CN105063070B - 一种抗除草剂草甘膦基因表达结构及其在玉米中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抗除草剂草甘膦基因表达结构，是由玉米Ubiqitin1基因启动子‑人工合成的草甘膦抗性基因mEPSPS‑水稻GluB5基因终止区TgluB5核苷酸片段构成。实验证实，将所述抗除草剂草甘膦基因表达结构以正义形式重组到植物表达载体中，通过转基因技术导入玉米可实现其高效表达，该技术可广泛应用于耐除草剂草甘膦玉米的培育，具有很好的应用前景。

Description

一种抗除草剂草甘膦基因表达结构及其在玉米中的应用

技术领域

本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种抗除草剂草甘膦基因表达结构及其在玉米中的应用，是通过人工合成除草剂草甘膦抗性基因、定向重组到玉米基因高效表达的插盒中，通过转基因技术获得耐草甘膦特性优异的转基因玉米。

背景技术

草害是影响作物生长和产量的重要因素。据联合国粮农组织(FAO)统计，全世界每年因病虫草害致农作物产量下降三分之一，其中因草害损失11％。要满足日益增长的需求，粮食生产的集约化和提高单位面积上的生产力是首选措施，而这需要加强草害的防治。针对草害，传统防治措施主要是依靠中耕除草和除草剂施用，成本较高。

玉米是重要的粮食和饲料作物，也是重要的工业原料和能源作物，在我国经济中起着十分重要的作用。我国玉米种植区域广，杂草种类及危害情况也极为复杂，并且因耕作制度和除草方式使杂草群落不断演替而危害玉米生长。杂草与玉米相伴而生，地上争夺阳光和空间，妨碍田间通风透光，造成玉米群体光能利用率低；地下则争夺土壤养分、水分，导致玉米植株营养不良，严重影响了玉米的产量和品质。同时，许多杂草是农作物病虫的天然寄主，易导致病虫害在玉米田间传播。

自从1942年除草剂2,4-D问世以来，杂草防治由人工除草进入化学除草时代。此后，除草剂新品种层出不穷，应用范围也越来越广，有效的提高了劳动生产率、降低了成本。1971年草甘磷上市，该除草剂为内吸传导型广谱灭生性除草剂，除草效果好，且在环境中容易降解。草甘膦能竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，从而阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，扰乱生物体正常的氮代谢而使其死亡。其在24-28小时内就可扩散到整棵植株，使其2-10天内出现枯萎或死亡。由于草甘膦是一种非选择性除草剂，对农作物同样有毒害作用，喷施后对作物的光合作用和代谢过程会产生一定的影响，这极大限制了草甘膦在农业生产中的应用，因此，耐除草甘膦转基因作物的发展无疑有广泛市场。1985年，Comai等从鼠伤寒沙门氏菌中分离出了抗草甘膦的突变基因aroA并将其转入烟草，首次获得了耐除草剂的转基因植物，之后有关抗草甘膦新基因研究报道层出不穷，耐草甘膦转基因作物也相继研发成功并推广应用。2011年，耐除草剂性状转基因作物种植面积为9390万公顷，占全球转基因作物种植面积的59％。同时也减轻了农药滥用对农业环境的影响。

耐草甘膦转基因作物得以应用的两个关键因素是：耐草甘膦基因的获得以及该基因在转基因作物中的表达量能保证草甘膦在除草剂量施用下植株仍能生长发育正常。也就是说，高抗草甘膦基因的发掘及利用是转基因作物成功推广的奠基石。目前，在转基因耐除草剂植物中草甘膦抗性基因即突变的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因最为广泛应用。

