JP2003509055A - アミノ酸含有量が改変された植物およびその作製方法 - Google Patents

アミノ酸含有量が改変された植物およびその作製方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、1種以上のアミノ酸の量が、対応する形質転換されていない植物に比べて同時に改変されるように、ATP/ADP輸送体遺伝子の制御配列および/または遺伝子コピー数が改変されていることを特徴とする形質転換植物およびその子孫に関する。本発明はまた、上記植物の作製方法および作物植物としての利用または動物用飼料製造業における利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 本発明は、1種以上のアミノ酸の量が形質転換されていない植物に比べて同時
に改変されている、ATP/ADP輸送体遺伝子の制御配列および/または遺伝子コピー
数を改変した形質転換植物およびその子孫に関する。また本発明はこの植物の作
製方法および有用植物としての使用、または飼料製造業の分野での使用に関する
【0002】 ヒトおよび動物は20種のアミノ酸のうち11種しか合成することができず、
従って必須アミノ酸として知られている9種は食物からの摂取に頼らざるを得な
い。ヒトおよび家畜の栄養は大部分が植物性成分に基づく。必須アミノ酸にはリ
シン、トリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トレオ
ニン、フェニルアラニンおよびヒスチジンが挙げられる。
【0003】 食用植物では多くの場合上記アミノ酸の濃度が極めて低いという事実が問題と
なる。この理由により、栄養価を高めるために、合成により製造されたアミノ酸
がしばしば穀物混合物や野菜ベースの食品に補給される。
【0004】 過去には、遊離アミノ酸、即ちタンパク質内に存在していないアミノ酸の量を
高めるために、これまで多数の方法がとられた。しかし、これらの試みはとりわ
け古典的な育種と突然変異体の選択に集中していた。
【0005】 最近では、分子遺伝学的技術を応用することによって必須アミノ酸の量を増加
させる試みが増えてきている。国際特許出願WO97/28247号、国際特許出
願WO98/13506号および国際特許出願WO97/35023号は、リシンま
たはメチオニンに富む種子特有の貯蔵タンパク質の異種発現に至る最初の試みを
記述している。この場合、タンパク質でのアミノ酸の貯蔵が欠点である。即ち、
この場合もやはり、増加は結合したアミノ酸の増加という形態である。
【0006】 さらに、アミノ酸生合成に直接的に調節するための多数の試みが知られている
。これらの場合は、特定のアミノ酸生合成酵素をコードする個々の遺伝子を植物
で過剰発現させ、その結果対象とする生合成最終産物の増加がもたらされる。
【0007】 またその代案として、酵素の反応速度を調節することがさらに試みられた。こ
の場合、特に酵素のいわゆる生成物阻害が問題である。例えば、ShaulおよびGal
ili(1993;Plant Mol Biol 23:759−768)またはFalcoら(1995;Bio/Technol
ogy 13:577−582)は遊離リシンを過剰生産し、それに伴って遊離トレオニンが
減少する植物を記述している。その原因をなすのは、アスパラギン酸に由来する
アミノ酸の生合成の最初の酵素である、アスパラギン酸キナーゼである。該酵素
はリシンによってアロステリック阻害を受ける。このフィードバック阻害を回避
するために、遺伝子工学的に改変したアスパラギン酸キナーゼ遺伝子を植物に過
剰発現させた(国際特許出願WO94/25605号)。この改変されたアスパラ
ギン酸キナーゼはリシンおよびトレオニンによるフィードバック阻害が大幅に抑
制されるため、リシンの増加をもたらす。さらに、リシンによるフィードバック
阻害に対して非感受性である該アスパラギン酸キナーゼを、他の生合成酵素とと
もに過剰発現させた。同様の実験は、コリネバクテリウム(Corynebakuterium)
で行われた(1991、Applied and Environmenntal Microbiology 57:1746−1725
)。しかし、該細菌ではリシンの増加だけでなく、成長速度の大幅な減少も起こ
り、結局、リシンのバランスに否定的な影響を及ぼす。
【0008】 フィードバック非感受性のアスパラギン酸キナーゼおよびフィードバック非感
受性のジヒドロピコリン酸シンターゼの両方を含有する植物を用いる実験がShau
lおよびGalili(1993;Plant Mol Biol 23:759−768)に記載されている。これ
