CN108330115A

CN108330115A - 一种抗草甘膦epsp合成酶mc1-epsps及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN108330115A
Application number: CN201810329538.5A
Authority: CN
Inventors: 谢树章; 杨小艳; 雷开荣; 翁建峰; 王忠伟
Original assignee: Chongqing Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-04-13
Filing date: 2018-04-13
Publication date: 2018-07-27
Anticipated expiration: 2038-04-13
Also published as: CN108330115B

Abstract

本发明公开了一种抗草甘膦EPSP合成酶MC1‑EPSPS及其编码基因与应用。本发明人工改造合成的抗草甘膦基因MC1‑EPSPS序列,与原始EPSPS基因序列相比，大大增强了其在植物中的表达。本发明的抗草甘膦基因MC1‑EPSPS可在植物细胞中高效稳定的表达。将抗草甘膦基因MC1‑EPSPS导入烟草和玉米后，都可以得到稳定遗传的MC1‑EPSPS转化体，提高植物的草甘膦抗性。此外，该基因也可以转化大豆、棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗草甘膦活性，从而适用与少耕与免耕体系，加强了水分保持，大大减少了土壤流失，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

Description

一种抗草甘膦EPSP合成酶MC1-EPSPS及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种抗草甘膦EPSP合成酶MC1-EPSPS及其编码基因与应用。

背景技术

草甘膦是一种内吸传导非选择性、广谱灭生性除草剂，具有理化、质稳定、高效、低毒、低残留、易被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。其相关作用机理是由于草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的类似物，因此草甘膦、莽草酸-3-磷酸、EPSP合成酶容易结合形成EPSP-S3P-草甘膦复合体(此复合体非常稳定)，阻止PEP与EPSP合成酶的结合，这样草甘膦就竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，干扰生物体内芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，导致生物死亡。

植物可以通过转化导入对草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而获得抗草甘膦的能力。根癌农杆菌CP4、荧光假单胞菌G2和沙门氏菌CT7的EPSPS已经在植物中得到广泛的验证和应用。随着抗除草剂基因克隆的发展，抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用，这些转基因作物具有如下优点：(1)所用除草剂品种广谱、选择性强、对环境友好、使用方便，特别适用于少耕与免耕体系，加强了水分保持，大大减少了土壤流失，并形成了有机物质来锁住土壤碳并减少二氧化碳排放；同时减少机械耕作，节约燃料能源；(2)减少除草剂总使用量，使防治杂草费用下降，有效地降低农业成本，增加农产品的经济效益；(3)解决了常规除草剂难以防治的特殊杂草问题，如稻田的野生稻、赤稻、宽叶臂形草、圆叶牵牛；小麦田的雀麦、莎草；大豆田的鸭趾草、纯叶决明以及寄生杂草；(4)解决土壤长残留性除草剂对后茬作物的伤害。转基因作物所使用的草甘膦无土壤残留，故对后茬作物十分安全。

从1996年转基因作物首次商业化至今，耐除草剂性状始终是转基因作物的主要性状。2016年，转基因作物耐除草剂单一性状被运用在了大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜以及苜蓿中，种植面积为8650万公顷，占全球转基因作物种植面积的47％，这其中大部分为抗草甘膦转基因作物品种。同时，2016年复合性状(抗虫、耐除草剂和其它性状的结合)转基因作物的种植面积呈上升趋势，占全球转基因作物种植面积的41％。因此，近年来包括美国和中国在内的国家草甘膦产量急剧增加还与系列转基因抗草甘膦品种的选育和大面积推广有直接的关系。

我国在转基因草甘膦作物方面的研究已取得一定进展，但目前尚无转抗草甘膦基因作物进入商品化阶段的报道。研究表明，由于细菌密码子偏好性与植物密码子偏好性有较大差异，如将来自细菌的EPSPS基因直接转化植物，其表达效率较低。因此，本领域有必要对来自微生物的抗草甘膦基因进行人工改造，以保证抗草甘膦基因能够在植物体内高效稳定表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗草甘膦EPSP合成酶MC1-EPSPS及其编码基因与应用。

本发明提供了一种5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(命名为MC1-EPSPS基因)，为如下(a1)-(a4)中任一所述的DNA分子：

(a1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(a2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的DNA序列杂交且编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的DNA分子；

(a4)与(a1)或(a2)或(a3)限定的DNA序列具有95％以上同源性且编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明还保护一种融合基因，包括水稻肌动蛋白基因启动子P-ract1、拟南芥CTP2叶绿体转运肽的编码基因、所述MC1-EPSPS基因和NOS终止子。

