CN104219949B - 人造叶绿体转运肽 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于将肽、多肽和蛋白质导向至含质体细胞的质体的组合物及方法。在一些实施方案中，本公开涉及可以将多肽引导到质体的叶绿体转运肽以及编码它的核酸分子。在一些实施方案中，本公开涉及包含叶绿体转运肽的转基因植物材料(如转基因植物)的制备方法，以及通过这样的方法制备的植物材料，以及由此制备的植物产品。

Description

人造叶绿体转运肽
优先权要求
本申请要求2012年2月1日提交的美国临时专利申请系列号No.61/593,555以及2012年4月17日提交的美国临时专利申请系列号No.61/625,222的优先权。
根据37C.F.R.§1.821(c)或(e)–以ASCII文本文件提交的序列表的声明
根据37C.F.R.§1.821(c)或(e)，含ASCII文本版本序列表的文件已经随同本申请一起提交，其内容作为参考在此引入。
技术领域
本公开涉及用于基因编码和表达多肽的组合物和方法，该多肽导向至含质体细胞的质体。在某些实施方案中，本公开涉及将多肽导向至(例如高等植物的)叶绿体的氨基酸序列，和/或编码该氨基酸序列的核酸分子。在某些实施方案中，本公开涉及包含嵌合多肽，其包含控制该嵌合多肽至质体的转运的氨基酸序列，和/或编码该嵌合多肽的核酸分子。
背景技术
植物细胞含有不同的亚细胞器，一般称为“质体”，其由特征性膜体系界定，并且在细胞内实施特殊功能。特定的质体参与了光合作用以及一些化合物的合成和储存。所有的质体都衍生自存在于植物分生区中的前质体(Proplasmid)。前质体可以发育成为例如：叶绿体、黄化体、质体、老质体(gerontoplast)、白色体、淀粉体、脂质体和蛋白质体。质体以细胞内的半自主方式存在，含有它们自己的遗传体系和蛋白质合成机制，但是在它们的发育和生物合成活性方面依赖于与核质系统的紧密合作。
在高等植物的光合叶细胞中，最引人注目的质体为叶绿体。叶绿体最必要的功能为实施光合作用的光驱动反应。但是，叶绿体还实施许多其它的对植物细胞重要的生物合成过程。例如，所有的细胞脂肪酸由位于叶绿体基质中的酶使用这里可获得的ATP、NAOPH和糖类来制造。此外，光活化电子的还原能力驱使叶绿体中的亚硝酸根(NO2 -)还原成氨(NH3)；该氨向植物提供氨基酸和核苷酸的合成所必需的的氮。
叶绿体也参与了农业化学工业的特别重要的过程中。例如，已知的是许多除草剂通过在叶绿体内进行的阻断功能而起作用。近来的研究已经识别出一些除草剂的特异性靶标。例如，三嗪衍生的除草剂通过将质体醌分子从其在光合体系的32kD多肽中的结合位点置换来抑制光合作用。该32kD多肽在叶绿体基因组中编码，并且通过细胞器机构进行合成。已经获得了对抗三嗪除草剂的突变植物。这些植物含有突变32kD多肽，由此质体醌不再被三嗪除草剂所置换。磺酰脲类化合物抑制叶绿体中的乙酰乳酸合酶。乙酰乳酸合酶参与异亮氨酸和缬氨酸的合成。草甘膦抑制5-烯醇式丙酮酰-3-莽草酸合酶(EPSPS)的功能，后者为参与芳香族氨基酸合成的酶。所有这些酶均由细胞核基因组编码，但是它们易位进入叶绿体中，在这里发生实际的氨基酸合成。
大多数叶绿体蛋白质在植物细胞核中编码，在细胞质中合成为较大的前体，并且在翻译后输入至叶绿体中。穿过外被膜和内被膜输入进入基质是以基质、类囊体膜和类囊体腔为目的地的蛋白质的主要进入方式。输入的前体蛋白质定位至类囊体膜和类囊体腔是通过四种不同的机制完成的，包括与细菌蛋白质运输体系同源的两种。因此，蛋白质在叶绿体中定位的机制部分地源自原核内共生体。Cline and Henry(1996)Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.12:1-26。
以叶绿体表达为目标的前体蛋白质包含被称作叶绿体转运肽(CTPs)的N-末端延伸。转运肽对于特异性识别叶绿体表面、以及在介导前蛋白翻译后迁移穿过叶绿体被膜并从叶绿体被膜到达叶绿体内的各种亚室(例如，基质，类囊体和类囊体膜)中有帮助。这些N-末端转运肽序列包含将叶绿体蛋白质输入至质体中的所有必要信息；转运肽序列对于质体运输是充分必要的。
报道在其N-末端具有天然编码的转运肽序列的植物基因包括叶绿体小亚单位的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCo)(de Castro Silva-Filho et al.(1996)PlantMol.Biol.30:769-80；Schnell et al.(1991)J.Biol.Chem.266:3335-42)；EPSPS(参见，例如，Archer et al.(1990)J.Bioenerg.and Biomemb.22:789-810和美国专利US6,867,293、7,045,684和Re.36,449)；色氨酸合酶(Zhao et al.(1995)J.Biol.Chem.270:6081-7)；质体蓝素(Lawrence et al.(1997)J.Biol.Chem.272:20357-63)；分支酸合酶(Schmidt etal.(1993)J.Biol.Chem.268:27447-57)；捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa et al.(1988)J.Biol.Chem.263:14996-14999)；和拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶绿体蛋白质(Lee et al.(2008)Plant Cell 20:1603-22)。美国专利公开US2010/0071090提供了来自衣藻属(Chlamydomonas sp.)的一些叶绿体导向肽。
然而，尽管可能存在不同亚组的具有独立结构基序的叶绿体导向肽，由于叶绿体导向肽的高度序列多样性且缺乏共同或一致的序列基序，叶绿体导向肽编码的信息的结构要求仍然难以把握。Lee et al.(2008)，同上。而且，不是所有这些序列都已经用于在高等植物中异源表达导向叶绿体。
发明内容
本文描述的是用于植物中多肽的质体导向的组合物和方法。在一些实施方案中，组合物包含如下的核酸分子，该核酸分子包括至少一种编码可操作地连接于感兴趣的核苷酸序列的人造叶绿体转运肽(例如，TraP23肽)的核苷酸序列。在具体的实施方案中，这样的核酸分子可以用于在单子叶植物和双子叶植物中表达并导向由感兴趣的核苷酸序列编码的多肽。本文进一步描述了包含如下核酸分子的载体，该核酸分子包含可操作地连接于感兴趣的核苷酸序列的至少一个编码人造转运肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码人造CTP的核苷酸序列可以是从参考核苷酸序列衍生的核苷酸序列，或其功能性变体，其中参考核苷酸序列是从多种5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)比对获得的。在一些实施方案中，编码人造CTP的核苷酸序列可以是包含来自不同生物体的部分CTP编码核苷酸序列的核苷酸序列，或其功能性变体。在特定的实施方案中，编码人造CTP的核苷酸序列可以含有从每个参考EPSPS CTP、或任一前述的功能性变体得到的连续核苷酸序列。在这些和进一步的实施方案中，编码人造CTP的核苷酸序列可以是包含多于一个编码CTP的核苷酸序列的核苷酸序列。
在一些实例中，编码人造CTP的核苷酸序列可以是包含来自EPSPS酶的部分CTP核苷酸序列或其功能性变体的核苷酸序列。在具体的实施方案中，编码人造CTP的核苷酸序列可以含有由EPSPS酶得到的连续核苷酸序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，组合物包含如下的核酸分子，该核酸分子包含至少一种自EPSPS衍生的用于将多肽导向至叶绿体的手段。进一步描述了多个核酸分子，它们中包含如下核酸分子：该核酸分子包含至少一个自EPSPS衍生的用于将多肽导向至叶绿体的手段，其可操作地连接于感兴趣的核苷酸序列。在具体的实施方案中，这种核酸分子可以用于在单子叶植物和双子叶植物中表达并导向由感兴趣的核苷酸序列编码的多肽。为了公开的目的，自EPSPS衍生的用于将多肽导向至叶绿体的手段是指特定的人造核苷酸序列。在具体的实施方案中，自EPSPS衍生的用于将多肽导向至叶绿体的手段选自本文称为TraP23的核苷酸序列。
本文还描述了包含如下核酸分子的植物材料(例如且不限于，植物，植物组织和植物细胞)，该核酸分子包含至少一个可操作地连接于感兴趣的核苷酸序列的编码人造CTP的核苷酸序列。在一些实施方案中，植物材料在其基因组中可以具有稳定整合的此类核酸分子。在一些实施方案中，植物材料可以瞬时表达如下的核酸分子的产物，该核酸分子包含至少一个可操作地连接于感兴趣的核苷酸序列的编码人造CTP的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述植物材料为不能再生以生成植物的植物细胞。
还描述了用于在含质体细胞(例如植物)中在所述细胞的质体(例如叶绿体)中表达核苷酸序列的方法。在具体的实施方案中，可以用包含至少一个可操作地连接于感兴趣的核苷酸序列的编码人造CTP的核苷酸序列的核酸分子转化植物细胞，使得在植物细胞的细胞质中产生前体融合多肽，前体融合多肽包含与该感兴趣的核苷酸序列的表达产物融合的人造CTP，并且然后该融合多肽体内被运输至植物细胞的叶绿体中。在这种方法的一些实施方案中，植物细胞不能再生以生成植物。
进一步描述了用于制备包含如下核酸分子的转基因植物的方法，该核酸分子包含至少一个可操作地连接于感兴趣的核苷酸序列的编码人造CTP的核苷酸序列。还描述了由该转基因植物制备的植物商业产品(例如，种子)。
前述和其他特征将由下文对一些实施方案并参考附图的详细说明变得更加明了。
附图简要说明
图1显示的是mRNA分子，它们代表了可操作地连接于感兴趣的核苷酸序列的、编码人造CTP的核苷酸序列(例如，TraP23)的特定实例。在一些实施方案中，mRNA分子(如所显示的这些)可以从如下的DNA分子转录，该DNA分子包含开放阅读框，该阅读框包括可操作地连接于感兴趣的核苷酸序列的编码人造CTP的序列。该感兴趣的核苷酸序列在一些实施方案中可以是编码感兴趣的肽的序列，感兴趣的肽例如但不限于，要导向至质体的标志物基因产物或肽。
图2显示了多个EPSPS叶绿体转运肽序列的比对。带阴影的氨基酸残基表明为TraP23选择的氨基酸序列。
图3显示了pDAB107640的质粒图谱。
图4显示了TraP23-GFP渗透进入烟草叶组织的显微图片。
图5显示了pDAB106598的质粒图谱。
图6显示了TraP23-GFP转化进入玉米原生质体的显微图片，显示转运进入玉米原生质体的叶绿体。
图7显示了pDAB109808的质粒图谱。
图8显示了pDAB107687的质粒图谱。
具体实施方式
I.一些实施方案的概述
A叶绿体转运肽(CTP)(或质体转运肽)以共翻译或翻译后方式起作用以将包含CTP的多肽引导到质体(例如，叶绿体)。在本发明的一些实施方案中，内源性叶绿体蛋白质或是异源蛋白质均可通过将该蛋白表达为含有CTP的较大前体多肽而被导向到叶绿体中。在具体的实施方案中，CTP可以衍生自由多种5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的比对得到的核苷酸序列，例如但不限于，通过例如，但不限于，纳入至少一个来自从不同生物体获得的直系同源基因的连续序列，或其功能性变体衍生而来。
在一个示例性实施方案中，自EPSPS蛋白质序列的比对分离出各自编码CTP的核酸序列(图2)。编码CTP的序列通过以ChloroP预测服务器(prediction server)分析EPSPS基因序列来分离。Emanuelsson et al.(1999)Protein Science 8:978-84(可在cbs.dtu.dk/services/ChloroP查阅)。分离的编码CTP的序列的预测蛋白质产物为约60-70个氨基酸长的转运肽。在该实例中，将多个EPSPS CTP序列的比对用作参考序列来设计示例的人造CTP，方法是随机选择氨基酸来生成新的人造CTP。该设计过程显示了人造CTP的衍生物(derivation)的特征。示例性人造CTP在本公开全文中称为TraP23。测试示例性人造TraP23的质体导向功能，发现它们显示的质体导向至少不逊于对单独的天然CTP序列观察到的质体导向。
在进一步的示例实施方案中，独立地合成多个核酸序列，每一个均编码本发明的人造TraP肽，并将它们与编码黄色荧光蛋白(YFP)的核酸序列可操作地连接，从而产生多个人造的核酸分子，每一个均编码嵌合TraP:YFP融合多肽。将这些核酸分子，它们每一个均编码嵌合TraP:YFP多肽，分别倒入到双元载体中，使得每一个TraP:YFP编码核酸序列与AtUbi10启动子可操作地连接。
在更进一步的示例实施方案中，将多个包含与AtUbi 10启动子可操作地连接的TraP:YFP编码核酸序列的双元载体通过土壤杆菌介导的转化分别独立地瞬时转化到烟草(本氏烟草(Nicotiana benthamiana))中。共聚焦显微术和Western印迹分析证实，每一个TraP均成功地将YFP导向到了烟草叶绿体上。
在进一步的示例实施方案中，独立地合成了多个核酸序列，每一个均编码本发明的人造TraP肽，并将它们与编码农艺学上重要的基因序列的核酸序列可操作地连接。将TraP序列与除草剂耐受性性状(例如dgt-28)融合，从而产生多个人造的核酸分子，每一个均编码嵌合的TraP:DGT-28融合多肽。将这些核酸分子，它们中每一个均编码嵌合的TraP:DGT-28多肽，分别引入双元载体中，从而使每一个TraP:dgt-28编码核酸序列均与启动子或其它基因调节元件可操作地连接。用这些含有TraP:dgt-28编码核酸序列的双元载体转化各种植物物种。对转基因植物测定由于DGT-28酶的表达和转位到叶绿体导致的除草剂耐受性。
在进一步的示例实施方案中，独立地合成核酸序列，其编码本发明的人造TraP肽，并与编码农艺学上重要的基因序列的核酸序列可操作地连接。将TraP序列与昆虫耐受性性状(例如cry2Aa)融合，从而产生人造的核酸分子，其编码嵌合的TraP:Cry2Aa融合多肽。将这样的编码嵌合的TraP:cry2Aa多肽的核酸分子引入双元载体中，使得每一个TraP:cry2Aa编码核酸序列均与启动子或其它基因调节元件可操作地连接。用含有TraP:cry2Aa编码核酸序列的双元载体转化各种植物物种。对转基因植物测定由于Cry2Aa酶的表达和转位到叶绿体导致的除草剂耐受性。
鉴于前述的详细工作实施例，本发明的人造CTP序列和编码它们的核酸，可用于在广大范围的含质体细胞内将任何多肽引导到质体上。例如，通过通过本公开提供给本领域技术人员的方法，可以将包含人造的CTP序列、且该序列与任意的第二个肽序列的N端融合的嵌合多肽引入到含质体的宿主细胞内(或在其中表达)，以便将所述第二个肽序列导向到质体上。因此，在特定的实施方案中，本发明的TraP肽，与天然CTP相比，可以提供期望在质体上表达的肽的更高的引入和加工效率。
II.缩写
CTP 叶绿体转运肽
EPSPS 3-烯醇式丙酮酰莽草酸-5-磷酸合成酶
YFP 黄色荧光蛋白质
Ti 肿瘤诱导(源自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的质体)
T-DNA 转移DNA
III.术语
为了方便本公开各实施方案的阅读，提供以下具体术语的解释：
叶绿体转运肽：如本文所使用的，术语“叶绿体转运肽”(CTP)(或“质体转运肽”)可以指如下的氨基酸序列，当其存在于多肽的N端时，会指导该多肽进入含质体细胞(例如植物细胞，例如在全植物或植物细胞培养物中)的质体内。CTP对于指导蛋白质转运进入宿主细胞的质体(例如，初级、二级或三级质体，例如叶绿体)而言一般是必要而且充分的。通过多种可用的算法中的任一种(例如PSORT，和ChloroP(可以在cbs.dtu.dk/services/ChloroP获得))可以鉴定推定的叶绿体转运肽。ChloroP可以提供特别好的CTP预测。Emanuelsson et al.(1999),Protein Science 8:978-84。然而，任何现有算法均不能以100％的效率实现功能性CTP的预测。因此，确认所鉴定出的假定CTP是否确实如预期的那样发挥功能(例如，在体外或体内方法中)是重要的。
叶绿体转运肽可以位于被转运到质体内的多肽的N端。CTP可以帮助含有CTP的多肽的共翻译或翻译后的向质体中的转运。叶绿体转运肽通常含有大约40-大约100个氨基酸，这些CTP已经被观察到含有某些共同的特征。例如：CTP所含的带负电荷氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)非常少(即使有的话)；CTP的N端区缺少带电氨基酸、甘氨酸和脯氨酸；CTP的中心区还很可能含有非常高比例的碱性或羟基化氨基酸(例如丝氨酸和苏氨酸)；并且CTP的C端很可能富含精氨酸，并具有构成两亲性β折叠片结构的能力。在包含CTP的多肽被转运到质体内之后，质体蛋白酶可以将CTP与包含CTP的多肽的其余部分切离。
接触：如本文关于核酸分子所使用的，术语与细胞、组织或生物体(例如植物细胞；植物组织；和植物)“接触”，或被细胞、组织或生物体“摄取”，包括核酸分子被内化到生物体中，例如但不限于：使生物体与包含该核酸分子的组合物接触；和用含有该核酸分子的溶液浸泡生物体。
内源的：如本文所使用的，术语“内源的”是指源自于特定生物体、组织或细胞的物质(例如，核酸分子和多肽)。例如，植物细胞内表达的“内源”多肽可以指通常在来自相同物种的非遗传工程化植物的相同类型的细胞内表达的多肽。在一些实例中，可以利用内源基因(例如EPSPS基因)来获得参考CTP基因。
表达：如本文所使用的，编码序列(例如基因或转基因)的“表达”是指核酸转录单元(包括例如基因组DNA或cDNA)的编码信息转变成细胞的运作性(operational)、非运作性或结构性部分的过程，往往包括蛋白质的合成。基因表达可能受到外部信号(例如，细胞、组织或生物体暴露于可以增加或降低基因表达的作用剂)的影响。基因的表达还可以在从DNA到RNA到蛋白的通路中的任何地方被调节。基因表达的调节可以通过例如下述方式发生：对转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子如mRNA的降解等的控制，或者通过在特定蛋白分子产生后使其活化、失活、区室化(compartmentalization)或降解，或者通过前述的任何组合。基因表达可以通过本领域已知的方法在RNA水平或蛋白水平进行测量，这些方法例如但不限于Northern印迹、RT-PCR、Western印迹，和体外、原位和体内蛋白活性测定。
遗传物质：如本文所使用的，术语“遗传物质”包括所有的基因和核酸分子，如DNA和RNA。
异源的：如本文所使用的，术语“异源的”是指并非源自于特定生物体、组织或细胞的内部的物质(例如核酸分子和多肽)。例如，在植物细胞内表达的“异源”多肽可以指通常不在来自相同物种的非遗传工程化植物的相同类型细胞中表达的多肽(例如，在相同生物体的不同细胞中，或者在不同生物体的细胞中表达的多肽)。
分离的：如本文所使用的，术语“分离的”是指如下的分子(例如，核酸分子或多肽)，该分子已与天然存在该分子的生物体细胞内通常与该分子伴随的其它同类分子(例如其它核酸分子和其它多肽)实质上分离或提纯脱离。例如，分离的核酸分子可以与天然存在该核酸分子的生物体细胞内的染色体DNA或染色体外DNA实质性分离或提纯脱离。因此，该术语包括经过生化纯化从而除去其它的核酸分子、多肽和细胞组分的重组核酸分子和多肽。该术语还包括重组核酸分子、化学合成的核酸分子、和重组产生的多肽。
如本文所使用的，术语“基本上纯化的”是指这样的分子，其与通常在天然状态下与之伴随的其它分子是分离的。基本上纯化的分子可以是组合物中存在的主导种类。基本上纯化的分子可以是，例如，除了天然混合物中存在的溶剂之外，其它分子有至少60％、至少75％、或至少90％不存在。术语“基本上纯化的”不是指以天然状态存在的分子。
核酸分子：如本文所使用的，术语“核酸分子”可以指聚合物形式的核苷酸，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA、和合成形式的上述混合聚合物的有义和反义链。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸，或两者任一类型核苷酸的修饰形式。如本文所使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。除非另有说明，核酸分子的长度通常为至少10个碱基。该术语包括单链和双链形式的DNA。核酸分子包括二聚体(所谓的串联)形式，和核酸分子的转录产物。核酸分子可包括天然存在的和/或经过修饰的核苷酸，其中核苷酸通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸连接键连接在一起。
核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，如本领域技术人员所容易理解的。这些修饰包括，例如，标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，不带电的连接键：例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电荷的连接键：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；侧基部分：例如，肽；嵌入剂：例如，吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；和经过修饰的连接键：例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”也包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体化(duplexed)、三链体化(triplexed)、发夹(hairpinned)、环形、和挂锁构象。
如本文关于DNA所使用的，术语“编码序列”、“结构核苷酸序列”或“结构核酸分子”是指这样的核苷酸序列，当其置于合适调节序列的控制之下时，可以通过转录和mRNA最终被翻译成多肽。关于RNA，术语“编码序列”是指被翻译成肽、多肽或蛋白质的核苷酸序列。编码序列的边界可以由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子确定。编码序列包括，但不限于：基因组DNA；cDNA；EST；和重组核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明包括可以用分离方法分离、纯化或部分纯化的核苷酸序列，分离方法例如离子交换色谱、基于分子量或亲和性的排除、基于在不同溶剂中的溶解性的分级技术、和遗传工程化方法如扩增、克隆和亚克隆。
序列同一性：术语“序列同一性”或“同一性”，如本文在两个核酸或多肽序列的语境中所使用的，可以指当在特定比较窗口上对齐以实现最大对应性时，两个序列中相同的残基数。
如本文所使用的，术语“百分比序列同一性”可以指通过比较两个在比较窗口上最佳对齐的序列(例如，核酸序列和氨基酸序列)确定的数值，其中为了实现两个序列的最佳对齐，比较窗口中的序列部分与参考序列(其不含添加或缺失)相比可以包括添加或缺失(即缺口)。百分比的计算是通过确定在两个序列中均出现的相同核苷酸或氨基酸的位置的数目，从而产生匹配位置数，并用匹配位置数除以比较窗中的位置总数，并将结果乘以100，得到百分比序列同一性。
