CN102911950A - 一种高粱抗草甘膦5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高粱5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶变体，它较其他物种变体对其合成底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的竞争性抑制剂草甘膦表现出很高的耐受性。本发明也涉及利用该变体培育抗草甘膦玉米的应用。

Description

一种高粱抗草甘膦5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学和植物遗传工程学领域。具体的说，本发明涉及修饰以抗草甘膦的I型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶。使用植物遗传工程学方法修饰I型5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶DNA和其编码的蛋白，并将这些分子转入农艺学重要的植物中。更具体的说，本发明包含来源于高粱的抗草甘膦的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的DNA和蛋白组合物，以及含有这些组合物的玉米组织，含有这些组合物的玉米对草甘膦具有耐受性，方便农田中的杂草清除。本发明可以运用于玉米的育种、玉米细胞培养的筛选。

背景技术

N-膦酰甲基甘氨酸，也称草甘膦，是使用最为广泛的广谱除草剂，具有对人畜无毒，自然条件下杂草和农作物难以对其产生抗性，低土壤残留量、易于被微生物分解等特点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的除草剂品种。然而由于草甘膦无选择性的杀死杂草和作物，限制了其只能在作物出苗前或非作物种植区使用，这便制约了其在农业上的应用。为了获得抗草甘膦作物，从上世纪80年代，人们便开始培育抗草甘膦农作物，其中最成功的例子是将改良的草甘膦靶标酶EPSP合酶导入植物中，以提高转基因植物对草甘膦的抗性。

草甘膦是通过抑制芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，该酶催化莽草酸代谢途径倒数第二个反应。正常情况下EPSPS催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与3-磷酸莽草酸(S3P)反应生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和无机磷。由于草甘膦与PEP结构相似，在植物和微生物体内可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦复合物，阻截PEP与酶的结合，从而阻断芳香族氨基酸的合成。该酶只在植物和微生物中存在，在动物体中不存在。在一些极端环境下，如长期喷洒草甘膦的农田、草甘膦工厂的废液池以及人为的加大对某植株草甘膦的选择压力等，发现了部分对草甘膦具有耐受能力的细菌和植物。如Amrhein等人通过逐渐增加草甘膦的浓度，分离到一个耐受草甘膦的矮牵牛细胞系；Baerson等人在长期喷洒草甘膦的果园中发现了一株耐受草甘膦的牛筋草，经过后期实验证明这些抗性的产生均为EPSPS基因发生了突变，导致了其与草甘膦的结合能力降低，并且保证了正常的催化能力。植物可以通过转化对草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而获得抗草甘膦的能力。根癌农杆菌CP4、荧光假单胞菌G2和Salmonella typhimurium CT7的EPSPS已经在植物中得到广泛的验证和应用。

在某些植物和某些细菌中发现的I型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)对草甘膦具有抗性。在植物中草甘膦的抗性可以通过表达与草甘膦具有较低亲和力的修饰I型EPSPS而获得，存在草甘膦时此酶也仍然保持其催化活性(ZL200480009843和ZL200380105147)。植物对草甘膦耐受或对草甘膦具有抗性是指用草甘膦除草剂喷施植物后，植物可以正常生长发育。

现已被确定EPSP合成酶分为两个家族(Ming He等2001)，家族I包括来源于大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的EPSP合成酶；家族II包括来源于根癌农杆菌CP4、无色杆菌LBAA、假单胞菌PG2982。家族II的EPSP合成酶多克隆抗体与家族I的EPSP合成酶不发生交叉反应，且两者间的氨基酸同源性低于50％。

在天然的植物EPSPS基因中，叶绿体转运肽区域包含在天然的编码序列中(例如：CTP2，Klee等，Mol.Gen.Genet.210：47-442，1987)，CTP在叶绿体膜上从EPSPS酶上裂解下来，产生成熟的EPSPS。叶绿体转运肽对EPSPS酶行使正常功能是必须的，在蛋白结构及功能一致的前提下，如果去掉信号肽，虽然整个植物组织EPSPS蛋白表达量一致，但是植株确不具有草甘膦抗性，不同来源的信号肽对EPSPS蛋白在不同转化受体中行使功能的效率存在差异(Guy dellaCioppa1988，Guy della Cioppa1986)。

