FR2829151A1

FR2829151A1 - Procede d'obtention de plants de mais transformes a caracteristiques de digestibilite ameliorees, plants de mais obtenus par le procede et utilisations

Info

Publication number: FR2829151A1
Application number: FR0111326A
Authority: FR
Inventors: Magalie Pichon; Michel Beckert; Isabelle Nadaud; Deborah Goffner
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2001-08-31
Filing date: 2001-08-31
Publication date: 2003-03-07
Also published as: CA2459076A1; WO2003018819A1; EP1425401A1

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide modulant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°1, dans un procédé d'obtention de plants de maïs à caractéristiques de digestibilité améliorées ayant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante. Application à l'amélioration de la digestibilité du maïs

Description

La présente invention se rapporte au domaine de l'amélioration des caractéristiques de digestibilité du maïs, en modifiant la composition et la teneur des lignines.

ART ANTERIEUR
Le maïs ensilé est un aliment intéressant à plusieurs points de vue.

Pour l'agriculteur, le rendement au champ du maïs est relativement élevé, la récolte et le stockage sont aisés. Pour les animaux, en particulier pour les vaches laitières, les qualités nutritionnelles du maïs ensilé sont stables et peuvent aisément être complimentées en protéines par d'autres ensilages de fourrage ou par des tourteaux de soja. Ces qualités nutritionnelles permettent la persistance de la production laitière. Ainsi, un mélange d'ensilage de maïs et d'ensilage de fourrage permet de valoriser l'utilisation des protéines du fourrage dont la solubilité (50%) est très élevée et très rapide au niveau du rumen de la vache (Léonard, 1996). Le faible contenu en calcium et en potassium de l'ensilage de maïs permet de diluer l'importante teneur de ces éléments dans l'ensilage de fourrage, notamment ceux de l'ensilage de légumineuses et d'obtenir un équilibre quasi parfait entre l'énergie et les protéines du début à la fin de la lactation. L'ensilage est souvent un élément qui aide l'éleveur à maîtriser le synchronisme énergie- protéine. Etant donné les qualités nutritionnelles du maïs d'ensilage, la culture de ce type de fourrage est très répandue et couvre plus de 3 millions d'hectares dans l'Union Européenne. L'optimisation des qualités de l'ensilage de maïs consiste à augmenter l'énergie nette fournie par ce type d'alimentation en améliorant sa digestibilité.

Un facteur important de diminution de digestibilité du maïs fourrage est lié à la présence dans les parois des cellules végétales de composés phénoliques, en particulier des lignines. Les lignines établissent différents type de liaison avec les autres constituants pariétaux pour former un maillage serré qui gène l'accessibilité des glucides aux enzymes digestives, principale source d'énergie pour les herbivores. Selon leur stade de maturité, les plantes ne posséderaient pas le même type de lignines déposées sur leurs parois cellulaires. L'augmentation de la lignification au cours de la maturation de la plante provoque une diminution de la digestibilité de cette plante (Bentley, 1959 et Grabber et al., 1992). Il est difficile de corréler la réduction

de la digestibilité des plantes au cours de leur maturation avec le contenu en lignines, la composition en lignines, la structure des lignines, ou avec tout autre composant pariétal étant donné les changements dans les constituants chimiques et la structure physique associés à la maturation de la plante.

Par conséquent, une des voies privilégiées d'amélioration des qualités du maïs d'ensilage concerne la modification de la composition et de la teneur en lignine des plantes fourragères. En effet, une faible diminution de la teneur en lignine conduit à une forte amélioration de la digestibilité. Une expérimentation menée par Emile (1995) démontre qu'une variété plus digeste permet d'augmenter le niveau de production de lait de plus d'un kilogramme et la prise de poids des vaches de 22 kg par rapport à une variété moins digeste. Ainsi, plus la variété est digeste plus la production laitière est élevée et moins la perte d'état de chair est importante.

Les maïs de type Brown midrib, en particulier les maïs bm3, possèdent une digestibilité fortement augmentée par rapport aux maïs conventionnels et améliorent significativement la production laitière. Ces maïs bm3 diffèrent des maïs normaux par une teneur fortement réduite en lignine (jusqu'à 40%) et des rapports unités S (alcool sinapylique)/unités G (alcool coniférylique) modifiés. Cependant, les inconvénients des maïs bm3 tels qu'un rendement en champ moindre, une susceptibilité à la verse accrue, un manque de croissance et de vigueur en début de végétation et un retard à la floraison en empêchent l'exploitation (Barrière et Argillier (1993)).

La lignine est un composé majeur de la paroi des cellules du sclérenchyme et du xylème des plantes vasculaires. Elle joue un rôle important dans les fonctions conductrices du xylème en réduisant la perméabilité hydrique des parois cellulaires. Dans les tissus lignifiés, elle intervient comme agent de liaison intercellulaire. Elle est responsable de la rigidité des parois cellulaires et du port dressé des végétaux et participe à la résistance des plantes aux agressions mécaniques (vent, blessure...) ou infection par des pathogènes, tolérance aux stress thermique et hydrique.

En général, il est considéré que la lignine est un polymère insoluble de
3 monomères d'alcools ou monolignols : l'alcool p-coumarylique (unités H), l'alcool coniférylique (unités G) et l'alcool sinapylique (unités S). Chaque type de précurseurs peut former une variété de liaisons avec d'autres précurseurs et ainsi constituer la lignine. D'autres liaisons peuvent également s'établir

avec d'autres composés pariétaux (polysaccharides et protéines) pour former un réseau complexe tridimensionnel. Le contenu et la composition des lignines varient entre les grands groupes de végétaux supérieurs et entre espèces. Les deux classes majeures sont les lignines de gymnospermes qui contiennent principalement des unités G et une petite proportion d'unités H, et les lignines d'angiospermes qui contiennent à la fois des unités S, G et en faible proportion des unités H (Whetten et al., 1998). Les lignines de monocotylédones, et, plus particulièrement des céréales sont les plus complexes. Elles sont constituées des 3 unités H, G, S auxquelles se rajoutent en proportion importante des acides hydroxycinnamiques (acide férulique et coumarique) liés par des liaisons éthers ou esters. Cette hétérogénéité structurale se rencontre également au sein d'un même végétal, en fonction de l'organe considéré mais également en fonction du stade de développement et de la localisation dans la paroi (Lewis et Yamamoto, 1990)).

La voie de biosynthèse des lignines est représentée sur la Figure 1.

Bien que la voie de biosynthèse des lignines soit beaucoup étudiée, de nombreuses étapes sont encore incomprises notamment celles impliquées dans la méthoxylation.

L'hypothèse actuelle de la voie de biosynthèse des monolignols considère que le réseau métabolique aboutissant à la formation des unités S et G fait intervenir des réactions successives d'hydroxylation et de 0- méthylation. La voie de biosynthèse des phénylpropanoides débute par la conversion de la phénylalanine en acide cinnamique sous l'action de la
Phénylalanine-Ammonia-Lyase (PAL). Le produit de l'activité PAL sur la phénylalanine est l'acide trans-cinnamique qui est un substrat de la cinnamate-4-hydroxylase (C4H), une P450-hydroxylase. La C4H hydroxyle la position 4 du cinnamate pour produire l'acide p-coumarique. Chez les monocotylédones, l'acide p-coumarique résulte de l'action de la Tyrosine-
Ammonia-Lyase (TAL) sur la tyrosine.

L'ensemble des enzymes intervenant ultérieurement dans le réseau métabolique ont fait l'objet de revues (Boudet et al., 1995 ; Dixon et al., 2001 ;
Whetten et al., 1998, Li et al., 2000), elles incluent : des O-méthyitransférases ayant des désignations distinctes selon les espèces : l'acide caféique 3-0-méthyltransférase (COMT)

également désignée acide caféique O-méthyltransférase (COMT), 0- méthyltransférase COMT ou encore de manière préférentielle dans le texte méthyltransférase COMT ou la 5-hydroxyconiféryl aldéhyde O-méthyltransférase (AldOMT) et la Caféoyl coenzyme A 3-0- méthyltransférase (CCOAMT), des hydroxycinnamate coenzyme A ligases (4CL), - une férulate 5-hydroxylase (F5H) à cytochrome P450, ta p-coumarate-hydroxylase (C3H), et plusieurs isoformes de Cinnamyl Co A réductase (CCR) et de
Cinnamyl alcool déhydrogénase (CAD).

L'étape terminale de polymérisation des monolignols fait vraisemblablement intervenir des enzymes pariétales, peroxydases et/ou laccases.

Les enzymes catalysant les étapes de méthylation sont les 0- méthyltransférases. Les O-méthyltransférases (S-adénoxyl-L-méthionine 0- méthyltransférases, EC 2.1. 1.6) jouent un rôle important dans la biosynthèse des monolignols. Il est actuellement admis que la COMT interviendrait préférentiellement dans la synthèse des unités S et la CCoAOMT dans la synthèse des unités G.

La COMT permettrait la méthylation des formes libres d'acides hydroxycinnamiques : l'acide caféique et l'acide 5-hydroxyférulique en introduisant respectivement un ou deux groupes méthoxy dans les monomères de lignines (Davin and Lewis, 1992). Récemment, il a été montré chez le peuplier que la COMT est en fait une 5-hydroxyconiféryl aldéhyde 0- méthyltransférase (AldOMT). En effet, le 5-hydroxyconiféraldéhyde est le substrat préférentiel de l'AldOMT. Ainsi, pour Li et al. (2000), il existe chez les angiospermes ligneux, deux voies distinctes d'hydroxylation/méthylation conduisant respectivement aux unités S et G : la CCoA3H (Coumaroyl CoA

3-hydroxylase)/CCoAOMT, avec la 4CL, la CCR et la CAD sont associés à la synthèse des unités G, et la CAld5H (Coniféraldéhyde 5- hydroxylase)/AldOMT se connecte à partir du conyféryl aldéhyde pour la biosynthèse des unités S. L'implication des COMT dans la biosynthèse des unités S de lignine est supportée par une forte réduction en unité S de la lignine mais pas des unités G dans les plantes transgéniques sous-exprimant

la COMT comme le tabac (Atanassova et al., 1995), la luzerne (Guo et al., 2001) et le peuplier (Van Doorselaere et a/., 1995).