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)合成5′-烯醇式丙酮酸-3′-磷酸莽草酸。可分为两类(Ming He等，2001)。以鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌为代表的这一类具有相同氨基酸保守序列的EPSPS合酶被称做Class I EPSPS。以农杆菌CP4、假单胞菌PG2982为代表的称为Class II EPSPS。两类EPSPS拥有各自的结构特征，且氨基酸序列相似性低于50％。从这些物种中克隆出的EPSPS基因也相应分成了两类。一些大型国际生物技术公司已明确了epsps基因中对草甘膦抗性有影响的氨基酸保守序列，并申请了相关专利，构筑了严密的知识产权保护网。就草甘膦抗性来讲，Class II EPSPS成员突变体对草甘膦表现出的抗性普遍较高。如大面积推广的抗草甘膦玉米所含的抗性基因就是从根癌农杆菌CP4中克隆出的CP4-epsps基因(Class II)。我国在草甘膦抗性菌株和基因资源的研究方面也取得重要进展。朱玉和刘柱等分别从草甘膦极端污染的环境中分离到了两株抗性极强的菌株-荧光假单胞菌G2(psedomonasfluorescens G2)和可变盐单胞菌HTG7(Halomonas Variabilis HTG7)，并克隆出2个结构新颖、功能明确的草甘膦抗性新基因。它们均不含专利保护的氨基酸序列及突变位点，与之前已报道的Class I和Class II家族中的草甘膦抗性基因相似性低，显示了有良好的开发应用前景。该基因也被广泛应用于转基因大豆、棉花和油菜等多种植物。Heck等(2005)构建了一个分别用水稻actin 1启动子和花椰菜花叶病毒P35s启动子启动CP4-epsps基因的表达载体，转基因玉米在高于生产应用浓度2～4倍剂量的除草剂喷施条件下均有植株正常生长，获得了高抗草甘膦的转基因株系，并完成了商品化。Howe(2002)等将突变后的玉米epsps基因和GOX基因一同转入玉米细胞，产生的愈伤组织经过1mM和3mM草甘膦各筛选一个月后，再生出玉米转化植株；在植株约61cm高时喷施0.036升/公顷的除草剂农达(40％草甘膦)筛选抗性植株，获得了抗性品种，并完成了商品化。我国对耐草甘膦转基因作物的研究也取得很大进步。具有我国自主知识产权的G2-epsps基因被转入烟草和棉花后，获得可耐受草甘膦的能力(刘锡娟等，2007)。2008年，赫福霞等，对G2-epsps进行植物密码子优化后转入玉米，获得了抗草甘膦转基因玉米，并建立了以2mG2-epsps基因(优化后基因)为筛选标记的玉米转化体系。在转化实验中，愈伤组织筛选压力为1mM的草甘膦异丙胺盐筛选15天。2010年余桂容等将2mG2-epsps基因转入10个优良玉米自交系，并确定了不同自交系草甘膦的最适筛选浓度(变幅在1‰-1.25‰)，但未达到生产上应用浓度2‰，在随后发表的文章中又将2mG2-epsps和R79-epsps(从宏基因组文库中分离的R79菌株中克隆)构建到同一表达载体中转入玉米，获得最高可耐受6‰的草甘膦浓度的转基因玉米。刘柱等(2004)从草甘膦的耐受浓度高达900mM可变盐单胞菌中克隆出新的epsps基因，提示该基因有很好的应用前景。

除草剂抗性基因能否在受体植物中高效表达产生理想的抗性性状，不仅取决于基因的来源及碱基序列的特异性、转基因的拷贝数，而且决定于转基因表达结构和转基因表达产物的稳定性。转基因表达结构一般是由“启动子-基因编码区-转录终止区”组成，在单子叶植物中，高效表达的启动子一般与基因的内含子序列紧邻，内含子可明显提高基因表达丰度，植物基因工程常用的启动子Pubiqintin、Pactin均含有内含子序列。转录终止区不仅保证了编码区的正确转录，而且对转录产物的稳定性即半衰期有很大影响。构建理想的转基因表达结构可使转基因高效转录，且产物稳定。转基因产物的稳定性还取决于基因编码区的碱基组成，不同进化阶梯上的生物，其基因的碱基组成可有明显不同，异源的碱基组成差异较大的转录产物往往会表现出不稳定现象，即易被降解，半衰期短。另外，物种对密码子具有不同程度的偏好性，即一些密码子在特定的物种中使用频率高，而另一些密码子在特定物种中使用频率低，这种特性会影响特定蛋白的合成速率。因此，要实现转基因在受体植物中高效表达并产生理想性状，需要基因编码区的碱基序列适合于该基因的高效表达，即用受体物种偏爱的密码子取代在受体物种中利用率低的密码子、改变影响mRNA寿命的DNA片段；需要将基因编码区与高效表达的启动子融合；需要在基因的3`区连上能提高mRNA寿命的3`尾巴区。转基因的插入位点也明显影响转基因的表达强度，因此，也需要获得大量的转化事件，从中选择合乎目标的转基因体。