所述水稻肌动蛋白基因启动子P-ract1如序列表的序列3自5’端第1-1403位所示。

所述拟南芥CTP2叶绿体转运肽的编码基因如序列表的序列3自5’端第1416-1640位所示。

所述NOS终止子如序列表的序列3自5’端第3009-3282位所示。

所述融合基因如序列表的序列3所示。

本发明还保护含有所述MC1-EPSPS基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列2所示的双链DNA分子插入PET30a(+)质粒的多克隆位点(具体可为NdeⅠ和Xho酶切位点)之间的片段得到的重组表达载体。

本发明还保护含有所述融合基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pTF101.1的多克隆位点(具体可为SmaI酶切位点)中插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组表达载体。

本发明还保护所述MC1-EPSPS基因，或，所述融合基因在调控植物草甘膦抗性中的应用。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述MC1-EPSPS基因，或，所述融合基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物草甘膦抗性高于所述目的植物。

所述MC1-EPSPS基因可通过含有MC1-EPSPS基因的重组表达载体导入目的植物中。所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列2所示的双链DNA分子插入PET30a(+)质粒的多克隆位点(具体可为NdeⅠ和Xho酶切位点)之间的片段得到的重组表达载体。

所述融合基因可通过含有所述融合基因的重组表达载体导入目的植物中。所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pTF101.1的多克隆位点(具体可为SmaI酶切位点)中插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组表达载体。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。

所述双子叶植物可为茄目植物。所述茄目植物可为茄科植物。所述茄科植物可为夜香树族植物。所述夜香树族植物可为烟草属植物。所述烟草属植物所述植物具体可为烟草，例如烟草W38(Nicotiana tobacum cv.Wisconsin 38)。

所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为玉蜀黍族植物。所述玉蜀黍族植物可为玉蜀黍属植物。所述玉蜀黍属植物所述植物具体可为玉米，例如玉米杂交系Hi-II。

本发明还保护所述MC1-EPSPS基因，或，所述融合基因，或，所述方法，在植物育种中的应用。

所述育种的目的为选育草甘膦抗性高的植物。

所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明人工改造合成的抗草甘膦基因MC1-EPSPS序列与原始EPSPS基因序列相比，大大增强了其在植物中的表达。使用植物偏爱性密码子，减少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重复序列以及不明确的真核DNA内含子序列，改造后的MC1-EPSPS基因G的含量由原来的31.21％变为33.77％；C的含量也由原来的34.58％变为37.13％；T的含量由原来的16.52％变为13.3％，A的含量由原来的17.69％变为15.79％，与原始CP4-EPSPS基因的DNA序列的同源性为94.88％。

本发明的抗草甘膦基因MC1-EPSPS可在植物细胞中高效稳定的表达。将抗草甘膦基因MC1-EPSPS导入烟草和玉米后，都可以得到稳定遗传的MC1-EPSPS转化体，提高植物的草甘膦抗性。此外，该基因也可以转化大豆、棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗草甘膦活性，从而适用与少耕与免耕体系，加强了水分保持，大大减少了土壤流失，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为T₀代转化体中目的基因MC1-EPSPS的PCR检测结果。其中，M：100bp DNAMark；1-4：转pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar烟草植株CQ01-A1到CQ01-A4；CK1：pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar质粒；CK2：转pTF101.1空载体的转基因烟草；CK3：未转基因烟草。

图2为T₀代玉米转化体目的基因MC1-EPSPS的PCR检测结果。其中，M：100bp DNAMark；1-4：转pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar玉米植株pTF101.1-CQA01到pTF101.1-CQA04；CK1：pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar质粒；CK2：转pTF101.1空载体的转基因玉米；CK3：未转基因玉米。

图3为转基因玉米的功能验证。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

植物表达载体pTF101.1参考文献：Margie M.Paz,Huixia Shou,Kan Wang,etal.Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybeantransformation using the cotyledonary node explants.Euphytica,2004(136):167-179.；公众可以从重庆市农业科学院获得。

农杆菌EHA101：北京华越洋生物科技有限公司，产品号：WXR15-100S。

烟草W38(Nicotiana tobacum cv.Wisconsin 38)：参考文献：眭顺照,李琳莉,祝钦泷等.蜡梅凝集素基因克隆及其对蚜虫、蛞蝓抗性分析.中国农业科学,2011(2)：358-368).；公众可以从重庆市农业科学院获得。

玉米杂交系Hi-II:参考文献：Bronwyn R.Frame,Kan Wang，et al.Agrobacteriumtumefaciens-Mediated Transformation of Maize Embryos Using a Standard BinaryVector System,Plant Physiol,2002(129):13-22；公众可以从重庆市农业科学院获得。

