CN103608458A

CN103608458A - 草甘膦抗性的增强

Info

Publication number: CN103608458A
Application number: CN201280020879.5A
Authority: CN
Inventors: 保尔·本多克
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2014-02-26
Also published as: US20170240916A1; CA2833613A1; BR112013027635A2; US20140206850A1; US20150191741A1; US9624506B2; WO2012148275A1; EP2702157A1; JP2014516517A

Abstract

本发明涉及一种用于提高植物的草甘膦抗性的新方法。该方法包括在该植物的特定核苷酸序列中提供一个或多个特定突变。与没有根据该方法处理的植物相比，通过该方法获得的植物表现（提高的）草甘膦抗性。还提供了（转基因）植物，包括其种子，和根据本发明的方法可以获得的植物产品。

Description

草甘膦抗性的增强

技术领域

本发明涉及一种提供抗草甘膦植物和/或增强植物的草甘膦抗性的方法。该方法包括给植物提供编码包含特定突变的EPSPS酶的核苷酸序列。与未经修饰的植物相比，通过该方法获得的该植物显示了（改善的）草甘膦抗性。本发明还提供了（转基因）植物，包括其种子，和通过本发明的方法可获得的植物产品。

背景技术

草甘膦（N-膦酰基甲基-甘氨酸）是农达（Round Up）中的活性成分且是最常用的除草剂。其用于农业、园艺和林业中。通常其被喷洒并通过叶子吸收。

草甘膦广泛地作用于植物品种，且通过抑制5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（enzyme 5-eno/pyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）起作用，该酶是莽草酸途径中的一种关键酶，对芳香族氨基酸的生产至关重要。草甘膦的化学结构与天然EPSPS酶底物磷酸烯醇丙酮酸盐（PEP）的化学结构相似，因此其与PEP竞争酶活性作用位点。对EPSPS的抑制扰乱了氨基酸的合成，并因此杀死受影响的植物细胞。草甘膦是非选择性的，它既除草又杀死农作物。

草甘膦作为除草剂普及的部分原因是由于其对动物的毒性低。该莽草酸途径只在植物和细菌中发现。孟山都公司（Monsanto）最初在1970年代取得草甘膦专利。

对某些细菌能在草甘膦中存活的观察结果使人们发现一些细菌EPSPS酶对草甘膦不敏感。这引起了对表达这些抗草甘膦细菌EPSPS酶的Monsanto转基因耐草甘膦作物（Round Up Ready crops）的研发。

目前的耐草甘膦作物（Round Up Ready crops）包括大豆、玉米、高粱、卡诺拉(canola)、苜蓿、棉花和甜菜。这些作物极大地改进了农民控制杂草的能力，因为可以将草甘膦喷洒在田间而不会严重影响农作物。自2005年起，87%的美国大豆田种上了抗草甘膦作物（National AgricultureStatistics Service(2005)in Acreage eds.Johanns,M.&Wiyatt,S.D.6 30,（U.S.Dept.of Agriculture,Washington,DC））。

然而，据发现，耐草甘膦大豆作物与优良的传统品种相比，产量降低6.7%(Charles Benbrook.Evidence of the Magnitude and Consequences ofthe Roundup Ready Soybean Yield Drag from University-Based VarietalTrials in 1998.Ag BioTech InfoNet Technical Paper Number l(1998年高校主导的品种试验中耐草甘膦大豆产量的量和结果的证明)）。赋予植物草甘膦抗性可能涉及该植物的大量的适宜性成本。这样的适宜性成本可能接近于农作物产量的降低，也可能随时间的推移表现为生物量积累下降。

已发现在田间条件下赋予植物草甘膦抗性的一种重要突变是单核苷酸变化，即将EPSPS酶中位置106的脯氨酸变为亮氨酸（P106L）。全世界许多杂草种类已独立地发生这种突变，但是到目前为止，还没有在EPSPS中发现其他自发性突变（Baerson et al.Plant Physiol,July 2002,Vol.129,pp.1265-12752002）。Gassert et al.（J.BioI.Chem Vol 263(9)pp4280-4289）描述了矮牵牛花和番茄的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因的结构、表达和演变。

需要识别在提供赋予草甘膦的（改善的）抗性的EPSPS酶方面有用的进一步的突变，以及携带这种突变和/或表达这种酶的植物，因此该植物能够在存在（增长水平的）草甘膦的条件下生长。与现有技术的植物，包括抗草甘膦植物相比，这些植物能够在存在更高浓度的草甘膦的条件下生长，或者与现有技术的植物，包括抗草甘膦植物相比，在存在相似浓度的草甘膦的条件下表现增强的生长。

此外，还需要识别进一步增强现有技术的抗草甘膦植物的草甘膦抗性的突变或者优选地降低与现有技术的抗草甘膦植物的草甘膦抗性相关的适宜性成本的突变。

本发明的目的是提供上述需要的至少一种。

发明内容

定义

在以下的描述和实例中使用了大量术语。为了对包括这些术语给定的范围的说明书和权利要求书有清楚一致的理解，给出以下定义。除非本文另有定义，否则所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容通过引用结合到本文中。

除非本文中另有清楚地说明，本文中使用的单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括多个所指物。例如，如上面所使用的，一种分离“一个”DNA分子的方法，包括分离多个分子（如数十个、数百个、数千个、数万个、数十万个、数百万个或更多分子）。

实施本发明的方法中使用的传统技术的方法，对本领域技术人员应当是显而易见的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域中的传统技术的实践为本领域技术人员所熟知，并且在例如以下的参考文献中论述：分子克隆（Sambrook et al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989）；现有分子生物学技术（Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1987 and periodic updates）；和系列方法（theseries Methods in Enzymology Academic Press,San Diego）。

“栽培植物”和“野生植物”分别指的是为了有利的农学特征已被人类培植的植物和野外大自然中发现的植物。在后者中发现的基因和等位基因还称为“野生型”。然而，相对于EPSPS基因，在“栽培植物”和“野生型植物”中存在的基因称为“野生型基因”。这些野生型基因在植物中表达至通常在这些植物中发现的说明，并不提供“抗草甘膦”EPSPS，而是提供“对草甘膦敏感的”EPSPS（见下文）。

“核酸构建”或者“载体”在本文中应理解为，使用重组DNA技术产生的人造核酸分子，并且其用来将外源DNA运送到宿主细胞。该载体骨架可以是例如双元或者超双元载体（参见例如US5591616，US2002138879和WO95/06722），共整合载体或者T-DNA载体，如本领域所知和本文别处描述的那样，可以将嵌合基因整合到上述载体中，或者当已存在合适的转录调控序列时，只将期望的核酸序列（如编码序列、反义序列或者反向重复序列）整合到该转录调控序列的下游。载体通常还包含遗传元件如选择性标记、多克隆位点等以促进它们在分子克隆中的使用。

本文使用的“抗草甘膦”EPSPS指的是EPSPS，其在植物细胞中的表达赋予该植物细胞以草甘膦抗性。如果以在这些植物中通常发现的水平在植物细胞中表达即没有引起过度表达时，没有赋予草甘膦抗性，那么EPSPS是“对草甘膦敏感的”。

本文使用的“抗草甘膦”细胞或者植物指的是在存在通常杀死或者抑制其它细胞或者植物的生长的一定浓度的草甘膦存在的条件下能够存活或者继续生长的细胞或者植物。生长包括例如光合作用、根的增多、高度的增加、重量的增加或者新叶的发育。

例如，当赋予植物草甘膦抗性时，EPSPS是抗草甘膦的。如在EPSPS同样的表达水平下，在比不携带该抗草甘膦EPSPS的植物停止生长或者死亡的草甘膦水平高至少5%、10%、20%、30%或者40%草甘膦水平下，携带该抗草甘膦EPSPS的植物继续存活或生长。

在一个实施方案中，抗草甘膦（植物）细胞可以在含50μM（或50mg/l）或者更多草甘膦的培养基上生长和分裂，优选地，抗草甘膦细胞可以在含100μM（或100mg/l）或者更多如200μM（或200mg/l）、300μM（或300mg/l）或者400μM（或400mg/l）草甘膦的培养基上生长和分裂。甚至更优选地，抗草甘膦细胞可以在含500μM（或500mg/l）或者更多如600μM（或600mg/l）草甘膦的培养基上生长和分裂。就本发明的目的，术语“草甘膦”包括N-膦酰基甲基甘氨酸（包括其任何盐）的任何除草剂有效形式和引起植物中草甘膦阴离子产生的其它形式。

“草甘膦抗性”，如本申请中定义的，在本领域一般指的是草甘膦耐受性。

与蛋白（或者变体如直系同源物或者突变体，以及片段）相关的“功能性的”指的是该基因和/或编码蛋白通过修饰（如通过过度表达或者沉默）植物中该基因的表达水平来修饰（定量和/或定性的）特征的能力。例如，由植物种类X获得的推定蛋白质的功能性可以通过多种方法来测试。优选地，如果该蛋白是功能性的，使用例如基因沉默载体沉默编码植物种类X中该蛋白的基因，将导致该特征的降低或抑制，而在易感植物中的过度表达将导致提高的抗性。并且，与功能性蛋白的互补将能恢复或者赋予该特征。熟练技术人员在测试功能性方面没有困难。

