ES2716481T3 - Plantas resistentes al glifosato y métodos asociados - Google Patents

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Justin M Lira
Robert M Cicchillo
Carla Yerkes
Andrew E Robinson
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Description

DESCRIPCIÓN
Plantas resistentes al glifosato y métodos asociados
Campo técnico
La presente descripción se refiere a biotecnología vegetal. Las realizaciones particulares se refieren a nuevos polipéptidos implicados en el metabolismo de la N-(fosfonometil) glicina y a ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos. Las realizaciones particulares se refieren a plantas, partes de plantas y células de plantas que comprenden unos polipéptidos y/o ácidos nucleicos anteriores.
Antecedentes
Las especies de malezas han sido durante mucho tiempo un problema en los campos de cultivo. Aunque el control de malezas puede ser una operación que requiere mucha mano de obra, se ha hecho más fácil gracias a la disponibilidad de herbicidas químicos eficaces para eliminar las malezas. El uso generalizado de herbicidas, junto con variedades mejoradas de cultivos y fertilizantes, ha contribuido significativamente a la "revolución verde" en la agricultura. Herbicidas particularmente útiles son aquellos que tienen un amplio espectro de actividad herbicida. Por desgracia, los herbicidas de amplio espectro tienen típicamente un efecto perjudicial sobre las plantas de cultivo expuestas al herbicida. Una forma de superar este problema es producir plantas de cultivo que sean tolerantes al herbicida de amplio espectro.
Un ejemplo de un herbicida de amplio espectro es la N-fosfonometil-glicina, también conocida como glifosato. El glifosato ha sido utilizado ampliamente por los agricultores de todo el mundo para controlar las malezas antes de la siembra de cultivos, por ejemplo en la agricultura sin labranza. Además, el glifosato es un medio eficaz para controlar las malezas y las plantas voluntarias entre ciclos de producción o rotaciones de cultivos. El glifosato no se arrastra de los suelos después de su uso, y se considera en general como uno de los herbicidas químicos más seguros para el medio ambiente y más efectivos para la agricultura.
El glifosato mata a las plantas inhibiendo la ruta del ácido shikímico. Esta ruta conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos, incluyendo los aminoácidos, las vitaminas y las hormonas vegetales. El glifosato bloquea la condensación del ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y del ácido 3-fosfoshikímico para dar ácido 5-enolpiruvil-3- fosfoshikímico mediante la unión de la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, e inhibición de su actividad, comúnmente conocida como "EPSP sintetasa" y " EPSp S".
Desgraciadamente, no se conocen plantas de cultivo que sean por naturaleza tolerantes al glifosato y, por tanto, la utilidad de este herbicida para el control de malezas en cosechas cultivadas ha sido limitada. Un método para producir plantas de cultivo tolerantes al glifosato es introducir un gen que codifica una forma heteróloga tolerante al glifosato de un gen de EPSPS en la planta de cultivo, utilizando las técnicas de ingeniería genética. Usando mutagénesis química, se han producido formas de EPSPS tolerantes al glifosato en bacterias, y se introdujeron genes heterólogos en las plantas para producir plantas tolerantes al glifosato. Véase, por ejemplo, Comai et al. (1983) Science 221: 370 -71. Los genes heterólogos de EPSPS se pueden sobreexpresar en las plantas de cultivo para obtener un nivel de tolerancia deseado. La entrada de la base de datos UniProt con el número de acceso de la base de datos n° B5HND8 describe una secuencia de polipéptidos de una sintasa de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSPS) de Streptomyces sviceus. Haghani K. et al., "Comparative studies of wild type Escherichia coli 5-enolpyruvylshikimato 3-phosphate synthase with three glyphosate-insensitive mutated forms: Activity, stability and structural characterization", Biochimica et Biophysica Acta (b Ba ) - Proteins & Proteomics, Elsevier, Netherlands, vol. 1784, n° 9, pp 1167 - 1175, describe tres formas mutadas insensibles al glifosato de la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de Escherichia coli. El documento WO2010/078156 A1 describe algas resistentes a herbicidas, Chlamydomonas reinhardtii, que expresan formas mutantes de la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de Escherichia coli. Pollegioni L. et al., "Molecular basis of glyphosate resistance - different approaches through protein engineering", FEBS Journal, vol. 278, n° 16, pp 2753 - 2766, describe formas mutadas insensibles al glifosato de la 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de varios organismos que incluyen Escherichia coli.
Los ejemplos anteriores de la técnica relacionada y las limitaciones relacionadas con los mismos pretenden ser ilustrativos y no excluyentes. Otras limitaciones de la técnica relacionada se harán evidentes para los expertos en la materia tras la lectura de la memoria descriptiva.
Descripción de la invención
La invención se define en las reivindicaciones. En este documento se describen polipéptidos aislados que tienen al menos un 90% de identidad con la SEC ID NO: 1, y ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene al menos un 90% de identidad con la SEC ID NO: 1 (por ejemplo, SEC ID NO: 2-4).
También se describen plantas, partes de plantas, órganos de plantas, semillas de plantas y células vegetales que comprenden un polipéptido heterólogo que tiene al menos un 90% de identidad con la SEC iD NO: 1. En particular, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere a una planta la tolerancia al glifosato, en donde la EPSPS es al menos el 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 y, cuando se alinea con la SEC ID NO: 1, comprende una alanina en la posición correspondiente a la posición 84 de la SEC ID NO: 1, en donde el polinucleótido es una secuencia sintética que ha sido diseñada para la expresión en una planta seleccionada entre el grupo formado por:
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 2 o s Ec ID NO: 3; y
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con otro ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3 en condiciones de rigor alto,
en donde el polinucleótido está unido operativamente a un promotor, en donde preferiblemente el promotor está dirigiendo la expresión de un gen.
Algunas realizaciones incluyen una planta transgénica tolerante al glifosato, parte de la planta, órgano de la planta, semilla de la planta y/o célula vegetal que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere a una planta la tolerancia al glifosato, en donde la EPSPS es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 y cuando está alineada con la SEC ID NO: 1 comprende una alanina en la posición correspondiente a la posición 84 de la SEC ID NO: 1, en donde el polinucleótido es una secuencia sintética que ha sido diseñada para la expresión en una planta seleccionada entre el grupo que consiste en:
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 2 o s Ec ID NO: 3; y
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con otro ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3 en condiciones de rigor alto,
en donde el polinucleótido está unido operativamente a un promotor, en donde preferiblemente el promotor está dirigiendo la expresión de un gen.
En otras realizaciones, la descripción se refiere a métodos para generar una planta, parte de planta, órgano de planta, semillas de planta y/o células vegetales resistentes al glifosato, que comprenden: transformar una planta, una parte de la planta, un órgano de la planta, una semilla de la planta y/o células vegetales con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere a una planta tolerancia al glifosato, en donde la EPSPS es al menos un 90% idéntica con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 y cuando se alinea con la SEC ID NO: 1 comprende una alanina en la posición correspondiente a la posición 84 de la SEC ID NO: 1, en donde el polinucleótido es una secuencia sintética que se ha diseñado para la expresión en una planta seleccionada entre el grupo que consiste en:
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3; y
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con otro ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3 en condiciones de rigor alto,
en donde el polinucleótido está unido operativamente a un promotor, en donde preferiblemente el promotor está dirigiendo la expresión de un gen.
En algunas realizaciones, la descripción se refiere a un cultivo de tejido de células vegetales regenerables tolerantes al glifosato, que comprenden la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con lo precedente. Tal cultivo de tejidos puede ser capaz de regenerar plantas que tienen las características fisiológicas y morfológicas de las anteriores plantas resistentes al glifosato, y también de plantas regeneradoras que tienen sustancialmente el mismo genotipo que las plantas resistentes al glifosato. Las células regenerables de plantas tolerantes al glifosato en tales cultivos de tejidos pueden ser, por ejemplo, embriones, protoplastos, células meristemáticas, callos, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de la raíz, flores, semillas, vainas y tallos. Realizaciones particulares se refieren a plantas transgénicas tolerantes al glifosato regeneradas a partir de un cultivo de tejido de acuerdo con lo precedente.
En algunas realizaciones, la descripción se refiere a células vegetales transgénicas tolerantes al glifosato que no son regenerables para producir plantas, por ejemplo para su uso en la producción de líneas de células vegetales resistentes al glifosato. En otras realizaciones la descripción se refiere a plantas transgénicas tolerantes al glifosato que comprenden en parte tales células.
En otras realizaciones, la presente descripción se refiere a métodos y composiciones para hacer y usar una planta que es tolerante a más de un herbicida o de una clase o subclase de herbicida, como se describe más adelante. En algunas formas de realización particulares, se proporciona una planta que es tolerante al glifosato y al menos a otro herbicida (o clase o subclase de herbicida) o producto químico (o clase o subclase de producto químico) (por ejemplo, fungicidas, insecticidas, reguladores del crecimiento de plantas y similares). Tales plantas pueden encontrar aplicación, por ejemplo, en métodos que comprenden el tratamiento de plantas de cultivo con múltiples herbicidas. Por lo tanto, la descripción proporciona plantas resistentes a herbicidas que toleran el tratamiento con un herbicida o una combinación de herbicidas (incluida una combinación de herbicidas que actúan a través de un modo diferente de actividad herbicida) o que toleran el tratamiento con una combinación de al menos un herbicida y al menos otro producto químico. De esta manera, la descripción describe métodos mejorados para cultivar plantas de cultivo en las que las malezas se controlan selectivamente.
Una planta resistente a los herbicidas de acuerdo con algunas realizaciones puede comprender una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo que confiere tolerancia al glifosato y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que confiere tolerancia al ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). De acuerdo con los párrafos anteriores, se proporcionan plantas que comprenden al menos una tercera molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que imparte a la planta un rasgo seleccionado entre el grupo que consiste en un rasgo de tolerancia a herbicidas; un rasgo de resistencia a los insectos; un rasgo agronómico; un rasgo de resistencia a las enfermedades; un rasgo de ácido graso modificado; y un rasgo de fitato reducido.
En algunos ejemplos, una planta resistente a un herbicida comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que confiere tolerancia al glifosato y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que confiere tolerancia al glufosinato. Algunos ejemplos incluyen una planta resistente a los herbicidas, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que imparte a la planta un rasgo seleccionado entre el grupo que consiste en un rasgo de tolerancia al herbicida; un rasgo de resistencia a los insectos; un rasgo agronómico; un rasgo de resistencia a la enfermedad; un rasgo de ácido graso modificado; y un rasgo de fitato reducido.
En ejemplos particulares, una planta resistente a un herbicida comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que confiere tolerancia al glifosato y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que confiere tolerancia a un herbicida que inhibe la acetolactato sintasa (ALS) (Lee et al. (1988) EMBOJ.
7: 1241), también conocida como enzima acetohidroxiácido sintasa (AHAS) (Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80: 449). Algunos ejemplos incluyen una planta resistente a los herbicidas que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que imparte a la planta un rasgo seleccionado entre el grupo que consiste en un rasgo de tolerancia a herbicidas; un rasgo de resistencia a los insectos; un rasgo agronómico; un rasgo de resistencia a las enfermedades; un rasgo de ácido graso modificado; y un rasgo de fitato reducido.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico puede combinarse (o "apilarse") en una planta con cualquier otra molécula de ácido nucleico, por ejemplo, y sin que sea limitante, para proporcionar resistencia o tolerancia adicionales al glifosato o a otro herbicida, para proporcionar resistencia a insectos o enfermedades seleccionados, para proporcionar mejoras nutricionales, para proporcionar mejores características agronómicas, y para proporcionar una proteína u otro producto útil en piensos, alimentos, usos industriales, usos farmacéuticos y/u otros usos. Los ejemplos incluyen el apilamiento de dos o más ácidos nucleicos de interés dentro del genoma de una planta. Tal "pila de genes" puede conseguirse a través del desarrollo de plantas convencional utilizando dos o más eventos, la transformación de una planta con un constructo que contiene las secuencias de interés, la re-transformación de una planta transgénica o la adición de nuevos rasgos a través de la integración dirigida vía recombinación homóloga. Ejemplos particulares de tal apilamiento incluyen cualquier combinación de los siguientes: un ácido nucleico dgt-28; un ácido nucleico Cry34Ab1; un ácido nucleico Cry35Ab1; un ácido nucleico Cry1F; un ácido nucleico Cry1Ac; un ácido nucleico aad-12; un ácido nucleico aad-1; un ácido nucleico pat; y un ácido nucleico DSM-2.
Además de los aspectos y realizaciones ejemplares descritos anteriormente, se harán evidentes otros aspectos y realizaciones adicionales por el estudio de las siguientes descripciones.
Breve descripción de las figuras
La Fig.1 incluye una alineación de secuencia parcial de enzimas EPSP sintasas ejemplares (es decir, DGT-28, DGT-32, DGT-33, y otras). Los tres ejemplos de estas enzimas DGT comparten una alanina conservada en la posición de aminoácido 96 de la enzima aroA EPSP sintasa. La ubicación de este aminoácido está indicada por un asterisco, y el resto de aminoácido está subrayado.
La Fig. 2 incluye una alineación de enzimas DGT ejemplares (es decir, DGT-1, DGT-3 y DGT-7). La ubicación de un resto de aminoácido mutado que fue cambiado de una glicina por una alanina está indicada por el primer asterisco. La ubicación de un segundo resto de aminoácido mutado que fue cambiado de una treonina por una isoleucina está indicada por el segundo asterisco. La ubicación de un tercer resto de aminoácido mutado que fue cambiado de una prolina por una a serina está indicada por el tercer asterisco.
Las Figs. 3-30 incluyen mapas de diversos plásmidos ejemplares: pDAB107527 (Fig. 3); pDAB105530 (Fig. 4) pDAB105531 (Fig. 5); pDAB105532 (Fig. 6); pDAB105533 (Fig. 7); pDAB105534 (Fig. 8); pDAB4104 (Fig. 9) pDAB102715 (Fig. 10); pDAB107532 (Fig. 11); pDAB107534 (Fig. 12); pDAB102785 (Fig. 13); pDAB100445 (Fig. 14) pDAB102946 (Fig. 15); pDAB100469 (Fig. 16); pDAB102028 (Fig. 17); pDAB102029 (Fig. 18); pDAB102032 (Fig. 19) pDAB102034 (Fig. 20); pDAB100429 (Fig. 21); pDAB100442 (Fig. 22); pDAB100430 (Fig. 23); pDAB102036 (Fig.24) pDAB102038 (Fig. 25); pDAB102040 (Fig. 26); pDAB102042 (Fig. 27); pDAB107712 (Fig. 28); pDAB107713 (Fig.29) y pDAB107714 (Fig. 30).
La Fig. 31 incluye los valores de IC50 obtenidos después de la introducción de varias mutaciones dentro de DGT-1 (A) y DGT-7 (B) usando 1 mM de PEP. Tanto para curvas de IC50 de la Fig. 31 (A) como para las de la Fig. 31 (B), los triángulos cerrados representan tipo silvestre, los círculos cerrados representan mutantes GA, los cuadrados abiertos representan mutantes GAPS y los cuadrados cerrados representan mutantes TIPS. Las figs. 32-46 incluyen mapas de diversos plásmidos ejemplares: pDAB102719 (Fig. 32); pDAB102718 (Fig. 33); pDAB107663 (Fig. 34); pDAB107664 (Fig. 35); pDAB107665 (Fig. 36); pDAB107666 (Fig.37); pDAB109812 (Fig.38); pDAB101556 (Fig. 39); pDAB107698 (Fig. 40); pDAB108384 (Fig. 41); pDAB108385 (Fig.42); pDAB108386 (Fig.43); pDAB108387 (Fig. 44); pDAB102716 (Fig. 45); pDAB102717 (Fig. 46); pDAB110828 (Fig.47); pDAB110827 (Fig.48); pDAB107545 (Fig. 49); pDAB107548 (Fig. 50); pDAB107553 (Fig. 51); pDAB102792 (Fig. 52); pDAB107602 (Fig. 53); y pDAB107533 (Fig. 54).
Modo(s) para llevar a cabo la invención
I. Perspectiva general.
La invención se define en las reivindicaciones. En el presente documento se describen nuevos polipéptidos implicados en el metabolismo de N-(fosfonometil) glicina y ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos. En algunos ejemplos, dicho polipéptido confiere la tolerancia al glifosato (o la aumenta) en una célula vegetal en donde el polipéptido se expresa de forma heteróloga, por ejemplo sin afectar adversamente a la unión de EPSP sintasa con su sustrato natural, fosfoenolpiruvato (PEP).
II. Términos.
Para aclarar mejor la amplitud de esta descripción, se proporcionan las siguientes definiciones, términos y abreviaturas específicas.
A menos que se defina específicamente otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado entendido comúnmente por un experto en la técnica. A menos que se indique otra cosa en el contexto en el que aparece, un término singular incluirá los plurales, y se entenderá que los términos plurales incluyen el singular. Así, los artículos indefinidos "un" y "una", usados precediendo a un elemento o componente, son no restrictivos con respecto al número de instancias (es decir, ocurrencias) del elemento o del componente. Cuando se proporcionan rangos de valores numéricos en el presente documento (por ejemplo, "menos que aproximadamente X”, “menos que X" y "por ejemplo, X1 ... y X2"), se entiende que los rangos incluyen todos los valores y rangos de valores incluidos dentro del rango proporcionado, como si estos valores y rangos incluidos hubieran sido citados expresamente.
Como se usan en el presente documento, los términos "que comprende", "que incluyen", "que tienen" y "que contienen", y sus variaciones, están abiertos (es decir, no son excluyentes). Por ejemplo, una composición o método que comprende una lista de elementos no está necesariamente limitado a solo esos elementos. Dicha composición o método puede (o no) incluir otros elementos no listados expresamente o inherentes a la composición o al método. Además, a menos que se indique expresamente otra cosa, "o" se utiliza en el sentido inclusivo (y no exclusivo). Por ejemplo, una condición "A o B" es satisfecha por cualquiera de las siguientes: A es verdadera (o presente) y B es falsa (o no presente); A es falsa (o no presente) y B es verdadera (o presente); y tanto A como B son verdaderas (o presentes).
Planta: como se usa en el presente documento, el término "planta" incluye una planta completa y cualquier descendiente, célula, tejido o parte de un planta. La expresión "partes de la planta" incluye cualquier parte o partes de una planta, incluyendo, por ejemplo y sin limitación: semilla (incluyendo semilla madura y semilla inmadura); una planta de corte; una célula vegetal; un cultivo de células vegetales; un órgano vegetal (p. ej., polen, embriones, flores, frutos, brotes, hojas, raíces, tallos y explantes. Un tejido u órgano vegetal puede ser una semilla, protoplasto, callo, o cualquier otro grupo de células vegetales que se organiza en una unidad estructural o funcional. Un cultivo de células o tejidos vegetales puede ser capaz de regenerar una planta que tiene las características fisiológicas y morfológicas de la planta a partir de la cual se obtuvieron las células o tejidos y de regenerar una planta que tenía sustancialmente el mismo genotipo que la planta. En cambio, algunas células vegetales no pueden regenerarse para producir plantas. Células regenerables en una célula vegetal o tejido de cultivo pueden ser embriones, protoplastos, células meristemáticas, callos, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de raíces, seda, flores, granos, espigas, mazorcas, cáscaras o tallos.
Las partes de la planta incluyen partes cosechables y partes útiles para la propagación de las plantas de progenie. Las partes de la planta útiles para la propagación incluyen, por ejemplo y sin ser limitación: semilla; fruta; esqueje; muda; un tubérculo; y un portainjerto. Una parte cosechable de una planta puede ser cualquier parte útil de una planta, incluyendo, por ejemplo y sin limitación: flor; polen; plantón; tubérculo; hoja; tallo; fruta; semilla; y raíz.
Una célula vegetal es la unidad estructural y fisiológica de la planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. Una célula vegetal puede estar en forma de una sola célula aislada, o un agregado de células (por ejemplo, un callo friable y una célula cultivada), y puede ser parte de una unidad organizada superior (por ejemplo, un tejido vegetal, un órgano vegetal y una planta). Así, una célula vegetal puede ser un protoplasto, una célula productora de gametos, o una célula o colección de células que pueden regenerarse en una planta completa. Como tal, una semilla que comprende múltiples células vegetales y es capaz de regenerarse en una planta completa, se considera una "célula vegetal" en realizaciones del presente texto.
Resistencia/tolerancia a los herbicidas: Cuando se hace referencia a plantas que son resistentes o tolerantes al glifosato, se entiende que una aplicación de una cantidad de glifosato en la planta no afecta significativamente o mata a la planta, en donde una planta de tipo silvestre de la misma especie se vería significativamente afectada y/o mataría por la aplicación de la cantidad de glifosato. Una planta puede ser por naturaleza tolerante a un herbicida en particular, o una planta puede ser tolerante a un herbicida como resultado de ingeniería genética, como por ejemplo, la cría selectiva; la transformación genética y/o la introducción de un transgén en el genoma de la planta. Una "planta resistente al glifosato" se refiere a una planta que contiene un polipéptido o una molécula de ácido nucleico que confiere tolerancia a los herbicidas cuando se proporciona a una planta heteróloga u otro organismo que lo exprese (es decir, que hace que una planta u otro organismo sea tolerante a los herbicidas).
Una planta que es resistente o tolerante al glifosato puede mostrar algo de impacto mínimo de la aplicación de glifosato a la planta. Por ejemplo, puede haber una alteración en el crecimiento y desarrollo normal de la planta, en donde la planta puede exhibir signos o síntomas que están asociados con estrés o enfermedad. Tal mínimo impacto resultante de la aplicación de glifosato a plantas que son resistentes o tolerantes al glifosato contrasta con el impacto adverso que resulta de la aplicación de glifosato a las plantas que son susceptibles al glifosato. Un experto en la técnica puede distinguir entre plantas que son resistentes al glifosato y plantas que son susceptibles al glifosato. La aplicación de glifosato a plantas que comprenden un ácido nucleico que confiere tolerancia al glifosato tiene como resultado un impacto significativamente menor que la aplicación de la misma cantidad de glifosato a una planta de la misma especie que no comprende una molécula de ácido nucleico que confiere tolerancia al glifosato.
Una planta que es tolerante a un herbicida u otro producto químico muestra una tolerancia mejorada en comparación con una planta testigo o de control apropiada. El daño que resulta de un tratamiento con herbicida u otro tratamiento químico puede establecerse evaluando cualquier parámetro de crecimiento o bienestar de la planta. Tales parámetros son conocidos por los expertos en la técnica, y su selección es a discreción del profesional experto. El daño a las plantas se puede establecer mediante inspección visual y/o mediante análisis estadísticos de uno o más parámetros adecuados del crecimiento o el bienestar de las plantas en plantas individuales o en uno o más grupos de plantas. Por tanto, el daño puede establecerse evaluando parámetros que incluyen, por ejemplo y sin limitación: altura de la planta; peso de la planta; color de las hojas; longitud de las hojas; floración; fertilidad; floración femenina; rendimiento; y producción de semilla. El daño también puede ser establecerse evaluando el tiempo transcurrido hasta una etapa particular de desarrollo (por ejemplo, floración femenina, floración y emisión de polen), o el tiempo transcurrido hasta que una planta se ha recuperado del tratamiento con un producto químico y/o herbicida en particular.
Al realizar evaluaciones de daños, los valores pueden asignarse a grados particulares de daño para que se puedan realizar los análisis estadísticos o comparaciones cuantitativas. El uso de rangos de valores para describir grados particulares de daño es conocido en la técnica, y se puede usar cualquier rango o escala adecuados. Por ejemplo, pueden ser asignadas puntuaciones de daños del herbicida (también llamadas puntuaciones de tolerancia). En consecuencia, la tolerancia a los herbicidas también puede estar indicada por otras clasificaciones en esta escala, donde una planta de control apropiada (o grupo de plantas de control) presenta una puntuación estadísticamente más baja en la escala en respuesta a un tratamiento herbicida que un grupo de plantas en cuestión.
El daño causado por un herbicida u otro producto químico se puede evaluar en varios momentos después de que una planta ha sido tratada con un herbicida. A menudo el daño se evalúa aproximadamente en el momento en que la planta de control presenta el daño máximo. A veces, el daño se evalúa después de un período de tiempo durante el cual una planta de control que no fue tratada con herbicida u otro producto químico ha crecido y/o se ha desarrollado de manera medible en comparación con el tamaño o la etapa en la que se realizó el tratamiento administrado. El daño puede evaluarse en cualquiera de los muchos momentos adecuados, por ejemplo, a las 12 horas; en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y/o 14 días; a las 3 y/o 4 semanas o más, después de ser tratada con herbicida una planta en cuestión. Cualquier tiempo de evaluación es adecuado siempre que permita detectar una diferencia en la respuesta a un tratamiento de plantas de prueba y control.
Un herbicida no "afecta significativamente" a una planta cuando no tiene efecto sobre la planta, cuando tiene algún efecto en la planta del cual la planta se recupera más tarde, o bien cuando tiene un efecto en la planta que es perjudicial pero que es compensado, por ejemplo, por el impacto sobre las malezas del herbicida en particular. Así, por ejemplo, una planta de cultivo no puede ser "significativamente afectada" por un herbicida u otro tratamiento si la planta presenta menos de aproximadamente el 25%, menos de aproximadamente el 20%, menos de aproximadamente el 15%, menos de aproximadamente el 10%, menos de aproximadamente el 9%, menos de aproximadamente el 8%, menos de aproximadamente el 7%, menos de aproximadamente el 6%, menos de aproximadamente el 5%, menos de aproximadamente el 4%, menos de aproximadamente el 3%, menos de aproximadamente el 2% o menos de aproximadamente el 1% de disminución, en al menos un parámetro adecuado que sea indicativo de la salud y/o la productividad de la planta, en comparación con un planta testigo o de control (por ejemplo, una planta de la misma especie no tratada). En realizaciones particulares, una planta es tolerante a un herbicida u otro producto químico si muestra daño en comparación con una planta de control apropiada que es menor que el daño presentado por la planta de control en al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% o 1.000% o más. Una planta de cultivo que no es significativamente afectada por un herbicida u otro tratamiento puede mostrar una disminución en al menos un parámetro, pero la disminución es de naturaleza temporal, y la planta se recupera completamente al cabo de, por ejemplo, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, o aproximadamente 6 semanas. En realizaciones particulares, una planta que es tolerante a un herbicida u otro producto químico puede caracterizarse por el hecho de que la planta no esté afectada significativamente por la aplicación del herbicida u otro producto químico.
Los parámetros adecuados que son indicativos de la salud y/o la productividad de la planta incluyen, por ejemplo, y sin que sean limitantes: altura de la planta; peso de la planta; longitud de la hoja; tiempo transcurrido hasta una fase particular de desarrollo; floración; rendimiento; y producción de semilla. La evaluación de un parámetro se puede realizar mediante inspección visual y/o análisis estadístico del parámetro. Una vez evaluada en una planta en cuestión y una planta de control, puede hacerse una comparación para determinar si la planta en cuestión se ve afectada significativamente por el herbicida u otro tratamiento, en su caso.
Las plantas de control apropiadas que pueden usarse para determinar la resistencia a un herbicida (u otro producto químico) incluyen plantas de la misma especie que no comprenden un ácido nucleico y/o polipéptido putativo de tolerancia a herbicidas heterólogos, y plantas que sí comprenden el supuesto ácido nucleico y/o polipéptido de tolerancia a herbicidas heterólogos, pero que no han sido tratados con el herbicida.
Herbicida: Un "herbicida" es un producto químico que causa a una planta una lesión temporal o permanente. Ejemplos no limitantes de herbicidas se enumeran y analizan con más detalle en otra parte de este documento. Un herbicida puede ser incorporado en una planta o sus células, o puede actuar sobre la planta o células sin ser incorporado. Un "ingrediente activo" es un producto químico de una formulación herbicida que es responsable de la fitotoxicidad de la formulación. Los ingredientes activos en las formulaciones de herbicidas comerciales se identifican típicamente como ingrediente activo en la etiqueta del producto. La información de la etiqueta del producto está disponible en la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. y se actualiza on line en oaspub.epa.gov/pestlabl/ ppls.own. La información de la etiqueta del producto también está disponible on line en www.cdms.net.
Cuando se usa en relación con un herbicida, la expresión "equivalente de ácido" se refiere a la tasa o cantidad como ácido parental activo como herbicida.
Aislado: un componente biológico "aislado" (como un ácido nucleico o un polipéptido) ha sido sustancialmente separado, producido aparte o purificado de otros componentes biológicos de la célula del organismo en el que el componente se presenta de forma natural (es decir, otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, y proteínas), mientras que efectúa un cambio químico o funcional en el componente (por ejemplo, un ácido nucleico puede aislarse de un cromosoma) rompiendo enlaces químicos que conectan el ácido nucleico con el ADN restante en el cromosoma). Las moléculas de ácido nucleico y las proteínas que han sido "aisladas" incluyen moléculas de ácido nucleico y proteínas purificadas por métodos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados por expresión recombinante en una célula hospedadora, así como moléculas de ácido nucleico, proteínas y péptidos sintetizados químicamente.
Ácido nucleico: los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente en el presente texto, y abarcan un ácido nucleico singular; ácidos nucleicos plurales; un fragmento de ácido nucleico, variante o derivado del mismo; y un constructo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) y ADN plasmídico (ADNp)). Un polinucleótido o ácido nucleico puede contener la secuencia de nucleótidos de una secuencia de ADNc de longitud completa, o un fragmento de la misma, incluyendo las secuencias 5' y/o 3' no traducidas y secuencias de codificación. Un polinucleótido o ácido nucleico puede estar formado por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede incluir ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos no modificados o ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos modificados. Por ejemplo, un polinucleótido o ácido nucleico puede estar compuesto por ADN de doble cadena; ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias; ARN monocatenario y bicatenario; y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Las moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN pueden ser monocatenarias, bicatenarias o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Las expresiones anteriores incluyen también formas modificadas químicamente, enzimáticamente y metabólicamente de un polinucleótido o ácido nucleico.
Se entiende que un ADN específico se refiere también al complemento del mismo, cuya secuencia se determina de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de desoxirribonucleótido.
Como se usa en el presente documento, el término "gen" se refiere a un ácido nucleico que codifica un producto funcional (ARN o polipéptido/proteína). Un gen puede incluir secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes 5') y/o que siguen (secuencias no codificantes 3') a la secuencia que codifica el producto funcional.
Como se usa en el presente documento, el término "secuencia codificante" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos específica. Una "secuencia reguladora" se refiere a una secuencia de nucleótidos localizada aguas arriba (por ejemplo, secuencias no codificantes 5'), dentro, o aguas abajo (por ejemplo, secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante, que influye en la transcripción, el procesamiento o estabilidad de ARN o la traducción de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras incluyen, por ejemplo y sin que sean limitantes: promotores; secuencias líder de traducción; intrones; secuencias de reconocimiento de poliadenilación; sitios de procesamiento de ARN; sitios de unión de efector; y estructuras de horquilla.
Como se usa en el presente documento, el término "degeneración de codones" se refiere a la redundancia del código genético que permite la variación de una secuencia de nucleótidos particular sin afectar a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Dado que cada codón consta de tres nucleótidos, y los nucleótidos que comprenden el ADN están restringidos a cuatro bases específicas, existen 64 combinaciones posibles de nucleótidos, 61 de los cuales codifican aminoácidos (los tres codones restantes codifican señales de terminación de la traducción). Como resultado, muchos aminoácidos están designados por más de un codón. Por ejemplo, los aminoácidos alanina y prolina están codificados por cuatro tripletes, la serina y la arginina por seis, mientras que el triptófano y la metionina están codificados por un solo triplete. El "código genético" que muestra qué codones son los que codifican qué aminoácidos, se conoce comúnmente en la técnica. La degeneración en el mismo permite que las bases de un ADN varíen en un amplio margen sin alterar la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por el ADN.
En algunas realizaciones en el presente documento, cuando se diseña una secuencia codificante para una expresión mejorada en una célula huésped, el gen se diseña de tal manera que la frecuencia de uso del codón se acerque a la frecuencia del uso del codón de la célula huésped preferido. Por consiguiente, la expresión "optimizado en codones" (“codón-optimizado”) se refiere a genes o secuencias codificantes de ácidos nucleicos para la transformación de varios hospedadores, en donde los codones del gen o secuencia codificante se han alterado para reflejar el uso de codones típico del organismo huésped sin alterar el polipéptido codificado por el ácido nucleico. En ejemplos, dicha optimización incluye reemplazar al menos uno, más de uno, un número significativo y/o todos los codones en el gen o secuencia de codificación con uno o más codones que se usan con más frecuencia en los genes de ese organismo.
Muchos organismos muestran un sesgo para el uso de codones particulares para codificar la inserción de un aminoácido en particular en una cadena peptídica en crecimiento. Las diferencias de preferencia de codón, o sesgo de codón, en el uso del codón entre organismos, se produce por la degeneración del código genético, y están bien documentadas entre muchos organismos. El sesgo del codón a menudo se correlaciona con la eficiencia de la traducción del ARN mensajero (ARNm), que a su vez se cree que depende, entre otras cosas, de las propiedades de los codones que se están traduciendo y de la disponibilidad de moléculas de ARN de transferencia (ARNt) particulares. El predominio de los ARNt seleccionados en una célula es generalmente un reflejo de los codones utilizados con mayor frecuencia en la síntesis de péptidos. En consecuencia, los genes se pueden hacer a la medida o diseñar para una expresión génica óptima en un organismo determinado en función de la optimización del codón.
Dado el gran número de secuencias de genes disponibles para una amplia variedad de especies animales, vegetales y microbianas, es posible calcular las frecuencias relativas del uso de codones. Las tablas de uso de codones están disponibles, por ejemplo, en la "Base de datos de uso de codones" disponible en Internet en kazusa.or.jp/codon/, y estas tablas se pueden adaptar de varias maneras. Véase Nakamura et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28: 292. Utilizando una tabla de uso de codones, un experto en la técnica puede aplicar las frecuencias correspondientes a una especie dada a cualquier secuencia de polipéptidos dada, para diseñar y producir un fragmento de ácido nucleico sintético de una región de codificación codón-optimizada que codifica el polipéptido, pero que utiliza codones óptimos para la especie.
El sesgo del codón se refleja en la composición de base media de las regiones codificantes de proteínas. Por ejemplo, los organismos que tienen genomas con un contenido relativamente bajo de G C utilizan más codones que tienen A o T en la tercera posición de los codones sinónimos, mientras que los que tienen contenidos más altos de G C utilizan más codones que tienen G o C en la tercera posición. Además, se cree que la presencia de codones "menores" dentro de un ARNm puede reducir la tasa de traducción absoluta de ese ARNm, especialmente cuando es baja la abundancia relativa del ARNt cargado correspondiente al codón menor. Una extensión de este razonamiento es que la disminución de la velocidad de traducción por codones minoritarios individuales sería al menos aditiva para múltiples codones menores. Por tanto, los ARNm que tienen alto contenido relativo de codones minoritarios tendrían tasas de traducción correspondientemente bajas. Esta tasa podría reflejarse por niveles de la proteína codificada bajos en correspondencia.
El sesgo de codón se puede calcular como la frecuencia a la que se usa un solo codón en relación con los codones para todos los aminoácidos. Alternativamente, el sesgo del codón se puede calcular como la frecuencia a la que se usa un codón único para codificar un aminoácido particular, en relación con todos los otros codones para ese aminoácido (codones sinónimos).
La expresión "porcentaje de identidad" (o "% de identidad") se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos (o secuencias de polinucleótidos), según se determina comparando las secuencias. El porcentaje de identidad puede expresar el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptidos (o polinucleótidos), como puede determinarse por la coincidencia entre las cadenas de tales secuencias. En general, identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas, respectivamente. El porcentaje de identidad de dos secuencias, ya sean secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas, dividido por la longitud de las secuencias más cortas y multiplicado por 100. Véase Russell y Barton (1994) J. Mol. Biol. 244: 332 - 50.
Las técnicas para alinear las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos y determinar la identidad son conocidas en este campo e incluyen, por ejemplo y sin limitación, las proporcionadas en: Computational Molecular Biology (1988) (Lesk, A. M., Ed.) Universidad de Oxford, NY; Biocomputing: Informatics and Genome Projects (1993) (Smith, DW, Ed.) Academic, NY; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (1994) (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., Eds.) Humania, NJ; Sequence Analysis in Molecular Biology (1987) (von Heinje, G., Ed.) Academic, n Y; y Sequence Analysis Primer (1991) (Gribskov, M. y Devereux, J., Eds.) Stockton, NY. Una técnica para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias puede incluir proporcionar la secuencia de nucleótidos de un ARNm o gen y/o proporcionar o inferir la secuencia de aminoácidos codificada así, y comparar la secuencia o las secuencias con una segunda secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos. También se pueden determinar y comparar de esta manera las secuencias genómicas.
Además, los métodos para alinear las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos y determinar la identidad se incorporan en varios programas de software informáticos disponibles para el público. Se pueden realizar alineaciones de secuencia y cálculos de porcentaje de identidad, por ejemplo, utilizando el programa AlignX™ de la suite Vector NTI® (Invitrogen, Carlsbad, CA) o el programa MegAlign™ de la suite de computación de bioinformática LASERGENE™ (DNASTAR™ Inc., Madison, WI). La alineación múltiple de secuencias se puede realizar utilizando el método Clustal™, que abarca diversas variedades de un algoritmo de alineación, incluyendo Clustal™ V y Clustal™ W (Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5: 151 - 3; Higgins et al. (1992) Comput. Apl. Biosci. 8: 189 - 91). Para las alineaciones múltiples en Clustal™ V, los valores predeterminados que pueden usarse incluyen GAP PENALTY = 10 y GAP LENGTH PENALTY = 10. Los parámetros por defecto para la alineación múltiple en Clustal™ W incluyen GAP PENALTY= 10, GAP LENGHT PENa Lt Y = 0.2, Secuencias de retardo de divergencia (%) = 30, peso de transición de ADN = 0.5, Matriz de peso de proteína = Serie Gonnet, Matriz de peso de ADN = IUB). Los parámetros por defecto para las alineaciones por pares y el cálculo del porcentaje de identidad entre las secuencias de proteínas que se pueden usar en un método Clustal™ son KTUPLE = 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 y DIAGONALS SAVED = 5. Para los ácidos nucleicos, estos parámetros por defecto pueden ser KTUPLE = 2, GAP PENALTY = 5, WINDOW = 4 y DIAGONALS SAVED = 4. Después de la alineación de secuencias usando un programa Clustal™, es posible obtener un "porcentaje de identidad" al ver la tabla de "distancias de secuencia" en el mismo programa.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia (cuando se compara con un polipéptido de referencia; por ejemplo, un polipéptido DGT) de, por ejemplo y sin que sea limitante, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90% y al menos aproximadamente el 95%, tiene la misma o similar función que el polipéptido de referencia. Por consiguiente, cualquier porcentaje entero de identidad de, por ejemplo, 55% a 100% puede ser útil para describir ácidos nucleicos particulares en el presente texto, por ejemplo y sin que sea limitante: 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60% , 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99%. Ciertos fragmentos de ácido nucleico no solo tienen la identidad de secuencia anterior, sino que pueden codificar un polipéptido que tiene, por ejemplo y sin que sea limitante: al menos 50 aminoácidos; al menos 100 aminoácidos; al menos 150 aminoácidos; al menos 200 aminoácidos; y al menos 250 aminoácidos. Las realizaciones particulares incluyen un ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad con la SEC ID NO: 1 (por ejemplo, al menos 89% de identidad; al menos aproximadamente 90% de identidad; al menos aproximadamente 91% de identidad; al menos aproximadamente 92% de identidad; al menos aproximadamente 93% de identidad; al menos aproximadamente 94% de identidad; al menos aproximadamente 95% de identidad; al menos aproximadamente 96% de identidad; al menos aproximadamente 97% de identidad; al menos aproximadamente 98% de identidad; al menos aproximadamente 99% de identidad; y al menos aproximadamente 99,5% de identidad).
La expresión "software de análisis de secuencia" se refiere a un algoritmo de ordenador o programa de software que es útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El "software de análisis de secuencia" puede estar disponible comercialmente o ser desarrollado de forma independiente. Los ejemplos no limitantes de software de análisis de secuencia incluyen: el conjunto de programas GCG (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); BLASTP™, BLASTN™ y BLASTX™ (Altschul y otros (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 10); DNASTAR™ (DNASTAR™, Inc. Madison, WI); Sequencher™ (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); y el programa FASTA™ que incorpora el algoritmo Smith-Waterman (Pearson (1994) Comput. Methods Genome Res. [Proc. Int. Symp.], Meeting date 1992 (Suhai y Sandor, Eds.), Plenum: Nueva York, NY, pp. 111 - 20). Cuando el software de análisis de secuencias se ha utilizado para analizar una secuencia de nucleótidos o aminoácidos en este documento, los resultados del análisis mostrado se han generado utilizando los valores por defecto del programa al que se hace referencia, a menos que se especifique otra cosa. Como se usa en este documento, la expresión "valores predeterminados" se refiere a un conjunto de valores o parámetros que originalmente se cargan con el software de análisis de secuencias cuando se inicializa por primera vez.
Hibridación: Un ácido nucleico que comprende toda o parte de una secuencia de nucleótidos se puede usar como una sonda que "se hibrida" selectivamente con secuencias de nucleótidos presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonados o fragmentos de ADNc (por ejemplo, bibliotecas genómicas o de ADNc de un organismo elegido) que tiene una cantidad significativa de identidad de secuencia con la secuencia de la sonda. Una sonda de hibridación puede ser un fragmento de ADN genómico; un fragmento de ADN plasmídico; un fragmento de cDNA; un fragmento de ARN; un fragmento de ADN amplificado por PCR; un oligonucleótido; u otro polinucleótido, y una sonda puede estar marcada con un grupo detectable (por ejemplo, 32P), o cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo y sin que sea limitante, se puede hacer una sonda para hibridación marcando un oligonucleótido sintético que específicamente se hibrida con un ácido nucleico en el presente documento (por ejemplo, un ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad con la SEC ID NO: 1). Los métodos para la preparación de sondas para hibridación, y para la construcción de bibliotecas de ADNc y genómicas, son conocidos en la técnica. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se puede encontrar en Sambrook et al. (1989), supra; y Ausubel et al. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, tercera edición, Wiley, NY, Nueva York, pp. 2 - 40.
En algunas formas de realización, la hibridación de ácido nucleico (por ejemplo, con ADN amplificado) puede usarse para identificar la presencia de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o sus fragmentos son capaces de "hibridarse específicamente" con otra molécula de ácido nucleico bajo determinadas circunstancias. En algunos ejemplos, un ácido nucleico se hibrida específicamente en condiciones rigurosas con un ácido nucleico diana. Como se usa en el presente documento, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridarse específicamente entre ellas si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico bicatenario antiparalelo bajo condiciones rigurosas (por ejemplo, de rigor alto).
