KR20160051447A - 활성 피타제를 생산하는 형질전환 부평초 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 유래 피타제(phytase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는 피타제 단백질 생산 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 피타제 단백질을 생산하는 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 형질전환 식물체를 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다.

Description

활성 피타제를 생산하는 형질전환 부평초 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic Spirodela polyrrhiza plant producing active phytase and the plant thereof}

본 발명은 활성 피타제를 생산하는 형질전환 부평초 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 유래 피타제(phytase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는 피타제 단백질 생산 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 피타제 단백질을 생산하는 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 형질전환 식물체를 포함하는 사료 조성물, 상기 피타제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 형질전환된 식물체로부터 피타제 단백질을 발현시키고 상기 발현된 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 재조합 피타제 단백질의 생산 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 재조합 피타제 단백질에 관한 것이다.

2007년 초부터 세계적 곡물공급 부족으로 인해 초래된 애그플레이션(agflation)은 한국을 비롯한 세계 각국의 식량, 식료품 및 사료 등의 가격 상승을 연계적으로 촉발시켜 당시 세계 경제에 인플레이션 압력을 고조시킨 바가 있다. 2010년 하반기 들어 옥수수와 소맥을 비롯한 각종 곡물값이 큰 폭으로 상승하였고, 국내 도착가격 기준으로 2010년 7월 초 1t당 225달러에 머물렀던 옥수수 값은 11월 318달러로 상승하였고, 소맥과 콩도 197달러와 368달러에서 각각 313달러, 483달러로 상승하였다. 이렇듯, 곡물 가격이 상승함에 따라 축산농가는 비싼 가격에 사료를 구입해야 하고, 그나마 물량확보에 어려움으로 인해 이중고에 시달리고 있으며 이로 인해 축산소득 역시 감소하는 악순환이 지속되고 있다.

최근 축산폐수로 인한 환경 및 수질오염 문제는 상수도원뿐만 아니라, 청정 해역 연안까지 오염의 수위를 높여가고 있다. 이러한 오염원 가운데 특히 인(phosphorus)은 동물에 필수적인 영양소이지만, 곡물사료에 존재하는 인의 대부분은 가축이 이용할 수 없는 형태로 존재하여, 곡물사료 내 인은 동물 체내에서 흡수되지 않고 배설되어 환경오염의 주원인이 되고 있으며, 축산농가는 고가의 무기인을 사료에 따로 첨가하고 있는 실정이다.

피타제(phytase)는 피틴산(phytic acid; phytate) 형태의 무기인을 분해하는 효소로, 단위동물의 사료에 피타제를 첨가하면, 가축의 인 흡수율을 높일 뿐 아니라 배설되는 인의 함량도 줄이게 되어 환경보호에 이점이 있다.

현재 효소 세계 시장은 24억달러 이상 규모로 추정 되며 이중 테크니컬 효소(technical enzyme) 분야는 12억달러, 식품첨가제 분야는 8억달러, 동물 사료 분야는 2억달러에 이르는 것으로 추산된다. 특히 동물 사료첨가 분야에서 피타제는 5억 달러(한국은 약 120 내지 150억원/년)의 경제적 가치가 있는 것으로 알려져 있고, 국제적으로 그 가치는 매년 5% 정도씩 증가하고 있다. 세계시장규모가 정확히 조사된 바는 없으나, 유럽의 일부 국가와 미국의 일부 주에서는 현재 피타제를 첨가하지 않은 사료에 한해서는 판매를 규제하는 등 각국의 환경규제가 강화되고 있어 피타제 관련 시장이 상당히 확대될 것으로 전망되고 있으며, 업계에서는 미국의 경우 매년 돼지 사료로는 5,127만 7,600톤을, 닭의 사료로는 4,528만 9,000톤이 생산되기 때문에 의무적으로 피타제를 사료에 첨가할 경우 시장규모가 상당할 것으로 예상되고 있다. 총액 2조 7,000억원에 해당하는 국내 사료시장 환경을 고려할 때 피타제가 상용화 될 경우 국내 수요량 역시 클 것으로 전망된다.

피타제 효소 분리 및 특성에 대한 연구는 주로 세균, 효모, 진균 유래 효소를 중심으로 1990년대 후반부터 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 대량생산을 위한 시스템 구축에 관한 연구로는 미생물의 경우 대장균과 바실러스균, 칸디다(Candida)균, 효모균, 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) 균에 대해 연구가 이루어졌다. 현재 국제적으로 유용 단백질의 대량생산에 많이 이용되는 시스템은 효모를 이용한 발현 시스템이다.

