JP2003509055A - アミノ酸含有量が改変された植物およびその作製方法 - Google Patents

アミノ酸含有量が改変された植物およびその作製方法

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ガイゲンベルガー，ペーター，ルドウィヒ
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メールマン，トルステン
チャデン，ヨアヒム
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ビーエーエスエフ プランド サイエンス ゲーエムベーハー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、1種以上のアミノ酸の量が、対応する形質転換されていない植物に比べて同時に改変されるように、ATP/ADP輸送体遺伝子の制御配列および/または遺伝子コピー数が改変されていることを特徴とする形質転換植物およびその子孫に関する。本発明はまた、上記植物の作製方法および作物植物としての利用または動物用飼料製造業における利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、1種以上のアミノ酸の量が形質転換されていない植物に比べて同時
に改変されている、ATP/ADP輸送体遺伝子の制御配列および/または遺伝子コピー
数を改変した形質転換植物およびその子孫に関する。また本発明はこの植物の作
製方法および有用植物としての使用、または飼料製造業の分野での使用に関する
。
【０００２】 ヒトおよび動物は２０種のアミノ酸のうち１１種しか合成することができず、
従って必須アミノ酸として知られている９種は食物からの摂取に頼らざるを得な
い。ヒトおよび家畜の栄養は大部分が植物性成分に基づく。必須アミノ酸にはリ
シン、トリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トレオ
ニン、フェニルアラニンおよびヒスチジンが挙げられる。
【０００３】 食用植物では多くの場合上記アミノ酸の濃度が極めて低いという事実が問題と
なる。この理由により、栄養価を高めるために、合成により製造されたアミノ酸
がしばしば穀物混合物や野菜ベースの食品に補給される。
【０００４】 過去には、遊離アミノ酸、即ちタンパク質内に存在していないアミノ酸の量を
高めるために、これまで多数の方法がとられた。しかし、これらの試みはとりわ
け古典的な育種と突然変異体の選択に集中していた。
【０００５】 最近では、分子遺伝学的技術を応用することによって必須アミノ酸の量を増加
させる試みが増えてきている。国際特許出願WO９７／２８２４７号、国際特許出
願WO９８／１３５０６号および国際特許出願WO９７／３５０２３号は、リシンま
たはメチオニンに富む種子特有の貯蔵タンパク質の異種発現に至る最初の試みを
記述している。この場合、タンパク質でのアミノ酸の貯蔵が欠点である。即ち、
この場合もやはり、増加は結合したアミノ酸の増加という形態である。
【０００６】 さらに、アミノ酸生合成に直接的に調節するための多数の試みが知られている
。これらの場合は、特定のアミノ酸生合成酵素をコードする個々の遺伝子を植物
で過剰発現させ、その結果対象とする生合成最終産物の増加がもたらされる。
【０００７】 またその代案として、酵素の反応速度を調節することがさらに試みられた。こ
の場合、特に酵素のいわゆる生成物阻害が問題である。例えば、ShaulおよびGal
ili（1993；Plant Mol Biol 23：759−768）またはFalcoら（1995；Bio/Technol
ogy 13：577−582）は遊離リシンを過剰生産し、それに伴って遊離トレオニンが
減少する植物を記述している。その原因をなすのは、アスパラギン酸に由来する
アミノ酸の生合成の最初の酵素である、アスパラギン酸キナーゼである。該酵素
はリシンによってアロステリック阻害を受ける。このフィードバック阻害を回避
するために、遺伝子工学的に改変したアスパラギン酸キナーゼ遺伝子を植物に過
剰発現させた（国際特許出願WO９４／２５６０５号）。この改変されたアスパラ
ギン酸キナーゼはリシンおよびトレオニンによるフィードバック阻害が大幅に抑
制されるため、リシンの増加をもたらす。さらに、リシンによるフィードバック
阻害に対して非感受性である該アスパラギン酸キナーゼを、他の生合成酵素とと
もに過剰発現させた。同様の実験は、コリネバクテリウム（Corynebakuterium）
