CN102711445B - 具有改良的氮利用和胁迫耐性的植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及转基因植物，其具有增加的氮利用效率、胁迫耐性和/或减轻限制从而增加产量，或者这些的组合，并且已利用包括调节植物中的氮利用的合成N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)基因的新载体构建体转化所述转基因植物。本发明还包括分离自细菌菌株的精氨酸不敏感型NAGK的过量表达和酶促表征，所述NAGK改良胁迫耐性和氮摄取、代谢或者这两者。在各种实施方案中，所述载体构建体包括一种或多种核酸序列，包括SEQ ID NO:1。本发明还涉及用于转化植物的分离载体以及用于检测转化的植物的抗体。本发明还涉及在植物中表达核酸分子的方法，所述核酸分子对应调节植物中的氮利用或由氮条件调节的核酸序列。

Description

具有改良的氮利用和胁迫耐性的植物
技术领域
本申请要求2009年11月4日提交的美国专利申请系列号61/258,075的优先权。
本发明一般涉及具有改良的氮利用和胁迫耐性的植物，更具体地，涉及在植物中异源表达精氨酸不敏感型N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)，包括分离自细菌菌株的精氨酸不敏感型NAGK的过量表达和酶促表征，所述NAGK改良胁迫耐性和氮摄取、代谢或者这两者。
背景技术
植物在其营养生长和生殖生长阶段需要氮。氮通过土壤矿化、施用氮肥或者这二者而可为植物所利用。然而估计施用于农作物的50%-70%的氮从植物-土壤系统中流失[Peoples,M.B.et al.,“Minimizing Gaseous Losses ofNitrogen,”In Nitrogen Fertilizer in the Environment(Bacon,P.E.,ed.)MarcelDekker,pp.565-606(1995)]。氮是最昂贵的植物营养素之一，氮肥不总是可以合理成本获得，并且氮肥的过量施用可以导致环境挑战。玉米是通常需要氮肥以发挥其遗传潜力的农业重要植物的实例。
在植物细胞中，NAGK(N-乙酰谷氨酸激酶)进行导致产生精氨酸的生物合成途径中的第二步。重要地，已知几种植物和细菌NAGK酶被高浓度的精氨酸抑制(Bourrellier,2009;Llacer,2008;Lohmeier-Vogel,2005;Fernandez-Murga,2004)，这表明NAGK在植物中的精氨酸调节中起作用。此外，据证实植物P-II蛋白可以减轻基于精氨酸的NAGK抑制。已知P-II在调节植物中的碳和氮流量中起作用(Bourrellier,2009;Llacer,2008)。
上调植物中的精氨酸生物合成途径的一种方法是减少或消除精氨酸对NAGK的抑制。这可以通过在植物中异源表达精氨酸不敏感型NAGK酶来实现。这里，我们描述分离自细菌菌株的精氨酸不敏感型NAGK的过量表达和酶促表征。
发明概述
本发明涉及转基因植物，该植物具有增加的氮利用效率、胁迫耐性或者这两种性质，其已经利用新载体构建体转化，所述新载体构建体包括调节植物中氮利用的精氨酸不敏感型NAGK核酸序列。在细菌菌株文库中鉴定各种NAGK核酸序列，其中一些为新NAGK基因。鉴定用于本发明的NAGK基因的可选方法是已在公共数据库中存档的几种细菌和植物基因组测序项目，由此可以选择编码具有强活性的NAGK酶的序列。本发明还涉及用于转化植物的分离载体以及用于检测所关注的核苷酸序列在转化植物中的表达的抗体。本发明还涉及在植物中表达核酸分子的方法，所述核酸分子对应调节植物中的氮利用的核酸序列。
具体地，已利用核苷酸序列SEQ ID NO:1及其变体、片段和互补体构建用于转化植物和细菌细胞的载体。这些载体包括5’DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述核酸序列、所述DNA启动子序列和所述终止子序列可操作地连接以允许所述核苷酸序列的转录。在一些实施方案中，所述启动子序列可以是组成型植物启动子或组织特异性启动子。
本发明还包括多克隆抗体，其包含针对SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的多肽的多克隆抗体。
本发明还包括用选自SEQ ID NO:1及其变体和片段的核苷酸序列转化的植物。所述植物选自玉米(corn)(玉米(maize))、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、和油菜、芸苔属(Brassica sp.)、苜蓿、黑麦、小米(millet)、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、草(例如草坪草、饲草或牧草)、观赏植物、树(例如果树、坚果树、pulp tree、油棕)以及针叶树。本发明还包括这类植物的组成部分、从这类植物产生的植物种子以及用本发明的载体构建体转化的植物种子。
本发明还包括用核苷酸序列SEQ ID NO:1转化的宿主细胞。所述宿主细胞可以是细菌细胞或植物细胞。
本发明还包括一种表达调节植物中的氮的核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：提供用本发明的载体构建体转化的转基因植物或植物种子，并且使所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物在有效条件下生长，所述条件是在所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物中有效表达所述核酸分子的条件。转基因植物的生长有效增加所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物的氮摄取，和/或增加所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物的氮利用效率，和/或减轻限制，从而在所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物中提高产量。本发明还包括前述方法，其中提供转基因植物或者提供转基因种子。本发明还包括前述方法，其中所述植物选自玉米(corn)(玉米(maize))、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、和油菜、芸苔属、苜蓿、黑麦、小米、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、草(例如草坪草、饲草或牧草)、观赏植物、树(例如果树、坚果树、pulp tree、油棕)以及针叶树。
本发明还包括通过一种在植物中表达由氮调节的核酸分子来改良植物的胁迫耐性的方法，所述方法包括以下步骤：提供用本发明的载体构建体转化的转基因植物或植物种子，并且使所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物在有效条件下生长，所述条件是在所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物中有效表达所述核酸分子的条件。
本发明还包括通过一种在植物中表达由氮调节的核酸分子来改变植物的形态学的方法，所述方法包括以下步骤：提供用本发明的载体构建体转化的转基因植物或植物种子，并且使所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物在有效条件下生长，所述条件是在所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物中有效表达所述核酸分子的条件。
本发明还包括载体构建体，其包含编码NAGK氨基酸序列SEQ ID NO:2的核苷酸序列、5’DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述核酸序列、所述DNA启动子序列和所述终止子序列可操作地连接以允许所述核苷酸序列的转录。
本发明还包括载体构建体，其包含调节植物中的氮的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列为SEQ ID NO:1的序列；与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少85%序列相同性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列调节植物中的氮；编码NAGK氨基酸序列SEQ ID NO:2的核苷酸序列；以及编码与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85%序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列调节植物中的氮，其中所述构建体还包含5’DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述核苷酸序列、所述DNA启动子序列和所述终止子序列可操作地连接以允许所述核苷酸序列的转录。
附图说明
图1为pAX4389的载体图。
图2为NAGK体外酶测定的图；用酶滴定。将NAGK酶加入底物(NAG)导致以酶依赖性方式形成产物。
图3为NAGK体外酶测定的图；用底物滴定。将NAGK酶加入不同浓度的底物(NAG)导致以底物依赖性方式形成产物。
图4为NAGK体外酶测定的图；用精氨酸滴定。NAGK酶的产物形成对测试浓度范围中的精氨酸的存在不敏感。
优选实施方案详述