发明内容

针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种抗除草剂草甘膦基因表达结构及其在玉米中的应用。

本发明所述的抗除草剂草甘膦基因表达结构，其特征在于：所述基因表达结构由玉米Ubiqitin1基因启动子-人工合成的草甘膦耐性基因mEPSPS-水稻GluB5基因终止区TgluB5核苷酸片段构成；其中，所述草甘膦耐性基因mEPSPS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述水稻GluB5基因终止区TgluB5核苷酸片段的序列如SEQ ID No.3所示，所述玉米Ubiqitin1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明所述抗除草剂草甘膦基因表达结构在培育耐除草剂草甘膦作物中的应用。其中，所述作物是玉米自交系或杂交种，优选玉米自交系昌7-2或郑58。

本发明以可变盐单胞菌的EPSPS核苷酸序列为参照，根据玉米偏爱的密码子，并将可变盐单胞菌的EPSPS核苷酸序列的295位T突变为G，299位G突变为C，人工合成mEPSPS基因，即产生新的抗除草剂草甘膦基因；再将合成基因mEPSPS与玉米Ubiqitin1基因启动子及内含子I即Pubi序列和水稻谷蛋白B5基因(Glutelin type-B 5)的转录终止区TgluB5融合，形成在玉米中能高效表达的融合基因。将所述融合基因导入到玉米细胞中，通过植株再生获得转基因植株。对转基因植株进行草甘膦抗性检测和转基因分子鉴定，筛选出对除草剂草甘膦耐受性强的转基因玉米自交系及杂交种。

其中，上述合成的草甘膦抗性基因mEPSPS的核苷酸序列全长1370个核苷酸，该基因编码449个氨基酸。上述的转录终止区TgluB5从水稻中克隆，其核苷酸序列全长549个核苷酸。用该终止子取代与gus基因(β-葡萄糖半乳糖苷酶基因)融合的Tnos(胭脂碱合成酶基因的终止区)，产生的新的gus融合基因在用基因枪轰击法导入洋葱内表皮细胞和玉米胚芽鞘细胞后，显色强度大幅度增加。推测具有该终止子的融合基因的mRNA在细胞内的半衰期相对较长。上述启动子是单子叶植物转基因常用的玉米Ubiqitin1基因启动子(含内含子I)，长度2018个核苷酸。

本发明中，抗除草剂草甘膦基因表达结构的构建采用常规的基因重组技术。

首先，从水稻中克隆出gluB5基因转录终止区，经测序验证后，插入中间载体中；然后按设计人工合成草甘膦抗性基因mEPSPS，并进行末端磷酸化处理；再将植物表达载体上的Ubiqitin1基因启动子用限制酶切下后重组到含有TgluB5的中间质粒中；然后将抗除草剂草甘膦基因mEPSPS定向插入到Pubi和TgluB5之间，形成“Pubi：：mEPSPS-TgluB5”结构。

其中，构建的含有“Pubi：：mEPSPS-TgluB5”结构的质粒可通过转入大肠杆菌中大量繁殖，提供基因枪轰击法、花粉管导入法等转基因技术所需的质粒DNA或“Pubi：：mEPSPS-TgluB5”结构片段。后者可由限制酶消化产生。在采用农杆菌为中介的遗传转化方法中，还需将该中间质粒中的“Pubi：：mEPSPS-TgluB5”结构重组到植物表达载体中。