术语“基因”指包含区域（转录域）的DNA序列，其被转录为细胞中的可操作地连接至合适的调控区（如启动子）的RNA分子（如，mRNA）。因此基因可能包含几个可操作地连接的序列，如启动子、包含例如包含与翻译起始相关的序列的5′前导序列、（蛋白）编码区（cDNA或者基因组DNA）和包含例如转录终止位点的3′非翻译序列。“基因的表达”指的是这样的过程，其中可操作地连接至合适的调控区具体为启动子的DNA区域转录为RNA的过程，该RNA是有生物活性的RNA，即其能被翻译成生物活性蛋白或者肽（或者活性肽片段）或其本身有活性（例如在转录后的基因沉默或RNAi中）。某些实施方案中的活性蛋白指的是具有组成活性的蛋白。该编码序列优选地位于有义方向并编码期望的生物活性蛋白或者肽或者活性肽片段。在基因沉默方法中，该DNA序列优选以反义DNA或者反向重复DNA的形式存在，包括位于反义方向或者有义和反义方向的靶基因的短序列。“异位表达”指的是基因在其中一般不表达的组织中的表达。

本文公开的核酸可以包括嘧啶碱基和嘌呤碱基的任何多聚物或者低聚物，嘧啶碱基和嘌呤碱基分别优选为胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鸟嘌呤（参见生物化学原理(Albert L.Lehninger,Principles ofBiochemistry,at 793-800(Worth Pub.1982)，其全部内容通过引用结合到本文中）。本公开预期了任何脱氧核苷酸、核苷酸或者肽核酸组成，以及其任何化学变体，如这些碱基的甲基化、羟甲基化或者糖基化形式等等。这些多聚物或者低聚物在组合物中可以是异源的或者同源的，可以从天然存在的来源中分离，或者可以是人造的或合成的。因此术语“分离的”指从天然来源中或者人造的或合成的中分离。例如核苷酸序列可以通过将其克隆进宿主有机体如BAC克隆来分离。通常，当分离核苷酸序列时，它包含该核苷酸序列的至多500，优选地至多250，更优选地至多100，更优选地至多50或者最优选地至多20个连续的核苷酸，其自然直接地位于现在分离的核苷酸序列两侧。另外，该核酸可以是DNA或者RNA，或者其混合物，且可能是以单链或双链形式永久地或过渡地存在，包括同源双链、异源双链或混合态。

本发明的植物包括葫芦科(ucurbitanceae)、禾本科(Graminaeae)、茄科(Solanaceae)或者菊科(Asteraceae)、玉米（玉蜀黍属(Compositae)）、小麦（小麦属(Zea)种类）、大麦（如大麦芽(Hordeum vulgare)）、燕麦（如野燕麦(Avena sativa)）、高粱（Sorghum bicolor）、黑麦（黑麦(Secale cereal)）、大豆（大豆属(Glycine)种类，如大豆(G.max）)、棉花（棉属(Gossypiun)种类，如G.hirsutum，海岛棉(G.barbadense）)、芸苔属(Brasscia)种类（如甘蓝型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.juncea)、甘蓝(B.oleracea)、白菜型油菜(B.rapa)等），向日葵（向日葵(Helianthus annus)）、红花、山药、木薯、紫苜蓿（Medicago sativa）、水稻（稻属(Oryza)，如籼稻栽培品种组（O.sativa indica cultivar-group）或粳稻品种组（japonica cultivar-group））、饲草、狼尾草（狼尾草属(Pennisetum)种类，如狼尾草(P.glaucum）)、树种（松属（Pinus）、白杨、冷杉、车前草等）、茶树、咖啡属、油棕、椰子、蔬菜如豌豆、西葫芦、豆（如菜豆属(Phaselolus)）、辣椒、黄瓜、朝鲜蓟、芦笋、茄子、西兰花、大蒜、韭、生菜、洋葱、萝卜、大头菜、番茄、马铃薯、球芽甘蓝(Brussels sporuuts)、胡萝卜、花椰菜、菊苣、芹菜、菠菜、莴苣菜、茴香、甜菜、结肉果植物（葡萄、桃子、李子、草莓、芒果、苹果、梅子、樱桃、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、柑橘、奇异果、无花果、柠檬、酸橙、油桃、覆盆子、西瓜、桔子、葡萄柚等）、观赏树种（如玫瑰(Rose)、矮牵牛(Petunia)、菊花(Chyrsanthemum)、百合花(Lily)、非洲菊(Gerbear)）、草本植物（簿荷、荷兰芹、罗勒属植物、百里香等）、木本树（如杨树属、柳属、栎属、桉属）、纤维种类如亚麻（亚麻(Linumusitatissimum)）和大麻(大麻(Canabis sativa))，以及其它。

“重组植物”或者“重组植物部分”或者“转基因植物”是指植物或者植物部分（例如，种子或果实或叶子），其包含所有细胞和植物部分里在同一位点的嵌合基因，即使该基因可能不在所有细胞中表达。

术语“测序”指的是确定核酸样品例如DNA或者RNA中核苷酸的顺序（碱基序列）。可采用许多技术如桑格（Sanger）测序和454或者Solexa技术提供的新一代测序技术。

SEQ ID NO:1-8以图1所示的EPSPS的相关区域为基础：玉米（SEQID NO:1），水稻（SEQ ID NO:2）、小麦（SEQ ID NO:3），番茄（SEQ IDNO:4）、拟南芥（SEQ ID NO:5）、洋葱（SEQ ID NO:6）、沙门氏菌（SEQID NO:7）和大肠杆菌（SEQ ID NO:8）。相对于SEQ ID NO:1-8中任一序列和图1所示的相应序列之间的任何非预定差异，特此注明，图1中所示的序列是主要的，应该作为任何非预定差异的修正基础。

全文中的氨基酸可以使用以下常见缩写。

详细说明

本发明涉及在与位置44的氨基酸的变化相对应的EPSPS编码序列中的新识别的突变，如图1所示。在优选的实施方案中，这个变化与所述EPSPS编码序列中的至少一个进一步的突变相组合，优选地，与选自由101、106或者179组成的组中的位置的氨基酸的变化相对应的进一步的突变相组合，如图1所示。正如本领域技术人员所清楚了解的，图1示出了缺少叶绿体引导信号的成熟蛋白质，而其它的图示出了包括这种引导信号的完整蛋白质。因此，例如按照图1的数据通过比对各种EPSPS基因的序列，本领域技术人员可以毫无问题地确定编码EPSPS酶的核苷酸序列或EPSPS酶的氨基酸序列中本发明的相应位置和突变。

在用各种植物材料进行实验的过程中，包括原生质体，例如含有番茄原生质体，得到能够在含草甘膦的培养基上生长的植物材料如胼胝,并且该植物材料如胼胝在维持生长的同时还表现了对这种除草剂的抗性。

使用熟练技术人员可用的方法对来自不同抗草甘膦材料的EPSPS基因测序。在EPSPS的编码区域中鉴定出一种新的意料之外的突变，遗传材料中的该突变导致编码的EPSPS酶中位置44的氨基酸改变，如图1所示。据发现，携带这种突变的植物（细胞）表现出（提高的）草甘膦抗性。事实上，甚至更令人惊讶的是，据发现，通过引入存在于该植物中的EPSPS编码序列中位置44的上述鉴定的突变可以进一步增强植的现有草甘膦抗性。例如，特别是，如图1所示，可以通过引入引起位置44的氨基酸改变的突变，进一步增强表达EPSPS编码序列的植物的草甘膦抗性，该EPSPS编码序列通过具有引起原EPSPS酶中的选自由101、106或者179组成的组中的位置的氨基酸改变的突变来赋予草甘膦抗性。换句话说，该新鉴定的突变可以有利地被用来增强赋予EPSPS酶中其它和已知的突变的草甘膦抗性。

因此本发明的某些方面涉及与特定位置的氨基酸改变相对应的EPSPS编码序列中四种不同的突变。总之，这些突变在下文中称为突变A、B、C和D。

突变A

EPSPS编码序列中的第一突变称为突变A，并且其引起该EPSPS酶中位置44的氨基酸改变，如图1所示，例如与没有该突变的相同的EPSPS酶相比引起草甘膦抗性。例如，且优选地，由于EPSPS编码序列中的突变引起变化的位置44的氨基酸是天冬酰胺（N），如图1所示的植物氨基酸序列中所示（换句话说，根据本发明，位置44的原始氨基酸将被改变，且该原始氨基酸可以是天冬酰胺）。因此，优选地，该突变导致EPSPS编码序列中位置44的氨基酸不是天冬酰胺（N）。

