BR112012010520A2 - planta, célula de planta, material de planta ou semente de planta, método para melhorar a eficiência de utilização de nitrogênio em uma planta, sequência de nagk, vetor de expressão, anticorpo policlonal, parte, célula hospedeira, construto de vetor, método para expressar uma molécula de ácido nucleico, e, método para melhorar o número de grãos em uma planta de milho - Google Patents

Abstract

PLANTA, CÉLULA DE PLANTA, MATERIAL DE PLANTA OU SEMENTE DE PLANTA, MÉTO-DO PARA MELHORAR A EFICIÊNCIA DE UTILIZAÇÃO DE NITROGÊNIO EM UMA PLANTA, SEQUÊNCIA DE NAGK, VETOR DE EXPRESSÃO, ANTICORPO POLICLONAL, PARTE, CÉ-LULA HOSPEDEIRA, CONSTRUTO DE VETOR, MÉTODO PARA EXPRESSAR UMA MOLÉ-CULA DE ÁCIDO NUCLEICO, E, MÉTODO PARA MELHORAR O NÚMERO DE GRÃOS EM UMA PLANTA DE MILHO A presente invenção diz respeito a plantas transgênicas que apresentam eficiência de uso do nitrogênio melhorada, tolerância estresse e/ou que aliviam uma limitação, de maneira tal que o rendimento seja aumentado, ou uma combinação destes, e que foram transformadas usando um construto de vetor inédito, incluindo um gene sintético de N-acetil glutamato quinase (NAGK) que modula o uso do nitrogênio em plantas. A invenção também inclui a superex-pressão a caracterização enzimática de uma NAGK insensível à arginina, isolada de uma cepa bacteriana que melhora a tolerância ao estresse e absorção de nitrogênio, metabolismo ou ambos. Em várias modalidades, o construto de vetor inclui uma ou mais sequências de ácidos nucleicos, incluindo SEQ ID NO: 1. A invenção também diz respeito a vetores isolados para transformar plantas e a anticorpos usados para detectar plantas transformadas. A invenção também diz respeito aos métodos de expressar em plantas as moléculas de ácido nucleico correspondente às sequências de ácidos nucleicos que modulam o uso do nitrogênio em plan-tas, ou são moduladas pelas condições de nitrogênio.

Description

“PLANTA, CÉLULA DE PLANTA, MATERIAL DE PLANTA OU SEMENTE DE PLANTA, MÉTODO PARA MELHORAR A EFICIÊNCIA DE UTILIZAÇÃO DE NITROGÊNIO EM UMA PLANTA, SEQUÊNCIA DE NAGK, VETOR DE EXPRESSÃO, ANTICORPO POLICLONAL, 5 PARTE, CÉLULA HOSPEDEIRA, CONSTRUTO DE VETOR, MÉTODO PARA EXPRESSAR UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, E,

MÉTODO PARA MELHORAR O NÚMERO DE GRÃOS EM UMA PLANTA DE MILHO”

CAMPO DA INVENÇÃO Este pedido reivindica a prioridade do pedido de patente dos Estados Unidos número de série 61/258.075, depositado em 4 de novembro de 2009. A invenção diz respeito em geral às plantas com utilização de nitrogênio e tolerância ao estresse melhoradas, mais especificamente, à expressão heteróloga de uma enzima N-acetil glutamato quinase (NAGK) insensível à arginina, incluindo a superexpressão e caracterização enzimática de uma NAGK insensível à arginina, isolada de uma cepa bacteriana que melhora a tolerância ao estresse e absorção de nitrogênio, metabolismo ou ambos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO As plantas exigem nitrogênio durante suas fases de crescimento vegetativas e reprodutivas. O nitrogênio se torna disponível para a planta por meio da mineralização do solo, da aplicação de fertilizante com nitrogênio, ou ambos. Estima-se, entretanto, que entre 50 e 70 por cento de nitrogênio aplicado às culturas agrícolas é perdido do sistema planta-solo [Peoples, M.B. et al., “Minimizing Gaseous Losses of Nitrogen,” Em Nitrogen Fertilizer in the Environment (Bacon, P.E., ed.) Marcel Dekker, pp. 565-606 (1995)]. O nitrogênio é um dos nutrientes de planta mais caros, o fertilizante nitrogenado nem sempre está disponível em um custo razoável, e a aplicação excessiva de fertilizante nitrogenado pode resultar em desafios ambientais. O milho é um exemplo de uma planta agronomicamente importante que exige frequentemente fertilizantes nitrogenados para realizar seu potencial genético. 5 Em células de planta, a NAGK (N-Acetil Glutamato Quinase) realiza a segunda etapa em uma via biossintética que leva à produção de arginina. De maneira importante, sabe-se que várias enzimas NAGK de planta e bacterianas são inibidas por altas concentrações de arginina (Bourrellier, 2009; Llacer, 2008; Lohmeier-Vogel, 2005; Fernandez-Murga, 2004), o que sugere que NAGK exibe um papel na regulação de arginina em plantas. Adicionalmente, demonstra-se que a proteína de planta P-II pode atenuar a inibição a base da arginina de NAGK. Sabe-se que P-II desempenha um papel chave na regulação do fluxo de carbono e nitrogênio em plantas (Bourrellier, 2009; Llacer, 2008). Uma estratégia para suprarregular a via biossintética da arginina em plantas é reduzir ou eliminar a inibição de NAGK por arginina. Isto pode ser atingido pela expressão heteróloga de uma enzima NAGK insensível à arginina em plantas. Aqui, descreve-se a superexpressão e caracterização enzimática de uma NAGK insensível à arginina isolada de uma cepa bacteriana.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito às plantas transgênicas que apresentam eficiência melhorada de uso do nitrogênio, tolerância ao estresse, ou ambos, que foram transformadas usando um construto de vetor inédito, incluindo uma sequência de ácidos nucleicos de NAGK insensível à arginina que modula o uso do nitrogênio em plantas. Uma variedade de sequências de ácidos nucleicos de NAGK foi identificada em uma biblioteca de cepas bacterianas, algumas das quais eram gene inéditos de NAGK. Um método alternativo de identificar genes de NAGK para uso na presente invenção são os vários projetos de sequenciamento genômico de bactérias e plantas, que foram arquivados em bases de dados públicas, a partir dos quais as sequências que codificam as enzimas NAGK com muita atividade podem ser selecionadas.

A invenção também diz respeito aos vetores isolados para 5 transformar plantas e aos anticorpos para detectar expressão da sequência de nucleotídeos de interesse nas plantas transformadas.

A invenção também diz respeito aos métodos de expressar em plantas as moléculas de ácido nucleico correspondentes às sequências de ácidos nucleicos que modulam o uso do nitrogênio em plantas.

Especificamente, os vetores para transformar plantas e células bacterianas foram construídos usando a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1, bem como variantes, fragmentos e complementos destes.

Estes vetores incluem uma sequência promotora de DNA 5’ e uma sequência terminadora 3’, em que a sequência de ácidos nucleicos, a sequência promotora de DNA, e a sequência terminadora são acopladas operativamente para transmitir a transcrição da sequência de nucleotídeos.

Em algumas modalidades, a sequência promotora pode ser um promotor de planta constitutivo ou um promotor específico tecidual.

A invenção também inclui anticorpos policlonais, compreendendo anticorpos policlonais em um polipeptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1. A invenção também inclui plantas transformadas com uma sequência de nucleotídeos selecionadas de SEQ ID NO: 1, bem como variantes e fragmentos destas.

A planta é selecionada do grupo que consiste em milho (grão de milho), sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana de açúcar, tabaco, cevada e colza, Brassica sp., alfafa, centeio, milheto, cártamo, amendoins, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, plantas cítricas, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, oliva, mamão papaia, caju, macadâmia, amêndoa, aveias,

vegetais, gramíneas (tais como gramado, gramíneas forrageiras ou gramíneas de pastagem), plantas ornamentais, árvores (tais como árvores de fruta, árvores de nozes, árvores de oleaginosas, palmeiras) e coníferas.

A invenção também inclui uma parte do componente de tais plantas, semente de planta 5 produzida a partir de tais plantas, e uma semente de planta transformada por um construto de vetor da presente invenção.

A invenção também inclui uma célula hospedeira transformada por uma sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1. A célula hospedeira pode ser uma célula bacteriana ou uma célula de planta.

A invenção também inclui um método para expressar uma molécula de ácido nucleico que modula nitrogênio em uma planta, o dito método compreendendo as etapas de fornecer uma planta transgênica ou semente de planta transformada por um construto de vetor de acordo com a presente invenção, e desenvolver a planta transgênica, ou uma planta desenvolvida a partir da semente de planta transgênica, em condições eficientes para expressar a molécula de ácido nucleico na dita planta transgênica, ou na dita planta desenvolvida a partir da semente de planta transgênica.

O desenvolvimento da planta transgênica é eficiente em aumentar a absorção de nitrogênio na dita planta transgênica ou na dita planta desenvolvida a partir da semente de planta transgênica, e/ou em aumentar a eficiência da utilização de nitrogênio na dita planta transgênica ou na dita planta desenvolvida a partir da semente de planta transgênica, e/ou aliviar uma limitação de maneira tal que o rendimento seja aumentado na dita planta transgênica ou na dita planta desenvolvida a partir da semente de planta transgênica.

A invenção também inclui os métodos anteriores, em que uma planta transgênica é fornecida ou uma semente transgênica é fornecida.

A invenção também inclui o método anterior, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em milho (grão de milho), sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana de açúcar,

tabaco, cevada, e colza, Brassica sp., alfafa, centeio, milheto, cártamo, amendoins, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, plantas cítricas, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, oliva, mamão papaia, caju, macadâmia, amêndoa, aveias, vegetais, gramíneas (tal como gramado, 5 gramíneas forrageiras, ou gramíneas de pastagem), plantas ornamentais, árvores (tais como árvores de fruta, árvores de nozes, árvores de oleaginosas, palmeiras) e coníferas.

A invenção também inclui um método para melhorar a tolerância ao estresse de uma planta expressando uma molécula de ácido nucleico modulada por nitrogênio em uma planta, o dito método compreendendo as etapas de fornecer uma planta transgênica ou semente de planta transformada por um construto de vetor de acordo com a presente invenção, e desenvolver a planta transgênica, ou uma planta desenvolvida a partir da semente de planta transgênica, em condições eficientes para expressar a molécula de ácido nucleico na dita planta transgênica ou na dita planta desenvolvida a partir da semente de planta transgênica.

A invenção também inclui um método de alterar a morfologia de uma planta expressando uma molécula de ácido nucleico modulada por nitrogênio em uma planta, o dito método compreendendo as etapas de fornecer uma planta transgênica ou semente de planta transformada por um construto de vetor de acordo com a presente invenção e desenvolver a planta transgênica, ou uma planta desenvolvida a partir da semente de planta transgênica, em condições eficientes para expressar a molécula de ácido nucleico na dita planta transgênica ou na dita planta desenvolvida a partir da semente de planta transgênica.