本发明所述抗除草剂草甘膦基因表达结构的构建及其在培育耐除草剂草甘膦玉米中的应用方法概述：人工合成mEPSPS、从水稻基因组中克隆谷蛋白B5基因的转录终止区TgluB5，并利用玉米Ubiqitin1启动子，构建适合在玉米中高效表达的mEPSPS融合基因及中间质粒。将该融合基因(结构)重组到以农杆菌为宿主的质粒中，或将该基因(中间质粒)通过大肠杆菌进行扩增，质粒纯化后直接或酶切除掉载体后用于植物遗传转化，或将该基因表达结构通过PCR方法进行大量扩增后直接用于遗传转化。在本发明中，以玉米骨干自交系为材料，通过建立转化体系获得转基因植株；对转基因植株及其后代进行除草剂草甘膦耐性检测和转基因分子鉴定，入选植株自交纯合。通过严格的草甘膦耐性的评价和综合性状分析，按常规程序选育出耐草甘膦自交系，并在大田种植鉴定和配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米耐草甘膦单交种的选育。

具体步骤是：

1)人工合成mEPSPS基因，末端磷酸化后重组到Teasy载体中，通过测序进行验证，得SEQ ID No.1。

2)采用PCR方法从水稻基因组DNA中克隆出TgluB5片段，重组到Teasy载体中测序验证。即以水稻基因组DNA为模板(稀释到80ng/μl)，用高保真酶Primer Star进行扩增。程序为：95℃7min，95℃1min，54℃1min，35cycles；72℃50s，72℃10min。反应体系为：10×buffer(Mg2+Plus)5μl，Primer1(TCAAATGAGTCGGAGAACG)0.5μl，Primer2(CAAGACTTTGGGCTATTACTC)0.5μl，dNTP 2μl，Taq酶0.25μl，模板1μl(<100ng)，补水至25μl。扩增片段549bp(碱基对)，见SEQ ID No.3。

3)以携带限制酶SacII-KpnI位点-Ubiqitin1基因启动子的入门载体pENTR11为受体，经过二轮重组将mEPSPS基因和TgluB5或TgluB5-KpnI片段插入载体，产生融合基因“Pubi::mEPSPS-TgluB5”及质粒pENTR11-Pubi::mEPSPS-TgluB5。对该结构区域测序，确定质粒重组正确。

4)以pENTR11-Pubi::mEPSPS-TgluB5为供体，以改造的植物表达载体pB7WG2.0-d35s::bar-Tnos-MCS或pCAMBIA系列质粒和pPOKII及派生质粒为受体，通过定点重组或常规的体外重组技术产生目标载体质粒pB7WG2.0-d35s::bar-Tnos-Pubi::mEPSPS-TgluB5等，采用冻融法或电激法将目标载体质粒导入农杆菌中用于遗传转化。

或以大肠杆菌为宿主大量扩繁质粒pENTR11-Pubi::mEPSPS-TgluB5，采用碱裂解法大量提取质粒DNA，纯化后直接用于植物遗传转化或用限制酶KpnI消化纯化的质粒，回收“Pubi::mEPSPS-TgluB5”片段用于植物遗传转化。

或以质粒pENTR11-Pubi::mEPSPS-TgluB5为模板，采用PCR方法大量扩增“Pubi::mEPSPS-TgluB5”片段用于植物遗传转化。

5)玉米骨干自交系或易于转化的基因型为材料进行遗传转化。常用的转基因方法：以农杆菌为中介的遗传转化方法，可以无菌苗茎尖、未成熟胚、愈伤组织、离体诱导和继代培养的丛生芽块为受体；基因枪轰击法，可以未成熟胚、愈伤组织、离体诱导和继代培养的丛生芽块为受体，转化所用的DNA可是质粒或“Pubi::mEPSPS-TgluB5”片段；花粉管导入法，所用的DNA可是质粒或“Pubi::mEPSPS-TgluB5”片段。

6)产生转化植株并自交或姊妹交结实。无论用何种方法获得了转化小苗，应对后者进行草甘膦耐性筛选。耐草甘膦植株移栽到温室或田间，精心管理，力争自交或姊妹交结实，产生T1代种子。