根据本发明，尽管位置44的氨基酸优选天冬酰胺（N）可以改变为任何其它的氨基酸，只要其有利于提供草甘膦抗性方面，但优选地，该EPSPS编码序列包含引起位置44的氨基酸优选天冬酰胺改变为天冬氨酸（D）的突变，如图1所示。

因此，在优选的实施方案中，该EPSPS编码序列编码EPSPS酶，其中位置44的氨基酸是天冬氨酸（D），独立于之前存在于该位置的氨基酸。

突变B

第二突变（可以把这个突变称为突变B）引起EPSPS酶中位置101的氨基酸改变，如图1所示，例如与没有该突变的相同的EPSPS酶相比带来草甘膦抗性。例如，且优选地，由于EPSPS编码序列中的突变引起变化的位置101的氨基酸是甘氨酸（G），如图1所示的植物氨基酸序列所示（换句话说，根据本发明，位置101的原始氨基酸将被改变，且该原始氨基酸可以是甘氨酸）。因此，优选地，该突变导致EPSPS编码序列中位置101的氨基酸不是甘氨酸（G）。在图17的大肠杆菌(E.coli)EPSPS氨基酸序列中，突变B与位置96的氨基酸的改变相对应。

尽管位置101的氨基酸优选甘氨酸（G）可以改变为任何其它的氨基酸，只要其有利于提供草甘膦抗性，但优选地，该EPSPS编码序列包含引起位置101的氨基酸优选甘氨酸改变为丙氨酸（A）的突变，如图1所示。

因此，在优选的实施方案中，该EPSPS编码序列编码EPSPS酶，其中位置101的氨基酸是丙氨酸（A），独立于之前存在于该位置的氨基酸。

该G101A突变的结构显示，位置101的丙氨酸在空间上阻碍草甘膦与PEP结合位点的结合，其伴随有PEP Km的相应增长（参见：Eschenburg,S.,Healy,M.L.,Priestman,M.A Lushington,G.H.and Schonbrunn,E.(2002)How the mutation glycine 96 to alanine confers glyphosate insensitivity to5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli(甘氨酸96到丙氨酸的突变如何赋予来自大肠杆菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶以草甘膦不敏感性).Planta 216,129-135。

突变C

第三突变（可以把这个突变称为突变C）引起EPSPS酶中位置106的氨基酸改变，如图1所示，例如与没有该突变的相同的EPSPS酶相比带来草甘膦抗性。例如，且优选地，由于EPSPS编码序列中的突变引起变化的位置106的氨基酸是脯氨酸（P），如图1所示的植物氨基酸序列所示（换句话说，位置106的原始氨基酸可以是脯氨酸，且可以改变该原始氨基酸）。因此，优选地，该突变导致EPSPS编码序列中位置106的氨基酸不是脯氨酸（P）。

尽管位置106的氨基酸，优选脯氨酸（P），可以改变为任何其它的氨基酸，只要其有利于提供草甘膦抗性，但优选地，该EPSPS编码序列包含引起位置106的氨基酸优选脯氨酸改变为亮氨酸（L）的突变，如图1所示。

因此，在优选的实施方案中，该EPSPS编码序列编码EPSPS酶，其中位置106的氨基酸是亮氨酸（L），独立于之前存在于该位置的氨基酸。

突变D

第四突变（其是新鉴定的，可以把这个突变称为突变D）引起EPSPS酶中位置179的氨基酸改变，如图1所示，例如与没有该突变的相同的EPSPS酶相比带来草甘膦抗性。例如，且优选地，由于EPSPS编码序列中的突变引起变化的位置179的氨基酸是丝氨酸（S），如图1所示的植物氨基酸序列中所示（换句话说，位置179的原始氨基酸可以是丝氨酸，且可以改变该原始氨基酸）。因此，优选地，该突变导致EPSPS编码序列中位置179的氨基酸不是丝氨酸（S）。

尽管位置179的氨基酸，优选丝氨酸（S），可以改变为任何其它的氨基酸，只要其有利于提供草甘膦抗性，但优选地，该EPSPS编码序列包含引起位置179的氨基酸优选丝氨酸改变为天冬酰胺（N）的突变，如图1所示。

因此，在优选的实施方案中，该EPSPS编码序列编码EPSPS酶，其中位置179的氨基酸是天冬酰胺(N)，独立于之前存在于该位置的氨基酸。

图1到22中的任一图示出了各种生物体的EPSPS酶的各种序列（氨基酸或者编码这种氨基酸的核酸）；在图4-22中的大部分图中，在图1中称为44、101、106和179的氨基酸位置用下划线标明。本领域技术人员应该理解，参考图1，本文所描述的突变可以存在于或者引入任何生物体的任何EPSPS编码序列和/或EPSPS酶中相应的位置，如图中所示的那些位置。通过对比图1所示的序列，很容易确定其它序列中的相应位置。这可以通过以下步骤来完成：从相关生物体（特别是植物）取得EPSPS蛋白序列，与拟南芥(A.thaliana)蛋白进行比对，以及鉴定对应于N44、G101、P106和S179的氨基酸位置。图4所示的序列进一步包括叶绿体引导信号；图1示出缺少该叶绿体引导信号的成熟蛋白质。

在第一方面，本发明提供了编码EPSPS酶优选植物EPSPS酶的（分离的）核苷酸序列，所述酶赋予植物（细胞）草甘膦抗性，其特征在于该核苷酸序列包含与位置44的氨基酸的变化相对应的至少一个突变，如图1所示。

相应地，该EPSPS编码序列中位置44的氨基酸优选不是天冬酰胺（N）。

优选地，在位置44发生改变的氨基酸是天冬酰胺。优选地，位置44的氨基酸改变为等电位点（pl）为3.50或以下的蛋白氨基酸，是天冬氨酸或谷氨酸，优选天冬氨酸。换句话说，根据本发明，EPSPS酶中位置44的氨基酸(提供草甘膦抗性)优选是天冬氨酸或者谷氨酸，优选天冬氨酸。

优选地，所述变化与野生型EPSPS酶相比较，例如从草甘膦抗性被引入和/或增强的植物中获得的野生型EPSPS酶。

人们发现，如图1所示位置44的这种特定氨基酸（改变为等电位点（pl）为3.50或以下的的蛋白氨基酸，是天冬氨酸或谷氨酸，优选天冬氨酸）相对于由所得的EPSPS酶赋予的草甘膦抗性呈现有利的结果，和/或与相应的野生型EPSPS或者位置44的氨基酸是除天冬氨酸或者谷氨酸以外的其它氨基酸的EPSPS酶相比，得到对其正常底物有改善活性的EPSPS酶。

因此，携带该核苷酸序列的植物（细胞），例如通过改变所述植物中存在的原始序列，可以表现（增强的）草甘膦抗性。在本发明的内容中，植物（细胞）的草甘膦抗性指所述植物（细胞）在存在通常杀死或抑制野生型植物（细胞）的一定浓度的草甘膦的条件下存活或继续生长的能力。优选地，在这样的情况下所述植物（细胞）维持正常的或仅略微降低的生长（例如，不到20%的质量积累）。

增强植物（细胞）的草甘膦抗性，指在存在高于通常抑制植物（细胞）存活和/或生长的草甘膦浓度例如不携带抗草甘膦EPSPS的草甘膦浓度的条件下，赋予所述植物（细胞）存活或者继续生长的能力。这提供了草甘膦抗性增强的植物（细胞）。换句话说，对草甘膦表现一定水平的抗性的植物，例如由于突变的存在，由于位置44的突变的存在可以表现出对更高浓度草甘膦的抗性。

例如，如果参照抗草甘膦植物（细胞）仅可以在最多含50μM（或50mg/l）草甘膦的培养基上生长，那么草甘膦抗性增强的植物（细胞）可以在含有大于50μM（或50mg/l）草甘膦的培养基上生长，例如55μM（或55mg/l）的草甘膦或更高，如100μM（或100mg/l）、200μM（或200mg/l）或300μM（或300mg/l）草甘膦。如果参照抗草甘膦植物（细胞）可以在含100μM（或100mg/l）草甘膦的培养基上生长，那么草甘膦抗性增强的植物（细胞）可以在含有大于100μM（或100mg/l）草甘膦的培养基上生长，例如110μM（或110mg/l）的草甘膦或更高，如200μM（或200mg/l）、300μM（或300mg/l）或400μM（或400mg/l）草甘膦。可以通过引入引起如图1所示位置44的氨基酸变化的突变来该植物（细胞）在草甘膦浓度增加的情况下的生长能力，优选地改善的EPSPS酶中的氨基酸是天冬氨酸。

