CN101501197A - 改善的epsp合酶：组合物及使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于在细菌、植物、植物细胞、组织和种子中赋予对于草甘膦的耐受性的组合物和方法。组合物包括新型EPSP合酶和编码此类酶的核酸分子，包含那些核酸分子的载体，和包含所述载体的宿主细胞。

Description

改善的EPSP合酶：组合物及使用方法

发明领域

本发明涉及植物分子生物学，特别涉及赋予改善的对于除草剂草甘膦的抗性或耐受性的新型EPSP合酶多肽。

发明背景

N-膦酰甲基甘氨酸，通常称为草甘膦，是重要的农艺学化合物。草甘膦抑制将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)转化成5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸的酶。这种酶(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)；在本文中称为“EPSP合酶”或“EPSPS”)的抑制通过关闭莽草酸途径从而抑制芳香族氨基酸的生物合成而杀死植物细胞。

因为草甘膦类除草剂抑制芳香族氨基酸的生物合成，所以它们不仅杀死植物细胞，而且对于细菌细胞也有毒性。草甘膦抑制许多细菌的EPSP合酶，因此对这些细菌有毒。然而，某些细菌的EPSP合酶对草甘膦具有高耐受性。

对草甘膦毒性有抵抗力的植物细胞可以通过转化植物细胞以表达草甘膦抗性细菌EPSP合酶来产生。值得注意的是，来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4的细菌基因已用于在植物中在表达后赋予植物细胞以除草剂抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株CT7的突变的EPSP合酶在细菌细胞中赋予草甘膦抗性，并且将草甘膦抗性赋予植物细胞(美国专利号4,535,060；4,769,061；和5,094,945)。

已分离了野生型EPSP合酶的变体，其由于EPSP合酶氨基酸编码序列中的改变而是草甘膦耐受性的(Kishore和Shah(1988)Annu.Rev.Biochem.57：627-63；Wang等人(2003)J.PlantRes.116：455-60；Eschenburg等人(2002)Planta216：129-35)。美国专利6,040,497报告了突变型玉蜀黍EPSP合酶，其具有在位置102处的苏氨酸至异亮氨酸的置换和在位置106处的脯氨酸至丝氨酸的置换(“TIPS”突变)。此类改变将草甘膦抗性赋予该玉蜀黍酶。来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株CT7的突变的EPSP合酶在细菌细胞中赋予草甘膦抗性，并且被报告将草甘膦抗性赋予植物细胞(美国专利号4,535,060；4,769,061；和5,094,945)。He等人((2001)Biochim et Biophysica Acta 1568：1-6)已通过诱变以及在大肠杆菌(E.coli)和鼠伤寒沙门氏菌EPSP合酶基因之间的重组开发出了具有增加的草甘膦耐受性的EPSP合酶，并且提出在位置42(T42M)和位置230(Q230K)处的突变可能是造成所观察到的抗性的原因。后续工作(He等人(2003)Biosci.Biotech.Biochem.67：1405-1409)显示，T42M突变(苏氨酸至甲硫氨酸)足以改善大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的酶的耐受性。由于除草剂抗性植物提供许多优点，所以具有改善的草甘膦抗性活性的除草剂抗性基因是希望的。

发明概述

提供了用于赋予抗性或耐受性的组合物和方法。组合物包括对于草甘膦除草剂具有抗性的EPSP合酶，和编码此类酶的核酸分子，包含那些核酸分子的载体，和包含载体的宿主细胞。本发明的组合物包括与SEQ ID NO：1和46不同的EPSP合酶，所述EPSP合酶具有序列结构域X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X(SEQ ID NO：44)，其中X表示任意氨基酸。在某些实施方案中，所述EPSP合酶包含序列结构域D-C-X₁-X₂-S-G(SEQ ID NO：76)，其中X₁表示谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，和X₂表示任意氨基酸。在其他实施方案中，本发明的EPSP合酶包含序列结构域X₁-C-X₂-E-G-L-S-X₃-R-X₄-F-X₅-P-X₆(SEQ ID NO：45)，其中X₁表示D、K、E、S、G、P、R或N，和X₂表示G、Q、V、D、E、I、N、M、A、T、S或R，和X₃表示I、G、S、M、F或V，X₄表示M、A、S、G、Q、L、V或I，X₅表示T、P、L、G、A、V或I，和X₆表示I、L、C、A、F或M。

组合物还包括编码除草剂抗性多肽的核酸分子，所述核酸分子包括编码包含SEQ ID NO：5-43和SEQ ID NO：56-65的多肽的与SEQID NO：1和46不同的那些，以及SEQ ID NO：3、4、66、67、74和75的多核苷酸序列，和包含SEQ ID NO：68-73的多核苷酸序列。所述编码序列可以在DNA构建体或表达盒中使用以用于转化生物体并在其中表达，所述生物体包括微生物和植物。组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子，它们通过将本发明的组合物引入所述生物体的基因组中而是草甘膦抗性的。当生物体是植物时，所述序列的引入允许将包含草甘膦的除草剂施用于植物，以选择性地杀死草甘膦敏感的杂草或其他未转化的植物，而不杀死转化的生物体。所述序列另外可以用作标记以用于选择在草甘膦条件下生长的植物细胞。

此外，还提供了用于鉴定具有草甘膦抗性活性的EPSP合酶的方法。所述方法包括基于本发明的结构域的存在来鉴定另外的对于草甘膦具有抗性的EPSP合酶序列。

附图简述

图1图解说明了关于syngrgl-SB的Q-环区域的组合诱变策略。

图2图解说明了关于syngrgl-SB的Q-环区域的排列诱变文库(permutational mutagenesis library)的设计。共有序列翻译和寡核苷酸设计显示在图2的底部以及SEQ ID NO：48(共有序列翻译)和SEQ ID NO：49(寡核苷酸设计)中。

图3显示了关于文库3的组合诱变策略。“N”表示核苷酸碱基A、T、C或G；“W”表示核苷酸碱基A或T；和“S”表示核苷酸碱基C或G。

图4显示了草甘膦抗性克隆的Q-环核心区域中的氨基酸序列的比对。括弧勾画出了Q-环核心区域。灰色阴影表示其中未观察到改变的位置。具有改变的位置用无阴影显示。在该区域中还包括了野生型GRG1氨基酸序列(相应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置81至104)。

图5显示了通过将GRG1氨基酸序列层叠在大肠杆菌AroA晶体结构上而模拟的GRG1晶体结构的图解(Stallings等人(1991)ProcNatlAcad Sci USA.1；88(11)：5046-50)。图版A显示了相对于底物莽草酸-3-磷酸和PEP的完整蛋白质。图版B仅显示了相对于底物莽草酸-3-磷酸和PEP的GRG1的Q-环区域。

图6显示了来自表达GRG1(EV06)的转基因玉蜀黍植物的叶样品的Western印迹，其中使用多克隆抗体来检测。从玉蜀黍叶样品中分离出总蛋白质，并使用Western印迹分析来鉴定GRG1(EV06)蛋白的表达。泳道A显示了5ng纯化的GRG1(EV06)蛋白，泳道B显示了1ng GRG1蛋白。泳道B至J显示了独立的表达grg1(evo6)的转基因植物。包含阴性对照植物的泳道未显示出信号。

发明详述

组合物

提供了能够赋予草甘膦耐受性或抗性的多肽序列。所述组合物包括EPSP合酶多肽，所述EPSP合酶多肽具有序列结构域X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X(SEQ ID NO：44)，其中X表示任意氨基酸；序列结构域D-C-X₁-X₂-S-G(SEQ ID NO：76)，其中X₁表示谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，和X₂表示任意氨基酸；或序列结构域X₁-C-X₂-E-S-G-L-S-X₃-R-X₄-F-X₅-P-X₆(SEQ ID NO：45)，其中X₁表示天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸或精氨酸；X₂表示天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或精氨酸；其中X₃表示异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸；其中X₄表示甲硫氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；其中X₅表示苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、亮氨酸或甘氨酸；和其中X₆表示异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸。该结构域位于EPSP合酶多肽的Q-环区域中。相应于草甘膦抗性EPSP合酶多肽GRG1(SEQ ID NO：2；美国专利申请号10/739,610)的氨基酸80-105的区域(本文称为“Q-环”)已知参与EPSP合酶底物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的识别(

等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1376-1380，Stauffer等人(2001)Biochemistry 40：3951-3957)。

在一个实施方案中，该序列结构域相应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置85至99，并且选自SEQ ID NO：5-43和SEQ ID NO：56-65的相应位置。在另一个实施方案中，包含本发明的序列结构域的多核苷酸编码与SEQ ID NO：1和46不同的EPSP合酶多肽，所述EPSP合酶多肽与相应于SEQ ID NO：2的位置1至84和位置100至431的氨基酸具有至少70％序列同一性。如本文所使用的，短语“相应于”，当涉及氨基酸(或核苷酸)位置编号时，意指一个或多个氨基酸(或核苷酸)序列与参考序列于在参考序列中指定的位置编号处对准排列。例如，为了鉴定氨基酸序列中相应于SEQ ID NO：2的氨基酸80-105的Q-环区域，可以使用本文其他地方讨论的比对方法来使所研究的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列进行比对，并且鉴定与SEQ IDNO：2的氨基酸残基80-105对准排列的所研究的氨基酸序列的区域。应认识到，标明Q-环的氨基酸位置可以通过在相应于SEQ ID NO：2的位置80-105的氨基酸的任一侧上加上或减去大约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸而改变。

短语“与SEQ ID NO：1和46不同”包括SEQ ID NO：1或46的片段，包括包含SEQ ID NO：1或46的至少约340个，至少约350个，至少400个，至少401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429或431个连续氨基酸的片段。此外，应认识到，在现有技术中可获得包含本发明的结构域的序列(参见，例如美国专利申请公开号20060143727、20030049814、20030079246、20030200560、2004148650和20050223436；美国专利号5188642、6040497、7214535、7169970、6867293、7183110、5094945、6225114、7141722、7045684、5312910、6566587和RE037287，所述专利中的每一个通过提及而整体合并入本文)。在本发明之前，在本领域中没有意识到此类序列具有赋予草甘膦抗性的能力，并且从本发明的组合物中排除了那些序列。就未知那些序列赋予抗性而言，它们被包括在方法权利要求中。本发明的方法提供了新途径以鉴定和使用具有赋予草甘膦抗性的能力的序列。

EPSP合酶Q环形成了用于PEP和草甘膦的结合袋的一部分，并包含已知与PEP的磷酸直接氢键键合的不变的精氨酸(Shuttleworth等人(1999)Biochemistry 38：296-302)。该Q-环结构域已被描述为关于草甘膦抗性的预测物，并且已鉴定了在该结构域内的关键残基(美国申请号60/658,320，通过提及而整体合并入本文)。本发明的组合物包括GRG1的变体，所述变体显示出(1)继续的耐受草甘膦的能力，或(2)增强的耐受草甘膦的能力。因此，这些变体的氨基酸序列扩展和精制了草甘膦抗性EPSP合酶的Q-环的关键结构域。

A.分离的多核苷酸，及其变体和片段

在某些实施方案中，本发明包括分离的或重组的多核苷酸。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或者多肽或其生物学活性部分，基本上不含其他细胞材料或培养基(当通过重组技术生产时)，或者基本上不含化学前体或其他化学制品(当以化学方法合成时)。“生物学活性的”意指具有天然多肽的所需生物活性，即保留了除草剂抗性活性。“分离的”和“重组的”多核苷酸可以不含在该多核苷酸所源自的生物体的基因组DNA中天然地位于该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5′和3′末端处的序列)(例如，蛋白质编码序列)。对本发明而言，当用于指多核苷酸时，“分离的”不包括分离的染色体。例如，在各种实施方案中，分离的编码草甘膦抗性的多核苷酸可以包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在该多核苷酸所源自的细胞的基因组DNA中天然地位于该多核苷酸侧翼的核苷酸序列。