진균 유래 피타제는 유전, 생화학, 생리적으로 그 특성이 매우 다양하며 여러 환경으로의 적용이 가능하기 때문에 효소의 대량 생산에 있어 매우 안정한 시스템을 구축할 수 있는 장점을 지니고 있으나, 여러 환경에서 분리되는 다양한 진균을 고려할 때 지금까지 연구 보고된 진균 유래 피타제 발현은 아직까지 2-3종에 국한되어 있는 실정이다.

이에 본 발명에서는 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 유래 피타제를 안정적으로 생산하는 부평초 식물체를 개발코자 하였다.

한편, 한국공개특허 제2014-0072503호에는 '피타아제를 대량 생산하는 신규한 락토바실러스 사케이 Wikim001 균주 및 이를 이용한 발효현미 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0754242호에는 '효모 유래 프로모터를 이용한 대장균 유래 파이타제의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 활성 피타제를 생산하는 형질전환 부평초 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 아스퍼질러스 니둘란스 유래 피타제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 부평초 식물체를 형질전환하여 피타제 단백질을 생산하는 형질전환 식물체를 제작하였고, 형질전환 부평초 식물체의 건조분말을 비형질전환 부평초 식물체의 건조분말과 비교하여 피틴산 가수분해 능력을 비교한 결과, 형질전환 부평초의 건조분말에서 피타제 활성이 높게 측정되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 유래 피타제(phytase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는 피타제 단백질 생산 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 피타제 단백질을 생산하는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체를 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 피타제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 형질전환된 식물체로부터 피타제 단백질을 발현시키고 상기 발현된 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 재조합 피타제 단백질의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 피타제 단백질을 제공한다.

본 발명의 피타제(phytase) 단백질을 생산하는 부평초 또는 상기 부평초로부터 분리 및 정제한 재조합 피타제 단백질을 사료로 이용할 경우, 미생물 유래 피타제보다 생산가가 경제적이며, 대규모 수입 첨가제를 대체할 수 있어 축산산업분야 발전에 기여할 수 있으며, 피타제 활성 극대화를 통해 축산분뇨의 토양오염 및 수질오염 최소화에도 기여할 수 있다.

도 1은 부평초 애월 라인의 캘러스 유도와 재분화 과정이다.
도 2는 본 발명에 사용된 부평초 핵 형질전환용 IG2PHY 벡터의 모식도이다.
도 3은 PCR을 통한 부평초 형질전환 라인들의 도입 유전자 확인 결과이다.
도 4는 GUS 염색을 통한 부평초 형질전환 라인들의 도입 유전자 확인 결과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명에서 사용한 피타제 효소 활성 측정방법의 순서도이다.
도 6은 건조된 형질전환 부평초의 피타제 활성을 측정한 결과이다. wt, 야생형(비형질전환) 부평초; 3i2-2, 3i6 및 3i9, 공벡터가 도입된 라인들; 4p1~6px39, 피타제 도입된 라인들; tr/wt, 형질전환체 A595/야생형 A595 값.
도 7은 비건조된 형질전환 부평초의 피타제 활성을 측정한 결과이다. wt, 야생형(비형질전환) 부평초; 3i2-2, 3i6 및 3i9, 공벡터가 도입된 라인들; 4p1~6px39, 피타제 도입된 라인들; tr/wt, 형질전환체 A595/야생형 A595 값.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 유래 피타제(phytase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환된 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는 피타제 단백질 생산 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 피타제 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 피타제 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 피타제 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

피타제 단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 포스피노트리신(phosphinothricin) 또는 글리포세이트(glyphosate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 유비퀴틴, CaMV 35S, 액틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 지속적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 지속적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 피타제 단백질을 생산하는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 부평초(개구리밥) 또는 좀개구리밥 등의 개구리밥과 (Lemnaceae) 식물일 수 있고, 바람직하게는 부평초일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 피타제 단백질을 생산하는 형질전환 식물체를 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 형질전환 부평초 식물체를 포함하는 '사료 조성물'은 일반적인 사료 첨가제로서의 용도와 상응하며, 다만 상기 형질전환 부평초 식물체는 피타제를 생산하여 함유하고 있는 것을 의미한다.