Se dice que un ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si las dos moléculas de ácido nucleico presentan una complementariedad de secuencia completa. Como se usa en este documento, se dice que los ácidos nucleicos exhiben una "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario de un nucleótido de la otra. Las moléculas que presentan una complementariedad completa generalmente se hibridarán entre sí con una estabilidad suficiente para permitirlas permanecer apareadas entre sí en condiciones convencionales de "rigor alto". Las condiciones convencionales de rigor alto están descritas por Sambrook et al. (1989), supra.
Se dice que dos moléculas presentan "complementariedad mínima" si pueden hibridarse entre sí con estabilidad suficiente para permitirlas permanecer emparejadas entre sí bajo al menos condiciones convencionales de "rigor bajo". Las condiciones convencionales de rigor bajo también están descritas por Sambrook et al. (1989), supra. Para que una molécula de ácido nucleico sirva de cebador o sonda, solo necesita mostrar la mínima complementariedad de la secuencia para poder formar una estructura estable de doble cadena bajo el disolvente particular y las concentraciones de sal empleadas.
Los factores que afectan al rigor de la hibridación son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo: temperatura; pH; fuerza iónica; y concentración de disolventes orgánicos (p. ej., formamida y dimetilsulfóxido). Como saben los expertos en la técnica, el rigor de la hibridación se incrementa a temperaturas más altas, menor fuerza iónica y menores concentraciones de disolvente. También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como la formamida.
La expresión "condición rigurosa" o "condiciones de rigurosidad" se define con respecto a la hibridación de un ácido nucleico con otro ácido nucleico diana (es decir, a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de interés en particular) por el procedimiento de hibridación específica discutido en Sambrook et al. (1989), supra (en 9.52 - 9.55). Véase también Sambrook. et al. (1989) en 9.47 - 9.52 y 9.56 - 9.58.
La especificidad en muchas aplicaciones está relacionada con las condiciones de los lavados posteriores a la hibridación, en los que los factores incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado. Para híbridos ADN-ADN, la temperatura de fusión térmica (Tm) se puede aproximara partir de la ecuación:
Tm = 81.5°C+16.6 (logM )+0.41 (%GC)-0.61 (%form)-500/L, (1)
donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, %form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267 - 84.
La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH particulares) a la que el 50% de una secuencia diana complementaria se hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1% de desajuste. Así, las condiciones de Tm, hibridación y/o lavado pueden ajustarse para secuencias de la identidad deseada para hibridar. Por ejemplo, si se busca la hibridación de secuencias con una identidad del 90%, la Tm puede disminuirse 10 °C (bajo una fuerza iónica y pH particulares). Las condiciones rigurosas se pueden seleccionar, por ejemplo, para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para una secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4 °C por debajo de la Tm; las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C por debajo de la Tm; las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a una temperatura entre 11 y 20 °C más baja que la Tm.
En algunos ejemplos, las condiciones rigurosas son aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente Na+1,5 M (por ejemplo, aproximadamente Na+ 0,01 a 1,0 M) a pH de 7,0 a 8,3, y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para ácidos nucleicos cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos de longitud) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos de longitud). Las condiciones de rigurosidad baja ejemplares incluyen hibridación con una solución tampón de formamida del 30 al 35%, NaCl 1,0 M, dodecil sulfato sódico al 0,1% (SDS) a 37 °C y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/Citrato trisódico 0,3 M) a una temperatura de 50 a 55 °C. Los ejemplos de condiciones de rigurosidad moderada incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl 1,0 M, SDS al 0,1% a 37 °C, y un lavado en SSC de 0,5X a 1X a una temperatura de 55 a 60°C. Las condiciones de rigurosidad alta incluyen la hibridación en aproximadamente 50% de formamida, aproximadamente 1,0 M de sal de Na, aproximadamente 0,1% de SDS a aproximadamente 37°C y un lavado en aproximadamente 0,1X SSC a aproximadamente de 60 a 65 °C.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" incluye un polipéptido singular, polipéptidos plurales y fragmentos de los mismos. Este término se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud o tamaño específicos del producto. En consecuencia, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, proteínas, cadenas de aminoácidos y cualquier otro término utilizado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, están incluidos dentro de la definición de "polipéptido", y los términos anteriores son utilizados indistintamente con "polipéptido" en el presente documento. Un polipéptido puede aislarse de una fuente biológica natural o producirse por tecnología recombinante, pero un polipéptido específico no se traduce necesariamente a partir de un ácido nucleico específico. Un polipéptido puede generarse de cualquier manera apropiada, incluyendo por ejemplo y sin que sea limitante, mediante síntesis química.
Endógeno y heterólogo: como se usa en este documento, el término "nativo" se refiere a la forma de un polinucleótido, gen o polipéptido que se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras, si están presentes. El término "endógeno" se refiere a la forma nativa del polinucleótido, gen o polipéptido en su ubicación natural en el organismo o en el genoma del organismo.
En cambio, el término "heterólogo" se refiere a un polinucleótido, gen o polipéptido que no se encuentra normalmente en su ubicación en el organismo de referencia (huésped). Por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo puede ser un ácido nucleico que normalmente se encuentra en el organismo de referencia en una ubicación genómica diferente. A título de ejemplo adicional, un ácido nucleico heterólogo puede ser un ácido nucleico que normalmente no se encuentra en el organismo de referencia. Un organismo huésped que comprende un polinucleótido, gen o polipéptido heterólogo puede producirse introduciendo el polinucleótido, gen o polipéptido heterólogo en el organismo huésped. En ejemplos particulares, un polinucleótido heterólogo comprende una secuencia codificante nativa, o parte de la misma, que se reintroduce en un organismo fuente en una forma que es diferente del polinucleótido nativo correspondiente. En ejemplos particulares, un gen heterólogo comprende una secuencia de codificación nativa, o parte de la misma, que se reintroduce en un organismo fuente en una forma que es diferente del gen nativo correspondiente. Por ejemplo, un gen heterólogo puede incluir una secuencia de codificación nativa que es una parte de un gen quimérico que incluye regiones reguladoras no nativas que se reintroducen en el huésped nativo. En ejemplos particulares, un polipéptido heterólogo es un polipéptido nativo que se reintroduce en un organismo fuente en una forma que es diferente del polipéptido nativo correspondiente.
Un gen o polipéptido heterólogo puede ser un gen o polipéptido que comprende un polipéptido funcional o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido funcional que se fusiona con otro gen o polipéptido para producir un polipéptido quimérico o de fusión, o un gen que lo codifica. Los genes y proteínas de realizaciones particulares incluyen secuencias de longitud completa ejemplificadas específicamente, y porciones, segmentos, fragmentos (incluyendo fragmentos contiguos y deleciones internas y/o terminales en comparación con las moléculas de longitud completa), variantes, mutantes, quiméricos y fusiones de estas secuencias.
Modificación: como se usa en este documento, el término "modificación" puede referirse a un cambio en un polinucleótido de referencia particular que tiene como resultado una actividad reducida, sustancialmente eliminada o eliminada de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Una modificación también puede referirse a un cambio en un polipéptido de referencia que da como resultado una actividad reducida, sustancialmente eliminada o eliminada del polipéptido de referencia. Alternativamente, el término "modificación" puede referirse a un cambio en un polinucleótido de referencia que tiene como resultado una actividad aumentada de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia, así como un cambio en un polipéptido de referencia que tiene como resultado una actividad incrementada o aumentada del polipéptido de referencia. Los cambios como los anteriores pueden realizarse por cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo y sin que sean limitantes: borrar una parte de la molécula de referencia; mutar la molécula de referencia (p. ej., mediante mutagénesis espontánea, mutagénesis aleatoria, mutagénesis causada por genes mutantes y mutagénesis por transposón); sustituir una porción de la molécula de referencia; insertar un elemento en la molécula de referencia; regular a la baja la expresión de la molécula de referencia; alterar la ubicación celular de la molécula de referencia; alterar el estado de la molécula de referencia (por ejemplo, a través de la metilación de un polinucleótido de referencia, y a través de la fosforilación o ubiquitinación de un polipéptido de referencia); eliminar un cofactor de la molécula de referencia; introducir un ARN/ADN antisentido dirigido a la molécula de referencia; introducir un ARN/ADN interferente que se dirige a la molécula de referencia; modificar químicamente la molécula de referencia; modificar covalentemente la molécula de referencia; irradiar la molécula de referencia con radiación UV o rayos X; recombinación homóloga que altera la molécula de referencia; recombinación mitótica que altera la molécula de referencia; sustitución del promotor de la molécula de referencia; y/o combinaciones de cualquiera de los anteriores.
Se puede encontrar una guía para determinar qué nucleótidos o residuos de aminoácidos se pueden modificar en un ejemplo específico comparando la secuencia del polinucleótido o polipéptido de referencia con la de polinucleótidos o polipéptidos homólogos (p. ej., levaduras o bacterias homólogas), y maximizando el número de modificaciones realizadas en regiones de alta homología (regiones conservadas) o secuencias de consenso.
Derivado y variante: el término "derivado", como se usa en el presente documento, se refiere a una modificación de una secuencia ejemplar en el presente documento. Dichas modificaciones incluyen la sustitución, inserción y/o deleción de una o más bases de una secuencia de codificación en el presente texto que preserva, altera ligeramente o aumenta la función de la secuencia de codificación en una especie de cultivo. Dichos derivados pueden ser determinados fácilmente por un experto en la técnica, por ejemplo y sin que sean limitantes, utilizando técnicas de modelado por ordenador para predecir y optimizar la estructura de secuencia. Así pues, el término "derivado" incluye también ácidos nucleicos heterólogos que comprenden una secuencia que tiene una identidad de secuencia sustancial con una secuencia ejemplar en el presente texto, tal como poder tener la misma funcionalidad, ligeramente alterada o mayor para usar en la expresión de DGT-28 en una planta de cultivo.
Como se usa en el presente documento, el término "variante" se refiere a un polipéptido que se diferencia de un polipéptido ejemplar en este documento por inserciones, deleciones, mutaciones y/o sustituciones de aminoácidos, como pueden introducirse usando, por ejemplo y sin que sea limitante, técnicas de ADN recombinante. Se puede encontrar una guía para determinar qué residuos de aminoácidos se pueden reemplazar, agregar o eliminar dentro de una secuencia de aminoácidos de referencia comparando la secuencia del polipéptido de referencia particular con la de polipéptidos homólogos, y minimizando el número de cambios de secuencia de aminoácidos realizados en regiones de alta homología (regiones conservadas), o reemplazando los aminoácidos con una secuencia de consenso. Un polipéptido variante puede tener aminoácidos sustituidos y sin embargo mantener aún la actividad funcional del polipéptido de referencia. Los genes "variantes" comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el mismo polipéptido que un gen de referencia o un polipéptido equivalente que tiene una actividad equivalente o similar al polipéptido de referencia.
En algunas realizaciones, pueden usarse genes variantes para producir proteínas variantes, y pueden usarse huéspedes recombinantes para producir las proteínas variantes. Por ejemplo, pueden construirse variantes de genes y proteínas que comprenden residuos contiguos (aminoácido o nucleótido) de cualquier secuencia ejemplificada en el presente texto. Un gen o proteína variante puede tener, por ejemplo y sin que sea limitante: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 247, 249, 249, 250, 251, 253, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292 y 293 restos contiguos (aminoácido o nucleótido) que corresponden a un segmento (del mismo tamaño) en la secuencia ejemplificada. También pueden usarse como sondas y/o cebadores segmentos de tamaño similar, especialmente los que son para regiones conservadas.
Los expertos en la técnica entenderán que muchos niveles de identidad de secuencia son útiles para identificar polipéptidos (por ejemplo, a partir de otras especies) que tienen la misma o similar función o actividad que un polipéptido de referencia. En algunas realizaciones, un polipéptido variante que tiene una identidad de secuencia (cuando se compara con un polipéptido de referencia; por ejemplo, un polipéptido DGT-28), por ejemplo y sin que sea limitante: al menos aproximadamente el 55%; al menos aproximadamente el 60%; al menos aproximadamente 65%; al menos aproximadamente 70%; al menos aproximadamente 75%; al menos aproximadamente el 80%; al menos aproximadamente el 85%; al menos aproximadamente el 90%; y al menos aproximadamente el 95%, tiene la misma o similar función que el polipéptido de referencia.
Las estrategias para diseñar y construir genes y proteínas variantes que comprenden restos contiguos de una molécula particular se pueden determinar obteniendo y examinando la estructura de una proteína de interés (por ejemplo, coordenadas atómicas en 3D (tridimensionales), a partir de una estructura cristalina y/o un modelo molecular). En algunos ejemplos, puede dirigirse una estrategia a ciertos segmentos de una proteína que son ideales para la modificación, tales como los segmentos expuestos a la superficie, y no a los segmentos internos que están implicados en el plegamiento de proteínas y la integridad estructural 3-D esencial. La patente de Estados Unidos n° 5.605.793, por ejemplo, se refiere a métodos para generar diversidad molecular adicional usando el reensamblaje de ADN después de la fragmentación aleatoria o focalizada. Esto se puede denominar "mezcla aleatoria" de genes (“shuffling”), que generalmente implica la mezcla de fragmentos (de un tamaño deseado) de dos o más moléculas de ADN diferentes, seguida de rondas repetidas de renaturalización. Este proceso puede mejorar la actividad de una proteína codificada por un gen sujeto. El resultado puede ser una proteína quimérica que tenga mejoramiento de la actividad, alteración de la especificidad del sustrato, aumento de la estabilidad enzimática, alteración de la estereoespecificidad, u otras características.
Una "sustitución" de aminoácidos puede ser el resultado de reemplazar un aminoácido de una secuencia de referencia con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares (es decir, sustitución conservadora de aminoácidos), o puede ser el resultado de reemplazar un aminoácido de una secuencia de referencia con un aminoácido que tenga diferentes propiedades estructurales y/o químicas (es decir, sustitución de aminoácidos no conservadora). Los aminoácidos se pueden colocar en las siguientes clases estructurales y/o químicas: no polar; polar sin carga; básico; y ácido. Por consiguiente, las sustituciones "conservadoras" de aminoácidos se pueden hacer sobre la base de la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, o la naturaleza anfipática de los restos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos polares sin carga (neutros) incluyen serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Alternativamente, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos "no conservadoras" seleccionando las diferencias en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad o naturaleza anfipática de cualquiera de estos aminoácidos. "Inserciones" o "deleciones" pueden estar dentro del rango de variación según la tolerancia estructural o funcional de las proteínas recombinantes.
En algunas realizaciones, una proteína variante se "trunca" con respecto a una proteína de referencia, de longitud completa. En algunos ejemplos, una proteína truncada retiene la actividad funcional de la proteína de referencia. Por proteína "truncada" se entiende que una porción de una proteína puede ser escindida, por ejemplo, mientras que la proteína truncada restante retiene y exhibe la actividad deseada después de la escisión. La escisión puede lograrse por cualquiera de diversas proteasas. Además, las proteínas escindidas efectivamente pueden producirse usando técnicas de biología molecular, en donde las bases de ADN que codifican una porción de la proteína son eliminadas de la secuencia codificante, ya sea mediante digestión con endonucleasas de restricción u otras técnicas disponibles para el experto en la técnica. Una proteína truncada puede expresarse en un sistema heterólogo, por ejemplo, E. coli, baculovirus, sistemas virales basados en plantas y levaduras. Las proteínas truncadas que confieren tolerancia a los herbicidas pueden confirmarse utilizando el sistema heterólogo que expresa la proteína en un bioensayo de tolerancia a los herbicidas, tal como se describe en el presente documento. Es bien conocido en la técnica que las proteínas truncadas pueden producirse con éxito de forma que retengan la actividad funcional de la proteína de referencia de longitud completa. Por ejemplo, las proteínas Bt se pueden usar en forma truncada (proteína del núcleo). Véanse, por ejemplo, Hofte y Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53 (2): 242 - 55; y Adang et al. (1985) Gene 36: 289 - 300.
En algunos casos, especialmente para la expresión en plantas, puede ser ventajoso usar genes truncados que expresan proteínas truncadas. Los genes truncados pueden codificar un polipéptido que comprende, por ejemplo, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de la proteína de longitud completa.
Los genes y proteínas variantes que retienen la función de la secuencia de referencia a partir de la cual se diseñaron pueden ser determinados por un experto en la técnica, por ejemplo, analizando la actividad de las variantes recombinantes. Si tal ensayo de actividad es conocido y caracterizado, entonces la determinación de variantes funcionales requiere solamente una experimentación rutinaria.
Se pueden hacer cambios específicos en el "sitio activo" de una enzima para afectar su funcionalidad inherente con respecto a la actividad o la estereoespecificidad. Véase Muller et. al. (2006) Protein Sci. 15 (6): 1356 - 68. Por ejemplo, la estructura tauD conocida se ha utilizado como un modelo de dioxigenasa para determinar los restos del sitio activo mientras se une a su sustrato inherente, la taurina. Véase Elkins et al. (2002) Biochemistry 41 (16): 5185 - 92. Se puede encontrar información adicional sobre la optimización de secuencias y la designabilidad de los sitios activos de enzimas en Chakrabarti et al. (2005) Proc. Natl Acad. Sci. USA 102 (34): 12035 - 40.
Se pueden cambiar varias propiedades estructurales y características tridimensionales de una proteína sin afectar adversamente a la actividad/funcionalidad de la proteína. Se pueden hacer sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan adversamente a la actividad y/o la configuración tridimensional de la molécula (sustituciones "toleradas"). También pueden diseñarse proteínas variantes que difieren a nivel de secuencia de la proteína de referencia, pero que conservan la misma estructura tridimensional esencial, distribución de carga de superficie y similares. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 7.058.515; Larson et al. (2002) Protein Sci. 11: 2804 - 13; Crameri et al. (1997) Nat. Biotecnol. 15: 436 - 8; Stemmer (1994) Proc. Natl Acad Sci. USA 91: 10747 - 51; Stemmer (1994) Nature 370: 389 - 91; Stemmer (1995) Bio/Technology 13: 549 - 53; Crameri et al. (1996) Nat. Med. 2: 100-3; y Crameri et al. (1996) Nat. Biotecnol. 14: 315-9.
También se puede realizar el diseño computacional de las UTR 5' o 3' (por ejemplo, horquillas sintéticas) que son adecuadas para su uso en un constructo de expresión (por ejemplo, un constructo de expresión DGT-28), y se puede usar para diseñar elementos dentro de ácidos nucleicos de algunas realizaciones de la presente invención. Las técnicas de modelado por computadora y UTR y de modelado por computadora para usar en la predicción/ evaluación de derivados UTR en 5' y 3' incluyen, por ejemplo y sin que sean limitantes: MFoLd™ version 3.1 (disponible de Genetics Corporation Group, Madison, WI; véase Zucker et al. "Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide" en RNA Biochemistry and Biotechnology, 11 - 43, J. Barciszewski & B. F. C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1999; Zucker et al. (1999) J. Mol. Biol.
288: 911 - 40; Zucker et al. "RNA Secondary Structure Prediction," en Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, S. Beaucage, D. E. Bergstrom, G. D. Glick, y R. A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1 - 11.2.10, 2000); y COVE™ (RNA structure analysis using covariance models (stochastic context free grammar methods)) v.2.4.2 (Eddy y Durbin (1994) Nucl. Acids Res. 22: 2079 - 88), que se distribuye libremente como código fuente y que puede descargarse accediendo al sitio web, genetics.wustl.edu/eddy/software/; y FOLDALIGN™ (véase Gorodkin et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (18): 3724 - 32 y Gorodkin et al. (1997) Proceedings International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology ISMB International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology 5: 120 - 123), también distribuida de forma gratuita y disponible para descargar en el sitio web, foldalign.ku.dk/software/index.html.
Promotor: El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificadora de ácido nucleico o ARN funcional. En ejemplos, la secuencia de codificación controlada está localizada 3' de una secuencia promotora. Un promotor puede derivarse en su totalidad de un gen nativo, un promotor puede estar formado por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o un promotor puede comprender incluso segmentos de ADN sintético. Los expertos en la materia entenderán que los promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiológicas. Se conocen ejemplos de todos los promotores anteriores y se usan en la técnica para controlar la expresión de ácidos nucleicos heterólogos. Los promotores que dirigen la expresión de un gen en la mayor parte de los tipos de células en la mayoría de los casos se denominan comúnmente "promotores constitutivos". Además, mientras los expertos de la técnica han intentado (en muchos casos sin éxito) delinear los límites exactos de las secuencias reguladoras, se ha llegado a entender que fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora idéntica. La actividad promotora de un ácido nucleico particular puede ensayarse usando técnicas que son familiares para los expertos en la técnica.
Ligado operativamente: La expresión "ligado operativamente" se refiere a una asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo ácido nucleico, en el que la función de una de las secuencias de ácido nucleico está afectada por otra. Por ejemplo, un promotor está ligado operativamente con una secuencia de codificación cuando el promotor es capaz de efectuar la expresión de esa secuencia codificadora (por ejemplo, la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor). Una secuencia codificadora puede estar unida operativamente a una secuencia reguladora en una orientación de sentido o antisentido.
Expresión: El término "expresión", como se usa en el presente documento, puede referirse a la transcripción y acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o antisentido derivado de un ADN. La expresión puede también referirse a la traducción de ARNm en un polipéptido. Como se usa en este documento, el término "sobreexpresión" se refiere a la expresión que es mayor que la expresión endógena del mismo gen o de un gen relacionado. Por lo tanto, un gen heterólogo se "sobreexpresa" si su expresión es más alta que la de un gen endógeno comparable.
Transformación: Como se usa en el presente documento, el término "transformación" se refiere a la transferencia e integración de un ácido nucleico o un fragmento del mismo en un organismo huésped, lo que tiene como resultado una herencia genéticamente estable. Los organismos hospedadores que contienen un ácido nucleico transformante se denominan organismos "transgénicos", "recombinantes" o "transformados". Los métodos de transformación conocidos incluyen, por ejemplo: transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens o A. rhizogenes; transformación con fosfato cálcico; transformación con polibreno; fusión de protoplastos; electroporación; métodos ultrasónicos (p. ej. sonoporación); transformación con liposomas; microinyección; transformación con ADN desnudo; transformación con vectores plasmídicos; transformación con vectores virales; transformación biolística (bombardeo de micropartículas); transformación mediada por fibras de carburo de silicio (WHISKERS); emisión de aerosol; y transformación mediada por PEG.
Introducido: como se usa en este documento, el término "introducido" (en el contexto de la introducción de un ácido nucleico en una célula) incluye la transformación de una célula, así como el cruce de una planta que comprende el ácido nucleico con una segunda planta, de manera que la segunda planta contiene el ácido nucleico, como se puede realizar utilizando técnicas convencionales de reproducción de plantas. Tales técnicas de reproducción son conocidas en este campo. Para una discusión de las técnicas de cultivo de plantas, véase Poehlman (1995) Breeding Field Crops, 4a edición, AVI Publication Co., Westport CT.
Se pueden usar métodos de retrocruzamiento para introducir un ácido nucleico en una planta. Esta técnica se ha utilizado durante décadas para introducir rasgos en las plantas. Un ejemplo de una descripción de retrocruzamiento (y otras metodologías de cultivo de plantas) se puede encontrar, por ejemplo, en Poelman (1995), supra; y Jensen (1988) Plant Breeding Methodology, Wiley, Nueva York, NY. En un ejemplo de protocolo de retrocruzamiento, una planta original de interés (el "padre recurrente") se cruza con una segunda planta (el "padre no recurrente") que transporta el ácido nucleico que se ha de introducir. La progenie resultante de este cruce se cruza de nuevo con el padre recurrente, y el proceso se repite hasta que se obtiene una planta convertida, en donde esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas del padre recurrente se recuperan en la planta convertida, además del ácido nucleico del padre no recurrente.
Plásmido/vector: Los términos "plásmido" y "vector", como se usan en este documento, se refieren a un elemento cromosómico extra que puede llevar uno o más genes que no forman parte del metabolismo central de la célula. Plásmidos y vectores son típicamente moléculas de ADN de doble cadena circular. Sin embargo, los plásmidos y los vectores pueden ser ácidos nucleicos lineales o circulares, de un ADN o ARN de cadena simple o doble, y pueden derivarse de cualquier fuente en la que varias secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción única que es capaz de introducir en una célula un fragmento promotor y una secuencia de ADN codificante junto con cualquier secuencia no traducida 3' apropiada. En ejemplos, los plásmidos y los vectores pueden comprender secuencias de replicación autónoma, secuencias de integración del genoma y/o secuencias de fagos o nucleótidos.
III. DGT-28 y secuencias codificadoras de DGT-28.
La invención se define en las reivindicaciones. Algunas realizaciones de este documento están relacionadas con un polipéptido aislado que tiene al menos aproximadamente un 90% de identidad (por ejemplo, 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95 %, al menos el 96%, al menos 97%, al menos 98%, y al menos 99% de identidad) con la SEQ ID NO: 1. Dicho polipéptido se denomina aquí como un polipéptido DGT-28. Algunas realizaciones del presente texto proporcionan una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere a una planta tolerancia al glifosato, en donde la EPSPS es al menos el 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 1 y cuando está alineado con la SEC ID NO: 1 comprende una alanina en la posición correspondiente a la posición 84 de la SEC ID NO: 1, en donde el polinucleótido es una secuencia sintética que ha sido diseñada para la expresión en una planta seleccionada entre el grupo que consiste en:
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 3; y
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con otro ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 3 en condiciones de rigor alto,
en donde el polinucleótido está ligado operativamente a un promotor, donde preferiblemente el promotor está dirigiendo la expresión de un gen. Ejemplos particulares de tal ácido nucleico se denominan en este documento como ácido nucleico "dgt-28'. Los ácidos nucleicos dgt-28 pueden ser útiles en cualquiera de una amplia variedad de aplicaciones (por ejemplo, introduciendo resistencia al glifosato) en las que se desea el metabolismo del glifosato modificado en una célula vegetal.
Los ejemplos particulares de ácidos nucleicos dgt-28 proporcionados con fines ilustrativos en este documento son las SEC ID N°: 2 y 3. En consecuencia, algunas realizaciones proporcionan un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia (por ejemplo, 79%, al menos el 80%, al menos el 81%, al menos el 82%, al menos el 83%, al menos el 84%, al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89% , al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% y al menos el 99% % de identidad) con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90% de identidad con la SEC ID NO: 1. Los ejemplos particulares de ácidos nucleicos dgt-28 incluyen ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con un ácido nucleico que tiene la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 3 en condiciones rigurosas (por ejemplo, altamente rigurosas).
En algunas realizaciones, se proporcionan ácidos nucleicos de dgt-28 codón-optimizados. Por ejemplo, para obtener una alta expresión de un gen heterólogo en una planta puede ser deseable diseñar y reconstruir el gen para que se exprese de manera más eficiente en una célula de la planta. Esta estrategia puede ser particularmente deseable en el caso de que se desee que un gen bacteriano se exprese en una célula vegetal.
Por tanto, algunos ejemplos en este documento proporcionan un gen optimizado para plantas que codifica una proteína DGT-28, y métodos para su diseño, para generar una secuencia de ADN que puede expresarse óptimamente en plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas, y en las que las modificaciones de secuencia no impida la traducción o la transcripción. El diseño de un gen dgt-28 optimizado para la expresión de la misma proteína DGT-28 en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas se ejemplifica en este documento con una re-ingeniería de la región codificadora de proteínas de este gen para una expresión óptima. Los ejemplos de ácidos nucleicos dgt-28 optimizados para plantas en este documento incluyen la SEC ID NO: 2 y la SEC ID NO: 3.
En la ingeniería de un gen que codifica una proteína DGT-28 para la expresión en plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas (por ejemplo, algodón, canola, tabaco, maíz, soja, trigo y arroz), el sesgo de codón de la planta o plantas prospectivas puede determinarse, por ejemplo, mediante el uso de bases de datos de secuencias de ADN disponibles públicamente para encontrar información acerca de la distribución de codones de los genomas de las plantas o las regiones codificantes de proteínas de varios genes de plantas.
En el diseño de las regiones codificantes en un ácido nucleico para la expresión en la planta, deben determinarse los codones primarios ("primera elección") preferidos por la planta, y también pueden ser la segunda, tercera, cuarta, etc. elección de los codones preferidos cuando existen múltiples opciones. Luego puede diseñarse una nueva secuencia de ADN que codifique la secuencia de aminoácidos del mismo péptido (por ejemplo, una proteína DGT-28), pero la nueva secuencia de ADN difiere de la secuencia de ADN original por la sustitución de los codones de la planta (primero preferido, segundo preferido, tercero preferido, o cuarto preferido, etc.) para especificar el aminoácido en cada posición dentro de la secuencia de aminoácidos.
La nueva secuencia puede entonces analizarse en relación con sitios de enzimas de restricción que podrían haber sido creados por las modificaciones. Los sitios identificados pueden modificarse más reemplazando los codones por los codones preferidos de primera, segunda, tercera o cuarta elección. Otros sitios en la secuencia que podrían afectar la transcripción o traducción del gen de interés son las estructuras de horquilla, uniones exón:intrón (5' o 3'), señales de adición de poli A y señales de terminación de ARN polimerasa; estos sitios pueden eliminarse mediante la sustitución de codones de plantas. La secuencia puede analizarse y modificarse adicionalmente para reducir la frecuencia de dobletes TA o CG. Además de los dobletes, los bloques de secuencia G o C que tienen más de unos seis residuos que son iguales pueden afectar a la transcripción o la traducción de la secuencia. Por consiguiente, estos bloques pueden modificarse reemplazando los codones de primera o segunda elección, etc., con el siguiente codón de elección preferido.
La SEC ID N°: 2 (dgt-28 (v5)) se optimizó para la expresión en plantas dicotiledóneas. La SEC ID NO: 3 (dgt-28 (v6)) se optimizó para la expresión en plantas monocotiledóneas. El uso de codones en estas secuencias sintéticas se seleccionó basándose en el uso de codones preferidos; es decir, los productos de expresión de cada uno están codificados por codones que tienen un sesgo hacia el uso de plantas bien sea monocotiledóneas o dicotiledóneas, y las secuencias perjudiciales y los sitios de restricción superfluos se eliminaron para aumentar la eficiencia de la transcripción/traducción del polipéptido DGT-28 y para facilitar las etapas de manipulación del ADN.
Del mismo modo, la molécula de ácido nucleico de la SEC ID NO: 4 (dgt-28 (v1)) fue optimizada para mejorar la expresión en Escherichia coli. El uso de codones en la SEC ID N°: 4 se seleccionó en función del uso de codones de E. coli preferido; la proteína expresada está codificada por codones que tienen un sesgo hacia el uso de E. coli. Durante el rediseño, se eliminaron las secuencias perjudiciales y los sitios de restricción superfluos para aumentar la eficacia de la transcripción/traducción de la secuencia de codificación de DGT-28 y para facilitar las etapas de manipulación del ADN. Por lo tanto, la expresión de DGT-28 a partir de un ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 4 en E. coli puede dar como resultado una expresión robusta de la proteína, por ejemplo, para la caracterización enzimática de DGT-28.
Una vez que se ha diseñado una secuencia de ADN optimizada (p. ej., una planta optimizada) sobre el papel o in silico, las moléculas de ADN reales se pueden sintetizar en el laboratorio para que se correspondan en secuencia con precisión con la secuencia diseñada. Dichas moléculas de ácido nucleico sintéticas pueden clonarse y manipularse de otra manera exactamente como si fueran derivadas de fuentes naturales o nativas.
Un ácido nucleico del presente documento puede clonarse en un vector para la transformación en células procariotas o eucariotas para la replicación y/o la expresión. Los vectores pueden ser vectores procariotas; por ejemplo, plásmidos o vectores lanzadera, vectores de insectos o vectores eucarióticos. Un ácido nucleico en el presente documento también puede clonarse en un vector de expresión, por ejemplo, para la administración a una célula vegetal. En ciertas aplicaciones, puede ser preferible tener vectores que sean funcionales en E. coli (por ejemplo, producción de proteínas para producir anticuerpos, análisis de secuencia de ADN, construcción de insertos, obtener cantidades de ácidos nucleicos).
Para expresar una proteína DGT-28 en una célula, un ácido nucleico que codifica la proteína se subclona típicamente en un vector de expresión que contiene un promotor para dirigir la transcripción. Los promotores bacterianos y eucariotas adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a ed. 1989; 3a ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., supra.). Los sistemas de expresión bacterianos para expresar un ácido nucleico en el presente documento están disponibles, por ejemplo, en E. coli, Bacillus sp. y Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229 - 235 (1983)). Los kits para tales sistemas de expresión son comercialmente disponibles. Los sistemas de expresión eucarióticos para células de mamíferos, levaduras y células de insectos son bien conocidos por los expertos en la técnica y también están disponibles comercialmente.
El vector de expresión particular usado para transportar la información genética a la célula se selecciona con respecto al uso pretendido de la proteína DGT-28 (por ejemplo, la expresión en plantas, animales, bacterias, hongos y protozoos). Los vectores de expresión bacterianos y animales estándar son conocidos en la técnica y se describen con detalle, por ejemplo, en la publicación de patente de EE.UU. 20050064474A1 y las publicaciones de patente internacional WO 05/084190, w O 05/014791 y W o 03/080809. Los métodos de transfección estándar se pueden usar para producir líneas celulares bacterianas que expresan grandes cantidades de proteínas, que luego se pueden purificar utilizando técnicas estándar.
La selección de un promotor usado para dirigir la expresión de un ácido nucleico en el presente documento depende de la aplicación en particular. Cierto número de promotores que dirigen la expresión de un gen en una planta pueden emplearse en realizaciones en este documento. Dichos promotores pueden seleccionarse entre promotores constitutivos, regulados químicamente, inducibles, específicos del tejido y preferidos de semillas. Por ejemplo, puede usarse un promotor constitutivo fuerte adecuado para la célula huésped para la expresión y la purificación de proteínas DGT-28. Los ejemplos no limitantes de promotores vegetales incluyen secuencias promotoras derivadas de ubiquitina-10 de A. thaliana (ubi-10) (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem., 265: 12486 -12493); manopina sintasa de A. tumefaciens (Amas) (Petolino et al., patente de Estados Unidos n° 6.730.824); y/o virus del mosaico de la vena de la yuca (CsVMV) (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31: 1129 - 1139).
Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el núcleo del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313: 810 - 812); promotor de la actina del arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163 -171); promotor de ubiquitina de maíz (patente de Estados Unidos n° 5.510.474; Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); promotor pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581 - 588); promotor ALS (patente de Estados Unidos n° 5.659.026); promotor de histonas de maíz (Chabouté et al. Plant Molecular Biology, 8: 179- 191 (1987)); y similares.
La gama de promotores compatibles con plantas disponibles incluye promotores inducibles y específicos del tejido. Un elemento regulador inducible es un elemento que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias de ADN o los genes no serán transcritos. Típicamente, el factor de proteína que se une específicamente a un elemento regulador inducible para activar la transcripción está presente en una forma inactiva, que luego es convertida directa o indirectamente en la forma activa por el inductor. El inductor puede ser un agente químico como una proteína, un metabolito, un regulador del crecimiento, un herbicida o un compuesto fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente por calor, frío, sal o elementos tóxicos o indirectamente a través de la acción de un agente patógeno o productor de enfermedades, como un virus. Típicamente, el factor proteico que se une específicamente a un elemento regulador inducible para activar la transcripción está presente en una forma inactiva que luego es convertida directa o indirectamente en la forma activa por el inductor. Una célula vegetal que contiene un elemento regulador inducible puede exponerse a un inductor aplicando externamente el inductor a la célula o planta, por ejemplo mediante pulverización, riego, calentamiento o métodos similares.
Se puede usar cualquier promotor inducible en realizaciones en este documento. Véase Ward et al. Plant Mol. Biol.
22: 361 - 366 (1993). Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo y sin que sean limitantes: promotores del receptor de ecdisona (patente de Estados Unidos n° 6.504.082); promotores del sistema ACE1 que responden al cobre (Mett et al. PNAS 90: 4567 - 4571 (1993)); los genes In2-1 e In2-2 del maíz que responden a los protectores contra herbicidas de la bencenosulfonamida (patente de los Estados Unidos n° 5.364.780; Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229 - 237 (1991) y Gatz y otros, Mol. Gen. Genetics 243: 32 - 38 (1994)); el represor Tet de Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229 - 237 (1991); promotores de un gen de la hormona esteroide, cuya actividad transcripcional es inducida por una hormona glucocorticosteroide, Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421 (1991) y McNellis et al., (1998) Plant J. 14 (2): 247 -257; el promotor GST de maíz, que se activa por compuestos electrofílicos hidrófobos que se utilizan como herbicidas preemergentes (véase la patente de EE. UU. n° 5.965.387 y Solicitud de Patente Internacional, Publicación No. WO 93/001294); y el promotor PR-1a del tabaco, que se activa con ácido salicílico (véase Ono S., Kusama M., Ogura R., Hiratsuka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminiscence Reporter System”, Biosci. Biotechnol. Biochem. 23 de septiembre de 2011; 75 (9): 1796 - 800). Otros promotores de interés regulados por sustancias químicas incluyen promotores inducibles por tetraciclina y represores de tetraciclina (véase, por ejemplo, Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229 - 237, y las patentes de EE. UU. n° 5.814.618 y 5.789.156).
Otros promotores regulables de interés incluyen un elemento regulador que responde al frío o un elemento regulador del choque térmico, cuya transcripción se puede efectuar en respuesta a la exposición al frío o al calor, respectivamente (Takahashi et al., Plant Physiol. 99: 383 - 390, 1992); el promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa (Gerlach et al., PNAS USA 79: 2981 -2985 (1982); Walker et al., PNAS 84 (19): 6624-6628 (1987)), inducible por condiciones anaeróbicas; el promotor inducible por la luz derivado del gen rbcS del guisante o el gen psaDb del guisante (Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2): 255 - 265); un elemento regulador inducible por la luz (Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226: 449, 1991; Lam y Chua, Science 248: 471, 1990; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl Acad Sci. USA 90 (20): 9586 - 9590; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6): 1129 - 1138); un elemento regulador inducible por hormonas vegetales (Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15: 905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15: 225, 1990), y similares. Un elemento regulador inducible también puede ser el promotor del gen In2-1 o In2-2 del maíz, que responde a los protectores del herbicida bencenosulfonamida (Hershey et al., Mol. Gen. Gene. 227: 229 - 237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243: 32 - 38, 1994), y el represor Tet del transposón Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237, 1991).
Los promotores inducibles por estrés incluyen promotores inducibles por estrés sal/agua tales como P5CS (Zang et al. (1997) Plant Sciences 129: 81 - 89); promotores inducibles por frío, tales como cor15a (Hajela y otros (1990) Plant Physiol. 93: 1246 - 1252), cor15b (Wilhelm y otros (1993) Plant Mol. Biol. 23: 1073 - 1077), wsc120 (Ouellet y otros (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33: 897-909), y ci21A (Schneider et al. (1997) Plant Physiol. 113: 335 - 45); promotores inducibles por la sequía, como Trg-31 (Chaudhary et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 1247 - 57) y rd29 (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnology 18: 287 - 291); promotores inducibles osmóticos, tales como Rab17 (Vilardell et al. (1991) Plant Mol. Biol.17: 985-93) y osmotina (Raghothama et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23: 1117 - 28); promotores inducibles por calor, como las proteínas de choque térmico (Barros et al. (1992) Plant Mol. 19: 665 - 75; Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 14: 27 - 41), smHSP (Waters et al. (1996) J. Experimental Botany 47: 325 - 338); y el elemento inducible de choque térmico del promotor de ubiquitina de perejil (documento WO 03/102198). Otros promotores inducibles por estrés incluyen rip2 (patente de EE. UU. n° 5.332.808 y Publicación de EE. UU. n° 2003/0217393) y rd29a (Yamaguchi-Shinozaki et al. (1993) Mol. Gen. Genetics 236: 331 - 340). Ciertos promotores son inducibles por heridas, incluido el promotor pMAS de Agrobacterium (Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4 (3): 495 - 505) y el promotor ORF13 de Agrobacterium (Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254 (3): 337 - 343).
Los promotores preferidos de tejido pueden utilizarse para dirigir la transcripción y/o expresión mejorada dentro de un tejido vegetal particular. Los ejemplos de estos tipos de promotores incluyen la expresión preferida de la semilla, tal como la proporcionada por el promotor de faseolina (Bustos et al. 1989. The Plant Cell Vol. 1, 839 - 853), y el gen de la globulina-1 del maíz, Belanger, et al. 1991 Genetics 129: 863 - 972. Para las dicotiledóneas, dicots, los promotores preferidos de las semillas incluyen, pero no se limitan a ellos, p-faseolina de haba, napina, p-conglicinina, lectina de soja, cruciferina y similares. Para las monocotiledóneas, monocots, los promotores preferidos de las semillas incluyen, entre otros, zeína de maíz de 15 kDa, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, Y-zeína, cerosa, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Los promotores preferidos de las semillas también incluyen aquellos promotores que dirigen la expresión génica predominantemente a tejidos específicos dentro de la semilla como, por ejemplo, el promotor preferido del endospermo de la Y-zeína, el promotor críptico del tabaco (Fobert et al. 1994. T-DNa tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567 - 577), el promotor del gen P del maíz (Chopra et al. 1996. Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteins with C-terminal replacements. Plant Cell 7:1149 - 1158, Erratum in Plant Cell. 1997, 1:109), el promotor de globulina-1 del maíz (Belenger and Kriz.1991. Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863­ 972), y promotores que dirigen la expresión a la cáscara de la semilla o vaina del grano de maíz, por ejemplo el promotor de glutamina sintetasa específico del pericapio (Muhitch et al., 2002. Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872).
Además del promotor, un vector de expresión contiene típicamente una unidad de transcripción o casete de expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresión del ácido nucleico en células huésped, procariotas o eucariotas. Una casete de expresión típica, por tanto, contiene un promotor unido operativamente, por ejemplo, a una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína, y señales requeridas, por ejemplo, para una poliadenilación eficaz del transcrito, terminación de la transcripción, sitios de unión al ribosoma o terminación de la traducción. Los elementos adicionales de la casete pueden incluir, por ejemplo, potenciadores y señales de corte y empalme heterólogas.
Se pueden incluir otros componentes del vector, también dependiendo del uso que se pretenda dar al gen. Los ejemplos incluyen marcadores seleccionables, secuencias de dirección o reguladoras, secuencias peptídicas de tránsito tales como las secuencias estabilizadoras de la secuencia peptídica de tránsito optimizada (véase la patente de EE. UU. n° 5.510.471) como RB7 MAR (véase Thompson y Myatt, (1997) Plant Mol. Biol., 34: 687 - 692 y WO9727207) o secuencias líder, intrones, etc. Las descripciones generales y los ejemplos de vectores de expresión de plantas y genes informadores se pueden encontrar en Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. Eds; CRC Press pp. 89-119 (1993).