Les unités S et G sont donc des composants importants des lignines et par conséquent interviennent dans la digestibilité de la paroi des cellules végétales. Cependant l'impact sur la digestibilité de l'augmentation ou de la diminution des unités S et/ou G varie selon les études. Ainsi, les études sur le mutant bm3 ont montré que la digestibilité accrue des parois est associée à une altération forte de la structure des lignines : rapport S/G faible avec incorporation substantielle d'unités 5-hydroxyguaiacyl (5-OH G) (Lapierre et a/., 1988) et une teneur en lignine plus faible. Si les résultats de corrélation entre la digestibilité et la teneur en lignine de la plante sont toujours négatifs, les résultats de corrélations entre le rapport S/G et la teneur en lignine et la digestibilité ne sont pas toujours identiques. Ainsi, pour Zhong et al. (1998) et Méchin et a/. (2000), le rapport S/G est corrélé positivement avec la digestibilité. Autrement dit, les résultats respectifs de ces auteurs sur le tabac et le maïs montrent que plus le rapport S/G augmente, plus la digestibilité est importante. Ainsi, suivant l'espèce et les études, il apparaît qu'une variation du rapport S/G, associée ou non à une teneur en lignine réduite peut être accompagnée d'une stabilité, d'une réduction ou d'une augmentation de la digestibilité.

Ces résultats contradictoires démontrent qu'il n'est pas évident de prévoir les conséquences de la modification de l'activité des 0- méthyltransférases (COMT, AldOMT) sur le rapport S/G et la teneur en lignine et par conséquent sur la digestibilité de la plante. L'invention décrite dans ce brevet permet d'obtenir des plants de maïs offrant une meilleure digestibilité en modifiant les activités O-méthyltransférases.

En particulier, l'homme du métier n'est pas en mesure de transposer les résultats expérimentaux hautement contradictoires décrits dans l'état de la technique relatifs aux conséquences de la surexpression ou au contraire de la sous-expression d'une enzyme impliquée dans la biosynthèse de la lignine dans une espèce végétale donnée, y compris le maïs, sur la teneur et la composition de la lignine, en particulier sur le rapport entre les unités S et les unités G.

De plus, l'homme du métier, à la lumière des résultats expérimentaux décrits dans l'état de la technique, ne pouvait prévoir, dans le cas spécifique

du maïs, si une augmentation ou une réduction du rapport unités S/unités G de la lignine et/ou la teneur en lignine influeraient positivement ou négativement sur les caractéristiques de digestibilité de cette espèce végétale ou des produits de transformation correspondants, par exemple le fourrage produit à partir du maïs.

SOMMAIRE DE L'INVENTION
Il a été montré selon l'invention que, de manière surprenante, l'induction de la modulation de la synthèse d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine du maïs, l'acide caféique 3-0 Méthyltransférase, aussi désignée COMT, appelée dans la suite du présent texte méthyltransférase COMT, provoquait une modification du rapport unités S/unités G dans la composition de la lignine et/ou de la teneur en lignine, par rapport à ce qui est retrouvé dans le maïs sauvage, et que la modification du rapport unités S/unités G et/ou de la teneur en lignine conférait au plant de maïs, ainsi qu'à ses produits de transformation, des caractéristiques améliorées de digestibilité.

Par modulation de la synthèse d'une enzyme, on entend selon l'invention une diminution, ou au contraire une augmentation de la synthèse de ladite enzyme.

Par modification du rapport unités S/unités G dans la composition de la lignine, on entend une diminution ou une augmentation de ce rapport.

On entend par maïs sauvage , un maïs possédant des caractéristiques de digestibilité, un rapport entre les unités S et les unités G de la lignine, ainsi qu'une teneur en lignine dans la plante similaires, voire identiques, à celles de la lignée de maïs désignée WT dans les exemples, qui est une lignée disponible auprès de l'Institut National de la
Recherche Agronomique (INRA) sous la dénomination12.

Selon l'invention, les caractéristiques améliorées de digestibilité du maïs, ou de ces produits dérivés, sont obtenues par la modulation de la synthèse de la méthyltransférase COMT, laquelle modulation de synthèse induit : (i) la modification du rapport unités S/unités G dans la composition de la lignine ; et/ou

(ii) la modification de la teneur en lignine dans le plant de maïs, et les produits qui en sont dérivés.

Conformément à l'invention, la modulation de la synthèse de la méthyltransférase COMT peut être complétée par la modulation simultanée de la synthèse d'une seconde enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine, de préférence une seconde enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine chez le maïs telle que décrite dans l'art antérieur et notamment illustrée dans le schéma de la Figure 1.

La diminution de la synthèse de la méthyltransférase COMT peut être obtenue par la transformation de plants de maïs, notamment de plants de maïs sauvages, par un polynucléotide antisens inhibant la traduction de l'ARN messager correspondant. Cette diminution peut également être obtenue par un phénomène de co-suppression, comme décrit par exemple par Napoli et al. (1990) ou Carvalho Niebel et al. (1995).

Inversement, l'augmentation de la synthèse de la méthyltransférase COMT peut être obtenue par transformation de plants de maïs, notamment de plants de maïs sauvages, par un polynucléotide codant cette enzyme.

Quel que soit le polynucléotide utilisé, il comprend de préférence au moins une séquence de régulation permettant son expression dans une cellule de maïs.

Selon l'invention, une réduction du rapport unités S/unités G est obtenue au moins par inhibition spécifique de l'activité COMT. Elle peut être complétée par l'augmentation ou la réduction de la synthèse d'autres enzymes impliquées dans la biosynthèse des unités S et des unités G de la lignine du maïs, augmentation ou réduction d'activité obtenue principalement par surexpression ou au contraire inhibition de l'expression des gènes codant ces autres enzymes.

Une inhibition de l'activité de la COMT du maïs est principalement obtenue selon l'invention par l'utilisation d'oligonucléotides inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction du gène codant cette enzyme.

L'acide nucléique codant la COMT du maïs est référencé comme la séquence SEQ ID ? 1 du listage de séquences.

L'invention a pour objet l'utilisation d'un polynucléotide modulant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs codée par la séquence

nucléotidique SEQ ID N'l, dans un procédé d'obtention de plants de maïs à caractéristiques de digestibilité améliorées ayant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante.

Elle est également relative à un procédé d'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, possédant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou dont la teneur en lignine est modifiée et compatible avec le développement normal de la plante, ledit procédé comportant une étape de transformation d'une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la méthyltransférase COMT de maïs ; b) un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs.

De préférence, le polynucléotide antisens est le polynucléotide de séquence SEQ ID ? 2.

Préférentiellement, la polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs est le polynucléotide de séquence SEQ ID N'l.

Le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs sont préférentiellement insérés dans une cassette d'expression permettant leur expression fonctionnelle chez le maïs.

Une telle cassette d'expression est avantageusement introduite dans un vecteur d'expression adapté pour transformer des cellules de maïs.

Selon le procédé de l'invention, on peut utiliser un second polynucléotide modulant l'activité d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des unités S et des unités G de la lignine, autre que la méthyltransférase COMT.

L'invention est également relative à un plant de maïs transformé selon le procédé ci-dessus, qui possède des caractéristiques de digestibilité améliorées, ainsi qu'à toute partie du plant de maïs transformé, notamment racine, graine, feuille, fleur et tige.

Elle concerne aussi les produits de transformation obtenus à partir des plants de maïs transformés définis ci-dessus, notamment le fourrage et la lignine purifiée.

DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Voie de biosynthèse des monomères de lignines (Guo et al., 2001).

Le "réseau métabolique" décrit dans le schéma comprend les résultats de récentes études suggérant les spécificités inattendues de substrat des enzymes F5H et COMT (Humphreys et al. 1999 ; Osakabe et al. 1999 ; Li et al. 2000). La voie encadrée (guaiacyl [G] unit) représente les réactions principales aboutissant aux lignines G. La voie encadrée (syringyl [8] unit) représente la voie de biosynthèse préférée pour les lignines S, 4CL, 4coumarate coenzyme A ligase ; CAD, cinnamyl alcool déhydrogénase ; CCR, cinnamyl coenzyme A réductase.

Figure 2 : Principe de la méthode employée pour évaluer l'impact de la

transformation visant l'activité COMT sur la structure des lignines. Les unités H (R1=R2=H), G (R1=OCH3, R2=H), S (R1=R2=OCH3) et 5-OH G (R1= OCH3, R2=OH) engagées dans des liaisons-0-4 génèrent des monomères thioéthylés spécifiques. Après silylation (BSTFA), ces monomères sont analysés en CPG-SM (impact électronique). Les chromatogrammes reconstruits sur les ions benzyliques propres à chacun d'eux permettent d'évaluer de manière univoque et sans interférence des autres constituants la fréquence relative des unités ayant généré ces monomères.

Figure 3 : Profils chromatographiques en CPG-SM des lignées témoin et sous-exprimant la COMT : profils reconstruits sur les ions spécifiques de chaque type de monomères.

Figure 4 : Analyse HPLC des produits issus de l'hydrolyse alcaline douce (NaOH 1M, 2.5h, 40 C) d'échantillons de maïs (tiges + feuilles) extraits.

Acide p-coumarique E et Z : pics 1 et 2. Acide férulique E et Z : pics 3 et 4.

Etalon (éthylvanilline) : pic 5. Ces profils illustrent que les teneurs en PC (acide p-coumarique) diminuent dans les deux lignées transgéniques ASCOMT1.2 et ASCOMT3.2 par rapport au témoin WT.

Figure 5 : Représentation schématique des constructions des plasmides décrits à l'exemple 1.

Figure 6 :
La Figure 6A représente une analyse Northern blot de la lignée de maïs C-OMT 225 au stade 20 jours.