更有效利用氮的植物品种的开发会降低氮的过量投入，节约农场主的生产成本，帮助不能获得肥料投入的发展中国家的农场主获益，并且降低与施用过量氮肥相关的环境污染。一种已用于开发具有改良的氮利用的植物品种的方法依赖于常规的植物育种技术。但是，由于遗传重组中缺少规范，这类方法的成功变化不定。
需要开发更有效地吸收和利用氮的植物栽培种。植物学家已采用简略语氮利用效率(NUE)，并且已开发各种测量和评价NUE的方法[Craswell,E.T.and Godwin,D.C.(1984)The efficiency of nitrogen fertilizers applied tocereals grown in different climates.In Advances in Plant Nutrition(Vol.1)(Tinker,P.B.and Lauchli,A.,eds),pp.1–55,Praeger Publishers;Steenbjerg,F.and Jakobsen,S.T.(1963)Plant nutrition and yield curves.Soil Sci.95,69–90;Siddiqi,M.Y.and Glass,D.M.(1981)Utilization index:a modified approach tothe estimation and comparison of nutrient utilization efficiency in plants.J. Plant Nutr.4,289–302;Moll,R.H.et al.(1982)Analysis and interpretation offactors which contribute to efficiency of nitrogen utilization.Agron.J.74,562–564]。在具体定义和使用的上下文中有差异。例如，一些定义基于总生物量，而其它定义基于产生的谷物的重量。另一组定义使用从土壤提取氮的效率。用来改良谷物产量所施用的氮的效率可以通过农学利用率(AE)即生理学效率与利用效率的乘积来测量，或者通过摄取效率与利用效率的乘积NUEg来测量。其它定义将生理学因素考虑在内。
如本说明书所用，术语氮利用效率或NUE定义为包括在同化途径中任何主要氮代谢库大小的可测量变化(例如，可以包括一种或多种以下物质的可测量变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)，或者植物示出在较低的施氮肥水平提供相同或提高的生物量或可收获产量，或者植物示出当与未用本发明的氮调节核酸构建体转化的植物相比时在相同施氮肥水平提供提高的生物量或可收获产量。“可测量变化”可以包括氮同化途径的任何组分(“代谢库”)的量的增加或减少。变化可以包括所述途径中一个或多个代谢库的减少或增加，或者一个或多个库的减少伴随一个或多个其他库的增加，例如当氮同化途径中的一种中间体用于产生另一中间体或者所述途径的产物时。例如，在谷氨酸至谷氨酰胺的转化中，谷氨酸的水平可以降低，而谷氨酰胺的水平可以升高。因此，虽然不受任何具体理论或机制的束缚，这些库中的一个或多个的任何变化均表明氮被植物更有效地利用。
氮利用效率的增加可以与同化途径中任何主要氮代谢库大小的约5%、约10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、约200%或更大的可测量变化相关。在一实施方案中，本发明的转基因植物在与不含本发明的氮调节序列的植物相比时从环境摄取增加的氮。“氮调节序列”是指通过非限制性实例的方式调节NUE的核苷酸或氨基酸序列：通过产生影响NUE的酶，或者通过产生与参与NUE的组分相互作用的蛋白，或者通过产生影响调节NUE的内部稳态信号级联的蛋白，或者通过这些机制的组合。本发明还提供通过在植物内表达一种或多种氮调节核苷酸序列来改良植物中的胁迫耐性的方法。在一实施方案中，所述氮调节核苷酸序列为SEQ ID NO:1或者其变体和片段。在另一实施方案中，所述氮调节核苷酸序列为编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列，或者其变体和片段。
如本文所用，术语“胁迫”或“胁迫条件”是指植物、植物细胞等暴露于对植物的代谢、生长、发育、繁殖和/或存活(统称“生长”)具有不利影响的物理、环境、生物学或化学物质或条件。胁迫可以通过例如环境因素如水(例如，淹水、干旱、脱水)，厌氧条件(例如，低水平氧)，异常渗透条件，盐度或温度(例如，高热/温热、寒冷、严寒、霜冻)，缺乏营养素如氮、磷酸盐、钾、硫、微量营养素，或者暴露于污染物，或者通过激素、第二信使或其它分子来施加于植物。例如，厌氧胁迫是由于足以产生胁迫应答的氧水平降低(低氧或缺氧)。淹水胁迫可以是由于植物、植物部分、组织或分离的细胞在液体介质中长期或短暂浸泡，例如在季风、雨季、洪水或过度灌溉植物等期间发生。寒冷胁迫或热胁迫可以分别是由于温度从特定植物物种的最佳生长温度范围降低或升高而发生。本领域技术人员容易地确定或已知这类最佳生长温度范围。脱水胁迫可以由细胞、组织、器官或整个植物的水分丧失、膨压降低、或水含量降低而诱导。干旱胁迫可以由水的匮乏或者供给细胞、组织、器官或生物体的水减少而诱导或与之相关。盐水胁迫(盐胁迫)可以与细胞的胞内或胞外环境的渗透压波动相关或者由其诱导。渗透胁迫也可以与例如植物细胞的胞内或胞外环境中分子浓度的变化相关或者由其诱导，特别是在所述分子不能穿过植物细胞膜的情况下。
胁迫耐性的改良可以通过在给定胁迫条件下对植物性能进行任何定量或定性测量来评价，并且与在相同胁迫条件下生长的未用本发明的氮调节序列转化的植物的性能进行对比。因此，所述植物可表现出改良的氮含量、改变的氨基酸或蛋白组成、改变的碳水化合物组成、改变的油组成、健壮的生长特征、增加的营养体产量(vegetative yield)或者更好的种子产量和质量。这些植物可以通过检测以下任何参数来鉴别：1)生长速度，根据鲜重或干重的增长速度来测量；2)成熟植物的营养体产量，根据鲜重或干重测量；3)种子或果实产量；4)种子或果实重量；5)植物的总氮含量；6)果实或种子的总氮含量；7)植物的游离氨基酸含量；8)果实或种子的游离氨基酸含量；9)植物的总蛋白含量；10)果实或种子的总蛋白含量；11)碳水化合物或油的可测量变化。检测这些参数的程序和方法是本领域技术人员公知的。这些方法可以包括测量酶/蛋白水平的酶促测定和免疫测定；测量各种植物组织的氨基酸组成、游离氨基酸库或总氮含量的测定；根据鲜重随时间的增加测量生长速度；或者根据总干重和/或总种子重量测量植物产量。
细菌和植物细胞的转化
本文提供新核苷酸序列，其调节植物中的氮利用效率。本文还提供本发明的蛋白的氨基酸序列，其可以调节氮或者由氮浓度调节。
可以对本发明的氮调节核苷酸序列进行修饰以获得或增强在植物细胞中的表达。本发明的氮调节序列可以在表达盒中提供，用于在所关注的植物中表达。“植物表达盒”包括能够导致在植物细胞中从开放阅读框表达蛋白的DNA构建体。所述盒包括5′-3′转录方向的与本发明的DNA序列可操作地连接的转录起始区(即，启动子)，以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即，终止区)。所述盒可以额外地包含待共转化入生物体的至少一种其他基因，如选择标记基因或不同功能的堆叠基因。或者，所述其他基因可以提供在多表达盒上。这样的表达盒具有多个限制位点，用于插入所述氮调节序列使之在调节区的转录调节下。
“启动子”是指发挥指导下游编码序列转录的功能的核酸序列。启动子与其他转录和翻译调节核酸序列(也称作“控制序列”)一起对于所关注的DNA序列的表达是必需的。优选地，启动子是已知在引入本发明的核苷酸序列的生物体中刺激转录的启动子。
启动子对于植物宿主和/或本发明的DNA序列可以是天然的或类似的，或者是外源的或异源的。此外，启动子可以是天然序列或者可选地是合成序列。当启动子对于植物宿主是“天然的”或“同源的”时，是指所述启动子在引入该启动子的天然植物中发现。当启动子对于本发明的DNA序列是“外源的”或“异源的”时，是指所述启动子不是可操作地连接的本发明的DNA序列的天然或天然存在的启动子。“异源”一般是指核酸序列，所述核酸序列对于其存在的细胞或部分天然基因组不是内源的，并且已通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微轰击（microprojection）等加入细胞。“可操作地连接”是指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列起始并介导对应于所述第二序列的DNA序列的转录。通常，“可操作地连接”表示连接的核酸序列是相邻的，包括外显子和内含子，并且在必需连接两个蛋白编码区时是相邻且位于相同阅读框中的。
在一实施方案中，所述启动子为组成型启动子。用于植物的合适的组成型启动子包括：来自植物病毒的启动子，如花生褪绿条死病花椰菜花叶病毒(peanut chlorotic streak caulimovirus，PClSV)启动子(美国专利第5,850,019号)；来自花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)的35S启动子(Odell et al.(1985)Nature313:810-812)；小球藻病毒甲基转移酶基因的启动子(美国专利第5,563,328号)和来自玄森花叶病毒(FMV)的全长转录启动子(美国专利第5,378,619号)；来自如水稻肌动蛋白这样的基因的启动子(McElroy et al.(1990)Plant Cell2:163-171)；泛素(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)，包括TrpPro5启动子(美国专利申请第10/377,318号；于2005年3月6日提交)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723-2730)；玉米H3组蛋白(Lepetit etal.(1992)Mol.Gen.Genet.231:276-285和Atanassova et al.(1992)Plant J.2(3):291-300)；甘蓝型油菜(Brassica napus)ALS3(PCT申请WO97/41228)；以及各种农杆菌(Agrobacterium)基因的启动子(参见美国专利号4,771,002；5,102,796；5,182,200；以及5,428,147)。
