2o plus la producfiion laitière est élevée et moins la perte d'état de chair est ïmportante.
Les maïs de type Brown midrib, en particulier les maïs bm3, possèdent une digestibilité fortement augmentëe par rapport aux maïs conventionnels et améliorent significativement la production laitière. Ces 2s maïs bm3 diffèrent des maïs « normaux » par une teneur fortement réduite en lignine (jusqu'à 40%) et des rapports unités. S (alcool sinapylique)/unités G (alcool coniférylique) modifiés. Cependant, les inconvénients des maïs bm3 tels qu'un rendement en champ moindre, une susceptibilité à la verse accrue, un manque de croissance et de 3o vigueur en début de végétation et un retard à la floraison en empêchent l'exploitation (Barriëre et Argillier (1993)).
La lignine est un composé majeur de la paroi des cellules du sclérenchyme et du xylème des plantes vasculaires. Elle joue un rôle important dans les .fonctions conductrices du xylème en réduisant la 3s perméabilité hydrique des parois cellulaires. Dans les tissus lignifiés, elle intervient comme agent de liaison intercellulaire. Elle est responsable de la rigidité des parois cellulaires et du port dressé des végétaux efi participe à la résistance des plantes aux agressions mécaniques (vent, blessure...) ou infection par des pathogènes, tolérance aux stress s thermique efi hydrique.
En général, il est considéré que la lignine est un polymère insoluble de 3 monomères d'alcools ou monolignols : l'alcool p-coumarylique (unités H), l'alcool coniférylique (unifiés G) efi l'alcool sinapylique (unités S). Chaque type de précurseurs peut former une 1o variété de liaisons avec d'autres précurseurs et ainsi constifiuer la lignine.
D'autres liaisons peuvent également s'établir avec d'autres composés pariétaux (polysaccharides et protéines) pour former un réseau complexe tridimensionnel. Le contenu et la composition des lignines varient entre les grands groupes de végétaux supérieurs et entre espèces. Les deux is classes majeures sont les lignines de gymnospermes qui contiennent principalemenfi des unités G et une petite proportion d'unités H, et les lignines d'angiospermes qui contiennent à la fois des unités S, G et 'en faible proportion des unités H (Whetten et al., 1998). Les lignines de monocotylédones, et, plus particulièrement des céréales sont les plus 2o complexes. Elles sonfi constituées des 3 unités H, G, S auxquelles se rajoutent en proportion importante des acides hydroxycinnamiques (acide férulique et coumarique) liés par des liaisons éthers ou esters. Cette hétérogénéité structurale se rencontre également au sein d'un méme végétal, en fonction de l'organe considéré mais également en fonction du 2s stade de développement et de la localisafiion dans la paroi (Lewis et Yamamoto, 1990)).
La voie dé biosynthèse des lignines est représentée sur la Figure 1. Bien que la voie de biosynthèse des lignines soit beaucoup étudiée, de nombreuses étapes sont encore incomprises nofiamment celles 3o impliquées dans la méthoxylation.
L'hypothèse actuelle de la voie de biosynthèse des monolignols considère que le réseau métabolique aboutissant à la formation des unités S et G fait intervenir des réactions successives d'hydroxylation et de O-méthylation. La voie de biosynthèse des phénylpropanoides débute 3s par la conversion de la phénylalanine en acide cinnamique sous l'action de la Phënylalanine-Ammonia-Lyase (PAL). Le produit de l'activité PAL
sur la phényfalanine est l'acide trans-cinnamique qui est un substrat de la cinnamate-4-hydroxylase (C4H), une P450-hydroxylase. La C4H
hydroxyle la position 4 du cinnamate pour produire l'acide p-courüarique.
s Chez les monocotylédones, l'acide p-coumarique résulte de l'action de la Tyrosine-Ammonia-Lyase (TAL) sur la tyrosine.
L'ensemble des enzymes intervenant ultérieurement dans le réseau métabolique ont fait l'objet de revues (Boudet ef al., 1995; Dixon et al., 2001; Whetten et al., 1998, Li et al., 2000), elles incluent io - des O-méthyltransférases ayant des désignations distinctes selon les espèces : l'acide caféique 3-O-méthyltransférase (COMT) également désignée acide cafëique O-méthyltransférase (COMT), O-méthyltransférase COMT ou encore de manière préférentielle dans le texte méthyltransférase COMT ou la S-is hydroxyconiféryl aldéhyde O-méthyltransférase (AIdOMT) et la Caféoyl coenzyme A 3-O-méthyltransférase (CCOAMT), - des hydroxycinnamate coenzyme A ligases (4CL), - une férulate 5-hydroxylase (F5H) à cytochrome P450, - la p-coumarate-hydroxylase (C3H), 20 - et plusieurs isoformes de Cinnamoyl Co A réductase (CCR) et de Cinnamyl alcool déhydrogénase (CAD).
L'étape terminale de polymérisation des monolignols fait vraisemblablement intervenir des enzymes pariétales, peroxydases etlou laccases.
2s Les enzymes catalysant les étapes de méthylation sont les O
méthyltransférases. Les O-mëthyltransférases (S-adénoxyl-L-méthionine O-méthyltransférases, EC 2.1.1.6) jouent . un rôle important dans la biosynthèse des monolignols. II est actuellement admis que la COMT
interviendrait préférentiellement dans la synthèse des unités S et la 3o CCoAOMT dans la synthèse des unités G.
La COMT permettrait la méthylation des formes libres d'acides hydroxycinnamiques : l'acide caféique et l'acide 5-hydroxyférulique en introduisant respectivement un ou deux groupes méthoxy dans les monomères de lignines (Davin and Lewis, 1992). Récemment, il a été
3s montré chez le peuplier que la COMT est en fait une 5-hydroxyconiféryl aldéhyde O-méthyltransférase (AIdOMT). En effet, le 5-hydroxyconiféraldéhyde est le substrat préférentiel de l'AIdOMT. Ainsi, pour Li et al. (2000), il existe chez les angiospermes ligneux, deux voies distinctes d'hydroxylation/méthylation conduisant respectivement aux s unifiés S et G : la CCoA3H (Coumaroyl CoA 3-hydroxylase)/CCoAOMT, avec la 4CL, la CCR et la CAD sont associés à la synthèse des unités G, et la CAIdSH (Coniféraldéhyde 5-hydroxylase)IAIdOMT se connecte à
partir du conyféryl aldéhyde pour la biosynfihèse des unités S.
L'implication des COMT dans la biosynthèse des unités S de lignine est Lo supportée par une forte réduction en unité S de la lignine mais pas des unités G dans les plantes transgéniques sous-exprimant la COMT
comme le tabac (Atanassova et al., 1995), la luzerne (Guo et al., 2001 ) et le peuplier (Van Doorselaere et al., 1995).
Les unitës S et G sont donc des composants importants des 1s lignines et par conséquent interviennent dans la digestibilité de la paroi des cellules végétales. Cependant l'impact sur la digestibilité de l'augmentation ou de la diminutiôn des unités S etlou G varie, selon les études. Ainsi, les études sur le mutant bm3 ont montré que la digestibilité
accrue des parois est associëe à une altération forte de la structure des 20 lignines : rapport S/G faible avec incorporation substantielle d'unités 5-hydroxyguaiacyl (5-OH G) (Lapierre et al., 1988) et une teneur en lignine plus faible. Si les résultats de corrëlation entre la digestibilité et la teneur en lignine de la plante sont toujours négatifs, les résultats de corrélations entre le rapport SlG et la teneur en lignine et la digestibilité ne sont pas 2s toujours identiques. Ainsi, pour Zhong ef al. (1998) et Méchin et al.
(2000), le rapport SIG est corrélé positivement avec la digestibilité.
Autrement dit, les résultats respectifs de ces auteurs sur le tabac et le maïs montrent que plus le rapport SIG augmente, plus la digestibilité est importante. Ainsi, suivant l'espèce et les études, il apparaît qu'une 3o variation du rapport S/G, associée ou non à une teneur en lignine réduite peut être accompagnée d'une stabilité, d'une réduction ou d'une augmentation de la digestibilité.
Ces résultats contradictoirés démontrent qu'il n'est pas évident de prévoir les conséquences de la modification de l'activité des O
3s méthyltransférases (COMT, AIdOMT) sur le rapport S/G et la teneur en ügnine et par conséquent sur la digestibilité de la plante. L'invention décrite dans ce brevet permet d'obtenir des plants de maïs offrant une meilleure digestibilité en modifiant les activités O-méthyltransférases.
En particulier, l'homme du métier n'est pas en mesure de s transposer les résultats expérimentaux hautement contradictoires décrits dans l'état de la technique relatifs aux conséquences de la surexpression ou au contraire de la sous-expression d'une enzyme impliquée dans la biosynthèse de la lignine dans une espèce végétale donnée, y compris le maïs, sur la teneur et la composition de la lignine, en particulier sur le 1o rapport entre les unités S et les unités G.
De plus, l'homme du métier, à la lumière des résultats expérimentaux décrits dans l'état de 1â technique, ne pouvait prévoir, dans le cas spécifique du maïs, si une augmentation ou une réduction du rapport unités S/unités G de la lignine et/ou la teneur en lignine is influeraient positivement ou négativement sur les caractéristiques de digestibilité de cette espècé végétale ou des produits de transformation correspondants, par éxemple le fourrage produit à partir du maïs..
SOMMAIRE DE L'INVENTION
2o II a été montré selon l'invention que, de manière surprenante, l'induction de la modulation de la synthèse d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine du maïs, l'acide caféique 3-O
Méthyltransférase, aussi désignée COMT, appelée dans la suite du prësent texte méthyltransférase COMT, provoquait une modification du 2s rapport unités S/unitës G dans la composition de la lignine et/ou de la teneur en lignine, par rapport à ce qui est retrouvé dans le maïs sauvage, et que la modification du rapport unités S/unités G efi/ou de la tenéur en lignine confërait au plant de maïs, ainsi qu'à ses produits de transformation, des caractéristiques améliorées de digestibilité.
3o Par « modulation » de la synthèse d'une enzyme, on entend selon l'invention une diminution, ou au contraire une augmentation de la synthèse de ladite enzyme.
Par « modification » du rapport unités S/unités G dans la composition de la lignine, on entend une diminution ou une augmentation 3s de ce rapport.

On entend par « maïs sauvage », un maïs possédant des caractéristiques de digestibilité, un rapport entre les unités S et les unités G de la ügnine, ainsi qu'une teneur en lignine dans la plante similaires, voire identiques, à celles de la lignée de maïs désignée « WT » dans les s exemples, qui est une lignée disponible auprès de l'Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) sous la dénomination I2.
Selon l'invention, les caractéristiques améliorées de digestibilité du maïs, ou de ces produits dérivés, sont obtenues par la modulation de la synthèse de la méthyltransférase COMT, laquelle modulation de ~o synthèse induit (i) la modification du rapport unités S/unités G dans la composition de la lignine ; et/ou (ü) la modification de la teneur en lignine dans le plant de maïs, et les produits qui en sont dérivés.
1s Conformément à l'invention, la modulation de la synthèse de la méthyltransférase COMT peut étre complétée par la modulation simultanée de la synth'ese d'une seconde enzyme impliquée dâns la voie de biosynthèse de la lignine, de préférence une seconde enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine chez le maïs telle que 2o décrite dans l'art antérieur et notamment illustrée dans le schéma de la Figure 1.
La diminution de la synthèse de la méthyltransférase COMT peut ëtre obtenue par la transformation de plants de maïs, notamment de plants de maïs sauvages, par un polynucléotide antisens inhibant la 2s traduction de l'ARN messager correspondant. Cette diminution peut également être obtenue par un phénomène de co-suppression, comme décrit par exemple par Napoli et al. (1990) ou Carvalho Niebel et al.
(1995).
Inversement, l'augmentation de la synthèse de la 3o méthyltransférase COMT peut être obtenue par transformation de plants de maïs, notamment de plants de maïs sauvages, par un polynucléotide codant cette enzyme.
Quel que soit le polynucléotide utilisé, il comprend de préférence au moins une séquence de régulation permettant son expression dans 3s une cellule de maïs.