で行われた（1991、Applied and Environmenntal Microbiology 57：1746−1725
）。しかし、該細菌ではリシンの増加だけでなく、成長速度の大幅な減少も起こ
り、結局、リシンのバランスに否定的な影響を及ぼす。
【０００８】 フィードバック非感受性のアスパラギン酸キナーゼおよびフィードバック非感
受性のジヒドロピコリン酸シンターゼの両方を含有する植物を用いる実験がShau
lおよびGalili（1993；Plant Mol Biol 23：759−768）に記載されている。これ
ら２種の酵素はアミノ酸生合成で中心的役割を担う。しかし、これらのボトルネ
ック（bottleneck）酵素の過剰発現は２種のアミノ酸、リシンおよびトレオニン
を期待どおりに増加させなかった。むしろ、遊離リシンの含有量だけは増加させ
ることができたが、同時に遊離トレオニンの含有量は大幅に低下した。
【０００９】 国際特許出願WO９８／５６９３５号、欧州特許第０８５４１８９号および欧州
特許第０４８５９７０号は、１または２個のアミノ酸生合成遺伝子の過剰発現だ
けでなく、ある植物の1種以上のアミノ酸の量に同時に影響を与えることを目的
とした多重遺伝子手法を記述している。それには植物の複数の遺伝子に関する遺
伝子の改変が必要である。即ち、多重形質転換植物を作出することが必要である
。ところが、この方法は大変複雑である。さらに、植物の遺伝材料へのこのよう
な大がかりな干渉は、予測不能な副作用の危険が大きい。
【００１０】 そこで本発明の課題は、上述の欠点がない形質転換植物およびその作製方法を
提供することである。
【００１１】 意外なことに、上記課題は、1種以上のアミノ酸の量が、対応する形質転換さ
れていない植物に比べて同時に改変されるように、ATP/ADP輸送体遺伝子の制御
配列および/または遺伝子コピー数を改変した形質転換植物を提供することによ
る本発明により達成される。
【００１２】 本発明による形質転換植物は、主として1種以上の必須アミノ酸の量が改変さ
れていることを特徴とする。
【００１３】 特に、本発明に係る植物は、1種以上の必須アミノ酸の含有量が形質転換され
ていない植物に比べて増加を示す。
【００１４】 本発明の形質転換植物は、有用植物、好ましくは経済的に重要な植物、例えば
ジャガイモまたはトウモロコシである。但し本発明はこの種類に限定されるもの
ではない。
【００１５】 本発明は、前述の形質転換植物、その種子および子孫、ならびに該形質転換植
物に由来する組織、細胞または繁殖可能な材料に関する。
【００１６】 本発明の1実施形態では、ATP/ADP輸送体をコードする遺伝子をジャガイモで過
剰発現させる本発明の実施形態では、栄養生理学的および経済的な観点から重要
なアミノ酸、例えばリシン、メチオニン、トレオニン、バリン、トリプトファン
、ヒスチジン、イソロイシンおよびロイシンの増加が得られる。
【００１７】 ライン９８と称する形質転換植物で遊離リシンの量が２８%増大し、ライン６
２と称する形質転換植物では遊離リシン量の増加が２５．７５％である。意外な
ことに、植物内のATP/ADP輸送体活性が５０％増加するだけで、リシン含有量が
少なくとも２５％増加する。さらに、ライン９８ではメチオニンの量が１１％増
加した。リシンおよびメチオニンの量が増加するほか、必須アミノ酸バリン（ラ
イン９８で１２％）、トリプトファン（ライン９８で５０％）、トレオニン（ラ
イン９８で１２．５％）、ヒスチジン（ライン９８で２３．５％、ライン６２で
２０％）、イソロイシン（ライン９８で２５％）およびロイシン（ライン９８で
４０％）の量の増加も認められる。
【００１８】 アンチセンス方向のATP/ADP輸送体の過剰発現は、ライン５９４および５９５
と称するそれぞれの形質転換植物でアミノ酸量の低下をもたらす。この場合、リ
シンについては野生型のリシン量の僅か約４分の１しか、メチオニンではさらに
野生型のメチオニン量の約８分の１以下しか認められない。
【００１９】 ジャガイモの野生型ソラヌム・ツベロスム（Solanum tuberosum）および形質
転換ジャガイモ植物の各種のアミノ酸量の概要を表１にまとめた。本発明のこの
実施形態では、形質転換ジャガイモ植物の遊離アミノ酸の総量が野生型に比べて
約７％増加している。
【００２０】 本発明の特別な利点は、単一の遺伝子即ちATP/ADP輸送体の発現の増加によっ
て複数の主要な必須アミノ酸の特異的な増加が同時に得られることである。
【００２１】 本発明における形質転換植物は、葉緑体包膜へのATPの輸送能が増加している
ことを特徴とする。
【００２２】 さらに、本発明は、図１に示すアミノ酸配列をコードするシロイヌナズナ（Ar
