MX2012004873A - Plantas con utilizacion de nitrogeno mejorada y tolerancia al estres. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona a plantas transgénicas que tienen eficiencia de uso de nitrógeno incrementada, tolerancia al estrés y/o mitigan una limitación tal que se incrementa el rendimiento, o una combinación de estos y que se han transformado usando un constructo de vector novedoso que incluye un gen de N-acetil glutamato quinasa (NAGK) sintético que modula el uso de nitrógeno en plantas. La invención también incluye la sobreexpresión y caracterización enzimática de un NAGK insensible a arginina aislado de una cepa bacteriana que mejora la tolerancia al estrés y la captación de nitrógeno, metabolismo o ambos. En varias modalidades, el constructo de vector incluye una o más secuencias de ácido nucleico incluyendo la SEQ ID NO: 1. La invención también se relaciona a vectores aislados para transformar plantas y a anticuerpos usados para detectar plantas transformadas. La invención también se relaciona a métodos para expresar en plantas las moléculas de ácido nucleico correspondientes a las secuencias de ácido nucleico que modulan el uso de nitrógeno en plantas o se modulan por las condiciones de nitrógeno.

Description

PLANTAS CON UTILIZACIÓN DE NITRÓGENO MEJORADA Y TOLERANCIA AL ESTRÉS Campo de la Invención Esta solicitud reclama la prioridad de la Solicitud de Patente Norteamericana No. de Serie 61/258,075 presentada el 4 de Noviembre del 2009.

La invención se relaciona generalmente a plantas con utilización de nitrógeno mejorada y tolerancia al estrés, más específicamente, a la expresión heteróloga de una enzima de N-acetil glutamato quinasa (NAGK) insensible a arginina en plantas, incluyendo la sobreexpresión y caracterización enzimática de una NAGK insensible a arginina aislada de una cepa bacteriana que mejora la tolerancia al estrés y la captación de nitrógeno, metabolismo o ambos.

Antecedentes de la Invención Las plantas requieren nitrógeno durante sus fases de crecimiento vegetativo y reproductivo. El nitrógeno se hace disponible a la planta a través de la mineralización del suelo, la aplicación de fertilizante de nitrógeno, o ambos. Se ha estimado, sin embargo, que entre 50 y 70 por ciento de nitrógeno aplicado a cultivos se pierde del sistema de planta-suelo [Peoples, M.B. y colaboradores, "Minimizing Gaseous Losses of Nitrogen", In Nitrogen Fertilizer in the Environment (Bacon, P.E., ed.) Marcel Dekker, pp . 565-606 (1995)]. El nitrógeno es uno de los nutrientes de plantas más costoso de suministrar, el fertilizante de nitrógeno no siempre está disponible a un costo no razonable, y la aplicación excesiva de fertilizante de nitrógeno puede dar por resultado problemas ambientales. El maíz en un ejemplo de una planta agronómicamente importante que frecuentemente requiere fertilizantes de nitrógeno para realizar su potencial genético.

En células de plantas, NAGK (N-Acetil Glutamato Quinasa) lleva a cabo la segunda etapa en una ruta biosintética que conduce a la producción de arginina. De manera importante, varias enzimas NAGK de plantas y bacterianas se conocen que son inhibidas por altas concentraciones de arginina (Bourrellier, 2009; Llacer, 2008; Lohmeier-Vogel , 2005; Fernandez-Murga, 2004), lo cual sugiere que NAGK desempeña una función en la regulación de arginina en plantas. Adicionalmente, se ha demostrado que la proteina P-II de planta puede mitigar la inhibición basada en arginina de NAGK. P-II se conoce que desempeña una función clave en la regulación de flujo de carbono y nitrógeno en plantas (Bourrellier, 2009; Llacer, 2008).

Una estrategia para regular hacia arriba la ruta biosintética de arginina en plantas es reducir o eliminar la inhibición de NAGK por arginina. Esto se puede lograr mediante la expresión heteróloga de una enzima NAGK insensible a arginina en plantas. Aquí, los inventores describen la sobreexpresión y caracterización enzimática de una NAGK insensible a arginina aislada de una cepa bacteriana .

Breve Descripción de la Invención La presente invención se relaciona a plantas transgénicas que tienen eficiencia de uso de nitrógeno incrementada, tolerancia al estrés, o ambas, que se han transformado utilizando un constructo de vector novedoso que incluye una secuencia de ácido nucleico de NAGK insensible a arginina que modula el uso de nitrógeno en plantas. Una variedad de secuencias de ácido nucleico de NAGK se identificaron en una librería de cepas bacterianas algunas de las cuales fueron los genes NAGK novedosos. Un método alternativo para identificar genes NAGK para el uso con la presente invención son los diversos proyectos de secuenciación genómica bacteriana y de plantas que se ha archivado en bases de datos públicas de las cuales podrían ser seleccionadas secuencias que codifican enzimas NAGK con actividad robusta. La invención también se relaciona a vectores aislados para transformar plantas y a anticuerpos para detectar la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés en las plantas transformadas. La invención también se relaciona a métodos para expresar en plantas las moléculas de ácido nucleico correspondientes a las secuencias de ácido nucleico que modulan el uso de nitrógeno en plantas.

Específicamente, vectores para transformar plantas y células bacterianas se han construido utilizando la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1, así como variantes, fragmentos y complementos de la misma. Estos vectores incluyen una secuencia de promotor de DNA 5' y una secuencia de terminador 3' , en donde la secuencia de ácido nucleico, la secuencia de promotor de DNA y la secuencia de terminador se acoplan operativamente para permitir la transcripción de la secuencia de nucleótidos. En algunas modalidades, la secuencia de promotor puede ser un promotor de planta constitutivo o un promotor específico de tejido.

La invención también incluye anticuerpos policlonales, que comprenden anticuerpos policlonales a un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO : 1.

La invención también incluye plantas transformadas con una secuencia de nucleótidos seleccionada SEQ ID NO: 1, así como variantes y fragmentos de la misma. La planta se selecciona del grupo que consiste de cereal (maíz) , sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, betabel, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza de semilla de aceite, Brassica sp, alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuates, camote, mandioca, café, coco, piña, árboles cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avenas, vegetales, hierbas (tales como hierbas de césped, hierbas de forraje o hierbas de pastura), plantas ornamentales, árboles (tales como árboles frutales, árboles de nueces, árboles de pulpa, palmas de aceite) y coniferas. La invención también incluye una parte componente de tales plantas, la semilla de planta producida de tales plantas, y una semilla de planta transformada con un constructo de vector de la presente invención.

La invención también incluye una célula hospedera transformada con una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1. La célula hospedera puede ser una célula bacteriana o una célula de planta .

La invención también incluye un método para expresar una molécula de ácido nucleico que modula el nitrógeno en una planta, el método que comprende las etapas de proporcionar una planta transgénica o semilla de planta transformada con un constructo de vector de acuerdo con la presente invención, y cultivar la planta transgénica o una planta cultivada de la semilla de planta transgénica bajo condiciones efectivas para expresar la molécula de ácido nucleico en la planta transgénica o la planta cultivada de la semilla de planta transgénica. El crecimiento de la planta transgénica es efectivo en incrementar la captación de nitrógeno de la planta transgénica o la planta cultivada de la semilla de planta transgénica, y/o incrementar la eficiencia de utilización de nitrógeno de la planta transgénica o la planta cultivada de la semilla de planta transgénica, y/o mitigar una limitación tal que el rendimiento se incrementa en la planta transgénica o la planta cultivada de la semilla de planta transgénica. La invención también incluye los métodos anteriores en donde se proporciona planta transgénica o se proporciona una semilla transgénica. La invención también incluye el método anterior en donde la planta se selecciona el grupo que consiste de cereal (maíz), sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, betabel, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza de semilla de aceite, Brassica sp, alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuates, camote, mandioca, café, coco, piña, árboles cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avenas, vegetales, hierbas (tales como hierbas de césped, hierbas de forraje o hierbas de pastura) , plantas ornamentales, árboles (tales como árboles frutales, árboles de nueces, árboles de pulpa, o palmas de aceite) y coniferas.

La invención también incluye un método para mejorar la tolerancia al estrés de una planta al expresar una molécula de ácido nucleico modulada por nitrógeno en una planta, el método que comprende las etapas de proporcionar una planta transgénica o semilla de planta transformada con un conducto de vector de acuerdo con la presente invención y cultivar la planta transgénica o una planta cultivada de la semilla de planta transgénica bajo condiciones efectivas para expresar la molécula de ácido nucleico en la planta transgénica o en la planta cultivada de la semilla de planta transgénica .

La invención también incluye un método para alterar la morfología de una planta al expresar una molécula de ácido nucleico modulada por nitrógeno en una planta, el método que comprende las etapas de proporciona una planta transgénica o una semilla de planta transformada con un constructo de vector de acuerdo con la presente invención y cultivar la planta transgénica o una planta cultivada de la semilla de planta transgénica bajo condiciones efectivas para expresar la molécula de ácido nucleico en la planta transgénica o la planta cultivada de la semilla de planta transgénica.

La invención también incluye un constructo de vector, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos NAGK SEQ ID NO: 2, una secuencia de promotor de DNA 5' , y una secuencia de terminador 3', en donde la secuencia de nucleótidos, la secuencia de promotor de DNA, y la secuencia de terminador se acoplan operativamente para permitir la transcripción de la secuencia de nucleótidos.

La invención también incluye un constructo de vector que comprende una secuencia de nucleótidos que modula el nitrógeno en una planta, en donde la secuencia de nucleótidos es de la SEQ ID NO: 1; una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos modula el nitrógeno en una planta; una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos NAG SEQ ID NO: 2; y, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos modula el nitrógeno en una planta, en donde el constructo además comprende una secuencia de promotor de DNA 5' y una secuencia de terminador de 3' , en donde la secuencia de nucleótidos, la secuencia de promotor de DNA y la secuencia de terminador se acoplan operativamente para permitir la transcripción de la secuencia de nucleótidos .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es un mapa de vector para pAX4389.

La Figura 2 es una gráfica de un ensayo de enzima in vitro NAGK; titulación con enzima. La adición de la enzima NAGK al substrato (NAG) conduce a la formación de producto de una manera dependiente de enzima.

La Figura 3 es una gráfica de un ensayo de enzima in vitro NAGK; titulación con sustrato. La adición de la enzima NAGK a concentraciones variantes de sustrato (NAG) conduce a la formación de producto de una manera dependiente de sustrato.

La Figura 4 es una gráfica de un ensayo de enzima in vitro NAGK; titulación con arginina. La formación del producto por la enzima NAGK fue insensible a la presencia de arginina sobre el intervalo de concentraciones probadas.