Selon l'invention, une réduction du rapport unités S/unités G est obtenue au moins par inhibition spécifique de l'activité COMT. Elle peut étre complétée par l'augmentation ou la réduction de la synthèse d'autres enzymes impliquées dans la. biosynthèse des ûnités S et des unités G de s la lignine du maïs, augmentation ou réduction d'activitë obtenue principalement par surexpression ou au contraire inhibition de l'expression des gènes codant ces autres enzymes.
Une inhibition de l'activité de la COMT du maïs est principalement obtenue selon l'invention par l'utilisation d'oligonucléotides inhibant 1o spécifiquement la transcription ou la traduction du gène codant cette enzyme.
L'acide nucléique codant la COMT du maïs est référencé comme la séquence SECS ID N° 1 du listage de séquences.
L'invention a pour objet l'utilisation d'un polynucléotide modulant la 1s synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs codée par la séquence nucléotidique SEQ 1D N°1, dans un procédé d'obtention de plants de maïs à caractéristiques de digestibilité améliorées ayant un rappôrt entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante.
2o Elle est également relative à un procédé d'obtention de plants de mâis possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, possédant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou dont la teneur en lignine est modifiée et compatible avec le développement normal de la plante, ledit procédé comportant une étape 2s de transformation d'une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants a) un pôlynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la mëthyltransférase COMT de maïs ;
b) un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs.
3o De préférence, le polynucléotide antisens est le poiynucléotide de séquence SEQ ID N°2.
Préférentiellement, la polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs est le polynucléotide de séquence SEQ ID N°1.
Le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codant la 3s méthyltransférase COMT de mâis sont préfërentiellement insérés dans une cassette d'expression permettant leur expression fonctionnelle chez le maïs. Une telle cassette d'expression est avantageusement introduite dans un vecteur d'expression adapté pour transformer des cellules de maïs.
s Selon le procédé de l'invention, on peut utiliser un second polynucléotide modulant l'activité d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des unités S et des unités G de la lignine, autre que la méthyltransférase COMT.
L'invention est également relative à un plant de maïs transformé
io selon le procédé ci-dessus, qui possède des caractéristiques de digestibilité améliorées, ainsi qu'à toute partie du plant de maïs transformé, notamment racine, graine, feuille, fleur et tige.
Elle concerne aussi les produits de transformation obtenus à partir des plants de maïs transformés définis ci-dessus, notamment le fourrage 1s et la lignine purifiée.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Voie de biosynthèse des monomères de lignines (Guo ét al., 2001 ).
2o Le "réseau métabolique" décrit dans le schëma comprend les résultats de récentes études suggérant les spécificités inattendues de substrafi des enzymes F5H et COMT (Humphreys et al. 1999 ; Osakabe et al. 1999 ; Li et.al. 2000). La voie encadrée (guaiacyl [G] unit) représente les réactions principales aboutissant aux lignines G. La voie encadrée (syringyl [S]
2s unit) représente la voie de biosynthèse préférée pour les lignines S, 4CL, 4-coumarate coenzyme A ligase; CAD, cinnamyl alcool déhydrogénase;
CCR, cinnamyl côenzyme A réducfase.
Figure 2 : Principe de la méthode employée pour évaluer l'impact de la 3o transformation visant l'activité COMT sur la structure des lignines. Les unités H (R~=R2=H), G (R~=OCH3, R2=H), S (R~=R2=OCH3) et 5-OH G
(R~= OCH3, R2=OH) engagées dans des liaisons -O-4 génèrent des monomères thioéthylés spécifiques. Après silylation (BSTFA), ces monomères sont analysés en CPG-SM (impact électronique). Les 3s chromatogrammes reconstruits sur les ions benzyliques propres à

chacun d'eux permettent d'évaluer de manière univoque et sans interférence des autres constituants la fréquence relative des unités ayant généré ces monomères.
5 Figure 3 : Profils chromatographiques en CPG-SM des lignées témoin et sous-exprimant la COMT : profils reconstruits sur les ions spécifiques de chaque type de monomères.
Figure 4 : Analyse HPLC des produits issus de l'hydrolyse alcaline douce 1o (NaOH 1 M, 2.5h, 40°C) d'échantillons de maïs (tiges + feuilles) extraits.
Acide p-coumarique E et Z : pics 1 et 2. Acide férulique E et Z: pics 3 et 4. Etalon (éthylvanilline): pic 5. Ces profils illustrent que les teneurs en PC (acide p-coumarique) diminuent dans les deux lignées transgéniques ASCOMT1.2 et ASCOMT3.2 par rapport au témoin WT.
Figure 5 : Représentation schématique des constructions des plasmides décrits à l'exemple 1.
Figure 6 2o La Figure 6A représente une analyse Northern blot de la lignée de maïs C-OMT 225 au stade 20 jours.
La Figure 6B représente une analyse Southern blot comparative entre la lignée antisens 225 et la lignée I2, en utilisant quatre enzymes de restriction distinctes, respectivement : AcoRV, Kpnl, EcoRl et Sacl.
Figure 7 : Criblage d'une population de plants de maïs transgéniques, transformés . respectivement avec les plasmides pProsper+pBar, pProsper-Bar, pJim+pBar2 et pALIX+pBar2.
L'axe des ordonnées représente l'activité COMT retrouvée dans les plants de maïs analysés, exprimée en cpm/mg de protéine.
Les barres d'histogramme représentent chacune un plant transgénique testé.
Figure 8: faisceaux cribro-vasculaires de feuilles adultes de maïs 3s témoins (I2) et antisens C-OMT (225) colorés selon la méthode de Maille.

On voit que la coloration est moins intense dans le sclérenchyme et dans le xylème de 225 ; cette observation suggère une diminution des unités S
dans. les lignines de la lignée 225.
s DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
II a étë montré selon l'invention que, de manière surprenante, l'induction de la modulation de la synthëse d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine du maïs, la méthyltransférase COMT, aussi désignée COMT, provoquait une modification du rapport unités 1o S/unités G dans la composition de la lignine et/ou de la teneur en lignine, par rapport à celui retrouvé dans le maïs sauvage, et que la modification du rapport unités S/unités G et/ou de la teneur en lignine conférait au plant de maïs, ainsi qu'à ses produits de transformation, des caractéristiques améliorées de digestibilité.
1s Par « caractéristiques améliorées de digestibilité », d'un plant de maïs selon l'invention, on entend que, par rapport à une variété de plant de maïs sauvage, par exemple la variété de maïs I2 précitée, le.plant de maïs obtenu selon l'inventiori possède uné valeur d'indice de digéstibilité
dndf » plus élevée que la valeur d'indice de digestibilité calculée à partir 2o d'un plant de maïs de la variété sauvage.
Selon l'invention, la valeur de l'indice de digestibilité « dndf » est calculée à partir de « ndf (neutral detergent fiber) » dont la méthode d'obtention est décrite par Van Soest (1967) et du « dms (solubilité
enzymatique Aufrère) » dont la méthode d'obtention est décrite par 2s Aufrère (1983), selon la formule dmdf = 100*[dms - (100 - ndf)]/ndf donnée par Struik (1985). Le matériel utilisé pour l'établissement du ndf est une poudre .lyophilisée de. plantes entières récoltéés au stâde floraison.
Préférentiellement, un plant de maïs obtenu selon l'invention 3o possède des caractéristiques de digestibilitë améliorées si la valeur de l'indice « dndf » est d'au moins 80.
Préférentiellement, un plant de maïs selon l'invention possède une teneur en lignine Klason, mesurée à partir des tiges et des feuilles, qui est inférieure à 8,5, de préférence inférieure à 8, à 7,5, à ,7,0, à 6,9 ou à
3s 6,8, et de préférence inférieure à 6,7.

Un plant de mâis préféré selon l'invention possède une teneur en lignine Klason comprise entre 6,1 et 6,6.
Pour mesurer la teneur en lignine Klason, l'homme du mëtier peut avantageusement se référer à la technique décrite à l'exemple 9.
s II est montré pour la première fois selon l'invention, de manière surprenante a) que l'inhibition de l'enzyme méthyltransférase COMT de maïs permettait (i) de réduire le rapport unités SI unités G de la lignine chez cette plante et (ü) de réduire la teneur en lignine chez cette plante ; et 1o b) que la réduction du rapport unités S/unités G de la lignine efilou de la teneur en lignine chez le maïs permettait l'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, par rapport au maïs sauvage.
Tirant parti de ces résultats inattendus, la demanderesse a mis au 1s point un procédé de transformation de plants de maïs dans lequel les plants de maïs transformës ont un rapport unités S/unités G de la lignine etlou une teneur en lignine modifiés, pâr rapport à celui retrouvé dans les plants de maïs sauvages.
Prëférentiellement, le rapport unités S /unités G est inférieur au 2o rapport unités S/unitës G retrouvés dans un plant de maïs sauvage.
Plus spécifiquement, il est montré selon l'invention que des plants de maïs transformés ayant des caractéristiques de digestibilité
améliorées peuvent étre obtenus en utilisant un polynucléotide antisens.
L'invention a pour objet l'utilisation d'un polynucléotide modulant la 2s synthèse de la méthyltransférase COMT de mâis codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°1, dans un procédé d'obtention de plants de maïs à caractéristiques de digestibilité amëliorées ayant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante.
Inhibition de la synthèse de la méthyltransférase COMT
Selon un premier mode de réalisation, ledit polynucléotide inhibe la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs dans la plante, lorsqu'il est introduit par transformation dans les cellules de ladite plante.

Ledit polynucléotide antisens consiste en un polynuclëotide codant un ARN antisens s'hybridant avec l'ARN messager constituant le produit de transcription du gène codant la méthyltransférase COMT du maïs.
L'inhibition de la synthèse de la méthjrltransférase COMT peut être s obtenue - (i) soit en transformant les cellules de maïs avec un polynucléotide antisens, tel que défini ci-dessus, placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs, ladite séquence de régulation pouvant comprendre un promoteur constitutif fort et, le cas 1o échéant, aussi des séquences activatrices de la firanscription (séquences « enhancer » fonctionnelles chez le maïs), permettant un haut niveau d'expression du nombre de copies de l'ARNm de l'antisens méthyltransférase COMT ;
- (ü) soit en introduisant de manière stable dans les cellules de maïs 1s une pluralité de copies du polynucléotide antisens tel que défini ci-dessus;
- (iii) soit par uné combinaison de (i) et de (ü), comme cela est décrit dans les exémples.
L'homme du métier peut synthétiser tout polynucléotide antisens 2o inhibant la synthèse de la méthyltransférase COMT à l'aide de ses connaissances générales techniques, à partir d'une séquence nucléotidique codant la COMT, par exemple la séquence SEQ ID N°1.
Pour la synthèse d'un polynucléotide sens ou d'un polynuclëotide antisens inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction d'un 2s gène chez une plante, l'homme du métier se référera avantageusement à
l'article de revue de Matzke et al. (2001 ) ainsi qu'au contenu des articles référencës dans cet article de revue.
Encore plus spécifiquement, pour la construction ou la synthèse d'un polynucléotide sens ou d'un polynucléotide antisens inhibant 3o spécifiquement la transcription ou la traduction d'un gène codant une enzyme impliquée dans la biosynthèse des lignines chez les plantes, notamment la COMT de certaines espèces végétales, l'homme du métier peut se référer avantageusement aux articles de Gaucher et al. (1999), de Zhong et al. (2000), de Pincon et aL (2001 a), de Blee et al. (2001 ), de 3s Pincon et al. (2001 b) ou de Lapierre et al. (1999).

