KR20180038048A - 엽록체 전이 펩티드 - Google Patents

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저스틴 엠 리라
로버트 시칠로
칼라 엔 예케스
앤드류 이 로빈슨
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다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 색소체-함유 세포의 색소체로 표적화하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드를 색소체로 유도할 수 있는 엽록체 전이 펩티드, 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 트랜스제닉 식물 물질 (예를 들어, 트랜스제닉 식물), 및 이러한 방법에 의해 생산된 식물 물질, 및 그로부터 생산된 식물 일용품을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

엽록체 전이 펩티드
37 C.F.R. §1.821 (c) 또는 (e)에 따른 진술 -
ASCII 텍스트 파일로 제출된 서열 목록
37 C.F.R. §1.821(c) 또는 (e)에 따라, ASCII 텍스트 버전의 서열 목록을 포함하는 파일을 본 출원과 동시에 제출하였고, 그 내용은 본원에 참고로 삽입된다.
본 개시내용은 고등 식물의 엽록체로 표적화되는 폴리펩티드를 유전적으로 코딩하고, 발현하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하는 아미노산 서열, 및/또는 그를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 키메라 폴리펩티드의 엽록체로의 전이를 제어하는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩티드, 및/또는 그를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
식물 세포는 특징적인 막 시스템에 의해 경계가 정해져 있고, 세포내에서 특화된 기능을 수행하는, 일반적으로 "색소체(plastid)"라고 부르는, 독특한 세포하 소기관을 포함한다. 특정 색소체는 광합성 뿐만 아니라, 특정 화학 화합물의 합성 및 저장도 담당한다. 모든 색소체는 식물의 분열 조직부(meristematic region)에 존재하는 전색소체(proplastid)로부터 유래된다. 전색소체는 예를 들어, 엽록체, 황색체(etioplast), 유색체, 게론토플라스트(gerontoplast), 백색체(leucoplast), 전분체(amyloplast), 유지방체(elaioplast), 및 단백질체(proteinoplast)로 발달할 수 있다. 자기 자신의 유전 시스템 및 단백질 합성 기구를 함유하지만, 그의 발달 및 생합성 활성에서 핵-세포질 시스템과의 긴밀한 협력에 의존하는, 색소체는 세포내에서 반-자율 방식으로 존재한다.
고등 식물의 광합성 잎 세포에서 가장 눈에 띄는 색소체는 엽록체이다. 엽록체의 가장 본질적인 기능은 광합성의 광-구동 반응 수행이다. 그러나, 엽록체는 또한 식물 세포에 중요한 많은 다른 생합성 과정을 수행한다. 예를 들어, 세포의 지방산들은 모두 엽록체 스트로마에 위치하는 효소에 의해, 거기에서 쉽게 이용가능한 ATP, NAOPH 및 탄수화물을 이용하여 제조된다. 또한, 광-활성화된 전자의 환원력이 엽록체에서의 아질산염 (NO2 -)의 암모니아 (NH3)로의 환원을 구동시키며; 이 암모니아는 아미노산 및 뉴클레오티드 합성에 요구되는 질소를 식물에 제공한다.
엽록체는 또한 농화학 산업에서 특히 중요한 공정에 참여한다. 예를 들어, 많은 제초제는 엽록체 내에서 수행되는 기능들을 차단함으로써 작용하는 것으로 알려져 있다. 최근의 연구에 의하면 여러 제초제의 특이적인 표적이 확인되었다. 예를 들어, 트리아진-유래 제초제는 플라스토퀴논 분자를 광계 II의 32 kD 폴리펩티드 중의 그의 결합 부위로부터 이동시킴으로써 광합성을 억제시킨다. 이 32 kD 폴리펩티드는 엽록체 게놈에서 코딩되고, 세포소기관 기구에 의해 합성된다. 트리아진 제초제에 대해 내성이 있는 돌연변이체 식물이 수득되었다. 이 식물은 트리아진 제초제에 의해 플라스토퀴논이 더 이상 이동될 수 없는 돌연변이체 32 kD 폴리펩티드를 포함하고 있다. 술포닐우레아는 엽록체에서의 아세토락테이트 신타제를 억제한다. 아세토락테이트 신타제는 이소류신 및 발린 합성에 관여한다. 글리포세이트는 방향족 아미노산의 합성에 관여하는 효소인, 5-에놀 피루빌-3-포스포시키메이트 신타제 (5-enol pyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, EPSPS)의 기능을 억제한다. 이 효소들 모두 핵 게놈에 의해 코딩되지만, 이들은 실제 아미노산 합성이 이루어지는 엽록체로 전위된다.
대부분의 엽록체 단백질은 식물 세포의 핵에서 코딩되고, 세포질에서 보다 큰 전구체 단백질로서 합성되고, 번역 후에 엽록체 내로 이입된다. 외부 및 내부 외피 막을 가로질러 스트로마 내로의 이입은 스트로마, 틸라코이드 막, 및 틸라코이드 루멘으로 예정되어 있는 단백질의 진입에 중요한 수단이다. 이입된 전구체 단백질을 틸라코이드 막 및 틸라코이드 루멘으로 국소화시키는 것은 박테리아 단백질 수송 시스템과 상동성인 두 가지 기전을 포함하는, 네 가지 독특한 기전에 의해 달성된다. 따라서, 엽록체에서 단백질 국소화를 위한 기전은 부분적으로 원핵성 내공생체로부터 유래된다. Cline and Henry (1996), Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:1-26.
엽록체 발현으로 예정된 전구체 단백질은 엽록체 전이 펩티드 (chloroplast transit peptide, CTP)로 알려져 있는 N-말단 연장부를 포함하고 있다. 전이 펩티드는 엽록체 표면의 특이적 인식에 도구 역할을 하고, 엽록체 외피를 가로질러 거기서 엽록체 내의 다양한 하부구획 (예컨대, 스트로마, 틸라코이드, 및 틸라코이드 막)으로 전-단백질의 번역 후 전위를 매개하는 데 도구 역할을 한다. 이 N-말단 전이 펩티드 서열은 엽록체 단백질의 색소체 내로의 이입에 필요한 모든 정보를 담고 있으며; 전이 펩티드 서열은 색소체 이입을 위해 필수적이고, 충분하다.
자연 코딩된 전이 펩티드 서열을 그들의 N-말단에 갖는다고 보고된 식물 유전자로는 리불로스-1,5-비포스페이트 카르복실라제 (RuBisCo) (de Castro Silva-Filho 등. (1996), Plant Mol. Biol. 30:769-80; Schnell 등. (1991), J. Biol. Chem. 266:3335-42); EPSPS (예컨대, Archer 등. (1990), J. Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810 및 미국 특허 6,867,293, 7,045,684, 및 Re. 36,449 참조); 트립토판 신타제 (Zhao 등. (1995), J. Biol. Chem. 270:6081-7); 플라스토시아닌 (Lawrence 등. (1997), J. Biol. Chem. 272:20357-63); 코리스메이트 신타제 (Schmidt 등. (1993), J. Biol. Chem. 268:27447-57); 집광 엽록소 a/b 결합 단백질 (LHBP) (Lamppa 등. (1988), J. Biol. Chem. 263:14996-14999); 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 엽록체 단백질 (Lee 등. (2008), Plant Cell 20:1603-22)의 엽록체 작은 서브유닛을 포함한다. 미국 특허 공개 번호 US 2010/0071090은 클라미도모나스 속(Chlamydomonas sp.)으로부터의 특정 엽록체 표적화 펩티드를 제공한다.
그러나, 독립적인 구조적 모티프를 가지는 엽록체 표적화 펩티드의 독특한 서브군이 존재할 가능성은 있지만, 그의 서열 다양성 수준이 높고, 공통 또는 컨센서스 서열 모티프가 부족하기 때문에, 엽록체 표적화 펩티드에 의해 코딩되는 정보에 관한 구조적 요건은 여전히 파악하기가 어려운 상태이다. Lee 등 (2008), 전술됨. 추가로, 이 서열 모두가 고등 식물에서 엽록체-표적화된 단백질의 이종 발현에 유용했던 것은 아니다.
식물에서 폴리펩티드의 색소체 표적화를 위한 조성물 및 방법이 본원에서 기재된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 엽록체 전이 펩티드 (예컨대, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드)를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이러한 핵산 분자는 단자엽 또는 쌍자엽 식물에서 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하고 표적화하는 데 유용할 수 있다. 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 추가로 기재된다.
일부 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 원핵성 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하등 광합성 진핵생물로부터 단리된 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 녹조식물, 예컨대 클라미도모나스(Chlamydomonas) 및 두날리엘라(Dunaliella)로부터 단리된 서열), 또는 그의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 고등 광합성 진핵생물로부터 단리된 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 쌍자엽 식물, 예컨대 브라시카 나푸스(Brassica napus), 비름(Amaranthus), 메꽃(Calystegia), 및 글리신 맥스(Glycine max), 또는 단자엽 식물, 예컨대 오리자 사티바(Oryza sativa)로부터 단리된 서열), 또는 그의 기능적 변이체일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 브라시카 나푸스, 글리신 맥스, 오리자 사티바, 비름(Amaranthus), 메꽃(Calystegia), 및 두날리엘라 살리나 및 클라미도모나스 레인하르드티로부터 단리된 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 추가 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 부분 원핵성 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 변이체일 수 있다. 추가 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 1개 넘는 원핵성 엽록체 전이 펩티드 뉴클레오티드 서열, 예컨대 상이한 식물 종 유래의 1개 넘는 (예를 들면, 2개) 엽록체 전이 펩티드 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 변이체일 수 있다. 추가 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 합성 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 이는 적어도 부분적으로 원핵성 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드 뉴클레오티드 서열을 참조하여 설계될 수 있다. 추가 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 합성 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 이는 적어도 부분적으로 진핵성 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드 뉴클레오티드 서열을 참조하여 설계될 수 있다. 추가 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 합성 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 이는 적어도 부분적으로 EPSPS 유전자 서열 또는 엽록체 전이 펩티드를 함유하는 임의의 다른 유전자 서열로부터의 진핵성 엽록체 전이 펩티드 뉴클레오티드 서열을 참조하여 설계될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하기 위한 적어도 1개의 수단을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이러한 핵산 분자는 단자엽 또는 쌍자엽 식물에서 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하고 표적화하는 데 유용할 수 있다. 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하기 위한 적어도 1개의 수단을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 추가로 기재된다. 다른 실시양태들은 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 뉴클레오티드 서열 및 그의 기능적 변이체를 통해서 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하기 위한 수단을 기재하고 있다.
본원에서는 또한 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 식물, 식물 조직, 및 식물 세포를 기재한다. 일부 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 그의 게놈에 안정적으로 통합되어 있는 이러한 핵산 분자를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 이러한 핵산 분자를 일시적으로 발현할 수 있다.
식물 또는 식물 세포의 엽록체에서 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 방법 또한 기재한다. 특정 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 사용하여 식물 세포를 형질전환시켜서, 관심 뉴클레오티드 서열의 발현 생성물에 융합된 , TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 전구체 융합 폴리펩티드가 식물 세포의 세포질에서 생산된 다음, 융합 폴리펩티드가 생체 내에서 식물 세포의 엽록체 내로 수송되도록 할 수 있다.
관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물을 제조하는 방법도 추가로 기재한다. 이러한 트랜스제닉 식물로부터 생산된 식물 생성물 (예컨대, 종자) 또한 기재한다.
상기 특색 및 다른 특색이 여러 실시양태에 대한 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이고, 이는 첨부된 도면을 참조로 진행된다.
도 1은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CTP-코딩 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드)의 특정 예를 대표하는 mRNA 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, mRNA 분자 (예컨대, 도시된 바와 같음)는 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CTP-코딩 서열을 포함하는 개방 판독 프레임을 포함하는 DNA 분자로부터 전사될 수 있다. 관심 뉴클레오티드 서열은, 일부 실시양태에서, 관심 펩티드를 코딩하는 서열, 예를 들어, 제한 없이, 색소체로 표적화되는 마커 유전자 생성물 또는 펩티드일 수 있다.
도 2는 브라시카 나푸스, 두날리엘라 살리나, 오리자 사티바, 비름, 클라미도모나스 레인하르드티, 메꽃 및 글리신 맥스 유래의 예측된 엽록체 전이 펩티드의 정렬을 제공한다. 별표는 서열들이 스플라이싱되고 재조합되어 다양한 키메라 TraP 서열을 형성하는 위치를 나타낸다. 비름은 2개의 다른 키메라 엽록체 전이 펩티드 (TraP18 및 TraP19)에서 사용되었고, 2개의 별표가 존재하는 것으로서 보이는 서열 내의 2개의 상이한 위치에서 스플라이싱되었음을 유의해야 한다.
도 3은 pDAB101979 플라스미드 지도를 제공한다.
도 4는 pDAB101980 플라스미드 지도를 제공한다.
도 5는 pDAB107634 플라스미드 지도를 제공한다.
도 6은 pDAB107635 플라스미드 지도를 제공한다.
도 7은 pDAB107636 플라스미드 지도를 제공한다.
도 8은 pDAB109847 플라스미드 지도를 제공한다.
도 9는 pDAB109848 플라스미드 지도를 제공한다.
도 10은 pDAB109849 플라스미드 지도를 제공한다.
도 11은 pDAB101908 플라스미드 지도를 제공한다.
도 12는 담배 잎 조직 내로 침투되고 담배 잎 조직의 엽록체 내로 전위된 TraP10-YFP의 현미경 이미지를 제공한다.
도 13은 담배 잎 조직 내로 침투되고 담배 잎 조직의 엽록체 내로 전위된 TraP11-YFP의 현미경 이미지를 제공한다.
도 14는 담배 잎 조직의 엽록체 내로 전위하지 않은 담배 잎 조직 내로 침투된 TraP17-GFP의 현미경 이미지를 제공한다.
도 15는 담배 잎 조직의 엽록체 내로 전위된 담배 잎 조직 내로 침투된 TraP18-GFP의 현미경 이미지를 제공한다.
도 16은 담배 잎 조직 내로 침투되고 담배 잎 조직의 엽록체 내로 전위된 TraP19-GFP의 현미경 이미지를 제공한다.
도 17은 담배 잎 조직의 엽록체 내로 전위된 담배 잎 조직 내로 침투된 TraP26-GFP의 현미경 이미지를 제공한다.
도 18은 담배 잎 조직 내로 침투되고 담배 잎 조직의 엽록체 내로 전위된 TraP27-GFP의 현미경 이미지를 제공한다.
도 19는 담배 잎 조직 내로 침투되고 담배 잎 조직의 엽록체 내로 전위된 TraP28-GFP의 현미경 이미지를 제공한다.
도 20은 담배 잎 조직 내로 침투되고 담배 잎 조직의 엽록체 내로 통합되지 않은 비-표적화된 YFP 대조군의 현미경 이미지를 제공한다.
도 21은 옥수수 원형질체 내로 형질전환되고 옥수수 원형질체 내로 전위된 TraP17-GFP의 현미경 이미지를 제공한다.
도 22는 옥수수 원형질체 내로 형질전환되고 옥수수 원형질체 내로 전위된 TraP18-GFP의 현미경 이미지를 제공한다.
도 23은 옥수수 원형질체 내로 형질전환되고 옥수수 원형질체 내로 전위된 TraP19-GFP의 현미경 이미지를 제공한다.
도 24는 pDAB107538 플라스미드 지도를 제공한다.
도 25는 pDAB107617 플라스미드 지도를 제공한다.
도 26은 pDAB114286 플라스미드 지도를 제공한다.
도 27은 pDAB114287 플라스미드 지도를 제공한다.
서열 목록
첨부된 서열 목록에 열거된 핵산 서열은 37 C.F.R. §1.822에서 규정된 바와 같은, 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시된다. 각 핵산 서열의 단지 한 가닥만이 첨부된 서열 목록에 제공되지만, 디스플레이된 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 상보적 가닥이 포함되는 것으로 이해된다. 첨부된 서열 목록에서: 서열번호 1은 TraP10의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 2는 TraP11의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 3은 TraP17의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 4는 TraP18의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 5는 TraP19의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 6은 TraP26의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 7은 TraP27의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 8은 TraP28의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 9는 TraP10의 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 10은 TraP11의 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 11은 TraP17의 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 12는 TraP18의 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 13은 TraP19의 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 14는 TraP26의 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 15는 TraP27의 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 16은 TraP28의 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
I. 몇몇 실시양태의 개관
엽록체 전이 펩티드 (CTP) (또는 색소체 전이 펩티드)는 번역과 동시에 또는 번역 후에 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 색소체, 예를 들어, 엽록체로 유도하는 작용을 한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 내인성 엽록체 단백질 또는 이종성 단백질은 CTP를 포함하는 보다 큰 전구체 폴리펩티드와 같은 단백질의 발현에 의해 엽록체로 유도될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, CTP를 코딩하는 핵산 서열은 Brassica napus (NCBI 데이터베이스 접근 번호 P17688)에서 수득한 EPSPS 유전자 서열, Glycine max (NCBI 데이터베이스 접근 번호 XP_003517039)에서 수득한 EPSPS 유전자 서열, Calystegia (NCBI 데이터베이스 접근 번호 ACB37380)에서 수득한 EPSPS 유전자 서열, Chlamydamonas reinhardtii (NCBI 데이터베이스 접근 번호 XP_001702942)에서 수득한 EPSPS 유전자 서열, Oryza sativa (NCBI 데이터베이스 접근 번호 AF413082_1)에서 수득한 EPSPS 유전자 서열, Amaranthus (NCBI 데이터베이스 접근 번호 ACV53022)에서 수득한 EPSPS 유전자 서열, Dunaliella salina (NCBI 접근 번호: AMBM68632)에서 수득한 EPSPS 유전자 서열로부터 단리되었다. CTP는 상기 유전자 서열을 ChloroP 예측 서버로 분석함으로써 전장 단백질로부터 식별되고 단리되었다. Emanuelsson 등 (1999), Protein Science 8:978-84 (cbs.dtu.dk/services/ChloroP에서 이용가능함). 단리된 CTP 코딩 서열의 예측된 단백질 생성물은 본 개시물의 키메라 CTP 코딩 핵산 서열, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28을 생산하는 데 사용되었다.
추가의 예시적인 실시양태에서, TraP10 펩티드를 독립적으로 합성하고 황색 형광성 단백질 (YFP)에 융합시켜 키메라 TraP10-YFP 폴리펩티드를 생산하였다. 키메라 TraP10-YFP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 이원성 벡터 내에 도입함으로써, TraP10-YFP 코딩 핵산 서열을 AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결시켰다.
또 추가의 예시적인 실시양태에서, AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결된 TraP10-YFP 코딩 핵산 서열을 포함하는 이원성 벡터를 아그로박테리움을 통해 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum))를 일시적으로 형질전환시켰다. 공초점 현미경 및 웨스턴 블롯 분석으로 TraP10이 YFP를 담배 엽록체로 성공적으로 표적화시켰는지 확인하였다.
추가의 예시적인 실시양태에서, TraP11 펩티드를 독립적으로 합성하고 황색 형광성 단백질 (YFP)에 융합시켜 키메라 TraP11-YFP 폴리펩티드를 생산하였다. 키메라 TraP11-YFP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 이원성 벡터 내에 도입함으로써, TraP11-YFP 코딩 핵산 서열을 AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결시켰다.
또 추가의 예시적인 실시양태에서, AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결된 TraP11-YFP 코딩 핵산 서열을 포함하는 이원성 벡터를 아그로박테리움을 통해 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum))를 일시적으로 형질전환시켰다. 공초점 현미경 및 웨스턴 블롯 분석으로 TraP11이 YFP를 담배 엽록체로 성공적으로 표적화시켰는지 확인하였다.
추가의 예시적인 실시양태에서, TraP17 펩티드를 독립적으로 합성하고 녹색 형광성 단백질 (GFP)에 융합시켜 키메라 TraP17-GFP 폴리펩티드를 생산하였다. 키메라 TraP17-GFP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 이원성 벡터 내에 도입함으로써, TraP17-GFP 코딩 핵산 서열을 AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결시켰다.
또 추가의 예시적인 실시양태에서, AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결된 TraP17-GFP 코딩 핵산 서열을 포함하는 이원성 벡터를 아그로박테리움을 통해 옥수수 (제아 메이스(Zea mays))를 일시적으로 형질전환시켰다. 공초점 현미경 및 웨스턴 블롯 분석으로 TraP17이 GFP를 옥수수 엽록체로 성공적으로 표적화시켰는지 확인하였다.
추가의 예시적인 실시양태에서, TraP18 펩티드를 독립적으로 합성하고 녹색 형광성 단백질 (GFP)에 융합시켜 키메라 TraP18-GFP 폴리펩티드를 생산하였다. 키메라 TraP18-GFP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 이원성 벡터 내에 도입함으로써, TraP18-GFP 코딩 핵산 서열을 AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결시켰다.
또 추가의 예시적인 실시양태에서, AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결된 TraP18-GFP 코딩 핵산 서열을 포함하는 이원성 벡터를 아그로박테리움을 통해 옥수수 (제아 메이스(Zea mays)) 및 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum))을 일시적으로 형질전환시켰다. 공초점 현미경 및 웨스턴 블롯 분석으로 TraP18이 GFP를 옥수수 및 담배 엽록체로 성공적으로 표적화시켰는지 확인하였다.
추가의 예시적인 실시양태에서, TraP19 펩티드를 독립적으로 합성하고 녹색 형광성 단백질 (GFP)에 융합시켜 키메라 TraP19-GFP 폴리펩티드를 생산하였다. 키메라 TraP19-GFP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 이원성 벡터 내에 도입함으로써, TraP19-GFP 코딩 핵산 서열을 AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결시켰다.
또 추가의 예시적인 실시양태에서, AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결된 TraP19-GFP 코딩 핵산 서열을 포함하는 이원성 벡터를 아그로박테리움을 통해 옥수수 (제아 메이스(Zea mays)) 및 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum))을 일시적으로 형질전환시켰다. 공초점 현미경 및 웨스턴 블롯 분석으로 TraP19이 GFP를 옥수수 및 담배 엽록체로 성공적으로 표적화시켰는지 확인하였다.