在另一实施方案中，所述启动子为组织特异性启动子。常用的组织特异性启动子的列表可以在Moore et al.(2006)Plant J.45(4):651-683中的综述中找到，该文献整体援引加入本文。
通常，这类构建体还包含5′和3′非翻译区。这类构建体可以包含“信号序列”或“前导序列”以促进所关注的肽的共翻译或翻译后转运至某些胞内结构如叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体或者被分泌。例如，可以将基因工程化为包含信号肽以促进肽转移至内质网。“信号序列”是指已知或推测导致共翻译或翻译后的肽转运穿过细胞膜的序列。在真核细胞中，这通常包括分泌入高尔基体，导致一些糖基化。“前导序列”是指任何这样的序列，当其翻译时导致氨基酸序列足以触发肽链共翻译转运至亚细胞细胞器。因此，其包括通过进入内质网，进入液泡、包括叶绿体的质体、线粒体等来靶向转运和/或糖基化的前导序列。还可以优选工程化植物表达盒以包含内含子，从而所述内含子的mRNA加工是表达所需的。
“3′非翻译区”是指位于编码序列下游的核苷酸序列。多腺苷酸化信号序列以及编码能够影响mRNA前体3′末端添加聚腺苷酸束的调节信号的其它序列是3′非翻译区。“5′非翻译区”是指位于编码序列上游的核苷酸序列。
其它上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是增加启动子区表达的核苷酸序列。增强子是本领域公知的，并且包括但不限于SV40增强子区和35S增强子元件。
终止区与转录起始区可以是天然的，可以与本发明的氮调节序列是天然的，或者可以衍生自另一来源。方便的终止区可得自根癌农杆菌（A.tumefaciens）的Ti-质粒，如章鱼碱合酶及胭脂氨酸合成酶终止区，或者马铃薯蛋白酶抑制剂II序列(PinII)，如Liu et al.(2004)Acta Biochim BiophysSin36(8):553-558所述。还参见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144;Proudfoot(1991)Cell64:671-674;Sanfacon et al.(1991)GenesDev.5:141-149;Mogen et al.(1990)Plant Cell2:1261-1272;Munroe et al.(1990)Gene91:151-158;Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903;和Joshi et al.(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639。
在适当情况下，可以优化基因以增加在转化的宿主细胞中的表达。即，基因可以使用改良表达的宿主细胞优选密码子来合成，或者可以使用宿主优选的密码子使用频率的密码子来合成。一般来说，基因的GC含量会增加。参见例如Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11，讨论宿主优选的密码子使用。本领域已知合成宿主优选的基因的方法。参见例如美国专利号6,320,100；6,075,185；5,380,831；和5,436,391，美国公开申请号20040005600和20010003849，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498，所述文献援引加入本文。
在一实施方案中，所关注的核酸靶向叶绿体以表达。在这种方式中，当所关注的核酸未直接插入叶绿体时，表达盒会额外地包含编码转运肽的核酸以指导所关注的基因产物到达叶绿体。这类转运肽是本领域已知的。参见例如Von Heijne et al.(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126;Clark et al.(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550;Della-Cioppa et al.(1987)PlantPhysiol.84:965-968;Romer et al.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421;和Shah et al.(1986)Science233:478-481。
靶向至叶绿体的所关注的核酸可以优化为在叶绿体中表达，以解决植物细胞核与该细胞器之间密码子使用的差异。在这种方式中，所关注的核酸可以使用叶绿体优选的密码子来合成。参见例如美国专利第5,380,831号，其援引加入本文。
通常将这种“植物表达盒”插入“植物转化载体”。“转化载体”是指高效转化细胞所必需的DNA分子。这样的分子可以由一个或多个表达盒组成，并且可以组织成一个以上“载体”DNA分子。例如，二元载体是这样的植物转化载体，其利用两个不相邻的DNA载体编码植物细胞转化所有必需的顺式和反式作用功能(Hellens and Mullineaux(2000)Trends in PlantScience5:446-451)。“载体”是指设计为在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有在外源细胞中掺入、整合及表达异源DNA序列或片段的能力的载体。
这种植物转化载体可以包含实现植物转化所需的一种或多种DNA载体。例如，本领域通常利用包含一个以上连续DNA节段的植物转化载体。在本领域中这些载体通常称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现高效转化所需的DNA节段的大小和复杂性非常大，并且有利于区别不同DNA分子的功能。二元载体通常包含质粒载体，所述质粒载体包含T-DNA转移所需的顺式作用序列(如左边界和右边界)、工程化以能够在植物细胞中表达的选择标记，以及“所关注的核苷酸序列”(工程化以能够在期望产生转基因植物的植物细胞中表达的核苷酸序列)。在这种质粒载体上还存在细菌复制所需的序列。顺式作用序列以允许高效转移入植物细胞并在其中表达的方式排列。例如，选择标记基因和所关注的基因位于左边界和右边界之间。通常第二质粒载体包含反式作用因子，其介导T-DNA从农杆菌转移至植物细胞。如本领域所理解，这种质粒通常包含毒力功能(Vir基因)，其允许农杆菌感染植物细胞，并且通过在边界序列切割以及vir-介导的DNA转移来转移DNA(Hellens andMullineaux(2000)Trends in Plant Science,5:446-451)。几种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以用于植物转化。所述第二质粒载体对于通过其它方法如显微轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等转化植物不是必需的。
可用于本发明的构建体中的改变或改良的变体
据认为在本发明中有用的核苷酸和氨基酸序列可以通过各种方法改变，并且这些改变可以导致编码蛋白的序列，所述蛋白具有与本文公开的氮调节序列编码的蛋白不同的氨基酸序列。
在本发明中有用的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示的序列及其变体、片段和互补体。如本文所用，术语“核苷酸序列”或“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及利用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选为双链DNA。“互补体”是指与给定核苷酸序列充分互补的核苷酸序列，由此其可以杂交至所述给定核苷酸序列，从而形成稳定的双链体。由这些核苷酸序列编码的氮调节蛋白的相应氨基酸序列如SEQID NO:2所示，以及其变体和片段。本发明还涵盖核酸分子的用途，所述核酸分子包含编码部分长度的氮调节蛋白的核苷酸序列及其互补体。
作为这些氮调节核苷酸序列的片段的核酸分子在本发明中也是有用的。“片段”是指编码氮调节蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码氮调节蛋白的生物学活性部分，或者其可以是在下文所公开的方法中可以用作杂交探针或PCR引物的片段。根据预期用途，是氮调节核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约15、20、50、75、100、200、300、350或至少约400个连续的核苷酸，或者多达本文公开的全长氮调节核苷酸序列中存在的核苷酸的数目。“连续”核苷酸是指互相紧密相邻的核苷酸残基。
作为这些氮调节多肽的片段的多肽在本发明中也是有用的。“片段”是指编码SEQ ID NO:2所示的氮调节蛋白的氨基酸序列的一部分，并且其保留氮利用效率。氮调节蛋白的生物学活性部分可以是这样的多肽，即例如长度为10、25、50、100、125、150、175、200、250、300、350、400或更多个氨基酸。这类生物学活性部分可以通过重组技术制备，并且评价其氮利用效率。如本文所用，片段包含SEQ ID NO:2的至少8个连续氨基酸。然而，本发明涵盖其他片段，例如大于约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸的任何蛋白片段。