Le polynucléotide antisens peut aussi consister en l'ADNc obtenu à partir de l'ARNm constituant le produit de transcription du gène codant la méthyltransférase COMT.
II peut aussi consister en un fragment nucléotidique de cet ADNc, s de préférence un fragment nucléotidique d'au moins. 100 bases consécutives de cet ADNc, cette longueur du fragment nucléotidique étant suffisante pour permettre son hybridation spécifique avec l'ARNm de la méthyltransférase COMT. du maïs et ainsi empêcher sa traduction en protéine.
1o Selon un premier aspect préféré, le polynucléotide antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°2.
Selon un second aspect préféré, le polynucléotide antisens consiste en le polynucléotide antisens de séquence SEQ ID N°2.
1s Augmentation (surproduction) de la méthyltransférase COMT
Selon un second mode de réalisation, ledit polynucléotide augmente 1â : synthèse de la méthyltransférase COMT dans la plante;
lorsqu'il est introduit par transformation dans les cellules de lâdite plânte.
Selon ce second mode de réalisation, on utilise un polynucléotide 2o codant la méthyltransférase COMT de maïs, qui provoque une production plus élevée de cette enzyme, lorsqu'il est introduit par transformation dans la plante.
La synthèse ou l'isolement d'un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT du maïs peut étre effectué par l'homme du 2s métier, à l'aide de ses connaissances générales en biologie moléculaire, notamment grâce à sa connaissance de la séquence nucléotidique SEQ
ID N°1.
La production plus élevée de la méthyltransférasé COMT peut être obtenue 30 - (i) soit en transformant les cellules de maïs avec un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs, ladite séquence de régulation pouvant comprendre un promoteur constitutif fort et, le cas échéant, aussi des séquences activatrices de la transcription (séquences « enhancer » fonctionnelles chez le maïs), permettant un haut niveau d'expression de la méthyltransférase COMT ;
- (ü) soit en introduisant de manière stable dans les cellules de maïs une pluralité de copies dû polynucléotide codant la méthyltransférase s COMT ;
- (iii) soit par une combinaison de (i) et de (ü).
Selon un premier aspect préféré, le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT comprend la séquence nucléotidique SEQ ID
N°1.
1o Selon un second aspect préféré, le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID
N°1.
PROCEDES D'OBTENTION DE PLANTS DE MAòS A
1s CARACTÉRISTIQUES DE DIGESTIBILITE AMELIOREES.
L'invention a aussi pour objet un procédé d'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digéstibilité améliorées, possédant un rappôrt ehtre les unités S et G de la~lignine modifié et/ou dont la teneur en lignine est modifiée et compatible avec le 2o développement normal de la plante, ledit procédé comportant une étape de transformation d'une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la méthyltransférase COMT de maïs ;
2s b) un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs.
Selon un premier mode de réalisation du procédé ci-dessus peut être caractérisé en qu'.il comprend les ëtapes suivantes a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction du 3o gène codant pour la méthyltransférase COMT de maïs.;
b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;
Selon un premier aspect, la modification de la composition de la lignine des plants de maïs transformés susceptibles d'être obtenus par le 3s procédé ci-dessus consiste à réduire la teneur en unités S par rapport à

la teneur en unités G des lignines de maïs, de façon à obtenir un rapport S/G inférieur à celui des plants de maïs sauvages.
Préférentiellement, le rapport SlG est inférieur à 40/60.
Selon un second mode derëalisation du procédé ci-dessus, ledit s procédë est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs;
b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;
1o Préférentiellement, le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°1.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé d'obtention de plants de maïs transformés selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante 1s c) sélectionner les plants de maïs ayant intégré dans leur génome au moins une copie du polynucléotide antisens ou au moins une copie du polynûclëotide codant la mëthyltransférase.COMT du maïs.
Cassettes d'expression comprenant un potynucléotide antisens ou 2o un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT du maïs Avantageusement, le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT du maïs est intégré dans une cassette d'expression comprenant aussi une séquence nucléotidique régulant ,l'expression dudit polynucléotide dans les cellules de maïs.
2s Avantageusement, le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codânt la méthyltransférase COMT est intégré dans une cassette d'expression comprenant aussi urie séquence nucléotidique à fonction de terminateur de la transcription.
La cassette d'expression définie de manière générale ci-dessus 3o peut aussi étre désignée « construction d'ADN » ou « construit d'ADN »dans la présente description.
Selon encore un autre aspect, le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT, oü encore la cassette d'expression dans laquelle est inséré respectivement l'un ou l'autre de ces polynucléotides, est artificiellement inséré dans une cellule hôte de Agrobacterium tumefaciens.
Les constructions d'ADN comprennent égalemént une séquence promotrice dé gène et une séquence terminatrice liées de façon s opérationnelle à la séquence d'ADN devant être transcrite. Le promoteur du gène est généralement situé à l'extrémité 5' pour permettre l'initiation de la transcription de la séquence d'ADN. Les séquences promotrices sont situées dans les régions 5' non codantes des gènes mais aussi parfois dans les introns (Luehrsen K,. 1991 ) ou dans les régions 1o codantes comme par exemple le promoteur du gène PAL de la tomate (Bloksberg, 1991 ). Lorsque le construit inclut une phase ouverte de lecture en orientation sens, il est nécessaire d'utiliser un ADNc pleine longueur de façon à ce que la protéine puisse être traduite. Lorsque le construifi comprend une phase ouverte de lecture en antisens ou une 1s région non codante, il n'est pas indispensable d'utiliser un ADNc pleine longueur, une séquence partielle peut suffire.
Promoteûrs Parmi les promoteurs de transcription pouvant être utilisés, on 2o peut citer notamment les promoteurs dits constitutifs, les promoteurs dits inductifs ainsi que les promoteurs tissus spécifiques.
Un promoteur constitutif permet une expression forte du transcrit dans l'ensemble des tissus de la plante régénërée et sera actif dans la plupart des conditions environnementales, et dans l'ensemble des étapes 2s de transformations et de différentiations cellulaires. Par exemple, les principaux promoteurs doubles constitutifs sont -. le promoteur 35S, ou avantageusement le promoteur double constitutif 35S (pd35S) du CaMV, décrit dans l'article de Kay et aL, (1987) 30 - le promoteur de l'active du riz suivi de l'intron active de riz contenu dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Mc Elroy et al. (1991 ) - le promoteur ubiquitine 1 de maïs (Christensen et al., 1996) et d'autres régions. initiatrices de la transcription de gènes de plantes variables connues de l'homme du métier.

Alternativement, il peut être intéressant d'utiliser une séquence promotrice de transcription inductible capable d'être contrôlée par les conditions environnementales ou le stade de développement comme par exempte les promoteurs phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-s CoA réductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de protéinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (US-5.670.349), tous ces promoteurs étant rappelés avec les références des publications correspondantes par le Tableau 3 du brevet US-5.670.349.
1o Une autre catégorie de promoteurs pouvant avantageusement être utilisée pour réaliser le procédé objet de l'invention regroupe les promoteurs tissus spécifiques, en particulier il peut s'agir des promoteurs des gènes de la voie de biosynthèse des lignines ou par exemple le promoteur de l'alcool déshydrogénase qui s'exprime spécifiquement dans 1s les tissus vasculaires.
On peut également citer des promoteurs spécifiques des graines (Datla, R. et al., 1997); notâmment les promoteurs de . la napine (EP
0.255.378), de la gluteniné, de I'héliantinine (W0-92/17580), de l'albumine (W0-98/45460), de l'oléosine (W0-98/45461), de l'ATS1 ou 2o de l'ATS3 (W0-99/20775).
Séquences terminatrices La séquence terminatrice employée dans les constructions objets de l'invention est située à l'extrémité 3' de la séquence à transcrire. Elle 2s peut provenir du même gène que la séquence promotrice ou d'un gène différent.
Parmi les teri~-~inateurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer -le terminateur polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur 30 (CaMV) décrit dans l'article de Franck ef al., (1980), ou -le terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium fumefaciens souche à nopaline.

Marqueur de sélection Les constructions comportent également un marqueur de sélection permettant de sélectionner les cellules végétales transformées par ces constructions. Ces marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme s du métier, particulièrement ils confèrent une résistance à une ou plusieurs toxines, par exemple une résistance à l'herbicide BASTA~. Par ailleurs, la transformation des cellules végétales par les constructions, objet de l'invention peut être contrôlëe par d'autres techniques bien connues de l'art telles que les Southern et Western Blots.
1o Fabrication d'une cassefte d'expression Les techniques pour lier de manière opérationnelle tous les composants de ces constructions sont bien connues de l'homme de l'art et incluent l'utilisation de sites de clonage synthétiques comprenant un ou 1s plusieurs sites de restrictions endonucléasiques comme décrits par exemple par Maniatis et al. (199). Les constructions d'ADN de la présente invéntion peuvent être liées à un vecteur possédant au moins un s~stème de réplicâtiôn, par exemple avec E. Coli, après chaque manipulation, il est possible de cloner et de séquences la construction 20 obtenue afin de vérifier l'exactitude de la manipulation.
L'invention concerne les constructions telles que décrites ci-dessus, et comportant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID n°1 ou 2 liée de maniëre fonctionnelle en amont à un promoteur et en aval à un terminateur.
2s De manière tout à fait préférée, la cassette d'expression comprend le promoteur de l'alcool déshydrogénase spécifique du système vasculaire, I'ADNc de ' la méthyltransférase (COMT ou AIdOMT) et le terminateur de la Nopaline synthase, comme cela est montré dans l'exemple 1.
Vecteurs d'expression Les cassettes d'expression ou les constructions d'ADN telles que définies ci-dessus peuvent être incluses dans des vecteurs d'expression utilisables pour transformer une cellule de Agrobacterium tumefaciens ou 3s une cellule hôte de maïs.

Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC n°37 017) ou encore les vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, Etats-Unis). .
s On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psiX174, pBluescript SA, pNHBA, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI et pSG (Stratagene).
II peut s'agir également de vecteurs du type Baculovirus tel que le 1o vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N°CRL 1711 ) dérivée de Spodoptera frug!iperda.
Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquence d'intérét dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants:
1s - vecteur pBIN19 (BEVAN et al.), commercialisé par la Société
CLONTECH (Palo Alto, Californie, USA);
- vecteur pB1 101 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ;
- vecteur pB1121 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la 2o Société CLONTECH;
- vecteur pEGFP; Yang et al. (1996), commercialisé par la Société
CLONTECH;
- vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994) - vecteurs intermédiaires et superbinaires dérivés des vecteurs 2s pSB12 et pSB1 décrits par Japan Tobacco (EP-0.672.752 et Ishida efi al., 1996).
Un premier vecteur tout à fait préféré est le plasmide pAlix représenté à la figure 5, dans lequel a été inséré le polynucléotide 3o antisens de séquence SEQ ID N°2 inhibant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs..
Un second vecteur tout à fait préféré est le plasmide pProsper représenté à la figure 5, dans lequel a été inséré le polynuclëotide de séquence SEQ ID N°1 codant la méthyltransfërase COMT de mais.
3s Transformation des plants de maïs Une augmentation de la synthèse des unités S etlou G de la lignine et/ou de la teneur en lignine dans la plante peut être obtenue en intégrant dans la phase ouverte de lecture une construction d'ADN en s orientation sens, en particulier la séquence SEQ ID n°1. La transformation d'une plante cible avec une telle construction aboutit à
une augmentation du nombre de copies du transcrit et donc à une augmentation de la quantité d'enzyme. Par exemple, une augmentation de la synthèse d'unités S peut être obtenue en intégrant dans le génome 1o de la plante cible la séquence sens de la O méthyltransférase codée par la SEQ ID n°1.
Une réduction de la synthèse d'unités S efi/ou G de la lignine etlou de la teneur en lignine dans la plante peut être obtenue en introduisant dans la phase de lecture ouverte une construction d'ADN en orientation 1s antisens, en particulier toute ou partie de la séquence SEQ ID n°2.
L'ARN transcrit est complémentaire de la séquence endogène d'ARNm ce qui aura pour conséquence de diminuer le nombre de copies du transcrit et doric de diminuer la quantité d'enzyme. Par exemple, une diminution de la synthèse d'unités S peut être obtenue en intégrant dans 20 le génome de la plante cible la séquence antisens de la méthyltransférase COMT codée par la SEQ ID n°2. Les constructions d'ADN peuvent également comporter une séquence nucléotidique comprenant une région non-codante du gène de la méthyltransférase COMT. Les exemples de régions non-codantes pouvant être utilisées 2s dans de telles constructions incluent les introns et les séquences 5' ou 3' non-codantes. La transformation de plantes cibles avec de telles constructions d'ADN peut aboutir à une réduction de la synthèse d'unités S et/ou G de lignine et/ou de la teneur en lignine par le processus de co suppression, comme l'ont décrit par exemple Napoli et al. (1990) ou 3o Carvalho Niebel ef al. (1995).
La régulation de la synthèse d'unités S et/ou G de lignine etlou de la teneur en lignine peut aussi être réalisée en insérant lesdites séquences en tout ou partie (par exemple ADN ou ARN) dans des constructions de ribozyme (Haseloff et al., 1988).

Utilisation d'un second polynucléotide modulant la synthèse d'une enzyme impliquée dans la biosynthèse de la lignine, autre que la méthyltransférase COMT
Selon encore un autre. aspéct du procédé d'obtention de plants de s maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, tel que défini ci-dessus, l'effet du polynucléotide antisens ou du polynucléotide codant la méthyltransférase COMT du maïs peut être complété par l'insertion dans le génome de la même plante de maïs d'un second polynucléotide dérivë du gène codant une enzyme impliquée dans la voie 1o de biosynthèse de la lignine, autre que la méthyltransférase COMT.
Ainsi, le procédé ci-dessus peut aussi ëtre caractérisé en ce qu'à
l'étape a), la cellule hôte de maïs est aussi transformée avec au moins un second polynucléotide, modulant spécifiquement l'expression d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la is méthyltransférase COMT de maïs.
Selon cet aspect particulier, ledit procédé est caractérisé en ce que le second polynucléotide est choisi parmi a) uri polynucléotide antisens inhibant spëcifiquement l'expression du gène codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des 20 lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs ;
b) un po(ynucléotide codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs.
L'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, 2s autre que la méthyltransférase COMT de maïs est choisie parmi :(a) l'enzyme CAD du maïs dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le n° d'accès Y13733, (b) I 'enzyme CCR1 de maïs dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le n° d'accès X98083 et (c) l'enzyme F5H de Arabidopsis 3o thaliana dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le n° d'accès 038416.
L'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs peut étre aussi choisie parmi (d) l'enzyme CCoAOMTI du maïs dont la séquence est référencée 3s dans la base de données GenBank sous le n° d'accès AJ242980 et (e) l'enzyme CCoAOMT2 du maïs dont la séquence est référencëe dans la base de données GenBank sous le n° d'accès AJ242981.
Une fois obtenues, les constructions servent à transformer les cellules végétales. Avantageusement, la transformation des cellules s végétales peut étre réalisée par transfert des vecteurs susmentionnés dans les protoplastes végétaux, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol en présence de cations divalents (Ca 2+) (Schocher et al., 1986).
La transformation des cellules végétales peut avantageusement io être réalisée par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article de Fromm ef al. (1985).
La transformation des cellules végétales peut également ëtre réalisée par utilisation d'un canon à particules permettant la projection, à
très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences is d'ADN d'intérét, délivrant ainsi les séquences à l'intérieur du noyau cellulaire (Fromm et al. 1990, Finer et al., 1992).
Une autre méthode de .transformation des cellules végétales, esfi celle de la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire (Neuhaus et al., 1987).
2o Une des méthodes de transformation de cellules végétales pouvant être utilisée dans le cadre de l'invention est l'infection des cellules végétales par un hôte cellulaire bactérien comprenant le vecteur contenant la séquence d'intérêt. Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacferium tumefaciens, notamment selon la 2s méthode décrite dans l'article d'An et al. (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Guerche et al. (1987).
De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire 3o extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacferium tumefaciens, en utilisant un système binaire (Watson et al., 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la 3s sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Ce plasmide est maintenu dans Agrobacterium.
s Selon un mode préféré, la méthode décrite par Ishida efi al. (1996) peut être appliquée pour la transformation des monocotylédones, en particulier le maïs.
Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la mëthode décrite par Finer ef al. (1992) utilisant le canon à particules~de io tungstène ou d'or.
Selon encore un autre aspect, le procédé d'obtention de planfis de maïs transformé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles 1s qu'obtenues à l'étape b) ou à l'étape c) avec un second plant de maïs ;
e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène ou les transgènes.
Selon encore un autre aspect, le procédé d'obtention de plants de maïs transformés selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend 20 les étapes additionnelles suivantes f) croisement d'un plant de maïs transformé obtenu à l'étape c) avec un second plant de maïs ; ' g) sélection des plantes de maïs issues du croisement de l'étape f) et ayant conservé le transgène.
2s Un des modes de réalisation du procédé objet de l'invention concerne l'obtention de plants de maïs transgéniques à partir de cellules végétales transformées avec une construction comprenant au moins une séquencé choisie parmi les séquences SEQ ID n°1 ou SEQ ID n°2.
3o Cellules hôfes transformées par un polynucléotide antisens ou par un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT et plants de maïs transformés obtenus à partir des cellules hôtes transformées.
L'invention a aussi pour objet une cellule hôte de maïs ou une cellule de Agrobacterium tumefaciens transformée avec a) soit un polynucléotide antisens inhibant la synthèse de la méthyltransférase COMT dans une cellule de maïs ;
b) soit un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT, ledit polynucléotide (a) ou ledit polynucléotide (b) étant préfërentiellement s placé sous le contrôle d'une sëquence régulatrice fonctionnelle dans une cellule de maïs, par exemple dans une cassette d'expression ou encore dans un vecteur d'expression tels définis précédemmént.
La présente invention concerne les cellules de plantes transformées ainsi obtenues. En particulier, les cellules de maïs ayant lo intégré de manière stable dans leur génome les constructions comprenant toute ou partie des séquences SEQ ID n°1 ou n°2.
Les cellules transformées par les constructions objets de la présente invention sont sélectionnées au moyen du marqueur de sélection par exemple la résistance au SASTA~. Les cellules ls transgéniques sont ensuite cultivées sur un milieu approprié pour régénérer des plantes entières grâce aux méthodes bien connues de l'homme de métier. Dans. le cas des protoplastes, la paroi cellulaire peut se reformer sous l'efFet de conditions osmotiques appropriées. Dans le cas de graines ou d'embryons, un milieu favorable à la germination ou à
20 l'initiation de cals est employé. Pour les expiants, le milieu employé doit permettre la régénération.
Le principe de régénération in vitro de cellules végétales de maïs est bien connu de l'homme de métier. Les plantes sont régénérées à
partir de cals obtenus après culture de cellules d'anthères, de grains de 2s pollen, d'embryons ou de protoplastes. Les cellules sont cultivées sur des milieux nutritifs gélosés adaptés à chaque type cellulaire en conditions stériles dans des boïtes de Pétri ou des tubes de cultures .en chambre climatique dans des conditions environnementales favorables (température et luminosité adaptées). Aprés repiquage, les vitroplants 3o sont transplantés en serre.
En particulier, selon un des aspects de l'invention, les plants de maïs offrant une meilleure digestibilité et dont la teneur en unités S etlou G est modifiée, notamment possédant un rapport S/G inférieur à celui des plantes dont le rapport n'est pas modifié peuvent être obtenus après 3s hybridation avec un individu dont l'activité de la méthyltransférase COMT

est modifiée par les principes de sélection variétale bien connus de l'homme du mëtier.
L'homme du métier peut également employer les méthodes de multiplication végétative à partir des plants de maïs dont l'activité
s méthyltransférase COMT est modifiée, en particulier afin de modifier le rapport en unités S/unités G et/ou la teneur en lignine. Ces méthodes peuvent avantageusement comporter certaines étapes in vitro. Ce peut être des étapes de régénération de cellules possédant une activité
méthyltransférase COMT modifiëe. Ce peut être des méthodes de culture io tissulaire, de micro-bouturage, de culture de méristèmes, de culture d'embryons, de plants de maïs possédant une activité méthyltransférase COMT modifiée. Ce peut être des méthodes de régénération de protoplastes issus de plants de maïs possédant une activitë
méthyltransfërase COMT modifiée ou issus de fusion avec des 1s protoplastes issus de plants de maïs possédant une activité
méthyltransférase COMT modifiée.
L'invention a aussi pour objet un plarit de maïs transformé, susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini ci-dessus, qui est 2o caractérisë par des caractéristiques de digestibilité.améliorées.
Selon une première caractéristique pouvant le définir, un plant de maïs transformé conformément à l'invention possède des caractéristiques de digestibilité améliorées et une valeur de l'indice « dndf » d'au moins 80.
2s Selon une seconde caractéristique pouvant le définir, un plant de maïs selon l'invention possède une teneur en lignine Klason, mesurée à
partir des tiges et des feuilles, qui est infërieure à 8,5, de préférence inférieure à 8, à 7,5, à ,7,0, à 6,9 ou à 6,8, et de préférence inférieure à
6,7.
3o Un plant de maïs préféré selon l'invention possède une teneur en lignine Klason comprise entre 6,1 et 6,6.
Selon une troisième caractéristique pouvant le définir, un plant de maïs transformé selon l'invention possède un rapport S/G de la lignine inférieur à 40160.