Descripción Detallada de Modalidades Preferidas El desarrollo de variedades de plantas que usan nitrógeno más eficientemente reducirá la necesidad para entradas excesivas de nitrógeno, ahorro de costos de producción para los granjeros, beneficio de los granjeros en países en desarrollo quienes no tienen acceso a entradas de fertilizante y reducir la contaminación ambiental asociada con la aplicación de fertilizantes de nitrógeno excesivos. Un procedimiento que se ha utilizado en el desarrollo de variedades de plantas con utilización de nitrógeno mejorada depende de técnicas de reproducción de plantas convencionales. Sin embargo, tales procedimientos han tenido éxito variable debido a la carencia de especificación en la recombinación genética.

Hay una necesidad para desarrollar variedades de cultivo de plantas que adsorban y usen el nitrógeno más eficientemente. Los científicos de plantas han adoptado el término abreviado de eficiencia de uso de nitrógeno (NUE) y una variedad de métodos para medir y evaluar la NUE se han desarrollado [Craswell, E.T. and Godwin, D.C. (1984) The efficiency of nitrogen fertilízers applied to cereals grown in different climates. In Advances in Plant Nutrition (Vol. 1) (Tinker, P.B. and Lauchli, A., eds), pp. 1-55, Praeger Publishers; Steenbjerg, F. and Jakobsen, S.T. (1963) Plant nutrition and yield curves. Soil Sci. 95, 69-90; Siddigi, M.Y. and Glass, D.M. (1981) Utilization índex: a modified approach to the estimation and comparison of nutrient utilization efficiency in plants. J. Plant Nutr. 4, 289-302; Molí, R.H. y colaboradores, (1982) Analysis and interpretation of factors which contribute to efficiency of nitrogen utilization. Agron. J. 74, 562-564] . Hay diferencias en las definiciones especificas, y el contexto de uso. Por ejemplo, algunas definiciones están basadas en la biomasa total mientras que otras están basadas en el peso de grano producido. Otro conjunto de definiciones usa la eficiencia de extracción de nitrógeno del suelo. La eficiencia con la cual el nitrógeno aplicado se utiliza para mejorar el rendimiento de grano se puede medir mediante la eficiencia agronómica (AE) , el producto de eficiencia fisiológica y eficiencia de utilización, o NUEg que es el producto de eficiencia de captación y eficiencia de utilización. Otras definiciones toman factores fisiológicos en cuenta.

Como se utiliza en esta especificación, el término eficiencia de uso de nitrógeno, o NUE, se define para incluir un cambio medible en cualquiera de los tamaños de acumulación metabólica de nitrógeno principales en las rutas de asimilación (por ejemplo, puede incluir un cambio medible en uno o más de los siguientes: nitrato, nitrito, amoniaco, ácido glutámico, ácido aspártico, glutamina, asparagina, lisina, leucina, treonina, metionina, glicina, triptofano, tirosina, contenido de proteina total de una parte de la planta, contenido de nitrógeno total de una parte de la planta y/o contenido de clorofila) o donde la planta se muestra que proporciona la misma o biomasa elevada o rendimiento cosechable en niveles de fertilización de nitrógeno inferiores, o donde la planta se muestra que proporciona biomasa elevada o rendimientos cosechables en los mismos niveles de fertilización de nitrógeno cuando se compara a una planta que no se ha transformado con un constructo de ácido nucleico de modulación de nitrógeno de la invención. Un "cambio medible" puede incluir un incremento o una disminución en la cantidad de cualquier componente ("acumulación metabólica") de la ruta de asimilación de nitrógeno. Un cambio puede incluir ya sea una disminución o un incremento en una o más acumulaciones metabólicas en la ruta, o una disminución en una o más acumulaciones con un incremento concomitante en una o más de otras acumulaciones, tal como cuando un intermediario en la ruta de asimilación de nitrógeno está siendo utilizando para el propósito de generar otro intermediario o producto de la ruta. Por ejemplo, en la conversión de glutamato a glutamina, el nivel de glutamato puede disminuir mientras que el nivel de glutamina puede incrementarse. Así, mientras que no es limitado por alguna teoría particular o mecanismo, cualquier cambio en una o más de estas acumulaciones indica que el nitrógeno está siendo utilizado más eficientemente por la planta.

Un incremento en la eficiencia de utilización de nitrógeno se puede asociar con aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, aproximadamente un 200% o más grande cambio medible en cualquiera de los tamaños de acumulación metabólica de nitrógeno principales en la ruta de asimilación. En una modalidad, las plantas transgénicas de la invención tienen una captación de nitrógeno incrementada del ambiente cuando se compara con una planta que no contiene una secuencia de modulación de nitrógeno de la invención. Por "secuencia de modulación de nitrógeno" se propone para dar a entender una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que modula NUE, a manera de ejemplo no limitante: ya sea al generar una enzima que impacta NUE, o al generar una proteína que interactúa con los componentes involucrados en NUE, o al generar una proteína que impacta la cascada de señal homeostática interna que regula NUE, o mediante una combinación de estos mecanismos. La presente invención además proporciona un método para mejorar la tolerancia al estrés en una planta al expresar una o más secuencias de nucleótidos de modulación de nitrógeno dentro de la planta. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos de modulación de nitrógeno es SEQ ID NO: 1, o variantes y fragmentos de la misma. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos de modulación de nitrógeno es una secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO: 2, o variantes y fragmentos de las mismas .

Como se utiliza en la presente, el término "estrés" o "condición de estrés" se refiere a la exposición de una planta, célula de planta, o los similares, a un agente físico, ambiental, biológico o químico o condición que tiene un efecto adverso sobre el metabolismo, crecimiento, desarrollo, propagación y/o supervivencia de la planta (colectivamente "crecimiento"). Un estrés se. puede imponer en una planta debido, por ejemplo, a un factor ambiental tal como agua (por ejemplo, inundación, sequía, deshidratación) , condiciones anaeróbicas (por ejemplo, un bajo nivel de oxígeno) , condiciones osmóticas anormales, salinidad o temperatura (por ejemplo, caliente/calor, frío, congelación, escarcha) , una deficiencia de nutrientes tales como nitrógeno, fosfato, potasio, azufre, micronutriente, o exposición a contaminantes, o mediante una hormona, segundo mensajero u otra molécula. El estrés anaeróbico, por ejemplo, es debido a una reducción en los niveles de oxigeno (hipoxia o anoxia) suficiente para producir una respuesta de estrés. Un estrés de inundación puede ser debido a la inmersión prolongada o transiente de una planta, parte de planta, tejido o célula aislada en un medio liquido tal como ocurre durante el monzón, estación húmeda, inundación instantánea o riego excesivo de plantas, o los similares. Un estrés de frío o estrés de calor puede ocurrir debido a una disminución o incremento, respectivamente, en la temperatura del intervalo óptimo de temperatura de crecimiento para una especie de planta particular. Tales intervalos de temperatura de crecimiento óptimos se determinan fácilmente o son conocidos para aquellos expertos en la técnica. El estrés de deshidratación se puede inducir por la pérdida de agua, turgor reducido, o contenido de agua reducido de una célula, tejido, órgano o planta completa. El estrés de sequía se puede inducir mediante o asociado con la privación de agua o suministro reducido de agua a una célula, tejido, órgano u organismo. El estrés salino (estrés de sal) se puede asociar con o inducir por una perturbación en el potencial osmótico del ambiente intracelular o extracelular de una célula. El estrés osmótico se puede asociar con o inducir por un cambio, por ejemplo, en la concentración de moléculas en el ambiente intracelular o extracelular de una célula de planta, particularmente donde las moléculas no pueden ser particionadas a través de la membrana de célula de planta.

Una mejora en la tolerancia al estrés se puede estimar mediante cualquier medida cuantitativa p cualitativa del desempeño de la planta bajo una condición de estrés dada y es relativa al desempeño de una planta cultivada bajo las mismas condiciones de estrés que no se ha transformado con una secuencia de modulación de nitrógeno de la invención. Asi, las plantas pueden exhibir contenidos de nitrógeno mejorados, composiciones de aminoácidos o de proteina alterados, composición de carbohidrato alterada, composición de aceite alterada, características de crecimiento vigorosas, rendimientos vegetativos incrementados o mejores rendimientos de semilla y cualidades. Estas plantas se pueden identificar al examinar cualquiera de los siguientes parámetros: 1) la velocidad de crecimiento, medida en términos de la velocidad de incremento en peso fresco o seco; 2) rendimiento vegetativo de la planta madura, en términos de peso fresco o seco; 3) el rendimiento de semilla o de fruto; 4) el peso de la semilla o fruto; 5) el contenido de nitrógeno total de la planta; 6) el contenido de nitrógeno total del fruto o semilla; 7) el contenido de aminoácido libre de la planta; 8) el contenido de aminoácido libre del fruto o semilla; 9) el contenido de proteína total de la planta; 10) el contenido de proteína total del fruto o semilla; 11) el cambio medible en carbohidratos o aceites. Los procedimientos y métodos para examinar estos parámetros son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Estos métodos pueden involucrar ensayos enzimáticos e inmunoensayos para medir los niveles de enzima/proteína; ensayos para medir la composición de aminoácido, la acumulación de aminoácido libre o el contenido de nitrógeno total en varios tejidos de planta; medición de velocidades de crecimiento en términos de ganancias de peso fresco a través del tiempo; o medición del rendimiento de la planta en términos del peso seco total y/o peso de semilla total .

Transformación de Células Bacterianas o de Planta Se proporcionan en la presente secuencias de nucleótidos novedosas que modulan la eficiencia de utilización de nitrógeno en plantas. También se proporcionan secuencias de aminoácidos de las proteínas de la invención, que pueden ser de modulación de nitrógeno o moduladas por la concentración de nitrógeno.

Las secuencias de nucleótidos de modulación de nitrógeno de la invención se pueden modificar para obtener o aumentar la expresión en células de planta. Las secuencias de modulación de nitrógeno de la invención se pueden proporcionar en casetes de expresión para la expresión en la planta de interés. "Cásete de expresión de plantas" incluye constructos de DNA que son capaces de dar por resultado la expresión de una proteina desde una estructura de lectura abierta en una célula de planta. El cásete incluirá en dirección 5' -3' de transcripción, una región de iniciación transcripcional (es decir promotor) operablemente enlazado a una secuencia de DNA de la invención, y una región de terminación transcripcional y traduccional (es decir región de terminación) funcional en plantas. El cásete adicionalmente puede contener por lo menos un gen adicional que es co-transformado en el organismo, tal como un gen marcador seleccionable o un gen apilado de función diferente. Alternativamente, el gen (es) adicional se puede proporcionar en múltiples casetes de expresión. Tal cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia de modulación de nitrógeno que está bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras .

Por "promotor" se propone una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo. El promotor, junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras transcripcionales y traduccionales (también llamadas como "secuencias de control") son necesarias para la expresión de una secuencia de DNA de interés. De preferencia, el promotor es uno . que se conoce que estimula la transcripción en el organismo en el cual la secuencia de nucleótidos de la invención está siendo introducida.