本发明还涵盖变异核酸分子或变异氨基酸序列在本发明的方法和组合物中的用途。氮调节核苷酸序列的“变体”包括编码本文公开的氮调节蛋白但由于遗传密码的简并性而保守性不同的那些序列，以及与上文讨论的序列基本上相同的那些序列。天然存在的等位变体可以通过使用公知的分子生物学技术来鉴别，例如下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。如下文所讨论的，变异核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，其例如通过使用定点诱变技术产生，但是仍编码本发明公开的氮调节蛋白。在本发明中有用的变异蛋白是生物学活性的，即它们保留期望的天然蛋白生物学活性，即氮利用效率和/或改良的胁迫耐性。
“变体”是指具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少约60%、65%、约70%、75%、80%、85%、或者90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%相同的氨基酸序列的蛋白或多肽。变体还包括在严格条件下杂交至SEQ ID NO:1的核酸分子或其互补体的核酸分子编码的多肽。变体包括由于诱变而导致氨基酸序列不同的多肽。本发明涵盖的变异蛋白是生物学活性的，即它们继续具有期望的天然蛋白生物学活性，即保留氮利用效率和/或改良的胁迫耐性。
在本发明中有用的优选氮调节蛋白质由与SEQ ID NO:1的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列编码。术语“基本上相同”是指利用本文所述的对比程序之一使用标准参数与参考序列相比具有至少约60%或65%序列相同性、约70%或75%序列相同性、约80%或85%序列相同性、或者约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员会认识到可以对这些值适当调节以通过考虑到密码子简并性、氨基酸相似性、读框位置等因素确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应相同性。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的相同性百分比，对序列进行排列以进行最佳对比。两个序列之间的相同性百分比是所述序列共有的相同位置数的函数(即，相同性百分比=相同位置数/总位置数(例如，重叠位置)x100)。在一实施方案中，两个序列是相同长度的。两个序列之间的相同性百分比可以利用与下文所述的那些相似的技术来确定，允许或不允许缺口。在计算相同性百分比时，通常计算精确匹配。
两个序列之间的相同性百分比的确定可以利用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264的算法，如Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中修改。将这样的算法并入Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLASTN和BLASTX程序。BLAST核苷酸检索可以用BLASTN程序进行，score=100、wordlength=12，以获得与本发明氮调节核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以用BLASTX程序进行，score=50、wordlength=3，以获得与本发明氮调节蛋白同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对以进行比较，可以如Altschul et al.(1997)NucleicAcids Res.25:3389所述利用Gapped BLAST。或者，PSI-Blast可以用来进行重复检索，检测分子之间的距离关系。参见上文的Altschul et al.(1997)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一非限制性实例是ClustalW算法(Higgins et al.(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680)。ClustalW比较序列并比对完整的氨基酸或DNA序列，因此可以提供关于整个氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法用于几种可商购的DNA/氨基酸分析软件包，例如VectorNTI Program Suite的ALIGNX模块(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)。用ClustalW比对氨基酸序列后，可以确定氨基酸相同性百分比。用于分析ClustalW比对的软件程序的非限制性实例是GENEDOCTM。GENEDOCTM(Karl Nicholas)允许评价多种蛋白之间的氨基酸(或DNA)相似性和相同性。用于序列比较的数学算法的另一非限制性实例是Myers and Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法。这样的算法并入ALIGN程序(2.0版)，后者是GCG序列对比软件包(可获得自Accelrys,Inc.,9865Scranton Rd.,San Diego,California,USA)的部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表（weight residue table），缺口长度罚分为12，并且缺口罚分为4。
优选程序是GAP10版，其使用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的算法。GAP10版可以使用以下参数：核苷酸序列的%相同性和%相似性使用GAP Weight为50和Length Weight为3，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的%相同性和%相似性使用GAPWeight为8和Length Weight为2，以及BLOSUM62评分矩阵。还可以使用等价程序。“等价程序”是指任何序列比较程序，对于任何讨论的两个序列，当与通过GAP10版产生的相应比对比较时，所述程序产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配以及相同序列相同性百分比的比对。
技术人员会进一步理解可以通过突变将变化引入本发明的核苷酸序列，从而导致编码的氮调节蛋白的氨基酸序列变化，而不改变所述蛋白的生物学活性。因此，变体分离的核酸分子可以通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入本文公开的相应核苷酸序列来产生，从而将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码的蛋白。可以通过标准技术来引入突变，例如定点诱变和PCR介导的诱变。这类变异核苷酸序列也涵盖在本发明中。
例如，保守氨基酸取代可以在一个或多个预测的、优选非必需氨基酸残基进行。“非必需”氨基酸残基是在氮调节蛋白的野生型序列中可以改变但不改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物学活性所需的。“保守氨基酸取代”是其中用具有相似侧链的氨基酸残基代替氨基酸残基的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有无电荷极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保留功能的氨基酸取代可以在非保守区进行。通常，这类取代不会对保守氨基酸残基或位于保守基序内的氨基酸残基进行，这类残基是蛋白活性必需的。然而，本领域技术人员会理解功能变体可以在保守残基中具有少量保守或非保守改变。保守的以及蛋白活性必需的残基的实例包括例如，在已知参与氮同化的相似或相关序列的比对中包含的在所有蛋白之间均相同的残基。保守的但是可以允许保守氨基酸取代并仍保留活性的残基的实例包括例如，在已知参与氮同化的相似或相关序列的比对中包含的在所有蛋白之间仅具有保守取代的残基。
或者，变异核苷酸序列可以通过沿所有或部分编码序列随机引入突变来制备，例如通过饱和诱变，并且可以对所得的突变体筛选赋予氮利用效率的能力以鉴别保留活性的突变体。诱变之后，编码的蛋白可以重组表达，并且蛋白的活性可以利用标准测定技术来确定。
利用诸如PCR、杂交等的方法可以鉴别相应的氮调节序列，这类序列与本发明的序列基本上相同。参见例如，Sambrook J.,and Russell,D.W.(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)和Innis,et al.(1990)PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,NY)。在杂交方法中，所有或部分氮调节核苷酸序列可以用来筛选cDNA或基因组文库。构建这类cDNA和基因组文库的方法是本领域公知的，并且公开于上文的Sambrook and Russell,2001。