L'invention est également relative à une partie d'un planfi de maïs firansformé tel que défini ci-dessus, par exemple une racine, une graine, une feuille, une tige ou une fleur.
Elle a également trait à des cellules de maïs isolées obtenues à
s partir d'un plant de maïs transformé tel que défini ci-dessus.
L'invention concerne aussi un vecteur d'expression recombinant comprenant un polynucléotide choisi parmi a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquemenfi l'expression du gène codant la méthyltransférase COMT de maïs ;
1o b) un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT ;
ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs.
La présente invention a aussi pour objet une construction d'ADN
comprenant un polynucléotide sens ou un polynucléofiide antisens 1s inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction du gène COMT
de séquence SEQ ID N°1, placé sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel chez le maïs.
Elle concerne également une construction d'ADN comprenant un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT, placée sous le 2o contrôle d'un promoteur fonctionnel chez le maïs pour augmenter l'expression de ladite enzyme.
L'invention est également relative à un produifi de transformation obfienu à partir d'un plant de maïs transformé ou d'une partie d'un plant de maïs transformé, tels que définis ci-dessus. Un fiel produit de 2s firansformation est caractérisé notamment en ce que la lignine qu'il contient prësente un rapport modifié entre les unités S et les unités G.
Préférentiellement, le rapport S/G est inférieur à 40160.
Ledit produit de transformation inclut les aliments pour le bétail, obtenus à partir des plants de maïs dont les teneurs en unités S ou en 3o unités G sont modifiées etlou dont la teneur en lignine est modifiée.
L'invention a aussi pour objet une lignine purifiée à partir d'un plant de maïs transformé ou d'une partie de plant de maïs tels que définis ci dessus, caractérisée en ce qu'elle présente notamment un rapport entre les unités S et les unités G qui est modifié, par rapport au rapport S/G
3s retrouvé dans la lignine de plants de maïs sauvages.

Préférentiellement la lignine purifiée ci-dessus est caractérisée en ce que le rapport S/G est inférieur à 40/60.
La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitées, aux exemples suivants.
EXEMPLES
Exempte 1 : Construction des vecteurs de transformation Plusieurs vecteurs ont été construits afin d'obtenir le vecteur de io transformation.
- Plasmide pProsper [Figure 5]
Un fragment Pstl-Hindlll de 0.26 Kpb correspondant au terminateur du gène de la nopaline synthase (T-Nos) est sous-cloné dans pUCl8 1s (Yannisch-Perron C. et al., 1985) entre les sites Pstl et Hindlll, donnant ainsi le vecteur pUC18-Nos. Le plasmide pMC1 (Collazo P. ef al., 1992), correspondant à l'ADNc de la C-OMT (1.4 kb) inséré au site pstl de pUC18. Une âmplification PCR est réalisée sur ce plasmide avec les oligonucléotides TOM22 (5'-CTGCTGGAGGTGCTGCAGAAG-3' - SEQ
2o ID N°3) et TOM23 (5'-CTCCTTGCCCCCGGGGTTGTG-3 - SEQ ID
N°4'), permettant d'introduire respectivement les sites Pstl et Smal, en 5' et en 3' d'un fragment de 0.85 Kpb compris entre les positions 0.17 et 1.04 Kpb de l'ADNc. Ce fragment est ensuite sous-cloné dans le vecteur pGemT (Promega), et le plasmide obtenu est digéré par Pstl et Smal. Le 2s fragment libéré est sous cloné dans pUC18-Nos aux sites Pstl et Smal, générant ainsi le plasmide pTMO-Nos.
Le plasmide pBARGUS (Fromm et a1.,1990) contient une cassette promoteur CaMV35S-intron Adhl-BAR-Tnos ainsi qu'une cassette 3o promoteur Adhl-Intron Adhl-GUS-Tnos. Cette dernière est libérée par une digestion EcoRl et Hindlll. Dans un deuxième temps, une digestion partielle EcoRl / Pvull du même fragment permet de libérer un fragment de 1.75 Kpb correspondant au promoteur Adhl couplé à l'intron Adhl. Ce fragment est alors sous-cloné dans pTMO-Nos entre EcoRl et Smal. Le 3s plasmide obtenu est le pProsper.

- Plasmide pAlix [Figure 5j Le plasmide PMC1 est digéré par Hindlll et Xbal pour libérer l'ADNc pleiné longueur (1.4 Kpb) de la C-OMT. Le plasmide pActine-BAR
s (Wu, (Cornell University, New York) est constitué du plasmide psP72 contenant une cassette promoteur actine - Intron actine - BAR - Tnos.
Ce plasmide est digéré par Hindlll et Xbal pour éliminer le fragment BAR, puis le fragment Hindlll-Xbal de 1.4 Kpb de la C-OMT est sous-cloné
entre ces deux sites, donnant ainsi le plasmide pAlix.
~o - Plasmide pBar2 [Figure 5j Le plasmide pBARGUS est digéré par Hindlll, pour libérer la cassette promoteur CaMV35S - Intron Adh1 - BAR - Tnos de 2.13 Kpb.
La cassette ainsi libérée est sous-clonée dans pUC18 au site Hindlll, is pour donner le plasmide pBar2.
- Plasmide p8ar [Fïgure 5j .
La construction du plasmide pBar est décrite par Peter Eckes (Biology Research Center H 872 N, Hoechst AG 6230 Frankfurt 80 l EP
20 0.275.957).
Exemple 2 : Transformation par A_arobacterium tumefaciens La technique de transformation décrite par Ishida et al. (1996) est utilisée à partir d'embryons immatures de 10 jours après la fécondation.
2s Tous les milieux utilisés sont référencés dans la référence citée.
La transformation débute avec une phase de co-culture où les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact pendant au moins 5 minutes avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 3o contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN-T contenant le gène d'intérét etiou le marqueur de sélection dérivé des plasmides décrits dans les exemples précédents, et le vecteur pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) qui contient : les gènes 3s vira et vire du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281 d'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette recombinaison homologue.
s Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25°C. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés : les cals embryogënes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg/l et de la céfotaxime à 250 mg/l (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium 1o tumefaciens). Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à
25°C.
La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSDS, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/l) en prësence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précëdemment. La troisième 1s étape de sélection consiste à exciser les cals de type I (fragments de 1 à

2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 25°C sur milieu LSD 10 en :présence de céfotaxime.
La régénération des plantules est effectuée en excisant les 2o cals de type I qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/l et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22°C et sous lumière continue.
Les plantules régénérées sont transférées sur milieu RM +
2s G2 contenant 100mg/l d'Augmentin pendant 2 semaines à 22°C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.
Exemple 3 : Transformation par bombardement Des cals du gënotype I2, âgés de 2 mois, obtenus après la mise en culture d'embryons immatures sur un milieu de callogénése sont utilisés pour la transformation.

s 1o Un traitement plasmolysant permet de réduire le volume de la vacuole et limite ainsi les éclatements cellulaires lors du tir (prétraitement de 4 heures et un posfi-traifiement de 16 heures sur un milieu Sorbitol 0.2M et Mannitol 0.2M).
Le matériel végétal est réparti de façon homogène sur l'ensemble de chacune des boîfies.
15 mg de microbilles de tungstène stëriles sont mélangées dans 150p1 d'eau milliQ stérile.
Pour 5 tirs, le mélange suivant est préparé
- 25p1 de microbilles de tungstène, 2,5 p1 d'ADN du plasmide portant le gène d'intérét (à1 pg/pl), - 2,5 p1 d'ADN du plasmide portant le gène de sélection (à 1 pg/pl), 1s - 25 p1 de CaCl2 à 2,5M, - 10 p1 de spermidine à 0,1 M, Ce mélange 'est laissé à décanter dans la glacé pendant au moins 5 minutes.
2o Cinq boîtes de Pétri contenant le matériel à bombarder sont placées sur des boîtes Agar à 15g/L.
50p1 de surnageant du tube décanté sont éliminés et le mélange restant est bien vortéxé, puis 2 p1 de celui-ci est déposé sur la grille de la 2s seringue stérile, qui est vissée sur le support dans le canon.
Un filtre de gaze stérile est placé sur la boîte de pétri qui est disposée à
19 cm dans l'enceinte du canon. Le vide est poussé à l'intérieur de l'enceinte à la pression de 25 mbars Le tir est déclenché. La pression de l'hélium dans le canon est de 8 bars.
Le matériel végétal bombardé est remis sur sa boîte de pétri d'origine (Mannitol/Sorbitol). Les boîtes sont placées à 26°C et à l'obscurité

pendant 16 heures pour un traitement plasmolysant post-bombardement (mannitol/sorbitol).
La pression de sélection est appliquée 16 héures après le tir et est s maintenue à la méme concentration de l'agent sélectif (bialaphos à
5mg/L) pendant toutes les étapes de régénération. Les plantules sont ensuite repiquées dans du terreau (petits pots) pendant 1 semaine puis transférées en pots de 20 litres (mélange tourbe-pouzzolane) dans la serre transgénique ou en chambre climatisée (Température 24°C jour/
l0 20°C nuit; photopériode 16h jour/ 8h nuit, hygrométrie 80%). Les plantes sont autofécondëes ou croisées.
Exemple 4: Analyse des ARNs par Northern Blot et de l'ADN
1s aénomiaue par Southern Blot A. Matériels et Méthodes Les ARN sont isolés par la solution Extract-all (Eurobio); selon le protocole du fournisseur. Une précipitation supplëmentaire avec 0.2 M de 2o NaCI avec 2 volumes d'éthanol absolu est effectuée. 10pg d'ARN sont séparés sur gels au formaldehyde (Sambrook et a1.,1989). L'ADN
génomique total est extrait à partir de 1 g de feuilles par la méthode décrite dans Dellaporta et al. (1983). Après une étape de purification au phénol-chloroforme, 10pg d'ADN sont digérés avec 40 unités d'enzyme 2s de restriction (Promega), et séparés sur gel TAE d'agarose à 1 % (m/v).
Les ARNs ou les ADNs sont transférés sur membranes de nylon (Hybond-N+, Amersham), et hybridés avec des sondes ADN marquées au 3~P-dCTP par le kit " prime-a-gene labelling system " de Promega. Le signal d'hybridation est déterminé en mettant en contact les membranes 3o avec des films Biomax-MS de Kodak dans une cassette d'autoradiographie.
B. Rësultats La Figure 6A représente une analyse Northern blot de la lignée de 3s maïs C-OMT 225 au stade 20 jours.