耐除草剂农作物的开发已经成为农业生物技术的主要突破，为农场主提供了新的杂草防除方法。一种成功被设计为耐受抑制剂除草剂的酶是I型EPSPS。国内外已经分离了大量抗草甘膦的I型EPSPS变体(Pro-Ser，US4769061；Gly-Ala，US4971908；Gly-Ala，Gly-Asp，美国专利5310667；Gly-Ala、Ala-Thr，US58866775)。然而许多EPSPS变体不能表现对草甘膦有足够高的Ki，或者对磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km太高而不能有效的作为草甘膦抗性酶在植物中使用(padgette等，“Herbicide-resistant Crop”中，4章53-83页，Stephen Duke编，LewisPub，CRC Press Boca Raton，F11996)。一种成功耐受草甘膦的EPSPS变体，不单单取决于变化发生的位点，还取决于变体的来源，目前商品化最为广泛的CP4EPSPS来源于农杆菌CP4菌株，其变化的位点在第100位的Ala转变为Gly，而将大肠杆菌或肺炎链球菌相应的Ala转变为Gly确不能赋予EPSPS变体草甘膦抗性(Eschenburg，S.等2002；Sost，D.等1990；ToddFunke等2006)。由此可见选择恰当来源的EPSPS进行相应位点的改变，获得对草甘膦具有足够抗性的EPSPS蛋白起到关键的作用。目前国内外虽然获得了大量对草甘膦具有一定抗性的EPSPS变体，然而能够应用到生产中的确非常少，主要原因在于没有选择合适来源的EPSPS变体，而达不到生产的要求(Zhou Min等2002，Sun Yicheng等2005)。

在植物分子生物学领域内需要可提供阳性选择标记表型的各种基因。具体地说，草甘膦耐受可在植物中广泛地用作阳性选择标记，并且用在农作物生产中是很有价值的表型。当使用不同的阳性选择标记基因时，扩展了现有的转基因性状与新开发性状的堆积和组合。标记基因提供了不同的表型如抗生素或草甘膦耐受，或者通过DNA检测方法可区别的分子差异。通过多重抗生素或除草剂耐受分析，或通过DNA检测方法检测新型DNA分子的存在，可以筛选叠加性状的转基因植物。本发明提供了抗草甘膦变体I型EPSP合酶的DNA和蛋白组合物。本发明也提供了用于植物的DNA构建和展示草甘膦抗性的转基因植物。

发明内容

本发明一方面提供了分离后修饰的高粱EPSPS DNA分子，它编码的耐受草甘膦的EPSPS蛋白在60位为天冬酰胺、71位为缬氨酸、106位具有丝氨酸、161位为异亮氨酸、313位为谷氨酰胺、345位为天冬酰胺。本发明的另一方面是包含启动子的DNA构建物，此启动子在植物细胞中有功能，有效与修饰的高粱EPSPS DNA分子连接，该修饰EPSPS DNA分子编码的耐受草甘膦的EPSPS蛋白在60位为天冬酰胺、71位为缬氨酸、106位具有丝氨酸、161位为异亮氨酸、313位为谷氨酰胺、345位为天冬酰胺。本发明的又一方面提供了包含DNA构建物的转基因玉米，其中此转基因玉米耐受草甘膦除草剂，耐受能力达到1200克/亩。

本发明的另一方面是一个制备转基因玉米的方法，包括提供具有修饰高粱EPSPS基因的植物表达载体，该修饰高粱EPSPS基因编码的耐受草甘膦的EPSPS蛋白在60位为天冬酰胺、71位为缬氨酸、106位具有丝氨酸、161位为异亮氨酸、313位为谷氨酰胺、345位为天冬酰胺；在允许植物表达载体能被受体玉米细胞摄取的条件下，将受体玉米细胞与植物表达载体接触；选择包含植物表达载体的受体玉米细胞；从选择的受体玉米细胞再生植物；鉴定耐受草甘膦的转基因玉米。