La Figure 6B représente une analyse Southern blot comparative entre la lignée antisens 225 et la lignée 12, en utilisant quatre enzymes de restriction distinctes, respectivement : AcoRV, Kpnl, EcoRI et Sacl.

Figure 7 : Criblage d'une population de plants de maïs transgéniques, transformés respectivement avec les plasmides pProsper+pBar, prosperBar, pJim+pBar2 et pALIX+pBar2.

L'axe des ordonnées représente l'activité COMT retrouvée dans les plants de maïs analysés, exprimée en cpm/mg de protéine.

Les barres d'histogramme représentent chacune un plant transgénique testé.

Figure 8 : faisceaux cribro-vasculaires de feuilles adultes de maïs témoins (12) et antisens C-OMT (225) colorés selon la méthode de Maüle. On voit que la coloration est moins intense dans le sclérenchyme et dans le xylème de 225 ; cette observation suggère une diminution des unités S dans les lignines de la lignée 225.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il a été montré selon l'invention que, de manière surprenante, l'induction de la modulation de la synthèse d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine du maïs, la méthyltransférase COMT, aussi désignée COMT, provoquait une modification du rapport unités S/unités G dans la composition de la lignine et/ou de la teneur en lignine, par rapport à celui retrouvé dans le maïs sauvage, et que la modification du rapport unités S/unités G et/ou de la teneur en lignine conférait au plant de maïs, ainsi qu'à ses produits de transformation, des caractéristiques améliorées de digestibilité.

Par caractéristiques améliorées de digestibilité , d'un plant de maïs selon l'invention, on entend que, par rapport à une variété de plant de maïs sauvage, par exemple la variété de maïs 12 précitée, le plant de maïs obtenu

selon l'invention possède une valeur d'indice de digestibilité dndf plus élevée que la valeur d'indice de digestibilité calculée à partir d'un plant de maïs de la variété sauvage.

Selon l'invention, la valeur de l'indice de digestibilité dndf est calculée à partir de ndf (neutral detergent fiber) dont la méthode d'obtention est décrite par Van Soest (1967) et du dms (solubilité enzymatique Aufrère) dont la méthode d'obtention est décrite par Aufrère (1983), selon la formule dmdf=100* [dms- (100-ndf)]/ndf donnée par Struik (1985). Le matériel utilisé pour l'établissement du ndf est une poudre lyophilisée de plantes entières récoltées au stade floraison.

Préférentiellement, un plant de maïs obtenu selon l'invention possède des caractéristiques de digestibilité améliorées si la valeur de l'indice dndf est d'au moins 80.

Préférentiellement, un plant de maïs selon l'invention possède une teneur en lignine Klason, mesurée à partir des tiges et des feuilles, qui est inférieure à 8,5, de préférence inférieure à 8, à 7,5, à, 7,0, à 6,9 ou à 6,8, et de préférence inférieure à 6,7.

Un plant de maïs préféré selon l'invention possède une teneur en lignine Klason comprise entre 6,1 et 6,6.

Pour mesurer la teneur en lignine Klason, l'homme du métier peut avantageusement se référer à la technique décrite à l'exemple 9.

Il est montré pour la première fois selon l'invention, de manière surprenante : a) que l'inhibition de l'enzyme méthyltransférase COMT de maïs permettait (i) de réduire le rapport unités S/unités G de la lignine chez cette plante et (ii) de réduire la teneur en lignine chez cette plante ; et b) que la réduction du rapport unités S/unités G de la lignine et/ou de la teneur en lignine chez le maïs permettait l'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, par rapport au maïs sauvage.

Tirant parti de ces résultats inattendus, la demanderesse a mis au point un procédé de transformation de plants de maïs dans lequel les plants de maïs transformés ont un rapport unités S/unités G de la lignine et/ou une teneur en lignine modifiés, par rapport à celui retrouvé dans les plants de maïs sauvages.

Préférentiellement, le rapport unités S unités G est inférieur au rapport unités S/unités G retrouvés dans un plant de maïs sauvage.

Plus spécifiquement, il est montré selon l'invention que des plants de maïs transformés ayant des caractéristiques de digestibilité améliorées peuvent être obtenus en utilisant un polynucléotide antisens.

L'invention a pour objet l'utilisation d'un polynucléotide modulant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N'l, dans un procédé d'obtention de plants de maïs à caractéristiques de digestibilité améliorées ayant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante.

Inhibition de la synthèse de la méthyltransférase COMT
Selon un premier mode de réalisation, ledit polynucléotide inhibe la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs dans la plante, lorsqu'il est introduit par transformation dans les cellules de ladite plante.

Ledit polynucléotide antisens consiste en un polynucléotide codant un ARN antisens s'hybridant avec l'ARN messager constituant le produit de transcription du gène codant la méthyltransférase COMT du maïs.

L'inhibition de la synthèse de la méthyltransférase COMT peut être obtenue : - (i) soit en transformant les cellules de maïs avec un polynucléotide antisens, tel que défini ci-dessus, placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs, ladite séquence de régulation pouvant comprendre un promoteur constitutif fort et, le cas échéant, aussi des séquences activatrices de la transcription (séquences enhancer fonctionnelles chez le maïs), permettant un haut niveau d'expression du nombre de copies de l'ARNm de l'antisens méthyltransférase COMT ; - (ii) soit en introduisant de manière stable dans les cellules de maïs une pluralité de copies du polynucléotide antisens tel que défini ci--dessus ; - (iii) soit par une combinaison de (i) et de (ii), comme cela est décrit dans les exemples.

L'homme du métier peut synthétiser tout polynucléotide antisens inhibant la synthèse de la méthyltransférase COMT à l'aide de ses

connaissances générales techniques, à partir d'une séquence nucléotidique codant la COMT, par exemple la séquence SEQ ID ? 1.

Pour la synthèse d'un polynucléotide sens ou d'un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction d'un gène chez une plante, l'homme du métier se référera avantageusement à l'article de revue de Matzke et al. (2001) ainsi qu'au contenu des articles référencés dans cet article de revue.

Encore plus spécifiquement, pour la construction ou la synthèse d'un polynucléotide sens ou d'un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction d'un gène codant une enzyme impliquée dans la biosynthèse des lignines chez les plantes, notamment la COMT de certaines espèces végétales, l'homme du métier peut se référer

avantageusement aux articles de Baucher et al. (1999), de Zhong et al. (2000), de Pincon et al. (2001 a), de Blee et al. (2001), de Pincon et al.

(2001 b) ou de Lapierre et al. (1999).

Le polynucléotide antisens peut aussi consister en l'ADNc obtenu à partir de l'ARNm constituant le produit de transcription du gène codant la méthyltransférase COMT.

Il peut aussi consister en un fragment nucléotidique de cet ADNc, de préférence un fragment nucléotidique d'au moins 100 bases consécutives de cet ADNc, cette longueur du fragment nucléotidique étant suffisante pour permettre son hybridation spécifique avec l'ARNm de la méthyltransférase COMT du maïs et ainsi empêcher sa traduction en protéine.

Selon un premier aspect préféré, le polynucléotide antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID ? 2.

Selon un second aspect préféré, le polynucléotide antisens consiste

en le polynucléotide antisens de séquence SEQ ID ? 2.

Augmentation (surproduction) de la méthyltransférase COMT
Selon un second mode de réalisation, ledit polynucléotide augmente la synthèse de la méthyltransférase COMT dans la plante, lorsqu'il est introduit par transformation dans les cellules de ladite plante.

Selon ce second mode de réalisation, on utilise un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs, qui provoque une production

plus élevée de cette enzyme, lorsqu'il est introduit par transformation dans la plante.

La synthèse ou l'isolement d'un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT du maïs peut être effectué par l'homme du métier, à l'aide de ses connaissances générales en biologie moléculaire, notamment grâce à sa connaissance de la séquence nucléotidique SEQ ID N'l.

La production plus élevée de la méthyltransférase COMT peut être obtenue : - (i) soit en transformant les cellules de maïs avec un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs, ladite séquence de régulation pouvant comprendre un promoteur constitutif fort et, le cas échéant, aussi des séquences activatrices de la transcription (séquences enhancer fonctionnelles chez le maïs), permettant un haut niveau d'expression de la méthyltransférase COMT ; - (ii) soit en introduisant de manière stable dans les cellules de maïs une pluralité de copies du polynucléotide codant la méthyltransférase COMT ; - (iii) soit par une combinaison de (i) et de (ii).

Selon un premier aspect préféré, le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N'l.

Selon un second aspect préféré, le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID N'l.

PROCEDES D'OBTENTION DE PLANTS DE MAÏS A CARACTERISTIQUES DE DIGESTIBILITE AMELIOREES.

L'invention a aussi pour objet un procédé d'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, possédant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou dont la teneur en lignine est modifiée et compatible avec le développement normal de la plante, ledit procédé comportant une étape de transformation d'une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la méthyltra n sfé rase COMT de maïs ; b) un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs.

Selon un premier mode de réalisation du procédé ci-dessus peut être caractérisé en qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction du gène codant pour la méthyltransférase COMT de maïs. ; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;
Selon un premier aspect, la modification de la composition de la lignine des plants de maïs transformés susceptibles d'être obtenus par le procédé ci-dessus consiste à réduire la teneur en unités S par rapport à la teneur en unités G des lignines de maïs, de façon à obtenir un rapport S/G inférieur à celui des plants de maïs sauvages.

Préférentiellement, le rapport S/G est inférieur à 40/60.

Selon un second mode de réalisation du procédé ci-dessus, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs ; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;
Préférentiellement, le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N'l.

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé d'obtention de plants de maïs transformés selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante : c) sélectionner les plants de maïs ayant intégré dans leur génome au moins une copie du polynucléotide antisens ou au moins une copie du polynucléotide codant la méthyltransférase COMT du maïs.

Cassettes d'expression comprenant un polynucléotide antisens ou un polynucléotide codant la méthyttransférase COMT du maïs
Avantageusement, le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT du maïs est intégré dans une cassette d'expression comprenant aussi une séquence nucléotidique régulant l'expression dudit polynucléotide dans les cellules de maïs.