A invenção também inclui um construto de vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de NAGK SEQ ID NO: 2, uma sequência promotora de DNA 5’, e uma sequência terminadora 3’, em que a sequência de nucleotídeos, a sequência promotora de DNA, e a sequência terminadora são acopladas operativamente para transmitir a transcrição da sequência de nucleotídeos. A invenção também inclui um construto de vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeos que modula nitrogênio em 5 uma planta, em que a dita sequência de nucleotídeos é de SEQ ID NO: 1; uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, em que a dita sequência de nucleotídeos modula o nitrogênio em uma planta; uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de NAGK SEQ ID NO: 2; e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a dita sequência de nucleotídeos modula o nitrogênio em uma planta, em que o dito construto compreende adicionalmente uma sequência promotora de DNA 5’ e uma sequência terminadora 3’, em que a sequência de nucleotídeos, a sequência promotora de DNA, e a sequência terminadora são acopladas operativamente para transmitir a transcrição da sequência de nucleotídeos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 é um mapa de vetor para pAX4389. A figura 2 é um gráfico de um ensaio enzimático de NAGK in vitro; titulação com enzima. A adição da enzima NAGK ao substrato (NAG) leva à formação de produto de uma maneira dependente de enzima. A figura 3 é um gráfico de um ensaio enzimático de NAGK in vitro; titulação com substrato. A adição da enzima NAGK em concentrações variadas de substrato (NAG) leva à formação de produto de uma maneira dependente de substrato. A figura 4 é um gráfico de um ensaio enzimático de NAGK in vitro; titulação com arginina. A formação do produto pela enzima NAGK foi insensível à presença de arginina acima das faixas de concentrações testadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS O desenvolvimento de variedades de planta que usam o nitrogênio mais eficientemente reduzirá a necessidade de entradas excessivas de nitrogênio, custos de produção segura para os produtores, benefício para os 5 produtores em países em desenvolvimento que não têm acesso aos insumos dos fertilizantes, e redução da contaminação ambiental associada com a aplicação de fertilizantes nitrogenados excessivos.

Uma abordagem que foi usada no desenvolvimento de variedades de planta com utilização de nitrogênio melhorada depende de técnicas de cultivo de planta convencionais.

Entretanto, tais abordagens apresentaram sucesso variável em virtude da falta de especificação na recombinação genética.

Existe uma necessidade de desenvolver cultivares de planta que absorvem e usam nitrogênio mais eficientemente.

Os cientistas pesquisadores de planta adotaram o termo abreviado eficiência de uso do nitrogênio (NUE), e uma variedade de métodos de medir e avaliar NUE foi desenvolvido [Craswell, E.T. e Godwin, D.C. (1984) O efficiency of nitrogen fertilizers applied to cereals grown in different climates.

Em Advances em Plant Nutrition (Vol. 1) (Tinker, P.B. e Lauchli, A., eds), pp. 1-55, Praeger Publishers; Steenbjerg, F. e Jakobsen, S.T. (1963) Plant nutrition and yield curves.

Solo Sci. 95, 69-90; Siddiqi, M.Y. and Glass, D.M. (1981) Utilization index: a modified approach to the estimation and comparison of nutrient utilization efficiency in plants.

J.

Planta Nutr. 4, 289-302; Moll, R.H. et al. (1982) Analysis and interpretation of factors which contribute to efficiency of the nitrogen utilization.

Apron.

J. 74, 562-564]. Existem diferenças nas definições específicas e no contexto da utilização.

Por exemplo, algumas definições baseiam-se em biomassa total, enquanto outras baseiam-se no peso do grão produzido.

Um outro conjunto de definições usa a eficiência de extrair nitrogênio do solo.

A eficiência com a qual o nitrogênio aplicado é usado para melhorar o rendimento do grão pode ser medido por eficiência agronômica (AE), o produto de eficiência fisiológica e eficiência de utilização, ou NUEg que é o produto de eficiência de absorção e eficiência de utilização.

Outras definições levam os fatores fisiológicos em consideração.

Da maneira usada nesta especificação, o termo eficiência de 5 uso do nitrogênio, ou NUE, é definido para incluir uma mudança mensurável em qualquer dos principais agrupamentos metabólicos de nitrogênio calculado nas vias de assimilação (por exemplo, pode incluir uma mudança mensurável em um ou mais dos seguintes: nitrato, nitrito, amônia, ácido glutâmico, ácido aspártico, glutamina, asparagina, lisina, leucina, treonina, metionina, glicina, triptofano, tirosina, teor de proteína total de uma parte da planta, teor de nitrogênio total de uma parte da planta, e/ou teor de clorofila), ou onde observa-se que a planta fornece a mesma ou mais biomassa, ou rendimento coletável em níveis de fertilização de nitrogênio menores, ou onde observa-se que a planta fornece biomassa elevada ou rendimentos coletáveis nos mesmos níveis de fertilização com nitrogênio, quando comparada com uma planta que não foi transformada com um construto de ácido nucleico que modula nitrogênio da invenção.

Uma “mudança mensurável” pode incluir um aumento ou uma diminuição na quantidade de qualquer componente (“agrupamento metabólico”) da via de assimilação de nitrogênio.

Uma mudança pode incluir tanto uma diminuição quanto um aumento em um ou mais agrupamentos metabólicos na via, ou uma diminuição em um ou mais agrupamentos com um aumento concomitante em um ou mais outro(s) agrupamento(s), tal como quando um intermediário na via de assimilação de nitrogênio está sendo utilizado com o propósito de gerar um outro intermediário ou produto da via.

Por exemplo, na conversão de glutamato em glutamina, o nível de glutamato pode diminuir enquanto o nível de glutamina pode aumentar.

Assim, embora não esteja ligado a nenhuma teoria ou mecanismo particular, qualquer mudança em um ou mais destes agrupamentos indica que o nitrogênio está sendo utilizado mais eficientemente pela planta.

Um aumento na eficiência de utilização de nitrogênio pode estar associado com cerca de um 5 %, cerca de 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, cerca de 200 % 5 ou mais de uma mudança mensurável em qualquer dos principais agrupamentos metabólicos de nitrogênio calculados na via de assimilação.

Em uma modalidade, as plantas transgênicas da invenção apresentam uma absorção de nitrogênio aumentada do ambiente quando comparadas a uma planta que não contém uma sequência que modula nitrogênio da invenção.

Pretende-se que a “sequência que modula nitrogênio” signifique um nucleotídeo ou sequência de aminoácidos que modula NUE, a título de exemplo não limitante: tanto gerando uma enzima que impacta NUE quanto gerando uma proteína que interage com os componentes envolvidos em NUE, ou gerando uma proteína que impacta a cascata de sinal homeostático interno que regula NUE, ou por uma combinação destes mecanismos.

A presente invenção fornece adicionalmente um método para melhorar tolerância ao estresse em uma planta expressando uma ou mais sequências de nucleotídeos que modulam o nitrogênio na planta.

Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que modula nitrogênio é SEQ ID NO: 1, ou variantes e fragmentos desta.

Em uma outra modalidade, a sequência de nucleotídeos que modula nitrogênio é uma sequência de nucleotídeos que codifica SEQ ID NO: 2, ou variantes e fragmentos desta.

Da maneira aqui usada, o termo “estresse” ou “condição de estresse” refere-se à exposição de uma planta, célula de planta, ou similar, a um agente físico, ambiental, biológico ou químico ou condição que apresenta um efeito adverso no metabolismo, crescimento, desenvolvimento, propagação e/ou sobrevivência da planta (coletivamente “crescimento”). Um estresse pode ser imposto em uma planta em virtude de, por exemplo, um fator ambiental tal como água (por exemplo, inundação, aridez, desidratação),

condições anaeróbicas (por exemplo, um baixo nível de oxigênio), condições osmóticas anormais, salinidade ou temperatura (por exemplo, quente/calor, frio, congelamento, geada), um deficiência de nutrientes tais como nitrogênio, fosfato, potássio, enxofre, micronutriente, ou exposição a poluentes, ou por 5 um hormônio, segundo mensageiro ou outra molécula.

O estresse anaeróbico, por exemplo, é em virtude de uma redução nos níveis de oxigênio (hipóxia ou anóxia) suficientes para produzir uma resposta ao estresse.

Um estresse por inundação pode ser em virtude da imersão prolongada ou transiente de uma planta, parte da planta, tecido ou célula isolada, em um meio líquido tal como ocorre durante monção, estação úmida, inundação rápida ou irrigação excessiva de plantas, ou similares.

Um estresse pelo frio ou estresse pelo calor pode ocorrer em virtude de uma diminuição ou aumento, respectivamente, na temperatura a partir de uma faixa ideal de temperaturas de crescimento para uma espécie de planta particular.

Tais faixas de temperaturas de crescimento ideais são facilmente determinadas ou conhecidas pelos versados na técnica.

O estresse por desidratação pode ser incluído pela perda de água, turgor reduzido, ou teor reduzido de água de uma célula, tecido, órgão ou planta completa.

O estresse por aridez pode ser induzido ou associado com a falta de água ou suprimento reduzido de água em uma célula, tecido, órgão ou organismo.

O estresse salino (estresse por sal) pode estar associado ou ser induzido por uma perturbação no potencial osmótico do ambiente intracelular ou extracelular de uma célula.

O estresse osmótico também pode estar associado ou ser induzido por uma mudança, por exemplo, na concentração de moléculas no ambiente intracelular ou extracelular de uma célula de planta, particularmente onde as moléculas não podem estar posicionadas através da membrana da célula de planta.

Uma melhoria na tolerância ao estresse pode ser avaliada por qualquer medida quantitativa ou qualitativa do desempenho de planta em uma dada condição de estresse, e está relacionada com o desempenho de uma planta crescida nas mesmas condições de estresse que não foi transformada com uma sequência que modula o nitrogênio da invenção.

Assim, as plantas podem exibir teores de nitrogênio melhorados, composições alteradas de aminoácido ou proteína, composições alteradas de carboidrato, composições 5 alteradas de óleo, características de crescimento vigoroso, rendimentos vegetativos melhorados ou melhores rendimentos e qualidades de semente.

Estas plantas podem ser identificadas examinando qualquer dos parâmetros a seguir: 1) a taxa de crescimento, medida em termos de taxa de aumento no peso fresco ou seco; 2) rendimento vegetativo da planta madura, em termos de peso fresco ou seco; 3) o rendimento da semente ou fruta; 4) o peso da semente ou fruta; 5) o teor de nitrogênio total da planta; 6) o teor de nitrogênio total da fruta ou semente; 7) o teor de aminoácido livre da planta; 8) o teor de aminoácido livre da fruta ou semente; 9) o teor de proteína total da planta; 10) o teor de proteína total da fruta ou semente; 11) mudança mensurável em carboidratos ou óleos.

Os procedimentos e métodos para examinar estes parâmetros são bem conhecidos pelos versados na técnica.

Estes métodos podem envolver ensaios enzimáticos e imunoensaios para medir os níveis de enzima/proteína; ensaios para medir a composição de aminoácido, agrupamento de aminoácido livre ou teor de nitrogênio total de vários tecidos de planta; medições de taxas de crescimento em termos de ganhos de peso fresco com relação ao tempo; ou medição do rendimento de planta em termos de peso seco total e/ou peso total da semente.