추가의 예시적인 실시양태에서, TraP26 펩티드를 독립적으로 합성하고 녹색 형광성 단백질 (GFP)에 융합시켜 키메라 TraP26-GFP 폴리펩티드를 생산하였다. 키메라 TraP26-GFP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 이원성 벡터 내에 도입함으로써, TraP26-GFP 코딩 핵산 서열을 AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결시켰다.
또 추가의 예시적인 실시양태에서, AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결된 TraP26-GFP 코딩 핵산 서열을 포함하는 이원성 벡터를 아그로박테리움을 통해 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum))을 일시적으로 형질전환시켰다. 공초점 현미경 및 웨스턴 블롯 분석으로 TraP26이 GFP를 담배 엽록체로 성공적으로 표적화시켰는지 확인하였다.
추가의 예시적인 실시양태에서, TraP27 펩티드를 독립적으로 합성하고 황색 형광성 단백질 (GFP)에 융합시켜 키메라 TraP27-GFP 폴리펩티드를 생산하였다. 키메라 TraP27-GFP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 이원성 벡터 내에 도입함으로써, TraP27-GFP 코딩 핵산 서열을 AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결시켰다.
또 추가의 예시적인 실시양태에서, AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결된 TraP27-GFP 코딩 핵산 서열을 포함하는 이원성 벡터를 아그로박테리움을 통해 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum))을 일시적으로 형질전환시켰다. 공초점 현미경 및 웨스턴 블롯 분석으로 TraP27이 GFP를 담배 엽록체로 성공적으로 표적화시켰는지 확인하였다.
추가의 예시적인 실시양태에서, TraP28 펩티드를 독립적으로 합성하고 황색 형광성 단백질 (GFP)에 융합시켜 키메라 TraP28-GFP 폴리펩티드를 생산하였다. 키메라 TraP28-GFP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 이원성 벡터 내에 도입함으로써, TraP28-GFP 코딩 핵산 서열을 AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결시켰다.
또 추가의 예시적인 실시양태에서, AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결된 TraP28-GFP 코딩 핵산 서열을 포함하는 이원성 벡터를 아그로박테리움을 통해 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum))을 일시적으로 형질전환시켰다. 공초점 현미경 및 웨스턴 블롯 분석으로 TraP28이 GFP를 담배 엽록체로 성공적으로 표적화시켰는지 확인하였다.
추가의 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 합성 TraP 펩티드를 각각 코딩하는, 핵산 서열을 독립적으로 합성하고, 작물학상 중요한 유전자 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결시켰다. TraP 서열을 제초제 내성 형질 (예컨대, dgt-28, dgt-14, dgt-32 및 dgt-33)에 융합시켜, 키메라 TraP10:DGT-28, TraP11:DGT-28, TraP17:DGT-28, TraP18:DGT-28, TraP19:DGT-28, TraP26:DGT-28, TraP27:DGT-28 또는 TraP28:DGT-28 융합 폴리펩티드를 각각 코딩하는, 합성 핵산 분자를 생산할 수 있다. 키메라 TraP10:DGT-28, TraP11:DGT-28, TraP17:DGT-28, TraP18:DGT-28, TraP19:DGT-28, TraP26:DGT-28, TraP27:DGT-28 또는 TraP28:DGT-28 폴리펩티드를 각각 코딩하는, 이러한 핵산 분자를 이원성 벡터 내로 각각 도입하여, 각각의 TraP10:DGT-28, TraP11:DGT-28, TraP17:DGT-28, TraP18:DGT-28, TraP19:DGT-28, TraP26:DGT-28, TraP27:DGT-28 또는 TraP28:DGT-28 코딩 핵산 서열을 프로모터 및 다른 유전자 조절 요소에 작동가능하게 연결시켰다. TraP10:DGT-28, TraP11:DGT-28, TraP17:DGT-28, TraP18:DGT-28, TraP19:DGT-28, TraP26:DGT-28, TraP27:DGT-28 또는 TraP28:DGT-28 코딩 핵산 서열을 함유하는 이원성체를 사용하여 다양한 식물 종을 형질전환시켰다. 트랜스제닉 식물을 DGT-28 효소의 발현 및 엽록체로의 전위의 결과로서 글리포세이트 내성에 대하여 검정할 수 있다.
상기 상세히 설명된 실험 실시예에 비추어, 본 발명의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 서열을 사용하여 임의의 폴리펩티드를 광범위한 식물 종의 색소체로 유도할 수 있다. 예를 들어, 본 개시물에 의해 당업자에게 이용가능한 방법에 의해서, 임의의 제2 펩티드 서열의 N-말단에 융합된 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드 서열을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 제2 펩티드 서열의 색소체 표적화를 위해 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드는 색소체 발현이 바람직한 펩티드의 이입 및 가공 효율을 증가시킬 수 있다.
II. 약어
CTP 엽록체 전이 펩티드
EPSPS 3-에놀피루빌시키메이트-5-포스페이트 신타제
YFP 황색 형광성 단백질
Ti 종양 유도성 (A. 투메파시엔스(A. tumefaciens)로부터 유래된 플라스미드)
T-DNA 전달 DNA
III. 용어
본 개시물의 다양한 실시양태에 관한 검토를 용이하게 하기 위해, 구체적인 용어에 관한 다음과 같은 설명을 제공한다:
엽록체 전이 펩티드(Chloroplast transit peptide): 본원에서 사용되는, "엽록체 전이 펩티드" (CTP) (또는 "색소체 전이 펩티드")라는 용어는 폴리펩티드의 N-말단에 존재할 때, 폴리펩티드를 식물 세포의 색소체, 예컨대, 엽록체 내로 이입하는 것을 유도하는 아미노산 서열을 의미할 수 있다. CTP는 일반적으로 단백질을 숙주 세포의 색소체 (예컨대, 1차, 2차, 또는 3차 색소체, 예컨대, 엽록체) 내로 이입하는 것을 유도하는 데 필요하며, 충분하다. 여러가지 이용가능한 알고리즘 (예컨대, PSORT, 및 ChloroP (www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP에서 이용가능함)) 중 하나에 의해 추정 엽록체 전이 펩티드를 확인할 수 있다. ChloroP는 특히 엽록체 전이 펩티드에 대해 우수한 예측을 제공할 수 있다. Emanuelsson 등 (1999), Protein Science 8:978-84. 그러나, 기능성 엽록체 전이 펩티드를 예측하는 것은 현존하는 어느 알고리즘으로도 100% 효율로 달성하지 못한다. 그러므로, 예컨대, 시험관 내, 또는 생체 내 방법론으로, 확인된 추정 엽록체 전이 펩티드가 실제로 의도된 바와 같이 기능하는지 입증하는 것이 중요하다.
엽록체 전이 펩티드는 색소체 내로 이입되는 폴리펩티드의 N-말단에 위치할 수 있으며, 일부 예에서는 폴리펩티드의 C-말단에 위치할 수 있다. 상기 전이 펩티드는 CTP를 포함하는 폴리펩티드의 색소체로의 번역과 동시 또는 번역 후 수송을 용이하게 할 수 있다. 엽록체 전이 펩티드는 전형적으로 약 40 내지 약 100개의 아미노산을 포함하고, 이러한 CTP는 소정의 공통 특징을 포함하는 것으로 관찰되었으며, 예를 들어, CTP는 음으로 하전된 아미노산 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 또는 글루타민)이, 있다 하더라도, 거의 함유하지 않고; CTP의 N-말단 영역에는 하전된 아미노산인 글리신, 및 프롤린이 결핍되어 있고; CTP의 중앙 영역은 또한 매우 높은 비율로 염기성 또는 히드록실화된 아미노산 (예컨대, 세린 및 트레오닌)을 함유할 가능성이 있고; CTP의 C-말단 영역은 아르기닌이 풍부할 가능성이 있고, 양친매성 베타-시트 구조를 포함하는 능력을 가진다. 색소체 프로테아제는 폴리펩티드의 색소체 내로의 이입 후 상기 CTP를 포함하는 폴리펩티드의 나머지 부분으로부터 CTP를 절단할 수 있다.
접촉: 본원에서 사용되는, 핵산 분자와 관련하여 세포, 조직, 또는 유기체 (예컨대, 식물 세포; 식물 조직; 및 식물)"와의 접촉" 또는 "에 의한 흡수"라는 용어는 핵산 분자의 유기체 내로의 내재화, 예를 들어, 제한 없이, 핵산 분자를 포함하는 조성물과 유기체를 접촉시키는 것; 및 핵산 분자를 포함하는 용액으로 유기체를 담그는 것을 포함한다.
내인성: 본원에서 사용되는, "내인성"이라는 용어는 특정 유기체, 조직, 또는 세포 내로부터 기원하는 물질 (예컨대, 핵산 분자 및 폴리펩티드)을 의미한다. 예를 들어, 식물 세포에서 발현된 "내인성" 폴리펩티드는 보통 비-유전자 조작된, 같은 종의 식물로부터의 같은 유형의 세포에서 발현되는 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
발현: 본원에서 사용되는, 코딩 서열 (예를 들어, 유전자 또는 트랜스젠)의 "발현"이란, (예컨대, 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함하는) 핵산 전사 단위의 코딩된 정보가 세포의 작동적, 비-작동적, 또는 구조적 부분으로 전환되는 공정, 종종 단백질의 합성을 포함하는 공정을 의미한다. 유전자 발현은 예컨대 유전자 발현을 증가시키거나 감소시키는 제제에 세포, 조직 또는 유기체를 노출시키는 것과 같은 외부 신호에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자 발현은 또한 DNA에서 RNA, 단백질에 이르는 임의의 경로에서 조절될 수 있다. 유전자 발현 조절은, 예컨대 전사, 번역, RNA 수송 및 가공, mRNA와 같은 중간 분자의 분해, 또는 이들이 만들어진 후에 특이적 단백질 분자의 활성화, 불활성화, 구획화 또는 분해, 또는 이들의 조합을 통해 작용하는 제어를 통해 발생한다. 유전자 발현은 노던 블롯, RT-PCR, 웨스턴 블롯, 또는 시험관 내, 계 내(in situ), 또는 생체 내 단백질 활성 검정법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
유전 물질: 본원에서 사용되는, "유전 물질"이라는 용어는 모든 유전자, 및 핵산 분자, 예컨대, DNA 및 RNA를 포함한다.
이종성: 본원에서 사용되는, "이종성"이라는 용어는 특정 유기체, 조직, 또는 세포내로부터 기원하지 않는 물질 (예컨대, 핵산 분자 및 폴리펩티드)을 의미한다. 예를 들어, 식물 세포에서 발현된 "이종성" 폴리펩티드란 보통 비-유전자 조작된, 같은 종의 식물로부터의 같은 유형의 세포에서 발현되지 않는 폴리펩티드 (예컨대, 같은 유기체의 다른 세포 또는 다른 유기체의 세포에서 발현되는 폴리펩티드)를 의미할 수 있다.
단리된: 본원에서 사용되는, "단리된"이라는 용어는 분자가 자연적으로 발생하는 유기체의 세포에서 분자가 보통 회합되어 있는 같은 유형의 다른 분자 (예컨대, 다른 핵산 분자 및 다른 폴리펩티드)로부터 실질적으로 분리되거나, 또는 그로부터 정제되어 있는 분자 (예컨대, 핵산 분자 및 폴리펩티드)를 의미한다. 예를 들어, 단리된 핵산 분자는 핵산 분자가 자연적으로 발생하는 유기체의 세포에서 염색체 DNA 또는 염색체외 DNA로부터 실질적으로 분리되거나, 또는 그로부터 정제되어 있는 것일 수 있다. 따라서, 상기 용어는 다른 핵산 분자, 폴리펩티드, 및 세포 성분이 제거되도록 생화학적으로 정제된 재조합 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 또한 재조합 핵산 분자, 화학적으로 합성된 핵산 분자, 및 재조합적으로 생산된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는, "실질적으로 정제된"이라는 용어는 분자가 그의 천연 상태에서 보통 그와 회합되어 있는 다른 분자로부터 분리되어 있다는 것을 의미한다. 실질적으로 정제된 분자는 조성물에 존재하는 우세한 종일 수 있다. 실질적으로 정제된 분자에는 천연 혼합물 중에 존재하는 용매 이외의 다른 분자가 예를 들어, 적어도 60% 없거나, 적어도 75% 없거나, 또는 적어도 90% 없을 수 있다. "실질적으로 정제된"이라는 용어는 그의 천연 상태에서 존재하는 분자를 의미하는 것은 아니다.
핵산 분자: 본원에서 사용되는, "핵산 분자"라는 용어는 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미하며, 이는 RNA, cDNA, 게놈 DNA의 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두, 및 상기의 합성 형태 및 혼합된 중합체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 둘 중 하나의 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 본원에서 사용된 “핵산 분자”는 “핵산” 및 “폴리뉴클레오티드”와 동의어이다. 핵산 분자는 달리 명시되지 않는 한, 통상적으로 길이가 적어도 10 염기이다. 상기 용어는 단일- 및 이중-가닥 형태의 DNA를 포함한다. 핵산 분자는 이량체 (소위 탠덤) 형태, 및 핵산 분자의 전사 생성물을 포함한다. 핵산 분자는 자연 발생 뉴클레오티드, 및 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 결합에 의해 함께 연결된 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 당업자에 의해 용이하게 인지될 수 있는 바와 같이 비-자연적인 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 표지, 메틸화, 유사체에 의한 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상의 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 비전하 결합: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등; 전하 결합: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 삽입제(intercalator): 예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등; 킬레이트제; 알킬화제; 및 변형된 연결기: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 단일-가닥, 이중-가닥, 부분 이중나선, 삼중나선, 헤어핀, 원형, 및 패드록 (padlock) 입체형태를 비롯한 임의의 위상 입체형태를 포함한다.
DNA와 관련하여 본원에서 사용되는, "코딩 서열," "구조적 뉴클레오티드 서열," 또는 "구조적 핵산 분자"라는 용어는 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓였을 때, 전사 및 mRNA를 통해 궁극적으로 폴리펩티드로 번역되는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. RNA와 관련하여 "코딩 서열"이라는 용어는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 코딩 서열의 경계는 5'-말단에 있는 번역 개시 코돈 및 3'-말단에 있는 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 게놈 DNA; cDNA; EST; 및 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어, 분리 방법, 예컨대, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여; 분자 크기에 기초한 배제법에 의하거나, 또는 친화도에 의해; 상이한 용매 중의 용해도에 기초한 분별에 의해; 또는 유전자 조작 방법, 예컨대, 증폭, 클로닝 및 서브클로닝에 의해, 단리, 정제, 또는 부분적으로 정제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
서열 동일성: 두 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 본원에서 사용되는, "서열 동일성" 또는 "동일성"이라는 용어는 구체화된 비교 윈도우 상에서 최대한 대응하도록 정렬되었을 때, 두 서열내 잔기가 동일한 것을 의미할 수 있다.
본원에 사용되는, 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우 상에서 2개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들면, 핵산 서열 및 아미노산 서열)을 비교함으로써 측정된 값을 지칭하며, 여기서 비교 윈도우 중 서열의 일부는, 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여, 첨가, 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 둘 다의 서열에서 발생하는 위치의 개수를 결정하여 매칭되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교 윈도우에서의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다. 예컨대 다음에 다양한 프로그램 또는 정렬 알고리즘이 기술되어 있다: Smith 및 Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman 및 Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443; Pearson 및 Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins 및 Sharp (1988), Gene 73:237-44; Higgins 및 Sharp (1989), CABIOS 5:151-3; Corpet 등 (1988), Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang 등 (1992), Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson 등 (1994), Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana 등 (1999), FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고찰을, 예를 들어, Altschul 등 (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10에서 확인할 수 있다.
국립 생물 정보 센터 (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul 등 (1990))은 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 국립 생물 정보 센터 (메릴랜드주 베데스다)를 포함한 여러 소스로부터와 인터넷 상에서 이용가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법의 설명이 인터넷 상에서 BLAST™에 대한 "도움말" 섹션 하에 입수가능하다. 핵산 서열 비교를 위해, 파라미터를 디폴트하기 위해 설정된 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 함수가 사용될 수 있다. 참조 서열에 대한 유사성이 더 큰 핵산 서열은 이러한 방법에 의해 평가되었을 때 증가하는 백분율 동일성을 나타낼 것이다
특이적으로 혼성화가능한/특이적으로 상보적인: 본원에 사용되는, 용어 "특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보적인"은 핵산 분자와 표적 핵산 분자 사이에 안정적이고 특이적인 결합이 일어나도록 하는 충분한 정도의 상보성을 나타내는 용어이다. 2개의 핵산 분자 사이의 혼성화는 2개의 핵산 분자의 핵산 서열 사이의 역평행 정렬의 형성을 수반한다. 이어서, 2개의 분자는 대향 가닥 상의 상응하는 염기와 수소 결합을 형성하여 듀플렉스 분자를 형성할 수 있으며, 이것이 충분히 안정적인 경우에 본 기술분야에 주지된 방법을 사용하여 검출가능하다. 핵산 분자는 특이적으로 혼성화가능하도록 그의 표적 서열에 대해 100% 상보적이어야 할 필요는 없다. 그러나, 특이적인 혼성화를 위해 존재해야 하는 서열 상보성의 양은 사용되는 혼성화 조건의 함수이다.
특정한 정도의 엄중도를 발생시키는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 성질 및 혼성화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 비록 세척 횟수 또한 엄중도에 영향을 미치지만, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히 Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 혼성화의 엄중도를 결정할 것이다. 특정한 엄중도를 달성하는데 요구되는 혼성화 조건에 관한 계산은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 Sambrook 등 (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; 및 Hames 및 Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985에 논의되어 있다. 핵산의 혼성화에 관한 추가의 상세한 지침 및 안내는, 예를 들어, Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; 및 Ausubel 등, Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995에서 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 "엄중한 조건"은 혼성화 분자와, 표적 핵산 분자 내의 상동 서열 사이에 20% 미만의 미스매치가 존재하는 경우에만 혼성화가 일어나게 되는 조건을 포괄한다. "엄중한 조건"은 추가의 특정한 수준의 엄중도를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "중간 정도의 엄중도" 조건은 20% 초과의 서열 미스매치를 갖는 분자들이 혼성화되지 않을 조건이고; "고 엄중도" 조건은 10% 초과의 미스매치를 갖는 서열들이 혼성화되지 않을 조건이고; "매우 고도의 엄중도" 조건은 5% 초과의 미스매치를 갖는 서열들이 혼성화되지 않을 조건이다.
하기는 대표적인 비제한적 혼성화 조건이다.
고 엄중도 조건 (적어도 90% 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출함): 16시간 동안 65℃에서 5x SSC, .1% SDS 완충제 중에서의 혼성화; 각각 15분 동안 실온에서 2x SSC, .1% SDS 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 20분 동안 65℃에서 0.5x SSC, .1% SDS 완충제 중에서의 2회 세척.
중간 정도의 엄중도 조건 (적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출함): 16-20시간 동안 65-70℃에서 5x-6x SSC, .1% SDS 완충제 중에서의 혼성화; 각각 5-20분 동안 실온에서 2x SSC, .1% SDS 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 30분 동안 55-70℃에서 1x SSC, .1% SDS 완충제 중에서의 2회 세척.
비-엄중 대조군 조건 (적어도 50% 서열 동일성을 공유하는 서열이 혼성화될 것임): 16-20시간 동안 실온 내지 55℃에서 6x SSC, .1% SDS 완충제 중에서의 혼성화; 각각 20-30분 동안 실온 내지 55℃에서의 2x-3x SSC, .1% SDS 완충제 중에서의 적어도 2회 세척.
인접한 핵산 서열과 관련하여, 본원에 사용된 용어 "실질적으로 상동성인" 또는 "실질적 상동성"은 엄중한 조건 하에서 참조 핵산 서열에 혼성화하는 인접한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의 참조 핵산 서열과 실질적으로 상동성인 핵산 서열은 엄중한 조건 (예컨대, 상기 기재된 중간 정도의 엄중한 조건) 하에서 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의 참조 핵산 서열에 혼성화하는 핵산 서열이다. 실질적으로 상동성인 서열은 적어도 80%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 상동성인 서열은 약 80% 내지 100% 서열 동일성, 예컨대 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94%; 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 및 약 100%를 가질 수 있다. 실질적 상동성의 특성은 특이적 혼성화와 밀접한 관련이 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 특이적 결합을 요망하는 조건 하에서, 예를 들어 엄중한 혼성화 조건 하에서 핵산의 비-표적 서열에 대한 비-특이적 결합을 피하는데 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에 특이적으로 혼성화가능하다.
본원에 사용된 용어 "오르토로그(ortholog)"는 공통 조상 뉴클레오티드 서열로부터 진화하였고, 2 이상의 종에서 동일한 기능을 보유할 수도 있는, 2 이상의 종에서의 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된, 2개의 핵산 분자는 5'에서 3' 방향으로 판독된 서열의 모든 뉴클레오티드가 3'에서 5' 방향으로 판독했을 때 다른 서열의 모든 뉴클레오티드와 상보적인 경우에 "완전한 상보성"을 나타낸다고 언급된다. 참조 뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적인 뉴클레오티드 서열은 참조 뉴클레오티드 서열의 역 상보체 서열과 동일한 서열을 나타낼 것이다. 이들 용어 및 설명은 본 기술분야에 잘 정의되어 있으며, 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해된다.
아미노산 서열 사이의 서열 동일성 백분율을 판정할 때, 정렬에 의해 제공된 주어진 위치에서의 아미노산의 실체는 정렬된 서열을 포함하는 폴리펩티드의 원하는 특성에는 영향을 주지 않으면서 상이할 수 있다는 것은 당업계의 숙련자에게 주지되어 있다. 이러한 경우, 서열 동일성 %은 보존적으로 치환된 아미노산 사이의 유사성을 고려하여 조정될 수 있다. 이러한 조정은 주지되어 있으며, 당업자에 의해 널리 사용된다. 예컨대, Myers 및 Miller (1988), Computer Applications in Biosciences 4:11-7을 참조한다.