在本发明的内容中，生长包括例如光合作用、根的增长、高度的增加、质量的增加、新叶发育、作物生长和/或作物产量的增加。以下详细阐述实施例。

然而，植物（细胞）的草甘膦抗性增强也可以指植物在存在特定浓度草甘膦的条件下，与该植物（细胞）在存在所述浓度的草甘膦下通常表现的存活和/或生长相比，提高的存活和/或增加的生长。换句话说，对草甘膦表现一定水平的抗性的植物，例如由于突变的存在，正如本文详述的，由于位置44的突变的存在，在存在特定浓度的草甘膦的条件下将显示提高的存活或者生长。

例如，如果在含50μM（或50mg/l）草甘膦的培养基上生长的参照抗草甘膦植物（细胞）显示50天后存活率为90%和每50天100g干重的生长率，那么在含50μM（或50mg/l）草甘膦的培养基上生长的具有提高的草甘膦抗性的植物（细胞）可以显示增加的存活和/或生长。同等地，如果在含100μM（或100mg/l）草甘膦的培养基上生长的参照抗草甘膦植物（细胞）显示特定的存活率和特定的生长率，那么在含100μM（或100mg/l）草甘膦的培养基上生长的具有增强的草甘膦抗性的植物（细胞）可以显示增加的存活和/或生长。

在优选的实施方案中，根据本发明及本文公开的内容，编码EPSPS酶的核苷酸序列的进一步特征在于，该核苷酸序列包含至少一个进一步的突变，所述突变独立地使得该核苷酸序列编码赋予植物草甘膦抗性的EPSPS酶，优选地，其中所述至少一个进一步的突变与选自由101、106或者179组成的组中的位置的氨基酸的变化相对应，如图1所示。因此，在EPSPS编码序列中，位置101的氨基酸优选不是甘氨酸（G），位置106的氨基酸优选不是脯氨酸（P），和/或位置179的氨基酸优选不是丝氨酸（S）。

例如，根据本发明编码具有氨基酸突变（例如对应于图1所示的位置101、106或者179）的EPSPS酶的核苷酸序列，其中该突变赋予EPSPS酶草甘膦抗性，可以提供有与本文公开的位置44的氨基酸的变化对应的至少一个进一步的突变。

在优选的实施方案中，在位置101发生改变的氨基酸是甘氨酸。

在优选的实施方案中，在位置106发生改变的氨基酸是脯氨酸。

在优选的实施方案中，在位置179发生改变的氨基酸是丝氨酸。

优选地，位置101的氨基酸改变为丙氨酸。

优选地，位置106的氨基酸改变为亮氨酸。

优选地，位置179的氨基酸改变为天冬酰胺。

换句话说，优选地根据本发明，位置101的氨基酸是丙氨酸，或者位置106的氨基酸是脯氨酸，或者位置179的氨基酸是天冬酰胺。据发现，如图1所示，在EPSPS酶中，在位置44优选地与天冬氨酸或者谷氨酸组合，优选天冬氨酸，这些特定氨基酸（变化）相对于由所得的EPSPS酶赋予的草甘膦抗性呈现有利的结果，和/或与相应的野生型EPSPS相比或者与在该位置改变为除优选氨基酸以外的氨基酸的EPSPS相比，得到对其正常底物活性获得改善的EPSPS酶。

在文献和实践中，不同的数字用来指EPSPS酶的氨基酸序列中相同氨基酸的位置，尤其是当比对不同生物体的氨基酸序列时。为了避免说明书中使用的数字的歧义，我们引入图1，其中比对和编号了玉米、水稻、小麦、番茄、拟南芥、洋葱、沙门氏菌和大肠杆菌的EPSPS酶氨基酸序列的相关区域。此外，突出了重要的氨基酸。本文公开和提及的氨基酸位置参见图1。

当在本说明书（或者权利要求书）中提到氨基酸位置44、101、106和/或179时，它们应被解释为，表示在与氨基酸序列中位置44、101、106和/或179相似的位置的氨基酸的变化，本领域技术人员应该理解，该氨基酸序列与具有如图1所示的氨基酸序列的EPSPS蛋白基本上同源，例如与图1所示氨基酸序列的蛋白质的整个长度具有至少75%的氨基酸的同一性，优选地至少75%，更优选地至少80%，甚至更优选地84%、88%、92%、95%、98%或者99%的同一性，和/或是功能性的，换言之具有EPSPS酶活性。

例如，尽管图1没有示出马铃薯或者向日葵的EPSPS的相关区域，它们仍然可以根据熟练技术人员已知的方法（例如使用CLC Bio MainWorkbench package(www.clcbio.com)）与图1公开的序列进行比对。例如，具有EPSPS酶活性且包含序列苏氨酸（T）-缬氨酸（V）-缬氨酸（V）-天冬氨酸（D）-天冬氨酸（D）-亮氨酸（L）-亮氨酸（L）-天冬酰胺（N）的马铃薯EPSPS酶的氨基酸序列，对应于图1所示的位置40-47。由于这个序列包含与如图1所示的位置44相对应的位置的变化，即根据本发明其是天冬氨酸，而不是天冬酰胺。

发明者已认识到，EPSPS酶中突变的限制因素可能是它们赋予EPSPS酶的生化活性降低。例如，沙门氏菌中T42M突变使对其正常底物（PEP）的亲和力降低25倍，而对草甘膦的耐受性提高26倍。这种适应性损失可能意味着这样的突变基因在田间条件下不足以正常生长。同等地，与优良的传统品种相比，抗草甘膦大豆作物的产量降低6.7%（Charles Benbrook.Evidence of the Magnitude and Consequences of theRoundup Ready Soybean Yield Drag from University-Based Varietal Trials in1998.Ag BioTech InfoNet Technical Paper Number l(1998年高校主导的变种试验中抗草甘膦大豆产量的量和结果的证明)）。

人们认为单独地具有优选如上文描述突变A即位置44的突变，或具有突变A与其它产生草甘膦抗性的突变优选本文描述的突变相组合的EPSPS突变体可能导致对草甘膦的（改善的）抗性。这可能是没有（进一步）抑制酶活性或者甚至改善了酶活性。尤其意外的是，发现突变A（在位置44）与产生草甘膦抗性的其它突变例如突变B（在位置101）、突变C（在位置106）或者突变D（在位置179）的组合增强了草甘膦抗性，这超出了以单独的突变A和单独的其它突变为基础达到的预期效果。

例如，还可以为编码EPSPS酶的核苷酸序列，所述酶包含使EPSPS酶赋予植物（细胞）草甘膦抗性的突变，优选选自由如图1所示的101、106或者179组成的组中的位置的氨基酸的变化相对应的突变，提供与上文所公开的位置44的氨基酸的变化相对应的进一步的突变，以获得编码EPSPS酶的核苷酸序列，相较于当编码EPSPS酶的核苷酸序列中未提供与位置44的氨基酸的变化的相对应的所述突变时，上述EPSPS酶对其正常底物可以具有增加的活性，或者对草甘膦有更好的抗性。例如增加的活性包括EPSPS酶对其正常底物的亲和力增加1.5、2、4或5倍。在不受理论限制的情况下，本申请发明人认为，该效果可能涉及EPSPS酶活性位点的变化，所述变化导致酶对草甘膦亲和力更低和/或酶对其正常底物亲和力增加。

其它突变的或者修饰的EPSPS，如美国专利第5,310,667号、第5,866,775、第6,225,114号和第6,248,876号中描述的那些，或者显示草甘膦抗性的天然EPSPS变体，也可以与本发明组合使用。另外，细菌衍生的抗草甘膦EPSPS变体，例如与叶绿体转运肽融合之后，也可以与本发明组合使用。

如熟练技术人员所理解的，通过应用诱变化合物例如甲磺酸乙酯（EMS）或者能够（任意）将突变引入核苷酸序列中的其它化合物，可以将突变引入到本文限定的编码EPSPS的核苷酸序列中。该诱变化合物或其它化合物可以作为产生具有编码EPSPS酶的核苷酸序列中的突变的植物（细胞）的一种手段。然后根据本发明可以通过测序选择具有突变的植物（细胞）。

可选地，根据本发明在编码EPSPS酶的核苷酸序列中引入突变，会受到在植物中引入转移DNA（T-DNA）的影响，例如某些种类细菌例如根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱发（Ti）质粒的T-DNA。可以将包含根据本发明编码含有位置44的氨基酸变化的EPSPS酶的核苷酸序列的T-DNA要素，可选地与本文描述的其它突变相组合，引入到植物中，这导致通过根据本发明的方法获得的具有（增强的）草甘膦抗性的植物（细胞）（参见例如Krysan et al，1999 The Plant Cell,Vol 11.2283-2290）。可以通过转座因子插入的使用获得同样的优点（参见例如Kunze et al(1997)Advances in Botanical Research 27 341-370 or Chandlee(1990)Physiologia Planta 79(1)105-115）。

优选地，通过基因组工程技术将突变引入根据本发明编码EPSPS酶的核苷酸序列中，如基于同源重组的技术或者寡聚物定向诱变（ODM），例如WO2007073170、WO2007073149、WO2009002150和WO2007073166中描述的)。通过应用ODM，可以改变编码EPSPS的核苷酸序列中的特定核苷酸，从而可以引入本发明的突变。