Transformação de células bacterianas ou de planta São aqui fornecidas sequências inéditas de nucleotídeos que modulam a eficiência de utilização de nitrogênio em plantas.

São também fornecidas sequências de aminoácidos das proteínas da invenção, que podem ser moduladas por ou moduladas pela concentração de nitrogênio.

As sequências de nucleotídeos que modulam o nitrogênio da invenção podem ser modificadas para obter ou intensificar a expressão em células de planta.

As sequências que modulam o nitrogênio da invenção podem ser fornecidas em cassetes de expressão para a expressão na planta de interesse. “O cassete de expressão em planta” inclui construtos de DNA que são capazes de resultar na expressão de uma proteína a partir de um quadro 5 aberto de leitura em uma célula de planta.

O cassete incluirá na direção de transcrição 5'-3' uma região de iniciação transcricional (isto é, promotora) operavelmente ligada a uma sequência de DNA da invenção, e uma região transcricional e translacional (isto é, região de terminação) funcionais em plantas.

O cassete pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser co-transformado no organismo, tal como um gene de marcador selecionável ou um gene empilhado de função diferente.

Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode(m) ser fornecido(s) em múltiplos cassetes de expressão.

Um cassete de expressão como este é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para a inserção da sequência moduladora de nitrogênio para estar na regulação transcricionais das regiões regulatórias.

Pretende-se que “promotora” seja uma sequência de ácidos nucleicos que funcione para direcionar a transcrição de uma sequência codificante a jusante.

As sequências promotoras, junto com outras sequências transcricionais e translacionais de ácidos nucleicos (também denominadas como “sequências controle”), são necessárias para a expressão de uma sequência de DNA de interesse.

Preferivelmente, o promotor é aquele que é conhecido por estimular a transcrição no organismo em que a sequência de nucleotídeos da invenção está sendo introduzida.

O promotor pode ser natural ou análogo, ou estrangeiro ou heterólogo, à planta hospedeira e/ou à sequência de DNA da invenção.

Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética.

Onde o promotor é “natural” ou “homólogo” à planta hospedeira, pretende-se que o promotor seja encontrado na planta natural na qual o promotor é introduzido.

Onde o promotor é

“estrangeiro” ou “heterólogo” à sequência de DNA da invenção, pretende-se que o promotor não seja natural ou promotor de ocorrência natural para a sequência de DNA operavelmente ligada da invenção. “Heterólogo” refere-se em geral às sequências de ácidos nucleicos que não são endógenas à célula ou 5 parte do genoma natural no qual estão presentes, e foram adicionadas na célula por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojeção, ou similares. Pretende-se que “operavelmente ligado” seja uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA que corresponde à segunda sequência. Em geral, “operavelmente ligada” significa que as sequências de ácidos nucleicos que são ligadas são contíguas, incluindo éxons e íntrons e, onde necessário, unem duas regiões codificantes de proteína, contíguas e no mesmo quadro de leitura. Em uma modalidade, o promotor é um promotor constitutivo. Os promotores constitutivos adequados para uso em plantas incluem: os promotores de vírus de planta, tal como o promotor de caulimovírus da mancha clorótica do amendoim (PC1SV) (patente U.S. 5.850.019); o promotor 35S do vírus do mosaico da couve flor (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); promotores de genes de metiltransferase o vírus Chlorella (patente U.S. 5.563.328) e o promotor de transcrito de tamanho completo do vírus do mosaico da escrofulária (FMV) (patente U.S.

5.378.619); os promotores de genes tal como actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689), incluindo o promotor TrpPro5 (pedido de patente U.S. 10/377,318; depositado em 16 de março de 2005); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); H3 histona de milho (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 e Atanassova et al. (1992) Plant J. 2(3):291-300); ALS3 de Brassica napus (pedido PCT WO

97/41228); e promotores de vários genes de Agrobacterium (ver patentes U.S.

4.771.002, 5.102.796, 5.182.200 e 5.428.147). Em uma outra modalidade, o promotor é um promotor específico de tecido. Uma lista de promotores específicos de tecido 5 comumente usados pode ser encontrada na revisão em Moore et al. (2006) Plant J. 45(4):651-683, que é aqui incorporada pela referência na sua íntegra. Frequentemente, tais construtos também conterão regiões 5' e 3' não traduzidas. Tais construtos podem conter uma “sequência sinal” ou “sequência principal” para facilitar o transporte co-translacional ou pós- translacional do peptídeo de interesse em certas estruturas intracelulares, tais como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático, ou complexo de Golgi, ou para ser secretado. Por exemplo, o gene pode ser engenheirado para conter um peptídeo sinal pata facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Pretende-se que a “sequência de sinal” seja uma sequência que é conhecida ou suspeita de resultar no transporte co-translacional ou pós-translacional através da membrana da célula. Em eucariotos, isto envolve tipicamente a secreção no complexo de Golgi, com alguma glicosilação resultante. Pretende-se que a “sequência principal” seja qualquer sequência que, quando traduzida, resulte em uma sequência de aminoácidos suficiente para ativar o transporte co-translacional da cadeia de peptídeo em uma organela sub-celular. Assim, isto inclui sequências principais que alvejam o transporte e/ou glicosilação por passagem no retículo endoplasmático, passagem nos vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndria e similares. Pode ser preferível também engenheirar o cassete de expressão na planta para conter um íntron, de maneira tal que o processamento de RNAm do íntron seja exigido para a expressão. Pretende-se que “região 3' não traduzida” seja uma sequência de nucleotídeos localizada a jusante de uma sequência codificante. As sequências de sinal de poliadenilação e outras sequências que codificam os sinais regulatórios capazes de realizar a adição de traços de ácido poliadenílico na extremidade 3' do precursor de RNAm são as regiões 3' não traduzidas.

Pretende-se que “região 5' não traduzida” seja uma sequência de nucleotídeos localizada a montante de uma sequência codificante. 5 Outros elementos não traduzidos a montante e a jusante incluem os intensificadores.

Os intensificadores são as sequências de nucleotídeos que agem para aumentar a expressão de uma região promotora.

Os intensificadores são bem conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitação, a região intensificadora SV40 e o elemento intensificador 35S.

A região de terminação pode ser natural com a região de iniciação de transcrição, pode ser natural com a sequência moduladora de nitrogênio da presente invenção, ou pode ser derivada de uma outra fonte.

As regiões de terminação convenientes são disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase, ou a sequência do inibidor de proteinase II de batata (PinII) da maneira descrita em Liu et al. (2004) Acta Biochim Biophys Sin 36(8):553-558. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol.

Gen.

Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic acid Res. 15:9627-9639. Onde apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser timizado(s) para expressão aumentada na célula hospedeira transformada.

Isto é, os genes podem ser sintetizados usando os códons preferidos pela célula hospedeira para expressão melhorada, ou podem ser sintetizados usando códons em uma frequência de uso de códon preferido pelo hospedeiro.

Em geral, o teor de GC do gene será aumentado.

Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão de uso de códon preferido pelo hospedeiro.

Os métodos são conhecidos na técnica para sinterizar genes preferidos pelo hospedeiro. Ver, por exemplo, patentes U.S. 6.320.100;

6.075.185; 5.380.831 e 5.436.391, pedidos publicados U.S. 20040005600 e 20010003849, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, aqui incorporados pela referência. 5 Em uma modalidade, os ácidos nucleicos de interesse são alvejados no cloroplasto para a expressão. Desta maneira, onde o ácido nucleico de interesse não estiver diretamente inserido no cloroplasto, o cassete de expressão conterá adicionalmente um ácido nucleico que codifica um peptídeo trânsito para direcionar o produto de gene de interesse para os cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Os ácidos nucleicos de interesse a serem alvejados no cloroplasto podem ser otimizados para a expressão no cloroplasto, levando em consideração as diferenças no uso do códon entre o núcleo da planta e esta organela. Desta maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usando códons preferidos pelo cloroplasto. Ver, por exemplo, patente U.S. 5.380.831, aqui incorporada pela referência. Tipicamente, este “cassete de expressão em planta” será inserido em um “vetor de transformação de planta”. Pretende-se que o “vetor de transformação” seja uma molécula de DNA que é necessária para a transformação eficiente de uma célula. Uma molécula como esta pode consistir em um ou mais cassetes de expressão, e pode ser organizada em mais de uma molécula de DNA “vetor”. Por exemplo, os vetores binários são vetores de transformação de planta que utilizam dois vetores de DNA não contíguos para codificar todos os requisitos das funções de ação cis e trans para a transformação de células de planta (Hellens e Mullineaux (2000)

Trends em Plant Science 5:446-451). “Vetor” refere-se a um construto de ácido nucleico determinado para a transferência entre diferentes células hospedeiras.

O “vetor de expressão” refere-se a um vetor que apresenta a capacidade de incorporar, integrar e expressar as sequências heterólogas de 5 DNA ou fragmentos em uma célula estrangeira.

Este vetor de transformação de planta pode ser compreendido de um ou mais vetores de DNA necessários para atingir a transformação da planta.

Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de planta que são compreendidos de mais de um segmento de DNA contíguo.

Estes vetores são frequentemente referidos na técnica como “vetores binários.” Os vetores binários, bem como vetores com plasmídeos auxiliares são mais frequentemente usados para transformação mediada por Agrobacterium, onde o tamanho e a complexidade dos segmentos de DNA necessários para atingir a transformação eficiente são muito grandes, e é vantajoso separar as funções em moléculas separadas de DNA.

Os vetores binários contêm tipicamente um vetor de plasmídeo que contém as sequências de ação cis exigidas para a transferência de DNA-T (tal como a extremidade esquerda e extremidade direita), um marcador selecionável que é engenheirado para ser capaz de expressar em uma célula de planta, e uma “sequência de nucleotídeos de interesse” (uma sequência de nucleotídeos engenheirada para ser capaz de expressar em uma célula de planta, na qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Estão presentes também neste vetor de plasmídeo as sequências exigidas para replicação bacteriana.

As sequências de ação cis são arranjadas de uma maneira para permitir a transferência eficiente para as células de planta e a expressão nestas.

Por exemplo, o gene de marcador selecionável e o gene de interesse estão localizados entre as extremidades esquerda e direita.

Em geral, um segundo vetor de plasmídeo contém os fatores de ação trans que medeiam a transferência de DNA-T de Agrobacterium para as células de planta.

Este plasmídeo contém em geral as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células de planta por Agrobacterium, e a transferência de DNA por clivagem em sequências da extremidade e a transferência de DNA mediada por vir, da maneira entendida na técnica (Hellens e Mullineaux 5 (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451). Vários tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usados para a transformação de planta.

O segundo vetor de plasmídeo não é necessário para transformar as plantas por outros métodos, tais como por microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietileno glicol, etc.

Variantes alterados ou melhorados usados nos construtos da invenção Reconhece-se que as sequências de nucleotídeos e aminoácidos usadas na presente invenção podem ser alteradas por vários métodos, e que estas alterações podem resultar em sequências que codificam proteínas com sequências de aminoácidos diferentes daquelas codificadas pelas sequências que modulam o nitrogênio aqui reveladas.