本发明的多核苷酸包括编码这样的EPSP合酶多肽的那些多核苷酸，所述EPSP合酶多肽的特征在于具有本发明的序列结构域。用于鉴定本发明的结构域的信息包括在本文其他地方描述的EPSP合酶的序列比对。所述序列比对用于鉴定在序列之间具有同源性的区域和鉴定这些EPSP合酶所特征性的结构域。在某些实施方案中，本发明的结构域用于鉴定具有草甘膦抗性的EPSP合酶。进一步的实施方案包括编码包含SEQ ID NO：5-43和SEQ ID NO：56-65的草甘膦抗性多肽的多核苷酸，SEQ ID NO：3、4、66、67、74和75的多核苷酸序列，以及包含SEQ ID NO：68-73的多核苷酸序列。

“草甘膦”意指N-膦酰甲基甘氨酸(包括其任何盐)的任何除草剂形式以及导致在植物中产生草甘膦阴离子的其他形式。“除草剂抗性蛋白质”或由于“编码除草剂抗性的核酸分子”的表达而产生的蛋白质包括将下述能力赋予细胞的蛋白质：比不表达该蛋白质的细胞耐受更高浓度的除草剂，或比不表达该蛋白质的细胞更长时间地耐受某一除草剂浓度。“草甘膦抗性蛋白质”包括将下述能力赋予细胞的蛋白质：比不表达该蛋白质的细胞耐受更高浓度的草甘膦，或比不表达该蛋白质的细胞更长时间地耐受某一草甘膦浓度。“耐受”或“耐受性”意指存活或者以不容易与未经处理的细胞相区分的方式执行基本的细胞功能例如蛋白质合成和呼吸。

本发明进一步考虑了本文描述的多核苷酸的变体和片段。多核苷酸的“片段”可以编码多肽的生物学活性部分，或者它可以是通过使用本文其他地方公开的方法而可以用作杂交探针或PCR引物的片段。取决于预期用途，作为多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950个邻接核苷酸，或高至在本文公开的全长多核苷酸中存在的核苷酸的数目(例如，包含SEQ ID NO：1的EPSP合酶多核苷酸)。“邻接”核苷酸意指彼此紧邻的核苷酸残基。

本发明的多核苷酸的片段一般将编码保留全长草甘膦抗性蛋白质的生物活性即除草剂抗性活性的多肽片段。“保留除草剂抗性活性”意指该片段将具有本文公开为SEQ ID NO：2的全长草甘膦抗性蛋白质的至少约30％，至少约50％，至少约70％，至少约80％、85％、90％、95％、100％、110％、125％、150％、175％、200％、250％，至少约300％或更高的除草剂抗性活性。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域众所周知的。参见，例如，美国专利号4,535,060和5,188,642，所述专利中的每一个通过提及而整体合并入本文。

编码本发明多肽的生物学活性部分的多核苷酸的片段将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400个邻接氨基酸，或高至在本发明的全长多肽中存在的氨基酸的总数目。

优选的本发明的除草剂抗性蛋白质由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含编码具有本文公开的序列结构域的多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，该序列结构域相应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置85至99，并且选自SEQ ID NO：5-43和SEQ ID NO：56-65的相应位置。在另一个实施方案中，包含本发明的序列结构域的多核苷酸编码在相应于SEQ ID NO：2的位置1至84和位置100至431的氨基酸处具有足够同一性的EPSP合酶。术语“具有足够同一性”意指这样的氨基酸或核苷酸序列，即通过使用本文描述的比对程序之一并采用标准参数，其与参照序列相比较具有至少约60％或65％序列同一性，约70％或75％序列同一性，约80％或85％序列同一性，或者约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在另一个实施方案中，包含本发明的结构域的多核苷酸编码这样的EPSP合酶，所述EPSP合酶在相应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置1至84和位置100至431的区域中具有一个或多个添加、置换或删除，高至约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100个或更多氨基酸置换、删除或插入。本领域技术人员将会认识到，这些值可以适当地进行调整以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读码框定位等来确定由2个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。

为了确定2个氨基酸序列或2个核酸的同一性百分比，就最佳比较目的来对序列进行比对。2个序列之间的同一性百分比是由所述序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性百分比＝相同位置的数目/位置(例如，重叠位置)的总数目x100)。在一个实施方案中，2个序列具有相同的长度。2个序列之间的同一性百分比可以使用与下文描述的那些类似的技术来进行确定，其中允许或不允许缺口。在计算同一性百分比中，通常计数准确的匹配。为了本发明的目的，当计算相应于氨基酸位置1至84和位置100至431的区域中的同一性百分比时，测量跨越整个区域(1至84加100至431)的百分比。

2个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。用于2个序列比较的数学算法的非限制性例子是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264的算法，其在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中进行了修改。将此类算法整合入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序(得分＝100、字长＝12)来进行，以获得与本发明的草甘膦抗性核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序(得分＝50、字长＝3)来进行，以获得与本发明的除草剂抗性蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以使用如Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25：3389中所描述的Gapped BLAST。备选地，PSI-Blast可以用于执行检测分子间的远距离关系的迭代搜索。参见Altschul等人(1997)(同上)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各个程序(例如，BLASTX和BLASTN)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是ClustalW算法(Higgins等人(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。ClustalW比较序列并比对氨基酸或DNA序列的整体，因此可以提供关于整个氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法在几个商购可得的DNA/氨基酸分析软件包中使用，例如Vector NTI Program Suite(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的ALIGNX模块。在用ClustalW比对氨基酸序列后，可以评估氨基酸同一性百分比。可用于ClustalW比对分析的软件程序的非限制性例子是GeneDoc^TM。GeneDoc^TM(Karl Nicholas)允许评估多个蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法。此类算法被整合入ALIGN程序(版本2.0)中，所述ALIGN程序是GCG序列比对软件包(可从Accelrys，Inc.，9865 Scranton Rd.，San Diego，California，USA获得)的一部分。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。

除非另有说明，采用Needleman和Wunsch(1970)(同上)的算法的GAP Version 10将被用于测定序列同一性或相似性，其中使用下述参数：关于核苷酸序列的同一性％和相似性％，使用50的GAP权重和3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；关于氨基酸序列的同一性％或相似性％，使用8的GAP权重和2的长度权重，以及BLOSUM62评分矩阵。还可以使用等价的程序。“等价的程序”意指任何这样的序列比较程序，即对于所研究的任何2个序列，当与由GAPVersion 10产生的相应比对相比较时，产生具有相同的核苷酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。

本发明还包括变体多核苷酸。多核苷酸的“变体”包括编码本文公开的多肽但由于遗传密码的简并性而保守性地不同的那些序列，以及具有足够同一性的那些序列。

细菌基因在开放读码框的起始附近十分经常具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始将导致功能蛋白质的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，诸如芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的细菌还将密码子GTG识别为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白质在第一个氨基酸处包含甲硫氨酸。此外，常常事先不确定这些密码子中的哪一些天然地在细菌中使用。因此，应当理解，备选的甲硫氨酸密码子之一的使用可能导致产生赋予除草剂抗性的变体。这些除草剂抗性蛋白质包括在本发明中，并且可以在本发明的方法中使用。

天然存在的等位基因变体可以使用众所周知的分子生物学技术来鉴定，例如如下所述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸还包括合成衍生的多核苷酸，其例如通过使用定点诱变或其他诱变策略产生但仍编码具有所需生物活性的多肽。

技术人员将会进一步意识到，可以通过本发明多核苷酸的进一步突变来引入改变，从而导致编码的多肽的氨基酸序列中的进一步改变，而不改变所述多肽的生物活性。因此，分离的多核苷酸变体可以通过下述方式来制备：将一个或多个另外的核苷酸置换、添加或删除引入编码本文公开的EPSP合酶结构域的相应的多核苷酸中，从而使得将一个或多个氨基酸置换、添加或删除引入所编码的多肽中。可以通过标准技术来引入进一步的突变，例如通过定点诱变和PCR介导的诱变，或基因改组技术。此类变体多核苷酸也包括在本发明内。

可以通过沿着全部或部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，来制备变体多核苷酸，并且可以就赋予除草剂抗性活性的能力来筛选所得到的突变体，以鉴定保留活性的突变体。

基因改组或有性PCR操作(sexual PCR procedure)(例如，Smith(1994)Nature 370：324-325；美国专利号5,837,458；5,830,721；5,811,238；和5,733,731，所述参考文献各自通过提及而合并入本文)可以用于进一步修饰或增强具有本发明的EPSP合酶结构域的多核苷酸和多肽(例如，赋予草甘膦抗性的多肽)。基因改组涉及几种突变体DNA的随机片段化，随后通过PCR装配成全长分子。各种基因改组操作的例子包括但不限于，DNA酶处理后的装配、交错延伸过程(STEP)和随机引发体外重组。在DNA酶介导的方法中，将从阳性突变体库中分离出的DNA区段用DNA酶I切割成随机片段，并且经历多轮PCR而不添加引物。随着PCR循环进行，随机片段的长度接近未切割的区段的长度，从而导致在不同克隆中的突变，所述突变变得是混合的并在某些所得序列中积聚。多个循环的选择和改组已导致几种酶的功能增强(Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Crameri等人(1996)Nat.Biotechnol.14：315-319；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；和Crameri等人(1997)Nat.Biotechnol.15：436-438)。此类操作例如可以对编码具有本发明的序列结构域的多肽的多核苷酸进行，以产生赋予草甘膦抗性的多肽。

使用诸如PCR、杂交等的方法可以通过寻找本发明的EPSP合酶结构域来鉴定出相应的除草剂抗性序列。参见，例如，Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning；A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)和Innis等人(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，NY)。

在杂交方法中，全部或部分除草剂抗性核苷酸序列可以用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法是本领域通常已知的，并且在Sambrook和Russell，2001(同上)中公开。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团例如³²P或任何其他可检测标记例如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子进行标记。可以基于本文公开的已知的编码除草剂抗性的核苷酸序列，通过对合成的寡核苷酸进行标记来制备用于杂交的探针。可以另外使用基于在所述核苷酸序列或编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基而设计的简并引物。探针通常包含这样的核苷酸序列区域，所述核苷酸序列区域在严格条件下与本发明的编码除草剂抗性的核苷酸序列或其片段或变体的至少约12个，优选约25个，至少约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1300个连续核苷酸杂交。用于制备用于杂交的探针的方法是本领域通常已知的，并且公开于Sambrook和Russell，2001(同上)以及Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York)中，所述2个参考文献通过提及而合并入本文。

例如，本文公开的完整除草剂抗性序列，或者其一个或多个部分，可以用作能够与相应的除草剂抗性序列和信使RNAs特异性地杂交的探针。为了达到在各种条件下的特异性杂交，此类探针包括独特的并且长度为至少约10个核苷酸或长度为至少约20个核苷酸的序列。此类探针可以用于通过PCR从所选择的生物体中扩增出相应的除草剂抗性序列。这种技术可以用于从所需生物体中分离另外的编码序列，或用作诊断测定法以测定生物体中编码序列的存在。杂交技术包括铺板的DNA文库的杂交筛选(噬斑或菌落；参见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。

此类序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”意指这样的条件，即在所述条件下探针将与其靶序列杂交，达到相比与其他序列来说可检测地更大的程度(例如，为背景的至少2倍)。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与探针100％互补的靶序列(同源探测)。备选地，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，从而使得检测出较低程度的相似性(异源探测)。一般地，探针长度为小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

通常，严格条件是这样的条件，其中在pH7.0-8.3下盐浓度小于约1.5M Na离子，通常约0.01-1.0M Na离子浓度(或其他盐)，以及温度对于短探针(例如，10-50个核苷酸)为至少约30℃，和对于长探针(例如，超过50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件还可以用添加去稳定剂如甲酰胺来达到。示例性的低严格性条件包括于37℃用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，和于50-55℃在1X-2X SSC(20X SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中进行洗涤。示例性的中等严格性条件包括于37℃在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中进行杂交，和于55-60℃在0.5X-1X SSC中进行洗涤。示例性的高严格性条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中进行杂交，和于60-65℃在0.1X SSC中进行洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％-约1％SDS。杂交的持续时间一般少于约24小时，通常为约4-约12小时。

