CN101553570B

CN101553570B - 通过调控谷氨酰胺合成酶的活性改进植物的籽粒的生产能力

Info

Publication number: CN101553570B
Application number: CN200780036953.1A
Authority: CN
Inventors: 贝特朗·伊雷尔; 帕斯夸尔·佩雷斯
Original assignee: Genoplante Valor SAS
Current assignee: Genoplante Valor SAS
Priority date: 2006-10-09
Filing date: 2007-10-09
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2027-10-09
Also published as: EP2078088A2; EP1911847A1; US20100107280A1; EP2636745A1; US20130185829A1; ES2565098T3; US8426704B2; ZA200902012B; WO2008044150A2; CA2665739A1; CN101553570A; AU2007306040B2; US9422571B2; AU2007306040A1; EP2078088B1; WO2008044150A3

Abstract

本发明涉及一种提高玉米植物籽粒生产能力的方法，其中所述方法包括在所述植物中过量表达一种谷氨酰胺合成酶同工酶，以便增加籽粒的数目和/或大小。

Description

通过调控谷氨酰胺合成酶的活性改进植物的籽粒的生产能力

技术领域

本发明涉及通过对谷氨酰胺合成酶(GS)活性的调控来控制植物(特别是谷类作物，优选是玉米作物)的产量的方法。

背景技术

包括玉米、小麦和稻的谷类占全世界粮食产量的70％。当为了蛋白质含量而种植此类作物时，它们需要大量氮肥以达到最大的产量。过去几年中，对氮使用效率(nitrogen useefficiency，NUE)已经有相当大的兴趣，NUE可以被定义为土壤中每单位氮(N)的籽粒(kernal)产量，而N利用效率(N utilization efficiency，NutE)是每个被吸收的N的产量。(Hirel and Lemaire，A.Basra，and S.Goyal，eds.(Haworth′s Food Product Press.Binghamton，New-York)，15：213-257，2005)。已经进行了许多生理学和农学的研究来鉴别在植物生长和发育过程中哪些是控制N吸收、同化以及再循环的限制性步骤(Jeuffroy et al.J.Exp.Bot.，53 809-823，2002)，这些包括谷类，诸如玉米(Hirel et al.et al.Physiol.Plant，124：178-188，2005b)、稻(Yamaya et al.et al.，J.Exp.Bot.，53：917-925，2002)以及最近的小麦(Kicheyet al.，New Phytol.，169：265-278，2006)。利用玉米作为一种模型作物，Hirel等人(如上所述，2005b)已经研究了在叶生长的不同阶段以及在籽粒灌浆期的植物发育的不同时期，在单片叶内涉及N代谢的代谢物浓度以及酶的活性的变化。结论是总N、叶绿素、可溶性蛋白含量以及GS活性是很强地相互关联的，并且是主要反映个体叶片关于N同化以及再循环的代谢活性的指标，无论施N肥的水平如何。

谷氨酰胺合成酶(GS；E.C.6.3.1.2)催化根据下列反应的无机氮(铵)转化成谷氨酰胺：

三磷酸腺苷+L-谷氨酸酯+NH₃＝＞二磷酸腺苷+磷酸盐+L-谷氨酰胺。

一种植物中的所有的氮，不论最初得自硝酸盐、铵离子、固氮作用，或通过在该植物内释放铵的其他反应生成(甘氨酸在光呼吸作用期间的脱羧反应、N转运化合物的代谢以及苯丙氨酸氨裂解酶的作用)，都是通过由GS催化这些反应而获得的。因此，这种酶很可能是一个控制植物生长和生产能力的主要控制点(Miflin and Habash，J.Exp.Bot.，53(370)：979-87，2002)。

在玉米中，GS对于籽粒生产能力的公认的作用也已经利用定量的遗传方法突出显示。叶酶活性的QTL与产量的QTL已经被证明是一致的(Hirel et al.，Plant Physiol.，125：1258-1270，2001)，并且已经观察到在籽粒产量以及GS活性之间的一种正相关性(Gallaisand Hirel，J.Exp.Bot.，55：295-306，2004)。关于N从叶、茎以及整个植物的再转移、开花期后的N摄取(Gallais和Hirel，如上所述，2004)以及萌芽效率(Limami et al.，Plant Physiol.，130：1860-1870，2002)已经识别出了GS基因座的进一步的QTL。GS在控制谷物生产能力的重要性最近已经通过一项在稻中做的研究而得以加强，在这项研究中，在胞质GS缺陷的一种突变型中，观察到生长率和籽粒产量都有一个强烈下降(Tabuchi et al.，Plant J.，42：641-655，2005)。

在包括玉米的高等植物中的GS通过标准色谱分析、定位法以及蛋白质印迹技术可以被容易地分离成细胞质型(GS1)以及质体型(GS2)(Hirel and Lea，In：Plant Nitrogen，R.J.Lea and J.F.Morot-Gaudry，eds(INRA，Springer)，pp.79-99，2001)。然而，这种区别并不像最初想象的那样简单，因为虽然仅仅一个基因已经被证明编码该质体型，但是高达五个基因的一个小家族现在已知编码该细胞质型(Cren and Hirel，Plant Cell Physiol.，40：1187-1193，1999)。初期的实验表明这五个细胞质型GS基因在玉米的根、茎以及叶中被有差别地表达。(Sakakibara et al.，Plant Cell Physiol.，33：1193-1198，1992；J.Biol.Chem.，271：29561-29568，1996；Li et al.，Plant Mol.Biol.，23：401-440，1993)。GS1-2是发育中的籽粒的一种重要的GS同工酶，它在花梗和粒壳中很丰富，但是也已经被证明存在于玉米植物的未成熟的雄花蕊、裂开的花药、籽粒的颖片、穗的苞叶、穗轴以及茎之中(Muhitch et al.，Plant Sci.，163：865-872，2002；Muhitch，J.Plant Physiol.，160：601-605，2003)。与其他的四种编码GS1的基因相比，Gln1-5在叶、根以及茎中的表达水平是极低的(Sakakibara等人，如上所述，1992；Li等人，如上所述，1993)。在由Hirel等人进行的一项更新的关于玉米叶的研究中(以上提及的，2005b)表明，对GS1进行编码的这五个基因中的两个基因(Gln1-3与Gln1-4)，无论叶期和N施肥的水平如何都是高表达的，尽管在老的叶中存在一种Gln1-4转录物的增多。它已经提示Gln1-4编码一种GS同种型，该同种型参与在叶蛋白再转移期间释放的铵的再同化，而Gln1-3编码一种GS同种型，它在植物生长期间起到一种管家作用(Hirel等人，如上所述，2005a)。由Gln2编码的质体型GS(GS2)仅在植物发育的早期表达，大概是为了再同化在光呼吸作用过程中释放的铵，与一种C₃植物相比，在一种C₄植物里的该质体型GS是出于一个低得多的比率(Ueno et al.，Ann.Bot.，96：863-869，2005)。

尽管如上面所列出的可获得的涉及在玉米中这五个胞质GS1基因的表达的信息以及来源于QTL证明的它们的重要性的证据，单个的GS1同工酶在植物表型以及籽粒产量方面的精确作用是未知的。

发明内容

诸位发明人现在已经发现了Gln1-3以及Gln1-4基因的胞质GS同工酶产物在玉米中控制籽粒产量以及籽粒组分的功能的重要性。

他们已经发现了Gln1-3在控制籽粒的数目方面起一种主要作用，而Gln1-4在控制籽粒的大小方面起一种主要作用。更进一步的，他们已经观察到这些基因特别地对谷粒生产起作用，而不影响植物的生物质的生产。

Gln1-3对胞质GS的同工酶GS1-3进行编码。Gln1-3的cDNA序列是可得到的，例如在GenBank数据库里在登录号码X65928下；GS1-3的多肽序列是可得到的，例如在UniProtKB/Swiss-Prot数据库里在登录号P38561下。Gln1-3的cDNA序列在此表示为SEQID NO：1，并且推演出的多肽序列表示为SEQ ID NO：2。

Gln1-4对胞质GS同工酶GS1-4进行编码。Gln1-4的cDNA序列是可得到的，例如在GenBank数据库里在登录号X65929下；GS1-4的多肽序列是可得到的，例如在UniProtKB/Swiss-Prot数据库里在登录号P38562下。Gln1-4的cDNA序列在此表示为SEQID NO：3，并且推演出的多肽序列表示为SEQ ID NO：4。

本发明提供了一种用于提高玉米植物籽粒生产能力的方法，其中所述方法包括在所述植物中过量表达一种谷氨酰胺合成酶同工酶，该同工酶与多肽SEQ ID NO：2具有至少95％的同一性。