Avantageusement, le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT est intégré dans une cassette d'expression comprenant aussi une séquence nucléotidique à fonction de terminateur de la transcription.

La cassette d'expression définie de manière générale ci-dessus peut aussi être désignée construction d'ADN ou construit d'ADN dans la présente description.

Selon encore un autre aspect, le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT, ou encore la cassette d'expression dans laquelle est inséré respectivement l'un ou l'autre de ces polynucléotides, est artificiellement inséré dans une cellule hôte de

Agrobacterium tumefaciens.

Les constructions d'ADN comprennent également une séquence promotrice de gène et une séquence terminatrice liées de façon opérationnelle à la séquence d'ADN devant être transcrite. Le promoteur du gène est généralement situé à l'extrémité 5'pour permettre l'initiation de la transcription de la séquence d'ADN. Les séquences promotrices sont situées dans les régions 5'non codantes des gènes mais aussi parfois dans les introns (Luehrsen K, . 1991) ou dans les régions codantes comme par exemple le promoteur du gène PAL de la tomate (Bloksberg, 1991). Lorsque le construit inclut une phase ouverte de lecture en orientation sens, il est nécessaire d'utiliser un ADNc pleine longueur de façon à ce que la protéine puisse être traduite. Lorsque le construit comprend une phase ouverte de lecture en antisens ou une région non codante, il n'est pas indispensable d'utiliser un ADNc pleine longueur, une séquence partielle peut suffire.

Promoteurs
Parmi les promoteurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer notamment les promoteurs dits constitutifs, les promoteurs dits inductifs ainsi que les promoteurs tissus spécifiques.

Un promoteur constitutif permet une expression forte du transcrit dans l'ensemble des tissus de la plante régénérée et sera actif dans la plupart des conditions environnementales, et dans l'ensemble des étapes de transformations et de différentiations cellulaires. Par exemple, les principaux promoteurs doubles constitutifs sont :

- le promoteur 35S, ou avantageusement le promoteur double constitutif 35S (pd35S) du CaMV, décrit dans l'article de Kay et al., (1987) - le promoteur de l'actine du riz suivi de l'intron actine de riz contenu

dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Mc Elroy et al. (1991) - le promoteur ubiquitine 1 de maïs (Christensen et al., 1996) et d'autres régions initiatrices de la transcription de gènes de plantes variables connues de l'homme du métier.

Alternativement, il peut être intéressant d'utiliser une séquence promotrice de transcription inductible capable d'être contrôlée par les conditions environnementales ou le stade de développement comme par exemple les promoteurs phénylalanine ammoniac Iyase (PAL), d'HMG-CoA réductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de protéinase (Pl), de gènes de la famille PR1, de la opaline synthase (nos) ou du gène vspB (US-5.670. 349), tous ces promoteurs étant rappelés avec les références des publications correspondantes par le Tableau 3 du brevet US- 5.670. 349.

Une autre catégorie de promoteurs pouvant avantageusement être utilisée pour réaliser le procédé objet de l'invention regroupe les promoteurs tissus spécifiques, en particulier il peut s'agir des promoteurs des gènes de la voie de biosynthèse des lignines ou par exemple le promoteur de l'alcool déshydrogénase qui s'exprime spécifiquement dans les tissus vasculaires.

On peut également citer des promoteurs spécifiques des graines (Datla, R. et al., 1997), notamment les promoteurs de la napine (EP- 0.255. 378), de la glutenine, de l'héliantinine (WO-92/17580), de l'albumine (WO-98/45460), de l'oléosine (WO-98/45461), de l'ATS1 ou de l'ATS3 (WO- 99/20775).

Séquences terminatrices
La séquence terminatrice employée dans les constructions objets de l'invention est située à l'extrémité 3'de la séquence à transcrire. Elle peut provenir du même gène que la séquence promotrice ou d'un gène différent.

Parmi les terminateurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer : -le terminateur polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit dans l'article de Franck et al., (1980), ou

-le terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3'noncodante du gène de la opaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à opaline.

Marqueur de sélection
Les constructions comportent également un marqueur de sélection permettant de sélectionner les cellules végétales transformées par ces constructions. Ces marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme du métier, particulièrement ils confèrent une résistance à une ou plusieurs toxines, par exemple une résistance à l'herbicide BASTA (D. Par ailleurs, la transformation des cellules végétales par les constructions, objet de l'invention peut être contrôlée par d'autres techniques bien connues de l'art telles que les Southern et Western Blots.

Fabrication d'une cassette d'expression
Les techniques pour lier de manière opérationnelle tous les composants de ces constructions sont bien connues de l'homme de l'art et incluent l'utilisation de sites de clonage synthétiques comprenant un ou plusieurs sites de restrictions endonucléasiques comme décrits par exemple par Maniatis et al. (1989). Les constructions d'ADN de la présente invention peuvent être liées à un vecteur possédant au moins un système de réplication, par exemple avec E. Coli, après chaque manipulation, il est possible de cloner et de séquencer la construction obtenue afin de vérifier l'exactitude de la manipulation.

L'invention concerne les constructions telles que décrites ci-dessus, et comportant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID n01 ou 2 liée de manière fonctionnelle en amont à un promoteur et en aval à un terminateur.

De manière tout à fait préférée, la cassette d'expression comprend le promoteur de l'alcool déshydrogénase spécifique du système vasculaire,

l'ADNc de la méthyltransférase (COMT ou AldOMT) et le terminateur de la Nopaline synthase, comme cela est montré dans l'exemple 1.

Vecteurs d'expression
Les cassettes d'expression ou les constructions d'ADN telles que définies ci-dessus peuvent être incluses dans des vecteurs d'expression utilisables pour transformer une cellule de Agrobacterium tumefaciens ou une cellule hôte de maïs.

Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC n 37 017) ou encore les vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, Etats-Unis).

On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI et pSG (Stratagene).

Il peut s'agir également de vecteurs du type Baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N CRL 1711) dérivée de Spodoptera frugiperda.

Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquence d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants : - vecteur pBIN19 (BEVAN et a/.), commercialisé par la Société CLONTECH (Palo Alto, Californie, USA) ; - vecteur pB1 101 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pBI121 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société
CLONTECH ; - vecteur pEGFP ; Yang et al. (1996), commercialisé par la Société
CLONTECH ; - vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKI IEWICZ et a/., 1994) - vecteurs intermédiaires et superbinaires dérivés des vecteurs pSB12 et pSB1 décrits par Japan Tobacco (EP-0.672. 752 et Ishida et al., 1996).

Un premier vecteur tout à fait préféré est le plasmide pAlix représenté à la figure 5, dans lequel a été inséré le polynucléotide antisens de séquence
SEQ ID D ? 2 inhibant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs..

Un second vecteur tout à fait préféré est le plasmide prosper représenté à la figure 5, dans lequel a été inséré le polynucléotide de séquence SEQ ID N'l codant la méthyltra n sfé rase COMT de mais.

Transformation des plants de maïs
Une augmentation de la synthèse des unités S et/ou G de la lignine et/ou de la teneur en lignine dans la plante peut être obtenue en intégrant dans la phase ouverte de lecture une construction d'ADN en orientation sens, en particulier la séquence SEQ ID n'l. La transformation d'une plante cible avec une telle construction aboutit à une augmentation du nombre de copies du transcrit et donc à une augmentation de la quantité d'enzyme. Par exemple, une augmentation de la synthèse d'unités S peut être obtenue en intégrant dans le génome de la plante cible la séquence sens de la 0 méthyltransférase codée par la SEQ ID n'l.

Une réduction de la synthèse d'unités S et/ou G de la lignine et/ou de la teneur en lignine dans la plante peut être obtenue en introduisant dans la phase de lecture ouverte une construction d'ADN en orientation antisens, en particulier toute ou partie de la séquence SEQ ID n 2. L'ARN transcrit est complémentaire de la séquence endogène d'ARNm ce qui aura pour conséquence de diminuer le nombre de copies du transcrit et donc de diminuer la quantité d'enzyme. Par exemple, une diminution de la synthèse d'unités S peut être obtenue en intégrant dans le génome de la plante cible la séquence antisens de la méthyltransférase COMT codée par la SEQ ID n 2. Les constructions d'ADN peuvent également comporter une séquence nucléotidique comprenant une région non-codante du gène de la méthyltransférase COMT. Les exemples de régions non-codantes pouvant être utilisées dans de telles constructions incluent les introns et les séquences 5'ou 3'non-codantes. La transformation de plantes cibles avec de telles constructions d'ADN peut aboutir à une réduction de la synthèse d'unités S et/ou G de lignine et/ou de la teneur en lignine par le processus de co-suppression, comme l'ont décrit par exemple Napoli et al. (1990) ou Carvalho Niebel et al. (1995).

La régulation de la synthèse d'unités S et/ou G de lignine et/ou de la teneur en lignine peut aussi être réalisée en insérant lesdites séquences en

tout ou partie (par exemple ADN ou ARN) dans des constructions de ribozyme (Haseloff et al., 1988).

Utilisation d'un second polynucléotide modulant la synthèse d'une enzyme impliquée dans la biosynthèse de la lignine, autre que la méthyltransférase COMT
Selon encore un autre aspect du procédé d'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, tel que défini ci-dessus, l'effet du polynucléotide antisens ou du polynucléotide codant la méthyltransférase COMT du maïs peut être complété par l'insertion dans le génome de la même plante de maïs d'un second polynucléotide dérivé du gène codant une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine, autre que la méthyltransférase COMT.

Ainsi, le procédé ci-dessus peut aussi être caractérisé en ce qu'à l'étape a), la cellule hôte de maïs est aussi transformée avec au moins un second polynucléotide, modulant spécifiquement l'expression d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs.

Selon cet aspect particulier, ledit procédé est caractérisé en ce que le second polynucléotide est choisi parmi : a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransfé rase COMT de maïs ; b) un polynucléotide codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs.

L'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs est choisie parmi : (a) l'enzyme CAD du maïs dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le nO d'accès Y13733, (b) l'enzyme CCR1 de maïs dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le

nO d'accès X98083 et (c) l'enzyme F5H de Arabidopsis thaliana dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le nO d'accès U38416.