El promotor puede ser nativo o análogo, o foráneo o heterólogo, al hospedero de planta y/o a la secuencia de DNA de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Donde el promotor es "nativo" u "homólogo" al hospedero de planta, se propone que el promotor se encuentra en la planta ¦nativa en la cual se introduce el promotor. Donde el promotor es "foráneo" o "heterólogo" a la secuencia de DNA de la invención, se propone que el promotor no es el promotor nativo o que ocurre naturalmente para la secuencia de DNA operablemente enlazada de la invención. "Heterólogo" generalmente se refiere a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el cual están presentes, y se han adicionado a la célula por infección, transíección, microinyección , electroporación, microproyección o los similares. Por "operablemente enlazado" se propone un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia de promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de DNA correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, "operablemente enlazado" significa que las secuencias de ácido nucleico que están enlazadas están contiguas, incluyendo exones e intrones y, donde es necesario unen dos regiones de codificación de proteína, contiguas y en la misma estructura de lectura.

En una modalidad, el promotor es un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos adecuados para el uso en plantas incluyen: los promotores de virus de planta, tal como el promotor de caulimovirus rayado ciorótico de cacahuate (PCISV) (Patente Norteamericana No. 5,850,019); el promotor 35S del virus de mosaico de coliflor (Ca V) (Odell y colaboradores, (1985) ?/ature 313:810-812); promotores de genes de metiltransferasa del virus Chlorella (Patente Norteamericana No. 5,563,328) y el promotor de transcripto de longitud completa del virus de mosaico de escrofularia (FMV) (Patente Norteamericana No. 5,378,619); los promotores de tales genes como actina de arroz (McElroy y colaboradores, (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen y colaboradores, (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 and Christensen y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) , incluyendo el promotor TrpPro5 (Solicitud de Patente Norteamericana No. 10/377,318; presentada el 16 de Marzo del 2005); pEMU (Last y colaboradores, (1991) Theor. Appl . Genet. 81:581-588); MAS (Velten y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2723-2730); histona H3 de maíz (Lepetit y colaboradores, (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 and Atanassova y colaboradores, (1992) Plant J. 2 ( 3 ) : 291-300 ) ; ALS3 de Brassica napus (Solicitud de PCT WO 97/41228); y promotores de varios genes de Agrobacteriu (ver las Patentes Norteamericanas Nos. 4,771,002; 5,102,796; 5,182,200 y 5, 428, 147) .

En otra modalidad, el promotor es un promotor especifico de tejido. Una lista de promotores específicos de tejido comúnmente utilizados se puede encontrar en Reviewed in Moore y colaboradores, (2006) Plant J. 45 ( ) : 651- 683 , la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

Frecuentemente, tales constructos también contendrán regiones no traducidas 5' y 3' . Tales constructos puede contener una "secuencia de señal" o "secuencia de guía" para facilitar el transporte co-traduccional o post-traduccional del péptido de interés a ciertas estructuras intracelulares tal como el cloroplasto (u otra plástida), retículo endoplásmico, o aparato de Golgi, o para ser secretado. Por ejemplo, el gen se puede diseñar para contener un péptido de señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. Por "secuencia de señal" se propone una secuencia que se conoce o se sospecha que da por resultado el transporte de péptido co-traduccional o post-traduccional a través de la membrana celular. En eucariotas, esto típicamente involucra la secreción en el aparato de Golgi, con algo de gl icosi lación resultante. Por "secuencia de guía" se propone cualquier secuencia que cuando se traduce, da por resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para activar el transporte co-transduccional de la cadena de péptido a una organela sub-celular. Así, este incluye secuencias de guia que dirigen el transporte y/o glicosilación mediante el pasaje en el retículo endoplásmico, pasaje a vacuolas, plástidos que incluyen cloroplastos, mitocondrios y los similares. También puede ser preferible diseñar el cásete de expresión de planta para contener un intrón, tal que el procesamiento de mRNA del intrón se requiere para la expresión.

Por "región no traducida 3' " se propone una secuencia de nucleótidos localizada corriente abajo de una secuencia de codificación. Las secuencias de señal de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar la adición de tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de mRNA son regiones no traducidas 3'. Por "región no traducida 5'" se propone una secuencia de nucleótidos localizada corriente arriba de una secuencia de codificación.

Otros elementos no traducidos corriente arriba o corriente abajo incluyen aumentadores . Los aumentadores son secuencias de nucleótidos que actúan para incrementar la expresión de una región de promotor. Los aumentadores son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados, a la región de aumentador SV40 y el elemento de aumentador 35S.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional , puede ser nativa con la secuencia de modulación de nitrógeno de la presente invención, o se puede derivar de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes son disponibles del plásmido Ti de A. turnefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa, o la secuencia del inhibidor II de proteinasa de papa (Pinll) como es descrito en Liu y colaboradores, (2004) Acta Biochim Biophys Sin 36 (8 ): 553-558. Ver también Guerineau y colaboradores, (1991) Mol. Gen. Genet . 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y colaboradores, (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen y colaboradores, (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe y colaboradores, (1990) Gene 91: 151-158; Bailas y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; and Joshi y colaboradores, (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Donde es apropiado, el gen (es) se puede optimizar para la expresión incrementada en la célula hospedera transformada. Estos es, los genes se pueden sintetizar utilizando codones preferidos de la célula hospedera para la expresión mejorada, o se pueden sintetizar utilizando codones en una frecuencia de utilización de codón preferida por el hospedero. Generalmente, el contenido de GC del gen será incrementado. Ver, por ejemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. ¦ 92:1-11 para una discusión de la utilización de codón preferida por el hospedero. Los métodos son conocidos en la técnica para sintetizar genes preferidos por el hospedero. Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,320,100; 6,075,185; 5,380,831; y 5,436,391, · la Solicitudes Publicadas Norteamericanas Nos. 20040005600 and 20010003849 y Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas en la presente por referencia.

En una modalidad, los ácidos nucleicos de interés se dirigen al cloroplasto para expresión. De esta manera, donde el ácido nucleico de interés no se inserta directamente en el cloroplasto, el cásete de expresión adicionalmente contendrá un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir el producto génico de interés a los cloroplastos . Tales péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Von Heijne y colaboradores, (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark y colaboradores, (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa y colaboradores, (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer y colaboradores, (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; and Shan y colaboradores, (1986) Science 233:478-481.

Los ácidos nucleicos de interés que son dirigidos al cloroplasto pueden optimizar para la expresión en el cloroplasto para tener en cuenta las diferencias en la utilización de codón entre el núcleo de planta y esta organela. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés se puede sintetizar utilizando codones preferidos de cloroplasto. Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,380,831, incorporada en la presente por referencia.

Típicamente este "cásete de expresión de planta" será insertado en un "vector de transformación de planta". Por "vector de transformación" se propone una molécula de DNA que es necesaria para la transformación eficiente en una célula. Tal molécula puede consistir de uno o más casetes de expresión, y se puede organizar en más de una molécula de DNA de "vector". Por ejemplo, vectores binarios son vectores de transformación de planta que utilizan dos vectores de DNA no contiguos para codificar todas las funciones de acción cis y trans necesarias para la transformación de células de planta (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451) . "Vector" se refiere a un constructo de ácido nucleico diseñado para la transferencia entre diferentes células hospederas. Vector de expresión "se refiere a un vector que tiene la habilidad para incorporar, integrar y expresar secuencias de DNA heterólogas o fragmentos en una célula foránea .

Este vector de transformación de planta puede estar comprendido de uno o más vectores de DNA necesarios para lograr la transformación de planta. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación de planta que están comprendidos de más de un segmento de DNA contiguo. Estos vectores son frecuentemente referidos en la técnica como "vector binario". Los vectores binarios asi como los vectores con plásmidos ayudantes son más frecuentemente utilizados para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de DNA necesarios para lograr la transformación eficiente es muy grande, y es ventajoso separar las funciones sobre moléculas de DNA separadas. Los vectores binarios típicamente contienen un vector de plásmido que contiene la secuencia de acción cis requerida para la transferencia de T-DNA (tal como el borde izquierdo y borde derecho), un marcador seleccionable que es diseñado para ser capaz de la expresión en una célula de planta, y una "secuencia de nucleótidos de interés" (una secuencia de nucleótidos diseñada para ser capaz de expresión en una célula de planta para la cual se desea la generación de planta transgénicas ) . También presente en este vector de plásmido están secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias de acción cis está arregladas de una manera que permiten la transferencia eficiente en células de plantas y la expresión en las mismas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen de interés están localizados entre los bordes izquierdos y derecho. Frecuentemente un segundo vector de plásmido contiene los factores de acción trans que median la transferencia de DNA de Agrobacterium a la célula de planta. Este plásmido frecuentemente contiene las funciones virulencias (genes Vir) que permiten la infección de las células de planta por Agrobacterium, y la transferencia de DNA mediante la segmentación en la secuencias de borde y la transferencia de DNA mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451). Varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) se pueden utilizar para la transformación de planta. El segundo vector de plásmido no es necesario para transformar las plantas mediante otros métodos tales como microproyección , microinyección , electroporación , polietilenglicol , etc.

Variantes Alteradas o Mejoradas Útiles en los Constructos de la Invención Se reconoce que las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos útiles en la presente invención se pueden alterar por varios métodos, y que estas alteraciones pueden dar por resultado secuencias que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes de aquellas codificadas por las secuencias de modulación de nitrógeno divulgadas en la presente .

Las secuencias de nucleótidos útiles en la presente invención incluyen las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 1, y variantes, fragmentos y complementos de las mismas. Como se utiliza en la presente, el término "secuencia de nucleótidos" o "molécula de ácido nucleico" se propone para incluir moléculas de DNA (por ejemplo, cDNA o DNA genómicos) y moléculas de RNA (por ejemplo, mRNA) y análogos del DNA o RNA generados utilizando análogos de nucleótidos. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser de una sola hebra o de doble hebra, pero de preferencia son DNA de doble hebra. Por "complemento" se propone una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria a una secuencia de nucleótidos dada tal que puede hibridar a la secuencia de nucleótidos dada para de esta manera formar un dúplex estable. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para las proteínas de modulación de nitrógeno codificadas por estas secuencias de nucleótidos se exponen en la SEQ ID NO: 2, así como variantes y fragmentos de la misma. La invención también abarca el uso de moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de modulación de nitrógeno de longitud parcial, y complementos de las mismas.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos de modulación de nitrógeno también son útiles en la presente invención. Por "fragmento" se propone una porción de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de modulación de nitrógeno. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar una porción biológicamente activa de una proteina de modulación de nitrógeno, o puede ser un fragmento que se puede utilizar como una sonda de hibridación o cebador de PCR utilizando los métodos divulgados enseguida. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de modulación de nitrógeno comprende por lo menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350 o por lo menos aproximadamente 400 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos de modulación de nitrógeno de longitud completa divulgada en la presente dependiendo del uso propuesto. Por nucleótidos "contiguos" se proponen residuos de nucleótido que están inmediatamente adyacentes uno al otro.