La selección de un vector de expresión apropiado dependerá del hospedador y del método de introducción del vector de expresión en el hospedador. La casete de expresión puede incluir, en el extremo 3' de una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, una región de terminación transcripcional y traduccional funcional en las plantas. La región de terminación puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés o puede derivarse de otra fuente. Se dispone de regiones de terminación convenientes a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa (nos) (Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1: 561 - 573 (1982) y Shaw y otros (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp. 7831 - 7846 (nep)); véase también Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262: 141 - 144 (1991); Proudfoot, Cell 64: 671 -674 (1991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5: 141 -149 (1991); Mogen et al. Plant Cell 2: 1261 - 1272 (1990); Munroe et al. Gene 91: 151 - 158 (1990); Ballas et al. Nucleic Acids Res. 17: 7891 - 7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res.15: 9627-9639 (1987).
Una casete de expresión puede contener una secuencia líder 5'. Tales secuencias líder pueden actuar mejorando la traducción. Los líderes de la traducción son conocidos en la técnica e incluyen, a título de ejemplo, los líderes del picornavirus, el líder del EMCV (región no codificadora 5' de encefalomiocarditis), Elroy-Stein et al. Proc. Nat. Acad Sci. USA 86: 6126 - 6130 (1989); líderes de potyvirus, por ejemplo, líder de TEV (Tobacco Etch Virus) Carrington y Freed Journal of Virology, 64: 1590 - 1597 (1990), líder de MDm V (Maize Dwarf Mosaic Virus), Allison et al., Virology 154: 9 - 20 (1986); proteína de unión (BiP) de cadena pesada de la inmunoglobulina humana, Macejak et al. Nature 353: 90 -94 (1991); líder no traducido del ARNm de la proteína de la cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV ARN 4), Jobling et al. Nature 325 : 622 - 625 (1987); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV), Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, pp. 237 - 256; y líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) Lommel et al. Virology 81: 382 - 385 (1991). Véase también Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84: 965 - 968 (1987).
El constructo puede contener también secuencias que mejoran la traducción y/o la estabilidad del ARNm, tales como los intrones. Un ejemplo de uno de estos intrones es el primer intrón del gen II de la variante de la histona H3.III de Arabidopsis thaliana. Chaubet et al. Journal of Molecular Biology, 225: 569 - 574 (1992).
En aquellos casos en los que es deseable tener el producto expresado de la secuencia de nucleótidos heteróloga dirigida a un orgánulo particular, en particular el plástido, amiloplasto, o al retículo endoplásmico, o secretada en la superficie de la célula o extracelularmente, la casete de expresión puede comprender además una secuencia de codificación para un péptido de tránsito. Dichos péptidos de tránsito son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a ellos, el péptido de tránsito para la proteína transportadora de acilo, la subunidad pequeña de RUBISCO, EPSP sintasa vegetal y Helianthus annuus (véase Lebrun et al., patente de Estados Unidos 5.510.417), péptido de tránsito al cloroplasto Brittle-1 de Zea mays (Nelson et al. Plant Physiol 117 (4): 1235 - 1252 (1998); Sullivan et al. Plant Cell 3 (12): 1337 - 48; Sullivan et al., Planta (1995) 196 (3): 477 - 84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267 (26): 18999 - 9004) y similares. Además, son conocidos en la técnica los péptidos de tránsito al cloroplasto quimérico, tales como el Péptido de Tránsito Optimizado (véase la patente de Estados Unidos n° 5.510.471). Otros péptidos de tránsito al cloroplasto se han descrito previamente en las patentes de EE.UU. n° 5.717.084; 5.728.925. Un experto en la técnica apreciará fácilmente las muchas opciones disponibles en la expresión de un producto a un orgánulo particular. Por ejemplo, la secuencia de alfa amilasa de la cebada se usa a menudo para dirigir la expresión al retículo endoplásmico. Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731 - 3738 (1985).
Un experto en la materia apreciará que el uso de tecnologías de ADN recombinante puede mejorar el control de la expresión de moléculas de ácido nucleico transfectadas manipulando, por ejemplo, el número de copias de las moléculas de ácido nucleico dentro de la célula huésped, la eficiencia con la que se transcriben esas moléculas de ácido nucleico, la eficiencia con la que se traducen las transcripciones resultantes y la eficiencia de las modificaciones postraduccionales. Además, la secuencia del promotor podría estar diseñada genéticamente para mejorar el nivel de expresión en comparación con el promotor nativo. Las técnicas recombinantes útiles para controlar la expresión de las moléculas de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a ellas, la integración estable de las moléculas de ácido nucleico en uno o más cromosomas de la célula huésped, la adición de secuencias de estabilidad del vector a los plásmidos, sustituciones o modificaciones de las señales de control de la transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, potenciadores), sustituciones o modificaciones de las señales de control de la traducción (p. ej., sitios de unión a los ribosomas, secuencias Shine-Dalgarno o Kozak), modificación de moléculas de ácido nucleico para que correspondan al uso de codones de la célula huésped, y eliminación de secuencias que desestabilizan los transcritos.
Pueden incluirse genes informadores o marcadores en los vectores de transformación para la selección de células o tejidos transformados o partes de plantas, o plantas. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen los que confieren resistencia a antimetabolitos como herbicidas o antibióticos, por ejemplo dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13: 143 - 149, 1994; véase también Herrera Estrella et al., Nature 303: 209 - 213, 1983; Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16: 807 - 820, 1991); neomicina fosfotransferasa, que confiere resistencia a los aminoglucósidos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2: 987 - 995, 1983 y Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80: 4803 (1983)); higromicina fosfotransferasa, que confiere resistencia a la higromicina (Marsh, Gene 32: 481-485, 1984; véase también Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5: 103 - 108, 1985; Zhijian et al., Plant Science 108: 219 - 227, 1995); trpB, que permite a las células utilizar indol en vez de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 8047, 1988); manosa-6-fosfato isomerasa que permite a las células utilizar manosa (documento WO 94/20627); ornitina descarboxilasa, que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina (DFMO; McConlogue, 1987, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); y desaminasa de Aspergillus terreus, que confiere resistencia a Blasticidin S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59: 2336 - 2338, 1995).
Los marcadores seleccionables adicionales incluyen, por ejemplo, una acetolactato sintasa mutante, que confiere resistencia a la imidazolinona o la sulfonilurea (Lee et al., Em Bo J. 7: 1241 - 1248, 1988), un psbA mutante, que confiere resistencia a la atrazina (Smeda et al., Plant Physiol. 103: 911 - 917, 1993), o una protoporfirinógeno oxidasa mutante (véase la patente de Estados Unidos n° 5.767.373), u otros marcadores que confieren resistencia a un herbicida como el glufosinato. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no se limitan a ellos, genes que codifican resistencia al cloranfenicol (Herrera Estrella et al., EMBO J. 2: 987 - 992, 1983); estreptomicina (Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210: 86 - 91, 1987); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5: 131 - 137, 1996); bleomicina (Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171 - 176, 1990); sulfonamida (Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15: 127 - 136, 1990); bromoxinilo (Stalker et al., Science 242: 419 - 423, 1988); glifosato (Shaw et al., Science 233: 478 - 481, 1986); fosfinotricina (DeBlock et al., EMBO J. 6: 2513 - 2518, 1987), y similares.
Una opción para usar un gen selectivo es un ADN codificador de resistencia al glufosinato y en una realización puede ser la fosfinotricina acetil transferasa (pat), gen pat o gen bar optimizado del maíz o bajo el control del promotor del virus del mosaico de la vena de la mandioca. Estos genes confieren resistencia al bialafos (ver, Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25 - 37); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603; 1990; Uchimiya et al., BioTechnology 11: 835,1993; White et al., Nucl. Acidos Res. 18: 1062, 1990; Spencer et al., Theor. Apl. Genet. 79: 625 - 631, 1990; y Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219: 492, 1989). Una versión del gen pat es el gen pat optimizado del maíz, descrito en la patente de los EE. UU. n° 6.096.947.
Además, pueden emplearse marcadores que faciliten la identificación de una célula vegetal que contiene el polinucleótido que codifica el marcador. Son útiles los marcadores apilables o seleccionables, donde la presencia de la secuencia genera un producto medible y puede generar el producto sin destrucción de la célula vegetal. Los ejemplos incluyen una p-glucuronidasa, o gen uidA (GUS), que codifica una enzima para la cual se conocen diversos sustratos cromogénicos (por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 5.268.463 y 5.599.670); cloranfenicol acetil transferasa (Jefferson et al. The EMBo Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901 - 3907); y fosfatasa alcalina. En una realización preferida, el marcador usado es beta caroteno o provitamina A (Ye et al., Science 287: 303 - 305 (2000)). El gen se ha utilizado para mejorar la nutrición del arroz, pero en este caso se emplea como marcador seleccionable, y la presencia del gen vinculado a un gen de interés se detecta por el color dorado que proporciona. A diferencia de la situación en la que el gen se utiliza por su contribución nutricional a la planta, una cantidad menor de la proteína es suficiente para fines de marcado. Otros marcadores seleccionables incluyen los genes de antocianina/ flavonoides en general (véase discusión en Taylor y Briggs, The Plant Cell (1990) 2: 115 - 127) que incluye, por ejemplo, un gen del locus R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta et al., en Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels y Gustafson eds., pp. 263 - 282 (1988)); los genes que controlan la biosíntesis de los pigmentos de los flavonoides, como el gen C1 del maíz (Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171 - 1179; Scheffler et al., Mol. Gen. Genet. (1994) 242: 40 -48 ) y C2 del maíz (Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203: 202-207); el gen B (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1: 1175 -1183), el gen p1 (Grotewold et al., Proc. Natl Acad Sci USA (1991) 88: 4587-4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76: 543 - 553; Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999) 39: 11 - 19); los genes del locus bronze (Ralston et al., Genetics (1988) 119: 185- 197; Nash et al., Plant Cell (1990) 2 (11): 1039- 1049), entre otros.
Otros ejemplos de marcadores adecuados incluyen el gen de la proteína fluorescente cian (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943 - 54 y Kato et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42), el gen de la proteína fluorescente amarilla (PHIYFP™ de Evrogen; véase Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943 - 54); un gen lux, que codifica una luciferasa, cuya presencia puede detectarse utilizando, por ejemplo, película de rayos X, recuento de centelleo, espectrofotometría fluorescente, cámaras de video de luz baja, cámaras de recuento de fotones o luminometría de pozos múltiples (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8: 343); un gen de proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al., Plant J. (1995) 8 (5): 777 - 84); y DsRed2 donde las células vegetales transformadas con el gen marcador son de color rojo y por tanto se pueden seleccionar visualmente (Dietrich et al. (2002) Biotechniques 2 (2): 286 - 293). Los ejemplos adicionales incluyen un gen de p-lactamasa (Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1978) 75: 3737), que codifica una enzima para la cual se conocen diversos sustratos cromogénicos (p. ej., PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen xylE (Zukowsky et al., Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA (1983) 80: 1101), que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen de a-amilasa (Ikuta et al., Biotech. (1990) 8: 241); y un gen de tirosinasa (Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129: 2703), que codifica una enzima capaz de oxidar la tirosina a DOPA y dopaquinona, que a su vez se condensa para formar la melanina compuesta fácilmente detectable. Claramente, muchos de estos marcadores están disponibles y son conocidos por los expertos en la técnica.
IV. Células y organismos que comprenden DGT-28.
La invención se define en las reivindicaciones. En algunas formas de realización, se proporciona una célula y/o un organismo (por ejemplo, una célula vegetal o planta) que comprende una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere a una planta tolerancia al glifosato, en donde la EPSPS es idéntico al menos en un 90% a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 y cuando está alineado con la SEC ID NO: 1 comprende una alanina en la posición correspondiente a la posición 84 de la SEC ID NO: 1. En realizaciones particulares, se proporciona una célula y/o un organismo que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere a una planta tolerancia al glifosato, en donde la EPSPS es al menos en un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 y cuando está alineada con la SEC ID NO: 1 comprende una alanina en la posición correspondiente a la posición 84 de la SEC ID NO: 1, en donde el polinucleótido es una secuencia sintética que se ha diseñado para la expresión en una planta seleccionada entre el grupo que consiste en:
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 3; y
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con otro ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 3 en condiciones de rigor alto,
en donde el polinucleótido está unido operativamente a un promotor, en donde preferiblemente el promotor está dirigiendo la expresión de un gen; por ejemplo, un ácido nucleico dgt-28.
Una célula vegetal, una parte de la planta y/o una planta pueden modificarse genéticamente para comprender un polipéptido heterólogo (por ejemplo, una proteína DGT-28) y/o un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, un ácido nucleico dgt-28) por cualquiera de varios métodos para introducir una molécula heteróloga conocidos en la técnica. En realizaciones particulares en el presente documento, una molécula heteróloga se introduce en una célula vegetal, una parte de una planta y/o una planta por transformación.
Cualquier especie de planta o célula vegetal puede modificarse genéticamente para comprender un polipéptido y/o ácido nucleico heterólogo. En algunas realizaciones, la célula vegetal que está genéticamente modificada no es capaz de regenerarse para producir una planta. En algunas realizaciones, las plantas que están así modificadas genéticamente de acuerdo con la presente descripción (por ejemplo, células huésped vegetales) incluyen, pero no se limitan a ellas, una planta superior, una planta dicotiledónea, una planta monocotiledónea, una planta consumible, una planta de cultivo, y una planta utilizada por sus aceites (por ejemplo, una planta de semillas oleaginosas). Tales plantas incluyen, por ejemplo y sin ser limitantes: alfalfa; haba de soja; algodón; colza (canola); linaza; maíz; arroz; brachiaria; trigo; cártamo; sorgo; remolacha azucarera; girasol; tabaco; y pastos (por ejemplo césped). En ejemplos particulares, una planta o célula vegetal modificada genéticamente incluye, por ejemplo y sin limitación: Brassica napus; mostaza india (Brassica júncea); mostaza etíope (Brassica carinata); nabo (Brassica rapa); col (Brassica olerácea); Glycine max; Linum usitatissimum; Zea mays; Carthamus tinctorius; Helianthus annuus; Nicotiana tabacum; Arabidopsis thaliana, nuez de Brasil (Betholettia excelsa); haba de ricino (Ricinus communis); nuez de coco (Cocus nucifera); cilantro (Coriandrum sativum); Gossypium spp.; maní (Arachis hypogaea); jojoba (Simmondsia chinensis); palma de aceite (Elaeis guineeis); oliva (olea eurpaea); Oryza sativa; calabaza (Cucurbita maxima); cebada (Hordeum vulgare); caña de azúcar (Saccharum officinarum); Triticum spp. (incluyendo Triticum durum y Triticum aestivum); y la lenteja de agua (Lemnaceae sp.). En algunas realizaciones, la planta puede tener un fondo genético particular, como para los cultivares de élite, los cultivares de tipo salvaje y las variedades distinguibles comercialmente.
Los ácidos nucleicos introducidos en una célula vegetal pueden usarse para conferir los rasgos deseados en cualquier planta concreta. Se puede diseñar una amplia variedad de plantas y sistemas celulares vegetales para las características fisiológicas y agronómicas deseadas descritas en este documento utilizando un ácido nucleico que codifica un polipéptido DGT y diversos métodos de transformación. Las realizaciones de este documento pueden usar cualquiera de los muchos métodos para la transformación de plantas (y la producción de plantas modificadas genéticamente) que se conocen en la técnica. Se han desarrollado numerosos métodos para la transformación de plantas, incluyendo protocolos de transformación física y biológica para plantas dicotiledóneas, así como plantas monocotiledóneas (véase, por ejemplo, Goto-Fumiyuki et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 282 - 6; Miki et al. (1993) Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (Glick, B. R. y Thompson, J. E., eds.), CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, pp. 67 - 88). Además, los vectores y los métodos de cultivo in vitro para la transformación de células y tejidos vegetales y la regeneración de plantas se describen, por ejemplo, en Gruber et al. (1993), supra, en pp. 89-119.
Las técnicas de transformación de plantas disponibles para la introducción de un ácido nucleico en una célula huésped de la planta incluyen, por ejemplo y sin limitación: la transformación con ADN-T desarmado usando Agrobacterium tumefaciens o A. rhizogenes como agente de transformación; transfección con fosfato de calcio; transformación con polibreno; fusión de protoplastos; electroporación (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495 - 505); métodos ultrasónicos (p. ej., sonoporación); transformación de liposomas; microinyección; contacto con ADN desnudo; contacto con vectores plasmídicos; contacto con vectores virales; biolística (por ejemplo, bombardeo con partículas de ADN (véase, por ejemplo, Klein et al. (1987) Nature 327: 70-3) y bombardeo con micropartículas (Sanford et al. (1987) Part. Sci. Tecnol. 5:27; Sanford (1988) Trends Biotech. 6: 299, Sanford (1990) Physiol. Plant 79: 206; y Klein et al. (1992) Biotechnology 10: 268); transformación mediada por WHISKERS de carburo de silicio (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Rep. 9: 415 - 8); transformación de nanopartículas (véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos n° US2009/0104700A1); emisión de aerosol; y captación mediada por polietilenglicol (PEG). En ejemplos específicos, un ácido nucleico heterólogo puede introducirse directamente en el a Dn genómico de una célula vegetal.
Un método ampliamente utilizado para introducir un vector de expresión en una planta se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium. Horsch et al. (1985) Science 227: 1229. A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo, patógenas para las plantas, que se sabe que son útiles para transformar genéticamente células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, llevan genes responsables de la transformación genética de la planta. Kado (1991) Crit. Rev. Plant. Sci. 10: 1. Los detalles en relación con los sistemas de vectores de Agrobacterium y los métodos para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium también están disponibles, por ejemplo, en Gruber et al., supra, Miki et al., supra, Moloney et al. (1989) Plant Cell Reports 8: 238, y las patentes de EE. UU. n° 4.940.838 y 5.464.763.
Si se usa Agrobacterium para la transformación, el ADN que se va a insertar se clona típicamente en plásmidos especiales; ya sea en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios no pueden replicarse ellos mismos en Agrobacterium. El vector intermedio se puede transferir a A. tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). El sistema Japan Superbinary Tobacco es un ejemplo de dicho sistema (revisado por Komari et al. (2006) Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343; Agrobacterium Protocols, 2a edición, Vol. 1, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp.15 — 41; y Komori y otros (2007) Plant Physiol. 145: 1155 - 60). Los vectores binarios se pueden replicar tanto en E. coli como en Agrobacterium. Los vectores binarios comprenden un gen marcador de selección y un enlazador o polienlazador que están enmarcados por las regiones de borde T-ADN derecha e izquierda. Se pueden transformar directamente en Agrobacterium (Holsters, 1978). El Agrobacterium comprende un plásmido que lleva una región vir. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. La región vir es necesaria para la transferencia del T-ADN a la célula vegetal. Puede contener también T-ADN.
Las funciones de virulencia del huésped de Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción de una cadena T que contiene el constructo y el marcador adyacente en el ADN de la célula vegetal cuando la célula es infectada por la bacteria utilizando un vector de ADN T binario (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12: 8711-21) o el procedimiento de co­ cultivo (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229 - 31). En general, el sistema de transformación Agrobacterium se utiliza para diseñar plantas dicotiledóneas. Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16: 357 - 84; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118: 627 - 41. El sistema de transformación Agrobacterium también se puede usar para transformar, así como para transferir, ácidos nucleicos a plantas monocotiledóneas y células vegetales. Véase la patente de Estados Unidos n° 5.591.616; Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3: 3039 - 41; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311: 763-4 ; Grimsley et al. (1987) Nature 325: 1677-9; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 31-40; y Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95: 426 - 34.
Las manipulaciones genéticas de un huésped recombinante en el presente documento se pueden realizar utilizando técnicas genéticas y selección estándar, y se pueden llevar a cabo en cualquier célula huésped que sea adecuada para la manipulación genética. En algunas realizaciones, una célula huésped recombinante puede ser cualquier organismo o microorganismo huésped adecuado para la modificación genética y/o la expresión génica recombinante. En algunas realizaciones, un huésped recombinante puede ser una planta. Las técnicas estándar de ADN recombinante y de clonación molecular utilizadas aquí son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, y sin ser limitantes: Sambrook et al. (1989), supra; Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; y Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience, Nueva York, NY.
Después de la introducción de un ácido nucleico en una célula vegetal, la célula vegetal puede crecer y, tras emerger tejido diferenciador, como brotes y raíces, se pueden generar plantas maduras. En algunas realizaciones, se puede generar una pluralidad de plantas. Los expertos en la técnica conocen las metodologías para regenerar plantas y pueden encontrarse, por ejemplo, en Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil y Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers y en Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press). Las plantas modificadas genéticamente descritas en el presente texto pueden cultivarse en un medio de fermentación o crecer en un medio adecuado, como el suelo. En algunas realizaciones, un medio de crecimiento adecuado para plantas superiores puede ser cualquier medio de crecimiento para plantas, que incluye, pero sin ser limitantes, tierra, arena, cualquier otro medio en partículas que soporte el crecimiento de la raíz (p. ej., vermiculita, perlita, etc.) o cultivo hidropónico, así como luz adecuada, agua y suplementos nutricionales que facilitan el crecimiento de la planta superior.
Las células vegetales transformadas que se producen mediante cualquiera de las técnicas de transformación anteriores pueden cultivarse para regenerar una planta completa que posee el genotipo transformado y, por tanto, el fenotipo deseado. Tales técnicas de regeneración se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo tisular, basándose típicamente en un marcador de biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de la planta a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" en Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124 - 176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21 - 73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneración también se puede obtener a partir de callos de plantas, explantes, órganos, pólenes, embriones o partes de los mismos. Tales técnicas de regeneración se describen en general en Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467 - 486.
En otras realizaciones, las células vegetales que se transforman no son capaces de regenerarse para producir una planta. Dichas células pueden emplearse, por ejemplo, en el desarrollo de una línea celular vegetal que tenga el fenotipo de interés, por ejemplo, la resistencia a herbicidas.
Una célula vegetal, callo, tejido o planta transformada puede identificarse y aislarse seleccionando o cribando el material vegetal diseñado para rasgos codificados por los genes marcadores presentes en el ADN transformante. Por ejemplo, la selección puede realizarse cultivando el material vegetal construido, en medios que contengan una cantidad inhibidora del antibiótico o herbicida al cual confiere resistencia el constructo transformador del gen. Además, las plantas transformadas y las células vegetales también pueden identificarse mediante la detección de las actividades de cualquier gen marcador visible (por ejemplo, los genes de la p-glucuronidasa, luciferasa o gfp) que pueden estar presentes en los constructos de ácido nucleico recombinante. Dichas metodologías de selección y cribado son bien conocidas por los expertos en la técnica.
Puede producirse una planta transgénica que contiene una molécula heteróloga de la presente invención a través de la reproducción selectiva, por ejemplo, cruzando sexualmente una primera planta parental que comprende la molécula y una segunda planta parental, produciendo así una pluralidad de plantas de primera progenie. Luego, se puede seleccionar una primera planta de progenie que sea resistente a un marcador seleccionable (por ejemplo, glifosato, la resistencia al cual puede ser conferida a la planta de progenie por la molécula heteróloga). La primera planta de progenie puede entonces ser autosembrada, produciendo así una pluralidad de plantas de segunda progenie. Luego, se puede seleccionar una segunda planta de progenie que sea resistente al marcador seleccionable. Estos pasos pueden incluir además el cruce de la primera planta de progenie o la segunda planta de progenie a la segunda planta parental o una tercera planta parental.
También debe entenderse que dos plantas transgénicas diferentes pueden también aparearse para producir descendientes que contienen dos genes exógenos añadidos y segregados independientemente. La autosiembra de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes agregados y exógenos. También se contempla el retrocruzamiento hacia una planta parental y la fecundación externa con una planta no transgénica, como es la propagación vegetativa. Son conocidos en la técnica otros métodos de multiplicación comúnmente usados para diferentes características y cultivos. La reproducción por retrocruzamiento se ha utilizado para transferir genes para un rasgo simplemente hereditario y altamente heredable a un cultivar o línea pura homocigótica deseable, que es el progenitor recurrente. Es de esperar que la planta resultante tenga los atributos del padre recurrente (p. ej., el cultivar) y el rasgo deseable transferido del padre donante. Después del cruce inicial, los individuos que poseen el fenotipo del padre donante se seleccionan y se cruzan repetidamente (retrocruzado) con el padre recurrente. Es de esperar que el padre resultante tenga los atributos del padre recurrente (p. ej., el cultivar) y el rasgo deseable transferido del padre donante.
También se puede introducir un ácido nucleico en un área predeterminada del genoma de la planta mediante recombinación homóloga. Los métodos para integrar establemente una secuencia de polinucleótidos dentro de un sitio cromosómico específico de una célula vegetal mediante recombinación homóloga se han descrito en la técnica. Por ejemplo, la integración específica del sitio como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos n° 2009/0111188 A1 implica el uso de recombinasas o integrasas para mediar en la introducción de una secuencia de polinucleótido donante en una diana cromosómica. Además, la Solicitud de Patente Internacional n°WO 2008/021207 describe la recombinación homóloga mediada por el dedo de zinc para integrar de manera estable una o más secuencias de polinucleótidos donantes en localizaciones específicas del genoma. El uso de recombinasas tales como FLP/FRT como se describe en la patente de EE. UU. n° 6.720.475, o CRE/LOX como se describe en la patente de EE. UU. n° 5.658.772, puede utilizarse para integrar establemente una secuencia de polinucleótidos en un sitio cromosómico específico. Finalmente, el uso de meganucleasas para dirigir los polinucleótidos del donante a una ubicación cromosómica específica se describió en Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055 - 5060).
Otros métodos diversos para la integración específica del sitio dentro de células vegetales son generalmente conocidos y aplicables (Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6 (4) (2001) pp. 155 - 159). Además, los sistemas de recombinación específicos del sitio que se han identificado en varios organismos procariotas y eucariotas inferiores se pueden aplicar para su uso en plantas. Los ejemplos de tales sistemas incluyen, pero sin limitarse a ellos, el sistema de recombinasa R/RS del plásmido pSR1 de la levadura Zygosaccharomyces rouxii (Araki y otros (1985) J. Mol. Biol.
182: 191 - 203) y el sistema Gin/gix del fago Mu (Maeser y Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170 -176).
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere a una planta tolerancia al glifosato, en donde la EPSPS es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 y cuando está alineada con la SEC ID NO: 1 comprende una alanina en la posición correspondiente a la posición 84 de la SEC ID NO: 1, en donde el polinucleótido es una secuencia sintética que ha sido diseñada para la expresión en una planta, como se describió anteriormente, puede combinarse opcionalmente con otro ácido nucleico en la célula y/u organismo hospedador. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada, como se describe anteriormente, puede combinarse o "apilarse" con otro que proporcione resistencia adicional o tolerancia al glifosato u otro herbicida, y/u otro que proporcione resistencia a insectos o a enfermedades seleccionadas y/o mejoras nutricionales, y/o características agronómicas mejoradas, y/u otro que proporcione proteínas u otros productos útiles para piensos, alimentos, productos industriales, farmacéuticos u otros. El "apilamiento" de dos o más secuencias de ácidos nucleicos de interés dentro del genoma de una planta se puede lograr, por ejemplo, a través de la transformación de una planta con uno o más constructos que contienen los ácidos nucleicos, la re-transformación de una planta transgénica, o la adición de nuevos rasgos a través de la integración dirigida por medio de la recombinación homóloga.
Los ácidos nucleicos que pueden "apilarse" con la molécula de ácido nucleico aislada, como se describe anteriormente, incluyen, por ejemplo y sin ser limitantes:
Genes o secuencia de codificación (p. ej. IRNA) que confieren resistencia a plagas o enfermedades.
(A) Genes de resistencia a enfermedades de las plantas. Las defensas de las plantas se activan frecuentemente por la interacción entre el producto de un gen de resistencia a la enfermedad (R) en la planta y el producto de un gen de avirulencia correspondiente en el patógeno. Una diversidad de plantas pueden transformarse con un gen de resistencia clonado para construir plantas que son resistentes a cepas patógenas específicas. Los ejemplos de tales genes incluyen el gen Cf-9 del tomate para la resistencia a Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994 Science 266: 789), el gen Pto del tomate, que codifica una proteína quinasa, para la resistencia a Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin et al., 1993 Science 262: 1432), y el gen de Arabidopsis RSSP2 para la resistencia a Pseudomonas syringae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78: 1089).
(B) Una proteína de Bacillus thuringiensis, un derivado de la misma o un polipéptido sintético modelado en la misma, tal como una secuencia de nucleótidos de un gen Bt 5-endotoxina (Geiser et al., 1986 Gene 48: 109), y un gen de insecticida vegetativo (VIP) (véase, por ejemplo, Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 5389 - 94). Además, las moléculas de ADN que codifican los genes de endotoxina pueden adquirirse en la American Type Culture Collection (Rockville, Md.), bajo los números de registro de entrada ATCC 40098, 67136, 31995 y 31998.
(C) Una lectina, tal como las secuencias de nucleótidos de varios genes de la lectina de unión con manosa de Clivia miniata (Van Damme y otros, 1994 Plant Molec. Biol. 24: 825).
(D) Una proteína de unión a la vitamina, como la avidina y los homólogos de avidina que son útiles como larvicidas contra plagas de insectos. Véase la patente de EE.UU. N° 5.659.026.
(E) Un inhibidor de enzimas, por ejemplo, un inhibidor de proteasa o un inhibidor de amilasa. Los ejemplos de los genes incluyen un inhibidor de la cisteína-proteinasa del arroz (1987, J. J. Biol. Chem. 262: 16793), un inhibidor I de la proteinasa del tabaco (Huub y otros, 1993 Plant Molec. Biol. 21: 985), y un inhibidor de la aamilasa (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1243).
(F) Una hormona o una feromona específicas para insectos, tal como un ecdisteroide y una hormona juvenil, una variante de la misma, un mimético basado en la misma, o un antagonista o agonista de la misma, como la expresión de baculovirus de la hormona juvenil clonada esterasa, un inactivador de la hormona juvenil (Hammock et al., 1990 Nature 344: 458).
(G) Un péptido o neuropéptido específico del insecto que, al expresarse, altera la fisiología de la plaga afectada (J. Biol. Chem. 269: 9). Los ejemplos de dichos genes incluyen un receptor de hormona diurética de insecto (Regan, 1994), una alostatina identificada en Diploptera punctata (Pratt, 1989) y neurotoxinas paralíticas específicas del insecto (patente de Estados Unidos n° 5.266.361).
(H) Un veneno específico del insecto producido en la naturaleza por una serpiente, una avispa, etc., tal como un péptido insectotóxico del escorpión (Pang, 1992 Gene 116: 165).
(I) Una enzima responsable de una hiperacumulación de monoterpeno, un sesquiterpeno, un esteroide, ácido hidroxámico, un derivado fenilpropanoide u otra molécula no proteica con actividad insecticida.
(J) Una enzima implicada en la modificación, incluida la modificación postraduccional, de una molécula biológicamente activa; por ejemplo, enzima glucolítica, una enzima proteolítica, una enzima lipolítica, una nucleasa, una ciclasa, una transaminasa, una esterasa, una hidrolasa, una fosfatasa, una quinasa, una fosforilasa, una polimerasa, una elastasa, una quinasa y una glucasa, sea natural o sintética. Los ejemplos de dichos genes incluyen un gen callas (solicitud publicada PCT WO93/02197), secuencias codificantes de quitinasa (que pueden obtenerse, por ejemplo, de la ATCC con los números de registro 3999637 y 67152), quitinasa del anquilostoma del tabaco (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23: 691), y el gen de la poliubiquitina ubi4-2 del perejil (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21: 673).
(K) Una molécula que estimula la transducción de la señal. Los ejemplos de tales moléculas incluyen secuencias de nucleótidos para clones de ADNc de calmodulina de frijol mungo (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24: 757) y una secuencia de nucleótidos de un clon de ADNc de calmodulina de maíz (Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104: 1467).
(L) Un péptido de momento hidrófobo. Véase la patente de EE.UU. n° 5.659.026 y 5.607.914; esta última enseña péptidos antimicrobianos sintéticos que confieren resistencia a la enfermedad.
(M) Una permeasa de la membrana, un formador de canales o un bloqueador de canales, tal como el análogo de péptido lítico cecropina-p (Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43) que hace que las plantas de tabaco transgénicas sean resistentes a Pseudomonas solanacearum.
(N) Una proteína viral invasiva o una toxina compleja derivada de ella. Por ejemplo, la acumulación de proteínas virales de cobertura en las células vegetales transformadas confiere resistencia al desarrollo de la infección viral y/o de la enfermedad efectuado por el virus del que se deriva el gen de la proteína de la cubierta, así como por virus relacionados. La resistencia mediada por la proteína de cobertura ha sido conferida en plantas transformadas contra el virus del mosaico de la alfalfa, el virus del mosaico del pepino, el virus del estriado del tabaco, el virus K de la patata, el virus Y de la patata, el virus etch del tabaco, el virus del cascabeleo del tabaco y el virus del mosaico del tabaco. Véase, por ejemplo, Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28: 451.
(O) Un anticuerpo específico de insecto o una inmunotoxina derivada del mismo. Por lo tanto, un anticuerpo dirigido a una función metabólica crítica en el intestino del insecto inactivaría una enzima afectada, matando al insecto. Por ejemplo, Taylor et al. (1994) Abstract n° 497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions, muestra la inactivación enzimática en tabaco transgénico a través de la producción de fragmentos de anticuerpo de cadena única.
(P) Un anticuerpo específico contra el virus. Véase, por ejemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature 266 : 469, que demuestra que las plantas transgénicas que expresan genes de anticuerpos recombinantes están protegidas del ataque de virus.
(Q) Una proteína que detiene el desarrollo productivo en la naturaleza por un patógeno o un parásito. Así pues, las endo a-1,4-D poligalacturonasas fúngicas facilitan la colonización fúngica y la liberación de las plantas solubilizando la homo-a-1,4-D-galacturonase de la pared celular de las plantas (Lamb et al., 1992) Bio/Technology 10: 1436. La clonación y caracterización de un gen que codifica una proteína que inhibe la endopoligalacturonasa del frijol se describe en Toubart et al. (1992 Plant J. 2: 367).
(R) Una proteína que detiene el desarrollo producida en la naturaleza por una planta, como el gen de inactivación de los ribosomas de la cebada, que proporciona una mayor resistencia a la enfermedad fúngica (Longemann et al., 1992). Bio/Tecnology 10: 3305.
(S) Interferencia de ARN, en la que se utiliza una molécula de ARN para inhibir la expresión de un gen diana. Una molécula de ARN en un ejemplo es parcial o totalmente bicatenaria, lo cual desencadena una respuesta de silenciamiento, con el resultado de la escisión del ARNbc en pequeños ARN de interferencia, que luego se incorporan en un complejo de direccionamiento que destruye los ARNm homólogos. Véanse, por ejemplo, Fire et al., patente de Estados Unidos 6.506.559; Graham et al. 6.573.099.
Genes que confieren resistencia a un herbicida.
(A) Genes que codifican resistencia o tolerancia a un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o meristema, tal como un herbicida de imidazalinona, sulfonanilida o sulfonilurea. Los genes ejemplares en esta categoría codifican una enzima ALS mutante (Lee et al., 1988 EMBO J. 7: 1241), que también se conoce como enzima AHAS (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80: 449).
(B) Uno o más genes adicionales que codifican la resistencia o la tolerancia al glifosato, impartidos por los genes mutantes de la EPSP sintasa y aroA, o por inactivación metabólica por genes como el GAT (glifosato acetiltransferasa) o GOX (glifosato oxidasa) y otros compuestos fosfono como glufosinato (genes pat y bar; DSM-2), y ácidos ariloxifenoxipropiónicos y ciclohexanodionas (genes que codifican inhibidores de la ACCasa). Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 4.940.835, que describe la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSP que puede conferir resistencia al glifosato. Se puede obtener una molécula de ADN que codifica un gen aroA mutante bajo el número de registro ATCC 39256, y la secuencia de nucleótidos del gen mutante se describe en la patente de EE. UU. n° 4,769.061. La solicitud de patente europea n° 0333033 y la patente de EE.UU. n° 4.975.374 describen secuencias de nucleótidos de genes de la glutamina sintetasa que confieren resistencia a herbicidas tales como L-fosfinotricina. La secuencia de nucleótidos de un gen de fosfinotricinacetiltransferasa se proporciona en la solicitud europea n° 0 242 246. De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61 describe la producción de plantas transgénicas que expresan genes bar quiméricos que codifican la actividad de la fosfinotricina acetil transferasa. Ejemplos de genes que confieren resistencia a los ácidos ariloxifenoxipropiónicos y a las ciclohexanodionas, tales como setoxidim y haloxifop, son los genes Accl-S1, Accl-S2 y Accl-S3 descritos por Marshall et al. (1992) Theor. Apl. Genet. 83: 435.
(C) Genes que codifican resistencia o tolerancia a un herbicida que inhibe la fotosíntesis, como una triazina (genes psbA y gs+) y un benzonitrilo (gen de la nitrilasa). Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3: 169 describe el uso de plásmidos que codifican genes psbA mutantes para transformar Chlamydomonas. Las secuencias de nucleótidos para los genes de nitrilasa se describen en la patente de EE.UU. n° 4.810.648, y las moléculas de ADN que contienen estos genes están disponibles con los números de acceso de ATCC 53435, 67441 y 67442. La clonación y expresión de ADN que codifica una glutatión S-transferasa está descrita por Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285: 173.
(D) Genes que codifican resistencia o la tolerancia a un herbicida que se une a hidroxifenilpiruvato dioxigenasas (HPPD), enzimas que catalizan la reacción en la cual el para-hidroxifenilpiruvato (HPP) se transforma en homogentisato. Esto incluye herbicidas tales como los isoxazoles (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, patente de Estados Unidos n° 5.424.276), en particular isoxaflutol, que es un herbicida selectivo para el maíz, diketonitrilos (EP496630, EP496631), en particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3-fenil)propano-1,3-diona y 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-2,3-C^fenil) propano-1,3-diona, tricetonas (EP625505, EP625508, patente de Estados Unidos n° 5.506.195), en particular sulcotriona, y pirazolinatos. Un gen que produce una sobreabundancia de HPPD en plantas puede proporcionar tolerancia o resistencia a dichos herbicidas, incluyendo, por ejemplo, los genes descritos en las patentes de EE. UU. n° 6.268.549 y 6.245.968 y la Solicitud de Patente de EE. UU., Publicación n° 20030066102.
(E) Genes que codifican resistencia o tolerancia a los herbicidas de fenoxi auxina, como el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y que también pueden conferir resistencia o tolerancia a los herbicidas ariloxifenoxipropionato (AOPP). Los ejemplos de tales genes incluyen el gen de la enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (aad-1), descrito en la patente de Estados Unidos n° 7.838.733.
(F) Genes que codifican resistencia o tolerancia a herbicidas fenoxi auxina, como el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y que también pueden conferir resistencia o tolerancia a herbicidas de piridiloxi auxina, como fluroxipir o triclopir. Los ejemplos de dichos genes incluyen el gen de la enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (aad-12), descrito en el documento WO 2007/053482 A2.
(G) Genes que codifican resistencia o tolerancia a dicamba (véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos número 20030135879).
(H) Genes que proporcionan resistencia o tolerancia a los herbicidas que inhiben la protoporfirinógeno oxidasa (Pp O) (véase la patente de EE. UU. n° 5.767.373).
(I) Genes que proporcionan resistencia o tolerancia a los herbicidas de triazina (como la atrazina) y derivados de urea (como el diuron), herbicidas que se unen a las proteínas del núcleo de los centros de reacción del fotosistema II (PS II) (véase Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8 (4): 1237 - 1245.
Genes que confieren o contribuyen a un rasgo de valor añadido.
(A) Metabolismo de los ácidos grasos modificado, por ejemplo, transformando maíz o Brassica con un gen antisentido o estearoil-ACP desaturasa para aumentar el contenido de ácido esteárico de la planta (Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad Sci. USA 89: 2624.
(B) Disminución del contenido de fitato.
(1) La introducción de un gen que codifica fitasa, como el gen de la fitasa de Aspergillus niger (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127: 87), mejora la descomposición del fitato y agrega más fosfato libre a la planta transformada.
(2) Se podría introducir un gen que reduzca el contenido de fitato. En el maíz, esto podría lograrse, por ejemplo, mediante la clonación y luego reintroduciendo el ADN asociado con el alelo único que es responsable de los mutantes del maíz caracterizados por bajos niveles de ácido fítico (Raboy et al., 1990 Maydica 35: 383).
(C) Modificación de la composición de carbohidratos efectuada, por ejemplo, transformando plantas con un gen que codifica una enzima que altera el patrón de ramificación del almidón. Los ejemplos de dichas enzimas incluyen el gen de la fructosiltransferasa de Streptococcus mucus (Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170: 810, gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genet. 200: 220), a-amilasa de Bacillus licheniformis (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10: 292), genes de invertasa del tomate (Elliot et al., 1993), gen de amilasa de la cebada (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268: 22480), y enzima de ramificación de almidón de endospermo II del maíz (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102: 10450).
Se pueden emplear varios ensayos en relación con la molécula de ácido nucleico de ciertas realizaciones de la descripción. Las técnicas que siguen son útiles en diversas situaciones, y en una realización son útiles para detectar la presencia de la molécula de ácido nucleico y/o el polipéptido codificado en una célula vegetal. Por ejemplo, la presencia de la molécula se puede determinar de varias maneras, incluyendo el uso de un cebador o sonda de la secuencia, un ensayo ELISA para detectar la proteína codificada, una transferencia Western para detectar la proteína o una transferencia Northern o Southern para detectar ARN o ADN. Se pueden emplear ensayos enzimáticos para detectar la enzima DGT-28. Además, puede generarse un anticuerpo que puede detectar la presencia de la proteína DGT-28 usando procedimientos reconocidos en la técnica. También se pueden usar técnicas adicionales, como la hibridación in situ, la tinción enzimática y la inmunotinción, para detectar la presencia o la expresión de la construcción recombinante en órganos y tejidos vegetales específicos. Un transgén puede expresarse selectivamente en algunos tejidos de la planta o en algunas etapas de desarrollo, o el transgén puede expresarse en sustancialmente todos los tejidos de la planta, sustancialmente a lo largo de todo su ciclo de vida. Sin embargo, también es aplicable cualquier modo de expresión combinatoria.
El análisis de Southern es un método de detección usado comúnmente, en el que el ADN se corta con endonucleasas de restricción y se fracciona en un gel de agarosa para separar el ADN por peso molecular y luego se transfiere a las membranas de nailon. Luego se hibrida con el fragmento de la sonda que se marcó radiactivamente con 32P (u otros marcadores de sonda) y se lava en una solución de SDS.
Del mismo modo, el análisis de Northern despliega un protocolo similar, en el que el ARN se corta con endonucleasas de restricción y se fracciona en un gel de agarosa para separar el ARN por peso molecular y luego se transfiere a las membranas de nailon. Después se hibrida con el fragmento de sonda que fue marcada radiactivamente con 32P (u otros marcadores de sonda) y se lava en una solución de SDS. El análisis del ARN (p. ej., ARNm) aislado de los tejidos de interés puede indicar niveles de expresión relativos. Normalmente, si el ARNm está presente o si la cantidad de ARNm ha aumentado, se puede suponer que se está expresando el transgén correspondiente. El análisis Northern, u otros protocolos analíticos de ARNm, se puede usar para determinar los niveles de expresión de un transgén o gen nativo introducido.