特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交物，T_m可以从Meinkoth和Wah1(1984)Anal.Biochem.138：267-284的等式中进行估计：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，和L是以碱基对计的杂交物的长度。T_m是这样的温度，在该温度下50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交(在限定的离子强度和pH下)。对于每1％的错配，T_m减少约1℃；因此，可以调整T_m、杂交和/或洗涤条件，以与所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，那么T_m可以减少10℃。一般地，严格条件被选择为在限定的离子强度和pH下比关于特定序列和其互补物的热解链点(T_m)低约5℃。然而，极端严格条件可以利用在比热解链点(T_m)低1、2、3或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用在比热解链点(T_m)低6、7、8、9或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用在比热解链点(T_m)低11、12、13、14、15或20℃下的杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗涤组成以及所需T_m，普通技术人员应当理解，内在地描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性中的改变。如果所希望的错配程度导致低于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，那么优选增加SSC浓度，从而使得可以使用更高的温度。关于核酸杂交的详细指导可见下述参考文献：Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人，编辑，(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York)。参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning；A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork)。

B.分离的蛋白质及其变体和片段

本发明中还包括除草剂抗性多肽。基本上不含细胞材料的除草剂抗性多肽包括具有少于约30％、20％、10％或5％(干重)的非除草剂抗性多肽(在本文中也称为“污染蛋白质”)的多肽制剂。在本发明中，“除草剂抗性蛋白质”意指具有本发明的序列结构域的EPSP合酶多肽。还提供了其片段、生物学活性部分和变体，并且可以用于实践本发明的方法。

“片段”或“生物学活性部分”包括这样的多肽片段，所述多肽片段包含编码除草剂抗性蛋白质的氨基酸序列的部分，并保留除草剂抗性活性。除草剂抗性蛋白质的生物学活性部分可以是例如长度为10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。这种蛋白质可以以各种方式进行改变，包括在相应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置85至99的区域中一个或多个氨基酸的氨基酸置换、删除、截短和插入，包括高至约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100个或更多氨基酸置换、删除或插入。此类生物学活性部分可以通过重组技术来制备，并且就除草剂抗性活性来进行评估。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域众所周知的。参见，例如，美国专利号4,535,060和5,188,642，所述专利各自通过提及而整体合并入本文。如本文所使用的，片段包含SEQ ID NO：5-43或56-65的至少8个邻接氨基酸。然而，本发明包括其他片段，例如该蛋白质中超过约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸的任何片段。

“变体”意指这样的蛋白质或多肽，其具有与EPSP合酶多肽至少约60％、65％，约70％、75％，约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，所述EPSP合酶多肽具有本发明的EPSP合酶结构域。本领域技术人员将会认识到，这些值可以适当地进行调整以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读码框定位等来确定由两个多核苷酸所编码的多肽的相应的同一性。

例如，保守氨基酸置换可以在一个或多个非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以从多肽的野生型序列中进行改变而不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。在本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-分枝的侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。氨基酸置换可以在保留功能的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是多肽活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守残基中的保守或非保守改变。

还包括了针对本发明的多肽或者其变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法是本领域众所周知的(参见，例如Harlow和Lane(1988)Antibodies；A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；美国专利号4,196,265)。

在本发明的一个实施方案中，草甘膦抗性EPSPS酶具有约1-约150uM的的关于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的K_m，包括约2uM，约3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130或约140uM，以及约50-约2000、约100-约1000、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900或高至约2000的K_i(草甘膦)/K_m(PEP)。如本文所使用的，在大约pH7，在酶服从米-曼动力学的条件下测量K_m和K_i。一种非限制性测量技术在pH7和室温下在氯化钾和HEPES缓冲液中使用纯化形式的酶，并使用0-10mM的草甘膦浓度。

EPSP合酶动力学活性可以例如通过测量磷酸的释放来进行测定，所述磷酸的释放在EPSP合酶的底物(例如，PEP和S3P)被催化成其后续反应产物(例如，5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸)期间产生，其中使用由Vazquez等人(2003)Anal.Biochem.320(2)：292-298和在美国专利申请号11/605,824中描述的荧光测定法，所述美国专利申请的题目为“grg23 and grg51 Genes Conferring HerbicideResistance”，于2006年11月29日提交，并且通过提及而整体合并入本文。

C.多核苷酸构建体

编码本发明的EPSP合酶结构域的多核苷酸可以进行修饰，以获得或增强在植物细胞中的表达。编码通过本发明方法鉴定的多肽的多核苷酸可以在用于在目的植物中表达的表达盒中提供。“植物表达盒”包括能够导致多核苷酸在植物细胞中表达的DNA构建体，例如重组DNA构建体。所述盒可以以5′-3′的转录方向包括与一种或多种目的多核苷酸可操作地连接的转录起始区(即，启动子)，以及在植物中具有功能的翻译和/或转录终止区(即，终止区)。所述盒可以另外还包含至少一种待引入生物体中的至少一种另外的多核苷酸，例如选择标记基因。备选地，所述另外的多核苷酸可以在多个表达盒上提供。此类表达盒具有多个限制位点，所述限制位点用于插入一种或多种多核苷酸以处于调节区的转录调节之下。

“异源的”一般指这样的多核苷酸或多肽，所述多核苷酸或多肽对于它们所存在于其中的细胞来说不是内源的，或者对于它们所存在于其中的天然基因组中的位置来说不是内源的，并且已通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微粒轰击等加入细胞中。“可操作地连接”意指两个多核苷酸之间的功能连接。例如，当启动子与DNA序列可操作地连接时，启动子序列起始并介导DNA序列的转录。应认识到，可操作地连接的多核苷酸可以是邻接的或不是邻接的，并且在用于涉及两个多肽编码区的连接时，所述多肽在同一读码框中进行表达。

启动子可以是在所选择的植物细胞、植物部分或组织中显示出转录活性的任何多核苷酸序列。启动子对于植物宿主和/或本发明的DNA序列来说可以是天然的或类似的，或者外源的或异源的。当启动子对于植物宿主是“天然的”或“类似的”时，意指所述启动子在该启动子所引入的天然植物内存在。当启动子对于本发明的DNA序列是“外源的”或“异源的”时，意指所述启动子对于可操作地连接的本发明DNA序列来说不是天然的或天然存在的启动子。启动子可以是诱导型或组成型的。它可以是天然存在的，可以由各种天然存在的启动子的部分组成，或可以是部分或全部合成的。用于设计启动子的指导通过启动子结构的研究来提供，例如Harley和Reynolds(1987)NucleicAcids Res.15：2343-2361的研究。此外，启动子相对于转录起始点的位置可以进行优化。参见，例如Roberts等人(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：760-764。用于在植物中使用的许多合适的启动子是本领域众所周知的。

例如，用于在植物中使用的合适的组成型启动子包括：来自植物病毒的启动子，例如花生褪绿条死病花椰菜花叶病毒(PClSV)启动子(美国专利号5,850,019)；来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313：810-812)；小球藻病毒甲基转移酶基因的启动子(美国专利号5,563,328)和来自玄参花叶病毒(FMV)的全长转录启动子(美国专利号5,378,619)；来自诸如下列的基因的启动子，稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)PlantCell 2：163-171)；遍在蛋白(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632，和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)；玉蜀黍H3组蛋白(Lepetit等人(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-285，和Atanassova等人(1992)Plant J.2(3)：291-300)；欧洲油菜(Brassicanapus)ALS3(PCT申请WO 97/41228)；和各种土壤杆菌基因的启动子(参见美国专利号4,771,002；5,102,796；5,182,200；和5,428,147)。

用于在植物中使用的合适的诱导型启动子包括：对铜作出响应的来自ACE1系统的启动子(Mett等人(1993)PNAS 90：4567-4571)；对苯磺酰胺除草剂安全剂作出响应的玉蜀黍In2基因的启动子(Hershey等人(1991)Mol.Gen.Genetics 227：229-237，和Gatz等人(1994)Mol.Gen.Gene tics 243：32-38)；和来自Tn10的Tet阻抑物的启动子(Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237)。用于在植物中使用的另一种诱导型启动子是对诱导剂作出响应的启动子，而对于所述诱导剂植物通常不作出响应。这种类型的示例性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性通过糖皮质类固醇激素(Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88：10421)，或通过近期应用嵌合转录激活剂XVE(其用于在由雌二醇激活的基于雌激素受体的诱导型植物表达系统中使用)(Zuo等人(2000)Plant J.，24：265-273)来诱导。用于在植物中使用的其他诱导型启动子在EP 332104、PCT WO 93/21334和PCT WO 97/06269中得到描述，所述专利通过提及而整体合并入本文。还可以使用由其他启动子的部分组成的启动子和部分或全部合成的启动子。参见，例如，描述了用于在植物中使用的此类启动子的Ni等人(1995)Plant J.7：661-676和PCT WO 95/14098。

启动子可以包括或进行修饰以包括一种或多种增强子元件。在某些实施方案中，启动子可以包括多个增强子元件。与不包括它们的启动子相比较，包含增强子元件的启动子提供更高水平的转录。用于在植物中使用的合适的增强子元件包括PC1SV增强子元件(美国专利号5,850,019)、CaMV 35S增强子元件(美国专利号5,106,739和5,164,316)和FMV增强子元件(Maiti等人(1997)Transgenic Res.6：143-156)。还参见PCT WO 96/23898。

通常，此类构建体可以包含5′和3′非翻译区。此类构建体可以包含“信号序列”或“前导序列”，以有助于目的肽的共翻译或翻译后运输至某些细胞内结构，例如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体，或者被分泌。例如，构建体可以经改造以包含信号肽从而有助于将肽转移至内质网。“信号序列”意指已知或怀疑导致穿过细胞膜的共翻译或翻译后肽运输的序列。在真核生物中，这种运输通常涉及分泌到高尔基体内，其中具有某些发生的糖基化。“前导序列”意指当被翻译时导致足以引发肽链共翻译运输至亚细胞器的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过进入内质网内，进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等中来对运输和/或糖基化实施靶向的前导序列。还可以优选改造植物表达盒以包含内含子，从而使得内含子的mRNA加工是表达所需的。

“3′非翻译区”意指位于编码序列下游的多核苷酸。多腺苷酸化信号序列和编码能够影响向mRNA前体的3′末端添加多腺苷酸束的调节信号的其他序列是3′非翻译区。“5′非翻译区”意指位于编码序列上游的多核苷酸。

其他上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是用于增加启动子区的表达的多核苷酸。增强子是本领域众所周知的，并且包括但不限于，SV40增强子区和35S增强子元件。

终止区可以对于转录起始区来说是天然的，可以对于本发明的序列来说是天然的，或可以衍生自另一种来源。方便的终止区可从根瘤土壤杆菌的Ti质粒中获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶的终止区。还可参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人(1991)GenesDev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)NucleicAcids Res.17：7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

在本发明的一个方面，对于给定的多肽例如本发明的多肽来设计合成DNA序列。合成DNA序列的开放读码框在细胞中的表达导致产生本发明的多肽。合成DNA序列可以用于简单地去除不想要的限制性核酸内切酶位点，以促进DNA克隆策略，改变或去除任何潜在的密码子偏倚，改变或改善GC含量，去除或改变备选的读码框，和/或改变或去除可能存在于天然DNA序列中的内含子/外显子剪接识别位点、多腺苷酸化位点、Shine-Delgarno序列、不想要的启动子元件等。还可能的是，合成DNA序列可用于将其他改善引入DNA序列中，例如引入内含子序列，形成作为与细胞器靶向序列(例如，叶绿体转运肽、质外体/液泡靶向肽或者导致所得到的肽保留在内质网中的肽序列)的蛋白质融合物进行表达的DNA序列。可以使用宿主细胞偏爱的密码子来合成所述合成基因以获得改善的表达，或者可以通过以宿主偏爱的密码子使用频率使用密码子来合成所述合成基因。参见，例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11；美国专利号6,320,100；6,075,185；5,380,831；和5,436,391，美国公开申请号20040005600和20010003849，和Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，其通过提及而合并入本文。