本发明还提供了一种赋予植物草甘膦抗性的EPSPS酶，优选植物EPSPS酶，如本文所描述的，其通过根据本发明的核苷酸序列编码。这样的EPSPS酶可以源自细菌或者植物。然而，优选的是，该EPSPS酶或者编码该EPSPS酶的核苷酸源自作物，更优选源自棉花、番茄、马铃薯、洋葱、水稻、小麦、玉米或者向日葵，因为该EPSPS酶可能更类似于在农业中最常用的植物的天然EPSPS酶。这样更天然的EPSPS酶在农业中可以使农作物产生更高的作物产量。

本发明的EPSPS酶可以在植物中表达，优选为作物，更优选棉花、番茄、马铃薯、洋葱、水稻、小麦、玉米、向日葵、甜菜或者芸苔属种类。

棉花包括棉属种类，例如G.hirsutum和海岛棉。番茄包括番茄(Solanum lycopersicum)。马铃薯包括马铃薯(Solanum tubersosum)。洋葱包括葱属(Allium)种类，特别是洋葱(Allium cepa)。水稻包括稻(Oryzasativa)，如籼稻栽培种组(O.sativa cultivar-group)或者粳稻品种组(japonicacultivar-group)和光稃稻(Oryza glaberrima)。小麦包括小麦属(Triticum)种类，包括一粒小麦(T.monococcum)和二粒小麦(T.dicoccoides)。玉米包括玉蜀黍属(Zea)种类。向日葵包括向日葵(Helianthus annus)。芸苔属种类包括卡诺拉、油菜、菜花、花椰菜、卷心菜、甘蓝型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.juncea)、甘蓝(B.oleracea)、白菜型油菜(B.rapa)，以及甜菜，包括甜菜(Beta vulgaris)。

本发明还提供了包含本发明的核苷酸序列的载体和包含这样的载体的宿主。所述载体可以用来将本发明的核苷酸转移到另一细胞例如植物细胞。不同类型的载体包括质粒、噬菌体和其它病毒、粘粒和人工染色体。

本发明还提供了包含本发明的核苷酸序列和/或其片段和/或本发明的EPSPS酶的植物或转基因植物或其部分。所述片段的长度至少足以确定该片段是源自编码EPSPS酶的核苷酸序列，且其还包含本发明的突变A，优选与当在编码EPSPS酶的完整核苷酸序列中将赋予植物草甘膦抗性的至少一个进一步的突变相组合。优选地，该至少一个进一步的突变包括本文描述的本发明的突变B、突变C和/或突变D。

例如该片段的长度可以为至少10、30、100、500个连续核苷酸。熟练技术人员可以毫无问题地确定这样的片段是否包括本文所描述的突含变。例如可以通过将该片段与EPSPS编码序列比对来确定。

转基因作物含有人工插入的一个基因或多个基因，即其中该基因最初没有通过授粉获得。因此非转基因植物不含有人工插入的一个基因或多个基因。本发明还提供了源自上文所述的植物或者转基因植物或者其部分的种子，其包含本发明的核苷酸序列和/或其片段和/或本发明的EPSPS酶。

该片段的长度至少足以确定该片段是源自编码EPSPS酶的核苷酸序列，且其还包含本发明的突变A（位置44）。

例如该片段的长度可以为至少10、30、100、500个连续核苷酸。熟练技术人员可以毫无问题地确定这样的片段是否包含本文所描述的突变。例如可以通过将该片段与EPSPS编码序列比对来确定。

在另一方面，本发明涉及一种提供抗草甘膦植物（细胞）的方法，该方法包括：

a.提供包含编码EPSPS酶、优选植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物（细胞），其特征在于该核苷酸序列包含与如图1所示位置44的氨基酸的变化相对应的至少一个突变。

在上述方法中，优选的是，在位置44发生改变的氨基酸是天冬酰胺，和/或在位置44的氨基酸改变为天冬氨酸，优选与野生型EPSPS比较。换句话说，如图1所示，位置44的氨基酸优选是天冬氨酸。

在另一方面，本发明涉及一种提供对草甘膦有抗性的植物（细胞）的方法，该方法包括：

a.提供包含编码EPSPS酶、优选植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物（细胞），其特征在于该核苷酸序列包含与如图1所示位置44的氨基酸的变化相对应的至少一个突变，和独立地使该核苷酸序列编码赋予植物草甘膦抗性的EPSPS酶的至少一个进一步的突变，优选地，其中该至少一个进一步的突变与选自由101、106或者179组成的组中的位置的氨基酸的变化相对应，如图1所示。

在又一方面，本发明涉及一种提供对草甘膦有抗性的植物（细胞）的方法，该方法包括：

a.提供包含编码EPSPS酶、优选植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物（细胞）；

b.在步骤a）的所述核苷酸序列中，优选地在步骤a）的所述植物中，提拱与图1所示位置44的氨基酸的变化相对应的突变。

因此，优选提供了一种突变，其导致在EPSPS编码序列中的位置44的氨基酸不是天冬酰胺（N），例如与没有该突变的相同的EPSPS编码序列相比引起草甘膦抗性。

在又一方面，本发明涉及一种增强植物（细胞）的草甘膦抗性的方法，该方法包括：

a.提供包含编码赋予植物草甘膦抗性的EPSPS酶、优选植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物（细胞），并且优选地，其特征在于该核苷酸序列包含与选自由如图1所示的101、106或者179组成的组中的位置的氨基酸的变化相对应的至少一个突变。

b.在步骤a）的所述核苷酸序列中，优选地在步骤a）的所述植物中提拱与图1所示位置44的氨基酸的变化相对应的突变。

在编码EPSPS酶、优选植物EPSPS酶的核苷酸序列中提供与图1所示位置44的氨基酸的变化相对应的突变，可以通过靶向核苷酸交换（TNE）来完成，即通过在编码EPSPS酶、优选植物EPSPS酶的核苷酸序列中引入至少一个寡核苷酸来完成，该寡核苷酸能够和步骤a）的核苷酸序列杂交并且包含相对于步骤a）的核苷酸序列的错配，其中该错配的位置与图1所示位置44的氨基酸的变化相对应的突变的位置对应。

一旦引入细胞中，例如通过电穿孔或者PEG介导的寡核苷酸摄取，这样的寡核苷酸就能够与将被改变（即编码EPSPS酶的核苷酸序列中的靶位点）的核苷酸序列的互补序列杂交（碱基对）。通过在寡核苷酸中有意设计错配，该错配可以使得在靶基因组序列中的相应位置发生核苷酸转换。这可以导致提供与图1所示位置44的氨基酸变化相对应的突变。同样，根据有意设计的错配类型，这可以导致提供与图1所示位置101、106和/或179的氨基酸变化相对应的突变。

该寡核苷酸的长度可以为10-500个核苷酸之间，优选地15-250个核苷酸，更优选地10-200个核苷酸，最优选地15-150个核苷酸之间。该寡核苷酸可以含有锁核苷酸，优选地在该错配的上游或者下游设置一个核苷酸。该寡核苷酸可以可选地或者额外地包含丙炔基化碱基。申请人的专利公开WO2007073166、WO2007073170和WO2009002150中描述了TNE方法。该寡核苷酸还可以包含位于5′端和/或3′端或该错配的两端的至少4、至少3、3、2或者1个硫代磷酸酯连接。

进一步优选的是，在上述方法中，在位置44发生改变的氨基酸是天冬酰胺，和/或位置44的氨基酸改变为天冬氨酸，和/或在位置101发生改变的氨基酸是甘氨酸，和/或在位置106发生改变的氨基酸是脯氨酸，和/或在位置179发生改变的氨基酸是丝氨酸，和/或位置101的氨基酸改变为丙氨酸，和/或位置106的氨基酸改变为亮氨酸，和/或位置179的氨基酸改变为天冬酰胺（参见在本发明涵盖的标题“突变的具体组合”中描述的突变的具体组合）。

本发明的方法提供的植物可以用来生产其他植物和/或从其衍生的植物产品。术语植物产品指的是能从生长的植物中获得的那些材料，其包括压碎的、磨碎的或仍完整的、与其它材料混合的、干燥的或冰冻等的果实、叶子、植物器官、植物脂肪、植物油、植物淀粉和植物蛋白级分。