本发明的核苷酸或氨基酸序列的变体和片段一般编码保留全长氮调节蛋白的生物学活性的蛋白片段；即，保留氮利用效率。“保留氮利用效率”是指所述变体或片段具有如SEQ ID NO:2的本文公开的全长氮调节蛋白或者如SEQ ID NO:1的本文公开的全长氮调节核苷酸序列的至少约30%、至少约50%、至少约70%或者至少约80%的氮利用效率和/或胁迫耐性。监测氮利用效率的方法包括检测同化途径中任何主要氮代谢库大小的变化(例如，硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量的可测量变化)，或者检测当与不含或不表达本发明的氮调节序列的植物比较时，植物在较低的氮肥水平下提供相同或提高的产量的能力或者植物在相同氮肥水平下提供提高的产量的能力。“相同”或“较低”氮肥水平是指一般施用于不表达本发明的氮调节序列的植物的氮的水平。本领域已知大多数（如果不是全部）所关注的植物品种的足够的氮水平。其它指导可见于例如Hewitt(1966)Sand and Water Culture Methods Used in the Study of Plant Nutrition,2nd ed.,Farnham Royal(Bucks),Commonwealth Agricultural Bureaux;和Hewitt(1975)Plant Mineral Nutrition,London,English University Press。
在本发明中有用的多肽序列可以通过各种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。这类操作的方法是本领域公知的。例如，本文公开的氮调节蛋白的氨基酸序列变体可以通过核苷酸序列中的突变来制备。这还可以通过几种形式的诱变之一和/或定向进化实现。在一些方面，氨基酸序列中编码的变化基本上不影响蛋白的功能。这类变体会具有期望的氮利用效率。但是，应当理解本发明的氮调节序列改变或改良氮利用的能力可以通过使用这类技术在本发明组合物上进一步改良。例如，可以在DNA复制期间呈现高比率碱基错掺入的宿主细胞如XL-1Red(Stratagene,La Jolla,CA)中表达本文公开的核苷酸序列。在这类菌株增殖之后，可以分离DNA(例如通过制备质粒DNA，或者通过PCR扩增并将所得的PCR片段克隆入载体)，如本文其他地方所述将DNA转化入植物，并且测量氮利用效率。
或者，可以在氨基端或羧基端对许多蛋白的蛋白序列进行改变而基本不影响其活性。这可以包括通过现代分子学方法引入的插入、缺失或改变，所述分子学方法例如为PCR，包括通过在PCR扩增中使用的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列来改变或延伸蛋白编码序列的PCR扩增。或者，加入的蛋白序列可以包括完整的蛋白编码序列，如本领域常用来产生融合蛋白的那些序列。这类融合蛋白常用来(1)增加所关注的蛋白的表达，(2)引入结合结构域、酶促活性或表位以促进蛋白纯化、蛋白检测或本领域已知的其它实验用途，或者(3)将蛋白靶向分泌或翻译至亚细胞细胞器，例如革兰氏阴性细菌的周质空间或真核细胞的内质网，后者通常导致蛋白的糖基化。
本发明的变异核苷酸和氨基酸序列还涵盖衍生自诱变和重组方法如DNA改组的序列。使用这样的方法，一个或多个不同氮调节蛋白编码区可以用来产生具有期望特性的新氮调节蛋白。在这种方式中，重组多核苷酸文库从包含具有充分序列相同性的序列区域的一群相关序列多核苷酸产生，并且可以在体外或体内同源重组。例如，利用这种方法，编码所关注的结构域的序列基序可以在本发明中有用的氮调节序列与其它已知的氮调节序列之间改组以获得新序列，所述新序列编码具有改良的所关注的特性如改良的氮利用的蛋白。这样的DNA改组的方法是本领域已知的。参见例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751;Stemmer(1994)Nature370:389-391;Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15:436-438;Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272:336-347;Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509;Crameri et al.(1998)Nature391:288-291;以及美国专利第5,605,793号和第5,837,458号。
植物转化
本发明的方法包括将一个或多个氮调节核苷酸序列引入植物。在一些实施方案中，仅将一个本发明公开的氮调节序列引入植物。在其它实施方案中，引入至少2个、至少3个、至少4个或更多个所述序列。当引入多个序列时，每个核苷酸序列均不相同。如果两个核苷酸序列在至少一个核苷酸位置不同，则认为这两个核苷酸序列是不相同的。因此，不相同的核苷酸序列包括各自编码相同氨基酸序列的两个或多个不同核苷酸序列(例如，已经优化以在植物中表达的一个或多个)，以及编码至少两个不同氨基酸序列的两个或多个不同核苷酸序列。
“引入”是指以这样的方式向植物呈递包含一个或多个氮调节序列的一个或多个构建体，通过该方式所述构建体得以进入植物细胞的内部。本发明的方法不需要使用将核苷酸构建体引入植物的特殊方法，仅需要所述核苷酸构建体得以进入至少一个植物细胞的内部。将核苷酸构建体引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法以及病毒介导的方法。
一般来说，植物转化方法包括将异源DNA转移入靶植物细胞(例如不成熟或成熟胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，然后应用最大阈值水平的适当选择(取决于选择标记基因)以从一组未转化的细胞团回收转化的植物细胞。通常将外植体转移至新鲜供应的相同培养基并常规培养。随后，转化的细胞在放置于补充了最大阈值水平的选择剂(即抗生素，如壮观霉素和卡那霉素)的再生培养基上后分化为芽(shoot)。然后将该芽转移至选择性生根培养基以回收生根的芽或小植物。然后使该转基因小植物生长为成熟植物并产生能育种子(例如Hiei et al.(1994)The Plant Journal6:271-282;Ishida et al.(1996)Nature Biotechnology14:745-750)。通常将外植体转移至新鲜供应的相同培养基并常规培养。产生转基因植物的技术和方法的一般描述参见Ayres and Park(1994)Critical Reviews in Plant Science13:219-239和Bommineni and Jauhar(1997)Maydica42:107-120。因为转化的材料包含许多细胞，所述转化和未转化的细胞均存在于任何选定的靶愈伤组织或组织或细胞组中。杀死未转化的细胞并允许转化的细胞增殖的能力导致转化的植物培养物。通常，去除未转化的细胞的能力是对快速回收转化的植物细胞以及成功产生转基因植物的限制。然后分子和生物化学方法可以用来证实转基因植物的基因组中存在整合的所关注的异源基因。
转基因植物的产生可以通过几种方法之一进行，所述方法包括但不限于通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞(农杆菌介导的转化)、用附着至粒子的异源外源DNA轰击植物细胞，以及转移DNA的各种其它非粒子直接介导的方法(例如，Hiei et al.(1994)The Plant Journal6:271-282;Ishida et al.(1996)Nature Biotechnology14:745-750;Ayres and Park(1994)CriticalReviews in Plant Science13:219-239;Bommineni and Jauhar(1997)Maydica42:107-120)。
转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如，Svab et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:8526-8530;Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917;Svab and Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。所述方法依赖基因枪递送包含选择标记的DNA并通过同源重组将所述DNA靶向至质体基因组。此外，质体转化可以通过核编码和质体指导的RNA聚合酶的组织优选表达来反式激活沉默的质体携带转基因而实现。这样的系统已报道于McBride et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305。
细菌细胞的转化通过本领域已知的几种技术之一来实现，所述技术包括但不限于电穿孔或化学转化(参见例如，Ausubel,ed.(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,Indianapolis,IN)。赋予对毒性物质的抗性的标记可用于从未转化的细胞(不含或不表达检测DNA的那些细胞)鉴别转化的细胞(含有并表达检测DNA)。
在本发明的一方面，本发明的核苷酸序列可用作标记以评价细菌或植物细胞的转化。在这种方式中，转化通过如上文所述监测氮利用效率来评价。