abidopsis thaliana）のヌクレオチド配列（ＥＭＢＬ登録番号Ｚ４９２２７）を
有する上記植物に使用するためのATP/ADP輸送体遺伝子に関する。
【００２３】 本発明によれば、葉緑体を有する生物のあらゆるATP/ADP輸送体遺伝子の使用
が考えられる。一般に緑藻類または蘚苔植物の植物が好ましい。
【００２４】 ATP/ADP輸送体遺伝子は通常葉緑体内膜に局在する。そこでは葉緑体ADPをATP
と交換して細胞質ゾルへ輸送することにより、ATPおよびADPの対向輸送即ち逆向
きの輸送が成立する。このATP/ADP輸送体の活性の増加により、葉緑体のATP量が
増加する（Neuhausら、1997、The Plant Journal 11：73−82）。Tjadenら（199
8、Plant Jounal 16 ：531−540）は、ジャガイモの葉緑体のATPの取り込みが、
ATP/ADP輸送体の過剰発現により野生型が取り込み可能な量より平均で５０％増
加するを示した。Moehlmannら、1994、Planta、194：492−497；Neuhausら、199
3年、Plant Physiology 101：573−578；Tjadenら、1998、Plant Jounal 16：53
1−541に記載されているように、エネルギー豊富なATP分子は、供給が増大する
と、デンプンや脂肪酸の生合成の増強のために利用することができる。
【００２５】 本発明によれば、実質的に同様な作用を有する天然ヌクレオチド配列、化学合
成ヌクレオチド配列、改変ヌクレオチド配列もしくは人工的ヌクレオチド配列、
またはATP/ADP輸送体をコードする異種ヌクレオチド配列もしくはその対立遺伝
子変異型もしくはアイソフォーム、あるいははこれらの混合物を含有する、請求
項６に記載のATP/ADP輸送体遺伝子を使用することができる。
【００２６】 本質的に同様の作用を有するATP/ADP輸送体遺伝子をコードする配列とは、ヌ
クレオチド配列が異なるにかかわらず、所望の機能を有する配列である。従って
、同様の作用を有する等価物は、上記の配列の天然に存在する変異型および例え
ば化学合成によって得られる、植物のコドン使用頻度を適用させた人工ヌクレオ
チド配列をも含む。
【００２７】 特に、所望の機能を維持している最初に単離されたATP/ADP輸送体をコードす
る配列の天然の突然変異体または人工的突然変異体も、同様の作用を有するヌク
レオチド配列である。突然変異体は1種以上のヌクレオチド残基の置換、付加、
欠失、交換または挿入を包含する。従って、例えばATP/ADP輸送体ヌクレオチド
配列の改変によって得られるヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれる。この
ような改変の目的は、例えばそこに含まれるコード配列のさらなる限定または例
えば制限酵素のさらなる切断部位の挿入である。
【００２８】 出発遺伝子または遺伝子断片と比較して機能が低減または増大された変異型も
また、同様の作用を有するヌクレオチド配列である。
【００２９】 さらに、人工ＤＮＡ配列は、前述のように所望の特性を示す限り本発明に適切
なDNA配列である。このような人工ＤＮＡ配列は、例えばATP/ADP輸送体活性を有
する分子モデリングによる構築されたタンパク質の逆翻訳により、またはin vit
ro選択により決定することができる。特に適当なのは、宿主植物に特異的なコド
ン使用頻度に基づきポリペプチド配列の逆翻訳によって得たコードＤＮＡ配列で
ある。植物遺伝的方法に習熟した当業者は、形質転換される植物の他の既知の遺
伝子のコンピュータ解析によって、特異的コドン使用頻度をたやすく決定するこ
とができる。
【００３０】 さらに、本発明は制御ヌクレオチド配列と機能し得る形で連結されたATP/ADP
輸送体遺伝子を含む。制御配列には、とりわけ植物での発現を可能にする上流側
のプロモーターも含まれる。
【００３１】 機能し得る形の連結とは、コード配列の発現の際に各制御要素がその機能を規
定どおりに遂行し得るように、プロモーター、コード配列、ターミネーター、場
合によってはその他の制御要素のそれぞれを適切に並べて配置することである。
原則として植物での外部遺伝子の発現を制御することができるプロモーターはす
べてプロモーターとして適している。植物プロモーターまたは植物ウイルスに由
来するプロモーターを使用することが好ましい。特に好適なのはカリフラワー・
モザイクウイルスのＣaＭＶ３５ＳＰプロモーターである（Franckら、Cell 21
（1980）、285−294）。周知のように、このプロモーターは、全体として導入し
た遺伝子の永久的かつ構成的発現をもたらす転写エフェクターに対する種々の認