PET30a(+)质粒：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品号：MCV013。

ER2799感受态细胞：参考文献：陈荣荣，曹高燚，刘允军.拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得,农业生物技术学报，2014,22(4):397-405

农达(41％草甘膦异丙胺盐水剂)：购自中化作物保护品有限公司

M9液体培养基(pH＝7.0)：Na₂HPO₄ 12.8g，KH₂PO₄ 3.0g，NaCl 0.5g，NH₄Cl 1.0g，ddH₂O补至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min后，加抽滤灭菌的20％(质量百分比)葡萄糖水溶液20mL。

共培养基(pH 5.8)：含有0.1mg/L NAA的MS固体培养基。

分化培养基(pH 5.8)：含有2mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、57mg/L草甘膦和400mg/L头孢霉素的MS固体培养基。

生根培养基(pH 5.8)：1/2MS固体培养基。

实施例1、MC1-EPSPS基因的改造合成

对5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyrul-shikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS)基因(序列表的序列4)进行优化，使其更适于在植物中转录，经过大量序列分析优化，筛选得到了一个效果最优的基因，命名为MC1-EPSPS基因。MC1-EPSPS基因如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。

实施例2、草甘膦除草剂耐受实验

1、采用序列表的序列2所示的双链DNA分子替代PET30a(+)质粒的NdeⅠ和Xho酶切位点之间的片段，得到重组载体PET30a-MC1-EPSPS(已经测序验证)。

2、将步骤1得到的重组载体导入ER2799感受态细胞，得到重组菌ER2799-MC1-EPSPS。

3、将步骤2得到的重组菌接种于含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温200rpm震荡培养至OD_600nm＝0.5，离心收集菌体，采用M9液体培养基重悬菌体，调整菌液OD_600nm＝0.5，得到菌悬液。

4、完成步骤3后，取1ml菌悬液接种至100ml含有不同浓度草甘膦(0、50、100和150mmol/L)的M9液体培养基中，37℃、200r/min培养16h，测定菌体OD_600nm值。

5、采用PET30a(+)质粒替代重组载体PET30a-MC1-EPSPS，按照步骤2-4进行操作，作为阴性对照。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如表1所示。结果表明，在不含草甘膦的M9液体培养基中，大肠杆菌都正常生长；在含有100mM草甘膦的M9液体培养基中，阴性对照几乎不能生长，OD_600nm值为0.01；而转入PET30a-MC1-EPSPS的大肠杆菌的OD_600nm为1.68

上述结果说明MC1-EPSPS基因具有提高转化宿主大肠杆菌抗草甘膦的能力。

表1两种大肠杆菌在不同浓度草甘膦溶液生长的OD_600nm值

	0mM草甘膦	50mM草甘膦	100mM草甘膦	150mM草甘膦
					阴性对照	1.54	0.02	0.01	0.01
ER2799-MC1-EPSPS	1.48	1.53	1.68	0.02

实施例3、抗草甘膦基因MC1-EPSPS植物表达载体的构建

在植物表达载体pTF101.1的SmaI酶切位点中插入序列表的序列3所示的双链DNA分子，得到真核重组表达载体pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar(已经测序验证)。序列表的序列3中，自5’端第1-1403位为P-ract1启动子，第1416-1640位为CTP2(拟南芥叶绿体转移肽)，第1641-3008位为MC1-EPSPS基因，第3009-3282位为NOS终止子。所述真核重组表达载体pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar中启动所述MC1-EPSPS基因转录的启动子为P-ract1启动子，标记基因为吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar。

实施例4、MC1-EPSPS基因在转基因烟草中的表达及功能验证

一、重组农杆菌的制备

1、将实施例3制备的真核重组表达载体pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar通过冻融法(参考文献：Holsters M,de Waele D,Depicker A.Transfection and transformation ofAgrobacterium tumefaciens.Mol Gen Genet,1978,183:181-187)转入农杆菌EHA101，得到重组农杆菌。对重组农杆菌用由引物F(5’-GTCCTTCATGTTCGGCGGTCTC-3’，序列2的第99-120位)和引物R(5’-CGACAGCGAGGATCGGGTAC-3’，序列2的第981-1000位的反向互补序列)组成的引物对进行PCR鉴定(目的条带大小为902bp)。将经鉴定表明含有MC1-EPSPS基因的重组农杆菌命名为农杆菌EHA101/pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar。

2、将植物表达载体pTF101.1通过冻融法(参考文献：Holsters M,de Waele D,Depicker A.Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens.MolGen Genet,1978,183:181-187)转入农杆菌EHA101，得到农杆菌EHA101/PTF101.1。

