BR112013016876B1 - método para expressar transientemente uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta inteira intacta de soja - Google Patents

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Abstract

métodos e composições para uma sistema de espressão transiente de soja in-planta a presente invenção refere-se a métodos para expressar transientemente uma sequência de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta de soja, compreendendo: a) abrasar a superfície de uma planta de soja e/ou parte intata dessa; e ainda (b1) imergir a uma planta abrasada e/ou e ou a parte dessa abrasada em uma solução compreendendo células de agrobacterium e um surfatante, em que as células de agrobacterium compreendem a sequência de nucleotídeos a ser expressa transientemente; (b2) aplicar um vácuo à planta de soja e/ou parte intata imersa do passo (b1); e (b3) libertar o vácuo, introduzindo desse modo a solução na planta de soja e/ou na parte intata dessa; ou (c) contatar a planta de soja abrasada e/ou parte dessa abrasada com uma solução compreendendo células de agrobacterium e um surfatante, em que as células de agrobacterium compreendem a sequência de nucleotídeos a ser expressa transientemente, através da qual a sequência de nucleotídeos é expressa transientemente em uma ou mais células da planta de soja.

Description

MÉTODO PARA EXPRESSAR TRANSIENTEMENTE UMA OU MAIS SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS EM UMA OU MAIS CÉLULAS DE UMA PLANTA INTEIRA INTACTA DE SOJA”
DECLARAÇÃO DE ANTERIORIDADE
Este pedido reivindica o benefício, sob 35 U.S.C. § 119 (e), do Pedido Provisório U.S. No. 61/427,935; apresentado em 29 de dezembro, 2010, cujo conteúdo completo é incorporado neste documento como referência.
ÂMBITO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a métodos que em geral se relacionam com a expressão de ácidos nucleicos em plantas. Especificamente, esta invenção se relaciona com métodos e composições para expressão transiente de sequências de nucleotídeos em uma planta de soja intacta e/ou partes de essa.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A soja é uma das mais importantes plantas de cultivo comerciais em todo o mundo. A capacidade de avaliar os elementos genéticos em conjunto com sequências de nucleotídeos de interesse é importante para o desenvolvimento de plantas de soja com características agronômicas melhoradas. No entanto, a avaliação e a testagem dos elementos genéticos em plantas de soja transformadas estavelmente necessitam de muito tempo e muitos recursos. Pelo contrário, a avaliação dos elementos genéticos utilizando sistemas de expressão transientes pode executar-se em vários dias por muito menos custo.
Vários sistemas transientes virais baseados in-planta se têm reportado em soja (Zhang e Ghabrial, Virology 344:401-11 (2006); Wang et al., MPMI 19:304-312 (2006); Zhang et al., MPMI 22:123-131 (2009); Zhang et al., Plant Physiol. 153:52-65 (2010); Yamagishi e Yoshikawa, Plant Mol Biol. 71:15-24 (2009). Enquanto sistemas de transformação transiente de base viral são úteis para a expressão sistêmica e de elevado nível de sequências de nucleotídeos de interesse, os sistemas de transformação transiente de base viral são menos úteis para se avaliarem elementos genéticos tais como
Petição 870190063132, de 05/07/2019, pág. 8/11
2/66 melhoradores, promotores, cassetes de expressão completas, genes virais, e quaisquer elementos genéticos que sejam maiores que 2-3 kb. A expressão de múltiplos genes/características é comummente desejada. Essas construções podem ser bastante grandes, (por exemplo, 5-25kb) e geralmente não podem ser testadas nas plantas utilizando sistemas virais conhecidos.
Consequentemente, a presente invenção aborda insuficiências anteriores da matéria, proporcionando composições e métodos para expressar transientemente uma sequência de nucleotídeos em uma planta de soja utilizando vetores binários.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Um aspeto da presente invenção provê um método para expressar transientemente uma sequência de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta de soja, compreendendo: a) abrasar a superfície de uma planta de soja e/ou da parte intata dessa; b) imergir a planta se soja abrasada e ou a parte intata dessa abrasada em uma solução compreendendo células bacterianas competentes para transferir o ácido nucleico e um surfatante, em que as células bacterianas compreendem uma sequência de nucleotídeos a ser expressada transientemente e um surfatante, em que as células bacterianas compreendem a sequência de nucleotídeos a ser expressada transientemente; c) aplicar vácuo à planta de soja imersa e/ou à parte intata dessa do passo (b); e d) libertando o vácuo, introduzindo desse modo a solução na planta de soja e/ou na parte intacta dessa, Desse modo a sequência de nucleotídeos é expressada transientemente em uma ou mais células da planta de soja.
Um outro aspeto da presente invenção provê um método para expressar transientemente uma sequência de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta de soja, compreendendo: a) abrasar a superfície de uma planta de soja e/ou de parte intata dessa; e b) contatar a planta de soja abrasada e/ou de parte intata dessa abrasada com uma solução compreendendo células bacterianas competente para se transferir ácido nucleico e um surfatante, em que as células bacterianas compreendem a sequência de
3/66 nucleotídeos a serem expressadas transientemente e um surfatante, em que as células bacterianas compreendem a sequência de nucleotídeos a ser expressada transientemente, através da qual a sequência de nucleotídeos é expressada transientemente em uma ou mais células da planta de soja.
Em alguns aspectos da invenção, a planta de soja ou de parte intata dessa é contata com álcool antes de se abrasar a superfície da planta ou de parte intata dessa. Aspectos adicionais da presente invenção provêem plantas de soja transformadas transientemente feitas através dos métodos descritos no presente documento.
Em outros aspectos da invenção é provido um método para se predizer a expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta de soja transformada estavelmente, compreendendo: expressar transientemente uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta de soja através de um método da presente invenção; e determinar o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos, em que o nível de expressão determinado em plantas de soja transientemente transformadas prevê o nível de expressão em uma planta de soja transformada estavelmente com as referidas uma ou mais sequências de nucleotídeos.
Em aspectos adicionais da invenção um método para se otimizar a expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta de soja, compreendendo: (a) expressando transientemente a uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta de soja através dos método da presente invenção; (b) determinando o nível de expressão da uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma ou mais células da planta de soja transientemente transformada do passo (a); (c) modificando pelo menos uma ou mais sequências de nucleotídeos para se otimizar a expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta de soja; (d) expressando transientemente uma ou mais sequências de nucleotídeos do passo (c) em uma ou mais células de uma planta de soja através dos método da presente invenção; (e) determinando o nível de expressão da uma ou mais sequências de nucleotídeos da planta de soja transientemente
4/66 transformada do passo (d); e ou, (f) verificando se o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos é otimizado; ou (g) repetindo os passos (c) através de (e) uma ou mais vezes e verificando que o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos é otimizado, otimizando desse modo o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta de soja.
Ainda em aspectos adicionais da presente invenção, um método de produzir a planta de soja transformada estavelmente compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeos otimizada para expressão em uma planta de soja, compreendendo, (a) expressar transientemente uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta de soja através dos método da presente invenção; (b) determinando o nível de expressão da uma ou mais sequências de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico em uma ou mais células da planta de soja transientemente transformada do passo (a); (c) modificando pelo menos uma de uma ou mais sequências de nucleotídeos para otimizar a expressão da referida uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta de soja; (d) expressando transientemente a uma ou mais sequências de nucleotídeos do passo (c) em uma ou mais células de uma planta de soja de acordo com os métodos da presente invenção; (e) determinando o nível de expressão da uma ou mais sequências de nucleotídeos da planta de soja transientemente transformada do passo (d); ou então, (f) verificando que o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos é otimizada; ou (g) repetindo os passos de (c) até (e) uma ou mais vezes e verificando que o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos é otimizada; e (h) transformando estavelmente uma planta de soja com a uma ou mais sequências de nucleotídeos do passo (f) ou passo (g) otimizada para a expressão, produzindo desse modo a planta de soja transformada estavelmente compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeos otimizada para a expressão em uma planta de soja.
Aspectos adicionais da presente invenção provêm plantas de soja transformada transientemente e plantas de soja e/ou partes dessa esta5/66 velmente transformadas feitas través dos métodos descritos neste documento.
Estes e outros aspectos da invenção são apresentados com mais detalhes na descrição da invenção a seguir.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Tanto quanto os presentes inventores têm conhecimento não existem quaisquer vetores binários baseados em sistemas transientes inplanta disponíveis para a soja. Talvez isso se deva à dificuldade de se infiltrar na soja utilizando os métodos existentes tal como uma seringa sem agulha, que é comumente usada em tabaco e outras dicotiledôneas para infiltração de Agrobacterium (Ver, por exemplo, Ryu et al. Agrodrench: a novel and efficient agroinoculation method for virus induced gene silencing in plant roots and various Solanaceae species. Plant Biology 2004: sexta feira, julho 24 - quanta feira julho 28, 2004. Lake Buena Vista, FL USA, American Society of Plant Biologists, resumo # 834) e infiltração por vácuo. A dificuldade de infiltração no caso da soja pode dever-se em parte à cutícula espessa e quantidade de cera cuticular produzida nas folhas de soja assim como o sistema vascular complicado da soja. Portanto, os métodos descritos nesse documento foram desenvolvidos para se ultrapassar este problema e prover métodos e composições para um sistema de expressão transiente in planta utilizando vetores binários. Há relatos de expressão transiente em soja utilizando métodos biolísticos de transformação com os tecidos cortados tais como cotilédones, folhas ou callus. No entanto, estes sistemas não são sistemas ideais para realizar estudos de eficácia nas sequências de nucleotídeos de interesse, não são reprodutíveis, e e não são econômicos.
A presente invenção provê um vetor binário baseado em sistema de expressão transiente que é vantajoso não somente porque não tem as limitações de tamanho comummente associadas com sistemas de expressão com base viral (portanto, sequências de nucleotídeos maiores que 25 kb em tamanho podem ser usadas em uma cassete de expressão a ser avaliada) mas também cassetes de expressão impulsionadas por diferentes promotores incluindo essas de origem vegetal, expressão de polipeptídeos múl6/66 tiplos, e outros elementos genéticos de codificação e não codificantes podem ser avaliados em uma semana ou menos. O sistema de expressão transiente in planta da presente invenção pode ser utilizado como um modelo de previsão de confiança para a realização de cassetes de expressão em termos de produção de proteína, i.e, baixo, médio ou alto nível de produção, em plantas transgênicas estáveis. Testando várias construções, se pode eliminar rapidamente (dentro de 2 semanas) sob a execução de construção (i.e, nível de expressão não detetável devido ou a expressão extremamente baixa ou outras questões relacionadas com uma construção de baixo desempenho). Desse modo, isso permite melhor desenho de cassete de expressão/construção, economia significativa de tempo e outros recursos. Muito importante, as plantas/partes dessas intatas infiltradas da presente invenção podem ser utilizadas em estudos de eficácia para as sequências de nucleotídeos de interesse (s) tais como em um bioensaio de inseto/doença.
Consequentemente, um aspeto da presente invenção provê um método para expressar transientemente uma sequência de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta de soja, compreendendo: a) abrasar a superfície de uma planta de soja e/ou parte intata dessa, (i.e., em que a parte intata da planta de soja é ligada a uma planta de soja); b) imergindo a a planta abrasada e/ou e ou a parte dessa abrasada em uma solução compreendendo células bacterianas competentes para se transferir ácido nucleico (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, etc.) e um surfatante, em que as células bacterianas compreendem a sequência de nucleotídeos a ser expressada transientemente; c) aplicar um vácuo (i.e., pressão negativa) à planta de soja intata e/ou à parte dessa imergida do passo (b); e d) libertando o vácuo, introduzindo desse modo a solução dentro da planta de soja e/ou da parte intata dessa, através da qual a sequência de nucleotídeos é expressada transientemente em uma ou mais células da planta de soja.
Introdução no contexto da inoculação ou infeção de uma planta com uma solução bacteriana utilizando um vácuo (pressão negativa) significa a libertação ou a infiltração de solução bacteriana (i.e., meio de infeção)
7/66 nos espaços intracelulares da planta de soja e/ou da parte intata dessa, sob condições através da qual as bactérias (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, etc.)) pode infetar as células da planta de soja e/ou da parte intata dessa, proporcionando desse modo a sequência de nucleotídeos nas células da planta de soja e ou da parte intata dessa. Além disso, introdução no contexto da inoculação de uma planta com uma solução bacteriana por contato da planta ou de parte intata dessa com a solução como descrito neste documento significa a aplicação da solução bacteriana (i.e., meio de infeção) na superfície da planta de soja e/ou da parte intata dessa sob condições através das quais as bactérias podem entrar nos espaços intercelulares da planta de soja e/ou da parte intata dessa e infetar as células da planta de soja ou da parte intata dessas, proporcionando desse modo a sequência de nucleotídeos nas células da planta de soja e/ou da parte intata dessa.
Introdução ou aplicação no contexto de uma célula vegetal, parte de planta ou planta e uma molécula de ácido nucleico significa fornecer uma molécula de ácido nucleico à planta, parte de planta, e/ou célula vegetal de tal modo que a molécula de ácido nucleico consegue o acesso ao interior de uma célula. Quando mais de uma molécula de ácido nucleico é para ser introduzida ou aplicada, estas moléculas de ácidos nucleicos pode ser montadas como parte dos polinucleotídios únicos ou construção de ácido nucleico, ou como polinucleotídios separado ou construções de ácido nucleico, e pode ser localizado na mesma e/ou diferentes construções de ácido nucleico. Consequentemente, estes polinucleotídios podem ser introduzidos ou aplicados nas células vegetais em um único evento de transformação, e/ou em eventos de transformação separados. Portanto, o termo transformação conforme usado no presente documento refere-se à introdução de um ácido nucleico heterólogo em uma célula. A transformação de uma célula pode ser estável ou transitória.
Transformação transiente ou expressão transiente no contexto de uma sequência de nucleotídios significa que uma sequência de nucleotídios é introduzida ou aplicada na célula e não é integrada no genoma da
8/66 célula.
Por introdução estável ou estavelmente introduzida no contexto de um ácido nucleico introduzido em uma célula se entende que o ácido nucleico introduzido é estavelmente incorporado no genoma da célula, e desse modo a célula é transformada estavelmente com o ácido nucleico.
Transformação estável ou transformada estavelmente como usado neste documento significa que uma molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotídios que é introduzida em uma célula e integra-se no genoma da célula. Desse modo, a molécula de ácido nucleico integrada ou a sequência de nucleotídios é capaz de ser herdada pela descendência da mesma, mais especificamente, pela descendência de várias gerações sucessivas. O genoma como usado neste documento inclui também o genoma de plastídio, e portanto inclui a integração da molécula de ácido nucleico ou da sequência de nucleotídios em, por exemplo, o genoma de cloroplastos. Transformação estável como usado neste documento pode também referirse a uma molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotídios que é mantida de modo extracromossômico, por exemplo, como um mini cromossomo.
Tal como acima descrito, a planta de soja da presente invenção é intata (i.e., completa), e desse modo, em algumas modalidades de realização, a presente invenção provê um método de se ensaiar a expressão transiente de uma sequência de nucleotídios heteróloga em uma planta de soja e/ou parte intata dessa. Consequentemente, em algumas modalidades de realização da presente invenção, uma ou mais partes intatas da planta de soja podem ser tratadas (por exemplo, abrasadas, imersas, etc) como uma parte separada (por exemplo, individualmente) enquanto permanece ligado com a planta ao longo do tratamento. Desse modo, por exemplo, uma folha de uma planta de soja que esteja intata (i.e., que está ligada a uma planta de soja) pode ser abrasada e infiltrada com vácuo enquanto permanece ligada à planta. Ainda em um exemplo adicional não limitativo, mais do que uma folha intata (ou qualquer outra parte) em uma planta de soja pode ser abrasada e a mais do que uma folha (ou outra parte) que foi abrasada e ou a
9/66 planta de soja inteira e intata (partes abrasadas e não abrasadas) podem em seguida ser imersas no meio de infeção e infiltrada com vácuo. É de notar que devido ao fato de as plantas de soja da presente invenção estarem intatas, elas continuam crescendo após os tratamentos para a transformação transiente descrita no presente documento.
Como usado neste documento, uma parte intata de uma planta de soja inclui mas, não se limita a um embrião, pólen, um óvulo, uma região meristemática, um broto axilar, uma semente, uma folha, um folíolo, um cotilédone, um pecíolo, uma haste, uma flor, um ramo, um fruto, uma vagem, uma raiz, um ápice da raiz, uma antera, e os semelhantes, que estão ligados à planta de soja.
Desse modo, as partes intatas da planta de soja podem ser abrasadas em qualquer combinação (por exemplo, uma ou mais folhas, página superior e/ou inferior das folhas (abaxial e/ou adaxial), em qualquer combinação; uma ou mais folhas em qualquer combinação com outras partes intatas da planta de soja tais como hastes, flores, etc.).