Los polipéptidos que son fragmentos de estos polipéptidos de modulación de nitrógeno también son útiles en la presente invención. Por "fragmento" se propone una porción de una secuencia de aminoácidos que codifica una proteina de modulación de nitrógeno como se expone en la SEQ ID NO: 2, y que retienen la eficiencia de utilización de nitrógeno. Una porción biológicamente activa de una proteina de modulación de nitrógeno puede ser un polipéptido que es, por ejemplo, 10, 25, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 o más aminoácidos en longitud. Tales porciones biológicamente activas se pueden preparar mediante técnicas recombinantes y evaluar para la eficiencia de utilización de nitrógeno. Como se utiliza aquí, un fragmento comprende por lo menos 8 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2. La invención abarca otros fragmentos, sin embargo, tal como cualquier fragmento en la proteina mayor que aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos.

La invención también abarca el uso de moléculas de ácido nucleico variantes, o secuencias de aminoácidos variantes, en los métodos y composiciones de la invención. "Variantes" de las secuencias de nucleótidos de modulación de nitrógeno incluyen aquellas secuencias que codifican una proteina de modulación de nitrógeno divulgada en la presente pero que difiere conservativamente debido a la degeneración del código genético, asi como aquellas que son suficientemente idénticas como es discutido en lo anterior. Las variantes alélicas que ocurren naturalmente se pueden identificar con el uso de las técnicas de biología molecular bien conocidas, tal como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación como son resumidas enseguida. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas que se han generado, por ejemplo, al utilizar la mutagénesis dirigida al sitio pero que todavía codifican las proteínas de modulación de nitrógeno divulgadas en la presente como es discutido enseguida. Las proteínas variantes útiles de la presente invención son biológicamente activas, esto es ellos retienen la actividad biológica deseada de la proteina nativa, esto es, la eficiencia de utilización de nitrógeno y/o tolerancia al estrés mejorada.

Por "variantes" se proponen proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 60%, 65%, aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, o 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Las variantes también incluyen polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que híbrida a la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, o un complemento de la misma, bajo condiciones severas. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a la mutagénesis. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, esto es continúan presentando la actividad biológica deseada de la proteína nativa, esto es, retienen la eficiencia de utilización de nitrógeno y/o tolerancia al estrés mejorada.

Las proteínas de modulación de nitrógeno preferidas útiles en la presente invención son codificadas por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. El término "suficientemente idéntico" se propone para una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 60% o 65% de identidad de secuencia, aproximadamente 70% o 75% de identidad de secuencia, aproximadamente 80% o 85% de identidad de secuencia o aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia comparada con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación descritos en la presente utilizando parámetros estándar. Uno de habilidad en la técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente para determinar la identidad correspondiente a las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tomar en cuenta la degeneración de codón, similitud de aminoácidos, posicionamiento de estructura de lectura y los similares.

Para determinar el por ciento de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias de alinean para propósitos de comparación óptima. El por ciento de identidad de las dos secuencias es una función de número de posiciones idénticas compartidas por la secuencias (es decir, por ciento de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, sobre puestas) x 100) . En una modalidad, las dos secuencias son de la misma longitud. El por¦ ciento de identidad entre dos secuencias se puede determinar utilizando técnicas similares a aquellas descritas enseguida, con o sin permitir espacios. En el cálculo del por ciento de identidad, se cuentan igualaciones típicamente exactas.

La determinación del por ciento de identidad entre dos secuencias se puede realizar utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Cada algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul y colaboradores, (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsguedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, registro = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácido nucleico de modulación de nitrógeno de la invención. Las búsquedas de proteina BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, registro = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de proteínas de modulación de nitrógeno de la invención. Para obtener alineaciones espaciadas para propósitos de comparación se puede utilizar Gapped BLAST como es descrito en Altschul y colaboradores, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-Blast se puede utilizar para realizar una búsqueda iterada que detecta las relaciones distantes en las moléculas. Ver Altschul y colaboradores, (1997) supra . Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros de error de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN) . Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo no limitante en un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins y colaboradores, (1994) Nucleic Acíds Res. 22:4673-4680) . ClustalW compara las secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o DNA, y asi puede proporcionar datos acerca de la conservación de secuencia de la secuencia de aminoácidos completa. El algoritmo ClustalW se utiliza en varios paquetes de software de análisis de DNA/aminoácido comercialmente disponibles, tal como el modulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) . Después de la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, se puede estimar el por ciento de identidad de aminoácido. Un ejemplo no limitante de un programa de software útil para el análisis de alineaciones ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite la estimación de la similitud de aminoácidos (o DNA) y la identidad entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABI0S : 11-17. Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de software de alineación de secuencia GCG (disponible de Accelrys, Inc., 9865 Scranton Rd . , San Diego, California, USA) . Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos de ponderación de PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12, y una sanción de espacio de 4.

Un programa preferido es la versión 10 de GAP, que utilizó el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453. La versión 10 de GAP se puede utilizar con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando una Ponderación de GAP de 50 y Ponderación de Longitud de 3, y la matriz de registro nwsgapdna . cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y Ponderación de Longitud de 2 y la matriz de registro BLOSUM62. También se pueden utilizar programas equivalentes. Por "programa equivalente" se propone cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene igualaciones de residuos de nucleótidos o de aminoácidos idénticas y un por ciento de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada por la Versión 10 de GAP.

La persona experta además apreciará que cambios se pueden introducir mediante la mutación en las secuencias de aminoácidos de la invención para de esta manera conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteina de modulación de nitrógeno codificada, sin alterar la actividad biológica de la proteina. Asi, las moléculas de ácido nucleico aisladas variantes se pueden crear al introducir una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos correspondiente divulgada en la presente, tal que una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos se introducen en la proteina codificada. Las mutaciones se pueden introducir mediante técnicas estándares, tal como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Tales secuencias de nucleótidos variantes también son abarcadas por la presente invención .

Por ejemplo, las sustituciones de aminoácido conservativas se pueden hacer en uno o más residuos de aminoácido de preferencia no esenciales, predichos . Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia de tipo silvestre de una proteina de modulación de nitrógeno sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es requerido para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acídicas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina , metionina, triptofano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina , triptofano, histidina) . Las sustituciones de aminoácido se pueden hacer en regiones no conservadas que retienen la función. En general, tales sustituciones no serian hechas para residuos de aminoácido conservados, o para residuos de aminoácido que residen dentro de una porción conservada, donde tales residuos son esenciales para la actividad de la proteina. Sin embargo, uno de habilidad en la técnica entendería que las variantes funcionales pueden tener alteraciones conservadas o no conservadas menores en los residuos conservados. Ejemplos de residuos que son conservados y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de secuencias similares o relacionadas conocidas que son involucradas en la asimilación de nitrógeno. Ejemplos de residuos que son conservados pero que pueden permitir sustituciones de aminoácido conservativas y todavía retienen la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que tienen solamente sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en una alineación de secuencias similares o relacionadas conocidas que son involucradas en la asimilación de nitrógeno.

Alternativamente, las secuencias de nucleótidos variantes se pueden hacer al introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación, tal como mediante la mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden clasificar para la habilidad para conferir eficiencia de utilización de nitrógeno para identificar mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada se puede expresar recombinantemente, y la actividad de la proteína se puede determinar utilizando técnicas de ensayo estándares .

Utilizando métodos tal como la PC , hibridación y los similares, las secuencias de modulación de nitrógeno correspondientes se pueden identificar, tales secuencias que tienen identidad sustancial a las secuencias de la invención. Ver, por ejemplo, Sambrook J., and Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) and Innis, y colaboradores, (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY) . En un método de hibridación, toda o parte de la secuencia de nucleótidos de modulación de nitrógeno se puede utilizar para clasificar librerías de cDNA o genómicas. Métodos para la construcción de tales librerías de cDNA y genómicas son generalmente conocidos y se divulgan en Sambrook and Russell, 2001, supra .

Las variantes y fragmentos de las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención generalmente codificaran fragmentos de proteína que requieren la actividad biológica de la proteína de modulación de nitrógeno de longitud completa; es decir, retiene la eficiencia de utilización de nitrógeno. Por "retiene la eficiencia de utilización de nitrógeno" se propone que la variante o fragmento tendrá por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 70%, o por lo menos aproximadamente 80% de la eficiencia de utilización de nitrógeno y/o tolerancia al estrés de la proteína de modulación de nitrógeno de longitud completa divulgada en la presente como SEQ ID NO: 2, o la secuencia de nucleótidos de modulación de nitrógeno de longitud completa divulgada en la presente como la SEQ ID NO: 1. Métodos para monitorear la eficiencia de utilización de nitrógeno incluyen detectar un cambio en cualquiera de los tamaños de acumulación metabólicos de nitrógenos principales en las rutas de asimilación (por ejemplo, un cambio medible en nitrato, nitrito, amoniaco, ácido glutámico, ácido aspártico, glutamina, asparagina, lisina, leucina, treonina, metionina, glicina, triptofano, tirosina, contenido de proteina total en una parte de planta, contenido de nitrógeno total de una parte de planta y/o contenido de clorofila) o detectar la habilidad en una planta para proporcionar el mismo o rendimiento elevado en niveles de fertilización de nitrógeno inferiores, o la habilidad de una planta para proporcionar rendimientos elevados en los mismos niveles de fertilización de nitrógeno cuando se compara con una planta que no contiene o expresa una secuencia de modulación de nitrógeno de la invención. La designación de niveles de fertilización de nitrógeno "iguales" o "inferiores" se refiere a los niveles de nitrógeno generalmente aplicados a una planta que no expresa una secuencia de modulación de nitrógeno de la invención. Los niveles de nitrógeno suficientes son conocidos en la técnica para la mayoría, si no es que todas, las variedades de planta de interés. Guía adicional se puede encontrar en, por ejemplo, Hewitt (1966) Sand and Water Culture Methods Used in the Study of Plant Nutrition, 2nd ed., Farnham Royal (Bucks) , Commonwealth Agricultural Bureaux; and, Hewitt (1975) Plant Mineral Nutrition, London, English University Press.