As sequências de nucleotídeos usadas na presente invenção incluem as sequências apresentadas em SEQ ID NO: 1, e variantes, fragmentos e complementos destas.

Da maneira aqui usada, pretende-se que os termos “sequência de nucleotídeos” ou “molécula de ácido nucleico” incluam moléculas de DNA (por exemplo, DNAc ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, RNAm) e análogos do DNA ou RNA gerados usando análogos de nucleotídeo.

As moléculas de ácido nucleico podem ser de fita simples ou de fita dupla, mas preferivelmente são DNA de fita dupla.

Pretende-se que “complemento” seja uma sequência de nucleotídeos que é suficientemente complementar a uma dada sequência de nucleotídeos, de maneira tal que possa hibridizar na dada sequência de nucleotídeos para formar por meio disso um duplex estável.

As sequências correspondentes de aminoácidos para as proteínas moduladoras de nitrogênio codificadas por estas sequências de nucleotídeos são apresentadas em SEQ ID NO: 2, bem como variantes e fragmentos destas.

A invenção também inclui o uso de moléculas de ácido nucleico compreendendo as sequências de 5 nucleotídeos que codificam as proteínas moduladoras de nitrogênio de tamanho parcial e complementos destas.

As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos destas sequências de nucleotídeos que modulam o nitrogênio também são usadas na presente invenção.

Pretende-se que “fragmento” seja uma porção de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína moduladora de nitrogênio.

Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína moduladora de nitrogênio, ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou oligonucleotídeo iniciador de PCR usando métodos revelados a seguir.

As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência que modula nitrogênio de nucleotídeos compreendem pelo menos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, ou pelo menos cerca de 400 nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presente em uma sequência de nucleotídeos de tamanho total que modula o nitrogênio aqui revelada, dependendo do uso pretendido.

Pretende-se que os nucleotídeos “contíguos” sejam resíduos de nucleotídeo que são imediatamente adjacentes uns aos outros.

Os polipeptídeos que são fragmentos destes polipeptídeos que modulam o nitrogênio também são usados na presente invenção.

Pretende-se que “fragmento” seja uma porção de uma sequência de aminoácidos que codifica uma proteína moduladora de nitrogênio da maneira apresentada m SEQ ID NO: 2, e que mantêm a eficiência de utilização de nitrogênio.

Uma porção biologicamente ativa de uma proteína moduladora de nitrogênio pode ser um polipeptídeo que apresenta, por exemplo, 10, 25, 50, 100, 125, 150,

175, 200, 250, 300, 350, 400 ou mais aminoácidos em tamanho.

Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas pela eficiência de utilização do nitrogênio.

Da maneira aqui usada, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID 5 NO: 2. A invenção inclui outros fragmentos, entretanto, tal como qualquer fragmento na proteína com mais de cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, ou 400 aminoácidos.

A invenção também inclui o uso de moléculas de ácido nucleico variante, ou sequências de aminoácidos variantes, nos métodos e composições das invenções.

Os “Variantes” das sequências de nucleotídeos que modulam o nitrogênio incluem aquelas sequências que codificam uma proteína moduladora de nitrogênio aqui revelada, mas que difere conservativamente em decorrência da degeneração do código genético, bem como aquelas que são suficientemente idênticas, da maneira aqui discutida anteriormente.

Os variantes alélicos de ocorrência natural podem ser identificados com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, da maneira esboçada a seguir.

As sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos derivadas sinteticamente que foram geradas, por exemplo, usando mutagênese sítio-direcionada, mas que ainda codificam as proteínas moduladoras de nitrogênio reveladas na presente invenção da maneira discutida a seguir.

As proteínas variantes usadas na presente invenção são biologicamente ativas, isto é, mantêm a atividade biológica desejada da proteína natural, isto é, eficiência de utilização de nitrogênio e/ou tolerância ao estresse melhoradas.

Pretende-se que “variantes” sejam proteínas ou polipeptídeos com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60 %, 65 %, cerca de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, ou 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID

NO: 2. Os variantes também incluem polipeptídeos codificados por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza na molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, ou um complemento desta, em condições restritivas.

Os variantes incluem polipeptídeos que diferem em sequência de aminoácidos 5 em virtude da mutagênese.

As proteínas variantes incluídas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína natural, isto é, mantêm a eficiência de utilização de nitrogênio e/ou tolerância ao estresse melhoradas.

As proteínas moduladoras de nitrogênio preferidas usadas na presente invenção são codificadas por uma sequência de nucleotídeos suficientemente idêntica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Pretende-se que o termo “suficientemente idêntico” seja um aminoácido ou sequência de nucleotídeos que apresenta pelo menos cerca de 60 % ou 65 % de identidade de sequência, cerca de 70 % ou 75 % de identidade de sequência, cerca de 80 % ou 85 % de identidade de sequência, ou cerca de 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência comparada com uma sequência de referência, usando um dos programas de alinhamento aqui descritos que usa parâmetros padrões.

Os versados na técnica reconhecerão que estes valores podem ser ajustados aproximadamente para determinar a identidade correspondente de proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeos, levando-se em consideração à degeneração do código, a similaridade de aminoácido, o posicionamento do quadro de leitura e similares.

Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas com propósitos de comparação ideal.

A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade percentual = número de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, posições de sobreposição) x

100). Em uma modalidade, as duas sequências são do mesmo tamanho.

A identidade percentual entre as duas sequências pode ser determinada usando técnicas similares aquelas descritas a seguir, com ou sem intervalos de permissão.

Para calcular a identidade percentual, as combinações tipicamente 5 exatas são contadas.

A determinação da identidade percentual entre as duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático.

Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 87:2264, modificado por Karlin e Altschul (1993) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90:5873-5877. Um algoritmo como este é incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J.

Mol.

Biol. 215:403. As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, classificação = 100, tamanho de letra = 12, para obter as sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico que modulam nitrogênio da invenção.

As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, classificação = 50, tamanho de letra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína que modulam nitrogênio da invenção.

Para obter os alinhamentos intercalados com propósitos de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado da maneira descrita em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa repetida que detecta as relações distantes entre as moléculas.

Ver Altschul et al. (1997) supra.

Durante a utilização dos programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrões dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser usados.

Ver www.ncbi.nlm.nih.gov.

Um outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação das sequências é o algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara as sequências e alinha completamente a sequência de aminoácidos ou DNA e, assim, pode fornecer dados sobre a conservação da sequência a partir da sequência total de aminoácidos. O algoritmo ClustalW é usado em vários pacotes de software de análise de DNA/aminoácido disponíveis 5 comercialmente, tal como o módulo ALIGNX do programa de vetor NTI adequado (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Após o alinhamento das sequências de aminoácidos com ClustalW, a identidade percentual de aminoácidos pode ser avaliada. Um exemplo não limitante de um programa de software usado para a análise dos alinhamentos ClustalW é GENEDOCTM. GENEDOCTM (Karl Nicholas), que permite a avaliação de similaridade e identidade de aminoácido (ou DNA) entre proteínas múltiplas. Um outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Um algoritmo como este é incorporado no programa ALIGN (versão

2.0), que é parte do pacote de software de alinhamento de sequência GCG (disponível pela Accelrys, Inc., 9865 Scranton Rd., San Diego, Califórnia, USA). Durante a utilização do programa ALIGN para comparar as sequências de aminoácidos, uma tabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade de tamanho de intervalo de 12, e uma penalidade de intervalo de 4, podem ser usadas. Um programa preferido é GAP versão 10, que é usado no algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453. O GAP Versão 10 pode ser usado com os parâmetros a seguir: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos usando peso GAP de 50 e peso de tamanho de 3, e a matriz de classificação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de similaridade para uma sequência de aminoácidos usando o peso GAP de 8 e peso de tamanho de 2, e a motriz de classificação BLOSUM62. Os programas equivalentes também podem ser usados. Pretende-se que “programa equivalente” seja qualquer programa de comparação de sequência que, para qualquer das duas sequências em questão, gera um alinhamento com combinações idênticas de resíduo de nucleotídeo ou aminoácido e uma identidade percentual de sequência idêntica, quando comparado ao alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10. 5 Os versados na técnica entenderão adicionalmente que as mudanças podem ser introduzidas por mutação nas sequências de nucleotídeos da invenção, levando por meio disso às mudanças na sequência de aminoácidos da proteína codificada que modula o nitrogênio, sem alterar a atividade biológica da proteína.

Assim, as moléculas de ácido nucleico isoladas variantes podem ser criadas introduzindo uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeo na sequência correspondente de nucleotídeos aqui revelada, de maneira tal que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido sejam introduzidas na proteína codificada.

As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrões, tais como mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediada por PCR.

Tais sequências de nucleotídeos variantes também são incluídas pela presente invenção.

Por exemplo, as substituições conservativas de aminoácido podem ser realizadas em um ou mais resíduos de aminoácidos previstos, preferivelmente não essenciais.

Um resíduo de aminoácido “não essencial” é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência tipo selvagem de uma proteína moduladora de nitrogênio sem alterar a atividade biológica, ao passo que um resíduo de aminoácido “essencial” é exigido para atividade biológica.

Uma “substituição conservativa de aminoácido” é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar.

As famílias de resíduos de aminoácido com cadeias laterais similares foram definidas na técnica.

Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo, treonina, valina, 5 isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). As substituições de aminoácido podem ser realizadas em regiões não conservadas que mantêm a função.

Em geral, tais substituições não seriam realizadas em resíduos conservados de aminoácido, ou em resíduos de aminoácido que estão em um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para a atividade proteica.

Entretanto, os versados na técnica entenderão que os variantes funcionais podem apresentar alterações menos conservadas ou não conservadas nos resíduos conservados.

Os exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade proteica incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de sequências similares ou relacionadas, conhecidas por estar envolvidas na assimilação de nitrogênio.

Exemplos de resíduos que são conservados, mas que permitem substituições conservativas de aminoácido e ainda mantêm a atividade incluem, por exemplo, resíduos que apresentam apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de sequências similares ou relacionadas, conhecidas por estar envolvidas na assimilação de nitrogênio.

Alternativamente, as sequências de nucleotídeos variantes podem ser preparadas introduzindo mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência codificante, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser selecionados pela capacidade de conferir eficiência de utilização de nitrogênio para identificar mutantes que mantêm a atividade.

Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa aleatoriamente, e a atividade da proteína pode ser determinada usando técnicas de ensaio padrão.

Usando os métodos tais como PCR, hibridização e similares, as sequências correspondentes que modulam o nitrogênio podem ser identificadas, tais sequências com identidade substancial com as sequências da invenção.

Ver, por exemplo, Sambrook J., e Russell, D.W. (2001) 5 Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). Em um método de hibridização, toda ou parte da sequência de nucleotídeos que modula o nitrogênio pode ser usada para selecionar o DNAc ou bibliotecas genômicas.

Os métodos para a construção de tais DNAc e bibliotecas genômicas são em geral conhecidos na técnica, e são revelados em Sambrook e Russell, 2001, supra.