識配列を含む（Benfeyら、EMBO J、８（１９８９年）、２１９５−２２０２）。
【００３２】 機能し得る形の連結に好適な、但しそれに限定されないその他の配列は、転写
ターミネーターおよび翻訳エンハンサー（例えばタバコ・モザイクウイルスの５
’リーダー配列）である（Gallieら、Nucl.Acids Res.15（1987）、8693−8711
）。
【００３３】 ＤＮＡ断片を互いに結合させるために、断片にアダプターまたはリンカーを付
けることができる。転写方向のプロモーターおよびターミネーター領域に、この
配列の挿入のための1種以上の制限部位を含むリンカーまたはポリリンカーを設
けることが好ましい。通常リンカーは１〜１０個、好ましくは１〜８個、特に好
ましくは２〜６個の制限部位を有する。一般に制御領域内のリンカーのサイズは
１００ｂｐ未満、しばしば６０ｂｐ未満、但し少なくとも５ｂｐである。プロモ
ーターは宿主植物にとって、天然に存在するものもしくは相同であるもの、また
外来もしくは異種のものであってよい。
【００３４】 さらに、本発明の主題はATP/ADP輸送体遺伝子およびこの遺伝子と機能し得る
形で連結された制御配列を含む遺伝子構造物、ならびにATP/ADP輸送体遺伝子を
含むベクターまたは上記の遺伝子構造物に関する。この場合、ベクターはとりわ
けプロモーター、ターミネーターまたは翻訳エンハンサーからなる群より選択さ
れ得るさらなる制御ヌクレオチド配列、および適当な宿主細胞での複製またはそ
のゲノムへの組込みのためのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００３５】 それ自体公知の組換えおよびクローニング技術を使用して、上記遺伝子構造物
を宿主細胞、例えば植物、植物組織または細胞での増幅が可能な適切なベクター
にクローニングすることができる。適当なベクターはとりわけ「植物分子生物学
およびバイオテクノロジーの方法（Methods in Plant Molecular Biology and B
iotechnology） 」（CRC Press）、6/７章、71−119頁（1993）に記載されてい
る。
【００３６】 宿主細胞としての大腸菌のクローニングベクターとしては、とりわけｐＢＲ３
３２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系およびｐＡＣＹＣ１ ８４が好適である。特に好
適なのは、大腸菌内でも例えばアグロバクテリウム内でも複製することができる
二機能性ベクター（binary vector）である。これについて一例としてｐＢＩＮ
１９が挙げられる（Bevanら、Nucl.Acids Res.12（1984）、871 1）。例えば本
発明の遺伝子構造物をタバコ形質転換ベクターｐＢＩＮ−ＡＲ−ＴＰに組込むこ
ともできる。
【００３７】 さらに、本発明は前述のように形質転換した植物の作製方法に関する。その場
合、ATP/ADP輸送体遺伝子、前述の型の遺伝子構造物またはベクターを遺伝子工
学的方法で植物もしくはその組織または細胞に転移させる。なおＤＮＡの転移と
は一般に植物、植物組織または細胞の形質転換を意味する。
【００３８】 一時的または安定的な形質転換のために、形質転換または植物組織または植物
細胞からの植物の再生を行うための適当な方法は、ポリエチレングリコール誘導
性のＤＮＡ取り込みによる原形質体形質転換、遺伝子銃によるバイオリスティッ
ク法−いわゆるパーティクル・ボンバードメント法−、エレクトロポレーション
、ＤＮＡ含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロインジェクショ
ンおよびアグロバクテリウムの媒介による遺伝子転移である。上記の方法は例え
ばB.Jenesら、「遺伝子転移技術」、Transgenic Plants、１巻、Engineering an
d Utilization、S.D.KungおよびR.Wu監修、Academic Press（1993）128143およ
びPotrykus、Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42（1991）、202225に
記載されている。
【００３９】 このように、アミノ酸含量の実質的な増大、特に必須アミノ酸含量の実質的な
増大を特徴とする経済的に重要な有用植物を作製することを、本発明は可能とす
る。
【００４０】 さらに本発明は有用植物または飼料植物としての上記形質転換植物の使用に関
する。本発明の有用植物においては、複数の必須アミノ酸の含量をとりわけ同時