用于对齐序列以供比较的方法在本领域中是公知的。多种程序和比对算法记载于，例如：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins and Sharp(1988)Gene73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50中。序列比对方法和同源性计算的详细讨论可以参见，例如,Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(NCBI)基础本地比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLASTTM；Altschul等(1990))可从几个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和在因特网上，与几个序列分析程序联合使用。关于如何使用该程序来测定序列同一性的描述可在因特网上BLASTTM的“帮助”部分获得。对于核酸序列的比较，可使用缺省参数来采用BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2 sequences”函数。在通过此方法评估时，与参照序列具有越大的相似性的核酸序列将显示越高的序列同一性。
能够特异性杂交/能够特异性互补：如本文所使用的，术语“能够特异性杂交”和“能够特异性互补”是表明互补性的程度充分，使得在核酸分子和靶核酸分子之间产生稳定而特异的结合的术语。两个核酸分子之间的杂交涉及在两个核酸分子的核酸序列之间形成反平行对齐。两个分子随后能够与相对链的相应碱基形成氢键，从而形成一个二聚体分子，如果它足够稳定，则可以使用本领域众所周知的方法进行检测。核酸分子不需要与靶分子100％互补才能特异性杂交。然而，发生特异性杂交必须存在的序列互补性的量因杂交条件而变化。
导致特定程度的严格性的杂交条件会取决于所选杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成及长度而变化。一般而言，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na+和/或Mg++浓度)将确定杂交的严格性，尽管清洗次数也会影响严格性。获得特定程度的严格性所要求的杂交条件的计算方法是本领域普通技术人员已知的，例如，参见Sambrook et al.(ed.)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,chapters 9and 11；和Hames andHiggins(eds.)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985。关于核酸杂交的更加详细的说明和指导可以参见，例如，Tijssen,“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,”inLaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes,Part I,Chapter 2,Elsevier,NY,1993；和Ausubel et al.,Eds.,Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995。
如本文所使用的，“严格条件”包括在其中只有当杂交分子与靶核酸分子内的同源序列之间的错配小于20％时才发生杂交的条件。“严格条件”包括进一步特定水平的严格性。因此，如本文所使用的，“中等严格”条件是指在其中序列错配超过20％的分子将不会杂交的条件；“高严格”条件是指在其中序列错配超过10％的分子将不会杂交的条件；“极高严格”条件是指在其中序列错配超过5％的分子将不会杂交的条件。
下面是代表性的、非限制的杂交条件：
高严格条件(检测具有至少90％序列同一性的序列)：在65℃的5x SSC缓冲液中杂交16小时；在室温下用2x SSC缓冲液清洗2次，每次15分钟；和在65℃的0.5x SSC缓冲液中清洗2次，每次20分钟。
中等严格条件(检测具有至少80％序列同一性的序列)：在65-70℃的5x-6x SSC缓冲液中杂交16-20小时；在室温下用2x SSC缓冲液清洗2次，每次5-20分钟；和在55-70℃的1x SSC缓冲液中清洗2次，每次30分钟。
非严格对照条件(检测具有至少50％序列同一性的序列)：在55℃的6xSSC缓冲液中杂交16-20小时；在室温至55℃下用2x-3x SSC缓冲液清洗至少2次，每次20-30分钟。
如本文关于连续核酸序列所使用的，术语“基本上同源的”或“基本上同源”是指如下的连续核苷酸序列，其在严格条件下与参考核酸序列杂交。例如，与参考核酸序列(例如，SEQ ID NO:12)基本上同源的核酸序列是如下的核酸序列，其在严格条件下(例如，上文示明的中等严格条件)与参考核酸序列杂交。基本上同源的序列可具有至少80％序列同一性。例如，基本上同源的序列可具有大约80％-100％的序列同一性，例如大约81％；大约82％；大约83％；大约84％；大约85％；大约86％；大约87％；大约88％；大约89％；大约90％；大约91％；大约92％；大约93％；大约94％；大约95％；大约96％；大约97％；大约98％；大约98.5％；大约99％；大约99.5％；和大约100％。基本上同源的性质与特异性杂交密切相关。例如，当具有充分程度的互补性，从而在期望特异性结合的条件下(例如严格杂交条件下)避免核酸与非靶序列的非特异性结合时，核酸分子是能够特异性杂交的。
如本文所使用的，术语“直系同源物”(或“直向同源的”)是指两个或多个物种中的基因，其从一个共同的祖先核苷酸序列进化而来，并可以在两个或多个物种中保留相同的功能。
如本文所使用的，对于两个核酸分子而言，当沿着5’-3’方向阅读的序列的每一个核苷酸均与沿着3’-5’方向阅读的另一个序列的每一个核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示“完全互补性”。与参考核苷酸序列互补的核苷酸序列将显示与参考核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述在本领域中有确切的定义，且本领域的普通技术人员容易理解。
在确定氨基酸序列之间的百分比序列同一性时，本领域技术人员众所周知，在不影响包含该对齐序列的多肽的期望性质的情况下，某个对齐所提供的给定位置上的氨基酸的身份可以不同。在这些情况下，可以调整百分比序列同一性以解释被保守取代的氨基酸之间的相似性。这些调整是本领域技术人员众所周知并且普遍使用的。见，例如Myers andMiller(1988),Computer Applications in Biosciences 4:11-7。
本发明的实施方案包括示例性的质体转运肽氨基酸序列的功能性变体，和编码它们的核酸序列。示例性的转运肽序列的功能性变体可以是，例如，示例转运肽氨基酸序列的片段(例如N端或C端片段)，或全长示例性转运肽氨基酸序列或示例性转运肽氨基酸序列的片段的修饰序列。在一些实施方案中，示例性的转运肽氨基酸序列可以被修饰而引入一个或多个保守的氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指如下的氨基酸取代，其中氨基酸残基被另一个具有相似功能侧链、相似大小、和/或相似疏水性的氨基酸残基代替。可用于代替相同家族中的另一个氨基酸以便引入保守取代的氨基酸家族是本领域已知的。例如，这些氨基酸家族包括：碱性氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸和组氨酸)；酸性氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)；不带电的(在生理pH下)的极性氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，和半胱氨酸)；非极性氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，和色氨酸)；β支链氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，和异亮氨酸)；和芳香族氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和组氨酸)。见，例如，Sambrook etal.(Eds.),同上；和Innis et al.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,1990,Academic Press,NY,USA。
可操作地连接：当第一核苷酸序列与第二核苷酸序列存在功能关系时，则该第一核苷酸序列与第二核苷酸序列“可操作地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与该编码序列可操作地连接。如果可操作地连接的核苷酸序列是重组产生的，则这些核苷酸序列通常是连续的，并且在需要连接两个蛋白编码区时，这些核苷酸序列将共阅读框。然而，可操作地连接的核苷酸序列不一定连续的。
术语“可操作地连接的”，在用来指基因调节序列和编码序列时，其意思是调节序列影响所连接的编码序列的表达。“调节序列”或“控制元件”是指影响转录的时机和水平/量，RNA加工或稳定性，或相关编码序列的翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子；翻译前导序列；内含子；增强子；茎环结构；阻遏物结合序列；终止序列；多聚腺苷酸化识别序列；等。特定的调节序列可位于与之可操作地连接的编码序列的上游和/或下游。此外，与编码序列可操作地连接的特定调控序列可位于双链核酸分子的相关互补链上。
当用于指示两个或多个氨基酸序列时，术语“可操作地连接”是指第一个氨基酸序列与至少一个额外的氨基酸序列存在功能关系。例如，在包含转运肽和第二氨基酸序列的多肽内，如果该转运肽影响该多肽或该第二氨基酸序列的表达或运输，则该转运肽(例如CTP)与该第二氨基酸序列可操作地连接。
启动子：如本文所使用的，术语“启动子”是指一段DNA区域，其可以位于转录起点的上游，并参与RNA聚合酶和其它蛋白的识别和结合以起始转录。启动子可以与用于在细胞内表达的编码序列可操作地连接，或者启动子可以与编码信号序列的核苷酸序列可操作地连接，而该信号序列与用于在细胞内表达的编码序列可操作地连接。“植物启动子”可以是能够在植物细胞中起始转录的启动子。处于发育控制之下的启动子的实例包括：优先在某些组织(例如但不限于，叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织)中起始转录的启动子。这些启动子被称为“组织优选的”。仅在特定组织中启动转录的启动子被称为“组织特异的”。“细胞类型特异的”启动子主要在一个或多个器官的特定细胞类型中的驱动转录，例如根或叶中的导管细胞。“可诱导的”启动子可以是可受环境控制的启动子。可能通过可诱导的启动子触发转录的环境条件的实施例包括，例如但不限于，缺氧条件和光的存在。组织特异的、组织优选的、细胞类型特异的、和可诱导的启动子构成了“非组成型”启动子类型。“组成型”启动子是在大多数环境条件下可以有活性的启动子。
任何可诱导的启动子均可用于本发明的一些实施方案。见Ward et al.(1993),Plant Mol.Biol.22:361-366。使用可诱导的启动子，转录速度可响应诱导剂而增加。可诱导的启动子的实例包括，但不限于：来自ACEI系统的对铜响应的启动子；来自玉米的对苯磺酰胺除草剂安全剂响应的In2基因；来自Tn10的Tet阻遏物；和来自类固醇激素基因的可诱导启动子，其转录活性可以被糖皮质激素诱导(Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:0421)。
组成型启动子的实例包括，但不限于：来自植物病毒的启动子，如来自CaMV的35S启动子；来自水稻肌动蛋白基因的启动子；泛素启动子；pPEMU；MAS；玉米H3组蛋白启动子；和ALS启动子，欧洲油菜ALS3结构基因5'端的Xba1/NcoI片段(或与所述Xba1/NcoI片段相似的核苷酸序列)(国际PCT公开No.WO 96/30530)。
此外，所有的组织特异性或组织优选的启动子可以用于一些本发明的实施方案中。以包含可操作地连接于组织特异性启动子的编码序列的核酸分子转化的植物可以生成仅在特定组织或择优在特定组织中的编码序列的产物。示例性组织特异性或组织优选的启动子包括但不限于：根优选的启动子，例如，来自菜豆蛋白基因的启动子；叶特异性和光诱导的启动子，例如来自cab或rubisco的启动子；花药特异性的启动子，例如来自LAT52的启动子；花粉特异性的启动子，例如来自Zm13的启动子；和小孢子优选的启动子，例如来自apg的启动子。
转化：如本文所使用的，术语“转化”或“转导(transduction)”是指将一个或多个核酸分子转移进入细胞中。细胞在核酸分子通过细胞复制变得稳定时通过该转导进入细胞的核酸分子进行转化，或者通过将核酸分子结合进入细胞基因组进行转化，或者通过附加型复制(episomal replication)进行转化。如本文所使用的，术语“转化”包括所有的可以将核酸分子引入这种细胞中的技术。实例包括但不限于：以病毒载体进行转染；以质粒载体进行转化；电穿孔(Fromm et al.(1986)Nature 319:791-3)；脂质体转染(Felgner et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller et al.(1978)Cell15:579-85)；土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转移(Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)；直接DNA吸收；和微弹轰击法(microprojectilebombardment)(Klein et al.(1987)Nature 327:70)。
转基因：一种外源核酸序列。在一些实例中，转基因可以是编码包含至少一个人造的CTP的多肽的序列。在特定实例中，转基因可以编码这样的多肽，其包含至少一个人造的CTP和至少一个期望质体表达的额外的肽序列(例如，赋予除草剂抗性的肽序列)。在这些和其它的实例中，转基因可以含有与转基因的编码序列可操作地连接的调节序列(例如启动子)。为本公开的目的，术语“转基因(的)”在用于指示生物体(例如植物)时，是指包含外源核酸序列的生物体。在一些实例中，包含外源核酸序列的生物体可以是其中通过分子转化技术引入了该核酸分子的生物体。在其它实例中，包含外源核酸序列的生物体可以是通过例如基因渗入或植物异花授粉而引入了该核酸序列的生物体。
转运：如本文所使用的，术语“转运”、“导向”和“转移”是指本发明的某些氨基酸序列帮助包含该氨基酸序列的多肽从宿主细胞的细胞核移动进入宿主细胞的质体内的性质。在特定的实施方案中，这种氨基酸序列(例如人造的CTP序列)可能能够将包含该氨基酸序列的多肽的大约100％、至少大约95％、至少大约90％、至少大约85％、至少大约80％、至少大约70％、至少大约60％、和/或至少大约50％转运到宿主细胞的质体内。
载体：一种被引入到细胞内，例如为了产生转化细胞而被引入到细胞内的核酸分子。载体可以包括允许它在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体的实例包括，但不限于：质粒；粘粒；噬菌体；和携带外源DNA进入细胞的病毒。载体还可以包括一个或多个基因、反义分子、和/或选择标志物基因，以及其它本领域已知的遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，借此导致细胞表达由该载体编码的核酸分子和/或蛋白质。载体任选地包括可帮助核酸分子实现细胞进入的材料(例如脂质体、蛋白质包壳等)。
除非特别说明或暗示，如本文所用的，术语“一种”、“一个”和“该”意味着“至少一个”。
除非另有具体说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。分子生物学中常见术语的定义可见，例如LewinB.,Genes V,Oxford University Press,1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN0-632-02182-9)；和Meyers R.A.(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCHPublishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。所有的百分比均为重量百分比，并且所有的溶剂混合物的比例均基于体积，除非另有说明。所有的温度均为摄氏度。
IV.包含合成编码CTP的序列的核酸分子
在一些实施方案中，本公开提供核酸分子，其包含可操作地连接于感兴趣的核苷酸序列的至少一个编码人造CTP的核苷酸序列。在具体的实施方案中，所述感兴趣的核苷酸序列可以是编码感兴趣的多肽的核苷酸序列。在特别的实例中，提供编码多肽的单个核酸分子，所述多肽中TraP23序列融合至感兴趣的多肽的N端。
在一些实施方案中，人造叶绿体转运肽可以是嵌合CTP。人造CTP可以由从多个EPSPS酶的比对中随机选择氨基酸而得到。图2显示从植物EPSPS酶分离的CTP序列的比对。因此，编码氨基酸序列的人造CTP可以由从天然叶绿体转运肽序列的比对中随机选择氨基酸而得到。在这些和其他实例中，用来产生比对的参考CTP序列的连续氨基酸序列可以包含人造CTP。
本领域普通技术人员将会理解：在人造CTP序列内选择第一氨基酸序列后，根据前述的衍生过程从同源CTP序列的剩余部分鉴定和选择连续氨基酸序列是明确且自动的。在一些实例中，所述第一连续氨基酸序列的长度可以是约25至约41个氨基酸(例如，24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41和42个氨基酸长)。
根据前述过程的人造CTP蛋白质序列的实例以SEQ ID NO:11为代表。考虑遗传密码的简并性，本领域普通技术人员能立即想到编码这些肽的核苷酸序列的类群。这些特定的实例从来自不同植物物种的几种ESPSP直系同源物之一的同源CTP的比对纳入了连续序列，从而例示了人造CTP的结构特征。
一些实施方案包括人造叶绿体转运肽的功能性变体，和/或编码该变体的核酸。这样的功能性变体包括，例如且不限于：由SEQ ID NO:11所示的出的编码人造CTP的序列，和/或由其编码的CTP；编码包含SEQ ID NO:11内的连续氨基酸序列的人造CTP的核酸，和/或由其编码的CTP；编码截短的人造CTP的序列，其包含SEQ ID NO:12的连续核酸序列；编码截短的人造CTP的序列，其包含与SEQ ID NO:12基本上同源的连续核酸序列；截短的人造CTP，其包含SEQ ID NO:11的连续氨基酸序列；编码人造CTP的核酸和/或由其编码的CTP；所述人造CTP包含SEQ ID NO:11的连续氨基酸序列；编码人造CTP的核酸和/或由其编码的CTP，所述CTP包含SEQ ID NO:11内的连续氨基酸序列，且该序列具有一个或多个沉默氨基酸取代；和编码人造CTP的核酸和/或由其编码的CTP，所述CTP包含SEQ ID NO:11内的连续氨基酸序列，且该序列具有一个或多个被证明能将可操作连接的肽引导至含质体细胞中的质体的非沉默氨基酸取代。
因此，本发明的一些实施方案包括含有如下核苷酸序列的核酸分子，该核苷酸序列编码人造的CTP，其包含一个或多个保守的氨基酸取代。这种核酸分子可用于，例如，在分子生物学技术中帮助本发明CTP编码序列的操作。例如，在一些实施方案中，可将本发明的CTP编码序列引入到合适的用于将序列亚克隆到表达载体内的载体中，或者可以将本发明的CTP编码序列可以引入到这样的核酸分子中，该核酸分子可以帮助产生其他包含与感兴趣的核苷酸序列可操作地连接的CTP编码序列的核酸分子。在这些和进一步的实施方案中，人造的CTP序列中的一个或多个氨基酸位置可以被删除。例如，人造的CTP的序列可以被修饰，使得该序列中的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个位置上的氨基酸被删除。对同源CTP序列的比对可以提供哪些氨基酸可以被删除而不会影响人造CTP的功能的指导。
在特定的实施例中，人造叶绿体转运肽长度小于80个氨基酸。例如，人造CTP的长度可以是79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60个氨基酸或更少。在一些实例中，人造CTP的长度可以是约65、约68、约72、或约74个氨基酸。在这些和进一步的实例中，人造CTP可以包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或前述的功能性变体。因此，人造CTP可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其功能性变体，其中人造CTP的长度小于80个氨基酸长度。在一些实例中，人造CTP可以包含，例如，与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
本领域的技术人员结合本公开能识别编码某一具体的人造CTP的所有核苷酸序列，例如SEQ ID NO:11的TraP23肽，或任意前述者的功能性变体，包括任何特定缺失和/或保守氨基酸取代。遗传密码的简并性为特定氨基酸序列提供了有限数目的编码序列。选择特定的序列编码人造的CTP属于从业者的自由裁量。在不同的应用中可能期望使用不同的编码序列。例如，为了提高人造CTP在特定宿主内的表达，可以选择反映宿主密码子使用偏好的编码序列。作为举例，人造的CTP可以由如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列编码。
本发明的一些实施方案中提供的核酸分子中，编码人造的CTP的核苷酸序列的最后一个密码子和感兴趣的核苷酸序列的第一个密码子可以由任意数量的核苷酸三联体所分隔，例如不编码内含子或“终止(STOP)”。在一些实例中，编码在天然前体多肽中通常与叶绿体转运肽相伴随的成熟蛋白质的第一个氨基酸的序列可以存在于编码人造CTP的核苷酸序列的最后一个密码子与感兴趣的核苷酸序列的第一个密码子之间。将编码人造CTP的核苷酸序列和感兴趣的核苷酸序列第一个密码子隔开的序列可以例如由任何序列构成，使得所编码的氨基酸序列很可能不会显著改变嵌合多肽的翻译及其向质体的转位。在这些和进一步的实施方案中，编码人造叶绿体转运肽的核苷酸序列的最后一个密码子可以与直接与该序列毗邻、或者仅以短肽序列与之相隔的感兴趣的核苷酸序列的第一个密码子相位对准(phase register)地融合，所述短肽序列例如是由人造核苷酸接头(例如，可能已经被用于实现该融合的核苷酸接头)编码的短肽序列。
在一些实施方案中，可能期望修饰感兴趣的核苷酸序列的核苷酸和/或与之融合在一个编码序列中的、人造的CTP编码序列的核苷酸，以便例如增强该编码序列在特定宿主中的表达。遗传密码是冗余的，具有64个可能的密码子，但是大多数生物优先使用这些密码子中的一个子集。在某个物种中最经常使用的密码子被称为最优密码子，而那些不经常使用的被归类为稀有或低使用率密码子。Zhang et al.(1991)Gene 105:61-72。可更换密码子以反映特定宿主的优先密码子使用率，这个过程有时被称作“密码子优化”。可以制备含有特定原核或真核宿主优选的密码子的优化密码子序列，以便，例如，增加翻译速度或者产生具有期望性质(例如，与从非优化序列产生的转录本相比具有更长的半衰期)的重组RNA转录本。
任何多肽均可以通过纳入人造的CTP序列而被导向到含质体细胞的质体上。例如，在一些实施方案中，可以将多肽与人造的CTP序列连接，从而将多肽引导到的细胞的质体上，在质体中该多肽-CTP连接分子被表达。在特定的实施方案中，通过纳入人造的CTP序列而被导向到质体上的多肽可以是在天然表达该多肽的细胞内通常在质体中表达的多肽。例如但不限于，通过纳入人造的CTP序列被导向到质体上的多肽可以是参与除草剂抗性，病毒抗性，细菌性病原体抗性，昆虫抗性，线虫抗性，或抗真菌多肽的多肽。参见，例如，美国专利5,569,823；5,304,730；5,495,071；6,329,504和6,337,431。通过纳入人造的CTP序列被导向到质体上的多肽抑或可以是，例如但不限于，参与植物活力和产量的多肽(包括参与对极端温度、土壤条件、光照水平、水的水平、和化学环境的耐受性的多肽)，或者可以用作鉴定含有感兴趣的性状的植物的标志物的多肽(例如，选择标志物基因产物、参与种子颜色的多肽，等)。
