TW201336991A - 抗嘉磷賽（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）之植物及相關方法 - Google Patents

抗嘉磷賽（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）之植物及相關方法 Download PDF

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Abstract

本文揭示係有關於衍生自原核DGT酶之某些多肽，及可用於編碼該等多肽之核酸。

Description

抗嘉磷賽(GLYPHOSATE)之植物及相關方法 參考相關申請案
本案請求美國臨時專利申請案第61/593,555號申請日2012年2月1日之權益，及亦請求美國臨時專利申請案第61/625,222號申請日2012年4月17日之權益，該等申請案各自之揭示內容全文係爰引於此並融入本說明書的揭示。 遵照37 C.F.R.§ 1.821(c)或(e)-序列表係以ASCII文字檔案
陳述
遵照37 C.F.R.§ 1.821(c)或(e)，含有序列表的ASCII文字版本的檔案已經併同本案呈送，該序列表內容係爰引於此並融入本說明書的揭示。
發明領域
本文揭示係有關於植物生物技術。特定實施例係有關於涉及N-(膦基甲基)甘胺酸之代謝的新穎多肽，及編碼此等多肽之核酸。特定實施例係有關於包含前述多肽及/或核酸的植物、植物植株部分、及植物細胞。
發明背景
莠草物種長期以來構成種植耕地的一項問題。雖 然莠草控制乃勞力密集作業，但藉由可利用具有有效殺草作用的化學除草劑已經變得較為容易。除草劑的廣泛使用連同作物品種及肥料的改進已經對農業的「綠色革命」做出顯著貢獻。特別有用的除草劑乃具有廣效性除草活性者。不幸，廣效性除草劑典型地對暴露於除草劑的作物具有不利效應。克服此項問題的一個辦法係製作可耐受廣效性除草劑的作物植株。
廣效性除草劑的一個實例為N-膦基甲基-甘胺酸，又稱嘉磷賽(glyphosate)。嘉磷賽已經由全球農夫全面性地用於作物種植前控制莠草，例如用於免耕農業。此外，嘉磷賽乃控制莠草及在生產週期間或作物輪作間控制自生植物的有效手段。嘉磷賽於使用後不會殘留於土壤，且廣泛被視為供農業使用的最具環境安全性及廣效性化學除草劑中之一者。
嘉磷賽藉抑制莽草酸路徑而殺死植物。此一路徑結果導致芳香族化合物包括胺基酸、維生素、及植物激素的生物合成。嘉磷賽藉由結合至且抑制5-烯醇丙酮醯基莽草酸-3-磷酸合成酶俗稱「EPSP合成酶」及「EPSPS」的酶活性而阻斷丙酮酸磷酸烯醇酯(PEP)與3-磷莽草酸的縮合成5-烯醇丙酮醯基-3-磷莽草酸。
不幸，未知任何天然對嘉磷賽具有耐受性的作物植株，因而此種除草劑用於栽培作物的莠草控制的用途受限制。一種製作嘉磷賽耐受性作物植株之方法係使用基因工程技術，將編碼EPSPS基因的異源嘉磷賽耐受性形式的 一基因導入該農作物內。使用化學致突變作用，已經於細菌產生EPSPS的嘉磷賽耐受性形式，及該等異源基因被導入植物內以產生嘉磷賽耐受性植物。例如參考Comai等人(1983)科學221：370-71。異源EPSPS基因可在農作物過度表現以獲得期望的耐受性程度。
前文相關技術之實施例及其相關限制係意圖為說明性而非排它性。其它相關技術之限制對熟諳技藝人士當研讀本文說明書時將更為彰顯。
發明概要
此處揭示與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的經分離之多肽，及編碼與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的一多肽之核酸(例如SEQ ID NO：2-4)。也描述包含與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的一異源多肽之植物、植物部分、植物器官、植物種子、及植物細胞。
若干實施例包括一種植物、植物部分、植物器官、植物種子、及/或植物細胞其係包含編碼與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度之一多肽的異源核酸。於特定實施例中，該異源核酸係包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80%序列相同度之一核苷酸序列。若干實施例包括一種植物植株、植物部分、植物器官、植物種子、及/或植物細胞包含一異源核酸，其係於高度嚴苛條件下雜交至具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之另一核酸。於特定實施例中，包含一異源核酸其係於高度嚴苛條件下雜交至具有 SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之另一核酸的該植物、植物部分、植物器官、植物種子、及/或植物細胞係包含由該異源核酸所編碼之一多肽，該多肽係對該植物、植物部分、植物器官、植物種子、及/或植物細胞賦與嘉磷賽耐受性(或增高嘉磷賽耐受性)。
於進一步實施例中，該揭示係有關於產生對嘉磷賽具有抗性之植物、植物部分、植物器官、植物種子、及/或植物細胞之方法包含：使用編碼與SEQ ID NO：1具有至少90%相同度之一多肽的一核酸轉形一植物、植物部分、植物器官、植物種子、及/或植物細胞；及表現該核酸而產生與SEQ ID NO：1具有至少90%相同度之多肽。
其它實施例包括載體其係包含編碼與SEQ ID NO：1具有至少90%相同度之一多肽的一核酸。特定實施例包括載體其係包含編碼與SEQ ID NO：1具有至少95%相同度之一多肽的一核酸。例如，一載體可包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少90%相同度之一核苷酸序列。
特定實施例包括表現與SEQ ID NO：1具有至少90%相同度之一異源多肽的嘉磷賽耐受性植物及植物細胞。
額外實施例包括於含嘉磷賽耐受性植物的耕地或種植區內控制莠草之方法，其中此種方法可包含：於該耕地或種植區內栽種一植物或植物種籽，包含編碼與SEQ ID NO：1具有至少90%相同度之一異源多肽的一核酸；及對該耕地或種植區施用有效量之嘉磷賽以控制該地區的莠草 而不顯著影響該植物。
於若干實施例中，該揭示係有關於再生細胞以供用於對嘉磷賽具抗性的植物之組織培養。此種組織培養能夠再生具有前述抗嘉磷賽植物的生理學及形態學特性之植物，及也再生具有實質上與抗嘉磷賽植物相同基因型的植物。於此等組織培養中的可再生細胞例如可為胚、原生質體、分生細胞、胼胝體、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢、及莖。特定實施例係有關於從依據前文之組織培養所再生的植物。
於若干實施例中，本文揭示係有關於無法再生以產生植物例如用於製造抗嘉磷賽的植物細胞系。於其它實施例中，本文揭示係有關於部分包含此等細胞的植物。
於某些實施例中，本文揭示係有關於多種除草劑之施用至耕地種植的作物的用途。除了多種除草劑外，於頂上施用嘉磷賽可利用不同除草劑的性質，故莠草控制具有彈性與經濟的改良組合。舉例言之，個別除草劑於耕地具有不同的壽命；亦即某些除草劑施用至耕地後可能持續及有效相當長時間，而其它除草劑可能快速分解成其它及/或非活性化合物。依據特定實施例的改良除草劑施用系統允許使用嘉磷賽及多種除草劑，使得種植者可針對特定情況而調整特定除草劑的使用。
於其它實施例中，本文揭示係有關於用於製作及使用對多於一種除草劑或多於一類別或亞類的除草劑具有耐受性的植物之方法及組成物，容後詳述。於特定實施例 中，提供對嘉磷賽及至少一種其它除草劑(或類別或亞類的除草劑)或化學品(或類別或亞類的化學品)(例如殺真菌劑、殺蟲劑、植物生長調節劑等)二者具有耐受性的植物。此等植物例如可用於包含使用多種除草劑處理作物植株之方法。如此，本文揭示提供抗除草劑植物其可耐受除草劑或除草劑的組合(包括各自透過不同的除草活性模式作用的除草劑組合)之處理，或其可耐受至少一種除草劑與至少另一種化合物的組合之處理。藉此方式，本文揭示描述種植作物之改良方法，其中莠草係經選擇性地控制。
依據若干實施例一種抗除草劑植物可包含編碼賦與對嘉磷賽的耐受性之一異源多肽的一核酸分子，及編碼賦與對2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的耐受性之一多肽的一核酸分子。依據前文各段，提供植物其係包含編碼一多肽的至少一第三核酸分子，該多肽係對植物賦與選自於由下列所組成之組群中之一特徵：除草劑耐受性特徵；昆蟲抗性特徵；農藝特徵；疾病抗性特徵；改性脂肪酸特徵；及植酸鹽減少特徵。
於若干實例中，一種抗除草劑植物包含一異源核酸分子編碼賦與嘉磷賽耐受性的多肽，及一核酸分子編碼賦與草胺膦(glufosinate)耐受性的多肽。若干實例包括一種抗除草劑植物包含編碼一多肽的一核酸分子，該多肽係對植物賦與選自於由下列所組成之組群中之一特徵：除草劑耐受性特徵；昆蟲抗性特徵；農藝特徵；疾病抗性特徵；改性脂肪酸特徵；及植酸鹽減少特徵。
於特定實施例中，一種抗除草劑植物包含一異源核酸分子編碼賦與嘉磷賽耐受性的多肽，及一核酸分子編碼賦與抑制乙醯乳酸合成酶(ALS)(Lee等人(1988)EMBOJ.7：1241)，又稱乙醯羥基酸合成酶(AHAS)酵素(Miki等人(1990)Theor.Appl.Genet.80：449)的除草劑耐受性的多肽。若干實例包括一種抗除草劑植物包含編碼一多肽的一核酸分子，該多肽係對植物賦與選自於由下列所組成之組群中之一特徵：除草劑耐受性特徵；昆蟲抗性特徵；農藝特徵；疾病抗性特徵；改性脂肪酸特徵；及植酸鹽減少特徵。
於若干實施例中，一種核酸分子可與任何其它核酸分子組合(或「堆疊」)於植物，例如但非限制性，以提供對嘉磷賽或其它除草劑的額外抗性或耐受性，以提供對擇定的昆蟲或疾病的抗性，以提供營養提升，以提供改良農藝特性，及以提供蛋白質或其它於飼料、食物、工業用途、藥物用途、及/或其它用途為有用的產物。實例包括二或多種關注的核酸堆疊於植物基因體內部。此種「基因堆疊」可透過習知植物育種使用二或多個事件達成，使用含關注序列的一組成體轉形植物，基因轉殖植物的再轉形，或透過同源重組經由鎖定目標的綜合而增加新特徵。此種堆疊的特定實例包括下列之任一項組合：dgt-28核酸；Cry34Ab1核酸；Cry35Ab1核酸；Cry1F核酸；Cry1Ac核酸；aad-12核酸；aad-1核酸；pat核酸；及DSM-2核酸。
除了前述例示說明之面向及具體實施例外，其它面向及實施例藉研究後文詳細說明部分將變得顯然自明。
圖1包括EPSP合成酶酵素(亦即DGT-28、DGT-32、DGT-33及其它)實例的部分序列對齊。此等DGT酶實例中之全部三者分享在aroA EPSP合成酶酵素胺基酸位置96的一保留丙胺酸。此一胺基酸之位置係以星號指示，及胺基酸係經下方畫線。
圖2包括EPSP合成酶酵素(亦即DGT-1、DGT-3、DGT-7及其它)實例的對齊。從甘胺酸改成丙胺酸的突變胺基酸殘基的位置係以第一星號指示。從蘇胺酸改成異白胺酸的第二突變胺基酸殘基之位置係以第二星號指示。從脯胺酸改成絲胺酸的第三突變胺基酸殘基之位置係以第三星號指示。
圖3-30包括各個質體實例之圖譜：pDAB107527(圖3)；pDAB105530(圖4)；pDAB105531(圖5)；pDAB105532(圖6)；pDAB105533(圖7)；pDAB105534(圖8)；pDAB4104(圖9)；pDAB102715(圖10)；pDAB107532(圖11)；pDAB107534(圖12)；pDAB102785(圖13)；pDAB100445(圖14)；pDAB102946(圖15)；pDAB100469(圖16)；pDAB102028(圖17)；pDAB102029(圖18)；pDAB102032(圖19)；pDAB102034(圖20)；pDAB100429(圖21)；pDAB100442(圖22)；pDAB100430(圖23)；pDAB102036(圖24)；pDAB102038(圖25)；pDAB102040(圖26)；pDAB102042(圖27)；pDAB107712(圖28)；pDAB107713(圖29)；及pDAB107714(圖30)。
圖31包括使用1mM PEP在DGT-1(A)及DGT-7(B)導入各項突變後所得IC50值。針對圖31(A)及圖31(B)IC50曲線二者，實心圓表示野生型，空心圓表示GA突變型，空心方形表示GAPS突變型，及實心方形表示TIPS突變型。
圖32-54包括各個質體實例之圖譜：pDAB102719(圖32)；pDAB102718(圖33)；pDAB107663(圖34)；pDAB107664(圖35)；pDAB107665(圖36)；pDAB107666(圖37)；pDAB109812(圖38)；pDAB101556(圖39)；pDAB107698(圖40)；pDAB108384(圖41)；pDAB108385(圖42)；pDAB108386(圖43)；pDAB108387(圖44)；pDAB102716(圖45)；pDAB102717(圖46)；pDAB110828(圖47)；pDAB110827(圖48)；pDAB107545(圖49)；pDAB107548(圖50)；pDAB107553(圖51)；pDAB102792(圖52)；pDAB107602(圖53)；及pDAB107533(圖54)。
較佳實施例之詳細說明 I.綜論
此處揭示涉及N-(膦基甲基)甘胺酸之代謝的新穎多肽，及編碼此等多肽之核酸。於若干實施例中，此種多肽賦與(或提高)植物細胞對嘉磷賽的耐受性，其中該多肽係異源表現，例如，不會對EPSP合成酶與其天然酶基質丙酮酸磷酸烯醇酯(PEP)的結合造成不良影響。
II.術語
為了更進一步澄清本文揭示之範圍，提出下列特定定義、術語、及縮寫。
除非明確地另行定義，否則此處使用的全部科技術語具有如熟諳技藝人士一般瞭解的相同定義。除非由其出現的上下文另行澄清，否則單數型將包括複數，而多數型須瞭解包括單數。如此，用在一元件或一組件前方的不定冠詞「一(a)」及「一(an)」係有關該元件或組件的案例(亦即出現)數目為非限制性。當於此處提供數值範圍時(例如「少於約X」、「少於X」、及「例如X1...及X2」)，須瞭解該範圍係包括含括於所提供之範圍的全部數值及數值範圍，彷彿此等含括之數值及範圍已經明白陳述般。
全部公告案、專利案、及此處所述其它參考文獻的全文係併入此處用於全部目的，彷彿各個公告案或專利申請案係特別地及個別地指示為爰引於此並融入本說明書的揭示，除非只有專利案或專利公告案的特定章節係以引用方式併入此處。
如此處使用，「包含」、「包括」、「具有」、及「含有」等詞及其變化乃開放式(亦即非排它)。舉例言之，一種組成物或方法包含一列表之元件並非必要僅限於該等元件。此種組成物或方法可以(或可不)包括明確地列舉或該組成物或方法所特有的其它元件)。進一步，除非另行相反陳述，否則「或」係以包含(且非互斥)意義使用。舉例言之，條件「A或B」係由下列中之任一者滿足：A為真(或存在)而B為偽(或不存在)；A為偽(或不存在)而B為真(或存在)； 及A與B二者皆為真(或存在)。
植物：如此處使用，「植物」一詞包括全植物及植物的任何附屬物、細胞、組織、或部分。「植物部分」一詞包括植物的任何部分，包括但非限於：種子(含成熟種子及未成熟種子)；植物插枝；植物細胞；植物細胞培養；植物器官(例如花粉、胚、花、果實、枝、葉、根、莖、及外植體)。植物組織或植物器官可為種子、原生質體、胼胝體、或組織成結構單元或功能單元的任何植物細胞群組。植物細胞或組織培養能夠再生具有該細胞或組織所源自其中的該植物的生理及形態特性，且能夠再生具有與該植物實質上相同基因型的植物。相反地，有些植物細胞無法再生以產生植物。於植物細胞或組織培養中的可再生細胞可為胚、原生質體、分生細胞、胼胝體、花粉、花藥、根、根尖、鬚、花、果核、抽穗、穗軸、外皮、或莖梗。
植物部分包括可收穫部分及可用以繁衍子代植物的部分。可用於繁殖的植物部分包括例如但非僅限於：種子；果實；插枝；苗；塊莖；及地下莖。植物的可收穫部分可為植物的任何有用部分，包括例如但非僅限於：花；花粉；苗；塊莖；葉；莖；果實；種子；及根。
一個植物細胞乃植物的結構及生理單位，包含一原生質體及一細胞壁。植物細胞可為分離的單一細胞形式，或為細胞聚集體(例如胼胝體及培養細胞)，且可為更高級組織單元(例如植物組織、植物器官、及植物)的一部分。如此，植物細胞可為原生質體、配子產生性細胞、或可再 生成為全植物的細胞或細胞集合。如此，種子其係包含多個植物細胞且可再生成全植物於此處實施例中係被視為「植物細胞」。
除草劑抗性/耐受性：當述及對嘉磷賽具有抗性或耐受性的植物時，係指施用定量嘉磷賽於植物上不會顯著影響或殺死植物，其中同種的野生型植物將被施用該量嘉磷賽所顯著影響及/或殺死。植物可能天然對特定除草劑具有耐受性，或植物可藉基因工程，例如選擇性育種；基因轉形；及/或轉殖基因之導入植物的基因體內部的結果而變成除草劑耐受性。「抗嘉磷賽植物」係指一種植物含有多肽或核酸分子，該多肽或核酸分子當提供給一異源植物或可表現的其它有機體時賦與除草劑耐受性(亦即使得一植物或有機體變成除草劑耐受性)。
對嘉磷賽具有抗性或耐受性的植物可顯示來自施用嘉磷賽至植物的極少影響。舉例言之，該植物的正常生長及發育可能產生變化，其中該植物可能具有與壓力或疾病相聯結的徵象或症狀。由於施用嘉磷賽至對嘉磷賽具有抗性或耐受性的植物所造成的此種最低影響係與施用嘉磷賽至對嘉磷賽具有敏感性的植物所造成的不良影響相反。熟諳技藝人士將能區別對嘉磷賽具有抗性的植物與對嘉磷賽具有敏感性的植物。施用嘉磷賽給包含賦與嘉磷賽耐受性的一核酸的植物，比較施用等量嘉磷賽給不包含賦與嘉磷賽耐受性的一核酸的同種植物，結果導致顯著較低衝擊。
對除草劑或其它化學品具耐受性的植物比較適當對照植物顯示改良的耐受性。由除草劑或其它化學品所導致的損害可藉評估植物生長或健康的任何參數加以評比。此等參數乃熟諳技藝人士所已知，及其選擇係落入於熟諳技藝人士裁量範圍內。植物損害可藉於個別植物或成群植物中視覺檢查及/或藉統計分析植物生長或健康的一或多個適當參數加以評比。如此，損害可藉評估下列參數加以評比，該等參數包括例如但非僅限於：植物高度；植物重量；葉片顏色；葉片長度；開花；生殖力；長鬚；收成；及種子產量。損害也可藉評估至特定發育階段(例如長鬚、開花、及花粉脫落)所經歷的時間，或直至植物已經從使用特定化學品及/或除草劑處理中復原所經歷的時間加以評比。
在做損害評比中，可對特定損害程度指定數值，因而能做統計分析或量化比較。數值範圍之用以描述特定損害程度乃技藝界所已知，且可使用任何適當範圍或尺規。舉例言之，可指定除草劑傷害分數(又稱耐受性分數)。據此，除草劑耐受性也可藉本尺規中的其它評級指示，於該處適當對照植物(或成組對照植物)對除草劑處理的回應尺規上具有比較成組的該植物統計上更低的分數。
因除草劑或其它化學品所造成的損害可能已經使用除草劑處理植物後的不等時間評比。經常損害係在對照植物呈現最大損害的約略時間評比。偶爾，損害的評比係在不使用除草劑或其它化學品處理的對照植物，比較投 予處理當時的大小或階段，已經可度量地生長及/或發育歷經一段時間週期後進行。損害可於許多適當時間評比，例如在該植物使用除草劑處理後的12小時；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、及/或14日；3週及/或4週；或更長時間。任何評比時間皆屬適合，只要其許可試驗植物及對照植物對一處理的回應檢測得差異即可。
當一除草劑對一植物無影響時，當對植物有若干影響但後來植物恢復時，或當對植物具有不利的影響但藉該特定除草劑對莠草的衝擊而補償時，該除草劑不會「顯著地影響」該植物。如此舉例言之，若比較適當對照植物(例如同種的未經處理植物)，若一農作物於指示植物健康及/或生產力的至少一個合宜參數具有少於約25%，少於約20%，少於約15%，少於約10%，少於約9%，少於約8%，少於約7%，少於約6%，少於約5%，少於約4%，少於約3%，少於約2%，少於約1%的減低，則該農作物可能不受除草劑或其它處理的「顯著影響」。於特定實施例中，若一植物顯示的損害比較對照植物所顯示的損害少至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、或1000%或以上，則該植物係對除草劑或其它化學品具有耐受性。不受除草劑或其它處理的顯著影響的農作物可具有至少一個參數的減低，但該減低的本質為暫時性，及植物例如係在約1週、約2週、約3週、約4週、或約6週以內完全復原。於特定實施例中，對除草劑或其它 化學品具有耐受性的植物其特徵為下述事實，該植物不受除草劑或其它化學品的施用所顯著影響。