L'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs peut être aussi choisie parmi (d)

l'enzyme CCoAOMT1 du maïs dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le nO d'accès AJ242980 et (e) l'enzyme CCoAOMT2 du maïs dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le nO d'accès AJ242981.

Une fois obtenues, les constructions servent à transformer les cellules végétales. Avantageusement, la transformation des cellules végétales peut être réalisée par transfert des vecteurs susmentionnés dans les protoplastes végétaux, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol en présence de cations divalents (Ca 2+) (Schocher et al., 1986).

La transformation des cellules végétales peut avantageusement être réalisée par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article de Fromm et al. (1985).

La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par utilisation d'un canon à particules permettant la projection, à très grande vitesse, 1 de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, délivrant ainsi les séquences à l'intérieur du noyau cellulaire (Fromm et al. 1990, Finer et al., 1992).

Une autre méthode de transformation des cellules végétales, est celle de la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire (Neuhaus et al., 1987).

Une des méthodes de transformation de cellules végétales pouvant être utilisée dans le cadre de l'invention est l'infection des cellules végétales par un hôte cellulaire bactérien comprenant le vecteur contenant la séquence d'intérêt. Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans

l'article d'An et al. (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Guerche et al. (1987).

De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (Watson et al., 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti

auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir nécessaires à la transformation de la cellule végétale.

Ce plasmide est maintenu dans Agrobacterium.

Selon un mode préféré, la méthode décrite par Ishida et al. (1996) peut être appliquée pour la transformation des monocotylédones, en particulier le maïs.

Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par Finer et al. (1992) utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or.

Selon encore un autre aspect, le procédé d'obtention de plants de maïs transformé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes : d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape b) ou à l'étape c) avec un second plant de maïs ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène ou les transgènes.

Selon encore un autre aspect, le procédé d'obtention de plants de maïs transformés selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes : f) croisement d'un plant de maïs transformé obtenu à l'étape c) avec un second plant de maïs ; g) sélection des plantes de maïs issues du croisement de l'étape f) et ayant conservé le transgène.

Un des modes de réalisation du procédé objet de l'invention concerne l'obtention de plants de maïs transgéniques à partir de cellules végétales transformées avec une construction comprenant au moins une séquence

choisie parmi les séquences SEQ ID n01 ou SEQ ID n 2.

Cellules hôtes transformées par un polynucléotide antisens ou par un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT et plants de maïs transformés obtenus à partir des cellules hôtes transformées.

L'invention a aussi pour objet une cellule hôte de maïs ou une cellule de Agrobacterium tumefaciens transformée avec :

a) soit un polynucléotide antisens inhibant la synthèse de la méthyltransférase COMT dans une cellule de maïs ; b) soit un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT, ledit polynucléotide (a) ou ledit polynucléotide (b) étant préférentiellement placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice fonctionnelle dans une cellule de maïs, par exemple dans une cassette d'expression ou encore dans un vecteur d'expression tels définis précédemment.

La présente invention concerne les cellules de plantes transformées ainsi obtenues. En particulier, les cellules de maïs ayant intégré de manière stable dans leur génome les constructions comprenant toute ou partie des séquences SEQ ID n01 ou n 2.

Les cellules transformées par les constructions objets de la présente invention sont sélectionnées au moyen du marqueur de sélection par exemple la résistance au BASTA&commat;. Les cellules transgéniques sont ensuite cultivées sur un milieu approprié pour régénérer des plantes entières grâce aux méthodes bien connues de l'homme de métier. Dans le cas des protoplastes, la paroi cellulaire peut se reformer sous l'effet de conditions osmotiques appropriées. Dans le cas de graines ou d'embryons, un milieu favorable à la germination ou à l'initiation de cals est employé. Pour les explants, le milieu employé doit permettre la régénération.

Le principe de régénération in vitro de cellules végétales de maïs est bien connu de l'homme de métier. Les plantes sont régénérées à partir de cals obtenus après culture de cellules d'anthères, de grains de pollen, d'embryons ou de protoplastes. Les cellules sont cultivées sur des milieux nutritifs gélosés adaptés à chaque type cellulaire en conditions stériles dans des boîtes de Pétri ou des tubes de cultures en chambre climatique dans des conditions environnementales favorables (température et luminosité adaptées). Après repiquage, les vitroplants sont transplantés en serre.

En particulier, selon un des aspects de l'invention, les plants de maïs offrant une meilleure digestibilité et dont la teneur en unités S et/ou G est modifiée, notamment possédant un rapport SIG inférieur à celui des plantes dont le rapport n'est pas modifié peuvent être obtenus après hybridation avec un individu dont l'activité de la méthyltransférase COMT est modifiée par les principes de sélection variétale bien connus de l'homme du métier.

L'homme du métier peut également employer les méthodes de multiplication végétative à partir des plants de maïs dont l'activité méthyltransférase COMT est modifiée, en particulier afin de modifier le rapport en unités S/unités G et/ou la teneur en lignine. Ces méthodes peuvent avantageusement comporter certaines étapes in vitro. Ce peut être des étapes de régénération de cellules possédant une activité méthyltransférase COMT modifiée. Ce peut être des méthodes de culture tissulaire, de micro-bouturage, de culture de méristèmes, de culture d'embryons, de plants de maïs possédant une activité méthyltransférase COMT modifiée. Ce peut être des méthodes de régénération de protoplastes issus de plants de maïs possédant une activité méthyltransférase COMT modifiée ou issus de fusion avec des protoplastes issus de plants de maïs possédant une activité méthyltransférase COMT modifiée.

L'invention a aussi pour objet un plant de maïs transformé, susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini ci-dessus, qui est caractérisé par des caractéristiques de digestibilité améliorées.

Selon une première caractéristique pouvant le définir, un plant de maïs transformé conformément à l'invention possède des caractéristiques de digestibilité améliorées et une valeur de l'indice dndf d'au moins 80.

Selon une seconde caractéristique pouvant le définir, un plant de maïs selon l'invention possède une teneur en lignine Klason, mesurée à partir des tiges et des feuilles, qui est inférieure à 8,5, de préférence inférieure à 8, à 7,5, à, 7,0, à 6,9 ou à 6,8, et de préférence inférieure à 6,7.

Selon une troisième caractéristique pouvant le définir, un plant de maïs transformé selon l'invention possède un rapport S/G de la lignine inférieur à 40/60.

L'invention est également relative à une partie d'un plant de maïs transformé tel que défini ci-dessus, par exemple une racine, une graine, une feuille, une tige ou une fleur.

Elle a également trait à des cellules de maïs isolées obtenues à partir d'un plant de maïs transformé tel que défini ci-dessus.

L'invention concerne aussi un vecteur d'expression recombinant comprenant un polynucléotide choisi parmi : a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la méthyltransférase COMT de maïs ; b) un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT ; ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs.

La présente invention a aussi pour objet une construction d'ADN comprenant un polynucléotide sens ou un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction du gène COMT de séquence SEQ ID N"1, placé sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel chez le maïs.

Elle concerne également une construction d'ADN comprenant un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT, placée sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel chez le maïs pour augmenter l'expression de ladite enzyme.

L'invention est également relative à un produit de transformation obtenu à partir d'un plant de maïs transformé ou d'une partie d'un plant de maïs transformé, tels que définis ci-dessus. Un tel produit de transformation est caractérisé notamment en ce que la lignine qu'il contient présente un rapport modifié entre les unités S et les unités G.

Préférentiellement, le rapport S/G est inférieur à 40/60.

Ledit produit de transformation inclut les aliments pour le bétail, obtenus à partir des plants de maïs dont les teneurs en unités S ou en unités G sont modifiées et/ou dont la teneur en lignine est modifiée.

L'invention a aussi pour objet une lignine purifiée à partir d'un plant de maïs transformé ou d'une partie de plant de maïs tels que définis ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle présente notamment un rapport entre les unités S et les unités G qui est modifié, par rapport au rapport S/G retrouvé dans la lignine de plants de maïs sauvages.

Préférentiellement la lignine purifiée ci-dessus est caractérisée en ce que le rapport S/G est inférieur à 40/60.

La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitées, aux exemples suivants.

EXEMPLES Exemple 1 : Construction des vecteurs de transformation : Plusieurs vecteurs ont été construits afin d'obtenir le vecteur de transformation.

- Plasmide pProsper [Figure 5J
Un fragment Pstl-Hindlll de 0.26 Kpb correspondant au terminateur du gène de la opaline synthase (T-Nos) est sous-cloné dans pUC18 (Yannisch-Perron C. et al., 1985) entre les sites Pstl et Hindlll, donnant ainsi le vecteur pUC18-Nos. Le plasmide pMC1 (Collazo P. et al., 1992), correspondant à l'ADNc de la C-OMT (1.4 kb) inséré au site pstl de pUC18. Une amplification PCR est réalisée sur ce plasmide avec les oligonucléotides

TOM22 (5'-CTGCTGGAGGTGCTGCAGAAG-3'-SEQ ID N'3) et TOM23 (5'-CTCCTTGCCCCCGGGGTTGTG-3-SEQ ID N 4'), permettant d'introduire respectivement les sites Pstl et Smal, en 5'et en 3'd'un fragment de 0.85 Kpb compris entre les positions 0.17 et 1.04 Kpb de l'ADNc. Ce fragment est ensuite sous-cloné dans le vecteur pGemT (Promega), et le plasmide obtenu est digéré par Pstl et Smal. Le fragment libéré est sous cloné dans pUC18-Nos aux sites Pstl et Smal, générant ainsi le plasmide pTMO-Nos.

Le plasmide pBARGUS (Fromm et al., 1990) contient une cassette promoteur CaMV35S-intron Adhl-BAR-Tnos ainsi qu'une cassette promoteur Adhl-Intron Adhl-GUS-Tnos. Cette dernière est libérée par une digestion EcoRI et Hindlil. Dans un deuxième temps, une digestion partielle EcoRI/ Pvull du même fragment permet de libérer un fragment de 1.75 Kpb correspondant au promoteur Adhl couplé à l'intron Adhl. Ce fragment est alors sous-cloné dans pTMO-Nos entre EcoRI et Smal. Le plasmide obtenu est le prosper.