A planta de soja e/ou a parte intata dessa podem ser de qualquer idade. Desse modo, em algumas modalidades de realização da invenção, a planta de soja ou a parte intata dessa intata podem ser cerca de 3 dias de idade (i.e., dias após a germinação) até cerca de 90 dias de idade. Em algumas modalidades de realização, a planta de soja ou a parte intata dessa podem ser cerca de 5 dias de idade até cerca de 90 dias de idade. Em outras modalidades de realização, a planta de soja e/ou a parte intata dessa pode ser cerca de 3 dias de idade até cerca de 30 dias de idade. Ainda em uma outra modalidades de realização, a planta de soja e/ou a parte intata dessa pode ser cerca de 5 dias de idade até cerca de 30 dias de idade. Em modalidades de realização adicionais, a planta de soja e/ou a parte intata dessa pode ser cerca de 3 dias de idade até cerca de 15 dias de idade. Ainda em uma modalidade de realização adicional, a planta de soja ou a parte intata dessa pode ser cerca de 5 dias de idade até cerca de 15 dias de idade. Em modalidades de realização adicionais, a planta de soja e/ou a parte intata dessa pode ser de cerca de 7 dias de idade até cerca de 14 dias de
10/66 idade.
Em outras modalidades de realização da presente invenção, a planta de soja e/ou a parte intata dessa é cerca de 1 dia de idade (i.e., dias após a germinação), cerca de 2 dias de idade, cerca de 3 dias de idade, cerca de 4 dias de idade, cerca de 5 dias de idade, cerca de 6 dias de idade, cerca de 7 dias de idade, cerca de 8 dias de idade, cerca de 9 dias de idade, cerca de 10 dias de idade, cerca de 11 dias de idade, cerca de 12 dias de idade, cerca de 13 dias de idade, cerca de 14 dias de idade, cerca de 15 dias de idade, cerca de 16 dias de idade, cerca de 17 dias de idade, cerca de 18 dias de idade, cerca de 19 dias de idade, cerca de 20 dias de idade, cerca de 21 dias de idade, cerca de 22 dias de idade, cerca de 23 dias de idade, cerca de 24 dias de idade, cerca de 25 dias de idade, cerca de 26 dias de idade, cerca de 27 dias de idade, cerca de 28 dias de idade, cerca de 29 dias de idade, cerca de 30 dias de idade, cerca de 31 dias de idade, cerca de 32 dias de idade, cerca de 33 dias de idade, cerca de 34 dias de idade, cerca de 35 dias de idade, cerca de 36 dias de idade, cerca de 37 dias de idade, cerca de 38 dias de idade, cerca de 39 dias de idade, cerca de 40 dias de idade, cerca de 41 dias de idade, cerca de 42 dias de idade, cerca de 43 dias de idade, cerca de 43 dias de idade, cerca de 44 dias de idade, cerca de 45 dias de idade, cerca de 46 dias de idade, cerca de 47 dias de idade, cerca de 48 dias de idade, cerca de 49 dias de idade, cerca de 50 dias de idade, cerca de 51 dias de idade, cerca de 52 dias de idade, cerca de 53 dias de idade, cerca de 54 dias de idade, cerca de 55 dias de idade, cerca de 60 dias de idade, cerca de 65 dias de idade, cerca de 70 dias de idade, cerca de 75 dias de idade, cerca de 80 dias de idade, cerca de 85 dias de idade, cerca de 90 dias de idade, e os semelhantes.
A superfície de qualquer parte da planta de soja pode ser abrasada utilizando qualquer material de abrasão (i.e., abrasivo) incluindo mas não limitado a esmeril, granada, carboneto de silício (SiC, carborundo), óxido de alumínio (por exemplo, papel de lixa), diamante e/ou quartzo, areia, partilhas esfregadoras, escova de arame, e os semelhantes, e qualquer combinação desses. Em algumas modalidades de realização da presente inven
11/66 ção, abrasando compreende contatar a planta de soja intata, e/ou a parte dessa, com papel de lixa de óxido de alumínio. O papel de lixa de óxido de alumínio pode ser de diferentes tamanhos de grão (por exemplo, fino, médio, grão grosseiro). Tamanhos de grão padrão não limitativos são providos na Tabela 1.
Tabela 1. Designação de grão CAMI (Coated Abrasive Manufacturers Institute) e média de tamanho de partícula para diferentes tipos.
:ipos.
designação de grãos CAMI Tamanho médio de partícula (pm)
Macrogrãos
Grosso 40-50 336-425
Médio 60-80 265-190
Fino 100-120 140-115
Muito Fino 150-220 100-68
Microgrãos
Muito Fino 240 58,5-40,5
Extrafino 320-360 36,0-25,8
Superfino 400-600 23,0-15,3
Ultrafino 800-1000 12,6-8,4
Em algumas modalidades de realização da invenção, a superfície da parte de planta(s) pode ser abrasada utilizando papel de lixa tendo uma designação de grão CAMI de entre cerca de 100 até cerca de 220 e um tamanho de partícula de cerca de 140 pm até 68 pm. Em modalidades de realização adicionais, a superfície da parte de planta pode ser abrasada utilizando papel de lixa tendo uma designação de grão CAMI de cerca de 150 e um tamanho de partícula de cerca de 92 pm. Tipicamente, pressionando suavemente ou esfregando o abrasivo (por exemplo, papel de lixa) contra a superfície da parte de planta é suficiente para abrasar a superfície da planta. De modo alternativo, a superfície da parte de planta pode ser pressionada contra o abrasivo. Em modalidades de realização adicionais da presente invenção, a superfície da parte de planta(s) pode ser abrasada utilizando um laser. Ainda em uma modalidades de realização adicional da invenção, a
12/66 superfície da parte de planta(s) pode ser abrasada por pulverização da parte de planta(s) com uma solução que pode abrasar. Desse modo, uma solução compreendendo, por exemplo, areia, esmeril, granada, carboneto de silício (SiC, carborundo), óxido de alumínio (por exemplo, papel de lixa), diamante e/ou quartzo, partículas de tungstênio/ouro, nanopartículas, nanopartículas de tungstênio (W), nano grânulos ou nano pós, e semelhantes, podem ser pulverizados na superfície da parte da planta(s), deste modo abrasando a superfície da planta. Ainda em uma modalidades de realização adicional, um líquido (por exemplo, água, meio de infeção, e semelhantes) sob pressão e pulverizado na superfície da planta pode ser utilizado para abrasar a superfície da planta.
Em algumas modalidades de realização da presente invenção, quando a parte de planta que é abrasada é uma folha ou folhas, é abrasada a superfície abaxial da folha. Em outras modalidades de realização, é abrasada a superfície adaxial da folha. Em modalidades de realização adicionais, podem ser abrasados os dois lados de uma folha.
Como usado neste documento, superfície significa a superfície de qualquer parte intata da planta de soja incluindo, mas não se limitando a, um embrião, pólen, um óvulo, uma região meristemática, uma gema axilar, uma semente, uma folha, um folíolo, um cotilédone, um pecíolo, uma haste, uma flor, um ramo, um fruto, uma vagem, uma raiz, um ápice da raiz, uma antera, e semelhantes, que estejam conetados a uma planta de soja.
Uma vez que a superfície da planta de soja e/ou a parte dessa intata seja abrasada, a planta abrasada e/ou a parte dessa que foi abrasada podem ser imersas em uma solução (por exemplo, meio de infeção) compreendendo bactérias competentes para a transferência do ácido nucleico (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, etc.). A solução ou o meio de infeção podem ser qualquer meio conhecido na arte para utilização na infeção bacteriana de plantas. Conforme anteriormente descrito no presente documento, a planta abrasada e/ou a parte dessa abrasada da presente invenção permanece intata e viável e continua a crescer antes, durante e após o tratamento de abrasão e outros tratamentos
13/66 descritos no presente documento.
Como usado neste documento, imerso, imergidos, imersão, imergindo, e variações gramaticais dos mesmos, se refere a cobrindo completamente (submergindo) a planta de soja e/ou a parte intata dessa que é para ser infiltrada com o meio de infeção compreendendo a bactéria transformada (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, etc.).
Em conformidade com os métodos da presente invenção, uma sequência de nucleotídios de interesse é introduzida nas células de uma estirpe de bactéria competente para transferir o ácido nucleico (por exemplo, uma estirpe de Agrobacterium, estirpe de Rhizobium, estirpe de Sinorhizobium, estirpe de Mesorhizobium, etc.) por métodos de transformação convencionais, e a estirpe das bactérias é então utilizada nos métodos de transformação da presente invenção para introduzir a sequência de nucleotídeos de interesse nas células de uma planta de soja e/ou da parte intata dessa. Estão disponíveis bastantes vetores para transformação de bactérias competentes para se transferir o ácido nucleico (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, e semelhantes). Tipicamente esses carregando pelo menos uma sequência de fronteira T-DNA e incluindo vetores tais como pBIN19 (Bevan, Nucleic Acids Res. 12:8711-8721 (1984)). Para a construção de vetores úteis na transformação bacteriana, ver, por exemplo, Publicação da Patente U.S. No. 2006/0260011, incorporada neste documento como referência na sua totalidade.
Desse modo, a transformação bacteriana tipicamente envolve a transferência de um vetor binário carregando a sequência de nucleotídeos de interesse para uma estirpe apropriada de Agrobacterium ou outra estirpe de bactéria que é competente para transferir o ácido nucleico, o que pode depender do complemente dos genes vir carregados pela estirpe da bactéria hospedeira tanto em um plasmídio Ti co-residente ou cromossomicamente (Uknes et al. (1993) Plant Cell 5:159-169). A transferência dos vetores binários recombinantes para a bactéria hospedeira pode ser conseguida através de um procedimento de acoplamento tri-parental utilizando E. coli carregan
14/66 do os vetores binários recombinantes, uma estirpe de E. coli auxiliar transportando um plasmídio e a qual é capaz de mobilizar os vetores binários recombinantes à estirpe bacteriana hospedeira de destino (por exemplo, Agrobacteríum, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, etc. e semelhantes). De modo alternativo, os vetores binários recombinantes podem ser transferidas para a estirpe bacteriana hospedeira de destino por transformação de DNA (Hofgen e Willmitzer (1988) Nucleic Acids Res. 16:9877).
Desse modo, em algumas modalidades de realização, uma bactéria competente para se transferir o ácido nucleico pode ser Agrobacterium. Como usado neste documento, Agrobacterium significa uma espécie, subespécie, ou estirpe de Agrobacterium que é capaz de mobilizar e transferir seletivamente T-DNA em uma planta ou célula vegetal dessa. Qualquer estirpe de Agrobacterium capaz de mobilizar e transferir seletivamente T-DNA para uma planta ou célula vegetal que pode ser usada na presente invenção. Em algumas modalidades de realização, são usadas estirpes do tipo selvagem. Em outras modalidades de realização, são usados derivados desarmados de espécies de Agrobacterium, nos quais as sequências induzidas por tumor do plasmídio foram removidas. Em algumas modalidades de realização, a Agrobacterium é Agrobacterium tumefaciens. Exemplos de estirpes de A. tumefaciens adequadas incluem, mas não são limitados a, por exemplo, EHA101, como descrito por Hood et al. (1986) J. Bacteriol. 168:12911301); LBA4404, conforme descrito por Hoekema et al. (1983) Nature 303:179-180; C58 (pMP90), conforme descrito por Koncz e Schell (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396; EHA 105; AGLI; AGL0; e os semelhantes tai como é conhecido na arte, e qualquer combinação desses. Em outras modalidades de realização da invenção, o Agrobacterium pode ser Agrobacterium rhizogenes (i.e., Rhizobium rhizogenes). Exemplos de estirpes de Agrobacterium rhizogenes adequadas incluem, mas não são limitados a, 15834, como descrito por Birot et al. (Biochem, 25: 323-35) e R1000.
Em modalidades de realização adicionais, para além das espécies e estirpes de Agrobacterium, outras espécies e estirpes de bactérias dessas, que são competentes para se transferir ácido nucleico pode ser u
15/66 sado nos métodos da presente invenção (ver, por exemplo, os descritos por CAMBIA (www.cambia.org); ver também Broothaerts et al. Nature 433:629633 (2005)). Exemplos não limitativos de bactérias não Agrobacterium competentes para se transferir ácido nucleico incluem Sinorhizobium, Mesorhizobium e Rhizobium (Id.).
Consequentemente, em algumas modalidades de realização da presente invenção, um planta de soja e/ou parte intata dessa podem ser inoculadas por contato da planta e/ou da parte intata dessa com uma solução compreendendo uma estirpe de Agrobacterium ou outra estirpe bacteriana competente para se transferir ácido nucleico que acolhe um ou mais plasmídios nos vetores binários compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeos de interesse. Os vetores binários são vetores capazes de reprodução tanto na Escherichia coli como na bactéria hospedeira para ser usada para se transferir ácido nucleico para a planta (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium Sinorhizobium, Mesorhizobium, etc.). Os vetores binários T-DNA compreendem T-DNA e genes vir localizados em replicons separados. Vários desses vetores de transformação disponíveis para a transformação de plantas são conhecidos daqueles habilitados na técnica da transformação de plantas, e as sequências de nucleotídeos úteis nesta invenção podem ser usadas em conjunção com qualquer desses vetores.
Desse modo, em algumas modalidades de realização, um meio de infeção é um meio que foi preparado a partir de bactérias cultivadas (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, etc.). Desse modo, células da estirpe bacteriana compreendendo a sequência de nucleotídeos de interesse a ser transformada na planta de soja e/ou parte intata dessa são cultivadas em ou em um meio apropriado suplementado com antibióticos seletivos para a estirpe e o vector (ver, por exemplo, o protocolo descrito na seção Experimental a seguir neste documento). Os habilitados na arte são familiares com procedimentos para o crescimento de bactérias, por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, e os semelhantes, e condições de cultura adequadas. Tipicamente a cultura bacteriana é inoculada a partir de uma estoque de glicerol ou placa
16/66 inoculada e é crescida durante a noite. As células bacterianas são depois colhidas e ressuspendidas em um meio adequado para infeção da planta de soja ou da parte intata dessa. Como usado neste documento meio de infeção significa uma suspensão de células bacterianas (por exemplo, Agrobacterium spp. Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., etc.) para ser utilizado para infetar o material vegetal. Por exemplo, em algumas modalidades de realização, um meio de infeção pode compreender os sais de Murashige e Skoog sais com vitaminas, 2% de sacarose, 500 μΜ de MES (pH 5,6), 10 μΜ de MgSO4, e 400 μΜ de acetosiringona.
Em algumas modalidades de realização, a acetosiringona podem ser usadas a uma concentração de uma gama de cerca de 50 μΜ até cerca de 1000 μΜ, e qualquer intervalo nessa. Desse modo em algumas modalidades de realização, a acetosiringona pode ser utilizada a uma concentração de 50 μΜ, 100 μΜ, 200 μΜ, 300 μΜ, 400 μΜ, 500 μΜ, 600 μΜ, 700 μΜ, 800 μΜ, 900 μΜ, e/ou 1000 μΜ. A concentração de células bacterianas compreendidas em um meio de infeção que pode ser utilizada com a presente invenção pode ser qualquer concentração de bactérias conhecidas pelos habilitados na arte para ser eficiente para transformar/infetar plantas. Portanto, em algumas modalidades de realização da presente invenção, a concentração de células bacterianas utilizadas pode ser em uma gama desde cerca de 0.01 OD6oo até cerca de 4.0 OD600. Em outras modalidades de realização da invenção, a concentração de células bacterianas utilizadas pode ser em uma gama desde cerca de 0,2 OD6oo até cerca de 2,0 OD6ooDesse modo, a concentração das células bacterianas em uma solução (meio de infeção) pode ser um ODeoo de
0,03, cerca de 0,04, cerca de 0,05,
0,08, cerca de 0,09, cerca de 0,10,
0,25, cerca de 0,30, cerca de 0,35,
0,50, cerca de 0,55, cerca de 0,60,
0,75, cerca de 0,80, cerca cerca cerca cerca cerca cerca de 0,85, cerca de 0,01, de 0,06, de 0,15, de 0,40, de 0,65, de 0,90, cerca cerca cerca cerca cerca cerca de 0,02, cerca de 0,07, cerca de 0,20, cerca de 0,45, cerca de 0,70, cerca de 0,95, cerca de de de de de de
1,0, cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de
17/66
2.1, cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4, cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9, cerca de 3,0, cerca de 3,1, cerca de
3.2, cerca de 3,3, cerca de 3,4, cerca de 3,5, cerca de 3,6, cerca de 3,7, cerca de 3,8, cerca de 3,9, cerca de 4,0, e semelhantes. Em algumas modalidades de realização da presente invenção, a concentração de células bacterianas utilizadas no meio de infeção é 0,2 OD600. Em outras modalidades de realização, a concentração de células bacterianas utilizadas no meio de infeção é 0,5 ODeoo- Em modalidades de realização adicionais da presente invenção, a concentração de células bacterianas utilizadas no meio de infeção é 1,0 OD60o- Em modalidades de realização adicionais, a concentração de células bacterianas usado no meio de infeção da presente invenção é 2,0 de ODeoo·
Em algumas modalidades de realização da presente invenção, a solução ou meio de infeção compreendendo as células bacterianas competentes para se transferir ácido nucleico (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium etc) compreende ainda um ou mais surfatantes. Um surfatante pode auxiliar a ligação (i.e., anexo / infiltração) das células das bactérias na solução bacteriana na superfície da planta a qual por seu turno ajuda facilitando a entrada das células bacterianas e/ou do T-DNA na célula vegetal Qualquer surfatante que é não tóxica para plantas de soja pode ser usada com a presente invenção. Exemplos não limitativos de surfatantes úteis na presente invenção incluem polietoxilato de trisiloxano fechado na extremidade com metilo (Silwet L-77®), polisorbato 20 (Tween® 20), etoxilato de octil fenol (Triton® X-100), 2-(3-hidroxipropil)heptametil-trisiloxano (Sylgard 309®), e os semelhantes, e qualquer combinação desses. Em algumas modalidades de realização, o surfatante incluído no meio de infeção é Silwet L-77®. Em algumas modalidades de realização, a concentração de surfatante pode ser de cerca de 0,01% até cerca de 1%, e qualquer nesse intervalo. Deste modo, em outras modalidades de realização, a concentração do surfatante pode ser de cerca de 0,01%, cerca de 0,02%, cerca de 0,03%, cerca de 0,04%, cerca de 0,05%, cerca de 0,06%, cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09%, cerca de 0,1%, cerca de
18/66
0,15%, cerca de 0,2%, cerca de 0,25%, cerca de 0,3%, cerca de 0,35%, cerca de 0,4%, cerca de 0,45%, cerca de 0,5%, cerca de 0,55%, cerca de 0,6%, cerca de 0,65%, cerca de 0,7%, cerca de 0,75%, cerca de 0,8%, cerca de 0,85%, cerca de 0,9%, cerca de 0,95%, cerca de 1,0%, e semelhantes.