ら2種の酵素はアミノ酸生合成で中心的役割を担う。しかし、これらのボトルネ
ック(bottleneck)酵素の過剰発現は2種のアミノ酸、リシンおよびトレオニン
を期待どおりに増加させなかった。むしろ、遊離リシンの含有量だけは増加させ
ることができたが、同時に遊離トレオニンの含有量は大幅に低下した。
【0009】 国際特許出願WO98/56935号、欧州特許第0854189号および欧州
特許第0485970号は、1または2個のアミノ酸生合成遺伝子の過剰発現だ
けでなく、ある植物の1種以上のアミノ酸の量に同時に影響を与えることを目的
とした多重遺伝子手法を記述している。それには植物の複数の遺伝子に関する遺
伝子の改変が必要である。即ち、多重形質転換植物を作出することが必要である
。ところが、この方法は大変複雑である。さらに、植物の遺伝材料へのこのよう
な大がかりな干渉は、予測不能な副作用の危険が大きい。
【0010】 そこで本発明の課題は、上述の欠点がない形質転換植物およびその作製方法を
提供することである。
【0011】 意外なことに、上記課題は、1種以上のアミノ酸の量が、対応する形質転換さ
れていない植物に比べて同時に改変されるように、ATP/ADP輸送体遺伝子の制御
配列および/または遺伝子コピー数を改変した形質転換植物を提供することによ
る本発明により達成される。
【0012】 本発明による形質転換植物は、主として1種以上の必須アミノ酸の量が改変さ
れていることを特徴とする。
【0013】 特に、本発明に係る植物は、1種以上の必須アミノ酸の含有量が形質転換され
ていない植物に比べて増加を示す。
【0014】 本発明の形質転換植物は、有用植物、好ましくは経済的に重要な植物、例えば
ジャガイモまたはトウモロコシである。但し本発明はこの種類に限定されるもの
ではない。
【0015】 本発明は、前述の形質転換植物、その種子および子孫、ならびに該形質転換植
物に由来する組織、細胞または繁殖可能な材料に関する。
【0016】 本発明の1実施形態では、ATP/ADP輸送体をコードする遺伝子をジャガイモで過
剰発現させる本発明の実施形態では、栄養生理学的および経済的な観点から重要
なアミノ酸、例えばリシン、メチオニン、トレオニン、バリン、トリプトファン
、ヒスチジン、イソロイシンおよびロイシンの増加が得られる。
【0017】 ライン98と称する形質転換植物で遊離リシンの量が28%増大し、ライン6
2と称する形質転換植物では遊離リシン量の増加が25.75%である。意外な
ことに、植物内のATP/ADP輸送体活性が50%増加するだけで、リシン含有量が
少なくとも25%増加する。さらに、ライン98ではメチオニンの量が11%増
加した。リシンおよびメチオニンの量が増加するほか、必須アミノ酸バリン(ラ
イン98で12%)、トリプトファン(ライン98で50%)、トレオニン(ラ
イン98で12.5%)、ヒスチジン(ライン98で23.5%、ライン62で
20%)、イソロイシン(ライン98で25%)およびロイシン(ライン98で
40%)の量の増加も認められる。
【0018】 アンチセンス方向のATP/ADP輸送体の過剰発現は、ライン594および595
と称するそれぞれの形質転換植物でアミノ酸量の低下をもたらす。この場合、リ
シンについては野生型のリシン量の僅か約4分の1しか、メチオニンではさらに
野生型のメチオニン量の約8分の1以下しか認められない。
【0019】 ジャガイモの野生型ソラヌム・ツベロスム(Solanum tuberosum)および形質
転換ジャガイモ植物の各種のアミノ酸量の概要を表1にまとめた。本発明のこの
実施形態では、形質転換ジャガイモ植物の遊離アミノ酸の総量が野生型に比べて
約7%増加している。
【0020】 本発明の特別な利点は、単一の遺伝子即ちATP/ADP輸送体の発現の増加によっ
て複数の主要な必須アミノ酸の特異的な増加が同時に得られることである。
【0021】 本発明における形質転換植物は、葉緑体包膜へのATPの輸送能が増加している
ことを特徴とする。
【0022】 さらに、本発明は、図1に示すアミノ酸配列をコードするシロイヌナズナ(Ar
abidopsis thaliana)のヌクレオチド配列(EMBL登録番号Z49227)を
有する上記植物に使用するためのATP/ADP輸送体遺伝子に関する。
【0023】 本発明によれば、葉緑体を有する生物のあらゆるATP/ADP輸送体遺伝子の使用
が考えられる。一般に緑藻類または蘚苔植物の植物が好ましい。
【0024】 ATP/ADP輸送体遺伝子は通常葉緑体内膜に局在する。そこでは葉緑体ADPをATP
と交換して細胞質ゾルへ輸送することにより、ATPおよびADPの対向輸送即ち逆向