在一个实施方案中，目的多核苷酸被靶向叶绿体以进行表达。以这种方式，当目的多核苷酸不直接插入叶绿体内时，表达盒将另外包含编码转运肽的多核苷酸以将目的核苷酸导向叶绿体。此类转运肽是本领域已知的。参见，例如Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233：478-481。

可以就在叶绿体中的表达来优化被靶向叶绿体的目的多核苷酸，以解决植物细胞核和这种细胞器之间的在密码子使用方面的差异。以这种方式，可以使用叶绿体偏爱的密码子来合成目的多核苷酸。参见，例如，美国专利号5,380,831，通过提及而合并入本文。

这种植物表达盒可以被插入植物转化载体中。“转化载体”意指允许转化细胞的DNA分子。此类分子可以由一个或多个表达盒组成，或可以组织入超过一个的载体DNA分子中。例如，二元载体是植物转化载体，其利用2个非邻接DNA载体来编码用于植物细胞转化的所有必需的顺式和反式作用功能(Hellens和Mullineaux(2000)Trendsin Plant Science 5：446-451)。“载体”指设计用于在不同宿主细胞之间进行转移的多核苷酸构建体。“表达载体”指具有将异源DNA序列或片段引入、整合入外源细胞中并在其中表达该异源DNA序列或片段的能力的载体。

所述植物转化载体包含用于实现植物转化的一个或多个DNA载体。例如，利用包含超过一种邻接DNA区段的植物转化载体是本领域中常见的实践。这些载体在本领域中通常称为二元载体。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于土壤杆菌介导的转化，其中对于实现有效转化所需的DNA区段的大小和复杂性相当大，并且将功能分散到分开的DNA分子上是有利的。二元载体通常包括质粒载体，所述质粒载体包含对于T-DNA转移所需的顺式作用序列(例如左边界和右边界)、经改造从而能够在植物细胞中表达的选择标记、和“目的多核苷酸”(经改造从而能够在对于其希望产生转基因植物的植物细胞中表达的多核苷酸)。在这种质粒载体上还存在有细菌复制所需的序列。顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞内并在其中表达的方式排列。例如，选择标记序列和目的序列位于左和右边界之间。通常，第二质粒载体包含介导T-DNA从土壤杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。这种质粒通常包含毒力功能(Vir基因)，其允许用土壤杆菌感染植物细胞，并通过在边界序列处进行切割和vir介导的DNA转移来转移DNA，如本领域中所了解的(Hellens和Mullineaux(2000)Trendsin Plant Science，5：446-451)。几类土壤杆菌属菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以用于植物转化。第二质粒载体不是通过其他方法例如微粒轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等来将多核苷酸引入植物中所必需的。

D.植物转化

本发明的方法涉及将核苷酸构建体引入植物内。“引入”意指以使得该构建体进入植物细胞内部的方式将核苷酸构建体呈递给植物。本发明的方法不要求使用用于将核苷酸构建体引入植物的具体方法，只要求使该核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部。用于将核苷酸构建体引入植物内的方法是本领域已知的，包括但不限于，稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导的方法。

一般而言，植物转化法涉及将异源DNA转移到靶植物细胞(例如，未成熟或成熟的胚胎、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，随后应用最大阈值水平的合适选择(取决于选择标记基因，在这种情况下为“草甘膦”)，以从未转化的细胞群体中回收经转化的植物细胞。通常将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。随后，在置于补充有最大阈值水平的选择试剂(例如，“草甘膦”)的再生培养基上后，使经转化的细胞分化成幼芽。然后将幼芽转移至选择性生根培养基中以用于回收生根的幼芽或小植物。然后，转基因小植物生长为成熟植物并产生能育的种子(例如，Hiei等人(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida等人(1996)NatureBiotechnology 14：745-750)。通常将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。用于产生转基因植物的技术和方法的概括性描述可以在Ayres和Park(1994)Critical Reviews in PlantScience 13：219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120中找到。因为经转化的材料包含许多细胞；所以经转化的和未转化的细胞存在于受试靶愈伤组织或组织或细胞群的任何部分中。杀死未转化的细胞并允许经转化的细胞增殖的能力导致产生经转化的植物培养物。通常，去除未转化的细胞的能力是快速回收经转化的植物细胞和成功产生转基因植物的限制条件。分子和生物化学法可以用于证实转基因植物的基因组中存在整合的异源目的基因。

转基因植物的产生可以通过几种方法之一来进行，包括但不限于，通过土壤杆菌将异源DNA引入植物细胞内(土壤杆菌介导的转化)，用与粒子附着的异源外源DNA轰击植物细胞，和用于转移DNA的各种其他非粒子直接介导的方法(例如，Hiei等人(1994)The PlantJournal 6：271-282；Ishida等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750；Ayres和Park(1994)Critical Re views in Plant Science13：219-239；Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120)。

用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。该方法依赖于包含选择标记的DNA的基因枪递送并通过同源重组将该DNA靶向质体基因组。此外，质体转化可以通过核编码且质体指导的RNA聚合酶的组织偏爱的表达，经由沉默的质体携带的转基因的反式激活来完成。此类系统已在McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：7301-7305中得到报道。

已转化的细胞可以依照常规方法生长为植物。参见，例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后，可以让这些植物进行生长，并用相同的转化株或不同株进行授粉，并且鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得到的杂种。可以生长两代或更多代以确保所需表型特征的表达被稳定地维持和遗传，并随后收获种子以确保已获得了所需表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了经转化的种子(也称为“转基因种子”)，其具有本发明的核苷酸构建体，例如稳定地整合入其基因组内的本发明的表达盒。

E.植物转化的评估

在将异源外源DNA引入植物细胞内后，通过各种方法来证实异源基因已转化或整合入植物基因组中，所述方法例如为分析与整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢产物。

PCR分析是在移植到土壤中之前的较早阶段时就整合的基因的存在来筛选转化的细胞、组织或幼芽的快速方法(Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning；A Laboratory Manual(ColdS pringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY))。PCR使用对目的基因或土壤杆菌载体背景等特异的寡核苷酸引物来进行。

可以通过基因组DNA的Sout hern印迹分析来证实植物转化(Sambrook和Russell(2001)同上)。一般而言，从转化体中提取总DNA，用合适的限制酶消化，在琼脂糖凝胶中进行分级，并转移至硝酸纤维素或尼龙膜上。随后，可以用例如放射标记的³²P靶DNA片段来探测膜或“印迹”，以根据标准技术(Sambrook和Russell，2001，同上)来证实引入的基因整合到植物基因组中。

在Northern分析中，从转化体的特定组织中分离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中进行分级，并根据本领域常规使用的标准操作程序印迹到尼龙滤纸上(Sambrook和Russell(2001)同上)。随后，通过采用本领域已知的方法将滤纸与衍生自GDC的放射性探针杂交来测试由本发明的grg序列编码的RNA的表达(Sambrook和Russell(2001)同上)。

可以对转基因植物进行Western印迹法和生物化学测定法等，以通过标准操作程序来确定由除草剂抗性基因编码的蛋白质的存在(Sambrook和Russell(2001)同上)，其中使用与除草剂抗性蛋白质上存在的一种或多种表位结合的抗体。

F.植物和植物部分

“植物”意指整个植株、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚胎及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。本发明可以用于将多核苷酸引入任何植物种类内，包括但不限于，单子叶植物和双子叶植物。目的植物的例子包括但不限于，玉米(玉蜀黍)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜、芸苔属物种(Brassica sp.)、苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘类树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏树、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括但不限于，番茄、莴苣、青豆、利马豆、豌豆，以及甜瓜属(Cucumis)的成员，例如黄瓜、罗马甜瓜和香瓜。观赏植物包括但不限于，杜鹃花、绣球、木槿、玫瑰花、郁金香、水仙花、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。农作物植物也是感兴趣的，包括例如，玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜等。

本发明适合于单子叶植物家族的任何成员，包括但不限于，玉蜀黍、稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、薯蓣、洋葱、香蕉、椰子和枣椰子。

G.用于增加植物产量的方法

提供了用于增加植物产量的方法。所述方法包括将包含具有本文公开的序列结构域的EPSP合酶序列的多核苷酸引入植物或植物细胞中。如本文所定义的，植物的“产量”指由植物产生的生物量的品质和/或数量。“生物量”意指任何经测量的植物产物。生物量产生方面的增加是在所测量的植物产物的产量方面的任何改善。增加植物产量具有几种商业应用。例如，增加植物叶生物量可以增加用于人或动物消费的叶菜的产量。此外，增加叶生物量可以用于增加植物衍生的药物或工业产物的生产。产量的增加可以包括任何显著的增加，包括但不限于，至少1％的增加，至少3％的增加，至少5％的增加，至少10％的增加，至少20％的增加，至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。

在具体方法中，植物用有效浓度的除草剂进行处理，其中除草剂施用导致提高的植物产量。“有效浓度”意指允许植物中产量增加的浓度。对于目的除草剂而言此类有效浓度一般是本领域已知的。可以依照用于除草剂施用的常用技术，在苗前或苗后将除草剂施用至包含农作物的田地，所述农作物已通过本发明的EPSP合酶基因的异源表达而变得对于所述除草剂具有抗性。

还提供了用于在植物或植物部分中赋予除草剂抗性的方法。在这样的方法中，将本文公开的EPSP合酶多核苷酸引入植物中，其中所述多核苷酸的表达导致草甘膦耐受性或抗性。经由这种方法产生的植物可以用有效浓度的除草剂进行处理，并且对于所述除草剂展示出增加的耐受性。在本申请中，除草剂的“有效浓度”是足以减缓或终止植物或植物部分生长的量，所述植物或植物部分对于所述除草剂不是天然具有抗性的或者未被赋予对于所述除草剂的抗性。

H.用于控制田地中的杂草的方法

还提供了用于在包含植物的田地中选择性地控制杂草的方法。在一个实施方案中，植物种子或植物由于具有本文公开的序列结构域的多核苷酸插入植物种子或植物中而是草甘膦抗性的。在具体方法中，植物用有效浓度的除草剂进行处理，其中除草剂的施用导致杂草或其他未转化的植物的选择性控制。“有效浓度”意指这样的浓度，其控制杂草或其他未转化的植物的生长或散布而不显著影响草甘膦抗性植物或植物种子。关于目的除草剂的此类有效浓度一般是本领域已知的。可以依照用于除草剂施用的常规技术，在种子芽前或芽后将除草剂施用于包含植物或植物种子的田地，所述植物或植物种子已被赋予了对除草剂的抗性。

提供了下述实施例，这是为了举例说明而不是为了限制。

实验

实施例1.syngrg1的设计和表达

设计并合成编码GRG1蛋白(SEQ ID NO：2；美国专利申请号10/739,610)的新型基因序列。这种序列以SEQ ID NO：3提供。通过本领域已知的方法将在本文中命名为“syngrg1”的这个开放读码框克隆到表达载体pRSF1b(Invitrogen)中。

实施例2.GRG1的定点诱变

于2006年1月12日提交的美国专利申请号11/651,752(通过提及而合并入本文)公开了Q-环，其作为在将草甘膦抗性赋予EPSP合酶方面的重要区域。Q-环被定义为从相应于SEQ ID NO：2(GRG1)的氨基酸位置80的缬氨酸至相应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置105的谷氨酰胺的区域。为了本发明的目的，Q-环的讨论将进一步局限于包含Q-环的“核心”区域的区域，所述“核心”区域从相应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置84的异亮氨酸跨越至相应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置99的异亮氨酸。

在此，位置编号被分派给在这个核心区域中的氨基酸，以简化对于这个区域中每个氨基酸残基的提及。因此，Q-环核心的位置相应于SEQ ID NO：2的氨基酸84至99(I-D-C-G-E-S-G-L-S-I-R-M-F-T-P-I)，并且在本文中如下指定：

表1.关于Q-环核心氨基酸的位置坐标的命名

 

GRG1(SEQ ID NO：2)中的氨基酸(单字母代码)	Q-环核心中的指定位置
		I	位置1
D	位置2

 