A planta de soja e/ou parte intata dessa tendo uma ou mais superfícies abrasadas e imersas em um meio de infeção (compreendendo células bacterianas competentes para transferir ácido nucleico (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium,etc.) e um surfatante) é depois submetido a (por exemplo, exposto a; contatado com) um vácuo (ou seja, pressão negativa). Qualquer método para aplicar um vácuo a uma planta de soja e/ou parte intata dessa pode ser utilizado com a presente invenção. Deste modo, qualquer aparelho capaz de aplicar um vácuo pode usar-se com a presente invenção. Deste modo, por exemplo, um vácuo de bacada e/ou exsicador sob vácuo podem ser utilizados.
Pode aplicar-se o vácuo durante cerca de 30 segundos até cerca de 10 minutos. Deste modo, se pode aplicar o vácuo durante cerca de 30 segundos, cerca de 1,0 minuto, cerca de 1,5 minutos, cerca de 2,0 minutos, cerca de 2,5 minutos, cerca de 3,0 minutos, cerca de 3,5 minutos, cerca de 4,0 minutos, cerca de 4,5 minutos, cerca de 5,0 minutos, cerca de 5,5 minutos, cerca de 6,0 minutos, cerca de 6,5 minutos, cerca de 7,0 minutos, cerca de 7,5 minutos, cerca de 8,0 minutos, cerca de 8,5 minutos, cerca de 9,0 minutos, cerca de 9,5 minutos, cerca de 10,0 minutos, e os semelhantes. Desse modo, em algumas modalidades de realização, se pode aplicar o vácuo durante cerca de 30 segundos. Em outras modalidades de realização, se pode aplicar o vácuo durante cerca de 1,0 minuto. Em modalidades de realização adicionais, se pode aplicar o vácuo durante cerca de 2,0 minutos. Ainda em outras modalidades de realização, se pode aplicar o vácuo durante cerca de 5,0 minutos.
A pressão negativa aplicada durante o tratamento de vácuo pode ser desde cerca de 5 cm Hg até cerca de 100 cm Hg, qualquer neste intervalo. Em algumas modalidades de realização da invenção, a pressão negativa que é aplicada é cerca de 5 cm Hg até cerca de 50 cm Hg. Em outras
19/66 modalidades de realização, a pressão negativa que é aplicada é cerca de 5 cm Hg até cerca de 25 cm Hg. Em modalidades de realização adicionais, a pressão negativa que é aplicada é cerca de 10 cm Hg até cerca de 25 cm Hg. Em modalidades de realização adicionais da invenção, a pressão negativa que é aplicada é cerca de 25 cm Hg. Desse modo, a pressão negativa aplicada durante o tratamento de vácuo pode ser de cerca de 5 cm Hg, 10 cm Hg, 15 cm Hg, 20 cm Hg, 25 cm Hg, 30 cm Hg, 35 cm Hg, 40 cm Hg, 45 cm Hg, 50 cm Hg, 55 cm Hg, 60 cm Hg, 65 cm Hg, 70 cm Hg, 75 cm Hg, 80 cm Hg, 85 cm Hg, 90 cm Hg, 95 cm Hg, 100 cm Hg, e os semelhantes, ou qualquer combinação desses.
Depois da aplicação do vácuo, o vácuo é libertado e a solução (meio de infeção) compreendendo as células bacterianas (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium.etcf as quais compreendem a sequência de nucleotídeos a ser expressa na planta, é introduzida ou infiltrada nos espaços intracelulares da planta de soja e/ou da parte dessa, através da qual as bactérias infetam as células da planta de soja dentro da planta de soja e/ou da parte intata dessa, introduzindo desse modo a sequência de nucleotídeos a ser expressa nas célula(s) da planta de soja e/ou da parte intata dessa onde é expressa transientemente.
Em algumas modalidades de realização da presente invenção, a aplicação e libertação do vácuo se repete uma ou mais vezes, desse modo introduzindo repetidamente (infiltrando) a solução compreendendo as células bacterianas (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, etc.) na planta de soja e/ou na parte intata dessa. Deste modo, a aplicação e libertação do vácuo pode repetir-se uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes, dez vezes, onze vezes, doze vezes, treze vezes, catorze vezes, quinze vezes, e os semelhantes.
Em modalidades de realização adicionais da invenção, ceras cuticulares na superfície da planta de soja e/ou na parte intata dessa são pelo menos parcialmente removidas contatando a superfície da planta de soja e/ou a parte intata dessa com um álcool antes de se abrasar a superfície da
20/66 planta de soja e/ou a parte intata dessa. Em algumas modalidades de realização da invenção, a parte intata da planta que é contatada com o álcool é uma folha ou folhas e desse modo, as ceras cuticulares são pelo menos parcialmente removidas contatando a superfície da folha ou folhas intatas da planta de soja com álcool antes de se abrasar a superfície da folha ou folhas intatas da planta de soja. Exemplos não limitativos de alcoóis úteis para a presente invenção incluem etanol, metanol, propanol, butanol, isopropanol, isobutanol, e os semelhantes, ou qualquer combinação desses. Os termos contato, contatado, contatando, e variações gramaticais dos mesmos, como usado em referência à aplicação de etanol a uma planta inclui qualquer método através do qual a planta de soja e/ou parte intata dessa é exposta a, fornecida com, ou através do qual o álcool é aplicado a uma planta de soja intata e/ou parte dessa. Alguns exemplos não limitativos de contatar uma planta de soja e/ou parte intata dessa com álcool incluem enxugar, limpar, imergir, mergulhar, pulverizar, aspergir, nebulizar, atomizar, embeber, derramar, revestir, e os semelhantes, e combinações desses.
Em algumas modalidades de realização, a concentração de álcool usada com a presente invenção é em uma gama desde cerca de 10% até cerca de 100%. Em algumas modalidades de realização da presente invenção, a concentração de álcool é em uma gama desde cerca de 50% até cerca de 70%. Deste modo, em algumas modalidades de realização da invenção, o álcool pode ser a uma concentração de cerca de 10%, cerca de
15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de
40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de
65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de
90%, cerca de 95%, cerca de 100%, e os semelhantes. Em algumas modalidades de realização, o álcool pode ser a uma concentração de cerca de 96%, 97%, 98% ou 99%. Em outras modalidades de realização da invenção, o álcool é etanol a uma concentração de 70%.
A planta de soja infiltrada (e as partes intatas dessa) é colocada sob condições suficientes para crescimento. Essas condições são bem conhecidas dos especialistas na arte. Por exemplo, a planta de soja infiltrada
21/66 pode ser colocada em uma câmara de crescimento a 25 °C com um ciclo de 16/8 dia/noite e uma intensidade de luz de 1900 p-mol-m-2.s-1. Para manter a umidade, a planta e a parte intata dessa podem ser colocadas em um contentor que pode ser coberto.
O tecido da planta de soja e/ou da parte intata dessa pode ser colhido para análise subsequente para expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse a cerca de 2 dias até cerca de 15 dias apósinfiltração, e qualquer neste intervalo. Desse modo, em algumas modalidades de realização da invenção, o tecido da planta de soja e/ou da parte intata dessa pode ser colhido para análise a cerca de 2 dias pós-infiltração, cerca de 3 dias pós-infiltração, cerca de 4 dias pós-infiltração, cerca de 5 dias pós-infiltração, cerca de 6 dias pós-infiltração, cerca de 7 dias pós-infiltração, cerca de 8 dias pós-infiltração, cerca de 9 dias pós-infiltração, cerca de 10 dias pós-infiltração, cerca de 11 dias pós-infiltração, cerca de 12 dias pósinfiltração, cerca de 13 dias pós-infiltração, cerca de 14 dias pós-infiltração, cerca de 15 dias pós-infiltração, ou qualquer combinação desses.
Métodos para analisar a expressão de sequências de nucleotídeos são conhecidos na arte (Ver, por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I. (1989); Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I. (1984); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, e Wiley-lnterscience (1987)). Desse modo, a transformação transiente pode ser detetado, por exemplo, um ensaio imunosorbente ligado a enzima (ELISA) e/ou Western blot, o qual pode detetar a presença de um peptídio ou polipeptídio codificado por uma ou mais sequências de nucleotídeos introduzidas em um organismo e/ou análise de mRNA transcrito de uma sequência de nucleotídeos de interesse.
Em modalidades de realização adicionais, a presente invenção provê um método para expressar transientemente uma sequência de nucleotídios em uma ou mais células de uma planta de soja, compreendendo: a) abrasar a superfície de uma planta de soja e/ou parte intata dessa, em que a
22/66 parte intata da planta de soja é ligada a uma planta de soja; e b) contatar a planta de soja abrasada e/ou a parte dessa abrasada com uma solução compreendendo células bacterianas competentes para transferir o ácido nucleico (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, etc.) e um surfatante, em que as células bacterianas compreendem a sequência de nucleotídeos a ser expressa transientemente, através da qual a sequência de nucleotídeos é expressa transientemente em uma ou mais células da planta de soja.
A planta de soja e/ou a parte intata dessa e os métodos para se abrasar a superfície da planta de soja e/ou da parte intata dessa são descritos no presente documento.
Em seguida a abrasar a superfície da planta de soja e/ou da parte intata dessa, a planta abrasada e/ou a parte intata é contatada com uma solução compreendendo células bacterianas competentes para transferir o ácido nucleico, tal como, por exemplo, uma solução de Agrobacterium. A solução compreendendo células bacterianas competentes para transferir o ácido nucleico ou meio de infeção pode ser qualquer meio conhecido na arte para utilização na infeção bacteriana de plantas como descrito neste documento.
Em algumas modalidades de realização da invenção, a solução ou o meio de infeção compreendendo as células bacterianas compreendem ainda um surfatante. Exemplos não limitativos de surfatantes incluem Silwet L-77®, Tween® 20, Triton® X-100, Sylgard 309®, e os semelhantes, e qualquer combinação desses. Em algumas modalidades de realização, o meio de infeção compreende o surfatante Silwet L-77®.
Em alguns aspectos da invenção, o passo de contatar a planta e/ou parte intata dessa com uma solução compreendendo células bacterianas inclui qualquer método através do qual a suspensão ou o meio de infeção é trazido para contato com a planta de soja e/ou parte intata dessa. Desse modo, os termos contato, contatando, e variações gramaticais dos mesmos, incluem qualquer método através do qual a planta de soja e/ou a parte intata dessa é exposta a, fornecida com, ou através da qual o meio de
23/66 infeção é aplicada à planta de soja intata e/ou parte dessa. Alguns exemplos não limitativos de contatar uma planta de soja e/ou parte intata dessa com uma solução ou meio de infeção compreendendo células bacterianas incluem imersão, mergulho, pulverização, aspersão, nebulização, atomização, embebição, derrame, revestimento, e semelhantes, e suas combinações. Estes e outros procedimentos para contatar a planta de soja e/ou a parte intata dessa com uma solução ou meio de infeção compreendendo células bacterianas são bem conhecidos dos especialistas na arte.
Adicionalmente a presente invenção abrange plantas de soja e/ou partes intatas dessa em concordância com as modalidades de realização desta invenção. Desse modo, em algumas modalidades de realização, a presente invenção provê plantas de soja transientemente transformadas e/ou parte intatas dessas que são produzidas através dos método da presente invenção.
Adicionalmente, como discutido acima, o sistema de expressão transiente in-planta desta invenção pode ser usado como modelo para predizer a realização de construções/cassetes de expressão de ácido nucleico em uma planta transformada estavelmente (por exemplo, expressão de RNAs, produção de proteína, etc). Quando é para se testar o desempenho de múltiplos nucleotídeos, pode ser usado um único vector/cassete de expressão/molécula de ácido nucleico compreendendo um ou mais nucleotídeos. Pode usar-se um único ou múltiplos vetores/cassetes de expressão/moléculas de ácido nucleico com cada um compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeos a serem expressos. Se uma construção não consegue atingir os padrões de realização, podem fazer-se ajustamentos (por exemplo, as sequências reguladoras podem ser mudadas, pode alterarse a posição da sequência de nucleotídeos dentro da construção, os nucleotídeos dentro de uma sequência podem ser alterados, e afins) e a construção testar-se de novo. Desse modo, a realização de um vetor pode ser testada rapidamente e por um custo relativamente baixo utilizando o sistema transiente in-planta versus os maiores custos e o maior investimento em tempo associados com a criação de plantas transformadas estavelmente
24/66 que devem depois ser regeneradas e crescidas por algum tempo antes de o desempenho do vetor poder ser testado. A uma ou mais sequências de nucleotídeos pode incluir, mas não são limitados a, sequências de nucleotídeos codificando polipeptídeos, RNAs reguladores, e os semelhantes, regiões de regulação incluindo, mas não se limitando a, um promotor, uma terminação, um melhorador, um intron, um éxon, um marcador genético, e/ou um fator de transcrição. Desse modo, por exemplo, o sistema de expressão transiente da soja da presente invenção pode ser usado para avaliar vários tipos de construções de RNAi (por exemplo, siRNA, shRNA) quanto à eficiência na regulação para baixo de um gene nativo presente na soja ou para avaliar construções RNAi quanto à sua capacidade para controlar efetivamente uma infestação de insetos e doenças fúngicas e virais.
Desse modo, os métodos da presente invenção podem ser usados para otimizar rapidamente a expressão de uma molécula de ácido nucleico/vetor de expressão compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta de soja ou parte dessa. Uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa transientemente em uma planta de soja utilizando os métodos da presente invenção. O nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico na soja transformada transientemente pode ser medido (utilizando métodos para medir a expressão como conhecido na arte e descritos no presente documento). Se se determinar que pelo menos uma ou mais sequências de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico não tem o desejado nível de expressão, a sequência de nucleotídeos ou a molécula de ácido nucleico pode ser modificada utilizando técnicas conhecidas na arte para afetar a expressão de sequências de nucleotídeos e as sequências de nucleotídeos alteradas podem então ser expressas no sistema de expressão transiente da presente invenção para determinar se as modificações atingem o desejado nível de expressão. Este processo pode ser repetido tantas vezes quantas for necessário para se atingir um nível de expressão desejado. Quando se atingir o desejado nível de expressão como indicado pela expressão em um sistema de expressão transiente da presente invenção, a sequência de nucleotí
25/66 deos/molécula de ácido nucleico podem ser usados para transformar estavelmente a planta de soja utilizando métodos conhecidos na arte para a transformação de plantas. Devido ao fato de a expressão transiente de uma sequência de nucleotídios/molécula de ácido nucleico utilizando os métodos da presente invenção ser preditivo do nível de expressão da referida sequência de nucleotídios/molécula de ácido nucleico em uma planta de soja transformada estavelmente, os métodos da presente invenção provêem um método rápido, econômico e eficiente para se avaliar o desempenho de uma sequência de nucleotídios/molécula de ácido nucleico em vez de dar início ao tempo e custos substanciais associados ao desenvolvimento da planta de soja transformada estavelmente com a referida sequência de nucleotídios/molécula de ácido nucleico.