- Plasmide pAlix [Figure 5/
Le plasmide PMC1 est digéré par Hindi !) et Xbal pour libérer l'ADNc pleine longueur (1.4 Kpb) de la C-OMT. Le plasmide pActine-BAR (Wu, (Cornell University, New York) est constitué du plasmide psP72 contenant une cassette promoteur actine-tntron actine-BAR-Tnos. Ce plasmide est digéré par Hindlll et Xbal pour éliminer le fragment BAR, puis le fragment Hindlll-Xbal de 1.4 Kpb de la C-OMT est sous-cloné entre ces deux sites, donnant ainsi le plasmide pAlix.

-Plasmide pBar2 [Figure 5]
Le plasmide pBARGUS est digéré par Hindlll, pour libérer la cassette promoteur CaMV35S -Intron Adh1 - BAR - Tnos de 2.13 Kpb. La cassette ainsi libérée est sous-clonée dans pUC18 au site Hindill, pour donner le plasmide pBar2.

- Plasmide pBar [Figure 5]
La construction du plasmide pBar est décrite par Peter Eckes (Biology Research Center H 872 N, Hoechst AG 6230 Frankfurt 80/EP-0.275. 957).

Exemple 2 : Transformation par Aarobacterium tumefaciens
La technique de transformation décrite par Ishida et al. (1996) est utilisée à partir d'embryons immatures de 10 jours après la fécondation.

Tous les milieux utilisés sont référencés dans la référence citée.

La transformation débute avec une phase de c-culture où les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact pendant au moins 5 minutes avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN-T contenant le gène d'intérêt et/ou le marqueur de sélection dérivé des plasmides décrits dans les exemples précédents, et le vecteur pSB1 de
Japan Tobacco (EP 672 752) qui contient : les gènes virB et virG du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281

d'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette recombinaison homologue.

Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25 C. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés : les cals embryogènes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg ! 1 et de la céfotaxime à 250 mg ! 1 (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium tumefaciens). Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25 C. La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSD5, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/l) en présence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type 1 (fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 250C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime.

La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type 1 qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/l et de céfotaxime pendant 2 semaines à 220C et sous lumière continue.

Les plantules régénérées sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100mg ! 1 d'Augmentin pendant 2 semaines à 220C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.

Exemple 3 : Transformation par bombardement
Des cals du génotype Iz, âgés de 2 mois, obtenus après la mise en culture d'embryons immatures sur un milieu de callogénèse sont utilisés pour la transformation.

Un traitement plasmolysant permet de réduire le volume de la vacuole et limite ainsi les éclatements cellulaires lors du tir (prétraitement de 4 heures et un post-traitement de 16 heures sur un milieu Sorbitol 0.2M et Mannitol 0.2M).

Le matériel végétal est réparti de façon homogène sur l'ensemble de chacune des boîtes.

15 mg de microbilles de tungstène stériles sont mélangées dans 150 l d'eau milliQ stérile.

Pour 5 tirs, le mélange suivant est préparé : - 25pi de microbilles de tungstène, - 2, 5 pl d'ADN du plasmide portant le gène d'intérêt (àl pg/pl),

- 2, 5 ul d'ADN du plasmide portant le gène de sélection (à 1 pg/pl), - de CaCI2 à 2, 5M, -10 pI de spermidine à 0,1 M, Ce mélange est laissé à décanter dans la glace pendant au moins 5 minutes.

Cinq boîtes de Pétri contenant le matériel à bombarder sont placées sur des boîtes Agar à 15g/L.

50ul de surnageant du tube décanté sont éliminés et le mélange restant est bien vortéxé, puis 2 1-11 de celui-ci est déposé sur la grille de la seringue stérile, qui est vissée sur le support dans le canon.

Un filtre de gaze stérile est placé sur la boîte de pétri qui est disposée à 19 cm dans l'enceinte du canon. Le vide est poussé à l'intérieur de l'enceinte à la pression de 25 mbars Le tir est déclenché. La pression de l'hélium dans le canon est de 8 bars.

Le matériel végétal bombardé est remis sur sa boîte de pétri d'origine (Mannitol/Sorbitol). Les boîtes sont placées à 26 C et à l'obscurité pendant 16 heures pour un traitement plasmolysant post-bombardement (mannitol/sorbitol).

La pression de sélection est appliquée 16 heures après le tir et est maintenue à la même concentration de l'agent sélectif (bialaphos à 5mg/L) pendant toutes les étapes de régénération. Les plantules sont ensuite repiquées dans du terreau (petits pots) pendant 1 semaine puis transférées en pots de 20 litres (mélange tourbe-pouzzolane) dans la serre transgénique ou en chambre climatisée (Température 24 C jour/20 C nuit ; photopériode 16h jour/8h nuit, hygrométrie 80%). Les plantes sont autofécondées ou croisées.

Exemple 4 : Analyse des ARNs par Northern Biot et de l'ADN génomique par Southern Blot A. Matériels et Méthodes
Les ARN sont isolés par la solution Extract-all (Eurobio), selon le protocole du fournisseur. Une précipitation supplémentaire avec 0.2 M de NaCI avec 2 volumes d'éthanol absolu est effectuée. lopg d'ARN sont séparés sur gels au formaldehyde (Sambrook et al., 1989). L'ADN génomique total est extrait à partir de 1 g de feuilles par la méthode décrite dans Dellaporta et al. (1983). Après une étape de purification au phénolchloroforme, 10IJg d'ADN sont digérés avec 40 unités d'enzyme de restriction (Promega), et séparés sur gel TAE d'agarose à 1% (m/v). Les ARNs ou les ADNs sont transférés sur membranes de nylon (Hybond-N+, Amersham), et hybridés avec des sondes ADN marquées au 32p-dCTP par le kit"prime-a-gene labelling system"de Promega. Le signal d'hybridation est déterminé en mettant en contact les membranes avec des films Biomax-
MS de Kodak dans une cassette d'autoradiographie.

B. Résultats
La Figure 6A représente une analyse Northern blot de la lignée de maïs C-OMT 225 au stade 20 jours.

Des ARNs de racines (r), collet (c), et feuilles enroulées (H) de la lignée 225 et de la lignée témoin Î2 ont été déposés dur gel d'électrophorèse d'agarose.

Après migration et incubation pendant 10 minutes dans une solution de BET à 0, 1 ug/ml, le gel a été photographié sous UV dans le but d'estimer les quantités relatives des ARNs ribosomiques (rRNA). L'hybridation de la membrane après transfert avec une sonde ADNc marquée au 32p permet d'observer une forte diminution des transcrits C-OMT dans tous dans tous les organes testés (R, C, H) chez la lignée 225, par rapport à 12.

La Figure 6B représente une analyse Southern blot comparative entre la lignée antisens 225 et la lignée Is, en utilisant quatre enzymes de restriction distinctes, respectivement : EcoRV, Kpnl, EcoRI et Sacl.

La sonde utilisée est un fragment de 1,2 Kb localisé dans la région 3' de l'ADNc C-OMT de maïs.

Les bandes révélées sur la lignée 12 sont dues au gène endogène COMT.

Les bandes surnuméraires présentes pour la lignée 225 correspondent aux séquences transgéniques : les enzymes EcoRV, Kpnl et Sacl ne coupent pas dans le transgène. Un site Eco RI est présent dans la partie 5'de la construction transgénique. Selon les cas, 3 bandes (EcoRI, EcoRV) ou 2 bandes (Kpnl, Sacl) surnuméraires apparaissent pour la lignée 225.

Les résultats montrent que la lignée 225 a été transformée avec 2 ou 3 copies du transgène.

Exemple 5 : Analyse enzymatique de la COMT A. Matériels et Méthodes
Le protocole utilisé est dérivé d'Atanassova et al. (1995). Brièvement, de jeunes plantes de 20 jours (post-semis) sont récoltées en coupant au niveau du collet, puis les feuilles sont éliminées de la partie aérienne (coupure au niveau de la ligule). Le fragment restant, d'environs 15 cm de long est fixé dans l'azote liquide et broyé dans un mortier avec un pilon. La poudre obtenue est homogénéisée dans le tampon d'extraction Na2HPO, JNaH2P04 0. 1M pH7.5, PVPP 5% (m/v), DTT (10mM) à raison de
1 mL de tampon pour 300 mg de poudre. Après 1/2 heure d'incubation à 4 C, deux centrifugations successives (3000 g/10 min/4 C) sont réalisées pour éliminer le matériel insoluble. 40 uL d'extrait brut ainsi obtenu est ajouté à

960 uL de mélange réactionnel (Acide caféique 3mM, 3H-SAM 0. 1 uCi, SAM 50uM, DTT 10mM, Tampon Na2HP041 NaH2P04 0. 1M pH7. 5 qsp 960jjL) et l'ensemble est incubé 1 h à 37 C. La réaction est arrêtée avec 100uL d'acide sulfurique 9N et 5 mL de scintillant organique (OCS, Amersham) sont ajoutés au mélange. L'ensemble est homogénéisé pour faire passer l'acide férulique tritié, produit de la réaction, dans le scintillant organique. La quantification de la radioactivité de l'acide férulique est réalisée avec un compteur à scintillation Beckman. Les protéines sont dosées selon la méthode de Bradford (1976) avec le réactif de Biorad.

B. Résultats Criblage des plantes transgéniques sur la base de l'activité C-OMT (figure 7) 1-Choix de la partie de la plante utilisée pour la mesure de l'activité COMT Les plantes ont été récoltées à un stade jeune (âgées de 20 jours après semis), ce qui implique un délai court entre semis et analyse, et ce qui permet de cultiver un grand nombre de plantes simultanément. La tige et les jeunes feuilles enroulées ont été utilisés en mélange pour ce travail. Les feuilles ligulées ont été éliminées.