En el análisis de Western, en vez de aislar el ADN/ARN, la proteína de interés se extrae y se coloca en un gel de acrilamida. La proteína se transfiere luego a una membrana y se pone en contacto con una sustancia marcadora. Véase, por ejemplo, Hood et al., "Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize: Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purificacion" Molecular Breeding 3: 291 - 306 (1997); Towbin et al. (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from poliacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications” Proc Natl Acad Sci USA 76 (9): 4350 - 4354; Renart et al. "Transfer of proteins from geles to diazobenciloximetil-paper and y detection with con antisera: a method for studying antibody especifity and antigen structure" Proc Natl Acad Sci USA 76 (7): 3116 - 3120.
Los ácidos nucleicos del presente texto, o segmentos de los mismos, pueden usarse para diseñar cebadores para amplificación por PCR. Al realizar la amplificación por PCR, se puede tolerar un cierto grado de desajuste entre el cebador y la plantilla. Se pueden producir mutaciones, inserciones y deleciones en un cebador dado por métodos conocidos por un experto en la técnica.
Otro ejemplo del método de detección es la técnica de pirosecuenciación que describe Winge (Innov. Pharma. Tech.
00: 18 - 24, 2000). En este método, se diseña un oligonucleótido que se solapa con el ADN genómico adyacente e inserta la unión del ADN. El oligonucleótido se hibrida con un producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia genómica flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5'-fosfosulfato y luciferina. Los DNTPs se añaden individualmente y la incorporación da como resultado una señal luminosa que se mide. Una señal luminosa indica la presencia de la secuencia de inserto/flanqueo de transgenes debido a una amplificación, hibridación y extensión simple o de múltiples bases con éxito.
Se han descrito balizas moleculares para su uso en la detección de secuencias. Brevemente, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que solapa la unión genómica flanqueante e inserto ADN. La estructura única de la sonda FRET hace que contenga una estructura secundaria que mantiene en estrecha proximidad los restos fluorescentes y de apagado. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN del inserto y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTPs. Después de la exitosa amplificación por PCR, la hibridación de la sonda o las sondas de FRET con la secuencia diana da como resultado la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de los restos fluorescentes y de apagado. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia del inserto genómico/transgénico flanqueante debido a la amplificación e hibridación con éxito.
El ensayo de sonda de hidrólisis, conocido también como TAQMAN® (Life Technologies, Foster City, Calif.), es un método para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN. Brevemente, una sonda oligonucleotídica FRET está diseñada con un oligo dentro del transgén y uno en la secuencia genómica de flanqueo para la detección específica de un evento. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN del inserto y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridación de la sonda FRET tiene por resultado la escisión y la liberación del resto fluorescente que se aleja del resto de apagado en la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia del inserto flanqueante/transgénico debido a la amplificación e hibridación con éxito.
El ELISA o el inmunoensayo ligado a enzimas se conoce desde 1971. En general, los antígenos solubilizados en un tampón se aplican como recubrimiento sobre una superficie de plástico. Cuando se agrega suero, los anticuerpos pueden adherirse al antígeno en la fase sólida. La presencia o ausencia de estos anticuerpos puede demostrarse cuando se conjugan con una enzima. La adición del sustrato apropiado detectará la cantidad de conjugado unido que se puede cuantificar. Un ensayo ELISA común es un ensayo que utiliza anticuerpos policlonales anti-(proteína) biotinilados y un conjugado de fosfatasa alcalina. Por ejemplo, un ELISA utilizado para la determinación cuantitativa de los niveles de enzima lacasa puede ser un ensayo tipo sándwich de anticuerpos, que utiliza anticuerpos policlonales de conejo obtenidos comercialmente. El anticuerpo se conjuga con fosfatasas alcalinas para su detección. En otro ejemplo, un ensayo ELISA para detectar tripsina o tripsinógeno utiliza anticuerpos policlonales anti-tripsina o antitripsinógeno biotinilados y un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina.
Ciertas realizaciones se refieren a procesos para realizar cruces usando una planta de una realización de esta descripción como al menos un padre. Por ejemplo, realizaciones particulares se refieren a una planta híbrida F1 que tiene como uno o ambos progenitores cualquiera de las plantas ejemplificadas en el presente documento. Otras realizaciones se refieren a semillas producidas por tales híbridos Fi. Otras realizaciones más se relacionan con un método para producir una semilla híbrida Fi cruzando una planta ejemplificada con una planta diferente (p. ej., progenie consanguínea) y cosechando la semilla híbrida resultante. Otras realizaciones se relacionan con una planta ejemplificada que es un progenitor femenino o un progenitor masculino. Las características de las plantas resultantes pueden mejorarse mediante una cuidadosa consideración de las plantas parentales.
V. Tolerancia al glifosato mediada por DGT- 28.
La invención se define en las reivindicaciones. Los polipéptidos que tienen al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 1 pueden tener actividad enzimática de EPSPS. Así pues, los polipéptidos que tienen al menos un 90% de identidad con la SEC ID NO: 1, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene al menos un 90% de identidad con la SEC ID NO: 1 (por ejemplo, las SEC ID NO: 2-4) y un ácido nucleico que se hibrida con un ácido nucleico que tiene la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 3 en condiciones de alto rigor, pueden usarse en algunas realizaciones para conferir tolerancia al glifosato a una célula u organismo (por ejemplo, una planta o célula vegetal). Proporcionar una planta o una célula vegetal que sea resistente a las formulaciones de herbicidas de glifosato puede ser útil en diversas aplicaciones, en las que las células vegetales que tienen tal resistencia pueden tolerar la exposición a una cantidad suficiente de glifosato que se usa para controlar al menos algunas malezas en un área bajo cultivo.
El glifosato, una composición que comprende N-(fosfonometil) glicina, es un componente ampliamente utilizado en herbicidas. El glifosato se formula típicamente como una sal en un concentrado líquido acuoso, un concentrado sólido, una emulsión o una microemulsión. El glifosato se puede aplicar sobre la parte superior de las plantas desde la emergencia a lo largo de las distintas fases del desarrollo de la planta.
Las variedades de plantas tolerantes al glifosato utilizadas en combinación con formulaciones herbicidas de glifosato se han convertido en el programa estándar para la gestión de malezas en la producción de cultivos en los Estados Unidos y en todo el mundo. La principal ventaja para los cultivadores al usar un rasgo de tolerancia al glifosato es que permite la aplicación simple y cómoda de glifosato; un amplio espectro, herbicida de post-emergencia, para el control de plantas y hierbas no deseadas (es decir, "malezas") con una excelente seguridad de los cultivos y menor dependencia de las aplicaciones de herbicidas pre-plantas. Otras ventajas incluyen un mejor ajuste en sistemas de no-labranza y de labranza reducida. Los cultivos tolerantes al glifosato han ampliado las opciones para la gestión de malezas y han hecho mucho más fácil, menos costosa y más flexible la práctica del control de las malezas. Los productores han referido que realizan menos viajes a través de los campos para aplicar herbicidas, así como que realizan menos viajes de cultivo, lo que ahorra combustible y reduce la erosión del suelo. Los cultivos tolerantes al glifosato, por tanto, reducen los riesgos ambientales que plantean los herbicidas, al tiempo que aumentan la eficacia del necesario control químico de las malezas.
Se puede aplicar una composición de glifosato a las plantas a una tasa de aplicación suficiente para obtener los resultados biológicos deseados, por ejemplo la represión del crecimiento de las malezas sin afectar significativamente a las plantas de cultivo tolerantes al glifosato. Estas tasas de aplicación generalmente se expresan como la cantidad de glifosato por unidad de área tratada, por ejemplo, gramos por hectárea (g/ha). Lo que constituye un "efecto significativo" varía de acuerdo con los estándares y la práctica de quienes investigan, desarrollan, comercializan y utilizan composiciones, y la selección de tasas de aplicación que son significativamente efectivas para una composición está dentro de los conocimientos de los expertos en la materia.
En ciertos ejemplos, la cantidad de la composición de glifosato aplicada por unidad de área para dar un 85% de control de una especie de maleza medida por reducción del crecimiento o mortalidad, se usa para definir una tasa de aplicación. La selección de un número de tasas de aplicación de herbicida de glifosato suficientes para controlar las malezas en un área de cultivo está dentro de la experiencia de un profesional agrícola ordinario. Los expertos en la materia reconocerán igualmente que las condiciones individuales de la planta, el clima y las condiciones de crecimiento, así como los ingredientes activos específicos y su relación en peso en la composición, pueden influir en el grado de eficacia herbicida en una aplicación particular.
En general, se puede aplicar una composición acuosa de glifosato a los tejidos foliares de las plantas para matar o controlar el crecimiento de una gran variedad de plantas no deseadas, incluidas las especies de hierba anual y perenne y de malezas de hoja ancha, aplicándose a los tejidos foliares de las plantas composiciones acuosas de glifosato. La cantidad relativa de glifosato presente en una composición herbicida contemplada (por ejemplo, un concentrado sólido en partículas, un concentrado líquido, una composición lista para usar y una composición de mezcla en tanque) puede variar dependiendo de muchos factores entre los que se incluyen, por ejemplo, las especies de malezas a controlar y el método de aplicación. En términos generales, sin embargo, la concentración de glifosato y, opcionalmente, de un agente tensioactivo y/o algún otro coadyuvante o aditivo (como se describe en otra parte de este documento) en la composición herbicida, son suficientes para controlar las malezas dentro de un área de cultivo.
Una composición de pulverización herbicida se puede aplicar como una solución o una dispersión acuosa, bien sea que la composición se fabrique lista para su aplicación, o bien como resultado de la dilución adicional de un concentrado de glifosato líquido o la adición de agua a un concentrado de glifosato sólido en partículas. Sin embargo, el término "acuoso", como se usa en el presente documento, incluye composiciones que comprenden una pequeña cantidad de disolvente no acuoso, siempre que el disolvente predominante presente sea agua. Las composiciones de aerosol no herbicidas se pueden aplicar al follaje de las plantas a tratar a través de cualquiera de los métodos apropiados que son bien conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo las técnicas de aplicación aérea y de aplicación terrestre (por ejemplo una barra pulverizadora, un pulverizador manual y un aplicador de impregnación).
En algunos ejemplos, se formula una composición de concentrado líquido para incluir glifosato en una concentración de al menos aproximadamente 50 gramos, al menos aproximadamente 75 gramos, o al menos aproximadamente 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250. 275, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690 o 700 gramos (equivalente de ácido o a.e.: acid equivalent)) por litro, o más. El margen de concentración de glifosato puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 50 a aproximadamente 680 gramos (a.e.) por litro (gpl), de aproximadamente 100 a aproximadamente 600 gpl, de aproximadamente 250 a aproximadamente 600 gpl y de aproximadamente 360 a aproximadamente 540 gpl.
Cuando se expresa como porcentaje en peso basado en el peso total del concentrado de glifosato, un concentrado líquido puede comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente el 10% en peso de glifosato (a.e.), al menos aproximadamente el 15% en peso, y al menos aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, o 68% en peso, o más. El margen de concentración de glifosato puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 10% en peso a aproximadamente 70% en peso a.e.), de aproximadamente 20% en peso a aproximadamente 68% en peso, o de aproximadamente 25% en peso a aproximadamente 45% en peso.
Si el glifosato se aplica como una composición lista para usar, la concentración de glifosato puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1% en peso a aproximadamente 3% en peso a.e., y de aproximadamente 1% en peso a aproximadamente 2% en peso.
Las composiciones para pulverización pueden formularse para la aplicación de, por ejemplo, al menos aproximadamente 1 galón de composición de pulverización por acre, al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 galones por acre, y más. El volumen de rociado de la composición para pulverización puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 1 galón a aproximadamente 100 galones por acre, de aproximadamente 2 galones a aproximadamente 40 galones por acre, y de aproximadamente 2 galones a aproximadamente 5 galones por acre para una aplicación aérea, y de aproximadamente 5 galones a aproximadamente 20 galones por acre para una aplicación terrestre.
En general, puede emplearse una formulación de concentrado líquido que tiene una fase acuosa en la que el glifosato está presente predominantemente en forma de sal, y una fase no acuosa que contiene opcionalmente un segundo ingrediente herbicida activo que es relativamente insoluble en agua. Dichas formulaciones pueden incluir, por ejemplo, emulsiones (incluidas macroemulsiones y microemulsiones, agua en aceite, aceite en agua y agua en aceite en agua), suspensiones y suspoemulsiones. La fase no acuosa puede comprender en ciertos casos un componente microencapsulado (por ejemplo, un herbicida microencapsulado). En formulaciones que tienen una fase no acuosa, la concentración de glifosato a.e. en la composición como un todo puede, sin embargo, estar dentro de los márgenes ejemplares particulares citados aquí para formulaciones concentradas acuosas.
Las formas de sal adecuadas de glifosato que se pueden usar de acuerdo con cualquiera de las formulaciones incluyen, por ejemplo, sales de metales alcalinos, por ejemplo sales de sodio y potasio, sales de amonio, sales de di­ amonio tales como dimetilamonio, sales de alquilamina, por ejemplo sales de dimetilamina e isopropilamina, sales de alcanolamina, por ejemplo sales de etanolamina, sales de alquilsulfonio, por ejemplo sales de trimetilsulfonio, sales de sulfoxonio, y mezclas o combinaciones de las mismas. Los ejemplos de formulaciones comerciales de glifosato incluyen, sin restricción: GLYPHOMAX™, GLYPHOMAX™ XRT, GLYPHOMAX™ PLUS, DURANGO™, ROUNDUP™ ULTRA, ROUNDUP™ ULTRAMAK, ROUNDUP™ CT, ROUNDUP™ EXTRA, ROUNDUP™ BIOACTIVE, ROUNDUP™ BIOFORCE™, POLARIS™ , SPARK™, ACCORD™ SP, ACCORD™ XRT y ACCORD™ CONCENTRATE, todos los cuales contienen glifosato como su sal de isopropilamonio (IPA); ROUNDUP™ DRY y RIVAL™, que contienen glifosato como su sal de amonio; ROUNDUP™ GEOf Or CE, una formulación de glifosato de sodio; TOUCHDOWN™, una formulación de sal de glifosato trimesio, TOUCHDOWN™ IQ, una formulación de glifosato diamonio, TOUCHDOWN™ TOTAL IQ, una formulación de glifosato de potasio y ROUNDUP™ WEATHERMAX, una formulación de glifosato de potasio. Las formulaciones de glifosato pueden incluir agentes de protección, agentes tensioactivos y/o adyuvantes.
Si se desea, el usuario puede mezclar uno o más coadyuvantes con una composición de glifosato y el agua de dilución cuando se prepara una formulación para su aplicación. Dichos coadyuvantes pueden incluir agente tensioactivo adicional y/o una sal inorgánica (por ejemplo, sulfato de amonio) con el objetivo de mejorar aún más la eficacia herbicida.
Si se desea, el usuario puede también emplear protectores apropiados en una formulación de glifosato para una mayor protección de las plantas y/o para añadir resistencia cruzada a más herbicidas. Los protectores son agentes químicos que reducen la fitotoxicidad de los herbicidas a las plantas de cultivo por un mecanismo fisiológico o molecular, sin comprometer la eficacia de la represión de las malezas. Los protectores generalmente actúan aumentando el sistema inmunológico de una planta activando/expresando la cP450. Los protectores ejemplares incluyen, por ejemplo, y sin limitación: benoxacor, cloquintocet, ciometrinil, diclormid, diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, flurazol, fluxofenim, furilazol, isoxadifen, mefenpir, mefenato, anhídrido Itálico y oxabetrinil.
Pueden usarse protectores para la protección de cultivos de gramíneas de semillas grandes, por ejemplo, y sin ser limitante, maíz, sorgo en grano y arroz húmedo, contra los herbicidas incorporados en pre-siembras o aplicados en pre-emergencia de las familias de tiocarbamato y cloroacetanilida. Los protectores también se han desarrollado para proteger los cultivos de cereales de invierno como el trigo contra las aplicaciones en post-emergencia de los herbicidas de ariloxifenoxipropionato y sulfonilurea. El uso de protectores para la protección del maíz y el arroz contra la sulfonilurea, imidazolinona, ciclohexanediona, isoxazol y tricetona también está bien establecido.
Los activadores de plantas (una nueva clase de compuestos que protegen a las plantas activando sus mecanismos de defensa) también se pueden usar en las realizaciones en la presente invención. Los activadores de plantas ejemplares incluyen acibenzolar y probenazol.
Las realizaciones de la presente invención se definen adicionalmente en los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos se dan solo a título de ilustración. Partiendo de la discusión anterior y de estos ejemplos, un experto en la técnica puede comprobar las características esenciales de esta invención, y puede realizar diversos cambios y modificaciones de las realizaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones. Por lo tanto, diversas modificaciones de las realizaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en este documento, serán evidentes para los expertos en la técnica partiendo de la descripción anterior. Se entiende también que dichas modificaciones caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Lo que sigue se proporciona a modo de ilustración y no pretende limitar el alcance de la invención.
Ejemplos.
Ejemplo 1: Materiales y Métodos.
Las realizaciones de la presente descripción se exponen con más detalle en los ejemplos que siguen, que se ofrecen a título de ilustración y en modo alguno pretenden limitar la invención.
Una única mutación de aminoácido (G96A) en la enzima 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintasa de Escherichia coli (EPSP sintasa) puede tener como resultado una insensibilidad al glifosato (Padgette y otros, (1991); Eschenburg et al., (2002); Priestman et al., (2005); Haghani et al., (2008)). Aunque esta mutación confiere tolerancia al glifosato, también se sabe que afecta negativamente a la unión de la EPSP sintasa con su sustrato natural, fosfoenolpiruvato (PEP). El cambio resultante en la eficiencia de unión al sustrato puede hacer que una enzima mutada sea inadecuada para proporcionar tolerancia in planta al glifosato.
La base de datos NCBI Genbank se barrió in silico en relación con la proteína EPSP sintasa y secuencias de polinucleótidos que contienen naturalmente una alanina en una posición análoga dentro de la enzima EPSP sintasa, a la de la mutación G96A que se introdujo en la versión de E. coli de la enzima (Padgette et al., (1991); Eschenburg et al., (2002); Priestman et al., (2005); Haghani et al., (2008)).
Una enzima en la que se identificó que contenía una alanina natural en esta posición fue DGT-28 (GENBANK ACC NO: ZP_06917240.1) de Streptomyces sviceus ATCC29083. Además, la extracción de datos in silico reveló otras tres enzimas de Streptomyces únicas con mayor homología con DGT-28; DGT-31 (GENBANK ACC NO: YP_004922608.1); DGT-32 (GENBANK ACC NO: ZP_04696613); y DGT-33 (GENBANK ACC NO: NC_010572). Cada una de estas enzimas contiene una alanina natural en una posición análoga dentro de la enzima EPSP sintasa como la de la mutación G96A que se introdujo en la versión de E. coli de la enzima. FIG. 1.
Dado que las proteínas de la EPSP sintasa de diferentes organismos tienen diferentes longitudes, la numeración de la mutación para la versión de E. coli de la enzima EPSP sintasa no se corresponde necesariamente con la numeración de la mutación para las enzimas de la EPSP sintasa de los otros organismos. Estas enzimas de la EPSP sintasa identificadas no se caracterizaron previamente con respecto a la tolerancia al glifosato o a la afinidad del sustrato PEP. Además, estas enzimas de la EPSP sintasa representan una nueva clase de enzimas de la EPSP sintasa y no contienen ningún motivo de secuencia que se haya utilizado para caracterizar la Clase I anteriormente descrita (secuencias derivadas de plantas descritas con más detalle en la patente de EE. UU. No. RE39247), Clase II (secuencias derivadas de bacterias descritas con más detalle en la Patente de EE.UU. N° RE39247), y Clase III (secuencias derivadas de bacterias descritas adicionalmente en la Solicitud de Patente Internacional WO 2006/110586) de enzimas EPSP sintasa.
Las nuevas enzimas DGT-28, DGT-31, DGT-32 y DGT-33 se caracterizaron por la tolerancia al glifosato y la afinidad del sustrato de PEP en comparación con las enzimas EPSP sintasa de la Clase I. Las siguientes enzimas de Clase I: DGT-1 de Glycine max, d Gt -3 de Brassica napus (GENBANK ACC NO: P17688) y DGT-7 de Triticum aestivum (GENBANK ACC NO: EU977181) fueron para comparación. Se sintetizaron y evaluaron las enzimas EPSP sintasas de Clase I y sus variantes mutantes. Una mutación introducida en las enzimas de la EPSP sintasa de la planta consistió en la mutación de glicina a alanina hecha dentro de la enzima de la EPSP sintasa en una localización similar a la de la mutación G96A de la versión de E. coli de la enzima. Además, se introdujeron mutaciones de treonina a isoleucina y de prolina a serina dentro de estas enzimas EPSP sintasa de Clase I en posiciones análogas a las del aminoácido 97 (T a I) y el aminoácido 101 (P a S) en la EPSP sintasa de E. coli como se describe en Funke et al., (2009).
La FIG. 1 representa una alineación de secuencia parcial de DGT-28, DGT-31, DGT-32 y DGT-33 con otras enzimas de la EPSP sintasa. Las cuatro enzimas DGT comparten una alanina conservada en la posición 96 de aminoácido de la enzima aroA EPSP sintasa. La localización de este aminoácido se indica con un asterisco, y el resto del aminoácido está subrayado.
La FIG. 2 muestra una alineación de las enzimas DGT-1, DGT-3 y DGT-7. La localización del resto de aminoácido que se mutó de glicina a alanina se indica con el primer asterisco. La localización del resto de aminoácido que mutó de treonina a isoleucina se indica mediante el segundo asterisco. La localización del tercer resto de aminoácido que mutó de prolina a serina se indica con el tercer asterisco. Estas mutaciones se introdujeron en diferentes versiones de DGT-1, DGT-3 y DGT-7. Las distintas versiones (v1, v2, v3 ... vN) de los genes que contienen las mutaciones se describen con más detalle a continuación.
Ejemplo 2: Optimización de la secuencia para la expresión en plantas y bacterias.
Optimización de la planta. El sesgo de codón para dicotiledóneas y monocotiledóneas (maíz) se calculó como la frecuencia con la que se usa un solo codón en relación con los codones para todos los aminoácidos. Tabla 1. Alternativamente, el sesgo del codón se puede calcular como la frecuencia con la que se usa un solo codón para codificar un aminoácido particular, en relación con todos los demás codones para ese aminoácido (codones sinónimos). Al diseñar las regiones de codificación para la expresión en la planta, se determinaron los codones primarios ("primera elección") preferidos por la planta, así como la segunda, tercera, cuarta, etc. selecciones de codones preferidos cuando existían múltiples opciones.
El análisis de la secuencia codificadora de DGT-28 de S. sviceus reveló la presencia de varios motivos de secuencia que se creía que eran perjudiciales para la expresión óptima de la planta, así como una composición de codón no óptima para la expresión en plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas.
Tabla 1. Representación de codón sinónimo de las regiones codificadoras de los genes de plantas monocotiledóneas (maíz %) y dicotiledóneas (dicot %) se muestran en las columnas D, E, I y J. Los valores para un conjunto de representación del codón equilibrado-sesgado para un diseño del gen sintético optimizado para la planta, están en las columnas C y H.
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Para diseñar los genes optimizados para la planta que codifican una proteína DGT-28, se diseñaron secuencias de ADN para codificar las secuencias de aminoácidos, utilizando un código genético redundante establecido a partir de la tabla de sesgo de codones compilada a partir de las secuencias codificadoras de proteínas para las plantas hospedadoras en particular. En la Tabla 1, las Columnas D y I presentan las distribuciones (en % del uso para todos los codones para ese aminoácido) de codones sinónimos para cada aminoácido, como se encuentra en las regiones codificadoras de plantas monocotiledóneas (maíz). Las columnas E y J presentan las distribuciones (en % del uso para todos los codones para ese aminoácido) de codones sinónimos para cada aminoácido, como se encuentra en las regiones codificadoras de las plantas dicotiledóneas. Algunos codones sinónimos para algunos aminoácidos se encuentran tan solo raramente en genes de plantas (por ejemplo, CGG). Generalmente, se consideró que un codón se usaba raras veces si está representado en aproximadamente el 10% o menos del tiempo para codificar el aminoácido relevante en genes de un tipo de planta cualquiera (indicado por DNU en las Columnas C y H de la Tabla 1). Para equilibrar la distribución de las opciones de codón restantes para un aminoácido, se calculó una representación del promedio ponderado para cada codón, utilizando la fórmula:
Promedio ponderado % de C1 = 1/(%C1 %C2 %C3 etc.) x %CI x I00.
( 1)
donde C1 es el codón en cuestión, y % C2, % C3, etc. representan los promedios de los valores en % para las dicotiledóneas de codones sinónimos remanentes (los valores de % medio para los codones relevantes se toman de las Columnas C y H) de la Tabla 1.
El valor del % del promedio ponderado para cada codón se da en las columnas C y H de la Tabla 1.
Usando el procedimiento anterior, se diseñó una nueva secuencia de ADN que codifica esencialmente la secuencia de aminoácidos de la proteína DGT-28 para una expresión óptima en plantas dicotiledóneas, utilizando una distribución de codones equilibrada de los codones utilizados frecuentemente encontrados en los genes de plantas dicotiledóneas. Se diseñó una segunda secuencia de ADN que codifica esencialmente la secuencia de aminoácidos de la proteína DGT-28 para una expresión óptima en plantas monocotiledóneas, utilizando una distribución de codones equilibrada de codones utilizados frecuentemente encontrados en los genes de plantas monocotiledóneas. Las dos nuevas secuencias de ADN diferían de las secuencias de ADN originales que codifican dgt-28 por la sustitución de codones de la planta (primero preferido, segundo preferido, tercero preferido o cuarto preferido) para especificar el aminoácido apropiado en cada posición dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína.
El diseño de las secuencias de ADN optimizadas para la planta se inició mediante la traducción inversa de las secuencias de proteínas de la secuencia de proteína DGT-28 (número de registro de Genbank: ZP_06917240.1). La SEC ID NO: 1 fue traducida inversamente utilizando una tabla de sesgos de codones de dicotiledóneas, construida a partir de la Tabla 1; Columnas E y J. Se completó una segunda traducción inversa de la SEC ID NO: 1 utilizando una tabla de sesgos de codones de monocotiledóneas construida a partir de la Tabla 1; Columnas D e I.
Las secuencias de traducción inversa inicial se modificaron después compensando los cambios del codón (reteniendo al mismo tiempo la representación del codón del promedio ponderado general) para eliminar o agregar sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, eliminar estructuras secundarias intracatenarias altamente estables y eliminar otras secuencias que podrían ser perjudiciales para manipulaciones de clonación o expresión del gen manipulado en plantas. La secuencia de ADN se analizó de nuevo para determinar los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que podrían haber sido creados por las modificaciones. Los sitios identificados se modificaron más reemplazando los codones relevantes con los codones preferidos de primera, segunda, tercera o cuarta opción. Otros sitios en las secuencias que podrían afectar a la transcripción o a la traducción del gen de interés incluyen las uniones exón:intrón (5' o 3'), señales de adición de poliA y señales de terminación de ARN polimerasa. Las secuencias modificadas se analizaron y modificaron aún más para reducir la frecuencia de los dobletes TA o CG, y para aumentar la frecuencia de los dobletes TG o CT. Además de estos dobletes, los bloques de secuencia que tienen más de aproximadamente seis restos consecutivos de [G C] o [A T] pueden afectar a la transcripción o la traducción de la secuencia. Por tanto, estos bloques de secuencias también se modificaron reemplazando los codones de primera o segunda opción, etc., con otros codones de elección preferidos. Los codones utilizados raras veces no se incluyeron en un grado sustancial en el diseño del gen, siendo utilizados solamente cuando fue necesario para acomodar un criterio de diseño diferente al de la composición del codón, per se (por ejemplo, la adición o el borrado de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción).
La secuencia de polinucleótidos dgt-28 v5 optimizada para plantas dicotiledóneas de nuevo diseño está listada en la SEC ID NO: 2. La secuencia de polinucleótidos dgt-28 v6 optimizada para plantas monocotiledóneas de nuevo diseño está listada en la SEC ID NO: 3; esta secuencia se modificó ligeramente incluyendo una alanina en la segunda posición del aminoácido para introducir un sitio de enzima de restricción. Las secuencias de ADN resultantes tienen un mayor grado de diversidad de codones, una composición de bases deseable, contiene sitios de reconocimiento de enzimas de restricción puestos estratégicamente y carece de secuencias que podrían interferir con la transcripción del gen o la traducción del ARNm producto.
La síntesis de fragmentos de ADN que comprenden SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 que contienen secuencias adicionales, tales como paradas de 6 marcos (los codones de parada ubicados en los seis marcos de lectura que se añaden al extremo 3' de la secuencia de codificación), y un sitio de restricción 5' para la clonación se realizó por proveedores comerciales (DNA2.0, Menlo Park, CA). La molécula de ácido nucleico sintético se clonó entonces en vectores de expresión y se transformó en plantas o bacterias como se describe en los ejemplos que siguen.
Se usaron estrategias de optimización de codones similares para diseñar dgt-1, dgt-3 v2 (G173A), dgt-3 v3 (G173A; P178S), dgt-3 v4 (T174I; P178S), dgt-7 v4 (T168I; P172S), dgt-32 v3, dgt-33 v3 y dgt-33 v3. La versión de codón optimizado de estos genes se enumeran como SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO: 144, respectivamente.
Optimización bacteriana. Se diseñó una nueva secuencia de ADN que codifica la proteína DGT-28 de la SEC ID NO: 1 que está optimizada para la expresión en células de Escherichia coli. El diseño de la secuencia de ADN optimizada para E. coli se inició mediante la traducción inversa de la secuencia de proteína de la SEC ID NO: 1, utilizando un protocolo de optimización de codones registrado de GeneArt (Regensburg, Alemania). La secuencia inicial se modificó mediante la compensación de los cambios de codón (al tiempo que se retuvo la representación del promedio ponderado global) para eliminar o añadir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, y eliminar estructuras secundarias intracatenarias altamente estables y otras secuencias que podrían ser perjudiciales para las clonaciones o la expresión del gen modificado por ingeniería genética. Un ejemplo de tal secuencia perjudicial a evitar dentro de una región codificadora es una secuencia de unión a ARN ribosomal 16S ("secuencia Shine-Dalgarno") tal como AGGAGG, que podría codificar, por ejemplo, dos aminoácidos arginina consecutivos, pero que también podría servir como señal de iniciación de la traducción intragénica (y por lo tanto indeseable). La secuencia de ADN dgt-28 sesgada por E. coli (dgt-28 v1) que codifica la proteína de Se Q ID NO: 1 se da como SEQ ID NO: 4.
Para facilitar la clonación y asegurar el inicio eficiente de la traducción, se puso una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción Ndel 5' terminal aguas arriba del codón de inicio de la traducción ATG. También parafacilitar la clonación, y para asegurar una terminación de la traducción adecuada, se incluyeron bases que codifican dos codones de parada de la traducción de TAA y un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xhol en el extremo 3' de la región de codificación. La síntesis de un fragmento de ADN que comprende la SEC ID NO: 4 fue realizada por el proveedor comercial GeneArt™.
Se usaron estrategias similares de optimización de codones de E. coli para diseñar dgt-1 v5, dgt-1 v6 (G112A), dgt-1 v7 (G112A; P117S), dgt-1 v8 (T113I; P117S), dgt-3 v6 (G105A), dgt-3 v7 (G105A; P112S), dgt-3 v8 (T106I; P112S), dgt-7 v5, dgt-7 v6 (G113A), dgt-7 v7 (G113A; P117S), dgt-7 v8 (T114I; P117S), dgt-32 v5 y dgt-33 v5. Las versiones de secuencia dgt-1, dgt-3 y dgt-7 se modificaron mediante la eliminación de la secuencia de direccionamiento del cloroplasto. La versión de codones optimizados de E. coli de estos genes se enumeran como SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23 y SEC ID NO: 24, respectivamente.
Ejemplo 3: Vectores para la expresión bacteriana de genes de la tolerancia al glifosato.
Construcción del vector de expresión pET, dgt-28 para la expresión en E. coli. Para pruebas in vitro, la secuencia de genes optimizada de E. coli dgt-28 v1 (SEC ID NO: 4) fue sintetizada y clonada por GeneArt™ para la síntesis y la clonación. La secuencia del gen dgt-28 v1 sintetizada se clonó en el vector de expresión pET28 a través de los sitios de restricción Nde I y Xho I añadidos. La construcción resultante introdujo una etiqueta 6X His N-terminal y se marcó como pDAB100445. FIG. 14.
Mutagénesis dirigida al sitio de dgt-28 v1. La mutagénesis dirigida al sitio se llevó a cabo en dgt-28 v1 para establecer el papel de la alanina en la posición 84 para proporcionar tolerancia al glifosato. Esta alanina natural se mutó a glicina para determinar si el cambio reduciría la tolerancia de la enzima al glifosato o afinidad por PEP. Se seleccionó este resto de aminoácido, ya que corresponde con la mutación G96A que se introdujo en la EPSP sintasa de E. coli como se describió anteriormente.
Se utilizó el kit Quick Change II™ de Stratagene™ (Santa Clara, CA) para realizar la mutagénesis. Las reacciones de PCR se establecieron de acuerdo con el protocolo QuickChange™ utilizando pDAB100445 (dgt-28 v1) como ADN de plantilla. El constructo que contiene la secuencia del gen dgt-28 v2 mutado se designó pDAB102946 (FIG. 15) y se confirmó mediante secuenciación del ADN. Los siguientes cebadores fueron diseñados para hacer el cambio de aminoácido:
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Se llevó a cabo una segunda ronda de mutagénesis en dgt-28 v2 en un intento de disminuir más su tolerancia al glifosato. Una segunda mutación, T172A, fue introducida en el dgt-28 v2 ya mutagenizado. La mutación recíproca de alanina a treonina de EPSP sintasa en esta posición fue descrita previamente en Haghani et al., (2008), en donde resultó insensibilidad al glifosato. El resultado final fue la producción de un doble mutante A84G, T172A que fue designado como dgt-28 v3. Las reacciones de PCR se establecieron de acuerdo con el protocolo QuickChange™ utilizando pDAB 102946 (dgt-28 v2) como ADN plantilla. El constructo que contiene la secuencia del gen dgt-28 v3 mutado se designó pDAB 100469 (FIG. 16). Los cebadores que siguen fueron utilizados para producir la mutación T172A:
Figure imgf000034_0001
Construcciones adicionales, vector de expresión pET para la expresión de E. coli.
Para pruebas in vitro, las secuencias génicas dgt-1 v5, dgt-1 v6, dgt-1 v7, dgt-1 v8, dgt-3 v6, dgt-3 v7, dgt-3 v8, dgt-7 v5, dgt-7 v6, dgt-7 v7, dgt-7 v8, dgt-32 v5 y dgt-33 v5 fueron sintetizadas y clonadas (GeneArt™). Los genes sintetizados se clonaron en el vector de expresión pET28. Los constructos resultantes se marcaron como pDAB102028 (FIG. 17) que contenía dgt-1 v5, pDAB 102029 (FIG. 18) que contenía dgt-1 v6, pDAB102032 (FIG. 19) que contenía dgt-1 v7, que contenía pDAB102034 (FIG. 20) dgt-1 v8, pDAB100429 (FIG. 21) que contenía dgt-3 v6, pDAB100442 (FIG. 22) que contenía dgt-3 v7, pDAB100430 (FIG. 23) que contenía dgt-3 v8, pDAB102036 (FIG. 24) que contenía dgt-7 v5, pDAB102038 (FIG. 25) que contenía dgt-7 v6, pDAB102040 (FIG. 26) que contenía dgt-7 v7, y pDAB 102042 (FIG. 27) que contenía dgt-7 v8.
Clonación de DGT-32, y DGT-33. Para pruebas in vitro, los genes de plantas optimizadas, dgt-32 v3 y dgt-33 v3, se amplificaron a partir de los vectores binarios pDAB107532 (FIG. 11) y pDAB107534 (FIG. 12), respectivamente. Se utilizaron los siguientes conjuntos de cebadores:
pMALDGT32F (SEQ ID NO: 29; CATATGACCGTTATTGAAATTCCGGG) y pMALDGT32R (SEQ ID NO: 30; GATATCCTATTATTAACGACCTTCCAG) para dgt-32, y pMALDGT33F (SEQ ID NO: 31; CATATGGGTGCAG-TTACCGTTATTGA), pMALDGT33R (SEQ ID NO: 32; GATATCCTATTATTATGCCTGCGGAC) para dgt-33.
Las secuencias amplificadas se subclonaron luego en pMAL-c5X de modo que cada gen era una fusión en marco con la secuencia de codificación de malE. Los constructos de expresión finales fueron pDAB107713 (FIG. 29) que contenía dgt-32 v3, y pDAB107714 (FIG. 30) que contenía dgt-33 v3.
Ejemplo 4: Ensayo cinético enzimático bioquímico in vitro.
Sobreexpresión y purificación de enzimas DGT recombinantes. Las proteínas DGT recombinantes fueron sobreexpresadas en células Rosetta2™ (DE3) (Novagen™, Madison, WI) de los constructos descritos anteriormente. Se usó una única colonia para inocular 50 mL de cultivos iniciadores de LB que contenían cloranfenicol (25 pg/mL) y kanamicina (50 pg/mL) que se cultivaron durante la noche a 37 °C. Los cultivos durante la noche se usaron para inocular 1 L de LB que contenía cloranfenicol (25 pg/mL) y kanamicina (50 pg/mL). Los cultivos se desarrollaron a 37 °C hasta una OD600 = 0,6 y se pusieron en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. La expresión de las proteínas diana se logró mediante la adición de IPTG a una concentración final de 500 pM.
Se dejó avanzar la inducción durante la noche a 20 °C, seguido de recolección mediante centrifugación a 8.000 rpm durante 20 minutos. Los sedimentos celulares se almacenaron a -80 °C hasta que se requirieron para la purificación. Todas las etapas de purificación se llevaron a cabo a 4 °C. Los sedimentos celulares de los cultivos de 1 L se resuspendieron en 20-30 mL de tampón A (HEPES 50 mM, pH 7,5 , KCl 150 mM, DTT 2 mM, EDTA 1 mM, imidazol 20 mM y glicerol al 5%). Luego se añadieron el cóctel inhibidor de la proteasa COMPLETE™ (1 comprimido/50 mL, Roche, Indianapolis, IN) y lisozima (1 mg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y la suspensión se agitó durante 20 minutos. La lisis celular se realizó usando un Branson™ Sonifier™ 250 (3 ráfagas x 60 segundos) seguido de la eliminación de los residuos celulares mediante centrifugación a 16.000 rpm durante 45 minutos.
Las enzimas DGT se purificaron a homogeneidad en una etapa mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) utilizando una columna de HisTrap FF en bruto de 5mL. La columna se equilibró en tampón A y la muestra se cargó en el mismo tampón. La columna se lavó después con 10 volúmenes de columna de tampón A seguido de elución en un tampón B al 0-100% (HEPES 50 mM, pH 7,5, KCl 200 mM, DTT 2 mM, EDTA 1 mM, imidazol 500 mM y glicerol al 5%) de gradiente lineal sobre 25 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían proteína diana, según se determinó mediante análisis SDS-PAGE, se concentraron a 2,5 mL utilizando un dispositivo de ultracentrifugación Millipore equipado con un corte de 10 kDa de peso molecular (MWCO). Las enzimas DGT purificadas se intercambiaron en el tampón utilizando columnas PD-10 (GE Healthcare) en HEPES 50 mM, pH 7,5, KCl 150 mM, DTT 2 mM y glicerol al 5% y luego se concentraron ~ 1 mL. Las muestras se diluyeron típicamente a 1:50 y el espectro UV visible se registró de 240 a 700 nm en un espectrofotómetro Cary50™ Bio UV-visible. Luego se utilizó un coeficiente de extinción teórico para calcular la concentración de proteína basándose en la absorbancia a 280 nm (ExPASy, Ginebra, Suiza).
Expresión y purificación de fusiones DGT-32 y DGT-33 recombinantes. Las enzimas DGT-32 y DGT-33 se construyeron para contener una etiqueta de fusión de maltosa ubicada en el extremo amino de la enzima. Se aislaron y confirmaron células de Escherichia coli transformadas con pDAB107712 (Fig. 28), pDAB107713 y pDAB107714. Se usó una única colonia de cada cepa bacteriana para inocular 50 mL de medio LB que contenía 100 pg/pL de carbenicilina y 25 pg/pL de cloranfenicol. El cultivo iniciador se hizo crecer durante la noche a 37 °C y posteriormente se usó para inocular 600 mL de medio LB suplementado con glucosa al 0,2%, 100 pg/pL de carbenicilina y 25 pg/pL de cloranfenicol. Los cultivos se hicieron crecer a 37 °C hasta una OD600 = 0,4, momento en el que se añadió iPt G a una concentración final de 50 pM de IPTG. Los cultivos se indujeron durante 15 horas a 18 °C. Al día siguiente, los cultivos se recogieron por centrifugación a 8.000 rpm durante 20 minutos para sedimentar las células. La pasta celular se almacenó a -80 °C hasta que se requirió para la purificación.
Los sedimentos congelados se resuspendieron en 20-30 mL de tampón A (HEPES 50 mM, pH 7,5, KCl 100 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 5% y DTT 1 mM) y 1 tableta de inhibidor de proteasa (Roche Complete). Una vez que el sedimento estuvo completamente resolubilizado, se añadió 1 mg/mL de lisozima y la muestra se mezcló a 4 °C durante 15-20 minutos. Después de la incubación con la lisozima, la muestra se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 mL y se puso en hielo. La muestra se trató luego con ultrasonidos a intervalos de 1 minuto, seguido de 4 minutos de enfriamiento. Esta etapa se repitió dos veces más para un total de tres ciclos de sonicación. Los residuos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 16.500 rpm durante 45 minutos y el sobrenadante se cargó en un bucle de inyección de 50 mL. El lisado crudo se aplicó a una columna de amilosa, se lavó con 7 volúmenes de columna con tampón A, y se eluyó en tampón B al 100% (tampón A y maltosa 10 mM). La proteína diana se agrupó y se concentró hasta 2,5 mL utilizando un Centricon MWCO de 30 kDa. La proteína purificada se intercambió con tampón a HEPES 50 mM, pH 7,5, KCl 100 mM y glicerol al 5% utilizando una columna de filtración en gel PD-10. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo de Bradford utilizando BSA como estándar. La proteína pura se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.