指示植物健康及/或生產力的適當參數包括例如但非僅限於：植物高度；植物重量；葉片長度；至一特定發育階段經歷的時間；開花；收成；及種子產量。參數的評估可藉目測檢視及/或藉統計分析參數進行。一旦於主題植物及對照植物評估，可做比較以決定主題植物受除草劑或其它處理的顯著影響。
可用以決定對除草劑(或其它化學品)的抗性之適當對照植物包括不包含推定的異源除草劑耐受性核酸及/或多肽的同種植物，及不包含推定的異源除草劑耐受性核酸及/或多肽的但未曾使用除草劑處理的植物。
除草劑：「除草劑」乃對植物造成暫時性或持久性傷害的化學品。除草劑之非限制性實例係以進一步細節列舉且討論於本文它處。除草劑可結合入植物或植物細胞，或可作用在植物或植物細胞上而未結合於其中。「活性成分」乃負責配方的植物毒性的除草劑配方中的化學品。商業除草劑配方中的活性成分典型地係識別為產品標籤上的活性成分。產品標籤資訊可得自美國環境保護署且於oaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own線上更新。產品標籤資訊也於www.cdms.net線上可得。
當就除草劑使用時，「酸當量」一詞係指作為除草劑活性親代酸的比率或數量。
分離的：「分離的」生物成分(諸如核酸或多肽) 已經與該成分天然出現於其中的該有機體細胞內的其它生物成分(亦即其它染色體及染色體外DNA及RNA，及蛋白質)實質上分離，分開製造，或純化，同時執行該成分的化學或功能變化(例如藉斷裂連結核酸至染色體中其餘DNA的化學鍵可從染色體分離核酸)。已經「分離的」核酸分子及蛋白質係包括藉標準純化法純化的核酸分子及蛋白質。該術語也涵蓋於宿主細胞藉重組表現所製造的核酸及蛋白質，以及化學合成的核酸分子、蛋白質及胜肽。
核酸：「多核苷酸」、「核酸」、及「核酸分子」等詞於此處係互換使用，且涵蓋單數核酸；多數核酸；核酸片段、變異體、或其衍生物；及核酸組成體(例如信使RNA(mRNA)及質體DNA(pDNA))。多核苷酸或核酸可含有全長cDNA序列之序列之核苷酸序列、或其片段，包括未經轉譯的5’及/或3’序列及編碼序列。多核苷酸或核酸可由任何多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸組成，其可包括未經改性的核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或經改性的核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。舉例言之，多核苷酸或核酸可由單股及雙股DNA組成；DNA其為單股及雙股區之混合物；單股及雙股RNA；RNA其為單股及雙股區之混合物。包含DNA及RNA的雜交分子可為單股、雙股、單股及雙股區之混合物。前述術語也包括多核苷酸或核酸之化學上、酶學上、及代謝上的改性形式。
須瞭解一特定DNA也係指其補體、補體的序列係依據去氧核糖核苷酸鹼基配對法則決定。
如此處使用，「基因」一詞係指編碼一功能產物(RNA或多肽/蛋白質)的核酸。基因可包括在功能產物的編碼序列前方(5’非編碼序列)及/或後方(3’非編碼序列)的調節序列。
如此處使用，「編碼序列」一詞係指編碼特定胺基酸序列的核酸序列。「調節序列」係指位在編碼序列上游(例如5’非編碼序列)、內部、或下游(例如3’非編碼序列)的核苷酸序列，其影響轉錄、RNA處理或安定性、或相聯結的編碼序列之轉譯。調節序列包括例如但非僅限於：啟動子；轉譯先導子序列；內含子；聚腺苷酸化識別序列；RNA處理位置；效應物結合位置；及莖-環結構。
如此處使用，「密碼子簡併性」一詞係指遺傳密碼的冗餘許可一特定核苷酸序列的變化而不影響編碼多肽的胺基酸序列。由於各個密碼子係由三個核苷酸組成，而組成DNA的核苷酸係限於四個特定鹼基，故有64種核苷酸的可能組合，其中61種編碼胺基酸(其餘三個密碼子編碼結束轉譯信號)。結果，許多胺基酸係由多於一個密碼子標示。舉例言之，胺基酸丙胺酸及脯胺酸係由四個三聯體編碼，絲胺酸及精胺酸係由六個編碼，而色胺酸及蛋胺酸係只由一個三聯體編碼。顯示哪些密碼子編碼哪些胺基酸的「遺傳密碼」為技藝界習常已知。其中的簡併性許可一個DNA的鹼基在寬廣範圍內改變而不變更由該DNA所編碼的蛋白質之胺基酸序列。
此處於若干實施例中，當設計一編碼序列用以於 宿主細胞內改良表現時，該基因的設計使得其中密碼子的使用頻率係趨近於宿主細胞的較佳密碼子的使用頻率。據此，「密碼子最佳化」一詞係指用於各個宿主轉形的核酸之基因或編碼序列，其中於基因或編碼序列中的密碼子已經變更而反映宿主有機體的典型密碼子使用，而不變更由核酸編碼的多肽。於實施例中，此種最佳化係包括以在該有機體的基因中較常用的一或多個密碼子置換於該基因或編碼序列中的至少一個、多於一個、有效數的、及/或全部密碼子。
許多有機體顯示偏好使用特定密碼子以碼編一特定胺基酸的插入生長中的胜肽鏈。有機體間的密碼子使用的密碼子偏好、密碼子偏重、差異係由遺傳密碼的簡併性提供，在多種有機體已有明確文獻記載。密碼子偏重經常係與信使RNA(mRNA)的轉譯效率有相關性，相信其又轉而取決於被轉譯的密碼子之性質，及特定轉移RNA(tRNA)分子的可用性。擇定的tRNA在一細胞內的優勢通常係反映出最頻繁用在胜肽合成的密碼子。據此，基因可經訂製或設計用以基於密碼子最佳化而在一給定有機體內獲得最佳基因表現。
給定寬廣多種動物、植物及微生物物種可得的大量基因序列，可能計算密碼子使用的相對頻率。密碼子使用表方便易得，例如得自網際網路kazusa.or.jp/codon/可得的「密碼子使用資料庫」，此等表可以多種方式調整。參考Nakamura等人(2000)Nucl.Acids Res.28：292。藉由運用一 密碼子使用表，熟諳技藝人士可施用相對應一給定物種的頻率至任何給定多肽序列，設計及製造一密碼子最佳化編碼區的合成核酸片段，其編碼該多肽，但其使用對該物種為最佳的密碼子。
密碼子偏重係反映在蛋白質編碼區的平均鹼基組成。具有基因體含相當低G+C含量的有機體在同義密碼子的第三位置利用具有A或T的較多密碼子，而具有較高G+C含量的有機體在第三位置利用具有G或C的較多密碼子。進一步，相信在一mRNA內部「次要」密碼子的存在可減低該mRNA的絕對轉譯率，特別當相對應於次要密碼子的帶電tRNA相當豐富時尤為如此。此項論理的延伸為由個別次要密碼子減低轉譯率針對多個次要密碼子至少為加成性。因此，具有相對高次要密碼子含量的mRNA將具有相對應的低轉譯率。此種低轉譯率將由編碼蛋白質的含量相對應地低反映。
密碼子偏重可計算為單一密碼子相對於全部胺基酸的密碼子之使用頻率。另外，密碼子偏重可計算為單一密碼子相對於該胺基酸的針對該其它密碼子(同義密碼子)之用以編碼一特定胺基酸的頻率。
「百分比相同度」(或「%相同度」)一詞係指藉比較序列決定，二或多個多肽序列(或多核苷酸序列)間之關係。百分比相同度可表示多肽序列(或多核苷酸序列)間之序列相關程度，可由此等序列線索間之匹配決定。概略言之，相同度係指兩個多核苷酸序列或多肽序列分別間的確切核 苷酸對核苷酸或胺基酸對胺基酸對應關係。二序列無論為核酸序列或胺基酸序列的百分比相同度為二對齊序列間確切匹配數目除以較短序列長度乘以100。參考Russell及Barton(1994)J.Mol.Biol.244：332-50。
對齊核酸序列及胺基酸序列及決定相同度的技術為技藝界所已知，包括例如但非僅限於提供於下列的技術：計算分子生物學(1988)(Lesk, A. M.，編輯)牛津大學出版社，紐約；生物計算：資訊學及基因體計畫(1993)(Smith, D. W.，編輯)學術出版社，紐約；序列資料的電腦分析，部分I(1994)(Griffin, A. M.，及Griffin, H. G.，編輯)修曼尼亞，紐約；分子生物學之序列分析(1987)(von Heinje, G.，編輯)學術出版社，紐約；及序列分析引子(1991)(Grivskov, M.及Devereux, J.，編輯)史塔頓，紐約。決定二序列間的百分比相同度之技術可包括提供mRNA或基因的核苷酸序列及/或提供或推論藉此編碼的胺基酸序列，及比較該(等)序列與第二核苷酸及/或胺基酸序列。基因體序列也可以此方式決定及比較。
此外，排齊核酸序列及胺基酸序列及決定相同度的方法係結合於公諸大眾的電腦軟體程式。序列排齊及百分比相同度計算例如可使用Vector NTI®套裝軟體的AlignXTM程式(英維崔因(Invitrogen)，加州卡斯伯)或LASERGENETM生物資訊學計算套裝軟體的MegAlignTM程式(地星(DNASTARTM)公司，威斯康辛州麥迪遜)進行。序列的多重排齊可使用ClustalTM方法進行，涵蓋排齊演算法 的數種變化，包括ClustalTM V及ClustalTM W(Higgins及Sharp(1989)CABIOS 5：151-3；Higgins等人(1992)Conput.Appl.Biosci.8：189-91)。針對ClustalTM V的多重排齊，可用的內設值包括GAP PENALTY=10及GAP LENGTH PENALTY=10。針對ClustalTM W的多重排齊的內設參數包括(GAP PENALTY=10，GAP LENGTH PENALTY=0.2，延遲分歧串列(%)=30，DNA過渡權值=0.5，蛋白質重量矩陣=Gonnet Series，DNA重量矩陣=IUB)。可用於ClustalTM方法的蛋白質序列間之逐對排齊及百分比相同度的計算的內設參數為KTUPLE=1，GAP PENALTY=3，WINDOW=5，及DIAGONALS SAVED=5。針對核酸，此等內設參數可為KTUPLE=2，GAP PENALTY=5，WINDOW=4，及DIAGONALS SAVED=4。在使用ClustalTM程式對齊序列後，藉觀看相同程式中的「序列距離」表可獲得「百分比相同度」。
於若干實施例中，核酸編碼一多肽具有序列相同度(比較一參考多肽時；例如DGT多肽)例如但非僅限於：至少約55%；至少約60%；至少約65%；至少約70%；至少約75%；至少約80%；至少約85%；至少約90%；及至少約95%，具有與參考多肽相同或相似功能。據此，從例如55%至100%的相同度的任何整數百分比可用在此處描述特定核酸，例如但非僅限於：55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及99%。某些核酸片段不僅具有前述序列相同度，且可編碼一多肽具有例如但非僅限於：至少50個胺基酸；至少100個胺基酸；至少150個胺基酸；至少200個胺基酸；至少250個胺基酸。特定實施例包括與SEQ ID NO：1具有至少90%相同度之一核酸(例如至少約89%相同度；至少約90%相同度；至少約91%相同度；至少約92%相同度；至少約93%相同度；至少約94%相同度；至少約95%相同度；至少約96%相同度；至少約97%相同度；至少約98%相同度；至少約99%相同度；及至少約99.5%相同度)。
「序列分析軟體」一詞係指對核苷酸序列或胺基酸序列的分析係有用的電腦演算法或軟體程式。「序列分析軟體」可為商業上購得或獨立開發。序列分析軟體的非限制性實例包括：GCG程式套裝軟體(威斯康辛套裝9.0版，基因電腦群(GCG)，威斯康辛州麥迪遜)；BLASTPTM、BLASTNTM、及BLASTXTM(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)；地星(DNASTARTM)(地星(DNASTARTM)公司，威斯康辛州麥迪遜)；SequencherTM(基因碼公司(Gene Codes Corporation)，密西西比州安娜堡)；及FASTATM程式結合Smith-Waterman演算法(Pearson(1994)基因體研究之計算機方法[Proc.Int.Symp.]，會議日期1992年(Suhai及Sandor編輯)伯南：紐約州紐約，111-20頁)。當序列分析軟體已經用以分析此處的核苷酸序列或胺基酸序列時，除非 另行載明否則顯示的分析結果係使用參考程式的內設值產生。如此處使用，「內設值」一詞係指當首次被初始化時原先載入該序列分析軟體的值或參數之一集合。
雜交：包含全部或部分核苷酸序列的一核酸可用作為探子，該探子選擇性地「雜交」至存在於選殖的基因體DNA片段或cDNA片段(例如得自一所選有機體的基因體或cDNA存庫)之一族群的核苷酸序列，其與該探子序列具有顯著量之序列相同度。雜交探子可具有基因體DNA片段；質體DNA片段；cDNA片段；RNA片段；PCR擴增DNA片段；寡核苷酸；或其它多核苷酸，及探子可使用可偵測基團(例如32P)或任何其它可偵測標記標示。如此，例如但非限制性，用於雜交的探子可藉標示特異性地雜交至此處核酸(例如與SEQ ID NO：1具有至少約90%相同度之一核酸)的一合成寡核苷酸製成。雜交用探子之製法及cDNA存庫及基因體存庫之構成方法為技藝界所已知。Sambrook等人(1989)分子選殖：實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，紐約州冷泉港。核酸雜交的綜合指南可參考Sambrook等人(1989)，參見上文；及Ausubel等人(1997)分子生物學短協定，第三版，威利公司，紐約州紐約，2-40頁。
於若干實施例中，核酸雜交(例如雜交至擴增的DNA)可用以識別在樣本內基因轉殖事件的存在。核酸分子或其片段於某些情況下能夠「特異性地雜交」至另一核酸分子。於若干實例中，核酸在嚴苛條件下特異性地雜交至一目標核酸。如此處使用，若二核酸分子能夠在嚴苛(例如 高度嚴峻)條件下形成逆平行雙股核酸結構，則該二核酸分子據稱能彼此特異性地雜交。
若二核酸分子具有完全序列互補性，則核酸據稱為另一核酸的「補體」。如此處使用，當該等核酸分子中之一者的每個核苷酸係與另一者的核苷酸互補時，該核酸被稱作具有「完全互補性」。具有完全互補的分子通常以足夠安定性彼此雜交，以許可於習知「高度嚴苛」條件下維持彼此煉合。習知高度嚴苛條件係由Sambrook等人(1989)，參見上文描述。
兩個分子若係以足夠安定性彼此雜交，以許可於至少習知「低度嚴苛」條件下維持彼此煉合，則該二分子稱作為具有「最低互補性」。習知低度嚴苛條件也係由Sambrook等人(1989)，參見上文描述。為了讓核酸分子用作為引子或探子，只需具有序列之最低互補性能夠在所採用的特定溶劑及鹽濃度下形成雙股結構。
影響雜交嚴苛度的因素為熟諳技藝人士眾所周知及包括例如：溫度；pH；離子強度；及有機溶劑濃度(例如甲醯胺及二甲亞碸)。如熟諳技藝人士已知，雜交嚴苛度係因溫度升高、離子強度減低、及溶劑濃度減低而增加。嚴苛條件也可藉添加解除安定劑諸如甲醯胺達成。
「嚴苛條件」或「嚴峻度條件」等詞係藉於Sambrook等人(1989)，參見上文(於9.52-9.55)討論的特定雜交程序，就一個核酸雜交至另一目標核酸(亦即雜交至包含關注特定核苷酸序列的核酸分子)定義。也參考Sambrook等 人(1989)於9.47-9.52及9.56-9.58。
於許多應用中的特異性係有關雜交後洗液的條件，其中因素包括洗液的離子強度及溫度。針對DNA-DNA雜交體，熱熔點(Tm)可從方程式估算：Tm=81.5℃+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L, (1)
於該處M為一價陽離子的莫耳濃度，%GC為DNA中鳥苷及胞苷核苷酸的百分比，%form為雜交液中的甲醯胺之百分比，及L為雜交體長度，以鹼基對表示。Meinkoth及Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-84。
Tm為50%互補目標序列雜交至完美匹配探子的溫度(於特定離子強度及pH下)。針對各個1%不匹配，Tm減少約1℃。如此，Tm雜交及/或洗滌條件可對期望雜交相同度序列調整。舉例言之，若尋求具90%相同度的序列雜交，則Tm可減低10℃(於特定離子強度及pH下)。嚴苛條件例如可選擇為比針對特定序列及其補體於特定離子強度及pH時的熱熔點(Tm)低約5℃。但重度苛刻條件可利用比Tm低1、2、3或4℃的雜交及/或洗滌；中度苛刻條件可利用比Tm低6、7、8、9、或10℃的雜交及/或洗滌；低度苛刻條件可利用比Tm低11℃至20℃的雜交及/或洗滌。
於若干實例中，嚴苛條件為其中鹽濃度於pH 7.0至8.3係低於約1.5 M Na+(約0.01至1.0 M Na+)，及溫度對短核酸(例如長10至50核苷酸)至少約30℃及對長核酸(例如長度大於50核苷酸)至少約60℃。低嚴苛條件之實例包括使用於37℃於30%至35%甲醯胺、1.0 M氯化鈉、0.1%硫酸十二 烷酯鈉(SDS)之一緩衝液，及於50℃至55℃於1X至2X SSC(20X SSC=3.0 M氯化鈉/0.3 M檸檬酸三鈉)之洗液。中等嚴苛條件之實例包括於37℃於40%至45%甲醯胺、1.0 M氯化鈉、0.1% SDS雜交，及於55℃至60℃於0.5X至1X SSC洗滌。高度嚴苛條件之實例包括37℃於50%甲醯胺、約1.0 M鈉鹽、約0.1% SDS雜交，及於60℃至65℃於0.1X SSC洗滌。
如此處使用，「多肽」一詞包括單數多肽、複數多肽、及其片段。本術語係指藉醯胺鍵(又稱胜肽鍵)線性鍵聯的單體(胺基酸)。「多肽」一詞係指任何二或多個胺基酸之鏈，而不指特定長度或大小的產物。據此，用以指稱任何二或多個胺基酸之鏈的胜肽、二胜肽、三胜肽、寡胜肽、蛋白質、胺基酸鍵及任何其它術語係含括於「多肽」的定義範圍內，及前述術語係與此處的「多肽」互換使用。多肽可分離自天然生物來源或藉重組技術製造，但特定多肽並非必要從特定核酸轉譯。多肽可以任何適當方式產生，包括例如但非僅限於藉化學合成。
內生及異源：如此處使用，「天然」一詞表示自然界出現的具有其本身調節序列(若存在)的多核苷酸、基因或多肽形式。「內生」一詞表示於有機體內自然位置或在有機體的基因體內多核苷酸、基因或多肽的天然形式。
相反地，「異源」一詞表示於參考(宿主)有機體內其位置正常不會出現的一多核苷酸、基因或多肽。舉例言之，異源核酸可為正常出現於參考有機體的不同基因體位置的核酸。進一步舉例說明，異源核酸可為正常不出現 在參考有機體的核酸。包含異源多核苷酸、基因或多肽的宿主有機體可藉將異源多核苷酸、基因或多肽導入宿主有機體製造。於特定實施例中，異源多核苷酸包含天然編碼序列或其部分，係以與相對應天然多核苷酸不同形式重新導入來源有機體。於特定實施例中，異源基因包含天然編碼序列或其部分，係以與相對應天然基因不同形式重新導入來源有機體。舉例言之，異源基因可包括天然編碼序列，其乃含非天然調節區重新導入天然宿主內的嵌合體基因的一部分。於特定實施例中，異源多肽包含天然編碼序列或其部分，係以與相對應天然多肽不同形式重新導入來源有機體。
異源基因或多肽可為一基因或多肽，包括編碼一功能多肽的一功能多肽或核苷酸序列其係融合至另一個基因或多肽以製造嵌合或融合多肽，或編碼該多肽的一基因。特定實施例之基因及蛋白質包括特別舉例說明的全長序列及部分、此等序列之節段、片段(包括比較全長分子的連續片段及內部及/或端末刪除)、變異體、突變體、嵌合體、及融合體。
改性：如此處使用，「改性」一詞可指特定參考多核苷酸的改變結果導致由該參考多核苷酸編碼的多肽之活性減低、實質上消除、或消除。改性也可指參考多肽的改變結果導致由該參考多肽之活性減低、實質上消除、或消除。「改性」一詞可指參考多核苷酸的改變結果導致由該參考多核苷酸編碼的多肽之活性增高或提升，以及參考多 肽的改變結果導致由該參考多肽之活性增高或提升。諸如前述之改變可由數種技藝界眾所周知之方法中之任一者達成，包括例如但非僅限於：刪除一部分參考分子；突變該參考分子(例如透過自生突變發生，透過隨機突變發生，透過突變子基因引起的突變發生，及透過轉位子突變發生)；取代一部分參考分子；將一元體插入該參考分子；該參考分子之表現向下調節；變更該參考分子的細胞位置；變更該參考分子的狀態(例如透過參考多核苷酸的甲基化，及透過參考多肽的磷酸化或泛在化)；去除參考分子之一輔因子；導入靶定該參考分子之一反訊息RNA/DNA；導入靶定該參考分子之一干擾RNA/DNA；該參考分子之化學改性；該參考分子之共價改性；以UV射線或X光照射參考分子；變更參考分子之同源重組；變更參考分子之有絲分裂重組；參考分子之啟動子的置換；及/或前述任一項之組合。