본 발명의 사료 조성물은 다른 사료 및 사료첨가제와 일정부분 혼합하여 동물에 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 유래 피타제(phytase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 형질전환된 식물체로부터 피타제 단백질을 발현시키는 단계; 및

상기 발현된 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 재조합 피타제 단백질의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환된 식물체로부터 피타제 단백질의 분리 및 정제는 통상의 방법을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피 (예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별 용해 (예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하는 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 생산된 재조합 피타제 단백질을 제공한다. 본 발명의 재조합 피타제 단백질은 피틴산을 가수분해하는 활성을 가진 효소이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물체 준비

피타제(phytase) 형질전환을 위해 사용한 부평초 6종은, 대전에서 수집한 2종(대전 라인, Dajeon line)과 제주도 애월지역에서 1종(애월 라인, Aewol line), 용수지역에서 1종(용수 라인, Yongsoo line) 및 하가지역에서 수집한 2종을 사용하였다.

캘러스 형성능 및 재분화능 실험

부평초의 캘러스 유도와 재분화를 위하여 J.Li 등(J.Li et al., 2004, Plant Cell Reports, 22: 457-464)이 발표한 논문을 참고하였다. 배지조성1(전처리 배지: WP 배지 + 1.5% 갈락토스 + 50mg/L 디캄바 + 2mg/L BA, 캘러스 성장 배지: WP 배지 + 2% 소르비톨 + 1% 말토오스 + 5mg/L PCA + 2mg/L 2iP), 배지조성 2(캘러스 유도 배지: 1/2MS salt + B5 비타민 + 1% 소르비톨 + 3.5mg/L 2,4-D + 15mg/L 디캄바 + 2mg/L 2iP, 캘러스 생장 배지: WP 배지 + 1% 소르비톨 + 1mg/L 2,4-D + 5mg/L NAA + 0.5mg/L TDZ)에서 연녹색, 연노란색의 캘러스가 유도되는 것을 관찰할 수 있었다. 재분화 배지의 결정을 위하여 3종류의 배지에 배지조성1, 2에서 형성된 캘러스를 치상하고 관찰하였다. 배지조성1(WP 배지 + 0.5% 수크로스 + 1mg/L TDZ)에서는 엽상체가, 배지조성2(WP 배지 + 0.5% 수크로스 + 1% 소르비톨 + 1mg/L 2iP)에서는 뿌리가 주로 유도되어 배지조성1을 재분화 배지로 결정하였다. 최종적으로 딸엽상체를 제거한 모엽상체를 캘러스 유도 배지(1/2MS salt + B5 비타민 + 1% 소르비톨 + 3.5mg/L 2,4-D + 15mg/L 디캄바 + 2mg/L 2iP)에 치상하여 2주에 한번 계대배양하여 6~7주간 유지하였으며, 캘러스 성장배지(1/2MS salt + B5 비타민 + 1% 소르비톨 + 3.5mg/L 2,4-D + 15mg/L 디캄바 + 2mg/L 2iP, 캘러스 성장 배지 : WP 배지 + 1% 소르비톨 + 1mg/L 2,4-D + 5mg/L NAA + 0.5mg/L TDZ)로 옮겨 캘러스를 배양하였다. 계대배양 주기는 2주에 1회로 하였으며 계대배양 시 포셉으로 쉽게 떨어져 나오는 캘러스 덩어리는 분리하여 배지에 치상하거나 형질전환에 사용하였다. 캘러스 성장 배지에서 4회 이상 계대배양된 조직은 노화하여 캘러스 형성능이 떨어질 뿐만 아니라 캘러스 또한 노화하여 성장이 불량하였다. 노화된 캘러스는 재분화능력 또한 떨어지기 때문에 주기적으로 캘러스를 유도하여 실험에 사용하였다.

식물체의 형질전환용 벡터 제작 및 형질전환

부평초 핵 형질전환을 위한 벡터를 제작하기 위하여 배재대학교에서 분양받은 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 유래 피타제 유전자를 IG2 벡터에 도입하여 핵 형질전환용 벡터 IG2PHY를 완성하였다(도 2). IG2PHY 벡터는 형질전환세포의 선발마커로 제초제저항성 유전자인 포스피노트리신(PPT, phosphinothricin) 유전자를 가지고 있으며, 목표유전자의 발현조절 프로모터는 유비퀴틴 프로모터를 포함하고 있다.