在本发明的一些实施方案中，可以和人造CTP序列连接的、参与除草剂抗性的多肽的非限制性实例包括：乙酰乳酸合酶(ALS)、突变的ALS和ALS的前体(例如，见美国专利5,013,659)；EPSPS(见，例如，美国专利4,971,908和6,225,114)，例如CP4EPSPS或III类EPSPS；可修饰质体中发生的生理过程的酶，这些生理过程包括但不限于，光合作用和脂肪酸、氨基酸、油、类胡萝卜素(carotenoids)、萜类和淀粉的合成。在特定实施方案中，可以和人造的叶绿体转运肽连接的多肽的其它非限制性实例包括：玉米黄素环氧酶，胆碱单加氧酶，亚铁螯合酶，ω-3脂肪酸去饱和酶，谷氨酰胺合成酶，淀粉修饰酶，参与必需氨基酸、维生素A、激素、Bt毒素蛋白的人造的多肽，等等。编码上述多肽的核苷酸序列在本领域中是已知的，可以将这些核苷酸序列和编码人造的CTP的核苷酸序列可操作地连接，其中该CTP将被表达进入如下的多肽，其包含与该人造的CTP连接的感兴趣的多肽。此外，编码任何上述多肽的额外核苷酸序列可以由本领域的技术人员鉴定(例如，通过克隆与编码该特定多肽的其它基因高度同源的基因)。一旦鉴定了这样的核苷酸序列，设计包括与所鉴定核苷酸序列可操作地连接的人造的CTP编码序列，或编码等价多肽的序列，都会是直截了当的过程。
V.包含人造叶绿体转运肽的多肽的表达
在一些实施方案中，可以将至少一种核酸分子引入细胞、组织或生物体中，这些核酸分子包含编码包含至少一种人造的CTP或其功能等价物的多肽的核苷酸序列，以在所述细胞、组织或生物体中中表达该多肽。在特定的实施方案中，核酸分子可以包含与所述编码人造的CTP的核苷酸序列可操作地连接的感兴趣的核苷酸序列。例如，核酸分子可以包括编码如下多肽的编码序列，该多肽包含至少一个人造的CTP和至少一个由感兴趣的核苷酸序列编码的其他肽序列。在一些实施方案中，可以将本发明的核酸分子引入含质体的细胞、组织或生物体(例如，植物细胞，植物组织和植物)中，使得在该含质体宿主细胞、组织或生物体中从所述核酸分子表达多肽，其中该表达的多肽包含至少一个人造的CTP和至少一个由感兴趣的核苷酸序列编码的其他肽序列。在某些实例中，被表达的多肽的人造的CTP可以帮助将该多肽的至少含有所述其他肽序列的一部分导向到宿主细胞、组织或生物体的质体上。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以通过任何本领域技术人员已知的方法引入到含质体的细胞内。在特定的实施方案中，可以使宿主细胞、组织或生物体和本发明的核酸分子接触，以便将该核酸分子引入到细胞、组织或生物体内。在特定的实施方案中，可用本发明的核酸分子转化细胞，从而将该核酸分子导入细胞内，并且将核酸分子稳定整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，可以使用包含至少一个与感兴趣的核苷酸序列可操作地连接的人造CTP的核苷酸序列的核酸分子转化细胞，例如含质体的细胞(例如植物细胞)。为了引发或增强表达，核酸分子可以包含一个或多个调节序列，该调节序列可以和编码包含至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列可操作地连接。
核酸分子可以是，例如，载体系统，其包括例如线性质粒和闭合环状质粒。在特定的实施方案中，该载体可以是表达载体。本发明的核酸序列可以，例如，插入到载体中，使该核酸序列与一个或多个调节序列可操作地连接。有许多载体可用于该目的，并且特定载体的选择可以取决于，例如，待插入到载体内的核酸的大小，和要用载体转化的具体宿主细胞。载体通常含有多种组分，这些组分的身份取决于载体的功能(例如，DNA扩增和DNA表达)，以及与载体相容的特定宿主细胞。
一些实施方案可以包括植物转化载体，其包括含有至少一个上述的调节序列的核苷酸序列，其中该调节序列与一个或多个编码含有至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列可操作地连接。该一个或多个核苷酸序列可以在该调节序列的控制下在植物细胞、组织或生物体中表达，从而产生包含人造的CTP的多肽，该CTP将多肽的至少一部分导向到植物细胞、组织或生物体的质体上。
在一些实施方案中，与编码含有至少一个人造的CTP的多肽的核苷酸序列可操作地连接的调节序列可以是启动子序列，其可以在宿主细胞中，例如要在其中扩增该核酸分子的细菌细胞，或者要在其中表达该核酸分子的植物细胞中发挥功能。适用于根据本发明的核酸分子的启动子，包括诱导型启动子、病毒启动子、人造启动子、或组成型启动子，所有这些都是本领域中众所周知的。可用于本发明实施方案的启动子的非限制性实例在下列文献中提供：美国专利Nos.6,437,217(玉米RS81启动子)；5,641,876(水稻肌动蛋白启动子)；6,426,446(玉米RS324启动子)；6,429,362(玉米PR-1启动子)；6,232,526(玉米A3启动子)；6,177,611(组成型玉米启动子)；5,322,938,5,352,605,5,359,142和5,530,196(35S启动子)；6,433,252(玉米L3的油质蛋白启动子)；6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子和稻肌动蛋白内含子2)；6,294,714(光诱导型启动子)；6,140,078(盐诱导型启动子)；6,252,138(病原体诱导型启动子)；6,175,060(磷缺乏诱导的启动子)；6,388,170(双向启动子)；6,635,806(γ-coixin启动子)；和美国专利申请序列No.09/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。
其它示例性启动子包括，胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-9)；章鱼碱合酶(OCS)启动子(其被携带于根瘤土壤杆菌的肿瘤诱导型质粒上)；花椰菜花叶病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton et al.(1987)Plant Mol.Biol.9:315-24)；CaMV 35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313:810-2)；玄参花叶病毒35S启动子(Walker et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19):6624-8)，蔗糖合酶启动子(Yang and Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-8)；R基因复合体启动子(Chandler et al.(1989)Plant Cell 1:1175-83)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV35S(美国专利Nos.5,322,938,5,352,605,5,359,142,和5,530,196)；FMV35S(美国专利Nos.6,051,753,和5,378,619)；PC1SV启动子(美国专利No.5,850,019)；SCP1启动子(美国专利No.6,677,503)，以及AGRtu.nos启动子(GenBank登录号V00087；Depicker et al.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-73；Bevan et al.(1983)Nature 304:184-7)。
在特定的实施方案中，本发明的核酸分子可以包含组织特异性启动子。组织特异性启动子是一种核苷酸序列，其在该启动子特异针对的组织中导致可操作地连接的核苷酸序列发生与该生物体的其它组织相比更高水平的转录。组织特异性启动子的实例包括但不限于：绒毡层特异性启动子；花药特异性启动子；花粉特异性启动子(参见，例如，美国专利No.7,141,424，和国际PCT公开No.WO 99/042587)；胚珠特异性启动子；(参见，例如，美国专利申请No.2001/047525A1)；果实特异性启动子(参见，例如，美国专利Nos.4,943,674,和5,753,475)；和种子特异性启动子(参见，例如，美国专利Nos.5,420,034,和5,608,152)。在一些实施方案中，发育阶段特异性启动子(例如，在发育晚期活跃的启动子)可以在本发明的组合物或方法中使用。
其他可在一些实施方案中与核酸分子可操作地连接的调节序列包括位于启动子序列和充当翻译前导序列的编码序列之间的5’UTR。翻译前导序列存在于完全加工的mRNA中，并且它可能影响初级转录物的加工，和/或RNA稳定性。翻译前导序列的实例包括玉米和矮牵牛热休克蛋白前导序列(美国专利No.5,362,865)，植物病毒外壳蛋白前导序列，植物rubisco(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶)前导序列，及其他。参见，例如，Turner andFoster(1995)Molecular Biotech.3(3):225-36。下列文献中提供了5’UTR的非限制性实例：GmHsp(美国专利No.5,659,122)；PhDnaK(美国专利No.5,362,865)；AtAnt1；TEV(Carrington and Freed(1990)J.Virol.64:1590-7)；和AGRtunos(GenBank登录号V00087；和Bevan et al.(1983),Nature 304:184-7)。
其他可在一些实施方案中与核酸分子可操作地连接的调节序列还包括3’非翻译序列、3’转录终止区或多聚腺苷酸区。这些都是位于核苷酸序列下游的遗传元件，并包括提供多聚腺苷酸化信号，和/或其它能够影响转录或mRNA加工的调控信号的多核苷酸。多聚腺苷酸化信号在植物中发挥功能，导致在mRNA前体的3’端添加多聚腺苷酸核苷酸。多聚腺苷酸序列可以来自于各种植物基因，或T-DNA基因。3’转录终止区的一个非限制性实例是胭脂碱合酶3'区(nos 3’；Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7)。在Ingelbrecht et al.(1989)Plant Cell 1:671-80中提供了一个使用不同3'非翻译区的实例。多聚腺苷酸信号的非限制性实例包括来自豌豆RBCS2基因的多聚腺苷酸信号(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi et al.(1984)EMBO J.3:1671-9)和AGRtu.nos(GenBank登录号No.E01312)。
本发明的重组核酸分子或载体可包含选择标志物，其赋予被转化的细胞(例如植物细胞)可选择的表型。选择标志物也可以用于选择包含本发明核酸分子的植物或植物细胞。该标记可以编码杀生物剂抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遗传霉素(G418)、博来霉素，和潮霉素)或除草剂抗性(例如草甘膦)。选择标志物的实例包括，但不限于：neo基因，其赋予卡那霉素抗性并可用例如卡那霉素和G418进行筛选；bar基因，其赋予双丙氨磷抗性；突变的EPSP合酶基因，其赋予草甘膦抗性；腈水解酶基因，其赋予溴苯腈抗性；突变的乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性；和氨甲喋呤抗性DHFR基因。存在多种可赋予对氨苄青霉素；博来霉素；氯霉素；庆大霉素；潮霉素；卡那霉素；林可霉素；甲氨蝶呤；草铵膦；嘌呤霉素；大观霉素；利福平；链霉素；和四环素等抗性的选择标志物。这些选择标志物的实例在，例如，美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047中有举例。
本发明的核酸分子或载体可额外地/作为替代地包含筛选标志物。筛选标志物可用于监视表达。筛选标志物的实例包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，其编码已知有多种发色底物的酶(Jefferson et al.(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)；R-座位基因，其编码的产物可调节植物组织中花青素色素(红色)的产生(Dellaporta et al.(1988)“Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.”见18th Stadler Genetics Symposium,P.Gustafson and R.Appels,编辑,Plenum,NY(第263-82页)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe et al.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3737-41)；编码其各种发色底物已知的酶的基因(例如，PADAC，一种发色头孢菌素)；荧光素酶基因(Ow et al.(1986)Science 234:856-9)；xylE基因，其编码一种儿茶酚双加氧酶，转换发色的儿茶酚(Zukowski et al.(1983)Gene 46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(Ikatu etal.(1990)Bio/Technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其编码的酶能够氧化酪氨酸为DOPA多巴醌，进一步缩合成黑色素(Katz et al.(1983)J.Gen.Microbiol.129:2703-14)；和α-半乳糖苷酶。
适用于转化宿主细胞的方法包括任何能够将DNA引入到细胞内的方法，例如但不限于：原生质体转化(参见，例如，美国专利5,508,184)；干燥/抑制介导的DNA摄取(desiccation/inhibition-mediated DNA uptake)(参见，例如Potrykus et al.(1985)Mol.Gen.Genet.199:183-8)；电穿孔(参见，例如，美国专利5,384,253)；用碳化硅纤维搅拌(参见，例如，美国专利5,302,523和5,464,765)；土壤杆菌介导的转化(参见，例如，美国专利5,563,055,5,591,616,5,693,512,5,824,877,5,981,840,和6,384,301)；和DNA涂覆颗粒的加速(acceleration of DNA-coated particles)(参见，例如，美国专利5,015,580,5,550,318,5,538,880,6,160,208,6,399,861,和6,403,865)等。通过诸如这些技术的应用，几乎任何物种的细胞均可以被稳定地转化。在一些实施方案中，转化DNA被整合到宿主细胞的基因组中。在多细胞物种的情况下，转基因细胞可以再生为转基因生物。任何这些技术均可用于产生转基因植物，例如，在转基因植物的基因组中包含一个或多个本发明的核酸序列。
最广泛使用的用于将表达载体导入到植物中的方法是基于土壤杆菌的天然转化系统。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是可遗传转化植物细胞的植物致病性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。Ti(肿瘤诱导)质粒含有一个大区段，称为T-DNA，其可以转移到被转化的植物中。Ti质粒的另一个片段，vir区，负责T-DNA转移。T-DNA区域的边界由重复序列构成。在某些经修饰的双元载体中，肿瘤诱导的基因已被删除，并且vir区的功能被利用来转移被T-DNA边界序列包围的外源DNA。T-区还可以包括，例如，选择标志物，其用于高效回收转基因植物和细胞，和多克隆位点，其用于插入供转移的序列，例如人造的CTP编码核酸。
因此，在一些实施方案中，植物转化载体可衍生自根癌土壤杆菌的Ti质粒(参见，例如，美国专利Nos.4,536,475,4,693,977,4,886,937和5,501,967，以及欧洲专利EP 0122 791)或发根土壤杆菌的Ri质粒。其他的植物转化载体包括，例如但不限于，在下列文献中描述的那些：Herrera-Estrella et al.(1983)Nature 303:209-13；Bevan et al.(1983),同上；Klee et al.(1985)Bio/Technol.3:637-42；和欧洲专利EP 0 120 516，以及从前述任一种衍生的那些。其它天然与植物互作的细菌，例如中华根瘤菌、根瘤菌属、和慢生根瘤菌属，也可以被修饰从而介导将基因转移到多种不同的植物中。这些植物相关的共生菌可以通过获取卸甲(disarmed)的Ti质粒和合适的双元载体而拥有基因转移能力。
在向受体细胞提供外源DNA之后，一般对被转化细胞进行鉴定，以用于进一步的培养和植株再生。为了提高鉴定被转化的细胞的能力，可能期望采用与用于产生转化体的载体相伴的选择或筛选标志物基因，如先前所述。在使用选择标志物的情况下，通过使细胞暴露于选择试剂，在潜在的被转化细胞群体中鉴定被转化的细胞。在使用筛选标志物的情况下，可以通过期望的标记基因性状对细胞进行筛选。
对于暴露于选择试剂时存活的细胞，或在筛选测定中具有阳性得分的细胞，可以在支持植株再生的培养基中培养。在一些实施方案中，对任何合适的植物组织培养基(例如，MS和N6培养基)均可加以修饰使其包含更多的物质，如生长调节剂。组织可以保持在含有生长调节剂的基本培养基中，直到获得足够的组织用于开始植物再生，或者进行多轮重复的人工选择，直到组织的形态适合于再生(例如，至少2周)，然后转移到有利于芽形成的培养基中。培养被周期性转移，直到形成足够的芽。一旦芽形成，即将它们转移到有利于根形成的培养基中。一旦有足够的根部形成，可以将植物转移到土壤中进一步生长和成熟。
为了确认再生植物中感兴趣的核酸分子(例如编码含有至少一个人造的CTP的多肽的核苷酸序列)的存在，可以实施的测定有很多种。这些测定包括，例如：分子生物学测定，如Southern和Northern杂交、PCR和核酸测序；生物化学测定，例如通过如免疫学方法(ELISA和/或Western印迹)或通过酶促作用检测蛋白质产物的存在；植物部分测定，如叶或根测定；和全再生植物的表型分析。
作为举例，整合事件可以通过PCR扩增进行分析，其使用，例如，特异针对感兴趣的核苷酸序列的寡核苷酸引物。PCR基因分型理解为包括，但不限于，来自预测含有被整合到基因组中的感兴趣的核酸分子的分离宿主植物组织的基因组DNA的聚合酶链反应(PCR)扩增，随后是标准克隆和PCR扩增产物的序列分析。PCR基因分型的方法已经有详细的描述(参见，例如，Rios,G.et al.(2002)Plant J.32:243-53)，并可应用于衍生自任何植物物种(例如玉米或大豆)或组织类型(包括细胞培养物)的基因组DNA。
使用土壤杆菌依赖的转化方法形成的转基因植物通常含有被插入到一个染色体上的单一重组DNA序列。该单一重组DNA序列被称作“转基因事件”或“整合事件”。这样的转基因植物对于所插入的DNA序列而言是杂合的。在一些实施方案中，可以获得对转基因而言为纯合的转基因植物，这是通过使含有单个外源基因序列的独立分离的转基因植物与自身(例如F0植物)有性交配(自交)产生F1种子。所产生的F1种子中四分之一对转基因而言是纯合的。萌发F1种子产生能够用于杂合性测试的植物，其中杂合性测定通常使用允许区分杂合子和纯合子的SNP测定或热扩增测定法(即，合子型测定)。
在特定的实施方案中，在其中已经引入了至少一个包含编码至少一个含有至少一个人造CTP的多肽的核酸分子的含有质体的细胞内，产生了至少一个人造CTP的多肽的多个拷贝。每个含有至少一个人造CTP的多肽可以由被引入到不同转化事件中的多个核酸序列表达，或者由被引入到单个转化事件中的单个核酸序列表达。在一些实施方案中，多个这样的多肽可以在单个启动子的控制下表达。在其它实施方案中，多个这样的多肽可以在多个启动子的控制下表达。可以表达含有多个肽序列的单一多肽，其中每一个肽序列均将被导向到质体。
除了用重组核酸分子直接转化植物之外，还可以通过将具有至少一个转基因事件的第一植物与缺少这种事件的第二植物杂交，来制备转基因植物。例如，可以将含有编码包含至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列的重组核酸分子引入到适于转化的第一植物品系内，从而产生转基因植物，可以将转基因植物和第二植物品系杂交，从而将编码该多肽的核苷酸序列引入到该第二植物品系内。
VI.包含被人造叶绿体转运肽引导的多肽的植物材料
在一些实施方案中，提供了一种植物，其中该植物包含这样的植物细胞：该植物细胞中含有编码包含至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列。在特定的实施方案中，这样的植物可以通过转化植物组织或植物细胞，并再生整株植物来产生。在进一步的实施方案中，这样的植物可以从商业来源获得，或者通过将含有编码含有至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列的核酸渗入到种质中而获得。还提供了这样的植物材料，其包含植物细胞，该植物细胞中含有编码含有至少一种人造CTP的多肽的核苷酸序列。这样的植物材料可以从包含该植物细胞的植物中获得。
包含编码包含至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列的转基因植物或植物材料在一些实施方案中可表现出一个或多个以下的特征：在植物的细胞内表达该多肽；在植物细胞的质体内表达该多肽的一部分；将多肽从植物细胞的细胞质导入到细胞的质体内；在植物细胞内质体特异性地表达该多肽；和/或将多肽定位在植物的细胞内。除了表达编码的多肽之外，这样的植物可以额外具有一个或多个期望的性状。这些性状可以包括例如：抗昆虫等害虫以及致病剂；耐除草剂；增强稳定性、产量或保质期；环境抗性；药物生产；工业产品生产；和营养强化。
根据本发明的转基因植物可以是任何能够被本发明核酸分子转化的植物。因此，该植物可以是双子叶植物或单子叶植物。本发明方法中可以使用的双子叶植物的非限制性实例包括：拟南芥属，苜蓿，豆类，西兰花，卷心菜，胡萝卜，花椰菜，芹菜，大白菜，棉花，黄瓜，茄子，莴苣，甜瓜，豌豆，胡椒，花生，马铃薯，南瓜，萝卜，油菜，菠菜，大豆，倭瓜(squash)，甜菜，向日葵，烟草，番茄，和西瓜。本发明方法中可以使用的单子叶植物的非限制性实例包括：玉米，芸苔属植物(Brassica)，洋葱，水稻，高粱，小麦，黑麦，黍，甘蔗，燕麦，黑小麦，柳枝稷，以及草坪草。根据本发明的转基因植物可以按照任何方式使用或栽培。
一些实施方案还提供了含有一个或多个编码包含至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列的商业产品，例如从含有一个或多个这样的核苷酸序列的重组植物或种子中产生的商业产品。含有一个或多个编码包含至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列的商业产品包括，例如但不限于：含有一个或多个编码包含至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列的植物的食品、粕、油、压碎的或完整的颗粒或种子。在一个或多个商品或商业产品中检测到一个或多个编码包含至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列，是事实上的证据，表明该商品或商业产品至少部分地是由包含一个或多个编码包含至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列的植物产生的。在特定的实施方案中，本发明的商品产品包括可检测量的、编码包含至少一个人造CTP的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，这种商品产品可以通过，例如，获得转基因植物并从它们制备食物或饲料来生产。