本发明还提供了一种生成植物产品的方法，该方法包括：

a）加工包含本发明的核苷酸和/或本发明的EPSPS酶的植物或转基因植物或其部分，或者根据本发明的任何方法可得到的植物。

在上述方法中，优选地通过蒸煮、碾磨、干燥、研磨、烘焙、切割、筛分、剥落、脱皮、浸泡、洗涤、加热、冷却、破碎或者湿润来实施所述加工，以得到植物产品。

还提供通过上述方法可获得的植物产品，优选为淀粉基产品或植物油基产品，其特征在于，存在本发明的核苷酸序列和/或其片段。

淀粉基产品可以包括产品如番茄酱、面粉或任何其它含淀粉产品。植物油基产品可以包括产品如橄榄油、向日葵油或任何其它含植物油产品。

本发明还提供了本发明的核苷酸序列和/或本发明的EPSPS酶在增强植物的草甘膦抗性中的用途。例如，可以将这样的核苷酸序列引入到植物（细胞）中从而实现（增强的）草甘膦抗性。

本发明的另一个方面涉及与图1所示位置44的氨基酸的变化相对应的突变在增强抗草甘膦植物的草甘膦抗性中的用途，优选，其中该植物包含编码赋予植物草甘膦抗性的EPSPS酶优选植物EPSPS酶的核苷酸序列，优选地，其特征在于该核苷酸序列包含与选自由图1所示101、106或者179所组成的组中的位置的氨基酸的变化相对应的至少一个突变。

换句话说，与位置44的氨基酸的变化相对应的突变的用途包括，改变位置44的氨基酸，优选使得位置44的氨基酸是天冬氨酸，从而实现（增强的）草甘膦抗性。但换言之，该用途包括根据本发明位置44的氨基酸的变化信息的用途，从而实现（增强的）草甘膦抗性。

相对于上述用途，优选的是，在位置44发生改变的氨基酸是天冬酰胺，和/或在位置101发生改变的氨基酸是甘氨酸，和/或在位置106发生改变的氨基酸是脯氨酸，和/或在位置179发生改变的氨基酸是丝氨酸，和/或位置44的氨基酸改变为天冬氨酸，和/或位置101的氨基酸改变为丙氨酸，和/或位置106的氨基酸变为亮氨酸，和/或位置179的氨基酸改变为天冬酰胺。这些变化优选与野生型EPSPS比较。

还提供了以上描述的抗草甘膦的EPSPS酶中的突变在恢复或者提高酶活性中的用途。例如，引起位置44的氨基酸优选天冬酰胺改变为另一氨基酸优选天冬氨酸的突变可以通过以下方式使用：将其引入到已对草甘膦有抗性的酶中来进一步提高该酶对其正常底物PEP的活性。优选地，可以将引起位置101的氨基酸优选甘氨酸改变为另一氨基酸优选丙氨酸的突变，和/或引起位置106的氨基酸优选脯氨酸改变为另一氨基酸优选亮氨酸的突变，和/或引起位置179的氨基酸优选丝氨酸改变为另一氨基酸优选天冬酰胺的突变，（另外）引入到已对草甘有抗性的酶中来进一步提高该酶对其正常底物PEP的活性。

下面描述了可根据本发明使用的突变A、B、C和D的具体组合。

本发明涵盖的突变的具体组合

突变A+B

在优选的实施方案中，编码EPSPS酶的核苷酸序列包含引起位置44的氨基酸的变化的突变和引起位置101的氨基酸的变化的突变。在优选的实施方案中，在位置44发生改变的氨基酸是天冬酰胺。在另一优选的实施方案中，在位置101发生改变的氨基酸是甘氨酸。在进一步优选的实施方案中，在位置44发生改变的氨基酸是天冬酰胺和在位置101发生改变的氨基酸是甘氨酸。优选地，引起位置44的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为天冬氨酸，即天冬氨酸位于位置44。优选地，引起位置101的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为丙氨酸，即丙氨酸位于位置101。优选地，引起位置44的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为天冬氨酸，即天冬氨酸位于位置44，并且同时，引起位置101的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为丙氨酸，即目前丙氨酸位于位置101。

突变A+C

在另一优选的实施方案中，编码EPSPS酶的核苷酸序列包含引起位置44的氨基酸的变化的突变和引起位置106的氨基酸的变化的突变。在优选的实施方案中，在位置44发生改变的氨基酸是天冬酰胺。在另一优选的实施方案中，在位置106发生改变的氨基酸是脯氨酸。在进一步优选的实施方案中，在位置44发生改变的氨基酸是天冬酰胺和在位置106发生改变的氨基酸是脯氨酸。优选地，引起位置44的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为天冬氨酸，即天冬氨酸位于位置44。优选地，引起位置106的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为亮氨酸，即亮氨酸位于位置106。优选地，引起位置44的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为天冬氨酸，即天冬氨酸位于位置44，并且同时，引起位置106的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为亮氨酸，即亮氨酸位于位置106。

突变A+D

在另一优选的实施方案中，编码EPSPS酶的核苷酸序列包含引起位置44的氨基酸的变化的突变和引起位置179的氨基酸的变化的突变。在优选的实施方案中，在位置44发生改变的氨基酸是天冬酰胺。在另一优选的实施方案中，在位置179发生改变的氨基酸是丝氨酸。在进一步优选的实施方案中，在位置44发生改变的氨基酸是天冬酰胺和在位置179发生改变的氨基酸是丝氨酸。优选地，引起位置44的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为天冬氨酸，即天冬氨酸位于位置44。优选地，引起位置179的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为天冬酰胺（D），即天冬酰胺位于位置179。优选地，引起位置44的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为天冬氨酸，即目前天冬氨酸位于位置44，并且同时，引起位置179的氨基酸的变化的核苷酸序列中的突变使其改变为天冬酰胺，即天冬酰胺位于位置179。

附图说明

图l示出缺少叶绿体引导信号的成熟蛋白质。在图1中，比对了来自玉米（SEQ ID NO:1）、水稻（SEQ ID NO:2）、小麦（SEQ ID NO:3）、番茄（SEQ ID NO:4）、拟南芥（SEQ ID NO:5）、洋葱（SEQ ID NO:6）、沙门氏菌（SEQ ID NO:7）和大肠杆菌（SEQ ID NO:8）的EPSPS酶的相关区域，并且突出了重要的氨基酸。图1示出本文公开和提及的氨基酸位置。可以看出，本文公开和提及的氨基酸位置44、101、106和179分别涉及SEQ ID NO:1中的位置43、99、104和177，SEQ ID NO:2中的位置44、101、106和179，SEQ ID NO:3中的位置44、101、106和179，SEQ ID NO:4中的位置44、101、106和179，SEQ ID NO:5中的位置44、101、106和179，SEQ ID NO:6中的位置30、87、92和165，SEQ ID NO:7中的位置42、95、100和169以及SEQ ID NO:8中的位置42、95、100和169。

图2示出使用拟南芥(A.thaliana)EPSPS变体在大肠杆菌中互补试验的结果。以下是对图2的说明。

（1）N44D P106L

（2）S179N

（3）P106L

（4）野生型

（5）N44D

（6）P106L S179N

（7）空白

图3示出完整的拟南芥EPSPS氨基酸序列，包括叶绿体引导信号（SEQ ID NO:9）。相关的氨基酸用下划线标出。可以看出，本文公开和提及的氨基酸位置44、101、106和179分别涉及SEQ ID NO:1中的位置120、177、182和255。

图4示出完整的拟南芥EPSPS ORF(SEQ ID NO:10)。

图5示出包括与N44D（SEQ ID NO:11）对应的突变A358G的完整的拟南芥EPSPS ORF。

图6示出包含与P106L（SEQ ID NO:12）对应的突变C545T的完整的拟南芥EPSPS ORF。

图7示出包含分别与N44D和P106L（SEQ ID NO:13）对应的突变A358G和G545T的完整的拟南芥EPSPS ORF。

图8示出包含与S179N（SEQ ID NO:14）对应的突变G902A的完整的拟南芥EPSPS ORF。

图9示出包含分别与P106L和S179N（SEQ ID NO:15）对应的突变C545T和G902A的完整的拟南芥EPSPS ORF。

图10示出包含分别与N44D和S179N（SEQ ID NO:16）对应的突变A358G和G902A的完整的拟南芥EPSPS ORF。

图11示出包含与G101A（SEQ ID NO:17）对应的突变G530C的完整的拟南芥EPSPS ORF。

图12示出包含分别与N44D和G101A（SEQ ID NO:18）对应的突变A358G和G530C的完整的拟南芥EPSPS ORF。

图13示出完整的番茄EPSPS核苷酸序列（SEQ ID NO:19）。

图14示出完整的番茄EPSPS2核苷酸序列（SEQ ID NO:20）。

图15示出完整的番茄EPSPS1氨基酸序列（SEQ ID NO:21）。相关氨基酸用下划线标出。可以看出，本文公开和提及的氨基酸位置44、101、106和179分别涉及SEQ ID NO:21中的位置118、175、180和253。

图16示出完整的番茄EPSPS2氨基酸序列（SEQ ID NO:22）。相关氨基酸用下划线标出。可以看出，本文公开和提及的氨基酸位置44、101、106和179分别涉及SEQ ID NO:22中的位置120、177、182和255。