애월 라인의 캘러스를 이용한 부평초 형질전환은 Vunsh 등(Vunsh et al., 2007, Plant Cell Reports, 26: 1511-1519)이 보고한 형질전환법을 일부 수정하여 수행하였다. 우선, 아그로박테리움의 감염효율을 높이기 위하여, 유전자총(particle bombardment)을 사용하여 DNA를 코팅하지 않은 금 입자(gold particle)로 캘러스에 상처를 낸 후, IG2PHY 벡터를 가진 아그로박테리움 EHA105 균주로 접종하였다. CG 배지(캘러스 성장 배지: 2% 소르비톨, 1mg/L 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 5mg/L α-나프탈렌아세트산(NAA) 및 0.5mg/L 티디아주론(TDZ)을 포함하는 WP 배지)에서 3일간 공존 배양 후, 5mg/L PPT 및 300mg/L 세포탁심이 첨가된 FR 배지(엽상체 재생 배지: 0.5% 수크로스 및 1mg/L TDZ를 포함하는 WP 배지)에서 2주 간격으로 배지를 교환하면서 수 개월간 배양하였다. 재분화되어 생긴 엽상체를 5mg/L PPT가 첨가된 액체 WP 1% 수크로스 배지에 현탁배양하여 증식시켰다.

PCR 분석 및 GUS 염색

PPT에 대하여 내성을 나타내는 개체의 게놈에 T-DNA의 삽입을 확인하기 위하여 Chelex100을 이용한 간이 genomic PCR을 수행하였다. PCR 주형은 genomic DNA 추출과정 없이 2~3개의 엽상체에 200㎕ 5% Chelex100을 넣고 플라스틱 페슬로 조직을 으깬 후 5분간 가열하고 원심분리한 상층액을 사용하였다. 목적유전자는 T-DNA상의 Phytase, GUS 유전자를 사용하였고, PCR 양성 대조구로서 18s ribosomal RNA 유전자를 사용하여 PCR을 통해 증폭한 후 전기영동하여 유전자 도입 여부를 확인하였다. 각 프라이머의 염기서열은 phyS 5'-ACGGAACCGAGCTGTCTC-3'(서열번호 3), phyAS 5'-TTATAGGGTAAAACAAGTCTTCCAG-3'(서열번호 4), gusS 5'-ACGGCCTGTGGGCATTCAGT-3'(서열번호 5), gusAS 5'-GTGGTGTAGAGCATTACGCT-3'(서열번호 6), 18SS 5'-ATGATAACTCGACGGATCGC-3'(서열번호 7), 18SAS 5'-CCTCCAATGGATCCTCGTTA-3'(서열번호 8)이고 반응당 10pmol로 희석한 프라이머를 0.5㎕ 씩 넣어서 사용하였다.

리포터 유전자인 GUS 유전자의 발현 분석을 통하여 유전자의 도입과 안정적인 발현에 대하여 확인하여 보고자 모든 라인에 대하여 GUS 염색을 실시하였다. 식물체를 GUS 염색시약(100mM Na-P, 5mM Potassium ferricyanide, 5mM Potassium ferrocyanide, 0.5% tritonX-100, 10mM EDTA(pH8.0), DMSO, 0.1% X-glu, 20% MeOH)에 잠기도록 한 후 37℃에서 16시간 이상 반응시키고 70% 에탄올로 클로로필을 제거한 후 염색패턴을 관찰하였다.

피타제 효소활성 분석

형질전환 부평초에서의 피타제 효소활성을 분석하기 위해서, 55℃에서 3일 이상 건조된 부평초를 막자사발을 이용하여 곱게 분쇄하고 SensoLyte MG Phosphate assay kit(ANASPEC, 미국)를 이용하여 피타제 활성을 측정하였다. 간단하게, 형질전환 부평초 식물체 및 비형질전환(야생형) 부평초 식물체의 건조 분말에서 단백질을 조추출하고 기질을 처리한 후, 595nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 발명의 피타제 활성 측정 방법은 도 5에 상세히 설명되어 있다.

실시예 1. 재분화 능력이 우수한 부평초의 선발

형질전환 효율에 결정적인 영향을 미치는 재분화 능력이 탁월한 부평초를 확보하기 위하여, 기내 배양중의 총 6종의 부평초를, 재분화 배지 조성으로 캘러스 형성능 및 개체로의 재분화능을 조사하였다.