Os variantes e fragmentos das sequências de nucleotídeo ou aminoácidos da presente invenção codificarão em geral fragmentos de proteína que mantêm a atividade biológica da proteína que modula o nitrogênio de tamanho total, isto é, mantêm a eficiência de utilização de nitrogênio.

Pretende-se que “mantém a eficiência de utilização de nitrogênio” seja que o variante ou fragmento apresentará pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 70 %, ou pelo menos cerca de 80 % da eficiência de utilização de nitrogênio e/ou tolerância ao estresse da proteína que modula o nitrogênio de tamanho completo aqui revelada como SEQ ID NO: 2, ou a sequência de nucleotídeos de tamanho total que modula o nitrogênio aqui revelada como SEQ ID NO: 1. Os métodos para monitorar a eficiência de utilização de nitrogênio incluem detectar uma mudança em qualquer dos principais agrupamentos metabólicos de nitrogênio calculado nas vias de assimilação (por exemplo, uma mudança mensurável em nitrato, nitrito, amônia, ácido glutâmico, ácido aspártico, glutamina, asparagina, lisina, leucina, treonina, metionina, glicina, triptofano, tirosina, teor de proteína total de uma parte da planta, teor de nitrogênio total de uma parte da planta, e/ou teor de clorofila), ou detectar a capacidade de uma planta fornecer o mesmo, ou elevado, rendimento em níveis inferiores de fertilização de nitrogênio, ou a capacidade de uma planta fornecer rendimentos elevados nos mesmos níveis de fertilização de nitrogênio quando comparada a uma planta 5 que não contém ou expressa uma sequência que modula o nitrogênio da invenção.

A designação de “mesmo” nível ou nível “inferior” de fertilização de nitrogênio refere-se ao nível de nitrogênio aplicado em geral a uma planta que não expressa uma sequência que modula o nitrogênio da invenção.

Os níveis suficientes de nitrogênio são conhecidos na técnica para a maioria, se não todas, das variedades de planta de interesse.

Orientações adicionais podem ser encontradas em, por exemplo, Hewitt (1966) Sand and Water Culture Methods Used in the Study of Plant Nutrition, 2ª ed., Farnham Royal (Bucks), Commonwealth Agricultural Bureaux; e, Hewitt (1975) Plant Mineral Nutrition, London, English University Press.

As sequências de polipeptídeos usadas na presente invenção podem ser alteradas de várias maneiras, incluindo por substituições, deleções, truncações e inserções de aminoácido.

Os métodos para tais manipulações são em geral conhecidos na técnica.

Por exemplo, a sequência de aminoácidos variantes das proteínas moduladoras de nitrogênio aqui revelada pode ser preparada por mutações nas sequências de nucleotídeos.

Isto também pode ser realizado por uma das várias formas de mutagênese e/ou em evolução direcionada.

Em alguns aspectos, as mudanças codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína.

Tais variantes possuirão a eficiência desejada da utilização de nitrogênio.

Entretanto, entende-se que a capacidade das sequências que modulam o nitrogênio da invenção de alterar ou melhorar a utilização de nitrogênio pode ser melhorada adicionalmente pelo uso de tais técnicas nas composições desta invenção.

Por exemplo, pode-se expressar as sequências de nucleotídeos aqui reveladas em células hospedeiras que exibem taxas elevadas de má incorporação de base durante a replicação do DNA, tal como célula XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Após a propagação em tais cepas, pode-se isolar o DNA (por exemplo, preparando o DNA plasmidial, ou amplificando por PCR e clonando o fragmento resultante de PCR em um vetor), transformá-lo nas 5 plantas da maneira descrita aqui em outra parte, e medir a eficiência de utilização de nitrogênio.

Alternativamente, as alterações podem ser realizadas na sequência de proteína de muitas proteínas nas terminações amino ou carbóxi, sem afetar substancialmente a atividade.

Isto pode incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, tal como PCR, incluindo amplificações por PCR que alteram ou estendem a sequência codificante de proteína, em virtude da inclusão das sequências de aminoácidos codificantes nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação por PCR.

Alternativamente, as sequências de proteína adicionadas podem incluir sequências totais que codificam proteína, tais como aquelas comumente usadas na técnica para gerar fusões proteicas.

Tais proteínas de fusão são frequentemente usadas (1) para aumentar a expressão de uma proteína de interesse, (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epítopo para facilitar tanto a purificação de proteína, detecção de proteína, quanto outros usos experimentais conhecidos na técnica, ou (3) alvejar a secreção ou tradução de uma proteína em uma organela subcelular, tal como o espaço periplasmático de bactérias Gram negativas, ou o retículo endoplasmático de células eucariotas, o último que frequentemente resulta em glicosilação da proteína.

As sequências de nucleotídeos e aminoácidos variantes da presente invenção também incluem as sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos, tal como embaralhamento de DNA.

Com um procedimento como este, uma ou mais regiões codificantes diferentes de proteína que modula o nitrogênio podem ser usadas para criar uma nova proteína que modula o nitrogênio e que possui as propriedades desejadas. Desta maneira, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de sequência de polinucleotídeos relacionados, que compreendem as regiões de sequência que apresentam identidade de 5 sequência substancial, e podem ser recombinadas homologamente in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando esta abordagem, os motivos de sequência que codificam um domínio de interesse podem ser embaralhados entre a sequência moduladora de nitrogênio, usada na presente invenção, e outras sequências conhecidas, que modulam o nitrogênio para obter uma nova sequência que codifica uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, tal como utilização de nitrogênio melhorada. As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504- 4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291 e patentes U.S. 5.605.793 e

5.837.458. Transformação da planta Os métodos da invenção envolvem introduzir uma ou mais sequências de nucleotídeos que modulam o nitrogênio em uma planta. Em algumas modalidades, apenas uma das sequências que modulam o nitrogênio aqui reveladas é introduzida na planta. Em outras modalidades, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, ou mais das sequências são introduzidas. Onde múltiplas sequências são introduzidas, cada uma das sequências de nucleotídeos é não idêntica. Duas sequências de nucleotídeos são consideradas não idênticas se diferirem em pelo menos uma posição de nucleotídeo. Assim, as sequências não idênticas de nucleotídeos incluem duas ou mais sequências de nucleotídeos diferentes, em que cada uma codifica a mesma sequência de aminoácidos (por exemplo, uma ou mais foram otimizadas para a expressão na planta), bem como duas ou mais sequências de nucleotídeos diferentes que codificam pelo menos duas sequências de aminoácidos diferentes.

Pretende-se que “introduzir” seja apresentar à planta um ou 5 mais construtos compreendendo a uma ou mais sequências que modulam o nitrogênio, de maneira tal que o(s) construto(s) ganhe(m) acesso ao interior de uma célula da planta.

Os métodos da invenção não exigem que um método particular para introduzir um construto de nucleotídeo em uma planta seja usado, apenas que o(s) construto(s) de nucleotídeo(s) ganhe(m) acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta.

Os métodos para introduzir construtos de nucleotídeos nas plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.

Em geral, os métodos de transformação em planta envolvem transferir o DNA heterólogo nas células de planta alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calos não diferenciados, protoplastos, etc.), seguido pela aplicação de um nível no limite máximo de seleção apropriada (dependendo do gene de marcador selecionável) para recuperar as células de planta transformadas a partir de um grupo de massa celular não transformada.

Os explantes são transferidos tipicamente para um suprimento novo do mesmo meio e cultivados rotineiramente.

Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em brotos, após colocar em meio de regeneração suplementado com um nível no limite máximo de agente de seleção (isto é, antibióticos, tais como espectinomicina e canamicina). Os brotos são então transferidos para um meio de enraizamento seletivo para recuperar broto ramificado ou plântula.

A plântula transgênica cresce então na planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Os explantes são tipicamente transferidos para um suprimento novo do mesmo meio e cultivados rotineiramente.

Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park (1994) Critical Reviews em Plant Science 13:219-239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Uma 5 vez que o material transformado contém muitas células, tanto as células transformadas quanto não transformadas estão presentes em qualquer pedaço dos calos alvos, ou tecido, ou grupo de células em questão.

A capacidade de manter células não transformadas e permitir que as células transformadas se proliferem resulta em culturas de planta transformada.

Frequentemente, a capacidade de remover células não transformadas é uma limitação para recuperação rápida de células de planta transformadas e geração satisfatória de plantas transgênicas.

Os métodos moleculares e bioquímicos podem então ser usados para confirmar a presença do gene heterólogo de interesse integrado no genoma da planta transgênica.

A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por um dos vários métodos incluindo, mas sem limitação, a introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium nas células de planta (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeamento de células de planta com DNA heterólogo estrangeiro aderido às partículas, e vários outros métodos mediados por não partícula direta (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120) para transferência do DNA.

Os métodos para a transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica.

Ver, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 87:8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90:913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método depende da arma de partícula de distribuição de DNA contendo um marcador selecionável e alvejamento do DNA no genoma do plastídeo por meio de recombinação homóloga.

Adicionalmente, a transformação de plastídeo pode ser realizada por transativação de um transgene silencioso de origem no plastídeo, pela expressão preferida por tecido de uma RNA polimerase 5 codificada no núcleo e direcionada para o plastídeo.

Um sistema como este foi relatado em McBride et al. (1994) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 91:7301-7305. A transformação de células bacterianas é realizada por uma das várias técnicas conhecidas na técnica incluindo, mas sem limitação, eletroporação ou transformação química (ver, por exemplo, Ausubel, ed. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Inc., Indianapolis, EM). Os marcadores que conferem a resistência às substâncias tóxicas são usados na identificação de células transformadas (com absorção e expressão de DNA teste) a partir das células não transformadas (aquelas que não contêm ou não expressam o DNA teste). Em um aspecto da invenção, as sequências de nucleotídeos da invenção são usadas como marcadores para avaliar a transformação de células bacterianas ou de planta.

Desta maneira, a transformação é avaliada monitorando a eficiência de utilização de nitrogênio da maneira descrita anteriormente.

A transformação de células de planta pode ser realizada de maneira similar.

Pretende-se que “planta” sejam plantas completas, ou partes de componentes, incluindo órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de planta, propágulos, embriões e progênie da mesma.

As células de planta podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calos, células em cultura em suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células do floema, pólen). “Plantas transgênicas”, ou “plantas transformadas”, ou plantas, ou células ou tecidos “transformados estavelmente” referem-se às plantas que tiveram sequências exógenas de ácidos nucleicos ou fragmentos de DNA incorporados ou integrados na célula de planta.

Pretende-se que a “transformação estável” seja o construto de nucleotídeo introduzido em uma planta que se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdado pela progênie desta. 5 As células que foram transformadas podem ser crescidas em plantas de acordo com as maneiras convencionais.

Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser crescidas, e polinizadas tanto com a mesma cepa transformada e em cepas diferentes, quanto com o híbrido resultante com a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada.

Duas ou mais gerações podem ser crescidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida e transmitida estavelmente, e a seguir as sementes são coletadas para garantir que a expressão das características fenotípicas desejadas foi atingida.

Desta maneira, a presente invenção fornece a semente transformada (também referida como “semente transgênica”) com um construto de nucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado estavelmente em seu genoma.