決定哪些核苷酸或胺基酸殘基可於特定實例改性之指南可藉下述找出：藉由比較參考多核苷酸或多肽序列與同源(例如同源酵母或細菌性)多核苷酸或多肽序列，及最大化於高度同源序列區(保留區)或一致共有序列區所做的改性數目。
衍生體及變異體：如此處使用，「衍生體」一詞係指此處序列實例的改性。此等改性包括保留、略微變更、或增高作物物種內編碼序列的功能之此處編碼序列的一或多個鹼基之取代、插入、及/或刪失。此等衍生體方便由熟諳技藝人士決定，例如但非限制性，藉使用電腦模型技術 以預測及最佳化序列結構。如此「衍生體」一詞也包括異源核酸包含與此處序列實例具有實質序列相同度的一序列，使得該核酸可具有相同、略微變更、或增高的功能用在作物植物表現DGT-28。
如此處使用，「變異體」一詞如可使用例如但非限制性，重組DNA技術而導入的，藉胺基酸插入、刪除、突變、及/或取代而與此處多肽實例不同的多肽。決定哪些胺基酸殘基可於參考胺基酸序列內部置換、添加、或刪除之指南可藉下述找出：藉由比較特定參考多肽序列與同源多肽序列，及最小化於高度同源區(保留區)所做的胺基酸序列改變數目，或藉由以一致共有序列置換胺基酸。變異體多肽可具有經取代的胺基酸，但仍保有參考多肽的功能活性。「變異體」基因包含一核苷酸序列，其編碼與參考基因相同的多肽，或具有與參考多肽相等或相似活性的相等多肽。
於若干實施例中，變異體基因可用以製造變異體蛋白質，及重組體宿主可用以製造變異體蛋白質。舉例言之，變異體基因及蛋白質可組構成包含任何此處序列實例的連續殘基(胺基酸或核苷酸)。變異體基因及蛋白質可具有例如但非限制性：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、及293連續殘基(胺基酸或核苷酸)，其係相對應於舉例說明序列中(相等大小)節段。相似大小的節段，尤其保留區節段也可用作為探子及/或引子。
熟諳技藝人士須瞭解許多程度的序列相同度事用以識別與參考多肽具有相同的或相似的功能或活性之多肽(例如與其它物種區別)。於若干實施例中，變異體多肽具有例如但非限制性下述序列相同度(當比較參考多肽例如DGT-28多肽時)：至少約55%；至少約60%；至少約65%；至少約70%；至少約75%；至少約80%；至少約85%；至少約90%；及至少約95%具有與參考多肽相同的或相似的功能。
用以設計及組構包含一特定分子的連續殘基之變異體基因及蛋白質的策略可藉獲得及檢驗關注蛋白質的結構決定(例如得自晶體結構及/或分子模型的原子3-D(三度空間)座標)。於若干實施例中，策略可導向理想上用以改性的一蛋白質的某些節段，諸如表面暴露節段，而非涉及蛋白質摺疊及必需3-D結構完整性的內部節段。美國專利案第5,605,793號例如係有關於在隨機或聚焦分段後藉使用DNA重組而產生額外分子分集之方法。如此可稱作為基因「混洗」，典型地涉及混合二或多個不同DNA分子的(具有期望大小的)片段，接著為重複變性回合。此項處理可改良由主題基因編碼的蛋白質活性。結果可為嵌合體蛋白質具有改良活性，變更的酶基質特異性，增進酶安定性，改變立體特異性，或其它特性。
胺基酸「取代」可為以具有相似的結構及/或化學性質的另一個胺基酸置換於一參考序列中的一個胺基酸(亦即保留性胺基酸取代)，或可為以具有不同的結構及/或化學性質的另一個胺基酸置換於一參考序列中的一個胺基 酸(亦即非保留性胺基酸取代)。胺基酸可置於下列結構及/或化學類別：非極性；非帶電極性；鹼性；及酸性。據此，胺基酸取代可基於涉及殘基的極性、電荷、溶解度、斥水性、親水性、或兩親性本質進行。舉例言之，非極性(斥水性)胺基酸包括甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、擷胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸、及蛋胺酸；非帶電(中性)極性胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸、色胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺、及麩胺；帶正電(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸、及組胺酸；及帶負電(酸性)胺基酸包括天冬酸及麩胺酸。另外，「非保留性」胺基酸取代可選擇任何此等胺基酸的極性、電荷、溶解度、斥水性、親水性、或兩親性本質的差異進行。「插入」或「刪除」可落入於由重組蛋白質結構上或功能上可耐受的變異之範圍。
於若干實施例中，變異體蛋白質係相對於參考全長蛋白質「截頭」。於若干實例中，截頭蛋白質保有參考蛋白質的功能活性。「截頭」蛋白質表示部分蛋白質可被裂離，例如，而其餘截頭蛋白質於裂解後保有及具有期望活性。裂解可藉多種蛋白酶中之任一者達成。此外，有效裂解蛋白質可使用分子生物學技術製造，其中編碼部分蛋白質的DNA鹼基係從編碼序列經由使用限剪核酸內切酶消化或熟諳技藝人士可用的其它技術去除。截頭蛋白質可於異源系統表現，例如，大腸桿菌、棒狀病毒、基於植物的病毒系統、及酵母。賦與除草劑耐受性的截頭蛋白質可使用於除草劑耐受性生物檢定分析的表現蛋白質的異源系統證 實，諸如此處所述。技藝界眾所周知截頭蛋白質可成功地製造使其保有全長參考蛋白質的功能活性。舉例言之，Bt蛋白質可以截頭(核蛋白)形式表現。例如參考Hofte及Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53(2)：242-55；及Adang等人(1985)基因36：289-300。
於某些情況下，尤其在植物體表現，可優異地使用表現截頭蛋白質的截頭基因。截頭基因可編碼組成例如40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99%全長蛋白質的多肽。
保有其設計所源自的參考序列的功能之變異體基因及蛋白質可由熟例如藉檢定分析重組變異體的活性決定。若此種活性檢定分析為已知且經特徵化，則功能變異體的決定只需例行性實驗。
可對酶的「活性位置」作特定改變以影響其就活性或立體特異性的特有功能。參考Muller等人(2006)蛋白質科學15(6)：1356-68。舉例言之，已知之tauD結構已經用作為模型二氧合酶以決定活性位置殘基同時結合至其特有酶基質牛磺酸。參考Elkins等人(2002)生物化學41(16)：5185-92。有關酶活性位置之序列最佳化及設計能力的進一步資訊可參考Chakrabarti等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(34)：12035-40。
蛋白質的各種結構性質及三維特徵可經改變而不會對蛋白質的活性/功能造成不良影響。可做保留胺基酸取代而不會對分子的活性及/或三維組態造成不良影響(「可耐受」取代)。變異體蛋白質也可設計成於序列層面與參考蛋白質相異，但保有相同或相似的總必需三維結構、表面電荷分布等。例如參考美國專利案第7,058,515號；Larson等人(2002)蛋白質科學11：2804-13；Crameri等人(1997)Nat.Biotechnol.15：436-8；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-51；Stemmer(1994)自然370：389-91；Stemmer(1995)生物/技術13：549-53；Crameri等人(1996)Nat.Med.2：100-3；及Crameri等人(1996)Nat.Biotechnol.14：315-9。
也可進行適用於表現組成體(例如DGT-28表現組成體)的5’或3’UTR(例如合成髮夾體)的運算設計，且可用以設計在此處若干實施例的核酸內部的元體。用於預測/評估5’或3’UTR衍生體的電腦模型化及UTR及電腦模型化技術包括例如但非僅限於：MFoLDTM 3.1版(得自遺傳學企業群(Genetics Corporation Group)，威斯康辛州麥迪遜；參考Zucker等人「RNA二次結構預測的演算法及熱力學：規範指南」，於RNA生物化學及生物技術，11-43，J. Barciszewski & B.F.C. Clark編輯，NATO ASI系列，Kluwer學術出版社荷蘭朵瑞特(1999)；Zucker等人(1999)J.Mol.Biol.288：911-40；Zucker等人「RNA二次結構預測」，於核酸化學之現行協定，S. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick, 及R.A. Jones編輯，約翰威利父子公司紐約，11.2.1-11.2.10，2000)；及COVETM(使用協方差模型(隨機上下文自由文法方法)的RNA結構分析)v.2.4.2(Eddy及Durbin(1994)Nucl.Acids Res.22：2079-88)，免費分送為來源碼且可藉存取網址genetics.wustl.edu/eddy/software/下載；及FLODALIGNTM(參考Gorodkin等人(1997)核酸研究25(18)：3724-32及Gorodkin等人(1997)分子生物學智慧系統ISMB國際會議議事錄分子生物學智慧系統國際會議5：120-123)，也免費分發且於網址foldalign.ku.dk/software/index.html.下載可得。
啟動子：「啟動子」一詞係指可控制核酸編碼序列或功能RNA的表現之DNA序列。於實施例中，經控制的編碼序列係位在啟動子序列的3’。啟動子可全部衍生自天然基因，啟動子可包含衍生自自然界所見不同啟動子的不同元體，或啟動子甚至可包含合成DNA節段。熟諳技藝人士須瞭解不同啟動子可導引基因於不同組織或細胞型別的表現，或在不同發育階段的表現，或回應於不同的環境或生理條件而表現。前述全部啟動子之實例為技藝界所已知且用以控制異源核酸的表現。指導基因大部分時間於大部分細胞型別表現的啟動子俗稱「組成性啟動子」。此外，雖然技藝界曾經(大部分情況不成功)試圖界限調節序列的確切邊界，但須瞭解不同長度的DNA片段可具有相同的啟動子活性。特定核酸的啟動子活性可使用技藝界熟知的技術檢定分析。
操作式鏈接：「操作式鏈接」一詞係指單一核酸上的核酸序列之聯結，其中該等核酸序列中之一者的功能受另一者影響。舉例言之，當啟動子可執行編碼序列的表現時(例如編碼序列係在啟動子的轉錄控制之下)啟動子係操作式鏈接至一編碼序列。編碼序列可以訊息方向或反訊息方向操作式鏈接至一調節序列。
表現：如此處使用，「表現」一詞可指衍生自DNA的訊息(mRNA)或反訊息RNA的轉錄及穩定積聚。表現也可指mRNA轉譯成多肽。如此處使用，「過表現」一詞係指相同基因或相關基因的內生性表現。如此，若一異源基因表現係高於可相媲美內生基因的表現，則該異源基因為「過表現」。
轉形：如此處使用，「轉形」一詞係指核酸或其片段移轉或整合入宿主有機體，導致基因的穩定遺傳。含有轉形核酸的宿主有機體稱作為「基因轉殖」、「重組」、或「轉形」有機體。已知之轉形方法包括例如：根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發根農桿菌(A.rhizogenes)媒介的轉形；磷酸鈣轉形；聚凝胺(polybrene)轉形；原生質體融合；電穿孔；超音波法(例如超音波穿孔)；微脂粒轉形；微注射；以裸DNA轉形；以質體載體轉形；以病毒載體轉形；基因槍轉形(微粒子撞擊)；碳化矽晶鬚(WHISKERS)媒介轉形；氣溶膠束法；及聚乙二醇(PEG)媒介轉形。
導入：如此處使用，「導入」一詞(將核酸導入細胞的脈絡)包括細胞之轉形，以及以第二植物交配包含該核 酸的一植物，使得該第二植物含有該核酸，如利用習知植物育種技術執行者。此種育種技術為業界所已知。有關植物育種技術之討論請參考Poehlman(1995)育種農作物，第四版，AVI出版公司，康乃狄克州西港。
反交配法可用以將核酸導入植物體內。此項技術 用以將特徵導入植物體內已使用數十年。反交配(及其它植物育種法)的描述實例可參考例如Poelman(1995)，參見上文；及Jensen(1988)植物育種法，威利，紐約州紐約。於反交配方案之實例中，一原先關注植物(「輪回親代(recurrent parent)」)係交配至攜帶所導入的核酸之第二植物(「非輪回親代(non-recurrent parent)」)。由此交配所得子代然後再度交配至輪回親代，及該處理程序重複直至獲得轉換植物(converted plant)為止，其中除了得自非輪回親代的核酸之外，輪回親代的期望形態學及生理學特性大致上全部皆回收於轉換植物。
質體/載體：如此處使用，「質體」及「載體」等詞係指染色體外元體可攜載非屬細胞的中心代謝的一部分的一或多個基因。質體及載體典型地為圓形雙股DNA分子。但質體及載體可為單股或雙股DNA或RNA之線性或圓形核酸，及可衍生自任何來源，其中多個核苷酸序列已經接合或重組成獨特組成，能夠將一啟動子片段及一編碼DNA序列連同任何適當3’未轉譯序列導入細胞內。於實例中，質體及載體可包含自生複製序列、基因體整合序列、及/或噬菌體或核苷酸序列。
III. DGT-28及DGT-28編碼序列
此處若干實施例提出與SEQ ID NO：1具有至少90%相同度(例如89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同度)之一分離多肽。此種多肽於此處稱作為DGT-28多肽。此處若干實施例提出一種編碼與SEQ ID NO：1具有至少約90%相同度之一多肽的核酸。此種核酸之特例於此處稱作為「dgt-28」核酸。dgt-28核酸可用於寬廣多項應用中之任一者(例如導入嘉磷賽抗性)，其中一植物細胞期望改性嘉磷賽代謝作用。
此處用於例示說明用途的dgt-28核酸之特例為SEQ ID NO：2及3。據此，若干實施例提供與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少約80%序列相同度(例如79%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同度)之一核苷酸序列，其中該核酸係編碼與SEQ ID NO：1具有至少約90%相同度之一多肽。dgt-28核酸之特例包括在嚴苛(例如高度嚴峻)條件下特別雜交至具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核酸。
於若干實施例中，提出密碼子最佳化的dgt-28核酸。舉例言之，為了於植物獲得異源基因的高度表現，期望設計及工程再造基因使得可在植物細胞內更有效地表現。於細菌基因期望在植物細胞表現的情況此項策略特別 合所需。
如此，此處若干實例提出一種編碼DGT-28蛋白質之植物最佳化基因及其設計方法以產生可在雙子葉或單子葉植物最佳表現的DNA序列，及其中該序列修改不會妨礙轉譯或轉錄。用於在單子葉及雙子葉植物二者表現該DGT-28蛋白質的最佳化dgt-28基因之設計於此處係以此基因的蛋白質編碼區之工程再造用於最佳表現舉例說明。此處植物最佳化dgt-28核酸包括SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3。
於工程處理編碼DGT-28蛋白質用以在雙子葉或單子葉植物(例如棉、油菜籽、菸草、玉米、大豆、小麥及稻)中表現的基因時，例如透過使用公諸大眾的DNA序列資料庫以找出有關植物基因體的密碼子分布或各種植物基因的蛋白質編碼區之資訊，可決定個別宿主植物的密碼子偏重。
於設計用於植物表現的核酸中的編碼區時，須決定植物偏好的一次(「首選」)密碼子，以及當存在有多重選項時的第二、第三、第四等較佳密碼子的選擇。然後設計新穎DNA序列，其編碼相同胜肽(例如DGT-28蛋白質)的胺基酸序列，但新穎DNA序列與原先DNA序列差異為植物(第一較佳、第二較佳、第三較佳、或第四較佳等)密碼子的取代以載明在胺基酸序列內部各個位置的胺基酸。
然後新序列分析可能已藉改性產生的限剪酶位置。識別的位置可進一步以第一、第二、第三、或第四選擇較佳密碼子置換密碼子而改性。序列中可影響關注基因 的轉錄或轉譯的其它位置為莖-環結構、外顯子：內含子接合(5’或3’)、poly A加成信號、及RNA聚合酶終結信號；此等位置可藉植物密碼子的取代去除。該序列可經進一步分析及改性以減低TA或CG二聯體的頻率。除了二聯體外，G或C序列區塊有多於約六個殘基為相同，可能影響該序列的轉錄或轉譯。因此，此等區塊可藉以次佳選項密碼子置換第一或第二選項密碼子加以改性。
SEQ ID NO：2(dgt-28(v5))係最佳化用以於雙子葉植物表現。SEQ ID NO：3(dgt-28(v6))係最佳化用以於單子葉植物表現。於此等合成序列中的密碼子使用係基於較佳密碼子使用選擇；亦即，各自的表現產物係藉具有朝向單子葉或雙子葉植物使用偏向的密碼子編碼，及有害序列及多餘限剪位置被去除以提高DGT-28多肽之轉錄/轉譯效率及輔助DNA處理步驟。
同理，SEQ ID NO：4(dgt-28(v1))的核酸序列係經最佳化以改良於大腸桿菌(Escherichia coli)的表現。於SEQ ID NO：4的密碼子使用係基於較佳大腸桿菌密碼子使用而選擇；表現的蛋白質係藉具有朝向大腸桿菌使用偏向的密碼子編碼。在重新設計期間，有害序列及多餘限剪位置被去除以提高DGT-28多肽之轉錄/轉譯效率及輔助DNA處理步驟。如此，得自包含SEQ ID NO：4的核酸之DGT-28於大腸桿菌表現可導致穩健蛋白質表現，例如用於DGT-28的酶特徵化。
一旦最佳化的(例如植物最佳化的)DNA序列已 經於紙上設計或in silico，則實際DNA分子可於實驗室合成，而序列精準地對應所設計的序列。此種合成核酸分子可經選殖且以其它方式操控，恰如同係從自然界或天然來源衍生般。
此處核酸可選殖入載體內用以轉形入原核細胞或真核細胞以供複製及/或表現。載體可為原核載體；例如質體、或穿梭載體、昆蟲載體、或真核載體。此處核酸也可選殖入表現載體內例如用以投予植物細胞。某些應用中，可較佳地具有於大腸桿菌有功能的載體(例如生產蛋白質用以提引出抗體，DNA序列分析，插子的組構，獲得定量核酸)。
為了於細胞表現DGT-28蛋白質，編碼蛋白質的核酸典型地次選殖入含有一啟動子以指導轉錄的一表現載體。適當細菌性及真核啟動子為技藝界眾所周知，例如於Sambrook等人，分子選殖，實驗室手冊(第二版，1989；第三版，2001)；Kriegler，基因轉移及表現：實驗室手冊(1990)；及分子生物學現行協定(Ausubel等人，參見上文)。此處表現核酸的細菌性表現系統例如係得自大腸桿菌、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)、及沙門氏菌(Salmonella)(Palva等人，基因22：229-235(1983))。此種表現系統的套組為市面上可購得。用於哺乳動物細胞、酵母、及昆蟲細胞的真核表現系統為熟諳技藝人士眾所周知，也為市售可得。
用以將遺傳資訊轉運入細胞的特定表現載體係就DGT-28蛋白質的預期用途選擇(例如於植物、動物、細 菌、真菌、及原蟲表現)。標準細菌性及動物表現載體為技藝界所已知且以細節描述於例如美國專利公告案20050064474A1及國際專利公告案WO 05/084190、WO 05/014791及WO 03/080809。標準轉移感染方法可用以產生細菌細胞系，可表現大量蛋白質，然後可使用標準技術純化。
用以指導此處核酸表現的一啟動子的選擇係取決於特定應用。指導基因於植物表現的多個啟動子可用於此處實施例。此種啟動子可選自組成性經化學調節的可誘導組織特異性及種子較佳啟動子。舉例言之，適用於宿主細胞的強組成性啟動子可用於DGT-28蛋白質的表現及純化。植物啟動子之非限制性實例包括衍生自擬南芥(A.thaliana)泛肽素-10(ubi-10)(Callis等人，1990，J.Biol.Chem.,265：12486-12493)；根瘤農桿菌甘露鹼合成酶(△mas)(Petolino美國專利案第6,730,824號)；及/或木薯(Cassava Vein)嵌紋病毒(Mosaic Virus)(CsVMV)(Verdaguer等人，1996，植物分子生物學31：1129-1139)的啟動子序列。