きの輸送が成立する。このATP/ADP輸送体の活性の増加により、葉緑体のATP量が
増加する(Neuhausら、1997、The Plant Journal 11:73−82)。Tjadenら(199
8、Plant Jounal 16 :531−540)は、ジャガイモの葉緑体のATPの取り込みが、
ATP/ADP輸送体の過剰発現により野生型が取り込み可能な量より平均で50%増
加するを示した。Moehlmannら、1994、Planta、194:492−497;Neuhausら、199
3年、Plant Physiology 101:573−578;Tjadenら、1998、Plant Jounal 16:53
1−541に記載されているように、エネルギー豊富なATP分子は、供給が増大する
と、デンプンや脂肪酸の生合成の増強のために利用することができる。
【0025】 本発明によれば、実質的に同様な作用を有する天然ヌクレオチド配列、化学合
成ヌクレオチド配列、改変ヌクレオチド配列もしくは人工的ヌクレオチド配列、
またはATP/ADP輸送体をコードする異種ヌクレオチド配列もしくはその対立遺伝
子変異型もしくはアイソフォーム、あるいははこれらの混合物を含有する、請求
項6に記載のATP/ADP輸送体遺伝子を使用することができる。
【0026】 本質的に同様の作用を有するATP/ADP輸送体遺伝子をコードする配列とは、ヌ
クレオチド配列が異なるにかかわらず、所望の機能を有する配列である。従って
、同様の作用を有する等価物は、上記の配列の天然に存在する変異型および例え
ば化学合成によって得られる、植物のコドン使用頻度を適用させた人工ヌクレオ
チド配列をも含む。
【0027】 特に、所望の機能を維持している最初に単離されたATP/ADP輸送体をコードす
る配列の天然の突然変異体または人工的突然変異体も、同様の作用を有するヌク
レオチド配列である。突然変異体は1種以上のヌクレオチド残基の置換、付加、
欠失、交換または挿入を包含する。従って、例えばATP/ADP輸送体ヌクレオチド
配列の改変によって得られるヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれる。この
ような改変の目的は、例えばそこに含まれるコード配列のさらなる限定または例
えば制限酵素のさらなる切断部位の挿入である。
【0028】 出発遺伝子または遺伝子断片と比較して機能が低減または増大された変異型も
また、同様の作用を有するヌクレオチド配列である。
【0029】 さらに、人工DNA配列は、前述のように所望の特性を示す限り本発明に適切
なDNA配列である。このような人工DNA配列は、例えばATP/ADP輸送体活性を有
する分子モデリングによる構築されたタンパク質の逆翻訳により、またはin vit
ro選択により決定することができる。特に適当なのは、宿主植物に特異的なコド
ン使用頻度に基づきポリペプチド配列の逆翻訳によって得たコードDNA配列で
ある。植物遺伝的方法に習熟した当業者は、形質転換される植物の他の既知の遺
伝子のコンピュータ解析によって、特異的コドン使用頻度をたやすく決定するこ
とができる。
【0030】 さらに、本発明は制御ヌクレオチド配列と機能し得る形で連結されたATP/ADP
輸送体遺伝子を含む。制御配列には、とりわけ植物での発現を可能にする上流側
のプロモーターも含まれる。
【0031】 機能し得る形の連結とは、コード配列の発現の際に各制御要素がその機能を規
定どおりに遂行し得るように、プロモーター、コード配列、ターミネーター、場
合によってはその他の制御要素のそれぞれを適切に並べて配置することである。
原則として植物での外部遺伝子の発現を制御することができるプロモーターはす
べてプロモーターとして適している。植物プロモーターまたは植物ウイルスに由
来するプロモーターを使用することが好ましい。特に好適なのはカリフラワー・
モザイクウイルスのCaMV35SPプロモーターである(Franckら、Cell 21
(1980)、285−294)。周知のように、このプロモーターは、全体として導入し
た遺伝子の永久的かつ構成的発現をもたらす転写エフェクターに対する種々の認
識配列を含む(Benfeyら、EMBO J、8(1989年)、2195−2202)。
【0032】 機能し得る形の連結に好適な、但しそれに限定されないその他の配列は、転写
ターミネーターおよび翻訳エンハンサー(例えばタバコ・モザイクウイルスの5
’リーダー配列)である(Gallieら、Nucl.Acids Res.15(1987)、8693−8711
)。
【0033】 DNA断片を互いに結合させるために、断片にアダプターまたはリンカーを付