植物细胞的转化可以相似方式完成。“植物”是指完整植物或植物的组成部分，包括植物器官(例如，叶、茎干、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚和后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指植物，在该植物细胞中已掺入或整合外源核酸序列或DNA片段。“稳定转化”是指引入植物的核苷酸构建体整合入该植物的基因组，并且能够被该植物的后代遗传。
已转化的细胞可以根据常规方式生长为植物。参见例如，McCormick etal.(1986)Plant Cell Reports5:81-84。然后使这些植物生长，用相同的转化植株或不同植株授粉，并且鉴别组成型表达期望的表型特征的所得杂交体。生长两个或更多个世代以确保期望的表型特征的表达得以稳定维持和遗传，然后收获种子以确保期望的表型特征的表达已实现。在这种方式中，本发明提供转化的种子(也称作“转基因种子”)，在其基因组中稳定掺入本发明的核苷酸构建体，例如本发明的表达盒。
通过调节氮利用增加植物产量的方法
本发明提供增加植物产量的方法。所述方法包括将本文公开的氮调节核苷酸序列引入植物或植物细胞，从而氮利用效率的增加对应植物产量的增加。如本文所定义，植物的“产量”是指植物产生的生物量的质量和/或数量，和/或可收获产量。“生物量”是指任何测量的植物产物(例如，植物的任何组成部分，如种子、茎、根、谷粒、叶等)。生物量生产的增加是测量的植物产物的产量的任何提高。可收获产量的增加是利用已知的收获方法容易地收集的较高重量的植物组分，或者收获的部分中所关注的化合物的组成量的增加：非限制性实例为每单位土地面积收获的氨基酸如赖氨酸的量。增加植物产量或可收获产量具有一些商业应用。例如，增加植物叶生物量可以增加人或动物消耗的叶类植物的产量。此外，增加叶生物量可以用来增加源自植物的药物或工业产品的生产。产量的增加可以包括任何统计显著的增加，包括但不限于与其中未引入本发明的调节氮利用的核苷酸序列的植物的产量相比，所述植物产量增加至少1%、至少3%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少70%、至少100%或更高。
植物
本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注的植物的实例包括但不限于玉米(corn)(玉米(maize))、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、和油菜、芸苔属(Brassica sp.)、苜蓿、黑麦、小米(millet)、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、草(例如草坪草、饲草或牧草)、观赏植物、树(例如果树、坚果树、pulp tree、油棕)以及针叶树。
蔬菜包括但不限于洋葱、番茄、莴苣、青豆、利马豆、豌豆，以及Curcumis属成员如黄瓜、甜瓜和香瓜。观赏植物包括但不限于杜鹃花、绣球花属植物、芙蓉属植物、玫瑰、郁金香、水仙花、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。优选地，本发明的植物为农作物(例如玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等)。
本发明特别适合单子叶植物家族的任何成员，包括但不限于玉米、水稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、薯蓣、洋葱、香蕉、椰子和椰枣(date)。
植物转化的评价
将异源外源DNA引入植物细胞后，植物基因组中异源基因的转化或整合通过各种方法证实，例如分析与整合基因相关的核酸、蛋白和代谢物。
PCR分析是在植入土壤之前的较早阶段筛选转化的细胞、组织或芽中掺入的核苷酸序列存在的快速方法(Sambrook and Russell(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)。利用所关注的基因或农杆菌载体背景等特异性的寡核苷酸引物进行PCR。
植物转化可以通过基因组DNA的DNA印迹分析来证实(上文的Sambrook and Russell,2001)。通常，从转化体中提取总DNA，用适当的限制酶消化，在琼脂糖凝胶中分级分离并转移至硝化纤维素或尼龙膜。然后根据标准技术将该膜或“印迹”用例如放射标记的32P靶DNA片段探测以证实植物基因组中引入的基因的整合(上文的Sambrook and Russell,2001)。
在Northern分析中，根据本领域常规使用的标准方法从转化体的特定组织中分离RNA，将其在甲醛琼脂糖凝胶中分级分离，印迹在尼龙滤膜上(上文的Sambrook and Russell,2001)。然后根据本领域已知的方法，通过将所述滤膜与源自本发明的多核苷酸的放射性探针杂交来检测本发明的核苷酸序列编码的RNA的表达(上文的Sambrook and Russell,2001)。
可以通过标准方法(上文的Sambrook and Russell,2001)，利用结合至所述氮调节蛋白上存在的一个或多个表位的抗体对所述转基因植物进行蛋白印迹和生物化学测定等，以确定氮调节基因编码的蛋白的存在。例如，通过本发明的方法产生的多克隆抗体可以用来检测氮调节蛋白的存在。
抗体
本发明还涵盖在本发明中有用的多肽或者其变体或片段的抗体。制备抗体的方法是本领域公知的(参见例如，Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.;美国专利第4,196,265号)。
实验
材料和方法
制备编码NAGK酶的合成基因(SEQ ID NO:1)。为了将NAGK蛋白定位在叶绿体中，将编码叶绿体转运肽的多核苷酸(SEQ ID NO:3)加至所述蛋白的N端。
NAGK蛋白的功能表征
利用K.A.Datsenko和B.L.Wanner(One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.PNAS97(12):6640-6645.2001)所述的方法从大肠杆菌(E.coli)DH5α构建argB(在大肠杆菌中编码NAGK)缺失菌株。Baba等人(T.Baba,T.Ara,M.Hasegawa,Y.Takai,Y.Okumura,M.Baba,K.A.Datsenko,M.Tomita,B.L.Wanner&H.Mori.2006.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-geneknockout mutants:the Keio collection Molecular Systems Biology2:2006.0008)所述的PCR引物用来产生argB基因的符合读框的缺失。在卡那霉素上选择突变体，随后通过FLP重组酶去除卡那霉素抗性盒。
将这种缺失菌株命名为DH5αΔargB。通过PCR扩增跨越该缺失的DNA片段，并且将PCR产物测序，证实该缺失的结构。如对缺少功能性NAGK酶的菌株预期的，这种菌株在丰富培养基(例如，LB、TB)上正常生长，但是不能在M63基本培养基上生长，除非该培养基补充了精氨酸或鸟氨酸。我们制备编码NAGK的合成基因以简化克隆步骤并提高玉米中的NAGK蛋白表达。此外，我们利用来自藻类莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的烯醇丙酮莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)基因的5'端的叶绿体转运肽(CTP)来引导NAGK酶定位至植物叶绿体。将包含所述合成基因的各种质粒、包含来自亲本细菌菌株ATX16042的NAGK基因的粘粒以及包含玉米谷氨酰胺合成酶基因的阴性对照质粒转化入大肠杆菌菌株DH5αΔargB。通过DNA小量制备和限制酶切消化来证实质粒的存在和性质。将包含质粒的菌株划线在M63琼脂培养基以及补充了鸟氨酸或精氨酸的M63上。将培养物在37℃下培养2天，并且评价生长。结果如下文表1所示。
表1–NAGK基因的功能表征
玉米中的蛋白过量表达
构建植物转化载体pAX4395以指导玉米中NAGK蛋白的过量表达。该载体利用Scubi4启动子和PinII终止子来引导过量表达包含融合至NAGK的衣藻(Chlamydomonas)EPSPS叶绿体前导区的蛋白。该载体中的第二个盒引导过量表达dsdA1基因，导致d-氨基酸氧化酶蛋白的积累。在植物转化之前将每个基因盒完全测序。
植物转化
pAX4395载体用来进行农杆菌介导的玉米转化。载体构建并转化农杆菌之后，通过本领域已知的方法DNA印迹证实该载体。然后使通过这些检测的阳性农杆菌菌株在固体培养基上生长以产生用于大规模转化实验的细胞。
通过电穿孔将载体pAX4395引入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株。这种菌株还包含载体pSB1，这允许pSB1和pAX4395在体内重组以产生可以指导NAGK盒插入玉米基因组的载体。重组载体pAG4395的形成通过这种农杆菌菌株的DNA印迹杂交来证实。
包含共整合的农杆菌菌株可以用来转化植物，例如，通过PureIntro方法(Japan Tobacco,Inc.)。共培养之后，使胚在包含d-丝氨酸的选择培养基上生长，以便鉴别已从pAG4395整合dsdA基因并表达d-氨基酸氧化酶蛋白的愈伤组织。然后将在丝氨酸的存在下从选择生长存活的个体事件移至再生培养基，并且利用本领域已知的方法使其生长至小植物阶段。
蛋白印迹分析
通过产生特异性结合至NAGK蛋白的抗体来检测这些植物中的NAGK表达。简单地说，将NAGK基因亚克隆入载体pRSF1b(Novagen)以允许大肠杆菌中在IPTG诱导后过量表达NAGK蛋白。该载体还在所述蛋白的N端引入6xHis标签。蛋白过量表达后，通过钴柱层析纯化NAGK蛋白，并且通过N端测序证实纯化的蛋白的性质。然后将纯化的蛋白用来免疫兔，免疫后42天开始收集血清。