따라서, 본 발명의 실시양태는 예시적인 색소체 전이 펩티드 아미노산 서열의 기능적 변이체, 및 상기를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예시적인 전이 펩티드 서열의 기능적 변이체는 예를 들어, 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열의 단편 (예컨대, N-말단 또는 C-말단 단편), 또는 전장의 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열 또는 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열의 단편의 변형된 서열일 수 있다. 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열은 일부 실시양태에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환의 도입으로 변형될 수 있다. "보존적" 아미노산 치환은, 아미노산 잔기가 유사한 기능성 측쇄, 유사한 크기, 및/또는 유사한 소수성을 가지는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 보존적 치환을 도입하기 위해 같은 패밀리의 또 다른 아미노산으로 대체하는 데 사용될 수 있는 아미노산 패밀리는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 아미노산 패밀리로는 하기를 포함한다: 염기성 아미노산 (예컨대, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘); 산성 아미노산 (예컨대, 아스파르트산 및 글루탐산); (생리학적 pH에서) 미하전된 극성 아미노산 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 및 시토신); 비-극성 아미노산 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 및 트립토판); 베타-분지형 아미노산 (예컨대, 트레오닌, 발린, 및 이소류신); 및 방향족 아미노산 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 및 히스티딘). 예컨대, Sambrook 등 (Eds.), 전술함; 및 Innis 등, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, NY, USA를 참조할 수 있다.
작동가능하게 연결된(operably linked): 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열과 기능적인 관계에 있는 경우 제1뉴클레오티드 서열은 제2 뉴클레오티드 서열에 “작동가능하게 연결된다”. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 재조합적으로 생산될 때, 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열은 같은 판독 프레임 내에서, 두 개의 단백질-코딩 영역을 결합할 필요가 있는 경우, 일반적으로 인접하게 된다. 그러나, 뉴클레오티드 서열은 작동가능하게 연결되도록 하기 위해 인접할 필요는 없다.
조절 서열 및 코딩 서열을 참조하여 사용되는 경우에, 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 연결된 코딩 서열의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 서열" 또는 "제어 요소"는 전사의 시기 및 수준/양, RNA 가공 또는 안정성, 또는 회합된 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터; 번역 리더 서열; 인트론; 인핸서; 스템-루프 구조; 리프레서 결합 서열; 종결 서열; 폴리아데닐화 인식 서열 등을 포함할 수 있다. 특정한 조절 서열은 거기에 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 특정한 조절 서열은 이중-가닥 핵산 분자의 회합된 상보적 가닥 상에 위치할 수 있다.
프로모터: 본원에 사용된 용어 "프로모터"는 전사 출발점으로부터 상류에 위치할 수 있고, RNA 중합효소, 및 전사를 개시하는 다른 단백질의 인식 및 결합에 수반될 수 있는 DNA 영역을 지칭한다. 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터일 수 있다. 발생 제어 하에 있는 프로모터의 예는 소정의 조직, 예컨대 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 물관, 헛물관 또는 후막조직에서 전사를 우선적으로 개시하는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 "조직-선호"인 것으로 지칭된다. 소정의 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이적"인 것으로 지칭된다. "세포 유형-특이적" 프로모터는 주로 하나 이상 기관의 소정의 세포 유형, 예를 들어 뿌리 또는 잎의 도관 세포에서의 발현을 구동한다. "유도성" 프로모터는 환경 제어 하에 있을 수 있는 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사를 개시할 수 있는 환경 조건의 예는 혐기성 조건 및 광의 존재를 포함한다. 조직-특이적, 조직-선호, 세포 유형 특이적 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건 하에서 활성일 수 있는 프로모터이다.
임의의 유도성 프로모터가 본 발명의 일부 구현예에서 사용될 수 있다. Ward 등 (1993), Plant Mol. Biol. 22:361-366 참조. 유도성 프로모터의 경우에, 유도제에 대한 반응으로 전사 속도가 증가한다. 예시적인 유도성 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 구리에 반응하는 ACEI 시스템 유래 프로모터; 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 대해 반응하는, 옥수수 유래 In2 유전자; Tn10 유래 Tet 리프레서; 및 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 전사 활성이 유도될 수 있는, 스테로이드 호르몬 유전자 유래 유도성 프로모터 (Schena 등 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421).
예시적인 구성적 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 식물 바이러스 유래 프로모터, 예컨대 CaMV 유래 35S 프로모터; 벼 액틴 유전자 유래 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 옥수수 H3 히스톤 프로모터; 및 브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조적 유전자에 대해 5'의 Xba1/NcoI 단편인, ALS 프로모터 (또는 상기 Xba1/NcoI 단편과 유사한 뉴클레오티드 서열) (국제 PCT 공개 번호 WO96/30530).
추가로, 임의의 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터가 본 발명의 일부 구현예에서 이용될 수 있다. 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 식물은 특이적 조직에서 배타적으로 또는 우선적으로 코딩 서열의 산물을 생산할 수 있다. 예시적인 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 뿌리-선호 프로모터, 예컨대 파세올린(phaseolin) 유전자 유래의 것; 잎-특이적 및 광-유도 프로모터, 예컨대 캡(cab) 또는 루비스코(rubisco) 유래의 것; 꽃밥-특이적 프로모터, 예컨대 LAT52 유래의 것; 화분-특이적 프로모터, 예컨대 Zm13 유래의 것; 및 소포자-선호 프로모터, 예컨대 apg 유래의 것.
형질전환: 본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "형질도입"은 하나 이상의 핵산 분자(들)를 세포 내로 전달하는 것을 지칭한다. 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 통합에 의해 또는 에피솜 복제에 의해, 세포에 의해 안정적으로 복제될 때 세포는 상기 세포 내로 형질도입된 핵산 분자에 의해 "형질전환된다". 본원에 사용된 용어 "형질전환"은 핵산 분자가 이러한 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포괄한다. 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 바이러스 벡터를 사용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환; 전기천공 (Fromm 등 (1986), Nature 319:791-3); 리포펙션 (Felgner 등 (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); 미세주사 (Mueller 등 (1978), Cell 15:579-85); 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 전달 (Fraley 등 (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); 직접 DNA 흡수; 및 미세발사체 충격 (Klein 등 (1987), Nature 327:70).
트랜스젠(transgene): 외인성 핵산 서열. 일부 예에서, 트랜스젠은 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열일 수 있다. 특정 예에서, 트랜스젠은 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드 및 적어도 1개의 추가의 펩티드 서열 (예를 들어, 제초제 내성을 부여하는 펩티드 서열)을 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, 그를 위해서는 색소체 발현이 바람직할 수 있다. 이들 및 다른 예에서, 트랜스젠은 트랜스젠의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, "트랜스제닉"이라는 용어는 유기체 (예를 들어, 식물)를 언급하는 데 사용될 때, 외인성 핵산 서열을 포함하는 유기체를 의미한다. 일부 예에서, 외인성 핵산 서열을 포함하는 유기체는 핵산 서열이 분자 형질전환 기법을 통해 그 안으로 도입되어 있는 유기체일 수 있다. 다른 예에서, 외인성 핵산 서열을 포함하는 유기체는 핵산 서열이 식물에서 예를 들어, 유전자 이입 또는 타가 수분에 의해서 그 안으로 도입되어 있는 유기체일 수 있다.
수송: 본원에서 사용되는 바, "수송(들)," "표적(들)," 및 "전달(들)"이라는 용어는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 숙주 세포의 핵으로부터 숙주 세포의 색소체로 이동하는 것을 용이하게 하는 본 발명의 소정의 아미노산 서열의 특성을 의미한다. 특정 실시양태에서, 이러한 아미노산 서열 (즉, CTP)은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 약 100%, 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 85%, 적어도 약 80%, 적어도 약 70%, 적어도 약 60%, 및/또는 적어도 약 50%를 숙주 세포의 색소체로 수송할 수 있다.
벡터: 예를 들어 형질전환된 세포를 생산하기 위해 세포 내로 도입되는 핵산 분자. 벡터는 숙주 세포에서 복제가 가능한 핵산 서열, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터의 예는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드; 코스미드; 박테리오파지; 또는 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 벡터는 또한 하나 이상의 유전자, 안티센스 분자, 및/또는 선택성 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전적 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환, 또는 감염시켜 세포가 벡터에 의해 코딩된 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현할 수 있도록 할 수 있다. 벡터는 선택적으로 핵산 분자를 세포 내로 진입시키는데 도움을 주는 물질(예를 들어, 리포솜, 단백질 코팅 등)을 포함한다.
구체적으로 명시 또는 암시되지 않는 한, 용어 단수 형태는 본원에 사용된 "적어도 하나"를 의미한다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서의 일반 용어에 대한 정의들은 예를 들어, Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew 등 (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에서 발견할 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 백분율은 중량 기준이고 모든 용매 혼합물 비율은 부피 기준이다. 모든 온도는 섭씨 온도이다.
IV. TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28-코딩 서열을 포함하는 핵산 분자
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 TraP10 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 TraP11 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 TraP17 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 TraP18 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 TraP19 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 TraP26 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 TraP27 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
특정 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열은 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수도 있다. 특정 실시양태에서, TraP10 펩티드 서열이 관심 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, TraP11 펩티드 서열이 관심 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, TraP17 펩티드 서열이 관심 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, TraP18 펩티드 서열이 관심 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, TraP19 펩티드 서열이 관심 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, TraP26 펩티드 서열이 관심 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, TraP27 펩티드 서열이 관심 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, TraP28 펩티드 서열이 관심 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태에 제공된 핵산 분자에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈 및 관심 뉴클레오티드 서열의 제1 코돈은 예를 들어 "정지" 코돈에 대한 코딩 없이도 임의의 수의 뉴클레오티드 삼중체로 분리될 수 있다. 일부 예에서, 천연 전구체 폴리펩티드 중 전이 펩티드와 통상적으로 연관된 성숙한 단백질의 제1 아미노산을 코딩하는 서열은 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈과 관심 뉴클레오티드 서열의 제1 코돈 사이에 존재할 수 있다. TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 관심 뉴클레오티드 서열의 제1 코돈을 분리하는 서열은 예를 들어 임의의 서열로 이루어질 수 있으며, 코딩된 아미노산 서열은 키메라 폴리펩티드의 번역 및 그의 색소체로의 전위를 유의하게 변경시키지 않는 경향이 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈은 그에 직접 인접한 관심 뉴클레오티드 서열의 제1 코돈과 래지스터 상태로 융합되거나, 또는 짧은 펩티드 서열, 예컨대 합성 뉴클레오티드 링커에 의해 코딩된 것 (예를 들어, 융합을 달성하기 위해 사용될 수 있는 뉴클레오티드 링커) 이하로 그로부터 분리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 특정 숙주에서 코딩 서열의 발현을 향상시키기 위해 단일 코딩 서열에서 관심 뉴클레오티드 서열 및/또는 그에 융합된 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28-코딩 서열의 뉴클레오티드를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 유전자 코드는 64개의 가능한 코돈이 중복되지만, 대부분의 유기체는 우선적으로 이들 코돈의 하위조합을 사용한다. 종에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈은 최적 코돈이라 부르며, 가장 빈번하게 사용되지 않는 것들은 희귀 또는 저 사용 코돈으로 분류된다. Zhang 등 (1991), Gene 105:61-72. 코돈은 때때로 "코돈 최적화"라 불리는 공정에서 특정 숙주의 선호하는 코돈 사용을 반영하도록 치환될 수 있다. 특정 원핵성 또는 진핵성 숙주가 선호하는 코돈을 함유하는 최적화된 코딩 서열은 예를 들어 번역 속도를 증가시키거나 바람직한 특성(예를 들어, 비-최적화 서열로부터 생성된 전사체와 비교할 때, 보다 긴 반감기)을 갖는 재조합 RNA 전사체를 생성하도록 함으로써 제조될 수 있다.
일부 실시양태는 TraP10 기능적 변이체를 포함한다. TraP10 기능적 변이체는, 예를 들어 제한 없이 하기를 포함한다: 서열번호 1로 기재된 TraP10의 상동체 및 오르토로그; 서열번호 1 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 절단된 TraP10 펩티드; 서열번호 1 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 더 긴 엽록체 전이 펩티드; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 1 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 색소체 함유 세포에서 작동가능하게 연결된 펩티드를 색소체로 향하게 하는 것으로 입증된 하나 이상의 비 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 1 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드.
일부 실시양태는 TraP11 기능적 변이체를 포함한다. TraP11 기능적 변이체는, 예를 들어 제한 없이 하기를 포함한다: 서열번호 2로 기재된 TraP11의 상동체 및 오르토로그; 서열번호 2 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 절단된 TraP11 펩티드; 서열번호 2 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 더 긴 엽록체 전이 펩티드; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 색소체 함유 세포에서 작동가능하게 연결된 펩티드를 색소체로 향하게 하는 것으로 입증된 하나 이상의 비 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 2 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드.
일부 실시양태는 TraP17 기능적 변이체를 포함한다. TraP17 기능적 변이체는, 예를 들어 제한 없이 하기를 포함한다: 서열번호 3으로 기재된 TraP17의 상동체 및 오르토로그; 서열번호 3 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 절단된 TraP17 펩티드; 서열번호 3 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 더 긴 엽록체 전이 펩티드; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 3 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 색소체 함유 세포에서 작동가능하게 연결된 펩티드를 색소체로 향하게 하는 것으로 입증된 하나 이상의 비 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 3 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드.
일부 실시양태는 TraP18 기능적 변이체를 포함한다. TraP18 기능적 변이체는, 예를 들어 제한 없이 하기를 포함한다: 서열번호 4로 기재된 TraP18의 상동체 및 오르토로그; 서열번호 4 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 절단된 TraP18 펩티드; 서열번호 4 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 더 긴 엽록체 전이 펩티드; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 4 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 색소체 함유 세포에서 작동가능하게 연결된 펩티드를 색소체로 향하게 하는 것으로 입증된 하나 이상의 비 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 4 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드.
일부 실시양태는 TraP19 기능적 변이체를 포함한다. TraP19 기능적 변이체는, 예를 들어 제한 없이 하기를 포함한다: 서열번호 5로 기재된 TraP19의 상동체 및 오르토로그; 서열번호 5 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 절단된 TraP19 펩티드; 서열번호 5 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 더 긴 엽록체 전이 펩티드; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 5 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 색소체 함유 세포에서 작동가능하게 연결된 펩티드를 색소체로 향하게 하는 것으로 입증된 하나 이상의 비 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 5 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드.
일부 실시양태는 TraP26 기능적 변이체를 포함한다. TraP26 기능적 변이체는, 예를 들어 제한 없이 하기를 포함한다: 서열번호 6으로 기재된 TraP26의 상동체 및 오르토로그; 서열번호 6 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 절단된 TraP26 펩티드; 서열번호 6 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 더 긴 엽록체 전이 펩티드; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 6 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 색소체 함유 세포에서 작동가능하게 연결된 펩티드를 색소체로 향하게 하는 것으로 입증된 하나 이상의 비 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 6 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드. 일부 실시양태는 TraP27 기능적 변이체를 포함한다. TraP27 기능적 변이체는, 예를 들어 제한 없이 하기를 포함한다: 서열번호 7로 기재된 TraP27의 상동체 및 오르토로그; 서열번호 7 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 절단된 TraP27 펩티드; 서열번호 7 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 더 긴 엽록체 전이 펩티드; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 7 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 색소체 함유 세포에서 작동가능하게 연결된 펩티드를 색소체로 향하게 하는 것으로 입증된 하나 이상의 비 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 7 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드.
일부 실시양태는 TraP28 기능적 변이체를 포함한다. TraP28 기능적 변이체는, 예를 들어 제한 없이 하기를 포함한다: 서열번호 8으로 기재된 TraP28의 상동체 및 오르토로그; 서열번호 8 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 절단된 TraP28 펩티드; 서열번호 8 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 더 긴 엽록체 전이 펩티드; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 8 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드; 색소체 함유 세포에서 작동가능하게 연결된 펩티드를 색소체로 향하게 하는 것으로 입증된 하나 이상의 비 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 8 내 인접 아미노산 서열을 포함하는 엽록체 전이 펩티드.
본 발명의 일부 실시양태는 또한 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27 또는 TraP28 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 예를 들어, 분자 생물학 기술에서의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27 또는 TraP28-코딩 서열의 조작을 용이하게 하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27 또는 TraP28-코딩 서열은 발현 벡터 내로 서열의 서브 클로닝하기 위한 적합한 벡터 내로 도입될 수도 있으며, 또는 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27 또는 TraP28-코딩 서열은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27 또는 TraP28-코딩 서열을 포함하는 추가 핵산 분자의 생산을 용이하게 하는 핵산 분자 내로 도입될 수 있다.