に増加させることができるので、これまで在来の方法ではアミノ酸を別個に製造
または採取して、飼料に外部から混入しなければならなかった、費用のかかる飼
料のアミノ酸補給が不要であるという利点がある。
【００４１】 さらに、本発明の形質転換植物、その組織、細胞またはその抽出物は、農業、
飼料製造業もしくは製薬業の分野または保健分野で使用できる。
【００４２】 次に実施例により本発明を詳述する。但し実施例は本発明の趣旨を制限するも
のではない。
【００４３】１．一般的クローニング法 クローニング法、例えば制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精
製、ニトロセルロースおよびナイロン膜への核酸の転写、ＤＮＡ断片の連結、大
腸菌細胞の形質転換、細菌培養、ファージの増殖および組換えＤＮＡの配列決定
分析をSambrookら（1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press：ＩＳＢＮ ０
−８７９６９−３０９−６）に記載されたように実施した。
【００４４】 使用した細菌株（大腸菌、ＸＬ−I Ｂｌｕｅ）はStratagene（Heidelberg）ま
たはQiagen（Hilden）から入手した。植物の形質転換のために使用したアグロバ
クテリウム菌株（アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumef
aciens)、プラスミドｐＧＶ２２６０またはｐＧＶ３８５０ｋａｎを含むＣ５８
Ｃ１）は、DeblaereらがNucl.Acids Res.13（1985）、4777に記載した。代案と
してアグロバクテリウム菌株ＬＢＡ４４０４（Clontech）またはその他の適当な
菌株を使用することもできる。
【００４５】 クローニングのためにベクターｐＵＣ１９（Yanish-Perron、Gene ３３（1985
）103−119）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−(Stratagene)、ｐＧＥＭ−Ｔ（P
romega）、ｐＺｅｒＯ（Invitrogen）、ｐＢｉｎ１９（Bevanら、Nucl.Acids Re
s.12（1984）、8711−8720）およびｐＢｉｎＡＲ（HofgenおよびWillmitzer、Pl
ant Science 66（1990）、221−230）を利用することができる。
【００４６】２．アグロバクテリウムの形質転換 アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換は、HofgenおよびWillmitz
erの方法（Nucl.Acid Res.（1988）16、9877）に従って行った。アグロバクテリ
ウムの培養はＹＥＢ培地で行った（Vervlietら、J.Gen.Virol.（1975）26、33）
。
【００４７】３．組換えＤＮＡの配列決定分析 組換えＤＮＡ分子の配列決定はLicor社のレーザ蛍光ＤＮＡシークエンサー（
発売元MWG Biotech., Ebersbach）によりSangerの方法（Sangerら、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 74（1977）、5463−5467）で行った。
【００４８】４．センス方向性のＡＡＴＰ１を有する植物形質転換ベクターの構築 植物の形質転換用のベクターの構築のために、シロイヌナズナ(Arabidopsis t
haliana)のＡＡＴＰ１−ｃＤＮＡの２２３０ｂｐ長のＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨI断
片（シロイヌナズナ由来のＡＡＴＰ１のクローニングが、Kampfenkelら、FEBS L
etters ３７４（1955）、351−355およびNeuhausら、The Plant Journal 11：73
−82に記載されている）を、ＳｍａI／ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨIで切断したベ
クターｐＢｉｎＡＲ（HofgenおよびWillmitzer、Plant Science ６６（1990）、
223−230）に連結する。ｃＤＮＡ断片の挿入によってカリフラワーモザイクウイ
ルスの３５Ｓプロモーター（５４０ｂｐ）およびシロイヌナズナのＡＤＰ／ＡＴ
Ｐ輸送体１（ＡＡＴＰ１）のタンパク質コード領域を含む遺伝子構築物が生じる
。ｃＤＮＡ断片はセンス方向性でｐＢｉｎＡＲの３５Ｓプロモーターと融合され