然后，NAGK抗血清用来通过蛋白印迹分析评价转基因玉米植物中的蛋白表达。在温室中生长4周后，从个体植物采集叶样品，并且通过在水中研磨植物材料来制备蛋白提取物。通过Bradford测定确定各提取物中的蛋白浓度，并且将25ug的各提取物在具有4-12%梯度的聚丙烯酰胺凝胶上分离。将分离的蛋白转移至硝化纤维素，然后用1:5000稀释的兔抗血清探测。洗涤步骤后，使该硝化纤维素与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔(1:10,000稀释)接触，并且利用ECL检测试剂(GE Healthcare)使抗体复合物可见。4个代表性转基因事件(#8054,8055,8056,8057)各自表现出NAGK蛋白的强表达，而对照植物("Hi-II")未显示所述蛋白存在。重要的是注意在植物组织中检测的蛋白大小(～29kDa)与叶绿体前导区加工后的NAGK的大小(预测大小=29.2kDa)一致，而不是未加工的叶绿体前导区-NAGK融合蛋白(预测大小=36.9kDa)。
玉米氮分析
已开发一系列定量植物中的氮中间体的测定。这次氮测定方法描述于以前的专利文件(WO2008/051608“Plants with improved nitrogen utilizationand stress tolerance”)。这里这些测定用来分析总计10个包含NAGK基因的转基因植物。在温室中于土壤中生长4周后，将各植物采样(叶)。将这些叶样品加工以测定它们的硝酸盐、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、铵、总氨基酸、叶绿素以及总蛋白水平。所述分析中包括用仅包含dsdAl选择标记的构建体转化的植物(无NAGK)。这些植物同样在4周采样，并且称为“非GOI”植物。对两种类型的植物进行的氮测定的结果如下文表2所示。
表2–转移至土壤后4周NAGK对非GOI玉米事件的氮水平
这些数据证实我们设计的合成基因编码功能性NAGK酶。
NAGK过量表达载体的构建
以下NAGK DNA序列(SEQ ID NO:1)分离自侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)细菌分离菌：
ATGCTGCATGAGGTGATGGTGATCAAGTGCGGCGGCAGCATGCTGGAGCAGCTGCCGGAG
AGCTTCTACAACAAGCTGGCGACGCTGCAAGCAGAAGGAAGAAGCATCGTCATTGTTCAT
GGAGGAGGGCCGGCCATCAACCAGATGCTGGAGCAGCTGAAGATTGAGCCAACCTTCTCA
AATGGGCTGAGGGTGACAGATGAGCCAACAATGCAAGCTGTGGAGATGGTGCTCTCAGGG
CCCATCAACAAGCTGGTGGTGAGGAAGCTGCTGCACGCCGGCGGCAAGGCATGGGGCCTC
AGCGGCGTGGATGGAAGCCTGCTGCAAGCTGTTGAGAAGACTCAAGGCCTCGGCCTGGTG
GGCAGCATCACCGTGGTGGATCAAGCGCCGCTCCAGCTGCTGCTGAGCAATGGCTACATC
CCGGTGGTGTCTCCCATCGCCGTCTCAGAAGATGGAAGAACAAGATACAACTGCAACGCC
GACACCGTCGCCGGCGCCATTGCTTCAGCTCTCGGCGCCAAGCAGCTGCTGATGCTCACT
GATGTTCCTGGCATCTGGGCAGAAAATGAGCTGGGAGAGAAGCAGCTGCTGCCGACGGTG
ACAACAGAAGATATTCAGCTGATGATGAAGAACCAGATCATCACCGGCGGCATGATCCCC
AAGGTGCAAGCGGCGCTGGATGCTCTAGCTCAAGGAGTTCAAGAAGTGGTGATCTGCAAA
GGAGAAGCTGAGACGCTGGACGGCGTGGTGAAGGGCATGGCCGTCGGCACCTCCATCTCC
GCCGAGATGAGCAGAGGACAAGATTCTCAAGCCTTCATCAGCAACAAGGTGTGAGG
上文所示的NAGK DNA序列编码以下NAGK蛋白序列(SEQ IDNO:2)：
MLHEVMVIKC GGSMLEQLPE SFYNKLATLQ AEGRSIVIVH GGGPAINQML EQLKIEPTFS
NGLRVTDEPT MQAVEMVLSG PINKLVVRKL LHAGGKAWGL SGVDGSLLQA VEKTQGLGLV
GSITVVDQAP LQLLLSNGYI PVVSPIAVSE DGRTRYNCNA DTVAGAIASA LGAKQLLMLT
DVPGIWAENE LGEKQLLPTV TTEDIQLMMK NQIITGGMIP KVQAALDALA QGVQEVVICK
GEAETLDGVV KGMAVGTSIS AEMSRGQDSQ AFISNKV
将该DNA序列克隆入大肠杆菌表达载体pRSF-lb(Novagen,Inc.)以产生载体pAX4389。这个表达载体在所述蛋白的N端放置6-组氨酸标签，并且将NAGK基因的表达放置在病毒T7启动子的控制下。pAX4389的载体图如图1所示。
NAGK蛋白提取物的制备
将NAGK过量表达载体pAX4389转化入感受态大肠杆菌细胞(BL21*DE3,Invitrogen)，并且通过在抗生素卡那霉素上选择来获得单菌落。然后使单菌落在液体培养基(LB培养液)中生长，直至培养物吸光度(在600nm)达到0.6，随后加入0.5mM IPTG以诱导从T7启动子表达。诱导在16℃下进行过夜。第二天，将诱导的培养物离心，并且将沉淀在-20℃下冷冻2小时。在冰上解冻后，将沉淀重悬于1110th体积的裂解缓冲液(50mM Hepes,pH7.0,50mM NaC1)中，在室温下用溶菌酶(Novagen)处理30分钟，然后超声处理以裂解细胞。通过离心从可溶的蛋白提取物分离不溶的物质。然后将该蛋白提取物储存在冰桶中，并且不久之后准备NAGK酶测定。作为阴性对照，同时制备对照载体，其在相同基础载体(pRSF-1b)中指导细菌EPSPS酶的过量表达。将这个载体同样转化入相同的大肠杆菌细胞系，选择转化子菌落以过量表达蛋白，并且与NAGK同时制备蛋白提取物。
NAGK酶测定-用NAGK酶滴定
NAGK酶测定改编自Denes(1970)的方法。利用Spectramax190分光光度计在540nm定量产物形成。
用以下组分制备NAGK体外反应的预混液：50mM Tris,pH8.0；所述预混液的最终pH为5.5；100mM羟胺(NH2OH)；10mM MgC12；7mM ATP；70mM N-乙酰谷氨酸(NAG)。
将这种预混液分入96-孔板中的单孔(200uL/孔终体积)，然后通过将各种浓度的NAGK蛋白提取物加入各样品孔来起始反应。在37℃下温育1小时后，定量每个样品的吸光度。通过将所述提取物的稀释液与已知浓度的牛血清白蛋白标准品一起上样在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，然后用考马斯蛋白染色液(Simply Blue,Invitrogen)染色来估计所述提取物中NAGK蛋白的量。
通过这种方法，观察到加入浓度低至1ng/mL的NAGK蛋白提取物产生在540nm的吸收产物。吸光度由酶产物(N-乙酰谷氨酰-5-磷酸)与羟胺反应以产生吸收产物N-乙酰谷氨酰-5-氧肟酸所致。图(图1)和表(表3)示出6个不同浓度的NAGK蛋白各自的吸光度。从各NAGK吸光度值减去缓冲液对照产生的基线吸光度(A540=0.04)。高浓度的对照提取物(细菌EPSPS)产生的吸光度与缓冲液对照非常相似(A540=0.042)，这证实产物形成需要NAGK酶的存在。
表3—图1所示的NAGK体外酶测定的主要吸光度数据。
已从各值减去缓冲液对照的吸光度值(A540=0.040)。
NAGK(ng/mL) A540nm
1000 0.872
250 0.518
62.5 0.0159
15.6 0.039
3.9 0.002
1 0.001
NAGK酶测定-用底物(NAG)滴定
以下NAGK体外酶测定的预混液是为了将底物(NAG)滴定入反应而制备：50mM Tris；最终pH为5.5；100mM羟胺(NH2OH)；10mM MgC12；7mM ATP；1000ng/mL NAGK酶(来自蛋白提取物)。
将这种预混液分入96-孔板中的单孔(200uL/孔终体积)，然后通过将各种浓度的底物NAG加入各样品孔来起始反应。NAG浓度范围为1.6mM直至100mM。在37℃下温育1小时后，定量每个样品的吸光度。准备没有底物的对照反应并同时分析。
通过这种方法，观察到产物的形成(通过NAGK酶)是底物浓度依赖性的。在测试的最低底物浓度(NAG=1.6mM,3.1mM)，产生的产物的量大约与底物浓度成正比。在测试的最高底物浓度(NAGK=50mM,100mM)，底物是过量的，并且仅观察到产物形成的细微差别。这些数据的图如图3所示，并且数值吸光度值如表4所示。
表4—图3所示的NAGK体外酶测定的主要吸光度数据。
已从各值减去没有底物的对照反应的吸光度值(A540=0.041)。
NAG(mM) A540nm
100 0.57
50 0.515
25 0.411
12.5 0.313
6.3 0.0212
3.1 0.13
1.6 0.07
NAGK酶测定-用精氨酸滴定
以下NAGK体外酶测定的预混液是为了测定精氨酸对NAGK酶活性的影响而制备：50mM Tris；最终pH为5.5；100mM羟胺(NH2OH)；10mMMgC12；7mM ATP；70mM NAG。