Caracterización cinética in vitro de enzimas DGT vegetales y bacterianas. Las actividades enzimáticas de DGT de tipo silvestre (WT) y mutantes se midieron por la producción de fosfato inorgánico (Pi) en un procedimiento modificado descrito por Lanzetta et al. (1979) Anal. Bioch 100: 95-7. Los ensayos se realizaron en formato de placa de 96 pocillos en un total de 50 mL en un lector de placas Spectra-Max 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los ensayos típicos contenían HEPES 50 mM, pH 7,5, KCl 150 mM, DTT 2 mM y S3P 1 mM. Las concentraciones de PEP y cjifosato se variaron según se indica. El glifosato se obtuvo de Sigma como el ácido libre y se resuspendió en ddH2O. El glifosato se solubilizó mediante la adición de KOH hasta que la mezcla estuvo a un pH neutro. Los ensayos se iniciaron mediante la adición de la enzima DGT a concentraciones que variaron entre 0,01 -1 pM. Las reacciones se terminaron mediante la adición de 235 pL de una mezcla 3:1 de verde de malaquita: solución de molibdato amónico. Después del desarrollo completo del color (~ 1 minuto), se registró el cambio de absorbancia a 660 nm y se calculó la cantidad de Pi formado a partir de una curva estándar. Se usaron reacciones de control que carecen de enzima para corregir la absorbancia de fondo. Las altas concentraciones de PEP (> 2 mM) y glifosato (> 30 mM) contribuyen con una cantidad significativa de absorbancia de fondo usando este método de detección. Los datos se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten, lo que permitió la determinación de Km y Vmax (Ecuación 3), mientras que la IC50 se determinó a partir de la Ecuación 4, donde y es la actividad relativa y s es el coeficiente de Hill. Los datos se analizaron utilizando el software GraFit™ versión 5 (Erithacus Software Limited, Horley, Reino Unido).
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El valor de IC50 para un inhibidor competitivo cambiará dependiendo de la concentración de sustrato, y por consiguiente los valores de IC50 de la Tabla 2 se obtuvieron en PEP 1 mM y en PEP 60 pM (una estimación de las concentraciones de PEP intracelular en plantas). Solo deben compararse los valores de IC50 medidos a la misma concentración de PEP (las determinaciones de Km para DGT-32 y d GT-33 se realizaron a 100 pM de PEP). Además, los valores de IC50 de enzimas altamente tolerantes no pudieron determinarse con precisión por el método de Lanzetta y, por tanto, se estimaron en función de la actividad relativa.
Cinética de las DGTs de planta. Primero se probaron dos enzimas con secuencias nativas no mutadas, DGT-1 v5 y DGT-7 v5, para establecer parámetros de referencia para la sensibilidad al glifosato. Las dos proteínas mostraron valores bajos de Km para PEP (~ 70 mM) y fueron sensibles al glifosato con valores de IC50 de ~ 20 mM (Tabla 2) a PEP 1 mM. Como se observa para DGT-1 v6, DGT-3 v6, y DGT-7 v6, una única mutación de punto de G a A mejoró significativamente la tolerancia al glifosato (valores de IC50 de 8-21 mM), pero también aumentó la Km para PEP a ~ 8 veces. La doble mutación (GAPS), para todas las DGT derivadas de plantas (DGT-1 v7, DGT-3 v7 y DGT-7 v7), también mejoró la tolerancia al glifosato, pero una vez más tuvo como resultado una elevación considerable en Km de PEP. Tabla 2. Los mutantes TIPS (DGT-1 v8, DGT-3 v8 y DGT-7 v8) fueron tolerantes a concentraciones modestas de glifosato (3-6 mM) pero, a diferencia de los mutantes GA y GAPS, los niveles de Km se mantuvieron próximos a los de las proteínas de tipo silvestre entre 60-200 pM. La FIG. 31 demuestra los cambios en la tolerancia al glifosato para DGT-1 (A) y DGT-7 (B) tras la introducción de las mutaciones especificadas. La concentración de PEP se mantuvo a 1 mM para los experimentos que dieron como resultado los datos mostrados en la FIG. 31, lo que probablemente condujo a la elevada IC50 (> 80 mM) para DGT-7 v8. Se llevaron a cabo otros procedimientos para determinar si los niveles más bajos de PEP alteraban la tolerancia al glifosato relativa. Los niveles fisiológicamente relevantes de PEP varían de 5 a 60 |jM. Con PEP 60 |jM, el valor de IC50 disminuyó significativamente (3,6 mM), sugiriendo que la determinación inicial estuvo influenciada por el exceso de PEP, como era de esperar de la cinética de Michaelis-Menten, y se anotó en la Tabla 2.
La FIG. 31 muestra los valores de IC50 obtenidos después de la introducción de varias mutaciones dentro de DGT-1 (A) y DGT-7 (B) utilizando PEP 1 mM. Tanto para A como para B, los triángulos cerrados de las curvas IC50 representan tipo salvaje, los círculos cerrados representan mutantes GA, los cuadrados abiertos representan mutantes GAPS y los cuadrados cerrados representan mutantes TIPS.
Tabla 2. Parámetros cinéticos en estado estacionario para enzimas DGT. Los valores de IC50 mayores que 50 son estimaciones debido a las limitaciones del método empleado. El valor de IC50 para el glifosato se determinó a PEP 100 j M.
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Cinética de las DGTs bacterianas. De las enzimas bacterianas, DGT-28 v1 posee los parámetros cinéticos globales más favorables (valores elevados de IC50 y kca/Km). La enzima fue tolerante al glifosato en concentraciones > 80 mM y mostró una eficiencia catalítica de 1,32 x 105 M'1 s-1. La mutación A ^ G en DGT-28 v2 redujo la IC50 a 2,17 mM (a PEP 60 j M) y provocó una ligera elevación en la Km para PEP (161 j M). Esta enzima mutante conserva la alta eficacia catalítica observada en DGT-28 v1. Incluso con una IC50 reducida, esta enzima mutada es adecuada para proporcionar tolerancia al glifosato in planta en ciertas aplicaciones. Los datos sugieren que en esta nueva clase de e Ps P sintasa, la alanina no es el único determinante de la tolerancia al glifosato. Para explorar otros posibles determinantes, se construyó una variante adicional, DGT-28 v3 (mutante doble A84G T172A). Esta enzima mostró una tolerancia reducida al glifosato con un valor de IC50 de 5,15 mM (a PEP 60 j M). La disminución en la IC50 para DGT-28 v3 estuvo acompañada por una disminución de 200 veces en la eficacia catalítica, lo que sugiere que la segunda mutación condujo a efectos inesperados (Tabla 2). Los homólogos de mayor identidad DGT-28 v1 (~75% de identidad de aminoácidos), DGT-32 y DGT-33 tenían valores de Km bajos para PEP (~114 -139 mM), y sin embargo las eficacias catalíticas fueron 100 veces más bajas que las de DGT-28 v1. Esta caída en la eficacia catalítica se deriva probablemente de la fusión de la proteína de unión a la maltosa (MBP). Las enzimas son también insensibles al glifosato que presenta valores de IC50 mayores que 50 mM. Como resultado de estos ensayos in vitro que indicaron que las diversas enzimas DGT proporcionaban tolerancia al glifosato, las enzimas DGT se probaron en planta.
Ejemplo 5: Clonación de vectores de transformación de plantas.
Construcción de vectores binarios vegetales. Se usaron métodos de clonación estándar en la construcción de vectores de entrada que contienen una secuencia de polinucleótidos peptídicos de tránsito al cloroplasto unida a dgt-28 como una fusión en marco. Los vectores de entrada que contenían un péptido de tránsito (TraP) fusionado con dgt-28 se ensamblaron utilizando la tecnología Advantage IN-FUSION™ (Clontech, Mountain View, CA). Como resultado de la fusión, el primer aminoácido, la metionina, se eliminó de dgt-28. Péptidos de tránsito TraP4 v2 (SEC ID NO: 33 ), TraP5 v2 (SEC ID NO: 34), TraP8 v2 (SEC ID NO: 35), TraP9 v2 (SEC ID NO: 36), TraP12 v2 (SEC ID NO: 37), y TraP13 v2 (SEQ ID NO: 38) fueron sintetizados cada uno por DNA2.0 (Menlo Park, Ca ) y fusionados al fragmento del extremo 5' de dgt-28, hasta un sitio único, e incluyéndolo, de reconocimiento de endonucleasas de restricción AccI.
Los plásmidos binarios que contenían las diversas casetes de expresión de TraP y dgt-28 fueron dirigidos por el promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (AtUbi10 v2; Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486 -12493) y flanqueado por la región no traducida 3' del marco de lectura abierto veintitrés de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF233' UTR v1; patente de Estados Unidos n° 5.428.147).
Las casetes de expresión TraP y dgt-28 ensambladas se diseñaron utilizando la tecnología GATEWAY® (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformaron en plantas a través de la transformación de plantas mediada por Agrobacterium. Las endonucleasas de restricción se obtuvieron de New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) y se utilizó ADN Ligase T4 (Invitrogen) para la ligación del ADN. Las reacciones de la puerta de enlace (Gateway) se realizaron utilizando la mezcla de enzimas GATEWAY® LR CLONASE® (Invitrogen) para ensamblar un vector de entrada en un único vector de destino que contenía el casete marcador seleccionable promotor del virus del mosaico de la vena de la yuca (CsVMV v2; Verdaguer et al., (1996) Plant Mol Biol., 31: 1129 - 1139) - DSM-2 (solicitud de patente de EE. UU. n° 2007/086813) - Agrobacterium tumefaciens marco de lectura abierta una región no traducida 3' (AtuORF1 3' UTR v6; Huang et al., (1990) J. Bacteriol. 172: 1814 - 1822). Las preparaciones de plásmidos se realizaron utilizando el kit de plásmidos NUCLeOs PIN® (Macherey-Nagel Inc., Bethlehem, PA) o el kit de Plasmid Midi (Qiagen) siguiendo las instrucciones de los proveedores. Los fragmentos de ADN se aislaron utilizando el kit de extracción de gel QIAquick™ (Qiagen) después de la electroforesis en gel de agarosa en Tris-acetato.
Las colonias de todos los plásmidos ensamblados se cribaron inicialmente mediante digestión de restricción de ADN miniprep. El ADN plasmídico de los clones seleccionados fue secuenciado por un proveedor de secuenciación comercial (Eurofins™ MWG Operon, Huntsville, AL). Los datos de secuencia se ensamblaron y analizaron utilizando el software SEQUENCHER™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).
Los constructos binarios que siguen expresan las diversas secuencias del gen de fusión TraP: dgt-28. pDAB107527 (FIG. 3) contiene TraP4 v2:dgt-28 v5 (SEQ ID NO: 79); pDAB105530 (FIG. 4) contiene TraP5 v2:dgt-28 v5 (SEC ID NO: 80); pDAB105531 (FIG. 5) contiene TraP8 v2: dgt-28 v5 (SEC ID NO: 81); PDAB105532 (FIG. 6) contiene TraP9 v2: dgt-28 v5 (SEC ID NO: 82); pDAB105533 (FIG. 7) contiene TraP12 v2: dgt-28 v5 (SEC ID NO: 83); y pDAB105534 (FIG. 8) contiene TraP13 v2: dgt-28 v5 (SEC ID NO: 84). La secuencia dgt-28 v5 de pDAB105534 se modificó donde el primer codón (GCA) se cambió a (GCT).
Construcción de vectores binarios vegetales adicionales. Se utilizaron estrategias de clonación similares a las descritas anteriormente para construir plásmidos binarios que contienen dgt-31, dgt-32, dgt-33, dgt-1, dgt-3 y dgt-7.
Los genes derivados microbiológicamente dgt-31, dgt-32 y dgt-33 se fusionaron con péptidos de tránsito al cloroplasto diferentes a los descritos con anterioridad. Se utilizaron los siguientes péptidos de tránsito al cloroplasto: TraP14 v2 (SEC ID NO: 39), TraP23 v2 (SEC ID NO: 40), TraP24 v2 (SEC ID NO: 41). pDAB107532 (FIG. 11) contiene dgt-32 v3 fusionado a TraP14 v2 (SEC ID NO: 42 ), pDAB107534 (FIG. 12) contiene dgt-33 v3 fusionado a TraP24 v2 (SEC ID NO: 43), y pDAB1017533 (FIG. 54) contiene dgt-33 v1 fusionado a TraP23 v2 (SEC ID NO: 143). Las casetes de expresión dgt fueron controladas por el promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (promotor AtUbi10 v2) y flanqueadas por la región no traducida 3' veintitrés del marco de lectura abierto de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1). Una casete marcadora seleccionable DSM-2 que contiene el promotor del virus del mosaico de la vena de la yuca (CsVMV v2) - DSM-2 - región no traducida 3' del marco de lectura abierto uno de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3' UTR v6) estaba también presente en el vector binario.
Se construyen binarios adicionales en los que dgt-31 v3, dgt-32 v3 y dgt-33 v3 se fusionan con las secuencias de péptidos de tránsito al cloroplasto descritas anteriormente. Por ejemplo, la secuencia TraP8 v2 se fusiona con dgt-31 v3, dgt-32 v3 y dgt-33 v3, y se clona en vectores binarios como se describió anteriormente.
Se construyeron vectores binarios que contenían los genes de Clase I (dgt-1, dgt-3 y dgt-7). Los siguientes vectores binarios se construyeron y se transformaron en plantas: pDAB4104 (FIG. 9), que contiene la secuencia dgt-1 v4 como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. n° 2011/0124503, que está flanqueada por las secuencias Osmotin de Nicotiana tabacum como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2009/0064376; pDAB102715 (FIG. 10); pDAB102716 (FIG. 45); pDAB102717 (FIG. 46); y pDAB 102785 (FIG. 13). Los diversos péptidos de tránsito al cloroplasto TraP que se fusionaron con dgt-28, dgt-31, dgt-32 y dgt-33 no se agregaron a los genes de Clase I, ya que estas secuencias derivadas de plantas poseen péptidos de tránsito al cloroplasto de plantas nativas. Estos vectores se describen con más detalle en la Tabla 3.
Tabla 3. Descripción de los vectores binarios que contienen un gen de EPS sintasa de Clase I (es decir, dgt-1, dgt-3 o dgt-7).
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Ejemplo 6: Transformación en Arabidopsis y Selección.
Transformación de Arabidopsis thaliana. Arabidopsis fue transformada utilizando el método de inmersión floral de Clough and Bent (1998). Se usó una colonia seleccionada de Agrobacterium que contenía uno de los plásmidos binarios descritos anteriormente para inocular uno o más precultivos de 100 mL de caldo YEP que contiene espectinomicina (100 mg/L) y kanamicina (50 mg/L). El cultivo se incubó durante la noche a 28 °C con agitación constante a 225 rpm. Las células se sedimentaron a aproximadamente 5000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente, y el sobrenadante resultante fue desechado. El sedimento celular se resuspendió suavemente en 400 mL de medio de remojo que contenía 5% (p/v) de sacarosa, 10 pg/L de 6-bencilaminopurina y 0,04% de Silwet™ L-77. Las plantas de aproximadamente 1 mes de edad se sumergieron en el medio durante 5-10 minutos con agitación suave. Las plantas se tumbaron sobre sus lados y se cubrieron con bolsas de plástico transparentes u opacas durante 2-3 horas, y luego se colocaron en posición vertical. Las plantas se cultivaron a 22 °C, con un fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. Aproximadamente 4 semanas después de la inmersión, se cosecharon las semillas.
Selección de plantas transformadas. La semilla T1 recién cosechada (que contiene las casetes de expresión dgt y DSM-2) se dejó secar durante 7 días a temperatura ambiente. La semilla T1 se sembró en bandejas de germinación de 26,5 x 51 cm, recibiendo cada una de ellas una parte alícuota de 200 mg de semilla T1 estratificada (~ 10.000 semillas) que se habían suspendido previamente en 40 mL de solución de agarosa al 0,1%, y se almacenaron a 4 °C durante 2 días para completar los requisitos de latencia y asegurar la germinación sincronizada de las semillas.
Se cubrió Sunshine Mix LP5 con vermiculita fina y se sub-irrigó con una solución de Hoagland hasta humedecerla, y luego se deja drenar por gravedad. Cada alícuota de 40 mL de semilla estratificada se sembró uniformemente sobre la vermiculita con una pipeta, y se cubrió con domos de humedad durante 4-5 días. Los domos se retiraron 1 día antes de la selección transformante inicial utilizando un aerosol de post-emergencia con glufosinato (seleccionando el gen DSM-2 co-transformado).
Siete días después de la plantación (DAP) y nuevamente 11 DAP, las plantas T1 (fase de cotiledón y 2-4 lf, respectivamente) se pulverizaron con una solución al 0,2% de herbicida Liberty (200 g ai/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) a un volumen de pulverización de 10 mL/bandeja (703 L/ha) utilizando una boquilla de pulverización de aire comprimido DeVilbiss para suministrar una tasa efectiva de 280 g ai/ha de glufosinato por aplicación. Las supervivientes (plantas en crecimiento activo) se identificaron 4-7 días después de la pulverización final y se trasplantaron individualmente en macetas de 3 pulgadas (75 mm) preparadas con medios de cultivo (Metro Mix 360). Las plantas trasplantadas se criaron en el invernadero (22 ± 5 °C, 50 ± 30% de HR, 14 h luz:10 h oscuridad, mínimo 500 pE/m2s1 luz natural suplementaria). El análisis de confirmación molecular se completó en las plantas T1 supervivientes para confirmar que el gen de tolerancia al glifosato se había integrado de manera estable en el genoma de las plantas.
Confirmación Molecular. Se confirmó la presencia de los transgenes dgt-28 y DSM-2 dentro del genoma de las plantas de Arabidopsis que se transformaron con pDAB107527, pDAB105530, pDAB105531, pDAB105532, pDAB105533 o pDAB105534. La presencia de estas secuencias de polinucleótidos se confirmó mediante ensayos de sonda de hidrólisis, PCR en casete de expresión génica (también descrita como unidad de transcripción de la planta PCR - PTU PCR), análisis de transferencia Southern y análisis de PCR de Transcripción Inversa Cuantitativa.
Las plantas de Arabidopsis T1 se cribaron inicialmente mediante un ensayo de sonda de hidrólisis, análogo a TAQMAN™, para confirmar la presencia de los transgenes DSM-2 y dgt-28. Los eventos se seleccionaron mediante PCR de casete de expresión génica para determinar si la casete de expresión dgt se integró totalmente en los genomas de la planta sin redistribución. Los datos generados a partir de estos estudios se utilizaron para determinar el número de copias del transgén e identificar eventos de Arabidopsis seleccionados para la autofertilización y el avance a la generación T2. Las plantas de Arabidopsis T2 avanzadas también se seleccionaron mediante ensayos de sonda de hidrólisis para confirmar la presencia y estimar el número de copias de los genes DSM-2 y dgt dentro del cromosoma de la planta. Finalmente, se utilizó un ensayo de transferencia Southern para confirmar el número de copias estimado en un subconjunto de las plantas de Arabidopsis T1.
Se usaron ensayos similares para confirmar la presencia del transgén dgt-1 de las plantas transformadas con pDAB4101, la presencia del transgén dgt-32 de las plantas transformadas con pDAB107532, la presencia del transgén dgt-33 de las plantas transformadas con pDAB107534, la presencia del transgén dgt-3 de las plantas transformadas con pDAB102715, la presencia del transgén dgt-3 de las plantas transformadas con pDAB102716, la presencia del transgén dgt-3 de las plantas transformadas con pDAB102717 y la presencia del transgén dgt-7 transgén de plantas transformadas con pDAB 102785.
Ensayo de sonda de hidrólisis. El número de copias se determinó en las plantas de Arabidopsis T1 y T2 utilizando el ensayo de sonda de hidrólisis que se describe a continuación. Se identificaron y avanzaron plantas con un número variable de transgenes para estudios posteriores de tolerancia al glifosato.
Las muestras de tejido se recogieron en placas de 96 pocillos y se liofilizaron durante 2 días. La maceración de tejidos se realizó con un pulverizador de tejidos KLECO™ y perlas de tungsteno (Environ Metal INC., Sweet Home, Oregon). Después de la maceración del tejido, el ADN genómico se aisló en un formato de alta producción utilizando el kit Biosprint™ 96 Plant (Qiagen™, Germantown, MD) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. El ADN genómico se cuantificó mediante el QUANT-IT™ PICO GREEN DNA ASSAY KIT (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADN genómico cuantificado se ajustó a aproximadamente 2 ng/mL para el ensayo de la sonda de hidrólisis utilizando un manipulador automático de líquidos BIOROBOT3000™ (Qiagen, Germantown, MD). La determinación del número de copias transgénicas mediante el ensayo de sonda de hidrólisis se realizó mediante PCR en tiempo real utilizando el sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Los ensayos se diseñaron para DSM-2, dgt-28 y el gen de referencia interno, TAFII15 (Genbank ID: NC 003075; Duarte et al., (201) BMC Evol. Biol., 10:61).
Para la amplificación, se preparó la mezcla LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) a una concentración final IX en una reacción multiplex de 10 pL de volumen que contiene 0,1 pM de cada cebador para DSM-2 y dgt-28, 0,4 pM de cada cebador para TAFII15 y 0,2 pM de cada sonda. Tabla 4. Se realizó una reacción de amplificación en dos etapas con una extensión a 60 °C durante 40 segundos con adquisición de fluorescencia. Todas las muestras se analizaron y los valores de umbral de ciclo (Ct) promediados se utilizaron para el análisis de cada muestra. El análisis de los datos de PCR en tiempo real se realizó utilizando el software LightCycler™ versión 1.5 utilizando el módulo de cantidad relativa y se basa en el método AACt. Para esto, se incluyeron una muestra de ADN genómico de un calibrador de copia única y una verificación de 2 copias conocidas en cada análisis. Los resultados del número de copias del cribado de la sonda de hidrólisis se determinaron para las plantasde Arabidopsis transgénicas T1 y T2.
Tabla 4. Información de cebadores y sondas para el ensayo de sonda de hidrólisis de DSM-2, dgt-28 y gen de referencia interno (TAFII15).
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Confirmación de integración de dgt-28 a través del análisis de Transferencia Southern. Se usó el análisis de transferencia Southern para establecer el patrón de integración del fragmento de ADN de la cadena T insertado e identificar los eventos que contenían el dgt-28. Se generaron datos para demostrar la integración y la integridad de los insertos transgénicos dentro del genoma de Arabidopsis. Los datos de transferencia Southern se utilizan para identificar la integración simple de una copia intacta del ADN de la cadena T. Se realizó un análisis detallado de transferencia Southern usando una sonda amplificada por PCR específica para la casete de expresión del gen dgt-28. La hibridación de la sonda con el ADN genómico que se había digerido con las enzimas de restricción específicas identificó fragmentos del ADN genómico de pesos moleculares específicos, cuyos patrones se usaron para identificar eventos transgénicos T1 de inserción simple y longitud completa para el avance a la siguiente generación.
Las muestras de tejido se reconocieron en tubos cónicos de 2 mL (Eppendorf™) y se liofilizaron durante 2 días. La maceración de tejidos se realizó con un pulverizador de tejidos KLECKO™ y perlas de tungsteno. Después de la maceración del tejido, se aisló el ADN genómico en un procedimiento de aislamiento CTAB. El ADN genómico se purificó adicionalmente utilizando el kit de puntas genómicas Qiagen™. El ADN genómico se cuantificó mediante el kit de ensayo de ADN Pico Green de Quant-IT™ (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADN genómico cuantificado se ajustó a 4 |jg para una concentración consistente.
Para cada muestra, se digirieron minuciosamente 4 jg de ADN genómico con la enzima de restricción SwaI (New England Biolabs, Beverley, MA) y se incubaron a 25 °C durante la noche, luego se añadió Nsil a la reacción y se incubó a 37 °C durante 6 horas. El ADN digerido se concentró mediante precipitación con Quick Precipitation Solution™ (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. El ADN genómico se resuspendió después en 25 mL de agua a 65 °C durante 1 hora. Las muestras resuspendidas se cargaron en un gel de agarosa al 0,8% preparado en IX TAE y se sometieron a electroforesis durante la noche a 1,1 V/cm en tampón IX TAE. El gel se sometió secuencialmente a desnaturalización (NaOH 0,2 M/NaCl 0,6 M) durante 30 minutos, y a neutralización (Tris-HCl 0,5 M (pH 7,5)/NaCl 1,5 M) durante 30 minutos.
La transferencia de fragmentos de ADN a membranas de nailon se realizó mediante la absorción pasiva de 20 X solución de SSC durante la noche a través del gel sobre la membrana de transferencia tratada IMMOBILON™ NY (Millipore, Billerica, MA) utilizando una mecha de papel para cromatografía y toallas de papel. Después de la transferencia, la membrana se lavó brevemente con 2 X SSC, se reticuló con STRATALINKER™ 1800 (Stratagene, LaJolla, CA) y se coció bajo vacío a 80 °C durante 3 horas.
Las transferencias se incubaron con una solución de prehibridación (Perfect Hyb plus, Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora a 65 °C en botellas de vidrio rodantes, con una incubadora de hibridación modelo 400 (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). Las sondas se prepararon a partir de un fragmento de PCR que contiene la secuencia codificadora completa. El amplicón de PCR se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAEX™ II y se marcó con a32P-dCTP a través del kit de etiquetado Random RT Prime IT™ (Stratagene, La Jolla, CA). Las transferencias se hibridaron durante la noche a 65 °C con la sonda desnaturalizada añadida directamente al tampón de hibridación a aproximadamente 2 millones de cuentas por transferencia por mL. Después de la hibridación, las transferencias se realizaron secuencialmente a 65 °C con 0,1 X SSC/0,1% SDS durante 40 minutos. Finalmente, las transferencias se expusieron a las pantallas de imágenes de fósforo de almacenamiento y se obtuvieron las imágenes utilizando un sistema de imágenes Molecular Dynamics Storm 860™.
Los análisis de transferencia Southern completados en este estudio se usaron para determinar el número de copias y confirmar que los eventos seleccionados contenían el transgén dgt-28 dentro del genoma de Arabidopsis.
Confirmación de la casete de expresión génica dgt-28 mediante análisis por PCR. La presencia de la casete de expresión del gen dgt-28 contenido en los eventos de la planta T1 se detectó mediante una reacción de PCR de punto final. Se usaron cebadores (Tabla 5) específicos para el promotor AtUbi10 v2 y las regiones 3' UTR v1 AtuORF23 de la casete de expresión del gen dgt-28 para la detección.
Tabla 5. Cebadores oligonucleotídicos usados para la confirmación de la casete de expresión del gen dgt-28.
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Las reacciones de PCR requirieron un protocolo estándar de ciclos de PCR de tres etapas para amplificar la casete de expresión génica. Todas las reacciones de PCR se completan utilizando las siguientes condiciones de PCR: 94 °C durante tres minutos seguido de 35 ciclos de a 94 °C durante treinta segundos, 60 °C durante treinta segundos y 72 °C durante tres minutos. Las reacciones se completaron utilizando el kit de PCR EX-TAQ™ (TaKaRa Biotechnology Inc. Otsu, Shiga, Japón) según las instrucciones del fabricante. Después del ciclo final, la reacción se incubó a 72 °C durante 10 minutos. Se usó electroforesis en gel de agarosa TAE para determinar el tamaño del amplicón de PCR. Los amplicones de PCR del tamaño esperado indicaron la presencia de una casete de expresión génica de longitud completa en el genoma de los eventos transgénicos de Arabidopsis.
Confirmación de la Transcripción Relativa de dgt-28 a través del análisis de PCR de Transcripción Inversa Cuantitativa.
Se recogieron muestras de tejido de plantas transgénicas dgt-28 en placas de 96 pocilios y se congelaron a 80 °C. La maceración de los tejidos se realizó con un pulverizador de tejidos KLECO™ y perlas de tungsteno (Environ Metal INC., Sweet Home, Oregón). Después de la maceración del tejido, se aisló el ARN total en un formato de alta producción utilizando el kit Qiagen™ Rneasy 96 (Qiagen™, Germantown, MD) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante, que incluye el tratamiento opcional con DnaseI en la columna. Esta etapa fue seguida a continuación por un tratamiento adicional con DnaseI (Ambion™, Austin, TX) del ARN total eluido. La síntesis de ADNc se llevó a cabo utilizando el ARN total como plantilla con el kit High Capacity cDNA Reverse Transcription™ (Applied Biosystems, Austin, TX) siguiendo el procedimiento sugerido por el fabricante con la adición del oligonucleótido, TVN. La cuantificación de la expresión se completó con un ensayo de sonda de hidrólisis y se realizó mediante PCR en tiempo real utilizando el sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Los ensayos se diseñaron para dgt-28 y el gen de referencia interno "proteína desconocida" (número de registro de acceso Genbank: AT4G24610) utilizando el software de diseño de sonda LIGHTCYCLER® 2.0. Para amplificación, se preparó mezcla LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) a una concentración final de IX en una reacción singleplex de 10 pL de volumen que contenía 0,4 pM de cada cebador y 0,2 pM de cada sonda. Tabla 6.
Tabla 6. Cebadores de PCR utilizados para el análisis cuantitativo de PCR de transcripción inversa de dgt-28.
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Se realizó una reacción de amplificación en dos etapas con una extensión a 60 °C durante 40 segundos con adquisición de fluorescencia. Todas las muestras se analizaron por triplicado y los valores promedio del umbral de ciclo (Ct) se usaron para el análisis de cada muestra. Se llevó a cabo una reacción de transcripción inversa menos para cada muestra para asegurar que no hubiera contaminación de ADNg. El análisis de los datos de PCR en tiempo real se realizó basándose en el método AACt. Este ensayo se usó para determinar la expresión relativa de dgt-28 en eventos de Arabidopsis transgénico que se determinó que eran hemicigotos y homocigotos. Los niveles relativos de transcripción del ARNm de dgt-28 oscilaron entre 2,5 y 207,5 veces más que el control interno. Estos datos indican que las plantas transgénicas dgt-28 contenían una casete de expresión funcional del gen dgt-28, y las plantas eran capaces de transcribir el transgén dgt-28.
Análisis de transferencia Western. Se detectó DGT-28 en muestras de hojas obtenidas de plantas de Arabidopsis thaliana transgénicas. Los extractos de plantas transgénicas dgt-28 y los estándares de proteína DGT-28 se incubaron con tampón de muestra NUPAGE® LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contenía DTT a 90 °C durante 10 minutos y se separaron por electroforesis en un gel de acrilamida prefabricado. Las proteínas se transfirieron a continuación a la membrana de nitrocelulosa utilizando el protocolo del fabricante. Después de bloquear con la mezcla de bloqueo WESTERNBREEZE® (Invitrogen), la proteína DGT-28 fue detectada por un antisuero anti-DGT-28 seguido de fosfatasa anti-conejo de cabra. La proteína detectada se visualizó mediante el sustrato de quimioluminiscencia BCIP/NBT Western Analysis Reagent (KPL, Gaithersburg, MD). La producción de una proteína DGT-28 intacta a través de la transferencia Western indicó que las plantas transgénicas dgt-28 que se ensayaron expresaban la proteína DGT-28.
Ejemplo 7: Tolerancia al glifosato.
Las plantas de Arabidopsis T1 transgénicas que contienen el transgén dgt-28 se pulverizaron con diferentes tasas de glifosato. En este estudio se aplicaron tasas elevadas para determinar los niveles relativos de resistencia (105, 420, 1.680 o 3.360 g ae/ha). Una tasa típica de uso de glifosato IX que controlará la Arabidopsis no transformada es de 420 g ae/ha. Las formulaciones de glifosato con la adición de sulfato amónico se aplicaron a las plantas T1 con un desherbador químico calibrado a 187 L/ha. Las plantas de Arabidopsis T1 que se usaron en este estudio fueron de un número de copias variable para el transgén dgt-28. Las plantas Arabidopsis T1 dgt-28 de bajo número de copias se autopolinizaron y se usaron para producir plantas T2. La Tabla 7 muestra la comparación de plantas transgénicas dgt-28, sacada a un gen de resistencia al herbicida glifosato, dgt-1, y controles de tipo silvestre. La Tabla 8 muestra la comparación de dgt-32 y dgt-33 sacada a un gen de resistencia al herbicida glifosato, dgt-1 y controles de tipo silvestre. La Tabla 9 muestra la comparación de las nuevas enzimas EPSP sintasa bacterianas, con las enzimas EPSP sintasa de Clase I y los controles a una tasa de glifosato de 1.680 g ae/ha.
Resultados de la selección de glifosato de plantas de Arabidopsis dgt-28 transformadas. Los transformantes T1 de Arabidopsis se seleccionaron primero del fondo de semillas no transformadas utilizando un esquema de selección de glufosinato. Se analizaron tres pisos o 30.000 semillas para cada constructo T1. Las plantas T1 seleccionadas anteriormente se caracterizaron molecularmente y las plantas representativas con número de copias variable se trasplantaron posteriormente en macetas individuales y se pulverizaron con varias tasas de glifosato comercial como se describió anteriormente. La respuesta de estas plantas se presenta en términos de % de lesión visual 2 semanas después del tratamiento (WAT). Los datos se presentan en una tabla que muestra plantas individuales que presentan poca o ninguna lesión (< 20%), una lesión moderada (20-40%) o una lesión grave (> 40%). Se presenta una media aritmética y una desviación estándar para cada constructo utilizado para la transformación de Arabidopsis. El intervalo en la respuesta individual se indica también en la última columna para cada tasa y transformación. La Arabidopsis no transformada de tipo silvestre (c.v. Columbia) sirvió como control sensible al glifosato.
El nivel de respuesta de la planta varió. Esta variación puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformación independiente y, por tanto, el número de copias del gen de interés varía de una planta a otra. Se observó que algunas plantas que contenían el transgén no eran tolerantes al glifosato; no se completó un análisis exhaustivo para determinar si estas plantas expresaron el transgén. Es probable que la presencia de números elevados de copias del transgén dentro de las plantas de Arabidopsis T1 tenga como resultado el silenciamiento del transgén u otros efectos epigenéticos que produzcan sensibilidad al glifosato, a pesar de la presencia del transgén dgt-28.
Se presenta en la Tabla 9 un promedio global de lesiones en la población para tasas de glifosato a 1.680 g ae/ha para demostrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con dgt-3, dgt-7, dgt-28, dgt-32 y dgt-33 frente a los controles dgt-1 y de tipo silvestre.
La tolerancia proporcionada por las nuevas EPSP sintasas bacterianas varió dependiendo de la enzima específica. DGT-28, DGT-32 y DGT-33 proporcionaron inesperadamente una tolerancia significativa al glifosato. Los genes dgt impartieron resistencia a los herbicidas a plantas Arabidopsis T1 individuales en todos los péptidos de tránsito analizados. Como tales, el uso de péptidos de tránsito al cloroplasto adicionales (es decir, TraP8 - dgt-32 o TraP8 -dgt-33) proporcionaría protección al glifosato con niveles de lesión similares a los reportados dentro de un tratamiento dado.
Tabla 7. Respuesta de Arabidopsis T1 transformada con dgt-28 a un intervalo de tasas de glifosato aplicadas tras la emergencia, en comparación con una población homocigótica resistente a dgt-1 (T4) y un control no transformado. % de lesiones visuales 14 días después de la aplicación.
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Tabla 8. dgt-32 y dgt-33 transformaron la respuesta de Ti Arabidopsis a un intervalo de tasas de glifosato aplicadas después de la emergencia, en comparación con una población homocigótica resistente a dgt-1 (T4) y un control no transformado. % lesión visual 14 días después de la aplicación.
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Tabla 9. Respuesta de Arabidopsis Ti transformada con dgt-28, dgt-32, dgt-33, dgt-3 y dgt-7 a post-emergencia aplicada con glifosato a 1.680 g ae/ha, en comparación con una población resistente al dgt-1 (T4) homocigótico, y un control no transformado. % lesión visual 14 días después de la aplicación.
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El dzt-28 como marcador seleccionable. El uso dgt-28 como un marcador seleccionable para el agente de selección de glifosato se ensaya con las plantas transformadas Arabidopsis descritas anteriormente. Aproximadamente 50 semillas de Arabidopsis de la generación T4 (homocigóticas para dgt-28) se añaden a aproximadamente 5.000 semillas de tipo silvestre (sensibles al glifosato). Las semillas germinan y las plántulas se pulverizan con una dosis selectiva de glifosato. Se comparan varios tratamientos de glifosato; cada bandeja de plantas recibe uno o bien dos tiempos de aplicación de glifosato en uno de los siguientes esquemas de tratamiento: 7 DAP (días después de la plantación), 11 DAP o 7 seguido de 11 DAP. Dado que todas las plantas también contienen un gen de resistencia al glufosinato en el mismo vector de transformación, las plantas que contienen dgt-28 seleccionadas con glifosato se pueden comparar directamente con plantas que contienen DSM-2 o pat seleccionadas con glufosinato.
Los tratamientos con glifosato se aplican con una boquilla de pulverización DeVilbiss™ como se describió anteriormente. Las plantas transgénicas que contienen dgt-28 se identifican como 17 DAP "resistente" o "sensible". Los tratamientos de 26,25-1680 g ae/ha de glifosato aplicados 7 y 11 días después de la plantación (DAP), muestran una selección efectiva para las plantas Arabidopsis transgénicas que contienen dgt-28. Se cuentan las plantas sensibles y resistentes y se encuentra que el número de plantas tolerantes al glifosato se correlaciona con el número original de semillas transgénicas que contienen el transgén dgt-28 que se plantan. Estos resultados indican que dgt-28 se puede usar efectivamente como un marcador seleccionable alternativo para una población de Arabidopsis transformada.
Heredabilidad. Los eventos confirmados de Arabidopsis T1 transgénicos se autopolinizaron para producir semilla T2. En estas semillas hicieron pruebas de descendencia aplicando herbicida Ignite™ que contiene glufosinato (200 g ae/ha) a 100 hermanas T2 aleatorias. Cada planta T2 individual se trasplantó a macetas cuadradas de 7,5 cm antes de la aplicación del pulverizador (pulverizador de oruga) a una velocidad de aplicación de 187 L/ha). Las familias T1 (plantas T2) se segregaron en el 3 Resistente anticipado: 1 Modelo sensible para un locus único de herencia dominante con herencia mendeliana según lo determinado por el análisis de Chi cuadrado (P > 0,05). El porcentaje de familias T1 que se segregaron con la herencia mendeliana esperada se ilustra en la Tabla 10 y demuestra que el rasgo dgt-28 se pasa a través de la herencia mendeliana a la generación T2. Las semillas se recolectaron de 5 a 15 individuos T2 (semilla T3). Se hicieron pruebas de descendencia de veinticinco hermanos T3 de cada una de 3-4 familias T2 seleccionadas aleatoriamente como se describió anteriormente. Los datos no mostraron segregación y, por lo tanto, demostraron que dgt-28 y dgt-3 están integrados establemente en el cromosoma y se heredan de manera mendeliana por lo menos a tres generaciones.
Tabla 10. Porcentaje de familias T1 (plantas T2) segregadas como herencia mendeliana única para una prueba de descendencia de 100 plantas.
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Datos de Arabidopsis T2. Las plantas de segunda generación (T2) de eventos de Arabidopsis T1 seleccionadas que tenían bajos números de copias del transgén dgt-28 se caracterizaron además por la tolerancia al glifosato. El glifosato se aplicó como se describió anteriormente. La respuesta de las plantas se presenta en términos de % de lesión visual 2 semanas después del tratamiento (WAT). Los datos se presentan como un histograma de individuos que muestran poca o ninguna lesión (< 20%), una lesión moderada (20-40%) o una lesión grave (> 40%). Se presenta una media aritmética y una desviación estándar para cada constructo utilizado para la transformación de Arabidopsis. El intervalo en la respuesta individual también se indica en la última columna para cada tasa y transformación. La Arabidopsis no transformada de tipo silvestre (cv. Columbia) sirvió como control sensible al glifosato. En la generación T2, las plantas hemicigóticas y homocigóticas estaban disponibles para las pruebas de cada evento y, por tanto, se incluyeron para cada tasa de glifosato analizada. Las plantas hemicigóticas contienen dos alelos diferentes en un locus en comparación con las plantas homocigóticas que contienen los mismos dos alelos en un locus. Se espera una variabilidad de la respuesta al glifosato en la generación T2 como resultado de la diferencia en la dosis génica para hemicigotos en comparación con las plantas homocigóticas. La variabilidad de respuesta al glifosato se refleja en la desviación estándar y el intervalo de respuesta.
En la generación T2, los eventos dgt-28, tanto de copia única como multicopia, se caracterizaron por la tolerancia al glifosato. Dentro de un evento, las plantas de una sola copia mostraron niveles similares de tolerancia al glifosato. Los datos característicos para un evento T2 de una sola copia se presentan en la Tabla 11. Los eventos que contienen d g t-28 unido con TraP5 v2 no proporcionaron una tolerancia alta al glifosato en comparación con los constructos de d g t-28 que contenían otros péptidos de tránsito TraP. Sin embargo, los constructos de d g t-28 TraP5 sí que proporcionaron un bajo nivel de tolerancia al glifosato en comparación con el control Columbia no transformado. Hubo casos en los que se demostró que los eventos que contenían dos o más copias de d g t-28 eran más susceptibles a tasas elevadas de glifosato (datos no mostrados). Este aumento en la sensibilidad al glifosato es similar a los datos descritos anteriormente para las plantas T1 que también contenían números elevados de copias del transgén dgt-28. Es probable que la presencia de altos números de copias del transgén dentro de las plantas de A ra b id o p s is tenga por resultado un silenciamiento del transgén u otros efectos epigenéticos que resulten en sensibilidad al glifosato, a pesar de la presencia del transgén dgt-28.
Estos eventos contenían d g t-28 unido con TraP5 v2 (pDAB105530), TraP12 v2 (pDAB105533) y TraP13 v2 (pDAB105534).
Además de d g t-28 , los eventos T2 A ra b id o p s is transformados con d g t-3 se presentan en la Tabla 12. Como se describe para los eventos d g t-28 en la Tabla 11, la tabla de datos contiene un evento representativo que es característico de la respuesta al glifosato para cada constructo. Para la caracterización de d g t-3 , se compararon constructos que contenían una sola PTU (unidad de transformación de plantas) con el gen d g t-3 impulsado por el promotor AtUbi10 (pDAB102716, FIG.45 y pDAB102715, FIG. 10) con constructos con el mismo gen que contiene 2 PTU del gen (pDAB102719, FIG. 32; pDAB102718, FIG. 33). Los constructos que contenían 2 PTU utilizaron el promotor AtUbi10 para dirigir una copia del gen y el promotor CsVMV para impulsar la otra copia. El uso de la doble PTU se incorporó para comparar las plantas transgénicas d g t-3 con las plantas transgénicas d g t-28 que contenían dos copias del transgén. Los datos demostraron que los eventos T2 d g t- 3 de copia única con solo una PTU única fueron más susceptibles al glifosato que los eventos d g t-28 de copia única probados, pero fueron más tolerantes que el control no transformado. Las familias T1 que contienen 2 PTUs del gen d g t-3 proporcionaron un mayor nivel de tolerancia visual al glifosato en comparación con los constructos de 1 PTU. En ambos casos se compararon las familias T1 con los controles dgt-1 y de tipo silvestre. Los datos T2 demuestran que d g t-28 proporciona una tolerancia alta como eventos de copia única.