7)转基因植株后代的分子鉴定和性状选择及纯合。对农杆菌为中介转化的植株后代，应充分利用其T-DNA区存在的选择标记基因进行选择。如选择标记为bar时，植株长出3片叶后，喷洒除草剂(Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草剂glufosinateammonium)水溶液，浓度为9.6ml-10.8ml以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后5天后停止生长，12天左右死亡。转基因植株在喷洒后，植株持续生长，变化不明显。对于基因枪轰击法等转化的植株，可利用目标基因赋予植株的草甘膦耐性进行筛选，除草剂草甘膦(农达，美国孟山都公司开发的产品，有效成分41％)水溶液在初选中为0.15％-0.2％。草甘膦溶液喷洒后，随时间推移，药害程度不断加深，对照和非转基因玉米表现出叶色变深发褐、叶尖及下部叶片变黄，植株逐渐萎蔫、茎杆松软倒伏、停滞生长，最终绝大多数植株死亡，少量存活植株也表现出生长停滞和畸形。转基因玉米植株则能正常生长，多数受害症状不明显，少数虽呈现出药害，但以后逐渐消失。喷洒草甘膦第12天观察统计，

7)转基因耐草甘膦自交系及单交种的培育。对转基因纯合的株系进行草甘膦耐性的评价，了解不同剂量草甘膦对转基因耐草甘膦玉米植株生长发育和产量的影响。繁殖转基因自交系种子，在大田进行草甘膦喷洒试验。实验区分为草甘膦使用区和对照区(不喷洒草甘膦)，转基因玉米各株系和其受体自交系(未转基因对照)按小区种植，随机排列各基因型。小区长3米宽2米，种3行，株距0.26米，行距0.6米。精心种植，保证苗全。在对照区，设4次重复，按常规耕作措施管理，观察转基因玉米植株在形态特征和生长发育速率上与未转基因对照植株是否有明显差别，测定各小区株高、穗位高和籽粒产量。在草甘膦使用区，设12个重复区，7叶期植株分别喷洒大田除草推荐剂量(0.84kg a.e.ha-1)、2倍推荐剂量、3倍推荐剂量和5倍推荐剂量的草甘膦溶液，其它耕作措施同对照区。即每剂量每基因型重复3次。观察植株形态特征和生长发育速率与未喷洒草甘膦植株的差异，测定株高、穗位高和籽粒产量。未转基因对照植株在喷洒推荐剂量草甘膦12天后逐渐死亡，而转基因植株因耐性不同出现差异，耐性优异的株系在喷洒3倍推荐剂量草甘膦后仍叶片翠绿，无受害症状，10天后测定株高，只比对照区植株低3-8厘米；喷洒3周测定株高，草甘膦使用区和对照区的转基因玉米的株高基本相同。成熟后测定产量，草甘膦使用区的转基因玉米比对照区的略高，可能与田间杂草明显减少有关。当用5倍推荐剂量的草甘膦溶液喷洒时，只有不到1/10的转基因入选株系的植株不表现出明显药害，即未出现叶片受损和植株明显变矮。在喷洒10天后测定株高，对照区植株低5-15厘米；喷洒3周测定株高，草甘膦使用区和对照区的转基因玉米相比株高低5-8厘米。成熟后测定产量，草甘膦使用区的转基因玉米与对照区的相近。

选出耐草甘膦特性优异的转基因株系进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。

实验证实，将本发明公开的抗除草剂草甘膦基因表达结构重组到植物表达载体中，通过转基因技术导入玉米可实现其高效表达，该技术可广泛应用于耐除草剂草甘膦作物(玉米)的培育，具有很好的应用前景。

具体实施方式

实施例1玉米昌7-2耐草甘膦自交系的选育

质粒构建

以携带限制酶SacII-KpnI位点-Ubiqitin1基因启动子的入门载体pENTR11为受体，经过二轮重组将人工合成的mEPSPS基因和从水稻基因组中克隆的TgluB5片段插入载体，产生质粒pENTR11-Pubi::mEPSPS-TgluB5。经测序确定重组正确。

以改造的植物表达载体pB7WG2.0-d35s::bar-Tnos-MCS为受体，通过定点重组产生目标载体质粒pB7WG2.0-d35s::bar-Tnos-Pubi::mEPSPS-TgluB5。采用冻融法将目标载体质粒导入农杆菌LBA4404中用于遗传转化。