Des ARNs de racines (r), collet (c), et feuilles enroulées (H) de la lignée 225 et de la lignée témoin I2 ont été déposés dur gel d'électrophorèse d'agarose.
Après migration et incubation pendant 10 minutes dans une s solution de BET à 0,1 pg/ml, le gel a été photographië sous UV dans le but d'estimer les quantités relatives des ARNs ribosomiques (rRNA).
L'hybridation de la membrane après transfert avec une sonde ADNc marquée au 32P permet d'observer une forte diminution des transcrits C
OMT dans tous dans tous les organes testés (R, C, H) chez la lignée l0 225, par rapport à h.
La Figure 6B représente une analyse Southern blot comparative entre la lignée antisens 225 et la lignée h, en utilisant quatre enzymes de restriction distinctes, respectivement : EcoRV, Kpnl, EcoRl et Sacl.
La sonde utilisée est un fragment de 1,2 Kb localisé dans la région 1s 3' de l'ADNc C-OMT de maïs.
Les bandes révélées sur la lignée I2 sont dues au gène endogène C-OMT.
Les bandes surnumérâires présentes pour la lignëe 225 correspondent aux séquences transgéniques : les enzymes EcoRV, Kpnl 2o et Sacl ne coupent pas dans le transgène. Un site EcoRl est présent dans la partie 5' de la construction transgénique. Selon les cas, 3 bandes (EcoRl, EcoRV) ou 2 bandes (Kpnl, Sacl) surnuméraires apparaissent pour la lignée 225.
Les résultats montrent que la lignée 225 a été transformée avec 2 2s ou 3 copies du transgéne.
Exemple 5 : Analyse enzymatiaue de la COMT
A. Matëriels et Mëthodes 3o Le protocole utilisé est dérivé d'Atanassova et al. (1995).
Brièvement, de jeunes plantes de 20 jours (post-semis) sont récoltées en coupant au niveau du collet, puis les feuilles sont éliminées de la partie aérienne (coupure au niveau de la ligule). Le fragment restant, d'environs 15 cm de long est fixé dans l'azote liquide et broyé dans un mortier avec 3s un pilon. La poudre obtenue est homogénéisée dans le tampon d'extraction Na2HPO~/NaH2P04 0.1 M pH7.5, PVPP 5% (mlv), DTT
(10mM) à raison de 1 mL de tampon pour 300 mg de poudre. Après '/2 heure d'incubation à 4°C, deux centrifugations successives (3000, g l min. / 4°C) sont réalisées pour éliminer le matériel insoluble. 40 pL
s d'extrait brut ainsi obtenu est ajouté à 960 pL de mélange réactionnel (Acide caféique 3mM, 3H-SAM 0.1 pCi, SAM 50pM, DTT 10mM, Tampon Na2HP04 / NaH2P04 0.1 M pH7.5 qsp 960pL) et l'ensemble est incubé 1 h à 37°C. La réaction est arrêtée avec 100pL d'acide sulfurique 9N et 5 mL de scintillant organique (OCS, Amersham) sont ajoutés au mélange.
1o L'ensemble est homogénéisé pour faire passer l'acide férulique tritié, produit de la réaction, dans le scintillant organique. La quantification de la radioactivité de l'acide férulique est réalisée avec un compteur à
scintillation Beckman. Les protéines sont dosées selon la méthode de Bradford (1976) avec le réactif de Biorad.
B. Résultats Criblage, des plantes transgéniques sur la base,de l'activité C=OMT
(figure 7) 1 - Choix de la partie de la plante utilisée pour la mesure de l'activité
C-OMT
Les plantes ont été récoltées à un stade jeune (âgées de 20 jours après semis), ce qui implique un délai court entre semis et analyse, et ce qui permet de cultiver un grand nombre de plantes simultanément. La tige et 2s les jeunes feuilles enroulées ont été utilisés en mélange pour ce travail.
Les feuilles ligulées ont été éliminées.
2 - Activité C-OMT chez les plantes témoins utilisées pour le criblage 3o La lignée utilisée comme témoin dans le criblage est I2. La barre d'histogramme des témoins I2 résulte de la moyenne des résultats obtenus sur 12 plantes analysées deux fois. On a pour ces témoins des valeurs d'activité qui varient de 4385 à 7225 cpm/mg de protéine, Ia moyenne se situant à 5998 cpm/mg avec un écart type de 1039. Ce 3s premier résultat permet d'estimer la variabilité de l'activité C-OMT entre 3s des plantes différentes récoltëes au même moment. On voit que celle-ci est relativement réduite.
La lignée de maïs mutante bm3 a été utilisëe pour la comparaison. II
était intéressant de validér le protocole de mésure de l'activité C-OMT, s utilisé pour la première fois sur le maïs, à l'aide du mutant bm3, qui présente une activité C-OMT nulle. Trois plantes bm3 ont été analysées, et on observe un niveau d'activité très faible correspondant au bruit de fond. Les extraits bruts de protéines des plantes bm3 constituent donc d'excellents témoins négatifs dans ce travail.
1o

3 - Activité C-OMT dans les populations transgéniques Les résultats portant sur l'analyse de 32 évènements de transformation différents sont résumés sur la figure 7. Puisque l'analyse a été faite dans certains cas sur deux lots de graines du même événement 1s de transformation. Trois plantes du même lot ont été analysées de façon à pouvoir établir un écart-type. Chaque extrait brut a été utilisé pour deux déterminations d'activité.
Un total de 20 ëvènéménts avec le promoteur ADH-ASOMT
(pProsper et pProsper-Bar) ont été analysés. Une réduction significative 2o de l'activité COMT, de l'ordre de 70%, a été obtenue pour certains événements.
Exemple 6 : Analyse histoloaiaue 2s A. Matériels et Méthodes Coloration de Maille : Les coupes sont incubées dans une solution de KMnO~, à 1 % (m/v) pendant 5 minutes, rincées dans de l'eau distillée, décolorées avec une solution de HCI 15N pendant 3 minutes, rincées dans de l'eau distillée, et incubées dans une solution de NaHC03 à 5%
30 (m/v).
Coloration au phloroglucinol : Les coupes sont immergées dans une solution de phloroglucinol en solution chlorhydrique (Prolabo).
Les photographies sont réalisées avec une caméra.
3s B. Résultats Les résultats sont représentés sur la Figure 8, qui représente des clichés de microscopie photonique de faisceaux .cribro-vasculaires de feuilles adultes de maïs, respectivement de la lignée I2 de maïs témoin et s de la lignée de maïs 225, qui a été transformée avec un polynucléotide antiens inhibant la méthyltransférase COMT.
Sur la Figure 8, on voit que la coloration est moins intense dans le sclérenchyme et dans le xylème de la lignée 225 que dans le sclérenchyme et le xylème de la lignée I2 témoin.
1o Cela reflète une diminution des unités S dans les lignines de la variété transgénique de maïs 225.
Exemple 7 ' Test de diaestibilité des plantes par évaluation de la solubilité enzymatiaue A. Matériels et Méthodes Cette méthode permet d'estimer une .digestibilité potentielle par l'activité d'enzymes cellulolytiques sur la paroi végétale. Les échântillons sont placés dans des sachets scellës et plongés dans lés solutions 2o enzymatiques. Les réactions ont lieu dans un incubateur DAIZY pouvant contenir quatre flacons de 2 litres, agités par rotation , maintenus à
40°C
et pouvant contenir de 20 à 80 sachets. Les ëchantillons de poudre lyophilisée sont incubés une nuit à 70°C dans un cristallisoir. Puis, 0.5 g de poudre (masse initiale) sont déposés dans un sachet (F57, Ankom) 2s qui est fermé par soudure, incubé 24 h à 70°C puis pesé après refroidissement (P1 ). Le sachet est ensuite incubé dans une solution de pepsine (Merck) à 20 g / L de HCL 0,1 N, à 40°C pendant 24 h, puis à
80°C pendant '/2 heure. L'ensemble est alors rincé à l'eau à
35°C et essoré. Cette étape est répétée une fois. Le sachet est ensuite incubé
3o dans une solution de cellulase (Onozuka R10 Yakult, Biochemical Co,Ltd.) à 1 g/L avec de l'amyloglucosidase (Merck) à 0.1 g / L dans un tampon acétate de sodium / acide acétique (2.95 mL d'acide acétique à
96% et 6.8 g de d'acétate de sodium dans 1 L d'eau déminéralisée), à
40°C pendant 24 h, puis rincé et essoré deux fois, avant d'être séché à

M'étuve à 70°C pendant 24 heures. Le sachet est pesé (P2). La solubilité
(en % de la masse sèche) est égale à (P1-P2) / (masse initiale x 100).
B. Résultats s Les résultats comparés de digestibilité sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : Indice de digestibilité des plants de maïs Ligne Neutral detergent Digestibilit (dndf) fiber nd 225 1 47.69 86.24 225 2 43.65 82.20 tmoin 46.85 77.61 1o Dans le Tableau 1, l'indice ndf représente le pourcentage de fraçtion riondigestible mesuré à partir de, poudre lyophilisée de plantes entières récoltées au stadè floraison.
Dans le Tableau 1, l'indice dndf reprësente l'indice de digestibilité
1s calculë à partir de la valeur de ndf (neutral detergent fiber) et du dms (solubilité enzymatique Aufrère) selon la formule de Struik (1985).
Les résultats du Tableau 1 montrent la digestibilité plus élevée des deux lignées de maïs transgéniques 225(1 ) et 225(2) qui ont été
transformées avec une construction antisens selon l'invention, par ao rapport à la 'variété de maïs « WT » témoin, la lignée de maïs I2.
Exemple 8 ' Evaluation de la .teneur, la compbsition et de la structure en lianine de mâis transaëniaues sous-exprimant la COMT ' évaluation par CPG-SM des produits monomères issus de 2s leur thioacidolyse 1~ Etude des lianines: teneur et structure Trois lignées de maïs, un témoin (WT) et deux lignées anti-sens COMT
du méme événement de transformation présentant une activité résiduelle de 40 % (3.2 et 1.2) récoltées au stade floraison, lyophilisées et broyées ont été analysées.
Les échantillons ont été extraits par un mélange acétone/eau (5/1 ) afin s d'éliminer l'essentiel des composés solubles (pigments, lipides...) par un protocole relativement rapide. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 : le "résidu" de l'extraction représente à peu près le pourcentage de parois dans l'échantillon.
io Tableau 2 : Résultats de l'extraction des échantillons de maïs témoin (WT) et transgéniques WT ASCOMT1.2 ASCOMT3.2 crois 57.7 52.5 55.2 extractibles 42.3 47.5 44.8 Là teneur .assez élevée en . extractibles est imputablé à la présence des 1s feuilles.
Les valeurs observées sont assez semblables pour les 3 lignées.
Le dosage de la lignine Klason a été réalisé sur les échantillons extraits.
II est exprimé en pourcentage pondéral de ces échantillons (tableau 3).
Tableau 3: Teneur en lignine Klason des échantillons de maïs (tiges +
feuilles) extraits. Résultats exprimés en % pondëral des parois extraites WT ASCOMT1.2 ASCOMT3.2 Essai 1 8.89 6.11 6.50 Essai 2 8.63 6.34 6.57 Moyenne (cart- 8.76 (0.18) 6.23 (0.16) 6.54 (0.05) t e 2s Les teneurs en lignine sont plus faïbles que dans le cas de tiges récoltées à maturité : les échantillons extraits proviennent en effet de (feuilles + tiges) récoltées au stade floraison. Les deux lignées transgéniques présentent une teneur en lignine plus faible (25 à 30% en moins) que la lignée témoin.
La teneur en extractibles étant similaire pour les 3 lignées (Tableau 2), l'écart entre WT et antisens est maintenu lorsque le calcul est réalisé sur s l'échantillon non extrait Afin d'évaluer l'impact de la transformation sur la structure des lignines, les plantes entières (feuilles+tiges) ont été soumises à
thioacidolyse (Lapierre et al., Plant Physiol 119, 153-163, 1999), suivie io de l'analyse CPG-SM de leurs dérivés triméthylsilylés (Saturn Varian , impact électronique, 45-650 m/z). La frëquence relative des unités p-hydroxyphényles H, guaiacyles G, syringyles S et 5-hydroxyguaiacyles 5-OH G engagées uniquement dans des liaisons -0-4 a été déterminée sur les chromatogrammes reconstruits sur les ions 1s les plus spécifiques des dérivés qu'ils génèrent (Figure 2). Ces ions, correspondant au pic de base du spectre de masse, permettent d'évaluer sans équivoqué. les proportions des unités H/G/S/5-OHG liées en -O-4.
Les résultats rapportës dans le Tableau 4 et en Figure 3 révèlent 2o sans équivoque l'efficacité de la transformation visant à sous-exprimer l'activité COMT. Les lignées transgéniques 3.2 et 1.2 présentent un effondrement de la fréquence des unités S (divisée par 2) et surtout l'apparition dans leurs lignines d'unités 5 OH-G en quantifié substantielle (multipliée par un facteur compris entre 10 et 20). L'effet est un peu plus 2s marqué dans le cas de la lignée 1.2. Les écarts observés entre Tableaux 3 et 4 pour les témoins sont imputables aux diffërences d'organes analysés, de stade de récolte et de lignéé.