二、转MC1-EPSPS基因烟草的获得

1、选取生长旺盛的烟草W38(Nicotiana tobacum cv.Wisconsin 38)的无菌苗(转接后10-15天)叶片，用锋利手术刀片切成1cm²小片，弃去中脉。

2、将步骤一制备的农杆菌EHA101/pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar接种于YEB液体培养基中，28℃、200rpm培养至菌液OD_600nm＝0.6-0.8，得到菌液。

3、将步骤1处理后的烟草叶片浸泡于步骤2制备的菌液中，确保叶片切伤边缘完全与菌液接触，浸泡5min。

4、完成步骤3后，倾去菌液，将叶片转移到灭菌吸水纸上吸去多余菌液。

5、完成步骤4后，将叶片转移到共培养基中，叶片背面朝上25℃、暗培养2-3天。

6、完成步骤5后，将叶片转接到分化培养基上，25℃光照培养至分化出小芽，待分化出的小芽长至2-3cm，将其切下转接到生根培养基上(为确保得到的植株属于不同的转化株系，每个外植体只取一个不定芽)，25℃光照培养至生根成苗。

7、完成步骤6后，将生根苗转入温室中，晚上揭去封口膜，白天封上，炼苗2-3天后，将苗取出，在水中洗去附着于根上的培养基，小心栽入预备好的花盆中，置于阴凉处3-5天即可成活，获得具有草甘膦抗性的T₀代转基因烟草植株。

8、采用农杆菌EHA101/PTF101.1替代农杆菌EHA101/pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar，按照步骤1-7进行操作，得到T₀代转空载体烟草植株。

三、转基因烟草植株的分子鉴定

对步骤二获得的T₀代转基因烟草植株和T₀代转空载体烟草植株进行PCR检测，以转基因烟草苗的基因组DNA为模板，PCR检测使用由引物F(5’-GTCCTTCATGTTCGGCGGTCTC-3’，序列2的第99-120位)和引物R(5’-CGACAGCGAGGATCGGGTAC-3’，序列2的第981-1000位的反向互补序列)组成的引物对。同时以烟草W38(Nicotiana tobacum cv.Wisconsin 38)作为阴性对照。

结果如图1所示。结果表明，转入PTF101.1-MC1-EPSPS-Bar重组表达载体的转基因烟草的不同株系均扩增得到了长度约为902bp的目的片段；而转入PTF101.1空载体的转基因烟草与作为阴性对照的未转基因烟草相同，均未扩增出目的片段。

四、转基因烟草的功能验证

待测植株：T₀代转基因烟草植株、T₀代转空载体烟草植株和烟草W38(Nicotianatobacum cv.Wisconsin 38)。每种烟草植株各选取10株进行实验。

用含有41％(质量百分比)草甘膦异丙胺盐水剂的农达(中化作物保护品有限公司)配置为0.4％(体积百分比)农达水溶液，对待测植株叶片进行喷施，2周后观察植株生长状态及叶片形态。实验重复三次。

结果表明，转MC1-EPSPS基因烟草均能正常生长，而转入PTF101.1空载体的转基因烟草植株和非转基因烟草的生长明显受抑制，叶片出现不同程度发黄、枯萎。

实施例5、MC1-EPSPS基因在转基因玉米中的表达及功能验证

一、重组农杆菌的制备

同实施例4的步骤一。

二、转MC1-EPSPS基因玉米的获得

1、将步骤一制备的的农杆菌EHA101/pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar采用农杆菌介导玉米幼胚转化方法(参考文献：杨小艳，转Cry1Ab-Ma基因抗虫玉米植株的获得及其后代分析，分子植物育种，2015,13(9):1-6),转化受体玉米材料Hi-II的幼胚，共培养3天后依次转移到恢复培养基、筛选培养基、分化筛选培养基上，然后生根移栽获得转基因T0代植株。

2、将步骤一制备的农杆菌EHA101/PTF101.1采用农杆菌介导玉米幼胚转化方法(参考文献：杨小艳，转Cry1Ab-Ma基因抗虫玉米植株的获得及其后代分析，分子植物育种，2015,13(9):1-6),转化受体玉米材料Hi-II的幼胚，共培养3天后依次转移到恢复培养基、筛选培养基、分化筛选培养基上，然后生根移栽获得T₀代转空载体植株。

三、转基因玉米植株的分子鉴定

对步骤二获得的转基因T0代植株进行PCR检测，以7-8叶期的玉米基因组DNA为模板，PCR检测使用由引物F(5’-GTCCTTCATGTTCGGCGGTCTC-3’，序列2的第99-120位)和引物R(5’-CGACAGCGAGGATCGGGTAC-3’，序列2的第981-1000位的反向互补序列)组成的引物对。同时以玉米材料Hi-II作为阴性对照。