除非另作说明，在这里提及的两个序列之间同一性的百分比是从这两条序列全长的一个比对中计算出的。

根据本发明的一种优选的实施方案，籽粒生产能力是通过增加籽粒的数目而得以提高，并且所述谷氨酰胺合成酶是一种GS1-3同工酶，该酶在41位有一个丝氨酸，并且在278位有一个精氨酸。优选地，所述谷氨酰胺合成酶具有序列SEQ ID NO：2。

根据本发明的另一种优选的实施方案，籽粒生产能力是通过增加籽粒的大小而得以提高，并且所述谷氨酰胺合成酶是一种GS1-4同工酶，该酶在41位有一个脯氨酸，并且在278位有一个赖氨酸。优选地，所述谷氨酰胺合成酶具有序列SEQ ID NO：4。

有利地，本发明的一种方法包括在同一植物中对该GS1-3同工酶以及该GS1-4同工酶均进行过量表达，从而使籽粒的大小和数目均增加。

术语在一种植物中“过量表达”一种谷氨酰胺合成酶同工酶在此是指与一种参照植物相比，人工增加所述植物产生的所述活性GS同工酶的量。

对一种谷氨酰胺合成酶同工酶进行过量表达的一种优选的方法包括向所述植物的基因组中引入一种DNA构建体，该DNA构建体含有对所述谷氨酰胺合成酶同工酶进行编码的一种核苷酸序列，该核苷酸序列置于一种启动子的控制下。

本发明还提供了进行所述过量表达的手段。

这具体包括用于在一种宿主-细胞、或一种宿主生物中，特别是一种植物细胞或一种植物中，表达一种GS1-3同工酶和/或一种GS1-4同工酶的重组DNA构建体。这些DNA构建体可以通过众所周知的重组DNA技术和遗传工程技术来获得并且被引入所述宿主细胞或生物中。

本发明的重组DNA构建体具体地包括多种表达盒，这些表达盒包含，如以上所定义，在一种异源性启动子的控制下对一种谷氨酰胺合成酶同工酶进行编码的一种多核苷酸。

根据一个具体的实施方案，本发明的一种表达盒可以既包括对一种GS1-3同工酶进行编码的一种多核苷酸也包括对一种GS1-4同工酶进行编码的一种多核苷酸。

本发明的异源性启动子是在一种植物细胞里有功能的任何一种启动子，即，能够(如以上所定义)在一个植物细胞里指导编码一种谷氨酰胺合成酶同工酶的一种多核苷酸的转录。更适当的启动子的选择可以具体取决于用于靶向表达的一个或多个器官或一种或多种组织，以及人们所希望获得的表达类型(即组成型的或诱导型的)。

在本领域中可获得在植物中，并且特别是在玉米中，大批适合于异源基因表达的启动子。例如这些启动子可以从植物、植物病毒、或细菌(例如土壤杆菌属)中获得。它们包括组成型的多种启动子(即在大多数组织和细胞中以及大多数环境下具有活性的那些启动子)、仅仅或主要在某些组织或某些细胞类型中具有活性的组织或细胞特异性启动子、以及经过物理或化学刺激而被激活的诱导型启动子。

通常使用的组成型启动子的非限制性实例是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂碱合酶(Nos)启动子、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子(Verdaguer et al.，Plant Mol.Biol.，6：1129-39，1996)、包含在质粒pAct1-F4中的后面跟随有稻肌动蛋白内含子的稻肌动蛋白启动子(RAP-RAI)(McElroy et al.，Mol.Gen.Genet.，231(1)：150-160，1991)。

可用于本发明的器官或组织特异性启动子的非限制性实例包括(例如)籽粒特异的高分子量(HMW)启动子(Thomas and Flavell，Plant Cell.，2：1171-80，1990)、或叶特异的启动子(如pPEPc启动子)(Jeanneau et al.，Biochimie 84：1127-1135，2002)、或维管束鞘特异的Rubisco小亚基启动子(rbcS)(Katayama et al.，Plant Mol.Biol.，44：99-106，2000)。

诱导型启动子包括例如干旱胁迫应答启动子，如包含一种脱水-应答元件的rd29A启动子(Kasuga et al.，Nature Biotech.，17：287-291，1999；Narusaka et al.，Plant J.，34：137-148，2003)，或衰老特异性SAG12启动子(Noh and Amasino，Plant Mol.Biol.，41(2)：181 194，1999)。

这些表达盒通常也包括一种转录终止子，如35S转录终止子或Nos终止子(Depicker etal.，J.Mol.Appl.Genet.，1：561-73，1982)。它们还可以包括其他的调节序列，例如转录增强子序列。

本发明的重组DNA构建体还包括一些包含一种表达盒的重组载体，该表达盒包含，如以上所定义，在一种适当的启动子的转录控制之下对一种谷氨酰胺合成酶同工酶进行编码的一种多核苷酸。所述表达盒可以是本发明的一种重组表达盒，或是一种盒，其中对一种谷氨酰胺合成酶进行编码的多核苷酸是在它的内源性启动子的控制之下。

本发明的一种重组载体可以既包括对一种GS1-3同工酶进行编码的一种多核苷酸，也包括对一种GS1-4同工酶进行编码的一种多核苷酸。这些多核苷酸将有利地被置于在不同的启动子控制之下的单独的表达盒中；例如，对一种GS1-3同工酶进行编码的一种多核苷酸可以被置于CsVMV启动子的控制之下，而对一种GS1-4同工酶进行编码的一种多核苷酸可以被置于rbcS启动子控制之下。

本发明的重组载体还可以包括其他相关的序列，例如，一种或多种标记基因，这些基因允许选择转化的宿主。

有利地，该可选择的标记基因被包含在两个Ds因子(即转座子)之间，以便在随后的阶段通过与Ac转座酶相互作用而去除它。这个消除系统可以从本领域的技术人员得知。举例来说，这个消除系统已经被Goldsbrough等人描述(Biotechnology，11：1286-1292，1993)。

适合的载体的选择以及在其中插入DNA构建体的方法对于本领域的普通技术人员而言是众所周知的。载体的选择取决于预定的宿主以及预定的所述宿主的转化方法。对于许多植物物种来说，植物细胞或植物的各种遗传转化技术在本领域中都是可供使用的。作为非限制性实例，人们可以提及病毒介导的转化、通过微注射的转化、通过电穿孔的转化、微粒介导的转化、土壤杆菌属介导的转化(Ishida，Nat.Biotechnol.，14：745-750，1996)、等等。

在此使用的术语“植物”既包括双子叶植物也包括单子叶植物，并且特别是那些农艺学感兴趣的植物，如谷类作物，如小麦植物或稻植物，优选是玉米植物。

本发明还包括含有本发明的一种重组DNA构建体的宿主细胞。这些宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，特别是植物细胞，并且优选是玉米细胞。

本发明还提供生产转基因植物的一种方法，特别是一种玉米植物，该植物具有一个提高的籽粒生产能力。所述方法包括由本发明的一种DNA构建体来转化一种植物细胞(例如，一种玉米细胞)，并且从所述植物细胞(例如，玉米细胞)再生出对一种GS1-3同工酶和/或一种GS1-4同工酶进行过量表达的一种转基因植物(例如，玉米植物)。

根据本发明的一个优选的实施方案或方法，它包括由本发明的包含对一种GS1-3同工酶进行编码的一种多核苷酸的一种重组载体以及本发明的包含对一种GS1-4同工酶进行编码的一种多核苷酸的一种重组载体来转化一种植物细胞，特别是一种玉米细胞，并且从所述植物细胞(例如，玉米细胞)再生出对一种GS1-3同工酶和GS1-4同工酶进行过量表达的一种转基因植物(例如，玉米植物)。

根据本发明的另一个优选的实施方案或方法，它包括由本发明的包含对一种GS1-3同工酶进行编码的一种多核苷酸的一种重组载体以及本发明的包含对一种GS1-4同工酶进行编码的一种多核苷酸的一种重组载体转化一种植物细胞，特别是一种玉米细胞，并且从所述植物细胞(例如，玉米细胞)再生出对一种GS1-3同工酶与GS1-4同工酶进行过量表达的一种转基因植物(例如，玉米植物)。

本发明还包括由本发明的一种重组DNA构建体遗传转化的、并且过量表达一种GS1-3同工酶和/或一种GS1-4同工酶的植物。优选地，所述植物是可以通过本发明的一种方法获得的、对一种GS1-3同工酶和/或一种GS1-4同工酶进行过量表达的转基因玉米植物。在所述转基因植物里，本发明的一种DNA构建体被包含在被整合入该植物基因组内的一种转基因中(即稳定地整合)，这样它被传递给后续的植物世代。因而本发明的转基因植物不但包括源于该初始的基因转移的植物，而且包括它们的后代，只要它们包含了本发明的一种重组DNA构建体。与不具有所述的一种或多种转基因植物相比，在所述植物中对一种GS1-3同工酶和/或一种GS1-4同工酶的过量表达为它们提供一个改进的籽粒生产能力。