Métodos para aumentar o rendimento da planta modulando a utilização de nitrogênio Os métodos para aumentar o rendimento da planta são fornecidos.

Os métodos compreendem introduzir em uma planta ou célula de planta uma sequência de nucleotídeos que modula o nitrogênio aqui revelada, de maneira tal que um aumento na eficiência de utilização de nitrogênio corresponda a um aumento no rendimento da planta.

Da maneira aqui definida, o “rendimento” da planta refere-se à qualidade e/ou quantidade de biomassa e/ou rendimento coletável produzido pela planta.

Pretende-se que “biomassa” seja qualquer parte da planta medida (por exemplo, qualquer parte de componente de uma planta, tal como semente, pedúnculo, raiz, grão, folha, etc.). Um aumento na produção da biomassa é qualquer melhoria no rendimento do produto de planta avaliado.

Um aumento no rendimento coletável é um peso maior de um componente de planta que é facilmente coletável usando métodos de coleta conhecidos, ou um aumento na quantidade composicional de um composto de interesse na parte coletada: um 5 exemplo não limitante sendo a quantidade de um aminoácido, tal como lisina, que é coletado por unidade de área de terra.

Aumentar o rendimento da planta ou rendimento coletável apresenta várias aplicações comerciais.

Por exemplo, o aumento da biomassa de folha da planta pode aumentar o rendimento de vegetais folhosos para o consumo humano e de animais.

Adicionalmente, o aumento da biomassa de folhas pode ser usado para aumentar a síntese de produtos farmacêuticos ou industrializados derivados de planta.

Um aumento no rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas sem limitação, pelo menos um aumento de 1 %, pelo menos um aumento de 3 %, pelo menos um aumento de 5 %, pelo menos um aumento de 10 %, pelo menos um aumento de 20 %, pelo menos um aumento de 30 %, pelo menos um aumento de 50 %, pelo menos um aumento de 70 %, pelo menos um aumento de 100 % ou um aumento maior no rendimento da planta, comparado ao rendimento de uma planta na qual uma sequência de nucleotídeos que modula o uso de nitrogênio da invenção não foi introduzida.

Plantas A presente invenção pode ser usada para a transformação de qualquer espécie de planta incluindo, mas sem limitação, monocotiledôneas e dicotiledôneas.

Exemplos de plantas de interesse incluem, mas sem limitação, milho (grão de milho), sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana de açúcar, tabaco, cevada, e colza, Brassica sp., alfafa, centeio, milheto, cártamo, amendoins, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, plantas cítricas, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, oliva, mamão papaia, caju, macadâmia, amêndoa, aveias,

vegetais, gramíneas (tal como gramado, gramíneas forrageiras, ou gramíneas de pastagem), plantas ornamentais, árvores (tais como árvores de fruta, árvores de nozes, árvores de oleaginosas, palmeiras) e coníferas.

Os vegetais incluem, mas sem limitação, cebolas, tomates, 5 alface, vagem, feijão espadinho, ervilhas e elementos do gênero Curcumis tais como pepino, melão rosado e melão de casca de carvalho.

As plantas ornamentais incluem, mas sem limitação, azaléia, hortência, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravos, poinsétia e crisântemo.

Preferivelmente, as plantas da presente invenção são plantas de cultivo agrícola (por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana de açúcar, tabaco, cevada, colza, etc.). Esta invenção é particularmente adequada para qualquer elemento da família de planta monocotiledônea incluindo, mas sem limitação, milho, arroz, cevada, aveias, trigo, sorgo, centeio, cana de açúcar, abacaxi, inhames, cebola, banana, coco e tâmaras.

Avaliação da transformação de planta Após a introdução do DNA heterólogo estrangeiro nas células de planta, a transformação ou integração de gene heterólogo no genoma da planta é confirmada por vários métodos, tais como a análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados com o gene integrado.

A análise de PCR é um método rápido para selecionar células transformadas, tecido ou brotos com relação à presença de sequências de nucleotídeos incorporadas no estágio inicial, antes de transplantar para o solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). A PCR é realizada usando oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene de interesse ou antecedentes do vetor de Agrobacterium, etc.

A transformação da planta pode ser confirmada por análise Southern blot do DNA genômico (Sambrook e Russell, 2001, supra). Em geral, o DNA total é extraído a partir do transformante, digerido com enzimas de restrição apropriadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou de náilon. A membrana ou “borrão” é então sondada, por exemplo, com fragmentos de DNA alvo radiomarcado 5 com 32P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma da planta de acordo com técnicas padrões (Sambrook e Russell, 2001, supra). Na análise Northern, o RNA é isolado a partir de tecidos específicos do transformante, fracionado em um gel de agarose e formaldeído, borrado em um filtro de náilon de acordo com procedimentos padrões que são usados rotineiramente na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra). A expressão de RNA codificado pela sequência de nucleotídeos da invenção é então testada hibridizando o filtro em uma sonda radioativa, derivada de um polinucleotídeo da invenção, por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra). Os ensaios Western blot, bioquímicos e similares podem ser realizados nas plantas transgênicas para determinar a presença de proteína codificada pelo gene que modula o nitrogênio, por procedimentos padrões (Sambrook e Russell, 2001, supra), usando anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes na proteína que modula o nitrogênio. Por exemplo, os anticorpos policlonais gerados pelos métodos da presente invenção podem ser usados para detectar a presença de uma proteína moduladora de nitrogênio. Anticorpos Os anticorpos para os polipeptídeos usados na presente invenção, ou para os variantes ou fragmentos destes, também são incluídos. Os métodos para produzir anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; patente U.S.

4.196.265).

PARTE EXPERIMENTAL

Materiais e métodos Um gene sintético que codifica uma enzima NAGK foi gerado (SEQ ID NO: 1). A fim de localizar a proteína NAGK no cloroplasto, um polinucleotídeo que codifica um peptídeo trânsito no cloroplasto (SEQ ID 5 NO: 3) foi adicionado na terminação N da proteína.

Caracterização funcional de proteína NAGK Uma cepa de deleção de argB (que codifica NAGK em E. coli) foi construída a partir de E. coli DH5 alfa usando o método descrito por K.A.

Datsenko e B.L.

Wanner (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.

PNAS 97(12):6640-6645. 2001.) Os oligonucleotídeos iniciadores de PCR descritos por Baba, et al. (T.

Baba, T.

Ara, M.

Hasegawa, Y.

Takai, Y.

Okumura, M.

Baba, K.A.

Datsenko, M.

Tomita, B.L.

Wanner & H.

Mori. 2006. Construction of Escherichia coli K- 12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection Molecular Systems Biology 2:2006.0008) foram usados para criar uma deleção em alinhamento do gene argB.

Os mutantes foram selecionados com canamicina e o cassete de resistência à canamicina foi subsequentemente removido por FLP recombinase.

Esta cepa de deleção foi denominada DH5 alfa 4argB.

Um fragmento de DNA que abrange a deleção foi amplificada por PCR e o produto de PCR foi sequenciado, o que confirma a estrutura da deleção.

Esta cepa cresceu em geral em meio rico (por exemplo, LB, TB), mas foi incapaz de crescer me meio mínimo M63, a menos que o meio tenha sido suplementado com arginina ou ornitina, da maneira esperada para uma cepa que precisa uma enzima NAGK funcional.

Gerou-se um gene sintético que codifica NAGK para simplificar as etapas de clonagem e melhorar a expressão da proteína NAGK no milho.

Adicionalmente, direciona-se a localização da enzima NAGK para o cloroplasto da planta, usando o peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP) da extremidade 5' do gene enolpiruvil shiquimato fosfato sintase (EPSPS) da alga Chlamydomonas reinhardtii.

Vários plasmídeos contendo o gene sintético, o cosmídeo contendo o gene NAGK da cepa bacteriana parental ATX 16042 e um plasmídeo controle negativo contendo um gene glutamina sintetase de milho foram transformados 5 na cepa de E. coli DH5 alfa 4argB.

A presença e identidade dos plasmídeos foi confirmada por mini-preparação de DNA e digestão por restrição.

As cepas contendo o plasmídeo foram estriadas em ágar com meio M63 e em M63 suplementado com ornitina ou arginina.

As culturas foram incubadas a 37 ºC por 2 dias e o crescimento foi avaliado.

Os resultados são mostrados na tabela 1 a seguir.

Tabela 1 - Caracterização funcional do gene NAGK Crescimento em Plasmídeo Descrição M63 M63+orn M63+arg pAXX4371 Clone de cosmídeo que codifica NAGK a partir da cepa ++ ++ ++ ATX 16042 pAXX4381 Vetor pRSFlb contendo o gene de glutamina sintetase de milho - ++ ++ pAXX4383 Vetor pGA4 contendo o gene NAGK sintético + ++ ++ pAXX4389 Vetor pRSFlb contendo o gene NAGK sintético ++ ++ ++ pAXX4395 Vetor de transformação de planta contendo o gene CTP-NAGK ++ ++ ++ sintético

Superexpressão de proteína em milho O vetor de transformação de planta pAX4395 foi construído para direcionar a superexpressão da proteína NAGK em milho.

O vetor utiliza o promotor Scubi4 e o terminador PinII para direcionar a superexpressão de uma proteína compreendendo um cloroplasto EPSPS de Chlamydomonas principal fundido à NAGK.

Um segundo cassete no vetor direciona a superexpressão do gene dsdAl, o que leva ao acúmulo da proteína d- aminoácido oxidase.

Cada um dos cassetes do gene foi sequenciado completamente antes da transformação da planta.

Transformação de planta O vetor pAX4395 foi usado para realizar a transformação de milho mediada por Agrobacterium.

Após a construção do vetor e transformação de Agrobacterium, os vetores foram confirmados pelos métodos de Southern blot conhecidos na técnica.

As cepas de Agrobacterium positivas que passaram por estes testes foram então crescidas em um meio sólido para produzir contagens celulares para experimentos de transformação em grande escala.

O vetor pAX4395 foi introduzido em uma cepa de 5 Agrobacterium tumefaciens por eletroporação.

Esta cepa também continha o vetor pSB1, o que permite que pSB1 e pAX4395 recombinem in vivo para criar um vetor que pode direcionar a inserção do cassete NAGK no genoma do milho.

A formação do vetor recombinante, pAG4395, foi confirmada por hibridização Southern blot desta cepa de Agrobacterium.

A cepa de Agrobacterium que carrega o co-integrado pode ser usada para transformar plantas, por exemplo, pelo método PureIntro (Japan Tabaco, Inc.). Após o co-cultivo, os embriões foram crescidos em meio de seleção contendo d-serina para identificar os calos que apresentaram o gene dsdA de pAG4395 e expressaram a proteína d-aminoácido oxidase.

Os eventos individuais que sobreviveram ao crescimento seletivo na presença de serina foram então movidos para o meio de regeneração, e crescidos até o estágio de plântula usando métodos conhecidos na técnica.

Análise Western Blot A expressão de NAGK nestas plantas foi examinada gerando anticorpos que se ligam especificamente à proteína NAGK.

Resumidamente, o gene NAGK foi subclonado no vetor pRSFlb (Novagen) para permitir a superexpressão da proteína NAGK em E. coli após a indução de IPTG.