그 결과, 6종 중 애월 라인이 PT 배지(전처리 배지: 1.5% 갈락토스, 50mg/L 디캄바(디캄바) 및 2mg/L BA를 포함하는 WP 배지)에서 2주 배양 후 CI(캘러스 유도) 및 CG 배지에서 수 주간 배양하는 경우와 CI배지(비타민 B5, 1% 소르비톨, 3.5mg/L 2,4-D, 15mg/L 디캄바, 1mg/L 2iP를 포함하는 1/2 MS 배지)에서 6~7주 배양한 후 CG 배지로 옮겨 배양하는 2가지 경우에서 유사한 정도로 캘러스를 형성하였다. 대전 라인에서도 캘러스와 유사한 조직 덩어리를 형성하였으나 조직이 매우 치밀하고 단단하며 증식하지도 않고 재분화 또한 되지 않아 실험에 사용하지 않았다.

캘러스는 딸 엽상체가 생기는 부위에서 형성되는데, 애월 라인의 경우 흰색의 불투명한 도자기색을 띄며, 엽상체로부터 캘러스를 분리하여 CG 배지에서 배양할 때 재분화 또는 노화됨에 따라 연녹색, 진녹색 과정을 거쳐 녹기가 짙어졌다. CG 배지에서 약 2주 배양되면 점차적으로 녹기가 짙어지며 노화 또는 재분화가 진행되므로 이후의 실험에는 분리 후 3주 이내의 건강한 캘러스를 이용하였고 실험에 필요한 캘러스를 얻기 위하여 주기적으로 엽상체로부터 캘러스를 유도하였다(도 1). 애월 라인에서 유도된 캘러스를 재분화 시키기 위하여 두 가지의 FR 배지를 비교하였는데, WP 배지에 0.5% 수크로스 및 1mg/L TDZ가 첨가된 경우가 WP 배지에 0.5% 수크로스, 1% 소르비톨, 1mg/L 2iP를 첨가하였을 때보다 엽상체를 많이 형성하였다. 후자의 경우 엽상체보다는 뿌리가 풍성히 유도되어 자라는 것이 관찰되었다.

실시예 2. 형질전환 부평초 식물체의 확인

형질전환한 애월 라인에 대하여 5% chelex를 이용한 간이 PCR 방법으로 피타제 유전자와 GUS 유전자를 증폭하여 형질전환 여부를 확인하였다. 그 결과, 형질전환체 10-1, 10-2, 16, 24, 25번을 제외한 애월 라인 대부분의 형질전환체에서 피타제 유전자의 도입이 확인되었다(도 3).

또한, 리포터 유전자인 GUS 유전자의 발현 분석을 통하여 유전자의 도입과 안정적인 발현에 대하여 확인하여 보고자 애월 라인에 대하여 GUS 염색을 실시하였는데, 각 라인별로 다양한 발현 패턴을 나타내었으며 하나의 라인 내에도 발현패턴이 다르게 나타나는 라인도 있었다(도 4). 모엽상체에 붙어있는 딸엽상체에서만 발현이 관찰되는 패턴이 다수의 라인에서 관찰되었으며, 전체에서 GUS 발현이 확인되는 엽상체와 GUS 발현이 전혀 확인되지 않는 엽상체가 혼합되어 있는 라인도 있었다.

실시예 3. 형질전환 부평초에서의 피타제 효소활성 검정

형질전환 부평초에서의 피타제 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 형질전환체의 A595값을 비형질전환체(WT)의 흡광도 값과 비교하면, 공벡터가 도입된 라인들(3i2-2, 3i6 및 3i9)은 37℃에서 평균 1.1배 높았으며 55℃에서는 거의 유사하게 확인되었다. 한편, 피타제 유전자가 도입된 형질전환 라인들은 37℃ 및 55℃에서 비형질전환체 보다 평균 1.4배 높은 값을 나타내었다(도 6). 10개의 독립라인이 두 반응온도 모두에서 비형질전환체에 비해 2배 이상 높은 효소 활성을 나타내었고 55℃에서는 약 3배 이상 효소 활성이 높은 라인도 관찰되었다(도 6).