C	位置3
		G	位置4
E	位置5
		S	位置6
G	位置7
		L	位置8
S	位置9
		I	位置10
R	位置11
		M	位置12
F	位置13
		T	位置14
P	位置15
		I	位置16

为了促进syngrg1基因的诱变，产生syngrg1的变体，其在Q-环侧翼形成方便的限制位点。这种变体DNA序列编码与GRG1蛋白同一的蛋白质。使用

Multisite试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)来进行syngrg1的诱变，其中使用GATGGCAGCCTCCAGATCACTAGTGAAGGCGTTAAGCCAGTGGC(SEQ ID NO：52)和GTTCACACCAATCGTGGCGCTTTCGAAGGAAGAAGTGACAATCAAG(SEQ ID NO：53)寡核苷酸以同时引入位于GRG1的Q-环区域侧翼的两个限制位点：位于环的5′的Spe I位点，和位于Q-环区域的3′的BstB I位点。通过DNA测序来证实所得到的克隆的DNA序列，‘syngrg1-SB’(SEQI D NO：4)。

实施例3.syngrg1-SB的组合诱变

用一组32种寡核苷酸通过在GRG1的Q-环核心区域内的组合诱变来形成突变体克隆文库(文库1)。这些寡核苷酸被设计为在Q-环残基的4个残基中引入突变，在Q-环核心的位置4、5、7和12处(表1和图1)。将寡核苷酸以10μM的浓度重悬浮于10mM Tris-HCl pH8.5中。为了形成双链DNA分子，混合互补寡核苷酸并如下进行温育：95℃ 1分钟；80℃ 1分钟；70℃ 1分钟；60℃ 1分钟；和50℃ 1分钟。

如制造商所说明的，用SpeI和BstBI限制酶消化包含简并密码子的双链DNA分子。在限制性消化后，将所述DNA加载到4％琼脂糖凝胶上并实施电泳。从凝胶中切除DNA，并使用

凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行洗脱。将退火的寡核苷酸连接到pRSF1b-syngrg-SB中，用Spe I和BstB I进行消化，用小牛碱性磷酸酶进行处理，转化到BL21*DE3细胞(Invitrogen)中，并铺板在包含卡那霉素的LB平板上。根据这些测试转化，估计该文库包含约140,000个克隆。为了证实该文库的多样性，从LB-卡那霉素平板中随机挑取20个克隆，并在Q-环区域中进行测序。该序列分析证实了该文库的高度多样性，并且证明75％的克隆是全长的并具有Q-环区域中的完整开放读码框(数据未显示)。

实施例4.syngrg1-SB的排列诱变(Permutational Mutagenesis)

将排列诱变的方法(于2006年6月13日提交的美国专利申请号60/813,095，其通过提及而整体合并入本文)用于产生在Q-环中的变体的第二个文库。将GRG1、GRG20(SEQ ID NO：54；美国专利申请号60/658,320)和GRG21(SEQ ID NO：55；美国专利申请号60/658,320)的氨基酸序列进行比对，并且形成了氨基酸的共有序列组(图2)。

设计一系列寡核苷酸以引入图2中所显示的多样性，其覆盖了Q-环核心的共有序列翻译的全部多样性，如表3中所示。位置1、6、11和15在GRG1、GRG20和GRG21之间是绝对保守的。通过这种方法产生的潜在多样性显示为在图2和SEQ ID NO：48中的共有序列翻译。

将寡核苷酸以10uM的浓度重悬浮于10mM Tris-HCl pH8.5中。为了形成双链DNA分子，混合互补寡核苷酸并如下进行温育：95℃1分钟；80℃ 1分钟；70℃ 1分钟；60℃ 1分钟；和50℃ 1分钟。将退火的寡核苷酸连接至用Spe I和BstB I消化的pRSF1b-syngrg1-SB，并用小牛碱性磷酸酶进行处理。将测试连接产物转化到BL21*DE3(Invitrogen)中，并铺板在LB-卡那霉素上。根据这些测试转化，估计该文库包含约180,000个克隆。从在LB上生长的克隆中随机选择20个克隆并进行测序。发现这20个克隆中的19个编码在Q-环区域中的全长的、符合读框的蛋白质，尽管在这个区域中产生大量的多样性。在经测序的该20个克隆中可见高度的变异(在所有13个靶位置处)，这暗示该文库的多样性接近其理论水平(数据未显示)。

实施例5.在平板上就草甘膦抗性进行筛选

将文库连接产物转化到BL21*DE3感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen)中。转化根据制造商的说明来进行，并具有下述修饰。于37℃在SOC培养基中温育1小时后，细胞通过离心(5分钟，1000xg，4℃)进行沉淀。细胞用1ml M63+进行洗涤，再次离心，并倾析出上清液。细胞用1ml M63+进行第二次洗涤，并重悬浮于200ul M63+中。

对于选择在大肠杆菌中赋予草甘膦抗性的突变型GRG1酶，将细胞铺板在包含50mM草甘膦、0.05mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和50ug/ml卡那霉素的M63+琼脂培养基平板上。M63+培养基包含100mM KH₂PO₄、15mM(NH₄)₂SO₄、50μM CaC l₂、1μM FeSO₄、50μM MgCl₂、55mM葡萄糖、25mg/L L-脯氨酸、10mg/L硫胺素HCl、足够的NaOH(以将pH调整至7.0)和15g/L琼脂。平板于37℃温育36小时。

实施例6.制备包含草甘膦抗性GRG-1突变体的提取物

使在草甘膦平板上生长的用GRG-1突变体转化的BL21*DE3细胞在补充有50ug/ml卡那霉素的LB培养基中于37℃进行生长。当培养基达到0.5的光密度(600nm)时，加入0.5mM IPTG，并使培养物于20℃温育16小时。使培养物在12,000xg下于4℃离心15分钟，去除上清液，并且将细胞重悬浮于50mM Hepes/KOH pH7.0，300mM NaCl，1mg/ml溶菌酶，0.04ml DNA酶I中。使经重悬浮的细胞在室温下温育1小时。使用Misonix Sonicator 3000(处于设置7.5)对细胞进行超声处理3次10秒。在超声处理冲击之间，将细胞在冰上温育30秒。使细胞裂解物在27000xg下于4℃离心15分钟，并回收包含细胞提取物的上清液。使细胞提取物逆50mM Hepes/KOH pH7.0，300mMNaCl透析2次4小时，并贮存于4℃。

实施例7：包含草甘膦抗性GRG-1突变体的提取物的定量

通过定量抗体斑点印迹法来测定细胞提取物中GRG-1变体蛋白质的表达。将2张3MM滤纸浸入1x PBS缓冲液(20mM磷酸钾pH7.2，150mM NaCl)中，并置于96孔斑点印迹多孔板(manifold)(Schleicher和Schuell，Keene，NH)中。将1张Optitran BA-S83硝酸纤维素膜(Schleicher和Schuell)浸入1x PBS缓冲液中，并置于3MM滤纸之上。在100ul 1x PBS的总体积中制备细胞提取物的系列稀释，以及具有已知浓度的纯化的GRG-1野生型蛋白质的稀释物(“蛋白质标准”)。将样品加载到斑点印迹孔中，并施加10cm Hg的真空。用300ul PBS将孔洗涤3次。取出硝酸纤维素膜，并在处于PBS中的3％奶粉之中封闭1小时。去除封闭溶液，并将硝酸纤维素膜与缀合至辣根过氧化物酶的抗-6xHis单克隆抗体(Serotec，Raleigh，NC)一起进行温育，所述单克隆抗体在处于PBS中的3％奶粉之中作1:5000稀释。在室温下温育1小时后，用PBS-T(在PBS中的0.05％Tween20)将膜洗涤4次5分钟。使所述膜与ECL PLUS^TM Western印迹法检测试剂(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)一起在室温下温育5分钟。去除检测溶液，并且将BiomaxLight胶片(Kodak)置于所述膜之上并暴露10分钟。对所述胶片进行扫描，并使用Phoretix Array软件(Nonlinear Dynamics，Durham，NC)通过与GRG1蛋白质标准进行比较来施行信号定量。

实施例8.GRG-1变体的EPSPS活性的测定

使用先前所描述的测定法(美国专利申请号60/741,166，其通过提及而整体合并入本文)，就EPSP合酶活性来测定包含GRG1变体蛋白质的提取物。根据制造商的说明，通常在50ul总体积中进行测定法，所述总体积包含0.5mM莽草酸-3-磷酸、0-500uM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、1U/ml黄嘌呤氧化酶、2U/ml核苷磷酸化酶、2.25mM肌苷、1U/ml辣根过氧化物酶、0-2mM草甘膦、50mM Hepes/KOH pH7.0、100mM KCl和

 Red(Invitrogen)。通常将提取物与除莽草酸-3-磷酸和 Red外的所有测定法组分一起在室温下温育5分钟，并且通过添加莽草酸-3-磷酸和 Red来开始测定法。使用Spectramax Gemini XPS荧光分光计(Molecular Dynamics，激发：555nm；发射：590nm)来测量EPSP合酶活性。

对于动力学参数的初始测定，于50uM的单一PEP浓度进行测定法，并且于0、1mM和2mM草甘膦评估所述酶的活性。选择其提取物在2mM对1mM草甘膦时显示出在活性方面具有很少差异或无差异的克隆，以用于完全动力学分析。

在动力学参数的完全测定后，如下测定动力学常数，对于通过本文所描述的抗体斑点印迹分析法或通过本领域已知的Bradford测定法测定的蛋白质的量进行调整。对于任何一种草甘膦浓度，作为广泛范围的PEP浓度的函数，测量EPSP合酶活性。使用软件(Synergy Software)将所述数据拟合至米-曼等式，并用于测定在那种草甘膦浓度下EPSP合酶的K_m(表观K_m)。表观K_m值在不少于3个草甘膦浓度下进行测定，并且由表观K_m对草甘膦浓度的图来计算关于草甘膦的EPSPS的K_i，使用本领域已知的等式(m1*x/(m2+x)；m1＝1；m2＝1)。

实施例9.来自文库1的变体残基的测定

对于文库1，通过在50mM草甘膦平板上生长而鉴定了23个克隆。从这23个克隆中分离出DNA，并且测定所述克隆的Q-环区域的DNA序列。对所有23个克隆(图4和SEQ ID NO：5-43)的粗提取物进行动力学分析。在从文库1中鉴定出的克隆中，确定克隆L1-C具有最高水平的草甘膦抗性，并且进行完全动力学分析。这个克隆在本文中被命名为syngrg1(evo2)，并且所编码的蛋白质被命名为GRG1(EVO1)(SEQ ID NO：5)。

所得到的DNA序列与随机取样的克隆的DNA序列的比较揭示出，在文库1中经改变的4个核心残基中，4个中的2个是不耐受变异的。例如，对于核心区域的位置5，在该测定法中使用的条件下(例如，在50mM草甘膦上生长)，仅编码谷氨酸的克隆出现在文库1中。这暗示，用其他氨基酸置换在该位置处的谷氨酸不导致可检测的草甘膦抗性克隆。根据这个分析，确定了，对于在所公开的测定法的条件下草甘膦抗性的增强，对于位置5，谷氨酸是优选的残基，和对于位置7，甘氨酸是优选的氨基酸。可能的是，从在更低的草甘膦浓度(例如，20mM、15mM、10mM或更低)下的筛选中或在更长的温育时间(例如，大于16小时)后可以鉴定出在这个区域中表现出进一步多样性的另外的抗性克隆。事实上，下文的实施例12证明，随着草甘膦浓度的增加，抗性克隆的数目减少。

表1.文库1的诱变

 

核心的位置	GRG1中的氨基酸(AA)	文库中呈现的AAs	在抗性克隆中鉴定出的AAs	EV02中存在的AA
					4	G	所有20种氨基酸	G、Q、V、D、E、I、N、M、A、T、S	G
5	E	所有20种氨基酸	E	E
					7	G	所有20种氨基酸	G	G
12	M	所有20种氨基酸	M、A、S、G、Q	A