在一些实施方案中，含有转基因的转基因植物或种子(该转基因包含编码包含至少一个人造CTP的多肽的核苷酸序列)在其基因组中还可以包含至少一个其它的转基因事件，包括但不限于：转录RNAi分子的转基因事件；编码杀虫蛋白的基因(例如，苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白)；除草剂耐受性基因(例如，提供对草甘膦耐受性的基因)；和有助于在转基因植物中产生期望表型的基因(例如，增加产量，改变脂肪酸代谢，或恢复细胞质雄性不育性)。
VII.人造叶绿体转运肽介导的基因产物至质体的定位
本发明的一些实施方案提供了一种用于将基因产物表达和/或定位于质体(例如叶绿体)上的方法。在特定的实施方案中，基因产物可以是标志物基因产物，例如，荧光分子。基因产物作为还包含人造CTP的多肽的一部分的表达，可以提供一种用来评估特定的人造CTP序列的质体定位能力的系统。在一些实施方案中，标记基因产物的表达，其中该标记基因产物作为包含人造CTP的多肽的一部分，可用于将标记基因产物的表达导向到表达该多肽的细胞的质体上。在某些实施方案中，这样的标记基因产物被定位在宿主细胞的质体上。例如，标志物基因产物在质体中的表达水平可能比在宿主细胞细胞质或其他细胞器中更高；标志物基因产物可能在质体中的表达水平高得多；标记基因产物可能基本上只在质体中表达；或者标记基因产物可能完全在质体中表达，从而不能检测到其在细胞质或非质体细胞器中的表达。
在一些实施方案中，包括人造CTP的功能性变体的多肽，其中该多肽与标志物基因产物可操作地连接，用于评估功能性变体肽的特性。例如，可以改变人造CTP序列，例如在人造CTP中引入至少一个保守突变，并且可将所得的变体肽和标志物基因产物可操作地连接。在合适的宿主细胞(例如，其中表达构建体中的一个或多个调节元件可运作的细胞)中表达后，可以确定标志物基因产物的表达。通过在参考人造CTP-标记物构建体和变体肽-标记物构建体之间比较标志物基因产物的亚细胞定位，可以确定变体肽是否提供，例如，更大的(greater)质体定位，或基本上相同的质体定位。这样的变体可认为是功能性变体。通过鉴定人造CTP的能提供更大质体定位的功能性变体，可以将这样的变体中的突变纳入到进一步的人造CTP的变体中。执行多轮该评估过程，并随后将被鉴定的有利突变纳入到人造CTP序列内，可以产生一个迭代的过程，用于优化人造CTP序列。这种优化的人造CTP序列，和编码它们的核苷酸序列，被认为是本发明的一部分，无论此类优化的人造CTP序列是否能够通过添加额外的突变而进一步被优化。
本文通过援引并入在本文引用的所有参考文献，包括公开、专利和专利申请，以它们不与本公开的明确记载矛盾为限，并且并入的程度相当于将各参考文献明确地一一援引并入，如同这些文献全文记载在本文中一样。本文所讨论的参考文献仅是为了提供它们在本申请申请日之前的公开内容。本发明中任何内容均不应视为发明人承认无权基于发明在先而要求将本申请视为早于这些公开。
提供下面实施例以解释一些特定的特征和/或方面。这些实施例不应当被认为限制所述特定特征或方面的公开。
实施例
实施例1：人造叶绿体转运肽(TraP)序列的设计和制备
质体是在高等植物物种中发现的细胞器，并存在于所有植物组织中。叶绿体是在绿色光合组织中发现的一种特化型质体，负责至关重要的生理功能。例如，其中一种这样的主要生理功能是合成植物所需的芳香族氨基酸。细胞核编码的酶是此生物合成途径必需的，这些酶从细胞质被转运到叶绿体的内部。这些细胞核编码的酶通常具有N端转运肽，其与叶绿体膜相互作用，从而促进肽转运到叶绿体的基质。Bruce B.(2000)Chloroplasttransit peptides:structure,function,and evolution.Trends Cell Bio.10:440–447。在输入时，基质肽酶切掉该转运肽，而使成熟的功能蛋白被输入到叶绿体内。Richter S,Lamppa GK.(1999)Stromal processing peptidase binds transit peptides andinitiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts.Journ.Cell Bio.147:33–43。叶绿体转运肽是可变的序列，其在长度、组成和组织上有高度多样性。Bruce B.(2000)Chloroplast transit peptides:structure,function,and evolution.Trends CellBio.10:440–447。叶绿体转运肽的序列相似性在来自不同植物物种的同源蛋白之间有显著差异。叶绿体转运肽之间的差异大小出乎人们的预料，因为比较加工成熟的功能蛋白时，从不同植物物种获得的同源蛋白通常具有相对高水平的序列相似度。
设计、产生并在植物内测试了新的人造叶绿体转运肽序列。新的人造叶绿体转运肽显示具有高效的转位和加工性能，用于将农艺学上重要的蛋白转运到叶绿体中。首先，通过ChloroPTM计算机程序分析来自不同植物物种的天然5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)蛋白序列，以鉴定推定的叶绿体转运肽序列(Emanuelsson O,Nielsen H,vonHeijne G,(1999)ChloroP,a neural network-based method for predictingchloroplast transit peptides and their cleavage sites,Protein Science 8；978-984)，该程序可以在http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/获得。利用叶绿体转运肽序列比对，通过随机选择氨基酸设计新的人造叶绿体转运肽来生成新的合成推定的叶绿体转运肽序列。新设计的人造叶绿体转运肽的示例性序列为TraP23(SEQ ID NO:11)。对该嵌合叶绿体转运肽通过多种包括瞬时植物内表达系统的测定法进行测试，还通过转基因手段，将其作为包含与农艺学上重要的转基因序列融合的基因表达元件的稳定转化事件加以测试。
实施例2：人造叶绿体转运肽(TraP)序列的瞬时植物内测试(Transient InPlanta Testing)
烟草瞬时测定：
首先通过瞬时植物内测定对Trap23人造叶绿体转运肽序列进行了测试。合成了编码Trap23v2(SEQ ID NO：12)人造叶绿体转运肽序列的多核苷酸序列。所得的构建体含有两个植物转录单元(PTU)。第一个PTU包括拟南芥泛素10启动子(AtUbi10启动子；Callis,etal.,(1990)J.Biol.Chem.,265:12486-12493)、TraP-绿色荧光蛋白融合基因(TraP-GFP；美国专利号7,678,893)、和根癌土壤杆菌ORF 23的3'非翻译区(AtuORF23 3′UTR；美国专利号5,428,147)。第二个PTU包括木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV promoter；Verdaguer etal.,(1996)Plant Molecular Biology,31:1129-1139)、dsm-2(DSM2；美国专利申请号2011/0107455)和根癌土壤杆菌ORF 1 3′非翻译区域(AtuORF1 3′UTR；Huang et al.,(1990)J.Bacteriol.,172:1814-1822)。构建体pDAB107640包含TraP23v2叶绿体转运肽(图3)。通过限制酶消化和测序验证了该构建体。最后，将构建体转化到根癌土壤杆菌中，并作为甘油储液存储。
从土壤杆菌甘油储液将一满接种环的冷冻培养物接种到含有2ml YPD(100μg/ml壮观霉素)的14ml无菌管中。将接种后的培养基在28℃温育过夜，同时以200rpm震荡。翌日，将大约100μl培养物接种在含有25mlYPD(100μg/ml壮观霉素)的125ml无菌三隔挡板烧瓶(tri-baffled flask)中，并在28℃下温育过夜，同时以200rpm振荡。第二天，用无菌的ddH2O(pH 8.0)将培养物稀释至OD600为0.5。将稀释的土壤杆菌菌株以1:1的比例与含有P19辅助蛋白的第二土壤杆菌菌株混合。使用该培养物通过下列文献中所述的方法浸润烟草叶片：Voinnet O,Rivas S,Mestre P,and Baulcombe D.,(2003)An enhanced transientexpression system in plants based on suppression of gene silencing by thep19protein of tomato bushy stunt virus,The Plant Journal,33:949-956。将经过浸润的烟草植株置于ConvironTM组件中，在16小时光照、24℃下放置至少三天，直到测定。
显微观察结果
从植物切下经土壤杆菌浸润的烟草叶片，并置于含有水的培养皿(petri-dish)中防止脱水。通过蓝光激发，使用装配好长通滤光片(long-pass filter glasses)的DarkReader Hand LampTM(Clare Chemical Research Co.；Dolores,CO)并使用对经过浸润的烟草叶片进行观察，以鉴定成功表达GFP报告蛋白的叶片的未损伤区域。将具体鉴定的叶片区域从叶片切下，并置于水中，通过共聚焦显微镜(Leica TCS-SP5AOBSTM；Buffalo Grove,IL)成像。YFP报告蛋白使用多谱线氩离子激光器用514nm激光谱线激发。使用一个无表达的(暗)对照叶片样品调节检测狭缝(slit)的宽度，以排除背景叶自发荧光。同时在另一个通道内收集叶绿素自发荧光，用于与确定叶绿体定位用的荧光报告蛋白的信号进行直接比较。
显微成像结果表明包含TraP23叶绿体转运肽的GFP荧光蛋白质没有在位于烟草细胞的叶绿体中积累可检测量的GFP蛋白质(图4)。
蛋白质印迹结果：
通过Western印迹对经过浸润的烟草植物样品进行测定。收集叶冲孔(leafpunches)样品并进行球珠研磨。将大约100-200mg叶材料与2BBs(Daisy；Rogers,AR)和500ml PBST在KlecoTM珠磨机中混合3分钟。然后将样品在离心机中4℃下以14,000x g离心沉降。移出上清液，直接通过Western印迹进行分析，或者进行免疫沉淀。免疫沉淀使用Pierce Direct IP KitTM(Thermo Scientific；Rockford,IL)并按照制造商的方案进行。大约50μg抗-GFP被结合在树脂上。样品与树脂在4℃温育过夜。接着，次日早晨对样品进行清洗和洗脱，并通过与等体积的2X 8M尿素样品缓冲液混合后煮沸样品5分钟准备用于分析的样品。将煮沸过的样品在MOPS缓冲液中的4-12％SDS-Bis Tris凝胶上运行40分钟。然后，使用Invitrogen iBlotTM(Life Technologies；Carlsbad,CA)按照制造商的方案对凝胶进行印迹。印迹过的膜用PBS-吐温溶液中的5％脱脂奶粉封闭10分钟。用PBS-吐温溶液中5％的脱脂奶粉以1:1000稀释第一抗体(兔单克隆抗-GFP)，并用该第一抗体探测膜1小时。接着，用PBS-吐温将膜漂洗三次，每次5分钟，以除去所有未结合的第一抗体。用1:1000稀释的第二单克隆山羊抗兔抗体(Life Technologies)探测膜60分钟。如前所述地清洗膜，并通过添加Themo BCIP/NBT底物进行显影。让比色底物显影5-10分钟，然后用水漂洗印迹，再令印迹干燥。
Western印迹结果表明GFP蛋白质在经浸润的烟草细胞中表达。pDAB107640浸润的烟草植物叶组织表达GFP蛋白，表现在存在一个与GFP抗体反应的条带，且其大小与由不含叶绿体转运肽的GFP对照所得到的GFP蛋白条带相当。此外，这些结果表明TraP人造叶绿体转运肽被加工且从GFP蛋白质被切割下来。TraP23-GFP构建体表达一个被预加工的蛋白条带，其分子量大于对照GFP蛋白。Western印迹上存在大小与对照GFP等同的条带表明TraP23叶绿体转运肽序列被加工，从而将GFP的大小减少至与GFP对照等同的分子量大小。
玉米原生质体瞬时测定：
将Trap23v2叶绿体转运肽编码多核苷酸序列(SEQ ID NO：12)克隆在绿色荧光蛋白基因的上游，并且纳入到pDAB106598构建体中(图5)，用于通过玉米原生质体瞬时植物内测定法进行测试。所得的构建体含有下列植物转录单元(PTU)。第一个PTU包括玉米泛素1启动子(ZmUbi1启动子；Christensen,A.,Sharrock R.,and Quail P.,(1992)Maizepolyubiquitin genes:structure,thermal perturbation of expression andtranscript splicing,and promoter activity following transfer to protoplastsby electroporation,Plant Molecular Biology,18:675-689)，TraP-绿色荧光蛋白融合基因(TraP23-GFP；美国专利7,678,893)，和玉米过氧化物酶53'非翻译区(ZmPer53'UTR；美国专利No.6384207)。该构建体通过限制酶消化和测序得到了确认。
对玉米栽培种B104的种子在含有2～3滴吐温20的50％Clorox(3％次氯酸钠)中剧烈震荡大约20分钟进行表面灭菌。将种子用无菌蒸馏水彻底漂洗。将无菌的种子点种在放有1/2MS培养基的Phytatrays或相似类型的盒子中，并让它们在黑暗中(28℃)中生长12至20天。使用玉米原生质体瞬时测定法获得并转染来自B104-玉米叶片的原生质体。这种玉米原生质体测定法是下列文献所述系统的修改版本：Yoo,S.-D.,Cho,Y.-H.,and Sheen,J.,(2007),Arabidopsis Mesophyll Protoplasts:A Versitile Cell System forTransient Gene Expression Analysis,Nature Protocols,2:1565-1572。溶液的制备如Yoo et.al.(2007)所述，只是用于下述实验的甘露醇浓度改为0.6M。
100-500μl原生质体(1-5x105)的转染通过在室温下将原生质体加入到含有约40μg质粒DNA(pDAB106598)的2ml微量离心管中来完成。DNA的体积优选地保持为原生质体体积的约10％。在5分钟的温育期间偶尔对原生质体和DNA进行混合。将等体积的PEG溶液缓慢加入到原生质体和DNA中，每次加2滴，在各次加PEG溶液之间的间隔进行混合。将试管再温育约10分钟，并偶尔轻轻混合。接着，加入1ml W5+溶液，并颠倒试管数次混匀。将管在4℃下75x g离心5分钟。最后除去上清液，并将沉淀物重悬浮于1ml WI溶液中，并将原生质体放置在小培养皿(35x 10mm)中或放置于6孔多孔平板中，并在室温下黑暗温育过夜。温育12小时后，通过显微镜观察GFP荧光。使用前述的显微镜条件进行成像。
显微镜成像的结果表明，包含TraP23人造叶绿体转运肽的GFP荧光蛋白积累在玉米细胞细胞质中的叶绿体内，相比之下，对照GFP荧光蛋白不转位到玉米细胞细胞质叶绿体内(图6)。这些显微镜成像结果提示，GFP蛋白转位到叶绿体内是由于TraP23人造叶绿体转运肽造成的。
实施例3:用于在拟南芥(Arabidopsis)中表达农艺上重要的转基因的人造叶绿体转运肽(TraP)序列
大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)中的一个单氨基酸突变(G96A)会导致草甘膦不敏感性(Padgette et al.,(1991)；Eschenburg et al.,(2002)；Priestman et al.,(2005)；Haghani et al.,(2008))。尽管该突变会赋予对草甘膦的耐受性，但是它已知也会不利地影响EPSP合酶与其天然底物——磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的结合。由此造成的底物结合效率的改变可能会使得突变酶不适合于在植物内提供对草甘膦的耐受性。
在计算机上对NCBI GenBank数据库筛选在EPSP合酶的与该酶的大肠杆菌版本中引入的G96A突变类似的位置上天然含有丙氨酸的EPSP合酶蛋白和多核苷酸序列(Padgetteet al.,(1991)；Eschenburg et al.,(2002)；Priestman et al.,(2005)；Haghani etal.,(2008))。
一种被鉴定为在该位置含有天然丙氨酸的酶是来自斯维链霉菌(Streptomycessviceus)ATCC29083的DGT-28(GENBANK登录号NO:ZP_06917240.1)。进一步的计算机数据挖掘显示了3个另外的与DGT-28具有更大同源性的独特链霉菌酶：DGT-31(GENBANK ACC NO:YP_004922608.1)；DGT-32(GENBANK ACC NO:ZP_04696613)；和DGT-33(GENBANK ACC NO:NC_010572)。这些酶中的每一个都在EPSP合酶的与该酶的大肠杆菌形式中引入的G96A突变类似的位置上含有一个天然的丙氨酸。
因为来自不同生物体的EPSP合酶蛋白具有不同的长度，所以对大肠杆菌版本的EPSP合酶的突变编号不一定与对来自其它生物体的EPSP合酶的突变编号相对应。这些鉴定的EPSP合酶先前并未就其草甘膦耐受性或PEP底物亲和力接受过表征。而且，这些EPSP合酶代表了一类新的EPSP合酶，且它们不含有任何已经被用于表征先前描述的I类(在美国专利No.RE39247中进一步描述的植物来源序列)、II类(在美国专利No.RE39247中进一步描述的细菌来源序列)、和III类(在国际专利申请WO 2006/110586中进一步描述的细菌来源序列)EPSP合酶的序列基序。
对新型DGT-28,DGT-31,DGT-32和DGT-33酶的草甘膦耐受性和PEP底物亲和性进行了表征，并与I类EPSP合酶进行了比较。使用如下的I类酶进行比较：来自大豆的DGT-1，来自欧洲油菜的DGT-3(GENBANK登录号NO:P17688)，和来自普通小麦的DGT-7(GENBANK登录号NO:EU977181)。合成并评估了I类EPSP合酶及其突变变体。在植物EPSP合酶中导入的一个突变是与该酶的大肠杆菌版本中的G96A突变的相似位置处导入的甘氨酸向丙氨酸的突变。此外，在如Funke et al.,(2009)所述的大肠杆菌EPSP合酶的氨基酸97(T变为I)和氨基酸101(P变为S)的相似位置处，在这些I类EPSP合酶中引入了苏氨酸向异亮氨酸和脯氨酸向丝氨酸的突变。
DGT-28、DGT-31、DGT-32和DGT-33：
新设计的、双子叶植物优化的dgt-28v5多核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。新设计的、单子叶植物优化的dgt-28v6多核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；该序列被稍作修饰，在第二位氨基酸处包括丙氨酸，以便引入限制性酶切位点。所得的DNA序列具有更高度的密码子多样性、理想的碱基组成，包含有策略地布置的限制性酶识别位点，且缺少可能干扰基因转录或产物mRNA翻译的序列。
包含SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15且含有额外的序列如6-框终止(添加至编码序列3’端的、位于所有六个阅读框中的终止密码子)和克隆用5′限制性位点的DNA片段的合成由供应商(DNA2.0,Menlo Park,CA)进行。然后将该合成核酸分子克隆进入表达载体，并转化进入植物或细菌中，如下文实施例所述。
用类似的密码子优化策略来设计dgt-1、dgt-3v2(G173A)、dgt-3v3(G173A；P178S)、dgt-3v4(T174I；P178S)、dgt-7v4(T168I；P172S)、dgt-32v3、dgt-33v3和dgt-31v3。这些基因的密码子优化的版本分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示。
植物双元载体构建。用标准克隆方法构建入门载体(entry vector)，其含有叶绿体转运肽多核苷酸序列与dgt-28连接在一起而形成的合框融合物。将与dgt-28融合的转运肽(TraP)的入门载体用In-FusionTM Advantage Technology(Clontech,Mountain View,CA)进行装配。作为融合的结果，第一个氨基酸，甲硫氨酸，被从dgt-28去除。分别通过DNA2.0(Menlo Park,CA)合成编码转运肽的多核苷酸序列TraP4v2(SEQ ID NO:24)、TraP5v2(SEQ ID NO:25)、TraP8v2(SEQ ID NO:26)、TraP9v2(SEQ ID NO:27)、TraP12v2(SEQ ID NO:28)和TraP13v2(SEQ ID NO:29)，并融合于dgt-28的到唯一的AccI限制性核酸内切酶识别位点为止(含)的5’端片段。
含有各种TraP和dgt-28表达盒的双元质粒由拟南芥泛素10启动子(AtUbi10v2；Callis,et al.,(1990)J.Biol.Chem.,265:12486-12493)驱动，并且侧翼是根癌土壤杆菌开放阅读框23的3’非翻译区(AtuORF233′UTR v1；U.S.Pat.No.5,428,147)。
使用技术(Invitrogen,Carlsbad,CA)构建组装的TraP和dgt-28表达盒，并通过土壤杆菌介导的植物转化将其转化进植物中。限制性核酸内切酶从New EnglandBioLabs(NEB；Ipswich,MA)获得，并使用T4DNA连接酶(Invitrogen)进行DNA连接。使用 LR酶混合物(Invitrogen)实施Gateway反应，以将一个入门载体组装到单一目标载体中，该目标载体含有一个选择标志物盒：木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV v2；Verdaguer et al.,(1996)Plant Mol.Biol.,31:1129-1139)-DSM-2(美国专利申请No.2007/086813)-根癌土壤杆菌开放阅读框1的3’非翻译区(AtuORF1 3′UTR v6；Huang et al.,(1990)J.Bacteriol.172:1814-1822)。使用质粒试剂盒(Macherey-Nagel Inc.,Bethlehem,PA)或质粒Midi试剂盒(Qiagen)按照供应商的指导进行质粒制备。琼脂糖Tris-乙酸凝胶电泳后，使用QIAquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离DNA片段。
所有组装质粒的集落首先通过微量制备DNA的限制性消化进行筛选。将选定的集落的质粒DNA由商业测序公司(EurofinsTM MWG Operon,Huntsville,AL)进行测序。使用SequencherTM软件(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)对序列数据进行组装和分析。
下列双元构建体表达多种TraP:dgt-28融合基因序列：pDAB107527含有TraP4v2:dgt-28v5(SEQ ID NO:30)；pDAB105530含有TraP5v2:dgt-28v5(SEQ ID NO:31)；pDAB105531含有TraP8v2:dgt-28v5(SEQ ID NO:32)；pDAB105532含有TraP9v2:dgt-28v5(SEQ ID NO:33)；pDAB105533含有TraP12v2:dgt-28v5(SEQ ID NO:34)；和pDAB105534含有TraP13v2:dgt-28v5(SEQ ID NO:35)。pDAB105534的dgt-28v5序列经过修饰，其中将第一密码子(GCA)变成(GCT)。