る。挿入されたＡＡＴＰ１断片の３'方向にアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスのオクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナル（２１５ｂｐ）が
続く。
【００４９】 プラスミドｐＢｉｎＡＲ−ＡＡＴＰ１（図３）の全体の大きさは、約１４．２
ｋｂである。
【００５０】５．ジャガイモ植物のゲノムへのプラスミドｐＢＩＮＡＲ−ＡＴＴＰ１の挿入
Rocha-Sosaら（EMBO J. 8（1989）、23−29）が述べるように、アグロバクテリ
ウム・ツメファシエンスによってプラスミドをジャガイモ植物に導入する。形質
転換の陽性対照として、色素体ＡＤＰ／ＡＴＰ輸送体１のｍＲＮＡレベルが増加
したトランスジェニックジャガイモ植物が役割を果たした。検出は、ノーザンブ
ロッティング分析によって行われる。この目的のために標準プロトコルに従って
ジャガイモの葉および塊茎組織からＲＮＡを単離する。アガロースゲル（１．５
％アガロース、１×ＭＥＮバッファー、１６．６％ホルムアルデヒド）上で５０
μｇのＲＮＡを分離する。電気泳動の後、２０×ＳＳＣを使ってキャピラリーブ
ロッティングによりＲＮＡをHybond Nナイロン膜(Amersham、UK)に転写する。紫
外線照射によりＲＮＡを膜に固定し、膜をリン酸ハイブリダイゼーションバッフ
ァー（Sambrookら、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press：ＩＳＢＮ ０
−８７９６９−３０９−６）中で２時間予備ハイブリダイズし、続いて放射性標
識プローブを加えて１０時間ハイブリダイズする。
【００５１】６．アンチセンス方向性のＡＡＴＰ１を有する植物形質転換ベクターの構築 植物形質転換用のベクターの構築のために、ジャガイモ(S. tuberosum)のＡＡ
ＴＰ１ ｃＤＮＡのコード領域（Tjadenら、1998、The Plant Journal 16：531−
540所載のジャガイモのＡＡＴＰ１のクローニングの説明）に由来する１２６５
ｂｐ長のＢａｍＨ／Ｎｄｅｌ断片（そのＮｄｅI切断部位はＴ４ポリメラーゼに
より平滑末端となる）を、ＳｍａIおよびＢａｍＨIで切断されたベクターｐＢｉ
ｎＡＲ（HofgenおよびWillmitzer、Plant Science 66（1990）、221−230）に連
結する。ＮｄｅI切断部位は、ＡＡＴＰ１ ｃＤＮＡに位置し、ＢａｍＨI切断部
位は、ベクターｐＴＭ１に由来する（Tjadenら、1998、The Plant Journal 16
：531−540）。ｃＤＮＡ断片の挿入によって、カリフラワーモザイクウイルスの
３５Ｓプロモーター（５４０ｂｐ）およびアンチセンス方向性でジャガイモ由来
のＡＤＰ／ＡＴＰ輸送体１（ＡＡＴＰ１Ｓ．ｔ．）の１２６５ｂｐ長の領域を含
む遺伝子構築物が生じる。断片をｐＢｉｎＡＲの３５Ｓプロモーターに融合した
。挿入されたＡＡＴＰ１断片の３'方向にアグロバクテリウム・ツメファシエン
スのオクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナル（２１５ｂｐ）が続
く。
【００５２】 プラスミドｐＢＩＮ ＡＲ−ＡＳ−ＡＡＴＰ１（図４）の全体の大きさは、約
１３．３ｋｂである。
【００５３】７．ジャガイモ植物のゲノムへのプラスミドｐＢＩＮＡＲ−ＡＳＡＡＴＰ１の導 入 プラスミドの導入は、５項で述べた手順と同様に行う。
【００５４】 形質転換の結果、トランスジェニックジャガイモ植物は、色素体ＡＤＰ／ＡＴ
Ｐ輸送体のｍＲＮＡレベルの減少を示した。これはノーザンブロット分析により
検出される。この目的のために標準プロトコルに従ってジャガイモの葉および塊
茎組織からＲＮＡを単離する。５０μｇのＲＮＡをアガロースゲル（１．５％ア
ガロース、１×ＭＥＮバッファー、１６．６％ホルムアルデヒド）上で分離した
。電気泳動の後、２０×ＳＳＣを使ってキャピラリーブロッティングによりＲＮ
ＡをHybond Nナイロン膜（Amersham、UK）に転写した。紫外線照射によりＲＮＡ
を膜に固定する。膜をリン酸ハイブリダイゼーションバッファー（Sambrookら、
前掲）で２時間予備ハイブリダイズし、続いて放射性標識プローブを加えて１０
時間ハイブリダイズする。
【００５５】８．アミノ酸分析 アミノ酸（プロリンを除く）をエタノール抽出物のＨＰＬＣ分離により測定し
た（Geigenbergerら、1996、Plant Cell & Environ、19：43−55の方法）。
【００５６】８．１ エタノール抽出物の調製 それぞれ２個のジャガイモスライス（合計約０．２ｇの生鮮重量）を順次続く