Las secuencias de polipéptido útiles en la primera invención se pueden alterar de varias maneras incluyendo sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Métodos para tales manipulaciones generalmente son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos de las proteínas de modulación de nitrógeno divulgadas en la presente se pueden preparar mediante mutaciones en las secuencias de nucleótidos. Esto también se puede realizar mediante uno o varias formas de mutagénesis y/o en evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente la función de la proteína. Tales variantes poseerán la eficiencia de utilización de nitrógeno deseada. Sin embargo, se entiende que la habilidad de la secuencia de modulación de nitrógeno de la invención para alterar o mejorar la utilización de nitrógeno además se puede mejorar mediante el uso de tales técnicas en las composiciones de esta invención. Por ejemplo, se pueden expresar las secuencias de nucleótidos divulgadas en la presente en células hospederas que exhiben altas velocidades de mal incorporación de base durante la replicación de DNA, tal como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA) . Después de la propagación en tales cepas, se puede aislar el DNA (por ejemplo al preparar el DNA de plásmido, o al amplificar mediante PCR y al clonar el fragmento de PCR resultante en un vector) , transfórmalo en plantas como es descrito en otra parte en la presente, y medir la eficiencia de utilización de nitrógeno.

Alternativamente, las alteraciones se pueden hacer a la secuencia de proteína de muchas proteínas en el amino o carboxi terminal sin afectar sustancialmente la actividad. Esto puede incluir inserciones, supresiones o alteraciones introducidas por los métodos moleculares modernos, tal como PCR, incluyendo amplificaciones de PCR que alteran o extienden la secuencia de codificación de proteína en virtud de la inclusión de secuencia de codificación de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación de PCR. Alternativamente, las secuencias de proteína adicionadas puede incluir secuencias de codificación de proteína completas, tales como aquellas utilizadas comúnmente en la técnica para generar fusiones de proteína. Tales proteínas de fusión son f ecuentemente utilizadas para 1) incrementar la expresión de una proteína, 2) introducir un dominio de enlace, actividad enzimática o epítope para facilitar ya sea la purificación de la proteína, detección de proteína u otros usos experimentales conocidos en la técnica o 3) dirigir la secreción o traducción de una proteína a una organela subcelular, tal como el espacio periplásmico de bacterias gram-negativas , o el retículo endoplásmico de células eucarióticas , estas últimas de las cuales frecuentemente da por resultado la glicosilación de la proteína.

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos variantes de la presente invención también abarcan secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tal como el entremezclado de DNA. Con tal procedimiento, una o más regiones de codificación de proteína de modulación de nitrógeno diferentes se pueden utilizar para crear una nueva proteína de modulación de nitrógeno que posee las propiedades deseadas. De esta manera, librerías de polinucleótidos recombinantes se generan de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprende regiones de secuencia que tiene identidad de secuencia sustancial y se pueden recombinar homólogamente in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando este procedimiento, las porciones de secuencia que codifican un dominio de interés se pueden entremezclar entre la secuencia de modulación de nitrógeno útiles en la presente invención y otras secuencias de modulación de nitrógeno conocidas para obtener una nueva secuencia que codifica para una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como la utilización de nitrógeno mejorada. Las estrategias para tal entremezclado de DNA son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri y colaboradores, (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore y colaboradores, (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang y colaboradores, (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri y colaboradores, (1998) Nature 391:288-291; y Patentes Norteamericanas Nos. 5,605,793 y 5,837,458.

Transformación de Plantas Los métodos de la invención involucran introducir una o más secuencias de nucleótidos de modulación de nitrógeno en una planta. En algunas modalidades, solamente una de las secuencias de modulación de nitrógeno divulgadas en la presente se introduce en la planta. En otras modalidades, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, o más de las secuencias son introducidas. Donde se introducen múltiples secuencias, cada una de las secuencias de nucleótidos no es idéntica. Dos secuencias de nucleótidos se consideran no idénticas si difieren en por lo menos una porción de nucleótido. Asi, las secuencias de nucleótidos no idénticas incluyen dos o más de diferentes secuencias de nucleótidos cada una que codifica la misma secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una o más se ha optimizado para la expresión en la planta) asi como dos o más diferentes secuencias de nucleótidos que codifican por lo menos dos diferentes secuencias de aminoácidos.

Por "introducción" se propone presentar a la planta uno o más constructos que comprenden la una o más secuencias de modulación de nitrógeno de tal manera que el constructo ( s ) gana acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se utilice un método particular para introducir un constructo de nucleótido sobre una planta, solamente que el constructo ( s ) de nucleótidos gane acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Métodos para introducir constructos de nucleótidos en plantas son conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transiente y métodos mediados por virus.

En general, los métodos de transformación de plantas involucran transferir DNA heterólogo en células de planta objetivo (por ejemplo embriones inmaduros o maduros, cultivos de suspensión, callo no diferenciado, protoplastos, etc.), seguido por la aplicación de un nivel de umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar -las células de plantas transformadas de un grupo de masa de células no transformadas. Las explantas son típicamente transferidas a un suministro fresco del mismo medio y cultivadas rutinariamente. Subsecuentemente, las células transformadas se diferencian en retoños después de la colocación en el medio de regeneración suplementado con un nivel de umbral máximo de agente de selección (en decir, antibióticos, tal como espectinomicina y canamicina) . Los retoños luego se transfieren a un medio de formación de raíces selectivo para recuperar el retoño o plantita enraizada. La plantita transgénica luego se cultiva en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo Hiei y colaboradores, (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida y colaboradores, (1996) A/ature Biotechnology 14:745-750) . Las explantas se transfieren típicamente a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan rutinariamente. Una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas se encuentran en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Puesto que el material transformado contiene muchas células, las células tanto transformadas como no transformadas están presentes en cualquier pieza del callo objetivo presente o tejido o grupo de células. La habilidad de exterminar células no transformadas y permitir a las células transformadas proliferar da por resultado cultivos de plantas transformados. Frecuentemente, la habilidad para remover las células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de las células de plantas transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas. Métodos moleculares y bioquímicos luego se pueden utilizar para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

La generación de plantas transgénicas se puede realizar mediante de uno de varios métodos, incluyendo pero no limitados a la introducción de DNA heterólogo mediante Agrobacterium en células de planta (transformación mediada por Agrobacterium) , bombardeo de células de planta con DNA foráneo heterólogo adherido a partículas, y otros diversos métodos de mediación directa no de partículas (por ejemplo Hiei y colaboradores, (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida y colaboradores, (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120) para transferir DNA.

Métodos para transformación de cloroplastos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Svab y colaboradores, (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método depende del suministro con pistola de partículas de DNA que contiene un marcador seleccionable y la dirección del DNA al genoma de plástida a través de la recombinación homologa. Adicionalmente , la transformación de la plástida se puede realizar mediante la transactivación de un transgén portado por plástida silencioso mediante la expresión preferida de tejido de una RNA polimerasa codificada nuclear y dirigida a la plástida. Tal sistema se ha reportado en McBride y colaboradores, (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 7301-7305.

La transformación de células bacterianas se realiza mediante una de varias técnicas conocidas en el arte, incluyendo pero no limitadas a electroporación o transformación química (ver, por ejemplo, Ausubel, ed. (1994) Current Protocole in Molecular Biology, John iley and Sons, Inc., Indianapolis , IN). Los marcadores que confieren resistencia a sustancias tóxicas son útiles en identificar células transformadas (habiendo tomado y expresado el DNA de prueba) de las células no transformadas (aquellas que no contienen o que no expresan el DNA de prueba).

En un aspecto de la invención, las secuencias de nucleótidos de la invención son útiles como marcadores para estimar la transformación de células bacterianas o de plantas. De esta manera, la transformación se estima al monitorear la eficiencia de utilización de nitrógeno como es descrito en lo anterior.

La transformación de células de plantas se puede realizar de una manera similar. Por "planta" se propone plantas completas, o partes componentes que incluyen órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células de planta, propágulos, embriones y progenie de las mismas. Las células de plantas se pueden diferenciar o no diferenciar (por ejemplo callo, células de cultivo de suspensión, protoplastos, células de hoja, células de raíz, células de floema, polen) . Las "plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "establemente transformados" se refieren a plantas que han incorporado o integrado secuencias de ácido nucleico exógenas o fragmentos de DNA en la célula de planta. Por "transformación estable" se propone que el constructo de nucleótidos introducidos en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredado por la progenie de la misma.

Las células que se han transformado se pueden cultivar en plantas de acuerdo con maneras convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores, (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas luego se pueden cultivar, y ya sea polinizar con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y el híbrido resultante que tiene la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada identificado. Dos o más generaciones se pueden cultivar para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada sea mantenida establemente y heredada y luego las semillas cosechadas para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona la semilla transformada (también referida como "semilla transgénica" ) que tiene un constructo de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, establemente incorporado en su genoma.

Métodos para incrementar el rendimiento de plantas al modular la utilización de nitrógeno Se proporcionan métodos para incrementar el rendimiento de plantas. Los métodos comprenden introducir en una planta o célula de planta una secuencia de nucleótidos de modulación de nitrógeno divulgada en la presente tal que un incremento en la eficiencia de utilización de nitrógeno corresponde a un incremento de rendimiento de la planta. Como es definido en la presente, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa, y/o rendimiento cosechable, producido por la planta. Por "biomasa" se propone cualquier producto de planta medido (por ejemplo, cualquier parte componente de una planta, tal como semilla, tallo, raíz, grano, hoja, etc.) . Un incremento de la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto de planta medido. Un incremento de rendimiento cosechable es un peso más alto de un componente de planta que fácilmente se recolecta utilizando métodos de cosecha reconocidos, o un incremento de la cantidad de composición de un compuesto de interés en la parte cosechada: un ejemplo no limitante, que es la cantidad de un aminoácido, tal como lisina, que se cosecha por unidad de área de tierra. El incremento del rendimiento de la planta o rendimiento cosechable tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el incremento de la biomasa de hoja de la planta puede incrementar el rendimiento de vegetales hojosos para el consumo humano o animal. Adicionalmente , el incremento de la biomasa de la hoja se puede utilizar para incrementar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un incremento de rendimiento puede comprender cualquier incremento estadísticamente significante que incluye, pero no limitado, por lo menos un incremento de 1%, por lo menos un incremento de 3%, por lo menos un incremento de 5%, por lo menos un incremento de 10%, por lo menos un incremento de 20%, por lo menos 30%, por lo menos 50%, por lo menos de 70%, por lo menos 100% o un incremento más grande en el rendimiento de la planta comparado con el rendimiento de una planta en la cual una secuencia de nucleótidos que modula el uso de nitrógeno de la invención no se ha introducido.

Plantas La presente invención se puede utilizar para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitado a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no están limitadas a, cereal (maíz), sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, betabel, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza de aceite de semilla, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuates, camote, mandioca, café, coco, pina, árboles cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avenas, vegetales, hierbas (tales como hierbas de césped, hierbas de forraje o hierbas de pastura), plantas ornamentales, árboles (tales como árboles frutales, árboles de nuez, árboles de pulpa, palmas de aceite) y coniferas.

Los vegetales incluyen, pero no están limitados a, cebollas, tomates, lechuga, habichuelas verdes, habas, chícharos, y miembros del género Curcumis tal como pepino, cantalupo y melón amarillo. Las plantas ornamentales incluyen, pero no están limitadas a, azalea, hidrangea, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, pastora roja y crisantemo. De preferencia, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, betabel, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza de aceite de semilla, etc.).