Tabla 11. Respuesta de eventos de A ra b id o p s is T2 individuales seleccionados que contienen d g t-28 , a glifosato aplicado post-emergencia en tasas variables, en comparación con una población homocigótica resistente a dg t-1 (T4) y un control no transformado. % lesión visual 14 días después de la aplicación.
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Tabla 12. Respuesta de eventos de Arabidopsis T2 seleccionados transformados con dgt-3 a glifosato aplicado post­ emergencia a varias tasas. % lesión visual 14 días después de la aplicación.
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Datos de Arabidopsis T3. Las plantas de tercera generación (T3) de los eventos seleccionados de Arabidopsis T2 que contenían bajo número de copias del transgén dgt-28 se caracterizaron además por la tolerancia al glifosato. Se seleccionaron veinticinco plantas por línea con glufosinato como se describió anteriormente, y las líneas de cada constructo ensayado no se segregaron para el gen marcador seleccionable. El glifosato se aplicó como se describió anteriormente. La respuesta de las plantas se presenta en términos del % de lesión visual 2 semanas después del tratamiento (WAT). Los datos se presentan como un histograma de individuos que presentan poca o ninguna lesión (< 20%), lesión moderada (20-40%) o lesión grave (> 40%). Se presentan una media aritmética y desviación estándar para cada constructo utilizado para la transformación de Arabidopsis. El intervalo de respuesta individual también se indica en la última columna para cada tasa y transformación. Arabidopsis de tipo silvestre, no transformada (cv. Columbia) sirvió como control sensible al glifosato.
Tabla 13. Respuesta de eventos T3 Arabidopsis que contienen dgt-28 a glifosato aplicado en post-emergencia a tasas variables, comparada con una población homocigótica resistente a dgt-1 (T4) y un control no transformado. % de lesiones visuales 14 días después de la aplicación.
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Selección de plantas transformadas. Las semillas Ti recién cosechadas (genes dgt-31, dgt-32 y dgt-33 v1) se dejaron secar a temperatura ambiente y se enviaron a Indianápolis para su análisis. La semilla T1 se sembró en bandejas de germinación de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), recibiendo cada una de ellas partes alícuotas de 200 mg de semilla Ti estratificada (~ 10.000 semillas) que se habían suspendido previamente en 40 mL de solución de agarosa al 0,1% y se almacenó a 4 °C durante 2 días para completar los requisitos de latencia y asegurar la germinación sincronizada de las semillas.
Se cubrió Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticultura Inc., Bellevue, WA) con vermiculita fina y se sub-irrigó con solución de Hoagland hasta que se humedeció, y luego se dejó drenar por gravedad. Cada alícuota de 40mL de semilla estratificada se sembró uniformemente sobre la vermiculita con una pipeta y se cubrió con domos de humedad (KORD ™ Products, Bramalea, Ontario, Canadá) durante 4 - 5 días. Los domos se eliminaron una vez germinadas las plantas antes de la selección de transformante inicial utilizando un spray de post-emergencia con glufosinato (seleccionando el gen d s m -2 co-transformado).
Seis días después de la plantación (DAP), y de nuevo a los 10 DAP, se pulverizaron plantas T1 (cotiledón y fase 2-4-lf, respectivamente) con una solución al 0,1% de herbicida IGNITE™ (280 g ai/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) a un volumen de pulverización de 10 mL/bandeja (703 L/ha) utilizando una boquilla de pulverización de aire comprimido DeVilbiss™ para proporcionar una tasa efectiva de 200 g ae/ha de glufosinato por aplicación. Los sobrevivientes (plantas en crecimiento activo) se identificaron 4 - 7 días después de la pulverización final. Las plantas supervivientes se trasplantaron individualmente en macetas de 7,5 cm preparadas con medios de cultivo (Metro Mix 360™). Las plantas se criaron en el invernadero al menos 1 día antes del muestreo de tejido para los análisis del número de copias.
Se tomaron muestras de plantas T1 y se completó el análisis del número de copias para los genes dg t-31 , d g t-32 y d g t-33 v1. Las plantas T1 se asignaron luego a varias tasas de glifosato, de modo que entre cada tasa había una serie de copias. Para A ra b id o p s is , 26,25 g ae/ha glifosato es una dosis efectiva para distinguir las plantas sensibles de aquellas que tienen niveles de resistencia significativos. Se aplicaron tasas elevadas para determinar los niveles relativos de resistencia (105, 420, 1680 o 3360 g ae/ha). La Tabla 15 muestra las comparaciones sacadas a d g t-1.
Todas las aplicaciones de herbicida de glifosato se realizaron mediante un pulverizador de oruga en un volumen de pulverización de 187 L/ha. El glifosato usado fue de la formulación comercial de la sal de dimetilamina de Durango (480 g ae/L, Dow AgroSciences, LLC). Las plantas T1 de número de copias bajo que presentaron tolerancia al glufosinato o al glifosato accedieron a la generación T2.
Las primeras transformaciones de A ra b id o p s is se realizaron utilizando dg t-31 , d g t-32 y d g t-33 v 1. Los transformantes T1 se seleccionaron primero del fondo de semilla no transformada utilizando un esquema de selección de glufosinato. Se analizaron tres pisos o 30.000 semillas para cada constructo T1. Se calculó la frecuencia de transformación y los resultados de los constructos T1 dg t-31 , d g t-32 y d g t-33 se presentan en la Tabla 14.
Tabla 14. Frecuencia de transformación de constructos T1 dg t-31 , d g t-32 y d g t-33 de A ra b id o p s is seleccionados con glufosinato para la selección del gen marcador seleccionable DSM-2.
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Las plantas T1 seleccionadas anteriormente se trasplantaron después en macetas individuales y se pulverizaron con varias tasas de glifosato comercial. La Tabla 15 compara la respuesta de dg t-31 , d g t-32 y d g t-33 v i y los genes de control para conferir resistencia al glifosato a los transformantes T1 de A ra b id o p s is . La respuesta se presenta en términos de % de lesión visual 2 WAT. Los datos se presentan como un histograma de individuos con poca o ninguna lesión (< 20%), lesión moderada (20-40%) o lesión grave (> 40%). Se presenta una media aritmética y una desviación estándar para cada tratamiento. El intervalo en la respuesta individual se indica también en la última columna para cada tasa y transformación. La A ra b id o p s is no transformada de tipo silvestre (cv. Columbia) sirvió como control sensible al glifosato. El gen D G T -31 (v1) con el péptido de tránsito TraP23 confirió una ligera tolerancia a los herbicidas con plantas de A ra b id o p s is T1 individuales en comparación con el control negativo, pero el gen mostró una tolerancia mejorada con el péptido de tránsito TraP8. Tanto la DGT-32 como la DGT-33 demostraron una tolerancia alta al glifosato a las tasas probadas con TraP8 y con sus respectivos péptidos de tránsito al cloroplasto diferentes (TraP14 y TraP24 respectivamente). Dentro de un tratamiento dado, el nivel de respuesta de la planta varió en gran medida, lo que puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformación independiente y, por tanto, el número de copias del gen de interés varía de una a otra planta. Hay que señalar que, en cada tasa de glifosato ensayada, hubo individuos que fueron más tolerantes que otros. Se presenta en la Tabla 15 un promedio de lesiones en la población global por tasa, para demostrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con dgt-31, d g t-32 y d g t-33 v1 en comparación con dgt-1 v1 o los controles de tipo silvestre.
Tabla 15. Respuesta de Arabidopsis Ti transformada con dgt-31, dgt-32 y dgt-33 v i a un intervalo de tasas de glifosato aplicadas después del brote, en comparación con una población homocigótica resistente a dgt-1 (T4), o un control no transformado. % lesión visual 2 semanas después del tratamiento.
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Ejemplo 8: dgt-32 y dgt-33 como marcadores seleccionables.
dgt-32 y dgt-33 v i se utilizan como marcadores seleccionables con glifosato como agente de selección. El rendimiento de estos marcadores se analiza con Arabidopsis transformada. Aproximadamente 50 semillas de Arabidopsis de la generación T4 (homocigóticas para dgt-32 y dgt-33 v i) se fijan a aproximadamente 5.000 semillas de tipo silvestre (sensibles). Se comparan varios tratamientos, recibiendo cada bandeja de las plantas una o bien dos programaciones en el tiempo de aplicación de glifosato en uno de los siguientes esquemas de tratamiento: 7 DAP, 11 DAP, o 7 DAP seguido de 11 DAP. Dado que todos los individuos también contienen el gen dsm-2 en el mismo vector de transformación, dgt-32 y dgt-33 seleccionados con glifosato pueden ser comparados directamente con dsm-2 seleccionado con glufosinato.
Los tratamientos se aplican con una punta de pulverización DeVilbiss™. Las plantas se identifican como 17 DAP resistentes o sensibles. Los tratamientos de 26,25 - 280 g ae/ha 2,4-D aplicados 7 y 11 días después de la plantación (DAP) son igualmente efectivos en la frecuencia de selección. Estos resultados indican que dgt-32 y dgt-33 v i se pueden usar efectivamente como un marcador seleccionable.
Heredabilidad. Una variedad de eventos T1 se autopolinizaron para producir semilla T2. Se hicieron pruebas de descendencia de estas semillas mediante la aplicación de IGNITE™ (200 g ae/ha) a 100 hermanos T2 aleatorios. Cada planta T2 individual se trasplantó en macetas cuadradas de 7,5 cm antes de la aplicación del rociador (pulverizador de oruga a una tasa de aplicación de 187 L/ha). Se determinaron las familias T1 (plantas T2) que se segregan en 3 Resistente anticipado: Modelo sensible 1 para un locus único heredado dominantemente con herencia mendeliana según lo determinado por el análisis de Chi cuadrado (P> 0,05).
La semilla se recogió de 5 a 15 individuos T2 (semilla T3). Se hicieron pruebas de descendencia de veinticinco hermanos T3 de cada una de las 3 familias T2 seleccionadas al azar. Los datos que no presentan segregación demuestran que dgt-32 y dgt-33 v i se integraron de manera estable y se heredaron de manera mendeliana por lo menos a tres generaciones.
Caracterización de tolerancia a herbicidas adicionales de líneas T3 DGT. La semilla de Arabidopsis de la generación T3 se estratifica y se siembra en bandejas de selección. Una línea de control transformada que contiene dgt-1 y el control no transformado se plantan de manera similar. Las plántulas se transfieren a macetas individuales de 7,5 cm en el invernadero. Todas las plantas se rocían con un pulverizador de oruga ajustado a 187 L/ha. Las plantas se rocían con un intervalo de glifosato de 420-3.360 g ae/ha (DURANGO™ DMA, Dow AgroSciences). Todas las aplicaciones se formulan en agua. Cada tratamiento se repite 4 veces, y las plantas se evalúan a los 7 y 14 días después del tratamiento.
Ejemplo 9: Transformación de especies de cultivos adicionales.
La soja se transforma con dgt-28, dgt-31, dgt-32 y/o dgt-33 (con o sin un péptido de tránsito al cloroplasto) para proporcionar altos niveles de resistencia al herbicida glifosato, utilizando un método conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, sustancialmente las mismas técnicas descritas anteriormente en el Ejemplo 11 o en el Ejemplo 13 de la Publicación de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482.
El algodón se transforma con dgt-28, dgt-31, dgt-32 y/o dgt-33 (con o sin un péptido de tránsito al cloroplasto) para proporcionar niveles elevados de resistencia al herbicida glifosato utilizando un método conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, sustancialmente las mismas técnicas descritas anteriormente en los Ejemplos 14 de la patente de EE. UU. 7.838.733, o el Ejemplo 12 de la Publicación de Patente Internacional PCT N° WO 2007/053482.
La canola se transforma con dg t-28 , dg t-31 , dg t-32 y/o d g t-33 (con o sin un péptido de tránsito al cloroplasto) para proporcionar niveles elevados de resistencia al herbicida glifosato utilizando un método conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo sustancialmente las mismas técnicas descritas con anterioridad en el Ejemplo 26 de la patente de EE. UU. 7.838.733, o el Ejemplo 22 de la Publicación de Patente Internacional PCT No. w O 2007/053482.
Ejemplo 10: Transformación del maíz.
Constructos de ADN para la transformación del maíz. Los métodos de clonación estándar, como se describió anteriormente, se usaron en la construcción de vectores binarios para su uso en la transformación del maíz mediada por A g ro b a c te r iu m tum e fa c ien s . La Tabla 16 lista los vectores que se construyeron para la transformación del maíz. Los elementos genéticos siguientes se usaron en los vectores que contenían dg t-28 ; se usó el promotor ubiquitina 1 de Z e a m a ys (ZmUbi1; patente de Estados Unidos n° 5.510.474) para dirigir la secuencia codificante d g t-28 que está flanqueada por una región 3' no traducida de lipasa de Z ea m a ys (ZmLip 3'UTR; patente de Estados Unidos n° 7.179.902), el casete marcador seleccionable consiste en el promotor de ubiquitina 1 de Z ea m a ys que se usó para impulsar la secuencia codificante aad-1 (patente de EE. UU. n° 7.838.733) que está flanqueada por una región 3' no traducida de lipasa de Z ea m ays. La secuencia codificadora de aad-1 confiere tolerancia a los herbicidas de fenoxi auxina, tales como los herbicidas ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y ariloxifenoxipropionato (AOPP).
Los constructos d g t-28 se construyeron como vectores binarios estándar y vectores de sistema superbinario A g ro b a c te r iu m (Japan Tobacco, Tokio, JP). Los vectores binarios estándar incluyen pDAB107663, pDAB107664, pDAB107665 y pDAB107665. Los vectores del sistema superbinario A g ro b a c te r iu m incluyen pDAB108384, pDAB108385, pDAB108386 y pDAB108387.
Se completaron constructos adicionales que contienen un gen informador de p ro te ín a flu o re sce n te am a rilla (yfp; Solicitud de Patente de Estados Unidos 2007/0298412). pDAB109812 contiene una casete del gen informador y fp que es impulsado por el promotor de ubiquitina 1 de Z e a m a ys y flanqueado por la región per53' no traducida de Z ea m ays (Zm per53'UTR; Patente de EE. UU. No. 7.179.902), la casete marcadora seleccionable consiste en el promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar (SCBV; patente de EE. UU. n. 5.994.123) que se utiliza para dirigir la expresión de aad-1 y está flanqueado por la región 3' no traducida de la lipasa de Z e a m ays. pDAB101556 contiene una casete y fp que es impulsada por el promotor de ubiquitina 1 de Z e a m a y s y flanqueada por la región per 53' no traducida, la casete del marcador seleccionable consiste en el promotor de ubiquitina 1 de Z ea m a ys que se usa para dirigir la expresión de aad-1 y está flanqueada por la región 3' no traducida de la lipasa de Z e a m ays. pDAB107698 contiene una casete d g t-28 que es impulsada por el promotor de ubiquitina 1 de Z e a m a y s y está flanqueada por una región 3' no traducida de lipasa de Z e a m ays, una casete de y fp que es impulsada por el promotor de ubiquitina 1 de Z e a m a ys y flanqueada por la región per 53' no traducida, la casete marcador seleccionable consiste en el promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar que se usa para impulsar la expresión de aad-1 y está flanqueada por la región 3' no traducida de la lipasa de Z e a m ays. Estos tres constructos son vectores binarios estándar.
Tabla 16. Vectores de transformación del maíz
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Esterilización de mazorcas y aislamiento embrionario. Para obtener embriones inmaduros de maíz, se cultivaron en el invernadero plantas de la línea de cría B 104 de Zea mays y se auto- o sib-polinizaron para producir mazorcas. Las mazorcas fueron cosechadas aproximadamente 9-12 días después de la polinización. En el día experimental, las mazorcas se esterilizaron superficialmente por inmersión en una solución al 20% de hipoclorito de sodio (5%) y se agitaron durante 20-30 minutos, seguido por tres enjuagues en agua estéril. Después de la esterilización, se diseccionaron asépticamente embriones zigóticos inmaduros (1,5 - 2,4 mm) de cada mazorca y se distribuyeron al azar en tubos de microcentrífuga que contenían medios de infección líquidos (medio basal LS, 4,43 gm/L; solución de vitamina N6 [1000X], 1,00 mL/L; L-prolina, 700,0 mg/L; sacarosa, 68,5 g/l; D (+) glucosa, 36,0 gm/L; 10 mg/mL de 2,4-D, 150mL/L). Para un conjunto dado de experimentos, se utilizaron embriones de tres mazorcas agrupados para cada transformación.
Iniciación del cultivo de Agrobacterium:
Las existencias de glicerol de Agrobacterium que contienen los vectores de transformación binarios descritos anteriormente se sembraron en placas de medio mínimo AB que contenían antibióticos apropiados y se desarrollaron a 20 °C durante 3 - 4 días. Se seleccionó una única colonia y se extendió a placas YEP que contenían los mismos antibióticos y se incubó a 28 °C durante 1 - 2 días.
Cultivo de Agrobacterium y co-cultivo. Las colonias de Agrobacterium se tomaron de la placa YEP, se suspendieron en 10 mL de medio de infección en un tubo desechable de 50 mL, y se ajustó la densidad celular a una 0D600 nm de 0,2 - 0,4 utilizando un espectrofotómetro. Los cultivos de Agrobacterium se pusieron en un agitador rotatorio a 125 rpm, a temperatura ambiente, mientras se realizaba la disección del embrión. Se aislaron embriones zigóticos inmaduros de un tamaño de 1,5 a 2,4 mm, de los granos de maíz esterilizados y se colocaron en 1 mL del medio de infección) y se lavaron una vez en el mismo medio. La suspensión de Agrobacterium (2 mL) se añadió a cada tubo y los tubos se colocaron en una plataforma de agitación durante 10 -15 minutos. Los embriones se transfirieron a medios de co-cultivo (MS Salts, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; myo-inositol, 100,0 mg/L; hidrolizado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; sacarosa, 30,0 g/L; Gelzan™, 3,00 g/L; MS-Vitamina modificada [1000X], 1,00mL/L; 8,5 mg/mL AgNo3, 15,0 mg/L; DMSO, 100 mM), orientados con el escutelo hacia arriba y se incubaron a 25 °C, a la luz 24 horas a 50 pmoles itt2 seg'1 de intensidad luminosa durante 3 días.
Selección de callos y regeneración de eventos putativos. Después del período de cocultivo, los embriones se transfirieron a medios de reposo (MS Salts, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; 1,2,3,5/4,6-hexahidroxiciclohexano, 100 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanosulfónico), ácido libre] 0,500 g/mL; hidrolizado enzimático de caseína 100,0 mg/L; dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; sacarosa, 30,0 g/L; Gelzan 2,30 gm/L; MS-Vitamina modificada [1000X], 1,00mL/L; 8,5mg/ml AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) sin agente selectivo y se incubó bajo 24 horas de luz a 50 pmoles tt2 s_1 de intensidad luminosa y a 25 °C durante 3 días.
Los experimentos de respuesta a la dosis de inhibición del crecimiento sugirieron que las concentraciones de glifosato de 0,25 mM y superiores eran suficientes para inhibir el crecimiento celular en la línea de maíz B104 no transformada. Los embriones se transfirieron a un medio de Selección 1 que contenía glifosato 0,5 mM (sales de MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; myo-inositol, 100,0 mg/L; MES [ácido (2- (n-morfolino) -etanosulfónico), ácido libre] 0,500 g/l; hidrolizado enzimático de caseína 100,0 mg/l; Dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/l; sacarosa, 30,0 g/l; Gelzan™ 2,30 g/l; MS-vitamina modificada [1000X], 1,00mL/L; 8,5mg/ml AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) e incubados en luz oscura y/o bajo 24 horas a 50 mmoles tt2 seg_1 de intensidad luminosa por 7 -14 días a 28 °C.
Los callos embriogénicos en proliferación se transfirieron a medios de Selección 2 que contenían glifosato 1,0 mM (sales de MS, 4,33 g/L; 1,2,3,5/4,6-hexahidroxiciclohexano, 100 mg/L; L-prolina, 700,0 mg/L; MES [(ácido 2- (nmorfolino) etanosulfónico), ácido libre] 0,500 g/L; caseína hidrolizada enzimática 100,0 mg/L; dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; sacarosa, 30,0 g/L Gelzan™ 2,30 gm/L; MS-Vitamina modificada [1000X], 1,00mL/L; 8,5mg/mL AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L; R-Haloxyfop ácido 0,1810 mg/L), y se incubaron en la oscuridad y/o bajo luz de 24 horas a 50 mmoles tt2 seg_1 de intensidad luminosa durante 14 días a 28 °C. Esta fase de selección permitió que el callo transgénico proliferara y se diferenciara aún más. El período de selección de callos duró de tres a cuatro semanas.
Los callos proliferantes y embriogénicos se transfirieron a medios PreReg que contenían glifosato 0,5 mM (MS Salts, 4,33 g/L; 1,2,3,5/4,6-hexahidroxiciclohexano, 100 mg/L; L-prolina, 350,0 mg/L; MES [[ácido 2-(n-morfolino)-etanosulfónico), ácido libre] 0,250 g/L; hidrolizado enzimático de caseína 50,0 mg/L; NAA-NaOH 0,500 mg/L; ABA-EtOH 2,50 mg/L; BA 1,00 mg/L; sacarosa, 45,0 gm/L; Gelzan™ 2,50 gm/L; MS-Vitamina modificada [1000X], 1,00mL/L; 8,5mg/ml AgNo3, 1,00 mg/L; carbenicilina, 250,0 mg/L) y se cultivaron bajo luz de 24 horas a 50 mmoles tt2 sec1 de intensidad luminosa durante 7 días a 28 °C.
Los callos embriogénicos con yemas similares a brotes se transfirieron a un medio de regeneración que contenía glifosato 0,5 mM (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-hexahidroxiciclohexano, 100,0 mg/L; sacarosa, 60,0 gm/L; Gellan Gum G434™ 3,00 gm/L; MS-Vitamina modificada [1000X ], 1,00mL/L; carbenicilina, 125,0 mg/L) y se cultivó a la luz 24 horas a 50 mmoles m-2 seg_1 de intensidad luminosa durante 7 días.
Los brotes pequeños con raíces primarias se transfirieron a medios de enraizamiento (MS Salts, 4,33 gm/L; MS Vitamina modificada [1000X], 1,00mL/L; 1,2,3,5/4,6-hexahidroxiciclohexano, 100 mg/L; sacarosa, 60,0 g/L; Gellan Gum G434™ 3,00 g/L; carbenicilina, 250,0 mg/L) en fitobandejas y se incubaron durante 16/8 horas de luz/oscuridad a 140-190 mmoles m-2 seg-1 de intensidad luminosa durante 7 días a 27 °C. Las plantas transgénicas putativas se analizaron para determinar el número de copias del transgén utilizando los protocolos descritos anteriormente y se transfirieron a la tierra.
Confirmación molecular de la presencia de los transgenes dgt-28 y aad-1 dentro de las plantas de maíz. La presencia de las secuencias de polinucleótidos dgt-28 y aad-1 se confirmó mediante ensayos de sonda de hidrólisis. Las plantas de maíz T0 aisladas se seleccionaron inicialmente mediante un ensayo de sonda de hidrólisis, análogo a TAQMAN™, para confirmar la presencia de los transgenes aad-1 y dgt-28. Los datos generados por estos estudios se utilizaron para determinar el número de copias del transgén y se utilizaron para seleccionar eventos de maíz transgénico para el cruce y avance hacia la generación T1.
Se recogieron muestras de tejido en placas de 96 pocillos, se realizó la maceración de tejido con un pulverizador de tejido KLECO™ y perlas de acero inoxidable (Hoover Precision Products, Cumming, GA), en tampón Qiagen™ RLT. Después de la maceración del tejido, el ADN genómico se aisló en un formato de alto rendimiento utilizando el kit Biosprint 96™ Plant (Qiagen, Germantown, MD) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. El ADN genómico se cuantificó mediante el kit de ensayo de ADN Pico Green de Quant-IT™ (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADN genómico cuantificado se ajustó a aproximadamente 2 ng/pL para el ensayo de sonda de hidrólisis utilizando un manipulador automático de líquidos BIOROBOT3000™ (Qiagen, Germantown, MD). La determinación del número de copias de transgénicos mediante un ensayo de sonda de hidrólisis, análogo al ensayo TAQMAN®, se realizó mediante PCR en tiempo real utilizando el sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Se diseñaron ensayos para aad-1, dgt-28 y un gen de referencia interno Invertase (Genbank Número de Registro: U16123.1) utilizando el Software de Diseño de Sonda LIGHTCYCLER® 2.0. Para la amplificación, se preparó la mezcla maestra de sondas LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) a una concentración final de 1X en una reacción multiplex de 10 pL de volumen que contiene 0,4 pM de cada cebador para aad-1 y dgt-28 y 0,2 pM de cada sonda (Tabla 17).
Se realizó una reacción de amplificación en dos etapas con una extensión a 60 °C durante 40 segundos con adquisición de fluorescencia. Todas las muestras se analizaron y los valores promedio de umbral de ciclo (Ct) se utilizaron para el análisis de cada muestra. El análisis de los datos de PCR en tiempo real se realizó con el software LightCycler® versión 1.5 usando el módulo de cuantificación relativa y se basa en el método AACt. Los controles incluyeron una muestra de ADN genómico de un calibrador de copia única y dos verificaciones de copia conocidas que se incluyeron en cada ejecución. La Tabla 18 enumera los resultados de los ensayos de sonda de hidrólisis.
Tabla 17. Secuencias de cebador y sonda utilizadas para el ensayo de la sonda de hidrólisis de aad-1, dgt-28 y referencia interna (Invertasa).
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Tabla 18. Copiar resultados de cantidades para eventos de dgt-28. Los eventos de bajo número de copias consistían en 1-2 copias transgénicas, números de copia única se listan entre paréntesis. Los eventos de alto número de copias contenían 3 o más copias transgénicas.
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Ejemplo 11: Tolerancia al herbicida en maíz transformado con dgt-28.
Se dejó que los eventos de transformación dgt-28 de Zea mays (T0) se aclimataran en el invernadero y se cultivaron hasta que las plantas pasaron del cultivo de tejidos a las condiciones de crecimiento en invernadero (es decir, 2-4 hojas nuevas de aspecto normal habían emergido del verticilo). Las plantas se cultivaron a 27 °C bajo condiciones de 16 horas de luz:8 horas de oscuridad en el invernadero. Las plantas se trataron luego con formulaciones comerciales de DURANGO DMA™ (que contiene el herbicida glifosato) con la adición de 2% p/v de sulfato amónico. Las aplicaciones de herbicidas se realizaron con un pulverizador de oruga a un volumen de pulverización de 187 L/ha, 50 cm de altura de pulverización. Las plantas T0 se rociaron con un intervalo de glifosato de 280 a 4.480 g ae/ha de glifosato, que es capaz de dañar significativamente las líneas de maíz no transformadas. Una dosis letal se define como la tasa que causa > 95% de daño a la endogamia B104.
Los resultados de las plantas de maíz T0 dgt-28 demostraron que la tolerancia al glifosato se conseguía a velocidades de hasta 4.480 g ae/ha. Se usó un tipo de medio específico en la generación T0. La atrofia mínima y el crecimiento vegetal global de las plantas transformadas en comparación con los controles no transformados demostraron que dgt-28 proporciona una tolerancia alta al glifosato cuando se unen a los péptidos de tránsito al cloroplasto TraP5, TraP8 y TraP23.
Las plantas T0 seleccionadas se autofertilizan o se retrocruzan para una mayor caracterización en la próxima generación. 100 líneas de dgt-28 elegidas que contienen las plantas T1 se pulverizan con 140-1.120 g ae/ha de glufosinato o 105-1680 g ae/ha de glifosato. Tanto el marcador seleccionable como el gen resistente al glifosato se construyen en el mismo plásmido. Por tanto, si se selecciona un gen tolerante al herbicida rociando con el herbicida, se cree que ambos genes están presentes. A los 14 DAT, se cuentan las plantas resistentes y sensibles para determinar el porcentaje de líneas que se segregaron como un solo locus, rasgo mendeliano dominante (3R: 1S) según se determina por el análisis de Chi cuadrado. Estos datos demuestran que dgt-28 es heredable como gen de resistencia robusta a glifosato en una especie monocot. Se aplican mayores tasas de glifosato a los sobrevivientes de T1 o F1 para caracterizar aún más la tolerancia y protección proporcionada por el gen dgt-28.
Tolerancia al herbicida post-emergencia en el maíz T0 transformado con dgt-28. Los eventos T0 de dgt-28 vinculados con TraP4, TraP5, TraP8 y TraP23 se generaron mediante transformación con Agrobacterium y se les permitió aclimatarse en condiciones de cámara de crecimiento controlada hasta que emergieron 2-4 hojas nuevas de aspecto normal. A las plantas se les asignaron números de identificación individuales y se tomaron muestras para los análisis del número de copias de dgt-28 y aad-1. Basándose en los análisis del número de copias, las plantas se seleccionaron para los análisis de expresión de proteínas. Las plantas se trasplantaron en macetas más grandes con medios de cultivo nuevos y se cultivaron a 27 °C bajo 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad en el invernadero. Las plantas restantes que no fueron muestreadas para la expresión de proteínas se trataron después con formulaciones comerciales de DURANGO DMA™ (glifosato) con la adición de 2% p/v de sulfato amónico. Los tratamientos se distribuyeron de manera que cada agrupación de plantas contenía eventos T0 de número de copias variable. Las aplicaciones de herbicidas se realizaron con un pulverizador de oruga a un volumen de pulverización de 187 L/ha, altura de rociado 50 cm. Las plantas T0 se pulverizaron con un intervalo de glifosato de 280-4480 g ae/ha de glifosato capaz de causar una lesión significativa en líneas de maíz no transformadas. Una dosis letal se define como la tasa que provoca > 95% de daño a la endogamia B104. B104 fue el fondo genético de los transformantes.
Los resultados de las plantas de maíz T0 dgt-28 demuestran que se alcanzó la tolerancia al glifosato hasta 4.480 g ae/ha. Tabla 19. La atrofia mínima y el crecimiento vegetal de las plantas transformadas en comparación con los controles no transformados demostraron que d g t-28 proporciona una protección robusta al glifosato cuando se vincula a TraP5, TraP8 y TraP23.
Tabla 19. Respuesta de eventos T0 d g t-28 de números de copias variables a tasas de glifosato que se encuentran en el intervalo de 280 a 4.480 g ae/ha 2,0% p/v de sulfato amónico 14 días después del tratamiento.
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Los análisis de expresión de proteínas por ELISA estándar demostraron un intervalo medio de proteína DGT-28 de 12,6 a 22,5 ng/cm2 a través de los constructos probados.
Confirmación de la tolerancia al glifosato en la generación F1 bajo condiciones de invernadero. Las plantas T0 de una sola copia que no fueron pulverizadas se retrocruzaron al fondo B104 no transformado para una caracterización adicional en la generacion siguiente. En la generación T1, se evaluó la tolerancia al glifosato para confirmar la herencia del gen d g t-28. Para las plantas T1, se aplicó el herbicida ASSURE II™ (35 g ae/ha de quizalofop-metilo) en la fase de crecimiento V1 para seleccionar la proteína AAD-1. Tanto el marcador seleccionable como el gen de resistencia al glifosato se construyen en el mismo plásmido. Por tanto se cree que, si se selecciona un gen, ambos genes están presentes. Después de 7 DAT, se contaron las plantas resistentes y sensibles y se eliminaron las plantas nulas de la población. Estos datos demuestran que d g t-28 (v1) es heredable como gen firme de resistencia al glifosato en una especie monocotiledónea. Se tomaron muestras de las plantas para la caracterización de la proteína DGT-28 por ELISA estándar y del nivel de transcripción de ARN. Las plantas resistentes se pulverizaron con 560-4.480 g ae/ha de glifosato como se describió con anterioridad. Los datos demuestran una tolerancia alta de d g t-28 vinculado con los péptidos de tránsito al cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 y TraP23 hasta 4480 g ae/ha de glifosato. Tabla 20.
Tabla 20. Respuesta de eventos de d g t-28 de copia única F1 a tasas de glifosato que varían de 560 a 4.480 g ae/ha 2,0% p/v de sulfato amónico, 14 días después del tratamiento.
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Los datos de expresión de proteínas demuestran un intervalo de proteína DGT-28 medio de 42,2 a 88,2 ng/cm2 a través de los eventos T1 y constructos probados, estableciendo la expresión de proteínas en la generación T1.
Caracterización de maíz dgt-28 bajo condiciones de campo. Se enviaron eventos T1 de copia única a una ubicación de campo para crear semillas híbridas hemicigotas y consanguíneas homocigotas para una caracterización adicional. Las semillas híbridas se crearon cruzando eventos T1 en la línea de transformación B104 del maíz a la línea 4XP811 consanguínea generando poblaciones híbridas que segregan 1: 1 (hemicigóticas: nula) para el evento. Las semillas resultantes se enviaron a 2 ubicaciones separadas. Se plantó un total de cinco eventos de copia única por constructo en cada ubicación en un diseño de bloques completos al azar por triplicado. Los campos fueron diseñados para que las aplicaciones de glifosato se produjesen en la fase de crecimiento V4 y en un grupo separado de plantas, para aplicarse en la etapa de crecimiento V8. El híbrido convencional 4XP811/B104 se utilizó como control negativo.
Las filas experimentales se trataron con 184 g ae/ha de ASSURE II™ (106 g ai/L de quizalofop-metilo) para eliminar los segregantes nulos. Todas las entradas experimentales se segregaron 1:1 (sensible: resistente) (p = 0,05) con respecto a la aplicación de ASSURE II™. Se tomaron muestras de plantas resistentes seleccionadas de cada evento para la cuantificación de la proteína DGT-28 mediante ELISA estándar.
Las plantas resistentes a quizalofop-metilo fueron tratadas con el herbicida comercial DURANGO DMA™ (480 g ae/L de glifosato) con la adición de 2,5% p/v de sulfato amónico en cualquiera de las etapas de crecimiento V4 o V8. Las aplicaciones de herbicida se realizaron con una barra pulverizadora calibrada para suministrar un volumen de 187 L/ha, altura de pulverización de 50 cm. Las plantas se rociaron con un intervalo de glifosato de 1.120 a 4.480 g ae/ha, capaz de causar una lesión significativa en líneas de maíz no transformadas. Una dosis letal se define como la tasa que produce > 95% de daño a la endogamia 4XP811. Se realizaron evaluaciones de lesiones visuales para el porcentaje de clorosis visual, porcentaje de necrosis, porcentaje de inhibición del crecimiento y lesión visual total a los 7, 14 y 21 DAT (días después del tratamiento). Las evaluaciones se compararon con los controles no tratados para cada línea y los controles negativos.
Los datos de lesión visual para todos los programas de tiempos de evaluación demostraron una tolerancia alta de hasta 4.480 g ae/ha de DURANGO DMA™ en ambas ubicaciones y tiempos de aplicación. Los eventos representativos para la aplicación V4 se presentan desde una ubicación y son consistentes con otros eventos, tiempos de aplicación y ubicaciones. Tabla 21. Un evento del constructo que contiene dgt-28 vinculado con TraP23 (pDAB107665) fue tolerante a la selección de ASSURE II™ para la proteína AAD-1, pero fue sensible a todas las tasas de glifosato aplicadas.
Tabla 21. Respuesta de los eventos dgt-28 aplicados con un intervalo de glifosato de 1.120-4.480 g ae/ha 2,5% p/v de sulfato amónico en la fase de crecimiento V4.
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Se realizaron evaluaciones adicionales durante la fase de crecimiento reproductivo para la tasa de glifosato de 4.480 g ae/ha. Las evaluaciones visuales de las panículas, el tiempo de polinización y el relleno de la mazorca fueron similares a los controles no tratados de cada línea para todos los constructos, tiempos de aplicación y ubicaciones. Los resultados de la cuantificación de la proteína d GT-28 demostraron un intervalo de expresión media de proteínas de 186,4 a 303,0 ng/cm2 Los datos demuestran una tolerancia alta del maíz transformado con dgt-28 en condiciones de campo a través de las etapas de crecimiento reproductivo hasta 4.480 g ae/ha de glifosato. Los datos también demostraron la detección de la proteína DGT-28 y la función basada en los resultados de tolerancia a la pulverización.
Confirmación de la heredabilidad y tolerancia del maíz dgt-28 en el estado homocigótico. Las semillas del T-|S2 se plantaron bajo las condiciones de invernadero como se describió anteriormente. Las mismas cinco líneas de copia única que se caracterizaron bajo las condiciones de campo se caracterizaron en el estado homogéneo. Las plantas se cultivaron hasta la fase de crecimiento V3 y se separaron en tres tasas de glifosato en el intervalo entre 1.120 y 4.480 g ae/ha de glifosato (DURANGO DMA™) y cuatro replicados por tratamiento. Las aplicaciones se realizaron con un pulverizador de oruga como se describió anteriormente y se formularon en 2,0% p/v de sulfato amónico. Una aplicación de sulfato amónico sirvió como verificación no tratada para cada línea. Se realizaron evaluaciones visuales 7 y 14 días después del tratamiento como se describió anteriormente. Los datos demostraron una tolerancia alta de hasta 4.480 g ae/ha de glifosato para todos los eventos probados. Tabla 22.
Tabla 22. Respuesta de eventos homocigóticos d g t-28 aplicados con un intervalo de glifosato de 1.120-4.480 g ae/ha 2,0% p/v de sulfato amónico.
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La línea de pDAB107665 que no era tolerante en condiciones de campo no poresentó tolerancia al glifosato y, por tanto, es consistente con las observaciones de campo (datos no mostrados). Con la excepción de la línea mencionada anteriormente, todas las réplicas que fueron tratadas con glifosato a partir de las líneas fueron no sensibles al glifosato. Por tanto, los datos demuestran la heredabilidad a una población homogénea de maíz d g t-28 de manera mendeliana. La expresión de la proteína DGT-28 mediante ELISA estándar demostró un intervalo de expresión de proteína media de 27,5 a 65,8 ng/cm2 en eventos de copia única que eran tolerantes al glifosato. Los datos demuestran la proteína funcional y la estabilidad de la proteína DGT-28 a través de generaciones.
Ejemplo 12: Uso de tolerancia al herbicida post-emergencia del glifosato como marcador seleccionable.
Como se describió con anterioridad, las plantas transformadas con T0 se trasladaron del cultivo de tejidos y se aclimataron en el invernadero. Los eventos ensayados contenían d g t-28 enlazado a péptidos de tránsito al cloroplasto TraP5, TraP8 y TraP23. Se demostró que estas plantas T0 proporcionaron una tolerancia alta de hasta 4.480 g ae/ha de glifosato, y las plantas no transformadas se controlaron con glifosato a concentraciones tan bajas como 280 g ae/ha. Estos datos demuestran que d g t-28 puede utilizarse como marcador seleccionable utilizando una concentración de glifosato que varía de 280 a 4480 g ae/ha.
Una serie de semillas de líneas de maíz fijadas que contienen el transgén d g t-28 se añaden a una serie de semillas de maíz no transformadas. Las semillas se plantan y se dejan crecer hasta la etapa de desarrollo V1-V3, momento en el cual las plántulas se rocían con una dosis selectiva de glifosato en el intervalo de 280 a 4480 g ae/ha. Después de 7-10 días, se cuentan las plantas sensibles y las resistentes, y la cantidad de plantas tolerantes al glifosato se correlaciona con el número original de semillas transgénicas que contiene el transgén d g t-28 que se plantaron.
Ejemplo 13: Apilamiento de maíz dgt-28.
La proteína AAD-1 se usa como el marcador seleccionable en el maíz transformado d g t-28 con fines de investigación. El gen aad-1 se puede también utilizar como un rasgo tolerante a los herbicidas en el maíz para proporcionar una robusta tolerancia de 2,4-D hasta una aplicación de V8 en un cultivo. Cuatro eventos de los constructos pDAB107663 (TraP4 :: dgt-28), pDAB107664 (TraP8 :: dgt-28) y pDAB107666 (TraP5 :: dgt-28) se caracterizaron por la tolerancia de una aplicación de mezcla de tanque de glifosato y 2,4-D. El estudio de caracterización se completó con semillas F1 bajo condiciones de invernadero. Las aplicaciones se realizaron en un pulverizador de oruga como se describió anteriormente a las tasas siguientes: 1.120-2.240 g ae/ha de glifosato (selectivo para el gen d g t-28 ), 1.120-2.240 g ae/ha 2,4-D (selectivo para el gen a a d -1 ), o una mezcla de tanque de los dos herbicidas a las tasas descritas. Las plantas eran calificadas a los 7 y 14 DAT. Los resultados de la pulverización para aplicaciones de los herbicidas a 2.240 g ae/ha se muestran en la Tabla 23.
Tabla 23. Respuesta de F1 aad-1 y dgt-28 maíz pulverizado con 2240 g ae/ha de 2,4-D, glifosato y una combinación de mezcla de los dos herbicidas 14 días después del tratamiento.
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Los resultados confirman que dgt-28 puede apilarse con éxito con a a d -1 , aumentando así el espectro de herbicidas que se pueden aplicar al cultivo de interés (glifosato ácidos fenoxiacéticos para d g t-28 y a a d -1 , respectivamente). En la producción de cultivos en donde existen malezas de hoja ancha difíciles de controlar o biotipos de malezas resistentes, la pila se puede utilizar como medio de control de malezas y protección del cultivo de interés. Los rasgos de entrada o salida adicionales también se pueden apilar con el gen d g t-28 en el maíz y en otras plantas.
Ejemplo 14: Transformación de otros cultivos
Otros cultivos se transforman utilizando técnicas conocidas. Para la transformación de centeno mediada por A g ro b a c te r iu m , véase p. ej. Popelka J. C., Xu J, Altpeter F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye”, Transgenic Res. 2003 Oct; 12 (5): 587 - 96.). Para la transformación de sorgo mediada por A g ro b a c te r iu m , véase, p. ej., Zhao et al., "A g ro b a c te r iu m mediated sorghum transformation”, Plant Mol. Biol. Dec. 2000; 44 (6): 789 - 98. Para la transformación de cebada mediada por A g ro b a c te r iu m , véase, p. ej., Tingay et al., "Agrobacterium tumefaciensmediated barley transformation”, The Plant Journal, (1997) 11: 1369 - 1376. Para la transformación del trigo mediada por A g ro b a c te r iu m , véase, p. ej., Cheng et al., "Genetic Transformaton of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Plant Physiol. 1997 Nov; 115 (3): 971 - 980. Para la transformación del arroz mediada por A g ro b a c te r iu m , véase p.ej. Hiei et al., "Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens", Plant Mol. Biol. Sept 1997; 35 (1-2): 205- 18.