Consequentemente, em uma modalidade de realização, a presente invenção provê um método de se predizer a expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta de soja transformada estavelmente, compreendendo: expressar transientemente uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta de soja através dos métodos da presente invenção; e determinando o nível de expressão da uma ou mais sequências de nucleotídeos, em que o nível de expressão determinado na planta de soja transientemente transformada prediz o nível de expressão em uma planta de soja transformada estavelmente com as referidas uma ou mais sequências de nucleotídeos.
Em modalidades de realização adicionais, a presente invenção provê um método para se otimizar a expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta de soja, compreendendo: (a) expressar transientemente uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta de soja através dos método da presente invenção; (b) determinar o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma ou mais células da planta de soja transientemente transformada do passo (a); (c) modificar pelo menos uma ou mais sequências de nucleotídeos para se otimizar a expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta de soja; (d) expressar transientemente uma ou mais
26/66 sequências de nucleotídeos do passo (c) em uma ou mais células de uma planta de soja através dos método da presente invenção; (e) determinar o nível de expressão da uma ou mais sequências de nucleotídeos da planta de soja transientemente transformada do passo (d); e ou (f) verificando que o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos é otimizada; ou (g) repetindo os passos (c) até (e) uma ou mais vezes e verificar se o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos é otimizada, otimizando desse modo o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta de soja. As sequência(s) da molécula de ácido nucleico otimizada para a expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos podem ser utilizadas para se transformarem estavelmente plantas de soja e/ou partes dessas.
Em modalidades de realização adicionais, a presente invenção provê um método para produzir uma planta de soja transformada estavelmente compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeos otimizadas para a expressão em uma planta de soja, compreendendo, (a) expressar transientemente uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta de soja através dos métodos da presente invenção;
(b) determinar o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico em uma ou mais células da planta de soja transientemente transformada do passo (a); (c) modificar pelo menos uma ou mais sequências de nucleotídeos para otimizar a expressão da referida uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta de soja; (d) expressar transientemente a uma ou mais sequências de nucleotídeos do passo (c) em uma ou mais células de uma planta de soja de acordo com os métodos da presente invenção; (e) determinar o nível de expressão da uma ou mais sequências de nucleotídeos da planta de soja transientemente transformada do passo (d); ou então, (f) verificar que o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos é otimizada; ou (g) repetindo os passos (c) até (e) uma ou mais vezes e verificando que o nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleotídeos é otimizada; e (h) transformar estavelmente uma planta de soja com uma ou mais sequências de nucleotí
27/66 deos do passo (f) ou passo (g) otimizada para a expressão, produzindo desse modo uma planta de soja transformada estavelmente compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeos otimizadas para a expressão em uma planta de soja.
Adicionalmente a presente invenção abrange plantas de soja e/ou partes intatas dessas em concordância com as modalidades de realização desta invenção. Desse modo, em algumas modalidades de realização, a presente invenção provê plantas de soja transientemente transformadas e/ou partes intatas dessas que são produzidas através dos método da presente invenção. Em outras modalidades de realização, a presente invenção provê plantas de soja e/ou partes dessas estavelmente transformadas compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeos optimizadas pelos dos método da presente invenção.
Definições
Como usado aqui, um, uma ou o/a pode significar um ou mais do que um. Por exemplo, uma célula pode significar uma única célula ou várias células.
Como usado aqui, e/ou refere-se a, e engloba, toda e qualquer possível combinação de um ou mais dos itens listados associados, bem como a falta de combinações quando interpretado no alternativo (ou).
Além disso, o termo cerca de, como usado neste documento quando se refere a um valor mensurável tal como uma quantidade de um composto ou agente, dose, tempo, temperatura, idade da planta, densidade ótica, e semelhantes, significa englobar as variações de ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0,5%, ou mesmo ± 0,1% da quantidade especificada.
Conforme usada no presente documento, a expressão transitional que consiste essencialmente de significa que o escopo de uma reivindicação deve ser interpretado como abrangendo os materiais ou etapas especificados na reivindicação e os que não afetam significativamente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção pleiteada. Assim, o termo consistindo essencialmente de quando usado em uma reivindicação dessa invenção não deve ser interpretado como sendo equivalente a compreen28/66 dendo.
Molécula de ácido nucleico Tipo selvagem, ou nativa, sequência de nucleotídios, polipeptídio ou sequência de aminoácidos refere-se a uma molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídios, polipeptídio ou sequência de aminoácidos ocorrendo naturalmente ou endógenas na sua forma de ocorrendo naturalmente ou endógena (por exemplo, compreendendo os mesmos fatores de regulação, na mesma ordem, etc., como encontrado na natureza). Deste modo, um íntron tipo selvagem é um íntron ocorrendo naturalmente em ou endógeno do organismo e está operacionalmente associado a uma sequência de nucleotídeos(s) como encontrado no organismo tipo selvagem.
Como usado neste documento, heteróloga se refere a uma molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotídios que ou são originadas a partir de outras espécies ou são da mesma espécie ou organismo, mas é modificada ou a partir da sua forma original ou da forma primariamente expressa na célula. Deste modo, uma molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotídios derivadas a partir de um organismo ou espécies diferentes a partir das da célula na qual a molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotídios é introduzida, é heteróloga em relação a essa célula e os descendestes da célula. Para, além disso, a sequência de nucleotídios heteróloga inclui uma sequência de nucleotídios derivada de e inserida no mesmo tipo de célula natural, original, mas a qual está presente em um estado não natural, por exemplo, um número de cópias diferente, sob o controle de diferentes sequências reguladoras e/ou em uma posição diferente no genoma do que a encontrada na natureza.
Tal como aqui usado, o termo polipeptídeo engloba ambos os peptídeos e proteínas, salvo indicação em contrário.
Conforme são usados no presente documento, os termos ácido nucleico, molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeos” e polinucleotídeos se referem a RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de fita simples ou dupla, ou um híbrido do mesmo. O termo também abrange híbridos RNA/DNA. Quando o dsRNA é produzido sinteticamente, bases menos
29/66 comuns, tais como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina e outras, podem ser também usadas para dsRNA antissentido e emparelhamento de ribozimas. Por exemplo, polinucleotídeos que contêm análogos de uridina e citidina em C-5 propino demonstraram ligar RNA com alta afinidade e serem potentes inibidores antissentido da expressão de genes. Podem ser também realizadas outras modificações, tais como modificações do esqueleto de fosfodiéster, ou 2'-hidroxi no grupo açúcar ribose do RNA.
Como usado neste documento, o termo sequência de nucleotídios se refere a um heteropolímero de nucleotídeos ou a sequência destes nucleotídios desde a extremidade 5' até 3' de uma molécula de ácido nucleico e inclui moléculas de DNA ou RNA, incluindo cDNA, um fragmento de DNA, DNA genômico, DNA sintético (por exemplo, sintetizado quimicamente), DNA de plasmídio, mRNA, RNA anti-sentido, qualquer dos quais pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. O termo sequência de nucleotídios como usado neste documento inclui também, por exemplo, miRNA, e siRNA, e semelhantes. Os termos sequência de nucleotídeos ácido nucleico, molécula de ácido nucleico, oligonucleotídeo e polinucleotideo são também aqui usados alternadamente para referir um heteropolímero de nucleotídeos. As sequências de ácidos nucleicos aqui fornecidas são aqui apresentadas na direção de 5' para 3', da esquerda para a direita, e são representadas utilizando o código padrão para representação dos caracteres nucleotídicos, tal como definido nas regras de sequência U.S., 37 CFR § §1.821 - 1.825 e a Organização Mundial da Propriedade Intelectual (OMPI) Norma ST.25.
Como usado neste documento, expressão otimizada ou expressão de otimização em relação a uma expressão de uma sequência de nucleotídios e/ou molécula de ácido nucleico refere-se a uma sequência de nucleotídios modificadora de modo a atingir um nível desejado de expressão. Desse modo, a expressão otimizada pode ser maior ou menor em comparação com o nível de expressão de sequência de nucleotídeos antes das modificações feitas à sequência de nucleotídeos ou à molécula de ácido nucleico para a finalidade expressão de otimização.
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Métodos para se modificar uma sequência de nucleotídios ou molécula de ácido nucleico para a finalidade de optimização da expressão da referida sequência de nucleotídios ou molécula de ácido nucleico em uma planta são conhecidos na arte. Esses métodos incluem a seleção de códons adequados para expressão em uma espécie de planta particular (por exemplo, otimizada para uso de códons em soja), modificando (por exemplo, alterando, adicionando ou removendo) uma ou mais sequências reguladoras incluindo, mas não se limitando a, um promotor, um íntron, um terminador, um éxon, um fator de transcrição, e semelhantes. Os níveis de expressão podem ser modificados em um cassete de expressão/molécula de ácido nucleico alterando a posição das sequências do ácido nucleico dentro da molécula de ácido nucleico/cassete de expressão.
Como usado neste documento, o termo gene se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de ser usado para produzir mRNA, RNA antissentido, miRNA, siRNA e os semelhantes. Os genes podem ou não ser capazes de ser usados para produzir uma proteína funcional. Os genes podem incluir regiões codificadoras e não codificadoras (por exemplo, intrões, elementos reguladores, promotores, potenciadores, sequências de terminação e regiões não traduzidas 5' e 3'). Um gene pode ser isolado através do qual se entende um ácido nucleico que é substancialmente ou essencialmente sem componentes normalmente encontrados em associação com o ácido nucleico em seu estado natural. Esses componentes incluem outro material celular, meio de cultura de produção recombinante, e/ou vários químicos usados para sintetizar quimicamente o ácido nucleico.
Conforme são usados no presente documento, os termos fragmento ou porção, quando são empregues com referência a uma molécula de ácido nucleico ou uma sequência nucleotídica deverão ser entendidos como significando uma molécula de ácido nucleico ou uma sequência nucleotídica de comprimento reduzido em relação a uma molécula de ácido nucleico ou uma sequência nucleotídica de referência e compreendendo, consistindo essencialmente de e/ou consistindo de uma sequência nucleotídica de nucleotídeos contíguos ou quase idênticos (por exemplo, 80%, 81%, 82%,
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83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 98%, 99% idênticos) ao ácido nucleico de referência ou à sequência nucleotídica de referência. Tal fragmento de ácido nucleico de acordo com a invenção pode, quando apropriado, fazer parte de um polinucleotídeo maior do qual é um constituinte.
O termo fragmento, como aplicado a um polipeptídeo ou uma sequência de aminoácidos, deverá ser entendido como significandouma sequência de aminoácidos de comprimento reduzido em relação a um polipeptídio ou sequência de aminoácidos de referencia e compreendendo, consistindo essencialmente de, e/ou consistindo de uma sequência de aminoácidos contíguos idênticos ou substancialmente idênticos do polipeptídio ou sequência de aminoácidos de referência. Tal fragmento polipeptídico de acordo com a invenção pode, quando apropriado, fazer parte de um polipeptídeo maior do qual é um constituinte. Em algumas modalidades de realização, tais fragmentos podem compreender, consistir essencialmente de e/ou consistir de peptídeos que têm um tamanho de pelo menos cerca de 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200 ou mais aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo ou sequência de aminoácidos de acordo com a invenção. Um fragmento de um polipeptídio ou proteína pode ser produzido por métodos bem conhecidos e de rotina na arte, por exemplo, por divagem enzimática e/ou outra de peptídeos ou polipeptídeos ocorrendo naturalmente e/ou por protocolos sintéticos que são conhecidos.
Um fragmento polipeptídico pode ser um fragmento biologicamente ativo. Um fragmento biologicamente ativo ou fragmento ativo refere-se a um fragmento que retém uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de referência. Tais fragmentos podem ser testados para atividades biológicas de acordo com métodos descritos na técnica, que são métodos rotineiros para testar a atividade de polipeptídeos e/ou de acordo com quaisquer métodos rotineiros e conhecidos na técnica para identificar tais atividades. A produção de e testagem para identificar fragmentos biologicamente ativos de um polipeptídeo seria bem dentro do escopo de um comum habilitado na arte e deve ser de rotina.
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Uma molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotídeos ou construção de ácido nucleico ou molécula de RNA de cadeia dupla da presente invenção, isolados”, estão geralmente livres de sequências de nucleotídeos que flanqueiam o ácido nucleico de interesse no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucleico foi derivado (tal como sequências codificadoras presentes nas extremidades 5' ou 3'). Todavia, a molécula de ácido nucleico da presente invenção pode incluir algumas bases adicionais ou partes que não afetam prejudicialmente a estrutura básica e/ou as caraterísticas funcionais do ácido nucleico.
Desse modo, uma molécula de ácido nucleico isolada ou sequência de nucleotídeos isolada é uma sequência de nucleotídeos que não é imediatamente contígua com sequências de nucleotídeos com a qual é imediatamente contígua (uma na extremidade 5' e uma na extremidade 3') no genoma do organismo ocorrendo naturalmente a partir do qual são derivadas. Consequentemente, em uma modalidade de realização, um ácido nucleico isolado inclui algumas ou todas as sequências 5' não codificantes (por exemplo, promotoras) que são imediatamente contíguas à sequência codificante. O termo portanto inclui, por exemplo, um ácido nucleico recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídio ou vírus autônomo de replicação, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou o qual existindo como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento de DNA genômico produzido por tratamento PCR ou por endonuclease de restrição) sendo independente de outras sequências. Também inclui um ácido nucleico recombinante que faz parte de uma molécula de ácido nucleico híbrida que codifica um polipeptídeo ou sequência peptídica adicional.
Tal como é aqui utilizado, um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo isolado significa um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo separado ou substancialmente livre de, pelo menos, parte dos outros componentes do organismo que ocorre naturalmente, por exemplo, os componentes celulares ou outros polipeptídeos ou ácidos nucléicos encontrados comumente em associação com o polipeptídeo.
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Assim, o termo isolado pode referir-se adicionalmente a um a molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídio, polipeptídio, peptídio ou fragmento que é substancialmente isento de material celular, material viral, e/ou meio de cultura (por exemplo, quando produzido por técnicas de DNA recombinante), ou percursores químicos ou outros químicos (por exemplo, quando sintetizado quimicamente). Ademais, um fragmento isolado é um fragmento de uma molécula de ácido nucleico, sequência nucleotídica ou polipeptídeo que não é encontrado naturalmente na forma de um fragmento e que não seria encontrado nesta forma no estado natural. Isolado não significa que a preparação é tecnicamente pura (homogênea), mas que é suficientemente pura para fornecer o polipeptídeo ou ácido nucleico em uma forma na qual pode ser usada para a finalidade pretendida.
Em modalidades representativas da invenção, uma molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeos, e/ou polipeptídeo isolado é pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% puro (p/p) ou mais. Em outras modalidades, um ácido nucleico, sequência de nucleotídeos, e/ou polipeptídeo isolado indica que um enriquecimento de pelo menos cerca de 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes, 100.000 vezes ou mais do ácido nucleico (peso/peso) é alcançado em comparação ao material inicial.
Como usado neste documento, polinucleotídeos complementares são aqueles que são capazes de pareamento de bases de acordo com as regras standard de complementaridade de Watson-Crick. Concretamente, as purinas emparelham bases com pirimidinas para formar uma combinação de guanina emparelhada com citosina (G:C) e adenina emparelhada ou com timina (A:T) no caso do DNA, ou adenina emparelhada com uracilo (A:U) no caso de RNA. Por exemplo, a sequência A-G-T liga-se à sequência complementar T-C-A. Entende-se que dois polinucleotídeos podem hibridar um com o outro mesmo se não forem completamente complementares um do outro, desde que cada tem pelo menos uma região que é substancialmente complementar ao outro.
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Os termos complementar ou complementaridade, conforme são usados no presente documento, referem-se à ligação natural dos polinucleotídeos, por emparelhamento de bases, sob condições permissivas de sal e temperatura. Complementaridade entre duas moléculas de cadeia única pode ser parcial, na qual somente alguns dos nucleotídeos se ligam, ou podem estar completas quando total complementaridade existe entre as moléculas de cadeia única. O grau de complementaridade entre as cadeias de ácido nucleico afetou significativamente a eficiência e a força de hibridização entre cadeias de ácido nucleico.
Como usado neste documento, os termos substancialmente complementar ou parcialmente complementar significa que duas sequências de ácido nucleico são complementares a pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% dos seus nucleotídeos. Em algumas modalidades de realização, as duas sequências de ácido nucleico podem ser complementares em pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais dos seus nucleotídios. Os termos substancialmente complementar ou parcialmente complementar também podem significar que duas sequências de ácidos nucleicos podem hibridizar em condições de alta estringência, e essas condições são bem conhecidas na arte.
Como usado neste documento, os termos transformado e transgênico se referem a qualquer planta, célula vegetal, callus, tecido vegetal, ou parte de planta que contem todo ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Um polinucleotídeo recombinante pode ser integrado estavelmente em um cromossomo ou elemento extra-cromossômico estável, de modo a ser passado para gerações sucessivas. Um polinucleotídeo recombinante pode também ser transientemente expresso e, portanto não é passado para gerações sucessivas. Para as finalidades da invenção, o termo polinucleotídeo recombinante se refere a um polinucleotídeo que foi alterado, rearranjado ou modificado por engenharia genética. Os exemplos incluem qualquer polinucleotídeo clonado, ou polinucleotídeos que estejam ligados ou juntos a sequências heterólogas. O termo recombinante não se refere a alterações de polinucleotídeos que resultem de eventos de ocorrên
35/66 cia natural, tais como mutações espontâneas, ou de mutagênese não espontânea seguida de geração seletiva.