额外的植物双元载体构建。类似于上文所述的克隆策略用来构建含有dgt-31、dgt-32、dgt-33、dgt-1、dgt-3和dgt-7的双元质粒。
微生物衍生的基因：将dgt-31、dgt-32和dgt-33与不同于之前所述的叶绿体转运肽融合。使用下列叶绿体转运肽：TraP14v2(SEQ ID NO:36)、TraP23v2(SEQ ID NO:37)、TraP24v2(SEQ ID NO:38)。pDAB107532含有融合于TraP14 v2(SEQ ID NO:39)的dgt-32v，pDAB107534含有融合于TraP24 v2(SEQ ID NO:40)的dgt-33 v3，pDAB107533含有融合于TraP23 v2(SEQ ID NO:41)的dgt-31 v3。dgt表达盒由拟南芥泛素10启动子(AtUbi10启动子v2)驱动并且其侧翼为根癌土壤杆菌开放阅读框23的3′未翻译区域(AtuORF233′UTRv1)。该双元载体中还存在一个含有木薯脉花叶病毒启动子(CsVMVv2)–DSM-2–根癌土壤杆菌开放阅读框1的3′未翻译区域(AtuORF1 3′UTRv6)的DSM-2选择标志物盒。
构建额外的双元载体，其中dgt-31 v3、dgt-32 v3和dgt-33 v3融合于前文所述的叶绿体转运肽序列。例如，TraP8 v2序列融合于dgt-31 v3、dgt-32 v3和dgt-33 v3，并克隆进入上述的双元载体中。
构建含有I类基因(dgt-1、dgt-3和dgt-7)的双元载体。构建下列双元载体并转化至植物中：pDAB4104，其含有美国专利申请公开No.2011/0124503中描述的dgt-1 v4序列，侧翼为美国专利申请公开No.2009/0064376中描述的Nicotiana tabacum Osmotin序列；pDAB102715；pDAB102716；pDAB102717；和pDAB102785。未将用来与dgt-28、dgt-31、dgt-32和dgt-33融合的各种TraP叶绿体转运肽添加至I类基因，因为这些植物衍生的序列具有天然的植物叶绿体转运肽。这些载体详细描述于表1中。
表1含I类EPSP合酶基因(即dgt-1、dgt-3或dgt-7)的双元载体的描述。
拟南芥转化用Clough和Bent(1998)所述的花序浸渍(floral dip)法转化拟南芥。使用含有上述双元质粒其中之一的选定土壤杆菌菌落接种一个或多个100mL含有壮观霉素(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEP肉汤预培养物。将培养物在28℃并以225rpm恒定搅拌，温育过夜。在室温下通过大约5000xg 10分钟离心沉淀细胞，并弃去所得上清液。将细胞沉淀物轻柔重悬在含有5％(w/v)蔗糖、10μg/L 6-苄基氨基嘌呤和0.04％SilwetTML-77的400mL浸渍培养基(dunking media)中。大约1个月大的植物被浸渍在培养基中5-10分钟，并轻轻搅拌。将植物侧向放倒，用透明或不透明的塑料袋覆盖2-3小时，然后直立放置。使植物在22℃，16小时光照/8小时黑暗的光周期中生长。浸渍后大约4周，采收种子。
被转化植物的筛选新鲜采收的T1种子(含有dgt和DSM-2表达盒)在室温干燥7天。将T1种子播种在26.5x 51-cm发芽托盘(germination tray)中，每个盘中装入200mg等份的层积(stratified)T1种子(～10,000个种子)，这些种子预先已混悬于40mL 0.1％琼脂糖溶液中并在4℃保存2天，以完成休眠要求并确保种子同步萌发。
将Sunshine Mix LP5用细蛭石覆盖，并用Hoagland溶液从地下灌溉至湿润，然后通过重力排水。用移液器将每个40mL等份的层积种子均匀播种在蛭石上，并用保湿盖(humidity dome)覆盖4-5天。除去保湿盖1天后，利用草胺膦萌发后喷洒进行初始转化体筛选(筛选共转化的DSM-2基因)。
在种植后7天(DAP)和11DAP，使用DeVilbiss压缩空气喷嘴用0.2％Liberty除草剂溶液(200g ai/L草胺膦,Bayer Crop Sciences,Kansas City,MO)喷洒T1植物(分别为子叶期和2-4叶期)，喷洒体积为10mL/盘(703L/ha)，每个施用提供280g ai/ha有效比率的草胺膦。在最终喷洒4-7天后鉴定存活者(活跃生长的植物)，并单独移植到用盆栽培养基(MetroMix 360)准备的3英寸(7.6cm)盆(pot)中。移植的植物在温室中培养(22±5℃,50±30％RH,14h光照:10黑暗,最低500μE/m2s1自然光+辅助光)。对存活的T1植株进行分子确认分析，以确认草甘膦耐受基因已经被稳定整合到植物的基因组中。
分子确证确证了dgt-28和DSM-2转基因在以pDAB107527、pDAB105530、pDAB105531、pDAB105532、pDAB105533或pDAB105534转化的拟南芥基因组植物中的存在。这些多核苷酸序列的存在是通过水解探针测定、基因表达盒PCR(也称为植物转录单元PCR--PTU PCR)、Southern印迹分析和定量反向转录PCR分析确证的。
首先通过一种与TAQMANTM类似的水解探针测定对T1拟南芥植物进行筛选，确认DSM-2和dgt-28转基因的存在。通过基因表达盒PCR对事件进行筛选，以确定dgt表达盒是否完全整合到植物基因组中而没有重排。使用从这些研究所得的数据确定转基因拷贝数，并甄别选定的拟南芥事件，用于自花授粉和产生T2代。对产生的T2代拟南芥植物，也通过水解探针测定进行筛选，以确认植物染色体内DSM-2和dgt基因的存在并估计拷贝数。最后，使用Southern印迹分析对T1拟南芥植物中的一个子集确认估算的拷贝数。
使用类似的测定确证了来自以pDAB4104转化的植物的dgt-1转基因的存在、来自以pDAB107532转化的植物的dgt-32转基因的存在、来自以pDAB107534转化的植物的dgt-33转基因的存在、来自以pDAB107533转化的植物的dgt-31转基因的存在、来自以pDAB102715转化的植物的dgt-3转基因的存在、来自以pDAB102716转化的植物的dgt-3转基因的存在、来自以pDAB102717转化的植物的dgt-3转基因的存在和来自以pDAB102785转化的植物的dgt-7转基因的存在。
水解探针测定.使用下文所述的水解探针测定确定T1和T2拟南芥植物中的拷贝数。鉴定了具有不同数目的转基因的植物，并进行随后的草甘膦耐受性研究。
将组织样品收集到96孔平板中，并冻干2天。用KLECOTM组织粉碎机和钨珠(tungsten bead)(Environ Metal INC.,Sweet Home,Oregon)进行组织浸解(tissuemaceration)。组织浸解后，使用BiosprintTM96植物试剂盒(QiagenTM,Germantown,MD)根据制造商建议的方案以高通量格式分离基因组DNA。借助QUANT-ITTM PICO GREEN DNA测定试剂盒(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)对基因组DNA进行定量。将经过定量的基因组DNA用BIOROBOT3000TM自动液体操作仪(Qiagen,Germantown,MD)调整到大约2ng/μL，用于水解探针测定。通过水解探针测定法确定转基因拷贝数的过程应用实时定量PCR来实现，实时定量PCR使用480系统(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)。为DSM-2,dgt-28和内参基因TAFII15(Genbank ID:NC 003075；Duarteet al.,(201)BMC Evol.Biol.,10:61)设计了测定法。
为了扩增，准备1X终浓度的480Probe Master Mix(RocheApplied Science)，其在10μL体积的多重反应体系中含有每种DSM-2和dgt-28引物各0.1μM、每种TAFII15引物各0.4μM、和0.2μM每种探针。表2。实施两步扩增反应，60℃延伸40秒，同时进行荧光捕获。运行所有样品，并且对每个样品的分析使用平均循环阈值(Ct)值。使用LightCyclerTM软件1.5发布版进行实时定量PCR数据的分析，该分析使用相对定量模块(relative quant module)，并且基于ΔΔCt方法。为此，每个运行中包含一个来自单拷贝校准品(calibrator)和已知的2拷贝检验标准(check)的基因组DNA样品。确定了T1和T2转基因拟南芥植物的水解探针筛选的拷贝数结果。
表2.DSM-2、dgt-28和内部参考基因(TAFII15)的水解探针测定的引物和探针信息。
通过Southern印迹分析确认dgt-28的整合使用Southern印迹分析证实了插入的T-链DNA片段的整合模式并鉴定含有dgt-28的事件。得到了展示拟南芥基因组中转基因插入物的整合和完整性的数据。使用Southern印迹数据鉴定了T-链DNA的一个完整拷贝的简单整合。使用一个PCR扩增的、特异针对dgt-28基因表达盒的探针进行了详细的Southern印迹分析。该探针与用特定限制性内切酶消化过的基因组DNA的杂交鉴定了具有特定分子量的基因组DNA片段，利用这些片段的模式鉴定全长、单插入的T1转基因事件，以便用于产生下一代。
将组织样品收集于2mL锥形管中(EppendorfTM)并冷冻干燥2天。用KLECKOTM组织粉碎机和钨珠进行组织浸解。组织浸解后，用CTAB分离程序分离基因组DNA。基因组DNA进一步用QiagenTM Genomic Tips试剂盒进行纯化。通过Quant-ITTM Pico Green DNA测定试剂盒(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)对基因组DNA进行定量。将经过定量的基因组DNA调整到4μg以达到浓度一致。
对于每个样品，用限制酶SwaI(New England Biolabs,Beverley,MA)完全消化4μg基因组DNA，并在25℃温育过夜，然后向反应中添加NsiI，并在37℃温育6小时。用QuickPrecipitation SolutionTM(Edge Biosystems,Gaithersburg,MD)根据制造商建议的规程，通过沉淀来浓缩经过消化的DNA。然后于65℃下将基因组DNA重悬于25μL水中1小时。将重悬的样品加载到在1X TAE中制备的0.8％琼脂糖凝胶上，并在1X TAE缓冲液中以1.1V/cm电泳过夜。将凝胶依次进行变性(0.2M NaOH/0.6M NaCl)30分钟，和中和(0.5M Tris-HCl(pH7.5)/1.5M NaCl)30分钟。
使用色谱纸捻(wick)和纸巾将20X SSC缓冲液通过凝胶过夜被动吸取(wicking)到经过处理的IMMOBILONTM NY+转移膜(Millipore,Billerica,MA)，以将DNA片段转移到尼龙膜上。转移后，将膜用2X SSC短暂地清洗，与STRATALINKERTM1800(Stratagene,LaJolla,CA)交联，并在80℃真空烘烤3小时。
使用Model 400杂交培养箱(Robbins Scientific,Sunnyvale,CA)，在玻璃滚瓶中将印迹与预杂交液(Perfect Hyb plus,Sigma,St.Louis,MO)一起65℃温育1小时。从含有完整编码序列的PCR片段制备探针。使用QIAEXTM II凝胶提取试剂盒纯化PCR扩增子，并借助Random RT Prime ITTM标记试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)用α32P-dCTP对PCR扩增子进行标记。将变性探针直接添加到预杂交液中至大约200万计数每个印迹每mL，与印迹一起在65℃杂交过夜。杂交后，在65℃用0.1XSSC/0.1％SDS继续清洗印迹40分钟。最后，将印迹暴露于储磷光体成像屏，并利用Molecular Dynamics Storm860TM成像系统成像。
使用在本研究中完成的Southern印迹分析确定拷贝数，并确认含有dgt-28转基因的选定事件位于拟南芥的基因组中。
通过PCR分析确证dgt-28基因表达盒通过端点(end point)PCR反应检测在T1植物事件中所含的dgt-28基因表达盒的存在。使用特异针对dgt-28基因表达盒的AtUbi10启动子v2和AtuORF233′UTR v1区的引物(表3)进行检测。
表3.用于dgt-28基因表达盒确证的寡核苷酸引物
引物名称 序列
正向寡核苷酸(SEQ ID NO:50) 5′CTGCAGGTCAACGGATCAGGATAT 3′
正向寡核苷酸(SEQ ID NO:51) 5′TGGGCTGAATTGAAGACATGCTCC 3′
PCR反应需要一个标准的3步PCR循环规程来扩增基因表达盒。所有PCR反应均使用下述的PCR条件完成：94℃ 3分钟，接着35个循环的94℃30秒，60℃ 30秒，和72℃ 3分钟。该反应用EX-TAQTM PCR试剂盒(TaKaRa Biotechnology Inc.Otsu,Shiga,Japan)按照制造商的说明完成。最后一个循环之后，将反应在72℃温育10分钟。使用TAE琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增子的大小。具有预期大小的PCR扩增子的存在，表明在转基因拟南芥事件的基因组中全长基因表达盒的存在。
通过定量反转录PCR分析确认dgt-28相对转录将dgt-28转基因植物的组织样品收集在96孔平板中，并冷冻于80℃。用KLECOTM组织粉碎机和钨珠(Environ Metal INC.,SweetHome,Oregon)进行组织浸解。组织浸解后，使用QiagenTM Rneasy 96试剂盒(QiagenTM,Germantown,MD)根据制造商建议的方案以高通量格式分离总RNA，该方案包括任选的柱上DNA酶I处理。随后对洗脱的总RNA进行额外的DNA酶I(AmbionTM,Austin,TX)处理。使用总RNA作为模板并用High Capacity cDNA Reverse TranscriptionTM试剂盒(AppliedBiosystems,Austin,TX)按照制造商建议的方案，同时添加寡核苷酸TVN，进行cDNA合成。表达的定量用水解探针测定来实施，且使用480系统(Roche AppliedScience,Indianapolis,IN)通过实时定量PCR来进行。使用探针设计软件2.0，为dgt-28和内参基因“未知蛋白”(GenBank登录号：AT4G24610)设计了测定法。为了扩增，以1X终浓度准备480Probe Master Mix(Roche AppliedScience)，其在10μL体积的单重反应体系中含有每种引物各0.4μM和每种探针各0.2μM。表4。
表4.用于dgt-28定量反转录PCR分析的PCR引物。
引物名称 序列
AT26410LP(SEQ ID NO:52) 5′cgtccacaaagctgaatgtg 3′
AT26410RP(SEQ ID NO:53) 5′cgaagtcatggaagccactt3′
UPL146 Cat#04694325001(Roche,Indianapolis,IN)
DGT28F(SEQ ID NO:54) 5′CTTCAAGGAGATTTGGGATTTGT3′
DGT28R(SEQ ID NO:55) 5′GAGGGTCGGCATCGTAT 3′
UPL154探针 Cat#04694406001(Roche,Indianapolis,IN)
实施两步扩增反应，60℃延伸40秒，并进行荧光捕获。所有样品运行3个重复，使用平均循环阈值(Ct)值分析每个样品。每个样品运行负逆转录反应(minus reversetranscription)，以确保不存在gDNA污染。基于ΔΔCt方法分析实时定量PCR数据分析。利用该测定确定了dgt-28在转基因拟南芥事件(确定为半合和纯合)中的相对表达。dgt-28mRNA的相对转录水平比内部对照高2.5-207.5倍。这些数据表明，dgt-28转基因植物含有功能性dgt-28基因表达盒，并且植物能够转录dgt-28转基因。
Western印迹分析在从转基因拟南芥植物获得的叶片样品中检测DGT-28。将来自dgt-28转基因植物的植物提取物和DGT-28蛋白标准品用含有DTT的 LDS样品缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)在90℃温育10分钟，并在丙烯酰胺预制胶中电泳分离。然后，使用制造商的方案将蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上。用封闭混合物(Invitrogen)封闭后，先后用抗-DGT-28抗血清和山羊抗兔磷酸酶检测DGT-28蛋白。通过化学发光底物BCIP/NBT Western分析试剂(KPL,Gaithersburg,MD)将被检测的蛋白可视化。Western印迹产生完整DGT-28蛋白，表明接受测定的dgt-28转基因植物表达了DGT-28蛋白。
用不同比率的草甘膦喷洒含有dgt-28转基因的转基因T1拟南芥植物。在本研究中采用高比率确定相对抗性水平(105,420,1,680或3,360g ae/ha)。典型的会控制未转化拟南芥的1X草甘膦使用比率是420g ae/ha。用校准为187L/ha的轨道式喷洒器对T1植物施用添加有硫酸铵的草甘膦配制剂。本研究中使用的各T1拟南芥植物在dgt-28转基因的拷贝数上有变化。将低拷贝dgt-28T1拟南芥植物自花授粉，并用于产生T2植物。表5显示了具有草甘膦除草剂抗性基因的dgt-28转基因植物与dgt-1和野生型对照的比较。表6显示了具有草甘膦除草剂抗性基因的dgt-32和dgt-33与dgt-1和野生型对照的比较。表7显示了新型细菌EPSP合酶与I类EPSP合酶及对照在1,680gae/ha草甘膦比率下的比较。
转化有dgt-28的拟南芥植物的草甘膦选择结果首先使用草胺膦筛选方案从非转化种子的背景中选出拟南芥T1转化体。对每种T1构建体分析3个浅箱或30,000个种子。对上面选出的T1植物进行分子表征，随后将不同拷贝数的代表性植物转移到单独的盆中，并用如前所述的不同比率的商业草甘膦喷洒。以处理2周后(WAT)的％目测损伤为单位表示这些植物的响应。下面的表中提供的数据显示了展示很少或没有损伤(<20％)、中等损伤(20～40％)或严重损伤(>40％)的植株个体数。为每种用于拟南芥转化的构建体提供了算术平均和标准差。还在最后一列中针对每种比率和转化示出了个体响应的范围。野生型，非转化的拟南芥(哥伦比亚栽培种)，用作草甘膦敏感性对照。
植物的响应水平存在差异。该变差可能是由于以下的事实，即每株植物代表一个独立的转化事件，因此感兴趣的基因的拷贝数在每个植物之间有不同。我们注意到，一些含有转基因的植物对草甘膦不耐受；关于确定这些植物是否表达转基因的彻底分析尚未完成。很可能是，T1拟南芥植物中存在的高拷贝数转基因会导致转基因沉默或者表观遗传效应，结果导致虽然存在dgt-28转基因，但仍对草甘膦敏感。
表7呈现了草甘膦在1,680g ae/ha的比率的按比率别的总群体损伤平均，显示在以dgt-3、dgt-7、dgt-28、dgt-32和dgt-33对dgt-1和野生型对照转化的植物之间存在显著差异。
由新的细菌EPSP合酶提供的耐受性随着具体的酶而不同。DGT-28、DGT-32和DGT-33出人意料地提供了对草甘膦显著的耐受性。dgt基因可以为具有所有测试转运肽中任意一种的单个T1拟南芥植物赋予除草剂抗性。因此，使用额外的叶绿体转运肽(即TraP8-dgt-32或TraP8-dgt-33)可以提供对草甘膦的保护，在给定的处理中具有与报道相似的损伤水平。
表5.与dgt-1(T4)纯合抗性群体和非转化对照相比，dgt-28转化的T1拟南芥对萌发后一定范围比率施用的草甘膦的响应。施用后14天的可见％损伤。
表6.与dgt-1(T4)纯合抗性群体和非转化对照相比，dgt-32和dgt-33转化的T1拟南芥对萌发后一定范围比率施用的草甘膦的响应。施用后14天的可见％损伤。
表7.与dgt-1(T4)纯合抗性群体和非转化对照相比，dgt-28、dgt-32、dgt-33、dgt-3和dgt-7转化的T1拟南芥对萌发后以1,680g ae/ha施用的草甘膦的响应。施用后14天的可见％损伤。
dgt-28作为选择标志物使用如上所述的拟南芥转化植物测试dgt-28作为草甘膦筛选剂的选择标志物。将大约50个T4代拟南芥种子(对dgt-28是纯合的)掺杂(spikedinto)到大约5,000个野生型(对草甘膦敏感)种子中。萌发种子，并用筛选剂量的草甘膦喷洒幼苗。比较数个草甘膦处理；对每盘(tray)植物在如下的处理方案之一中的1个或2个时间应用草甘膦：7DAP(种植后天数)、11DAP、或7DAP后11DAP。因为所有植物还含有一个置于同一转化载体内的草胺膦抗性基因，用草甘膦选出的含dgt-28的植物可以与用草胺膦选出的含DSM-2或pat的植物直接进行比较。
如前所述地用DeVilbissTM喷头施用草胺膦处理。在17DAP，含有dgt-28的转基因植物被鉴定为“抗性”或“敏感性”。种植后7和11天(DAP)施用26.25-1680g ae/ha草甘膦处理，显示可以有效筛选含有dgt-28的转基因拟南芥植物。计数敏感性和抗性植物，发现草甘膦抗性植物的数目与所种植的含有dgt-28转基因的转基因种子的原始数目相关。这些结果表明，dgt-28可以有效地用针对经转化的拟南芥群体的一种替代的筛选标志物。
可遗传性将已确认的T1转基因拟南芥事件自花授粉，产生T2种子。通过向100颗随机的T2同胞(sibling)施用含有草胺膦(200g ae/ha)的IgniteTM除草剂，对这些种子的同胞进行测试。在施用喷洒(用履带式喷洒器以187L/ha比率施用)之前，将每个单独的T2植物移植到7.5-cm方盆中。通过卡方分析(P>0.05)确定了按照孟德尔遗传以预期对于显性遗传单座位的3耐受性:1敏感性模式分离的T1家族(T2植物)。表8示出了以预期孟德尔遗传分离的T1家族的百分比，证明dgt-28性状是通过孟德尔遗传传递给T2代的。从5-15个T2个体收集种子(T3种子)。如前所述地对来自3-4个随机选择T2家族中每一个的25个T3同胞进行后代测试。数据显示没有分离，因此证明dgt-28和dgt-3被稳定整合在染色体内，并以孟德尔方式遗传至少3代。
表8.在100株植物的后代试验中作为单个孟德尔遗传分离的T1家族(T2植物)的百分比。
感兴趣的基因 在1个座位分离的测试T1家族(％)
dgt-3v2 64％
dgt-3v3 60％
dgt-3v4 80％
dgt-7v4 63％
TraP5v2–dgt-28v5 100％
TraP8v2–dgt-28v5 100％
TraP9v2–dgt-28v5 100％
TraP12v2–dgt-28v5 50％
TraP13v2–dgt-28v5 75％
yfp转基因对照植物 100％
T2拟南芥数据对含有低拷贝数dgt-28转基因的所选T1拟南芥事件的第二代植物(T2)进行进一步的草甘膦耐受性表征。草甘膦的施用如前所述。用处理2周后(WAT)的％目测损伤表示植物响应。数据用展示很少或没有损伤(<20％)、中等损伤(20-40％)或严重损伤(>40％)的个体数的柱状图表示。为每个用于拟南芥转化的构建体提供了算术平均和标准差。还在最后一列中针对每种比率和转化示出了个体响应的范围。野生型，非转化的拟南芥(哥伦比亚栽培种)，用作草甘膦敏感性对照。在T2代中，可以获得半合子和纯合子植物用于测试每个事件，因此每个草甘膦测试比率都包括了这些植物。半合子植物在一个座位含有两个不同的等位基因，相比之下，纯合子植物在一个座位含有两个相同的等位基因。由于半合子和纯合子植物相比在基因剂量上的差异，导致T2代中预期存在对草甘膦响应的差异性。对草甘膦响应的差异性用标准差和响应范围表示。