Otras técnicas de transformación (no Agrobacterium) se utilizan para transformar dgt-28, dgt-32 o dgt-33, por ejemplo, en Maíz (Zea mays), Trigo (Triticum spp.), Arroz (Oryza spp. y Zizania spp.), Cebada (Hordeum spp.), Algodón (Abroma augusta y Gossypium spp.), Soja (Glycine max), Azúcar y remolacha (Beta spp.), Caña de azúcar (Arenga pinnata), Tomate (Lycopersicon esculentum) y otras especies, Physalis ixocarpa, Solanum incanum y otras especies, y Cyphomandra betacea), Patatas (Solanum tuberosum), batatas (Ipomoea batatas), Centeno (Secale spp.), Pimientos (Capsicum annuum, chinense y frutescens), Lechuga (Lactuca sativa, perennis y pulchella), Col (Brassica spp.), Apio (Apium graveolens), Berenjena (Solanum melongena), Maní (Arachis hypogea), Sorgo (Sorghum spp.), Alfalfa (Medicago sativa), Zanahoria (Daucus carota), Frijoles (Phaseolus spp. y otros géneros), Promed.na (Promed.na sativa y strigosa), Guisantes (Pisum, Vigna y Tetragonolobus spp.), Girasol (Helianthus annuus), Calabaza (Cucurbita spp.), Pepino (Cucumis sativa), Tabaco (Nicotiana spp.), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Césped (Lolium, Agrostis, Poa, Cynodon y otros géneros), Trébol (Trifolium), Algarroba (Vicia).
La resistencia al glifosato conferida por dgt-28, dgt-32 y dgt-33 incrementa la aplicabilidad de los herbicidas de glifosato para uso en temporada en muchos sistemas de cultivo de madera de hoja caduca y de hoja perenne. Las especies maderables resistentes al herbicida de glifosato aumentan la flexibilidad del uso excesivo de estos herbicidas sin problemas de lesiones. Así, dgt-28, dgt- 32 y/o dgt-33 se transforman en especies maderables: aliso (Alnus spp.), fresno (Fraxinus spp.), álamo y chopo (Populus spp.), haya (Fagus spp.), abedul (Kspp.), cerezo (Prunus spp.), eucalipto (Eucalyptus spp.), nogal (Carya spp.), arce (Acer spp.), roble (Quercus spp.) y pino (Pinus spp.).
La resistencia al herbicida del glifosato aumenta la aplicabilidad de los herbicidas del glifosato para el control selectivo de malezas en especies ornamentales y frutales. Así, dgt-28, dgt-32 y/o dgt-33 se transforman en las especies ornamentales y frutales: rosa (Rosa spp.), arbusto ardiente (Euonymus spp.), petunia (Petunia spp.), begonia (Begonia spp.), rododendro (Rhododendron spp.), manzano (Malus spp.), pera (Pyrus spp.), melocotón (Prunus spp.) y caléndulas (Tagetes spp.).
Ejemplo 15: Apilamiento con otros rasgos.
Los cultivos transgénicos que contienen rasgos de resistencia a insectos (IR) prevalecen en las plantas de maíz, soja y algodón en toda América del Norte, y el uso de estos rasgos se está expandiendo a todo el mundo. Muchas empresas productoras de semillas han desarrollado cultivos transgénicos comerciales que combinan rasgos resistentes a los insectos y tolerantes a los herbicidas (HT). Estos incluyen rasgos de Bacillus thuringiensis (p. ej. toxinas Bt listadas en el sitio web lifesci.sussex.ac.uk, 2006), rasgos de resistencia a insectos no Bt y cualquiera o todos los rasgos HT mencionados anteriormente. La capacidad de controlar múltiples problemas de plagas a través de los rasgos de IR es un valioso concepto de producto comercial. Sin embargo, la conveniencia de este concepto de producto se restringirá si el control de malezas y el control de insectos son independientes entre sí.
Dgt-28, dgt-31, dgt-32 o dgt-33, solos o apilados con uno o más rasgos de HT adicionales, se apilan con uno o más rasgos de entrada adicionales (por ejemplo, resistencia a insectos, resistencia a hongos, o tolerancia al estrés, et al. (véase www.isb.vt.edu), ya sea a través de la crianza convencional o conjuntamente como un nuevo evento de transformación. El rasgo o los rasgos de IR se apilan con dgt-28, dgt- 31, dgt-32 o dgt-33. Al obtener una secuencia de codificación de un rasgo de IR, se agregan elementos de expresión (por ejemplo, promotor, intrón, 3'UTR, etc.) y el rasgo de IR se apila molecularmente con dgt-28, dgt-31, dgt-32 o dgt -33 a través de metodologías de ADN recombinante.
Los rasgos de IR incluyen: CrylF (U.S. Pat. Nos. 5.126.133; 5.188.960; 5.691.308; 6.096.708; 6.573.240; y 6.737.273). Cry1A(c) (patentes de EE. UU. Nos. 6.114.138; 5.710.020; 6.251.656; y 6.229.004), CrylF y Cry1A(c) como una pila triple con dgt-28, dgt-31, dgt-32, o dgt-33, Cry34Ab(1) (patentes de EE. UU. Nos. 7.323.556; 7.897.342; 7.888.495; 7.875.430; 7.932.033; 7.956.246; 6.340.593). Cry35 Ab(1) (patentes de EE. UU. Nos. 6.340.593; 7.323.556; 7.897.342; 7.888.495; 7.875.430; 7.932.033; 7.956.246), y/o Cry35Ab(1) y Cry 34Ab(1) como triple pila con dgt-28, dgt-31, dgt-32 y/o dgt-33.
Los beneficios incluyen el control de malezas mejorado ofrecido por dgt-28, dgt-31, dgt-32 o dgt-33, y descrito en ejemplos anteriores, ligado a la capacidad de controlar plagas de insectos y/u otras tensiones agronómicas. Las plantas que comprenden dichos rasgos apilados con dgt-28, dgt-31, dgt-32 y/o dgt-33 proporcionan un paquete agronómico completo de calidad del cultivo mejorada con la capacidad de controlar de manera flexible y económica cualquier número de problemas agronómicos. Los rasgos combinados de IR y HT tienen aplicación en la mayoría de los cultivos agronómicos y hortícolas/ornamentales y forestales.
La combinación de dgt-28, dgt-31, dgt-32 o dgt-33, y la adecuada tolerancia al herbicida y resistencia a los insectos permitida por cualquiera del número de genes de IR Bt o no Bt se pueden aplicar a las especies de cultivo presentadas en este documento. El uso de cualquiera de los diversos herbicidas comerciales listados en este documento en tales cultivos se hace posible mediante la transformación de dgt-28, dgt-31, dgt-32 o dgt- 33 y el apilamiento con el correspondiente rasgo HT o rasgo IR, ya sea mediante crianza convencional o ingeniería genética. Las tasas de aplicación específicas de herbicidas representativos de estas químicas están determinadas por las etiquetas de herbicidas compiladas en el libro CPR (Referencia de Protección de Cultivos) o compilación similar, etiquetas compiladas on line (por ejemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp), o cualquier guía comercial o académica de protección de cultivos, como la Guía de Protección de Cultivos de Agriliance (2005).
Ejemplo 16: Rasgo DGT apilado con un rasgo AAD en cualquier cultivo.
Apilando un rasgo d g t con un rasgo a a d (por ejemplo, aad-1 descrito en la patente de EE. UU. 7.838.733; o a a d -12 descrito en la Publicación de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482 A2), ya sea mediante crianza convencional o conjuntamente como nuevo evento de transformación, se han mejorado la eficacia del control de malezas, la flexibilidad y la capacidad para gestionar los cambios de malezas y el desarrollo de resistencia a herbicidas.
La transformación de cultivos con aad-1 permite a un productor aplicar selectivamente herbicidas de ariloxialcanoato en cultivos de monocotiledóneas. Dichos cultivos de monocot tendrán un margen mayor de seguridad fenoxi auxina. Además, las fenoxi auxinas pueden aplicarse selectivamente en cultivos dicot transformados con a a d -1. La transformación de cultivos con a a d -12 permite que un cultivador aplique selectivamente herbicidas de piridiloxiauxina y ariloxialcanoato en cultivos de dicot para controlar las especies de malezas. Al apilar dg t-28 , dg t-31 , d g t-32 o d g t-33 con los rasgos aad-1 o a a d -12 , se proporciona a los cultivadores un espectro más amplio de herbicidas para el manejo de malezas. Además, el uso de combinaciones de herbicidas da como resultado una mayor flexibilidad para la gestión de la resistencia a herbicidas dentro de las especies de malezas.
Se proporcionan las opciones siguientes de control de malezas para una planta en la que un rasgo d g t y un rasgo a a d se apilan en cualquier especie de cultivo de monocot o dicot:
A. El glifosato se aplica a una tasa de aplicación post-emergente estándar (420 a 2.160 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1.120 g ae/ha) para el control de la mayoría de las especies de malezas herbáceas y de hoja ancha. Los rasgos d g t pueden proporcionar tolerancia a estas tasas de aplicación de glifosato. Para el control de malezas de hoja ancha resistentes al glifosato como C o nyza ca n a d e n s is o malezas inherentemente difíciles de controlar con glifosato (por ejemplo, C o m m e lina spp), se aplica secuencialmente 280 - 2.240 g ae/ha (por ejemplo, 560 - 1120 g ae/ha) de 2,4 D en un tanque de mezcla, o como una premezcla con glifosato para proporcionar un control adicional. Tanto aad-1 como a a d -12 proporcionan tolerancia a 2,4-D. Además, aa d -12 proporciona tolerancia a los herbicidas de piridiloxi auxina como triclopir y fluroxipir. Los herbicidas de piridiloxi auxina se aplican para controlar malezas de hoja ancha resistentes al glifosato como C o nyza ca n a d e n s is y C o m m e lina spp. Para el triclopir, las tasas de aplicación suelen oscilar entre 70- 1120 g ae/ha, por ejemplo 140 - 420 g ae/ha. Para el fluroxipir, las tasas de aplicación generalmente varían de 35 a 560 g ae/ha, por ejemplo, de 70 a 280 ae/ha.
B. El glifosato se aplica a una tasa de aplicación estándar postemergente (420 a 2.160 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1.120 g ae/ha) para el control de la mayoría de las especies de malezas de hoja ancha y gramíneas. Para el control de especies de gramíneas resistentes a glifosato como Lo liu m rig id u m o E le us ine in d ic a , se aplican de manera secuencial 10 - 200 g ae/ha (por ejemplo, 20 - 100 g ae/ha) de quizalofop, mezclado en tanque o como premezcla con glifosato para proporcionar control efectivo. A ad -1 proporciona tolerancia al quizalofop. El apilamiento de aad-1 en combinación con dgt-28, dg t-31 , d g t-32 o d g t-33 en las especies de cultivos tiene como resultado cultivos que son tolerantes a los herbicidas descritos anteriormente.
C. El glifosato es eficaz en el control de especies de gramíneas distintas de las especies de malezas de hoja ancha. Los rasgos apilados A ad -1 y dgt-28 , dg t-31 , d g t-32 o d g t-33 permiten la aplicación de tasas de glifosato eficaces en gramíneas (105 - 840 g ae/ha, por ejemplo, 210 - 420 g ae). Luego se aplica secuencialmente 2,4-D (a 280 - 2240 g ae/ha, por ejemplo, 560 - 1120 g ae/ha), mezclado en tanque o como premezcla con tasas de glifosato eficaces en gramíneas, para proporcionar el control necesario de la maleza de hoja ancha. Se usa un herbicida AOPP similar al quizalofop a 10 - 200 g ae/ha (por ejemplo, 20 -100 g ae/ha y 20 - 35 g ae/ha), para el control más firme de las malezas de gramíneas y/o para retrasar el desarrollo de gramíneas resistentes al glifosato. La baja tasa de glifosato también proporciona algún beneficio al control de malezas de hoja ancha; sin embargo, el control primario es a partir del 2,4-D.
D. Del mismo modo, los rasgos apilados a a d -12 y dg t-28 , dg t-31 , dg t-32 o d g t-33 permiten la aplicación de tasas de glifosato eficaces para gramíneas (105 - 840 g ae/ha, por ejemplo, 210 - 420 g ae/ha). Luego, se aplica secuencialmente 2,4-D (a 280 - 2.240 g ae/ha, por ejemplo, 560 - 1.120 g ae/ha), mezclado en tanque o como una premezcla con tasas de glifosato eficaces en gramíneas para proporcionar el control necesario de la maleza de hoja ancha. El triclopir y el fluroxipir utilizados a las tasas mencionadas anteriormente también son componentes aceptables en el régimen de tratamiento. La baja tasa de glifosato también proporciona algún beneficio al control de malezas de hoja ancha; sin embargo, el control primario es del 2,4-D, triclopir o fluroxipir.
El uso de uno o más herbicidas de ariloxi auxina comerciales, solos o en combinación (secuencial o independientemente), se facilita mediante la transformación de a a d -12 en los cultivos. Del mismo modo, el uso de uno o más herbicidas de fenoxi auxina comerciales solos o en combinación (secuencial o independientemente) con uno o más herbicidas comerciales de AOPP es facilitado por a a d -1. Apilar cualquiera de estos rasgos con dg t-28 , dg t-31, d g t-32 o d g t-33 permite un manejo más firme de las especies de malezas. Las tasas específicas de otros herbicidas representativos de estas químicas están determinadas por las etiquetas de herbicidas compiladas en el libro CPR (Crop Protection Reference)o compilación similar, etiquetas compiladas online (p. ej. cdms.net/manug/ manuf.asp) o cualquier guía de protección de cultivos comercial o académica, tal como la Crop Protection Guide de Agriliance (2005).
Ejemplo 17: Rasgo DGT apilado con rasgo A H A S en cualquier cultivo.
Los rasgos que codifican la tolerancia al herbicida imidazolinona (A H A S ) están actualmente presentes en varios cultivos plantados en América del Norte que incluyen, entre otros, maíz, arroz, girasol y trigo. Se han desarrollado otros cultivos tolerantes a la imidazolinona (por ejemplo, algodón y remolacha azucarera). Muchos herbicidas de imidazolinona (por ejemplo, imazamox, imazetapir, imazaquin, e imazapic) se usan actualmente de manera selectiva en varios cultivos convencionales. El uso de imazetapir, imazamox y el imazapyr no selectivo se ha facilitado a través de los rasgos de tolerancia a la imidazolinona similar a A H A S . Las HTCs tolerantes a la imidazolinona hasta la fecha tienen la ventaja de ser no transgénicas. Esta clase de química también tiene una actividad residual en el suelo significativa, por lo que puede proporcionar un control de malezas que se extiende más allá del tiempo de aplicación, a diferencia de los sistemas basados en glifosato o glufosinato. Sin embargo, el espectro de las malezas controladas por los herbicidas de imidazolinona no es tan amplio como el glifosato (Agriliance, 2003). Además, los herbicidas de imidazolinona tienen un modo de acción (inhibición de la acetolactato sintasa, ALS) al que muchas malezas han desarrollado resistencia (Heap I (2004). El estudio internacional de malezas resistentes a herbicidas, disponible en www.weedscience.com).
D gt-28 , dg t-31 , d g t-32 o d g t-33 se apilan con un rasgo de tolerancia a la imidazolinona, ya sea a través de la reproducción convencional o conjuntamente como un evento de transformación novedoso, y se mejora la eficacia de control de las malezas, flexibilidad y capacidad para gestionar las tandas de malezas y el desarrollo de resistencia a los herbicidas.
Se proporcionan las siguientes opciones de control de malezas para una planta en la que un rasgo d g t y un rasgo de tolerancia a la imidazolinona se apilan en cualquier especie de cultivo monocot o dicot:
A. Se aplica Imazetapir a una tasa de aplicación estándar post-emergencia (35 a 280 g ae/ha, por ejemplo, 70 - 140 g ae/ha) para el control de muchas especies de malezas de hoja ancha y gramíneas.
i) Las malezas de hoja ancha resistentes a los inhibidores de ALS como A m a ra n th u s ru d is , A m b ro s ia tr ífid a , C h e n o p o d iu m a lbu m (entre otras, Heap, 2004) se controlan mediante la mezcla de glifosato en tanque a razón de 420 a 2.160 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1.120 g ae/ha.
ii) Las especies de hoja ancha intrínsecamente más tolerantes a los herbicidas de imidazolinona como Ip o m o e a spp. se controlan mezclando glifosato en tanque a 420 a 2.160 g ae/ha, por ejemplo 560 a 1.120 g ae/ha.
iii) Malezas de gramíneas resistentes al inhibidor de ALS como S org hu m h a le p e n s e y Lo lium spp. se controlan mezclando glifosato en tanque entre 420 y 2.160 g ae/ha, por ejemplo 560 a 1.120 g ae/ha.
iv) Las especies de malezas de gramíneas tolerantes intrínsecamente (p. ej. A g ro p y ro n re p e n s ) se controlan mezclando glifosato en tanque a 420 a 2.160 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1.120 g ae/ha.
El uso de cualquiera de varios herbicidas de imidazolinona o herbicidas de glifosato comerciales, solos o en combinaciones múltiples, se facilita mediante la transformación con d g t-28 con dg t-28 , dg t-31 , d g t-32 o d g t-33 , y se apila con cualquier rasgo de tolerancia a la imidazolinona, ya sea por crianza convencional o por ingeniería genética. Las tasas específicas de otros herbicidas representativos de estas químicas están determinadas por las etiquetas de herbicidas compiladas en el libro de CPR (Crop Protection Reference) o compilación similar, etiquetas compiladas online (por ejemplo cdms.net/manuf/manuf.asp), o cualquier guía de protección de cultivos comercial o académica como la Crop Protection Guide de Agriliance (2005).
Ejemplo 18: Transformación de soja.
La soja transgénica (G lyc in e m a x ) que contiene un transgén d g t-28 integrado de forma estable se generó a través de la transformación mediada por A g ro b a c te r iu m de explantes de nódulos cotiledonarios de soja. Se utilizó una cepa de A g ro b a c te r iu m desarmada que llevaba un vector binario que contenía un d g t-28 funcional para iniciar la transformación.
La transformación mediada por A g ro b a c te r iu m se llevó a cabo utilizando un procedimiento modificado de nudos semicotiledonarios de Zeng et al. (Zeng P., Vadnais D. A., Zhang Z., Polacco J. C., (2004), Plant Cell Rep., 22 (7): 478 - 482). Brevemente, las semillas de soja (cv. Maverick) se germinaron en medio basal y los nodos cotiledonarios se aislaron e infectaron con A g ro b a c te r iu m . La iniciación de brotes, el alargamiento de los brotes y los medios de enraizamiento se suplementan con cefotaxima, timentina y vancomicina para la eliminación de Agrobacterium. Se empleó la selección a través de un herbicida para inhibir el crecimiento de brotes no transformados.
Los brotes seleccionados se transfirieron a un medio de enraizamiento para el desarrollo de la raíz y luego se transfirieron a la mezcla de suelo para la aclimatación de las plántulas.
Las láminas terminales de las plántulas seleccionadas se trataron tópicamente (técnica de pintura de hojas) con un herbicida para detectar transformantes putativos. Las plántulas cribadas se transfirieron al invernadero, se dejaron aclimatar y luego se pintaron en hoja con un herbicida para reconfirmar la tolerancia. Se tomaron muestras de estas plantas T0 putativas transformadas y se utilizaron análisis moleculares para confirmar la presencia del marcador seleccionable herbicida y el transgén dgt-28. Las plantas T0 se dejaron autofertilizar en el invernadero para producir semilla T1.
Se puede usar un segundo método de transformación de soja para producir plantas de soja transgénicas adicionales. Se usa una cepa de Agrobacterium desarmada que lleva un vector binario que contiene un dgt-28 funcional para iniciar la transformación.
La transformación mediada por Agrobacterium se llevó a cabo utilizando un procedimiento half-seed (media semilla) modificado de Paz et al., (Paz M., Martínez J., Kalvig A., Fonger T. y Wang K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206 - 213). Brevemente, las semillas de soja maduras se esterilizaron durante la noche con gas cloro y se embebieron con H2O estéril veinte horas antes de la transformación de la planta mediada por Agrobacterium. Las semillas se cortaron por la mitad con un corte longitudinal a lo largo del hilio para separar la semilla y quitar el tegumento de la misma. Se escindió el eje embrionario y se eliminó cualquier posible brote/yema del nudo cotiledonario. Los explantes de media semilla resultantes se infectaron con Agrobacterium. La iniciación de brotes, la elongación de brotes y el medio de enraizamiento se complementaron con cefotaxima, timentina y vancomicina para la eliminación de Agrobacterium. La selección herbicida se empleó para inhibir el crecimiento de brotes no transformados. Los brotes seleccionados se transfirieron al medio de enraizamiento para el desarrollo de la raíz y luego se transfirieron a la mezcla de suelo para la aclimatación de las plántulas.
Se tomaron muestras de plantas T0 transformadas putativas y se usaron análisis moleculares para confirmar la presencia del marcador seleccionable y el transgén dgt-28. Se identificó que varios eventos contenían los transgenes. Estas plantas T0 fueron avanzadas para el análisis adicional y se dejaron autofertilizar en el invernadero para dar lugar a semilla T1.
Confirmación de la heredabilidad de dgt-28 a la generación T1. La heredabilidad de la proteína DGT-28 en la generación T1 se evaluó en una de dos maneras. El primer método incluyó la siembra de semillas T1 en medio Metromix y la aplicación de 411 g ae/ha de IGNITE™ 280 SL en plantas germinadas en la primera etapa de crecimiento trifoliado. El segundo método consistió en homogeneizar semillas para un total de 8 replicados usando un cojinete de bolas y un Geno/Grinder. Las pruebas de tiras ELISA para detectar la proteína PAT se utilizaron para detectar eventos hereditarios ya que el marcador seleccionable estaba en el mismo plásmido que dgt-28. Por cualquiera de los métodos, si una sola planta era tolerante al glufosinato o se detectaba con la prueba de tiras ELISA PAT, el evento demostraba la heredabilidad de la generación T1.
Se seleccionaron un total de cinco constructos para determinar su heredabilidad como se describió anteriormente. Los plásmidos contenían dgt-28 ligado con TraP4, TraP8 y TraP23. Los eventos en todas los constructos demostraron una heredabilidad del 68% de la proteína PAT :: DGT-28 en la generación T1.
Tolerancia al herbicida postemergente en soja T1 transformada con dgt-28. Las semillas de los eventos T1 que se determinó que eran hereditarias por los métodos de cribado descritos anteriormente, se sembraron en medio Metromix en condiciones de invernadero. Las plantas se cultivaron hasta que el primer trifoliato se expandió completamente y se trató con 411 g ae/ha de IGNITE™ 280 SL para Selección del gen pat como se describió anteriormente. A las plantas resistentes de cada evento se les dieron identificadores únicos y se muestrearon para los análisis de cigosidad del gen dgt-28. Los datos de cigosidad se utilizaron para asignar 2 réplicas hemicigóticas y 2 homocigóticas a cada tasa de glifosato aplicada, lo que permitió un total de 4 réplicas por tratamiento cuando habia suficientes plantas. Estas plantas se compararon con el tabaco Petite havana de tipo silvestre. Todas las plantas se rociaron con un pulverizador de oruga a razón de 187 l/ha. Las plantas se pulverizaron en un intervalo de 560-4.480 g ae/ha de sal de dimetilamina DURANGO ™ (DMA). Todas las aplicaciones se formularon en agua con la adición de 2% p/v de sulfato amónico (AMS). Las plantas fueron evaluadas a los 7 y 14 días después del tratamiento. A las plantas se les asignó una calificación de lesión con respecto al retraso del crecimiento visual global, la clorosis y la necrosis. La generación T1 está segregando, por lo que es de esperar una respuesta variable debido a la diferencia de cigosidad.
Tabla 24. Los resultados de la pulverización demuestran una tolerancia alta de 14 DAT (días después del tratamiento) de hasta 4.480 g ae/ha de glifosato de al menos un evento dgt-28 por constructo caracterizado. Los eventos de copia única representativos de los constructos proporcionaron todos una tolerancia de hasta 4.480 g ae/ha en comparación con el control negativo de Maverick.
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Protección de d g t-28 contra tasas elevadas de glifosato en la generación T2. Se realizó una prueba de descendencia de 45 plantas en dos a cinco líneas T2 de d g t-28 por constructo. Las líneas homocigóticas se eligieron basándose en los análisis de cigosidad completados en la generación anterior. Las semillas se plantaron como se describió anteriormente. Las plantas se rociaron luego con 411 g ae/ha de IGNITE 280 SL para la selección del marcador seleccionable p a t como se describió anteriormente. Después de 3 DAT, se contaron las plantas resistentes y las sensibles.
Para los constructos que contienen TraP4 enlazada con d g t-28 (pDAB107543 y pDAB107548), nueve de las doce líneas analizadas no se segregaron, lo que confirma líneas homogéneas en la generación T2. Las líneas que contenían TraP8 unidas a d g t-28 (pDAB107545) demostraron dos de las cuatro líneas sin segregantes y demostrando la herencia mendeliana a través de al menos dos generaciones de d g t-28 en la soja. Las muestras de tejido se tomaron de plantas resistentes y la proteína DGT-28 se cuantificó por métodos ELISA estándar. Los datos demostraron un intervalo de proteína DGT-28 promedio de 32,8 a 107,5 ng/cm2 para las líneas de T2 no segregantes analizadas. Las líneas del constructo pDAB107553 (TraP23 :: d g t-28 ) no se seleccionaron previamente con glufosinato, y la respuesta a la dosis de glifosato se utilizó para probar tanto la homogeneidad como la tolerancia a tasas elevadas de glifosato. Los replicados de las líneas del constructo pDAB107553 fueron tolerantes a tasas que oscilaron entre 560 y 4.480 g ae/ha de glifosato y, por tanto, se confirmó que era una población homogénea y hereditaria hasta al menos dos generaciones.
Las tasas de DURANGO DMA que oscilan en el intervalo entre 560 y 4.480 g ae/ha de glifosato se aplicaron a soja 2­ 3 trifoliada como se describió anteriormente. Los datos de lesión visual a 14 DAT confirmaron los resultados de tolerancia que se demostraron en la generación T1.
Tabla 25. Los datos demuestran una tolerancia alta del tabaco dgt-28 hasta 3.360 g ae/ha de glifosato en el curso de dos generaciones, en comparación con el control no transformado.
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Ejemplo 19: Transformación de arroz con d g t-28.
En un método ejemplar, el arroz transgénico (O ryza s a tiv a ) que contiene un transgén d g t-28 integrado de manera estable se genera a través de la transformación, mediada por A g ro b a c te riu m , de la semilla de arroz esterilizada. Se utiliza una cepa de A g ro b a c te r iu m desarmada que lleva un vector binario que contiene un d g t-28 funcional para iniciar la transformación.
Los medios de cultivo se ajustan a pH 5,8 con KOH 1 M y se solidifican con 2,5 g/l de Phytagel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los callos embriogénicos se cultivan en placas Petri de 100 x 20 mm que contienen 30 ml de medio semisólido. Las plántulas de arroz se cultivan en 50 mL de medio en cajas MAGENTA. Las suspensiones de células se mantienen en matraces cónicos de 125 ml que contienen 35 mL de medio líquido y se hacen rotar a 125 rpm. La inducción y el mantenimiento de cultivos embriogénicos ocurren en la oscuridad a 25 -26 °C, y la regeneración de la planta y el cultivo de la planta completa ocurren en una habitación iluminada con un fotoperíodo de 16 h (Zhang et al.
1996).
La inducción y el mantenimiento del callo embriogénico se realizan en un medio basal NB modificado como se describió anteriormente (Li et al. 1993), en donde el medio está adaptado para contener 500 mg/L de glutamina. Los cultivos en suspensión se inician y se mantienen en medio líquido s Z (Zhang et al. 1998) con la inclusión de 30 g/L de sacarosa en vez de maltosa. Medio osmótico (NBO) que consiste en medio NB con la adición de 0,256 M de manitol y de sorbitol. El callo resistente a los herbicidas se selecciona en medio NB suplementado con el agente selectivo de herbicidas apropiado durante 3 - 4 semanas. La pre-regeneración se realiza en medio (PRH50) que consiste en medio NB con ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 1 mg/L de ácido a-naftalenacético (NAA), 5 mg/L de ácido abscísico (ABA) y herbicida selectivo durante 1 semana. La regeneración de las plántulas sigue el cultivo en medio de regeneración (RNH50) que comprende medio NB que contiene 2,4-D, 0,5 mg/L de NAA y herbicida selectivo hasta que se regeneran los brotes supuestamente transgénicos. Los brotes se transfieren al medio de enraizamiento con sales basales de Murashige y Skoog de fuerza media y vitaminas B5 de Gamborg, suplementadas con 1% de sacarosa y herbicida selectivo.
Semillas maduras desecadas de O ryza sa tiva L. japonica cv. Taipei 309 se esterilizan como se describe en Zhang et al. 1996. Se inducen tejidos embriogénicos mediante el cultivo de semillas de arroz maduras estériles en medio NB en la oscuridad. El callo primario de aproximadamente 1 mm de diámetro se retira del escutelo y se usa para iniciar la suspensión celular en medio líquido SZ. Las suspensiones se mantienen luego como se describe en Zhang 1996. Los tejidos embriogénicos derivados de la suspensión se extraen del cultivo líquido 3-5 días después del subcultivo previo y se ponen en medio osmótico NBO para formar un círculo de aproximadamente 2,5 cm de ancho en una placa Petri y se cultivan durante 4 h antes del bombardeo. Dieciséis a veinte horas después del bombardeo, los tejidos se transfieren del medio NBO al medio de selección NBH50, asegurando que la superficie bombardeada mira hacia arriba y se incuba en la oscuridad durante 14 - 17 días. Los callos recién formados se separan de los explantes bombardeados originales y se colocan cerca en el mismo medio. Después de 8 a 12 días adicionales, el callo opaco relativamente compacto se identifica visualmente y se transfiere al medio de pre-regeneración PRH50 durante 7 días en la oscuridad. El callo en crecimiento, que se vuelve más compacto y opaco, se subcultiva en medio de regeneración RNH50 durante un período de 14 a 21 días en un fotoperíodo de 16 h. Los brotes de regeneración se transfieren a cajas MAGENTA que contienen medio 1/2 MSH50. Las plantas múltiples regeneradas a partir de un solo explante se consideran hermanas y se tratan como una línea de plantas independiente. Una planta se califica como positiva para el gen d g t-28 si produce raíces gruesas y blancas y crece vigorosamente en el medio 1/2 MSH50. Una vez que las plántulas alcanzan la parte superior de las cajas MAGENTA, se transfieren al suelo en una maceta de 6 cm bajo una humedad del 100% durante una semana, y luego se trasladan a una cámara de crecimiento con un período de luz de 14 h a 30 °C y a 21 °C en la oscuridad durante 2-3 semanas antes de transplantar en macetas de 13 cm en el invernadero. Las semillas se recogen y se secan a 37 °C durante una semana antes del almacenamiento a 4 °C.
Análisis T0 del arroz dgt-28. Los transformantes de arroz trasplantados obtenidos a través de la transformación con A g ro b a c te r iu m se transplantaron en medios y se aclimataron a condiciones de invernadero. Todas las plantas fueron muestreadas para la detección con PCR de d g t-28 y los resultados demuestran veintidós eventos positivos en PCR para pDAB110827 (TraP8 :: dgt-28) y un mínimo de dieciséis eventos positivos en PCR para pDAB110828 (TraP23 :: d g t-28 ). El análisis Southern para dgt-28 de los eventos positivos en p Cr demostró eventos simples (1-2 copias) para ambos constructos. La expresión de proteína de los eventos Tq seleccionados demostraron intervalos de expresión de proteína DGT-28 desde por debajo de los niveles de detección hasta 130 nm/cm2. Eventos To seleccionados del constructo pDAB110828 fueron tratados con 2.240 g ae/ha de DURANGO DMA™ como se describió anteriormente, y evaluados 7 y 14 días después del tratamiento. Los datos demostraron una tolerancia alta a la tasa de glifosato aplicada. A todas las plantas positivas a PCR se las dejó producir semilla T1 para posterior caracterización.
Heredabilidad de dgt-28 en arroz. Se realizó una prueba de descendencia de 100 plantas en cuatro líneas T1 de dgt-28 del constructo pDAB110827 que contiene el péptido de tránsito al cloroplasto TraP8. Las semillas fueron plantadas en macetas llenas de medio. Todas las plantas se rociaron luego con 560 g ae/ha de DURANGO DMA™ para la selección del gen dgt-28 como se describió anteriormente. Después de 7 DAT, se contaron las plantas resistentes y sensibles. Dos de las cuatro líneas analizadas para cada constructo segregaron como un solo locus, rasgo mendeliano dominante (3R:1S), según se determina por el análisis de Chi cuadrado. El dgt-28 es un gen hereditario de resistencia al glifosato en múltiples especies.
Tolerancia al herbicida post-emergencia en el arroz T1 transformado con dgt-28. A las plantas resistentes a T1 de cada evento utilizado en las pruebas de descendencia se les dieron identificadores únicos y se tomaron muestras para los análisis de cigosidad del gen dgt-28. Los datos de cigosidad se utilizaron para asignar 2 replicados hemicigóticos y 2 homocigóticos a cada tasa de glifosato aplicada, lo que permitió un total de 4 replicados por tratamiento. Estas plantas se compararon con el arroz kitaake de tipo silvestre. Todas las plantas se rociaron con un pulverizador de oruga a razón de 187 L/ha. Las plantas se pulverizaron en un intervalo de 560 - 2.240 g ae/ha de DURANGO DMA™. Todas las aplicaciones se formularon en agua con la adición de 2% p/v de sulfato amónico (AMS). Las plantas se evaluaron a los 7 y 14 días después del tratamiento. A las plantas se les asignó una calificación de lesión con respecto la atrofia del crecimiento visual general, la clorosis y la necrosis. La generación T1 es segregante, por lo que se espera una respuesta variable debido a la diferencia de cigosidad.
Los resultados de la pulverización demuestran a 7 DAT (días después del tratamiento) que se detectó una lesión vegetativa mínima a tasas elevadas de glifosato (datos no mostrados).
Tabla 26. Datos de lesión visual a 14 DAT demuestran menos del 15% de lesión visual media hasta 2240 g ae/ha de glifosato.
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La detección de proteínas de DGT-28 se evaluó para replicados de las cuatro líneas T1 probadas de pDAB110827. Los datos demostraron intervalos de proteína media DGT-28 de 20-82 ng/cm2 y 21-209 ng/cm2 para réplicas hemicigóticas y homocigóticas, respectivamente. Estos resultados demostraron una expresión de proteína estable para la generación T1 y la tolerancia del arroz dgt-28 hasta 2.240 g ae/ha de glifosato después de una aplicación de 560 g ae/ha de glifosato utilizado para la selección.
Ejemplo 20: Transformación de césped con d g t-28.
La transformación genética, mediada por A g ro b a c te r iu m tu m e fa c ie n s , del transgén dgt-28 en b e n tg ra s s (agrostis) rastrero se logra mediante callos embriogénicos iniciados a partir de semillas (cv. Penn-A-4). Véase "Eficiencia de la transformación del césped (A g ro s tis s to lo n ife ra L) mediada por A g ro b a c te r iu m tu m e fa c ie n s " (Luo et al., 2004).
Las células de callo se infectan con una cepa de A. tu m e fa c ie n s que alberga un vector súper-binario que contiene un transgén resistente a los herbicidas (p. ej. dg t-28 , dg t-31 , d g t-32 o d g t-33 ) dirigido por un promotor específico de monocot. La eficiencia de transformación estable general oscila entre 18% y 45%. La transferencia Southern y el análisis genético confirman la integración del transgén dentro del genoma de b e n tg ra s s rastrero y la transmisión normal y la expresión estable del transgén en la generación T1. Todos los eventos de transformación independientes llevan de una a tres copias del transgén, y la mayoría (60-65%) contiene solo una copia única del transgén sin reajustes aparentes.
Las semillas maduras se descascarillaron con papel de lija y se esterilizaron en superficie en lejía Clorox™ al 10% (v/v) (hipoclorito sódico 6%) más 0,2% (v/v) de Tween 20 (polisorbato 20) con agitación vigorosa durante 90 min. Después de enjuagar cinco veces en agua destilada estéril, las semillas se colocan en medio inductor de callos (sales basales MS y vitaminas, 30 g/l de sacarosa, 500 mg/l de hidrolizado de caseína, 6,6 mg/l de ácido 3,6-dicloro-o-anísico (dicamba), 0,5 mg/l de 6-bencilaminopurina (BAP) y 2 g/l de Phytagel. El pH del medio se ajusta a 5,7 antes de autoclavar a 120 °C durante 20 min).
Las placas de cultivo que contienen explantes de semilla preparados se mantienen en la oscuridad a temperatura ambiente durante 6 semanas. Se seleccionan visualmente los callos embriogénicos y se subcultivan en medio fresco de inducción de callos en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 semana antes del co-cultivo.
Un día antes de la infección mediada por A g ro b a c te r iu m , el callo embriogénico se divide en trozos de 1 a 2 mm y se pone en un medio de inducción de callo que contiene acetosiringona 100 pM. Luego se aplica a cada parte del callo una parte alícuota de 10 pl de suspensión de A g ro b a c te r iu m (OD = 1,0 a 660 nm) que alberga el transgén d g t-28 , dg t-31, d g t-32 o d g t-33 , seguido de 3 días de co-cultivo en la oscuridad a 25 °C. Después se transfiere el callo y se cultiva durante 2 semanas en medio de inducción de callos más 125 mg/l de cefotaxima y 250 mg/l de carbenicilina para suprimir el crecimiento bacteriano.
La selección de plantas transgénicas se produce cuando el callo se traslada a un medio de inducción de callos que contiene 250 mg/l de cefotaxima y un herbicida. El material del callo se mantiene en este medio durante 8 semanas con un intervalo de subcultivo de selección de 3 semanas. El proceso de selección se realiza a temperatura ambiente en la oscuridad.
Para la regeneración de las plantas, los eventos de callos proliferantes resistentes a los herbicidas se trasladan primero al medio de regeneración (medio basal MS, 30 g/l de sacarosa, 100 mg/l de mio-inositol, 1 mg/l de BAP y 2 g/l de Phytagel) suplementado con cefotaxima y un herbicida para la selección. Estos callos se mantienen en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 semana y luego se trasladan a la luz durante 2-3 semanas para desarrollar brotes.
Los brotes desarrollados se separan y se transfieren a un medio de regeneración libre de hormonas que contiene un herbicida y cefotaxima para promover el crecimiento de la raíz mientras se mantiene la presión de selección y se suprime cualquier célula de A g ro b a c te r iu m restante. Las plántulas con raíces bien desarrolladas (3-5 semanas) se transfieren al suelo y se cultivan en invernadero o en el campo.
Las plantas transgénicas se mantienen al exterior libre en un vivero de contención (3-6 meses) hasta el solsticio de invierno en diciembre. Las plantas vernalizadas se transfieren luego al invernadero y se mantienen a 25 °C bajo un fotoperíodo de 16/8 h y se rodean de plantas de control no transgénicas que aíslan físicamente las plantas transgénicas de otras fuentes de polen. Las plantas transgénicas comienzan a florecer de 3 a 4 semanas después de ser trasladadas nuevamente al invernadero. Estas plantas se cruzan con el polen de las plantas de control circundantes. Las semillas recolectadas de cada planta transgénica individual se germinan en el suelo a 25 °C, y las plantas T1 se cultivan en el invernadero para un análisis adicional.
Otras gramíneas se transforman con d g t-28 de acuerdo con el protocolo descrito, que incluye prado anual (P oa a n n u a ), Bahiagrass, Bentgrass, Bermudagrass, Bluegrass, Bluestems, Brachiaria, Bromegrass, Browntop bent (A g ro s tis ca p illa r is ), Buffalograss, Canary Grass, Carpetgrass, Centipedegrass, Chewings fescue (F e s tu c a ru b ra c o m m u ta te ), Crabgrass, Creeping bent (A g ro s tis s to lo n ife ra ), Crested hairgrass (K oe le ria m a c ra n th a ), Dallisgrass, Fescue, Festolium, Hard/sheeps fescue (F es tuca o v in a ), Gramagrass, Indiangrass, Johnsongrass, Lovegrass, mezclas (Equine, Pasture, etc.), Native Grasses, Orchardgrass, Perennial ryegrass (Lo lium p e re n n e ), Redtop, Rescuegrass, Ryegrass anual y perenne, Slender creeping red fescue (F e s tu ca ru b ra tr ic h o p h y lla ), Smooth-stalked meadowgrass (P oa p ra te n s is ), St. Augustine, Strong creeping red fescue (F e s tu ca ru b ra ru b ra ), Sudangrass, Switchgrass, Tall fescue (F e s tu ca a ru n d in a c e a ), Tufted hairgrass (D e sch a m p s ia c a e s p ito s a ), Turfgrasses, Wheatgrass, and Zoysiagrass.
Ejemplo 21: Transformación de B ra ss ica spp. con el ra sg o D G T .
Un gen dg t-28 , dg t-31 , d g t-32 o d g t-33 que confiere resistencia al glifosato se usa para transformar B ra ss ica na pu s var. Nexera ™ 710 con transformación mediada por A g ro b a c te r iu m .
Las semillas de B ra ss ica n a p u s se esterilizan en superficie con un 10% de lejía comercial durante 10 minutos y se enjuagan 3 veces con agua destilada estéril. Las semillas se ponen después en la mitad de la concentración del medio basal MS (Murashige y Skoog, 1962) y se mantienen bajo un régimen de crecimiento establecido en 25 °C, y un fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad.
Se cortan los segmentos de hipocotilo (3-5 mm) de plántulas de 5 a 7 días y se colocan en medio de inducción de callos K1D1 (medio MS con 1 mg/l de kinetina y 1 mg/l de 2,4-D) durante 3 días como pre-tratamiento. Los segmentos se transfieren luego a una placa petri y se tratan con una cepa de A g ro b a c te r iu m tu m e fa c ie n s que contiene un constructo que comprende d g t-28. Los A g ro b a c te r iu m tu m e fa c ie n s se cultivan durante la noche a 28 °C en la oscuridad en un agitador a 150 rpm, y posteriormente se re-suspenden en el medio de cultivo.
Después de un tratamiento de 30 min de los segmentos de hipocotilo con A g ro b a c te r iu m , estos segmentos se ponen de nuevo en el medio de inducción de callos durante 3 días. Después del co-cultivo, los segmentos se ponen en K1D1TC (medio de inducción de callos que contiene 250 mg/l de carbenicilina y 300 mg/l de timentina) durante una semana de recuperación. Alternativamente, los segmentos se ponen directamente en el medio de selección K1D1H1 (por encima del medio con un herbicida). La carbenicilina y la timentina son los antibióticos utilizados para matar el A g ro b a c te r iu m . El agente de selección permite el crecimiento de las células transformadas.