けることができる。転写方向のプロモーターおよびターミネーター領域に、この
配列の挿入のための1種以上の制限部位を含むリンカーまたはポリリンカーを設
けることが好ましい。通常リンカーは1〜10個、好ましくは1〜8個、特に好
ましくは2〜6個の制限部位を有する。一般に制御領域内のリンカーのサイズは
100bp未満、しばしば60bp未満、但し少なくとも5bpである。プロモ
ーターは宿主植物にとって、天然に存在するものもしくは相同であるもの、また
外来もしくは異種のものであってよい。
【0034】 さらに、本発明の主題はATP/ADP輸送体遺伝子およびこの遺伝子と機能し得る
形で連結された制御配列を含む遺伝子構造物、ならびにATP/ADP輸送体遺伝子を
含むベクターまたは上記の遺伝子構造物に関する。この場合、ベクターはとりわ
けプロモーター、ターミネーターまたは翻訳エンハンサーからなる群より選択さ
れ得るさらなる制御ヌクレオチド配列、および適当な宿主細胞での複製またはそ
のゲノムへの組込みのためのヌクレオチド配列を含むことができる。
【0035】 それ自体公知の組換えおよびクローニング技術を使用して、上記遺伝子構造物
を宿主細胞、例えば植物、植物組織または細胞での増幅が可能な適切なベクター
にクローニングすることができる。適当なベクターはとりわけ「植物分子生物学
およびバイオテクノロジーの方法(Methods in Plant Molecular Biology and B
iotechnology) 」(CRC Press)、6/7章、71−119頁(1993)に記載されてい
る。
【0036】 宿主細胞としての大腸菌のクローニングベクターとしては、とりわけpBR3
32、pUC系、M13mp系およびpACYC1 84が好適である。特に好
適なのは、大腸菌内でも例えばアグロバクテリウム内でも複製することができる
二機能性ベクター(binary vector)である。これについて一例としてpBIN
19が挙げられる(Bevanら、Nucl.Acids Res.12(1984)、871 1)。例えば本
発明の遺伝子構造物をタバコ形質転換ベクターpBIN−AR−TPに組込むこ
ともできる。
【0037】 さらに、本発明は前述のように形質転換した植物の作製方法に関する。その場
合、ATP/ADP輸送体遺伝子、前述の型の遺伝子構造物またはベクターを遺伝子工
学的方法で植物もしくはその組織または細胞に転移させる。なおDNAの転移と
は一般に植物、植物組織または細胞の形質転換を意味する。
【0038】 一時的または安定的な形質転換のために、形質転換または植物組織または植物
細胞からの植物の再生を行うための適当な方法は、ポリエチレングリコール誘導
性のDNA取り込みによる原形質体形質転換、遺伝子銃によるバイオリスティッ
ク法−いわゆるパーティクル・ボンバードメント法−、エレクトロポレーション
、DNA含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロインジェクショ
ンおよびアグロバクテリウムの媒介による遺伝子転移である。上記の方法は例え
ばB.Jenesら、「遺伝子転移技術」、Transgenic Plants、1巻、Engineering an
d Utilization、S.D.KungおよびR.Wu監修、Academic Press(1993)128143およ
びPotrykus、Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)、202225に
記載されている。
【0039】 このように、アミノ酸含量の実質的な増大、特に必須アミノ酸含量の実質的な
増大を特徴とする経済的に重要な有用植物を作製することを、本発明は可能とす
る。
【0040】 さらに本発明は有用植物または飼料植物としての上記形質転換植物の使用に関
する。本発明の有用植物においては、複数の必須アミノ酸の含量をとりわけ同時
に増加させることができるので、これまで在来の方法ではアミノ酸を別個に製造
または採取して、飼料に外部から混入しなければならなかった、費用のかかる飼
料のアミノ酸補給が不要であるという利点がある。
【0041】 さらに、本発明の形質転換植物、その組織、細胞またはその抽出物は、農業、
飼料製造業もしくは製薬業の分野または保健分野で使用できる。
【0042】 次に実施例により本発明を詳述する。但し実施例は本発明の趣旨を制限するも
のではない。
【0043】1.一般的クローニング法 クローニング法、例えば制限切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精