本发明的另一方面是可育的草甘膦耐受的转基因玉米，它包含具有修饰高粱EPSPS基因的植物表达载体，该修饰高粱EPSPS基因编码的耐受草甘膦的EPSPS蛋白在60位为天冬酰胺、71位为缬氨酸、106位具有丝氨酸、161位为异亮氨酸、313位为谷氨酰胺、345位为天冬酰胺；将此转基因玉米与其他玉米杂交，以提供耐受草甘膦的子代玉米。

本发明的另一方面提供了在玉米田地中杂草防除的方法，其中玉米田地用有效量的含草甘膦除草剂处理，并且田间玉米包含具有修饰EPSPS基因的植物表达载体，该修饰EPSPS基因编码的耐受草甘膦的EPSPS蛋白在60位为天冬酰胺、71位为缬氨酸、106位具有丝氨酸、161位为异亮氨酸、313位为谷氨酰胺、345位为天冬酰胺。

附图简述

图1.修饰后高粱EPSPS基因的原核表达载体

图2.耐受草甘膦的牛筋草EPSPS植物表达载体

图3.耐受草甘膦的玉米EPSPS植株表达载体

图4.修饰后高粱EPSPS植物表达载体

图5.转牛筋草耐草甘膦EPSPS基因的玉米检测结果

图6.转玉米耐草甘膦EPSPS基因的玉米检测结果

图7.转修饰后高粱EPSPS基因的玉米检测结果

图8.转牛筋草耐草甘膦EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果

图9.转玉米耐草甘膦EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果

图10.转修饰后高粱EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体实施步骤参考(Sambrook等人，分子克隆实验指南，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，所用术语和缩写均是本领域技术人员通用的术语和缩写。

实施例1、高粱5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的定向诱变。

1、定向诱变体的选择

一种成功耐受草甘膦的EPSPS变体，不单单取决于变化发生的位点，还取决于变体的来源，目前商品化最为广泛的CP4EPSPS来源于农杆菌CP4菌株，其变化的位点在第100位的Ala转变为Gly，而将大肠杆菌或肺炎链球菌相应的Ala转变为Gly确不能赋予EPSPS变体草甘膦抗性(Eschenburg，S.等2002；Sost，D.等1990；Todd Funke等2006)。造成这种原因主要取决于两点：1、EPSPS变体对草甘膦的Ki是否足够高，2、对磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km足够低。

玉米的EPSPS变体(P106S)SEQ ID NO：2虽然对磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km足够低(Km-PEP＝17.1±2.8μM)但对草甘膦的Ki却不够高(Ki-glyp＝1.0±0.1μM)而达不到在生产上的应用(ZL200480009843.2)，牛筋草的EPSPS变体(P106S)SEQ ID NO：1对磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km足够低(Km-PEP＝8.9±1.0μM)但对草甘膦的Ki却不够高(Ki-glyp＝1.04±0.138μM)从而至今没有相关应用到实际生产中的报道(Scott R.Baerson2002)。我们利用玉米和牛筋草的EPSPS变体(P106S)转化玉米获得的转基因植株进行田间鉴定时也验证了上述结果。为此我们选择了与玉米有一定亲缘关系的高粱EPSPS基因作为诱变体，来验证经过诱变的高粱EPSPS基因在玉米中所表现的抗草甘膦效果。

2、高粱EPSP合酶cDNA全长的克隆

根据http://www.phytozome.net中高粱EPSP合酶的cDNA全序列，我们分析了该基因的结构，分析结果认为，高粱EPSPS基因5’端的62个氨基酸为叶绿体信号肽，第63个至第506个氨基酸为EPSPS功能区域。