O vetor também introduz um His tag 6x nas terminações N da proteína.

Após a superexpressão de proteína, a proteína NAGK foi purificada por cromatografia em coluna de cobalto e a identidade da proteína purificada foi confirmada por sequenciamento N-terminal.

A proteína purificada foi então usada para imunizar coelhos, com coleção de soro começando 42 dias após a imunização.

A seguir, o anti-soro de NAGK foi usado para avaliar a expressão de proteína nas plantas de milho transgênica por análise de Western blot.

As amostras de folha foram obtidas de plantas individuais após 4 semanas de crescimento na estufa, e os extratos proteicos foram preparados moendo o material da planta em água.

A concentração de proteína em cada 5 extrato foi determinada pelo ensaio de Bradford, e 25 ug de cada extrato foi separado em géis de poliacrilamida com um gradiente de 4-12 %. As proteínas separadas foram transferidas para nitrocelulose e a seguir foram sondadas com o anti-soro de coelho em uma diluição de 1:5.000. Após as etapas de lavagem, a nitrocelulose foi colocada em contato com anti-coelho de cabra conjugada com peroxidase de rábano silvestre (diluição de 1:10.000), e os complexos de anticorpo foram visualizados usando reagentes de detecção ECL (GE Healthcare). Quatro eventos transgênicos representativos (#8054, 8055, 8056, 8057) mostraram cada um a expressão forte da proteína NAGK, enquanto uma planta controle (“Hi-II”) não mostrou a presença da proteína.

É importante notar que o tamanho da proteína detectada no tecido da planta (-29 kDa) é consistente com o tamanho de NAGK apóso processamento do cloroplasto principal (tamanho previsto = 29,2 kDa), em vez do cloroplasto principal-proteína de fusão NAGK não processada (tamanho previsto= 36,9 kDa). Análise do nitrogênio do milho Uma série de ensaios que quantificam os intermediários de nitrogênio em plantas foram desenvolvidos.

Estes métodos de ensaio de nitrogênio são descritos em um registro de patente prévio (WO 2008/051608 “Plantas com utilização de nitrogênio e tolerância ao estresse melhoradas”). Estes ensaios foram utilizados para analisar um total de 10 plantas transgênicas contendo o gene NAGK.

Cada uma das plantas foram amostradas (folha) após 4 semanas de crescimento em solo em uma estufa.

Estas amostras de folha foram processadas para determinar seus níveis de nitrato, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico, amônio,

aminoácido total, clorofila e de proteína total.

Foram incluídas ao longo da análise as plantas que foram transformadas com um construto contendo apenas o marcador selecionável dsdAl (sem NAGK). Estas plantas foram amostradas igualmente em 4 semanas e são referidas como plantas “não GOP”. Os resultados dos ensaios de nitrogênio realizados em ambos os tipos de plantas são mostrados a seguir na tabela 2.

Tabela 2. Níveis de nitrogênio vs. eventos de não GOI em milho, 4 semanas após a transferência para o solo Ácido Ácido Aminoácidos Nitrato Asparagina Glutamina Amônio Proteína total Clorofila total Planta # GOI Aspártico Glutâmico totais (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (mg/g) a+b (mg/g) (ug/g) (ug/g) (mg/g) 8054 NAGK 275 90 333 251 1875 289 173 9,5 0,070 8055 NAGK 782 73 287 298 2197 368 159 9,4 0,084 8056 NAGK 239 916 250 243 1765 355 174 11,1 0,138 8057 NAGK 437 240 319 630 3347 236 183 14,5 0,080 8570 NAGK 438 276 430 588 2170 229 169 10,6 0,077 8571 NAGK 373 237 516 418 2128 254 163 12,5 0,049 8572 NAGK - 62 289 695 2640 183 143 9,8 0,069 8573 NAGK 363 177 434 704 2143 262 152 10,9 0,046 8643 NAGK 291 45 366 621 2123 132 122 10,9 0,031 8644 NAGK 694 55 218 - 2220 152 117 11,2 0,029 Média 432 217 344 494 2281 246 155 11,0 0061 Desvio Padrão 188 261 93 192 445 78 22 1,5 0,032 CV 0,43 1,20 0,27 0,39 0,20 0,32 0,14 0,14 0,47 8058 Não GOI 362 89 234 452 2540 201 115 8,04 0,053 8059 Não GOI 219 82 222 287 1687 227 122 11,41 0,081 8060 Não GOI 751 80 225 312 2083 276 142 10,58 0,099

42 Média 444 84 227 351 2103 235 121 10,01 0,078 Desvio Padrão 275 5 6 89 427 38 14 1,76 0,023 CV 0,62 0,06 0,03 0,25 0,20 0,16 0,11 0,18 0,30

Estes dados demonstram que o gene sintético designado codifica uma enzima NAGK funcional.

Construção do vetor de superexpressão de NAGK A sequência de DNA de NAGK a seguir (SEQ ID NO: 1) foi 5 isolada a partir de uma cepa bacteriana de Brevibacillus laterosporus:

A sequência de DNA de NAGK mostrada anteriormente codifica a sequência de proteína NAGK a seguir (SEQ ID NO:2):

A sequência de DNA foi clonada no vetor de expressão pRSF- lb em E. coli (Novagen, Inc.) para criar o vetor pAX4389. Este vetor de expressão colocou um tag 6-histidina nas terminações N da proteína, e coloca a expressão do gene NAGK no controle do promotor viral T7. O mapa de vetor para pAX4389 é mostrado na figura 1.

Preparação de extrato proteico de NAGK O vetor de superexpressão de NAGK, pAX4389, foi transformado em células de E. coli eletrocompetentes (BL21 *DE3, Invitrogen), e colônias simples foram obtidas por seleção com o antibiótico 5 canamicina.

Uma colônia individual foi então crescida em meio líquido (caldo LB) até que a absorbância da cultura (em 600 nm) atingisse 0,6, e a seguir IPTG 0,5 mM foi adicionado para induzir a expressão do promotor T7. A indução foi realizada por toda a noite a 16 ºC.

No dia seguinte, a cultura induzida foi centrifugada e o precipitado foi congelado por duas horas a -20 ºC.

Após descongelamento no gelo, o precipitado foi recolocado em suspensão em 1.110 volume de tampão de lise (Hepes 50mM, pH 7,0, NaCl 50mM), tratado com lisozima (Novagen) em temperatura ambiente por 30 minutos, e a seguir foi sonicado para lisar as células.

O material insolúvel foi separado do extrato proteico solúvel por meio de centrifugação.

Este extrato proteico foi então armazenado em um balde de gelo, e os ensaios da enzima NAGK foram preparados em um curto período posterior.

Como um controle negativo, um vetor controle foi preparado, junto com o qual direcionou a superexpressão de uma enzima bacteriana EPSPS no mesmo vetor base (pRSF-lb). Este vetor também foi transformado na mesma linhagem celular de E. coli e uma colônia transformante foi selecionada para a superexpressão de proteína, e um extrato proteico foi preparado junto com NAGK.

Ensaio de enzima NAGK - Titulação com enzima NAGK O ensaio com a enzima NAGK foi adaptado a partir do método de Denes (1970). A formação do produto foi quantificada usando um espectrofotômetro Spectramax 190 em 540 nm.

Uma mistura principal para a reação de NAGK in vitro foi preparada com os componentes a seguir: Tris 50 mM, pH 8,0; pH final da mistura principal foi 5,5; hidroxilamina 100 mM (NH2OH); MgCl2 10 mM; ATP 7 mM; N-acetilglutamato 70 mM (NAG).

Esta mistura principal foi subdividida em poços individuais em uma placa com 96 poços (volume final de 200 uL/poço), e as reações foram então iniciadas adicionando várias concentrações do extrato proteico de NAGK nos poços de amostra individual. Após 1 hora de incubação a 37 ºC, a 5 absorbância de cada amostra foi quantificada. A quantidade de proteína NAGK no extrato foi estimada carregando as diluições do extrato em um gel SDS-poliacrilamida junto com concentrações conhecidas de um padrão de albumina sérica bovina, e a seguir corando o gel com corante proteico Coomassie (Simply Blue, Invitrogen). Por este método, observa-se que a adição do extrato proteico de NAGK em concentrações tão baixas quanto 1 ng/mL gerou um produto de absorbância em 540 nm. Os resultados de absorbância do produto de enzima (N-actilglutamil-5-fosfato) reagem com hidroxilamina para criar o composto absorvente N-acetiglutamil-5-hidroxamato. O gráfico (figura 1) e a tabela (tabela 3) mostram a absorbância em cada uma das 6 diferentes concentrações da proteína NAGK. A absorbância da linha de base gerada por um tampão controle (A540 = 0,04) foi subtraída de cada valor de absorbância de NAGK. A absorbância gerada por uma alta concentração do extrato controle (EPSPS de bactéria) foi muito similar ao tampão controle (A540 = 0,042), que demonstra que a formação do produto exige a presença da enzima NAGK. Tabela 3. Dados de absorbância principal para ensaio de enzima NAGK in vitro mostrados na figura 1. O valor da absorbância para o tampão controle (A540 = 0.040) foi subtraído de cada valor. NAGK (ng/mL) A540 nm

1.000 0,872 250 0,518 62,5 0,0159 15,6 0,039 3,9 0,002 1 0,001 Ensaio com enzima NAGK - Titulação com substrato (NAG) A seguinte mistura principal para o ensaio de proteína NAGK in vitro foi preparada com o propósito de titular o substrato (NAG) na reação:

Tris 50 mM; pH final foi 5,5; hidroxilamina 100 mM (NH2OH); MgCl2 10 mM; ATP 7 mM; 1.000 ng/mL de enzima NAGK (do extrato proteico). Esta mistura principal foi subdividida em poços individuais de uma placa de 96 poços (volume final de 200 uL/poço), e as reações foram 5 então iniciadas adicionado várias concentrações do substrato NAG em poços de amostra individual.

As concentrações de NAG variaram de 1,6 mM até 100 mM.

Após 1 hora de incubação a 37 ºC, a absorbância de cada amostra foi quantificada.

Uma reação controle sem substrato foi preparada e analisada juntamente.

Por este método, observa-se que a formação do produto (pela enzima NAGK) foi dependente da concentração de substrato.

Nas menores concentrações de substrato testadas (NAG = 1,6 mM, 3,1 mM), a quantidade de produto gerado foi aproximadamente proporcional à concentração do substrato.

Nas maiores concentrações testadas (NAGK = 50 mM, 100 mM), o substrato estava em excesso e apenas poucas diferenças na formação do produto foram observadas.

Um gráfico destes dados é mostrado na figura 3, e os valores de absorbância numérica são mostrados na tabela 4. Tabela 4. Dados de absorbância principal para o ensaio de enzima NAGK in vitro mostrados na figura 3. O valor da absorbância para a reação de controle sem substrato (A540 = 0,041) foi subtraído de cada valor.