組成型啟動子包括例如核心花椰菜嵌紋病毒35S啟動子(Odell等人(1985)自然313：810-812)；稻肌動蛋白啟動子(McElroy等人(1990)植物細胞2：163-171)；玉米泛肽素啟動子(美國專利案第5,510,474號；Christensen等人(1989)植物分子生物學12：619-632及Christensen等人(1992)植物分子生物學18：675-689)；pEMU啟動子(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；ALS啟動子(美國專利案第5,659,026號)；玉米組織蛋白腖啟動子(Chaboute等人植物分 子生物學，8：179-191(1987))等。
可用的可相容啟動子之範圍包括組織特異性及 可誘導啟動子。可誘導調節元體乃能夠直接地或間接地回應於一誘導物而作動一或多個DNA序列或基因的轉錄。於誘導物不存在下，DNA序列或基因將不被轉錄。典型地，特異性結合至可誘導調節元體以作動轉錄的蛋白質因子係以無活性形式存在，然後藉該誘導物而直接地或間接地轉換成活性形式。誘導物可為化學劑，諸如蛋白質、代謝產物、生長調節劑、除草劑或酚系化合物，或由熱、冷、鹽、或毒性元素直接加諸的生理壓力，或由病原或疾病作用劑諸如病毒間接加諸的生理壓力。典型地，特異性地結合至可誘導調節元體以活化轉錄的蛋白質因子係以無活性形式存在，然後藉該誘導物而直接地或間接地轉換成活性形式。含有可誘導調節元體的植物細胞可藉諸如噴灑、澆水、加熱或類似方法從外部施用一誘導物至該細胞或植物而暴露於該誘導物。
任何可誘導啟動子皆可用於此處實施例。參考Ward等人植物分子生物學22：361-366(1993)。可誘導啟動子包括例如但非僅限於：蛻皮激素受體啟動子(美國專利案第6,504,082號)；對銅具反應性得自ACE1系統的啟動子(Mett等人PNAS 90：4567-4571(1993))；對苯磺醯胺除草劑安全劑具反應性得自玉米的In2-1及In2-2基因(美國專利案第5,364,780號；Hershey等人，分子基因遺傳學227：229-237(1991)；及Gatz等人，分子基因遺傳學 246：32-38(1994))；得自Tn10的Tet阻遏子(Gatz等人，分子基因遺傳學227：229-237(1991))；得自類固醇基因的啟動子，其轉錄活性係由糖皮質激素荷爾蒙誘導，Schena等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：10421(1991)及McNellis等人(1998)植物期刊14(2)：247-257；玉米GST啟動子，其係藉斥水性親電性化合物活化，用作為萌前除草劑(參考美國專利案第5,965,387號及國際專利申請公告案第WO 93/001294號)；及菸草PR-1a啟動子，其係藉水楊酸活化(參考Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K.，「菸草PR-1a啟動子用以監視藉蟲螢光素酶生物冷光通報子系統的防禦基因表現的使用評估」，Biosci Biotechnol Biochem.2011年9月23日；75(9)：1796-800)。其它關注的化學調節啟動子包括四環黴素(tetracycline)可誘導及四環黴素可遏止啟動子(例如參考Gatz等人，分子基因遺傳學227：229-237，及美國專利案第5,814,618號及第5,789,156號)。
其它關注的可調節啟動子包括冷反應性調節元體或熱震調節元體，其轉錄分別係受暴露於冷或熱的影響(Takahashi等人，植物生理學99：383-390，1992)；醇去氫酶基因的啟動子(Gerlach等人，PNAS USA 79：2981-2985(1982)；Walker等人，PNAS 84(19)：6624-6628(1987))，藉厭氧條件可誘導；光可誘導啟動子衍生自豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因(Yamamoto等人(1997)植物期刊12(2)：255-265)；光可誘導調節元體(Feinbaum等人，Mol.Gen.Genet.226：449，1991；Lam及Chua，科學248：471， 1990；Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(20)：9586-9590；Orozco等入(1993)植物分子生物學23(6)：1129-1138)；植物激素可誘導調節元體(Yamaguchi-Shinozaki等人，植物分子生物學15：905，1990；Kres等人，植物分子生物學15：225，1990)等。可誘導調節元體也可為玉米In2-1或In2-2基因的啟動子，其係對苯磺醯胺除草劑安全劑具反應性(Hershey等人，分子基因遺傳學227：229-237(1991)；及Gatz等人，分子基因遺傳學243：32-38(1994))；得自Tn10的Tet阻遏子(Gatz等人，分子基因遺傳學227：229-237，1991)。
壓力可誘導啟動子包括鹽/水壓力可誘導啟動子諸如P5CS(Zang等人(1997)植物科學129：81-89)；冷可誘導啟動子，諸如cor15a(Hajela等人(1990)植物生理學93：1246-1252)、cor15b(Wilhelm等人(1993)植物分子生物學23：1073-1077)、wsc120(Ouellet等人(1998)FEBS Lett.423-324-328)、ci7(Kirch等人(1997)植物分子生物學33：897-909)及ci21A(Schneider等人(1997)植物生理學113：335-45)；乾旱可誘導啟動子，諸如Trg-31(Chaudhary等人(1996)植物分子生物學30：1247-57)及rd29(Kasuga等人(1999)自然生物技術18：287-291)；滲透壓可誘導啟動子，諸如Rab17(Vilardell等人(1991)植物分子生物學17：985-93)及滲透素(osmotin)(Raghothama等人(1993)植物分子生物學23：1117-28)；熱可誘導啟動子，諸如熱震蛋白質(Barros等人(1992)植物分子學19：665-75；Marrs等人(1993)Dev.Genet. 14：27-41)、smHSP(Waters等人(1996)實驗植物學期刊47：325-338)；及從洋芹泛肽素啟動子熱震可誘導元體(WO 03/102198)。其它壓力可誘導啟動子包括rip2(美國專利案第5,332,808號及美國公告案2003/0217393)及rd29a(Yamaguchi-Shinozaki等人(1993)Mol.Gen.Genet.236：331-340)。有些啟動子係由創傷可誘導，包括農桿菌pMAS啟動子(Guevara-Garcia等人(1993)植物期刊4(3)：495-505)及農桿菌ORF13啟動子(Hansen等人(1997)Mol.Gen.Genet.254(3)：337-343)。
組織較佳啟動子可用以靶定在特定植物組織內部的增強轉錄及/或表現。此等型別的啟動子實例係包括種子較佳表現，諸如由菜豆蛋白(phaseolin)啟動子(Bustos等人1989，植物細胞第1期839-853)、及玉米球蛋白-1基因，Belanger等人1991遺傳學129：863-972所提供者。針對雙子葉植物，種子較佳啟動子包括但非僅限於豆β-菜豆蛋白、蕓薹蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)、大豆植物凝集素(lectin)、十字花科蛋白(cruciferin)等。針對單子葉植物，種子較佳啟動子包括但非僅限於玉米15 kDa玉米蛋白、22 kDa玉米蛋白、27 kDa玉米蛋白、γ-玉米蛋白、蠟樣蛋白(waxy)、皺縮蛋白(shrunken)1、皺縮蛋白2、球蛋白1等。種子-較佳的啟動子也包括主要針對種子內部特定組織指導基因表現的該等啟動子，諸如γ-玉米蛋白的胚乳較佳啟動子、得自菸草的隱藏啟動子(Fobert等人1994。菸草的種皮特異性隱藏啟動子之T-DNA標籤，植物期刊 4：567-577)、得自玉米的P-基因啟動子(Chopra等人1996，具有獨特組織特異性的玉米P基因之對偶基因編碼具有C-終端置換的Myb-同源蛋白質，植物細胞7：1149-1158，Erratum於植物細胞，1997，1：109)、得自玉米的球蛋白-1基因(Belenger and Kriz.1991.自玉米的球蛋白-1基因之多偶多形性的分子基礎，遺傳學129：863-972)、及指導表現至玉米穗軸的種皮或殼的啟動子，例如果皮特異性麩胺合成酶啟動子(Muhitch等人，2002，從於基因轉殖玉米可賦與組織特異性基因表現的麩胺合成酶1-2基因分離啟動子序列，植物科學163：865-872)。
除了啟動子之外，表現載體典型地含有轉錄單元或表現卡匣，核酸於宿主細胞或為原核或為真核表現要求的全部額外元體。如此，典型表現卡匣含有啟動子操作式鏈接例如至編碼蛋白質的核酸序列，及例如轉錄本的有效聚腺苷酸化、轉錄終結、核糖體結合位置、或轉譯終結要求的信號。卡匣的額外元體包括例如增強子及異源疊接信號。
載體的其它組件可包括，也取決於基因的預期用途。實例包括可選擇標記、靶定或調節序列、轉移胜肽序列諸如最佳化轉移胜肽序列(參考美國專利案第5,510,471號)穩定化序列，諸如RB7 MAR(參考Thompson及Myatt，(1997)植物分子生物學34：687-692及WO 9727207)或先導子序列、內含子等。植物表現載體及通報子基因的一般描述及實例可參考Gruber等人，「用於植物轉形的載體」於植物分子生物學及生物技術方法，Glick等入編輯；CRC出版社 89-119頁(1993)。
適當表現載體的選擇將取決於宿主及將表現載體導入宿主內的方法。表現卡匣可包括在關注異源核苷酸序列的3’端，於植物體有功能的轉錄及轉譯終結區。該終結區可為關注DNA序列的天然終結區或可衍生自另一來源。方便終結區係得自根瘤農桿菌的Ti質體，諸如octopine合成酶及nopaline合成酶(nos)終結區(Depicker等人，Mol.And Appl.Genet.1：561-573(1982)及Shaw等人(1984)核酸研究第12卷第20期第7831-7846頁(nos))；也參考Guerineau等人Mol.Gen.Genet.262：141-144(1991)；Proudfoot,Cell 64：671674(1991)；Sanfacon等人Genes Dev.5：141-149(1991)；Mogen等人植物細胞2：1261-1272(1990)；Munroe等人基因91：151-158(1990)；Ballas等人核酸研究17：7891-7903(1989)；Joshi等人核酸研究15：9627-9639(1987)。
一表現卡匣可含有5’先導子序列。此種先導子序列可作用以增強轉譯。轉譯先導子為技藝界所已知且包括例如小RNA病毒先導子、EMCV先導子(腦心肌炎5’非編碼區)，Elroy-Stein等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6126-6130(1989)；馬鈴薯Y病毒(potyvirus)先導子例如，TEV先導子(菸草蝕紋病毒)，Carrington及Freed病毒學期刊，64：1590-1597(1990)、MDMV先導子(玉米矮花葉嵌紋病毒)，Allison等人，病毒學154：9-20(1986)；人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)，Macejak等人自然353：90-94(1991)； 得自苜蓿嵌紋病毒的套膜蛋白質mRNA的未經轉譯先導子(AMV RNA 4)，Jobling等人自然325：622-625(1987)；菸草嵌紋病毒先導子(TMV)，Gallie等人(1989)RNA之分子生物學，237-256頁；及玉米黃化斑紋病毒先導子(MCMV)，Lommel等人病毒學81：382-385(1991)。也參考Della-Cioppa等人植物生理學84：965-968(1987)。
組成體也含有增強轉譯及/或mRNA安定性的序列，諸如內含子。此種內含子的一個實例為擬南芥(Arabidopsis thaliana)組織蛋白腖H3.III變異體的基因II之第一內含子。Chaubet等人分子生物學期刊，225：569-574(1992)。
於該等情況下，當期望異源核苷酸序列的表現產物導向特定小器官，特別色素體、澱粉體，或導向內質網、或分泌在細胞表面，或分泌在胞外時，表現卡匣可進一步包含轉移胜肽的編碼序列。此種轉移胜肽為技藝界眾所周知，及包括但非僅限於醯基攜帶子蛋白之轉移胜肽、RUBISCO的小型亞單元、植物EPSP合成酶及向日葵(Helianthus annuus)(參考Lebrun等人美國專利案第5,510,417號)、玉米(Zea mays)脆性(Brittle)-1葉綠體轉移胜肽(Nelson等人植物生理學117(4)：1235-1252(1998)；Sullivan等人植物細胞3(12)：1337-48；Sullivan等人，植物界(1995)196(3)：477-84；Sullivan等人，J.Biol.Chem.(1992)267(26)：18999-9004)等。此外，嵌合葉綠體轉移胜肽為技藝界已知，諸如最佳化轉移胜肽(參考美國專利案第 5,510,471號)。額外葉綠體轉移胜肽先前已描述於美國專利案第5,717,084號；第5,728,925號。熟諳技藝人士容易瞭解表現產物至特定小器官有許多選項。舉例言之，大麥α澱粉酶序列常用以指導表現至內質網。Rogers，J.Biol.Chem.260：3731-3738(1985)。
熟諳技藝人士將瞭解藉操控例如，宿主細胞內部核酸分子的套數、該等核酸分子的轉錄效率、所得轉錄本被轉譯的效率、及轉譯後改性效率，可改良轉移感染核酸分子的表現控制。此外，啟動子序列可經遺傳基因改造以比較天然啟動子改良表現程度。可用以控制核酸分子表現的重組技術包括但非僅限於核酸分子穩定整合入一或多個宿主細胞染色體，添加載體安定性序列至質體，轉錄控制信號(例如啟動子、操縱子、增強子)的取代或改性，轉譯控制信號(例如核糖體結合位置、祥達(Shine-Dalgarno)或柯札(Kozak)序列)的取代或改性，核酸分子之改性以相對應於宿主細胞的密碼子使用，使轉錄本變不穩定化的序列之刪除。
用以選擇已轉形的細胞或組織或植物部分或植物的通報子基因或標記子基因可含括於轉形載體。可選擇標記之實例包括賦與對抗代謝產物諸如除草劑或抗生素的抗性之標記，例如，二氫葉酸還原酶，其賦與對胺甲喋呤(methotrexate)的抗性(Reiss，植物生理學(Life Sci.Adv.)13：143-149，1994；也參考Herrera Estrella等人，自然303：209-213，1983；Meijer等人，植物分子生物學16：807-820，1991)；新黴素(neomycin)磷酸轉移酶，其賦與 對胺基糖苷類新黴素、康黴素(kanamycin)及帕洛黴素(paromycin)的抗性(Herrera-Estrella，EMBO J.2：987-995，1983及Fraley等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：4803(1983))；吸濕黴素(hygromycin)磷酸轉移酶，其賦與對吸濕黴素的抗性(Marsh，基因32：481-485，1984；也參考Waldron等人，植物分子生物學5：103-108，1985；Zhijian等人，植物科學108：219-227，1995)；trpB，其許可細胞利用吲哚替代色胺酸；hisD，其許可細胞利用組織醇替代組胺酸(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：8047，1988)；甘露糖-6-磷酸異構酶，其許可細胞利用甘露糖(WO 94/20627)；鳥胺酸去羧基酶，其賦與對鳥胺酸去羧基酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥胺酸的抗性(DFMO；McConlogue，1987，分子生物學之現行通訊，冷泉港實驗室編輯)；及得自土麴菌(Aspergillus terreus)的去胺酶，其賦與對殺稻瘟菌素(Blasticidin)S的抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59：2336-2338，1995)。
額外可選擇標記包括例如，突變體乙醯乳酸合成酶，其賦與對咪唑酮或磺醯脲之抗性(Lee等人，EMBO J.7：1241-1248，1988)、突變體psbA，其賦與對亞特拉景(atrazine)之抗性(Smeda等人，植物生理學103：911-917，1993)、或突變體原卟啉原(protoporphyrinogen)氧化酶(參考美國專利案第5,767,373號)、或其它標記賦與對除草劑諸如草胺膦(glufosinate)的抗性。合宜可選擇標記基因之實例包括但非僅限於編碼對下列的基因：氯黴素 (chloramphenicol)(Herrera Estrella等人，EMBO J.2：987-992，1983)；鏈黴素(streptomycin)(Jones等人，Mol.Gen.Genet.210：86-91，1987)；觀黴素(spectinomycin)(Bretagne-Sagnard等人，基因轉殖研究5：131-1371996)；布力歐黴素(bleomycin)(Hille等人，植物分子生物學7：171-176，1990)；磺醯胺(Guerineau等人，植物分子生物學15：127-136，1990)；溴苯腈(bromoxynil)(Stalker等人，科學242：419-423，1988)；嘉磷賽(Shaw等人，科學233：478-481，1986)；草丁膦(phosphinothricin)(DeBlock等人，EMBO J.6：2513-2518，1987)等。
選擇基因使用的一個選項係為草胺膦(glufosinate)抗性編碼DNA，於一個實施例中可為於木薯嵌紋病毒啟動子控制下的草丁膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶(pat)、玉米最佳化pat基因或bar基因。此等基因賦與對拜樂弗(bialaphos)的抗性。參考(參考Wohlleben等人(1988)基因70：25-37)；Gordon-Kamm等人，植物細胞2：603，1990；Uchimiya等人，生物技術11：835，1993；White等人，核酸研究18：1062，1990；Spencer等人，Theor.Appl.Genet.79：625-631，1990；及Anzai等人，Mol.Gen.Genet.219：492，1989)。pat基因之版本為玉米最佳化pat基因，述於美國專利案第6,096,947號。
此外，可採用輔助識別含編碼該標記的多核苷酸之植物細胞的標記。可計分或可篩選標記為有用，於該處該序列的存在可產生可量測產物，不破壞植物細胞而可製 造產物。實例包括β-葡萄糖醛酸酶，或uidA基因(GUS)，其編碼已知各個發色酶基質的酶(例如美國專利案第5,268,463及5,599,670號)；氯黴素乙醯轉移酶(Jefferson等人EMBO期刊第6卷第13期第3901-3907頁)；及鹼性磷酸酶。於一個實施例中，使用的標記為β-胡蘿蔔素或原維生素A(Ye等人，科學287：303-305(2000))。該基因已用以提升稻米的營養，但於本例中係用以替代作為可篩選標記，及鏈接至關注基因的該基因之存在係藉提供的金色而予檢測。不似基因係用於對植物的營養貢獻的情況，小量蛋白質即足夠用於標記目的。其它可篩檢標記一般包括花青素/類黃酮基因(參考Taylor及Briggs，植物細胞(1990)2：115-127的討論)包括例如R-基因座基因，其係編碼一產物其調節花青素色素(紅色)於植物組織的製造(Dellaporta等人，染色體結構及功能，Kluwer學術出版社，Appels及Gustafson編輯263-282頁(1988))；控制類黃酮色素的生合成之基因，諸如玉米C1基因(Kao等人，植物細胞(1996)8：1171-1179；Scheffler等人Mol.Gen.Genet.(1994)242：40-48)及玉米C2基因(Wienand等人，Mol.Gen.Genet.(1986)203：202-207)；B基因(Chandler等人，植物細胞(1989)1：1175-1183)、p1基因(Grotewold等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1991)88：4587-4591；Grotewold等人，細胞(1994)76：543-553；Sidorenko等人，植物分子生物學(1999)39：11-19)；古銅基因座基因(Ralstom等人，遺傳學(1988)119：185-197；Nash等人，植物細胞(1990)2(11)：1039-1049)等。