因此，本发明提供了一种转基因植物或它的一种分离的器官或组织，包括稳定地整合入其基因组中的一种重组表达盒，该重组表达盒包含如权利要求2或3中任何一项所限定的对一种GS1-3同工酶进行编码的一种多核苷酸，和/或如权利要求4或5中任何一项所限定的对一种GS1-4同工酶进行编码的一种多核苷酸。

本发明还包括含有本发明的一种重组表达盒的所述转基因植物的分离的器官或组织(诸如种子、叶、花、根、茎、穗)。

具体实施方式

从以下详细说明与附图，本发明的前述的和其他的目的以及本发明的优点将变得更明显。然而应该理解的是这些前述的详细说明仅仅是示例性的而不是对本发明的限制。

实例1：GLN1-3::与GLN1-4::MU插入事件的表征

利用玉米增变株(Mu)系统(Hanley et al.，Plant J.，23：557-566，2000)，已经分离出了Gln1-3基因与Gln1-4基因的基因敲除突变型。Gln1-3::Mu与Gln1-4::Mu的插入品系已经进行了与野生型非-Mu品系大规模的回交，并且已经获得了纯合的、杂合的和无效的突变品系。另外，已经生产了一种Gln1-3基因与Gln1-4基因的双重突变型(gln1-3/gln1-4)。

图1中示出增变株因子(Mutator element)插入该Gln1-3基因与Gln1-4基因里的位置。

为了清晰起见并且因为该Gln1-3基因与Gln1-4基因显示了高度的序列相似性，它们被显示为一个单一结构。利用引物通过对基因组DNA的PCR产物进行测序而测定了Gln1-3基因与Gln1-4基因的结构与外显子大小，该引物是从对应的cDNA序列(Li等人，如上所述，1993)、Mu-插入序列以及稻的基因组克隆AC105364设计的。

该玉米Gln1-3基因以及Gln1-4基因包括大小范围从40bp到252bp的10个外显子(黑色箭头)以及9个内含子(黑线)。最后一个外显子的大小在Gln1-3基因中是150bp，而在Gln1-4基因中是147bp。这些内含子与外显子结构是按比例描绘的。该基因编号是从ATG密码子(1bp)开始，并且延伸至终止密码子(位置3857bp)。

这两个Mu-插入事件用三角形(不成比例)表示。

还示出了该GS-NH₄ ⁺-结合位点特征标记以及该GS-ATP-结合位点特征标记的相对位置。

围绕该Mu-因子的侧翼区的序列分析显示，在Gln1-3::Mu1的情况中，插入已经在8号外显子之内发生，并且在Gln1-4::Mu5的情况中，插入已经在分隔7号外显子和8号外显子的内含子内发生。

实例2：在GLN1-3、GLN1-4以及双重突变型中谷氨酰胺合成酶的表达与活性

植物材料

这三种GS1缺陷突变型的种子，或对应的野生型的种子被首先播种在粗砂里，并在1星期后，当已经形成2到3片叶时，要么被转移到水培育中以收获根，要么转移到土壤中以收获叶。对于水培育，12株植物(野生型3株以及每种突变型各3株)被随机地置于一个130L通气培养单元里。每个品系设三个重复实行该实验，并且植物在一种有16/8(小时)光/暗周期的生长室中生长18天。通过金属卤化灯提供一种400mol m^-2s^-1的光合光子通量密度。其中的相对湿度维持在饱和度的60％。在10至11片叶期，在上午9至12点收获这些植物，并且将其分离成嫩叶(3片最嫩的叶)与根。这些根样品立即被放入液态氮气中，然后存储在-80℃直至更进一步地分析。

这三种突变型的三株植物被转入装有粘壤土的多个罐中(直径与高度是30cm)，并且在10至11叶期，收获3片最嫩的完全展开的叶并储存作为营养阶段(VS)的样品。在植物发育的生长后期，包括在吐丝之后15天(15DAS)以及在吐丝之后55天(55DAS)，低于穗的叶被收获。选中低于穗的叶是因为它已经被证明在谷粒灌浆期提供了显示出源库关系转变的一种很好的指示(Hirel等人，如上所述，2005a，b；Martin等人，New Phytol.，167：483-492，2005)。直到叶发育的最后阶段，在一个单一的叶片内没有观察到N代谢物含量和酶活性的主要变化。所以，已经推断出该整个叶片能被用于测量与N代谢相关的生理特性(Hirel等人，如上所述，2005b)。叶样品是在上午9点至12点收获并且冻存于液态氮气里，研磨成一种均一的粉末并且存储在-80℃用于随后的RNA、蛋白质以及代谢物分析。

在该水培育法中，将植物培养在包含10mM NO₃ ^-作为唯一N源的一种完全营养溶液中( and Lesaint，Hortic. 8：11-14，1971)。每天更换该营养溶液。在温室中，植物每天被用包含10mM NO₃ ^-作为唯一N源的一种完全营养溶液浇灌( 和Lesaint，如上所述，1971)。对于两种培养方法，该完全营养溶液包含1.25mM K⁺，0.25mM Ca²⁺，0.25mM Mg²⁺，1.25mM H₂PO₄ ^-，0.75mM SO₄ ^2-，21.5μM Fe²⁺(Sequestrene；Ciba-Geigy，Basel，Switzerland)，23μM B³⁺，9μM Mn²⁺，0.3μM Mo²⁺，0.95μM Cu²⁺以及3.5μM Zn²⁺。

谷氨酰胺合成酶蛋白质的表达

遵循一维聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹分析，利用针对GS2与GS1的抗体检测了该野生型以及三种突变型的根与叶的GS同工酶蛋白质含量。这项技术提供了一种可靠的方法，用于估计玉米的叶以及根的粗蛋白质提取物中的GS1以及GS2蛋白的相对总量(Becker et al.，Planta，211：800-806，2000)。

在冷的提取缓冲液中将如上所述获得的蛋白从冰冻的叶和根的粉末中提取出来，该缓冲液包含50mM Tris-HCl(pH值7.5)、1mM EDTA、1mM MgCl₂、0.5％(重量/体积)PVP、0.1％(体积/体积)2-巯基乙醇以及4mM亮肽素，并且蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离(Laemmli，Nature，227：680-685，1970)。聚丙烯酰胺在凝胶中的百分比是10％，并且在各泳道上载总量相等的蛋白质(10μg)。蛋白质被电泳转移到硝化纤维素膜用于蛋白质印迹分析。用针对烟草的GS2多克隆抗血清(Hirel et al.，Plant Physiol.，74：448-450，1984)、或来自菜豆根瘤的针对GS1的多克隆抗血清(Cullimore and Miflin，J.Exp.Bot.，35：581-587，1984)检测GS1和GS2多肽。利用牛血清白蛋白作为标准，使用一种可商购的试剂盒(Coomassie Protein assay reagent，Biorad，München，Germany)来测定可溶性蛋白。

结果如图2所示。

图2的说明：

在营养阶段收获的叶的GS亚基组成的蛋白质印迹分析，利用烟草GS抗体(A)；在营养阶段收获的叶的蛋白质印迹分析，利用菜豆GS抗体(B)；在55DAS收获的叶的蛋白质印迹分析，利用烟草GS抗体(C)；以及在营养阶段收获的根的蛋白质印迹分析，利用烟草GS抗体(D)。

在这些图片右边显示了蛋白质的分子量标准参照物的位置。

WT＝野生型

gln1-3＝gln1-3缺陷突变型

gln1-4＝gln1-4缺陷突变型

gln1-3/1-4＝glnl-3与gln1-4缺陷突变型

在营养阶段的野生型植物的叶内，利用烟草GS抗体检测到了相对丰度相似的两种多肽。该44kD的多肽对应于质体型GS(GS2)，而40kD多肽相当于该细胞质型GS(GS1)。在gln1-3以及gln1-4突变型中，观察到了GS1蛋白质总量的降低，这在前者中更显著。在gln1-3/gln1-4中，几乎没有检测到GS1蛋白质。在该野生型以及所有三种突变型中，可见到GS2蛋白质的类似总量(图2A)。利用针对菜豆根瘤GS培育的抗体，证实了在营养阶段的gln1-3、gln1-4以及gln1-3/gln1-4突变型的GS1蛋白质含量的下降。然而，因为制备的这些抗体明显地是对胞质GS(GS1)更为特异，因而在该蛋白质印迹上，不容易看见GS2蛋白质(图2B)。当利用烟草抗体分析55DAS的叶中的GS蛋白时，在该突变体中获得了GS1蛋白含量下降的一种类似模式。然而，在植物发育的更晚的阶段，从全部的四个品系中分离的GS2蛋白质的总量更低(图2C)。