NAG (mM) A540 nm 100 0,57 50 0,515 25 0,411 12,5 0,313 6,3 0,0212 3,1 0,13 1,6 0,07

Ensaio com enzima NAGK - Titulação com arginina A seguinte mistura principal para ensaios de enzima NAGK in vitro foi preparada com o propósito de determinar o efeito de arginina na atividade da enzima NAGK: Tris 50 mM; pH final foi 5,5; hidroxilamina 100 mM (NH2OH); MgCl2 10 mM; ATP 7 mM; NAG 70 mM.

Esta mistura principal foi subdividida em poços individuais em uma placa de 96 poços (volume final de 200 uL/poço), e a seguir concentrações variadas de arginina (0,15 mM a 10 mM) foram então adicionadas aos poços individuais.

As reações de enzima foram então iniciadas pela adição da enzima NAGK (100 ng/mL). Após 30 minutos de 5 incubação a 37 ºC, a absorbância de cada amostra foi quantificada.

Uma reação controle sem arginina foi preparada e analisada juntamente.

Por este método, observa-se que a formação do produto (pela enzima NAGK) foi insensível à concentração de arginina com relação à faixa de concentrações testada.

Um gráfico destes dados é mostrado na figura 4, e os valores de absorbância numérica são mostrados na tabela 5. Tabela 5. Dados de absorbância principal para ensaio de enzima NAGK in vitro mostrados na figura 4. Arginina (mM) A540 nm 10 0,287 5 0,266 2,5 0,257 1,25 0,237 0,63 0,263 0,31 0,259 0,16 0,291 0 0,284

Plantas de milho contendo gene NAGK produzem número aumentado de grãos por planta As sementes de um evento com milho contendo o gene NAGK (#8057) foram plantadas em um ambiente de pesquisa externa juntamente com os controles segregantes negativos.

Um total de 5 lotes (média de 55 plantas por lote) foram crescidos tanto para linhagem transgênica quanto controle.

As práticas típicas do campo foram usadas durante o crescimento destas plantas, com a exceção de que o nitrogênio suplementar não foi aplicado antes do plantio.

No final da estação de crescimento, o rendimento total dos grãos (ajustado para 15 % de umidade do grão) foi medido para todas as plantas em cada lote.

Adicionalmente, o número médio de fileiras de sementes por espiga (10 plantas por lote) e o número médio de sementes por fileira (10 plantas por lote) foi registrado e os dados são mostrados na tabela 6.

Tabela 6. Rendimento do grão, fileiras por espiga, sementes por fileira para evento 8057 com NAGK.

Genótipo Rendimento do grão Fileiras por Espiga Sementes por Fileira (Alqueire/Acre @ 15 % de umidade)(+/- Desvio padrão) (+/-Desvio padrão) (+/-Desvio padrão) NAGK 177,6 +/- 30,4 13,8 +/- 0,4 39,2 +/- 2,4 Controle 143,2 +/- 19,3 13,3 +/- 0,1 33,8 +/- 1,7

Plantas de milho contendo gene NAGK produzem número aumentado de espigas por planta 5 A espiga de um evento de milho T0 contendo o gene NAGK (#8644) foi polinizada com uma linhagem natural, e as sementes T1 foram coletadas.

A seguir, 4 plantas segregantes positivas T1 foram crescidas em condições de estufa até a maturidade.

O número de espigas que foi gerado por cada uma das plantas T1 foi registrado e os dados são mostrados na tabela 7. Tabela 7. Número de espigas por planta para o evento 8644 com NAGK.

Genótipo Número da planta Número de espigas na planta NAGK Planta T1 #1 2 NAGK Planta T1 #2 3 NAGK Planta T1 #3 3 NAGK Planta T1 #4 3

A descrição e os desenhos precedentes compreendem modalidades ilustrativas das presentes invenções.

As modalidades e os métodos precedentes aqui descritos podem variar com base na capacidade, experiência e preferência dos versados na técnica.

Apenas listar as etapas do método em uma certa ordem não constitui nenhuma limitação na ordem das etapas do método.

A descrição e os desenhos precedentes apenas explicam e ilustram a invenção, e a invenção não se limita a estes.

Os versados na técnica que apresentaram a revelação anterior serão capazes de realizar modificações e variações aqui, sem fugir do escopo da invenção.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 3

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES

1. Planta, célula de planta, material de planta ou semente de planta, caracterizada(o) pelo fato de que compreende um gene NAGK insensível à arginina, que é exógeno ou heterólogo para a dita Planta, célula 5 de planta, material de planta ou semente de planta.

2. Planta, caracterizada pelo fato de que foi regenerada a partir de uma célula ou semente de planta, como definida na reivindicação 1.

3. Planta de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita planta exibe eficiência melhorada de uso do nitrogênio comparada a uma planta tipo selvagem cultivada nas mesmas condições.

4. Método para melhorar a eficiência de utilização de nitrogênio em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de transformar a planta com pelo menos um gene NAGK insensível à arginina.

5. Sequência de NAGK, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: a) a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1; b) uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, em que a dita sequência de nucleotídeos modula o uso do nitrogênio em uma planta; c) a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e, d) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a dita sequência de nucleotídeos modula o uso do nitrogênio em uma planta.

6. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: a) a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1; b) uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, em que a dita sequência de 5 nucleotídeos modula o uso do nitrogênio em uma planta; c) a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e, d) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a dita sequência de nucleotídeos modula o uso do nitrogênio em uma planta.

7. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma sequência promotora de DNA 5’ e uma sequência terminadora 3’, em que a sequência de nucleotídeos, a sequência promotora de DNA, e a sequência terminadora são acopladas operativamente para transmitir a transcrição da sequência de nucleotídeos.

8. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a sequência promotora é selecionada do grupo que consiste em promotores constitutivos de planta e promotores específicos de tecido.

9. Anticorpo policlonal, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo policlonal para uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.

10. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende uma planta transformada por pelo menos uma primeira sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: a) a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1; b) uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, em que a dita sequência de nucleotídeos modula o uso do nitrogênio em uma planta; c) a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e, 5 d) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a dita sequência de nucleotídeos modula o uso do nitrogênio em uma planta

11. Planta de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o planta é selecionada do grupo que consiste em milho (grão de milho); sorgo; trigo; girassol; tomate; crucíferas; pimentas; batata; algodão; arroz; soja; beterraba; cana de açúcar; tabaco; cevada; e colza; Brassica sp.; alfafa; centeio; milheto; cártamo; amendoins; batata doce; mandioca; café; coco; abacaxi; cacau; chá; banana; abacate; figo; goiaba; manga; oliva; mamão papaia; caju; macadâmia; amêndoa; aveias; vegetais; gramíneas; vegetais, incluindo, mas sem limitação, cebolas, tomates, alface, vagem, feijão espadinho, ervilhas, e elementos do gênero Curcumis tais como pepino, melão rosado e melão de casca de carvalho; plantas ornamentais, incluindo, mas sem limitação, azaléia, hortência, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravos, poinsétia e crisântemo; árvores de oleaginosas; palmeiras e coníferas.

12. Parte, caracterizado pelo fato de que é componente de uma planta como definida na reivindicação 11.

13. Semente de planta, caracterizada pelo fato de que é produzida a partir de uma planta como definida na reivindicação 11.

14. Semente de planta, caracterizada pelo fato de que é transformada por um vetor como definido na reivindicação 6.

15. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula hospedeira transformada por pelo menos uma primeira sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: a) a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1; b) uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, em que a dita sequência de 5 nucleotídeos modula o uso do nitrogênio em uma planta; c) a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e, d) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a dita sequência de nucleotídeos modula o uso do nitrogênio em uma planta.

16. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira compreende adicionalmente pelo menos uma segunda sequência de nucleotídeos selecionada de (a), (b), (c) ou (d), em que a dita primeira e a dita segunda sequência de nucleotídeos não são idênticas.

17. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em células bacterianas e células de planta.

18. Construto de vetor, caracterizado pelo fato de que compreende: a) pelo menos uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: i) a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1; ii) uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, em que a dita sequência de nucleotídeos modula o uso do nitrogênio em uma planta; iii) a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e, iv) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a dita sequência de 5 nucleotídeos modula o uso do nitrogênio em uma planta; b) uma sequência promotora de DNA 5’ e, c) uma sequência terminadora 3’, em que a sequência de nucleotídeos, a sequência promotora de DNA, e a sequência terminadora são acopladas operativamente para transmitir a transcrição da sequência de nucleotídeos.

19. Construto de vetor de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada de (a)(i), (a)(ii), (a)(iii), ou (a)(iv), em que as sequências de aminoácidos codificadas pelas ditas primeiras e ditas segundas sequências de nucleotídeos não são idênticas.

20. Método para expressar uma molécula de ácido nucleico que modula o nitrogênio em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de fornecer uma planta transgênica ou semente de planta transformada por um construto de vetor como definido na reivindicação 1, e crescer a planta transgênica, ou uma planta crescida a partir da semente de planta transgênica, em condições eficientes para expressar a molécula de ácido nucleico na dita planta transgênica ou na dita planta crescida a partir da semente de planta transgênica.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a expressão da molécula de ácido nucleico é eficiente para aliviar uma limitação, de maneira tal que o rendimento seja aumentado na dita planta transgênica ou na dita planta crescida a partir da semente de planta transgênica.

22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a expressão da molécula de ácido nucleico é eficiente em aumentar a eficiência da utilização de nitrogênio na dita planta transgênica ou na dita planta crescida a partir da semente de planta transgênica. 5

23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada do grupo que consiste em milho (grão de milho); sorgo; trigo; girassol; tomate; crucíferas; pimentas; batata; algodão; arroz; soja; beterraba; cana de açúcar; tabaco; cevada; e colza; Brassica sp.; alfafa; centeio; milheto; cártamo; amendoins; batata doce; mandioca; café; coco; abacaxi; cacau; chá; banana; abacate; figo; goiaba; manga; oliva; mamão papaia; caju; macadâmia; amêndoa; aveias; vegetais; gramíneas; vegetais, incluindo mas sem limitação, cebolas, tomates, alface, vagem, feijão espadinho, ervilhas, e elementos do gênero Curcumis tais como pepino, melão rosado e melão de casca de carvalho; plantas ornamentais, incluindo, mas sem limitação, azaléia, hortência, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravos, poinsétia e crisântemo; árvores de oleaginosas; palmeiras e coníferas.

24. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a expressão da molécula de ácido nucleico é eficiente para melhorar a tolerância ao estresse na dita planta transgênica ou na dita planta crescida, a partir da semente de planta transgênica.

25. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a expressão da molécula de ácido nucleico é eficiente para alterar a morfologia na dita planta transgênica ou na dita planta crescida, a partir da semente de planta transgênica.

26. Planta de milho transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma planta de milho inicial transformada por um gene NAGK que melhora a eficiência de utilização de nitrogênio em milho, em que a planta de milho transformada apresenta um número de grãos aumentado com relação á planta de milho inicial.

27. Planta de milho transgênica de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o número de grãos aumentado é o resultado tanto de um número médio aumentado de sementes por espiga quanto de um número médio aumentado de espigas por planta ou ambos.

28. Método para melhorar o número de grãos em uma planta de milho, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de introduzir no genoma da planta um gene NAGK que melhora a eficiência de utilização de nitrogênio, e crescer a planta transformada para produzir o grão.