在T2代中，对单拷贝和多拷贝dgt-28事件均表征其草甘膦耐受性。在一个事件内，各单拷贝植物显示相似的草甘膦耐受性。表9提供了单拷贝T2事件的特征数据。含有与TraP5 v2连锁的dgt-28的事件与含有其它TraP转运肽的dgt-28构建体相比，没有提供对草甘膦的强抗性。然而，与非转化的哥伦比亚对照相比，dgt-28 TraP5构建体确实提供了低水平的草甘膦耐受性。有的情况下，显示含有2个或多个拷贝的dgt-28的事件对高比率的草甘膦更加敏感(数据未显示)。这种对草甘膦敏感性的增加与先前关于对同样含有高拷贝数dgt-28转基因的T1植物的描述数据相似。这可能是由于，拟南芥植物中存在的高拷贝数转基因会导致转基因沉默或者表观遗传效应，结果导致虽然存在dgt-28转基因，但仍对草甘膦敏感。
这些事件含有与TraP5 v2(pDAB105530)、TraP12 v2(pDAB105533)和TraP13 v2(pDAB105534)连锁的dgt-28。
除了dgt-28之外，以dgt-3转化的T2拟南芥事件呈现在表10中。如同对表9中的dgt-28事件所描述的，该数据表含有作为各构建体对草甘膦的响应的特点的代表性事件。为了表征dgt-3，将含有dgt-3基因被AtUbi10启动子驱动的单个PTU(植物转化单元)的构建体(pDAB102716和pDAB102715)与带有相同基因且该基因的2个PTU的构建体(pDAB102719,pDAB102718)进行比较。含有2个PTU的构建体使用AtUbi10启动子驱动该基因的一个拷贝，以CsVMV启动子驱动另一拷贝。使用两个PTU是为了比较dgt-3转基因植物与含有两个拷贝转基因的dgt-28转基因植物。数据证明，仅含有一个单PTU的单拷贝T2dgt-3事件比所测试的单拷贝dgt-28事件对草甘膦更敏感，但是比非转化对照更耐受。含有dgt-3基因的2个PTU的T1家族比1个PTU的构建体提供了更高水平的目测草甘膦耐受性。在两种情况下，T1家族均与dgt-1和野生型对照进行比较。T2数据证明，dgt-28作为单拷贝事件提供了强耐受性。
表9.含有dgt-28的所选单个T2拟南芥事件对以不同比率萌发后施用的草甘膦的响应，与dgt-1(T4)纯合抗性群体和非转化对照比较。施用后14天的目测％损伤。
表10.选定的以dgt-3转化的T2拟南芥事件对萌发后以不同比率施用的草甘膦的响应。施用后14天的可见％损伤。
T3拟南芥数据对含有低拷贝数dgt-28转基因的所选T2拟南芥事件的第三代植物(T3)进行进一步的草甘膦耐受性表征。如前文所述以草胺膦从每个品系选择了25株植物，并且来自每个被测试的构建体的品系对于选择标志物基因没有发生分离。如前文所述施用草甘膦。用处理2周后(WAT)的％目测损伤为单位表示植物响应。数据用展示很少或没有损伤(<20％)、中等损伤(20-40％)或严重损伤(>40％)的个体的柱状图表示。为每个用于拟南芥转化的构建体提供了算术平均和标准差。还在最后一列中针对每种比率和转化示出了个体响应的范围。野生型，非转化的拟南芥(哥伦比亚栽培种)，用作草甘膦敏感性对照。
表11.与dgt-1(T4)纯合抗性群体和非转化对照相比，选定的含有dgt-28的单个T3拟南芥事件对萌发后以不同比率施用的草甘膦的响应。施用后14天的可见％损伤。
转化植物的选择。新收获的T1种子[dgt-31、dgt-32和dgt-33v1基因]于室温干燥并运输至印第安纳波利斯用于测试。将T1种子播种在26.5x 51-cm的发芽盘(T.O.PlasticsInc.,Clearwater,MN)中，每个盘接收200mg等份的层积的T1种子(～10,000个种子)，种子已预先悬浮于40mL的0.1％琼脂溶液中并储存于4℃下2天以完成休眠要求和确保同步种子发芽。
将Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture Inc.,Bellevue,WA)用细蛭石覆盖，并用Hoagland溶液从地下灌溉至湿润，然后通过重力排水。用移液器将每个40mL等份的层积种子均匀播种在蛭石上，并用保湿盖(KORDTMProducts,Bramalea,Ontario,Canada)覆盖4-5天。一旦植物萌发即除去保湿盖，然后用草胺膦萌发后喷洒进行初始转化体筛选(筛选共转化的dsm-2基因)。
在种植后6天(DAP)和10DAP，使用DeVilbiss压缩空气喷嘴用0.1％IgniteTM除草剂溶液(280g ai/L草胺膦,Bayer Crop Sciences,Kansas City,MO)喷洒T1植物(分别为子叶期和2-4叶期)，喷洒体积为10mL/盘(703L/ha)，提供每次施用200g ae/ha有效比率的草胺膦。在最终喷洒4-7天后鉴定存活者(植物生长活跃者)。将存活的植物单独移植到用盆栽培养基(Metro Mix360TM)准备的3英寸(7.6cm)盆(pot)中。在组织采样用于拷贝数分析之前，植物在温室中培养至少1天。
对T1植物采样，并完成对dgt-31,dgt-32,和dgt-33v1基因的拷贝数分析。然后，对T1植物分配至各种比率的草甘膦，使得每个比率均涵盖一定范围的拷贝。对于拟南芥，26.25g ae/ha草甘膦是用于区分敏感性植物与具有有意义抗性水平的植物的有效剂量。施用更高的比率，用于确定相对抗性水平(105,420,1680,或3360g ae/ha)。表13显示了关于dgt-1的比较
所有草甘膦除草剂施用均用履带式喷洒器以187L/ha喷洒体积完成。所用草甘膦是商业Durango二甲胺盐制剂(480g ae/L,Dow AgroSciences,LLC)。对显示草胺膦或草甘膦耐受性的低拷贝T1植物进一步在T2代中进行评估。
第一个拟南芥转化使用dgt-31、dgt-32和dgt-33v1进行。首先使用草胺膦选择方案从未转化种子背景中选择出T1转化株。对每种T1构建体分析三个浅箱或30,000颗种子。计算转化频率且将T1dgt-31、dgt-32和dgt-33构建体的结果列在表12中。
表12.T1dgt-31,dgt-32和dgt-33拟南芥构建体的转化频率，用草胺膦选择选择标志物基因DSM-2。
构建体 盒 转化频率(％)
pDAB107532 AtUbi10/TraP14dgt-32v1 0.47
pDAB107533 AtUbi10/TraP23dgt-31v1 0.36
pDAB107534 AtUbi10/TraP24dgt-33v1 0.68
随后将上面选出的T1植物移植到单独的盆中，并用各种比率的商业草甘膦喷洒。表13比较了为拟南芥T1转化体赋予草甘膦抗性的dgt-31,dgt-32,和dgt-33v1和对照基因的响应。植物响应用2WAT的％目测损伤为单位表示。数据用展示很少或没有损伤(<20％)、中等损伤(20-40％)或严重损伤(>40％)的个体的柱状图表示。为每个用于拟南芥转化的构建体提供了算术平均和标准差。还在最后一列中针对每种比率和转化示出了个体响应的范围。野生型非转化的拟南芥(哥伦比亚栽培种)用作草甘膦敏感性对照。与阴性对照相比，具有转运肽TraP23的DGT-31(v1)基因为各个T1拟南芥植物引入的除草剂耐受性微弱，但在具有转运肽TraP8的情况下，该基因显示改善的耐性。DGT-32和DGT-33与Trap8及与其各自不同的叶绿体转运肽(分别为TraP14和TraP24)均展示了对所测试比率的草甘膦的强耐受性。在给定的处理中，植物的响应水平变化很大，这可能是由于以下的事实，即每株植物代表一个独立的转化事件，因此感兴趣的基因的拷贝数在每个植物之间有不同。尤其需要注意的是，在所测试的每个草甘膦比率下，均存在比其它个体更加耐受的个体。表13提供的按比率别的总群体损伤平均值证明，用dgt-31,dgt-32,和dgt-33v1转化的植物与dgt-1v1或野生型对照相比均存在显著差异。
表13.dgt-31,dgt-32和dgt-33v1转化T1拟南芥对萌发后以一定范围施用的草甘膦的响应，与dgt-1(T4)纯合抗性群体和非转化对照比较。施用后14天的目测％损伤。
玉米转化使用如上所述的标准克隆方法构建用于根癌土壤杆菌介导的玉米转化的双元载体。表14列出了被构建用于玉米转化的载体。在包含dgt-28的载体中使用如下的基因元件：使用玉米泛素1启动子(ZmUbi1；美国专利No.5,510,474)驱动dgt-28编码序列，该编码序列侧翼是玉米脂肪酶3’非翻译区(ZmLip 3′UTR；美国专利No.7179902)，选择标志物盒的组成为被用于驱动aad-1编码序列(美国专利No.7,838,733)的玉米泛素1启动子，该编码序列侧翼是玉米脂肪酶3’非翻译区。aad-1编码序列赋予对苯氧基生长素除草剂，例如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，和对芳基氧基苯氧基丙酸(AOPP)类除草剂的耐受性。
dgt-28构建体构建为标准双元载体和根癌土壤杆菌超双元系统载体(JapanTobacco,Tokyo,JP)。标准双元载体包括：pDAB107663、pDAB107664、pDAB107665和pDAB107665。土壤杆菌超双元系统载体包括pDAB108384、pDAB108385、pDAB108386和pDAB108387。
完成了其它的构建体，它们含有黄色荧光蛋白(yfp；美国专利申请2007/0298412)报告基因。pDAB109812含有一个yfp报告基因盒，其由玉米泛素1启动子驱动，侧翼为玉米per 53′非翻译区(Zm per53′UTR；美国专利No.7179902)，该选择标志物盒的组成为用于驱动aad-1表达的甘蔗杆状病毒启动子(SCBV；美国专利No.5,994,123)，其侧翼是玉米脂肪酶3’非翻译区。pDAB101556含有一个yfp盒，其由玉米泛素1启动子驱动，侧翼为玉米per 53′非翻译区，选择标志物盒的组成为用于驱动aad-1表达的玉米泛素1启动子，其侧翼是玉米脂肪酶3’非翻译区。pDAB107698含有：一个dgt-28盒，其由玉米泛素1启动子驱动，侧翼为玉米脂肪酶3′非翻译区；一个yfp盒，其由玉米泛素1启动子驱动，侧翼为玉米per 53′非翻译区；选择标志物盒包括用于驱动aad-1表达的甘蔗杆状病毒启动子，其侧翼是玉米脂肪酶3’非翻译区。所有这三个构建体均是标准的双元载体。
表14.玉米转化载体
穗灭菌和胚分离为了获得玉米的未成熟胚，在温室中生长玉米近交系B104的植株，并自花授粉或同胞授粉(sib-pollinated)产生穗。在授粉后大约9-12天采集穗。在实验当天，对穗进行表面灭菌，方法是在20％次氯酸钠(5％)溶液中浸泡穗，并震荡20-30分钟，随后在无菌水中漂洗3次。灭菌后，从每个穗无菌切出未成熟的合子胚(1.5–2.4mm)，并随机分配到含有液体感染培养基(LS基础培养基,4.43gm/L；N6维生素溶液[1000X],1.00mL/L；L-脯氨酸,700.0mg/L；蔗糖,68.5gm/L；D(+)葡萄糖,36.0gm/L；10mg/ml 2,4-D,150μL/L)的微离心管中。对于给定系列的实验，使用从3个穗汇集的胚用于每个转化。
土壤杆菌培养启动：
将含有上述双元转化载体的土壤杆菌甘油储在含有合适抗生素的AB基本培养基平板上划线，在20℃生长3-4天。挑取单个菌落并在含有相同抗生素的YEP平板上划线，并在28℃温育1-2天。
土壤杆菌培养物和共培养。从YEP平板获取土壤杆菌菌落，悬浮在置于50mL一次性管中的10mL感染培养基中，使用分光光度计将细胞密度调整到OD600nm为0.2-0.4。将土壤杆菌培养物置于旋转摇床上，室温125rpm振荡，同时进行胚解剖。从无菌玉米谷粒分离大小为1.5-2.4mm的未成熟合子胚，并置于在1mL感染培养基中，用相同培养基清洗1次。将土壤杆菌悬液(2mL)加入到每个管中，将管置于振荡器平台上10-15分钟。将胚转移到共培养培养基(MS盐，4.33gm/L，L-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L，酪蛋白酶促水解物100.0mg/L，30mM麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，30.030.0gm/L；GelzanTM,3.00gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L，8.5mg/mlAgNO3，15.0mg/L；DMSO，100μM)，调整方向使盾片朝上，并在25℃温育3天，24小时光照，50μmole m-2sec-1光强。
愈伤组织选择和推定事件再生共培养周期后，将胚转移到没有选择剂的恢复培养基(resting media)(MS盐，4.33gm/L；-脯氨酸，700.0mg/L；1,2,3,5/4,6-六羟基环己烷，100mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸),游离酸]0.500gm/L；酪蛋白水解酶100.0mg/L；30mM的麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，30.0gm/L；Gelzan 2.30gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)，并在25℃ 24小时光照，50μmole m-2sec-1光强下温育3天。
生长抑制剂量响应实验提示，0.25mM和更高的草甘膦浓度足以抑制非转化B104玉米品系的细胞生长。将胚转移到含有0.5mM草甘膦的选择1培养基(MS盐，4.33gm/L；-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉)-乙磺酸),游离酸]0.500gm/L；酪蛋白酶水解物100.0mg/L；30mM的麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，30.0gm/L；GelzanTM2.30gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)，并在28℃温育7-14天，黑暗和/或24小时光照，50μmole m-2sec-1光强。
将增殖性胚愈伤组织转移到含有1.0mM草甘膦的选择2培养基(MS盐，4.33gm/L；1,2,3,5/4,6-六羟基环己烷，100mg/L；-脯氨酸，700.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸),游离酸]0.500gm/L；酪蛋白酶水解物100.0mg/L；30mM麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，30.0gm/L；GelzanTM2.30gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L；R-吡氟氯禾灵酸(R-Haloxyfop acid)，0.1810mg/L)，并在28℃，黑暗和/或24小时光照，50μmole m-2sec-1光强下温育14天。这一选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。愈伤组织选择周期持续3-4周。
将增殖性胚愈伤组织转移到含有0.5mM草甘膦的PreReg培养基(MS盐，4.33gm/L；1,2,3,5/4,6-六羟基环己烷，100mg/L；-脯氨酸，350.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉)-乙磺酸),游离酸]0.250gm/L；酪蛋白酶水解物50.0mg/L；NAA-NaOH 0.500mg/L；ABA-EtOH 2.50mg/L；BA 1.00mg/L；蔗糖，45.0gm/L；GelzanTM2.50gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/mlAgNO3，1.00mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)，并在28℃，24小时光照，50μmole m- 2sec-1光强下温育7天。
将具有抽芽状芽(shoot-like bud)的胚愈伤组织转移到含有0.5mM草甘膦的再生培养基(MS盐，4.33gm/L；1,2,3,5/4,6-六羟基环己烷，100mg/L；蔗糖，60.0gm/L；GellanGum G434TM3.00gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；羧苄青霉素，125.0mg/L)，并在24小时光照，50μmole m-2sec-1光强培养7天。
将具有初生根的小抽芽转移到含有生根培养基(MS盐，4.33gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；1,2,3,5/4,6-六羟基环己烷，100mg/L；蔗糖，60.0gm/L；Gellan GumG434TM3.00gm/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)的植物托盘(phytotray)中，并在27℃，16/8小时光照/黑暗，140-190μmole m-2sec-1光强下温育7天。对推定的转基因植物小苗进行分析，使用上述方案评估转基因拷贝数，并转移到土壤中。
分子确认玉米植物中存在dgt-28和aad-1转基因通过水解探针测定确认存在dgt-28和aad-1多核苷酸序列。通过类似于TAQMANTM的水解探针测定对分离的T0玉米植株进行初始筛选，以确认dgt-28和aad-1转基因的存在。使用这些研究产生的数据确定转基因拷贝数，并用于选择用于回交和进行到T1代的转基因玉米事件。
将组织样品收集在96孔板中，用KLECOTM组织粉碎机和不锈钢珠(HooverPrecision Products,Cumming,GA)在QiagenTMRLT缓冲液中进行组织浸解(tissuemaceration)。组织浸解后，使用BiosprintTM96植物试剂盒(QiagenTM,Germantown,MD)根据制造商建议的方案以高通量模式分离基因组DNA。通过Quant-ITTMPico Green DNA测定试剂盒(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)对基因组DNA进行定量。用BIOROBOT3000TM自动移液器(Qiagen,Germantown,MD)将定量的基因组DNA调整到大约2ng/μL，用于水解探针测定。类似于TAQMANTM的水解探针测定通过实时定量PCR来实施，使用480系统(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)，用以确定转基因拷贝数。使用探针设计软件2.0为aad-1,dgt-28和内参基因转换酶(Genbank登录号No:U16123.1)设计了测定。为了扩增，制备1X终浓度的480Probe Master Mix(Roche Applied Science)，多重反应物体积为10μL，含有0.4μM的每种aad-1和dgt-28引物和0.2μM的每种探针(表15)。
进行两步扩增反应，60℃延伸40秒，并进行荧光获取。运行所有样品，并使用平均循环阈值(Ct)数值分析每个样品。使用LightCyclerTM软件发布版1.5使用相对定量模块，并根据ΔΔCt方法，进行实时定量PCR数据的分析。对照在每个运行中包含一个来自单拷贝校准品(calibrator)和已知的2拷贝检验标准(check)的基因组DNA样品。表16列出了水解探针测定的结果。
表15.用于aad-1、dgt-28和内参(转化酶)的水解探针测定的引物和探针序列。
表16.dgt-28事件的T0拷贝量结果。低拷贝事件由1-2个转基因拷贝构成，单拷贝数目列于括号中。高拷贝事件含有3个或更多个转基因拷贝
用于转化的质粒 低拷贝事件(单个拷贝)的# 高拷贝事件的#
pDAB107663 43(31) 10
pDAB107664 30(24) 5
pDAB107665 40(27) 10
pDAB107666 24(12) 12
pDAB109812 2(1) 0
pDAB101556 25(15) 10
pDAB107698 3(1) 2
dgt-28转化玉米中的除草剂耐受性。使玉米dgt-28转化事件(T0)在温室中驯化，并生长至植物从组织培养转向温室生长条件(即，从轮生体(whorl)生出2-3片新的外观正常的叶片)。植物在27℃，16小时光照:8小时黑暗条件的温室中生长。然后，用Durango DMATM商业制剂(含有除草剂草甘膦)并添加2％w/v硫酸铵对植物进行处理。除草剂施用用履带式喷洒器以187L/ha喷洒体积，50-cm喷洒高度进行。用280-4480g ae/ha草甘膦的草甘膦范围对T0植物进行喷洒，其能够对非转化玉米品系造成显著损伤。致死剂量的定义为导致B104近交系>95％损伤的比率。
T0dgt-28玉米植物的结果表明，实现了对高达4480g ae/ha比率的草甘膦的耐受性。在T0代中使用了一种特定培养基类型。与非转化对照相比，转化植物的极小生长停滞(stunting)和整体植物生长表明，当与TraP5,TraP8,和TraP23叶绿体转运肽连锁时，dgt-28提供了对草甘膦的强耐受性。
将所选T0植物自交和回交，以进一步在下一代中进行表征。用140-1120g ae/ha草胺膦或105-1680g ae/ha草甘膦喷洒100个含有T1植物的选定dgt-28品系。选择标志物和草甘膦抗性基因被构建在同一质粒上。因此，如果通过用除草剂喷洒选出一个除草剂抗性基因，则认为这两个基因同时存在。在14DAT，对抗性和敏感植物进行计数，用于确定通过卡法分析确定作为单个座位分离并具有显性孟德尔性状(3R:1S)的品系的百分比。这些数据证明，dgt-28作为一种强草甘膦抗性基因在单子叶物种中是可遗传的。向T1或F1存活者施用更高比率的草甘膦，以进一步表征由dgt-28基因提供的耐受性和保护。
dgt-28转化的T0玉米中的萌发后除草剂抗性通过土壤杆菌转化产生与TraP4,TraP5,TraP8和TraP23连锁的dgt-28的T0事件，并在可控生长室条件下驯化，直至从轮生体(whorl)生出2-4片新的外观正常的叶片。给植物单独指定鉴定编号，并采样用于进行dgt-28和aad-1拷贝数分析。根据拷贝数分析，选出植物用于蛋白表达分析。将植物移植到含有新生长培养基的更大的盆中，在27℃，16小时光照:8小时黑暗的温室条件下生长。然后用Durango DMATM商业制剂(草甘膦)并添加2％w/v硫酸铵对没有采样用于蛋白表达的剩余植物进行处理。处理的分布使得每组植物含有具有不同拷贝数的T0事件。除草剂施用使用履带式喷洒器以187L/ha喷洒体积，50-cm喷洒高度执行。用280-4480g ae/ha草甘膦的草甘膦范围对T0植物进行喷洒，该范围能够对非转化玉米品系造成显著损伤。致死剂量的定义为导致B104近交系>95％损伤的比率。B104是转化体的遗传背景。
T0dgt-28玉米植物的结果表明，实现了对高达4480g ae/ha比率的草甘膦的耐受性。表17。与非转化对照相比，转化植物的极小生长停滞(stunting)和整体植物生长表明，当与TraP5,TraP8,和TraP23连锁时，dgt-28提供了对草甘膦的强耐受性。
表17.处理14天后，不同拷贝数的T0dgt-28事件对280-4480g ae/ha范围的草甘膦施用比率+2.0％w/v硫酸铵的响应。
通过标准ELISA进行的蛋白表达分析证明，所测试构建体之间的平均DGT-28蛋白范围是12.6-22.5ng/cm2。
确认F1代在温室条件下的草甘膦耐受性将没有喷药的单拷贝T0植物与非转化背景B104回交，用于在下一代中进行进一步的表征。在T1代中评估草甘膦耐受性以确认dgt-28基因的遗传。对于T1植物，在V1生长期施用除草剂ASSURE IITM(35g ae/ha喹禾灵-甲酯(quizalofop-methyl))以选出AAD-1蛋白。选择标志物和草甘膦抗性基因构建在同一质粒上。因此，如果选出一个基因，则认为两个基因同时存在。7DAT后，对抗性和敏感性植物进行计数，并从群体中除去空(null)植物。这些数据证明，dgt-28(v1)作为一种强草甘膦抗性基因在单子叶物种中是可遗传的。将植物采样，用于通过标准ELISA和RNA转录本水平表征DGT-28蛋白。如前所述地用560-4480g ae/ha草甘膦喷洒抗性植物。数据表明，与叶绿体转运肽TraP4,TraP5,TraP8和TraP23连锁的dgt-28对高达4480g ae/ha草甘膦具有强耐受性。表18.