適當標記的額外實例包括靛螢光蛋白(CYP)基因(Bolte等人(2004)細胞科學期刊117：943-54及Kato等人(2002)植物生理學129：913-42)、黃螢光蛋白基因(PHIYFPTM得自伊佛吉(Evrogen)；參考Bolte等人(2004)細胞科學期刊117：943-54)；lux基因，其編碼蟲螢光素酶，其存在例如可使用X光片、掃描計數、螢光光譜術、低光視訊攝影機、光子計數相機、多井照度計量術檢測(Teeri等人(1989)EMBO J.8：343)；綠螢光蛋白(GFP)基因(Sheen等人，植物期刊(1995)8(5)：777-84)；及DsRed2，於該處以標記基因轉形的植物細胞為紅色，如此可目測選擇(Dietrich等人(2002)生物技術2(2)：286-293)。額外實例包括β-內醯胺酶基因(Sutcliffe,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1978)75：3737)，其係編碼多個發色酶基質為已知的酶(例如PADAC，發色頭孢子菌素)；xylE基因(Zukowsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(1983)80：1101)，其係編碼兒茶酚二氧合酶，其可轉換發色兒茶酚；α-澱粉酶基因(Ikuta等人，Biotech.(1990)8：241)；及酪胺酸酶基因(Katz等人，J.Gen.Microbiol.(1983)129：2703)，其係編碼可氧化酪胺酸成為DOPA及多巴醌的酶，其又轉而縮合形成易偵測的化合物黑色素。顯然，許多此等標記為可得，且為熟諳技藝人士所已知。
IV.包含DGT-28的細胞及有機體
於若干實施例中，提供細胞及/或有機體(例如植物細胞或植物)包含與SEQ ID NO：1具有至少約90%相同度之一異源多肽，例如，dgt-28核酸。於特定實施例中，提供 細胞及/或有機體包含與SEQ ID NO：1具有至少約90%相同度之一多肽的編碼異源核酸。若干實施例包括細胞及/或有機體包含一異源核酸，其於高度嚴苛條件下係雜交至具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的另一個核酸。
植物細胞、植物部分、及/或植物可藉技藝界已知之導入一異源分子的數種方法中之任一者基因改性而包含一異源多肽(例如DGT-28蛋白質)及/或異源核酸(例如dgt-28核酸)。於此處特定實施例中，異源分子係藉選自於下列方法而導入植物細胞、植物部分、及/或植物內，該等方法例如但非限制性：轉形及選擇性育種(例如反交配育種)。
任何植物物種或植物細胞可經基因改性而包含此處之一異源多肽及/或核酸。於若干實施例中，如此基因改性的植物細胞無法再生而產生植株。於若干實施例中，依據本文揭示基因改性的植物(例如植物宿主細胞)包括但非僅限於高等植物、雙子葉植物、單子葉植物、消費性植物、作物植物、及利用其油的植物(例如油籽植物)。此等植物包括例如但非僅限於：苜蓿；大豆；棉；油菜籽(油菜)；亞麻籽；玉米；稻；臂形草；小麥；紅花；高粱；甜菜；向日葵；菸草；及青草(例如草坪草)。於特定實施例中，此處基因改性植物細胞或植物包括例如但非僅限於：矮小芥(Brassica napus)；印度芥(Brassica juncea)；衣索匹亞芥(Brassica carinata)；蘿蔔(Brassica rapa)；甘藍(Brassica oleracea)；大豆(Glycine max)；亞麻(Linum usitatissimum)； 玉米(Zea mays)；紅花(Carthamus tinctorius)；向日葵(Helianthus annuus)；菸草(Nicotiana tabacum)；擬南芥(Arabidopsis thaliana)；巴西胡桃(Betholettia excelsa)；蓖麻籽(Ricinus communis)；椰子(Cocus nucifera)；芫荽(Coriandrum sativum)；草棉屬(Gossypium spp.)；落花生(Arachis hypogaea)；荷荷葩(Simmondsia chinensis)；油棕櫚(Elaeis guineeis)；橄欖(Olea eurpaea)；水稻(Oryza sativa)；南瓜(Cucurbita maxima)；大麥(Hordeum vulgare)；甜菜(Saccarum officinarum)；小麥屬(Triticum spp.)(包括Triticum durum及Triticum aestivum)；及浮萍(Lemnaceae sp.)。於若干實施例中，植物可具有特定基因背景，例如優良品種、野生型種、及商業可區別變種。
導入植物細胞的核酸可用以對大致上任何植物賦與期望的特徵。多種植物及植物細胞系可經工程處理以使用編碼DGT多肽的核酸及多種轉形方法。獲得此處所述期望的生理及農藝特性。此處實施例可使用技藝界已知之多種植物轉形(及遺傳改性植物的製造)方法。已經發展出無數植物轉形方法，包括用於雙子葉植物及單子葉植物的生物及物理轉形方案(例如參考Goto-Fumiyuki等人(1999)Nat.Biotechnol.17：282-6；Miki等人(1993)植物分子生物學及生物技術方法(Glick,B.R.及Thompson,J.E.，編輯)，CRC出版社公司，佛羅里達州波卡雷頓，67-88頁)。此外，描述植物的植物細胞及組織轉形及再生載體及試管試驗培養方法，例如於Gruber等人(1993)，參見上文，於89-119頁。
可用以將核酸導入植物宿主細胞之植物轉形技術包括例如但非限制性：使用根瘤農桿菌或發根農桿菌作為轉形因子，以解除武裝的T-DNA轉形；磷酸鈣轉移感染；聚凝胺轉形；原生質體融合；電穿孔(D’Halluin等人(1992)植物細胞4：1495-505)；超音波法(例如超音波穿孔)；微脂粒轉形；微注射；接觸裸DNA；接觸質體載體；接觸病毒性載體；基因槍(例如DNA粒子撞擊(例如參考Klein等人(1987)自然327：70-3)及微粒子撞擊(Sanford等人(1987)Part.Sci.Technol.5：27；Sanford(1988)生物技術趨勢6：299，Sanford(1990)植物生理學79：206；及Klein等人(1992)生物技術10：268)；碳化矽晶鬚(WHISKERS)-媒介轉形(Kaeppler等人(1990)植物細胞報告9：415-8)；奈米粒子轉形(例如參考美國專利公告案第S2009/0104700A1號)；氣溶膠束法；及聚乙二醇(PEG)-媒介的攝取。於特定實例中，異源核酸可直接導入植物細胞的基因體DNA。
用於將載體導入植物的廣用方法係基於農桿菌的自然轉形系統。Horsch等人(1985)科學227：1229。根瘤農桿菌及發根農桿菌為已知基因轉形植物細胞有用的植物病原性土壤細菌。根瘤農桿菌及發根農桿菌個別的Ti質體及Ri質體攜帶負責植物基因轉形的基因。Kado(1991)Crit.rev.Plant.Sci.10：1有關農桿菌載體系統及農桿菌媒介基因移轉方法的細節例如也可得自Gruber等人，參見上文，Miki等人，參見上文，Moloney等人，(1989)植物細胞報告8：238，及美國專利第4,940,838及5,464,763號。
若農桿菌用於轉形，則欲插入的DNA典型地係選 殖入特定質體；選殖入中間載體或二元載體。中間載體本身於農桿菌內無法複製。中間載體可利用助手質體(軛合)轉移入根瘤農桿菌內。日本菸草超二元系統為此種系統的範例(由Komari等人(2006)分子生物學方法(K.Wang編輯)No.343期；農桿菌方案，第2版，第1卷，修馬納出版公司，紐澤西州托托瓦15-41頁；及Komori等人，(2007)植物生理學145：1155-60綜論)。二元載體於大腸桿菌及農桿菌二者可本身複製。二元載體包含選擇標記基因及藉右及左T-DNA邊界區框出的鍵聯子或多鍵聯子。可直接轉形入農桿菌(Holsters，1978)。農桿菌包含攜帶vir區的質體。Ti或Ri質體也包含T-DNA轉移需要的vir區。vir區為T-DNA轉移入植物細胞所需。可含有額外T-DNA。
當使用二元T DNA載體(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12：8711-21)或共同培養程序(Horsch等人，(1985)科學227：1229-31)細胞藉細菌感染時，根瘤農桿菌宿主的毒力功能將指導含組成體及相鄰標記的T股插入植物細胞DNA。大致上，農桿菌轉形細胞係用來工程處理雙子葉植物。Bevan等人(1982)Ann.Rev.Genet 16：357-84；Rogers等人(1986)酶學方法118：627-41。農桿菌轉形法也可用來轉形及轉移核酸至單子葉植物及植物細胞。參考美國專利第5,591,616號；Hernalsteen等人(1984)EMBO J 3：3039-41；Hooykass-Van Slogteren等人(1984)自然311：763-4；Grimsley等人(1987)自然325：1677-9；Boulton等人(1989)植物分子生 物學12：31-40；及Gould等人，(1991)植物生理學95：426-34。
此處重組宿主的基因操控也可使用標準遺傳學技術及篩檢進行，可於適合基因操控的宿主細胞進行。於若干實施例中，重組宿主細胞可為適合基因改性及/或重組基因表現的任一種有機體或微生物宿主。於若干實施例中，重組體宿主可為植物。此處使用的標準重組DNA及分子選殖技術為技藝界眾所周知，且描述於例如但非限制性：Sambrook等人(1989)，參見上文；Silhavy等人(1984)使用基因融合實驗，冷泉港實驗室出版社，紐約州冷泉港；及Ausubel等人(1987)分子生物學之現行方案，格林出版公司及威利科技公司，紐約州紐約。
核酸導入植物細胞後，可生長植物細胞，及當分化組織諸如枝及根萌出時，可產生成熟植物。於若干實施例中，可產生多株植物。植物之再生方法為熟諳技藝人士所已知且例如可出現於：植物細胞及組織培養，1994，Vasil及Thorpe編輯，克魯沃學術出版社及出現於：植物細胞培養方案(分子生物學方法111，1999 Hall編輯，修馬納出版社)。此處所述遺傳改性植物可於發酵培養基培養或於適當培養基諸如土壤生長。於若干實施例中，高等植物的適當生長培養基可為任何植物生長培養基，包括但非限於土壤、沙、任何其它可支撐根生長的粒狀培養基(例如例如蛭石、珍珠石等)或水耕培養，以及可輔助高等植物生長的適當光線、水及營養補充物。
藉前述任一種轉形技術製造的轉形植物細胞可 經栽培來再生具有轉形基因型的全植物，如此具有期望的表現型。此種再生技術係仰賴於組織生長培養基內某些植物激素的操控，典型地仰賴殺生物標記及/或除草標記的操控，該等標記已經連同期望的核苷酸序列一起導入。得自培養原生質體的植物再生係描述於Evans等人，「原生質體分離及培養」植物細胞培養手冊，124-176頁，麥克米蘭出版公司，紐約1983；及植物、植物原生質體的結合、再生，21-73頁，CRC出版社，波卡雷頓1985。再生也可得自植物胼胝體、外植體、器官、花粉、胚或其部分。此種再生技術大致上描述於Klee等人(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38：467-486。
於其它實施例中，經轉形的植物細胞無法再生而產生植物。此種細胞例如可用於發展具有相關表現型例如除草抗性的植物細胞系。
轉形植物細胞、胼胝體、組織或植物可藉存在於轉形DNA上的標記基因所編碼的特徵，選擇或篩選經工程改造的植物材料識別及分離。舉例言之，藉將經工程改造的植物材料於含有抑制數量的抗生素或除草劑的介質上生長進行選擇，轉形基因組成體係賦與對該抗生素或除草劑的抗性。又，轉形植物及植物細胞也可藉篩選可存在於重組核酸組成體上的任何目測可見標記基因(例如β-葡萄糖醛酸酶、蟲螢光素酶、或gfp基因)的活性識別。此種選擇及篩選方法為熟諳技藝人士眾所周知。
含有此處異源分子的基因轉殖植物可透過選擇 性育種製造，例如藉性交配包含該分子的第一親本植物及第二親本植物，藉此製造多個第一子代植物。然後第一子代植物可選擇對可選擇標記具有抗性(例如嘉磷賽，藉此處異源分子可對子代植物提供抗性)。第一子代植物然後藉自交而製造多個第二子代植物。然後第二子代植物可選擇對該可選擇標記具有抗性。此等步驟進一步包括第一子代植物或第二子代植物反向交配至第二親本植物或第三親本植物。
也須瞭解兩種不同的基因轉殖植物也可交配來產生含有兩個獨立孤立的、加成的、外生基因的後代。適當子代的自交可產生對兩種加成外生基因為同型接合的植物。如同營養繁殖，預期也涵蓋與親本植物的反向交配及於非基因轉殖植物的異交。其它常用於不同特徵及作物的育種方法為業界已知。反向交配育種已經用來轉移基因用以單純遺傳高度可遺傳的特徵移轉入期望的同型接合栽培種系或近親交配種系，其為反回親本。所得植物預期具有返回親本(例如栽培種)的屬性及從施體親本所轉移的期望特徵。初次交配後，具有施體親本的表現型的個體經選擇及重複交配(反向交配)至該反回親本。所得親本預期具有反回親本(例如栽培種)的屬性及來自施體親本轉移的期望特徵。
核酸也可透過同源重組而導入植物基因體的預定區。透過同源重組穩定整合多核苷酸序列於植物細胞的特定染色體位置之方法已經於技藝界描述。例如，美國專利申請公告案第2009/0111188 A1號所述的位置專一性整合涉及使用重組酶或接合酶來媒介施體多核苷酸序列導入染 色體目標。此外，國際專利申請案第WO 2008/021207號描述鋅指媒介同源重組來將一或多個施體多核苷酸序列穩定整合入基因體的特定位置。重組酶諸如FLP/FRT的使用係描述於美國專利案第6,720,475號，或CRE/LOX係描述於美國專利案第5,658,772號可用以將多核苷酸序列穩定整合入特定染色體位置。最後，使用巨核酸酶將施體多核苷酸靶定特定染色體位置係說明於Puchta等人，PNAS USA 93(1996)5055-5060頁)。
其它多種植物細胞內位置專一性整合方法為大致上已知且可應用(Kumar等人，植物科學趨勢6(4)(2001)155-159頁)。此外，已經於數種原核有機體及低等真核有機體識別的位置專一性重組系統可應用於植物。此等系統之實例包括但也非限制性：得自酵母菌魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)之pSR1質體的R/RS重組酶系統(Araki等人(1985)J.Mol.Biol.182：191-203)，及噬菌體Mμ之Gin/gix系統(Maeser及Kahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230：170-176)。
於若干實施例中，編碼與SEQ ID NO：1具有90%相同度的多態之異源核酸可選擇性地組合宿主細胞及/或有機體的另一核酸。例如某些實施例中，編碼與SEQ ID NO：1具有90%相同度的多態之異源核酸可組合或「堆疊」另一者來提供對嘉磷賽或另一種除草劑的額外抗性或耐受性，及/或組合另一者來提供選擇昆蟲或疾病及/或營養增強，及/或改良農藝特性，及/或組合另一者來提供蛋白質或 於飼料、食物、工業、醫藥或其它用途有用的其它產物。關注的二或多個核酸序列在一個植物基因體內「堆疊」例如可透過使用二或多個事件之習知植物育種、植物使用含有該等核酸之組成體轉形、基因轉殖植物的再度轉形、或透過同源重組之鎖定目標整合添加新特徵而達成。
可與編碼與SEQ ID NO：1具有90%相同度的多態之異源核酸「堆疊」的核酸例如包括但非限制性：賦與對害蟲或疾病的抗性之基因或編碼序列(例如iRNA)
(A)植物抗病基因。植物防禦經常係藉植物的抗病基因(R)的產物與病原的相對應無毒力(Avr)基因產物間的特定交互作用活化。植物變異株也可以選殖抗性基因轉形至對特定病原種系具有抗性的工程改造植物。此種基因之實例包括對蕃茄葉黴菌(Cladosporium fulvum)具抗性的蕃茄Cf-9基因(Jones等人，1994科學266：789)、蕃茄Pto基因，其編碼蛋白質激酶以對抗丁香假單胞桿菌(Pseudomonas syringae)蕃茄致病變種(Martin等人，1993科學262：1432)、及對丁香假單胞桿菌具有抗性的擬南芥(Arabidopsis)RSSP2基因(Mindrinos等人，1994細胞78：1089)。
(B)蘇雲金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)蛋白質、其衍生物或於其上模型化的合成多肽，諸如Bt δ-內毒素基因之核酸序列(Geiser等人，1986，基因48：109)，及植物殺蟲(VIP)基因(例如參考Estruch等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci. 93：5389-94)。此外，編碼δ-內毒素基因的DNA分子也可以ATCC存取號碼40098、67136、31995及31998購自美國種型培養收集會(馬里蘭州，洛克維)。
(C)植物凝集素諸如數種君子蘭(Clivia miniata)甘露糖結合植物凝集素基因之核苷酸序列(Van Damme等人，1994植物分子生物學24：825)。
(D)維生素結合蛋白質，諸如可用於對抗昆蟲害蟲的殺幼蟲劑之抗生物素及抗生物素同系物。參考美國專利案第5,659,026號。
(E)酶抑制劑例如蛋白酶抑制劑或澱粉酶抑制劑。此等基因之實例包括稻半胱胺酸蛋白酶抑制劑(Abe等人，1987，J.Biol.Chem.262：16793)、菸草蛋白酶抑制劑I(Huub等人，1993，Plant Molec.Biol.21：985)、及α-澱粉酶抑制劑(Sumitani等人，1993，Biosci.Biotech.Biochem.57：1243)。
(F)昆蟲專一性激素或費洛蒙諸如蛻皮類固醇及幼年激素、其變異體、基於其之模擬物、或其拮抗劑或促效劑，諸如選殖幼年激素酯酶之棒狀桿菌表現、幼年激素之去活化劑(Hammock等人，1990，自然344：458)。
(G)昆蟲專一性胜肽或神經肽，當表現時，破壞受影響害蟲的生理學(J.Biol.Chem.269：9)。此等基因之實例包括昆蟲利尿激素受體(Regan，1994)、於太平洋摺翅蠊(Diploptera punctata)識別的異位素(allostatin)(Pratt,1989)，及昆蟲專一性麻痺性神經毒素(美國專利案第5,266,361號)。
(H)由蛇、胡蜂等於自然界製造的昆蟲專一性毒液，諸如蠍昆蟲毒性胜肽(Pang，1992，基因116：165)。
(I)負責一萜、倍半萜、類固醇、羥胺酸、苯丙素(phenylpropanoid)衍生物或其它具有殺蟲活性的非蛋白質分子的超級聚聚之酶。
(J)涉及生物活性分子之改性包括轉譯後改性之酶；例如糖分解酶、蛋白質分解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環化酶、轉胺酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激肽酶、磷酸分解酶、聚合酶、彈力蛋白酶、甲殼素酶及葡萄聚糖酶，包括天然者或合成者。此等基因之實例包括胼胝體基因(PCT公告案WO93/02197)、甲殼聚糖酶編碼序列(例如可以存取號碼3999637及67152得自ATCC)、菸草鉤蟲甲殼素酶(Kramer等人，1993，昆蟲分子生物學，23：691)、及洋芹ubi4-2(聚泛肽素)基因(Kawalleck等人，1993，植物分子生物學21：673)。
(K)刺激信號轉導的分子。此等分子之實例包括綠豆鈣調素(calmodulin)cDNA純株之核苷酸序列(Botella等人，1994，植物分子生物學24：757)及玉米鈣調素cDNA純株之核苷酸序列(Griess等人，1994，植物生理學104：1467)。