我们以高粱BTX623为材料，提取幼苗总RNA，并反转录获得cDNA，以cDNA为模版，5’gaagcagacaaagttgccaaaaga 3’为上游引物、5’ATCCCGCTGCGTGGTAGTATATCAC 3’为下游引物扩增EPSPS部分功能域，同时人工合成EPSPS 5’端序列，将合成的序列与扩增序列分别连接，获得修饰后高粱EPSPS基因(P106S)功能域的核苷酸序列，SEQ ID NO：5所示，我们将其命名为L38；修饰后高粱EPSPS基因(P106S)的核苷酸序列，SEQ ID NO：6所示，我们将其命名为CL38。RNA提取方法及RT-PCR参考分子克隆实验指南(第三版)，核苷酸合成在北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行。对修饰后高粱EPSPS基因(P106S)功能域的氨基酸序列与耐草甘膦牛筋草EPSPS(P106S)及玉米EPSPS(P106S)的同源性分析结果显示，其同源性分别为97％和99％。

3、修饰后高粱EPSPS酶活性检测

正常情况下EPSPS催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与3-磷酸莽草酸(S3P)反应生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和无机磷。由于草甘膦与PEP结构相似，在植物和微生物体内可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦复合物，阻截PEP与酶的结合，从而阻断芳香族氨基酸的合成。耐草甘膦的EPSPS酶不仅需要其较野生型EPSPS酶对草甘膦有更高的Ki，这样会赋予其耐受草甘膦的表型，同时一个耐受草甘膦的变体需要保持与野生型基本一致的对PEP的Km，保持其正常的酶动力学活性。为此我们构建了原核表达载体，具体见图1.修饰后高粱EPSPS基因(P106S)的原核表达载体，并转化了EPSPS缺陷型的大肠杆菌，体外验证了高粱EPSPS变体的酶活，具体实验流程参考Scott R.Baerson2002。实验结果表明修饰后高粱EPSPS变体(P106S)较牛筋草及玉米的EPSPS变体(P106S)的Km值基本一致，而Ki确明细提高，Ki为120±28μM，明显高于牛筋草的1.04±0.138μM和玉米的1.0±0.1μM。这表明高粱EPSPS变体更具有在实际生产中的应用前景，这主要取决于野生型高粱EPSPS酶的结构总体特征。

实施例2、修饰后高粱EPSPS植物表达载体的构建

我们将SEQ ID NO：6序列的5’端添加了BglII的酶切位点，3’端添加了KpnI的酶切位点，利用BglII、KpnI消化T-easy+CL38，回收CL38目标片段。通过已有的植物表达载体pHM102，分别用BamHI、Kpn1消化pHM102，由于BamHI与BglII酶切后产生的粘性末端相同，因此可以进行连接，将两个片段连接，得到修饰后高粱EPSPS(P106S)的植物表达载体，命名为pHM-CL38，具体见图4.修饰后高粱EPSPS植物表达载体。我们利用相同的方法分别构建了牛筋草、玉米的EPSPS变体的植物表达载体，具体见图2.耐受草甘膦的牛筋草EPSPS植物表达载体，命名为pHM+Ei-EPSPS，图3.耐受草甘膦的玉米EPSPS植株表达载体，命名为pHM+Zm-EPSPS。

实施例3、抗草甘膦基因CL38在玉米中的表达。

1、转抗草甘膦基因CL38玉米的获得

转基因玉米的获得方法为采用基因枪法将插入序列导入受体植株的愈伤组织，经100mg/L的除草剂草甘膦筛选后获得转基因植株。具体方法为：

(1)、诱导II型愈伤组织

a、去除苞叶：切除果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，这样可以以镊子当作把手，有利与操作，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可以在同一个烧杯里放4-6个果穗。

b、向烧杯里加约700ml的消毒液(50％的漂白剂或5.25％的次氯酸钠，并加入一滴Tween20)用来浸泡果穗，在消毒20分钟过程当中，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除子粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果。消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚。

c、把消过毒的果穗一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部(1-2mm)，在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等。

d、用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基，胚的密度大约是2X2cm(20-25个/皿)。

e、新鲜的幼胚大约1.5-1.8mm大小，放置在N6E培养基上面，每隔10-15天继代一次，刚获得的幼胚容易长出芽状组织，这样可以提早去掉该组织，而不用等到10-15天。