製、ニトロセルロースおよびナイロン膜への核酸の転写、DNA断片の連結、大
腸菌細胞の形質転換、細菌培養、ファージの増殖および組換えDNAの配列決定
分析をSambrookら(1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press:ISBN 0
−87969−309−6)に記載されたように実施した。
【0044】 使用した細菌株(大腸菌、XL−I Blue)はStratagene(Heidelberg)ま
たはQiagen(Hilden)から入手した。植物の形質転換のために使用したアグロバ
クテリウム菌株(アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumef
aciens)、プラスミドpGV2260またはpGV3850kanを含むC58
C1)は、DeblaereらがNucl.Acids Res.13(1985)、4777に記載した。代案と
してアグロバクテリウム菌株LBA4404(Clontech)またはその他の適当な
菌株を使用することもできる。
【0045】 クローニングのためにベクターpUC19(Yanish-Perron、Gene 33(1985
)103−119)、pBluescript SK−(Stratagene)、pGEM−T(P
romega)、pZerO(Invitrogen)、pBin19(Bevanら、Nucl.Acids Re
s.12(1984)、8711−8720)およびpBinAR(HofgenおよびWillmitzer、Pl
ant Science 66(1990)、221−230)を利用することができる。
【0046】2.アグロバクテリウムの形質転換 アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換は、HofgenおよびWillmitz
erの方法(Nucl.Acid Res.(1988)16、9877)に従って行った。アグロバクテリ
ウムの培養はYEB培地で行った(Vervlietら、J.Gen.Virol.(1975)26、33)
【0047】3.組換えDNAの配列決定分析 組換えDNA分子の配列決定はLicor社のレーザ蛍光DNAシークエンサー(
発売元MWG Biotech., Ebersbach)によりSangerの方法(Sangerら、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 74(1977)、5463−5467)で行った。
【0048】4.センス方向性のAATP1を有する植物形質転換ベクターの構築 植物の形質転換用のベクターの構築のために、シロイヌナズナ(Arabidopsis t
haliana)のAATP1−cDNAの2230bp長のEcoRV/BamHI断
片(シロイヌナズナ由来のAATP1のクローニングが、Kampfenkelら、FEBS L
etters 374(1955)、351−355およびNeuhausら、The Plant Journal 11:73
−82に記載されている)を、SmaI/EcoRVおよびBamHIで切断したベ
クターpBinAR(HofgenおよびWillmitzer、Plant Science 66(1990)、
223−230)に連結する。cDNA断片の挿入によってカリフラワーモザイクウイ
ルスの35Sプロモーター(540bp)およびシロイヌナズナのADP/AT
P輸送体1(AATP1)のタンパク質コード領域を含む遺伝子構築物が生じる
。cDNA断片はセンス方向性でpBinARの35Sプロモーターと融合され
る。挿入されたAATP1断片の3'方向にアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスのオクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナル(215bp)が
続く。
【0049】 プラスミドpBinAR−AATP1(図3)の全体の大きさは、約14.2
kbである。
【0050】5.ジャガイモ植物のゲノムへのプラスミドpBINAR−ATTP1の挿入
Rocha-Sosaら(EMBO J. 8(1989)、23−29)が述べるように、アグロバクテリ
ウム・ツメファシエンスによってプラスミドをジャガイモ植物に導入する。形質
転換の陽性対照として、色素体ADP/ATP輸送体1のmRNAレベルが増加
したトランスジェニックジャガイモ植物が役割を果たした。検出は、ノーザンブ
ロッティング分析によって行われる。この目的のために標準プロトコルに従って