(L)斥水瞬間胜肽。參考美國專利案5,659,026及5,607,914；後者教示賦與抗病能力的合成抗微生物胜肽。
(M)膜通透酶、通道形成劑或通道阻斷劑，諸如天蠶抗菌肽(cecropin)-β分解胜肽類似物(Jaynes等人，1993，植物科學89：43)使得基因轉殖菸草植物對茄假單胞桿菌 (Pseudomonas solanacearum)具有抗性。
(N)病毒入侵蛋白質或由其中衍生的複合毒素。例如，病毒套膜蛋白於轉形植物細胞內積聚提供對病毒感染或由病毒執行疾病發展的抗性，該病毒為從其中衍生套膜蛋白質基因的病毒以及相關病毒。套膜蛋白媒介抗性已經賦與轉形植物對抗苜蓿嵌紋病毒、黃瓜嵌紋病毒、菸草條紋病毒、馬鈴薯病毒X、馬鈴薯病毒Y、菸草蝕紋病毒、菸草裂紋病毒及菸草嵌紋病毒。例如參考Beachy等人(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28：451。
(O)昆蟲專一性抗體或由其中衍生的免疫毒素。如此，靶定於昆蟲腸道的關鍵代謝功能的抗體可將受影響的酶去活性化，殺死昆蟲。例如Taylor等人(1994)摘要497號，第七屆國際分子植物-微生物交互作用研討會顯示透過單鏈抗體片段的製造於基因轉殖菸草的酶去活化。
(P)病毒專一性抗體。例如參考Tavladoraki等人(1993)，自然266：469，顯示表現重組抗體基因的基因轉殖植物係保護避免病毒攻擊。
(Q)自然界由病原或寄生蟲所產生的發育停止蛋白質。如此，真菌α-1,4-D聚半乳糖醛酸內切酶輔助真菌的菌落形成，及藉溶解植物細胞壁同-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶輔助植物營養物質釋放(Lamb等人，1992)生物/技術10：1436。編碼豆聚半乳糖醛酸內切酶抑制蛋白質之基因的選殖及特徵化係描述於Toubart等人(1992植物期刊，2：367)。
(R)自然界由植物製造的發育停止蛋白質，諸如大豆核 糖體去活化基因提供對真菌疾病的抗病性增高(Longemann等人，(1992)生物/技術10：3305。
(S)RNA干擾，其中RNA分子用以抑制目標基因的表現。一個實例中，RNA分子係部分雙股或全部雙股，觸發靜默化反應，結果導致dsRNA裂解成小型干擾RNA，然後結合入靶定錯合物摧毀同源mRNA。例如參考Fire等人，美國專利6,506,559；Graham等人，6,573,099。
賦與抗除草劑性質之基因
(A)編碼對抑制生長中的植物或分生組織之除草劑的抗性或耐受性之基因，該等除草劑諸如咪唑啉酮、磺醯苯甲醯胺或磺醯脲除草劑。此類基因之實例編碼突變體ALS酶(Lee等人，1988 EMBOJ.7：1241)，又稱AHAS酶(Miki等人，1990 Theor.Appl.Genet.80：449)。
(B)編碼對嘉磷賽之抗性或耐受性之一或多個額外基因，該抗性或耐受性係由突變體EPSP合成酶及aroA基因所賦與，或藉下列基因透過代謝去活化所賦與，諸如GAT(嘉磷賽乙醯轉移酶)或GOX(嘉磷賽氧化酶)及其它膦基化合物諸如草胺膦(pat及bar基因；DSM-2)、及芳氧基苯氧基丙酸類及環己烷二酮類(ACCase抑制劑編碼基因)。例如參考美國專利案第4,940,835號，揭示可賦與嘉磷賽抗性之一種形式的EPSP核苷酸序列。編碼突變體aroA基因之DNA分子可於ATCC存取號碼39256獲得，突變基因之核苷酸序列係揭示於美國專利案第4,769,061號。歐洲專利申請案第0 333 033號及美國專利案第4,975,374號揭示賦與對除草劑諸如 L-草胺膦(L-phosphinothricin)抗藥性之麩胺合成酶基因的核苷酸序列。草胺膦乙醯基-轉移酶之核苷酸序列係提供於歐洲專利申請案第0 242 246號。De Greef等人(1989)生物/技術7：61描述表現草胺膦乙醯基轉移酶活性之編碼嵌合bar基因之基因轉殖植物的製造。對芳氧基苯氧基丙酸類及環己烷二酮類諸如拿撲淨(sethoxydim)及哈洛希佛(haloxyfop)賦與抗性的基因實例諸如Acc1-S1、Acc-S2及Acc1-S3基因，描述於Marshall等人(1992)Theor.Appl.Genet.83：435。
(C)編碼對抑制光合成的除草劑諸如三(psb A及gs+基因)及苯甲腈(腈酶基因)之基因。Przibilla等人(1991)植物細胞3：169描述使用編碼突變體psbA基因的質體轉形衣藻(Chlamydomonas)。腈酶基因之核苷酸序列係揭示於美國專利案第4,810,648號，含有此等基因之DNA分子可以ATCC存取號碼53435、67441及67442獲得。編碼麩胱甘肽S-轉移酶之DNA的選殖及表現係描述於Hayes等人(1992)Biochem.J.285：173。
(D)編碼對下述除草劑之抗性或耐受性之基因，該除草劑係結合至羥基苯基丙酮酸二氧合酶(HPPD)酶其催化對-羥基苯基丙酮酸(HPP)轉換為尿黑酸(homogentisate)的反應。如此包括除草劑諸如異唑類(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、U.S.Pat.No.5,424,276)，特別為埃索弗妥(isoxaflutole)，此乃玉米選擇性除草劑、二酮基腈類(EP496630、EP496631)，特別為2-氰基-3-環丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮及2- 氰基-3-環丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮、三酮類(EP625505、EP625508、U.S.Pat.no.5,506,195)，特別為蘇可崔昂(sulcotrione)，及吡唑啉酸類。於植物體內產生HPPD過度豐富基因可提供對此種除草劑的耐受性或抗性，包括例如美國專利案第6,268,549及6,245,968號及美國專利申請公告案第20030066102號所述的基因。
(E)編碼對苯氧基生長素除草劑諸如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性及也可賦與對芳氧基苯氧基丙酸(AOPP)除草劑之抗性或耐受性之基因。此等基因之實例包括α-酮基戊二酸相依性二氧合酶(aad-1)基因，描述於美國專利案第7,838,733號。
(F)編碼對苯氧基生長素除草劑諸如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)之抗性或耐受性及也可賦與對吡啶基氧基生長素除草劑，諸如芙羅喜琵(fluroxypyr)或崔克琵(triclopyr)之抗性或耐受性之基因。此等基因之實例包括α-酮基戊二酸-相依性二氧合酶基因(aad-12)，描述於WO 2007/053482 A2。
(G)編碼對麥草畏(dicamba)之抗性或耐受性之基因(例如參考美國專利公告案第20030135879號)。
(H)提供對抑制原卟啉原氧化酶(PPO)之抗性或耐受性之基因(參考美國專利案第5,767,373號)。
(I)提供對三除草劑(諸如亞徹金(atrazine))及尿素衍生物(諸如待午隆(diuron))除草劑之抗性或耐受性之基因，該除草劑係結合至光系統II反應中心(PS II)之核心蛋白(參考Brussian等人，(1989)EMBO J.1989,8(4)：1237-1245)。
賦與或貢獻附加價值特徵之基因
(A)改性脂肪酸代謝，例如使用反訊息基因或硬脂醯基-ACP去飽和酶轉形玉米或芥(Brassica)以增加植物的硬脂酸含量(Knultzon等人，1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89：2624。
(B)減低植酸含量
(1)導入植酸酶編碼基因諸如黑麴菌(Aspergillus niger)麴酸酶基因(Van Hartingsveldt等人，1993基因127：87)，提升植酸的分解，增加更多自由態磷酸至轉形植物。
(2)可導入而減低植酸含量之基因。於玉米，此項目的例如可藉選殖及然後重新導入負責具有植酸含量低的特徵之玉米突變體的單一對偶基因相關DNA(Raboy等人，1990Maydica 35：383)。
(C)改性碳水化合物組成物，例如使用編碼可改變澱粉的分枝樣式之酶的基因轉形植物執行。此種酶之實例包括黏液鏈球菌(Streptococcus mucus)果糖基轉移酶基因(Shiroza等人，1988)J.Bacteriol.170：810、枯草桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(Steinmetz等人，1985 Mol.Gen.Genel.200：220)、地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)α-澱粉酶(Pen等人，1992，生物/技術10：292)、蕃茄反錄酶基因(Elliot等人，1993)、大麥澱粉酶基因(Sogaard等人，1993J.Biol.Chem.268：22480)、及玉米胚乳澱粉分枝酶II(Fisher等人，1993，植物生理學102：10450)。
多項檢定分析可連結本文揭示若干實施例之核 酸分子採用。下列技術可用於多種情況，於一個實施例中，可用以檢測植物細胞內之核酸分子及/或編碼多肽的存在。例如，分子的存在可以多種方式決定，包括使用序列之引子或探子、ELISA檢定分析來檢測編碼蛋白質、西方墨點來檢測蛋白質、或北方墨點或南方墨點來檢測RNA或DNA。可採用檢測酶DGT-28之酶檢定分析。又，使用技藝界已知程序可產生檢測DGT-28蛋白質存在的抗體。額外技術諸如原位雜交、酶染色及免疫染色也可用來檢測重組組成體於特定植物器官及組織的存在或表現。轉殖基因可於植物的某些組織或在某個發育階段選擇性表現，或轉殖基因可於實質上全部植物組織連同其整個生命週期表現。但也適用任一項組合表現模型。
南方分析為常用檢測方法，其中DNA使用限剪核酸內切酶切割，及在瓊脂糖凝膠上分選而藉分子量分離DNA，及然後轉移至尼龍膜。然後與使用32P(或其它探子標記)加放射性標記的探子片段雜交及於SDS溶液中洗滌。
同理，北方墨點方分析部署類似的方案，其中RNA使用限剪核酸內切酶切割及在瓊脂糖凝膠上分選而藉分子量分離DNA，及然後轉移至尼龍膜。然後與使用32P(或其它探子標記)加放射性標記的探子片段雜交及於SDS溶液中洗滌。分析從關注組織分離的RNA(例如mRNA)可指示相對表現程度。典型地，若mRNA存在或mRNA之數量增加，則可推定表現相對應的轉移基因。北方分析或其它mRNA分析方案可用以決定導入的轉移基因或天然基因的表現程度。
於西方墨點分析中，替代分離DNA/RNA，萃取關注的蛋白質及置於丙烯醯胺凝膠上。然後蛋白質吸漬於膜上及接觸標記物質。例如參考Hood等人，「從基因轉殖玉米之抗生物素的商業製造；變形體的特徵化、製造、加工處理、萃取及純化」分子育種3：291-306(1997)；Towbin等人(1979)「蛋白質從聚丙烯醯胺凝膠電泳轉移至硝基纖維素片：程序及若干應用」Proc Natl Acad Sci USA 76(9)：4350-4354；Renart等人「蛋白質從凝膠轉移至重氮苯甲氧基甲基-紙及使用反訊息檢測：研究抗體專一性及抗原結構之方法」Proc Natl Acad Sci USA 76(7)：3116-3120。
此處核酸或其片段可用以設計PCR擴增用的引子。於進行PCR擴增中，引子與樣本間可容忍某些不匹配程度。藉熟諳技藝人士已知方法可以給定方式產生突變、插入及刪除。
另一個檢測方法實例為焦磷酸排序技術，述於Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24，2000)。本方法中，設計寡核苷酸重疊相鄰基因體DNA及插入DNA接合。寡核苷酸雜交至得自感興趣區的單股PCR產物(一個引子於被插入的序列及一個引子於旁出基因體序列)及於DNA聚合酶、ATP、硫酸酶、蟲螢光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)、腺苷5’-硫代磷酸及蟲螢光素。DNTP係個別添加，測量光信號中的摻混結果。光信號指示由於成功地擴增、雜交、及單鹼基或多鹼基延伸，故存在有轉移基因插入序列/旁出序列。
已經描述分子信標(Beacons)用於序列檢測。簡言之，設計FRET寡核苷酸探子，重疊旁出基因體及插入DNA接合。FRET探子的獨特結構結果導致含有次級結構保持螢光部分及淬熄部分緊密鄰近。FRET探子及PCR引子(一個引子於插入DNA序列及一個引子於旁出基因體序列)於熱安定性聚合酶及dNTP存在下環化。成功地PCR擴增後，FRET探子雜交至目標序列，結果導致探子二次結構的去除及螢光部分與淬熄部分的空間分離。螢光信號指示由於成功擴增及雜交而存在有旁出基因體序列/轉移基因插入序列。
水解探子檢定分析又稱泰克曼(TAQMAN)(生命技術公司(Life Technologies)，加州福斯特城)為檢測及量化DNA序列的存在之方法。簡言之，FRET寡核苷酸探子係設計成一個寡核苷酸係在轉移基因內及一個寡核苷酸係在旁出基因體序列用於事件專一性檢測。FRET探子及PCR引子(一個引子於插入DNA序列及一個引子於旁出基因體序列)於熱安定性聚合酶及dNTP存在下環化。FRET探子之雜交結果導致螢光部分從FRET探子的淬熄部分裂解及釋放。螢光信號指示由於成功的擴增及雜交而存在有旁出/轉移基因插入序列。
ELISA或稱酶聯結免疫檢定分析自1971年來為已知。一般而言，溶解於緩衝液的抗原係塗覆在塑膠表面上。當加入血清時，抗體附接至固相上的抗原。此等抗體的存在或不存在可驗證何時軛合至酶。添加適當酶基質將檢測出可定量的結合軛合物數量。常見ELISA檢定分析為 使用生物素化抗(蛋白質)多株抗體及鹼性磷酸酶軛合物。例如，用於量化決定蟲漆酶(laccase)濃度的ELISA可為抗體三明治檢定分析，利用市售多株兔抗體。抗體軛合至用於檢測的鹼性磷酸酶。於另一個實例中，檢測胰蛋白酶或胰蛋白酶原的ELISA檢定分析係使用生物素化抗胰蛋白酶或抗胰蛋白酶多株抗體及鏈絲菌抗生物素-鹼性磷酸酶軛合物。
某些實施例係有關於使用本文揭示之實施例的植物作為至少一個親本來進行交配之方法。例如，特定實施例係有關於F1雜交體植物具有此處說明之任一種植物作為一個親本或二親本。其它實施例係有關於藉此種F1雜交體所產生的種子。又有其它實施例係有關於藉舉例說明之植物與不同(例如自交親本)植物交配及收穫所得的雜交體種子而製造F1雜交體種子之方法。其它實施例係有關於雌性親本或雄性親本的植物實例。所得植物之特性可藉小心考慮親本植物之特性加以改良。
V.藉DGT-28媒介的嘉磷賽耐受性
與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的多肽可具有EPSPS酶活性。如此，與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的多肽、編碼與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的多肽之核酸(例如SEQ ID NO：2-4)、及於高度嚴苛條件下雜交至具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之核酸的核酸可於若干實施例用來賦與嘉磷賽耐受性給細胞或有機體(例如植物細胞或植物)。提供對嘉磷賽除草劑配方有抗性的植物或植物細胞於多項應用可能有用，於該處具有此種抗 性的植物細胞可耐受暴露於足量嘉磷賽，該嘉磷賽係用在耕地控制至少若干莠草。
嘉磷賽為包含N-(膦基甲基)甘胺酸的組合物為除草劑內廣泛使用的成分。嘉磷賽典型地於水性液體濃劑、固體濃劑、乳液或微乳液內配方為鹽。在植物發育的多個階段嘉磷賽可施用於萌出的植物頂上。
嘉磷賽耐受性植物變種與嘉磷賽除草劑配方組合使用已經變成美國及全世界作物生產的莠草管理的標準計畫。對農夫而言，使用嘉磷賽耐受性特徵的主要優點為允許簡單方便地施用嘉磷賽，此乃廣效性萌後除草劑以優異的作物安全性及對植物前期除草劑的施用有較少依賴性而控制非期望的植物及青草(亦即「莠草」)。其它好處包括更為匹配免耕系統及減少耕作系統。嘉磷賽耐受性作物已經擴大莠草管理的選項，使得莠草控制更為容易、更為廉價且更有彈性。栽種者曾經報告減少去田裡施用除草劑以及更少耕作，節省燃料且減少土壤的侵蝕。因此嘉磷賽耐受性作物減低因除草劑帶來的環境風險，同時提高需要化學莠草控制的功效。
如此，此處某些實施例提供於含有植物的耕地選擇性控制莠草，該植物包含與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的多肽、編碼與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的多肽之核酸、及/或於高度嚴苛條件下雜交至具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之核酸的核酸，其中該植物比較不含多肽及/或核酸的同種植物具有增高的嘉磷賽耐受 性。某些實例中，此處提供之方法包含施用足量除草嘉磷賽至農作物葉及莠草來控制莠草的生長。
此處特定實施例提供一種於含有一種作物(例如一種植物包含與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的多肽、編碼與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的多肽之核酸(例如SEQ ID NO：2-4)、及於高度嚴苛條件下雜交至具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之核酸的核酸)的耕地殺死或控制莠草或非期望的植物之方法。若干實例中，該方法包含施用嘉磷賽至該作物及/或該耕地；例如施用定量嘉磷賽至作物植株的的葉，及同時施用至生長在此種植株附近的莠草，其中該量係足夠導致控制莠草或非期望的植物，同時維持該作物植株實質上無害。
嘉磷賽組成物可以足夠獲得期望的生物結果，例如控制莠草生長而不顯著影響嘉磷賽耐受性作物植株的施用率施用至植物。此等施用率典型係以每單位處理面積的嘉磷賽量表示，例如克/公頃(g/ha)。組成「顯著量」係隨研究、發展、上市及使用組成物者的標準及規範而改變，及針對一種組成物顯著有效的施用率之選擇係在熟諳技藝人士之技巧範圍內。
若干實例中，每單位面積施用的嘉磷賽組成物獲得85%莠草控制(藉生長減少或死亡測量)之數量用來定義施用率。足夠控制耕地的莠草之多種嘉磷賽除草劑施用率的選擇係落入於尋常農業科學家之技巧範圍內。熟諳技藝人士同樣瞭解個別植物條件、氣候及生長條件、以及特定 活性成分及其於組成物內之重量比可能影響除草劑於特定應用的功效程度。
若干實施例中，水性嘉磷賽組成物可施用至植物的葉組織來殺死或控制寬廣多種非期望植物包括一年生及多年生雜草及闊葉莠草的生長，該施用係藉施用水性嘉磷賽組成物至植物的葉組織。存在於預期除草劑組成物(例如粒狀固體濃劑、液體濃劑、即用組成物、及槽混合組成物)的嘉磷賽之相對量可取決於多項因素而改變，例如包括欲控制的莠草種類及施用方法。但概略言之，嘉磷賽濃度及用於除草組成物的選擇性界面活性劑及/或若干其它輔劑或添加劑(如本文它處所述)係足夠控制耕地內的莠草。
除草噴灑組成物可呈水性溶液劑或分散液劑施用，而該組成物可製造成即刻施用，或藉進一步稀釋液體嘉磷賽濃劑，或藉加水至粒狀固體嘉磷賽濃劑獲得。但如此處使用「水性」一詞包括包含某種小量非水性溶劑之組成物，只要主要存在的溶劑為水即可。除草劑噴灑組成物可經由熟諳技藝人士已知之適當方法中之任一者，包括空氣施用及地面施用技術(例如地面橫杆、手動噴灑器、及繩芯)施用至欲處理的植物葉部。
於若干實例中，液體濃劑組成物係配方而包括濃度至少約每升50克，至少約75克，或至少約100、125、150、175、200、225、250、275、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、 550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690或700克(酸當量或a.e.)或以上的嘉磷賽。嘉磷賽濃度範圍例如可為每升約50至約680克(a.e.)(gpl)、約100至約600 gpl、約250至約600 gpl、及約360至約540 gpl。