结果如图2所示。结果表明，转入PTF101.1-MC1-EPSPS-Bar重组表达载体的转基因玉米的不同株系均扩增得到了长度约为902bp的目的片段；而转入PTF101.1空载体的转基因玉米与作为阴性对照的未转基因玉米相同，均未扩增出目的片段。

四、对照转基因玉米植株的构建

1、采用序列表的序列4所示的双链DNA分子替代序列表的序列3中自5’端第1641-3008位的MC1-EPSPS基因，插入植物表达载体pTF101.1的SmaI酶切位点中，得到对照重组表达载体(已经测序验证)。

对照重组表达载体与真核重组表达载体pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar的区别仅在于将MC1-EPSPS基因替换为序列表的序列4所示的野生型CP4-EPSPS基因。

2、采用步骤1得到的对照重组表达载体替代真核重组表达载体pTF101.1-MC1-EPSPS-Bar，按照步骤一至步骤三进行操作，得到对照转基因玉米植株。

五、转基因玉米的功能验证

待测植株：转基因玉米植株(转MC1-EPSPS基因)、对照转基因玉米植株(转CP4-EPSPS基因)、转空载体玉米植株和玉米材料Hi-II。每种玉米植株各选取30株进行实验。

含有41％(质量百分比)草甘膦异丙胺盐水剂的农达(中化作物保护品有限公司)配置为0.4％(体积百分比)农达水溶液，对待测植株叶片进行喷施，2-3周后观察植株生长状态及叶片形态。实验重复三次。

结果显示如图3所示，转MC1-EPSPS基因玉米均能正常生长，而转入PTF101.1空载体的转基因玉米植株和非转基因玉米的生长明显受抑制，叶片发黄枯萎，植株死亡。转入CP4-EPSPS基因玉米大多数植株均能正常生长，但有5株植株叶片出现黄化，生长受抑制。结果表明MC1-EPSPS基因更容易获得有效的转化事件，这主要取决于优化后的MC1-EPSPS基因密码子特征更适合在玉米中的表达。

序列表

<110> 重庆市农业科学院

<120> 一种抗草甘膦EPSP合成酶MC1-EPSPS及其编码基因与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu His Gly Ala Ser Ser Arg Pro Ala Thr Ala Arg Lys Ser Ser