表18.处理14天后F1单个拷贝dgt-28事件对560-4480g ae/ha范围的草甘膦的施用比率+2.0％w/v硫酸铵的响应。
蛋白表达数据证明，在所测试的T1事件和构建体中，DGT-28蛋白的平均范围是42.2-88.2ng/cm2，由此证明了T1代中的蛋白表达。
田间条件下的dgt-28玉米的表征将单拷贝T1事件送至田间地点，以产生杂交半合子和近交纯合子种子用于进一步的表征。杂交种子的产生是通过将玉米转化系B104的T1事件与近交系4XP811杂交，产生对该事件而言以1:1(半合子:空)分离的杂交群体。将所得种子运送到2个不同的地点。按照完全随机区组设计(randomized complete block design)，在每个地点为每个构建体种植总共5个单拷贝事件，设置3个重复。田地设计为用于在V4生长期施用草甘膦，而单独一组植物在V8生长期施用。4XP811/B104常规杂交体用作阴性对照。
实验行用184g ae/ha ASSURE IITM(106g ai/L喹禾灵-甲酯(quizalofop-methyl))处理，以消除空分离体。所有实验入选对象(entries)相对于ASSURE IITM施用以1:1(敏感:抗性)分离(p＝0.05)。从每个事件的所选抗性植物采样，用于通过标准ELISA定量DGT-28蛋白。
喹禾灵-甲酯(quizalofop-methyl)抗性植物在V4或V8生长期用商业除草剂DURANGO DMATM(480g ae/L草甘膦)加2.5％w/v硫酸铵进行处理。除草剂施用使用喷管式喷洒器(boom sprayer)实施，其被校准以输送187L/ha的体积，50-cm喷洒高度。用1120-4480gae/ha草甘膦的草甘膦范围喷洒植物，该范围能够对非转化玉米品系造成显著损伤。致死剂量的定义为导致4XP811近交系>95％损伤的比率。目测损伤评估表示为在7、14和21DAT(处理后天数)的目测失绿百分比、坏死百分比、生长抑制百分比和总目测损伤。评估与每个品系的未处理检验标准和阴性对照进行比较。
所有评估时机的目测损伤数据证明，在两个地点和两种施用时机下，对高达4480gae/ha DURANGO DMATM具有强耐受性。提供了来自一个地点的V4施用的代表性事件，它们与其它事件、施用时限和地点一致。表19。一个来自含有与TraP23连锁的dgt-28的构建体(pDAB107665)的事件对用于AAD-1蛋白的ASSURE IITM选择耐受，但是对所有施用比率的草甘膦敏感。
表19.以1120-4480g ae/ha的草甘膦范围+2.5％w/v硫酸铵在V4生长阶段施用的dgt-28事件的响应。
在生殖生长期对4480g ae/ha草甘膦比率进行了额外评估。对于所有构建体、施用时机和地点，抽穗、授粉时间和穗充满的目测评估均与每个品系的未处理检验标准(check)相似。DGT-28蛋白的定量结果证明，蛋白表达的平均范围是186.4-303.0ng/cm2。数据证明，dgt-28转化玉米在田间条件下在整个生殖生长期对高达4480g ae/ha的草甘膦具有强耐受性。数据还证明了基于喷洒耐受性结果的DGT-28蛋白检测和功能。
确认dgt-28玉米在纯合状态下的遗传性和耐受性如前所述地将来自T1S2的种子在温室条件下种植。对在田间条件下表征过的相同的5个单拷贝品系在纯合状态下进行了表征。植物生长至V3生长期，并分成3个草甘膦比率，范围是1120-4480g ae/ha草甘膦(Durango DMATM)，每个处理4个重复。施用用履带式喷洒器如前所述地进行，并在2.0％w/v硫酸铵中配制。施用硫酸铵作为每个品系的未处理检验标准。如前所述地在处理后7和14天进行目测评估。数据证明，所有测试事件对高达4480g ae/ha草甘膦具有强耐受性。表20。
表20.以1120-4480g ae/ha范围的草甘膦+2.0％w/v硫酸铵施用的纯合dgt-28事件的响应
来自在田间条件下不耐受的pDAB107665的品系未展现对草甘膦的耐受，因此与田间观察结果一致(数据未显示)。除了先前提到的一个品系之外，其它品系的所有用草甘膦处理的重复均对草甘膦不敏感。因此，数据证明了dgt-28玉米的纯合群体以孟德尔方式的遗传性。通过标准ELISA确定的DGT-28蛋白的表达证明，在对草甘膦耐受的单拷贝事件中，蛋白表达的平均范围是27.5-65.8ng/cm2。证据证明了DGT-28蛋白是功能性蛋白并且在世代之间稳定。
使用草甘膦作为选择标志物的萌发后除草剂耐受性如前所述，从组织培养物中除去T0转化植物，并在温室内驯化。所测的事件含有与TraP5,TraP8,和TraP23叶绿体转运肽连锁的dgt-28。结果显示，这些T0植物提供了高达4480g ae/ha草甘膦的强耐受性，而未转化植物受到低至280g ae/ha草甘膦浓度的控制。这些数据证明，在使用范围为280-4480gae/ha的草甘膦浓度的条件下，dgt-28能够用作选择标志物。
将若干来自含有dgt-28转基因的玉米固定品系的种子掺杂到(spiked into)若干非转化玉米种子中。种植种子并使之生长至V1-V3发育期，此时用280-4480g ae/ha范围的选择剂量的草甘膦喷洒幼苗。7-10天后，对敏感性和耐受性植株进行计数，草甘膦耐受植株的量与所种植的含有dgt-28转基因的转基因种子的原始数目相关。
dgt-28玉米的叠加(stacking)为研究目的，使用AAD-1蛋白作为dgt-28转基因玉米中的选择标志物。aad-1也可以在玉米中用作除草剂耐受性性状，为作物提供强2,4-D耐受性，直至V8施用。对来自构建体pDAB107663(TraP4::dgt-28),pDAB107664(TraP8::dgt-28)和pDAB107666(TraP5::dgt-28)的4个事件表征其对草甘膦和2,4-D桶混合施用的耐受性。表征研究用F1种子在温室条件下完成。用履带式喷洒器以如下的比率如前所述地实施施用：1120-2240g ae/ha草甘膦(对dgt-28基因选择),1120-2240g ae/ha 2,4-D(对aad-1基因选择)，或两种处于所述比率的除草剂的桶混合物。在7和14DAT对植物进行打分。表21显示了以2240g ae/ha施用除草剂的喷洒结果。
表21.以2240g ae/ha的2,4-D,草甘膦和两种除草剂的桶混合组合喷洒的F1aad-1和dgt-28玉米在处理后14天的响应
结果确认，dgt-28能够成功地与aad-1叠加，从而增加可用于感兴趣的作物的除草剂谱(草甘膦+苯氧乙酸类，分别用于dgt-28和aad-1)。在存在难以控制的阔叶杂草或抗性杂草生物型的作物生产中，该叠加可用作杂草控制和保护感兴趣的作物的手段。在玉米和其它植物中，其他的输入或输出性状也可以和dgt-28基因叠加。
大豆转化通过土壤杆菌介导的大豆子叶节外植体(cotyledonary node explant)转化产生了含有稳定整合dgt-28转基因的转基因大豆(Glycine max)。使用携带含有功能性dgt-28的双元载体的卸甲土壤杆菌菌株起始转化。
土壤杆菌介导的转化用Zeng et al.(Zeng P.,Vadnais D.A.,Zhang Z.,PolaccoJ.C.,(2004),Plant Cell Rep.,22(7):478482)的改良半子叶节程序实施。简而言之，将大豆种子(Maverick栽培种)在基本培养基上萌发，分离子叶节，并用土壤杆菌转染。抽芽起始、抽芽延伸和生根培养基补充有头孢噻肟、特美汀和万古霉素以除去土壤杆菌。通过除草剂进行选择，抑制非转化抽芽生长。将经过选择的抽芽转移到生根培养基用于根发育，然后转移到土壤混合物中，使幼苗驯化。
所选幼苗的顶生小叶(terminal leaflet)用除草剂局部处理(叶喷涂技术(leafpaint technique)，以筛选出推定的转化体。将筛选到的幼苗转移至温室，驯化，然后用除草剂叶片喷涂以确认耐受性。从这些推定的转化T0植物采样，并使用分子分析确认除草剂选择标志物和dgt-28转基因的存在。使T0植物在温室中自花授粉，产生T1种子。
可以使用第二种大豆转化方法产生额外的转基因大豆植物。使用携带含有功能性dgt-28的卸甲土壤杆菌菌株起始转化。
土壤杆菌介导的转化使用下面参考文献的改良半种子程序进行：Paz et al.,(Paz M.,Martinez J.,Kalvig A.,Fonger T.,and Wang K.,(2005)Plant Cell Rep.,25:206-213)。简而言之，将成熟大豆种子用氯气过夜灭菌，并用无菌H2O浸润20小时，然后进行土壤杆菌介导的植物转化。将种子沿种脐纵向对半切开，分开种子并去除种皮。切下胚轴，并从子叶节点除去任何轴向抽芽/芽。所得的半种子外植体用土壤杆菌感染。在抽芽起始、抽芽延伸和生根培养基中补充有头孢噻肟、特美汀和万古霉素以去除土壤杆菌。利用除草剂选择抑制非转化抽芽的生长。将所选抽芽转移到生根培养基中进行根发育，然后转移到土壤混合物中，使幼苗驯化。
所选幼苗的顶生小叶(terminal leaflet)用除草剂局部处理(叶喷涂技术(leafpaint technique)，以筛选推定的转化体。将筛选到的幼苗转移至温室，驯化，然后用除草剂叶片喷涂以确认耐受性。从这些推定的转化T0植物采样，并使用分子分析确认除草剂选择标志物和dgt-28转基因的存在。数个事件被鉴定为含有这些转基因。对这些T0植物进行进一步的分析，并允许在温室中自花授粉，产生T1种子。
dgt-28转化的T1大豆的萌发后除草剂耐受性对于来自通过如前所述的筛选方法被确认为可遗传的T1事件的种子，在温室条件下将其种植在Metro-mix培养基中。当植物生长至第1三小叶(trifoliate)完全展开时，如前所述地用411g ae/ha IgniteTM280SL处理，用于选择pat基因。给来自每个事件的抗性植株提供唯一的标识，并采样用于dgt-28基因的合子型分析。使用合子型数据为每个草甘膦施用比率指定2个半合子和2个纯合子重复，从而在存在足够植物时，每个处理可以有4个重复。这些植物与野生型Petite havana烟草进行比较。所有植物用设定为187L/ha的履带式喷洒器喷洒。对植物喷洒560-4480g ae/ha范围的DurangoTM二甲胺盐(DMA)。所有施用物用水配制，并添加2％w/v硫酸铵(AMS)。植物在处理后7和14天进行评估。给植物评定关于总体目测生长停滞、失绿和坏死的损伤分级。T1代是有分离的，因此可以预期由于合子型的不同存在一些不同的响应。
表22.喷洒结果证明，被表征的每个构建体的至少一个dgt-28事件在14DAT(处理后天数)可对高达4480g ae/ha的草甘膦具有强耐受性。构建体的代表性单拷贝事件与Maverick阴性对照相比，均可提供对高达4480g ae/ha的耐受性。
dgt-28在T2代中对高比率草甘膦的保护对每个构建体的2-5个T2品系进行45株植物后代测试。根据在前一代中完成的合子型分析选择纯合品系。如前所述地种植种子。然后用411g ae/ha IGNITE 280SL喷洒植物，如前所述地对pat选择标志物加以选择。3DAT后，对抗性和敏感性植物进行计数。
对于含有与dgt-28连锁的TraP4的构建体(pDAB107543和pDAB107548)，所测试的12个品系中有9个没有分离，从而确认了T2代中的纯合品系。含有与dgt-28连锁的TraP8的品系(pDAB107545)显示，4个品系中有2个没有分离，并且显示dgt-28在大豆中以孟德尔遗传方式遗传至少2代。从抗性植物获取组织样品，并通过标准ELISA方法对DGT-28蛋白进行定量。数据表明，DGT-28蛋白在无分离的T2测试品系中的平均范围是32.8-107.5ng/cm2。来自构建体pDAB107553(TraP23::dgt-28)的品系先前没有用草胺膦选择过，利用其草甘膦剂量响应测试纯合性和对高比率草甘膦的耐受性。来自构建体pDAB107553的品系的重复样品对560-4480g ae/ha范围的草甘膦比率耐受，因此被确认是一个纯合群体，并可以遗传至少2代。
如前所述地向2-3个三小叶大豆施用比率范围在560-4480g ae/ha草甘膦中变化的DURANGO DMA。14DAT的目测损伤数据确认了在T1中证明的耐受性结果。
表23.数据证明，与非转化对照相比，dgt 28烟草在两代内对高达3360g ae/ha草甘膦具有强耐受性。
用dgt-28转化水稻在示例性转化方法中，通过土壤杆菌介导的无菌水稻种子转化产生了含有稳定整合的dgt-28转基因的转基因水稻(Oryza sativa)。使用携带含有功能性dgt-28的双元载体的卸甲土壤杆菌菌株起始转化。
将培养基用1M KOH调节到pH 5.8，并用2.5g/l植物凝胶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)固化。将胚愈伤组织培养在含有30ml半固体培养基的100x 20mm培养皿中。水稻幼苗在含有50ml培养基的MAGENTA盒中生长。细胞悬浮液保持在含有35mL液体培养基的125ml锥形瓶中，并以125rpm旋转。胚培养物的诱导和维持在25–26℃黑暗中进行，植物再生和全株植物培养在16-h光周期的光照室内进行(Zhang et al.1996)。
胚愈伤组织的诱导和维持在如前所述的改良NB基础培养基(Li et al.1993)中进行，其中该培养基被修改为含有500mg/L谷氨酰胺。悬浮培养在含有用30g/L蔗糖代替麦芽糖的SZ液体培养基(Zhang et al.1998)中启动和保持。渗透性培养基(NBO)由添加了甘露醇和山梨醇各0.256M的NB培养基组成。在补充了合适除草剂筛选剂的NB培养基上对除草剂抗性愈伤组织选择3-4周。预再生(pre-egeneration)在含有NB培养基并添加了,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D),1mg/lα-萘乙酸(NAA),5mg/l脱落酸(ABA)和选择性除草剂的培养基(PRH50)上实施1周。在含有NB培养基和2,4-D,0.5mg/l NAA,和选择性除草剂的再生培养基(RNH50)上培养之后，进行幼苗再生，直至再生出推定的转基因抽芽。将抽芽转移到生根培养基中，其具有半强度的Murashige和Skoog基本盐和Gamborg B5维生素，并补充有1％蔗糖和选择性除草剂。
对水稻粳稻品种Taipei 309的成熟干燥的种子进行灭菌，如Zhang et al.1996所述。通过在NB培养基上黑暗培养无菌成熟水稻种子诱导胚组织。从盾片取出直径大约1mm的初级愈伤组织，并用于在SZ液体培养基中起始细胞悬液。然后如Zhang 1996所述地维持悬液。在先前预培养之后3-5天，从液体培养物取出源自悬液的胚发生组织，并放置在NBO渗透性培养基中，用于在培养皿中形成大约2.5cm直径的圆环，并在轰击之前培养4h。轰击后16-20小时，将组织从NBO培养基转移到NBH50选择培养基中，确保被轰击表面朝上，并在黑暗中温育14-17天。然后将新形成的愈伤组织从原始轰击的外植体分离，并放置在相同培养基上的附近位置。再过8-12天后，目测鉴定相对致密的、不透明的愈伤组织，并转移到PRH50预再生培养基中，在黑暗中7天。然后将生长的愈伤组织，其变得更加致密和不透明，亚培养到RNH50再生培养基中，在16小时光周期下14-21天。将再生的抽芽转移到含有1/2MSH50培养基的MAGENTA盒中。从单个外植体再生的多个植株视为同胞，并作为一个独立的植物品系对待。如果植株在1/2MSH50培养基上产生厚而白的根并且生长旺盛，则将该植物评定为对dgt-28基因呈阳性。一旦幼苗达到的MAGENTA盒的顶部，便将它们转移到6-cm盆的土壤中，在100％湿度下保持1周，然后移到生长室中，在30℃ 14-h光周期和黑暗中21℃的条件下，保持2-3周，然后转移到温室的13-cm盆中。采集种子，并在37℃干燥1周，随后在4℃保存。
dgt-28水稻的T0分析将通过土壤杆菌转化产生的水稻移植转化体移植到培养基中，并在温室条件下驯化。对所有植物进行采样，用于PCR检测dgt-28。结果表明，对pDAB110827(TraP8::dgt-28)有22个PCR阳性事件，对pDAB110828(TraP23::dgt-28)有最少16个PCR阳性事件。PCR阳性事件的dgt-28Southern分析显示，两个构建体均为简单(1-2个拷贝)事件。选出的T0事件的蛋白质表达表明，DGT-28的蛋白质表达从低于检测水平到130ng/cm2不等。用2240g ae/ha Durango DMATM如前所述地对从构建体pDAB110828选出的T0事件进行处理，并在处理后7和14天进行评估。数据证明对所施用比率的草甘膦具有强耐受性。使所有PCR阳性植株产生T1种子，用于进一步的表征。
Dgt-28在水稻中的可遗传性对来自含有叶绿体转运肽TraP8的构建体pDAB110827的4个dgt-28的T1品系进行100株后代测试。将种子种植于填满培养基的盆中。然后如前所述地用560g ae/ha Durango DMATM喷洒所有植物，用于选择dgt-28基因。7DAT后，对抗性和敏感性植株进行计数。通过卡方分析确定，对每个构建体所测试的4个品系中有2个作为单座位、显性孟德尔性状(3R:1S)分离。Dgt-28是一种在多个物种中可遗传的草甘膦抗性基因。
dgt-28转化的T1水稻的萌发后除草剂耐受性为来自用于后代测试的每个事件的T1抗性植株指定唯一的标识，并采样用于dgt-28基因的合子型分析。使用合子型数据为每个草甘膦施用比率指定2个半合子和2个纯合子重复，从而可以为每个处理提供总共4个重复。将这些植物与野生型kitaake水稻进行比较。所有植株用设定为187L/ha的履带式喷洒器喷洒。用560-2240g ae/ha范围的Durango DMATM喷洒植物。所有施用物用水配制，并添加2％w/v硫酸铵(AMS)。在处理后7和14天对植物进行评估。给植物评定关于总体目测生长停滞、失绿和坏死的损伤分级。T1代发生了分离，因此可以预期由于合子型的不同存在某些不同的响应。
喷洒结果表明，在7DAT(处理后天数)，更高比率的草甘膦仅造成微小的植物损伤(数据未显示)。
表24.14DAT的目测损伤数据证明对高达2240g ae/ha的草甘膦，平均目测损伤小于15％。
为来自pDAB110827的所有4个T1测试品系的重复评估DGT-28蛋白检测。数据表明，对于半合子和纯合子重复体，DGT-28蛋白的平均范围分别为20-82ng/cm2和21-209ng/cm2。这些结果表明稳定的蛋白表达传到了T1代，并且dgt-28水稻在经过施用用于选择的560gae/ha草甘膦之后，可对高达2240g ae/ha的草甘膦耐受。
用dgt-28转化烟草用含有dgt-28转基因的根癌土壤杆菌转化烟草(Petit Havana栽培种)叶片。将含有包含dgt-28转基因的质粒的单菌落接种到4mL含有壮观霉素(50μg/mL)和链霉素(125μg/mL)的YEP培养基中，并在28℃、190rpm摇床上过夜温育。随后使用4mL种子培养物接种含有25mL培养基相同的培养物的125mL挡板锥形瓶中。该培养物在28℃温育，190rpm震荡，直至达到OD600～1.2。然后，将10mL土壤杆菌悬浮物置于无菌60x 20mmPetriTM盘中。
从无菌生长于含有30g/L蔗糖的MS培养基(Phytotechnology Labs,ShawneeMission,KS,)的PhytaTraysTM(Sigma,St.Louis,MO)中的植物上新鲜切下叶片(0.5cm2)，并浸泡在10mL土壤杆菌过夜培养物中10分钟，在无菌滤纸上吸干水分，然后置于添加了1mg/L吲哚乙酸和1mg/L 6-苄氨基嘌呤的相同培养基上。3天后，将用携带有dgt-28转基因的土壤杆菌共培养的叶片转移到含有5mg/L BastaTM和250mg/头孢噻肟的相同培养基。
3周后，将各个T0幼苗转移到含有10mg/L BastaTM和250mg/L头孢噻肟的MS培养基中，再经过3周后，转移到土壤中并移至温室。使所选的T0植物(使用上述的分子分析方法进行鉴定)自花授粉，在荚果完全干燥后从其收集种子。对T1苗进行合子型和报告基因表达的筛选(如下文所述)，并鉴定了含有dgt-28转基因的所选植物。
将植物移至温室，操作流程为：从根部洗掉琼脂，移植到13.75cm方盆的土壤中，将盆置于袋(SC Johnson&Son,Inc.)中，在袋子的底部放置自来水，并在30℃温室中置于间接光下1周。3-7天后，打开袋子；给植物施肥，让其在打开的袋子中生长，直至让植物在温室条件下驯化，此时除去袋子。将植物在普通暖温室条件下生长(白天27℃,夜晚24℃,16小时白天,最小自然+辅助光＝1200μE/m2s1)。
繁殖前，从T0植物采样进行DNA分析，通过实时定量PCR确定插入的dgt-28的拷贝数。将新鲜组织置于试管中，并在4℃冻干2天。在组织完全干燥后，在试管中放置钨珠(Valenite)，并用Kelco球磨机对样品干磨1分钟。然后进行标准DNeasyTMDNA分离程序(Qiagen,DNeasy 69109)。然后，用Pico Green(Molecular Probes P7589)对提取的DNA等份进行染色，并在具有已知标准的荧光分光光度计(BioTekTM)中阅读，获得以ng/μl为单位的浓度。使用总共100ng总DNA作为模板。PCR反应在9700GeneampTM热循环仪(AppliedBiosystems)上执行，使样品经历：94℃ 3分钟，35个循环的94℃ 30秒、64℃ 30秒、和72℃1分45秒，随后是72℃ 10分钟。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳，用EtBr染色，对PCR产物进行分析，并通过Southern印迹进行确认。
从3个含有不同叶绿体转运肽序列(TraP4,TraP8和TraP23)的构建体再生5-9个具有1-3个dgt-28基因拷贝的PCR阳性事件，并移至温室中。
对所有PCR阳性植物进行采样，用于通过标准ELISA定量DGT-28蛋白。在所有PCR阳性植物中均检测到了DGT-28蛋白，并且注意到，随着dgt-28拷贝数的增加，蛋白浓度有增加趋势。
烟草中的aad-12(v1)可遗传性对每个构建体的5个dgt-28T1品系进行100株后代测试。构建体含有如下叶绿体转运肽序列之一：TraP4、TraP8或TraP23。将种子层积、播种并移植，与上文举例的拟南芥规程非常相似，只是在移植之前，不通过初始筛选将空植物除去。随后用280g ae/ha Ignite280SL喷洒所有植物，用于如前所述地选择pat选择标志物。3DAT后，对抗性和敏感性植物进行计数。
通过卡方分析确定，所测试的5个品系中的4个对每个构建体作为单座位、显性孟德尔性状分离(3R:1S)。Dgt-28在多个物种中是一种可遗传的草甘膦抗性基因。