當以嘉磷賽濃劑之總重為基準的重量百分比表示時，液體濃劑可包含至少約10 wt.%嘉磷賽(a.e.)、至少約15 wt.%、及至少約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、或68 wt.%或以上。嘉磷賽濃度範圍例如可為約10 wt.%至約70 wt.% a.e.、約20 wt.%至約68 wt.%、或約25 wt.%至約45 wt.%。
若嘉磷賽係施用為即用組成物，則嘉磷賽濃度例如可為約1 wt.%至約3 wt.% a.e.，以及約1 wt.%至約2 wt.%。
噴灑組成物可配方而施用例如至少約每英畝1加侖噴灑組成物，至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20加侖/英畝及以上。噴灑組成物之噴灑體積例如由約1加侖至約100加侖/英畝，於約2加侖至約40加侖/英畝，及約2加侖至約5加侖/英畝用於空氣施用，及約5加侖至約20加侖/英畝用於地面施用。
於若干實例中，可採用液體濃劑配方具有水相其中嘉磷賽主要係呈鹽形式存在，及選擇性地含有相對水不 溶性的第二除草活性成分之非水相。此種配方例如可包括乳液劑(包括巨乳液及微乳液、油包水型、水包油型及水包油包水型)、懸浮液劑、及懸浮液乳液劑。某些情況下，非水相可包含微膠囊成分(例如微膠囊除草劑)。於具有非水相之配方中，嘉磷賽a.e.於組成物全體之濃度雖言如此係落入於此處對水性濃劑配方所述之特定範圍實例。
依據任何配方可使用的適當嘉磷賽鹽形式例如包括鹼金屬鹽例如鈉及鉀鹽、銨鹽、二銨鹽諸如二甲基銨、烷基胺鹽，例如二甲基胺及異丙基胺鹽、烷醇胺鹽，例如乙醇胺鹽、烷基鋶鹽，例如三甲基鋶烷、氧化鋶鹽及其混合物或組合。嘉磷賽之商業配方之實例例如包括但非限制性：葛佛麥士(GLYPHOMAX)、葛佛麥士XRT、葛佛麥士PLUS、杜蘭格(DURANGO)、朗亞普(ROUNDUP)ULTRA、朗亞普ULTRAMAK、朗亞普CT、朗亞普EXTRA、朗亞普BIOACTIVE、朗亞普BIOFORCE、羅迪歐(RODEO)、波樂瑞斯(POLARIS)、史帕克(SPARK)、雅歌(ACCORD)SP、雅歌XRT、及雅歌濃劑(CONCENTRATE)，全部皆含有嘉磷賽呈其異丙基銨鹽(IPA)；朗亞普DRY及萊佛(RIVAL)含有嘉磷賽呈其銨鹽；朗亞普GEOFORCE，嘉磷賽納配方；塔屈當(TOUCHDOWN)，嘉磷賽三甲基鋶鹽配方，塔屈當IQ，亦即嘉磷賽二銨鹽配方、塔屈當TOTAL IQ，亦即嘉磷賽鉀配方，及朗亞普WEATHERMAX，以及嘉磷賽鉀配方。嘉磷賽配方可包括安全劑、界面活性劑、及/或輔劑。
若有所需，使用者可混合一或多種輔劑與嘉磷賽 組成物及若有所需當製備施用配方時，使用者可混合一或多種輔劑與嘉磷賽組成物及稀釋用水。此等輔劑可包括額外界面活性劑及/或無機鹽(例如硫酸銨)目標係針對進一步提升除草效果。
若有所需，使用者也可採用適當安全劑於嘉磷賽配方來進一步保護植物及/或增加對更多除草劑的交叉抗性。安全劑為藉生理或分子機轉可減低除草劑對農作物的植物毒性而不有損莠草控制功效的化學劑。安全劑之作用典型地係用來藉活化/表現cP450而提升植物免疫系統。安全劑之實例包括例如但非限制性：貝諾薩可(benoxacor)、克昆托賽(cloquintocet)、喜美崔尼(cyometrinil)、待克洛米(dichlormid)、待克洛農(dicyclonon)、待依索萊(dietholate)、芬克洛拉佐(fenchlorazole)、芬克潤(fenclorim)、芙拉佐(flurazole)、芙索菲寧(fluxofenim)、芙里拉佐(furilazole)、埃索薩迪芬(isoxadifen)、美芬琵(mefenpyr)、美芬奈(mephenate)、萘二甲酐、及歐撒貝崔尼(oxabetrinil)。
安全劑可用於保護大型種子青草作物，例如但非限制性，玉米、高粱、及水稻，對抗於種植前摻混的或萌前施用的硫代胺基甲酸酯及氯苯乙醯胺家族的除草劑。安全劑也已經發展來保護冬季穀物諸如小麥對抗萌後施用芳氧基苯氧基丙酸酯及磺醯脲除草劑。安全劑用以保護玉米及稻對抗磺醯脲、咪唑啉酮、環己烷二酮、異唑、及三酮除草劑也已明確確立。
植物活化劑(藉活化其防禦機轉保護植物的新一 類化合物)也可用於此處所述實施例。植物活化劑之實例包括艾賓佐樂(acibenzolar)及波貝納佐(probenazole)。
本發明之實施例係進一步定義於下列實例。須瞭解此等實例僅供舉例說明。由前文討論及此等實例，熟諳技藝人士可確定本發明之主要特性，未悖離其精髓及範圍，可做出本發明實施例之多項變化及修改來調整配合各項用途及狀況。如此，除了此處所示之描述者外，本發明實施例之各項修改為熟諳技藝人士從前文描述將顯然易明。此等修改也意圖落入於隨附之申請專利範圍之範圍內。後文係用於舉例說明而非限制本發明之範圍。
實例 實例1：材料及方法
本文揭示之實施例將於下列實例進一步描述，該等實例係提供用於舉例說明但絕非限制本發明之範圍。
於大腸桿菌5-烯醇丙酮醯基莽草酸3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)中的單一胺基酸突變(G96A)可導致嘉磷賽不敏感(Padgette等人(1991)；Eschenburg等人(2002)；Priestman等人(2005)；Haghani等人(2008))。雖然此種突變賦與嘉磷賽之耐受性，但也已知對EPSP合成酶與其天然酶基質磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)的結合造成不良影響。結果導致酶基質結合效率的改變可能使得突變後之酶不適合用以提供嘉磷賽的植物界耐受性。
NCBI基因庫資料庫係於晶片篩檢EPSP合成酶蛋白質及多核苷酸序列其天然含有丙胺酸在EPSP合成酶內部 與G96A突變的類似位置，該G96A突變係導入該酶的大腸桿菌版本內(Padgette等人(1991)；Eschenburg等人(2002)；Priestman等人(2005)；Haghani等人(2008))。
經識別含有天然丙胺酸在此位置的一種酶為DGT-28(基因存庫(GENBANK)ACC NO：ZP_06917240.1)得自史氏鏈絲菌(Streptomyces sviceus)ATCC29083。進一步探討電子資料顯示另外三個獨特鏈絲菌酶具有與DGT-28的較高同源性：DGT-31(GENBANK ACC NO：YP_004922608.1)；DGT-32(GENBANK ACC NO：ZP_04696613)；及DGT-33(GENBANK ACC NO：NC_010572)。此等酶各自含有一個天然丙胺酸於EPSP合成酶內部之與導入該酶的大腸桿菌版本內的G96A突變位置類似的位置。圖1。
由於得自不同有機體的EPSP合成酶蛋白質具有不同長度，故EPSP合成酶之大腸桿菌版本的突變編號並非必然相對應於得自其它有機體的EPSP合成酶之突變編號。此等經識別的EPSP合成酶就嘉磷賽耐受性或PEP酶基質親和力而言並非必然於先前決定特徵。此外，此等EPSP合成酶表示新一類EPSP合成酶，不含已經用來特徵化前述類別I(植物衍生序列進一步說明於美國專利案第RE39247號)、II(細菌衍生序列進一步說明於美國專利案第RE39247號)、及III(細菌衍生序列進一步說明於國際專利申請案WO 2006/110586)EPSP合成酶的任何序列部分。
新穎DGT-28、DGT-31、DGT-32、及DGT-33酶係 藉比較類別I EPSP合成酶而決定嘉磷賽耐受性及PEP酶基質親和力之特徵。下列類別I酶：DGT-1得自大豆(Glycine max)、DGT-3得自矮小芥(Brassica napus)(GENBANK ACC NO：P17688)、及DGT-7得自小麥(Triticum aestivum)(GENBANK ACC NO：EU977181)用於比較。類別I EPSP合成酶及其突變體變異株係經合成及評估。導入植物EPSP合成酶內部的突變包含於EPSP合成酶內部於G96A從酶的大腸桿菌版本突變的類似位置所做甘胺酸突變成丙胺酸。此外，蘇胺酸至異白胺酸突變及脯胺酸至絲胺酸突變係導入此等類別I EPSP合成酶內部在大腸桿菌的EPSP合成酶中胺基酸97(T至I)及胺基酸101(P至S)的類似位置，如Funke等人(2009)所述。
圖1顯示DGT-28、DGT-31、DGT-32及DGT-33之部分序列排齊至其它EPSP合成酶。全部四種DGT酶共享保留丙胺酸之aroA EPSP合成酶胺基酸位置96。此一胺基酸位置係以星號指示，及該胺基酸殘基係下方畫線。
圖2顯示DGT-1、DGT-3、及DGT-7酶之排齊。從甘胺酸突變至丙胺酸之胺基酸位置係由第一星號指示。從蘇胺酸突變至異白胺酸之胺基酸位置係由第二星號指示。從脯胺酸突變成絲胺酸之第三胺基酸位置係由第三星號指示。此等突變導入DGT-1、DGT-3、及DGT-7之不同版本。含有該等突變之基因的不同版本(v1、v2、v3...vN)以進一步細節說明如下。
實施例2：於植物及細菌表現序列之最佳化
植物最佳化。雙子葉植物及單子葉植物(玉米)的密碼子偏重係計算成單一密碼子相對於全部胺基酸的密碼子的使用頻率。表1。另外，密碼子偏重係計算為相對於該胺基酸的全部其它密碼子(同義密碼子)，單一密碼子用以編碼一特定胺基酸的頻率。設計用於植物表現的編碼區時，決定植物偏好的一次(「首選」)密碼子，以及當存在有多個選項時，較佳密碼子的第二、第三、第四等選項。
得自史氏鏈絲菌的DGT-28編碼序列之分析顯示數個序列部分的存在相信對最佳植物表現有害，以及於雙子葉及單子葉植物表現的非最佳密碼子組成。
為了基因改造編碼DGT-28蛋白質的植物最佳化基因，DNA序列係設計來編碼胺基酸序列，利用從特定宿主植物之蛋白質編碼區所彙編的密碼子偏重建立冗餘基因密碼。於表1中，欄D及I呈現各個胺基酸之同義密碼子的分布(以該胺基酸的全部密碼子之使用百分比表示)，如出現於單子葉(玉米)植物的編碼區。欄E及J呈現各個胺基酸之同義密碼子的分布(以該胺基酸的全部密碼子之使用百分比表示)，如出現於雙子葉植物的編碼區。有些胺基酸之若干同義密碼子只罕見出現於植物基因(例如CGG)。通常，密碼子 若表示在任一型植物基因中編碼相關胺基酸約10%或少於10%時間，則該密碼子被視為罕見使用(由表1之欄C及H的DNU指示)。為了平衡一種胺基酸的其餘密碼子選擇之分布，各個密碼子之加權平均表示型態係使用下式計算：C1之加權平均%=1/(%C1+%C2+%C3+等)×%C1×100， (1)此處C1為關注的密碼子，及%C2、%C3等表示表1其餘同義密碼子的雙子葉%平均值(相關密碼子的%平均值係取自欄C及H)。
各個密碼子之加權平均%值係列舉於表1之欄C及H。
使用前述程序，設計主要編碼DGT-28蛋白質之胺基酸序列的新穎DNA序列用以使用於雙子葉植物基因中最常用的密碼子之平衡密碼子分布而用於在雙子葉植物內最佳化表現。主要編碼DGT-28蛋白質之胺基酸序列的第二DNA序列係使用於單子葉植物基因內最常用的密碼子之平衡密碼子分布設計來在單子葉植物體內最佳表現。兩種新穎DNA序列與編碼dgt-28的原先DNA序列的差異在於植物(第一較佳、第二較佳、第三較佳、或第四較佳)密碼子之取代以載明於蛋白質胺基酸序列各個位置之適當胺基酸。
植物最佳化DNA序列之設計係藉DGT-28蛋白質序列(基因存庫存取號碼：ZP_06917240.1)的蛋白質序列之反轉譯而初始化。SEQ ID NO：1係使用從表1組成的雙子葉密碼子偏重表反轉譯：欄E及J。SEQ ID NO：1的第二反轉譯係使用從表1組成的單子葉密碼子偏重完成：欄D及I。
然後藉補償密碼子變化(同時保有總加權平均密碼子表示型態)修改出反轉譯序列以去除或添加限剪酶辨識位置，去除高度安定的股內二次結構，及去除其它可能對植物體內工程改造基因的選殖操控或表現有害的其它序列。DNA序列然後再度分析可能已經藉改性所產生的限剪酶辨識位置。經由以第一、第二、第三或第四選項較佳密碼子置換相關密碼子而進一步修改所識別的位置。序列中可能影響關注基因的轉錄或轉譯的其它位置包括外顯子：內含子接合(5’或3’)、poly A添加信號、及RNA聚合酶終結信號。改性序列進一步經分析及進一步修改來減低TA或CG二聯碼頻率，及增高TG或CT二聯碼頻率。除了此等二聯碼之外，具有多於約六個連續[G+C]或[A+T]殘基的序列區塊可能影響序列的轉譯或轉錄。因此此等序列區塊也可能以其它較佳選擇密碼子置換第一或第二選擇密碼子加以修改。基因設計中罕用的密碼子並不含括至相當程度，唯有當需要完成與密碼子組成本身不同的設計標準時才使用(例如限剪酶辨識位置之添加或刪除)。
新設計的雙子葉植物最佳化dgt-28 v5多核苷酸序列係列舉於SEQ ID NO：2。新設計的單子葉植物最佳化dgt-28 v6多核苷酸序列係列舉於SEQ ID NO：3；此序列藉含括丙胺酸於第二胺基酸位置來導入限剪酶位置而略微修改。結果導致的DNA序列具有較高度密碼子多樣化、期望的鹼基組成、含有策略定位的限剪酶辨識位置、及缺乏可能干擾基因轉錄或產物mRNA轉譯的序列。
包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3含有額外序列諸如6-框中止(添加至編碼序列之3’端位在全部六個讀取框的中止密碼子)，及5’選殖限剪位置的DNA片段之合成係藉商業供應商進行(DNA2.0，加州蒙洛公園)。然後合成核酸分子選殖入表現載體及轉形為植物或細菌，如下實例描述。
類似的密碼子最佳化策略係用以設計dgt-1、dgt-3 v2(G173A)、dgt-3 v3(G173A；P178S)、dgt-3 v4(T174I；P178S)、dgt-7 v4(T168I；P172S)、dgt-32 v3、dgt-33 v3、及dgt-33 v3。此等基因之密碼子最佳化版本係分別列舉為SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、及SEQ ID NO：144。
細菌最佳化。設計針對用於大腸桿菌細胞表現為最佳化的SEQ ID NO：1之編碼DGT-28蛋白質之新穎DNA序列。大腸桿菌最佳化DNA序列之設計係使用得自基因亞特(GeneArt)(德國雷金堡)的專有密碼子最佳化方案，藉SEQ ID NO：1蛋白質序列的反轉譯初始化大腸桿菌最佳化DNA序列的設計。初序列係藉補償密碼子改變而修改(同時保有總加權平均表示型態)以去除或添加限剪酶辨識位置，去除高度安定的股內二次結構，及去除其它可能對植物體內工程改造基因的選殖操控或表現有害的其它序列。編碼區內需避免的此種有害序列之實例為16S核糖體RNA結合序列(「祥-達(Shine-Dalgaron)序列」)諸如AGGAGG，其可編碼例如二連續精胺酸胺基酸，但也可作為基因內(因此為非 期望的)轉譯初始化信號。編碼SEQ ID NO：1蛋白質的大腸桿菌偏重dgt-28 DNA序列(dgt-28 v1)係給定為SEQ ID NO：4。
為了輔助選殖及確保有效轉譯初始化，5’端NdeI限剪酶辨識序列係置於ATG轉譯起始密碼子的上游。也為了輔助選殖，及為了確保適當轉譯結束，編碼兩個TAA轉譯停止密碼子及XhoI限剪酶辨識位置的鹼基係含括於編碼區的3’端。包含SEQ ID NO：4之DNA片段的合成係由商業供應商基因亞特進行。
類似的大腸桿菌密碼子最佳化策略係用來設計dgt-1 v5、dgt-1 v6(G112A)、dgt-1 v7(G112A；P117S)、dgt-1 v8(T113I；P117S)、dgt-3 v6(G105A)、dgt-3 v7(G105A；P112S)、dgt-3 v8(T106I；P112S)、dgt-7 v5、dgt-7 v6(G113A)、dgt-7 v7(G113A；P117S)、dgt-7 v8(T114I；P117S)、dgt-32 v5、及dgt-33 v5。dgt-1、dgt-3、及dgt-7序列版本係藉葉綠體標靶序列的去除改性。此等基因之大腸桿菌密碼子最佳化版本係列舉為SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、及SEQ ID NO：24。
實施例3：嘉磷賽耐受性基因之細菌性表現載體
用於大腸桿菌表現之pET表現載體dgt-28之組成。用於試管試驗，合成dgt-28 v1大腸桿菌最佳化基因序 列(SEQ ID NO：4)及由基因亞特選殖進行合成及選殖。合成dgt-28 v1基因序列係透過添加Nde I及Xho I限剪位置而選殖入pET28表現載體。所得組成導入N-端6X His標籤且標示為pDAB100445。圖14。
dgt-28 v1之位置取向突變發生。位置取向突變發生係在dgt-28 v1上進行以評比於位置84的丙胺酸提供對嘉磷賽的耐性之角色。此種天然丙胺酸突變為甘胺酸以決定是否該改變可降低酶對嘉磷賽耐性或降低對PEP的親和力。此種胺基酸經選出，其係相對應於如前述導入大腸桿菌EPSP合成酶的G96A突變故。
得自史翠基因(Stratagene)(加州勝塔卡拉)之快全吉(Quick Change)II套組用以進行突變發生。使用pDAB100445(dgt-28 v1)作為樣板DNA，依據快全吉方案建立PCR反應。含有突變dgt-28 v2基因序列的組成體標示為pDAB102946(圖15)及透過DNA排序證實。設計下列引子來讓胺基酸切換：DGT28 MutF(SEQ ID NO：25；5’gATgTTTATTgCCgTgATggTggAACCACCgCACgTTTTC) DGT28 MutR(SEQ ID NO：26；5’gAAAACgTgCggTggTTCCACCATCACggCAATAAACATC)
於dgt-28 v2進行第二回合突變發生意圖進一步降低對嘉磷賽的耐受性。第二突變T172A導入已經突變的dgt-28 v2。於此位置EPSP合成酶的往復丙胺酸至蘇胺酸突變先前說明於Haghani等人(2008)，其中導致對嘉磷賽不敏感。最終結果為製造雙重A84G,T172A突變體標示為dgt-28 v3。PCR反應係使用pDAB102946(dgt-28 v2)作為樣板DNA依據快全吉方案設定。含突變dgt-28 v3基因序列的組成體 標示為pDAB100469(圖16)。使用下列引子來產生T172A突變：DGT28 Mut2F(SEQ ID NO：27；5’gggTCCgCTggCACgTCAgggTCTgCgTATTCg) DGT28 Mut2R(SEQ ID NO：28；5’CgAATACgCAgACCCTgACgTgCCAgCggACCCAgCAgC)
用於大腸桿菌表現之額外組成pET表現載體。用於試管試驗，dgt-1 v5、dgt-1 v6、dgt-1 v7、dgt-1 v8、dgt-3 v6、dgt-3 v7、dgt-3 v8、dgt-7 v5、dgt-7 v6、dgt-7 v7、dgt-7 v8、dgt-32 v5、及dgt-33 v5基因序列係經合成及選殖(基因亞特)。合成基因選殖入pET28表現載體。所得組成體標示為pDAB102028(圖17)含dgt-1 v5，pDAB102029(圖18)含dgt-1 v6，pDAB102032(圖19)含dgt-1 v7，pDAB102034(圖20)含dgt-1 v8，pDAB100429(圖21)含dgt-3 v6，pDAB100442(圖22)含dgt-3 v7，pDAB100430(圖23)含dgt-3 v8，pDAB102036(圖24)含dgt-7 v5，pDAB102038(圖25)含dgt-7 v6，pDAB1020409(圖26)含dgt-7 v7，及pDAB102042(圖27)含dgt-7 v8。
DGT-32及DGT-33之選殖。用於試管試驗，下列植物最佳化基因：dgt-32 v3及dgt-33 v3係分別從二元體載體pDAB107532(圖11)及pDAB107534(圖12)擴增。使用下列引子集合：pMALDGT32F(SEQ ID NO：29；CATATGACCGTTATTGAAATTCCGGG)及pMALDGT32R(SEQ ID NO：30；GATATCCTATTATTAACGACCTTCCAG)針對dgt-32，及pMALDGT33F(SEQ ID NO：31；CATATGGGTGCAGTTACCGTTATTGA),pMALDGT33R(SEQ ID NO：32；GATATCCTATTATTATGCCTGCGGAC)針對dgt-33.