ジャガイモの葉および塊茎組織からRNAを単離する。アガロースゲル(1.5
%アガロース、1×MENバッファー、16.6%ホルムアルデヒド)上で50
μgのRNAを分離する。電気泳動の後、20×SSCを使ってキャピラリーブ
ロッティングによりRNAをHybond Nナイロン膜(Amersham、UK)に転写する。紫
外線照射によりRNAを膜に固定し、膜をリン酸ハイブリダイゼーションバッフ
ァー(Sambrookら、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press:ISBN 0
−87969−309−6)中で2時間予備ハイブリダイズし、続いて放射性標
識プローブを加えて10時間ハイブリダイズする。
【0051】6.アンチセンス方向性のAATP1を有する植物形質転換ベクターの構築 植物形質転換用のベクターの構築のために、ジャガイモ(S. tuberosum)のAA
TP1 cDNAのコード領域(Tjadenら、1998、The Plant Journal 16:531−
540所載のジャガイモのAATP1のクローニングの説明)に由来する1265
bp長のBamH/Ndel断片(そのNdeI切断部位はT4ポリメラーゼに
より平滑末端となる)を、SmaIおよびBamHIで切断されたベクターpBi
nAR(HofgenおよびWillmitzer、Plant Science 66(1990)、221−230)に連
結する。NdeI切断部位は、AATP1 cDNAに位置し、BamHI切断部
位は、ベクターpTM1に由来する(Tjadenら、1998、The Plant Journal 16
:531−540)。cDNA断片の挿入によって、カリフラワーモザイクウイルスの
35Sプロモーター(540bp)およびアンチセンス方向性でジャガイモ由来
のADP/ATP輸送体1(AATP1S.t.)の1265bp長の領域を含
む遺伝子構築物が生じる。断片をpBinARの35Sプロモーターに融合した
。挿入されたAATP1断片の3'方向にアグロバクテリウム・ツメファシエン
スのオクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナル(215bp)が続
く。
【0052】 プラスミドpBIN AR−AS−AATP1(図4)の全体の大きさは、約
13.3kbである。
【0053】7.ジャガイモ植物のゲノムへのプラスミドpBINAR−ASAATP1の導 プラスミドの導入は、5項で述べた手順と同様に行う。
【0054】 形質転換の結果、トランスジェニックジャガイモ植物は、色素体ADP/AT
P輸送体のmRNAレベルの減少を示した。これはノーザンブロット分析により
検出される。この目的のために標準プロトコルに従ってジャガイモの葉および塊
茎組織からRNAを単離する。50μgのRNAをアガロースゲル(1.5%ア
ガロース、1×MENバッファー、16.6%ホルムアルデヒド)上で分離した
。電気泳動の後、20×SSCを使ってキャピラリーブロッティングによりRN
AをHybond Nナイロン膜(Amersham、UK)に転写した。紫外線照射によりRNA
を膜に固定する。膜をリン酸ハイブリダイゼーションバッファー(Sambrookら、
前掲)で2時間予備ハイブリダイズし、続いて放射性標識プローブを加えて10
時間ハイブリダイズする。
【0055】8.アミノ酸分析 アミノ酸(プロリンを除く)をエタノール抽出物のHPLC分離により測定し
た(Geigenbergerら、1996、Plant Cell & Environ、19:43−55の方法)。
【0056】8.1 エタノール抽出物の調製 それぞれ2個のジャガイモスライス(合計約0.2gの生鮮重量)を順次続く
2つのステップ(それぞれ7mlの80%(v/v)エタノールおよび7mlの
50%エタノールを用いる)で80℃で30分間抽出する。全抽出物(容積約1
4ml)をアミノ酸分析のために使用する。
【0057】8.2 HPLCによるアミノ酸含有量の決定 アミノ酸の検出は、o−フタルジアルデヒド(OPA)で第1級アミノ基の予
備カラム誘導体化の後に蛍光定量法で行った。この目的のためにインジェクター
(Autosampler 465、Kontron、Eching)により、4℃でメタノール中5%(g/
v)のOPA、0.8Mのホウ酸バッファー(KOHを用いてpH10.4)お
よび3−メルカプトプロピオン酸の混合物(10:90:1;v:v:v)から
なる35μlのOPA試薬を35μlの抽出物に注入する。108秒後に20μ
lの誘導体化サンプルを注入した。
【0058】 移動相Aは、1000mlの12mMリン酸ナトリウム(pH6.8)と1.