O termo transgene conforme usado no presente documento, refere-se a qualquer sequência de nucleotídeos usada na transformação de uma planta, animal ou outro organismo. Assim, um transgene pode ser uma sequência codificadora, uma sequência não codificadora, um cDNA, um gene ou fragmento ou porção desses, uma sequência genômica, um elemento regulador e similares. Um organismo transgênico, tal como uma planta transgênica, microrganismo transgênico, ou animal transgênico, é um organismo no qual um transgene foi aplicado ou introduzido.
Diferentes sequências de nucleotídeos ou sequências polipeptídicas possuindo homologia são chamadas aqui de homólogos. O termo homólogo inclui sequências homólogas da mesma ou de outras espécies e sequências ortologas da mesma e de outras espécies. Homologia refere-se ao nível de similaridade entre duas ou mais sequências de nucleotídeos e/ou sequências de aminoácidos em termos de porcentagem de identidade posicionai (ou seja, similaridade ou identidade de sequências). A homologia também se refere ao conceito de propriedades funcionais similares entre diferentes ácidos nucleicos ou proteínas.
Conforme usado no presente documento, identidade de sequências refere-se à extensão em que duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas alinhadas de forma otimizada não variam em uma janela de alinhamento de componentes, por exemplo, de nucleotídeos ou aminoácidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos incluindo, mas sem limitação, os descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, Nova Iorque (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, Nova Iorque (1991).
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Como usado neste documento, o termo substancialmente idênticos ou correspondente a significa que duas sequências de nucleotídeos têm pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade de sequência. Em algumas modalidades de realização, as duas sequências de nucleotídeos podem ter pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência.
Uma fração de identidade para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são partilhados pelas duas sequências alinhadas dividindo pelo número total de componentes no segmento de sequência de referência, ou seja, toda a sequência de referência ou uma parte mais pequena definida da sequência de referência. Conforme usado no presente documento, o termo porcentagem de identidade de sequências ou porcentagem de identidade referem-se à porcentagem de nucleotídeos idênticos em uma sequência polinucleotídica linear de uma molécula polinucleotídica de referência (consulta) (ou sua fita complementar) em comparação a uma molécula polinucleotídica de teste (objeto) (ou sua fita complementar) quando as duas sequências estão alinhadas de forma otimizada (com um total de inserções, deleções ou espaços apropriados inferior a 20 porcento da sequência de referência na janela de comparação). Em algumas modalidades de realização, porcentagem de identidade pode se referir à porcentagem de aminoácidos idênticos em uma sequência de aminoácidos.
O alinhamento ótimo de sequências para alinhar uma janela de comparação é bem conhecida dos habilitados na arte e podem ser construídas por instrumentos tais como local algoritmo de analogia de Smith e Waterman, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, a pesquisa do método de similaridade de Pearson e Lipman, e opcionalmente por implementações computorizadas desses algoritmos tais como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA disponível como parte do GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Burlington, Mass.). Uma fração de identidade para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são partilhados pelas
37/66 duas sequências alinhadas dividido pelo número total de componentes no segmento da sequência de referência, ou seja, a sequência de referência inteira ou uma parte menor definida da sequência de referência. A porcentagem de identidade de sequência é representada como a fração de identidade multiplicada por 100. A comparação de uma ou mais polisequências de nucleotídeos pode ser com uma polisequência de nucleotídeos de comprimento total ou uma porção dessa, ou com uma polisequência de nucleotídeos mais longa. Para as finalidades da presente invenção, a porcentagem de identidade pode ser também determinada utilizando-se BLASTX versão 2.0 para as sequências nucleotídicas traduzidas e BLASTN versão 2.0 para as sequências polinucleotídicas.
A porcentagem de identidade de sequências pode ser determinada utilizando o programa Best Fit ou Gap do pacote Sequence Analysis Software Package™ (Versão 10; Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wis.). Gap utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, J Mol. Biol. 48:443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências maximizando o número de correspondências e minimiza o número de lacunas. BestFit realiza um alinhamento ótimo do melhor segmento de similaridade entre duas sequências e introduz espaços para maximizar o número de concordâncias utilizando o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482-489, 1981, Smith et al., Nucleic Acids Res. 11:2205-2220, 1983).
Métodos úteis para se determinar a sequência de identidade são também divulgadas em Guide to Huge Computers (Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994)), e Carillo et al. (Applied Math 48:1073(1988)). Mais particularmente, os programas de computador preferidos para a determinação de identidade de sequências incluem, mas sem limitação, os programas Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), que estão disponíveis publicamente no National Center Biotechnology Information (NCBI) da National Library of Medicine, National Institute of Health, Bethesda, Md. 20894; ver Manual BLAST, Altschul et al., NCBI, NLM, NIH; (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)); versão 2.0 ou mais alta dos
38/66 programas BLAST permite a introdução de lacunas (deleções e inserções) nos alinhamentos; para sequência de peptídios pode ser usado BLASTX para determinar a sequência de identidade; e, para polinucleotídeos a sequência BLASTN pode ser usada para determinar a sequência de identidade.
Como discutido previamente, a presente invenção provê métodos vantajosos para a análise dos efeito(s) de qualquer sequência de nucleotídeos, tendo uma função conhecida ou desconhecida, na expressão genética em uma planta de soja intata (por exemplo, elementos de regulação). Desse modo, a expressão ou efeito na expressão de qualquer elemento de regulação pode ser analisada em uma planta de soja utilizando os métodos como descrito neste documento. Exemplos não limitativos de elementos de regulação incluem promotores, melhoradores, introns, sequências alvo, regiões de regulação da transcrição, e regiões de terminação de transcrição, isoladores, sequências Kozak, UTRs 5' ou/e 3', sequências poliA diferentes (terminações), regiões de ligação da matriz (MARS), RNAs standard duplas, microRNA, e semelhantes, e quaisquer sequências não codificantes.
A presente invenção também provê métodos para analisar moléculas de ácido nucleico de elevado peso molecular (maior que 5 kb) tais como cassetes de expressão grandes, genes com introns maiores que 6Kb, engenharia de via metabólica, e empilhamento molecular de características múltiplas de segmentação impulsionada por diferentes promotores e direcionamento para as mesmas ou diferentes organelas.
Em algumas modalidades de realização da presente invenção, as cassetes de expressão são utilizadas para expressão de moléculas de ácido nucleicos e sequências de nucleotídeos. Como usado neste documento, a cassete de expressão significa uma molécula de ácido nucleico tendo pelo menos uma sequência de controle ou de regulação operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos de interesse. Desse modo, por exemplo, os promotores de plantas em associação operacional com as sequências de nucleotídeos a seres expressas são providas em cassetes de expressão para expressão em uma planta, parte de planta e/ou célula vege39/66 tal.
Para as finalidades da invenção, as regiões/elementos de regulação (por exemplo, promotores, melhoradores, sequências alvo, introns, regiões de regulação da transcrição, e regiões de terminação de transcrição) podem ser nativos/análogos de uma planta de soja e/ou as regiões de regulação podem ser nativas/análogas das outras regiões de regulação. De modo alternativo, as regiões de regulação podem ser heterólogas a uma planta de soja e/ou uns aos outros (ou seja, as regiões de regulação). Desse modo, por exemplo, um promotor pode ser heterólogo quando é operacionalmente ligado a um polinucleotídio de uma espécie de diferentes das espécies a partir das quais o polinucleotídeo foi derivado. De modo alternativo, um promotor pode também ser heterólogo a uma sequência de nucleotídeos selecionada se o promotor é da mesma/análoga espécie a partir da qual o polinucleotídeo deriva, mas um ou ambos (ou seja, promotor e polinucleotídeo) são substancialmente modificados a partir da sua forma original e/ou lócus genômico, ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo operacionalmente ligado.
Como usado neste documento, o termo promotor refere-se a uma região de uma sequência de nucleotídeos (por exemplo, um gene ou construção de ácido nucleico) que incorpora os sinais necessários para a expressão eficiente de uma sequência codificante operacionalmente associada com o promotor. Isto pode incluir sequências às quais qualquer RNA polimerase se liga, mas não se limita a essas sequências e pode incluir regiões às quais outras proteínas reguladoras ligam-se conjuntamente com regiões envolvidas no controle da tradução da proteína e pode também incluir sequências de codificação.
Em aspectos particulares, um promotor desta invenção é um promotor capaz de iniciar a transcrição de uma sequência de nucleotídeos em uma célula de uma planta. Esses promotores incluem aqueles que conduzem a expressão de uma sequência de nucleotídeos constitutivamente, aqueles que conduzem a expressão quando induzidos, e aqueles que conduzem a expressão em um modo específico de tecido ou de desenvolvimen
40/66 to, dado que estes vários tipos de promotores são conhecidos na arte.
Exemplos de promotores constitutivos incluem, mas não são limitados a, promotor do vírus cestrum (cmp) (U.S. Patente No. 7,166,770), o promotor de actina 1 de arroz (Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:33993406; assim como a Patente US No. 5,641,876), promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), promotor CaMV 19S (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324), promotor nos (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei USA 84:5745-5749), promotor Adh (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:6624-6629), promotor da sacarose sintase (Yang & Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4144-4148), e o promotor da ubiquitina.
Em algumas modalidades de realização, podem usar-se promotores específicos de tecido. Exemplos não limitativos de promotores específicos de tecidos incluem aqueles associados com genes codificando as proteínas de armazenagem de sementes (tais como β-conglicina, cruciferina, napina e faseolina), zeína ou as proteínas de óleo do organismo (tal como oleosina), ou proteínas envolvidas na biossíntese de ácido gordo (incluindo proteína transportadora de acilo, estearoílo-ACP desaturase e desaturases de ácido gordo (fad 2-1)), e outros ácidos nucleicos expressados durante o desenvolvimento embrionário (tais como Bce4, ver, por exemplo, Kridl et al. (1991) Seed Sei. Res. 1:209-219; assim como a Patente EP No. 255378).
Exemplos adicionais de promotores específicos para tecidos incluem mas não estão limitados aos promotores específicos para raízes RCc3 (Jeong et al. Plant Physiol. 153:185-197 (2010)) e RB7 (Patente U.S. No. 5459252), e promotor da lectina (Lindstrom et al. (1990) Der. Genet. 11:160-167; e Vodkin (1983) Prog. Clin. Biol. Res. 138:87-98), promotor de álcool desidrogenase 1 de milho (Dennis et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000), S-adenosil-L-metionina sintetase (SAMS) (Vander Mijnsbrugge et al. (1996) Plant and Cell Physiology, 37(8):1108-1115), promotor do complexo de captação de luz em milho (Bansal et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3654-3658), promotor de proteína de choque térmico em milho (O'Dell et al. (1985) EMBO J. 5:451-458; e Rochester et al. (1986)
41/66
EMBO J. 5:451-458), promotor de pequena subunidade de RuBP carboxilase em ervilha (Cashmore, Nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase pp. 29-39 In: Genetic Engineering of Plants (Hollaender ed., Plenum Press 1983; e Poulsen et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 205:193-200), promotor de manopina sintase de plasmidio Ti (Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-3223), promotor de nopalina sintase de plasmidio Ti (Langridge et al. (1989), supra), promotor de chalcona isomerase em petúnia (van Tunen et al. (1988) EMBO J. 7:1257-1263), promotor de proteína 1 rica em glicina rica em feijão (Keller et al. (1989) Genes Dev. 3:1639-1646), promotor de CaMV 35S truncada (O'Dell et al. (1985) Nature 313:810-812), promotor de patatina em batata (Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:347-354), promotor de células da raiz (Yamamoto et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449), promotor de zeína em milho (Kriz et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 207:90-98; Langridge et al. (1983) Cell 34:1015-1022; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6425; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449; e Wandelt et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2354), promotor de globulina-1 (Belanger et al. (1991) Genetics 129:863-872), promotor cab de α-tubulina (Sullivan et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:431-440), promotor de PEPCase (Hudspeth & Grula (1989) Plant Mol. Biol. 12:579-589), promotores associados ao complexo de R gene (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183), e promotores de chalcona sintase (Franken et al. (1991) EMBO J. 10:2605-2612). Particularmente útil para a expressão específicas de semente é o promotor de vicilina em ervilha (Czako eta/. (1992) Mol. Gen. Genet. 235:33-40; assim como a Patente U.S. No. 5,625,136).
Outros promotores úteis para a expressão em folhas maduras são aqueles que estão ligados ao início da senescência, tal como o promotor SAG de Arabidopsis (Gan et al. (1995) Science 270:1986-1988).
Além disso, promotores que são funcionais em plastídeos podem ser usados. Exemplos não limitativos de tais promotores incluem a UTR 5' do gene 9 de bacteriófago T3 e outros promotores revelados na patente dos EUA n.° 7.579.516. Outros promotores que são úteis com a presente
42/66 invenção incluem, mas sem limitação, o promotor da subunidade pequena da RuBP carboxilase S-E9 e o promotor do gene do inibidor de tripsina Kunitz (Kti3).
Em alguns casos, podem ser usados promotores induzíveis Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não são limitados a, promotores de sistema repressor de tetraciclina, promotores de sistema repressor Lac, promotores sistema induzível por cobre, promotores de sistema induzível por salicilato (por exemplo, o sistema PR1a), promotores induzíveis por glucocorticóides (Aoyama etal. (1997) Plant J. 11:605-612), e promotores de sistemas induzíveis por ecdisona. Outros promotores induzíveis incluem promotores induzíveis por turgescência e ABA, o promotor do gene da proteína ligado a auxina (Schwob et al. (1993) Plant J. 4:423-432), o promotor de glicosil-transferase flavonóide UDP-glucose (Ralston et al. (1988) Genetics 119:185-197), o promotor do inibidor de proteinase MPI (Cordero et al. (1994) Plant J. 6:141-150), e o promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Kohler et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:1293-1298; Martinez et al. (1989) J. Mol. Biol. 208:551-565; e Quigley et al. (1989) J. Mol. Evol. 29:412421). Também incluídos são promotores de glutationa S-transferase e sistemas induzíveis por benzeno sulfonamida (Patente US No. 5,364,780) e induzíveis por álcool (Publicação do Pedido das Patentes Infis Nos. WO 97/06269 e WO 97/06268). Do mesmo modo, pode usar-se qualquer dos descritos em Gatz (1996) Current Opinion Biotechnol. 7:168-172 e Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108.
Adicionalmente aos promotores descritos acima, uma cassete de expressão pode também incluir outras sequências de regulação. Como usado neste documento, pelo termo sequência de regulação entende-se uma sequência de nucleotídeos localizada a montante (sequências 5' não codificantes), em ou a jusante de uma sequência codificante (sequências 3' não codificantes), e a qual influencia a transcrição, o processamento ou estabilização de RNA, e/ou a translação da sequência codificante associada. Sequências de regulação incluem, mas não são limitados a, melhoradores, sequências líderes de tradução, sequências de sinal de poliadenilação, introns
43/66 e semelhantes. Desse modo, por exemplo, um cassete de expressão da presente invenção pode compreender três componentes: uma sequência promotora, uma sequência codificante (cDNA/janela de leitura aberta) e uma sequência 3' de poliadenilação. Em algumas modalidades de realização da presente invenção, a cassete de expressão pode incluir melhoradores translacionais e/ou transcricionais ou qualquer combinação desses. Em outras modalidades de realização da presente invenção, a cassete de expressão pode incluir dois ou mais melhoradores translacionais e/ou dois ou mais melhoradores transcricional, ou qualquer combinação desses. Os cassetes de expressão podem também incluir sequência Kozak, sequências alvo Nterminais incluindo péptido de trânsito de cloroplasto e péptido de sinal. Exemplos não limitativos de introns uteis com a presente invenção incluem introns do gene Adhl de milho e Intron 1, os quais mostraram aumentar a expressão de gene. Ver, por exemplo, Callis et al. (1987) Genes Develop. 1:1183-1200.
Várias sequências líder não traduzidas derivadas de vírus são também conhecidas para aumentar a expressão de gene e pode realizar-se a análise dos efeitos destas sequências líder na expressão de uma sequência de nucleotídeos selecionada utilizando os métodos da presente invenção. Especificamente, sequências líder do Vírus do Mosaico do Tabaco (VMT, a sequência-ω), do Vírus do Mosqueado Clorótico do Milho (VMCM) e do Vírus do Mosaico da Alfalfa (VMA) mostraram ser eficientes no aumento da expressão (Gallie et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:8693-8711; e Skuzeski et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:65-79). Outras sequências líder conhecidas na técnica incluem, mas sem limitação, líderes picornavírus, tais como uma região líder não codificadora em 5' de encefalomiocardite (EMCV) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); lideres potivírus tais como um líder de Vírus da Gravura do Tabaco (VGT) (Allison et al. (1986) Virology 154:9-20); líder do Vírus do Mosaico Anão do Milho (VMAM) (Allison et al. (1986), supra); líder proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak & Samow (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido de proteína de revestimento mRNA de VMA
44/66 (VMA RNA 4; Jobling & Gehrke (1987) Nature 325:622-625); líder mosaico do tabaco VMT (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA 237-256); e líder MCMV (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Ver também, DellaCioppa etal. (1987) Plant Physiol. 84:965-968.