f、挑选优等II型愈伤：第二次愈伤继代时，II型愈伤已经开始形成，其特征为：颜色米黄，生长速度快，松散易碎，新生愈伤顶端呈现米粒状颗粒。可以根据其特征来进行有针对性的挑选，可以把已经分化出的II型愈伤分成麦粒状大小，每皿(90cm)放20-25块。

g、为了保证愈伤的质量，保证每次继代的时间间隔不能超过15天，同时保证一直有400皿以上的II型愈伤，以便做基因枪转化。

(2)、金粉的准备和基因枪轰击

a、称量15mg金粉并放入灭菌后的1.5ml的eppendorf离心管当中，这样结果是10X的量。

b、在超净台下，向每个离心管中加入500ul冰冻(-20℃)无水乙醇，震荡15sec，在超净台上收集金粉到离心管底部，静置30min，直到金粉全部沉淀。

c、然后转速3000rpm离心60sec，彻底去除乙醇。再向离心管中加入冰浴的无菌ddH2O，用手指轻弹混匀，然后转速3000rpm离心60sec。重复上述步骤2-3次，最后一次用转速5000rpm离心15sec，然后移去上清，再用500ulddH2O悬浮。震荡15sec，然后快速悬浮混匀，边混边分装。

d、具体的分装方法是：先把10个离心管放好，用25ul的量分装，重复分装两次，第一遍从第一个管开始，第二遍从最后一个管开始，这样每个离心管含有50ul水，1.5mg金粉。然后盖上盖子于-20℃保存。

e、上午先把要打枪的愈伤分成小块，堆积在渗透培养基(N6OSM)的中央区域，根据计划做准备。

f、目的DNA的包裹，先把分装好的金粉(-20℃)(每管1.5mg并保存在50微升超纯水当中)放在冰上，同时把CaCL₂浓度为2.5M(4℃)和亚精胺浓度为0.1M(-70℃)也放在冰上融化，其中CaCL₂和亚精胺分装成一次性使用的包装。

g、用手指轻轻弹装有金粉的离心管使之悬浮起来，然后加入目的DNA(60-200ng)，迅速用手指轻弹使之混匀然后加入50微升CaCL₂并用枪头轻轻吸吐使之混匀，然后加入20微升亚精胺，静置30秒把离心管放在漩涡振荡器上面震荡10分钟(注意使旋涡液体不要上升太高，同时使液体全部悬浮起来)。

h、离心管放到冰上静置5分钟(如果震荡以后有金粉在液体表面漂浮，静置前再用手指轻弹使之沉淀下来)，2000rpm离心15秒，然后用吸头吸掉上清加入预冷(-20℃)的无水乙醇250微升，并用枪头轻轻(20微升的枪调到10-13微升)吸吐混匀。重复以上步骤3-4次，然后加入无水乙醇120-140微升使之平均分成8份并加到宏载片上面开始基因枪轰击。

i、基因枪轰击以后的1-12小时把愈伤倒至N6E培养基上进行恢复。

(3)、转基因植株的获得

a、在N6E培养基上诱导愈伤组织10-14天后，转移到N6S(选择培养基)上(2.0mg/Lbialaphos)，开始选择含有转化子的细胞，然后用parafilm封口膜封培养皿。

b、3周以后，把胚转移到新鲜的N6S培养基上，大约6-8周，就会选到抗草胺膦的克隆。

c、把II型愈伤组织每皿转移15片(4mm/片)到再生培养基I上，25度暗培养2-3周，并用通风带封住培养皿。

d、2-3周后，把成熟的胞质胚转移到再生培养基II上准备发芽，同时用通风带封住培养皿，植株将在这个培养基里长叶和根。

e、移栽成活的转化植株长出7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，转基因植株开花后套袋自交或姊妹交结实。种子播种在温室，植株长到4-6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是带有外源基因。