２つのステップ（それぞれ７ｍｌの８０％（ｖ／ｖ）エタノールおよび７ｍｌの
５０％エタノールを用いる)で８０℃で３０分間抽出する。全抽出物（容積約１
４ｍｌ）をアミノ酸分析のために使用する。
【００５７】８．２ ＨＰＬＣによるアミノ酸含有量の決定 アミノ酸の検出は、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）で第１級アミノ基の予
備カラム誘導体化の後に蛍光定量法で行った。この目的のためにインジェクター
（Autosampler 465、Kontron、Eching）により、４℃でメタノール中５％（ｇ／
ｖ）のＯＰＡ、０．８Ｍのホウ酸バッファー（ＫＯＨを用いてｐＨ１０．４）お
よび３−メルカプトプロピオン酸の混合物（１０：９０：１；ｖ：ｖ：ｖ）から
なる３５μｌのＯＰＡ試薬を３５μｌの抽出物に注入する。１０８秒後に２０μ
ｌの誘導体化サンプルを注入した。
【００５８】 移動相Ａは、１０００ｍｌの１２ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）と１．
６ｍｌのテトラヒドロフランとの混合物である。移動相Ｂは、２５０ｍｌの１２
ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１７５ｍｌのメタノールおよび１１０ｍ
ｌのアセトニトリルの混合物からなる。分離条件は次のとおりである。０―２分
、０％Ｂのアイソクラチック相、２―１１分、０％Ｂから１０％Ｂへの直線勾配
、１１―１７分、１０％Ｂ、１７―２７分、１０％Ｂから５０％Ｂへの直線勾配
、２７―３８分、５０％Ｂから６０％Ｂへの直線勾配、３８―４４分、６０％Ｂ
から１００％Ｂへの直線勾配、４４―４６分、１００％Ｂ、４６―４８分、１０
０％Ｂから０％Ｂへ、４８―６０分、０％Ｂ。分離のためにHypersil ＯＤＳカ
ラム（粒度３μｍ、長さ１５０ｍｍ、直径４．６ｍｍ、Knauer GmbH、Berlin）
を使用する。蛍光計（ＳＦＭ２５、Kontron、Eching）によって検出された信号
（励起波長＝３３０ｎｍ、放出波長＝４５０ｎｍ）をデータ処理システム４５０
−ＭＴ（Kontron、Eching）によって積分し、評価する。
【００５９】８．３ プロリン含有量の決定 プロリン含有量の決定はBatesら、1973、Plant Soil 39 ：205−207によって
行う。
【００６０】 ２００μｌの抽出物に、６Ｍ H3PO4２部と７５％酢酸３部との混合物５００μ
ｌおよび５００μｌのニンヒドリン溶液（７５％酢酸２０ｍｌにつき６００ｍｇ
）を加える。９５〜１００℃で４５分インキュベーションした後、試験混合物を
氷上に置き、３００μｌのトルエンを混合する。相分離を行った後、上側の相を
マイクロキュベットに移して、５１５ｎｍで光学密度を測定する。校正プロット
（１−５０μＭプロリン）と比較してプロリン含有量を決定する。
【００６１】
【表１】 ジャガイモの野生型およびセンス方向性（Ｓｅｎｓｅ−９８およびＳｅｎｓｅ−
６２）またはアンチセンス方向性（Ａｎｔｉｓ−５９４およびＡｎｔｉｓ−５９
５）のＡＴＰ／ＡＤＰ輸送体遺伝子を含む形質転換したジャガイモ植物のアミノ
酸含有量の概要
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、葉緑体ＡＴＰ／ＡＤＰ輸送体１のコード領域に対応するシロイヌナズ
ナｃＤＮＡ（ＥＭＢＬ登録番号Ｚ４９２２７）を示す。
【図２】 図２は、葉緑体ＡＴＰ／ＡＤＰ輸送体１のコード領域に対応するジャガイモｃ
ＤＮＡ（ＥＭＢＬ登録番号Ｙ１０８２１）を示す。
【図３】 図３は、センス方向性のＡＴＰ／ＡＤＰ輸送体の発現のための植物形質転換ベ
クターｐＢＩＮ−ＡＲ−ＡＡＴＰ１を示す。
【図４】 図４は、アンチセンス方向性のＡＴＰ／ＡＤＰ輸送体の発現のための植物形質
転換ベクターｐＢＩＮ−ＡＲ−ＡＡＴＰ１−ＡＳを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ノイハウス，ホルスト−エッカーハルド ドイツ連邦共和国 67659 カイザースラ イテル ン イム ブラウメンストュック 13 (72)発明者 グレーフェ−カンプフェンケル，カールハ インツ ドイツ連邦共和国 ディー−55246 マイ ンツ− コストハイム イム サムペル 10アー (72)発明者 メールマン，トルステン ドイツ連邦共和国 ディー−32257 ビュ ーンデ ゲレルシュトラーセ 17 (72)発明者 チャデン，ヨアヒム ドイツ連邦共和国 67661 カイザースラ イテル ン ランバッハシュトラーセ 16 Ｆターム(参考） 2B030 AD08 CA15 CA17 CA19 2B150 AA01 DA44 DD31 4B024 AA08 BA71 CA04 DA01 EA04 FA02 4B065 AA88 AB01 BA02 CA17 CA53