Esta invención es particularmente adecuada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas incluyendo, pero no limitadas a, maíz, arroz, cebada, avenas, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, pina, batatas, cebolla, aguacate, coco y dátiles.

Evaluación de la Transformación de Plantas Después de la introducción del DNA foráneo heterólogo en células de planta, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma por varios métodos tales como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado .

El análisis de PCR es un método rápido para clasificar células transformadas, tejido o retoños para la presencia de secuencias de nucleótidos incorporadas en la etapa más temprana antes del transplante en el suelo (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: ñ Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . La PCR se lleva a cabo utilizando cebadores de oligonucleótido específicos al gen de interés o el antecedente de vector de Agrobacterium, etc.

La transformación de plantas se pueden confirmar mediante el análisis de manchado de Southern del DNA genómico (Sambrook and Russell, 2001, supra) . En general, el DNA total se extrae del transformante, se digiere con enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gen de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o de nailon. La membrana o "mancha" luego se sondea con, por ejemplo, fragmentos de DNA objetivos radiomarcados con 32P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas estándares (Sambrook and Russell, 2001, supra) .

En el análisis de Northern, el RNA se aisla de tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel agarosa formaldehído, se mancha sobre un filtro de nailon de acuerdo con los procedimientos estándares que se utilizan rutinariamente en la técnica (Sambrook and Russell, 2001, supra) . La expresión de RNA codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención luego se prueba al hibridar el filtro con una sonda radioactiva derivada de un polinucleótido de la invención, por métodos conocidos en la técnica (Sambrook and Russell, 2001, supra) .

Los ensayos de manchado de Western y bioquímicos y los similares se pueden llevar a cabo en las plantas transgénicas para determinar la presencia de proteína codificada por el gen de modulación de nitrógeno mediante procedimientos estándares (Sambrook and Russell, 2001, supra) utilizando anticuerpos que enlazan a uno o más epítopes presentes sobre la proteina de modulación de nitrógeno. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales generados por los métodos de la presente invención se pueden utilizar para detectar la presencia de una proteína de modulación de nitrógeno .

Anticuerpos Los anticuerpos a los polipéptidos útiles en la presente invención, o a variantes o fragmentos de los mismos, también son abarcados. Métodos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, . Y . ; patente norteamericana No. 4,196,265) .

EXPERIMENTAL Materiales y Métodos Se generó un gen sintético que codifica una enzima NAGK (SEQ ID NO: 1) . Con el fin de localizar la proteina NAGK en el cloroplasto, un polinucleótido que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto (SEQ ID NO: 3) se adicionó a la N-terrainal de la proteina.

Caracterización Funcional de la Proteina NAGK Una cepa de supresión argB (codifica NAGK en £. coli) se construyó de DH5 alfa de E. coli utilizando el método descrito por K.A. Datsenko y B.L. Wanner (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS 97 ( 12 ): 66 0-66 5. 2001). Los cebadores de PCR descritos por Baba, y colaboradores, (T. Baba, T. Ara, M. Hasegawa, Y. Takai, Y. Okumura, M. Baba, K.A. Datsenko, M. Tomita, B.L. Wanner & H. Mori . 2006. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection Molecular Systems Biology 2:2006.0008), se utilizaron para crear una supresión en la estructura del gen argB. Los mutantes se seleccionaron sobre canamicina y el cásete de resistencia de canamicina subsecuentemente se removió mediante FLP recombinasa.

Esta cepa de supresión fue llamada DH5 alfa AargB. Un fragmento de DNA que abarca la supresión se amplificó mediante PCR y el producto de PCR se secuenció, confirmando la estructura de la supresión. Esta cepa creció normalmente en el medio rico (por ejemplo, LB, TB) pero fue incapaz de crecer en el medio mínimo M63 a menos que el medio se suplementara con arginina u ornitina, como fue esperado para una cepa que carece de una enzima NAGK funcional. Los inventores generaron un gen sintético que codifica NAGK para simplificar las etapas de clonación y mejorar la expresión de la proteína NAGK en el maíz. Adicionalmente , los inventores dirigieron la localización de la enzima NAGK al cloroplasto de planta utilizando el péptido de tránsito de cloroplasto (CTP) desde el extremo 5' del gen enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS) de las algas Chlamydomonas reinhardtii . Varios plásmidos que contienen el gen sintético, el cósmido que contiene el gen NAGK de la cepa bacteriana parental ATX16042 y un plásmido de control negativo que contiene un gen de glutamina sintetasa de maíz se transformaron en la cepa de E. coli DH5 alfa AargB. La presencia e identidad de los plásmidos se confirmó mediante la digestión de miniprep de DNA y restricción. Las cepas que contienen plásmido se colocaron en rayas sobre el medio de agar M63 y sobre M63 suplementado con ornitina o arginina. Los cultivos se incubaron a 37°C durante 2 días y se evaluó el crecimiento. Los resultados se muestran en la Tabla 1 enseguida .

Tabla 1 - Caracterización Funcional del Gen NAGK Sobreexpresion de Proteina en el Maíz El vector de transformación de planta pAX4395 se construyó para dirigir la sobreexpresion de la proteina NAGK en el maíz. El vector utiliza el promotor Scubi4 y el terminador Pinll para guiar la sobreexpresion de una proteina que comprende una guía de cloroplasto EPSPS de Chamydo onas fusionada a NAGK. Un segundo cásete en el vector guía la sobreexpresion del gen dsdAl, conduciendo a la acumulación de la proteína d-aminoácido oxidasa. Cada uno de los casetes de gen se secuenciaron completamente antes de la transformación de plantas.

Transformación de Plantas El vector pAX4395 se utilizó para llevar a cabo la transformación mediada por Agrobacterium del maíz. Después de la construcción del vector y la transformación de Agrobacterium, los vectores se confirmaron mediante el manchado de Southern por métodos conocidos en la técnica. Las cepas de Agrobacterium positivas que pasaron estas pruebas luego se cultivaron en un medio sólido para producir conteos de células para los experimentos de transformación a gran escala.

El vector pAX4395 se introdujo en una cepa de Agrobacterium tumefaciens mediante electroporacion. Esta cepa también contuvo el vector pSBl, que permite a pSBl y pAX4395 recombinarse in vivo para crear un vector que puede dirigir la inserción del cásete NAGK en el genoma del maíz. La formación del vector recombinante, pAG4395, se confirmó mediante la hibridación de manchado de Southern de esta cepa ¦ de Agrobacterium .

La cepa de Agrobacterium que alberga el cointegrado se puede utilizar para transformar plantas, por ejemplo, mediante el método Purelntro (Japan Tobacco, Inc.). Después del co-cultivo, los embriones se cultivaron en el medio de selección que contiene d-serina para identificar el callo que ha integrado el gen de dsdA del pAG4395 y expresado la proteina d-aminoácido oxidasa. Eventos individuales que sobrevivieron al crecimiento selectivo en la presencia de serina luego se movieron al medio de regeneración y se cultivaron a la etapa de plantita utilizando los métodos conocidos en la técnica.

Análisis de Manchado de Western La expresión de NAGK en estas plantas se examinó al generar anticuerpos que enlazan específicamente a la proteina NAGK. Brevemente, el gen NAGK se subclonó en el vector pRSFlb (Novagen) para permitir la sobreexpresion de la proteina NAGK en E. coli después de la inducción con IPTG. El vector también introduce una etiqueta 6xHis en la N-terminal de la proteína. Después de la sobreexpresion de la proteina, la proteina NAGK se purificó mediante la cromatografía de columna de cobalto y la identidad de la proteína purificada se confirmó mediante la secuenciación N-terminal. La proteína purificada luego se utilizó para inmunizar conejos, con la recolección del suero que comienza 42 días después de la inmunización .

Enseguida, el antisuero NAGK se utilizó para estimar la expresión de proteína en las plantas de maíz transgénicas mediante el análisis de manchado de Western. Las muestras de hoja se tomaron de plantas individuales después de 4 semanas de crecimiento en el invernadero, y los extractos de proteína se prepararon al moler el material de planta en agua. La concentración de proteína en cada extracto se determinó mediante el ensayo Bradford, y 25 ug de cada extracto se separó en geles de poliacrilamida con un gradiente de 4-12%. Las proteínas separadas se transfirieron a nitrocelulosa y luego se sondearon con el antisuero de conejo en una dilución de 1:5000. Después de las etapas- de lavado, la nitrocelulosa se puso en contacto con anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (dilución de 1:10,000) y los complejos de anticuerpo se visualizaron utilizando reactivos de detección ECL (GE Healthcare) . Cuatro eventos transgénicos representativos (#8054, 8055, 8056, 8057) cada uno que muestra fuerte expresión de la proteína en NAGK, mientras que una planta de control ("Hi-II") no mostró la presencia de la proteína. Es importante observar que el tamaño de la proteína detectada en el tejido de planta (-29 kDa) es consistente con el tamaño del NAGK después de procesamiento de la guía de cloroplasto (tamaño predicho = 29.2 kDa) antes que la guía de cloroplasto no procesada -proteína de fusión NAGK (tamaño predicho = 36.9 kDa) .

Análisis de Nitrógeno del Maíz Una serie de ensayos que cuantifican los intermediarios de nitrógeno en plantas se han desarrollado. Estos métodos de ensayo de nitrógeno se describen en una presentación de Patente previa (WO 2008/051608 "Plants with improved nitrogen utilization and stress tolerance") . Estos ensayos se utilizaron aquí para analizar un total de 10 plantas transgénicas que contienen el gen NAGK. Cada una de las plantas se muestreo (hoja) después de 4 semanas de crecimiento en el suelo en un invernadero. Estas muestras de hojas se procesaron para determinar su nitrato, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, amonio, aminoácido total, clorofila y niveles de proteina total. Incluidas al lado en el análisis estuvieron plantas que se transformaron con un constructo que contiene solamente el marcador selecciónatele dsdAl (no NAGK) . Estas plantas del mismo modo se muestrearon en 4 semanas y se refirieron como plantas "no-GOI". Los resultados de los ensayos de nitrógeno llevados a cabo en ambos tipos de plantas se muestran enseguida en la Tabla 2. t t> O Tabla 2 - Niveles de nitrógeno, evento- de maíz de NAGK vs . no-GOI , 4 semanas después de la transferencia al suelo 29 Estos datos demuestran que el gen sintético que los inventores diseñaron codifica un enzima NAGK funcional.