牛筋草及玉米来源的EPSPS变体转化方法同修饰后高粱EPSPS基因。

2、转基因植株的检测

根据修饰后高粱EPSPS(P106S)合酶基因序列和PHM102载体上的序列分别设计上游和下游引物，引物序列如下：CL38F：5’CGTGGCGTCCTGGAGAGTAAAG 3’，CL38R：5’CCAATACGCAAACCGCCTCT 3’分别提取通过上述方法获得的转基因植株的基因组DNA，取0.1μg基因组DNA为模板，分别在检测引物F和检测引物R的引导下，用PCR法鉴定外源基因CL38在基因组上的整合情况，反应条件为：95℃反应5min，95℃反应45s，59℃反应45s，72℃反应1min，32个循环，72℃反应10min，10℃保持。电泳PCR产物结果如图7.转修饰后高粱EPSPS基因的玉米检测结果，结果表明不同的转化事件均有目标基因的整合。

牛筋草EPSPS变体转化玉米的检测上游引物为：5’GTGGCTTCCTGGAGAGTAAAG 3’，下游引物为5’CCAATACGCAAACCGCCTCT 3’，检测结果见图5.转牛筋草耐草甘膦EPSPS基因的玉米检测结果。

玉米EPSPS变体转化玉米的检测上游引物为：5’GTGGCTTCCTGGAGAGTAAAG 3’，下游引物为5’CCAATACGCAAACCGCCTCT 3’，检测结果见图6.转玉米耐草甘膦EPSPS基因的玉米检测结果。

泳道M为MarkerIV，泳道CK-为转化有空载体的阴性对照，空为以ddH2O为模版扩增结果，CK+为质粒DNA阳性对照，泳道1-20为不同的转化事件，可以扩增出800bp左右大小特异片段的即为含有SbEPSPS-L38基因的转基因阳性植株，通过PCR结果可以看出1-20均为阳性植株。

3、转基因玉米田间草甘膦抗性检测

对获得的转基因植株喷施800ml/亩的商品化草甘膦，植株没有药害的条件下表明该转基因植株拥有足够的草甘膦抗性。我们对来源于高粱、玉米、牛筋草的EPSPS基因分别进行了诱变(P106S)，对诱变后的基因构建了植物转化载体并转化了玉米，每个诱变体获得了20个转化事件，通过对这些转化事件田间抗性鉴定结果表明：玉米及牛筋草来源的EPSPS变体在草甘膦耐受水平没有超过800ml/亩，而高粱来源的EPSPS变体每个转化事件草甘膦耐受能力均超过800ml/亩，具体见图8.转牛筋草耐草甘膦EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果，图9.转玉米耐草甘膦EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果，图10.转修饰后高粱EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果，CK-为非转基因对照，CK+为未喷施除草剂对照，1-5分别为不同的转化事件喷施800ml/亩的草甘膦后的表现，这说明来源于高粱的诱变体更容易获得有效的转化事件，这主要取决于修饰后高粱EPSPS(P106S)酶对草甘膦有足够高的Ki，并且对磷酸烯醇丙酮酸(PEP)较低的Km。

Claims (5)

1.一种从高粱(Sorghum bicolor)中分离的DNA分子，所述DNA分子编码抗草甘膦EPSPS蛋白，其中所述抗草甘膦EPSPS蛋白包含多肽序列GTX1X2RS，其中X1、X2为任何氨基酸。

2.一种DNA构建物，所述DNA构建物包含启动子，所述启动子在植物细胞中发挥功能且有效地与编码抗草甘膦EPSPS蛋白的DNA分子连接，其中所述抗草甘膦EPSPS蛋白为权利要求一种所述蛋白。

3.一种制备草甘膦耐受玉米的方法，所述方法包括以下步骤：1)将接受植物细胞与权利要求2的DNA构建物接触，其中所述DNA构建物掺入接受玉米细胞的基因组；2)将接受玉米细胞再生为植株并繁衍后代；3)向所述玉米及其繁衍后代施用有效剂量的草甘膦，所述玉米及其繁衍后代展示出草甘膦耐受表型。

4.一种包含权利要求2的DNA构建物的转化玉米细胞。

5.一种在草甘膦耐受玉米的田地中控制杂草的方法，所述方法包括向所述草甘膦耐受玉米的田地施用有效剂量的含草甘膦除草剂，其中所述草甘膦耐受玉米包含权力要求2的DNA构建物。

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