6mlのテトラヒドロフランとの混合物である。移動相Bは、250mlの12
mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、175mlのメタノールおよび110m
lのアセトニトリルの混合物からなる。分離条件は次のとおりである。0―2分
、0%Bのアイソクラチック相、2―11分、0%Bから10%Bへの直線勾配
、11―17分、10%B、17―27分、10%Bから50%Bへの直線勾配
、27―38分、50%Bから60%Bへの直線勾配、38―44分、60%B
から100%Bへの直線勾配、44―46分、100%B、46―48分、10
0%Bから0%Bへ、48―60分、0%B。分離のためにHypersil ODSカ
ラム(粒度3μm、長さ150mm、直径4.6mm、Knauer GmbH、Berlin)
を使用する。蛍光計(SFM25、Kontron、Eching)によって検出された信号
(励起波長=330nm、放出波長=450nm)をデータ処理システム450
−MT(Kontron、Eching)によって積分し、評価する。
【0059】8.3 プロリン含有量の決定 プロリン含有量の決定はBatesら、1973、Plant Soil 39 :205−207によって
行う。
【0060】 200μlの抽出物に、6M H3PO42部と75%酢酸3部との混合物500μ
lおよび500μlのニンヒドリン溶液(75%酢酸20mlにつき600mg
)を加える。95〜100℃で45分インキュベーションした後、試験混合物を
氷上に置き、300μlのトルエンを混合する。相分離を行った後、上側の相を
マイクロキュベットに移して、515nmで光学密度を測定する。校正プロット
(1−50μMプロリン)と比較してプロリン含有量を決定する。
【0061】
【表1】 ジャガイモの野生型およびセンス方向性(Sense−98およびSense−
62)またはアンチセンス方向性(Antis−594およびAntis−59
5)のATP/ADP輸送体遺伝子を含む形質転換したジャガイモ植物のアミノ
酸含有量の概要
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、葉緑体ATP/ADP輸送体1のコード領域に対応するシロイヌナズ
ナcDNA(EMBL登録番号Z49227)を示す。
【図2】 図2は、葉緑体ATP/ADP輸送体1のコード領域に対応するジャガイモc
DNA(EMBL登録番号Y10821)を示す。
【図3】 図3は、センス方向性のATP/ADP輸送体の発現のための植物形質転換ベ
クターpBIN−AR−AATP1を示す。
【図4】 図4は、アンチセンス方向性のATP/ADP輸送体の発現のための植物形質
転換ベクターpBIN−AR−AATP1−ASを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG ,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD, RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT, AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,C A,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM ,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH, GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,K E,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS ,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN, MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,RO,R U,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM ,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN, YU,ZA,ZW (72)発明者 ノイハウス,ホルスト−エッカーハルド ドイツ連邦共和国 67659 カイザースラ イテル ン イム ブラウメンストュック 13 (72)発明者 グレーフェ−カンプフェンケル,カールハ インツ ドイツ連邦共和国 ディー−55246 マイ ンツ− コストハイム イム サムペル 10アー (72)発明者 メールマン,トルステン ドイツ連邦共和国 ディー−32257 ビュ ーンデ ゲレルシュトラーセ 17 (72)発明者 チャデン,ヨアヒム ドイツ連邦共和国 67661 カイザースラ イテル ン ランバッハシュトラーセ 16 Fターム(参考) 2B030 AD08 CA15 CA17 CA19 2B150 AA01 DA44 DD31 4B024 AA08 BA71 CA04 DA01 EA04 FA02 4B065 AA88 AB01 BA02 CA17 CA53