实施例10：来自文库2的变体残基的测定

文库2具有超过2,000,000个克隆的理论多样性，并且就草甘膦抗性对大约180,000个克隆进行了测试。通过在50mM草甘膦平板上生长而鉴定出了9个克隆。从这9个克隆中分离出DNA，并且测定所述克隆的Q-环区域的DNA序列。所得到的DNA序列与随机取样的克隆的DNA序列的比较显示出，在文库2中经改变的13个核心残基中的许多是不耐受变异的(参见表3)。例如，在文库2中，核心区域的位置8表现为亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸这些氨基酸。然而，分离出的每一个草甘膦抗性克隆(在50mM草甘膦上生长)在这个位置8上包含亮氨酸。因此，这种方法可用于对核心区域中的可突变氨基酸进行“作图”。

在从文库2中鉴定出的克隆中，基于动力学分析确定克隆2-5在该测定法的条件下具有最高的草甘膦抗性，这些克隆在本文中被命名为syngrg1(evo1)，并且所编码的蛋白质被命名为GRG1(EV01)(SEQ ID NO：28)。

表3.文库2的诱变

 

核心的位置	GRG1中的氨基酸(AA)	文库中呈现的AAs	在抗性克隆中鉴定出的AAs	EV02中存在的AA
					2	D	D、K、E、N	D、K、E	D
3	C	C、L、W、F	C	C
					4	G	G、N、R、E、K、S、D	G、D、R、G、S	G
5	E	E、G	E	E
					7	G	G、A	G	G
8	L	L、S、R、I、T、M、P	L	L
					9	S	S、T	S	S
10	I	I、L、F、M	I、M、F	M
					12	M	M、F、I、L	M、L	L
13	F	F、L	F	F
					14	T	T、V、I、A	T、A、V、I	T
16	I	I、L、F、M	I、L、F、M	F

实施例11.evo3和evo4的产生和分离

使用上文的方法产生第三个文库，其中利用来自文库1和2的信息，从而使得仅利用已知可突变的残基。使用在位置2、10、14和16处编码每一个氨基酸可能性的寡核苷酸群体来产生文库3(参见图3)。如上文对于文库1所述，产生文库3，转化到大肠杆菌中，并以类似于对于文库1和2的方式就赋予草甘膦抗性的克隆来进行测试。如上所述，通过在具有50mM草甘膦、卡那霉素和IPTG的M63+平板上生长来筛选大约150,000个文库。由于在这些50mM草甘膦上生长而鉴定出了292个克隆。然后，将这292个克隆在包含100mM或200mM草甘膦的相似平板上进行再次划线。由于在200mM草甘膦上生长而鉴定出了7个克隆，并且就其动力学性质对所有7个克隆直接进行分析。然后，测定这些克隆的Q-环区域的DNA序列。两个克隆，即syngrg1(evo3)(SEQ ID NO：37；在本文中也称为evo3)和syngrg1(evo4)(SEQ ID NO：43；在本文中也称为evo4)，被鉴定为具有最大的在动力学参数方面的改善。

表4.文库3中的Q-环变体取样

 

核心的位置	GRG1中的氨基酸(AA)	文库中呈现的AAs	在抗性克隆中鉴定出的AAs	EV03中存在的AA	EV04中存在的AA
						2	D	所有	D、K、S、G、P、R、N	K	N
10	I	所有	I、G、S	G	I
						14	T	所有	T、P、L、G、V、A	P	A
16	I	所有	I、L、C、A	L	I

实施例12.EV01、EV02、EV03和EV04具有改善的动力学性质

EV01、EV02、EV03和EV04的动力学分析证明，相对于GRG1，所有4种这些蛋白质均显示出改善的草甘膦抗性(表5)。所有4种蛋白质显示出改善的关于草甘膦的K_i，并且保持低于200mM的合理的关于PEP的K_m。EV03显示出非常高的草甘膦抗性，和实质上与GRG1相同的关于PEP的K_m。EV04具有非常高的草甘膦抗性，和合理的(尽管稍微有些升高的)关于PEP的K_m。

表5.EV01-EV04对GRG1的动力学

 

	GRG-1wt	EV01	EV02	EV03	EV04
						Ki(μM)对GRG1	++	+++	+++	++++	++++

实施例13.另外的Q-环变体组合；文库4

由于鉴定了Q-环核心中的功能残基，以及鉴定了具有改善的功能的克隆，可以产生另外的文库，所述文库将在经改善的克隆中鉴定出的改变的残基相组合。获得这种文库的一种方法是以类似于文库1的方式，使用寡核苷酸来产生组合文库。备选地，可以产生排列文库(permutational library)，如文库2中一样。

将EV01、EV02、EV03和EV04的氨基酸序列进行比对，推导出共有序列翻译(SEQ ID NO：50)，并设计寡核苷酸以产生排列文库。这种文库具有大约1500个克隆的理论多样性。如本文所述使所述寡核苷酸退火，并连接至用Spe I和BstB I消化的pRSF1b-syngrg1-SB，和用小牛碱性磷酸酶进行处理。将所得到的文库铺板在包含50mM草甘膦的M63+平板(如上所述)上。由于在50mM草甘膦上生长而鉴定出了14个克隆。

就(1)改善的对于草甘膦的抗性和(2)不受干扰的对于PEP的亲和力，来测试由这14个克隆表达的蛋白质。分别编码蛋白质GRG1(4S-10)(SEQ ID NO：56)；GRG1(4S-16)(SEQ ID NO：59)；GRG1(4S-28)(SEQ ID NO：60)；GRG1(4S-3)(SEQ ID NO：61)；GRG1(4S-39)(SEQ ID NO：62)；和GRG1(4S-60)(SEQ ID NO：63)的这14个克隆中的6个[grg1(4S-10)(SEQ ID NO：66)；grg1(4S-16)(SEQ ID NO：69)；grg1(4S-28)(SEQ ID NO：70)；grg1(4S-3)(SEQ ID NO：71)；grg1(4S-39)(SEQ ID NO：72)；和grg1(4S-60)(SEQ ID NO：73)]，显示出改善的草甘膦抗性和良好的对于PEP的亲和力。将grg1(4s-10)重命名为grg1(evo5)(SEQ ID NO：66)，并且将它所编码的蛋白质命名为GRG1(EV05)(SEQ ID NO：56)。GRG1(EV05)蛋白的动力学分析(表6)确定，GRG1(EV05)具有1769的k_i/k_m比。

表6.所选择的变体的动力学

 

变体	k m (μM)	k i (μM)	k i /k m
				wt	22	152	7
4s-3	26	1,375	53
				4s-10[GRG1(EV05)]	5	8,757	1,769
4s-16	23	nd	nd
				4s-28	4.5	606	134
4s-39	2.8	851	304

在这6个变体中鉴定的氨基酸改变提供了在Q-环中的对于草甘膦抗性作出贡献的关键残基的进一步描绘。

表7.文库5中的Q-环变体取样

 

核心的位置	GRG1中的氨基酸(AA)	文库中呈现的AAs	在抗性克隆中鉴定出的AAs	EV05中存在的AA
					2	D	N、K、E、D	K、E	E
10	I	S、I、M、G、V、R	S、G、V	S
					12	M	T、I、M、A、V、S、L	I、M、A、L	I
14	T	T、P、A	T、P	T
					16	I	I、L、F	I、L、F	L

实施例14.随机诱变以增加GRG1(EV05)的溶解性；文库5

如本领域中已知的通过PCR对来自grg1(evo5)的DNA进行诱变，并克隆到pRSF1b(Invitrogen)中，并且根据在50mM草甘膦上生长来鉴定出经诱变的克隆的文库。然后，通过如本文所描述的定量斑点印迹法来分析这些克隆，并且根据显示出在可溶性蛋白质方面的实质增加来选择相对于grg1(evo5)具有修饰的2个克隆[(grg1(5.2.A10)(SEQ ID NO：67)和grg1(5.2.B6)(SEQ ID NO：68)]，它们分别编码GRG1(5.2.A10)(SEQ ID NO：57)和GRG1(5.2.B6)(SEQ ID NO：58)。GRG1(5.2.A10)(SEQ ID NO：57)和GRG1(5.2.B6)(SEQ ID NO：58)各自相对于GRG1(EV05)具有单个氨基酸改变。这些改变显示在表8中。将5.2.A10的EPSPS编码区重命名为grg1(evo6)(SEQ ID NO：67)，并将它所编码的蛋白质重命名为GRG1(EV06)(SEQ ID NO：57)。

表8.在变体5.2.A10(GRG1(EV06))和5.2.B6中的突变的概括

 

变体	相对于GRG1(EV05)的氨基酸改变
		5.2.A10[GRG1(EV06)]	N186→K
5.2.B6	V351→A

实施例15.grg1(evo7)和grg1(evo8)

在Q-环区域中诱变grg1(evo6)后，分离出编码GRG1(EV07)蛋白(SEQ ID NO：64)的grg1(evo7)(SEQ ID NO：74)，和编码GRG1(EV08)蛋白(SEQ ID NO：65)的grg1(evo8)(SEQ ID NO：75)作为草甘膦抗性克隆。GRG1(EV07)和GRG1(EV08)的动力学分析显示出，这2个克隆具有超过GRG1(EV06)的进一步改善的动力学性质。

表9.所选择的变体的动力学

 

	GRG1(EV06)	GRG1(EV07)	GRG1(EV08)
				k1(μM)	7,211	16,200	1,426
km(μM)	16	13	20
				V最大(nmol/分钟/ug)	7	15	6
ki/km	451	1,246	71

实施例16.Q-环核心区域的诱变的概括

由于对于Q-环核心区域进行了广泛诱变，分离出了继续显示出草甘膦抗性的变体，和分离出了经改善的变体，可以推断出GRG1主链中负责赋予改善的草甘膦抗性的关键氨基酸。数据概括在表10中。

表10.GRG1的诱变的概括

实施例17.Q-环中的关键氨基酸的进一步描绘

此处分离的变体的氨基酸序列进一步扩大并描绘在这个区域中耐受和所希望的关键氨基酸。因此，赋予草甘膦抗性的Q-环核心结构域的变异(位置2-16，相应于SEQ ID NO：2的位置85-99)可以由表达式X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X(SEQ ID NO：44)(其中X是任意氨基酸)来概括。

在一个实施方案中，该结构域由X₁-C-X₂-E-S-G-L-S-X₃-R-X₄-F-X₅-P-X₆(SEQ ID NO：45)来表示，其中X₁表示D、K、E、S、G、P、R或N，和X₂表示G、Q、V、D、E、I、N、M、A、T、S或R，和X₃表示I、G、S、M、F或V，X₄表示M、A、S、G、Q、L、V或I，X₅表示T、P、L、G、A、V或I，和X₆表示I、L、C、A、F或M。

在另一个实施方案中，该结构域由D-C-X₁-X₂-S-G(SEQ ID NO：76)来表示，其中X₁表示谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，和X₂表示任意氨基酸。

实施例18.将syngrg1、evo1、evo2、evo3、evo4、evo5、evo6、evo7 和evo8克隆到植物表达盒中

对于syngrg1、evo1、evo2、evo3、evo4、evo5、evo6、evo7和evo8中的每一个，通过PCR从全长DNA模板扩增开放读码框(ORF)。在PCR过程中给ORFs的每个末端添加Hind III限制位点。此外，紧挨该基因的起始密码子的5′处添加核苷酸序列ACC，以增加翻译效率(Kozak(1987)Nucleic Acids Research 15：8125-8148；Joshi(1987)Nucleic Acids Research 15：6643-6653)。使用本领域众所周知的技术来克隆PCR产物并进行测序，以确保在PCR期间没有引入突变。