1 5 10 15

Gly Leu Ser Gly Thr Val Arg Ile Pro Gly Asp Lys Ser Ile Ser His

20 25 30

Arg Ser Phe Met Phe Gly Gly Leu Ala Ser Gly Glu Thr Arg Ile Thr

35 40 45

Gly Leu Leu Glu Gly Glu Asp Val Ile Asn Thr Gly Lys Ala Met Gln

50 55 60

Ala Met Gly Ala Arg Ile Arg Lys Glu Gly Asp Thr Trp Ile Ile Asp

65 70 75 80

Gly Val Gly Asn Gly Gly Leu Leu Ala Pro Glu Ala Pro Leu Asp Phe

85 90 95

Gly Asn Ala Ala Thr Gly Cys Arg Leu Thr Met Gly Leu Val Gly Val

100 105 110

Tyr Asp Phe Asp Ser Thr Phe Ile Gly Asp Ala Ser Leu Thr Lys Arg

115 120 125

Pro Met Gly Arg Val Leu Asn Pro Leu Arg Glu Met Gly Val Gln Val

130 135 140

Lys Ser Glu Asp Gly Asp Arg Leu Pro Val Thr Leu Arg Gly Pro Lys

145 150 155 160

Thr Pro Thr Pro Ile Thr Tyr Arg Val Pro Met Ala Ser Ala Gln Val

165 170 175

Lys Ser Ala Val Leu Leu Ala Gly Leu Asn Thr Pro Gly Ile Thr Thr

180 185 190

Val Ile Glu Pro Ile Met Thr Arg Asp His Thr Glu Lys Met Leu Gln

195 200 205

Gly Phe Gly Ala Asn Leu Thr Val Glu Thr Asp Ala Asp Gly Val Arg

210 215 220

Thr Ile Arg Leu Glu Gly Arg Gly Lys Leu Thr Gly Gln Val Ile Asp

225 230 235 240

Val Pro Gly Asp Pro Ser Ser Thr Ala Phe Pro Leu Val Ala Ala Leu

245 250 255

Leu Val Pro Gly Ser Asp Val Thr Ile Leu Asn Val Leu Met Asn Pro

260 265 270

Thr Arg Thr Gly Leu Ile Leu Thr Leu Gln Glu Met Gly Ala Asp Ile

275 280 285

Glu Val Ile Asn Pro Arg Leu Ala Gly Gly Glu Asp Val Ala Asp Leu

290 295 300

Arg Val Arg Ser Ser Thr Leu Lys Gly Val Thr Val Pro Glu Asp Arg

305 310 315 320

Ala Pro Ser Met Ile Asp Glu Tyr Pro Ile Leu Ala Val Ala Ala Ala

325 330 335

Phe Ala Glu Gly Ala Thr Val Met Asn Gly Leu Glu Glu Leu Arg Val

340 345 350

Lys Glu Ser Asp Arg Leu Ser Ala Val Ala Asn Gly Leu Lys Leu Asn

355 360 365

Gly Val Asp Cys Asp Glu Gly Glu Thr Ser Leu Val Val Arg Gly Arg

370 375 380

Pro Asp Gly Lys Gly Leu Gly Asn Ala Ser Gly Ala Ala Val Ala Thr

385 390 395 400

His Leu Asp His Arg Ile Ala Met Ser Phe Leu Val Met Gly Leu Val

405 410 415

Ser Glu Asn Pro Val Thr Val Asp Asp Ala Thr Met Ile Ala Thr Ser

420 425 430

Phe Pro Glu Phe Met Asp Leu Met Ala Gly Leu Gly Ala Lys Ile Glu

435 440 445

Leu Ser Asp Thr Lys Ala Ala

450 455

<210> 2

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctgcacg gcgccagcag ccggcccgcg accgcccgca agtcctccgg cctctccggc 60

accgtccgca tccccggcga caagtcgatc tcccaccggt ccttcatgtt cggcggtctc 120

gcgagcggcg agacgcgcat caccggcctc ctggagggcg aggacgtcat caacacgggc 180

aaggccatgc aggcgatggg cgcccgcatc cgcaaggagg gcgacacctg gatcatcgat 240

ggcgtcggca acggcggcct cctggcgccg gaggcgccgc tcgacttcgg caacgccgcc 300

acgggctgcc gcctgacgat gggcctcgtc ggggtctacg acttcgacag caccttcatc 360

ggcgacgcct cgctcaccaa gcgcccgatg ggccgcgtgt tgaacccgct gcgcgagatg 420

ggcgtgcagg tgaagtcgga ggacggcgac cgcctgcccg tgaccttgcg cgggccgaag 480

acgccgacgc cgatcaccta ccgcgtgccg atggcctccg cccaggtgaa gtccgccgtg 540

ctgctcgccg gcctcaacac gcccggcatc acgacggtca tcgagccgat catgacgcgc 600

gaccacacgg agaagatgct gcagggcttc ggcgccaacc tgaccgtcga gacggacgcg 660

gacggcgtgc gcaccatccg cctggagggc cgcggcaagc tcaccggcca ggtcatcgac 720

gtgccgggcg acccgtcctc gacggccttc ccgctggtgg cggccctgct ggtgccgggc 780

tccgacgtca ccatcctcaa cgtgctgatg aaccccaccc gcaccggcct catcctgacg 840

ctgcaggaga tgggcgccga catcgaggtc atcaacccgc gcctggccgg cggcgaggac 900

gtggcggacc tgcgcgtgcg ctcctccacg ctgaagggcg tcacggtgcc ggaggaccgc 960

gcgccgtcga tgatcgacga gtacccgatc ctcgctgtcg ccgccgcctt cgcggagggg 1020

gcgaccgtga tgaacggcct ggaggagctc cgcgtcaagg agagcgaccg cctctcggcc 1080

gtcgccaacg gcctcaagct caacggcgtg gactgcgacg agggcgagac gtcgctcgtc 1140

gtgcgcggcc gcccggacgg caaggggctc ggcaacgcct cgggcgccgc cgtcgccacc 1200

cacctcgacc accgcatcgc catgagcttc ctcgtcatgg gcctcgtgtc ggagaacccg 1260

gtcacggtgg acgacgccac gatgatcgcc acgagcttcc cggagttcat ggacctgatg 1320

gccgggctgg gcgcgaagat cgagctctcc gacacgaagg ccgcctga 1368

<210> 3

<211> 3282

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcttactcg aggtcattca tatgcttgag aagagagtcg ggatagtcca aaataaaaca 60