2-Activité C-OMT chez les plantes témoins utilisées pour le criblage
La lignée utilisée comme témoin dans le criblage est 12. La barre d'histogramme des témoins 12 résulte de la moyenne des résultats obtenus sur 12 plantes analysées deux fois. On a pour ces témoins des valeurs d'activité qui varient de 4385 à 7225 cpm/mg de protéine, la moyenne se situant à 5998 cpm/mg avec un écart type de 1039. Ce premier résultat permet d'estimer la variabilité de l'activité C-OMT entre des plantes différentes récoltées au même moment. On voit que celle-ci est relativement réduite.

La lignée de maïs mutante bm3 a été utilisée pour la comparaison. Il était intéressant de valider le protocole de mesure de l'activité C-OMT, utilisé pour la première fois sur le maïs, à l'aide du mutant bm3, qui présente une activité
C-OMT nulle. Trois plantes bm3 ont été analysées, et on observe un niveau

d'activité très faible correspondant au bruit de fond. Les extraits bruts de protéines des plantes bm3 constituent donc d'excellents témoins négatifs dans ce travail.

3-Activité C-OMT dans les populations transgéniques
Les résultats portant sur l'analyse de 32 évènements de transformation différents sont résumés sur la figure 7. Puisque l'analyse a été faite dans certains cas sur deux lots de graines du même événement de transformation.

Trois plantes du même lot ont été analysées de façon à pouvoir établir un écart-type. Chaque extrait brut a été utilisé pour deux déterminations d'activité.

Un total de 20 évènements avec le promoteur ADH-ASOMT (prosper et pProsper-Bar) ont été analysés. Une réduction significative de l'activité COMT, de l'ordre de 70%, a été obtenue pour certains évènements.

Exemple 6 : Analvse histoloaique lique A. Matériels et Méthodes Coloration de Maüle : Les coupes sont incubées dans une solution de KMn04 à 1% (m/v) pendant 5 minutes, rincées dans de l'eau distillée, décolorées avec une solution de HCI 15N pendant 3 minutes, rincées dans de l'eau distillée, et incubées dans une solution de NaHC03 à 5% (m/v).

Coloration au phloroglucinol : Les coupes sont immergées dans une solution de phloroglucinol en solution chlorhydrique (Prolabo).

Les photographies sont réalisées avec une caméra.

B. Résultats
Les résultats sont représentés sur la Figure 8, qui représente des clichés de microscopie photonique de faisceaux cribro-vasculaires de feuilles adultes de maïs, respectivement de la lignée Is de maïs témoin et de la lignée de maïs 225, qui a été transformée avec un polynucléotide antiens inhibant la méthyltransférase COMT.

Sur la Figure 8, on voit que la coloration est moins intense dans le sclérenchyme et dans le xylème de la lignée 225 que dans le sclérenchyme et le xylème de la lignée 12 témoin.

Cela reflète une diminution des unités S dans les lignines de la variété transgénique de maïs 225.

Exemple 7 : Test de digestibilité des plantes par évaluation de la solubilité enzymatique A. Matériels et Méthodes
Cette méthode permet d'estimer une digestibilité potentielle par l'activité d'enzymes cellulolytiques sur la paroi végétale. Les échantillons sont placés dans des sachets scellés et plongés dans les solutions enzymatiques. Les réactions ont lieu dans un incubateur DAIZY pouvant contenir quatre flacons de 2 litres, agités par rotation, maintenus à 40 C et pouvant contenir de 20 à 80 sachets. Les échantillons de poudre lyophilisée sont incubés une nuit à 70 C dans un cristallisoir. Puis, 0.5 g de poudre (masse initiale) sont déposés dans un sachet (F57, Ankom) qui est fermé par soudure, incubé 24 h à 70 C puis pesé après refroidissement (P1). Le sachet est ensuite incubé dans une solution de pepsine (Merck) à 20 g/L de HCL 0, 1 N, à 40 C pendant 24 h, puis à 80 C pendant 14 heure. L'ensemble est alors rincé à l'eau à 35 C et essoré. Cette étape est répétée une fois. Le sachet est ensuite incubé dans une solution de cellulase (Onozuka R10 Yakult, Biochemical Co, Ltd. ) à 1 g/L avec de l'amyloglucosidase (Merck) à
0. 1g/L dans un tampon acétate de sodium/acide acétique (2.95 mL d'acide acétique à 96% et 6.8 g de d'acétate de sodium dans 1 L d'eau déminéralisée), à 40 C pendant 24 h, puis rincé et essoré deux fois, avant d'être séché à l'étuve à 70 C pendant 24 heures. Le sachet est pesé (P2). La solubilité (en % de la masse sèche) est égale à (P1-P2)/ (masse initiale x 100).

B. Résultats
Les résultats comparés de digestibilité sont présentés dans le Tableau
1 ci-dessous.

Tableau 1 : Indice de digestibilité des plants de maïs

<tb>
<tb> Lignée <SEP> Neutral <SEP> detergent <SEP> fiber <SEP> Digestibilité <SEP> (dndf)
<tb> (ndf)
<tb> 225 <SEP> 1 <SEP> 47. <SEP> 69 <SEP> 86. <SEP> 24
<tb> 225 <SEP> (2) <SEP> 43. <SEP> 65 <SEP> 82. <SEP> 20
<tb> témoin <SEP> 1246. <SEP> 8577. <SEP> 61
<tb>

Dans le Tableau 1, l'indice ndf représente le pourcentage de fraction non digestible mesuré à partir de poudre lyophilisée de plantes entières récoltées au stade floraison.

Dans le Tableau 1, l'indice dndf représente l'indice de digestibilité calculé à partir de la valeur de ndf (neutral detergent fiber) et du dms (solubilité enzymatique Aufrère) selon la formule de Struik (1985).

Les résultats du Tableau 1 montrent la digestibilité plus élevée des deux lignées de maïs transgéniques 225 (1) et 225 (2) qui ont été transformées avec une construction antisens selon l'invention, par rapport à la variété de maïs WT témoin, la lignée de maïs Iz.

Exemple 8 : Evaluation de la teneur. la composition et de la structure en lianine de maïs transgéniques sous-exprimant la COMT : évaluation par CPG-SM des produits monomères issus de leur thioacidolvse 11 Etude des liqnines : teneur et structure Trois lignées de maïs, un témoin (WT) et deux lignées anti-sens COMT du même événement de transformation présentant une activité résiduelle de 40 % (3.2 et 1.2) récoltées au stade floraison, lyophilisées et broyées ont été analysées.

Les échantillons ont été extraits par un mélange acétone/eau (5/1) afin d'éliminer l'essentiel des composés solubles (pigments, lipides...) par un protocole relativement rapide. Les résultats sont présentés dans le
Tableau 2 : le "résidu" de l'extraction représente à peu près le pourcentage de parois dans l'échantillon.

Tableau 2 : Résultats de l'extraction des échantillons de maïs témoin (WT) et transgéniques

<tb>
<tb> WT <SEP> ASCOMT1. <SEP> 2 <SEP> ASCOMT3. <SEP> 2
<tb> % <SEP> parois <SEP> 57. <SEP> 7 <SEP> 52. <SEP> 5 <SEP> 55. <SEP> 2
<tb> % <SEP> extractibles <SEP> 42.3 <SEP> 47. <SEP> 5 <SEP> 44. <SEP> 8
<tb>
La teneur assez élevée en extractibles est imputable à la présence des feuilles.

Les valeurs observées sont assez semblables pour les 3 lignées.

Le dosage de la lignine Klason a été réalisé sur les échantillons extraits. Il est exprimé en pourcentage pondéral de ces échantillons (tableau 3).

Tableau 3 : Teneur en lignine Klason des échantillons de maïs (tiges + feuilles) extraits. Résultats exprimés en % pondéral des parois extraites

<tb>
<tb> WT <SEP> ASCOMT1. <SEP> 2 <SEP> ASCOMT3. <SEP> 2
<tb> Essai <SEP> 1 <SEP> 8. <SEP> 89 <SEP> 6. <SEP> 11 <SEP> 6. <SEP> 50
<tb> Essai <SEP> 2 <SEP> 8. <SEP> 63 <SEP> 6. <SEP> 34 <SEP> 6. <SEP> 57
<tb> Moyenne <SEP> (écart-8. <SEP> 76 <SEP> (0.18) <SEP> 6.23 <SEP> (0.16) <SEP> 6.54 <SEP> (0.05)
<tb> type)
<tb>
Les teneurs en lignine sont plus faibles que dans le cas de tiges récoltées à maturité : les échantillons extraits proviennent en effet de (feuilles + tiges) récoltées au stade floraison. Les deux lignées transgéniques présentent une teneur en lignine plus faible (25 à 30% en moins) que la lignée témoin.

La teneur en extractibles étant similaire pour les 3 lignées (Tableau 2), t'écart entre WT et antisens est maintenu lorsque le calcul est réalisé sur l'échantillon non extrait Afin d'évaluer l'impact de la transformation sur la structure des lignines, les plantes entières (feuilles+tiges) ont été soumises à thioacidolyse (Lapierre et al., Plant Physiol119, 153-163,1999), suivie de l'analyse CPG-SM de leurs dérivés triméthylsilylés (Saturn Varian, impact électronique, 45-650 m/z). La

fréquence relative des unités p-hydroxyphényles H, guaiacyles G, syringyles S et 5-hydroxyguaiacyles 5-OH G engagées uniquement dans des liaisons - 0-4 a été déterminée sur les chromatogrammes reconstruits sur les ions les plus spécifiques des dérivés qu'ils génèrent (Figure 2). Ces ions, correspondant au pic de base du spectre de masse, permettent d'évaluer sans équivoque les proportions des unités H/G/S/5-OHG liées en-0-4.

Les résultats rapportés dans le Tableau 4 et en Figure 3 révèlent sans équivoque l'efficacité de la transformation visant à sous-exprimer l'activité COMT. Les lignées transgéniques 3.2 et 1.2 présentent un effondrement de la fréquence des unités S (divisée par 2) et surtout l'apparition dans leurs lignines d'unités 5 OH-G en quantité substantielle (multipliée par un facteur compris entre 10 et 20). L'effet est un peu plus marqué dans le cas de la lignée 1.2. Les écarts observés entre Tableaux 3 et 4 pour les témoins sont imputables aux différences d'organes analysés, de stade de récolte et de lignée.