用Hind III消化包含PCR产物的质粒，并分离包含完整ORF的片段。将这个片段克隆到质粒例如pAX200的Hind III位点中，pAX200是包含稻肌动蛋白启动子(McElroy等人(1991)Molec.Gen.Genet.231：150-160)和PinII终止子(An等人(1989)The Plant Cell 1：115-122)的植物表达载体。然后，将来自这种中间质粒的启动子-基因-终止子片段亚克隆到质粒pSB11(Japan Tobacco，Inc.)中，以形成最终的基于pSB11的质粒。在某些情况下，可能优选的是产生备选的构建体，其中将叶绿体前导序列编码为融合至syngrg1、evo1、evo2、evo3、evo4、evo5、evo6、evo7和evo8构建体的N-末端。通常如此地组织这些基于pSB11的质粒，即使得包含所述启动子-基因-终止子构建体或者启动子-叶绿体前导序列-基因-终止子构建体的DNA片段可以通过用限制酶例如Kpn I和Pme I进行双消化而切出，并且用于通过气溶胶束注射(aerosol beam injection)转化到植物中。通过限制性消化和凝胶电泳，以及通过在横跨各个克隆接头处进行测序来验证所得到的基于pSB11的克隆的结构。

通过使用本领域众所周知的三亲株交配操作程序并且在包含壮观霉素的培养基上铺板，来使该质粒移动到根瘤土壤杆菌菌株LBA4404内，所述菌株LBA4404还具有质粒pSB1(Japan Tobacco，Inc.)。所述基于pSB11的质粒克隆携带壮观霉素抗性但却是窄宿主范围质粒，并且在土壤杆菌中不能复制。当基于pSB11的质粒通过同源重组而整合到广宿主范围质粒pSB1中时，产生壮观霉素抗性菌落。pSB1和基于pSB11的质粒的共整合产物通过Southern杂交来进行验证。具有共整合物的土壤杆菌菌株用于通过本领域已知的方法例如PureIntro方法(Japan Tobacco)来转化玉蜀黍。

实施例19.通过气溶胶束来转化玉蜀黍细胞

最佳地在授粉后8-12天收集玉蜀黍穗。从穗中分离胚胎，并且大小0.8-1.5mm的那些胚胎优选用于转化。将胚胎以盾盖侧向上的方式放置在合适的温育培养基上，例如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1ml/L(的1000x母液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1ml/L(的1mg/ml母液)2，4-D)。然而，除DN62A5S外的培养基和盐也是合适的并且是本领域已知的。将胚胎在黑暗中于25℃温育过夜。但是，本身无需将胚胎温育过夜。

将所得到的外植体转移至网眼方阵(30-40个/平板)，转移至渗透培养基上并保持大约30-45分钟，随后转移至束射平板(beamingplate)(参见，例如，PCT公开号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。

使用气溶胶束加速器，将被设计为在植物细胞中表达本发明的GRG蛋白的DNA构建体加速进入植物组织中，其中使用基本上如PCT公开号WO/0138514中描述的条件。在束射(beaming)后，将胚胎在渗透培养基上温育约30分钟，并置于温育培养基上于25℃在黑暗中过夜。为了避免不适当地破坏经束射的外植体，在转移至恢复培养基前使它们温育至少24小时。然后，胚胎在恢复期培养基上于25℃在黑暗中扩散约5天，随后转移至选择培养基。取决于所利用的特定选择的性质和特征，使外植体在选择培养基中温育高达8周。在选择期后，将所得到的愈伤组织转移至胚胎成熟培养基，直至观察到成熟的体细胞胚的形成。然后，将所得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且通过本领域已知的方法起始再生过程。允许所得到的幼芽在生根培养基上生根，并且将所得到的植物转移至苗盆(nursery pot)中并繁殖成转基因植物。

材料

DN62A5S培养基

 

组分	每升	来源
			Chu’s N6基本盐混合物(Prod.No.C416)	3.98g/L	Phytotechnology Labs
Chu’s N6维生素溶液(Prod.No.C149)	1ml/L(的1000x母液)	Phytotechnology Labs
			L-天冬酰胺	800mg/L	Phytotechnology Labs
肌醇	100mg/L	Sigma
			L-脯氨酸	1.4g/L	Phytotechnology Labs
酪蛋白氨基酸	100mg/L	Fisher Scientific
			蔗糖	50g/L	Phytotechnology Labs
2，4-D(Prod.No.D-7299)	1ml/L(的1mg/ml母液)	Sigma

用1N KOH/1N KCl将该溶液的pH调整至pH5.8，添加Gelrite(Sigma)至3g/L，并进行高压灭菌。在冷却至50℃后，添加2ml/L的5mg/ml硝酸银母液(Phytotechnology Labs)。配方产生约20个平板。

实施例20.通过土壤杆菌介导的转化将EPSP合酶转化到玉蜀黍植物 细胞中

最佳地在授粉后8-12天收集穗。从穗中分离胚胎，并且大小0.8-1.5mm的那些胚胎优选用于转化。将胚胎以盾盖侧向上的方式放置在合适的温育培养基上，并在黑暗中于25℃温育过夜。

然而，本身无需将胚胎温育过夜。使胚胎与包含具有EPSP合酶(所述EPSP合酶具有本发明的Q-环区域结构域)的合适载体(用于Ti质粒介导的转移)的土壤杆菌菌株接触约5-10分钟，并随后铺板在共培养培养基上约3天(25℃，在黑暗中)。在共培养后，将外植体转移至恢复期培养基约5天(于25℃，在黑暗中)。取决于所利用的特定选择的性质和特征，使外植体在选择培养基中温育高达8周。在选择期后，将所得到的愈伤组织转移至胚胎成熟培养基，直至观察到成熟的体细胞胚的形成。然后，将所得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且如本领域已知的来起始再生过程。允许所得到的幼芽在生根培养基上生根，并且将所得到的植物转移至苗盆中并繁殖成转基因植物。

实施例21.表达grg1(evo5)和grg1(evo6)的转基因植物

将grg1(evo5)基因和grg1(evo6)基因各自克隆到适合于土壤杆菌介导的转化的植物表达载体中，此类载体至少包含(1)能够在植物细胞中表达的启动子，(2)叶绿体肽前导编码序列，(3)转录终止子。如本领域中已知和本文所描述的，将所得到的克隆pAX4014和pAX4032分别转移至土壤杆菌，并且将所得到的土壤杆菌菌株用于形成转基因玉蜀黍愈伤组织和最终形成转基因玉蜀黍植物。

转基因植物的Western印迹分析显示，GRG1(EV05)在grg1(evo5)转基因植物组织中表达，和GRG1(EV06)在grg1(evo6)转基因植物组织中表达。在适应土壤后，用14mM草甘膦的草甘膦制剂对T_o转基因植物进行喷雾，并且在2周后，相对于非转基因对照，对于对除草剂的抗性进行评分。

表11.草甘膦抗性植物

 

EPSPS基因	事件的数目	观察到EPSPS的表达？	在喷雾后2周时存活？	褪绿？	生长缓慢？	结实？
							GRG1(EV05)	>10	是	是	无	无	是
GRG1(EV06)	>10	是	是	无	无	是
							未转化的对照植物	N/A	否	否	N/A	N/A	N/A

说明书中提及的所有出版物和专利申请表明本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请通过提及而合并入本文，其程度就好像具体且独个地指出每一独个出版物或专利申请通过提及而合并。

尽管为了清楚地理解，已通过举例说明和实施例相当详细地描述了上述发明，但显而易见的是，可以在所附权利要求书的范围内施行某些变化和修饰。

序列表

<110>Athenix Corporation

    Volker Heinrichs

<120>改善的EPSP合酶：组合物及使用方法

<130>45600/329686

<150>60/813,061

<151>2006-06-13

<150>60/878,259

<151>2007-01-03

<160>76

<170>FastSEQ for Windows Version4.0

<210>1

<211>1398

<212>DNA

<213>肠杆菌科

<220>

<221>CDS

<222>(103)...(1398)

<400>1

<210>2

<211>431

<212>PRT

<213>肠杆菌科

<400>2

<210>3

<211>1296

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>syngrg1

<221>CDS

<222>(1)...(1296)

<400>3

<210>4

<211>1296

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>syngrg1-SB

<221>CDS

<222>(1)...(1296)

<400>4

<210>5

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆1-C(EV02)

<400>5

<210>6

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-1

<400>6

<210>7

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-10

<400>7

<210>8

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-11

<400>8

<210>9

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-12

<400>9

<210>10

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-14

<400>10

<210>11

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-15

<400>11

<210>12

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-2

<400>12

<210>13

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-3

<400>13

<210>14

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-4

<400>14

<210>15

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-5

<400>15

<210>16

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-6

<400>16

<210>17

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-7

<400>17

<210>18

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-12-9

<400>18

<210>19

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-6-1

<400>19

<210>20

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-6-2

<400>20

<210>21

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-6-4

<400>21

<210>22

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-6-5

<400>22

<210>23

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-A

<400>23

<210>24

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-B

<400>24

<210>25

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-E

<400>25

<210>26

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-F

<400>26

<210>27

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L1-G

<400>27

<210>28

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆2-5(EV01)

<400>28

<210>29

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L2-2

<400>29

<210>30

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L2-3

<400>30

<210>31

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L2-4

<400>31

<210>32

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L2-6

<400>32

<210>33

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L2-7

<400>33

<210>34

<211>23

<212>PRT

<213>人序列

<220>

<223>克隆L2-8

<400>34

<210>35

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L2-9

<400>35

<210>36

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L2-A

<400>36

<210>37

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L3_A-B6(EV03)

<400>37

<210>38

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L3_A-C9

<400>38

<210>39

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L3_A-D8

<400>39

<210>40

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L3_A-G8

<400>40

<210>41

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L3_B-G6

<400>41

<210>42

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L3_C-D8

<400>42

<210>43

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆L3_D-B9(EV04)

<400>43

<210>44

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>共有序列结构域

<221>VARIANT

<222>1，3，9，11，13，15

<223>Xaa＝任意氨基酸

<400>44

<210>45

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>共有序列结构域

<221>VARIANT

<222>1

<223>Asp，Lys，Glu，Asn，Ser，Gly，Pro或Arg

<221>VARIANT

<222>3

<223>Asn，Ala，Ser，Gly，Gln，Val，Asp，Glu，I le，Met，

    Thr或Arg

<221>VARIANT

<222>9

<223>Ile，Met，Phe，Gly，Ser或Val

<221>VARIANT

<222>11

<223>Met，Ala，Ser，Gly，Gln，Leu或Ile

<221>VARIANT

<222>13

<223>Thr，Ala，Val，Ile，Pro，Leu或Gly

<221>VARIANT

<222>15

<223>Ile，Leu，Cys，Ala，Phe或Met

<400>45

<210>46

<211>1500

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>从土壤中分离的

<400>46

<210>47

<211>499

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>从土壤中分离的

<400>47

<210>48

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>共有序列翻译-文库2

<221>VARIANT

<222>2

<223>Xaa＝Asp，Lys，Glu或Asn

<221>VARIANT

<222>3

<223>Xaa＝Cys，Leu，Phe或Trp

<221>VARIANT

<222>4

<223>Xaa＝Gly，Asn，Arg，Glu，Lys或Ser

<221>VARIANT

<222>5

<223>Xaa＝Glu或Gly

<221>VARIANT

<222>7

<223>Xaa＝Gly或Asp

<221>VARIANT

<222>8

<223>Xaa＝Leu，Ser，Arg，Ile，Thr，Met或Pro

<221>VARIANT

<222>9

<223>Xaa＝Ser或Thr

<221>VARIANT

<222>10

<223>Xaa＝Ile，Leu，Phe或Met

<221>VARIANT

<222>12

<223>Xaa＝Met，Phe，Ile或Leu

<221>VARIANT

<222>13

<223>Xaa＝Phe或Leu

<221>VARIANT

<222>14

<223>Xaa＝Thr，Val，Ile或Ala

<221>VARIANT

<222>16

<223>Xaa＝Ile，Leu，Phe或Met

<400>48

<210>49

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>共有序列-文库2寡核苷酸设计

<221>misc_feature

<222>4，10，11，14，40

<223>r＝A或G

<221>misc_feature

<222>6，8

<223>k＝G或T

<221>misc_feature

<222>9，12，24，30，36，39，48

<223>s＝G或C

<221>misc_feature

<222>22，42

<223>m＝A或C

<221>misc_feature

<222>23

<223>b＝G，C或T

<221>misc_feature

<222>25，28，34，46

<223>w＝A或T

<221>misc_feature

<222>27，41

<223>y＝T或C

<400>49

<210>50

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>共有序列翻译-文库4

<221>VARIANT

<222>4

<223>Xaa＝Asp，Lys或Asn

<221>VARIANT

<222>12

<223>Xaa＝Met，Ile或Gly

<221>VARIANT

<222>14

<223>Xaa＝Leu，Ala或Met

<221>VARIANT

<222>16

<223>Xaa＝Thr，Pro或Ala

<221>VARIANT

<222>18

<223>Xaa＝Phe，Leu或Ile

<400>50

<210>51

<211>103

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>共有序列寡核苷酸设计-文库4

<221>misc_feature

<222>20，33

<223>r＝A或G

<221>misc_feature

<222>22

<223>d＝G，A或T

<221>misc_feature

<222>26，28

<223>b＝G，C或T

<221>misc_feature

<222>32，40，64

<223>y＝T或C

<221>misc_feature

<222>34

<223>h＝A，T或C

<221>misc_feature

<222>38

<223>n＝A，C，G或T

<221>misc_feature

<222>39，62

<223>m＝A或C

<400>51

<210>52

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>52

<210>53

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>53

<210>54

<211>414

<212>PRT

<213>硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus sulfataricus)