在野生型植物的根组织里，检测到了与两种胞质型GS(分别是GSr以及GS1)对应的38kD和40kD的两种多肽(图2D)。如Sakakibara等人已经描述的(如上所述，1992)，上面的带对应于在叶中发现的一种大小相似的GS1蛋白质，而下面的带是一种根特异性胞质GS(GSr)。在该gln1-4突变型中，仅可看到GS1多肽(40kD)的总量有一个小的下降，而在该gln1-3突变型中，清楚地可检测到一个明显的下降。在该gln1-3/gln1-4双重突变型中，没有检测到GS1(40kD)多肽。在野生型以及所有三种突变型中，检测到了总量相似的GSr多肽(38kD)(图2D)。

谷氨酰胺合成酶蛋白质的活性

利用在营养阶段的植物，遵循离子交换色谱法以及酶促测定法，检查了野生型以及三种突变型的GS同工酶活性成分(质体和胞质GS活性的相对比例)。

在冷的提取缓冲液中，将蛋白质从冰冻的叶和根的粉末(按实例1的描述所获得)中提取出来，该缓冲液包含100mM TEA、1mM EDTA、10mM MgSO₄、5mM谷氨酸、10％(体积/体积)乙二醇、6mMDTT，pH值7.6。然后将提取物在4℃以10000g离心15分钟。在附着于一种高效液相层析仪(DX 500；Dionex(UK)Ltd.Camberley，Surrey，UK)的一种单Q阴离子交换柱(Amersham Pharmacia Biotech)上进行分离，除了一种0.1-0.7MNaCl线性梯度被用于洗脱并且1ml馏分被收集以外，该分离如Habash等人描述的那样进行(Ann.Appl.Biol.，138：83-89，2001)。

根据Lea等人(1999)的方法，对于转移酶反应测量谷氨酰胺合成酶(GS)的活性，并根据O′Neal和Joy的方法(Archiv.Biochem.Biophys.，159：113-122，1973)对合成酶反应进行测量。

用三种独立的提取法从叶材料获得的结果显示在图3里。

图3的说明：

在源自野生型(A)，gln1-4(B)，gln1-3(C)以及gln1-3/gln1-4(D)的叶提取物中，GS活性的离子交换色谱分析。GS活性的第一个峰对应于胞质GS(GS1)，而第二个峰对应于质体GS(GS2)。

在括号内标明的GS1和GS2活性的相对量值是用对于该野生型中GS1和GS2活性的量所测量的数值作为最大值而计算出来的。

与野生型(图3A)相比，在gln1-4突变型中观察到了GS1活性的16％的下降(图3B)。在gln1-3突变型中，GS1活性的下降更多(45％)(图3C)。在gln1-3/gln1-4突变型中，只保留了该野生型GS1活性的26％(图3D)。有趣的是在所有三个突变型中都观察到了GS2活性的增大，范围从11％至47％(图3B-D)。

与野生型相比，利用在营养阶段合成酶反应测量的三种突变型的根的GS活性都是相似的(野生型是3.2±0.06μmol.min^-1.g^-1DW，gln1-4突变型是3.4±0.3，gln1-3突变型是2.8±0.05，并且gln1-3/gln1-4突变型是3.1±0.05)。这些结果表明根的GS活性主要由GSr蛋白代表，GSr蛋白由Gln1-1基因编码，它的mRNA在根部表达最丰富。

GS蛋白质序列的识别

利用在营养阶段收获的植物，从以上描述的野生型、gln1-3、gln1-4以及gln1-3/gln1-4突变型中提取出的叶蛋白通过二维凝胶电泳进行分离。

从野生型的叶中提取出的蛋白的二维凝胶显示在图4A里。

为了明确地证明在gln1-3、gln1-4以及gln1-3/gln1-4突变型中缺乏相应的GS蛋白质，通过液相色谱串联质谱分析法(LC-MS/MS)分析了在来自所述区域的GS的等电点和分子量(MM)范围内的三十六个蛋白质的斑点。结果在图4B中示出。

蛋白质的识别揭示了在这36个斑点中有四个(斑点8、9、14以及38)包含一种GS蛋白质。

与野生型的蛋白质分布型相比，可以看出gln1-3突变型以及gln1-4突变型是分别缺乏斑点8和9，而且在gln1-3/gln1-4突变型中，斑点8和9都不存在。斑点8和9彼此非常靠近，并且表现出部分重叠。它们具有相同的表观的等电点，但在它们的表观的分子量有细小的差别。

这项发现并不出乎意料，因为根据由Li等人分离的基因的序列(如上所述，1993)，GS1-3和GS1-4蛋白质有一样的等电点，并且它们的分子量只表现出188D的差异。由Sakakibara等人(如上所述，1992)分离的等位基因形式(分别是GS112和GS107对应GS1-3和GS1-4)的两种产物具有有一个碱性更大的氨基酸，并因此也表现出相似的等电点。

将具有序列多态性的两个位点用于对这些GS1-3与GS1-4蛋白质的相互区分。结果如图4C所示。

图4C的说明：

给出了在UNIPROT Database的序列的登录名称。GS1-3和GS1-4的Ref2是指Sakakibara等人测序的等位基因形式(如上所述，1992)。除GS2之外，位置与所有GS的第一个甲硫氨酸有关，在GS2中，位置与信号肽后的第一个氨基酸有关。阴暗背景显示了在GS1-3与GS1-4之间以及在GS1-3等位形式之间的差异。在GS1-3与GS1-4作为一方面而其余的GS蛋白质作为另一方面之间的差异用下划线表示。

序列比对显示出在GS1-3中的41位上的氨基酸是一个丝氨酸，而GS1-4的41位上的氨基酸是一个脯氨酸，并且GS1-3的278位上的氨基酸是一个精氨酸，而GS1-4的278位上的氨基酸是一个赖氨酸。包含这些多态性位点的肽被鉴定出：TLSGPVTDPSK(SEQ IDNO：5)(以及该误剪切的TLSGPVTDPSKLPK(SEQ ID NO：6))允许对GS1-3的鉴定，而根据该41位的丝氨酸/脯氨酸的多态性，TLPGPVTDPSK(SEQ ID NO：7)(和TLPGPVTDPSKLPK(SEQ ID NO：8))允许对GS1-4的鉴定；并且HKEHIAAYGEGNER(SEQ ID NO：9)和HKEHIAAYGEGNER(SEQ ID NO：10)，根据该278位的精氨酸/赖氨酸的多态性，分别允许对GS1-3和GS1-4蛋白质鉴定。应当注意到肽HREHIAAYGEGNER(SEQ ID NO：9)与Sakakibara等人(如上所述，192)测序的GS1-3等位形式相似，而与Li等人(如上所述，1993)测序的等位形式不同，其中肽的最后两个氨基酸ER被DG代替。

实例3：GS1缺陷突变型的表型和籽粒生产

根据由Martin等人描述的方法(如上所述，2005)测定了籽粒的产量、它的成分、以及在植物从吐丝到成熟的发育阶段的不同部分的氮含量。

为了确定这些突变对植物表型以及籽粒产量的影响，将植物种植在一个温室里的土壤中，并且每天用一种和Lesaint描述的(如上所述，1971)包含10mM NO₃ ^-(氮最适度以下的条件)的营养液浇灌。在成熟期收获植物，并且利用杜马燃烧法(Dumas combustionmethod)测量总氮含量。

在GS1缺陷突变型中，苗和穗的干重(DW)积聚

野生型、gln1-3、gln1-4以及gln1-3/gln1-4的苗营养部分的总干重(A)和穗的总干重(B)在图5中示出。

图5的说明：

Ord＝以克单位(g)的干重(DW)

数值是三种个体植物的平均值±标准误差。

苗的营养部分的(图5A)干物质产量未见显著差异。相比之下，在穗的干物质含量方面观察到了较大的下降，与野生型的相比，gln1-3、gln1-4、gln1-3/gln1-4突变型分别降低了68％、48％、84％。在gln1-3和gln1-4突变型中观察到了穗的大小的下降，并且这在gln1-3/gln1-4突变型中更严重(图5B)。