O cassete de expressão pode também opcionalmente incluir a região de terminação transcricional e/ou translacional (ou seja, a região de terminação) que é funcional em plantas. Uma multiplicidade de terminações transcricionais estão disponíveis para uso em cassetes de expressão e são responsáveis pela terminação de transcrição para além do transgene e correta poliadenilação de mRNA. A região de terminação pode ser nativa da região de iniciação transcricional, pode ser nativa da sequência de nucleotídeos de interesse operacionalmente ligada, pode ser nativa da planta, e/ou pode derivar de outra fonte (ou seja, estranha ou heteróloga ao promotor, a sequência de nucleotídeos de interesse, a planta a ser transformada, ou qualquer combinação desses). Terminações transcricionais apropriadas inclui, mas não são limitados a, o terminador 35S CAMV, o terminador tml, o terminador nopalina sintase e o terminador rbcs E9 de ervilha. Esses podem usar-se tanto em monocotiledôneas como em dicotiledôneas, incluindo soja. Adicionalmente, pode usar-se um terminador de transcrição nativo da sequência codificante.
Independentemente do tipo da sequência(s) de regulação usadas, essas podem ser operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeos de interesse a ser expressa. Como usado neste documento, operacionalmente ligado significa que elementos de uma construção de ácido nucleico tal como um cassete de expressão são configurados de modo a realizar a sua função usual. Portanto, as sequências reguladoras ou controle (por exemplo, promotores) operavelmente ligadas a uma sequência nucleotídica de interesse são capazes de efetuarem a expressão da sequência nucleotídica de interesse. As sequências controle não precisam estar contíguas com a sequência nucleotídica de interesse, contanto que consigam dirigir a expressão da mesma. Assim, por exemplo, sequências intermediárias não traduzidas, mas transcritas, podem estar presentes entre um promotor e
45/66 uma sequência codificante, e pode ainda ser considerado que a sequência do promotor está operavelmente ligada à sequência codificante. Uma sequência de nucleotídeos de interesse pode ser operacionalmente ligada a uma sequência de regulação, permitindo desse modo a sua expressão em uma célula e/ou indivíduo. Em modalidades de realização adicionais da presente invenção, uma sequência sinal poder estar operacionalmente ligada a uma molécula de ácido nucleico ou a uma sequência de nucleotídeos de interesse para direcionar a molécula de ácido nucleico e/ou a sequência de nucleotídeos para um compartimento celular particular.
Uma cassete de expressão pode também incluir uma sequência de nucleotídeos para um marcador selecionável,o qual pode ser usado para selecionar uma planta transformada, parte de planta e/ou célula vegetal. Como usado neste documento, marcador selecionável significa uma molécula de ácido nucleico que quando expressa confere um fenótipo distinto a uma planta, parte de planta e/ou célula vegetal expressando a sequência de marcador e permitindo desse modo que a planta transformada, parte de planta e/ou célula vegetal a ser distinguida daquelas que não têm o marcador (por exemplo, uma planta de soja ou de parte intata dessa que não é transformada). Uma tal molécula de ácido nucleico pode codificar tanto um marcador selecionável ou marcador rastreável, dependendo de quando o marcador confere uma característica que pode ser selecionável por meios químicos, tal como utilizando um agente seletivo (por exemplo, um antibiótico, herbicida, ou afins), ou se o marcador é simplesmente uma característica que pode identificar-se através de observação ou testagem, tais como rastreamento (por exemplo, a característica de local R). Muitos exemplos de marcador selecionáveis adequados são conhecidos na arte e podem usar-se nos cassetes de expressão descritas no presente documento.
Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a, um ácido nucleico codificando neo ou nptll, o qual confere resistência à canamicina, G418, e semelhantes (Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188); um ácido nucleico codificando bar, o qual confere resistência a fosfinotricina; um ácido nucleico codificando uma 5
46/66 enolpiruvilshiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase alterada, o qual confere resistência a glifosato (Hinchee et al. (1988) Biotech. 6:915-922); um ácido nucleico codificando uma nitrilase tal como bxn da Klebsiella ozaenae que confere resistência a bromoxinilo (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); um ácido nucleico codificando uma acetolactato sintase alterada (ALS) que confere resistência a imidazolinona, sulfoniluréia ou outros químicos inibindo ALS (EP Publicação da Patente No. 154204); um ácido nucleico codificando uma di-hidrofolato redutase resistente a metotrexato (DHFR) (Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:12500-12508); um ácido nucleico codificando uma dalapon dehalogenase que confere resistência ao dalapon; um ácido nucleico codificando a manose-6-fosfato isomerase (também referido como fosfomanose isomerase (PMI)) conferindo a capacidade de metabolizar a manose (Patentes US Nos. 5,767,378 e 5,994,629); um ácido nucleico codificando uma antranilato sintase alterada conferindo resistência ao 5-metil triptofano; e/ou um ácido nucleico codificando hph conferindo resistência a higromicina. O profissional é capaz de selecionar um marcador selecionável adequado para utilização em um cassete de expressão dessa invenção.
Marcadores adicionais selecionáveis incluem, mas não são limitados a, um ácido nucleico codificando β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromatogênicos; um ácido nucleico local R codificando um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et al., Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposontagging with Ac pp. 263-282 In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18a Stadler Genetics Symposium (Gustafson & Appels eds., Plenum Press 1988)); um ácido nucleico codificando β-lactamase, uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromatogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica) (Sutcliffe (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-3741); um ácido nucleico codificando xylE que codifica uma catecol dioxigenase (Zukowsky et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1101-1105); a ácido nucleico codificando tirosinase, uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona, a qual por
47/66 sua vez se condensa para formar melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714); um ácido nucleico codificando β-galactosidase, uma enzima para a qual existem substratos cromatogênicos; um ácido nucleico codificando luciferase (lux) que permite a deteção de bioluminescência (Ow et al. (1986) Science 234:856-859); um ácido nucleico codificando aequorina a qual pode ser empregue em deteção de bioluminescência sensível a cálcio (Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 126:1259-1268); ou um ácido nucleico codificando proteína verde fluorescente (Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403-406). O profissional é capaz de selecionar um marcador selecionável adequado para utilização em um cassete de expressão dessa invenção.
Um cassete de expressão pode também incluir uma sequência codificante para um ou mais polipeptídeos para características agronômicas que basicamente são um benefício para uma empresa de sementes, produtor ou processador de grãos, por exemplo, resistência a patógeno bacteriano, resistência a fungos, resistência a herbicidas, resistência a insetos, resistência a nemátodos e/ou resistência a vírus. Ver, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5,304,730; 5,495,071; 5,569,823; 6,329,504 e 6,337,431. A característica pode ser também uma que aumente o vigor da planta ou rendimento (incluindo características que permitem que a planta cresça a diferentes temperaturas, condições de solo e nível de luz solar e precipitação), ou que permite a identificação de uma planta exibindo uma característica de interesse (por exemplo, um marcador selecionável, etc.). Várias características de interesse, assim como métodos de introdução dessas características na planta, são descritas, por exemplo, nas Patentes US Nos. 4,761,373; 4,769,061; 4,810,648; 4,940,835; 4,975,374; 5,013,659; 5,162,602; 5,276,268;
5,304,730; 5,495,071; 5,554,798; 5,561,236; 5,569,823; 5,767,366;
5,879,903, 5,928,937; 6,084,155; 6,329,504 e 6,337,431; assim como a Publicação da Patente US No. 2001/0016956. Ver também, na World Wide Web em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/. Desse modo, em algumas modalidades de realização, a presente invenção provê um método rápido para análise da expressão de sequências de nucleotídeos as quais
48/66 codificam polipeptídeos conferindo importantes características agronômicas em soja ou codificando elementos de regulação que afetam importantes características agronômicas em soja.
Consequentemente, um polipeptídeo útil na presente invenção (por exemplo, polipeptídeo heterólogo) podem ser qualquer polipeptídeo. Exemplos não limitativos de esses polipeptídeos incluem aqueles resultando em características agonomicamente importantes tais como resistência a herbicidas, resistência a vírus, resistência a patógeno bacteriano, resistência a insetos, resistência a nemátodos, e/ou resistência a fungos. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. N°s 5,569,823; 5,304,730; 5,495,071; 6,329,504; e 6,337,431. O polipeptídeo pode também ser um resultando em um aumento no vigor e/ou rendimento da planta (incluindo polipeptídeos que permitem a uma planta crescer a diferentes temperaturas, condições de solo e nível de luz solar e precipitação), e/ou um que permita a identificação de uma planta exibindo uma característica de interesse (por exemplo, gene marcador selecionável, etc.).
Em algumas modalidades de realização da presente invenção, as moléculas de ácido nucleico conferindo resistência (por vezes referida como tolerância) a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como uma imidazalinona ou uma sulfoniluréia podem ser adequadas. Ácidos nucleicos exemplares nesta categoria codificam enzimas ALS e AHAS mutantes como descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5,767,366 e 5,928,937. As Patentes U.S. N° 4,761,373 e 5,013,659 são direcionadas para as plantas resistentes a vários herbicidas imidazalinona ou sulfonamidas. A Patente U.S. N° 4,975,374 refere-se a plantas e células vegetais que contêm um ácido nucleico que codifica uma glutamina sintetase mutante (GS) resistente à inibição por herbicidas que são conhecidos por inibir a GS, por exemplo, fosfinotricina e metionina sulfoximina. A Patente U.S. N° 5,162,602 divulga plantas resistentes à inibição por herbicidas cicloexanodionas e ácidos ariloxifenoxipropanóicos. A resistência é conferida por uma acetilcoenzima A carboxilase alterada (ACCase).
Polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos conferindo re
49/66 sistência a glifosato são também adequados. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 4,940,835 e a Patente U.S. N° 4,769,061. A Patente U.S. N° 5,554,798 revela as plantas de milho transgênico resistentes ao glifosato, resistência essa que é conferida por um gene 5-enolpiruvil-3-fosfochiquimato (EPSP) sintase alterado.
Sequências de nucleotídeos codificando resistência a compostos fosfono tais como glufosinato de amônio ou fosfinotricina, e ácidos fenoxi ou pirídinoxi propiônicos e ciclohexanonas são também adequados. Ver, Pedido de Patente Européia N° 0 242 246. Ver também, as Patentes U.S. N°s 5,879,903, 5,276,268 e 5,561,236.
Sequências de nucleotídeos codificando resistência a herbicidas que inibem a fotossíntese são também úteis na invenção. Herbicidas que inibem fotossíntese incluem mas não são limitados a triazina e um benzonitrilo (nitrilase). Ver, Patente U.S. N° 4,810,648. Sequências de nucleotídeos codificando resistência ao ácido 2,2-dicloropropiônico, setoxidima, haloxifop, herbicidas imidazolinona, herbicidas sulfoniluréia, triazolopirimidina herbicidas, herbicidas s-triazina e bromoxinilo são também úteis. Também adequadas são sequências de nucleotídeos conferindo resistência a uma enzima protox, ou provê resistência aumentada a doenças de plantas; tolerância aumentada a condições ambientais adversas (stresse abiótico) incluindo mas não se limitando a seca, frio excessivo, calor excessivo, ou salinidade excessiva do solo ou extrema acidez ou alcalinidade; e alterações na arquitetura ou desenvolvimento da planta, incluindo alterações no tempo de desenvolvimento. Ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 2001/0016956 e Patente U.S. No. 6,084,155.
Sequências de nucleotídeos úteis para conferir resistência a insetos ou pragas incluem, por exemplo, as que codificam toxinas identificadas em organismos de Bacillus. Ácido nucleicos codificando Bacillus thuringiensis (Bt) toxinas de várias subespécies foram clonadas e os clones recombinantes verificou-se serem tóxicas para larvas de insetos de lepidópteros, dipteros e coleópteros (por exemplo, vários genes de delta-endotoxina tais como CrylAa, CrylAb, CrylAc, Cry1B, Cry1C, Cry1D, CrylEa, CrylFa,
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Cry3A, Cry9A, Cry9C e Cry9B·, assim como genes codificando proteínas inseticidas vegetativas tais como Vip1, Vip2 e Vip3). Uma lista completa das toxinas Bt pode ser encontrada na web mundial na base de dados de Nomenclatura de Toxinas de Bacillus thuringiensis mantida pela Universidade de Sussex (ver também , Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813).
Polipeptídeos que são adequados para produção em plantas incluem ainda aquelas aumentando ou de facilitando de outro modo a conversão da cana colhida em um produto comercialmente útil, incluindo, por exemplo, conteúdo e/ou distribuição em carboidratos aumentado ou alterado, propriedades de fermentação aumentadas, conteúdo em óleo aumentado, aumentado conteúdo em proteína, digestibilidade melhorada, e conteúdo nutracêutico aumentado, por exemplo, conteúdo em fitosterol aumentado, conteúdo em tocoferol aumentado, conteúdo em estanol aumentado e/ou conteúdo em vitamina aumentado. Polipeptídeos da invenção também incluem, por exemplo, os resultando em ou contribuindo para um conteúdo reduzido de um componente não desejado em uma cultura colhida, por exemplo, ácido fítico, ou enzimas de degradação de açúcar. Por resultando em ou contribuindo para entende-se que o polipeptideo da invenção pode contribuir direta ou indiretamente para a existência de uma característica de interesse (por exemplo, aumentando a degradação da celulose pelo uso de uma enzima celulase heteróloga).
Em algumas modalidades de realização da invenção, o polipeptideo pode contribuir para a digestibilidade melhorada para alimentação humana ou animal. As xilanases são enzimas hemicelulolíticas que melhoram a degradação das paredes celulares da planta, o que leva a uma melhor utilização dos nutrientes da planta por um animal. Isto leva a uma taxa de crescimento e conversão dos alimentos aumentadas. Ainda, a viscosidade dos alimentos contendo xilano pode ser reduzida utilizando xilanases. A produção heteróloga de xilanases em células vegetais também pode atuar como facilitadora da conversão lignocelulósica em açúcares fermentáveis no processamento industrial.
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Várias xilanases de microrganismos fúngicos e bacterianos têm sido identificadas e caracterizadas (ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 5,437,992; Coughlin et al. (1993) Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases Espoo; Souminen e Reinikainen, eds. (1993) Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8:125-135; Publicação de Patente U.S. No. 2005/0208178; e Publicação PCT No. WO 03/16654). Em particular, três xilanases específicas (XYL-I, XYL-II, e XYL-III) foram identificadas em T. reesei (Tenkanen et al. (1992) Enzyme Microb. Technol. 14:566; Torronen et al. (1992) Bio/Technology 10:1461; e Xu et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:718).
Em uma outra modalidade de realização, o polipeptídeo da invenção pode ser uma enzima de degradação de polissacarídeo. Plantas produzindo uma tal enzima pode ser útil para gerar, por exemplo, matériasprimas de fermentação para bioprocessamento. Em algumas modalidades, enzimas úteis para um processo de fermentação incluem alfa amilases, proteases, pululanases, isoamilases, celulases, hemicelulases, xilanases, ciclodextrina glicotransferases, lipases, fitases, lacases, oxidases, esterases, cutinases, hidrólise do amido granulado e de outras glucoamilases.
Enzimas que degradam polissacarídeos incluem: enzimas de degradação de amido, como D-amilases (EC 3.2.1.1), glucuronidases (E.C. 3.2.1.131); exo-1,4-D-D glucanases como amiloglucosidases e glucoamilase (EC 3.2.1.3), D-amilases (EC 3.2.1.2), C-glucosidases (EC 3.2.1.20), e outras exo-amilases; enzimas de desramificação de amido, como a) isoamilase (EC 3.2.1.68), pululanase (EC 3.2.1.41), e afins; b) celulases, como exo-1,4-
3-celobiohidrolase (EC 3.2.1.91), exo-1,3-C-D-glucanase (EC 3.2.1.39), Dglucosidase (EC 3.2.1.21); c) L-arabinases, como endo-1,5-C-L-arabinase (EC 3.2.1.99), C-arabinosidases (EC 3.2.1.55) e afins; d) galactanases, como endo-1,4-D-D-galactanase (EC 3.2.1.89), endo-1,3-C-D-galactanase (EC 3.2.1.90), D-galactosidase (EC 3.2.1.22), c-galactosidase (EC 3.2.1.23) e afins; e) mananases, como endo-1,4-C-D-mananase (EC 3.2.1.78), □manosidase (EC 3.2.1.25), D-manosidase (EC 3.2.1.24) e afins; f) xilanases,
52/66 como endo-1,4-G-xilanase (EC 3.2.1.8), D-D-xilosidase (EC 3.2.1.37), 1,3-GD-xilanase, e afins; e g) outras enzimas, como D-L-fucosidase (EC 3.2.1.51), □-L-ramnosidase (EC 3.2.1.40), levanase (EC 3.2.1.65), inulanase (EC 3.2.1.7), e afins.