특정 예에서, TraP10 펩티드는 72 이하의 아미노산 길이이다. 예를 들어, TraP10 펩티드는 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62 또는 그보다 적은 아미노산 길이일 수 있다. 특정 예에서, TraP10 펩티드는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다. 따라서, TraP10 펩티드는 서열번호 1을 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함할 수 있고, 여기서, TraP10 펩티드 또는 그의 기능성 변이체의 길이는 72 이하의 아미노산 길이이다. 소정의 예에서, TraP10 펩티드 또는 그의 기능성 변이체는 예를 들어 서열번호 1에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어 서열번호 1의 TraP10 펩티드, 또는 서열번호 1의 전체 서열 미만을 포함하는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모두 당업자에 의해 즉시 인식될 수 있을 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 특정 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. TraP10 펩티드를 코딩하는 특정 서열을 선택하는 것은 실무자의 재량에 달려 있다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주에서 TraP10 펩티드의 발현을 증가시키기 위해서는 숙주의 코돈 사용 빈도 편향을 반영하는 코딩 서열이 선택될 수 있다. 일례로, TraP10 펩티드는 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
특정 예에서, TraP11 펩티드는 68 이하의 아미노산 길이이다. 예를 들어, TraP11 펩티드는 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59 또는 그보다 적은 아미노산 길이일 수 있다. 특정 예에서, TraP11 펩티드는 서열번호 2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다. 따라서, TraP11 펩티드는 서열번호 2를 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함할 수 있고, 여기서, TraP11 펩티드 또는 그의 기능성 변이체의 길이는 68 이하의 아미노산 길이이다. 소정의 예에서, TraP11 펩티드 또는 그의 기능성 변이체는 예를 들어 서열번호 2에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어 서열번호 2의 TraP11 펩티드, 또는 서열번호 2의 전체 서열 미만을 포함하는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모두 당업자에 의해 즉시 인식될 수 있을 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 특정 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. TraP11 펩티드를 코딩하는 특정 서열을 선택하는 것은 실무자의 재량에 달려 있다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주에서 TraP11 펩티드의 발현을 증가시키기 위해서는 숙주의 코돈 사용 빈도 편향을 반영하는 코딩 서열이 선택될 수 있다. 일례로, TraP11 펩티드는 서열번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
특정 예에서, TraP17 펩티드는 66 이하의 아미노산 길이이다. 예를 들어, TraP17 펩티드는 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58 또는 그보다 적은 아미노산 길이일 수 있다. 특정 예에서, TraP17 펩티드는 서열번호 3에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다. 따라서, TraP17 펩티드는 서열번호 3을 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함할 수 있고, 여기서, TraP17 펩티드 또는 그의 기능성 변이체의 길이는 66 이하의 아미노산 길이이다. 소정의 예에서, TraP17 펩티드 또는 그의 기능성 변이체는 예를 들어 서열번호 3에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어 서열번호 3의 TraP17 펩티드, 또는 서열번호 3의 전체 서열 미만을 포함하는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모두 당업자에 의해 즉시 인식될 수 있을 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 특정 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. TraP17 펩티드를 코딩하는 특정 서열을 선택하는 것은 실무자의 재량에 달려 있다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주에서 TraP17 펩티드의 발현을 증가시키기 위해서는 숙주의 코돈 사용 빈도 편향을 반영하는 코딩 서열이 선택될 수 있다. 일례로, TraP17 펩티드는 서열번호 11에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
특정 예에서, TraP18 펩티드는 67 이하의 아미노산 길이이다. 예를 들어, TraP18 펩티드는 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59 또는 그보다 적은 아미노산 길이일 수 있다. 특정 예에서, TraP18 펩티드는 서열번호 4에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다. 따라서, TraP18 펩티드는 서열번호 4를 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함할 수 있고, 여기서, TraP18 펩티드 또는 그의 기능성 변이체의 길이는 67 이하의 아미노산 길이이다. 소정의 예에서, TraP18 펩티드 또는 그의 기능성 변이체는 예를 들어 서열번호 4에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어 서열번호 4의 TraP18 펩티드, 또는 서열번호 4의 전체 서열 미만을 포함하는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모두 당업자에 의해 즉시 인식될 수 있을 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 특정 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. TraP18 펩티드를 코딩하는 특정 서열을 선택하는 것은 실무자의 재량에 달려 있다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주에서 TraP18 펩티드의 발현을 증가시키기 위해서는 숙주의 코돈 사용 빈도 편향을 반영하는 코딩 서열이 선택될 수 있다. 일례로, TraP18 펩티드는 서열번호 12에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
특정 예에서, TraP19 펩티드는 67 이하의 아미노산 길이이다. 예를 들어, TraP19 펩티드는 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59 또는 그보다 적은 아미노산 길이일 수 있다. 특정 예에서, TraP19 펩티드는 서열번호 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다. 따라서, TraP19 펩티드는 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함할 수 있고, 여기서, TraP19 펩티드 또는 그의 기능성 변이체의 길이는 67 이하의 아미노산 길이이다. 소정의 예에서, TraP19 펩티드 또는 그의 기능성 변이체는 예를 들어 서열번호 5에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어 서열번호 5의 TraP19 펩티드, 또는 서열번호 5의 전체 서열 미만을 포함하는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모두 당업자에 의해 즉시 인식될 수 있을 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 특정 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. TraP19 펩티드를 코딩하는 특정 서열을 선택하는 것은 실무자의 재량에 달려 있다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주에서 TraP19 펩티드의 발현을 증가시키기 위해서는 숙주의 코돈 사용 빈도 편향을 반영하는 코딩 서열이 선택될 수 있다. 일례로, TraP19 펩티드는 서열번호 13에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
특정 예에서, TraP26 펩티드는 60 이하의 아미노산 길이이다. 예를 들어, TraP26 펩티드는 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 또는 그보다 적은 아미노산 길이일 수 있다. 특정 예에서, TraP26 펩티드는 서열번호 6에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다. 따라서, TraP26 펩티드는 서열번호 6을 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함할 수 있고, 여기서, TraP26 펩티드 또는 그의 기능성 변이체의 길이는 60 이하의 아미노산 길이이다. 소정의 예에서, TraP26 펩티드 또는 그의 기능성 변이체는 예를 들어 서열번호 6에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어 서열번호 6의 TraP26 펩티드, 또는 서열번호 6의 전체 서열 미만을 포함하는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모두 당업자에 의해 즉시 인식될 수 있을 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 특정 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. TraP26 펩티드를 코딩하는 특정 서열을 선택하는 것은 실무자의 재량에 달려 있다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주에서 TraP26 펩티드의 발현을 증가시키기 위해서는 숙주의 코돈 사용 빈도 편향을 반영하는 코딩 서열이 선택될 수 있다. 일례로, TraP26 펩티드는 서열번호 14에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
특정 예에서, TraP27 펩티드는 61 이하의 아미노산 길이이다. 예를 들어, TraP27 펩티드는 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54 또는 그보다 적은 아미노산 길이일 수 있다. 특정 예에서, TraP27 펩티드는 서열번호 7에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다. 따라서, TraP27 펩티드는 서열번호 7을 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함할 수 있고, 여기서, TraP27 펩티드 또는 그의 기능성 변이체의 길이는 61 이하의 아미노산 길이이다. 소정의 예에서, TraP27 펩티드 또는 그의 기능성 변이체는 예를 들어 서열번호 7에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어 서열번호 7의 TraP27 펩티드, 또는 서열번호 7의 전체 서열 미만을 포함하는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모두 당업자에 의해 즉시 인식될 수 있을 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 특정 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. TraP27 펩티드를 코딩하는 특정 서열을 선택하는 것은 실무자의 재량에 달려 있다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주에서 TraP27 펩티드의 발현을 증가시키기 위해서는 숙주의 코돈 사용 빈도 편향을 반영하는 코딩 서열이 선택될 수 있다. 일례로, TraP27 펩티드는 서열번호 15에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
특정 예에서, TraP28 펩티드는 60 이하의 아미노산 길이이다. 예를 들어, TraP28 펩티드는 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 또는 그보다 적은 아미노산 길이일 수 있다. 특정 예에서, TraP28 펩티드는 서열번호 8에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다. 따라서, TraP28 펩티드는 서열번호 8을 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 변이체를 포함할 수 있고, 여기서, TraP28 펩티드 또는 그의 기능성 변이체의 길이는 60 이하의 아미노산 길이이다. 소정의 예에서, TraP28 펩티드 또는 그의 기능성 변이체는 예를 들어 서열번호 8에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어 서열번호 8의 TraP28 펩티드, 또는 서열번호 8의 전체 서열 미만을 포함하는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모두 당업자에 의해 즉시 인식될 수 있을 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 특정 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. TraP28 펩티드를 코딩하는 특정 서열을 선택하는 것은 실무자의 재량에 달려 있다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주에서 TraP28 펩티드의 발현을 증가시키기 위해서는 숙주의 코돈 사용 빈도 편향을 반영하는 코딩 서열이 선택될 수 있다. 일례로, TraP28 펩티드는 서열번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
임의의 폴리펩티드는 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드 서열의 통합에 의해 색소체 함유 세포의 색소체로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 연결된 폴리펩티드- TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 분자가 발현되는 세포에서 폴리펩티드를 색소체로 유도하도록, 폴리펩티드는 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드 서열에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 서열의 통합에 의해 색소체로 표적화되는 폴리펩티드는 예를 들어, 보통은 폴리펩티드가 천연적으로 발현되는 세포의 색소체에서 발현되는 것인 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 및 제한 없이, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 서열의 통합에 의해 색소체로 표적화되는 폴리펩티드는 제초제 내성, 바이러스 내성, 박테리아 병원체 내성, 곤충 내성, 선충 내성, 또는 진균 내성에 관여하는 폴리펩티드일 수 있다. 예컨대, 미국 특허 5,569,823; 5,304,730; 5,495,071; 6,329,504; 및 6,337,431을 참조한다. 대안적으로, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 서열의 통합에 의해 색소체로 표적화되는 폴리펩티드는 예를 들어, 및 제한 없이, 식물 생장력 또는 수율에 관여하는 폴리펩티드 (극한 온도, 토양 조건, 조도, 수위, 질소 수준, 및 화학적 환경에 대한 내성에 관여하는 폴리펩티드 포함), 또는 관심 형질을 포함하는 식물을 확인하기 위한 마커로서 사용될 수 있는 폴리펩티드 (예컨대, 선택성 마커 유전자 생성물, 종자 색상에 관여하는 폴리펩티드 등)일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드 서열에 연결될 수 있는, 제초제 내성에 관여하는 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 아세토락타아제 신타제 (ALS), 돌연변이화된 ALS, 및 ALS의 전구체 (예컨대, 미국 특허 5,013,659 참조); EPSPS (예컨대, 미국 특허 4,971,908 및 6,225,114 참조), 예컨대, 일부 실시양태에서 DGT-28 또는 부류 IV EPSPS, 또는 다른 실시양태에서 CP4 EPSPS 또는 부류 III EPSPS; 광합성, 및 지방산, 아미노산, 오일, 카로티노이드, 테르페노이드, 전분 등의 합성을 비롯한, 색소체에 발생하는 생리학적 과정을 변형시키는 효소를 포함한다. 특정 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드에 연결될 수 있는 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 제아크산틴 에폭시다제, 콜린 모노옥시게나제, 페로킬라타제, 오메가-3 지방산 불포화효소, 글루타민 합성효소, 전분 개질 효소, 필수 아미노산, 프로비타민 A, 호르몬, Bt 독소 단백질 등의 합성에 관여하는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 언급된 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에서 구할 수 있고, 이러한 뉴클레오티드 서열은 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드에 연결된 관심 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드로 발현되도록 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 추가로, 상기 언급된 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 서열은 (예를 들어, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 다른 유전자와 고도한 상동성을 가지는 유전자를 클로닝함으로써) 당업자에 의해 확인될 수 있다. 일단 이러한 뉴클레오티드 서열이 확인되고 나면, 확인된 뉴클레오티드 서열, 또는 등가의 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28-코딩 서열을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열을 설계할 수 있다.
V. TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 발현
일부 실시양태에서, 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 1개의 핵산 분자(들)는 그 안에서 폴리펩티드를 발현시키기 위한 것인 세포, 조직, 또는 유기체 내로 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드 및 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 적어도 1개의 추가의 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 색소체 함유 숙주 세포, 조직, 또는 유기체 (예컨대, 식물 세포, 식물 조직, 및 식물) 내로 도입될 수 있고, 이로써, 폴리펩티드는 색소체 함유 숙주 세포, 조직, 또는 유기체에서 핵산 분자로부터 발현될 수 있으며, 여기서, 발현된 폴리펩티드는 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드 및 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 적어도 추가의 펩티드 서열을 포함한다. 특정 일례에서, 이러한 발현된 폴리펩티드의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드는 적어도 상기 추가의 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 숙주 세포, 조직, 또는 유기체의 색소체로 표적화하는 것을 촉진시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 당업자에게 공지된 방법들 중 임의의 임의의 한 방법에 의해 색소체 함유 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자를 세포, 조직, 또는 유기체 내로 도입시키기 위해 숙주 세포, 조직, 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자를 세포 내로 도입시키고, 핵산 분자를 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합시키기 위해 세포를 핵산 분자로 형질전환시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 세포, 예를 들어, 색소체 함유 세포 (예컨대, 식물 세포)의 형질전환에 사용될 수 있다. 발현을 개시하거나, 증진시키기 위해, 핵산 분자는 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있으며, 상기 조절 서열은 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
핵산 분자는 예를 들어, 선형 또는 폐환형 플라스미드를 비롯한, 벡터 시스템일 수 있다. 특정 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 예를 들어, 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이러한 목적을 위해 많은 벡터가 이용가능하고, 특정 벡터의 선택은 예를 들어, 벡터 내로 삽입시키고자 하는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정한 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 벡터는 전형적으로 다양한 성분을 함유하며, 그의 정체는 벡터의 기능 (예컨대, DNA 증폭 및 DNA 발현), 및 벡터와 화합성인 특정 숙주 세포(들)에 따라 달라진다.
일부 실시양태는 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)에 작동적으로 연결된 상기 기술된 조절 서열 중 적어도 1개를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 형질전환 벡터를 포함할 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드 서열은 식물 세포, 조직, 또는 유기체에서 조절 서열(들)의 제어하에 발현됨으로써 폴리펩티드의 적어도 일부를 식물 세포, 조직, 또는 유기체의 색소체로 표적화하는 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 숙주 세포, 예컨대, 핵산 분자가 증폭되는 박테리아 세포, 또는 핵산 분자가 발현되는 식물 세포에서 작용하는 프로모터일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 유도성, 바이러스성, 합성 또는 구성적 프로모터를 포함하며, 이들 모두 본 기술분야에 주지되어 있다. 본 발명의 실시양태에서 유용할 수 있는 프로모터의 비제한적인 일례는 미국 특허 제6,437,217호 (옥수수 RS81 프로모터); 제5,641,876호 (벼 액틴 프로모터); 제6,426,446호 (옥수수 RS324 프로모터); 제6,429,362호 (옥수수 PR-1 프로모터); 제6,232,526호 (옥수수 A3 프로모터); 제6,177,611호 (구성적 옥수수 프로모터); 제5,322,938호, 제5,352,605호, 제5,359,142호, 및 제5,530,196호 (35S 프로모터); 제6,433,252호 (옥수수 L3 올레오신 프로모터); 제6,429,357호 (벼 액틴 2 프로모터, 및 벼 액틴 2 인트론); 제6,294,714호 (광-유도성 프로모터); 제6,140,078호 (염-유도성 프로모터); 제6,252,138호 (병원성-유도성 프로모터); 제6,175,060호 (인 결핍-유도성 프로모터); 제6,388,170호 (양방향성 프로모터); 제6,635,806호 (감마-코익신 프로모터); 및 미국 특허 출원 번호 제09/757,089호 (옥수수 엽록체 알돌라제 프로모터)에 의해 제공되어 있다.
추가의 예시적인 프로모터는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 (Ebert 등 (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (이는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도성 플라스미드 상에 운반됨); 콜리모바이러스 프로모터(caulimovirus promoter), 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus, CaMV) 19S 프로모터 (Lawton 등 (1987), Plant Mol. Biol. 9:315-24); CaMV 35S 프로모터 (Odell 등 (1985), Nature 313:810-2; 피그워트 모자이크 바이러스(figwort mosaic virus) 35S-프로모터 (Walker 등 (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); 수크로스 신타제 프로모터 (Yang 및 Russell (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); R 유전자 복합체 프로모터 (Chandler 등 (1989), Plant Cell 1:1175-83); 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV 35S (미국 특허 제5,322,938호, 제5,352,605호, 제5,359,142호 및 제5,530,196호); FMV35S (미국 특허 제6,051,753호, 및 제5,378,619호); PC1SV 프로모터 (미국 특허 제5,850,019호); SCP1 프로모터 (미국 특허 제6,677,503호); 및 AGRtu.nos 프로모터 (유전자은행 수탁 번호 V00087; Depicker 등 (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan 등 (1983), Nature 304:184-7)을 포함한다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 조직-특이적 프로모터를 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 유기체의 다른 조직과 비교하여, 프로모터가 특이적인 조직에서 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 더 높은 수준으로 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 조직-특이적 프로모터의 예로는 제한 없이, 융단 조직-특이적 프로모터; 수술-특이적 프로모터; 화분-특이적 프로모터 (예컨대, 미국 특허 번호 제7,141,424호, 및 국제 PCT 공개 번호 WO 99/042587 참조); 배주-특이적 프로모터; (예컨대, 미국 특허 출원 번호 2001/047525 A1 참조); 과실-특이적 프로모터 (예컨대, 미국 특허 번호 제4,943,674호, 및 제5,753,475호 참조); 및 종자-특이적 프로모터 (예컨대, 미국 특허 번호 제5,420,034호, 및 제5,608,152호 참조)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발생 단계-특이적 프로모터 (예컨대, 발생 후기 단계에서 활성을 가진 프로모터)가 본 발명의 조성물 또는 방법에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열로는 번역 리더 서열로서의 작용을 하는, 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치하는 5' UTR을 포함한다. 번역 리더 서열은 완전히 가공된 mRNA에 존재하며, 그것은 일차 전사물의 가공 및/또는 RNA 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 번역 리더 서열의 예는 옥수수 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 제5,362,865호), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, Turner and Foster (1995), Molecular Biotech. 3(3):225-36을 참조한다. 5' UTR의 비제한적인 예는 GmHsp (미국 특허 제5,659,122호); PhDnaK (미국 특허 제5,362,865호); AtAnt1; TEV (Carrington 및 Freed (1990), J. Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (유전자은행 수탁 번호 V00087; 및 Bevan 등 (1983), Nature 304:184-7)에 의해 제공된다.
일부 실시양태에서 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열로는 또한 3' 비번역 서열, 3' 전사 종결 영역, 또는 폴리아데닐화 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 이들은 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치한 유전 요소이며, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사 또는 mRNA 가공에 영향을 미칠 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드를 mRNA 전구체의 3' 말단에 부가하는 작용을 한다. 폴리아데닐화 요소는 다양한 식물 유전자로부터 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비-제한적인 일례로는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; Fraley 등 (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)이 있다. 상이한 3' 비번역 영역의 사용에 관한 일례는 Ingelbrecht 등, (1989), Plant Cell 1:671-80에 제공되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비제한적인 일례로 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자로부터의 것 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi 등 (1984), EMBO J. 3:1671-9) 및 AGRtu.nos (유전자은행 수탁 번호 E01312)를 포함한다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 식물 세포와 같은 형질전환된 세포 상에 선택성 표현형을 부여하는 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택성 마커는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 세포의 선택에 또한 사용될 수 있다. 마커는 살생물제 내성, 항생제 내성 (예를 들어, 카나마이신, 제네티신(Geneticin) (G418), 블레오마이신, 히그로마이신 등), 또는 제초제 내성 (예를 들어, 글리포세이트 등)을 코딩할 수 있다. 선택성 마커의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 카나마이신 내성을 코딩하고 카나마이신, G418 등의 사용의 경우에 선택될 수 있는 neo 유전자; 비알라포스 내성을 코딩하는 bar 유전자; 글리포세이트 내성을 코딩하는 돌연변이체 EPSP 신타제 유전자; 브로목시닐에 대한 내성을 부여하는 니트릴라제(nitrilase) 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 내성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 (ALS) 유전자; 및 메토트렉세이트 내성 DHFR 유전자. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 겐타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신, 스펙티노마이신, 리팜피신, 스트렙토마이신 및 테트라시클린 등에 대한 내성을 부여하는 다수 선택성 마커가 이용가능하다. 이러한 선택성 마커의 예는, 예를 들어 미국 특허 제5,550,318호; 제5,633,435호; 제5,780,708호 및 제6,118,047호에 예시되어 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 또한 또는 대안적으로 스크리닝가능 마커를 포함할 수 있다. 스크리닝가능 마커는 발현을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝가능 마커는 다양한 발색원성 기질이 공지된 효소를 코딩하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자 (GUS) (Jefferson 등 (1987), Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); 식물 조직에서 안토시아닌 안료 (적색)의 생산을 조절하는 산물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta 등 (1988) “Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.”In 18 th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); β-락타마제 유전자 (Sutcliffe 등 (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); 다양한 발색원성 기질이 공지된 효소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PADAC, 발색원성 세팔로스포린); 루시페라제 유전자 (Ow 등 (1986), Science 234:856-9); 발색원성 카테콜을 전환시키는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowski 등 (1983), Gene 46(2-3):247-55); 아밀라제 유전자 (Ikatu 등 (1990), Bio/Technol. 8:241-2); 티로신을 DOPA 및 도파퀴논 (이들은 차례로 멜라닌으로 축합됨)으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz 등 (1983), J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); 및 α-갈락토시다제를 포함한다.
숙주 세포를 형질전환시키는 적합한 방법은, 예를 들어 제한 없이, 원형질체의 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,508,184호 참조), 건조/억제-매개 DNA 흡수에 의해 (예를 들어, Potrykus 등 (1985), Mol. Gen. Genet. 199:183-8 참조), 전기천공에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,384,253호 참조), 탄화규소 섬유와의 교반에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호 참조), 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,563,055호; 제5,591,616호; 제5,693,512호; 제5,824,877호; 제5,981,840호; 및 제6,384,301호 참조) 및 DNA-코팅된 입자의 가속화 (예를 들어, 미국 특허 제5,015,580호; 제5,550,318호; 제5,538,880호; 제6,160,208호; 제6,399,861호; 및 제6,403,865호 참조) 등에 의해 DNA를 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 실질적으로 임의의 종의 세포는 안정적으로 형질전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질전환 DNA는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 다세포 종의 경우에, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 유기체로 재생될 수 있다. 이들 기술 중 어느 하나를 사용함으로써, 예를 들어 트랜스제닉 식물의 게놈 중에 하나 이상의 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있다.
발현 벡터를 식물 내로 도입하는데 가장 널리 사용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. A. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 A. 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. A. 투메파시엔스 및 A. 리조게네스의 각각 Ti 및 Ri 플라스미드는 식물의 유전 형질전환을 담당하는 유전자를 운반한다. Ti (종양-유도)-플라스미드는 형질전환된 식물로 전달되는, T-DNA로서 공지된 큰 절편을 함유한다. Ti 플라스미드의 또 다른 절편인 vir 영역은 T-DNA 전달을 담당한다. T-DNA 영역은 말단 반복물에 의해 경계지어진다. 일부 변형된 이원 벡터에서, 종양-유도성 유전자는 결실되었고, vir 영역의 기능을 이용하여 T-DNA 보더 서열에 의해 경계지어진 외래 DNA를 전달한다. T-영역은 또한 예를 들어, 트랜스제닉 식물 및 세포의 효율적인 회수를 위한 선택성 마커, 및 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28-코딩 핵산과 같은 전달을 위한 서열의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위를 함유할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 식물 형질전환 벡터는 A. 투메파시엔스의 Ti 플라스미드 (예를 들어, 미국특허 제4,536,475호, 제4,693,977호, 제4,886,937호, 및 제5,501,967호; 및 유럽특허 제EP 0 122 791호 참조) 또는 A. 리조게네스의 Ri 플라스미드로부터 유래된다. 추가의 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어, 제한하지 않고 Herrera-Estrella 등 (1983), Nature 303:209-13; Bevan 등 (1983), Nature 304:184-7; Klee 등 (1985), Bio/Technol. 3:637-42에 의해; 및 유럽 특허 번호 EP 0 120 516에 기재된 것, 및 상기 중 어느 하나로부터 유래된 것을 포함한다. 식물과 상호작용하는 다른 박테리아, 예컨대 시노리조비움(Sinorhizobium), 리조비움(Rhizobium) 및 메소리조비움(Mesorhizobium)은 자연적으로 변형되어 수많은 다양한 식물로의 유전자 전달을 매개할 수 있다. 이들 식물-연관 공생 박테리아는 결손된(disarmed) Ti 플라스미드 및 적합한 이원 벡터 둘 다의 획득에 의해 유전자 전달에 적격으로 만들 수 있다.
외인성 DNA를 수용자 세포에 제공한 후, 형질전환된 세포는 일반적으로 추가 배양 및 식물 재생을 위해 식별된다. 형질전환된 세포를 식별할 수 있는 능력을 개선시키기 위해, 형질전환체를 생성하는데 사용된 형질전환 벡터와 함께, 상기 기재된 바와 같은 선택성 또는 스크리닝가능 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 선택성 마커가 사용되는 경우, 세포를 선택적 작용제 또는 작용제들에 노출시킴으로써 잠재적으로 형질전환된 세포 집단 내에서 형질전환된 세포가 식별된다. 스크리닝가능 마커가 사용되는 경우에, 세포는 목적하는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝될 수 있다.
선택적 작용제에 대한 노출에서 생존하는 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 스코어링된 세포는 식물의 재생을 지지하는 배지에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)는 추가 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함시킴으로써 변형될 수 있다. 식물 재생 노력을 시작하는 데 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 수동 선택을 수회에 걸쳐 반복 수행한 후, 조직의 형태가 재생에 적합한 상태가 될 때까지 (예를 들어, 적어도 2주) 성장 조절제를 포함하는 기초 배지 상에서 조직을 유지시킬 수 있고, 이어서 이를 싹 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 배양은 충분한 싹 형성이 발생할 때까지 주기적으로 옮겨진다. 싹이 형성되면, 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨진다. 충분한 뿌리가 형성되면, 식물은 추가의 성장 및 성숙을 위해 토양으로 옮겨질 수 있다.
재생 식물 중 관심 핵산 분자 (예를 들어, 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정법이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, PCR 및 핵산 서열분석; 생화학적 검정, 예컨대 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯)에 의해, 또는 효소 기능에 의해 단백질 산물의 존재를 검출하는 것; 식물 부분 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 전체 재생 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
통합 이벤트는, 예를 들어 관심 뉴클레오티드 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 예컨대 PCR 증폭에 의해 분석될 수 있다. PCR 유전자형결정은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유하는 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 이어서 PCR 증폭 산물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형결정 방법은 잘 기재되어 있고 (예를 들어, Rios, G. 등 (2002), Plant J. 32:243-53 참조), 임의의 식물 종 (예를 들어, Z. 메이스 또는 G. 맥스) 또는 세포 배양물을 포함한 조직 유형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다. 아그로박테리움-의존성 형질전환 방법을 이용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로는 하나의 염색체 내로 삽입된 단일 재조합 DNA 서열을 함유한다. 단일 재조합 DNA 서열은 "트랜스제닉 이벤트" 또는 "통합 이벤트"으로서 언급된다. 이러한 트랜스제닉 식물은 삽입된 DNA 서열에 대해 이형접합성일 가능성이 크다. 일부 실시양태에서, 트랜스젠과 관련하여 동형접합인 트랜스제닉 식물은 단일 외인성 유전자 서열을 함유하는 독립 분리개체 트랜스제닉 식물을 그 자신, 예를 들어 T0 식물과 유성 생식으로 성적 교배 (자가수분)시켜 T1 종자를 생산함으로써 수득할 수 있다. 생산된 T1 종자의 4분의 1은 트랜스젠에 대해 동형접합일 것이다. T1 종자의 발아는, 전형적으로 이형접합체와 동형접합체 사이의 구별을 가능하게 하는 SNP 검정 또는 PCR-기반 증폭 검정 (즉, 접합성 검정)을 사용하여 이형접합성에 대해 시험될 수 있는 식물을 생성한다.