dgt-28转化的T1烟草的萌发后除草剂耐受性为来自用于后代测试的每个事件的T1抗性植株指定唯一的标识，并采样用于dgt-28基因的合子型分析。使用合子型数据为每个草甘膦施用比率指定2个半合子和2个纯合子重复，从而可以为每个处理提供总共4个重复。将这些植物与野生型Petite havana烟草进行比较。所有植株用设定为187L/ha的履带式喷洒器喷洒。用560-2240g ae/ha范围的Durango DMATM喷洒植物。所有施用物用水配制，并添加2％w/v硫酸铵(AMS)。在处理后7和14天对植物进行评估。给植物评定关于总体目测生长停滞、失绿和坏死的损伤分级。T1代发生了分离，因此可以预期由于合子型的不同存在某些不同的响应。
喷洒结果表明，在7DAT(处理后天数)，高比率的草甘膦仅造成了微小的植物损伤(数据未显示)。14DAT后，目测损伤数据表明，含TraP4的构建体的单拷贝事件与来自含TraP8和TraP23的构建体的单拷贝事件相比，损伤增加。表25。
表25.在2240g ae/ha草甘膦比率下，含有TraP4的事件的平均损伤为37.5％而含有TraP8和TraP23的事件显示的平均损伤分别为9.3％和9.5％
这些结果表明，dgt-28对高达4480g ae/ha的草甘膦具有耐受性，并且显示了各种与dgt-28基因连锁的叶绿体转运肽序列提供的耐受性的差异。
Dgt-28在T2代中对更高比率草甘膦的保护对每个构建体的2-3个T2品系进行25株植物后代测试。根据在前一代中完成的合子型分析选择纯合品系。如前所述地对种子进行灭菌、播种和移植。然后用280g ae/ha Ignite 280SL喷洒所有植物，如前所述地选择pat选择标志物。3DAT后，对抗性和敏感性植物进行计数。所测试的全部品系对每个构建体均没有分离，从而确认了T2代的纯合品系，并证明dgt-28在烟草中可以孟德尔遗传至少2代。
如前所述地对2-3叶烟草施用比率范围为420-3360g ae/ha草甘膦的DURANGODMATM。14DAT的目测损伤数据确认了在T1代中证明的耐受性结果。来自含有TraP4的构建体的二拷贝品系的叶数据表明，单拷贝的TraP8和TraP23品系具有相似的耐受性(数据未显示)。
表26.来自含有TraP4与dgt-28的构建体的单拷贝系与来自含有TraP8和TraP23与dgt-28的构建体的品系相比，显示损伤增加。
这些结果表明，与非转化对照相比，dgt-28烟草在2代内对高达3360gae/ha的草甘膦具有强耐受性。
在施用草甘膦之前从每个事件的所选植株采样，用于通过标准DGT-28ELISA分析DGT-28蛋白。数据表明，在各构建体中，简单(1-2个拷贝)品系的DGT-28蛋白平均表达量范围是72.8-114.5ng/cm2。该数据表明，dgt-28在T2代转化烟草中表达蛋白，并且耐受性数据确认了有功能的DGT-28蛋白。
在烟草(栽培种Petit Havana)中叠加dgt-28以增加除草剂谱对纯合dgt-28(pDAB107543和pDAB107545)和aad-12 v1(pDAB3278)植物(对于后者，见PCT/US2006/042133，本文援引并入该文献)进行相互杂交，并收集F1种子。对来自每个基因的2次相互杂交的F1种子进行层积，并用1120gae/ha草甘膦(对dgt-28基因具有选择性),1120g ae/ha2,4-D(对aad-12基因具有选择性),或所述比率的两种除草剂的桶混合物，对每个杂交的6个重复实验进行处理。在14DAT对植物进行评级。喷洒结果如表27所示。
表27.F1aad-12和dgt-28的响应
结果确认dgt-28能够与aad-12(v1)成功叠加，从而增加可用于感兴趣的作物的除草剂谱(草甘膦+苯氧乙酸，分别对于dgt-28和aad-12)。在存在难以控制的阔叶杂草或者抗性杂草生物型的作物生产中，叠加可用作杂草控制和感兴趣的作物保护的手段。其他的输入或输出性状也可以和dgt-28基因叠加。
在小麦中对草甘膦的抗性编码DGT-28的双元载体的产生设计含有DGT-28表达盒和PAT选择盒的双元载体，并用本领域公知的手段和技术进行组装。每个DGT-28表达盒包含：启动子，来自玉米泛素(Ubi)基因的5’非翻译区和内含子(Toki et al.,PlantPhysiology 1992,1001503-07)，随后是编码序列，其由与人工版本的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(DGT-28)的5’端融合的4种转运肽(TraP4,TraP8,TraP23或TraP5)之一构成，其经过了密码子优化以便于在植物中表达。DGT-28表达盒以一个3’非翻译区(UTR)终止，该3’UTR包含来自玉米脂肪酶基因(Vp1)的转录终止子和多聚腺苷酸化位点(Paek etal.,Mol.Cells 199830；8(3)336-42)。PAT选择盒包括启动子、来自水稻肌动蛋白(Act1)基因的5’非翻译区、和内含子(McElroy et al.,The Plant Cell 19902(2)163171)，随后是人工版本的从绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)分离的草铵膦乙酰转移酶基因(PAT)，其经过了密码子优化，以便在植物中表达。PAT基因编码一个蛋白质，其赋予对谷氨酰胺合成酶抑制剂(包括草铵膦、草胺膦和双丙氨磷)的抗性(Wohlleben et al.,Gene 1988,70(1),25-37)。该选择盒以3′UTR结尾，该3′UTR包含来自花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因的转录终止子和多聚腺苷酸化位点(Chenault et al.,Plant Physiology1993101(4),1395-1396)。
选择盒由商业基因合成公司(GeneArt,Life Technologies)合成，并克隆到Gateway双元载体中。将DGT-28表达盒亚克隆到pDONR221中。使用所得入门克隆与编码草铵膦乙酰转移酶(PAT)表达盒的Gateway双元载体进行LR Clonase II(Invitrogen,LifeTechnologies)反应。通过使用得自于New England BioLabs(NEB；Ipswich,MA)和Promega(Promega Corporation,WI)的限制性核酸内切酶对经纯化的DNA进行限制性消化，对所有组装质粒的集落进行初始筛选。质粒DNA的制备用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen,Hilden)或Pure Yield Plasmid Maxiprep系统(Promega Corporation,WI)按照制造商的使用说明进行。对选出的克隆的质粒DNA用ABI Sanger测序和Big Dye Terminator v3.1循环测序规程(Applied Biosystems,Life Technologies)进行测序。使用SequencherTM软件(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)组装和分析序列数据。
将所得的4个双元表达克隆：pDAS000122(TraP4-DGT28),pDAS000123(TraP8-DGT28),pDAS000124(TraP23-DGT28)和pDAS000125(TraP5-DGT28)各自转化进入根癌土壤杆菌菌株EHA105。
用dgt-28表达构建体产生转基因小麦事件通过土壤杆菌介导的转化使用供体小麦品系Bobwhite MPB26RH，按照与Wu et al.,Transgenic Research 2008,17:425-436相似的规程，产生表达4种DGT-28表达构建体其中之一的转基因小麦植物。对推定的T0转基因事件进行草铵膦(PPT)耐受性选择(草铵膦耐受性是由PAT选择标志物赋予的表型)，并转移到土壤中。将T0植物在温室封闭(containment)条件下生长，并产生T1种子。总的来说，每个DGT-28表达构建体产生了大约45个独立的T0事件。
T0小麦dgt-28小麦事件的草甘膦耐受性让T0事件在温室中驯化，生长至从轮生体生出2-4片新的、外观正常的叶片(即植物已经从组织培养转向温室生长条件)。使植物在25℃温室中12小时补光条件下生长，直至成熟。如前所述地对在相同条件下生长的T1植物进行草甘膦耐受性的初始筛选和Taqman分析。数据为确定可用于进一步表征的可遗传T1事件提供了可能。将6个低拷贝(1-2个拷贝)和2个多拷贝T1事件再次种植在温室条件下，并生长至3叶期。用420-3360g ae/ha范围的草甘膦商业制剂(Durango DMATM)喷洒T1植物，该范围能够对非转化小麦品系造成显著损伤。在施用物中添加了2％w/v硫酸铵。致死剂量的定义为导致Bob White MPB26RH非转化对照>75％损伤的比率。施用除草剂。
在本实施例中，利用草甘膦施用来同时确定dgt-28基因在T1代中的分离以及证明对高水平的草甘膦的耐受性。用处理21天(DAT)后目测损伤的分级为单位来表示植物响应。数据显示为展示少于25％目测损伤(4)、25-50％目测损伤(3)、50-75％目测损伤(2)和大于75％目测损伤(1)的个体数的柱状图。为每个用于小麦转化的构建体提供了算术平均和标准差。还在最后一列中为每个比率和转化指示了个体响应的打分范围。野生型，非转化的小麦(Bob White MPB26RH栽培种)，用作草甘膦敏感性对照。在T1代中，可以获得半合子和纯合子植物用于测试每个事件，因此每个草甘膦测试比率都包括这些植物。半合子植物将含有纯合子植物一半的基因剂量，因此在T1代中可以预期对草甘膦的响应存在差异。
T1dgt-28小麦植株的结果证明，用叶绿体转运肽TraP4,TraP5,TraP8和TraP23实现了对高达3360g ae/ha草甘膦比率的耐受性。表28是低拷贝T1事件的数据，但是代表了每个构建体的群体。
表28.在处理后21天低拷贝T1dgt-28小麦事件对草甘膦的响应
在21DAT，对抗性和敏感性植株进行计数，确定了通过卡方分析确定作为单一座位显性孟德尔性状(3R:1S)分离的品系的百分比。表29。这些数据证明，dgt-28是一种在单子叶物种中可以遗传的强草甘膦抗性基因。
表29.基于420-3360g ae/ha范围的草甘膦选择，按构建体别的显示孟德尔方式可遗传性的T1dgt-28事件的百分比。
实施例4:用于表达玉米中农艺上重要的转基因的人造叶绿体转运肽(TraP)序列
Cry2Aa:
来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的Cry2Aa蛋白质已经显示了针对谷实夜蛾(Helicoverpa zea)(CEW)和欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)(ECB)的活性。在玉米中测试了一个版本的cry2Aa基因(SEQ ID NO:13)(其密码子偏向玉米)。在该实验中，在玉米中评估了单独的Cry2Aa和CryAa与TraP23人造叶绿体转运肽的结合，以确定昆虫耐受活性并评估TraP23人造叶绿体转运肽序列可能会对玉米中的Cry2Aa蛋白质的表达的影响。
将编码Trap23v2人造叶绿体转运肽的多核苷酸序列(SEQ ID NO:12)和GCA密码子接头克隆到cry2Aa基因的上游并纳入构建体pDAB109808(图7)，用于在玉米植物中的昆虫耐受性测试。所得构建体含有两个植物转录单元(PTU)。第一个PTU包括玉蜀黍泛素1启动子(ZmUbi1启动子；Christensen,A.,Sharrock R.,and Quail P.,(1992)Maizepolyubiquitin genes:structure,thermal perturbation of expression andtranscript splicing,and promoter activity following transfer to protoplastsby electroporation,Plant Molecular Biology,18:675-689)、TraP23-cry2Aa融合基因(TraP23Cry2Aa)和玉蜀黍脂肪酶3′非翻译区域(ZmLip 3′UTR；美国专利7,179,902)。第二个PTU包括甘蔗杆状病毒启动子(SCBV启动子；美国专利US 6,489,462)、含有MSV前导序列和醇脱氢酶1内含子6的aad-1除草剂耐受性基因(AAD-1；美国专利US7,838,733和MSV前导序列；Genbank Acc.No.FJ882146.1和醇脱氢酶内含子；Genbank Acc.No.EF539368.1)，以及玉蜀黍脂肪酶3′非翻译区域(ZmLip3′UTR)。构建不含有cry2Aa上游的叶绿体转运肽序列的对照质粒pDAB107687，并包含在这些研究中(图8)。将质粒引入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中用于植物转化。
在授粉后大约10-12天从玉米栽培种B104采集穗。对穗进行去壳和表面灭菌，方法是在20％市售漂白剂(Ultra Germicidal Bleach,6.15％次氯酸钠)和两滴吐温20中浸泡穗20分钟，随后在层流罩内用无菌去离子水漂洗3次。从每个穗无菌切出未成熟的合子胚(1.8–2.2mm长)，并分配到一个或多个含有2.0ml土壤杆菌悬浮液的微离心管中，其中添加了2μl 10％Break- S233表面活性剂。
胚分离完成后，封闭含有胚的试管，并置于摇动平台上5分钟。然后将管中的内容物倾倒到共培养培养基平板上，用无菌一次性移液管除去液体土壤杆菌悬液。将含有胚的共培养平板放置在层流罩的背面，并使盖半开30分钟；之后用显微镜将胚定向成盾片朝上。然后，将含有胚的共培养平板返回到层流罩的背面，使盖半开再维持15分钟。然后将平板封闭，用3M微孔胶带密封，并放置在培养箱中，25℃，24小时/天光照，光强为大约60μmolm-2s-1。
共同培育期之后，将胚转移到恢复培养基中。每个平板转移不超过36个胚。将平板用3M微孔胶带包裹，并在27℃温育7-10天，期间24小时/天光照，光强为大约50μmol m-2s-1。然后将愈伤胚(callused embryos)转移到选择I培养基上。向每个选择I培养基平板中移入不超过18个愈伤胚。将板用3M微孔胶带包裹，并在27℃温育7天，期间24小时/天光照，光强为大约50μmol m-2s-1。然后将愈伤胚转移到选择II培养基中。向每个选择II培养基平板中移入不超过12个愈伤胚。将板用3M微孔胶带包裹，并在27℃温育14天，期间24小时/天光照，光强为大约50μmol m-2s-1。
在此阶段，将抗性愈伤组织转移到预再生培养基。向每个预再生培养基平板中移入不超过9个愈伤组织。将板用3M微孔胶带包裹，并在27℃温育7天，期间24小时/天光照，光强为大约50μmol m-2s-1。然后将预再生的愈伤组织转移到含再生培养基的PhytatraysTM中，在28℃温育7-14天或直至抽芽发生，每天16小时光照/8小时黑暗，光强为大约150μmol m- 2s-1。每个PhytatrayTM中放置不超过5个愈伤组织。然后分离具有初生根的小抽芽，并转移到抽芽/根培养基。将大约6cm或者更高的生根幼苗转移到土壤中，并移出到用于晾苗(hardening off)的生长室中。
为各转基因植物指配唯一的标识，并定期转移到温室中。将植物从PhytatraysTM移植到充满生长培养基(Premier Tech Horticulture,ProMix BX,0581P)的小盆中，并用保湿盖覆盖，以帮助植物驯化。将植物置于ConvironTM生长室内(28℃/24℃,16-小时光周期,50-70％RH,200μmol光强度)，直至达到V3-V4期。该步骤可以帮助植株适应土壤和更严苛的温度。然后，将植株移至温室中(光暴露类型:照射(Photo)或同化(Assimilation)；高光限(High Light Limit):1200PAR；16-小时日长；27℃白天/24℃夜晚)，并从小盆移植到5.5英寸(14cm)盆中。移植到更大盆后大约1-2周，对植物进行采样进行生物测定。每个事件对一个植物进行生物测定。
根据基因的拷贝数、Western印迹的蛋白检测和针对生物测定昆虫的活性来鉴定选定的事件，并推进到下一代。对含有壮观霉素抗性基因的事件加以记录，但是不一定从推进到下一代的范围中排除。将选出用于推进的事件移植到5加仑(19L)盆中。周期性观察以监视任何异常的表型。在长出须之前，在抽芽上方放置芽袋(Shoot bag)，防止飘来花粉的交叉污染。记录任何在覆盖之前产生了须的抽芽，并除去该抽芽。然后覆盖第二个抽芽，并用于授粉。在数据库中记录下产生了异常抽芽或无抽芽的植物。在授粉前一天，修剪须以提供平齐的刷(brush)来接受花粉，并且对植物进行自花授粉。
用于T1筛选的植物在播种后7天进行喷洒。它们在含有Metro 360盆栽土的4英寸(10.2cms)盆中生长，每个浅箱15个盆。苗生长期为V1-V1.5。对萌发差或含有极小植物(轮生体依然关闭)的盆做标记，以防将它们纳入选择评估。然后将整个浅箱的植物置于第二载体托盘内，用履带式喷洒器施用。每次在Mandel履带式喷洒器中放置2个托盘，并校准喷洒器使之用8002E T形喷嘴(Tee Jet)向靶区域输送187L/ha的量。配制35g ae/ha Assure II(精喹禾灵)+1％COC(作物油浓缩物)溶液用于施用。使用15mls./喷洒体积计算所需的总喷洒溶液。计算：(35g ae/ha)x(1ha/187L)x(1L/97.7g ae Assure II)＝0.192％溶液或28.74μl/15ml H2O+1％v/v)。施用后，将植物在喷洒实验室内干燥1小时，然后返回到温室中。移植到大盆大约1-2周后，对植物进行采样，用于生物测定。每个事件使用一个植物进行生物测定。
对所有通过了分子分析筛选的T0事件分析Cry2Aa蛋白表达水平。来自对照构建体pDAB107687——其包含不带TraP的Cry2Aa——的事件，其Cry2Aa的平均表达水平(15.0ng/cm2)比来自含有TraP23的pDAB109808事件(0.2ng/cm2)显著更高。尽管pDAB109808事件的表达水平降低，但是这些事件仍然表达Cry2Aa蛋白。
在用转基因植物的叶片喂养新生鳞翅目幼虫的生物测定中，对含有单拷贝的具有cry2Aa基因的T-链的转基因植物的杀昆虫活性进行了测试。所测定的鳞翅目物种是欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis(Hübner))(ECB)和玉米穗虫(美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)(CEW))。
32孔托盘(C-D International,Pitman,NJ)用2％琼脂溶液部分填充，并让琼脂固化。从每株植物获取叶片切片，大致二取一(one in two)，并单个放置在32孔托盘的孔中。每孔放置一个叶片，每个植物、每种昆虫测试2个叶片。昆虫用画笔集中播撒(mass-infested)，每个孔中放置10个新生幼虫。托盘用穿孔粘盖密封，这使其在测试期间保持通气。将托盘置于28℃，40％RH，16小时光照:8小时黑暗，历时3天。测试期结束后，对每个叶片进行简单的百分比损伤评分。将每个测试的损伤评分取平均，与蛋白表达分析一起用于进行相关性分析。
生物测定的结果表明，TraP23人造叶绿体转运肽序列是有功能的，因为在生物测定中pDAB109808事件提供了针对所测试昆虫的保护。在转基因事件中，对所有测试的昆虫种，表达不带TraP的Cry2Aa蛋白的植物(pDAB107687)的平均叶损伤显著大于表达带有TraP23的Cry2Aa蛋白的植物(pDAB109808)。虽然具有TraP23的pDAB109808事件比没有TraP的事件具有更大的叶损伤，但是pDAB109808事件提供了针对被生物测试的昆虫的保护。

Claims (17)

1.分离的核酸分子，其包含：
编码包含感兴趣的多肽和人造叶绿体转运肽(CTP)的嵌合多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含：
编码所述人造CTP的核苷酸序列，其合框地可操作连接于编码所述感兴趣的多肽的核苷酸序列；
其中该人造CTP为SEQ ID NO:11。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其还包含至少一个额外的核苷酸序列，每个核苷酸序列编码叶绿体转运肽，其中所述额外的核苷酸序列可操作地连接于所述编码感兴趣的肽的核苷酸序列。
3.权利要求2的分离的核酸分子，其中所述至少一个额外的核苷酸序列来自选自下组的生物：原核生物、低级光合真核生物和绿藻。
4.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列。
5.由权利要求1的核酸分子编码的嵌合多肽，其中所述感兴趣的多肽被导向含质体细胞中的质体。
6.权利要求5的嵌合多肽，其中所述人造叶绿体转运肽在所述感兴趣的多肽被导向到所述质体时被移除。
7.权利要求5的嵌合多肽，其中所述感兴趣的多肽为生物活性多肽。
8.权利要求5的嵌合多肽，其中所述感兴趣的多肽是荧光多肽。
9.权利要求7的嵌合多肽，其中所述生物活性多肽选自下组：乙酰乳酸合酶(ALS)、突变的ALS、ALS的前体、3-烯醇式丙酮酰莽草酸-5-磷酸合成酶(EPSPS)、CP4EPSPS和III类EPSPS。
10.权利要求7的嵌合多肽，其中所述生物活性肽为DGT-28或Cry2Aa。
11.权利要求7的嵌合多肽，其中所述生物活性多肽参与选自下组的过程：除草剂抗性，病毒抗性，细菌病原体抗性，昆虫抗性，线虫抗性，真菌抗性，植物活力，植物产量，温度耐受性，土壤条件耐受性，低光照水平耐受性，低水位耐受性，高水位耐受性，化学环境耐受性，种子颜色，淀粉改性，氨基酸合成，光合作用，脂肪酸合成，油合成，类胡萝卜素合成，萜类合成，和淀粉合成。
12.权利要求7的嵌合多肽，其中所述生物活性多肽赋予包含该生物活性多肽的植物细胞至少部分的除草剂抗性。
13.一种制备转基因植物材料的方法，该方法包括：
用权利要求1的核酸分子转化植物材料。
14.权利要求4的核酸分子，其中该分子是植物表达载体或植物转化载体。
15.一种制备转基因植物材料的方法，所述方法包括：
用权利要求14的核酸分子转化植物材料。
16.根据权利要求13的方法，其中所述植物材料选自下组：植物细胞、植物组织、植物组织培养物、愈伤组织培养物、植物部分、和全植物。
17.根据权利要求15的方法，其中所述植物材料选自下组：其中所述植物材料选自下组：植物细胞、植物组织、植物组织培养物、愈伤组织培养物、植物部分、和全植物。
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