图17示出完整的大肠杆菌EPSPS氨基酸序列（SEQ ID NO:23）。相关氨基酸用下划线标出。可以看出，本文公开和提及的氨基酸位置44、101、106和179分别涉及SEQ ID NO:23中的位置43、96、101和170。

图18示出完整的棉花EPSPS氨基酸序列（SEQ ID NO:24）。相关氨基酸用下划线标出。可以看出，本文公开和提及的氨基酸位置44、101、106和179分别涉及SEQ ID NO:24中的位置121、178、183和256。

图19示出完整的玉米EPSPS氨基酸序列（SEQ ID NO:25）。相关氨基酸用下划线标出。可以看出，本文公开和提及的氨基酸位置44、101、106和179分别涉及SEQ ID NO:25中的位置46、102、107和180。

图20示出完整的水稻EPSPS氨基酸序列（SEQ ID NO:26）。相关氨基酸用下划线标出。可以看出，本文公开和提及的氨基酸位置44、101、106和179分别涉及SEQ ID NO:26中的位置115、172、177和250。

图21示出完整的小麦EPSPS氨基酸序列（SEQ ID NO:27）。相关氨基酸用下划线标出。可以看出，本文公开和提及的氨基酸位置44、101、106和179分别涉及SEQ ID NO:27中的位置110、167、172和245。

图22示出完整的向日葵EPSPS氨基酸序列（SEQ ID NO:28）。相关氨基酸用下划线标出。可以看出，本文公开和提及的氨基酸位置44、101和106分别涉及SEQ ID NO:28中的位置118、175和180。

图23示出转基因拟南芥株系中的草甘膦耐受性：平均幼苗重量比（+Gly/-Gly）。以下是对图23的说明。

（1）野生型EPSPS基因

（2）具有突变N44D的EPSPS

（3）具有突变P106L的EPSPS

（4）具有突变P106L和N44D的EPSPS(1)

（5）具有突变P106L和N44D的EPSPS(2)

（6）具有突变P106L和N44D的EPSPS(3)

（7）具有突变N44D和S179N的EPSPS

具体实施方式

实施例1

在EPSPS酶中应用突变A增强由所述EPSPS酶赋予的草甘膦抗性。

我们测试在EPSPS酶中与位置44的天冬酰胺改变为天冬氨酸相对应的突变（N44D突变）是否能够提供具有草甘膦抗性的EPSPS酶。通过将N44D突变单独地和与赋予该EPSPS酶以草甘膦抗性的其它突变组合引入到该EPSPS酶中来测试。这些是在EPSPS酶中与位置101的甘氨酸改变为丙氨酸的变化相对应的突变（G101A），在EPSPS酶中与位置106的脯氨酸改变为亮氨酸的变化相对应的突变（P106L），以及在EPSPS酶中与位置179的丝氨酸改变为天冬酰胺的变化相对应的突变（S179N）。

构建体

所有实验都使用了拟南芥（Arabidopsis thaliana）EPSPS（At2945300）开放阅读框（参见图4-12）。图13描述了该拟南芥(Arabidopsis)EPSPS氨基酸序列。

首先，综合地合成该序列（ww.geneart.com）并将其克隆到侧翼为BamHI和EcoRI位点的载体中。然后将其作为用于通过定点诱变引入N44D（A350G）、G101A（G530C）、P106L（C545T）和S179N（G902A）突变的基本构建体（ww.geneart.com）。还构建了以下双突变体：N44D+G101A、N44D+P106L、N44D+S179N以及P106L+S179N。

然后将这些EPSPS变体的每一个作为1576bps EcoRI-BamHI片段克隆到载体pET302NT HIS（lnvitrogen，产品K630203）中，从而将EPSPS变体融合到6x His标签并允许在大肠杆菌中用IPTG诱变蛋白表达。还可以将这些构建体引入到大肠杆菌表达菌株BL21 pLYS（lnvitrogen）中用于互补分析(complementation assay)。

互补分析

由于内源细菌EPSPS合酶AroA的活性的抑制，大肠杆菌不能在补充有草甘膦的基本M9生长培养基中生长。可以通过补充抗草甘膦植物EPSPS基因来恢复细菌生长。使含有该拟南芥(A.thaliana)EPSPS变体的大肠杆菌菌株在含100μg/ml羧苄青霉素（Duchefa）的10ml LB培养基中过夜生长。然后在相同的培养基中将菌种稀释4倍并再生长4小时。然后测量每一培养物的OD600，并在4000rpm的速度下将1.5ml培养物离心10分钟。在500μl M9培养基（12.8g/l Na₂HPO₄、3.0g/l KH₂PO₄、0.5g/l NaCl、1.0g/l NH₄Cl、2.0g/l葡萄糖、0.4940g/l MgSO₄·7H₂O、15mg/lCaCl₂·2H₂O、10mg/l硫胺素和l0mg/l FeSO₄·7H₂O）中重悬浮细菌球，然后将其接种在含有l mM IPTG、100μg/ml羧苄青霉素和30mM草甘膦的l0ml M9培养基上至达到0.1OD600。还制成用于每一菌株的缺少草甘膦的相同培养物，并且它们用来评价未经选择的每一菌株的生长。然后在25℃生长该培养物，并且随时间测量OD600以评价细菌的生长（参见图2）。

结果

图2示出互补分析的结果。正如所期望的，含有空白pET302NT His载体的菌株不能在存在草甘膦的条件下生长，而含有P106L突变的菌株显示了良好的抗性水平。野生型（WT）EPSPS酶的超表达能够在稍后的时间点补足细菌生长，大概是由于高蛋白表达水平引起的草甘膦滴定。换句话说，在上述稍后的时间点草甘膦的量可能不再足以使所有表达的EPSPS酶失活。

该结果表明，单独的N44D突变可以提供一些草甘膦抗性，但当与P106L突变组合时则在生长18小时后能够将抗性水平增强2.5倍。这表明，N44D可以优选地用作能够提高草甘膦抗性的次级突变。当突变A在这种情况下是N44D与上面描述的其它突变组合时，能获得相似的结果。单独的S179N突变也赋予了良好的抗性，但当其与P106L突变组合时，该EPSPS酶是无活性的。

实施例2

当含N44D和P106L突变的EPSPS基因在拟南芥中表达时赋予增强的草甘膦耐受性。

在使用大肠杆菌分析的第一个实施例中，我们已能证明N44D突变本身提供了草甘膦耐受性，但当与例如P106L突变组合时，极大地增强了草甘膦耐受性。本实施例的目的是证明N44D突变在植物中显示同样的效果，并且测试了大量突变EPSPS基因对拟南芥（Arabidopsis thaliana）中草甘膦抗性的影响。

构建含突变的EPSPS基因的双元载体

将大肠杆菌中测试的突变拟南芥EPSPS基因（参见实施例1）克隆到双元载体pEARLEYGATE100中（The Plant J.2006;45:616-629）。简言之，将EPSPS基因分离为包含完整的ORF′s的BamHI和Sacl片段，然后将它们插入到双元载体中的相同的特定的位点。这生成了一系列携带T-DNA和BAR基因（赋予草甘膦抗性）的双元载体，其中通过组成型35S启动子在T-DNA上表达EPSPS基因，BAR基因可以用于植物选择。使用熟练技术人员已知的方法，将该系列的双元载体电穿孔至根癌农根菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV2260，并且在含100μg/ml壮观霉素的LB培养基上选择细菌菌落。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）的转化

将拟南芥（生态型Colombia）种子播种在土壤中，一旦发芽，就将单个的幼苗放入5cm×5cm的盆中，使其生长，直到出现第一次内源荧光。然后在这个阶段使用花序浸渍法转化该植物。简单地说，在28℃使农杆菌属（Agrobacterium）菌株在含有100μg/ml壮观霉素的50ml液体LB培养基中生长过夜，然后在4000rpm将该培养物离心10分钟。然后在含0.02%表面活性剂(Silwet)（Lehle种子）的5%庶糖溶液中重悬浮该菌球。将拟南芥植物浸渍在该培养物中，然后在25℃避光孵育过夜。然后使该植物在温室中进一步生长，7天后重复该浸渍步骤。然后使该植物落籽并使籽在土壤中发芽。为选择转化的拟南芥幼苗，制备草胺膦溶液（0.1mg/ml草胺膦+0.005%表面活性剂），并将其喷洒在该幼苗上。7天后，确定存活的幼苗，使其长至成熟并且收集种子。

转基因拟南芥株系复制数目的确定

我们对转基因株系的种子进行分离分析以估计T-DNA复制数目。用2%次氯酸盐溶液对来自每一转基因株系的种子杀菌，并用无菌水洗涤。然后将每株系大约100粒种子放置到含0.1mg/ml草胺膦的MS20培养基上，并在20天后记录存活幼苗的数量。选择具有对草甘膦分离为3:1（抗性：敏感性）的单个的T-DNA复制的株系，用于进一步分型。