aaggtaagat tacctggtca aaagtgaaaa catcagttaa aaggtggtat aaagtaaaat 120

atcggtaata aaaggtggcc caaagtgaaa tttactcttt tctactatta taaaaattga 180

ggatgttttt gtcggtactt tgatacgtca tttttgtatg aattggtttt taagtttatt 240

cgcttttgga aatgcatatc tgtatttgag tcgggtttta agttcgtttg cttttgtaaa 300

tacagaggga tttgtataag aaatatcttt agaaaaaccc atatgctaat ttgacataat 360

ttttgagaaa aatatatatt caggcgaatt ctcacaatga acaataataa gattaaaata 420

gctttccccc gttgcagcgc atgggtattt tttctagtaa aaataaaaga taaacttaga 480

ctcaaaacat ttacaaaaac aacccctaaa gttcctaaag cccaaagtgc tatccacgat 540

ccatagcaag cccagcccaa cccaacccaa cccaacccac cccagtccag ccaactggac 600

aatagtctcc acaccccccc actatcaccg tgagttgtcc gcacgcaccg cacgtctcgc 660

agccaaaaaa aaaaagaaag aaaaaaaaga aaaagaaaaa acagcaggtg ggtccgggtc 720

gtgggggccg gaaacgcgag gaggatcgcg agccagcgac gaggccggcc ctccctccgc 780

ttccaaagaa acgcccccca tcgccactat atacataccc ccccctctcc tcccatcccc 840

ccaaccctac caccaccacc accaccacct ccacctcctc ccccctcgct gccggacgac 900

gagctcctcc cccctccccc tccgccgccg ccgcgccggt aaccaccccg cccctctcct 960

ctttctttct ccgttttttt ttccgtctcg gtctcgatct ttggccttgg tagtttgggt 1020

gggcgagagg cggcttcgtg cgcgcccaga tcggtgcgcg ggaggggcgg gatctcgcgg 1080

ctggggctct cgccggcgtg gatccggccc ggatctcgcg gggaatgggg ctctcggatg 1140

tagatctgcg atccgccgtt gttgggggag atgatggggg gtttaaaatt tccgccgtgc 1200

taaacaagat caggaagagg ggaaaagggc actatggttt atatttttat atatttctgc 1260

tgcttcgtca ggcttagatg tgctagatct ttctttcttc tttttgtggg tagaatttga 1320

atccctcagc attgttcatc ggtagttttt cttttcatga tttgtgacaa atgcagcctc 1380

gtgcggagct tttttgtagg tagaagtgat caaccatggc gcaagttagc agaatctgca 1440

atggtgtgca gaacccatct cttatctcca atctctcgaa atccagtcaa cgcaaatctc 1500

ccttatcggt ttctctgaag acgcagcagc atccacgagc ttatccgatt tcgtcgtcgt 1560

ggggattgaa gaagagtggg atgacgttaa ttggctctga gcttcgtcct cttaaggtca 1620

tgtcttctgt ttccacggcg atgctgcacg gcgccagcag ccggcccgcg accgcccgca 1680

agtcctccgg cctctccggc accgtccgca tccccggcga caagtcgatc tcccaccggt 1740

ccttcatgtt cggcggtctc gcgagcggcg agacgcgcat caccggcctc ctggagggcg 1800

aggacgtcat caacacgggc aaggccatgc aggcgatggg cgcccgcatc cgcaaggagg 1860

gcgacacctg gatcatcgat ggcgtcggca acggcggcct cctggcgccg gaggcgccgc 1920

tcgacttcgg caacgccgcc acgggctgcc gcctgacgat gggcctcgtc ggggtctacg 1980

acttcgacag caccttcatc ggcgacgcct cgctcaccaa gcgcccgatg ggccgcgtgt 2040

tgaacccgct gcgcgagatg ggcgtgcagg tgaagtcgga ggacggcgac cgcctgcccg 2100

tgaccttgcg cgggccgaag acgccgacgc cgatcaccta ccgcgtgccg atggcctccg 2160

cccaggtgaa gtccgccgtg ctgctcgccg gcctcaacac gcccggcatc acgacggtca 2220

tcgagccgat catgacgcgc gaccacacgg agaagatgct gcagggcttc ggcgccaacc 2280

tgaccgtcga gacggacgcg gacggcgtgc gcaccatccg cctggagggc cgcggcaagc 2340

tcaccggcca ggtcatcgac gtgccgggcg acccgtcctc gacggccttc ccgctggtgg 2400

cggccctgct ggtgccgggc tccgacgtca ccatcctcaa cgtgctgatg aaccccaccc 2460

gcaccggcct catcctgacg ctgcaggaga tgggcgccga catcgaggtc atcaacccgc 2520

gcctggccgg cggcgaggac gtggcggacc tgcgcgtgcg ctcctccacg ctgaagggcg 2580

tcacggtgcc ggaggaccgc gcgccgtcga tgatcgacga gtacccgatc ctcgctgtcg 2640

ccgccgcctt cgcggagggg gcgaccgtga tgaacggcct ggaggagctc cgcgtcaagg 2700