특정 실시양태에서, 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 적어도 1개의 폴리펩티드의 카피는, 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 적어도 1개의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 1개의 핵산 분자(들)가 그 내부로 도입되어 있는 색소체 함유 세포에서 생산된다. 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 각 폴리펩티드는 상이한 형질전환 이벤트에 도입된 다중 핵산 서열로부터, 또는 단일 형질전환 이벤트에 도입된 단일 핵산 서열로부터 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수 개의 이러한 폴리펩티드는 단일 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 복수 개의 이러한 폴리펩티드는 다중 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 각각의 펩티드 서열이 색소체로 표적화되는 것인, 다중 펩티드 서열을 포함하는 단일 폴리펩티드가 발현될 수 있다.
재조합 핵산 분자를 사용한 식물의 직접적인 형질전환에 더하여, 트랜스제닉 식물은 적어도 하나의 트랜스제닉 이벤트를 갖는 제1 식물을 이러한 이벤트가 결여된 제2 식물과 교배시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 쉽게 형질전환되는 제1 식물 계통 내로 도입함으로써 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있고, 이 트랜스제닉 식물을 제2 식물 계통과 교배시켜 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제2 식물 계통으로 이입시킬 수 있다.
VI. TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드-유도된 폴리펩티드를 포함하는 식물 물질
일부 실시양태에서, 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 세포를 포함하는 것인 식물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 이러한 식물은 식물 조직 또는 식물 세포의 형질전환, 및 전체 식물의 재생에 의해 생산될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 이러한 식물은 상업적 공급원으로부터, 또는 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 생식질로의 이입을 통해 수득될 수 있다. 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 세포를 포함하는 식물 물질 또한 제공한다. 이러한 식물 물질은 식물 세포를 포함하는 식물로부터 수득될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 식물 물질은 식물을 생산하기 위해 재생할 수 없는 식물 세포이다.
일부 실시양태에서, 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 물질은 하기 특징들 중 하나 이상의 것을 나타낸다: 식물의 세포에서 폴리펩티드 발현; 식물의 세포의 색소체에서 폴리펩티드의 일부를 발현; 식물 세포의 세포질부터 세포의 색소체로의 폴리펩티드 유입; 식물의 세포에서 폴리펩티드의 색소체-특이적 발현; 및/또는 식물의 세포에서 폴리펩티드의 국소화. 이러한 식물은 코딩된 폴리펩티드의 발현 이외에 하나 이상의 바람직한 형질을 추가로 가질 수 있다. 이러한 형질은, 예컨대 다음을 포함할 수 있다: 곤충, 다른 해충 및 질병 유발제에 대한 내성; 제초제 내성; 향상된 안정성, 수율, 또는 유효 기간; 환경적인 내성; 약제학적 생산; 산업 제품 생산; 및 영양 강화.
본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 본 발명의 핵산 분자로 형질전환될 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 따라서, 식물은 쌍자엽 식물일 수 있다. 본 방법에서 사용될 수 있는 쌍자엽 식물의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 아라비돕시스, 알팔파, 콩류, 브로콜리, 양배추, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 배추, 목화, 오이, 가지, 양상추, 멜론, 완두콩, 고추, 땅콩, 감자, 호박, 무, 유채, 시금치, 대두, 애호박, 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토, 및 수박을 포함한다. 본 방법에서 사용될 수 있는 단자엽 식물의 비제한적인 일례로 옥수수, 브라시카(Brassica), 양파, 벼, 수수, 밀, 호밀, 기장, 사탕수수, 귀리, 라이밀, 스위치그라스, 및 잔디를 포함한다. 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 임의 방식으로 사용될 수 있거나, 재배될 수 있다.
일부 실시양태는 또한 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 일용 제품, 예를 들어, 상기 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 함유하는 재조합 식물 또는 종자로부터 생산된 일용 제품을 제공한다. 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 일용 제품으로는 예를 들어, 및 제한 없이, 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물로 된 식제품, 밀(meal), 오일, 또는 분쇄된 또는 전체 곡물 또는 종자를 포함한다. 하나 이상의 일용품 또는 일용 제품 중에서 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 검출하는 것은 사실상 일용품 또는 일용 제품이 적어도 부분적으로 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물로부터 제조되었음을 나타내는 증거가 된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 일용 제품은 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 검출가능한 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 일용 제품은 예를 들어, 트랜스제닉 식물을 수득하고, 그로부터 식품 또는 사료를 제조함으로써 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 1개의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스젠을 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 종자는 또한 그의 게놈 내에 제한 없이, 그로부터 iRNA 분자로 전사되는 트랜스제닉 이벤트; 살충 단백질 (예컨대, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 살충 단백질)을 코딩하는 유전자; 제초제 내성 유전자 (예컨대, 글리포세이트에 대해 내성을 제공하는 유전자); 및 트랜스제닉 식물에서 바람직한 표현형 (예컨대, 수율 증가, 지방산 대사 변경, 또는 세포질 웅성 불임성의 복원)에 기여하는 유전자를 비롯한, 적어도 1개의 다른 트랜스제닉 이벤트를 그의 게놈 내에 포함할 수 있다. VII. 유전자 생성물의 색소체로의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28-매개 국소화
본 발명의 일부 실시양태는 유전자 생성물을 발현하고 그리고/또는 색소체 (예컨대, 엽록체)로 국소화시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 유전자 생성물은 마커 유전자 생성물, 예를 들어, 형광성 분자일 수 있다. TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드를 또한 포함하는 폴리펩티드의 일부로서 유전자 생성물의 발현은 특정 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드 서열의 색소체-국소화 능력을 평가하기 위한 시스템을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28-함유 폴리펩티드의 일부로서 마커 유전자 생성물의 발현을 이용하여 마커 유전자 생성물의 발현을, 폴리펩티드가 발현되는 세포의 색소체로 표적화한다. 특정 실시양태에서, 이러한 마커 유전자 생성물이 숙주 세포의 색소체(들)에 국소화된다. 예를 들어, 마커 유전자 생성물은 숙주 세포의 세포질 또는 다른 세포소기관에서보다는 색소체(들) 중에서 더 높은 수준으로 발현될 수 있거나; 마커 유전자 생성물은 색소체(들) 중에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현될 수 있거나; 마커 유전자 생성물은 본질적으로 색소체(들)에서만 발현될 수 있거나; 또는 마커 유전자 생성물은 전체적으로 색소체(들)에서 발현될 수 있고, 따라서, 세포질 또는 비-색소체 세포소기관에서의 발현은 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 마커 유전자 생성물에 연결된, 기능적인 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 변이체 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 기능적인 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 변이체 펩티드의 특징을 평가한다. 예를 들어, 적어도 1개의 보존적 돌연변이(들)를 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드 내로 도입함으로써 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드의 서열은 달라질 수 있고, 생성된 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 변이체 펩티드를 마커 유전자 생성물에 연결할수 있다. 적합한 숙주 세포 (예를 들어, 발현 구축물 중의 하나 이상의 조절 요소가 작동가능한 세포)에서 발현시킨 후, 마커 유전자 생성물의 발현을 측정할 수 있다. 참조 TraP 펩티드-마커 구축물과 변이체 TraP 펩티드-마커 구축물 사이의 마커 유전자 생성물의 세포하 국소화를 비교함으로써, 변이체 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드가 예를 들어, 더 큰 색소체 국소화, 실질적으로 동일한 색소체 국소화, 또는 더 작은 색소체 국소화를 제공하는지 여부를 측정할 수 있다. 더 큰 소성의 국소화를 제공하는 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 변이체를 확인함으로써, 이러한 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 변이체 중의 돌연변이를 추가의 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 변이체 내로 통합할 수 있다. 이 평가 과정을 다수 회 수행하고, 이어서, 순차적으로 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 서열에 확인된 바람직한 돌연변이를 통합시킴으로써, TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 서열을 최적화하기 위한 반복적인 과정을 얻을 수 있다. 이러한 최적화된 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드 서열, 및 상기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이러한 최적화된 TraP10, TraP11, TraP17, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 또는 TraP28 펩티드 서열이 추가의 돌연변이에 의해 추가로 최적화될 수 있는지 여부와는 상관없이 본 발명의 일부인 것으로 간주된다.
본원에 인용된 공개, 특허 및 특허출원을 포함한 모든 참고문헌은 이들이 본 개시내용의 명시적 세부사항과 불일치하지 않는 정도로 본원에 참조로 포함되고, 마치 각각의 참고문헌이 개별적이면서 구체적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어지며 그 전문이 본원에 제시된 것과 동일한 정도로 그렇게 포함된다. 본원에 논의된 참고문헌들은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서의 아무 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 그러한 개시내용을 앞서는 자격을 갖지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
하기 실시예들은 소정의 특정한 특징 및/또는 측면을 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 개시내용을 기재된 특정한 특징 또는 측면으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 키메라 엽록체 전이 펩티드 (TraP) 서열의 설계 및 생산
색소체는 고등 식물 종에서 발견되는 세포질 소기관이며 모든 식물 조직에 존재한다. 엽록체는 필수적인 생리 기능을 담당하는 녹색 광합성 조직에서 발견되는 특이적 유형의 색소체이다. 예를 들어, 이러한 한 가지 생리 기능은 식물이 필요로 하는 방향족 아미노산의 합성이다. 핵 코딩된 효소가 이 생합성 경로에서 필요하며, 세포질에서 엽록체 내부로 수송된다. 이들 핵 코딩된 효소는 보통 엽록체 막과 상호작용해서 펩티드를 엽록체의 스트로마로 수송하는 것을 용이하게 하는 N-말단 전이 펩티드를 보유하고 있다. Bruce B, (2000) Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolution. Trends Cell Bio.,10: 440-447. 이입시, 스트로마 펩티다아제가 전이 펩티드를 절단하고, 성숙한 기능성 단백질을 엽록체 내에 이입된 채로 남겨둔다. Richter S, Lamppa GK, (1999) Stromal processing peptidase binds transit peptides and initiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts. Journ. Cell Bio., 147: 33-43. 엽록체 전이 펩티드는 길이, 조성 및 구조에 있어 고도의 다양성을 띠는 가변 서열이다 (Bruce, 2000). 엽록체 전이 펩티드의 서열 유사성은 다른 식물 종으로부터의 상동성 단백질들 중에서 유의적으로 다양하다. 가공된 성숙한 기능성 단백질과 비교할 때, 상이한 식물 종으로부터 수득된 상동성 단백질은 통상적으로 상대적으로 높은 수준의 서열 유사성을 공유한다는 점을 고려해 보면, 엽록체 전이 펩티드 간의 다양성 양은 예측되지 못한다.
신규한 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열을 설계하고, 생산하고, 식물 내 시험을 수행하였다. 신규한 키메라 엽록체 전이 펩티드는 엽록체 내 작물학상 중요한 단백질의 이입을 위해 효과적인 전위 및 가공 특성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 처음에는, ChloroP™ 컴퓨터 프로그램을 통해 상이한 식물 종으로부터의 단백질 서열을 분석해서 추정 엽록체 전이 펩티드 서열을 확인하였다 (Emanuelsson O, Nielsen H, von Heijne G, (1999) ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science, 8: 978-984, available at http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/.) 천연 엽록체 전이 펩티드를 확인한 후, 엽록체 전이 펩티드 서열을 서로 정렬시켰다 (도 2).
엽록체 전이 펩티드 서열 정렬을 이용하여, 제1 유기체로부터의 엽록체 전이 펩티드 서열의 제1 절반과 제2 유기체로부터의 엽록체 전이 펩티드 서열의 제2 절반을 대략 1:1의 비율로 조합함으로써 신규한 키메라 엽록체 전이 펩티드를 설계하였다. 새롭게 설계한 키메라 엽록체 전이 펩티드의 예시적인 단백질 서열은 TraP10 (서열번호 1), TraP11 (서열번호 2), TraP17 (서열번호 3), TraP18 (서열번호 4), 및 TraP19 (서열번호 5)이다. 이들 신규한 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열은 브라시카 나푸스, 글리신 맥스, 오리자 사티바, 비름, 메꽃, 및 두날리엘라 살리나 및 클라미도모나스 레인하르드티의 EPSPS 단백질 유래이다. TraP10 (서열번호 1) 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열은 브라시카 나푸스로부터 유래된 N-말단을 포함하고, 엽록체 전이 펩티드의 C-말단은 글리신 맥스에서 유래한다. TraP11 (서열번호 2) 엽록체 전이 펩티드 서열은 글리신 맥스로부터 유래된 N-말단을 포함하고, 엽록체 전이 펩티드의 C-말단은 브라시카 나푸스에서 유래한다. TraP17 (서열번호 3) 엽록체 전이 펩티드 서열은 메꽃으로부터 유래된 N-말단을 포함하고, 엽록체 전이 펩티드의 C-말단은 클라미도모나스 레인하르드티에서 유래한다. TraP18 (서열번호 4) 엽록체 전이 펩티드 서열은 오리자 사티바로부터 유래된 N-말단을 포함하고, 엽록체 전이 펩티드의 C-말단은 비름에서 유래한다. TraP19 (서열번호 5) 엽록체 전이 펩티드 서열은 비름으로부터 유래된 N-말단을 포함하고, 엽록체 전이 펩티드의 C-말단은 두날리엘라 살리나에서 유래한다.
마찬가지로, ChloroP™ (Emanuelsson, 1999) 컴퓨터 프로그램을 통해 상이한 식물 종으로부터의 다중 단백질 서열을 분석해서 추정 엽록체 전이 펩티드 서열을 확인하였다 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/에서 이용가능함). 엽록체 전이 펩티드 서열 정렬을 활용하여, 신규한 합성 엽록체 전이 펩티드를 아미노산을 무작위로 선택해서 신규한 합성 추정 엽록체 전이 펩티드 서열을 생성하게 함으로써 설계하였다. 새롭게 설계된 합성 엽록체 전이 펩티드의 예시적인 서열은 TraP26 (서열번호 6), TraP27 (서열번호 7) 및 TraP28 (서열번호 8)이다.
다중 검정을 통해 신규 합성 엽록체 전이 펩티드를 시험하였는데, 이는 일시적 식물 내 발현 시스템을 작물학상 중요한 트랜스젠 서열에 융합된 유전자 조절성 발현 요소를 포함하는 안정적인 형질전환 이벤트로서 트랜스제닉 방식으로 포함하였다.
실시예 2:키메라 엽록체 전이 펩티드 (TraP) 서열에 대한 일시적 식물 내 시험
담배 일시적 검정:
상술한 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열을 일시적 식물 내 분석을 통해 초기에 시험하였다. TraP10 (서열번호 9), TraP11 (서열번호 10), TraP17 (서열번호 11), TraP18 (서열번호 12), TraP19 (서열번호 13), TraP26 (서열번호 14), TraP27 (서열번호 15), 및 TraP28 (서열번호 16), 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하였다. 링커 서열 (서열번호 17)을 TraP 서열 및 TraP10 및 TraP11의 yfp 코딩 서열 사이에 통합시켰다. 생성된 구축물은 2개의 식물 전사 단위 (PTU)를 함유하였다. 제1 PTU는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10 프로모터; Callis, 등, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493), TraP-황색 형광 단백질 융합 유전자 (TraP-YFP; 미국 특허 출원 2007/0298412) 또는 TraP-녹색 형광 단백질 융합 유전자 (TraP-GFP; Sheen 등, (1995) Plant J., 8(5): 777-84), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 23 3’비번역 영역 (AtuORF23 3’미국 특허 5,428,147)로 구성된다. 제2 PTU는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터; Verdaguer 등, (1996) Plant Molecular Biology, 31: 1129-1139), 포스피노쓰리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT; Wohlleben 등, (1988) Gene, 70: 25-37) 또는 DSM-II (국제 특허 출원 2008070845), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3’Huang 등, (1990) J. Bacteriol., 172: 1814-1822)로 구성된다. 구축물 pDAB101979는 TraP10 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한다 (도 3). 구축물 pDAB101980는 TraP11 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한다 (도 4). 구축물 pDAB107634는 TraP17 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한다 (도 5). 구축물 pDAB107635는 TraP18 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한다 (도 6). 구축물 pDAB107636는 TraP19 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한다 (도 7). 구축물 pDAB109847는 TraP26 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한다 (도 8). 구축물 pDAB109848는 TraP27 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한다 (도 9). 구축물 pDAB109849는 TraP28 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한다 (도 10). yfp 유전자의 상류에 엽록체 전이 펩티드 서열을 함유하지 않은, 대조군 플라스미드 pDAB101908을 만들어서 연구에 포함시켰다 (도 11). 구축물은 제한 효소 소화 및 서열결정을 통해 확인되었다. 마지막으로, 구축물을 아그로박테리움 투메파시엔스로 형질전환하고, 글리세롤 스톡으로서 보관하였다.
아그로박테리움 글리세롤 스톡으로부터, 냉동된 배양액으로 가득찬 루프를 14 ml 멸균 튜브 중 효모-추출물 펩톤 덱스트로스 2 ml (100 μg/ml 스펙티노마이신)에 접종시켰다. 접종시킨 배지를 200 rpm으로 진탕하면서 28℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 다음날 배양액 약 100 μl를 사용하여 멸균한 125 ml 트리-배플 플라스크에 YPD 25 ml (100 μg/ml 스펙티노마이신)에 접종시키고, 200 rpm으로 진탕하면서 28℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 다음날 배양액을 멸균한 ddH20 (pH 8.0) 중 OD600 0.5로 희석하였다. 희석시킨 아그로박테리움 균주를 P19 헬퍼 단백질을 함유한 제2 아그로박테리움 균주와 1:1의 비율로 혼합하였다. 배양액을 Voinnet 방법으로 담배 잎 침투를 위해 사용하였다. Voinnet O, Rivas S, Mestre P, and Baulcombe D, (2003) 토마토 덤불 성장위축 바이러스의 p19 단백질에 의해 유전자 침묵의 억제에 기초한 식물 내에서 증진된 일시적 발현 시스템. The Plant Journal, 33: 949-956. 침투된 담배 식물을 분석될 때까지 적어도 3일 동안 24℃에서 16시간 명기로 설정된 Conviron™에 두었다.
현미경 결과:
아그로박테리움-침투 담배 잎을 식물로부터 절단하고, 탈수를 방지하기 위해 물과 함께 페트리 접시에 두었다. 침투된 담배 잎을 Dark Reader Hand Lamp™ (Clare Chemical Research Co.; 콜로라도주 돌로레스)를 사용하여 제자리에 고정된 롱-패스(long-pass) 필터 유리를 가지고 청색광 여기 하에 관찰해서 YFP 또는 GFP 리포터 단백질을 성공적으로 발현시킨 잎의 미손상 영역을 확인하였다. 구체적으로 확인된 잎 영역을 잎으로부터 절개하고 공초점 현미경 (Leica TCS-SP5 AOBS™; 일리노이주 버팔로 그로브)에 의해 이미징하기 위해 물에 탑재하였다. YFP는 다중선 아르곤 이온 레이저를 사용하여, 514 nm 레이저 선에 의해 여기시켰다. GFP는 다중선 아르곤 이온 레이저를 사용하여, 488 nm 레이저 선에 의해 여기시켰다. 검출 슬릿의 폭은 배경 잎 자발형광을 배제하기 위해 비-발현 (암색) 대조군 잎 샘플을 사용하여 조정하였다. 엽록소 자발형광은 엽록체 국소화의 결정을 위한 형광성 리포터 단백질 신호에 직접 비교하기 위해 제2 채널에서 동시에 수집하였다.
현미경 이미지 결과에 의하면 담배 세포의 세포질의 엽록체 내에 전위하지 않은 대조군 YFP 형광 단백질에 비해, TraP 엽록체 전이 펩티드 (TraP10, TraP11, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 및 TraP28)를 포함하는 YFP 또는 GFP 형광 단백질은 담배 세포의 세포질에 위치한 엽록체 내에 축적하였음을 나타내었다 (도 12 내지 도 19). TraP17 전이 펩티드는 YFP 형광 단백질을 담배의 엽록체로 전위시키지 않았지만, TraP17 전이 펩티드는 YFP 형광 단백질을 옥수수의 엽록체 내로 전위시켰다는 것을 유의해야 한다. 이러한 현미경 이미지 결과에 의하면 YFP 단백질이 엽록체로 전위된 것이 TraP 엽록체 전이 펩티드의 결과임을 시사한다. 현미경 사진에서 볼 수 있듯이, YFP 형광 신호는 현미경 이미지 조건에서 자발형광으로 인해 빨간색을 발하기도 하는 엽록체에 국한되어 있다. 상대적으로, 도 20은 엽록체 전이 펩티드를 함유하지 않은 대조군 구축물 pDAB101908이 침투된 담배 잎 조직의 현미경 이미지를 제공한다. 이 이미지 속의 엽록체는 현미경 이미징 조건에서 자발형광으로 인해 단지 빨간색을 발하며, TraP 침투된 담배 세포에서 나타나는 어떠한 YFP 형광 신호도 없다. 오히려, 대조군 담배 식물 세포에서의 YFP 형광 신호는 담배 식물 세포의 세포질 전반에 걸쳐 광범위하게 발현된다.