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 1種以上のアミノ酸の量が、対応する形質転換されていない
    植物に比べて同時に改変されるように、ATP/ADP輸送体遺伝子の制御配列および/
    または遺伝子コピー数が改変されていることを特徴とする、形質転換植物および
    その子孫。
  2. 【請求項2】 葉緑体包膜へのATP輸送能が増加していることを特徴とする
    、請求項1に記載の形質転換植物およびその子孫。
  3. 【請求項3】 主として1種以上の必須アミノ酸の量が改変されていること
    を特徴とする、請求項1または2に記載の形質転換植物およびその子孫。
  4. 【請求項4】 1種以上の必須アミノ酸の含量が、形質転換されていない植
    物に比べて増加していることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載
    の形質転換植物およびその子孫。
  5. 【請求項5】 有用植物であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか
    1項に記載の形質転換植物およびその子孫。
  6. 【請求項6】 図1に示すアミノ酸配列をコードするシロイヌナズナ(Arab
    idopsis thaliana)のヌクレオチド配列(EMBL登録番号Z49227)を有
    する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の植物において使用するためのATP/ADP
    輸送体遺伝子。
  7. 【請求項7】 実質的に同様な作用を有する天然ヌクレオチド配列、化学合
    成ヌクレオチド配列、改変ヌクレオチド配列もしくは人工的ヌクレオチド配列、
    またはATP/ADP輸送体をコードする異種ヌクレオチド配列もしくはその対立遺伝
    子変異型もしくはアイソフォーム、あるいははこれらの混合物を含有する、請求
    項6に記載のATP/ADP輸送体遺伝子。
  8. 【請求項8】 機能し得る形で連結された制御ヌクレオチド配列を有する請
    求項6または7に記載のATP/ADP輸送体遺伝子。
  9. 【請求項9】 その上流に機能し得る形で連結されたプロモーターを含んで
    いる、請求項6〜8のいずれか1項に記載のATP/ADP輸送体遺伝子。
  10. 【請求項10】 請求項6〜9のいずれか1項に記載のATP/ADP輸送体遺伝子
    と、該遺伝子に機能し得る形で連結された制御配列とを含有する遺伝子構造物。
  11. 【請求項11】 請求項6〜9のいずれか1項に記載のATP/ADP輸送体遺伝
    子または請求項10に記載の遺伝子構造物を含むベクター。
  12. 【請求項12】 プロモーター、ターミネーターまたは翻訳エンハンサーか
    らなる群より選択され得るさらなる制御ヌクレオチド配列、および適当な宿主細
    胞での複製またはそのゲノムへの組込みのためのヌクレオチド配列を含む、請求
    項11に記載のベクター。
  13. 【請求項13】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の植物の種子。
  14. 【請求項14】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の植物に由来する組織
    または細胞または繁殖可能な材料。
  15. 【請求項15】 請求項1〜5のいずれか1項に記載のアミノ酸含量が増加
    している植物を作製する方法であって、請求項6〜9のいずれか1項に記載のATP
    /ADP輸送体遺伝子または請求項10に記載の遺伝子構造物または請求項11もし
    くは12に記載のベクターを遺伝子工学的方法で転移させることを特徴とする、
    上記方法。
  16. 【請求項16】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の形質転換植物の有用
    植物または飼料植物としての使用。
  17. 【請求項17】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の形質転換植物、その
    組織、細胞またはその抽出物の、農業、飼料製造業もしくは製薬業の分野または
    保健分野での使用。
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