agagcgaccg cctctcggcc gtcgccaacg gcctcaagct caacggcgtg gactgcgacg 2760

agggcgagac gtcgctcgtc gtgcgcggcc gcccggacgg caaggggctc ggcaacgcct 2820

cgggcgccgc cgtcgccacc cacctcgacc accgcatcgc catgagcttc ctcgtcatgg 2880

gcctcgtgtc ggagaacccg gtcacggtgg acgacgccac gatgatcgcc acgagcttcc 2940

cggagttcat ggacctgatg gccgggctgg gcgcgaagat cgagctctcc gacacgaagg 3000

ccgcctgaga gctcgaattc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt 3060

gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 3120

tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 3180

cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 3240

attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggga tt 3282

<210> 4

<211> 1368

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌CP4(Agrobacterium sp strain CP4)

<400> 4

atgcttcacg gtgcaagcag ccggcccgca accgcccgca aatcctctgg cctttccgga 60

accgtccgca ttcccggcga caagtcgatc tcccaccggt ccttcatgtt cggcggtctc 120

gcgagcggtg aaacgcgcat caccggcctt ctggaaggcg aggacgtcat caatacgggc 180

aaggccatgc aggcgatggg cgcccgcatc cgtaaggaag gcgacacctg gatcatcgat 240

ggcgtcggca atggcggcct cctggcgcct gaggcgccgc tcgatttcgg caatgccgcc 300

acgggctgcc gcctgacgat gggcctcgtc ggggtctacg atttcgacag caccttcatc 360

ggcgacgcct cgctcacaaa gcgcccgatg ggccgcgtgt tgaacccgct gcgcgaaatg 420

ggcgtgcagg tgaaatcgga agacggtgac cgtcttcccg ttaccttgcg cgggccgaag 480

acgccgacgc cgatcaccta ccgcgtgccg atggcctccg cacaggtgaa gtccgccgtg 540

ctgctcgccg gcctcaacac gcccggcatc acgacggtca tcgagccgat catgacgcgc 600

gatcatacgg aaaagatgct gcagggcttt ggcgccaacc ttaccgtcga gacggatgcg 660

gacggcgtgc gcaccatccg cctggaaggc cgcggcaagc tcaccggcca agtcatcgac 720

gtgccgggcg acccgtcctc gacggccttc ccgctggttg cggccctgct tgttccgggc 780

tccgacgtca ccatcctcaa cgtgctgatg aaccccaccc gcaccggcct catcctgacg 840

ctgcaggaaa tgggcgccga catcgaagtc atcaacccgc gccttgccgg cggcgaagac 900

gtggcggacc tgcgcgttcg ctcctccacg ctgaagggcg tcacggtgcc ggaagaccgc 960

gcgccttcga tgatcgacga atatccgatt ctcgctgtcg ccgccgcctt cgcggaaggg 1020

gcgaccgtga tgaacggtct ggaagaactc cgcgtcaagg aaagcgaccg cctctcggcc 1080

gtcgccaatg gcctcaagct caatggcgtg gattgcgatg agggcgagac gtcgctcgtc 1140

gtgcgtggcc gccctgacgg caaggggctc ggcaacgcct cgggcgccgc cgtcgccacc 1200

catctcgatc accgcatcgc catgagcttc ctcgtcatgg gcctcgtgtc ggaaaaccct 1260

gtcacggtgg acgatgccac gatgatcgcc acgagcttcc cggagttcat ggacctgatg 1320

gccgggctgg gcgcgaagat cgaactctcc gatacgaagg ctgcctga 1368

Claims

1.一种5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因，为如下(a1)-(a4)中任一所述的DNA分子：

(a1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(a2)序列表中序列2所示的DNA分子；

2.一种融合基因，包括水稻肌动蛋白基因启动子P-ract1、拟南芥CTP2叶绿体转运肽的编码基因、权利要求1所述基因和NOS终止子。

3.如权利要求2所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因如序列表的序列3所示。

4.含有权利要求1所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.含有权利要求2或3所述融合基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

6.权利要求1所述基因，或，权利要求2或3所述融合基因在调控植物草甘膦抗性中的应用。

7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求1所述基因，或，权利要求2或3所述融合基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物草甘膦抗性高于所述目的植物。

8.权利要求1所述基因，或，权利要求2或3所述融合基因，或，权利要求7所述方法，在植物育种中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述育种的目的为选育草甘膦抗性高的植物。