옥수수 원형질체 일시적 검정:
제아 메이스 c.v. B104의 종자를 Tween® 20 2-3 방울을 함유하는, 50% Clorox™ (3% 차아염소산 나트륨) 중에서 약 20분 동안 격렬하게 진탕시켜 표면을 멸균시켰다. 종자를 멸균 증류수로 철저하게 세정하였다. 멸균 종자를 피타트레이스(Phytatrays) 또는 유사한 유형의 박스 중 ½ MS 배지 상에 플레이팅하고, 암실 (28℃)에서 12 내지 20일 동안 성장시켰다. 옥수수 원형질체 일시적 검정을 사용하여 제아 메이스 c.v. B104 잎으로부터 옥수수 원형질체를 수득하고, 형질감염시켰다. 이 옥수수 원형질체 검정은 Yoo, S.-D., Cho, Y.-H., and Sheen, J., (2007), Arabidopsis Mesophyll Protoplasts: A Versitile Cell System for Transient Gene Expression Analysis, Nature Protocols, 2: 1565-1572에 기재된 시스템의 변형이다. 용액을 Yoo 등, (2007)에 기재되어 있는 대로 제조하되, 예외적으로, 하기 실험에서 사용된 만니톨의 농도를 0.6 M로 변경하였다.
실온에서, 약 40 μg의 플라스미드 DNA를 함유하는 2 ml 미세원심분리 관에 원형질체를 첨가하여 100 내지 500 μl의 원형질체 (1-5 x 105 세포)의 형질감염을 완료하였다. 바람직하게는 DNA의 부피를 원형질체 부피의 약 10%로 유지시켰다. 원형질체 및 DNA를 이따금 5분간의 인큐베이션 기간 동안 혼합하였다. 동일 부피의 PEG 용액을 원형질체 및 DNA에 한번에 2 방울씩 천천히 첨가하면서, PEG 용액을 적가하는 사이에 혼합하였다. 가끔씩 온화하게 혼합해 주면서, 약 10분 동안 상기 관을 인큐베이션시켰다. 다음으로, 1 ml의 W5+ 용액을 첨가하고, 상기 관을 수회에 걸쳐 도립시켜 혼합하였다. 상기 관(들)을 4℃ 온도에서 75 x g로 5분 동안 원심분리하였다. 최종적으로, 상청액을 제거하고, 펠릿을 1 ml의 WI 용액 중에 재현탁시키고, 원형질체를 소형 페트리 플레이트 (35 x 10 mm) 또는 6웰 다중 웰 플레이트에 놓고, 암실에서 실온에서 밤새 인큐베이션시켰다. 12시간 동안 인큐베이션시킨 후, 현미경 검사에 의해 GFP의 형광을 관찰하였다. 앞서 기술된 현미경 검사 조건을 이미징하는 데 사용하였다.
현미경 검사 이미지 결과에 의하면 옥수수 세포의 세포질의 엽록체 내로 전위되지 않은 대조군 GFP 형광 단백질에 비해 TraP17, TraP18, 또는 Trap19의 키메라 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 GFP 형광 단백질은 옥수수 세포의 세포질에 위치하는 엽록체 내에 축적되어 있는 것으로 나타났다 (도 21 내지 도 23). 상기 현미경 검사 이미지 결과는 GFP 단백질의 엽록체 내로의 전위는 TraP 키메라 엽록체 전이 펩티드의 결과였다는 것을 시사한다.
웨스턴 블롯 결과:
침투된 담배 식물의 샘플을 웨스턴 블롯팅을 통해 분석하였다. 잎 천공물을 수집하고 비드-밀링하였다. 약 100 내지 200 mg의 잎 물질을 2개의 BB (Daisy; 애리조나주 로저스) 및 PBST 500 ml와 3분 동안 Kleco™ 비드 밀에서 혼합하였다. 이어서, 샘플을 원심분리기에 4℃에서 14,000 x g으로 스핀다운하였다. 상청액을 제거하고, 웨스턴 블롯 또는 면역침강법을 통해 직접 분석하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 Pierce Direct IP kit™ (Thermo Scientific; 일리노이주 락포드)를 사용하여 면역침강법을 실시하였다. 대략, 안티-YFP 또는 안티-GFP 50 μg을 수지에 결합시켰다. 샘플을 4℃에서 수지와 함께 밤새 인큐베이팅시켰다. 이어서, 샘플을 세척하고, 다음날 아침에 용리시키고, 동일한 부피의 2x 8M 우레아 샘플 완충액을 배합한 후 샘플을 5분간 끓임으로써 분석을 준비하였다. 끓인 샘플을 40분 동안 MOPS 완충액에서 4-12% SDS-비스 트리스 겔에서 전개시켰다. 이어서, 겔을 제조업자의 프로토콜에 따라 Invitrogen iBlot™ (Life Technologies; 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 블롯팅하였다. 블롯팅된 막을 PBS-Tween® 용액 중에 5% 무지방 분유를 사용하여 10분 동안 블로킹하였다. 막을 1시간 동안 PBS-Tween® 용액 중에 5% 무지방 분유에서 1:1000 희석으로 사용된 1차 항체(토끼의 단일클론 안티-GFP 또는 안티-YFP)로 탐침하였다. 이어서, 모든 미결합 1차 항체를 제거하기 위해 막을 PBS-Tween®으로 5분 동안 3회 세정하였다. 막을 60분 동안 1:1000 희석으로 사용된 염소 항체 (Life Technologies) 중 2차 단일클론 항-토끼로 탐침하였다. 막을 상기 기재된 바와 같이 세척하고, Themo BCIP/NBT™ 기질을 첨가함으로써 전개하였다. 색도 기질을 5-10분 동안 전개시킨 후, 블롯을 물로 헹구고 건조시켰다.
웨스턴 블롯 결과는 YFP 또는 GFP 단백질이 시험한 구축물 전부에 대해 침투된 담배 세포에서 발현되었음을 나타내었다. 침투된 담배 식물 잎 조직은 전부 YFP 또는 GFP 항체에 반응하고, YFP 또는 GFP 대조군 구축물이 침투된 담배 잎 조직으로부터 수득된 YFP 또는 GFP 단백질 밴드에 크기가 당량인 단백질 밴드의 존재에 의해 나타난 바와 같이 YFP 또는 GFP 단백질을 발현시켰다. 게다가, 이 결과는 TraP 키메라 엽록체 전이 펩티드 (TraP10, TraP11, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 및 TraP28)가 처리되고 YFP 또는 GFP 단백질로부터 절단되었음을 나타내었다. TraP-YFP 또는 GFP 구축물은 대조군 YFP 또는 GFP 단백질보다 더 큰 분자량인 사전 처리된 단백질 밴드를 발현한다. 대조군 YFP 또는 GFP에 크기가 당량인 웨스턴 블롯 상의 밴드의 존재는 TraP 엽록체 전이 펩티드 서열 (TraP10, TraP11, TraP18, TraP19, TraP26, TraP27, 및 TraP28)이 처리되었고, 이로써 YFP 또는 GFP 대조군에 대응하는 분자량 크기로 YFP 또는 GFP의 크기를 감소시켰음을 나타내었다. 실시예 3: 아라비돕시스 내 곤충 내성 트랜스젠 발현을 위한 키메라 엽록체 전이 펩티드 (TraP) 서열 Cry2Aa:
아라비돕시스 탈리아나 내 Cry2Aa 단백질 발현에 대한 TraP11 키메라 엽록체 전이 펩티드의 효과를 평가하였다. Cry2Aa 단백질에 융합된 TraP11 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한 트랜스제닉 아라비돕시스 식물을 대두 루퍼 (SBL) 및 담배 벌레 (TBW)에 대한 곤충 내성에 대해 분석하였다.
TraP11 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열을 식물 발현 구축물 pDAB107538 (도 24)에 클로닝하고 아라비돕시스에서 시험하였다. Trap11 (서열번호 18) 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 새로운 버전을 합성하고 플라스미드 구축물에 통합시켰다. 생성된 구축물은 2개의 식물 전사 단위 (PTU)를 함유하였다. 제1 PTU는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10 프로모터; Callis, 등, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493), TraP11-cry2Aa 융합 유전자 (Cry2Aa; 서열번호 19, 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 23 3’비번역 영역 (AtuORF23 3’미국 특허 5,428,147)로 구성되었다. 제2 PTU는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터; Verdaguer 등, (1996) Plant Molecular Biology, 31: 1129-1139), dsm-2 유전자 (DSM2; 미국 특허 출원 2011/0107455), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3’Huang 등, (1990) J. Bacteriol., 172: 1814-1822)로 구성되었다. 구축물 pDAB107538는 TraP11 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한다. cry2Aa 유전자의 상류에 엽록체 전이 펩티드 서열을 함유하지 않은, 대조군 플라스미드 107617을 만들어서 연구에 포함시켰다 (도 25). 구축물은 제한 효소 소화 및 서열결정을 통해 확인되었다. 마지막으로, 구축물을 아그로박테리움 투메파시엔스로 형질전환하고, 글리세롤 스톡으로서 보관하였다.
pDAB107538 구축물을 아그로박테리움 투메파시엔스 매개 식물 형질전환을 통해 아라비돕시스 탈리아나 내로 형질전환시켰다. 요약하면, 250 μmol/m2의 광도, 25℃, 18/6 시간의 명기/암기를 가진 온실에서 12 내지 15 아라비돕시스 탈리아나 식물 (컬럼비아 생태형, Col-0)을 4”포트에서 재배하였다. 형질전환 1주 전에 일차 꽃 줄기를 트리밍한다. 10 μl 재조합 아그로박테리움 글리세롤 스톡을 100 mL LB 브로쓰 (100 mg/L 스펙티노마이신, 50 mg/L 카나마이신) 중에서 28℃에서 인큐베이션하고, 72시간 동안 225 rpm에서 진탕시킴으로써 아그로박테리움 접종물을 제조하였다. 아그로박테리움 배양물의 분량을 분광계로 측정하고 세포가 0.8의 OD 600에 도달하면 세포를 원심분리로 수거하였다. 다음으로 세포를 3-4 부피의 5% 수크로오스와 0.04% Silwet-L77™ 및 10 μg/L 벤즈아미노 퓨린 (BA) 침투 배지에 재현탁시켰다. 식물의 지상 부분을 아그로박테리움 용액 중에 5-10분 동안 온화하게 교반하면서 침지시킨다. 이어서 식물을 종자가 세팅될 때까지 규칙적으로 급수 및 시비하면서 정상 성장을 위해 온실로 옮긴다.
벌크형 T1 종자 약 200mg을 선별 트레이 (10.5”x 21”x 1”발아 트레이 T.O. Plastics Inc., 미네소타주 클리어워터)에 고르게 식재하였다. 식재 후 5일째 및 다시 식재 후 10일째에, 10 mL/트레이 (703 L/ha)의 분무 부피로 DeVilbiss 압축 공기 분무 팁을 이용하여 글루포시네이트 제초제 (Liberty™)의 0.20% 용액 (20 μl/10 mL dH2O)을 묘종에 분무하였다. 글루포시네이트를 두번째 적용한지 4일 내지 7일 사이에, 제초제 내성 식물을 확인하고 T2 종자 생산을 위해 이식하였다. 생성된 T2 종자를 하기 기술된 연구에 사용하였다.
각 이벤트에 대해 작은 분취량 (약 100-200 종자)의 T2 종자를 0.1% 아가로스 용액 40ml에 현탁시키고 4 ℃에서 24시간 동안 저온 층화시켰다. 층화 종자를 파종 플랫의 4개의 플랫의 표면 상에 종자 10ml을 피펫으로 파종하였다. 플랫을 Sunshine #5 soil media™ (Sun Gro; 워싱턴주 벨뷰)로 채우고 미세 질석으로 가볍게 덮었다. 파종 전과 필요에 따라 그 후에도 트레이를 Hoagland 비료에 포화시켰다. 파종 후, 습도 돔을 사용하여 트레이를 덮은 다음 16 시간의 광 기간으로 24℃로 설정된 Conviron™ 성장 챔버에 두었다. 백열등과 형광등으로 200 PAR의 밝기를 제공했다. 5일 후 종자들이 발아하였고 돔을 제거하였다. 형질전환체의 첫번째 제초제 선택은 6일째에 있었고 두번째는 10일째에 있었다. Liberty™ 제초제 (a.i. 글루포시네이트-암모늄)를 DeVilbiss 분무기 핸드 분무기를 사용하여 200g ai/ha의 속도로 가하여 영점을 제거하였다. 대략 25%의 식물이 예상대로 제로 값을 보였다. 야생형 검사의 행 또한 선택에 포함시켰으며 2가지 제초제 적용 후 100% 치사율을 보였다. 14일째에 식물들은 이식할 준비가 되었다. 생물-검정을 위해 각 이벤트에서 12개의 식물을 취하여 미세 질석으로 가볍게 덮은 Sunshine No. 5 토양으로 채워진 3”포트에 이식했다. 플랫들을 Hoagland 비료와 함께 이식 전과 필요에 따라 그 후에도 예비침지시켰다. 이식물을 14 시간의 보충 광으로 25℃에 설정된 에어컨이 없는 온실에서 전파시켰다. silique 발달을 가위로 트리밍하여 억제시켰으며 이에 따라 시험을 위해 더 많은 식물 조직이 생성되었다. 식물들은 16-18 일에 DNA 샘플링 준비가 되었으며 약 23 일에 생물-검정을 위한 준비가 되었다. 추정 트랜스제닉 식물을 분자 확인 검정법을 사용하여 스크리닝하고 단백질 분석 및 생물검정 결과를 위해 확인된 이벤트들을 진전시켰다.
형질전환된 식물은 일반적으로 야생형 식물과 시각적으로 비교할 때 일부 식물이 크기가 더 작더라도 건강한 표현형을 보여주었다. 각각의 아라비돕시스 구축물에 대한 유전자 카피수 분석은 모든 구축물에 대해 비교할만한 삽입 결과를 보여주었는데, 약 50%의 식물은 관심있는 cry2Aa 유전자 3 카피 이상을 가지고 약 50%가 1-2 카피를 가진다.
T1 아라비돕시스 이벤트의 Cry2Aa 단백질 발현 수준은 광범위하게 다양했다. ELISA 분석을 사용하여 단백질 검출을 완료하여 Cry2Aa 단백질 발현을 정량화하였다. 일반적으로, 단백질 발현 수준은 각 이벤트에 대한 T-가닥 삽입물의 카피수와 상관관계가 있었다. 높은 T-가닥 카피수 이벤트 (예, 3 초과 삽입 이벤트)는 일반적으로 아라비돕시스 형질전환 이벤트의 양쪽 세트 모두에 대한 낮은 T-가닥 카피수 이벤트보다 높은 평균 단백질 발현 수준을 나타냈다 (예를 들어, TraP 없는 Cry2Aa를 발현하는 pDAB107617 이벤트 및 TraP 11 키메라 엽록체 전이 펩티드를 갖는 Cry2Aa를 발현하는 pDAB107538 이벤트).
아라비돕시스 식물의 T2 세대는 T1 아라비돕시스 식물의 발현 값에 비해 감소된 Cry2Aa 단백질 값을 보여주었다. 이러한 결과는 단백질 발현이 각 이벤트 세트 간에 가변적이라는 것을 나타냈다. 동형접합 이벤트로부터 얻어진 평균 단백질 발현 수준은 시험된 모든 식물 이벤트 (예를 들어, TraP 무 [pDAB107617] 및 TraP11 유 [pDAB107538] 이벤트)에 대한 반접합성 이벤트로부터 얻어진 평균 단백질 발현 수준보다 컸다. T-가닥 삽입물의 두 개 넘는 카피를 포함하는 아라비돕시스 이벤트는 단 하나의 카피 만을 포함하는 아라비돕시스 이벤트보다 높은 수준의 발현을 보였다. T1에서 T2 세대까지의 단백질 발현 수준의 감소에도 불구하고, 구축물 내에서 TraP11 키메라 엽록체 전이 펩티드의 통합 결과 Cry2Aa 단백질을 발현하는 트랜스제닉 아라비돕시스 이벤트를 야기하였다.
T1 아라비돕시스 이벤트의 양쪽 세트 모두 곤충 생물검정 실험에서 시험되었다. 일반적으로, 더 많은 양의 Cry2Aa 단백질을 발현하는 높은 카피수 이벤트의 결과 낮은 카피수 이벤트에 비해 잎 손상의 양이 적었다. TraP 없는 Cry2Aa를 발현하는 아라비돕시스 이벤트의 경우 (r2=0.49 [SBL], 0.23 [TBW]), 그리고 TraP11 있는 Cry2Aa를 발현하는 아라비돕시스 이벤트의 경우 (r2=0.75 [SBL], 0.17 [TBW]). SBL과 TBW 모두에 대한 단백질 발현과 잎 보호 사이에 상관관계가 있었다. 결과적으로, 단백질 발현의 증가는 잎 손상 (Pr< 0.05)에 대한 상당한 보호를 야기했다.
아라비돕시스 식물은 TraP11 및 비 TraP 아라비돕시스 이벤트 모두에서 SBL 손상으로부터 보호받았다. TraP11가 있고 없는 Cry2Aa의 발현은 TraP11:Cry2Aa 이벤트의 경우 약 1.0 ng/cm2 및 TraP 없는 Cry2Aa 이벤트의 경우 약 1.5 ng/cm2인 최소 단백질 발현을 가지고 30% 미만의 잎 손상을 초래하였다. TraP11가 있고 없는 Cry2Aa의 아라비돕시스 이벤트 발현을 평가한 결과 TraP11 아라비돕시스 이벤트의 경우 약 1.1 ng/cm2 및 비-TraP 아라비돕시스 이벤트의 경우 약 2.0-2.5 ng/cm2인 최소 단백질 발현을 가지고 20% 미만의 잎 손상을 초래하였다.
아라비돕시스 식물은 TraP11 및 비 TraP 아라비돕시스 이벤트 모두에 의해 TBW 손상으로부터 보호받았다. TBW 곤충은 아라비돕시스 이벤트에서 얻은 식물 물질을 먹일 때 SBL 곤충보다 Cry2Aa 단백질에 더 민감했다. Cry2Aa 단백질이 각각, TraP11과 함께 그리고 TraP 없이 발현될 때 Cry2Aa의 약 1.0 및 1.5 ng/cm2 만큼 낮은 단백질 농도는 30% 미만 잎 손상을 초래하였다. 20% 잎 손상 컷오프 지점에서, TraP11 아라비돕시스 이벤트로부터의 잎 보호는 Cry2Aa 단백질 약 1.1 ng/cm2에서 야기된 반면, 발현된 Cry2Aa 단백질 2.0-2.5 ng/cm2은 TraP를 가지고 있지 않은 아라비돕시스 이벤트에서 요구되었다.
TraP11 키메라 엽록체 전이 펩티드는 아라비돕시스 탈리아나에서 Cry2Aa 단백질 발현의 효과를 감소시키지 않았다. Cry2Aa 단백질에 융합된 TraP11 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한 트랜스제닉 아라비돕시스 식물은 대두 루퍼 (SBL)와 담배 벌레 (TBW)에 곤충 내성을 제공한 높은 수준의 Cry2Aa 단백질을 발현하였다.
실시예 4: 아라비돕시스 내 제초제 내성 트랜스젠 발현을 위한 키메라 엽록체 전이 펩티드 (TraP) 서열
DGT28:
아라비돕시스 탈리아나 내 DGT28 (PCT/US2013/024488) 단백질 발현에 대한 TraP26 및 TraP27 키메라 엽록체 전이 펩티드의 효과를 평가하였다. DGT28 단백질에 융합된 TraP26 또는 TraP27 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한 트랜스제닉 아라비돕시스 식물을 글리포세이트 적용에 대한 제초제 내성에 대해 분석하였다.
TraP26 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열을 식물 발현 구축물 pDAB114286 (도 26)에 클로닝하고 아라비돕시스에서 시험하였다. 생성된 구축물은 2개의 식물 전사 단위 (PTU)를 함유하였다. 제1 PTU는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10 프로모터; Callis, 등, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493), TraP26-dgt28 융합 유전자 (TraP26-DGT28; 서열번호 27, 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 23 3’비번역 영역 (AtuORF23 3’미국 특허 5,428,147)로 구성되었다. 제2 PTU는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터; Verdaguer 등, (1996) Plant Molecular Biology, 31: 1129-1139), dsm-2 유전자 (DSM2; 미국 특허 출원 2011/0107455), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3’Huang 등, (1990) J. Bacteriol., 172: 1814-1822)로 구성되었다. 구축물 pDAB114286는 TraP26 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한다.
TraP27 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열을 식물 발현 구축물 pDAB114287 (도 27)에 클로닝하고 아라비돕시스에서 시험하였다. 생성된 구축물은 2개의 식물 전사 단위 (PTU)를 함유하였다. 제1 PTU는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10 프로모터; Callis, 등, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493), TraP27-dgt28 융합 유전자 (TraP27-DGT28; 서열번호 28, 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 23 3’비번역 영역 (AtuORF23 3’미국 특허 5,428,147)로 구성되었다. 제2 PTU는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터; Verdaguer 등, (1996) Plant Molecular Biology, 31: 1129-1139), dsm-2 유전자 (DSM2; 미국 특허 출원 2011/0107455), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3’Huang 등, (1990) J. Bacteriol., 172: 1814-1822)로 구성되었다. 구축물 pDAB114287는 TraP27 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유한다.
양쪽 구축물 모두 제한 효소 소화 및 서열결정을 통해 확인되었다. 구축물들을 아그로박테리움 투메파시엔스로 형질전환하고, 글리세롤 스톡으로서 보관하였다. 마지막으로, 구축물들을 아그로박테리움-형질전환 방법을 통해 아라비돕시스 탈리아나 내로 형질전환시켰다.
식물 형질전환:
dgt-28 및 DSM-2 발현 카세트를 함유한 새로 수거된 트랜스제닉 T1 종자를 실온에서 7일 동안 건조시켰다. T1 종자를 26.5 x 51 cm 발아 트레이에 파종하였는데, 각각은 사전에 40 mL의 0.1% 아가로스 용액 중에 현탁시키고, 4℃에서 2일 동안 보관하여 휴면 요건을 완료하고, 확실하게 동조 종자 발아가 이루어진, 200 mg 분취량의 층화된 T1 종자 (~10,000개의 종자)를 받았다.
Sunshine Mix LP5 soil™를 미세 질석으로 덮고, 습윤화될 때까지 Hoagland 용액을 이용하여 저면 관수를 수행한 후, 중력 배수시켰다. 피펫을 이용하여 각 40 mL 분취량의 층화된 종자를 질석 상에 고르게 파종시키고, 4-5일 동안 습도 돔으로 덮어 놓았다. (공동-형질전환된 dsm-2 유전자 선별을 위해) 글루포시네이트 발아 후 분무를 이용하여 초기 형질전환체 선별을 수행하기 1일 전 돔을 제거하였다.