转基因拟南芥株系的草甘膦耐受性

对来自转基因拟南芥株系的种子杀菌，并将其放置到含0.1mg/ml草胺膦和+/-400μM草甘膦的MS20培养基上，并生长4周。在这个阶段后，从生长盘中移走幼苗，并确定幼苗的平均重量。通过草甘膦存在下幼苗的平均重量除以无草甘膦时幼苗的平均重量来确定每一株系的草甘膦抗性程度。图23示出该分析的结果。

植物中即来自拟南芥的的数据，证实了我们在大肠杆菌生长分析中发现的抗性。与EPSPS未突变的WT形式相比，只含N44D突变的EPSPS基因的超表达导致草甘膦抗性。EPSPS P106L基因的超表达提供合理的抗性，而这在表达既有P106L又有N44D突变的EPSPS的3种独立的株系中可以增强。S179N突变的数据表明当与N44D组合时该突变也赋予抗性。

Claims

1.一种编码赋予植物草甘膦抗性的EPSPS酶、优选植物EPSPS酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包含与图1所示位置44的氨基酸的变化相对应的至少一个突变。

2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其中在位置44发生改变的所述氨基酸是天冬酰胺。

3.如权利要求1-2中任一项所述的核苷酸序列，其中优选与野生型EPSPS相比，所述位置44的氨基酸改变为天冬氨酸。

4.如权利要求1-3中任一项所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包含独立地使所述核苷酸序列编码赋予植物草甘膦抗性的EPSPS酶的至少一个进一步的突变，优选地，其中所述至少一个进一步的突变与选自由图1所示101、106或者179组成的组中的位置的氨基酸的变化相对应。

5.如权利要求4所述的核苷酸序列，其中在位置101发生改变的所述氨基酸是甘氨酸，和/或在位置106发生改变的所述氨基酸是脯氨酸，和/或在位置179发生改变的所述氨基酸是丝氨酸。

6.如权利要求4-5中任一项所述的核苷酸序列，其中优选与野生型EPSPS相比，所述位置101的氨基酸改变为丙氨酸，和/或所述位置106的氨基酸改变为亮氨酸，和/或所述位置179的氨基酸改变为天冬酰胺。

7.赋予植物草甘膦抗性的EPSPS酶，优选植物EPSPS酶，所述EPSPS酶由权利要求1-6中任一项所述的氨基酸序列编码。

8.如权利要求7所述的EPSPS酶，其中所述EPSPS酶源自细菌或者植物，优选源自农作物，更优选源自棉花、番茄、马铃薯、洋葱、水稻、小麦、玉米、向日葵、油菜、卡诺拉或甜菜。

9.如权利要求7或8所述的EPSPS酶，其中所述EPSPS酶在植物中，优选农作物，更优选棉花、番茄、马铃薯、洋葱、水稻、小麦、玉米、向日葵、油菜、卡诺拉或甜菜中表达。

10.包含权利要求1-6任一项所述的核苷酸序列的载体。

11.包含权利要求10所述的载体的寄主。

12.植物或转基因植物或其部分，包含权利要求1-6中任一项所述的核苷酸序列和/或包含权利要求1-3中任一项限定的突变的所述核苷酸序列的片段，优选地与权利要求4-6中任一项限定的所述至少一个进一步的突变组合，和/或权利要求7-9中任一项所述的EPSPS酶。

13.来源于权利要求12所述的植物或转基因植物或其部分的种子，包含权利要求1-6中任一项所述的核苷酸序列和/或包含权利要求1-3中任一项限定的所述突变的核苷酸序列的片段，优选地与权利要求4-6中任一项限定的所述至少一个进一步的突变组合，和/或权利要求7-9中任一项所述的EPSPS酶。

14.提供抗草甘膦植物（细胞）的方法，所述方法包括：

a.提供包含编码EPSPS酶、优选植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物（细胞），特征在于：所述核苷酸序列包含与图1所示位置44的氨基酸的变化相对应的至少一个突变。

15.如权利要求14所述的方法，其中在位置44发生改变的所述氨基酸是天冬酰胺。

16.如权利要求14-15中任一项所述的方法，其中优选与野生型EPSPS相比，所述位置44的氨基酸改变为天冬氨酸。

17.提供具有草甘膦抗性的植物（细胞）的方法，所述方法包括：

a.提供包含编码EPSPS酶、优选植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物（细胞），其特征在于，所述核苷酸序列包含与图1所示位置44的氨基酸的变化相对应的至少一个突变和独立地使所述核苷酸序列编码赋予植物草甘膦抗性的EPSPS酶的至少一个进一步的突变，优选地，其中所述至少一个进一步的突变与选自由图1所示101、106或者179组成的组中的位置的氨基酸的变化相对应。

18.提供具有草甘膦抗性的植物（细胞）的方法，所述方法包括：

b.在步骤a）的所述核苷酸序列中，优选在步骤a）的所述植物（细胞）中，提供权利要求1-3中任一项限定的突变。

19.如权利要求18所述的方法，其中在步骤a）的所述核苷酸序列中，在步骤a）的所述植物（细胞）中，提供权利要求1-3中任一项限定的突变的步骤b）是通过引入至少一个寡核苷酸来进行，所述寡核苷酸能和步骤a）的所述核苷酸序列杂交并且相对于步骤a）的所述核苷酸序列包含至少一个错配，其中所述错配的位置与权利要求1-3中任一项限定的突变的位置相对应。

20.增强植物（细胞）的草甘膦抗性的方法，所述方法包括：

a.提供包含编码赋予植物草甘膦抗性的EPSPS酶、优选植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物（细胞），并且优选地，其特征在于，所述核苷酸序列包含与选自由图1所示101、106或者179组成的组中的位置的氨基酸的变化相对应的至少一个突变；

b.在步骤a）的所述核苷酸序列中，优选在步骤a）的所述植物（细胞）中，提供权利要求1-3中任一项限定的所述突变。

21.如权利要求20所述的方法，其中在步骤a）的所述核苷酸序列中，在步骤a）的所述植物（细胞）中，提供权利要求1-3中任一项限定的突变的步骤b）是通过引入至少一个寡核苷酸来进行，所述寡核苷酸能和步骤a）的所述核苷酸序列杂交并且相对于步骤a）的所述核苷酸序列包含至少一个错配，其中所述错配的位置与权利要求1-3中任一项限定的突变的位置相对应。

22.如权利要求17-21中任一项所述的方法，其中在位置44发生改变的所述氨基酸是天冬酰胺，和/或其中在位置101发生改变的所述氨基酸是甘氨酸，和/或其中在位置106发生改变的所述氨基酸是脯氨酸，和/或其中在位置179发生改变的所述氨基酸是丝氨酸。

23.如权利要求17-22中任一项所述的方法，其中优选与野生型EPSPS相比，所述位置44的氨基酸改变为天冬氨酸，和/或所述位置101的氨基酸改变为丙氨酸，和/或所述位置106的氨基酸改变为亮氨酸，和/或所述位置179的氨基酸改变为天冬酰胺。

24.生成植物产品的方法，所述方法包括：

a.优选地通过蒸煮、碾磨、干燥、磨碎、烘焙、切割、过筛、剥落、脱皮、浸泡、洗涤、加热、冷却、破碎或者湿润，加工权利要求12所述的植物或其部分或者通过权利要求14-23中任一项所述的方法可获得的植物，从而得到植物产品。

25.由如权利要求24所述的方法获得的植物产品，优选淀粉基产品或植物油基产品，其特征在于，存在权利要求1-6中任一项所述的核苷酸序列和/或包含权利要求1-3中任一项限定的所述突变的核苷酸序列的片段，优选地与权利要求4-6中任一项限定的所述至少一个进一步的突变组合。

26.如权利要求1-6中任一项所述的核苷酸序列和/或权利要求7-9中任一项所述的EPSPS酶在增强植物的草甘膦抗性中的用途。

27.权利要求1-3中任一项所述的突变在增强抗草甘膦植物的草甘膦抗性中的用途，优选地，其中所述植物包含编码赋予植物草甘膦抗性的EPSPS酶、优选植物EPSPS酶的核苷酸序列，优选地，其特征在于：所述核苷酸序列包含与选自由图1所示101、106或者179组成的组中的位置的氨基酸的变化相对应的至少一个突变。

28.如权利要求27所述的用途，其中在位置44发生改变的所述氨基酸是天冬酰胺，和/或其中在位置101发生改变的所述氨基酸是甘氨酸，和/或其中在位置106发生改变的所述氨基酸是脯氨酸，和/或其中在位置179发生改变的所述氨基酸是丝氨酸。

29.如权利要求27或28所述的用途，其中优选与野生型EPSPS相比，所述位置44的氨基酸改变为天冬氨酸，和/或其中所述位置101的氨基酸改变为丙氨酸，和/或所述位置106的氨基酸改变为亮氨酸，和/或其中所述位置179的氨基酸改变为天冬酰胺。