Construcción del vector de sobreexpresión de NAG La siguiente secuencia de DNA de NAGK (SEQ ID NO: 1) se aisló de un aislado bacteriano de Brevibacillus laterosporus : ATGCTGCATGAGGTGATGGTGATCAAGTGCGGCGGCAGCATGCTGGAGCAGCTGCCGGAG AGCTTCTACAACAAGCTGGCGACGCTGCAAGCAGAAGGAAGAAGCATCGTCATTGTTCAT GGAGGAGGGCCGGCCATCAACCAGATGCTGGAGCAGCTGAAGATTGAGCCAACCTTCTCA AATGGGCTGAGGGTGACAGATGAGCCAACAATGCAAGCTGTGGAGATGGTGCTCTCAGGG CCCATCAACAAGCTGGTGGTGAGGAAGCTGCTGCACGCCGGCGGCAAGGCATGGGGCCTC AGCGGCGTGGATGGAAGCCTGCTGCAAGCTGTTGAGAAGACTCAAGGCCTCGGCCTGGTG GGCAGCATCACCGTGGTGGATCAAGCGCCGCTCCAGCTGCTGCTGAGCAATGGCTACATC CCGGTGGTGTCTCCCATCGCCGTCTCAGAAGATGGAAGAACAAGATACAACTGCAACGCC GACACCGTCGCCGGCGCCATTGCTTCAGCTCTCGGCGCCAAGCAGCTGCTGATGCTCACT GATGTTCCTGGCATCTGGGCAGAAAATGAGCTGGGAGAGAAGCAGCTGCTGCCGACGGTG ACAACAGAAGATATTCAGCTGATGATGAAGAACCAGATCATCACCGGCGGCATGATCCCC AAGGTGCAAGCGGCGCTGGATGCTCTAGCTCAAGGAGTTCAAGAAGTGGTGATCTGCAAA GGAGAAGCTGAGACGCTGGACGGCGTGGTGAAGGGCATGGCCGTCGGCACCTCCATCTCC GCCGAGATGAGCAGAGGACAAGATTCTCAAGCCTTCATCAGCAACAAGGTGTGAGG La secuencia de DNA de NAGK mostrada ante iormente codifica la siguiente secuencia de proteina NAGK (SEQ ID NO: 2) : MLHEVMVIKC GGSMLEQLPE SFYNKLATLQ AEGRSIVIVH GGGPAINQML EQLKIEPTFS NGLRVTDEPT MQAVEMVLSG PINKLVVRKL LHAGGKAWGL SGVDGSLLQA VEKTQGLGLV GSITWDQAP LQLLLSNGYI PVVSPIAVSE DGRTRYNCNA DTVAGAIASA LGAKQLLMLT DVPGI AENE LGEKQLLPTV TTEDIQLMM NQIITGGMIP KVQAALDALA QGVQEVVICK GEAETLDGVV KGMAVGTSIS AEMSRGQDSQ AFISNKV La secuencia de DNA se clonó en el vector de expresión de E. coli pRSF-lb (Novagen, Inc.) para crear el vector pAX4389. Este vector de expresión colocó una etiqueta de ß-histidina en la N-terminal de la proteina, y coloca la expresión del gen NAGK bajo el control de promotor T7 viral. El mapa de vector para pAX4389 se muestra en la Fig. 1.

Preparación del extracto de proteina NAGK El vector de sobreexpresión pAX4389 de NAGK se transformó en células de E. coli electrocompetentes (BL21 *DE3, Invitrogen) y colonias individuales se obtuvieron mediante la selección sobre el antibiótico canamicina. Una colonia individual luego se cultivó en el medio liquido (caldo LB) hasta que la absorbencia del cultivo (a 600 nm) alcanzó 0.6, y luego IPTG 0.5 mM se adicionó para inducir la expresión del promotor T . La inducción se llevó a cabo durante la noche a 16°C. Al siguiente día, el cultivo inducido se centrifugó y la pelotilla se congeló durante dos horas a -20°C. Después de la descongelación en hielo, la pelotilla se resuspendió en 1110th volumen de solución reguladora de lisis (Hepes 50mM, pH 7.0, NaCl 50mM) , se trató con Lysozyme (Novagen) a temperatura ambiente durante 30 minutos, y luego se sónico para lisar las células. El material insoluble se separó del extracto de proteina soluble a través de centrifugación. Este extracto de proteina luego se almacenó en una cubierta con hielo, y los ensayos de enzima NAGK se prepararon en un tiempo corto después. Como un control negativo, un vector de control se preparó al lado que dirigió la sobreexpresión de una enzima EPSPS bacteriana en el mismo vector de base (pRSF-lb) . Este vector del mismo modo se transformó en la misma linea de células de E. coli y una colonia transformante se seleccionó para la sobreexpresión de proteina y un extracto de proteina se preparó al lado de NAGK.

Ensayo de enzima NAGK - Titulación con enzima NAGK El ensayo de enzima NAGK se adaptó del método de Denes (1970). La formación de producto se cuantificó utilizando un espectrofotómetro Spectramax en 540 nm.

Una mezcla maestra para la reacción in vitro de NAGK se preparó con los siguientes componentes: Tris 50 mM, pH 8.0; el pH final de la mezcla maestra fue 5.5; hidroxilamina (NH2OH) 100 mM; MgCl2 10 mM; ATP 7 mM; N-acetilglutamato (NAG) 70 mM.

Esta mezcla maestra se subdividió en cavidades individuales en una placa de 96 cavidades (200 pL/volumen final de la cavidad) y las reacciones luego se iniciaron al adicionar varias concentraciones del extracto de proteina NAGK en cavidades de muestra individuales. Después de 1 hora de incubación a 37°C, la absorbencia de cada muestra se cuantificó. La cantidad de proteina NAGK en el extracto se estimó al cargar diluciones del extracto sobre un gel de SDS-poliacrilamida al lado de concentraciones conocidas de un estándar de albúmina de suero bovino, y luego al manchar el gel con tinte de proteina Coomassie (Simply Blue, Invitrogen) .

Mediante este método, se observó que la adición del extracto de proteina NAGK en concentraciones tan bajas como 1 ng/mL generó un producto de absorbencia en 540 nm. La absorbencia resulta del producto de enzima (N-actilglutamil-5-fosfato) que reacciona con hidroxi lamina para crear el compuesto absorbente N-acetiglutamil-5-hidroxamato. La gráfica (Figura 1) y la tabla (Tabla 3) muestran la absorbencia en cada una de 6 concentraciones diferentes de proteina NAGK. La absorbencia de linea de base generada por un control de solución reguladora (A540 = 0.04) se sustrajo de cada valor de absorbencia de NAGK. La absorbancia generada por una alta concentración del extracto de control (EPSPS bacteriano) fue muy similar al control de solución reguladora (A540 = 0.042), que demuestra que la formación de producto requiere la presencia de la enzima NAGK.

Tabla 3 — Datos de absorbencia primaria para el ensayo de enzima in vitro NAGK mostrado en la Figura 1. El valor de absorbencia para el control de solución reguladora (A540 = 0.040) se ha sustraído de cada valor.

Ensayo de enzima NAGK - Titulación con sustrato (NAG) La siguiente mezcla maestra para ensayos de enzima in vitro NAGK se preparó para el propósito de titular el sustrato (NAG) en la reacción: Tris 50 mM; pH final fue 5.5; hidroxilamina (NH2OH) 100 mM; MgCl2 10 mM; ATP 7 mM; enzima NAGK 1000 ng/mL (del extracto de proteína) .

Esta mezcla maestra se subdividió en cavidades individuales en una placa de 96 cavidades (200 pL/volumen final de la cavidad) , y las reacciones luego se iniciaron al adicionar varias concentraciones del NAG de sustrato en las cavidades de muestras individuales. Las concentraciones de NAG variaron de 1.6 mM hasta 100 mM. Después de 1 hora de incubación a 37°C, se cuantificó la absorbencia de cada muestra. Una reacción de control sin sustrato se preparó y se analizó al lado.

Mediante este método, se observó que la formación del producto (mediante la enzima NAGK) fue dependiente de la concentración de sustrato. En las concentraciones de sustratos más bajas probadas (NAG = 1.6 mM, 3.1 mM) , la cantidad de producto generado fue aproximadamente proporcional a concentración de sustrato. En las concentraciones de sustrato más altas probadas (NAGK = 50 mM, 100 mM) , el sustrato estuvo en exceso y solamente ligeras diferencias en la formación de productos se observaron. Una gráfica de estos datos se muestra en la Figura 3, y los valores de absorbencia numéricos se muestran en la Tabla .

Tabla 4 — Datos de absorbencia primaria para el ensayo de enzima in vitro NAGK mostrado en la Figura 3. El valor de absorbencia para la reacción de control sin sustrato (A540 = 0.041) se ha sustraído de cada valor.

Ensayo de enzima NAGK - Titulación con arginina siguiente mezcla maestra para los ensayos enzima in vitro NAGK se preparó para el propósito de determinar el efecto de arginina sobre la actividad de la enzima NAGK: Tris 50 m el pH final fue 5.5; hidroxilamina (NH2OH) 100 mM; MgCl2 10 mM; ATP 7 mM; NAG 70 mM.

Esta mezcla maestra se subdividió en cavidades individuales en una placa de 96 cavidades (200 pL/volumen final de la cavidad) , y luego concentraciones variantes de arginina (0.15 mM a 10 mM) luego se adicionaron a las cavidades individuales. Las reacciones de enzima luego se iniciaron mediante la adición de la enzima NAGK (100 ng/mL) . Después de 30 minutos de incubación a 37°C, la absorbencia de cada muestra se cuantificó. Una reacción de control sin arginina se preparó y se analizó al lado.

Mediante este método, se observó que la formación de producto (mediante de la enzima NAGK) fue insensible a la concentración de arginina sobre el intervalo de concentraciones, probadas. Una gráfica de estos datos se muestra en la Figura 4, y los valores de absorbencia numéricos se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5 — Datos de absorbencia primaria para el ensayo de enzima in vitro NAGK mostrado en la Figura 4.

Plantas de Maíz que Contienen el Gen NAGK Producen Número Incrementado de Granos por Planta Semillas de un evento de maíz que contiene el gen NAGK (#8057) se plantaron en un sitio de - investigación al aire libre al lado de controles segregantes negativos. Un total de 5 lotes (promedio de 55 plantas por lote) se cultivaron para tanto la línea transgénica como la línea de control. Las prácticas en campo típicas se utilizaron durante el crecimiento de estas plantas, excepto que nitrógeno suplemental no se aplicó antes de la plantación. Al final de la estación de crecimiento, el rendimiento de grano total (ajustado a 15% de humedad del grano) se midió para todas las platas en cada lote. Adicionalmente, el número promedio de hileras de granos por mazorca (10 plantas por lote) y el número promedio de granos por hilera (10 plantas por lote) se registró y los datos se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Rendimiento de Grano, Hileras por Mazorca, Granos por Hilera Para el Evento de NAGK 8057.