Las muestras de callo de eventos independientes aislados se analizan por PCR. Las muestras que dan positivo a la presencia de dg t-28 , dg t-31, d g t-32 o d g t-33 se confirman y avanzan a los medios para la regeneración. Los segmentos de hipocotilo callosos se ponen después en medio de regeneración de brotes B3Z1H1 (medio MS, 3 mg/l de bencilamino purina, 1 mg/l de zeatina, 0,5 gm/l de MES [ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico], 5 mg/l de nitrato de plata, herbicida selectivo, carbenicilina y timentina). Después de 3 semanas los brotes comienzan la regeneración. Los segmentos de hipocotilo junto con los brotes se transfieren a medio B3Z1H3 (medio MS, 3 mg/l de bencilamino purina, 1 mg/l de zeatina, 0,5 gm/l de MES [ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico], 5 mg/l de nitrato de plata, herbicida selectivo, carbenicilina y timentina) durante otras 3 semanas.
Los brotes se escinden de los segmentos de hipocotilo y se transfieren al medio de alargamiento de brotes MESH10 (MS, 0,5 gm/l de MES, herbicida selectivo, carbenicilina, timentina) durante 2-4 semanas. Los brotes alargados se cultivan para la inducción de la raíz en MSI.1 (MS con 0,1 mg/l de ácido indolbutírico). Una vez que las plantas establecen un sistema radicular, las plantas se trasplantan en el suelo. Las plantas se aclimatan bajo condiciones ambientales controladas en un Conviron™ durante 1-2 semanas antes de ser transferidas al invernadero.
Las plantas T0 transformadas se autopolinizan en el invernadero para obtener semillas T1. Las plantas T0 y la progenie T1 se rocían con un rango de concentraciones de herbicida de glifosato para establecer el nivel de protección mediante el gen dg t-28 , dg t-31 , d g t-32 o d g t-33.
Ejemplo 22: Transformación de Tabaco con dgt-28.
Se transformaron trozos de hojas de tabaco (cv. Petit Havana) utilizando A g ro b a c te r iu m tu m e fa c ie n s que contenía el transgén d g t-28. Las colonias individuales que contenían el plásmido que contiene el transgén d g t-28 se inocularon en 4 mL de medio YEP que contenía espectinomicina (50 pg/ml) y estreptomicina (125 pg/ml) y se incubaron durante la noche a 28 °C en un agitador a 190 rpm. El cultivo de semillas de 4 mL se usó posteriormente para inocular un cultivo de 25 mL del mismo medio en un matraz Erlenmeyer apantallado de 125 mL. Este cultivo se incubó a 28 °C con agitación a 190 rpm hasta que alcanzó una OD600 de ~ 1,2. Luego se pusieron 10 mL de suspensión de A g ro b a c te r iu m en placas Petri™ estériles de 60 x 20 mm.
Trozos de hojas recién cortadas (0,5 cm2) de plantas cultivadas asépticamente en medio MS (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS) con 30 g/l de sacarosa en PhytaTrays™ (Sigma, St. Louis, MO) se empaparon durante la noche en 10 mL de cultivo de A g ro b a c te r iu m durante unos pocos minutos, se secaron sobre papel de filtro estéril y luego se colocaron en el mismo medio con la adición de 1 mg/L de ácido indolacético y 1 mg/L de 6-bencilamino purina. Tres días más tarde, los trozos de hojas co-cultivados con A g ro b a c te r iu m que albergan el transgén d g t-28 se transfirieron al mismo medio con 5 mg/L de Basta™ y 250 mg/L de cefotaxima.
Después de 3 semanas, las plántulas T0 individuales se transfirieron a medio MS con 10 mg/L de Basta ™ y 250 mg/L de cefotaxima 3 semanas más antes del trasplante al suelo y la transferencia al invernadero. Las plantas T0 seleccionadas (como se identificaron usando los protocolos de análisis molecular descritos anteriormente) se dejaron autopolinizar y las semillas se recolectaron de las cápsulas cuando estaban completamente secas. Las plántulas T1 se examinaron para determinar la cigosidad y la expresión del gen reportero (como se describe a continuación) y se identificaron las plantas seleccionadas que contienen el transgén d g t-28.
Las plantas se trasladaron al invernadero lavando el agar de las raíces, transplantando en tierra en macetas cuadradas de 13,75 cm, poniendo la maceta en una bolsa Ziploc® (SC Johnson & Son, Inc.), poniendo agua del grifo en el fondo de la bolsa, y poniéndola en luz indirecta en un invernadero a 30 °C durante una semana. Después de 3-7 días, se abrió la bolsa; las plantas se fertilizaron y se dejaron crecer en la bolsa abierta hasta que se aclimataron en el invernadero, momento en el cual la bolsa se retiró. Las plantas se desarrollaron en condiciones normales de invernadero cálido (27 °C día, 24 °C noche, 16 horas día, mínimo natural luz suplementaria = 1200 |jE/m2s1).
Antes de la propagación, se tomaron muestras de plantas To para el análisis de ADN para determinar el número de copias del inserto dgt-28 mediante PCR en tiempo real. Se puso tejido fresco en tubos y se liofilizó a 4 °C durante 2 días. Una vez que el tejido se secó completamente, se puso en el tubo una perla de tungsteno (Valenite) y las muestras se sometieron a 1 minuto de molienda en seco usando un molino de perlas Kelco. Luego se siguió el procedimiento estándar de aislamiento de ADN DNeasy ™ (Qiagen, DNeasy 69109). Luego se tiñó una parte alícuota del ADN extraído con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leyó en el fluorómetro (BioTek™) con estándares conocidos para obtener la concentración en ng/jl. Se usó como plantilla un total de 100 ng de ADN total. La reacción de PCR se llevó a cabo en el termociclador Geneamp™ 9700 (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94 °C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 64 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto y 45 segundos, seguido de 72 °C durante 10 minutos. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido con EtBr y se confirmaron por transferencias Southern.
De cinco a nueve eventos positivos en PCR con 1-3 copias del gen dgt-28 de 3 constructos que contienen una secuencia de péptido de tránsito al cloroplasto diferente (TraP4, TraP8 y TraP23) se regeneraron y se trasladaron al invernadero.
Todas las plantas positivas para PCR se muestrearon para la cuantificación de la proteína DGT-28 mediante ELISA estándar. La proteína DGT-28 se detectó en todas las plantas positivas en PCR y se observó una tendencia a un aumento en la concentración de proteína con el aumento del el número de copias de dgt-28.
Heredabilidad de aad-12 (v1) en tabaco. Se realizó una prueba de descendencia de 100 plantas en cinco líneas T1 de dgt-28 por constructo. Las constructos contenían una de las siguientes secuencias de péptidos de tránsito al cloroplasto: TraP4, TraP8 o TraP23. Las semillas se estratificaron, se sembraron y se trasplantaron con respecto al procedimiento de Arabidopsis ejemplificado anteriormente, con la excepción de que las plantas nulas no se eliminaron en la selección inicial antes del trasplante. Todas las plantas se rociaron luego con 280 g ae/ha IGNITE 280 SL para la selección del marcador seleccionable pat como se describió anteriormente. Después de 3 DAT, se contaron las plantas resistentes y sensibles.
Cuatro de las cinco líneas analizadas para cada constructo segregaron como un solo locus, rasgo mendeliano dominante (3R:1S) según se determina por el análisis de Chi cuadrado. El dgt-28 es un gen hereditario de resistencia a glifosato en múltiples especies.
Tolerancia al herbicida postemergencia en el tabaco T1 transformado con dgt-28. A las plantas resistentes a T1 de cada evento utilizado en la prueba de descendencia se les dieron identificadores únicos y se tomaron muestras para los análisis de cigosidad del gen dgt-28. Los datos de cigosidad se utilizaron para asignar 2 réplicas hemicigóticas y 2 homocigóticas a cada tasa de glifosato aplicada, lo que permitió un total de 4 réplicas por tratamiento. Estas plantas se compararon de nuevo con el tabaco Petite havana de tipo silvestre. Todas las plantas se rociaron con un pulverizador de oruga a 187 l/ha. Las plantas se pulverizaron en un intervalo de 560 - 4480 g ae/ha DURANGO DMA™. Todas las aplicaciones se formularon en agua con la adición de 2% p/v de sulfato amónico (AMS). Las plantas fueron evaluadas a los 7 y 14 días después del tratamiento. A las plantas se les asignó una calificación de lesión con respecto a la atrofia visual general, la clorosis y la necrosis. La generación T1 es segregante, por lo que es de esperar una respuesta variable debido a la diferencia de cigosidad.
Los resultados de la pulverización demuestran a 7 DAT (días después del tratamiento) que se detectó lesión vegetativa mínima a tasas elevadas de glifosato (datos no mostrados). Después de 14 DAT, los datos de lesiones visuales demuestran una mayor lesión con los eventos de copia única del constructo que contiene TraP4 en comparación con los eventos de copia única de las estructuras TraP8 y TraP23.
Tabla 27. A una tasa de 2.240 g ae/ha de glifosato se demostró una lesión promedio de 37,5% con el evento que contiene TraP4, donde los eventos que contienen TraP8 y TraP23 demostraron una lesión promedio de 9,3% y 9,5%, respectivamente.
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Estos resultados demostraron la tolerancia de dgt-28 hasta 4.480 g ae/ha de glifosato, así como las diferencias en tolerancia proporcionadas por las secuencias de péptidos de tránsito al cloroplasto unidas al gen dgt-28.
Protección de dgt-28 contra tasas elevadas de glifosato en la generación T2. Se realizó una prueba de descendencia de 25 plantas en dos o tres líneas T2 de dgt-28 por constructo. Las líneas homocigóticas fueron elegidas basándose en los análisis de cigosidad completados en la generación anterior. Las semillas fueron estratificadas, sembradas y trasplantadas como se describió anteriormente. Todas las plantas se rociaron luego con 280 g ae/ha de Ignite 280 s L para la selección del marcador seleccionable pat según se describió anteriormente. Después de 3 DAT, se contaron las plantas resistentes y sensibles. Todas las líneas analizadas para cada constructo no se segregaron, confirmando así las líneas homogéneas en la generación T2 y demostrando la herencia mendeliana a través de al menos dos generaciones de dgt-28 en el tabaco.
Se aplicaron tasas de DURANGO DMA™ en el intervalo 420-3.360 g ae/ha de glifosato, a 2-3 hojas de tabaco como se describió anteriormente. Los datos de lesiones visuales al 14 DAT confirmaron los resultados de tolerancia que se demostraron en la generación T1. Los resultados foliares de líneas de dos copias del constructo que contiene TraP4 demostraron una tolerancia similar a la de las líneas TraP8 y TraP23 de copia única (datos no mostrados).
Tabla 28. Líneas de una sola copia del constructo que contiene TraP4 con dgt-28 demostraron incremento de lesiones en comparación con las líneas de constructos que contienen TraP8 y TraP23 con dgt-28.
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Los datos demuestran una tolerancia alta del tabaco d g t-28 hasta 3.360 g ae/ha de glifosato a través de dos generaciones en comparación con el control no transformado.
Plantas seleccionadas de cada evento fueron muestreadas antes de las aplicaciones de glifosato para los análisis de la proteína DGT-28 mediante ELISA DGT-28 estándar. Los datos demostraron la expresión de la proteína media DGT-28 de las líneas simples (1-2 copias) a través de constructos en el intervalo de 72,8-114,5 ng/cm2 Los datos demuestran que d g t-28 está expresando proteína en la generación T2 de tabaco transformado y los datos de tolerancia confirman la proteína funcional DGT-28.
Apilamiento de d g t-28 para aumentar el espectro de herbicidas en el tabaco (cv. Petit Havana). Las plantas homocigóticas d g t-28 (pDAB107543 y pDAB107545) y a a d -12 v l (pDAB3278) (véase PCT/US2006/042133 para este último) se cruzaron recíprocamente y se recolectó semilla F1. La semilla F1 de dos cruces recíprocos de cada gen se estratificaron y se trataron 6 reps de cada cruce con 1.120 g ae/ha glifosato (selectivo para el gen d g t-28 ), 1.120 g ae/ha 2,4-D (selectivo para el gen a a d -12 ), o una mezcla de tanque de los dos herbicidas a las tasas descritas. Las plantas se clasificaron a los 14 DAT. Los resultados de la pulverización se muestran en la Tabla 29.
Tabla 29. Respuesta de F1 a a d -12 y dgt-28.
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Los resultados confirman que dgt-28 se puede apilar con éxito con aad-12 (v1), aumentando así el espectro de herbicidas que se pueden aplicar al cultivo de interés (glifosato ácidos fenoxiacéticos para dgt-28 y aad-12, respectivamente). En la producción de cultivos en los que existen malezas de hoja ancha difíciles de controlar o biotipos de malezas resistentes, la pila se puede utilizar como un medio de control de malezas y protección de la cosecha de interés. Los rasgos de entrada o salida adicionales también podrían apilarse con el gen dgt-28.
Ejemplo 23: Resistencia al glifosato en el trigo.
Producción de vectores binarios que codifican DGT-28. Vectores binarios que contienen la expresión DGT-28 y las casetes de selección PAT fueron diseñados y ensamblados utilizando la experiencia y técnicas comúnmente conocidas en este campo. Cada casete de expresión de DGT-28 contenía el promotor, la región 5' no traducida y el intrón del gen de ubiquitina (Ubi) de Zea mays (Toki et al. Plant Physiology 1992, 100 1503 - 07), seguido de una secuencia de codificación que consta de uno de los cuatro péptidos de tránsito (TraP4, TraP8, TraP23 o TraP5) fusionados al extremo 5' de una versión sintética del gen de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (DGT-28), que había sido codón-optimizado para la expresión en plantas. La casete de expresión DGT-28 terminó con una región 3' no traducida (UTR) que comprende el terminador transcripcional y el sitio de poliadenilación de un gen de lipasa (Vp1) de Z. mays (Paek et al. Mol Cells 1998 30; 8 (3) 336 - 42). La casete de selección PAT estaba compuesta por el promotor, la región 5' no traducida y el intrón del gen de Actina (Act1) de Oryza sativa (McElroy et al. The Plant Cell 19902 (2) 163 - 171), seguido de una versión sintética del gen de la fosfinotricina acetil transferasa (PAT) aislado de Streptomyces viridochromogenes, que había sido codón-optimizado para la expresión en plantas. El gen de PAT codifica una proteína que confiere resistencia a los inhibidores de la glutamina sintetasa que comprende la fosfinotricina, el glufosinato y el bialafos (Wohlleben et al. Gene 1988, 70 (1), 25 - 37). La casete de selección se terminó con la UTR 3' que comprende el terminador transcripcional y los sitios de poliadenilación del gen 35s del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Chenault et al. Plant Physiology 1993 101 (4), 1395 - 1396).
La casete de selección fue sintetizada por un proveedor comercial de síntesis de genes (GeneArt, Life Technologies) y se clonó en un vector binario habilitado para Gateway. Las casetes de expresión DGT-28 se subclonaron en pDONR221. El clon de ENTRY resultante se usó en una reacción de LR Clonase II (Invitrogen, Life Technologies) con el vector binario habilitado para Gateway codificando la casete de expresión de fosfinotricina acetil transferasa (PAT). Las colonias de todos los plásmidos ensamblados se seleccionaron inicialmente mediante digestión de restricción de ADN purificado utilizando endonucleasas de restricción obtenidas de New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) y Promega (Promega Corporation, WI). Se realizaron preparaciones de ADN plásmido utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden) o el Sistema Pureipield Plasmid Maxiprep (Promega Corporation, WI), siguiendo las instrucciones de los proveedores. El ADN plasmídico de los clones seleccionados se secuenció utilizando la secuenciación ABI Sanger y el protocolo de secuenciación del ciclo Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies). Los datos de secuencia se ensamblaron y se analizaron utilizando el software s Eq UENCHER™ (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).
Los cuatro clones de expresión binaria resultantes: pDAS000122 (TraP4-DGT28), pDAS000123 (TraP8-DGT28), pDAS000124 (TraP23-DGT28) y pDAS000125 (TraP5-DGT28) se transformaron cada uno de ellos en Agrobacterium tumefaciens cepa EHA5.
Producción de eventos de trigo transgénico con el constructo de expresión dgt-28. Las plantas de trigo transgénicas que expresan uno de los cuatro constructos de expresión de d GT-28 se generaron mediante la transformación mediada por Agrobacterium utilizando la línea de trigo donante Bobwhite MPB26RH, siguiendo un protocolo similar al de Wu et al. Transgenic Research 2008, 17: 425 - 436. Los supuestos eventos transgénicos T0 se seleccionaron en relación con la tolerancia a la fosfinotricina (PPT), el fenotipo conferido por el marcador seleccionable PAT, y se transfirieron al suelo. Las plantas T0 se cultivaron en condiciones de contención de invernadero y se produjo semilla T1. En conjunto, se generaron aproximadamente 45 eventos T0 independientes para cada constructo de expresión de DGT-28.
Resistencia al glifosato en eventos de trigo dgt-28 trigo T0. A los eventos se les permitió aclimatarse en el invernadero y se cultivaron hasta que surgieron 2-4 hojas nuevas de apariencia normal del verticilo (es decir, las plantas habían pasado del cultivo de tejidos a las condiciones de cultivo en invernadero). Las plantas se cultivaron a 25 °C bajo 12 horas de iluminación suplementaria en el invernadero hasta la madurez. Se completó un cribado inicial de la tolerancia al glifosato y los análisis de Taqman en plantas T1 cultivadas en las mismas condiciones descritas anteriormente. Los datos permitieron caracterizar aún más la determinación de eventos T1 hereditarios. Se replantaron seis eventos de bajo número de copias (1-2 copias) y dos eventos T1 multicopia bajo condiciones de invernadero y se desarrollaron hasta la fase de 3 hojas. Las plantas T1 se rociaron con una formulación comercial de glifosato (Durango DMA™) a partir de un intervalo de 420 a 3.360 g ae/ha, que son capaces de dañar significativamente las líneas de trigo no transformadas. Se incluyó en la aplicación una adición de 2% p/v de sulfato amónico. Una dosis letal se define como la tasa que causa > 75% de lesión al control no transformado Bob White MPB26RH. Se aplicó herbicida.
En este ejemplo, las aplicaciones de glifosato se utilizaron tanto para determinar la segregación del gen dgt-28 en la generación T1 como para demostrar la tolerancia al aumento de los niveles de glifosato. La respuesta de las plantas se presenta en términos de escala de lesión visual 21 días después del tratamiento (DAT). Los datos se presentan como un histograma de individuos que muestran menos del 25% de lesión visual (4), 25% - 50% de lesión visual (3), 50% - 75% de lesión visual (2) y más del 75% de lesión (1). Se presenta una media aritmética y una desviación estándar para cada constructo utilizado para la transformación del trigo. El intervalo de puntuación de la respuesta individual también se indica en la última columna para cada tasa y transformación. El tipo natural, el trigo no transformado (cv Bob White MPB26RH), sirvió como control sensible al glifosato. En la generación T1, las plantas hemicigóticas y homocigóticas estaban disponibles para las pruebas para cada evento y, por tanto, se incluyeron para cada tasa de glifosato ensayada. Las plantas hemicigóticas contendrán la mitad de la dosis del gen como plantas homocigóticas, por lo que puede esperarse una variabilidad de respuesta al glifosato en la generación T1.
Los resultados de las plantas de trigo T1 d g t-28 demostraron que la tolerancia al glifosato se alcanzaba a tasas de hasta 3.360 g ae/ha con los péptidos de tránsito al cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 y TraP23. Tabla 30. Los datos son de un evento T1 de bajo número de copias pero son representativos de la población para cada constructo.
Tabla 30. Respuesta de eventos de trigo T1 d g t-28 de bajo número de copias al glifosato 21 días después del tratamiento.
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A los 21 DAT, se cuentan las plantas resistentes y sensibles para determinar el porcentaje de líneas que se segregaron como un solo locus, rasgo mendeliano dominante (3R: 1 S) según se determina mediante el análisis de Chi cuadrado. Tabla 31. Estos datos demuestran que dgt-28 es heredable como gen de alta resistencia al glifosato en una especie monocot.
Tabla 31. Porcentaje de eventos T1 dgt-28 por constructo que demostraron la heredabilidad de una manera mendeliana basándose en una selección de glifosato a tasas en el intervalo de 420-3.360 g ae/ha.
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Confirmación molecular de plantas transgénicas T0 para la integración de T-ADN que codifica DGT-28. El ADN genómico se extrajo del material foliar liofilizado de todas las plantas de trigo T0 putativas. El tejido foliar recién recolectado se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se liofilizó durante 24 h en una Labconco Freezone 4.5® de (Labconco, Kansas City, MO) a -40 °C y una presión 133 x 10'3 mBar. El material liofilizado se sometió a extracción de ADN utilizando el kit DNeasy® Plant DNA Extraction Mini (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
El ADN de cada planta T0 se ensayó para determinar la presencia o ausencia de la cepa de Agrobacterium tumefaciens por arrastre y el número de copias integradas del T-ADN que codifica DGT-28. La presencia o ausencia de la cepa de A. tumefaciens se realizó mediante un ensayo dúplex Taqman® qPCR para amplificar el gen de la ubiquitina endógena (cebadores directos e inversos y sonda):
5' GCGAAGATCCAGGACAAGGA 3' (SEC ID NO: 85; cebador directo)
5' CTGCTTACCGGCAAAGATGAG 3' (SEC ID NO: 86; cebador inverso)
5' TTCCCCCGGACCAGCAGCGT 3' (SEC ID NO: 87; sonda)
del genoma del trigo, y virC de pTiBo542:
5' CCGACGAGAAAGACCAGCAA 3' (SEC ID NO: 88; cebador directo)
5' CTTAAGTTGTCGATCGGGACTGT 3' (SEC ID NO: 89; cebador inverso)
5' TGAGCCTCTCGTCGCCGATCACAT 3' (SEC ID NO: 90; sonda).
El número de copias de T-ADN integradas se estimó usando un ensayo qPCR Taqman® dúplex siguiendo el procedimiento de Livak y Schmittgen (Methods 2001 25: 402 - 8). El ensayo amplificó el gen endógeno de una sola copia de puroindolina- b (Pinb) en el genoma D del trigo hexaploide (Gautier et al. Plant Science 2000 153, 81 - 91): 5' ATTTTCCATTCACTTGGCCC 3' (SEC ID NO: 91; cebador directo)
5' TGCTATCTGGCTCAGCTGC 3' (SEC ID NO: 92; cebador inverso)
5' ATGGTGGAAGGGCGGTTGTGA 3' (SEC ID NO: 93; sonda)
y una región del promotor de Actina (Act1) presente en el T- ADN:
5 'CTCCCGCGCACCGATCTG 3' (SEC ID NO: 94; cebador directo)
5 'CCCGCCCCTCTCCTCTTTC 3' (SEC ID NO: 95; cebador inverso)
5 'AAGCCGCCTCTCGCCCACCCA 3' (SEC ID NO: 96; sonda).
Las plantas que no amplificaron un producto de virC y a partir de las cuales se amplificaron los productos correctos con cebadores para la ubiquitina endógena y el promotor de actina del arroz, se clasificaron como transgénicas. El número de T-ADn integrado se estimó a partir de 2AAc (T), de acuerdo con Livak y Schmittgen (Methods 2001 25: 402-8). En general, aproximadamente el 95% de todas las plantas T0 tenían al menos una copia integrada del ADN-T. Tabla 32.
Tabla 32. Número de plantas T0 independientes generadas y número estimado de T-ADN integrado que codifica DGT-28.
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Desarrollo de ensayos de cigosidad por PCR para rastrear la herencia de transgenes. Las secuencias que flanquean los sitios de integración de T-ADN se identificaron mediante la digestión del ADN genómico purificado con ocho endonucleasas de restricción, seguido de la ligación de adaptadores de doble cadena específicos de los salientes creados por las endonucleasas de restricción. Después de la ligación del adaptador, se realizó la PCR con un cebador biotinilado en el extremo 3' o 5' del T-ADN que codifica DGT-28 y un cebador en cada adaptador. Los productos de la PCR se capturaron y purificaron en perlas de inmovilización reversible en fase sólida Ampure (SPRI) (Agencourt Bioscience Corporation, Beckman Coulter Company). Luego se realizó una PCR anidada y los productos de amplificación fueron secuenciados por el método de Sanger utilizando la química BigDye® v3.1 (Applied Biosystems) en una plataforma de electroforesis capilar automatizada ABI3730xl®. El análisis de secuencia realizado utilizando el software Sequencher (GeneCodes, Ann Arbor, MI) se utilizó para generar (cuando es posible) una secuencia de consenso. La secuencia de consenso resultante y los singletones (“solteros”), o instancia única, se utilizaron como consultas de BlastN contra cóntigos de secuencia del estudio del genoma ensamblado para brazos de cromosoma ordenados por flujo, del trigo de la variedad Chinese Spring (www.wheatgenome.org) para determinar los cromosomas en los que se había producido la integración del T-ADN y para permitir el diseño de cebadores específicos del subgenoma para el desarrollo de ensayos de cigosidad por PCR.
Se desarrollaron dos ensayos de PCR para cada evento transgénico para permitir el rastreo de la herencia transgénica en generaciones posteriores. El primer ensayo (en lo sucesivo denominado PCR out-out) se diseñó para amplificar a través del sitio de integración de TDNA. La amplificación específica para subgenomas en este ensayo se logró usando PCR on-off con cebadores diseñados para posicionar la penúltima base (que contenía un enlace de fosforotioato) sobre la variación de la secuencia de nucleótidos que distinguía el locus objetivo de copias duplicadas (tanto homólogas como parálogas) del locus en otra parte del genoma del trigo. El segundo ensayo (en lo sucesivo denominado PCR in-out) se diseñó para amplificar desde el T-ADN en la secuencia endógena. Este ensayo utilizó uno de los cebadores del ensayo de PCR out-out y un cebador diseñado para el extremo 3' o 5' de los T-ADN que codifican DGT-28. Los cebadores de PCR se diseñaron para tener una longitud de entre 18 y 27 nucleótidos y una temperatura de fusión de 60 a 65 °C, la óptima de 63 °C. Los ensayos de PCR tanto out-out como in-out se realizaron en un volumen de reacción de 25 pl con dNTP 0,2 mM, 1x tampón de PCR Phusion (New England BioLabs), MgCh 1,5 mM, ADN polimerasa de Hotstart Phusion de 0,5U (New England BioLabs), 25 ng de ADN genómico purificado y 0,4 pM de cada cebador. Las condiciones de los ciclos de PCR fueron 98 °C durante 30 s y luego (98 °C durante 10 s, 65 °C durante 20 s, 72 °C durante 60 s) durante 40 ciclos. La cigosidad de las plantas transgénicas se asignó como se muestra en la Tabla 33.
Tabla 33. Eventos transgénicos para los que se desarrollaron ensayos de cigosidad por PCR y se utilizaron secuencias de cebadores para PCR out-out e in-out.
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Evaluación fenotípica de plantas transgénicas Ti para la tolerancia al glifosato. Para determinar si los eventos transgénicos con constructos de expresión de DGT-28 presentaban tolerancia al glifosato, las plantas T1 derivadas de eventos individuales se evaluaron fenotípicamente en condiciones de contención de invernadero. Se realizaron dos cribados fenotípicos. En el primer cribado (preliminar), los eventos transgénicos (con semilla T1 suficiente para ambos cribados fenotípicos) se evaluaron para determinar la tolerancia al glufosinato y al glifosato para confirmar la expresión de DGT-28 y establecer el orden de clasificación del intervalo para la tolerancia al herbicida entre eventos. En el segundo cribado (detallado), los eventos transgénicos seleccionados fueron evaluados para determinar la tolerancia al glifosato a diferentes tasas de dosis de pulverización para establecer el nivel de tolerancia al herbicida conferido dentro de los eventos y entre los constructos de expresión de DGT-28.
Doce semillas T1 por evento seleccionado y tres replicados (12 semillas cada uno) de la línea Bobwhite MPB26RH del trigo donante no transformado se sembraron en macetas de 85 mm y se cultivaron hasta la fase de 2 hojas, bien regadas, a 25 °C con iluminación adicional que proporciona un fotoperiodo de 12 horas. Las macetas se colocaron en un diseño aleatorio para permitir que se eliminen los efectos ambientales durante el análisis de los datos. Los eventos transgénicos examinados se enumeran en la Tabla 34. En la fase de 2 hojas, todas las plantas T1 y la primera réplica de 12 plantas de trigo donante no transformadas se pulverizaron con glufosinato a una tasa de dosis de 420 g ai/ha. Las plantas se inspeccionaron visualmente al cabo de cuatro días y se usaron plantas representativas que capturaron el intervalo de respuestas fenotípicas para desarrollar una escala de puntuación de 0 a 6. Tabla 35.
Tabla 34. Eventos transgénicos probados en cribado preliminar.
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Tabla 35. Escala de puntuación utilizada para registrar la respuesta fenotípica al glufosinato a los 4 días después de la pulverización.
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Cada planta del ensayo se calificó luego en relación con la escala de puntuación, con el anotador "cegado" con respecto al genotipo de la planta para eliminar el sesgo de puntuación. Cinco días después de la puntuación del glufosinato, todas las plantas T1 y la primera y segunda réplicas de plantas de trigo donante no transformadas se pulverizaron con glifosato a una tasa de dosis de 420 g ia/ha. La tercera réplica restante de la línea de trigo donante no transformado (12 plantas en total) no se pulverizó. Las plantas se inspeccionaron visualmente a los 7, 14 y 21 días después de la pulverización. Se desarrolló una escala de puntuación que captura el intervalo de respuestas fenotípicas para cada valor de tiempo y se utiliza para puntuar toda la prueba. En cada momento, el anotador "se cegó" con respecto al genotipo de la planta. La escala de puntuación a los 7 días después de la pulverización varió de 0 a 7 (Tabla 36) y de 1 a 4 a los 14 y 21 días después de la pulverización (Tabla 37). La longitud de la planta, el número de retoños y las anomalías morfológicas también se registraron para cada planta 14 días después de la pulverización con glifosato. Las plantas con germinación tardía o establecimiento deficiente se excluyeron de los análisis posteriores.
Tabla 36. Escala de puntuación utilizada para registrar la respuesta fenotípica al glifosato a los 7 días después de la pulverización.
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Tabla 37. Escala de puntuación utilizada para registrar la respuesta fenotípica al glifosato a los 14 y 21 días después de la pulverización.
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El análisis de la respuesta al glufosinato no pudo revelar una diferencia fenotípica clara entre las plantas de trigo donantes no transformadas que se pulverizaron y las plantas donantes no transformadas que no se pulverizaron (datos no mostrados). Como consecuencia, la tolerancia de los eventos transgénicos al glufosinato no pudo evaluarse de manera fiable. En cambio, el análisis de la respuesta al glifosato 21 días después de la pulverización reveló una clara diferencia fenotípica entre las plantas donantes no transformadas pulverizadas y no pulverizadas. Tabla 38. Por tanto, los análisis para la tolerancia al glifosato entre los eventos transgénicos se basaron en las puntuaciones de respuesta recopiladas 21 días después de la pulverización. Se consideró que un evento transgénico presentaba tolerancia al glifosato cuando 4 o más de las 12 plantas T1 para ese evento tuvieron una puntuación de respuesta mayor o igual a 3. Este criterio estaba basado en la expectativa de que cada evento se segregaría 1: 2: 1 (homocigoto presente: hemicigoto: homocigoto ausente) para el transgén en la generación T1 y para permitir que se identifiquen los eventos con una expresión de DGT28 débil. Los eventos transgénicos se clasificaron por la tolerancia al glifosato observada utilizando una puntuación agregada arbitraria calculada a partir de plantas tolerantes individuales. La puntuación agregada se calculó a partir de las puntuaciones de respuesta a los 14 y 21 días y la longitud de la planta, el número de retoños y las anomalías morfológicas registradas a los 14 días después de la pulverización.
Tabla 38. Respuesta fenotípica de plantas de trigo donantes no transformadas, al tratamiento con herbicida a los 21 días después de la pulverización.
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En general, 67 de los 92 eventos transgénicos cribados mostraron evidencia de tolerancia al glifosato. Tabla 39. Se seleccionaron seis eventos transgénicos, que se estimó que tenían < 3 copias integradas del transgén, y dos eventos transgénicos que se estimó que tenían 4 o más transgenes integrados para cada vector de expresión d GT-28 para su inclusión en el segundo (detallado) cribado fenotípico.
Tabla 39. Respuesta fenotípica de eventos transgénicos al tratamiento con glifosato, por orden de clasificación.
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Pantalla fenotípica detallada. Se sembraron cuatro réplicas de 12 semillas T1 por evento seleccionado y ocho réplicas (12 semillas cada una) de la línea de trigo donante no transformado Bobwhite MPB26RH, en macetas de 85 mm, y se cultivaron hasta la fase de 2 hojas en condiciones bien regadas a 25 °C con Iluminación suplementaria que proporciona un fotoperiodo de 12 horas. Las macetas se colocaron en un diseño aleatorio para permitir que los efectos ambientales se eliminasen durante el análisis de los datos. Los eventos transgénicos examinados se enumeran en la Tabla 40. En la fase de 2 hojas, se registró la longitud de la planta y el número de hojas para cada planta antes de pulverizar con glifosato. El primero, segundo, tercero y cuarto replicados de plantas T1 para cada evento seleccionado y la línea de trigo donante no transformada se pulverizaron a una tasa de dosis de 420, 840, 1680 y 3360 g ia/ha, respectivamente. Los replicados quinto, sexto, séptimo y octavo de la línea de trigo donante no transformado (48 plantas en total) no se pulverizaron. A los 7, 14 y 21 días después de la pulverización, las plantas se clasificaron según su longitud, el número de hojas y la respuesta fenotípica al glifosato utilizando la escala de puntuación de la Tabla 37. También se registró cualquier anomalía morfológica. Para la puntuación, el anotador “se cegó" con respecto al genotipo de la planta y la tasa de dosis de rociado para evitar el sesgo de puntuación. Las plantas con germinación retardada y establecimiento deficiente (criterio: longitud de la planta < 6 cm) en la puntuación previa al rociado se excluyeron de los análisis posteriores.
Tabla 40. Eventos transgénicos probados en cribado fenotípico detallado.
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El análisis de la respuesta al glifosato a los 7, 14 y 21 días después de la pulverización reveló una clara diferencia fenotípica entre las plantas de trigo donantes no transformadas pulverizadas y no pulverizadas. Esta diferenciación fue máxima a los 21 días y se observó en todas las tasas de dosis de glifosato. Tabla 41. Para evaluar la tolerancia de los eventos transgénicos al glifosato a cada tasa de dosis de pulverización, las plantas T1 nulas (es decir, las plantas que no llevan el transgén) se excluyeron de los análisis posteriores. Se consideró que las plantas T1 con una puntuación de respuesta de menos de tres a los 21 días después de la pulverización tenían el genotipo nulo. El análisis de varianza (ANOVA) basado en fenotipos tolerantes reveló un efecto significativo para el constructo de expresión de DGT-28, evento transgénico y dosis de pulverización de glifosato. Tabla 42. Sin embargo, múltiples pruebas de comparación no pudieron desvelar una interpretación biológica significativa del origen de estas diferencias debido al rango limitado de puntajes de respuesta (es decir, 1 a 4; Tabla 40) que se usa para registrar el fenotipo de plantas individuales. En general, los ocho eventos transgénicos independientes analizados para cada construcción de expresión de DGT-28 mostraron una tolerancia similar al glifosato a cada tasa de dosis de rociado, lo que indica que los cuatro transgenes DGT-28 confirieron un fenotipo dominante y que una sola copia fue suficiente para conferir tolerancia al glifosato. Cada una de las construcciones de expresión de DGT-28 reveló una tolerancia efectiva de al menos 3360 g ai/ha de glifosato.
Tabla 41. Respuesta fenotípica de plantas de trigo donante no transformadas a diferentes tratamientos con glifosato a los 21 días después de pulverizar.
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Tabla 42. Análisis de varianza (ANOVA) basado en plantas tolerantes al glifosato.
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Confirmación molecular de la presencia de T-ADN en plantas T1 tolerantes al glifosato. Los ensayos de cigosidad de PCR desarrollados en el Ejemplo 2 se usaron para confirmar la presencia de T-ADN que codifica DGT-28 en las plantas T1 tolerantes al glifosato reservadas para la producción de semillas T2 (véase el Ejemplo 6). En conjunto, se realizaron pruebas de cigosidad por PCR para 104 plantas T1, de lass que el 89% se confirmó que contenían al menos una copia del transgén. Tabla 43. Estos resultados confirmaron que la tolerancia al glifosato observada fue conferida por la presencia de T-ADN que codifica DGT-28.
Tabla 43. Segregación de transgén observada entre plantas T1.
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Generación de semillas T2 para eventos transgénicos tolerantes al glifosato. Aproximadamente ocho plantas T1 tolerantes al glifosato se guardaron de los cribados fenotípicos para los 32 eventos transgénicos que se seleccionaron para su inclusión en el cribado fenotípico detallado (Tabla 40). Las plantas se transfirieron a macetas de 200 mm y se cultivaron en condiciones de buen riego a 25 °C con iluminación adicional que proporcionó un fotoperíodo de 12 horas. Las puntas en cada planta se embolsaron individualmente antes de la floración para evitar el cruce.
Aunque en ciertas realizaciones se han descrito aspectos de esta invención, pueden modificarse adicionalmente dentro del alcance de esta descripción. Por tanto, esta solicitud está destinada a cubrir cualquier variación, uso o

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfatasa sintasa (EPSPS) que confiere tolerancia al glifosato a una planta, en donde la EPSPS es al menos el 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 y cuando se alinea con la SEC ID NO: 1 comprende una alanina en la posición correspondiente a la posición 84 de la SEC ID NO: 1, en donde el polinucleótido es una secuencia sintética que ha sido diseñada para la expresión en una planta seleccionada entre el grupo que consiste en:
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3; y
un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con otro ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3 en condiciones de rigor alto, en donde el polinucleótido está unido operativamente a un promotor, en donde preferiblemente el promotor está dirigiendo la expresión de un gen.
2. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde la molécula es un vector que cumple al menos uno de los siguientes aspectos:
i) comprende un polinucleótido adicional que codifica un polipéptido heterólogo, y
ii) el promotor es el promotor AtUbi10.
3. Una célula hospedadora transgénica para la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde preferiblemente la célula hospedadora es una célula vegetal, en donde preferiblemente la célula vegetal no es regenerable para producir una planta.
4. Una planta transgénica tolerante al glifosato, parte de la planta, órgano de la planta, semilla de la planta o célula vegetal que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1.
5. La planta transgénica tolerante al glifosato, la parte de la planta, el órgano de la planta, la semilla de la planta o la célula vegetal de la reivindicación 4, que cumple uno de los siguientes aspectos:
i) el ácido nucleico no codifica LGNAAT (SEC ID NO: 141) y no codifica ALLMXAPLT, en donde X se selecciona entre el grupo que consiste en alanina, serina y treonina (SEC ID NO: 142),
ii) la EPSPS codificada por dicho ácido nucleico, cuando está alineada con la SEC ID NO: 1, comprende una treonina en la posición correspondiente a la posición 172 de SEQ ID NO: 1,
iii) el genoma de dicha planta, parte de la planta, órgano de la planta, semilla de la planta o célula vegetal comprende una molécula de ácido nucleico que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 3.
6. La planta tolerante al glifosato, parte de la planta, órgano de la planta, semilla de la planta o célula vegetal según la reivindicación 4, que es una planta.
7. La planta transgénica tolerante al glifosato, parte de la planta, órgano de la planta, semilla de la planta o célula vegetal de la reivindicación 4, que comprende un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo, en donde el segundo polinucleótido comprende preferiblemente aad-1 o aad-12.
8. La planta transgénica tolerante al glifosato según la reivindicación 6, en la que el polinucleótido que codifica la EPSPS está establemente integrado en su genoma.
9. La planta transgénica tolerante al glifosato según la reivindicación 8, en la que la planta cumple al menos uno de los siguientes aspectos:
i) la planta es una planta de soja,
ii) la planta es una planta de maíz,
iii) la planta se selecciona entre el grupo que consiste en trigo, maíz, soja, tabaco, brachiaria, arroz, mijo, cebada, tomate, manzana, pera, fresa, naranja, alfalfa, algodón, zanahoria, patata, remolacha azucarera, ñame, lechuga, espinaca, petunia, rosa, crisantemo, césped, pino, abeto, plantas hiperacumuladoras de metales pesados, girasol, cártamo, colza, y A rab id ops is , y
iv) la planta es una especie seleccionada entre el grupo que consiste en los géneros A sp a ra g u s , P rom ed .na , B rach ia ria , B rass ica , C itrus, C itru llus, C aps icum , C ucúrb ita , D aucus, E rige ron , G lyc ine , G ossyp ium , H o rde um , H e lian thus , Lactuca , Lo lium , L yco pe rs icon , M alus, M an iho t, N ico tiana , O rych o p h ra g m u s , O ryza, P ersea, P haseo lus, P isum , Pyrus, P runus, R aphanus, Secale, S o lanum , S orghum , Triticum , Vitis, V igna y Zea.
10. La planta transgénica tolerante al glifosato, parte de la planta, órgano de la planta, semilla de la planta o célula vegetal según la reivindicación 4, que es una parte de la planta u órgano de la planta que no es regenerable para producir una planta.
11. Un cultivo de tejido de células de plantas regenerables tolerantes al glifosato que comprenden la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde preferiblemente las células regenerables se producen a partir de un tipo de tejido seleccionado entre el grupo que consiste en hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, células meristemáticas, raíces, puntas de las raíces, anteras, flores, tallos y vainas.
12. Un protoplasto tolerante al glifosato que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.
13. Un método de generar una planta, parte de la planta, órgano de la planta, semilla de la planta o célula vegetal resistente al glifosato, comprendiendo el método:
transformar la planta, parte de la planta, órgano de la planta, semilla de la planta o célula vegetal con la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde preferiblemente se transforma una célula vegetal que no es regenerable para producir una planta.
14. El método según la reivindicación 13, en el que se satisface al menos una de las siguientes condiciones:
i) el polipéptido no comprende LGNAAT (SEC ID NO: 141) y/o no comprende ALLMXAPLT, en donde X se selecciona entre el grupo que consiste en alanina, serina y treonina (SEC ID NO: 142),
ii) el polipéptido, cuando está alineado con la SEC ID NO: 1, comprende una treonina en la posición correspondiente a posición 172 de la SEC ID NO: 1,
iii) la molécula de ácido nucleico tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO : 2 o la SEC ID NO: 3, y
iv) la molécula de ácido nucleico comprende la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 3.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que se transforma una parte de la planta, órgano de la planta, semilla de la planta o célula vegetal, comprendiendo el método además:
regenerar una planta transgénica tolerante al glifosato, a partir de la parte de la planta transformada, órgano de la planta, semilla de la planta o célula vegetal, en donde la molécula de ácido nucleico comprende preferiblemente un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo expresable en la planta, en donde preferiblemente el polinucleótido es aad-1 o aad-12.
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