Tableau 4. Structure des lignines de maïs (tiges + feuilles récoltées à la floraison) de lignées témoin et sous-exprimant la COMT : Fréquence relative des unités H, G, S et 5-OHG liées en-0-4

<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Témoin <SEP> AS <SEP> COMT <SEP> 3. <SEP> 2 <SEP> AS <SEP> COMT <SEP> 1. <SEP> 2
<tb> % <SEP> unités <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 2,5 <SEP> 2,4
<tb> % <SEP> unités <SEP> 56, <SEP> 0 <SEP> 68,7 <SEP> 70,1
<tb> % <SEP> Unités <SEP> S <SEP> 40, <SEP> 5 <SEP> 24,4 <SEP> 20,4
<tb> % <SEP> Unités <SEP> 50H <SEP> G <SEP> 0,3 <SEP> 4,4 <SEP> 7,1
<tb> SIG <SEP> 0,72 <SEP> 0,36 <SEP> 0,29
<tb>

21 Etude des esters p-OH cinnamiques liés aux parois de maïs extraites Les esters p-hydroxycinnamiques liés aux parois ont été libérés par hydrolyse alcaline (NaOH 1 M, 2. 5 h, 40 C, 20 mg d'échantillon extrait traité par 2 ml de soude, en présence de 0. 2 mg étalon interne éthylvanilline, avec agitation magnétique et sous N2). L'hydrolysat a été acidifié par HCI 2 M (1. 5 ml), ultrafiltré sur Millex H25 NS (Millipore). Les composés phénoliques ont été extraits par extraction en phase solide sur Sep-Pak C18 (Classic, Waters Millipore), selon un protocole adapté de Beveridge et al. (2000, Food Res. Internat., 33, 775-783). Le conditionnement de la cartouche Sep-pak a été réalisé par 2*5 ml MeOH, 2*5ml eau (milli), 2*5 mi tampon formiate pH 3, avant passage de l'hydrolysat acidifié, suivi d'un lavage par 3 ml tampon formiate. L'élution des composés phénoliques retenus intégralement sur la cartouche (nous l'avons vérifié) a été réalisée par 1 mi CH3CN. L'échantillon recueilli a été dilué v/v par le solvant de CLHP avant d'être ultrafiltré à nouveau et analysé par CLHP en phase inverse (20 ul injectés). Un traitement identique a été réalisé sur un mélange étalon témoin contenant des quantités équipondérales d'acide p-coumarique (PC), d'acide férulique (Fe) et d'éthylvanilline (EtV), pour réaliser la calibration. L'analyse CLHP a été réalisée sur colonne Lichrocart RP18 Merck (5 pm, 250 * 4 mm), utilisée en conditions isocratiques, avec élution par le mélange eau/CH3CN/CH3COOH (78/20/2, v/v) à un débit de 1. 3 ml/min et avec détection en sortie de colonne à 280 nm. Les résultats sont rapportés dans le tableau 5 et illustrés en Figure 4.

Tableau 5 : Quantité d'acides p-coumarique (PC) et féruliques (FE) libérés par hydrolyse alcaline douce (NaOH 1 M, 2. 5h, 40 C) d'échantillons de maïs (tiges + feuilles) extraits. Résultats exprimés en % pondéral des parois extraites

<tb>
<tb> WT <SEP> ASCOMT1. <SEP> 2 <SEP> ASCOMT3. <SEP> 2
<tb> Essai <SEP> PC <SEP> FE <SEP> PC <SEP> FE <SEP> PC <SEP> FE
<tb> Essai <SEP> 1 <SEP> 0.81 <SEP> 0.89 <SEP> 0.55 <SEP> 1.03 <SEP> 0.54 <SEP> 1.06
<tb> Essai <SEP> 2 <SEP> 0.80 <SEP> 0.85 <SEP> 0.56 <SEP> 1.05 <SEP> 0.54 <SEP> 1.04
<tb> Moyenne <SEP> 0.80 <SEP> 0.86 <SEP> 0.56 <SEP> 1.04 <SEP> 0.54 <SEP> 1.05
<tb>

A nouveau, les résultats présentent une plus faible teneur en esters pcoumariques que les lignées témoins analogues, tandis que les teneurs en esters féruliques sont peu affectées par la déficience en activité COMT. Le résultat global est une diminution du rapport PC/FE.

Ralph et al. ont démontré à plusieurs reprises qu'une partie de l'acide pcoumarique acyle les unités S des lignines (par RMN et par thioacidolyse) : la baisse en esters PC observée ici va donc de paire avec la baisse des unités S.

Les esters féruliques sont associés aux polysaccharides et peuvent être liés aux lignines par liaisons éthers (Jacquet et al., 1995). La teneur plus faible des maïs transgéniques en lignines limite cet arrimage et rend compte, vraisemblablement, du fait qu'on libère davantage d'acide férulique par hydrolyse alcaline des lignées transgéniques, par rapport au témoin.

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Claims

REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un polynucléotide modulant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NI, dans un procédé d'obtention de plants de maïs à caractéristiques de digestibilité améliorées ayant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit polynucléotide est un polynucléotide antisens inhibant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs.
3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le

polynucléotide antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID ? 2.
4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit polynucléotide code la méthyltransférase COMTde maïs, et provoque une production. plus élevée de cette enzyme dans la plante.
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT comprend la séquence nucléotidique SEQ ID Nos.
6. Procédé d'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, possédant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou dont la teneur en lignine est modifiée et compatible avec le développement normal de la plante, ledit procédé comportant une étape de transformation d'une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la méthyltransférase COMT de maïs ; b) un polynucléotide codant la méthyltra n sfé rase COMT de maïs.

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7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement la traduction du gène codant pour la méthyltransférase COMT de maïs. ; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le polynucléotide antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID D ? 2.
9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs ; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N01.
11. Procédé selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante : c) sélectionner les plants de maïs ayant intégré dans leur génome au moins une copie du polynucléotide antisens ou au moins une copie du polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs.
12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codant la méthyltransférase

COMT de maïs est intégré dans une cassette d'expression comprenant une séquence nucleotid'tique régulant l'expression dudit polynucléotide dans les cellules de maïs.

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13. Procédé selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisé en ce que le polynucléotide antisens ou le polynucléotide codant la méthyltransférase COMT de maïs est artificiellement inséré dans une cellule de Agrobacterium

tumefaciens.
14. Procédé selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisé en ce qu'à l'étape a), la cellule hôte de maïs est aussi transformée avec au moins un second polynucléotide, modulant spécifiquement l'expression d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le second polynucléotide est choisi parmi : a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs ; b) un polynucléotide codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines code pour une enzyme autre que la méthyltransférase COMT de maïs.
17. Procédé selon l'une des revendications 6 rai 16, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes : d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape b) ou à l'étape c) avec un second plant de maïs ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène ou les transgènes.
18. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 11 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes : f) croisement d'un plant de maïs transformé obtenu à l'étape c) avec un second plant de maïs ; g) sélection des plante de maïs issus du croisement de l'étape f) et ayant conservé le transgène.

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19. Cellules de maïs susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une des revendications 6 à 18.
20. Plant de maïs transformé susceptible d'être obtenu à partir des cellules selon la revendication 19.
21. Partie d'un plant de maïs transformé selon la revendication 20, notamment, racine, graine, tige, feuille ou fleur.
22. Construit d'ADN comprenant un polynucléotide modulant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs, choisi parmi les séquences

nucléotidiques SEQ ID N01 ou SEQ ID ? 2 ou un fragment de celles-ci, sous le contrôle de séquences régulatrices liées de façon opérationnelle à la séquence d'ADN devant être transcrite.
23. Construit d'ADN selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend également un second polynucléotide codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs.
24. Vecteur d'expression recombinant comprenant un polynucléotide choisi parmi : a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la méthyltransférase COMT de maïs ; b) un polynucléotide codant la methyltransferase COMT ; ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs.
25. Vecteur d'expression recombinant selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend un second polynucléotide, ledit polynucléotide étant choisi parmi : a) un polynucléotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs ;

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b) un polynucléotide codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la méthyltransférase COMT de maïs.
26. Cellule hôte de maïs ou une cellule de Agrobacterium tumefaciens transformée avec : a) soit un polynucléotide antisens inhibant la synthèse de la méthyltransfé rase COMT dans une cellule de maïs ; b) soit un polynucléotide codant la méthyltransférase COMT, ledit polynucléotide (a) ou ledit polynucléotide (b) étant préférentiellement placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice fonctionnelle dans une cellule de maïs, par exemple dans un vecteur d'expression selon l'une des revendications 24 ou 25.
27. Produit de transformation obtenu à partir d'un plant de maïs transformé selon la revendication 20, d'une partie d'un plant de maïs selon la revendication 21, ou à partir d'une cellule de maïs transformée selon l'un des revendications 19 ou 26, caractérisé en ce qu'il possède des caractéristiques de digestibilité améliorées et qu'il présente un rapport modifié entre les unités S et les unités G de la lignine et une teneur modifiée en lignine.
28. Produit de transformation selon la revendication 27, caractérisé en ce que le rapport entre les unités S et les unités G est inférieur à 40/60.
29. Produit de transformation selon l'une des revendications 27 et 28, caractérisé en ce qu'il est du fourrage.
30. Lignine purifiée obtenue à partir d'un plant de maïs transformé selon la revendication 20, d'une partie d'un plant de maïs selon la revendication 21, ou d'une cellule de maïs selon l'une des revendications 19 ou 26, caractérisée en ce qu'elle présente notamment un rapport modifié entre les unités S et les unités G.
31. Lignine purifiée selon la revendication 30, caractérisée en ce que le rapport entre les unités S et les unités G est inférieur à 40/60.