在GS1缺陷突变型中穗的表型

玉米植物(品系B73)的野生型、gln1-4、gln1-3以及gln1-3/gln1-4的穗在图6中示出。

在gln1-3和gln1-4两种突变型中，在籽粒的产量方面观察到了强烈的下降，这在前者中更为重要，因此证实了如图6所示的表型。

在氮最适度以下的条件下生长的三种GS突变型的籽粒产量的主要组成在表1中示出。

在gln1-3/gln1-4突变型中，籽粒的产量下降至仅为野生型的12％。与gln1-3相比，在gln1-4中籽粒的重量有一个较大的下降，但是籽粒的数目较多。在gln1-3/gln1-4突变型中，与野生型以及两种单突变型相比，两种产量成分都强烈地下降。与野生型相比，在这三种突变型中，在氮籽粒含量方面观察到了一个大约20％的增长。

实例4：GS1缺陷突变型的生理学

在三种玉米突变型中检查了GS1活性水平下降对叶的氮和碳代谢的代表性标志物的影响(Hirel等人，如上所述，2005b)。

代谢物提取与分析

对营养阶段的玉米植物的代谢物进行定量。冻干的植物材料用于代谢物提取。NH₄ ⁺和氨基酸用2％的5-磺基水杨酸提取(10mg DW，ml^-1；Ferrario-Méry et al.，Plant Physiol.，117：293-302，1998)。总氨基酸含量以及个体氨基酸组成由离子交换层析对从等量的干重材料提取出的库样品进行测定。总的游离氨基酸由Rosen比色法进行测定，利用亮氨酸作为标准(Rosen，Arch.Biochem.Biophys.，67(1)：10-15，1957)。个体氨基酸的组成通过离子交换层析进行，然后是利用AminoTac JLC-500/V氨基酸分析器根据厂家的说明书(JEOL[Europe]，Croissy-sur-Seine，France)以水合茚三酮进行检测。通过苯酚次氯酸盐实验(Berthelot反应)测定游离的NH₄ ⁺，当NH₄ ⁺浓度低时，该实验提供了用于比较研究的可靠的资料，尽管可以通过其他方法获得一种更精确的定量(Husted et al.，Physiol.Plant，109：167-179，2000)。如Ferrario-Méry等人描述的方法(如上所述，1998)，用1M HClO₄(每5至10mg植物材料的干重用1ml)提取蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉。利用一种可商购的试剂盒(Boehringer Mannheim，Germany)通过酶催化测量这些可溶性糖(葡萄糖、果糖以及蔗糖)。

结果如表2中所示。

表2显示与野生型相比，在gln1-3和gln1-4突变型中，GS1活性下降导致在叶中游离的NH₄ ⁺的数量有一个几乎2倍的增加，而在gln1-3/gln1-4突变型中，这个量比野生型大约高出四倍。在营养阶段，在野生型与三种突变型之间在NO₃ ^-、可溶性糖、游离氨基酸(从质量和数目两方面)以及叶的总氮含量方面没有观察到显著性差异。虽然不太显著，在三种GS突变型中，在15DAS，仍然观察到了游离的NH4+量值的增加。在植物发育的这个阶段上，NO₃ ^-、氨基酸以及可溶性糖的相对浓度也在减小，但是在野生型与突变型之间没有检测到显著的变化(数据未显示)。如较早时候已经报告的(Hirel等人，如上所述，2005b)，在55DAS叶中，NO₃ ^-、NH₄ ⁺以及可溶性糖的总量在野生型和三种GS突变型中都至少降低四倍。然而在野生型与三种突变型之间没有观测到明显的差异。

在该55DAS阶段，调查了GS1活性的减小对氨基酸和氮水平的影响。结果如表3中所示。

与营养阶段相比，在植物发育的55DAS阶段，三种突变型的叶的总氨基酸含量有了一个明显的增加。这种增加的部分原因是天冬酰胺与谷氨酸含量的增加，该增加在gln1-3/gln1-4突变型中分别高达20倍与10倍。

在这三种突变型的叶中还观察到了总氮的量的增加。

木质部与韧皮部汁液收集

利用King与Zeevaart描述的技术(Plant Physiol.，53：96-103，1974)获得韧皮部溢泌物。在迅速浸入收集缓冲液之前，将叶切断并且在水下再切割。对每个实验，在一个恒湿箱中(相对湿度＞90％)并且在黑暗中将三种个体植物(野生型和三种突变型)的完全展开的叶分离地置于一种溶液中，该溶液含10mM Hepes，10mM EDTA(用NaOH将pH值调至7.5)。从早上10点至下午4点的6个小时期间收集溢泌物。然后测量叶的鲜重并且将该溢泌物储存在-80℃下。韧皮部溢泌物(在EDTA溶液里)的pH值被调至2.1并进行离心以除去杂物和EDTA，在该pH下杂物和EDTA会沉淀。

结果如表4所示。

在营养阶段的韧皮部汁液的组成的分析显示，在三种突变型中，除谷氨酸之外的所有主要氨基酸浓度都有一种普遍的下降。对于天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸，这种下降大约是2倍，而对天冬酰胺与丙氨酸则至少是4倍。然而，除谷氨酸之外，这些氨基酸的相对比例没有明显地改变，对于谷氨酸观察到了一种轻微的增加。对于籽粒的游离氨基酸含量没有观察到明显的变化，除了这些突变型中的天冬酰胺有一个2倍的下降，在野生型里，天冬酰胺大约占总量的14％(数据未显示)。

为了确定在三种突变型里根是否能为苗提供充足的氮同化产物，分析了木质部汁液的氨基酸组成。为了收集木质部汁液，植物根系2厘米以上的茎被切下，并且将切下的茎用水浸透并且吸干。根压伤流液(每株植物大约200至400μL)用一种微量吸液管收集，并且立即将样品储存在-80℃下。氨基酸分析由以前说明过的方法进行。结果如表5所示。

观察到了在营养阶段的木质部汁液的总氨基酸浓度的轻微下降，特别是在gln1-3，主要是由于天冬酰胺的下降，天冬酰胺是在木质部汁液中最丰富的氨基酸。然而这种下降不显著。有趣的是，与野生型相比，在突变型里谷氨酰胺的量(几乎与天冬酰胺一样丰富)没有被显著改变。

实例5：GS1的过量表达

植物转化、再生与表征

用存留一种超级双元质粒(super-binary plasmid)的根瘤土壤杆菌菌株LBA4404进行了玉米的近交系A188的转化，这基本上是按Ishida等人所描述的方法进行的(Nat.Biotechnol.，14：745-750，1996)。具体地，此后引用的所有介质的组成在这篇参考文献里做详细说明。关于选择性标记，将实验方案稍做修改，其中用了NPTII基因而不是bar基因。

超级双元质粒pRec 445

用于转化的该超级双元质粒是一种重组的结果，该重组是在土壤杆菌属菌株LBA4404内(pSB1)(Komari et al.，Plant J.，10：165-74，1996)在pBIOS 445质粒与pSB1质粒(存留从超毒力菌株A281分离出的virB与virG基因)之间的重组形成了质粒pRec445。质粒Pbios 445是在T-DNA边界之间存留的pSB11的一种衍生物(Komari等人，如上所述，1996)，T-DNA边界是一种新霉素抗性盒(NPTII基因)(Bevan et al.，Biotechnol.，24：367-70，1992；Berg and Berg，Biotechnol.，1：417-435，1983)，其侧翼是一种肌动蛋白启动子(McElroyet al.，Plant Cell，2(2)：163，1990)、以及3’Nos终止子(Depicker et al.，J.Mol.Appl.Genet.，1：561-73，1982)，并且在木薯叶脉花叶病毒启动子(pCsVMV)(Verdaguer et al.，Plant Mol.Biol.，6：1129-39，1996)侧翼的Gln1-3cDNA(Sakakibara等人，如上所述，1992)连接至一种肌动蛋白内含子(McElroy等人，如上所述，1990)以及3’Nos终止子。所产生的用于转化的土壤杆菌属菌株是LB4404(pRec445)。

在图7中对pRec445进行了图解：

-RB与LB代表该T-DNA的右侧与左侧边界。

-Ds(3’Ac)与Ds(5’Ac)代表该Ds转座因子用于进一步消除赋予卡那霉素抗性的选择性标记。

-NptII是新霉素磷酸转移酶基因，由肌动蛋白启动子以及肌动蛋白内含子与胭脂碱合成酶终止子(3’Nos)赋予卡那霉素抗性。

-一个肌动蛋白内含子被置于玉米的Gln1-3cDNA与CsVMV启动子之间。LB与RB的外边界、3’Nos、Gln1-3以及内含子肌动蛋白被用作探针来确定在该转基因玉米品系中的构建体插入事件的模式。