Além disso, enzimas que podem ser usadas incluem proteases, tais como protéases fungícas e bacterianas. As proteases fúngicas incluem, mas não estão limitadas a, aquelas obtidas a partir de Aspergillus, Trichoderma, Mucor e Rhizopus, tais como A. niger, A. awamori, A. oryzae e M. miehei. Em algumas modalidades, os polipeptídeos dessa invenção podem ser enzimas celobiohidrolase (CBH) (EC 3.2.1.91). Em uma modalidade, a enzima celobiohidrolase pode ser CBH1 ou CBH2.
Outras enzimas (polipeptídeos desta invenção) incluem, mas não são limitadas a, hemicelulases, tais como manases e arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55); ligninases; lipases (por exemplo, E.C. 3.1.1.3), oxidases de glucose, pectinases, xilanases, transglucosidases, alfa-1,6glucosidases (por exemplo, E.C. 3.2.1.20); esterases tais como a esterase do ácido ferúlico (EC 3.1.1.73) e acetilxilana esterases (EC 3.1.1.72); e cutinases (por exemplo, E.C. 3.1.1.74).
Deste modo, introduzindo as sequências de nucleotídeos codificando polipeptídeos de interesse tais como os discutidos acima, a presente invenção provê um meio rápido de analisar os efeitos da sua produção em uma planta de soja intata. Desse modo, por exemplo, plantas intatas, inteiras, que são transientemente transformadas usando os métodos da presente invenção podem ser usadas para testar a resistência/tolerâncias a herbicidas, resistência/tolerâncias a insetos, resistência/tolerâncias a fungos e bactérias, e semelhantes. Em outras modalidades de realização, a planta intata, inteira, que é transientemente transformada utilizando os métodos da presente invenção pode ser usada para investigar a expressão de enzima e digestibilidade.
Em algumas modalidades de realização, a polipeptídeo da invenção também compreender um peptídeo líder. Assim, os métodos da presente invenção poem ser usados para análise do efeito ode um péptideo
53/66 líder na produção de um polipeptídeo. Como é bem conhecido na arte, um peptídeo líder é um peptídeo que é codificado a montante (extremidade 5' da sequência codificante) de uma matriz de leitura aberta maior. Qualquer peptídeo líder pode ser usado com os métodos da presente invenção. Um peptídeo líder pode ser um peptídeo que é encontrado na natureza, ou pode ser um peptídeo sintético concebido para funcionar como um peptídeo líder.
Os exemplos não limitantes de peptídeos líder incluem peptídeos de sinal, peptídeos de trânsito, peptídeos de alvejamento, sequências de sinal, e semelhantes. Tal como é bem conhecido na arte, peptídeos sinal / trânsito direcionam ou transportam uma proteína codificada por um gene nuclear para um organelo particular tal como a mitocôndria, plastídios (por exemplo, apicoplasto, cromoplasto, cloroplasto, cianela, tilacóide, amiloplasto, e os semelhantes), e/ou microcorpos (por exemplo, pequenos organelos ligados a membrana simples, tais como peroxissomos, hidrogenosomas, glioxissomas e/ou glicossoma).
Além disso, os peptídeos líderes são bem conhecidos na arte e podem ser encontrados em bases de dados públicas tais como o Signal Peptide Website: An Information Platform for Signal Sequences and Signal Peptides. (www.signalpeptide.de); a Signal Peptide Database (proline.bic.nus.edu.sg/spdb/index.html) (Choo et al., BMC Bioinformatics 6:249 (2005)(disponivel em www.biomedcentral.com/1471-2105/6/249/abstract); ChloroP (www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/; prevê a presença de peptídeos de transito de cloroplastos (eTP) em sequências de proteínas e a localização dos potenciais locais de divagem da eTP); LipoP (www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/; prevê lipoproteínas e peptídeos de sinal em bactérias Gram-negativas); MITOPROT (ihg2.helmholtzmuenchen.de/ihg/mitoprot.html; prevê as sequências de alvejamento mitocondrial); PlasMit (gecco.org.chemie.uni-frankfurt.de/plasmit/index.html; prevê peptídeos de trânsito mitocondriais em Plasmodium falciparum)·, Predotar (urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html; prevê sequências de alvejamento mitocondriais e de plastídeos); PTS1 (mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1predictor.jsp; prevê proteínas conten
54/66 do o sinal 1 de alvejamento peroxissomal); SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/; prevê a presença e a localização de locais de divagem no péptido de sinal em sequências de aminoácidos de diferentes organismos: Procariotas Gram-positivos, Procariotas Gram-negativos e eucariotas. O método de SinalP incorporara uma previsão dos sítios de divagem e uma previsão de peptídio de sinal/peptídio não de sinal baseada em uma combinação de várias redes neurais artificiais e modelos de Markov não observáveis; e DireçãoP (www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/); prevê a localização subcelular de proteínas eucarióticas - a atribuição do local se baseia na presença de qualquer das présequências prevista N-terminais: péptido de trânsito de cloroplasto (cTP), peptídeo alvo mitocondrial (mTP) ou peptídeo sinal de via secretora (SP)). (Ver também, von Heijne, G., Eur J Biochem 133 (1) 17-21 (1983); Martoglio et al. Trends Ce//B/o/8 (10):410-5 (1998); Hegde et al. Trends Biochem Sci 31(10):563-71 (2006); Dultz et ai. J Biol Chem 283(15):9966-76 (2008); Emanuelsson et al. Nature Protocols 2(4) 953-971(2007); Zuegge et al. 280(1-2):19-26 (2001); Neuberger et al. J Mol Biol. 328(3):567-79 (2003); e Neuberger et al. J Mol Biol. 328(3):581-92 (2003)).
A presente invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos. Estes exemplos não se destinam a limitar o escopo das reivindicações da invenção, mas destinam-se preferencialmente a serem exemplificativos de certas modalidades de realização. Quaisquer variações nos métodos exemplificados que ocorram aos especialistas na técnica são entendidos como estando abrangidos no escopo da presente invenção. EXEMPLOS
Exemplo 1. Construção de vetores e transformação de Agrobacterium
DNA recombinante standard e técnicas de clonagem molecular usadas neste documento são bem conhecidas na arte e são descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I. (1989), Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I. (1984) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,
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Greene Publishing Assoc, e Wiley-lnterscience (1987). Especificamente, a construção 17282 contendo a sequência de nucleotídeos codificando a proteína gus (beta glucuronidase), foi transferida para a estirpe LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens contendo plasmídio auxiliar (pSB1) utilizando métodos standard.
A preparação das culturas de Agrobacterium foi realizada conforme descrito por Azhakanandam et al., Plant Mol. Biol. 63: 393-404 (2007). Resumindo, as agrobactérias geneticamente modificadas foram crescidas ao longo da noite em 50 mL de meio YP contendo 100 μΜ de acetosiringona e 10 μΜ de MES (pH 5,6), e em seguida peletizadas por centrifugação a 4000Xg durante 10 min. Os precipitados foram ressuspendidos em meio de infeção [sais de Murashige e Skoog com vitaminas, 2% de sacarose, 500 μΜ de MES (pH 5,6), 10μΜ MgSO4, e 400 μΜ acetosiringona] a OD6oo=0,5 ou 1,0 e subsequentemente mantidas a 28 graus C durante 2-3 horas.
Exemplo 2. Mudas de soja para agroinfeção (antes e após tratamento)
Sistemas de expressão transiente in-planta foram desenvolvidos utilizando mudas de soja jovens intatas (6-21 dias de idade). Os procedimentos seguintes foram usados para cada um dos Exemplos seguintes. As sementes foram germinadas sob condições de estufa em vasos de 2,5 cheios com mistura de germinação de Fafard. As mudas foram mantidas sob um ciclo de 14/10 dia/noite com uma intensidade de luz de dia de 2000 p-mol-m-
2.s-1 mantida com iluminação suplementar. A temperatura foi mantida constante entre 23°C-26°C Para facilitar a infiltração, as mudas foram regadas 12 horas antes do tratamento para manter as folhas turgidas e os estornas abertos. Os tratamentos específicos das mudas são descritos abaixo.
As plantas tratadas foram transferidas para tabuleiros e mantidas sob as condições da câmara de crescimento estabelecidas a 25 °C com um ciclo de 16/8 dia/noite e uma intensidade de luz de 1900 p-mol-m-2.s-1. As plantas foram cobertas para manter a umidade.
Os tecidos da folha foram colhidos cerca de 3-5 dias após infiltração para análise subsequente. Aproximadamente 20-30 mg de tecido de folhas foram extraídos com 0,5 mL de tampão de extração BB/PVP/Tw (0,1M
56/66 borato, pH 7,5 contendo 0,5% Tween-20 e 0,2% polivinil pirrolidona). Os sobrenadantes foram ensaiados e a proteína total solúvel foi determinada pelo método de BCA (kit de ensaios de Proteína Pierce BCA, Cat# 23223 e 23224) utilizando ovalbumina como um standard.
Exemplo 3. ELISA Quantitativo.
Placas de 96 poços de alta ligação (Nunc Maxisorp) foram revestidas a 4°C durante a noite com 2 pg/mL de IgG anti-GUS de coelho (Sigma G5545) em 25 mM de borato, 75 mM NaCI, pH 8.5 (100 pL/poço). As placas foram lavadas três vezes com Tris 10 mM, pH 8,0 contendo 0,05% de Tween-20 e 0,2% de NaN3. As amostras ou os standards (GUS Type VII-A, Sigma G7646) foram adicionados à placa (100 pL/poço), incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com agitação, e lavadas cinco vezes. 100 pL/poço de 2 pg/mL de IgG anti-GUS de coelho marcado com HRP (Invitrogen A5790 conjugado a HRP) foram depois adicionados à placa, incubada durante 1 h à temperatura ambiente com agitação, e lavada como anteriormente. O anticorpo conjugado a HRP foi detetado adicionando 100 pL/poço de tetrametilbenzidina (TMB, Sigma T0440) e desenvolvimento durante 30 min à temperatura ambiente. A reação foi parada pela adição de 100 pL/poço de HCI 0,1N. A absorbância foi medida a 450nm com 620 como referência utilizando um leitor de microplacas (Tecan Sunrise, Research Triangle Park, NC). A curva padrão de GUS emprega um ajustamento da curva de 4 parâmetros. A curva é representada graficamente linear versus log com um intervalo desde 0 a 320 ng/ml.
Exemplo 4: Infiltração de soja assistida por vácuo.
Para cada um dos tratamentos no Exemplo 4, usou-se a estirpe LBA4404 de Agrobacterium (pSB1) contendo 17282 construções com GUS. A concentração das células bacterianas no meio de infeção foi OD6oo de cerca de 1,0. Quatro plantas (16 dias após a germinação) foram usadas por tratamento e foram analisadas seis amostras por planta (colhidas a partir de duas folhas trifoliadas). Para a análise ELISA (ver Exemplo 3), as amostras foram colhidas 4 dias após infiltração.
Tratamento 1 Infiltração somente com vácuo. As plantas foram
57/66 imersas em uma solução (meio de infeção) compreendendo células de Agrobacterium (preparada como descrito no Exemplo 1) e foi aplicado um vácuo. O meio de infeção incluiu sais de Murashige e Skoog com vitaminas, 2% de sacarose, 500 μΜ de MES (pH 5,6), 10 μΜ de MgSO4, e 400 μΜ de acetosiringona. Um alto vácuo de bancada foi usado e o vácuo foi aplicado a 25 cm Hg durante cerca de 1-2 minutos. Após libertação do vácuo, a solução de Agrobacterium penetrou nos espaços intercelulares das folhas.
Tratamento 2: Infiltração de etanol e vácuo. Usou-se ma toalha de papel umedecida com etanol a 70% para limpar a página inferior das folhas (superfície abaxial da folha) para remover o material ceroso. A seguir à remoção das ceras cuticulares com o etanol, as plantas tratadas foram imersas em uma solução (ou meio de infeção) compreendendo Agrobacterium e um foi aplicado vácuo tal como acima descrito no Tratamento 1. Após libertação do vácuo, a solução de Agrobacterium penetrou nos espaços intercelulares das folhas.
Tratamento 3: Infiltração com surfatante e vácuo. Um surfatante não iônico, Silwet L-77®, a uma concentração de 0,04%, foi incluído na cultura de suspensão de Agrobacterium (meio de infeção) usado para a infeção (descrita acima no Tratamento 1). Assim, as plantas foram imersas no meio de infeção compreendendo o surfatante e foi aplicado vácuo tal como acima descrito no Tratamento 1. Após libertação do vácuo, a solução de Agrobacterium penetrou nos espaços intercelulares das folhas.
Tratamento 4: Infiltração por papel de lixa e vácuo: Papel de lixa de óxido de alumínio 3M (extrafino) foi pressionado contra o lado abaxial da folha inteira para fazer uma abrasão suave na superfície da folha antes da aplicação do vácuo. As folhas abrasadas foram imersas em uma solução (ou meio de infeção) compreendendo Agrobacterium e foi aplicado vácuo tal como acima descrito no Tratamento 1. Após libertação do vácuo, a solução de Agrobacterium penetrou nos espaços intercelulares das folhas.
Tratamento 5: etanol a 70 %, papel de lixa, surfatante, e infiltração de vácuo. Usou-se uma toalha de papel umedecida com etanol a 70% para limpar a página inferior das folhas (superfície abaxial da folha) para re
58/66 mover o material ceroso. No seguimento da remoção das ceras cuticulares com o etanol, as folhas foram depois abrasadas com papel de lixa tal como acima descrito no Tratamento 4. As plantas tratadas com álcool/papel de lixa foram imersas em uma solução (ou meio de infeção) compreendendo Agrobacterium e um surfatante não iônico, Silwet L-77®, a uma concentração de 0,04% (como descrito no Tratamento 3 acima). Foi aplicado um vácuo tal como acima descrito no Tratamento 1. Após libertação do vácuo, a solução de Agrobacterium penetrou nos espaços intercelulares das folhas.
Tratamento 6: Infiltração por papel de lixa, surfatante, e vácuo. Papel de lixa de óxido de alumínio 3M (extrafino) foi pressionado contra o lado abaxial da folha inteira para fazer uma abrasão suave na superfície da folha antes da aplicação do vácuo. As folhas abrasadas foram imersas em uma solução (ou meio de infeção) compreendendo Agrobacterium e um surfatante não iônico, Silwet L-77®, a uma concentração de 0,04%. Foi aplicado um vácuo tal como acima descrito no Tratamento 1. Após libertação do vácuo, a solução de Agrobacterium penetrou nos espaços intercelulares das folhas.
Tratamento 7: Infiltração por etanol a 70 %, papel de lixa, e vácuo. Usou-se uma toalha de papel umedecida com etanol a 70% para limpar a página inferior das folhas (superfície abaxial da folha) para remover o material ceroso. No seguimento da remoção das ceras cuticulares com o etanol, as folhas foram depois abrasadas com papel de lixa tal como acima descrito no Tratamento 4. As plantas tratadas com álcool/papel de lixa foram imersas em uma solução (ou meio de infeção) compreendendo Agrobacterium e foi aplicado um vácuo tal como acima descrito no Tratamento 1. Após a libertação do vácuo a solução de Agrobacterium penetrou os espaços intercelular das folhas.
Tratamento 8: Infiltração por etanol a 70 %, surfatante, e vácuo. Usou-se ma toalha de papel umedecida com etanol a 70% para limpar a página inferior das folhas (superfície abaxial da folha) para remover o material ceroso. No seguimento da remoção das ceras cuticulares com o etanol, as plantas tratadas com álcool foram imersas em uma solução (ou meio de in59/66 feção) compreendendo Agrobacterium e um surfatante não iônico, Silwet L77®, a uma concentração de 0,04%. O meio de infeção compreendendo o surfatante é descrito no Tratamento 3, acima. Foi aplicado um vácuo tal como acima descrito no Tratamento 1. Após libertação do vácuo, a solução de 5 Agrobacterium penetrou nos espaços intercelulares das folhas.
Os dados dos Tratamentos 1-8 acima são providos na Tabela 2, a seguir.
Tabela 2. Infiltração de plantas de soja com estirpes de Aqrobacterium contendo 17282 (qus) utilizando vácuo sozinho ou com diferentes tratamentos 10 tal como acima descrito.
Genotipo T ratamento Proteína marcadora GUS Média* (proteína solúvel total marcadora GUS ng/mg (TSP))
var. Jack 1. Somente o vácuo 1,46
2. Etanol e vácuo 51,08
3. Surfatante e vácuo 72,19
4. Papel de lixa e vácuo 219,81
5. Etanol, papel de lixa, surfatante e vácuo 497,16
6. Papel de lixa, surfatante e vácuo (sem etanol) 362,09
7. Etanol, papel de lixa e vácuo (sem surfatante) 127,87
8. Etanol, surfatante e vácuo (sem papel de lixa) 44,38
*Quatro plantas (16 dias de idade) foram usadas por tratamento.