식재 후 7일째 (DAP) 및 재차 11 DAP에, T1 식물 (각각 자엽 및 2-4-lf 단계)에 0.2% Liberty™ 제초제 용액 (200 g ai/L 글루포시네이트, Bayer Crop Sciences, 미주리주 캔자스시티)을 10 mL/트레이 (703 L/ha)의 분무 부피로 DeVilbiss 압축 공기 분무 팁을 이용하여 분무함으로써 글루포시네이트 1회 적용당 280 g ai/ha의 유효 비율로 전달하였다. 최종 분무 후 4-7일이 경과하였을 때 생존 식물 (활발하게 성장하는 식물)을 확인하고, 화분용 배지 (Metro Mix 360™)로 제조된 3 인치 포트로 개별적으로 이식시켰다. 이식시킨 식물을 습도 돔으로 3-4일 동안 덮고 앞서와 같이 22℃ 성장 챔버에 두거나 온실로 직접 옮겼다. 이어서 돔을 제거하고 식물을 온실 (22± 5℃, 50± 30% RH, 14 h 명기: 10 암기, 최소 500 μE/m2s1 자연광 + 보충광)에서 재배하였다. 글리포세이트 내성 유전자가 식물의 게놈 내로 안정적으로 통합되었는지를 확인하기 위해 생존한 T1 식물에 대한 분자적 확인 분석을 완료하였다
분자적 확인:
pDAB114286 및 pDAB114287로 형질전환된 아라비돕시스 식물의 게놈 내에 dgt-28 및 dsm-2 트랜스젠이 존재하는지를 확인하였다. 가수분해 프로브, 유전자 발현 카세트 PCR (식물 전사 단위 PCR; PTU PCR로도 기술됨), 웨스턴 블롯, 및 ELISA 분석을 통해 이들 폴리뉴클레오티드 서열의 존재를 확인하였다.
먼저 T1 아라비돕시스 식물을 스크리닝하여 dgt-28 및 dsm-2 트랜스젠 및 AtUbi10 프로모터의 존재를 확인하였다. 유전자 발현 카세트 PCR을 통해 이벤트를 스크리닝해서 dgt 발현 카세트가 재배열 없이 식물 게놈 내로 완전하게 통합되었는지 여부를 판정하였다. 다음으로, TAQMAN™과 유사한 가수분해 프로브 검정을 통해 T1 아라비돕시스 식물을 스크리닝하였다. 이 연구로부터 생성된 데이터를 사용하여 트랜스젠 카피수를 결정하고, 자가 수정 및 T2 세대로의 진행을 위해 아라비돕시스 이벤트를 확인하였다. 하기 기술되는 가수분해 프로브 검정을 이용하여 T1 아라비돕시스 식물에서 카피수를 결정하였다. 다양한 개수의 트랜스젠을 포함하는 식물을 확인하고, 후속 글리포세이트 내성 연구를 진행시켰다.
조직 샘플을 96웰 플레이트에 수집하고, 2일 동안 동결건조시켰다. KLECO™ 조직 미분기 및 텅스텐 비드 (Environ Metal INC., 오레곤주 스위트 홈)를 이용하여 신선한 조직의 침연을 수행하였다. 조직 침연 후, 게놈 DNA를 Biosprint 96 Plant kit™ (Qiagen, 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 고처리량 포맷으로 단리시켰다. 단리 후, gDNA를 표준 1:3 희석으로 희석시켰다. LIGHTCYCLER®480 시스템 (Roche Applied Science, 인디애나주 인디애나폴리스)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 가수분해 프로브 검정에 의한 트랜스젠 카피수 결정을 수행하였다. dsm-2, AtUbi10 및 내부 참조 유전자인 TAFII15 (유전자은행 ID: NC 003075; Duarte 등, BMC Evol. Biol., 10:61)에 대해 검정을 설계하였다.
증폭을 위해, LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix (Roche Applied Science, 인디애나주 인디애나폴리스)를, dsm-2 및 AtUbi10에 대한 0.1 μM의 각 프라이머 및 TAFII15 에 대한 0.4 μM의 각 프라이머 및 0.2 μM의 각 프로브를 함유하는 10 μL 부피 멀티플렉스 반응물 중 1x 최종 농도로 제조하였다 (표 1). 60℃에서 40초 동안 연장시키고, 형광을 획득하는 2단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플을 진행시키고, 각 샘플 분석을 위해 사이클 역치 (Ct) 평균값을 사용하였다. 상대 콴트 모듈을 이용하여 LightCycler 소프트웨어 출시 1.5™를 사용하여 실시간 PCR 데이터 분석을 수행하였는데, 이는 ΔΔCt 방법에 기초하는 것이다. 이를 위해 각 진행당 단일 카피 교정기 및 공지된 2개의 카피 체크로부터 게놈 DNA의 샘플을 포함하였다. T1 트랜스제닉 아라비돕시스 식물에 대해 가수분해 프로브 스크린의 카피수 결과를 결정하였다.
dsm-2, AtUbi10 및 내부 참조 유전자 (TAFII15) 의 가수분해 프로브 검정을 위한 프라이머 및 프로브 정보
프라이머 명칭 서열
DSM2A (서열번호 29) 5’AGCCACATCCCAGTAACGA 3’
DSM2S (서열번호 30) 5’CCTCCCTCTTTGACGCC 3’
DSM2 Cy5 프로브 (서열번호 31) 5’CAGCCCAATGAGGCATCAGC 3’
AtUbi10v2Set5-F (서열번호 32) 5’CTTCACCGCCTTAGCTTTCT 3’
AtUbi10v2Set5-R (서열번호 33) 5’GTGAAGAAGAAGCTTTGGGTATTG 3’
AtUbi10v2Set5-FAM (서열번호 34) 5’CGTGACCTAGTCGTCCTCGTCTTT 3’
TAFFY-HEX 프로브 (서열번호 35) 5’AGAGAAGTTTCGACGGATTTCGGGC 3’
TAFII15-F (서열번호 36) 5’GAGGATTAGGGTTTCAACGGAG 3’
TAFII15-R (서열번호 37) 5’GAGAATTGAGCTGAGACGAGG 3’
트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 식물에서 수득한 잎 샘플에서 발현된 DGT-28 단백질을 검출하기 위해 웨스턴 블롯을 완료했다. Invitrogen™ 장치 및 염기성 시약으로 기존의 전기영동 및 블롯팅 방법을 사용했다. Gallagher S, Winston S, Fuller S, Hurrell J, “Immunoblotting and Immunodetection”Current Protocols in Immunology 8.10.1 - 8.10.28, 2008년 11월. 토끼 항-DGT-28 항체를 항-토끼 형광 (Cy3) 검출 시스템을 갖는 일차 항체로서 사용하여 DGT-28 단백질을 발현하는 양성 트랜스제닉 이벤트를 검출하였다. 웨스턴 블롯을 통한 무손상 DGT-28 단백질의 생산은 분석된 트랜스제닉 식물이 적정 분자량에서 DGT-28 단백질을 발현함을 나타냈다. 웨스턴 블롯은 분자량이 다른 2개의 단백질 밴드를 포함하는 것으로 관찰되었다. 두 밴드는 dgt-28 트랜스젠으로부터의 엽록체 전이 펩티드의 절단으로부터 유래된 제1 저 분자량 처리된 DGT-28 단백질, 및 처리되지 않았고 엽록체 전이 펩티드 서열의 절단을 일으키지 않은 제2 더 큰, 전장 TraP::DGT-28 단백질로 구성된다는 가설이 세워졌다.
ELISA 분석을 이용하여 웨스턴 블롯, 및 qPCR을 이용하여 확인된 트랜스제닉 이벤트가 트랜스젠를 발현하였음을 확인했다. 직경 6mm인 2개의 잎 샘플을 수집하고 96웰 클러스터 튜브 랙에 두었다. 다음으로, 2개의 Daisy™ 강철 BB 및 200 μl의 추출 완충액 (50mM HEPES, 5.97g/500ml, 1% Brij™ 0.5 g/500 ml를 포함하는 완충액 pH 7.5, 프로테아제 억제제 5 μl/ml)을 각 튜브에 첨가하였다. 샘플을 최대 설정에서 Klecko™ 조직 분쇄기에서 3분 동안 분쇄하였다. 샘플을 3,000 x g에서 5분간 원심분리하고 상청액 100 μl를 빈 샘플 튜브로 옮겼다. 또 다른 100 μl의 추출 완충액을 식물 샘플에 첨가하고 비드를 3분 더 분쇄하고, 원심분리하고 100 μl의 이 추출물을 첫 번째 100 μl 용액과 합쳤다. 합친 상청액을 혼합하고 수집한 날과 동일한 날에 분석하였다.
단일클론 항체를 ELISA 분석을 위해 진행하였다. 포획 항체 클론, SW4-8F11를 PBS 중 2 μg/ml의 maxisorp 플레이트에 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이팅시켰다. 그런 다음 플레이트를 PBS (10X 스톡), 4웰 용량의 완충액을 함유한 Tween®-20으로 세척했다. ELISA 플레이트를 실온에서 2시간 동안 PBS (10X 스톡), Tween®-20 및 2% 생선 젤라틴의 웰 당 200 μl로 블로킹하였다. 플레이트를 PBS (10X 스톡), 4웰 용량의 완충액을 함유한 Tween®-20으로 세척했다. 샘플을 상기한 바와 같이 제조하고, 표준 곡선을 60 ng/ml에서 2배 희석하여 0.94 ng/ml로, 다음의 완충액에 적용하였다: 50 mM HEPES, 5.97 g/500 ml, 완충액 pH 7.5, 1% Brij™, 0.5 g/500 ml, 프로테아제 억제제 5 μl/ml. 샘플 및 표준을 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 웰당 100 μl로 첨가하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS (10X 스톡), 4웰 용량의 완충액을 함유한 Tween®-20으로 세척했다. 퍼옥시다아제에 접합된, 검출 항체 클론, SW4-18F5를 1 μl/mg의 농도로 각 100 μl에 첨가하고 실온에서 1시간 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 PBS (10X 스톡), 4웰 용량의 완충액을 함유한 Tween®-20으로 세척했다. TMB™ (Pierce) 기질을 웰 당 100 μl 씩 첨가하고 대략 10분 동안 또는 적정 발색이 될 때까지 인큐베이팅시켰다. 발색은 0.4M H2SO4의 웰 당 100 μl로 중단되었다. Softmax™ 소프트웨어를 사용하여, 450 nm에서 플레이트를 판독했다. 단일 카피 T1 이벤트에서 얻은 생성된 ELISA 데이터는 표준 편차가 +/-33 ng/cm2인 77 ng/cm2의 평균 DGT-28 단백질 발현을 나타냈다.
글리포세이트 내성:
먼저, 글루포시네이트 선별 방식을 사용하여 비형질전환된 종자 배경으로부터 아라비돕시스 T1 형질전환체(pDAB114286 또는 pDAB114287에 의한 형질전환 유래)를 선별하였다. 3개의 플랫 또는 50,000개의 종자를 각 T1 구축물에 대해 분석하였다. 선별된 T1 식물을 분자적으로 특징을 규명하고 (상술한 바와 같음), 다양한 카피수의 이벤트를 다양한 비율의 시판용 글리포세이트로 분무하였다.
dgt-28 트랜스젠을 함유한 트랜스제닉 T1 아라비돕시스 식물을 다양한 비율의 글리포세이트로 분무하였다. 내성의 상대적 수준 (420, 840, 1,680 또는 3,360 g ae/ha)을 결정하기 위해 상승된 비율을 이 연구에 적용하였다. 일반적인 글리포세이트의 1X 필드 사용률은 1120g ae/ha이다. 상기 식물의 반응을 처리 후 2주째 (WAT)의 시각적 손상률(%)로 나타낸다. 이 연구에 사용된 T1 아라비돕시스 식물은 dgt-28 트랜스젠에 대해 가변적인 카피수를 가졌다. 낮은 카피 dgt-28 T1 아라비돕시스 식물은 자가 수분을 하여 T2 식물을 생산하는 데 사용하였다. 표 2는 야생형 (비-트랜스제닉) 대조군에 대한, dgt-28 트랜스제닉 식물의 비교를 보여준다.
제시한 데이터는 손상을 거의 보이지 않거나, 전혀 보이지 않거나 (<20%), 중간 정도의 손상을 보이거나 (20-40%), 심각한 손상을 보이는 (>40%) 개별 식물을 보여주고 있다. 아라비돕시스 형질전환에 사용된 각 구축물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제시되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비-형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 c.v. 콜롬비아가 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다.
글리포세이트 적용에 대한 식물 반응 수준은 다양하였다. 이러한 다양함은 각 식물이 독립적인 형질전환 이벤트를 나타내고, 따라서, 관심 유전자의 카피수는 식물마다 다르다는 사실에 기인하는 것일 수 있다. 하지만, 데이터는 TraP26 및 TraP27의 엽록체 전이 펩티드와 연결된 dgt-28가 글리포세이트에 대한 보호를 제공함을 입증한다.
Figure pct00001
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences, LLC Lira, Justin Cicchillo, Robert Yerkes, Carla Robinson, Andrew <120> CHLOROPLAST TRANSIT PEPTIDES <130> 69716-US-PSP <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 72 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> TraP10 <400> 1 Met Ala Gln Ser Ser Arg Ile Cys His Gly Val Gln Asn Pro Cys Val 1 5 10 15 Ile Ile Ser Asn Leu Ser Lys Ser Asn Gln Asn Lys Ser Pro Phe Ser 20 25 30 Val Ser Leu Arg Pro Arg Leu Trp Gly Ala Ser Lys Ser Arg Ile Pro 35 40 45 Met His Lys Asn Gly Ser Phe Met Gly Asn Phe Asn Val Gly Lys Gly 50 55 60 Asn Ser Gly Val Phe Lys Val Ser 65 70 <210> 2 <211> 68 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> TraP11 <400> 2 Met Ala Gln Val Ser Arg Val His Asn Leu Ala Gln Ser Thr Gln Ile 1 5 10 15 Phe Gly His Ser Ser Asn Ser Asn Lys Leu Lys Ser Val Asn Ser Val 20 25 30 Ser Leu Lys Thr His Gln Pro Arg Ala Ser Ser Trp Gly Leu Lys Lys 35 40 45 Ser Gly Thr Met Leu Asn Gly Ser Val Ile Arg Pro Val Lys Val Thr 50 55 60 Ala Ser Val Ser 65 <210> 3 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TraP17 <400> 3 Met Ala Gln Val Asn Asn Met Met Gln Gly Leu Arg Leu Ser Pro Ser 1 5 10 15 Asn Leu Ser Lys Pro Gln Thr Pro Leu Pro Ser His Ser Leu Leu Leu 20 25 30 Gly Ser Asn Ser Leu Lys Asn Ser Val Ser Ala Ser Ser Val Ala Pro 35 40 45 Ala Pro Ala Cys Ser Ala Pro Ala Gly Ala Gly Arg Arg Ala Val Val 50 55 60 Val Arg 65 <210> 4 <211> 67 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> TraP18 <400> 4 Met Ala Ala Thr Met Ala Ser Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser 1 5 10 15 Leu Asp Gln Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Phe Ser Ser Lys Thr Leu 20 25 30 Asn Phe Gly Ser Asn Leu Arg Ile Ser Pro Lys Phe Met Ser Leu Thr 35 40 45 Asn Lys Arg Val Gly Gly Gln Ser Ser Ile Val Pro Lys Ile Gln Ala 50 55 60 Ser Val Ala 65 <210> 5 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TraP19 <400> 5 Met Ala Gln Ala Thr Thr Ile Asn Asn Gly Val His Thr Gly Gln Leu 1 5 10 15 His His Thr Leu Pro Lys Thr Gln Leu Pro Lys Ser Ser Lys Val Asn 20 25 30 Asp Val Val Pro His Val Tyr Ser Ala Pro Leu Ser Val Ala Arg Arg 35 40 45 Ser Cys Ser Lys Ser Ser Ile Arg Ser Thr Arg Arg Leu Gln Thr Thr 50 55 60 Val Cys Ser 65 <210> 6 <211> 60 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> TraP26 <400> 6 Met Ala Gln Val Ser Met Ile Pro Asn Ala Ile Gln Ala Pro Cys Ser 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ser Lys Ser Gln Ala Gly Lys Ser Val Arg Lys Val Ser 20 25 30 Leu Lys Pro Asn Gln His Ala Ala Trp Gly Leu Arg Arg Ser Gly Met 35 40 45 Arg Val Gly Asn Pro Glu Val Val Val Ser Ala Ser 50 55 60 <210> 7 <211> 61 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> TraP27 <400> 7 Met Ala Thr Phe Thr Arg Val Cys His Thr Ala Arg Lys Ser Phe Val 1 5 10 15 Ser Leu Ser Asn Ser Gln Ala Asn Ser Pro Val Ser Val Arg Phe Leu 20 25 30 Ser Leu Pro Met Pro Ala Ala Arg Pro Ala Val Lys Ser Gly Val Arg 35 40 45 Leu Trp Gly Cys Arg Leu Ser Phe Lys Val Ser Ala Ser 50 55 60 <210> 8 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TraP28 <400> 8 Met Ala Val Gln Ser Asn Met Ile Cys Ala Gly Val Ala Asn Pro Phe 1 5 10 15 Val Ser Pro Asn Leu Ser Lys Thr Arg Ala Ser Lys Ser Val Tyr Ser 20 25 30 Val Leu Gly Thr Arg Leu Asn Ser Ser Ala Arg Gly Lys Lys Ser Ala 35 40 45 Met Pro Leu Ile Gly Asn Arg Val Pro Val Ser Ala 50 55 60 <210> 9 <211> 217 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> TraP10 polynucleotide <400> 9 atggctcaat cttctaggat ttgccacggt gttcaaaacc cttgcgtgat catctctaac 60 ctttccaagt ccaaccagaa caagtctcct ttcagcgttt ctcttagacc tagactttgg 120 ggagcttcta agtctaggat ccctatgcat aagaacggat ccttcatggg aaacttcaat 180 gtgggaaagg gaaactctgg tgttttcaag gtttccg 217 <210> 10 <211> 204 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> TraP11 polynucleotide <400> 10 atggctcaag tttctagggt tcacaacctt gctcagtcta ctcagatttt cggacactct 60 tccaactcta acaagctcaa gtctgttaac tctgtgtctc ttaagactca tcaacctagg 120 gcttcatctt ggggacttaa gaaatccgga accatgctta acggatctgt tatcaggcct 180 gttaaggtta ccgcttctgt gtct 204 <210> 11 <211> 198 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> TraP17 polynucleotide <400> 11 atggctcaag ttaacaacat gatgcaaggg ttgagacttt caccctctaa cttgtccaaa 60 ccgcagactc cgctcccttc tcactctctg ctgcttggaa gcaatagcct caagaactct 120 gtctccgcat catccgttgc tccagctcct gcctgtagcg caccagctgg tgccggaagg 180 agggctgtgg tcgtgaga 198 <210> 12 <211> 201 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> TraP18 polynucleotide <400> 12 atggctgcca ctatggcctc aaacgcagca gcagctgctg ctgtgagctt ggaccaagct 60 gttgccgcat ctgctgcctt cagctccaaa acacttaact ttggctccaa tctccgtatc 120 agcccaaagt ttatgagcct gactaacaag agagtgggtg gacagtcatc tatagttcct 180 aagattcaag cctcagtcgc a 201 <210> 13 <211> 201 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> TraP19 polynucleotide <400> 13 atggcacaag ctacaacgat caacaatggt gtccacaccg gacaactgca tcatacactt 60 ccaaagacgc agctcccgaa atcttctaag gtgaacgacg ttgtgcctca cgtctactcc 120 gctcccctta gcgttgcaag gaggtcatgc agcaaatcca gcataagatc cactagacgt 180 ctccagacca ctgtttgttc a 201 <210> 14 <211> 180 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> TraP26 polynucleotide <400> 14 atggcacaag tctccatgat acctaatgct attcaagcac cgtgctcaat ctccctgagc 60 aagtcccaag ctggaaagtc tgttcgcaag gtgtctctca aacctaatca gcacgcagct 120 tggggtttgc gtaggtctgg catgagggtg gggaacccag aggtggtcgt ttcagccagc 180 <210> 15 <211> 183 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> TraP27 polynucleotide <400> 15 atggctacgt ttaccagagt gtgccacaca gcaaggaaat ccttcgtttc actttcaaac 60 tctcaagcca attctcctgt gagcgttagg tttctgtcct tgcccatgcc agcagccaga 120 ccagctgtca agagcggagt gcgtctctgg ggttgtcgct tgtccttcaa ggtctcagct 180 tct 183 <210> 16 <211> 180 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> TraP28 polynucleotide <400> 16 atggcagtgc agtctaacat gatctgcgct ggtgtggcta acccgttcgt gtccccaaac 60 cttagcaaaa caagggcttc aaagtccgtc tacagcgttc tcgggactag actcaattca 120 tccgcaagag gcaagaagtc tgccatgcct ctgattggaa atcgtgttcc cgtctctgcc 180 <210> 17 <211> 9 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> linker <400> 17 gcttcttct 9 <210> 18 <211> 204 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Trap11 polynucleotide <400> 18 atggctcaag tttctagggt tcacaacctt gctcagtcta ctcagatttt cggacactct 60 tccaactcta acaagctcaa gtctgttaac tctgtgagtc ttaagactca tcaaccgagg 120 gcttcatctt ggggacttaa gaaatccgga accatgctta acggatcagt tatcagacct 180 gtgaaagtta ccgcttctgt gtct 204 <210> 19 <211> 1902 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 19 atgaacaacg ttctcaactc tgggagaacc accatctgcg acgcgtacaa tgtggtggca 60 cacgacccat tctcatttga gcacaagagc ctggatacga tccagaaaga gtggatggaa 120 tggaaaagga cggaccattc cttgtacgtt gctccagtgg tgggcactgt gtcctcgttc 180 ctcctcaaga aagtggggtc gctgatcggg aagcggatac tctccgaact ctggggaatc 240 atctttccgt ctggctcaac aaacttgatg caagacatac tgagagagac tgagcagttc 300 ttgaatcaga ggctgaatac ggacacgctg gcgagggtga acgctgaact cattggcctc 360 caagcgaaca ttagagagtt caatcagcaa gttgataact ttctgaaccc cacacagaat 420 ccagtgcctc tgtccatcac atcatctgtg aacacaatgc agcagctgtt cttgaatagg 480 ctgccacagt ttcagattca aggctatcaa ctgcttcttc tgcctctgtt tgctcaagct 540 gcgaacatgc acctcagctt catcagagac gtgattctga acgcagatga gtggggaatc 600 agcgctgcca ctttgaggac ctacagagat tacttgagga actatacacg cgattactca 660 aactactgca tcaacaccta tcaaacagcg tttaggggac ttaacaccag actgcacgac 720 atgcttgagt tccggactta catgttcctc aacgtctttg agtatgtctc gatttggtcc 780 ctcttcaagt atcagagcct tatggtctcc tctggtgcta acctctacgc ctcgggttcc 840 ggaccgcagc agacccagtc attcactgcc cagaactggc cattcctcta cagccttttc 900 caagtgaaca gcaactacat cttgtctggc atctctggca caaggctctc tatcacattt 960 ccgaacattg gtggcctgcc tggctccacg acgacacaca gcctcaattc cgcacgcgtc 1020 aactactcgg gtggggtctc ctccggactc attggtgcca ctaacttgaa ccataacttc 1080 aactgttcaa cggtgctgcc acccctttca actccgtttg