昌7-2遗传转化

优良自交系昌7-2的种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10--15分钟，然后用无菌水洗涤4--5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30-40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23-26℃)下1--2天。萌动(露白)后种子放在改良MS培养基上于黑暗条件下继续萌发。待胚芽鞘伸长至3-5厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖生长锥用于遗传转化。

将带目标载体的根瘤农杆菌LBA4404在附加抗生素的YEP培养基中28℃震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100μmol/l乙酰丁香酮的1/2MS改良液体培养基悬浮，稀释到OD₆₀₀0.4用于转化。

首先将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，将露出茎尖生长锥的无菌苗顶端浸泡在菌液中，在1/2大气压下感染8-10分钟。浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，将小苗根部插入改良MS培养基中于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃，然后将转化小苗放在散射光下培养2天。

照光培养后的转化小苗移栽到装填为下层壤土和上层蛭石的花盆中，蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温18-23℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。转化植株长出3片叶后，喷洒1.25ml/l草丁膦(LIBERTY 280SL，Glufosinate-ammonium 24.5％)水溶液，以未转化植株为对照。喷洒量以植株掉液滴为宜。对照植株在喷洒后3天停止生长，6天左右开始死亡。转化处理后的植株，一些个体的变化与对照植株相似，另一些个体则持续生长，无明显变化。存活植株长到5-6叶期，将其定植到田间。

转基因植株的分子检测和选择

抗除草剂植株生长到7-8叶时，取叶片微量提取DNA，采用PCR技术检测草甘膦抗性基因或选择标记基因bar。对PCR阳性植株进行Southern blotting检测以确定转基因植株。

转基因植株开花后套袋自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，植株长到4-6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。转基因植株连续自交2代后获得转基因纯合系，通过草甘膦耐性水平的检测和RT-PCR技术确定转基因表达水平，从中挑选出形态特征和生长发育正常的耐草甘膦的株系。

转基因植株草甘膦抗性的田间检测和应用

玉米植株大小不同，对草甘膦的耐性有明显差异，一般营养生长期植株叶龄越大抗性越强。在玉米栽培中，一般5-6叶后才使用除草剂。本工作在玉米小苗生长至6-8叶期进行草甘膦耐受剂量测定。配制的草甘膦除草剂水溶液分别为0.2％(1L水含有2mL农达和1mLTween 20)、0.4％、0.6％、1.0％浓度，喷洒量为113mL/m²，即喷洒剂量相当于田间推荐用量(0.84kg a.e.ha-1)的1倍、2倍、3倍和5倍。低浓度草甘膦溶液喷洒后，随时间推移，药害程度不断加深，非转基因玉米表现出叶色变深发褐、叶尖及下部叶片变黄，植株逐渐萎蔫、茎杆松软倒伏、停滞生长，最终死亡，少量存活植株也表现出生长停滞和畸形。转基因玉米植株则正常生长，一般受害症状不明显，少数虽出现药害，但逐渐消失。喷洒高浓度草甘膦溶液，非转基因玉米一周内全部死亡，部分转基因株系无明显药害，继续生长。第15天观察统计，在检测的42个独立转化体的后代中，有6个来自不同转化体的转基因株系对草甘膦表现出很好的抗性，可耐受5倍推荐剂量的草甘膦。

为了评估喷洒除草剂草甘膦对转基因耐草甘膦玉米植株生长发育和产量的影响，在大田进行草甘膦喷洒试验。实验区分为4个大区，每大区设置草甘膦使用区和对照区(不喷洒草甘膦)，转基因玉米和其受体自交系(未转基因对照)按小区种植，即在每一大区内每基因型种植2小区，分别位于草甘膦使用区和对照区。每小区长3米宽2米，种3行，株距0.26米，行距0.6米。即4次重复设计。在对照区，转基因玉米植株在形态特征和生长发育速率上与未转基因对照植株相比无明显差别。在草甘膦使用区，7叶期植株喷洒2倍推荐剂量的草甘膦溶液后，未转基因对照植株一周后全部死亡，而转基因植株叶片翠绿，无受害症状，一周后测定株高，比对照区植株低5-8％。在草甘膦喷洒3周后，草甘膦使用区和对照区的转基因玉米的株高基本相同。成熟后测定产量，草甘膦使用区的转基因玉米略高于(2％-5％)对照区的，可能与田间杂草明显减少有关。即草甘膦可在转基因玉米田中安全使用。