본 발명에서 건조샘플을 이용하여 효소의 활성을 확인한 이유는 사료로 실용화할 때 건조된 부평초가 비건조 상태보다 보관과 취급이 용이하기 때문이다. 그러나 실험조건(55℃ 건조)에서 건조 상태에 따라서 결과가 크게 달라져 비건조 샘플의 효소 활성을 추가로 측정하였다. 비건조 샘플은 액체 질소를 이용하여 곱게 마쇄하였으며 샘플 1㎎ 당 단백질 조추출 용액을 5㎕ 넣어 볼텍싱하여 현탁하였다. 이후의 과정은 건조샘플과 동일하게 하였다.

건조되지 않은 부평초로 실험한 결과, 공벡터가 도입된 라인들(3i2-2, 3i6 및 3i9)은 비형질전환체(WT)와 다르지 않았으나 피타제가 도입된 형질전환 라인은 비형질전환체에 비해 37℃에서는 평균 2.0배, 55℃에서는 평균 1.5배 높은 활성을 나타내었다(도 7). 대부분의 라인이 37℃에서 더 높은 활성을 나타내었고 37℃에서는 21개 라인이 2배 이상의 활성을 나타내었으나 55℃에서는 그 수가 크게 줄어 9개의 라인에서만 비형질전환체에 비해 2배 이상의 활성을 유지하였다. 활성이 가장 높게 나온 라인은 반응온도 37℃에서 약 4.1배 높은 피타제 효소 활성을 나타내었다(도 7).