Incrementado de Mazorcas por Planta mazorca de un evento de maíz T0 que contiene gen NAGK (#8644)> se polinizó con una línea endogámica, y las semillas TI se cosecharon. Enseguida, 4 plantas TI segregantes positivas se cultivaron bajo condiciones de invernadero hasta la madurez. El número de mazorcas que se generaron por cada una de las plantas TI se registró y los datos se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Número de Mazorcas por Planta para el Evento de NAGK descripción anterior y los dibujos comprenden modalidades ilustrativas de las presentes invenciones. Las modalidades anteriores y los métodos descritos en la presente pueden variar basados en la habilidad, experiencia y preferencia de aquellos expertos en la técnica. Solamente el listado de las etapas del método en un cierto orden no constituye cualquier limitación en el orden de las etapas del método. La descripción anterior y los dibujos solamente explican e ilustran la invención, y la invención no está limitada a los mismos. Aquellos expertos en la técnica quienes tienen la descripción ante estos, serán capaces de hacer modificaciones y variaciones en la misma sin apartarse del alcance de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS SEO ID NO: 1 ATGCTGCATGAGGTGATGGTGATCAAGTGCGGCGGCAGCATGCTGGAGCAGCTGCCGGAG AGCTTCTACAACAAGCTGGCGACGCTGCAAGCAGAAGGAAGAAGCATCGTCATTGTTCAT GGAGGAGGGCCGGCCATCAACCAGATGCTGGAGCAGCTGAAGATTGAOCCAACCTTCTCA AATGGGCTGAGGGTGACAGATGAGCCAACAATGCAAGCTGTGGAGATGGTGCTCTCAGGG CCCATCAACAAGCTGGTGGTGAGGAAGCTGCTGCACGCCGGCGGCAAGGCATGGGGCCTC AGCGGCGTGGATGGAAGCCTGCTGCAAGCTGTTGAGAAGACTCAAGGCCTCGGCCTGGTG GGCAGCATCACCGTGGTGGATCAAGCGCCGCTCCAGCTGCTGCTGAGCAATGGCTACATC CCGGTGGTGTCTCCCATCGCCGTCTCAGAAGATGGAAGAACAAGATACAACTGCAACGCC GACACCGTCGCCGGCGCCATTGCTTCAGCTCTCGGCGCCAAGCAGCTGCTGATGCTCACT GATGTTCCTGGCATCTGGGC AGAAAATGAGCTGGGAGAGAAGCAGCTGCTGCCGACGGTG ACAACAGAAGATATTCAGCTGATGATGAAGAACCAGATCATCACCGGCGGCATGATCCCC AAGGTGCAAGCGGCGCTGGATGCTCTAGCTCAAGGAGTTCAAGAAGTGGTGATCTGCAAA GGAGAAGCTGAGACGCTGGACGGCGTGGTGAAGGGCATGGCCGTCGGCACCTCCATCTCC GCCGAGATGAGCAGAGGACAAGATTCTCAAGCCTTCATCAGCAACAAGGTGTGAGG SEO ID NO: 2 MLHEVMVIKC GGSMLEQLPE SFYNKLATLQ AEGRSIVI H GGGPAINQML EQLKIEPTFS NGLRVTDEPT MQAVEMVLSG PINKLWRKL LHAGGKA GL SGVDGSLLQA VE TQGLGLV GSITWDQAP LQLLLSNGYI PVVSPIAVSE DGRTRYNCNA DTVAGAIASA LGAKQLLMLT DVPGI AENE LGEKQLLPTV TTEDIQLMMK NQI ITGGMIP KVQAALDALA QGVQEVVIC GEAETLDGW GMAVGTSIS AEMSRGQDSQ AFISNKV SEO ID NO: 3 ATGCAGCTGCTCAACCAGCGGCAGGCGCTGCGGCTGGGAAGAAGCTCCGCCAGCAAGAAC CAGCAGGTGGCGCCGCTGGCATCAAGGCCGGCAAGCAGCCTCTCCGTCTCCGCCTCCTCC GTGGCGCCGGCGCCGGCCTGCTCGGCGCCGGCCGGCGCCGGCCGCCGCGCCGTGGTGGTG CGCGCCTCCGCCACCAAGGAGAAGGTGGAGGAGCTCACCATCCAG

Claims (28)

REIVINDICACIONES

1. Una planta, célula de planta, material de planta o semilla de una planta, caracterizada porque comprende un gen NAGK insensible a arginina que es exógeno o heterologo a la planta, célula de planta, material de planta o semilla de una planta.

2. Una planta, caracterizada porque se ha regenerado de una célula de planta o semilla de conformidad con la reivindicación 1.

3. Una planta de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la planta exhibe eficiencia de uso de nitrógeno mejorada como es comparada con una planta de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones.

4. Un método para mejorar la eficiencia de utilización de nitrógeno en una planta, caracterizado porque comprende la etapa de transformar la planta con por lo menos un gen NAGK insensible a arginina.

5. Una secuencia de NAGK, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos modula el uso de nitrógeno en una planta; c) la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y, d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos modula el uso de nitrógeno en una planta.

6. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1; b) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos modula el uso de nitrógeno en una planta; c) la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y, d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos modula el uso de nitrógeno en una planta.

7. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque además comprende una secuencia de promotor de DNA 5' y una secuencia de terminador 3' , en donde la secuencia de nucleótidos, la secuencia de promotor de DNA y 'la secuencia de terminador se acoplan operativamente para permitir la transcripción de la secuencia de nucleótidos.

8. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la secuencia de promotor se selecciona del grupo que consiste de promotores de planta constitutivos y promotores específicos de tejido.

9. Un anticuerpo policlonal, caracterizado porque comprende un anticuerpo policlonal a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.

10. ,Una planta, caracte izada porque comprende una planta transformada con por lo menos una primera secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos modula el uso de nitrógeno en una planta; c) la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y, d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos modula el uso de nitrógeno en una planta.

11. Una planta de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste de cereal (maíz); sorgo; trigo; girasol; tomate; cruciferas; pimientos; papa; algodón; arroz; soja; betabel; caña de azúcar; tabaco; cebada; y colza de semilla de aceite; Brassica sp.; alfalfa; centeno; mijo; cártamo; cacahuates; camote; mandioca; café; coco; piña; cacao; té; plátano; aguacate; higo; guayaba; mango; olivo; papaya; anacardo; macadamia; almendra; avenas; vegetales; hierbas; vegetales, que incluyen pero no limitados a cebollas, tomates, lechuga, habichuelas verdes, habas, chícharos, y miembros del género Curcumís tal como pepino, cantalupo y melón amarillo; plantas ornamentales, que incluyen, pero no limitadas a, azalea, hidrangea, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, pastora roja y crisantemo; árboles de pulpa; palma de aceite; y coniferas.

12. Una parte componente de una planta de la reivindicación 11.

13. Una semilla de planta, caracterizada porque se produce de una planta de la reivindicación 11.

14. Una semilla de planta, caracterizada porque se transforma con un vector de la reivindicación 6.

15. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende una célula hospedera transformada con por lo menos una primera secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1; b) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos modula el uso de nitrógeno en una planta; c) la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y, d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos modula el uso de nitrógeno en una planta.

16. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la célula hospedera además comprende por lo menos una segunda secuencia de nucleótidos seleccionada de (a) , (b) , (c) o (d) , en donde la primera y la segunda secuencia de nucleótidos no son idénticas .

17. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la célula hospedera se selecciona del grupo que consiste de células bacterianas y células de plantas.

18. Un constructo de vector, caracterizado porque comprende : a) por lo menos una primera secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: i) la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 ; ii) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos modula el uso de nitrógeno en una planta; iii) la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ; Yr iv) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos modula el uso de nitrógeno en una planta; b) una secuencia de promotor de DNA 5' ; y, c) una secuencia de terminador 3' , en donde la secuencia de nucleótidos, la secuencia de promotor de DNA, y la secuencia de terminador se acoplan operativamente para permitir la transcripción de la secuencia de nucleótidos.

19. Un constructo de vector de conformidad con la. reivindicación 18, caracterizado porque demás comprende por lo menos una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de (a) (i), (a) (ii), (a) (iii) o (a) (iv), en donde las secuencias de aminoácidos codificadas por la primera y la segunda secuencia de nucleótidos no son idénticas.

20. Un método para expresar una molécula de ácido nucleico que modula el nitrógeno en una planta, el método' caracterizado porque comprende las etapas de proporcionar una planta transgénica o semilla de planta transformada con un constructo de vector de conformidad con la reivindicación 1, y cultivar la planta transgénica o una planta cultivada de la semilla de planta transgénica bajo condiciones efectivas para expresar la molécula de ácido nucleico en la planta transgénica o la planta cultivada de la semilla de planta transgénica .

21. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la expresión de la molécula de ácido nucleico es efectiva en mitigar una limitación tal que el rendimiento se incrementa en la planta transgénica o la planta cultivada de la semilla de planta transgénica.

22. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la expresión de la molécula de ácido nucleico es efectiva en incrementar la eficiencia de utilización de nitrógeno de la planta transgénica o la planta cultivada de la semilla de planta transgénica.

23. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste de cereal (maíz); sorgo; trigo; girasol; tomate; cruciferas; pimientos; papa; algodón; arroz; soja; betabel; caña de azúcar; tabaco; cebada; y colza de semilla de aceite; Brassica sp.; alfalfa; centeno; mijo; cártamo; cacahuates; camote; mandioca; café; coco; piña; cacao; té; plátano; aguacate; higo; guayaba; mango; olivo; papaya; anacardo; macadamia; almendra; avenas; vegetales; hierbas; vegetales, que incluyen pero no limitados a, cebollas, tomates, lechuga, habichuelas verdes, habas, chícharos, y miembros del género Curcumis tal como pepino, cantalupo y melón amarillo; plantas ornamentales, que incluyen, pero no limitadas a, azalea, hidrangea, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, pastora roja y crisantemo; árboles de pulpa; palma de aceite; y coniferas.

24. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la expresión de la molécula de ácido nucleico es efectiva en mejorar la tolerancia al estrés de la planta transgénica o la planta cultivada de la semilla de planta transgénica.

25. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la expresión de la molécula de ácido nucleico es efectiva en alterar la morfología de la planta transgénica o la planta cultivada de la semilla de planta transgénica .

26. Una planta de maíz transgénica, caracte izada porque comprende una planta de maíz de partida transformada con un gen NAGK que mejora la eficiencia de utilización de nitrógeno en el maíz, en donde la planta de maíz transformada tiene un número de granos incrementado sobre la planta de maíz de partida.

27. Una planta de maíz transgénica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el número de granos incrementado es el resultado de ya sea un número promedio incrementado de granos por mazorca o un número promedio incrementado de mazorcas por planta o ambos.

28. Un método para mejorar el número de granos de una planta de maíz, caracterizado porque comprende las etapas de introducir en el genoma de la planta un gen NAGK que mejora la eficiencia de utilización de nitrógeno y cultivar la planta transformada para producir grano.