选出耐草甘膦特性优异的转基因株系进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。

实施例2玉米郑58耐草甘膦自交系的选育

融合基因构建

以携带限制酶SacII-KpnI位点-Ubiqitin1基因启动子的入门载体pENTR11为受体，经过二轮重组将合成的mEPSPS基因和从水稻基因组中克隆的TgluB5-KpnI片段插入载体，产生融合基因“KpnI-Pubi::mEPSPS-TgluB5-KpnI”及质粒pENTR11-Pubi::mEPSPS-TgluB5。对该结构区域测序，确定结构正确。

或以大肠杆菌为宿主大量扩繁质粒pENTR11-Pubi::mEPSPS-TgluB5，采用碱裂解法大量提取质粒DNA，纯化后直接用于植物遗传转化或用限制酶KpnI消化纯化的质粒，琼脂糖凝胶电泳分离回收“KpnI-Pubi::mEPSPS-TgluB5-KpnI”片段，用于直接导入法或基因枪轰击法为基础的植物遗传转化。

玉米自交系胚性愈伤组织遗传转化

自交系郑58植株在自交授粉后9-12天，取果穗剥去苞叶后于70％酒精中浸泡5min，无菌条件下挑取约1.0-1.2mm大小的幼胚接种于诱导培养基上，培养4-6周得到松脆、淡黄色的II型愈伤组织，然后继代培养基每10-15天继代培养一次。所得到的II型愈伤组织作为遗传转化的受体材料。

采用常规方法制备基因枪弹丸。即称取1.0μm大小的金粉，经70％乙醇洗涤后静置15分钟，离心去除上清液；再用无菌水彻底清洗3次，然后50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹)贮存备用。使用时涡旋5分钟打破金粉凝集，依次加入5μl质粒片段(目标)DNA(1μg/μl)、50μl 12.5M CaCl2、20μl 0.1M亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋涡2～3分钟，静置1分钟。离心弃上清液后，加70％乙醇静置。然后离心弃上清液，再用无水乙醇重悬，取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。

在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的培养基，然后将愈伤组织高密度放入培养皿中，每皿轰击一次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6--9cm。其它参数按使用说明书取值。轰击后材料在暗中恢复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。将材料转入加有草甘膦(0.1％浓度)的培养基上进行筛选。连续筛选三代，每代15天。继代时淘汰变褐死亡的组织块。经过筛选的抗性愈伤组织转入不加筛选剂的培养基上在光照16小时/天下恢复培养1代后，转入分化培养基上分化小苗。愈伤组织产生的小苗在生根培养基中生根，壮苗后移入花盆，长至约10cm高时栽到大田中，自交或与郑58植株回交结实。

转基因植株的分子检测和选择

耐除草剂植株生长到7-8叶时，取叶片微量提取DNA，采用PCR技术检测耐草甘膦基因mEPSPS或TgluB5片段。

转基因植株开花后套袋自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，植株长到4-6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。对PCR阳性植株进行Southern blotting检测以确定转基因植株。转基因植株后代长至三叶期，喷洒添加0.1％Tween-20和0.2％的草甘膦溶液(有效成分41％的农达)，每盆5mL，盆子大小为21.5cm×16cm，均匀喷洒至植株叶片布满水珠。喷洒7天后未转基因自交系(对照)小苗明显受害，出现枯萎坏死，15天后死亡率在90-95％。经除草剂筛选后，将耐性植株移栽到大田。

由于基因枪轰击法产生的转基因植株，转基因多以多拷贝存在，为了获得转基因单拷贝的株系，在完成Southern blotting检测后，对单拷贝转基因植株连续自交以获得转基因纯合系，对多拷贝转基因植株则与郑58连续回交2-3代，并对回交后代进行草甘膦耐性检测，然后自交1-2代获得转基因纯合系。对转基因纯合系采用RT-PCR技术确定转基因表达水平，从中挑选出形态特征和生长发育与郑58差异不明显的耐草甘膦的株系进行Southernblotting检测，确定转基因的拷贝数。选择单拷贝或低拷贝转基因的株系用于后续工作。