<400>54

<210>55

<211>424

<212>PRT

<213>具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)

<400>55

<210>56

<211>431

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GRG1变体-GRG1(EV05)

<400>56

<210>57

<211>431

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GRG1变体-GRG1(EV06)

<400>57

<210>58

<211>431

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GRG1变体-GRG1(EV07)

<400>58

<210>59

<211>431

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GRG1变体-GRG1(EV08)

<400>59

<210>60

<211>431

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GRG1变体-GRG1(5.2.B6)

<400>60

<210>61

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GRG1变体-GRG1(4S-16)

<400>61

<210>62

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GRG1变体-GRG1(4S-28)

<400>62

<210>63

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GRG1变体-GRG1(4S-3)

<400>63

<210>64

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GRG1变体-GRG1(4S-39)

<400>64

<210>65

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GRG1变体-GRG1(4S-60)

<400>65

<210>66

<211>1296

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>grg1变体-grg1(evo5)

<400>66

<210>67

<211>1296

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>grg1变体-grg1(evo6)

<400>67

<210>68

<211>1296

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>grg1体-grg1(5.2.b6)

<400>68

<210>69

<211>99

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>grg1变体-grg1(4s-16)

<400>69

<210>70

<211>99

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>grg1变体-grg1(4s-28)

<400>70

<210>71

<211>99

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>grg1变体-grg1(4s-3)

<400>71

<210>72

<211>99

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>grg1变体-grg1(4s-39)

<400>72

<210>73

<211>99

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>grg1变体-grg1(4s-60)

<400>73

<210>74

<211>1296

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>grg1变体-grg1(evo7)

<400>74

<210>75

<211>1296

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>grg1变体-grg1(evo8)

<400>75

<210>76

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>共有序列结构域

<221>VARIANT

<222>3

<223>Xaa＝Gln，Val，Pro，Glu，Ile，Met，或Thr

<221>VARIANT

<222>4

<223>Xaa＝任意氨基酸

<400>76

Claims (36)

1.与SEQ ID NO：1和46不同的分离的多核苷酸，其编码具有选自下列的序列结构域的草甘膦耐受性EPSP合酶多肽：

a)X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X(SEQ ID NO：44)，其中X表示任意氨基酸；和

b)D-C-X₁-X₂-S-G(SEQ ID NO：76)，其中X₁表示谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，和X₂表示任意氨基酸。

2.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述序列结构域为X₁-C-X₂-E-S-G-L-S-X₃-R-X₄-F-X₅-P-X₆(SEQ ID NO：45)，并且其中X₁表示天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸或精氨酸；X₂表示天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或精氨酸；其中X₃表示异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸；其中X₄表示甲硫氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；其中X₅表示苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、亮氨酸或甘氨酸；和其中X₆表示异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸。

3.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码对于草甘膦除草剂具有抗性的EPSP合酶多肽。

4.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述序列结构域相应于SEQID NO：2的氨基酸位置85至99，并且选自SEQ ID NO：5-43和SEQ IDNO：56-65的相应位置。

5.权利要求4的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码与相应于SEQ ID NO：2的位置1至84和位置100至431的氨基酸具有至少70％序列同一性的EPSP合酶多肽，其中所述EPSP合酶多肽对于草甘膦除草剂具有抗性。

6.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码融合多肽，所述融合多肽包含氨基末端的叶绿体转运肽和所述EPSP合酶。

7.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸是被设计用于在植物中表达的合成序列。

8.权利要求7的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自SEQ IDNO：3、4、66、67、74和75。

9.用于产生显示出草甘膦耐受性的经遗传转化的植物的方法，其包括下列步骤：

a)将与SEQ ID NO：1和46不同的多核苷酸插入植物细胞的基因组中，所述多核苷酸编码具有选自下列的序列结构域的草甘膦耐受性EPSP合酶多肽：

i)X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X(SEQ ID NO：44)，其中X表示任意氨基酸；和

ii)D-C-X₁-X₂-S-G(SEQ ID NO：76)，其中X₁表示谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，和X₂表示任意氨基酸；

b)获得经转化的植物细胞；和

c)从所述经转化的植物细胞再生出对于草甘膦除草剂的耐受性增加的经遗传转化的植物。

10.权利要求9的方法，其中所述序列结构域为X₁-C-X₂-E-S-G-L-S-X₃-R-X₄-F-X₅-P-X₆(SEQ ID NO：45)，并且其中X₁表示天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸或精氨酸；X₂表示天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或精氨酸；其中X₃表示异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸；其中X₄表示甲硫氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；其中X₅表示苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、亮氨酸或甘氨酸；和其中X₆表示异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸。

11.权利要求9的方法，其中所述序列结构域相应于SEQ ID NO：2的位置85至99，并且选自SEQ ID NO：5-43和SEQ ID NO：56-65的相应位置。

12.权利要求11的方法，其中所述多核苷酸编码与相应于SEQ IDNO：2的位置1至84和位置100至431的氨基酸具有至少70％序列同一性的EPSP合酶多肽，其中所述EPSP合酶多肽对于草甘膦除草剂具有抗性。

13.权利要求9的方法，其中所述多核苷酸编码融合多肽，所述融合多肽包含氨基末端的叶绿体转运肽和所述EPSP合酶。

14.权利要求9的方法，其中所述多核苷酸是被设计用于在植物中表达的合成序列。

15.权利要求14的方法，其中所述多核苷酸选自SEQ ID NO：3、4、66、67、74和75。

16.草甘膦耐受性植物细胞，其包含与SEQ ID NO：1和46不同的异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码具有选自下列的序列结构域的草甘膦耐受性EPSP合酶多肽：

a)X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X(SEQ ID NO：44)，其中X表示任意氨基酸；和

b)D-C-X₁-X₂-S-G(SEQ ID NO：76)，其中X₁表示谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，和X₂表示任意氨基酸。

17.权利要求16的草甘膦耐受性植物细胞，其中所述序列结构域为X₁-C-X₂-E-S-G-L-S-X₃-R-X₄-F-X₅-P-X₆(SEQ ID NO：45)，并且其中X₁表示天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸或精氨酸；X₂表示天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或精氨酸；其中X₃表示异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸；其中X₄表示甲硫氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；其中X₅表示苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、亮氨酸或甘氨酸；和其中X₆表示异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸。

18.权利要求17的草甘膦耐受性植物细胞，其中所述序列结构域相应于SEQ ID NO：2的位置85至99，并且选自SEQ ID NO：5-43和SEQ ID NO：56-65的相应位置。

19.权利要求18的草甘膦耐受性植物细胞，其中所述多核苷酸编码与相应于SEQ ID NO：2的位置1至84和位置100至431的氨基酸具有至少70％序列同一性的EPSP合酶多肽，其中所述EPSP合酶多肽对于草甘膦除草剂具有抗性。

20.权利要求16的草甘膦耐受性植物细胞，其中所述多核苷酸编码融合多肽，所述融合多肽包含氨基末端的叶绿体转运肽和所述EPSP合酶。

21.权利要求16的草甘膦耐受性植物细胞，其中所述多核苷酸是被设计用于在植物中表达的合成序列。

22.权利要求21的草甘膦耐受性植物细胞，其中所述多核苷酸选自SEQ ID NO：3、4、66、67、74和75。

23.权利要求16的草甘膦耐受性植物细胞，其选自玉米、小麦、稻、大麦、大豆、棉花、甜菜、油籽油菜、卡诺拉油菜、亚麻、向日葵、马铃薯、烟草、番茄、苜蓿、杨树、松树、桉树、苹果、莴苣、豌豆、兵豆、葡萄和草坪草。

24.草甘膦耐受性植物，其包含权利要求16的植物细胞。

25.经转化的种子，其包含权利要求1的多核苷酸。

26.权利要求25的草甘膦耐受性植物，其选自玉米、小麦、稻、大麦、大豆、棉花、甜菜、油籽油菜、卡诺拉油菜、亚麻、向日葵、马铃薯、烟草、番茄、苜蓿、杨树、松树、桉树、苹果、莴苣、豌豆、兵豆、葡萄和草坪草。

27.用于在包含植物的田地中选择性地控制杂草的方法，所述包含植物的田地具有种植的种子或植物，所述方法包括下列步骤：

a)种植由于将与SEQ ID NO：1和46不同的多核苷酸插入了种子或植物中而对于草甘膦具有耐受性的种子或植物，所述多核苷酸编码具有选自下列的序列结构域的草甘膦耐受性EPSP合酶多肽：

i)X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X(SEQ ID NO：44)，其中X表示任意氨基酸；和

ii)D-C-X₁-X₂-S-G(SEQ ID NO：76)，其中X₁表示谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，和X₂表示任意氨基酸；和

b)对田地中的所述植物和杂草施用有效浓度的草甘膦除草剂，以控制杂草而不显著地影响所述植物。

28.权利要求27的方法，其中所述序列结构域为X₁-C-X₂-E-S-G-L-S-X₃-R-X₄-F-X₅-P-X₆(SEQ ID NO：45)，并且其中X₁表示天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸或精氨酸；X₂表示天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或精氨酸；其中X₃表示异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸；其中X₄表示甲硫氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；其中X₅表示苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、亮氨酸或甘氨酸；和其中X₆表示异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸。

29.权利要求28的方法，其中所述序列结构域相应于SEQ ID NO：2的位置85至99，并且选自SEQ ID NO：5-43和SEQ ID NO：56-65的相应位置。

30.权利要求29的方法，其中所述多核苷酸编码与相应于SEQ IDNO：2的位置1至84和位置100至431的氨基酸具有至少70％序列同一性的EPSP合酶多肽，其中所述EPSP合酶多肽对于草甘膦除草剂具有抗性。

31.权利要求28的方法，其中所述多核苷酸编码融合多肽，所述融合多肽包含氨基末端的叶绿体转运肽和所述EPSP合酶。

32.权利要求28的方法，其中所述多核苷酸是被设计用于在植物中表达的合成序列。

33.权利要求32的方法，其中所述多核苷酸选自SEQ ID NO：3、4、66、67、74和75。

34.编码草甘膦耐受性EPSPS酶的分离的核酸分子，其中所述草甘膦耐受性EPSPS酶具有约100-约1700的K_i(草甘膦)/K_m(PEP)。

35.具有稳定整合到其基因组内的DNA构建体的植物，所述DNA构建体包含编码草甘膦耐受性EPSPS多肽的核苷酸序列，所述EPSPS多肽具有约100-约1700的K_i(草甘膦)/K_m(PEP)，所述植物显示出对于草甘膦除草剂的耐受性。

36.权利要求35的植物，其中所述植物选自玉米、小麦、稻、大麦、大豆、棉花、甜菜、油籽油菜、卡诺拉油菜、亚麻、向日葵、马铃薯、烟草、番茄、苜蓿、杨树、松树、桉树、苹果、莴苣、豌豆、兵豆、葡萄和草坪草。

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