<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for producing transgenic Spirodela polyrrhiza plant producing active phytase and the plant thereof <130> PN14333 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1392 <212> DNA <213> Aspergillus nidulans <400> 1 atggcttttt tcacggtcgc tctttcgctt tattacttgc tatcgagagt ctctactcag 60 gccccagtgg tccagaatca ttcatgcaat acggcggacg gtggatatca atgcttcccc 120 aatgtctctc atgtttgggg tcagtactcg ccgtacttct ccatcgagca ggagtcagct 180 atctctgagg acgtgcctca tggctgtgag gttacctttg tgcaggtgct ctcgcggcat 240 ggggctaggt atccgacaga gtcgaagagt aaggcgtact cggggttgat tgaagcaatc 300 cagaagaatg ctacctcttt ttggggacag tatgcttttc tggagagtta taactatacc 360 ctcggcgcgg atgacttgac tatcttcggc gagaaccaga tggttgattc gggtgccaag 420 ttctaccgac ggtataagaa tctcgccagg aaaaatactc cttttatccg tgcatcaggg 480 tctgaccgtg tcgttgcgtc tgcggagaag ttcattaatg gatttcgcaa ggctcagctc 540 cacgaccatg gctccaaacg tgctacgcca gttgtcaatg tgattatccc tgaaatcgat 600 gggtttaaca acaccctgga ccatagcacg tgcgtatctt ttgagaatga tgagcgggcg 660 gatgaaattg aagccaattt cacggcaatt atgggacctc cgatccgcaa acgtctggaa 720 aatgacctcc ctggcatcaa acttacaaac gagaatgtaa tatatttgat ggatatgtgc 780 tctttcgaca ccatggcgcg caccgcccac ggaaccgagc tgtctccatt ttgtgccatc 840 ttcactgaaa aggagtggct gcagtacgac taccttcaat ctctatcaaa gtactacggc 900 tacggtgccg gaagccccct tggcccagct cagggaattg gcttcaccaa cgagctgatt 960 gcccgactaa cgcaatcgcc cgtccaggac aacacaagca ccaaccacac tctagactcg 1020 aacccagcca catttccgct cgacaggaag ctctacgccg acttctccca cgacaatagc 1080 atgatatcga tattcttcgc catgggtctg tacaacggca cccagccgct gtcaatggat 1140 tccgtggagt cgatccagga gatggacggt tacgcggcgt cttggactgt tccgtttggt 1200 gcgagggctt actttgagct catgcagtgc gagaagaagg agccgcttgt gcgggtatta 1260 gtgaatgatc gcgttgttcc tcttcatggc tgcgcagttg acaagtttgg acggtgcact 1320 ttggacgatt gggtagaggg cttgaatttt gcaaggagcg gcgggaactg gaagacttgt 1380 tttaccctat aa 1392 <210> 2 <211> 463 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 2 Met Ala Phe Phe Thr Val Ala Leu Ser Leu Tyr Tyr Leu Leu Ser Arg 1 5 10 15 Val Ser Thr Gln Ala Pro Val Val Gln Asn His Ser Cys Asn Thr Ala 20 25 30 Asp Gly Gly Tyr Gln Cys Phe Pro Asn Val Ser His Val Trp Gly Gln 35 40 45 Tyr Ser Pro Tyr Phe Ser Ile Glu Gln Glu Ser Ala Ile Ser Glu Asp 50 55 60 Val Pro His Gly Cys Glu Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser Arg His 65 70 75 80 Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Glu Ser Lys Ser Lys Ala Tyr Ser Gly Leu 85 90 95 Ile Glu Ala Ile Gln Lys Asn Ala Thr Ser Phe Trp Gly Gln Tyr Ala 100 105 110 Phe Leu Glu Ser Tyr Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Ile 115 120 125 Phe Gly Glu Asn Gln Met Val Asp Ser Gly Ala Lys Phe Tyr Arg Arg 130 135 140 Tyr Lys Asn Leu Ala Arg Lys Asn Thr Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly 145 150 155 160 Ser Asp Arg Val Val Ala Ser Ala Glu Lys Phe Ile Asn Gly Phe Arg 165 170 175 Lys Ala Gln Leu His Asp His Gly Ser Lys Arg Ala Thr Pro Val Val 180 185 190 Asn Val Ile Ile Pro Glu Ile Asp Gly Phe Asn Asn Thr Leu Asp His 195 200 205 Ser Thr Cys Val Ser Phe Glu Asn Asp Glu Arg Ala Asp Glu Ile Glu 210 215 220 Ala Asn Phe Thr Ala Ile Met Gly Pro Pro Ile Arg Lys Arg Leu Glu 225 230 235 240 Asn Asp Leu Pro Gly Ile Lys Leu Thr Asn Glu Asn Val Ile Tyr Leu 245 250 255 Met Asp Met Cys Ser Phe Asp Thr Met Ala Arg Thr Ala His Gly Thr 260 265 270 Glu Leu Ser Pro Phe Cys Ala Ile Phe Thr Glu Lys Glu Trp Leu Gln 275 280 285 Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Ser Lys Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ala Gly 290 295 300 Ser Pro Leu Gly Pro Ala Gln Gly Ile Gly Phe Thr Asn Glu Leu Ile 305 310 315 320 Ala Arg Leu Thr Gln Ser Pro Val Gln Asp Asn Thr Ser Thr Asn His 325 330 335 Thr Leu Asp Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asp Arg Lys Leu Tyr 340 345 350 Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Ser Met Ile Ser Ile Phe Phe Ala Met 355 360 365 Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Gln Pro Leu Ser Met Asp Ser Val Glu Ser 370 375 380 Ile Gln Glu Met Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Gly 385 390 395 400 Ala Arg Ala Tyr Phe Glu Leu Met Gln Cys Glu Lys Lys Glu Pro Leu 405 410 415 Val Arg Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Ala 420 425 430 Val Asp Lys Phe Gly Arg Cys Thr Leu Asp Asp Trp Val Glu Gly Leu 435 440 445 Asn Phe Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Lys Thr Cys Phe Thr Leu 450 455 460 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acggaaccga gctgtctc 18 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttatagggta aaacaagtct tccag 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acggcctgtg ggcattcagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtggtgtaga gcattacgct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atgataactc gacggatcgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cctccaatgg atcctcgtta 20

Claims (10)

1. 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 유래 피타제(phytase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환된 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는 피타제 단백질 생산 식물체의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 피타제 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 피타제 단백질 생산 식물체의 제조 방법.
3. 제1항의 방법에 의해 제조된 피타제 단백질을 생산하는 형질전환 식물체.
4. 제3항에 있어서, 상기 식물체는 부평초(Spirodela polyrrhiza) 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
5. 제3항에 따른 형질전환 식물체의 종자.
6. 제3항의 형질전환 식물체를 포함하는 사료 조성물.
7. 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 유래 피타제(phytase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 형질전환된 식물체로부터 피타제 단백질을 발현시키는 단계; 및
   상기 발현된 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 재조합 피타제 단백질의 생산 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 피타제 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 피타제 단백질의 생산 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 식물체는 부평초(Spirodela polyrrhiza) 식물인 것을 특징으로 하는 재조합 피타제 단백질의 생산 방법.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 재조합 피타제(phytase) 단백질.

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