转基因植株草甘膦耐性的检测和应用

基本工作同昌7-2的转基因耐草甘膦材料的选择及应用。在玉米小苗生长至6-8叶期进行草甘膦耐受剂量测定。配制的草甘膦除草剂水溶液分别为0.2％(1L水含有2mL农达和1mL Tween 20)、0.4％、0.6％、1.0％浓度，喷洒量为113mL/m²，即喷洒剂量相当于田间推荐用量(0.84kg a.e.ha-1)的1倍、2倍、3倍和5倍。低浓度草甘膦溶液喷洒后，随时间推移，药害程度不断加深，非转基因玉米表现出叶色变深发褐、叶尖及下部叶片变黄，植株逐渐萎蔫、茎杆松软倒伏、停滞生长，最终枯死，少量存活植株也表现出生长停滞和畸形。转基因玉米植株则正常生长，一般受害症状不明显，少数虽出现药害，但逐渐消失。喷洒高浓度草甘膦溶液草甘膦溶液，非转基因玉米一周内全部死亡，部分转基因株系无明显药害，继续生长。第12天观察统计，在72个检测的株系中有2个转基因株系对草甘膦表现出很好的抗性，可耐受5倍推荐剂量的草甘膦溶液。

为了评估喷洒除草剂草甘膦对转基因耐草甘膦玉米植株生长发育和产量的影响，繁殖转基因株系种子，在大田进行草甘膦喷洒试验。实验区分为草甘膦使用区和对照区(不喷洒草甘膦)，转基因玉米各株系和其受体自交系(未转基因对照)按小区种植，随机排列各基因型。小区长3米宽2米，种3行，株距0.26米，行距0.6米。精心种植，保证苗全。在对照区，设4次重复，按常规耕作措施管理，观察转基因玉米植株在形态特征和生长发育速率上与未转基因对照植株是否有明显差别，测定各小区株高、穗位高和籽粒产量。在草甘膦使用区，设12个重复区，7叶期植株分别喷洒推荐剂量(0.84kg a.e.ha-1)、2倍推荐剂量、3倍推荐剂量和5倍推荐剂量的草甘膦溶液，其它耕作措施同对照区。即每剂量每基因型重复3次。观察植株形态特征和生长发育速率与未喷洒草甘膦植株的差异，测定株高、穗位高和籽粒产量。未转基因对照植株在喷洒推荐剂量草甘膦12天后逐渐死亡，而转基因植株因耐性不同出现差异，耐性优异的株系在喷洒3倍推荐剂量草甘膦后仍叶片翠绿，无受害症状，10天后测定株高，只比对照区植株低2-5厘米；喷洒3周测定株高，草甘膦使用区和对照区的转基因玉米的株高基本相同。成熟后测定产量，草甘膦使用区的转基因玉米比对照区的略高，可能与田间杂草减少有关。当用5倍推荐剂量的草甘膦溶液喷洒时，只有2个转基因入选株系的植株不表现出明显药害，即未出现叶片受损和植株明显变矮。在喷洒10天后测定株高，对照区植株低2-7厘米；喷洒3周测定株高，草甘膦使用区和对照区的转基因玉米相比株高低1-5厘米。成熟后测定产量，草甘膦使用区的转基因玉米与对照区的相近。

选出耐草甘膦特性优异的转基因株系进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。

Claims (3)

1.一种抗除草剂草甘膦基因表达结构，其特征在于：所述基因表达结构由玉米Ubiqitin1基因启动子-人工合成的草甘膦耐性基因mEPSPS-水稻GluB5基因终止区TgluB5核苷酸片段构成；其中，所述草甘膦耐性基因mEPSPS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述水稻GluB5基因终止区TgluB5核苷酸片段的序列如SEQ ID No.3所示，所述玉米Ubiqitin1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述抗除草剂草甘膦基因表达结构在培育耐除草剂玉米自交系或杂交种中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述玉米自交系是玉米自交系昌7-2或郑58。