转基因植物

利用在授粉以后10天分离的未成熟的玉米胚进行植物转化。未成熟的胚用根瘤土壤杆菌孵育5分钟，并且在25℃的黑暗里，用没有抗生素选择的LSAs培养基培养3天。当转入该LSD5培养基时，根瘤土壤杆菌通过250mg L^-1头孢噻肟的存在被反向选择，并且该转化的愈伤组织由存在的50mgμL^-1卡那霉素选择。培养2周以后，正在发育中的愈伤组织被转到含有50mg μL^-1卡那霉素的LSD10培养基并且生长3周。将I型愈伤组织切离并且在卡那霉素上再培养3周。为了再生，发育良好的I型愈伤组织在在持续的选择压力以及卡那霉素条件下，在LSZ培养基上在22℃下进行培养。在2星期以后，带苗的愈伤组织被转到RMG2培养基中并且再培养2星期，以允许在将该小植株转到土壤并且逐渐适应环境湿度之前根的发育。然后将植物栽植在一种温室里(18℃至24℃)并且自花受粉或与A188品系授粉以产生种子。

选择了多个转基因品系并对pCsVMV-Gln1-3构建体的插入模式进行试验。随后用NcoI消化基因组DNA，用Gln1-3cDNA、肌动蛋白内含子以及3’Nos探针进行杂交以确定T-DNA的拷贝数。另外，在pRec 445质粒上设计了两种探针，每个探针都重叠于RB与LB这两种T-DNA边界，以便于检查在该T-DNA以外最终存在的质粒序列(对于探针的位置参见图7)。在两种初级的转化体中(品系1与品系9)，检测到了一个单个插入事件而没有附加的T-DNA序列存在，除了那些插入物侧翼的序列之外，该插入物包含该pCsVMV-Gln1-3以及该pActin-NPTII嵌合构建体(资料没有显示)。这两种初级的转化体同FV2品系杂交，FV2品系包含了对Gln1-3不利的等位基因(Hirel等人，如上所述，2001)。然后选择T1转化体并且与FV2品系回交3次。在T4代中包含50％的转基因、50％的无效分离型，对于品系1与品系9的无效分离型被用作未转化的对照植物，并且分别命名为野生型1(WT1)与野生型9(WT9)。

对Gln1-3进行编码的cDNA通过将其与CsVMV启动子融合而成为构建性的。经过选择与再生之后，随后是与FV2品系回交3次，选择出过量表达Gln1-3的两个T4转基因植物(品系1与品系9)，以及对应的无效的分离型(WT1和WT9)用于进一步分析。

将这些玉米植物在一种包含10mM NO₃ ^-的营养液的氮最适度以下的环境里进行培养，并且在成熟期收获。野生型未转化的无效分离型(WT1和WT9)以及过量表达该Gln1-3cDNA的T4转基因品系(品系1与品系9)的穗如图8所示。

应当注意的是，与如图6所示的未转化的无效的分离型(野生型)的穗相比，该未转化的野生型植物的穗较小，以便比较由于以下事实的突变型的表型，即欧洲品系FV2比起用来生产该转基因玉米植物的北美品系B73生产更少的籽粒。

转基因植物的表征

对于在最适度以下的氮供给条件下在温室里生长直至成熟的植物测定了Gln1-3的过量表达对植物表型以及籽粒产量的影响。

GS亚基组成

利用识别GS1与GS2的烟草抗体，通过蛋白质印迹分析检测了两种未转化的无效的分离型(WT1和WT9)以及两种转基因品系(品系1和品系9)在营养阶段的叶的GS亚基的组成。结果如图9所示。

图9的说明：

上面的带(44kD的分子量)对应于质体GS(GS2)亚基，并且下面的带(39kD的分子量)对应于胞质GS(GS1)亚基。

在两种转化的植物的蛋白提取物中可清楚地看见GS1蛋白质总量的提高，其中品系9的增高更显著。当分析在55DAS叶中的GS蛋白质时，得到了GS1蛋白质含量提高的一种相似的模式(数据未显示)。

与GS活性相关的苗以及谷粒产量

测定了两种未转化的无效的分离型(WT1和WT9)以及该两种转基因品系(品系1与品系9)的与GS活性相关的苗以及谷粒产量，结果如图10所示。

图10的说明：

A＝总的叶GS活性

B＝籽粒产量

C＝苗营养部分的总干重

D＝叶GS活性(横坐标)与籽粒的产量(纵坐标)之间的散布图

与这两种未转化的无效的分离型相比，在品系1与品系9中分别观察到叶的总GS活性的二倍和三倍的增大(图10A)。

观察到了籽粒产量的显著增加，当与两种相应的野生型对照植物相比时，对于品系1与品系9这个增加均为大约30％(图10B)，因此证实了如图8所示的表型。籽粒数目是籽粒产量增大负主要责任的产量因素，如以下表6所示。

对于在两种未转化的无效分离型以及两种转基因品系中叶的GS活性水平对谷粒产量计算了线性回归以及相关系数。图10D显示在叶的GS活性水平与谷粒产量之间有一种强的相关性(r²0.91)，因此提示产量的提高与酶活性的增大是成比例的。

相比之下，在两种野生型对照植物与两种转基因品系之间，苗的干物质产量没有看到显著性差异(图10C)。

实例6：在叶的叶肉与维管束鞘细胞里GS1的过量表达。

如实例5中所描述，来自该pCsVMV启动子的GS1-3的表达导致转化植物中GS活性显著增加，并且改善了农艺性状。然而pCsVMV的表达主要局限在叶肉细胞，因此通过利用在叶肉以及维管束鞘细胞内指导高水平表达的启动子，在转化玉米植物叶中GS1的表达可以被进一步优化。如下所述，一种可替代的策略是用在pCsVMV启动子控制下表达GS1-3的一种T-DNA与在一种维管束鞘细胞特异性的启动子如玉米rbcS启动子(Katayama等人，如上所述，2000)的控制之下的GS1-4一起来转化玉米，以便获得在叶肉里表达GS1-3并且在维管束鞘细胞里表达GS1-4的转基因玉米植物。期望在所述的转基因植物中、在氮受限以及不受限的情况下谷粒产量均得到改进。

植物转化、再生和表征

用留存一种超级双元质粒的根瘤土壤杆菌菌株LBA4404对玉米近交系A188进行的转化基本上按照Ishida等人描述进行的(如上所述，1996)。具体地，此后引用的所有介质的组成在这个参考文献里被详细说明。仅有的修改涉及选择性标记物，即在本实例中它是NPTII基因，而不是Ishida等人所使用的bar基因。

超级双元质粒pRec 445+

用于转化的超级双元质粒是在土壤杆菌属菌株LBA4404内(pSB1)(Komari等人，如上所述，1996)pBIOS 445质粒与pSB1质粒(留存从超毒力菌株A281分离出的virB与virG基因)之间的一种重组的结果，这形成了质粒pRec 445。(pBIOS 445+与pBIOS 445(实例5)相同，除了它还在T-DNA边界之间包含一种玉米rbcS启动子(Katayama等人，如上所述，2000)，该启动子连接到Gln1-4cDNA以及一个nos终止子上。用于转化的所生成的土壤杆菌属菌株是LB4404(pRec 445+)。

序列表

<110>法国植物基因组研究计划-华莱

贝特朗.伊雷尔

帕斯夸尔.佩雷斯

<120>通过调控谷氨酰胺合成酶的活性改进植物的籽粒的生产能力

<130>PFRCA0900577S

<150>EP 06291570.7

<151>2006-10-09

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1317

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>CDS

<222>(63)..(1133)

<400>1

caatcccaca ccaccaccac ctcctccggt ccccaacccc tgtcgcaccg cagccgccgg 60

cc atg gcc tgc ctc acc gac ctc gtc aac ctc aac ctc tcg gac acc 107

Met Ala Cys Leu Thr Asp Leu Val Asn Leu Asn Leu Ser Asp Thr

1 5 10 15

acc gag aag atc atc gcg gaa tac ata tgg atc ggt gga tct ggc atg 155

Thr Glu Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Ile Gly Gly Ser Gly Met

20 25 30

gat ctc agg agc aaa gca agg acc ctc tcc ggc ccg gtg acc gat ccc 203

Asp Leu Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Ser Gly Pro Val Thr Asp Pro

35 40 45

agc aag ctg ccc aag tgg aac tac gac ggc tcc agc acg ggc cag gcc 251

Ser Lys Leu Pro Lys Trp Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Gly Gln Ala