Tabela 3 Análise estatística dos resultados dos diferentes tratamentos na tabela 2 utilizando o teste t de student.
teste-t Valor P (nível de significância de 0,01)
Etanol, papel de lixa, surfatante e vácuo (Tratamento 5) vs papel de lixa, surfatante e vácuo (ou seja, sem etanol; Tratamento 6)) 0,241428184
Etanol, papel de lixa, surfatante e vácuo (Tratamento 5) vs etanol, surfatante e vácuo (ou seja, sem papel de lixa; Tratamento 8)) 0,000198537029889437**
60/66
Tabela 3 Análise estatística dos resultados dos diferentes tratamentos na tabela 2 utilizando o teste t de student.
teste-t Valor P (nível de significância de 0,01)
Etanol, papel de lixa, surfatante e vácuo (Tratamento 5) vs surfatante e vácuo (ou seja, sem papel de lixa/sem etanol; Tratamento 3)) 0,0000300895046502825**
Etanol, papel de lixa, surfatante e vácuo (Tratamento 5) vs etanol, papel de lixa e vácuo (ou seja, sem surfatante; Tratamento Ό) 0,0000736544148373222**
Etanol, papel de lixa, surfatante e vácuo (Tratamento 5) vs papel de lixa e vácuo (T ratamento 4) 0,00577380673221763**
Etanol, papel de lixa, surfatante e vácuo (Tratamento 5) vs etanol e vácuo (Tratamento 2) 0,000020995769469533**
Etanol, papel de lixa, surfatante e vácuo (Tratamento 5) vs vácuo (Tratamento 1) 2.33196549717962E-08**
** significativamente diferente
Os vários tratamentos usados para estabelecer o sistema de expressão transiente in planta da soja é sumariado na Tabela 2. Os resultados revelaram que a utilização de infiltração somente por vácuo foi ineficiente 5 para a soja com pequena ou sem expressão GUS obtida nas folhas de soja infiltradas (somente uma amostra de folha para além das 24 amostras colhidas das quatro plantas infiltradas foi positiva para a expressão GUS). Um tal nível de expressão não é útil para a avaliação de cassetes de expressão ou de sequências de regulação em soja. No entanto, a combinação de infiltra10 ção por abrasivo (papel de lixa), surfatante e vácuo ou álcool (etanol), infiltração por abrasivo, surfatante e vácuo proveu uma surpreendente melhoria no sistema transiente in planta para a soja. Como pode ser visto a partir de Tabelas 2 e 3, os níveis de expressão foram significativamente melhorados utilizando os métodos da presente invenção com Tratamento 5 (infiltração 15 por álcool, papel de lixa, surfatante e vácuo) provendo o mais alto nível de expressão GUS. Portanto, enquanto a infiltração somente com vácuo foi ine
61/66 ficiente no estabelecimento de um ensaio de expressão transiente in planta de soja, a sua combinação com um abrasivo e surfatante ou um álcool, abrasivo e surfatante foi surpreendentemente eficiente.
Exemplo 5: Infeção por Agrobacteríum das folhas de soja sem vácuo:
Plantas de soja com dezasseis dias de idade foram pré-tratadas com álcool (etanol a 70%), abrasadas com papel de lixa fino e imersas (mergulhadas) em um meio de infeção compreendendo células de Agrobacteríum e um surfatante. Usou-se ma toalha de papel umedecida com etanol a 70% para limpar a página inferior das folhas (superfície abaxial da folha) para remover o material ceroso. No seguimento da remoção das ceras cuticulares com o etanol e antes da aplicação de vácuo, o lado abaxial da superfície da folha foi depois abrasada com papel de lixa de óxido de alumínio 3M (extrafino) pressionando o papel de lixa contra toda a folha para provocar uma abrasão suave na superfície da folha. As folhas tratadas/abrasadas com etanol foram imersas (mergulhadas) em uma solução compreendendo células de Agrobacteríum (LBA4404 compreendendo a construção 17282; descritas acima no Exemplo 1) (ou seja, meio de infeção) durante 5 minutos à temperatura ambiente. O meio de infeção incluiu sais de Murashige e Skoog com vitaminas, 2% de sacarose, 500 μΜ de MES (pH 5,6), 10 μΜ de MgSO4, e 400 μΜ de acetosiringona. Imediatamente antes da imersão/mergulho das plantas, um surfatante, 0,04% Silwet®, adicionou-se ao meio de infeção.
As plantas tratadas foram removidas da solução e transferidas para tabuleiros e mantidas sob as condições de câmara de crescimento definidas a 25 °C com um ciclo 16/8 dia/noite e uma intensidade de luz 1900 μmol-m-2.s-1. As plantas foram cobertas para manter a umidade.
Foram usados dois controles negativos. O controle negativo de Agrobacteríum incluiu o tratamentodas folhas intatas (lado abaxial) da planta de soja com álcool, abrasão da superfície das folhas intatas e depois mergulhando a planta intata com as folhas tratadas em meio de infeção compreendendo estirpes de Agrobacteríum LBA4404 (pSB1) sem qualquer sequência de nucleotídeos codificando gus. Um controle negativo adicional incluiu plantas de soja tipo selvagem da mesma variedade (Jack) sem qualquer trata62/66 mento (plantas tipo selvagem não infiltradas).
Os tecidos das folhas foram colhidos quatro dias após infiltração para análise subsequente. Aproximadamente 20-30 mg de tecido de folhas foram extraídos com 0,5 mL de tampão de extração BB/PVP/Tw (0,1M borato, pH 7,5 contendo 0,5% Tween-20 e 0,2% polivinil pirrolidona). Os sobrenadantes foram ensaiados e a proteína total solúvel foram determinados pelo método de BCA (kit de ensaios de Proteína Pierce BCA, Cat# 23223 e 23224) utilizando ovalbumina como um standard. Os dados são apresentados na Tabela 4.
Tabela 4. Aqroinfeção sem infiltração por vácuo.
Genotipo Tratamento Proteína marcadora GUS Média* (GUS ng/mg TSP)
Jack Álcool, abrasão e mergulho em estirpes de Agrobacterium LBA4404 (pSB1) + construção 17282 (gus) 370.19 ± 169.83
Álcool, abrasão e mergulho em estirpes de Agrobacterium LBA4404 (pSB1) (controlo negativo) 0
Plantas tipo selvagem não infiltradas (controlo negativo) 0
*A experiência foi repetida duas vezes utilizando 4 plantas por experimento.
As plantas de soja são difíceis de infiltrar e obter significativa expressão das sequências de nucleotídeos de interesse utilizando vetores binários com qualquer dos métodos existentes, tais como uma seringa sem a agulha ou via infiltração por vácuo. No entanto, os métodos da presente invenção demonstram uma bem sucedida e nova abordagem que provê significativa expressão de sequências de nucleotídeos de interesse in planta (plantas negativas intatas) sistema de expressão transiente utilizando vetores binários sem uma seringa ou infiltração de vácuo. Estes métodos provêem métodos não dispendiosos e simples para triar, por exemplo, cassetes de expressão.
Exemplo 6: Triagem rápida da eficácia de um gene de resistência a insetos
63/66 (vip3a) utilizando um bioensaio com insetos.
Para validar a utilidade do sistema de expressão transiente in planta descrito na presente invenção, um bioensaio com insetos foi realizado em cinco plantas infiltradas com células de Agrobacterium compreendendo uma construção (17406) compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando vip3a. vip3a é uma proteína 89-kDa secretada por Bacillus thuringiensis durante o crescimento vegetativo.
Especificamente, toalha de papel umedecida com etanol a 70% foi usada para limpar a página inferior das folhas (superfície abaxial da folha) para remover o material ceroso. No seguimento da remoção das ceras cuticulares com o etanol, as plantas tratadas com álcool foram imersas em uma solução (ou meio de infeção) compreendendo Agrobacterium e um surfatante não iônico, Silwet L-77®, a uma concentração de 0,04%. O meio de infeção compreendendo o surfatante é descrito no Exemplo 4, Tratamento 3, acima. Foi aplicado um vácuo tal como acima descrito no Exemplo 4, Tratamento 1. Após libertação do vácuo, a solução de Agrobacterium penetrou nos espaços intercelulares das folhas.
O tecido foliar foi colhido 4 dias após a infiltração. As folhas infiltradas foram sujeitas a alimentação por insetos durante 7 dias e as leituras foram tomadas aos 7-8° dias. Os dados são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Bioensaio de insetos utilizando folhas de soja transientemente infetadas com a construção A compreendendo a sequência de nucleotídeos codificando a proteína vip3a.
Nome da amostra Réplica # 1 Réplica # 2
Vivas Larvas Mortas Larvas % Mortalidade Folha % Danos Vivas Larvas Mortas Larvas % Mortalidade Folha % Danos
Controle de Vetor (negativo) 10 0 0 100 9 0 0 100
Meio de infeção (negativo) 10 0 0 100 10 0 0 90
Não filtrada (negativo) 10 0 0 40 10 0 0 80
construção A (vip3a) 0 10 100 0 0 9 90 0
64/66
Nome da amos- tra Réplica # 1 Réplica # 2
Vivas Larvas Mortas Larvas % Mortalidade Folha % Danos Vivas Lar- vas Mortas Larvas % Mortalidade Folha % Danos
construção A (vip3a) 2 8 80 30 0 10 100 0
construção A (vip3a) 0 10 100 2 1 9 90 10
construção A (vip3a) 0 10 100 0 0 10 100 0
construção A (vip3a) 0 10 100 0 0 9 90 2
Os resultados deste experimento mostraram que a expressão de vip3a em soja utilizando o sistema de expressão transiente da soja in planta como descrito neste documento resulta na queda da mortalidade lagarta do cartucho de 80-100%. Os controles (controle de vetor (por exemplo, Agrobacterium contendo vetores binários sem vip3a), só o meio de infeção (ou seja, sem Agrobacterium) e plantas de soja tipo selvagem não infiltradas)) mostram pequena ou nenhuma mortalidade (Tabela 5).
Exemplo 7: Sistema de expressão transiente de soja in-planta como uma modelo de preditivo para a expressão de construções em plantas de soja estavelmente transformadas.
Utilizando a soja em sistema de expressão transiente in planta envolvendo o método de infiltração de vácuo como descrito no Tratamento 5 (Exemplo 4), ou a soja em sistema de expressão transiente in planta nas quais nenhuma infiltração por vácuo é usada como descrito no Exemplo 5, duas construções foram usadas para testar o modelo de expressão preditivo. Cada construção inclui uma sequência de nucleotídeos codificando uma HPPD4-hidroxifenilpiruvato desidrogenase) de Avena sativa (aveia). Na construção B, a sequência de nucleotídeos é otimizada no códon para a expressão em soja enquanto a construção C têm uma sequência codificante HPPD tipo selvagem de aveia. Para, além disso, ambas as construções têm promotores virais mínimos adicionalmente aos melhoradores. A construção B tem um melhorador de transcrição (região melhoradora do vírus do mosaico de Escrofulária (FMV)) e uma sequência líder VMT Omega 5'UTR conhe65/66 cida para aumentar a expressão) e a construção C tern um potenciador transcricional duplo (FMV + 35S (região melhoradora de virus do mosaico da Escrofulária (FMV), regiões melhoradoras 35S do virus do mosaico da couve-flor) e também um melhorador translacional, sequência líder VMT Omega 5 5'UTR. Os resultados para os métodos utilizando infiltração de vácuo são providos na Tabela 6 e os resultados para os métodos sem infiltração de vácuo são providos na Tabela 7.
Tabela 6. Comparação da expressão de HPPD em sistema de expressão transiente de soja in-planta (utilizando infiltração por vácuo) versus expressão de HPPD em plantas de soja transformadas estavelmente.
Construções Média* da Expressão HPPD [ng/mg (Proteína solúvel total)]
Transiente Plantas transgênicas estáveis
construção B (HPPD optimizado para Códon) 2,46 260,12
construção C (HPPD optimizado para não-Códon) 93,09 2396,17
Plantas tipo selvagem não infiltradas (controlo negativo) 0 0
Infiltração somente com meio de infeção (controlo negativo) 0 0
* As primeiras folhas das quatro plantas (16 dias de idade) foram usadas por ratamento
Tabela 7. Comparação da expressão de HPPD no sistema de expressão transiente de soja in-planta sem infiltração por vácuo versus expressão de HPPD em plantas de soja transformadas estavelmente.
Construções Média* da Expressão HPPD [ng/mg (Proteína solúvel total)]
Transiente Plantas transgênicas estáveis
construção B (HPPD optimizado para Códon) 0,78 260,12
construção C (HPPD optimizado para não-Códon) 26,61 2396,17
Plantas tipo selvagem não infiltradas (controlo negativo) 0 0
Infiltração somente com meio de infeção (controlo negativo) 0 0
* As primeiras folhas das quatro plantas (16 dias de idade) foram usadas por tratamento
66/66
Ambas, as Tabela 6 e Tabela 7, mostram que a expressão de uma construção em tecido de folha de soja transientemente transformada pode ser preditiva para o nível de expressão da mesma construção que é transformada estavelmente em uma planta de soja. Nos exemplos providos nas Tabela 6 e Tabela 7, o nível de expressão no HPPD optimizado de códon foi baixo quando comparado para expressão da construção HPPD otimizada de não códon em ambos os sistemas de expressão transiente de soja da presente invenção e plantas de soja transformadas estavelmente. Desse modo, o sistema de expressão transiente in-planta desta invenção pode ser usado para determinar ou predizer se uma construção particular deverá ser expressa com sucesso a um nível ótimo em uma planta transformada estavelmente. Os dois diferentes sistemas de expressão transiente de soja inplanta, descritos no presente documento podem ser também usados para testar a expressão de múltiplas sequências de nucleotídeos. As múltiplas sequências de nucleotídeos podem ser compreendidas em um vetor único compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeos. De modo alternativo, múltiplos vetores podem usar-se com cada vetor compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeos a serem expressos.
A vantagem da testagem no sistema de expressão transiente inplanta da presente invenção é que significativos recursos podem ser salvos determinando quais construções irão funcionar e quais não irão. Se uma construção não funciona, podem ser feitos ajustamentos (por exemplo, a posição de sequência de nucleotídeos dentro da construção pode ser alterada) e a construção testada de novo. Desse modo, a eficiência de uma construção pode ser testada para custo relativamente baixo versus os dispêndios relacionados com plantas estavelmente transformadas e depois regenerando e crescendo as plantas transformadas estavelmente até um ponto no qual podem ser testados os níveis de expressão.
O que precede é ilustrativo da presente invenção, e não deve ser interpretado como limitando o âmbito da mesma. A invenção é definida pelas seguintes reivindicações, com equivalentes das reivindicações a serem nelas incluídos.

Claims (10)

1. Método para expressar transientemente uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma ou mais células de uma planta inteira intacta de soja caracterizado por compreender:
a) colocar em contato a superfície de uma planta de soja intacta e/ou parte intacta da planta com um abrasivo;
b) colocar em contato a folha da planta de soja abrasada e/ou a planta de soja inteira compreendendo a folha com uma solução compreendendo células bacterianas competentes para transferir ácido nucleico e um surfactante, em que as células bacterianas compreendem uma ou mais das sequência (s) de nucleotídeos(s) a serem expressadas transientemente, e em que as referidas células bacterianas são células de Agrobacterium;
c) aplicar um vácuo à planta de folha de soja imersa colocada em contato e/ou parte intacta da mesma da etapa b); e/ou a planta de soja inteira compreendendo a referida folha da etapa b); e
d) libertar o vácuo, introduzindo desse modo a solução na folha de soja abrasada, de modo que a uma ou mais sequências de nucleotídeos são transientemente expressas em uma ou mais células da planta de soja.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do surfactante ser selecionado a partir do grupo consistindo em polietoxilato de trisiloxano fechado na extremidade com metila, polisorbato 20, etoxilato de octil fenol, 2-(3-hidroxipropil)-heptametil-trisiloxano e qualquer combinação desses.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato do referido contato na etapa b) compreender imergir a folha abrasada e/ou a planta de soja inteira compreendendo a referida folha na solução.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
3, caracterizado pelo fato do referido abrasivo compreender papel de lixa.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
4, caracterizado pelo fato que na etapa a) o lado abaxial da folha de soja é colocado em contato com o abrasivo.
Petição 870200022040, de 14/02/2020, pág. 11/12
2/2
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender ainda colocar em contato o lado abaxial da folha com o álcool antes da etapa a).
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo 5 fato do álcool ser etanol.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da pressão de vácuo estar em uma faixa de 5 psi até 30 psi e do tempo para aplicar o vácuo ser de 30 segundos até 5 minutos.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo
10 fato da etapa c) e da etapa d) serem repetidas.
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