tcagatcgtg gcttgattct 1140 ggcactgaca gagagggagt tgccacgagc accaactggc agaccgagtc cttccagacc 1200 acactttcgc tgcgctgcgg tgccttctca gcgaggggaa actcgaacta cttcccagac 1260 tacttcatac gcaacattag cggagtcccg ttggtgatcc ggaatgagga cctcaccaga 1320 cctcttcact acaatcagat acgcaacatc gaaagcccat ctgggacacc tggaggtgca 1380 agggcatact tggttagcgt tcacaaccgg aagaacaaca tctatgctgc taatgagaat 1440 gggaccatga ttcatcttgc accggaagat tacactggct tcacgatctc acccatccat 1500 gccacccaag tgaacaacca gactcgcacg ttcatctcag agaagttcgg caaccaaggt 1560 gacagcctcc gcttcgaaca gagcaacacc acagccagat acacccttag aggcaatggc 1620 aacagctaca atctctatct gagggtgtct agcattggca attcgaccat tcgggtgacg 1680 atcaatggtc gcgtttacac ggtctccaac gtcaatacga ccactaacaa tgatggggtc 1740 aatgacaatg gtgctcgctt ctccgacatc aacatcggca acatcgtcgc ttccgacaac 1800 accaatgtta cgctggacat caatgtcacc ttgaactctg gcacaccttt cgatctgatg 1860 aacatcatgt ttgtccccac caatcttcct cccctctact ga 1902 <210> 20 <211> 69 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 20 Met Ala Gln Ser Ser Arg Ile Cys His Gly Val Gln Asn Pro Cys Val 1 5 10 15 Ile Ile Ser Asn Leu Ser Lys Ser Asn Gln Asn Lys Ser Pro Phe Ser 20 25 30 Val Ser Leu Lys Thr His Gln Pro Arg Ala Ser Ser Trp Gly Leu Lys 35 40 45 Lys Ser Gly Thr Met Leu Asn Gly Ser Val Ile Arg Pro Val Lys Val 50 55 60 Thr Ala Ser Val Ser 65 <210> 21 <211> 71 <212> PRT <213> Glycine max <400> 21 Met Ala Gln Val Ser Arg Val His Asn Leu Ala Gln Ser Thr Gln Ile 1 5 10 15 Phe Gly His Ser Ser Asn Ser Asn Lys Leu Lys Ser Val Asn Ser Val 20 25 30 Ser Leu Arg Pro Arg Leu Trp Gly Ala Ser Lys Ser Arg Ile Pro Met 35 40 45 His Lys Asn Gly Ser Phe Met Gly Asn Phe Asn Val Gly Lys Gly Asn 50 55 60 Ser Gly Val Phe Lys Val Ser 65 70 <210> 22 <211> 65 <212> PRT <213> Calystegia <400> 22 Met Ala Gln Val Asn Asn Met Met Gln Gly Leu Arg Leu Ser Pro Ser 1 5 10 15 Asn Leu Ser Lys Pro Gln Thr Pro Leu Pro Ser His Ser Leu Leu Leu 20 25 30 Gly Ser Asn Ser Leu Lys Asn Ser Ser Val Ser Val Lys Phe Phe Lys 35 40 45 Thr Gly Lys Asp Ser Ile Phe Thr Ala Ala Arg Ser Pro Leu Lys Val 50 55 60 Arg 65 <210> 23 <211> 61 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 23 Met Gln Leu Leu Asn Gln Arg Gln Ala Leu Arg Leu Gly Arg Ser Ser 1 5 10 15 Ala Ser Lys Asn Gln Gln Val Ala Pro Leu Ala Ser Arg Pro Ala Ser 20 25 30 Ser Leu Ser Val Ser Ala Ser Ser Val Ala Pro Ala Pro Ala Cys Ser 35 40 45 Ala Pro Ala Gly Ala Gly Arg Arg Ala Val Val Val Arg 50 55 60 <210> 24 <211> 58 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 24 Met Ala Ala Thr Met Ala Ser Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser 1 5 10 15 Leu Asp Gln Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Phe Ser Ser Arg Lys Gln 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ala Ala Arg Gly Gly Met Arg Val Arg Val Arg 35 40 45 Ala Arg Gly Arg Arg Glu Ala Val Val Val 50 55 <210> 25 <211> 67 <212> PRT <213> Amaranthus <400> 25 Met Ala Gln Ala Thr Thr Ile Asn Asn Gly Val His Thr Gly Gln Leu 1 5 10 15 His His Thr Leu Pro Lys Thr Gln Leu Pro Lys Ser Ser Lys Thr Leu 20 25 30 Asn Phe Gly Ser Asn Leu Arg Ile Ser Pro Lys Phe Met Ser Leu Thr 35 40 45 Asn Lys Arg Val Gly Gly Gln Ser Ser Ile Val Pro Lys Ile Gln Ala 50 55 60 Ser Val Ala 65 <210> 26 <211> 71 <212> PRT <213> Dunaliella salina <400> 26 Met Leu Ala Arg Gln Gly Gly Ser Leu Arg Ala Ser Gln Cys Asn Ala 1 5 10 15 Gly Leu Ala Arg Arg Val Glu Val Gly Ala Leu Val Val Pro Arg Pro 20 25 30 Ile Ser Val Asn Asp Val Val Pro His Val Tyr Ser Ala Pro Leu Ser 35 40 45 Val Ala Arg Arg Ser Cys Ser Lys Ser Ser Ile Arg Ser Thr Arg Arg 50 55 60 Leu Gln Thr Thr Val Cys Ser 65 70 <210> 27 <211> 1428 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Trap26 DGT28 fusion coding sequence <400> 27 atggcacaag tctccatgat acctaatgct attcaagcac cgtgctcaat ctccctgagc 60 aagtcccaag ctggaaagtc tgttcgcaag gtgtctctca aacctaatca gcacgcagct 120 tggggtttgc gtaggtctgg catgagggtg gggaacccag aggtggtcgt ttcagccagc 180 gcaagaggga tgccagcctt gtctttacct ggatcaaaga gtatcacagc tagggcactc 240 tttcttgctg ctgctgctga tggggttact actttggtga ggccattgag aagtgacgac 300 acagaaggat tcgctgaggg gttagttcgt ttaggctatc gtgtagggag gacacccgat 360 acttggcaag tcgatggcag accacaagga ccagcagtgg ctgaggctga cgtctactgt 420 agagacggag caaccaccgc tagattcttg ccaaccttag cagctgctgg tcacggaaca 480 tacagatttg atgcttcacc acagatgagg agacgtcctc ttttgccctt aagcagagcc 540 ttgagggatt tgggtgtcga tcttagacac gaagaagctg aaggtcatca ccctctgact 600 gtccgtgctg ctggggttga aggaggagag gttactttgg atgctggtca gtcaagtcag 660 tatctcactg ccttgttgct ccttggtccc cttacaagac aaggactgag gataagggtt 720 actgatttgg tgtcagcacc atacgtggag attacgcttg caatgatgag ggctttcgga 780 gttgaagtgg caagggaggg agatgtgttc gttgttccac ctggtggata tcgtgcaact 840 acgtatgcta tagaacccga cgcaagtact gcttcttact tcttcgcagc tgctgctttg 900 actcctggag ctgaagtgac tgtacctggg ttaggcacgg gagcacttca aggagatttg 960 ggatttgtag atgtcttaag gagaatggga gccgaggtgt ccgtaggagc tgatgcaacc 1020 actgttagag gaactggtga attgcgtggc cttacagcca acatgagaga cataagtgat 1080 acgatgccga ccctcgctgc aatagcaccc tttgctagtg ctccagttag aatcgaggat 1140 gttgccaaca ctcgtgtcaa agaatgtgac agacttgagg cttgtgcaga gaaccttagg 1200 aggttgggag taagggttgc aacgggtccg gactggattg agatacaccc tggtccagct 1260 actggtgctc aagtcacaag ctatggtgat cacagaattg tgatgtcatt tgcagtgact 1320 ggacttcgtg tgcctgggat cagcttcgac gaccctggct gtgttcgtaa gacttttcct 1380 gggtttcacg aggctttcgc agaattgagg cgtggcattg ggagctga 1428 <210> 28 <211> 1431 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Trap27 DGT28 fusion coding sequence <400> 28 atggctacgt ttaccagagt gtgccacaca gcaaggaaat ccttcgtttc actttcaaac 60 tctcaagcca attctcctgt gagcgttagg tttctgtcct tgcccatgcc agcagccaga 120 ccagctgtca agagcggagt gcgtctctgg ggttgtcgct tgtccttcaa ggtctcagct 180 tctgcaagag ggatgccagc cttgtcttta cctggatcaa agagtatcac agctagggca 240 ctctttcttg ctgctgctgc tgatggggtt actactttgg tgaggccatt gagaagtgac 300 gacacagaag gattcgctga ggggttagtt cgtttaggct atcgtgtagg gaggacaccc 360 gatacttggc aagtcgatgg cagaccacaa ggaccagcag tggctgaggc tgacgtctac 420 tgtagagacg gagcaaccac cgctagattc ttgccaacct tagcagctgc tggtcacgga 480 acatacagat ttgatgcttc accacagatg aggagacgtc ctcttttgcc cttaagcaga 540 gccttgaggg atttgggtgt cgatcttaga cacgaagaag ctgaaggtca tcaccctctg 600 actgtccgtg ctgctggggt tgaaggagga gaggttactt tggatgctgg tcagtcaagt 660 cagtatctca ctgccttgtt gctccttggt ccccttacaa gacaaggact gaggataagg 720 gttactgatt tggtgtcagc accatacgtg gagattacgc ttgcaatgat gagggctttc 780 ggagttgaag tggcaaggga gggagatgtg ttcgttgttc cacctggtgg atatcgtgca 840 actacgtatg ctatagaacc cgacgcaagt actgcttctt acttcttcgc agctgctgct 900 ttgactcctg gagctgaagt gactgtacct gggttaggca cgggagcact tcaaggagat 960 ttgggatttg tagatgtctt aaggagaatg ggagccgagg tgtccgtagg agctgatgca 1020 accactgtta gaggaactgg tgaattgcgt ggccttacag ccaacatgag agacataagt 1080 gatacgatgc cgaccctcgc tgcaatagca ccctttgcta gtgctccagt tagaatcgag 1140 gatgttgcca acactcgtgt caaagaatgt gacagacttg aggcttgtgc agagaacctt 1200 aggaggttgg gagtaagggt tgcaacgggt ccggactgga ttgagataca ccctggtcca 1260 gctactggtg ctcaagtcac aagctatggt gatcacagaa ttgtgatgtc atttgcagtg 1320 actggacttc gtgtgcctgg gatcagcttc gacgaccctg gctgtgttcg taagactttt 1380 cctgggtttc acgaggcttt cgcagaattg aggcgtggca ttgggagctg a 1431 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 29 agccacatcc cagtaacga 19 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 30 cctccctctt tgacgcc 17 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 31 cagcccaatg aggcatcagc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 32 cttcaccgcc ttagctttct 20 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 33 gtgaagaaga agctttgggt attg 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 34 cgtgacctag tcgtcctcgt cttt 24 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 35 agagaagttt cgacggattt cgggc 25 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 36 gaggattagg gtttcaacgg ag 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 37 gagaattgag ctgagacgag g 21

Claims (56)

  1. 키메라 핵산 분자로서,
    73 미만의 아미노산 길이를 갖는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 펩티드는 관심 뉴클레오티드 코딩 서열에 프레임 내에서 작동가능하게 연결된, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 6 중 하나와 적어도 80% 동일한, 키메라 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한, 키메라 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 2와 적어도 95% 동일한, 키메라 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 6과 적어도 95% 동일한, 키메라 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1인, 키메라 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 2인, 키메라 핵산 분자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 6인, 키메라 핵산 분자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 관심 뉴클레오티드 코딩 서열은 dsm-2 코딩 서열, dgt-28 코딩 서열, Bt 독소 유전자 코딩 서열, yfp 코딩 서열 또는 gfp 코딩 서열인, 키메라 핵산 분자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 14 중 하나와 특이적으로 혼성화가능한, 키메라 핵산 분자.
  10. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 키메라 핵산 분자.
  11. 제1항의 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 색소체 함유 세포의 색소체로 표적화되는, 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드가 색소체로 표적화될 때 제거되는 엽록체 전이 펩티드를 포함하는, 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 엽록체 전이 펩티드가 제거될 때 잔류하는 엽록체-표적화된 펩티드를 포함하고, 여기서 상기 엽록체-표적화된 펩티드는 상기 관심 뉴클레오티드 코딩 서열에 의해 코딩되는, 폴리펩티드.
  15. 제11항에 있어서, 상기 관심 뉴클레오티드 코딩 서열은 생물학적으로 활성인 펩티드를 코딩하는, 폴리펩티드.
  16. 제11항에 있어서, 상기 관심 뉴클레오티드 코딩 서열은 형광 펩티드를 코딩하는, 폴리펩티드.
  17. 제15항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 효소인, 폴리펩티드.
  18. 제15항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 상기 펩티드가 본래 발현되는 세포의 색소체에서 정상적으로 발현되는, 폴리펩티드.
  19. 제15항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 제초제 내성, 바이러스 내성, 박테리아 병원체 내성, 곤충 내성, 선충 내성, 진균 내성, 식물 생장력, 식물 수율, 온도 내성, 토양 조건 내성, 저 조도 내성, 저 수위 내성, 고 수위 내성, 화학적 환경 내성, 종자 색상, 전분 개질, 아미노산 합성, 광합성, 지방산 합성, 오일 합성, 카로티노이드 합성, 테르페노이드 합성, 전분 합성 및 제초제 내성으로 이루어진 군으로부터 선택된 과정에 관여하는, 폴리펩티드.
  20. 제15항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 제아크산틴 에폭시다제, 콜린 모노옥시게나제, 페로킬라타제, 오메가-3 지방산 불포화효소, 글루타민 합성효소, 프로비타민 A, 호르몬, Bt 독소 단백질, 및 관심 형질을 포함하는 식물의 동정에 유용한 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  21. 제19항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 제초제 내성에 관여하는, 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 아세토락타아제 신타제 (ALS), 돌연변이화된 ALS, ALS의 전구체, 3-에놀피루빌시키메이트-5-포스페이트 신타제 (EPSPS), DGT-28 EPSPS, CP4 EPSPS, 부류 IV EPSPS, 및 부류 III EPSPS로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  23. 제19항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 곤충 내성에 관여하는, 폴리펩티드.
  24. 제10항의 핵산 분자를 포함하는 식물 발현 벡터.
  25. 제1항의 키메라 핵산 분자를 포함하는 식물 물질.
  26. 제25항에 있어서, 상기 식물 물질은 식물 세포, 식물 조직, 식물 조직 배양물, 캘러스 배양물, 식물 부분 및 전체 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 식물 물질.
  27. 제26항에 있어서, 상기 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 식물 물질.
  28. 제27항에 있어서, 상기 관심 뉴클레오티드 코딩 서열은 상기 식물 물질의 세포의 색소체로 표적화되는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는, 식물 물질.
  29. 제25항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 식물 물질의 세포의 게놈에 안정적으로 통합되는, 식물 물질.
  30. 제25항에 있어서, 상기 식물 물질은 전체 식물인, 식물 물질.
  31. 제25항에 있어서, 상기 식물 물질은 아라비돕시스, 알팔파, 브라시카, 콩류, 브로콜리, 양배추, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 배추, 목화, 오이, 가지, 양상추, 멜론, 완두콩, 고추, 땅콩, 감자, 호박, 무, 유채, 시금치, 대두, 애호박, 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토, 수박, 옥수수, 양파, 벼, 수수, 밀, 호밀, 기장, 사탕수수, 귀리, 라이밀, 스위치그라스, 및 잔디로 이루어진 군으로부터 선택된 식물 유래인, 식물 물질.
  32. 트랜스제닉 식물 물질을 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    제1항의 키메라 핵산 분자를 수득하는 단계; 및
    상기 핵산 분자로 식물 물질을 형질전환시키는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 식물 물질은 식물 세포, 식물 조직, 식물 조직 배양물, 캘러스 배양물, 식물 부분 및 전체 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 식물 물질은 전체 식물이 아닌, 방법.
  35. 제32항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 물질.
  36. 제34항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 물질.
  37. 제36항의 식물 물질로부터 재생된 트랜스제닉 식물.
  38. 제35항의 식물 물질로부터 생산된 트랜스제닉 식물 일용 제품.
  39. 제35항에 있어서, 상기 관심 뉴클레오티드 코딩 서열은 생물학적으로 활성인 펩티드를 코딩하는, 트랜스제닉 식물 물질.
  40. 제39항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 제초제 내성, 바이러스 내성, 박테리아 병원체 내성, 곤충 내성, 선충 내성, 진균 내성, 식물 생장력, 식물 수율, 온도 내성, 토양 조건 내성, 저 조도 내성, 저 수위 내성, 고 수위 내성, 화학적 환경 내성, 종자 색상, 전분 개질, 아미노산 합성, 광합성, 지방산 합성, 오일 합성, 카로티노이드 합성, 테르페노이드 합성, 전분 합성 및 제초제 내성으로 이루어진 군으로부터 선택된 과정에 관여하는, 트랜스제닉 식물 물질.
  41. 제39항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 제아크산틴 에폭시다제, 콜린 모노옥시게나제, 페로킬라타제, 오메가-3 지방산 불포화효소, 글루타민 합성효소, 프로비타민 A, 호르몬, Bt 독소 단백질, 및 관심 형질을 포함하는 식물의 동정에 유용한 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는, 트랜스제닉 식물 물질.
  42. 제40항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 제초제 내성에 관여하는, 트랜스제닉 식물 물질.
  43. 제42항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 아세토락타아제 신타제 (ALS), 돌연변이화된 ALS, ALS의 전구체, 3-에놀피루빌시키메이트-5-포스페이트 신타제 (EPSPS), CP4 EPSPS, 및 부류 III EPSPS로 이루어진 군으로부터 선택되는, 트랜스제닉 식물 물질.
  44. 제42항에 있어서, 동일 종의 야생형 식물 물질과 비교할 때 상기 식물 물질은 제초제 저항성 또는 제초제 내성 증가를 나타내는, 트랜스제닉 식물 물질.
  45. 제40항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 제초제 내성에 관여하는, 트랜스제닉 식물 물질.
  46. 제26항에 있어서, 상기 식물 물질은 식물을 생산하기 위해 재생할 수 없는 식물 세포인, 식물 물질.
  47. 제32항에 있어서, 상기 식물 물질은 식물을 생산하기 위해 재생할 수 없는 식물 세포인, 방법.
  48. 곤충 내성 식물 필드를 식재하는 것을 특징으로 하는, 관심 뉴클레오티드 코딩 서열과 프레임 내에서 작동가능하게 연결된, 서열번호 9를 포함하는 트랜스제닉 식물 종자의 용도.
  49. 제초제 내성 식물 필드를 식재하는 것을 특징으로 하는, 관심 뉴클레오티드 코딩 서열과 프레임 내에서 작동가능하게 연결된, 서열번호 9를 포함하는 트랜스제닉 식물 종자의 용도.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 트랜스제닉 식물 종자가 옥수수, 대두 및 목화로 이루어진 군으로부터 선택된 식물 유래인 것을 특징으로 하는, 용도.
  51. 곤충 내성 식물 필드를 식재하는 것을 특징으로 하는, 관심 뉴클레오티드 코딩 서열과 프레임 내에서 작동가능하게 연결된, 서열번호 10을 포함하는 트랜스제닉 식물 종자의 용도.
  52. 제초제 내성 식물 필드를 식재하는 것을 특징으로 하는, 관심 뉴클레오티드 코딩 서열과 프레임 내에서 작동가능하게 연결된, 서열번호 10을 포함하는 트랜스제닉 식물 종자의 용도.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 트랜스제닉 식물 종자가 옥수수, 대두 및 목화로 이루어진 군으로부터 선택된 식물 유래인 것을 특징으로 하는, 용도.
  54. 곤충 내성 식물 필드를 식재하는 것을 특징으로 하는, 관심 뉴클레오티드 코딩 서열과 프레임 내에서 작동가능하게 연결된, 서열번호 14를 포함하는 트랜스제닉 식물 종자의 용도.
  55. 제초제 내성 식물 필드를 식재하는 것을 특징으로 하는, 관심 뉴클레오티드 코딩 서열과 프레임 내에서 작동가능하게 연결된, 서열번호 14를 포함하는 트랜스제닉 식물 종자의 용도.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 트랜스제닉 식물 종자가 옥수수, 대두 및 목화로 이루어진 군으로부터 선택된 식물 유래인 것을 특징으로 하는, 용도.
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