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 1種以上のアミノ酸の量が、対応する形質転換されていない
    植物に比べて同時に改変されるように、ATP/ADP輸送体遺伝子の制御配列および/
    または遺伝子コピー数が改変されていることを特徴とする、形質転換植物および
    その子孫。
  2. 【請求項２】 葉緑体包膜へのATP輸送能が増加していることを特徴とする
    、請求項１に記載の形質転換植物およびその子孫。
  3. 【請求項３】 主として1種以上の必須アミノ酸の量が改変されていること
    を特徴とする、請求項１または２に記載の形質転換植物およびその子孫。
  4. 【請求項４】 1種以上の必須アミノ酸の含量が、形質転換されていない植
    物に比べて増加していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載
    の形質転換植物およびその子孫。
  5. 【請求項５】 有用植物であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか
    １項に記載の形質転換植物およびその子孫。
  6. 【請求項６】 図１に示すアミノ酸配列をコードするシロイヌナズナ（Arab
    idopsis thaliana）のヌクレオチド配列（ＥＭＢＬ登録番号Ｚ４９２２７）を有
    する、請求項１〜５のいずれか1項に記載の植物において使用するためのATP/ADP
    輸送体遺伝子。
  7. 【請求項７】 実質的に同様な作用を有する天然ヌクレオチド配列、化学合
    成ヌクレオチド配列、改変ヌクレオチド配列もしくは人工的ヌクレオチド配列、
    またはATP/ADP輸送体をコードする異種ヌクレオチド配列もしくはその対立遺伝
    子変異型もしくはアイソフォーム、あるいははこれらの混合物を含有する、請求
    項６に記載のATP/ADP輸送体遺伝子。
  8. 【請求項８】 機能し得る形で連結された制御ヌクレオチド配列を有する請
    求項６または７に記載のATP/ADP輸送体遺伝子。
  9. 【請求項９】 その上流に機能し得る形で連結されたプロモーターを含んで
    いる、請求項６〜８のいずれか１項に記載のATP/ADP輸送体遺伝子。
  10. 【請求項１０】 請求項６〜９のいずれか1項に記載のATP/ADP輸送体遺伝子
    と、該遺伝子に機能し得る形で連結された制御配列とを含有する遺伝子構造物。
  11. 【請求項１１】 請求項６〜９のいずれか１項に記載のATP/ADP輸送体遺伝
    子または請求項１０に記載の遺伝子構造物を含むベクター。
  12. 【請求項１２】 プロモーター、ターミネーターまたは翻訳エンハンサーか
    らなる群より選択され得るさらなる制御ヌクレオチド配列、および適当な宿主細
    胞での複製またはそのゲノムへの組込みのためのヌクレオチド配列を含む、請求
    項１１に記載のベクター。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物の種子。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物に由来する組織
    または細胞または繁殖可能な材料。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のアミノ酸含量が増加
    している植物を作製する方法であって、請求項６〜９のいずれか1項に記載のATP
    /ADP輸送体遺伝子または請求項１０に記載の遺伝子構造物または請求項１１もし
    くは１２に記載のベクターを遺伝子工学的方法で転移させることを特徴とする、
    上記方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換植物の有用
    植物または飼料植物としての使用。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換植物、その
    組織、細胞またはその抽出物の、農業、飼料製造業もしくは製薬業の分野または
    保健分野での使用。
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