将这种预混液分入96-孔板中的单孔(200uL/孔终体积)，然后将不同浓度的精氨酸(0.15mM-10mM)加入各孔。然后通过加入NAGK酶(100ng/mL)来起始酶反应。在37℃下温育30分钟后，定量每个样品的吸光度。准备没有精氨酸的对照反应并同时分析。
通过这种方法，观察到产物的形成(通过NAGK酶)在测试的浓度范围中对精氨酸的浓度不敏感。这些数据的图如图4所示，并且数值吸光度值如表5所示。
表5—图4所示的NAGK体外酶测定的主要吸光度数据。
精氨酸(mM) A540nm
10 0.287
5 0.266
2.5 0.257
1.25 0.237
0.63 0.263
0.31 0.259
0.16 0.291
0 0.284
包含NAGK基因的玉米植物每植物产生增加的谷物数量
将来自包含NAGK基因的玉米事件(#8057)的种子与阴性分离子对照一起种植在室外研究场地中。对于转基因系和对照系，使总计5块样地(平均55株植物每样地)生长。在这些植物生长期间使用典型田间管理，除了种植之前不施用补充氮。在生长季节结束时，测量每块样地中所有植物的总谷物产量(调整至15%谷物湿度)。此外，记录穗行数的平均数目(10株植物每样地)和行粒数的平均数目，并且数据如表6所示。
表6.NAGK事件8057的谷物产量、穗行数、行粒数。
包含NAGK基因的玉米植物每植物产生增加的穗数
将来自包含NAGK基因的T0玉米事件(#8644)的穗用近交系授粉，并且收获T1种子。然后，使4株阳性分离子T1植物在温室条件下生长至成熟。记录各T1植物产生的穗数，并且数据如表7所示。
表7.NAGK事件8644的每植物穗数
基因型 植物编号 植物上的穗数
NAGK T1植物#1 2
NAGK T1植物#2 3
NAGK T1植物#3 3
NAGK T1植物#4 3
前文的描述和图表包含本发明的说明性实施方案。前述实施方案和本文所述的方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而变化。仅以一定顺序列出方法的步骤对所述方法的步骤的顺序不构成任何限制。前文的描述和图表仅解释和说明本发明，而本发明并不限于此。具有本公开的本领域技术人员能够对其进行修改和变动而不偏离本发明范围。
序列表
SEQ ID NO:1
ATGCTGCATGAGGTGATGGTGATCAAGTGCGGCGGCAGCATGCTGGAGCAGCTGCCGGAG
AGCTTCTACAACAAGCTGGCGACGCTGCAAGCAGAAGGAAGAAGCATCGTCATTGTTCAT
GGAGGAGGGCCGGCCATCAACCAGATGCTGGAGCAGCTGAAGATTGAGCCAACCTTCTCA
AATGGGCTGAGGGTGACAGATGAGCCAACAATGCAAGCTGTGGAGATGGTGCTCTCAGGG
CCCATCAACAAGCTGGTGGTGAGGAAGCTGCTGCACGCCGGCGGCAAGGCATGGGGCCTC
AGCGGCGTGGATGGAAGCCTGCTGCAAGCTGTTGAGAAGACTCAAGGCCTCGGCCTGGTG
GGCAGCATCACCGTGGTGGATCAAGCGCCGCTCCAGCTGCTGCTGAGCAATGGCTACATC
CCGGTGGTGTCTCCCATCGCCGTCTCAGAAGATGGAAGAACAAGATACAACTGCAACGCC
GACACCGTCGCCGGCGCCATTGCTTCAGCTCTCGGCGCCAAGCAGCTGCTGATGCTCACT
GATGTTCCTGGCATCTGGGCAGAAAATGAGCTGGGAGAGAAGCAGCTGCTGCCGACGGTG
ACAACAGAAGATATTCAGCTGATGATGAAGAACCAGATCATCACCGGCGGCATGATCCCC
AAGGTGCAAGCGGCGCTGGATGCTCTAGCTCAAGGAGTTCAAGAAGTGGTGATCTGCAAA
GGAGAAGCTGAGACGCTGGACGGCGTGGTGAAGGGCATGGCCGTCGGCACCTCCATCTCC
GCCGAGATGAGCAGAGGACAAGATTCTCAAGCCTTCATCAGCAACAAGGTGTGAGG
SEQ ID NO:2
MLHEVMVIKC GGSMLEQLPE SFYNKLATLQ AEGRSIVIVH GGGPAINQML
EQLKIEPTFS NGLRVTDEPT MQAVEMVLSG PINKLVVRKL LHAGGKAWGL
SGVDGSLLQA VEKTQGLGLV GSITVVDQAP LQLLLSNGYI PVVSPIAVSE
DGRTRYNCNA DTVAGAIASA LGAKQLLMLT DVPGIWAENE LGEKQLLPTV
TTEDIQLMMK NQIITGGMIP KVQAALDALA QGVQEVVICK GEAETLDGVV
KGMAVGTSIS AEMSRGQDSQ AFISNKV
SEQ ID NO:3
ATGCAGCTGCTCAACCAGCGGCAGGCGCTGCGGCTGGGAAGAAGCTCCGCCAGCAAGAAC
CAGCAGGTGGCGCCGCTGGCATCAAGGCCGGCAAGCAGCCTCTCCGTCTCCGCCTCCTCC
GTGGCGCCGGCGCCGGCCTGCTCGGCGCCGGCCGGCGCCGGCCGCCGCGCCGTGGTGGTG
CGCGCCTCCGCCACCAAGGAGAAGGTGGAGGAGCTCACCATCCAG

Claims (17)

1.一种提高玉米中的氮利用效率的方法，所述方法包括至少用精氨酸不敏感型NAGK基因转化所述玉米的步骤，所述精氨酸不敏感型NAGK基因编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质。
2.一种表达载体，其包含选自以下的核苷酸序列：
a)核苷酸序列SEQ ID NO:1；以及，
b)编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的表达载体，其还包含5’DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述核苷酸序列、所述DNA启动子序列和所述终止子序列可操作地连接以允许所述核苷酸序列的转录。
4.如权利要求3所述的表达载体，其中所述启动子序列选自组成型植物启动子和组织特异性启动子。
5.一种多克隆抗体，其包含针对SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多克隆抗体。
6.一种宿主细胞，其为细菌细胞，其用选自以下的至少一种第一核苷酸序列转化：
a)核苷酸序列SEQ ID NO:1；以及，
b)编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含选自(a)或(b)的至少一种第二核苷酸序列，其中所述第一和所述第二核苷酸序列不相同。
8.一种载体或构建体，其包含：
a)至少一种选自以下的编码氨基酸序列的第一核苷酸序列：
i)核苷酸序列SEQ ID NO:1；以及
ii)编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列；
b)5’DNA启动子序列；以及，
c)3’终止子序列，其中所述核苷酸序列、所述DNA启动子序列和所述终止子序列可操作地连接以允许所述核苷酸序列的转录。
9.如权利要求8所述的载体或构建体，其还包含至少一种选自(a)(i)或(a)(ii)的编码氨基酸序列的第二核苷酸序列，其中所述第一和所述第二核苷酸序列不相同。
10.一种表达调节玉米中的氮的核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：提供用权利要求8所述的载体或构建体转化的转基因玉米或玉米种子，以及使所述转基因玉米或者由所述转基因玉米种子长成的玉米在有效条件下生长，所述条件是在所述转基因玉米或者由所述转基因玉米种子长成的玉米中有效表达所述核酸分子的条件。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸分子的表达导致在所述转基因玉米或者由所述转基因玉米种子长成的玉米中提高产量。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸分子的表达有效增加所述转基因玉米或者由所述转基因玉米种子长成的玉米的氮利用效率。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸分子的表达有效减少或消除所述转基因玉米或者由所述转基因玉米种子长成的玉米中精氨酸对NAGK的抑制。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸分子的表达有效改变所述转基因玉米或者由所述转基因玉米种子长成的玉米的形态学，所述形态学选自以下组中：谷物数量、穗行数或行粒数。
15.一种提高玉米植物的谷物数量的方法，所述方法包括以下步骤：将提高氮利用效率的NAGK基因引入所述植物的基因组，并且使转化的植物生长以产生谷物，其中所述NAGK基因编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质。
16.一种生产谷物的方法，包括以下步骤：种植根据权利要求1的方法获得的植物的种子，使来自所述种子的植物在产生谷物的条件下生长，且收获所述谷物。
17.一种增加种子的方法，包括以下步骤：种植根据权利要求1的方法获得的植物的种子，使来自所述种子的植物在产生种子的条件下生长，且收获所述种子。
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