Tableau 4. Structure des lignines de maïs (tiges + feuilles récoltées à la floraison) de lignées témoin et sous-exprimant la COMT
Fréquence relative des unités H, G, S et 5-OHG liées en -O-4 Echantillon Tmoin AS COMT 3.2 AS COMT 1.2 %Units H 3,2 2,5 2,4 %Units G 56,0 68,7 70,1 %Units S 40,5 24,4 20,4 %Units 501 G 0,3 4,4 7,1 SIG 0,72 0,36 0,29 21 Etude des esters p-OH cinnamigues liés aux yarois de maïs extraites Les esters p-hydroxycinnamiques liés aux parois ont été libérés par hydrolyse alcaline (NaOH 1 M, 2.5 h, 40°C, 20 mg d'échantillon extrait 1o traitë par 2 ml de soude, en présence de 0.2 mg étalon interne éthylvanilline, avec agitation magnétique et sous N2). L'hydrolysat a été
acidifië par HCI 2 M (1.5 ml), ultrafiltré sur Millex H25 NS (Millipore). Les composés phénoliques ont été extraits par extraction en phase solide sur Sep-Pak C1.8 (Classic, Waters Millipore), selon un protocole adapté de 1s Beveridge et al. (2000, Food Res.. Internat., 33, 775-783). Le conditionnement de la cartouche Sep-pak a été réalisé par 2*5 ml MeOH, 2*5ml eau (milliQ), 2*5 ml tampon formiate pH 3, avant passage de l'hydrolysat acidifié, suivi d'un lavage par 3 ml tampon formiate. L'élution des composés phénoliques retenus intégralement sur la cartouche (nous 20 l'avons vérifié) a été réalisée par 1 ml CH3CN. L'échantillon recueilli a ëté
dilué v/v par le solvant de CLHP avant d'être ultrafiltré à nouveau et analysé par CLHP en phase inverse (20 p1 injectés). Un traitement identique a été rëalisé sur un mélange étalon témoin contenant des quantités équipondérales d'acide p-coumarique (PC), d'acide férulique (Fe) et d'éthylvanilline (EtV), pour réaliser la calibration. L'analyse CLHP
a été réalisée sur colonne Lichrocart RP18 Merck (5 pm, 250 ~' 4 mm), utilisée en conditions isocratiques, avec élution par le mélange s eau/CH3CN/CH3COOH (78120/2, v/v) à un débit de 1.3 ml/min et avec 'détection en sortie de colonne à 280 nm. Les résultats sont rapportés dans le tableau 5 et illustrés en Figure 4. .
Tableau 5 : Quantité d'acides p-coumarique (PC) et féruliques (FE) 1o libérés par hydrolyse alcaline douce (NaOH 1 M, 2.5h, 40°C) d'échantillons de maïs (tiges + feuilles) extraits. Résultats exprimés en pondéral des parois extraites WT ASCOMT1.2 ASCOM T3.2 Essai PC FE PC FE PC FE

Essai 0.81 0.89 0.55 1.03 0.54 1.06 Essai 0.80 0.85 0.56 1.05 0.54 1.04 Mo enne 0.80 0.8fi 0.56 1.04 0.54 1.05 1s A nouveau, les résultats présentent une plus faible teneur en esters p-coumariques que les lignëes témoins analogues, tandis pue les teneurs en esters féruliques sont peu affectées par la déficience en activité
COMT. Le résultat global est une diminution du rapport PC/FE.
Ralph et al. ont démontré à plusieurs reprises qu'une partie de l'acide p 2o coumarique acyle les unités S des lignines (par RMN et par thioacidolyse) : la baisse en, esters PC observée ici va donc de paire avec la baisse des unités S.
Les esters féruliques sont associés aux polysaccharides et peuvent être liés aux lignines par liaisons éthers (Jacquet et al., 1995). La teneur plus 2s faible des maïs transgéniques en lignines limite cet arrimage et rend compte, vraisemblablement, du fait qu'on libère davantage d'acide férulique par hydrolyse alcaline des lignées transgéniques, par rapport au témoin. .

REFERENCES
An et al., (1986) Plant Physiol. 81, 86-91 s Atanassova R, Favet N, Martz F, Chabbert B, Tollier MT, Monties B, Fritig B et Legrand M, 1995. Alterned lignin composition in transgenic tobacco expressing O-méthyltransférase sequences in sense and antisense orientation. Plant J. 8 : 465-477.
Aufrère (1982), Etude de la prévision de la digestibilité des fourrages par io une méthode enzymatique Ann. Zootah, 31 (2), 111-130 Barrière et al., 1994, Agronomie, 14, 15-25 Barrière Y et Argillier O, 1993. Brown midrib genes of maize, a review.
Agronomie : 13 : 865-876.
Baucher M, Bernard-Vailhe MA, Chabbert B, Besle JM, Opsomer C, Van is Montagu M, Botterman J., Plant Mol Biol 1999 Feb;39(3):437-47.
BEVAN et al., Nucleic Acids Research, vo1.12:8711-8721.
Beveridge et al. 2000. Food Res. Internaf., 33, 775-783.
Blee K, Choi JW; O'Connell AP, Jupe SC, Schuch W, Lewis NG, Bolwell GP,. Phytochemistry 2001 Aug;57(7):1159-66 2o Bloksberg, 1991. Studies on the biology of Phenylalanine ammonia lyase and plant pathogen interaction. Thèse de l'Université de Californie n °9217564.
Boerjan W, Ferret V V, De Nadai V, Jouanin L., Plant Physiol 1999 Jan;119(1 ):153-64 2s Boudet AM, 1998. A new view ofd lignification. Trends Planf Sci. 3 : 67-61.
Boudet AM, Lapierre C ; et Grima-Pettenati J, 1995. Biochemestry and molecular biology of lignification. New Phytol. 129 : 203-236.
Bradford M.M, 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of 3o microgram quantifies of protein-dye binding. Anal. Biochem. :72 :248-254 Carvalho Niebel et al., 1995. Plant Cell :7:347-358 Chabbert et al., 1994, J Sci. Food Agric, 64, 349-355 Christensen et al., 1996, Transgenic. Res., 5:213 Collazo P., Montoliu L., Puigdomenech P. and Rigau J. (1992), Structure s and expression of the lignin O-methyltransferase gene from Zea mays L.
Plant Molecular Biology 20, 857-867 Datla, R. et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev., 3:269-296 Davin LB and Lewis NG, 1992. Phenylpropanoid metabolism biosynthesis of monolignols, lignans and neolignans, lignins and io suberins. In HA Stafford, RK Ibrahim eds, Phenofic Metabolism in Plants.
Plenum Press, Nevv York, pp 325-375.
Dellaporta S.L., Wood J. and Hicks J.B, 1983. A plant DNA
minipreparation : version I I. Plant Mol. Biol. Reporter : 1 (4) : 19-21.
Dixon RA, Chen F, Guo D et Parvathi K,. 2001. The biosynthesis of 1s: monolignols : a 'metabolic grid', or independent pathways to guaiacyl and syringyl units ? Phytochemistry, in press Eckes P. (Biology Research Center H 872 N, Hoechst AG 6230 Frankfurt 80) Finer et al. (1992) Plant Cell Report, 11, 323-328 2o Franck et al., (1980) Cell : 21 : 285-294 Fromm et al., (1985) Proc. Noat. Acad. Sci. 82, 5824 Fromm et a1.,(1990) Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of trânsgenic Guerche et al. (1987), Mol Gen. Genet 206, 382 2s Guo D, Chen F, (noue K et Dixon RA, 2001. Down regulation of caffeic acid 3-O methyltransferase and caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) : effects on lignin structure and implications for the biosynthesis of guaiacyl and syringyl lignin. Plant cell 13 : 73-88.
3o Hajdukiewicz et al.,. Plant Mol. Biol. 25 (6), 989-994 (1994) Haseloff et al., 1988. -Nature 334 : 585-591.
Ishida et a1.,1996. Nature biotechnology : 14 : 745-750 Jacquet et al. 1995. J Agr Food Chem, 43, 2746-2751.
Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vo1.5:387-405.
s Lapierre C, Pollet B, Petit-Conil M, Toval G, Romero J, Pilate G, Leple JC, Lapierre C, Tollier MT et Monties B, 1988. Occurrence of additional monomeric units in the lignins from internodes of brown-midrib mutant of maize bm3. CR Acad. Sci Paris : 307 723-728.
io Lapierre ef al., 1999. Plant Physiol 119, 153-163 Léonard M, 1996. Concepts et stratégies alimentaires pour la vache laitière haute productrice. Symposium sur les bovins laitiers. CPAQ, pp 16-56.
Li L, Popko JL, Umezawa T et Chiang VL, 2000..5-hydroxyconiferyl 1s aldehyde modulates enzymatic methylation fôr syringyl monolignol formation, a new view of monolignol biosynthesis in angiospems. J. Biol.
Chem. 275 : 6537-6545.
Luehrsen K, 1991. Mol. Gen. Genet. : 225 : 81-93 maize plants. Biotechnology : 8 : 833-839.
2o Maniatis et al., 1989. Molecular cloning : a laboratory manual, Cold spring harbor laboratories, Cold Spring harbor, NY.
Matzke MA, Matzke AJ, Pruss GJ, Vance VB, Curr Opin Genet Dev 2001 Apr;11 (2):221-7 Méchin V et al., 2000. Relationship of cell wall composition to in vitro cell 2s wall digestibility of maize inbred line stems. J. Sci Food Agric. : 80 :