50 55 60

ccc ggc gag gac agc gag gtc atc ctg tac ccg cag gcc atc ttc aag 299

Pro Gly Glu Asp Ser Glu Val Ile Leu Tyr Pro Gln Ala Ile Phe Lys

65 70 75

gac cca ttc agg agg ggc aac aac atc ctt gtg atg tgc gat tgc tac 347

Asp Pro Phe Arg Arg Gly Asn Asn Ile Leu Val Met Cys Asp Cys Tyr

80 85 90 95

acc cca gcc ggc gag cca atc ccc acc aac aag agg tac aac gcc gcc 395

Thr Pro Ala Gly Glu Pro Ile Pro Thr Asn Lys Arg Tyr Asn Ala Ala

100 105 110

aag atc ttc agc agc cct gag gtc gcc gcc gag gag ccg tgg tat ggt 443

Lys Ile Phe Ser Ser Pro Glu Val Ala Ala Glu Glu Pro Trp Tyr Gly

115 120 125

att gag cag gag tac acc ctc ctc cag aag gac acc aac tgg ccc ctt 491

Ile Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys Asp Thr Asn Trp Pro Leu

130 135 140

ggg tgg ccc atc ggt ggc ttc ccc ggc cct cag ggt cct tac tac tgt 539

Gly Trp Pro Ile Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys

145 150 155

gga atc ggc gcc gaa aag tcg ttc ggc cgc gac atc gtg gac gcc cac 587

Gly Ile Gly Ala Glu Lys Ser Phe Gly Arg Asp Ile Val Asp Ala His

160 165 170 175

tac aag gcc tgc ttg tat gcg ggc atc aac atc agt ggc atc aac ggg 635

Tyr Lys Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Ile Asn Ile Ser Gly Ile Asn Gly

180 185 190

gag gtg atg cca ggg cag tgg gag ttc caa gtc ggg cct tcc gtg ggt 683

Glu Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe Gln Val Gly Pro Ser Val Gly

195 200 205

att tct tca ggc gac cag gtc tgg gtc gct cgc tac att ctt gag agg 731

Ile Ser Ser Gly Asp Gln Val Trp Val Ala Arg Tyr Ile Leu Glu Arg

210 215 220

atc acg gag atc gcc ggt gtg gtg gtg acg ttc gac ccg aag ccg atc 779

Ile Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Val Thr Phe Asp Pro Lys Pro Ile

225 230 235

ccg ggc gac tgg aac ggc gcc ggc gcg cac acc aac tac agc acg gag 827

Pro Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ala His Thr Asn Tyr Ser Thr Glu

240 245 250 255

tcg atg agg aag gag ggc ggg tac gag gtg atc aag gcg gcc atc gag 875

Ser Met Arg Lys Glu Gly Gly Tyr Glu Val Ile Lys Ala Ala Ile Glu

260 265 270

aag ctg aag ctg cgg cac agg gag cac atc gcg gcc tac ggc gag ggc 923

Lys Leu Lys Leu Arg His Arg Glu His Ile Ala Ala Tyr Gly Glu Gly

275 280 285

aac gac ggc cgg ctc acc ggc agg cac gag acc gcc gac atc aac acg 971

Asn Asp Gly Arg Leu Thr Gly Arg His Glu Thr Ala Asp Ile Asn Thr

290 295 300

ttc agc tgg ggc gtg gcc aac cgc ggc gcg tcg gtg cgc gtg ggc cgg 1019

Phe Ser Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala Ser Val Arg Val Gly Arg

305 310 315

gag acg gag cag aac ggc aag ggc tac ttc gag gac cgc cgc ccg gcg 1067

Glu Thr Glu Gln Asn Gly Lys Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala

320 325 330 335

tcc aac atg gac ccc tac gtg gtc acc tcc atg atc gcc gag acc acc 1115

Ser Asn Met Asp Pro Tyr Val Val Thr Ser Met Ile Ala Glu Thr Thr

340 345 350

atc atc tgg aag ccc tga gcgccgcggc cgttgcgttg cagggtcccc 1163

Ile Ile Trp Lys Pro

355

gaagcgattg caaagccact gttccttccg ttctgtttgc ttattattgt tattatctag 1223

ctagatcatc cggggtcagg tcgtcgtggt gtgccaaaac agaacacaga aagaggaaga 1283

agaaaaaaaa aacaagacgt gtggcgttta tgtt 1317

<210>2

<211>356

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<400>2

Met Ala Cys Leu Thr Asp Leu Val Asn Leu Asn Leu Ser Asp Thr Thr

1 5 10 15

Glu Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Ile Gly Gly Ser Gly Met Asp

20 25 30

Leu Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Ser Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser

35 40 45

Lys Leu Pro Lys Trp Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Gly Glu Asp Ser Glu Val Ile Leu Tyr Pro Gln Ala Ile Phe Lys Asp

65 70 75 80

Pro Phe Arg Arg Gly Asn Asn Ile Leu Val Met Cys Asp Cys Tyr Thr

85 90 95

Pro Ala Gly Glu Pro Ile Pro Thr Asn Lys Arg Tyr Asn Ala Ala Lys

100 105 110

Ile Phe Ser Ser Pro Glu Val Ala Ala Glu Glu Pro Trp Tyr Gly Ile

115 120 125

Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys Asp Thr Asn Trp Pro Leu Gly

130 135 140

Trp Pro Ile Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Gly

145 150 155 160

Ile Gly Ala Glu Lys Ser Phe Gly Arg Asp Ile Val Asp Ala His Tyr

165 170 175

Lys Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Ile Asn Ile Ser Gly Ile Asn Gly Glu

180 185 190

Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe Gln Val Gly Pro Ser Val Gly Ile

195 200 205

Ser Ser Gly Asp Gln Val Trp Val Ala Arg Tyr Ile Leu Glu Arg Ile

210 215 220

Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Val Thr Phe Asp Pro Lys Pro Ile Pro

225 230 235 240

Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ala His Thr Asn Tyr Ser Thr Glu Ser

245 250 255

Met Arg Lys Glu Gly Gly Tyr Glu Val Ile Lys Ala Ala Ile Glu Lys

260 265 270

Leu Lys Leu Arg His Arg Glu His Ile Ala Ala Tyr Gly Glu Gly Asn

275 280 285

Asp Gly Arg Leu Thr Gly Arg His Glu Thr Ala Asp Ile Asn Thr Phe

290 295 300

Ser Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala Ser Val Arg Val Gly Arg Glu

305 310 315 320

Thr Glu Gln Asn Gly Lys Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala Ser

325 330 335

Asn Met Asp Pro Tyr Val Val Thr Ser Met Ile Ala Glu Thr Thr Ile

340 345 350

Ile Trp Lys Pro

355

<210>3

<211>1490

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>CDS

<222>(85)..(1152)

<400>3

ccacatcctc ccctcattcc tccttgggtt cccagcccgt gcgccccgcc tgtcgcagtg 60

ccagtcgcgc cgcagccgcc ggcc atg gcc tgc ctc acc gac ctc gtc aac 111

Met Ala Cys Leu Thr Asp Leu Val Asn

1 5

ctc aac ctc tcg gac acc aca gag aag atc atc gcc gag tac ata tgg 159

Leu Asn Leu Ser Asp Thr Thr Glu Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp

10 15 20 25

atc ggt gga tct ggc atg gat ctc agg agc aaa gcc agg acc ctc ccg 207

Ile Gly Gly Ser Gly Met Asp Leu Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Pro

30 35 40

ggc ccg gtg acc gat ccc agc aag ctg ccc aag tgg aac tac gac ggc 255

Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser Lys Leu Pro Lys Trp Asn Tyr Asp Gly

45 50 55

tcc agc acc ggc cag gcc ccc ggc gag gac agc gag gtc atc ctg tac 303

Ser Ser Thr Gly Gln Ala Pro Gly Glu Asp Ser Glu Val Ile Leu Tyr

60 65 70

ccg cag gcc atc ttc aag gac cca ttc agg agg ggc aac aac atc ctt 351

Pro Gln Ala Ile Phe Lys Asp Pro Phe Arg Arg Gly Asn Asn Ile Leu

75 80 85

gtc atg tgc gat tgc tac acc cca gct ggc gag cca att ccc acc aac 399

Val Met Cys Asp Cys Tyr Thr Pro Ala Gly Glu Pro Ile Pro Thr Asn

90 95 100 105

aag agg tac agc gcc gcc aag atc ttc agc agc cct gag gtc gct gcc 447

Lys Arg Tyr Ser Ala Ala Lys Ile Phe Ser Ser Pro Glu Val Ala Ala

110 115 120

gag gag ccc tgg tat ggt atc gag cag gag tac acc ctc ctt cag aag 495

Glu Glu Pro Trp Tyr Gly Ile Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys

125 130 135

gac acc aac tgg ccc ctc ggg tgg cct att ggc ggc ttc cct ggc cct 543

Asp Thr Asn Trp Pro Leu Gly Trp Pro Ile Gly Gly Phe Pro Gly Pro

140 145 150

cag ggt cct tac tac tgt gga atc ggc gcg gag aaa tcg ttc ggg cgt 59l

Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Gly Ile Gly Ala Glu Lys Ser Phe Gly Arg

155 160 165

gac ata gtc gac gcc cac tac aag gcc tgc ctg tac gca ggc atc aac 639

Asp Ile Val Asp Ala His Tyr Lys Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Ile Asn

170 175 180 185

atc agt ggc atc aac ggg gag gtc atg ccg ggg cag tgg gag ttc cag 687

Ile Ser Gly Ile Asn Gly Glu Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe Gln

190 195 200

gtc gga ccg tcc gtc ggc atc tct tcg ggc gat cag gtg tgg gtt gct 735

Val Gly Pro Ser Val Gly Ile Ser Ser Gly Asp Gln Val Trp Val Ala

205 210 215

cgc tac att ctt gag agg atc acc gag atc gcc ggc gtg gtg gtg acg 783

Arg Tyr Ile Leu Glu Arg Ile Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Val Thr

220 225 230

ttc gac ccg aag ccg atc ccg ggc gac tgg aac ggc gcg ggc gcc cac 831

Phe Asp Pro Lys Pro Ile Pro Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ala His

235 240 245

acc aac tac agc acc gag tcc atg agg aag gag ggc ggg tac gag gtg 879

Thr Asn Tyr Ser Thr Glu Ser Met Arg Lys Glu Gly Gly Tyr Glu Val

250 255 260 265

atc aag gcg gcc atc gag aag ctg aag ctg cgg cac aag gag cac atc 927

Ile Lys Ala Ala Ile Glu Lys Leu Lys Leu Arg His Lys Glu His Ile

270 275 280

gcg gcc tac ggc gag ggc aac gag cgc cgg ctc acc ggc agg cac gag 975

Ala Ala Tyr Gly Glu Gly Asn Glu Arg Arg Leu Thr Gly Arg His Glu

285 290 295

acc gcc gac atc aac acc ttc agc tgg gga gtc gcc aac cgt ggc gcg 1023

Thr Ala Asp Ile Asn Thr Phe Ser Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala

300 305 310

tcg gtg gcc gtg ggc cag acg gag cag aac ggc aag ggc tac ttc gag 1071

Ser Val Ala Val Gly Gln Thr Glu Gln Asn Gly Lys Gly Tyr Phe Glu

315 320 325

gac cgc cgg ccg gcg tcc aac atg gat ccc tac gtg gtc acc tcc atg 1119

Asp Arg Arg Pro Ala Ser Asn Met Asp Pro Tyr Val Val Thr Ser Met

330 335 340 345

atc gcc gag acc acc atc gtc tgg aag ccc tga ggcatcccgt ggccgtgtcg 1172

Ile Ala Glu Thr Thr Ile Val Trp Lys Pro

350 355

tgtcggtttg ctccgcgtac ggcgctggcc gttgcatcgc agggcccagc ggttgcgcaa 1232

ctattttccc ttccccgttc cgtttgcttg tactactact ctaccgctag tcctgcatag 1292

cattttagct agaacacaac aacagccaaa aaaaaacatt gttgcttgct tcgacttcga 1352

cgcttcccac cactagttcc attccatgcc gtccgtccac ttccttcctg tgtaatcctc 1412

ctccaataat agacgtgtca tgctgcatcc tctgcattgt ataaaagaaa gtggtgtaat 1472

ccttttgctg gcgcctcc 1490

<210>4

<211>355

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<400>4

Met Ala Cys Leu Thr Asp Leu Val Asn Leu Asn Leu Ser Asp Thr Thr

1 5 10 15

Glu Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Ile Gly Gly Ser Gly Met Asp

20 25 30

Leu Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Pro Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser

35 40 45

Lys Leu Pro Lys Trp Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Gly Glu Asp Ser Glu Val Ile Leu Tyr Pro Gln Ala Ile Phe Lys Asp

65 70 75 80

Pro Phe Arg Arg Gly Asn Asn Ile Leu Val Met Cys Asp Cys Tyr Thr

85 90 95

Pro Ala Gly Glu Pro Ile Pro Thr Asn Lys Arg Tyr Ser Ala Ala Lys

100 105 110

Ile Phe Ser Ser Pro Glu Val Ala Ala Glu Glu Pro Trp Tyr Gly Ile

115 120 125

Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys Asp Thr Asn Trp Pro Leu Gly

130 135 140

Trp Pro Ile Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Gly

145 150 155 160

Ile Gly Ala Glu Lys Ser Phe Gly Arg Asp Ile Val Asp Ala His Tyr

165 170 175

Lys Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Ile Asn Ile Ser Gly Ile Asn Gly Glu

180 185 190

Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe Gln Val Gly Pro Ser Val Gly Ile

195 200 205

Ser Ser Gly Asp Gln Val Trp Val Ala Arg Tyr Ile Leu Glu Arg Ile

210 215 220

Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Val Thr Phe Asp Pro Lys Pro Ile Pro

225 230 235 240

Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ala His Thr Asn Tyr Ser Thr Glu Ser

245 250 255

Met Arg Lys Glu Gly Gly Tyr Glu Val Ile Lys Ala Ala Ile Glu Lys

260 265 270

Leu Lys Leu Arg His Lys Glu His Ile Ala Ala Tyr Gly Glu Gly Asn

275 280 285

Glu Arg Arg Leu Thr Gly Arg His Glu Thr Ala Asp Ile Asn Thr Phe

290 295 300

Ser Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala Ser Val Ala Val Gly Gln Thr

305 310 315 320

Glu Gln Asn Gly Lys Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala Ser Asn

325 330 335

Met Asp Pro Tyr Val Val Thr Ser Met Ile Ala Glu Thr Thr Ile Val

340 345 350

Trp Lys Pro

355

<210>5

<211>11

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<400>5

Thr Leu Ser Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser Lys

1 5 10

<210>6

<211>14

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<400>6

Thr Leu Ser Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser Lys Leu Pro Lys

1 5 10

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<400>7

Thr Leu Pro Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser Lys

1 5 10

<210>8

<211>14

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<400>8

Thr Leu Pro Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser Lys Leu Pro Lys

1 5 10

<210>9

<211>14

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<400>9

His Arg Glu His Ile Ala Ala Tyr Gly Glu Gly Asn Glu Arg

1 5 10

<210>10

<211>14

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<400>10

His Lys Glu His Ile Ala Ala Tyr Gly Glu Gly Asn Glu Arg

1 5 10

Claims

1.一种通过增加籽粒的数目而提高玉米植物籽粒生产能力的方法，其中所述方法包括在所述植物中过量表达一种活性谷氨酰胺合成酶GS1-3同工酶，该GS1-3同工酶的序列为SEQ ID NO:2。

2.如权利要求1所述的方法，其中该籽粒的生产能力进一步是通过增加籽粒的大小而提高的，并且所述方法进一步包括在所述植物中对活性谷氨酰胺合成酶GS1-4同工酶进行过量表达，该GS1-4同工酶的序列为SEQ ID NO:4。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中该籽粒生产能力的提高是通过在同一种植物中对该GS1-3同工酶以及该GS1-4同工酶均进行过量表达，以使籽粒的大小与数目均增加。

4.一种重组表达盒，包括一种多核苷酸，该多核苷酸在一种植物细胞中的一种启动子功能的控制下对权利要求1中限定的GS1-3同工酶进行编码。

5.如权利要求4所述的一种重组表达盒，还包括对权利要求2中限定的GS1-4同工酶进行编码的一种多核苷酸。

6.一种重组载体，该重组载体含有如权利要求4或5所述的一种表达盒。

7.一种重组载体，包括在一种植物细胞中的一种启动子功能的控制下对权利要求1中限定的GS1-3同工酶进行编码的一种多核苷酸，以及在一种植物细胞中的一种启动子功能的控制下对权利要求2中限定的GS1-4同工酶进行编码的一种多核苷酸。

8.用于生产转基因植物的一种方法，该转基因植物具有一个提高的籽粒生产能力，其中所述方法包括：

-提供一种植物细胞，该细胞含有如权利要求4或5所述的一种重组表达盒，或者如权利要求6或7所述的一种重组载体；

-从所述植物细胞再生一种转基因植物，该转基因植物过量表达如权利要求1或2中限定的一种谷氨酰胺合成酶同工酶。

9.根据权利要求8所述的一种方法，其中该转基因植物是一种转基因谷类植物。

10.根据权利要求9所述的一种方法，其中该转基因谷类植物选自一种转基因小麦植物、一种转基因稻植物、或一种转基因玉米植物。