580.
Napoli et al., 1990. Plant Cell : 2 : 279-290 Neish AC, 1968. Monomeric intermediates in the biosynthesis of lignin. In constitution and Biosynfhesis of Lignin, F. Freudenberg and AC Neish, 3o eds New York : Springer Verlag pp 1-43 Neuhaus et al., (1987).Theor. Appl. Genet. 75(1 ), 30-36 Pincon G, Chabannes M, Lapierre C, Pollet B, Ruel K, Joseleau JP, Boudet AM, Legrand M, Plant Physiol 2001a May;126(1):145-55 Pincon G, Maury S, Hoffrriann L, Geoffroy P, Lapierre C, Pollet B, s Legrand M., Phytochemistry 2001 b Aug;57(7):1167-76 Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., 1989 Molecular cloning : A
laborafory manual. Cold Spring Harbor, Nevv York : Cold Spring Harbor Laboratory Press Sarkanen KV, Hergert HL, 1971. Classification and distribution. In 1o Lignins, Occurrence, Formation, Structure and Reactions, ed KV
Sarkanen, CH Luduvig, New York : V1/iley pp 43-94.
Schocher et al., 1986 Struik P.C. (1983) Physiology of forage maize (Zea mays L.) in relation to its production and quality. Thèse doctorat, Université d'Agriculture de 1s Wageningen, 252 p.
Van Doorsselaere J, Baucher M, Chognot E, 1995. A novel lignin in poplar trees with a reduced caffeic acidi5-hydroxyferulic acid O-methyltransferase activity. Plant J. 8 : 855-864.
Van Soest P.J. (1967) Development of a comprehensive system of feed 2o analyses and its application to forages. J. Aniom. Sci., 28, 119-128.
Watson et al., 1994.
Whetten RW, Mackay JJ et Sederoff RR , 1998. Recent advances in understanding lignin biosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol Plant. Mol.
Biol. 49 : 585-609.
2s Yang F. ET AL.,. Nat. Biotechnol. 1996 Oct. 14(10):1246-51.
Yang TT,ET AL., Nucleic acids Res. 1996, Novembre 15; 24(22):4592-3.
Yannisch-Perron C., Vieira J. and Messing J. (1985), Improved M13 phage cloning vectors and host strains : nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119 Ye ZH et Varner JE, 1995. Differential expression of two O
methyltransferases in lignin biosynthesis in Zinnia. Plant Physiol. 108 459-467.
Ye ZH, 1997.Association of caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase s expression with lignifying tissues in several dicot plnats. Plant Physiol.
115 : 1341-1350.
Ye ZH, Kneusel RE, Matern U, et Varner JE, 1994. an alternative methylation pathway in lignin biosynthesis in Zinnia. Plant tell 6 : 1427-1439.
io Zhong R, Morrison IWH, Negrel J et Ye ZH, 1998. Dual mathylation pathways in lignin biosynthesis. Plant tell 10 : 2033-2045.
Zhong R, Morrison WH 3rd, Himmelsbach DS, Poole FL tnd, Ye ZH, Plant Physiol 2000 Oct;124(2):563-78 LISTE DE SEQUENCES
<110> Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Aventis Cropscience S.A.
Biogemma S.A.S.
<120~> Procédê d'obtention de plants de maïs transformés â
caractéristiques de digestibilité améliorées, plants de maïs obtenus par le procédé et utilisations <130> COMT
<140>
<141>
<160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1488 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: sens de la COMT
<400> 1 tcctcgagcc cagcagagaa aggccggcag cgctaatcgt aatagccatg ggetccaccg 60 ccggcgacgt ggccgcggtg gtggacgagg aggcgtgcat gtacgcgatg cagctggcgt 120 cgtcgtccat cctgcccatg acgctgaaga acgccatcga gctgggcctg ctggaggtgc 180 tgcagaagga ggccggcggc ggcaaggcgg cgctggcgcc cgaggaggtg gtggcgcgga 240 tgcccgcggc gcccagcgac cccgccgccg ccgcggccat ggtggaccgc atgctccgcc 300 tgCtCgCCtC CtaCgaCgtC gtccggtgcc agatggagga ccgggacggc cggtacgagc 360 gCCgCtaCtC CgCCgCgCCC gtctgcaagt ggctcacccc caacgaggac ggcgtgtcca 420 tggccgccct cgcgctcatg aaccaggaca aggtcctcat ggagagctgg tactatctca 480 aggacgcggt gctggacggc ggcatcccgt tcaacaaggc gtacgggatg acggcgttcg 540 agtaccacgg cacggacgcg cgcttcaacc gcgtgttcaa cgagggcatg aagaaccact 600 cggtgatcat caccaagaag ctgctggact tctacacggg cttcgagggc gtgtcgacgc 660 tggtggacgt gggcggcggc gtgggCgCCa CgCtgCaCg'C CatCaCgtCC CgCCaCCCgC 720 acatctccgg ggtcaacttc gacctgccgc acgtcatctc cgaggcgccg ccgttccccg 780 gcgtgcgcca cgtgggcggg gacatgttcg cgtccgtgcc cgccggcgac gccatcctca 840 tgaagtggat cctccacgac tggagcgacg cgcactgcgc cacgctgctc aagaactgct 900 acgacgcgct gccggaaaat ggcaaggtca tcgtcgtcga gtgcgtgctg ccggtcaaca 960 cggaggccac ccccaaggcg cagggcgtgt tccacgtcga catgatcatg ctcgcgcaca 1020 accccggcgg caaggagcgg tacgagcgcg agttccgcga gctcgccaag ggcgccggct 1080 tctccgggtt caaggccacc tacatctacg ccaacgcctg ggccatcgag ttcatcaagt 1140 gaatacggct accaccgtcg ccgcgatgag atgcatggct gccacatgca tgcttgcttg 1200 cttggtcctc gtatcgtacg tcgccgtcgt cgtcttcttc tggttgcgct gctaccttgc 1260 tgctctcgcc ctcgcgtatg catgtacttt tgcttaattt tctttcttca tatcatgcac 1320 tctggctggc ctagactgcc cccgatccat ggtggccatg tcttcggtac gtcttgtcga 1380 gctcttgcat gtcgtggatt ctaaattctt cttctgcgtc gaattgtctc tgccatgtgc 1440 gagtaataac aatcaaggtt atacttacca tacaattaca tggtggtt 1488 <210> 2 <211> 870 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:antisens de la COMT
<400> 2 ctgctggagg tgctgcagaa ggaggccggc ggcggcaagg cggcgctggc gcccgaggag 60 gtggtggcgc ggatgcccgc ggcgcccagc gaccccgccg ccgccgcggc catggtggac 120 cgcatgctcc gcctgctcgc ctcctacgac gtcgtccggt gccagatgga ggaccgggac 180 ggccggtacg agCgCCgCta CtCCgCCgCg CCCgtCtgCa agtggCtCa.C CCCCaaCgag 240 gacggcgtgt ccatggccgc cctcgcgctc atgaaccagg acaaggtcct catggagagc 300 tggtactatc tcaaggacgc ggtgctggac ggcggcatcc cgttcaacaa ggcgtacggg 360 atgacggcgt tcgagtacca cggcacggac gcgcgcttca accgcgtgtt caacgagggc 420 atgaagaacc actcggtgat catcaccaag aagctgctgg acttctacac gggcttcgag 480 ggcgtgtcga cgctggtgga cgtgggcggc ggcgtgggcg ccacgctgca cgccatcacg 540 tCCCgCCaCC CgCaCatCtC CggggtCaaC ttcgacctgc cgcacgtcat ctccgaggcg 600 ccgccgttcc ccggcgtgcg ccacgtgggc ggggacatgt tcgcgtccgt gcccgccggc 660 gacgccatcc tcatgaagtg gatcctccac gactggagcg acgcgcactg cgccacgctg 720 ctcaagaact gctacgacgc gctgccggaa aatggcaagg tcatcgtcgt cgagtgcgtg 780 ctgccggtca acacggaggc cacccccaag gcgcagggcg tgttccacgt cgacatgatc 840 atgctcgcgc acaaccccgg cggcaaggag 870 <210> 3 <211> 21 <212> ADN
<213> Sëquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 3 ctgctggagg.tgctgcagaa g 21 <210> 4 <211> 21 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 4 CtCCttgCCC CCggggttgt g 21

Claims (31)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'un polynucléotide modulant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs codée par 1a séquence nucléotidique SEQ ID N o1, dans un procédé d'obtention de plants de maïs à
caractéristiques de digestibilité améliorées ayant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit polynucléotide est un polynucléotide antisens inhibant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs.

3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le polynucléotide antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID
N o2.

4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit polynucléotide code la méthyltransférase COMT de maïs, et provoque une production .plus élevée de cette enzyme dans la plante.

5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N o1.

6. Procédé d'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, possédant un rapport entre tes unités S et G
de la lignine modifié et/ou dont la teneur en lignine est modifiée et compatible avec le développement normal de la plante, ledit procédé
comportant une étape de transformation d'une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants :
a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la méthyltransférase COMT de maïs ;
b) un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement la traduction du gène codant pour la méthyltransférase COMT de maïs.;
b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le polynucléotide antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID
N o2.

9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs;
b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N o1.

11. Procédé selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante :
c) sélectionner les plants de maïs ayant intégré dans leur génome au moins une copie du polynucléotide antisens ou au moins une copie du polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs.

12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs est intégré dans une cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique régulant l'expression dudit polynucléotide dans les cellules de maïs.

13. Procédé selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisé en ce que le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs est artificiellement inséré dans une cellule de Agrobacterium tumefaciens.

14. Procédé selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisé en ce qu'à
l'étape a), la cellule hôte de maïs est aussi transformée avec au moins un second polynucléotide, modulant spécifiquement l'expression d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le second polynucléotide est choisi parmi:
a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs ;
b) un polynueléotide codant l'enzyme impliquée dans, la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines code pour une enzyme autre que la méthyltransférase COMT de maïs.

17. Procédé selon l'une des revendications 6 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes :
d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape b) ou à l'étape c) avec un second plant de maïs ;
e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène ou les transgènes.

18. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 11 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes:
f) croisement d'un plant de maïs transformé obtenu à l'étape c) avec un second plant de maïs ;

g) sélection des plante de maïs issus du croisement de l'étape f) et ayant conservé le transgène.

19. Cellules de maïs susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une des revendications 6 à 18.

20. Plant de maïs transformé susceptible d'être obtenu à partir des cellules selon la revendication 19.

21. Partie d'un plant de maïs transformé selon la revendication 20, notamment, racine, graine, tige, feuille ou fleur.

22. Construit d'ADN comprenant un polynucléotide modulant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs, choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N o1 ou SEQ ID N o2 ou un fragment de celles-ci, sous le contrôle de séquences régulatrices liées de façon opérationnelle à la séquence d'ADN devant être transcrite.

23. Construit d'ADN selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend également un second polynucléotide codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs.

24. Vecteur d'expression recombinant comprenant un polynucléotide choisi parmi :
a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la méthyltransférase COMT de maïs ;
b) un polynucléotide codant la methyltransferase COMT ;
ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs.

25. Vecteur d'expression recombinant selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend un second polynucléotide, ledit polynucléotide étant choisi parmi :

a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs ;
b) un polynucléotide codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs.

26. Cellule hôte de maïs ou une cellule de Agrobacterium tumefaciens transformée avec:
a) soit un polynucléotide antisens inhibant la synthèse de la méthyltransférase COMT dans une cellule de maïs ;
b) soit un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT, ledit polynucléotide (a) ou ledit polynucléotide (b) étant préférentiellement placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice fonctionnelle dans une cellule de maïs, par exemple dans un vecteur d'expression selon l'une des revendications 24 ou 25.

27. Produit de transformation obtenu à partir d'un plant de maïs transformé selon la revendication 20, d'une partie d'un plant de maïs selon la revendication 21, ou à partir d'une cellule de maïs transformée selon l'un des revendications 19 ou 26, caractérisé en ce qu'il possède des caractéristiques de digestibilité améliorées et qu'il présente un rapport modifié entre les unités S et les unités G de la lignine et une teneur modifiée en lignine.

28. Produit de transformation selon la revendication 27, caractérisé en ce que le rapport entre les unités S et les unités G est inférieur à 40/60.

29. Produit de transformation selon l'une des revendications 27 et 28, caractérisé en ce qu'il est du fourrage.

30. Lignine purifiée obtenue à partir d'un plant de maïs transformé selon la revendication 20, d'une partie d'un plant de maïs selon la revendication 21, ou d'une cellule de maïs selon l'une des revendications 19 ou 26, caractérisée en ce qu'elle présente notamment un rapport modifié entre les unités S et les unités G.

31. Lignine purifiée selon la revendication 30, caractérisée en ce que le rapport entre les unités S et les unités G est inférieur à 40/60.