然後已擴增序列次選殖入pMAL-c5X，使得各個基因係於ma1E編碼序列進行框內融合。最後表現組成體為 pDAB107713(圖29)含dgt-32 v3，及pDAB107714(圖30)含dgt-33 v3。
實例4：試管內生物化學酶動力學檢定分析
重組DGT酶之過度表現及純化。重組DGT蛋白質係從前述組成體於羅希塔2(Rosetta2)(DE3)細胞(諾瓦真(Novagen)，威斯康辛州馬迪森)過度表現。單一群落用來接種含氯黴素(25微克/毫升)及康黴素(50微克/毫升)的50毫升起始LB培養，於37℃培養隔夜。隔夜培養用來接種1升含氯黴素(25微克/毫升)及康黴素(50微克/毫升)的LB。培養於37℃生長至O.D.600=0.6，然後置於冰水浴內10分鐘。目標蛋白質的表現係藉添加IPTG至500 μM終濃度而達成。
允許於20℃進行導入隔夜，接著透過於8,000 rpm離心20分鐘收穫。細胞丸粒儲存於-80℃直到要求純化時。全部純化步驟皆係於4℃進行。得自1升培養之細胞丸粒再度懸浮於20-30毫升緩衝液A(50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、2 mM DTT、1 mM EDTA、20 mM咪唑、及5%甘油)。添加康普利特(COMPLETE)蛋白酶抑制劑混合液(1錠/50毫升，羅氏(Roche)，印第安那州，印第安那波利)及溶菌酶(1毫克/毫升，希格瑪亞利須(Sigma-Aldrich)，密蘇里州，聖路易)及懸浮液攪拌20分鐘。使用布蘭森(Branson)超音波機(Sonifier)250(3x60秒叢發)進行細胞溶解，接著於16,000 rpm 45分鐘離心去除細胞碎屑。
使用5毫升喜斯崔普(HisTrap)FF粗產物管柱，透過制動金屬親和力層析術(IMAC)以一步驟純化至均質。管 柱係於緩衝液A平衡，樣本係載入相同緩衝液內。然後管柱以10倍管柱體積緩衝液A洗滌，接著於0-100%緩衝液B(50 mM HEPES pH 7.5、200 mM KCl、2 mM DTT、1 mM EDTA、500 mM咪唑、及5%甘油)線性梯度經歷25倍管柱體積洗提。藉SDS-PAGE分析判定，含目標蛋白質之洗提分使用裝配有10 kDa分子量截留(MWCO)的米利波(Millipore)超離心裝置濃縮至2.5毫升。純化後之DGT酶係使用PD-10管柱(GE健康照護公司(GE Healthcare))緩衝液交換入50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、2 mM DTT、及5%甘油及隨後濃縮至約1毫升。樣本典型稀釋1：50，於凱瑞50(Cary50)Bio紫外光-可見光分光光度計上記錄240至700奈米的紫外光-可見光光譜。然後使用理論值消光係數來基於於280奈米的吸光計算蛋白質濃度(ExPASy，瑞士日內瓦)。
重組DGT-32及DGT-33融合體的表現及純化。DGT-32及DGT-33酶係經組成而含有位在於酶胺基端的麥芽糖融合標籤。分離及證實以pDAB107712(圖28)、pDAB107713、及pDAB107714轉形的大腸桿菌細胞。各個細菌種系的單一菌落用來接種含100微克/微升卡本西林(carbenicillin)及25微克/微升氯黴素的50毫升LB培養基。起始培養於37℃生長隔夜及隨後用以接種補充0.2%葡萄糖、100微克/微升卡本西林及25微克/微升氯黴素的600 mLLB培養基。培養於37℃生長至OD600=0.4，此時添加IPTG至50 μM IPTG終濃度。培養於18℃誘導15小時。次日於8,000 rpm離心20分鐘將細胞造粒而收穫培養。細胞糊於 -80℃儲存至需要純化時。
冷凍丸粒再度懸浮於20-30毫升緩衝液A(50 mM HEPES pH 7.5、100 mM KCl、1 mM EDTA、5%甘油、及1 mM DTT)及1錠蛋白酶抑制劑(羅氏完整)。一旦丸粒完全再度溶解，添加1毫克/毫升溶菌酶，樣本於4℃混合15至20分鐘。於溶菌酶培養後，樣本移轉至50毫升離心管及置於冰上。然後樣本藉超音波處理1分鐘時間間隔，接著為4分鐘冷卻。又重複此步驟兩次共計三個超音波處理週期。於16,500 rpm離心45分鐘去除細胞碎屑，上清液載入50毫升注入回路內。粗產物溶解產物施用至戊糖管柱，以7倍管柱體積的緩衝液A洗滌，及以100%緩衝液B(緩衝液A及10 mM麥芽糖)洗提。匯集目標蛋白質及使用30 kDa MWCO離心機離心至2.5毫升。純化後之蛋白質使用PD-10凝膠過濾管柱交換入50 mM HEPES pH 7.5、100 mM KCl、及5%甘油。蛋白質濃度係使用BSA作為標準品透過布拉德佛(Bradford)檢定分析決定。純蛋白質係於液態氮中冷凍及儲存於-80℃。
植物及細菌性DGT酶之試管內動力學特徵化。野生型(WT)及突變種DGT之酶活性係藉於修改程序製造的無機磷酸鹽(Pi)測量，述於Lanzetta等人(1979)Anal.Bioch.100：95-7。檢定分析係於96孔孔板格式總計50微升於史貝徹麥(Spectra-Max)190孔板讀取器(分子裝置公司(Molecular Devices)，加州桑尼維爾)進行。典型檢定分析含有50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、2 mM DTT、及1 mM S3P。PEP及嘉磷賽濃度係如指示改變。嘉磷賽係得自希格瑪公司(Sigma)呈自由態酸及再度懸浮於重蒸餾水。嘉磷賽藉添加氫氧化鉀直到混合物於中性pH而溶解。藉添加0.01-1 μM改變濃度的DGT酶初始化檢定分析。藉添加235微升孔雀石綠：鉬酸銨溶液之3：1混合物結束反應。完全顯色(約1分鐘)後，記錄於660奈米的吸光比變化，從標準曲線計算Pi的形成量。缺酶的對照反應用以校正背景吸光比。高濃度PEP(>2 mM)及嘉磷賽(>30 mM)使用此種檢測法貢獻顯著量背景吸光比。資料匹配麥克斯蒙騰(Michaelis-Menten)方程式，允許決定Km及Vmax(方程式3)，IC50係由方程式4決定，於該處y為相對活性及s為希爾(Hill)係數。資料係使用GraFit第5版軟體分析(異瑞克斯軟體有限公司(Erithacus Software Limited)，英國賀利)。
競爭性抑制劑之IC50值將取決於酶基質濃度改變，因此表2之IC50值係於1 mM PEP及於60 μM PEP(植物的胞內PEP濃度估值)獲得。須比較於相同PEP濃度測量的IC50值(DGT-32及DGT-33之Km測量係於100 μM PEP決定)。此 外，高度耐受性酶之IC50值無法藉Lanzetta方法準確決定，因此係基於相對活性估計。
植物DGT之動力學。具有未經突變天然序列的兩種酶DGT-1 v5及DGT-7 v5首先測試建立嘉磷賽敏感度之基準線參數。兩種蛋白質對PEP顯示低Km值(~70 μM)且對嘉磷賽敏感，於1 mM PEP具有IC50值約20 μM(表2)。如針對DGT-1 v6、DGT-3 v6及DGT-7 v6觀察，由G至A的單點突變顯著改良對嘉磷賽的耐受性(8-21 mM之IC50值)，但也提高PEP的Km約8倍。針對全部植物衍生的DGT(DGT-1 v7、DGT-3 v7、及DGT-7 v7)，雙重突變(GAPS)也提升嘉磷賽耐受性，但再度導致PEP Km的顯著增高。表2。TIPS突變體(DGT-1 v8、DGT-3 v8、及DGT-7 v8)對溫和濃度的嘉磷賽(3-6 mM)具有耐受性，但GA及GAPS突變體相反，Km濃度維持接近野生型蛋白質的60-200 μM。圖31證實當導入特別突變時DGT-1(A)及DGT-7(B)之嘉磷賽耐性的移位。實驗中PEP濃度維持於1 mM，結果導致圖31所示資料，可能導致DGT-7 v8之IC50升高(>80 mM)。進行進一步程序來決定較低濃度PEP是否變更對嘉磷賽的相對耐受性。PEP的生理相關濃度係於5-60 μM改變。使用60 μM PEP，IC50值顯著增高(3.6 mM)，提示初步決定受過度PEP影響，如由Michaelis-Menten動力學預期及如表2標記。
圖31顯示使用1 mM PEP將各項突變導入DGT-1(A)及DGT-7(B)後所得IC50值。針對A及B二者的IC50曲線， 實心三角形表示野生型，實心圓形表示GA突變體，空心方形表示GAPS突變體，及實心方形表示TIPS突變體。
細菌性DGT之動力學。細菌性酶中，DGT-28 v1具有最有利的總動力學參數(IC50值及kcat/Km值升高)。酶可耐受於大於80 mM濃度的嘉磷賽及顯示1.32 x105 M-1 s-1的催化效果。於DGT-28 v2之A→G突變將IC50值降低至2.17 mM(於60 μM PEP)，使得PEP的Km略微升高(161 μM)。此種突變體酶保有於DGT-28 v1所見的高催化功效。即便有較低的IC50，此種突變酶適合於某些應用提供植物界對嘉磷賽的抗性。資料提示於此新穎類別的EPSP合成酶中，丙胺酸並非決定嘉磷賽耐受性的唯一決定因子。為了探索其它可能的決定，組成額外變異體DGT-28 v3(A84G T172A雙重變異體)。此種酶顯示對嘉磷賽之耐受性減低，具有5.15 mM(於60 μM PEP)之IC50值。針對DGT-28 v3之IC50減低係藉伴隨有催化效率減低200倍，提示第二突變導致非預期的效應(表2)。較高相同度DGT-28 v1同系物(約75%胺基酸相同度)，亦即DGT-32及DGT-33，對PEP具有低Km’s(~114-139 μM)，但催化效率比DGT-28 v1低100倍。此種催化效率的減低可能係衍生自麥芽糖結合蛋白質(MBP)融合。酶也對嘉磷賽不敏感顯示IC50值大於50 mM。此等試管內檢定分析結果指示，多種DGT酶提供對嘉磷賽的耐受性，該等DGT酶係於植物界測試。
實例5：植物轉形載體之選殖
植物二元載體組成。標準選殖法係用於含有葉綠體轉運肽多核苷酸序列接合至dgt-28作為框內融合的入門載體的組成。含有轉運肽(TraP)融合至dgt-28之入門載體係使用融合有利技術(IN-FUSION Advantage Technology)(克隆泰克(Clontch)，加州山景市)組裝。由於融合結果，從dgt-28移開第一胺基酸，亦即蛋胺酸。轉運肽TraP4 v2(SEQ ID NO：33)、TraP5 v2(SEQ ID NO：34)、TraP8 v2(SEQ ID NO：35)、TraP9 v2(SEQ ID NO：36)、TraP12 v2(SEQ ID NO：37)、及Trap13 v2(SEQ ID NO：38)各自係藉DNA2.0(加州蒙羅公園)合成及融合至dgt-28之5’端，直到且含獨特AccI限剪核酸內切酶辨識位置。
含有各種TraP及dgt-28表現卡匣之二元質體係藉擬南芥泛肽素10啟動子(AtUbi10 v2；Callis等人，(1990)J.Biol.Chem.,265：12486-12493)驅動，及由根瘤農桿菌開放讀取框23-3’未經轉譯區(AtuORF23 3’UTR v1；U.S.Pat.No.5,428,147)。
經組裝的TraP及dgt-28表現卡匣係使用蓋威(GATEWAY)技術(英維崔因，加州卡斯貝)進行工程改造及透過農桿菌媒介的植物轉形而轉形入植物體。限剪核酸內切酶係得自新英格蘭生物實驗室(NEB；麻州伊波威契)及T4DNA接合酶(英維崔因)用於DNA接合。蓋威反應係使用蓋威LR選殖酶(CLONASE)酶混合物(英維崔因)進行用以將一個入門載體組裝為單一目的地載體且含有可選擇標記卡匣木薯嵌紋病毒啟動子(CsVMV v2；Verdaguer等人，(1996)Plant Mol.Biol.,31：1129-1139)-DSM-2(U.S.Pat.App.No.2007/086813)-根瘤農桿菌開放讀取框1 3’未經轉譯區(AtuORF1 3 UTR v6；Huang等人(1990)J.Bacteriol.172：1814-1822)。質體製備係使用紐克史賓(NUCLEOSPIN)質體套組(馬奇瑞-奈格公司(Macherey-Nagel Inc.)，賓州伯利恆)或質體Midi套組(葵亞真(Qiagen))遵照供應商的指示進行。於瓊脂糖Tris-乙酸凝膠電泳後，DNA片段係使用葵爾快克(QIAquick)凝膠萃取套組(葵亞真)分離。
全部組裝質體群落初步係藉迷你製備DNA的限剪消化篩選。經選定的純株之質體DNA係藉商業定序供應商(優洛芬斯(Eurofins)MWG操縱子，阿拉巴馬州漢茲維爾)定序。序列資料經組合及使用SEQUENCHER軟體(基因碼公司(Gene Codes Corp.)，密西根州安哈伯)分析。
下列二元組成體表示各種TraP：dgt-28融合基因序列：pDAB107527(圖3)含TraP4 v2：dgt-28 v5(SEQ ID NO：79)；pDAB105530(圖4)含TraP5 v2：dgt-28 v5(SEQ ID NO：80)；pDAB105531(圖5)含TraP8 v2：dgt-28 v5(SEQ ID NO：81)；PDAB105532(圖6)含TraP9 v2：dgt-28 v5(SEQ ID NO：82)；pDAB105533(圖7)含TraP12 v2：dgt-28 v5(SEQ ID NO：83)；及pDAB105534(圖8)含TraP13 v2：dgt-28 v5(SEQ ID NO：84)。pDAB105534之dgt-28 v5序列經修改，其中第一密碼子(GCA)改成(GCT)。
額外植物二元載體組成。類似前述選殖策略係用以組成含有dgt-31、dgt-32、dgt-33、dgt-1、dgt-3、及dgt-7之二元質體。
微生物衍生基因：dgt-31、dgt-32、及dgt-33係與前文描述之不同葉綠體轉運肽融合。使用下列葉綠體轉運肽：TraP14 v2(SEQ ID NO：39)、TraP23 v2(SEQ ID NO：40)、TraP24 v2(SEQ ID NO：41)。pDAB107532(圖11)含有dgt-32 v3融合至TraP14 v2(SEQ ID NO：42)，pDAB107534(圖12)含有dgt-33 v3融合至TraP24 v2(SEQ ID NO：43)，及pDAB1017533(圖54)含有dgt-33 v1融合至TraP23 v2(SEQ ID NO：143)。dgt表現卡匣係藉擬南芥泛肽素10啟 動子(AtUbi10啟動子v2)驅動及旁出有根瘤農桿菌開放讀取框23-3’未經轉譯區(AtuORF23 3’URT v1)。DSM-2可選擇標記卡匣含有木薯嵌紋病毒啟動子(CsVMV v2)-DSM-2-根瘤農桿菌開放讀取框1 3’未經轉譯區(AtuORF1 3’UTR v6)也存在於二元載體。
組成額外二元體其中dgt-31 v3、dgt-32 v3、及dgt-33 v3融合至前述葉綠體轉運肽序列。例如TraP8 v2序列係融合至dgt-31 v3、dgt-32 v3、及dgt-33 v3，及選殖入如前述二元載體。
含有I類基因(dgt-1、dgt-3及dgt-7)之二元載體經組成。組成下列二元載體及轉形入植物：pDAB4104(圖9)，其含有如美國專利申請公告案第2011/0124503號所述的dgt-1 v4序列，其旁出有菸草滲透素序列，如美國專利申請公告案第2009/0064376號所述；pDAB102715(圖10)；pDAB102716(圖45)；pDAB102717(圖46)；及pDAB102785(圖13)。融合至dgt-28、dgt-31、dgt-32、及dgt-33之各種TraP葉綠體轉運肽未添加至I類基因，原因在於此等植物所衍生的序列具有天然植物葉綠體轉運肽。此等載體之進一步細節係說明於表3。
實例6：轉形成擬南芥及選擇
擬南芥轉形。擬南芥係使用得自Clough及Bent(1998)之花浸泡法轉形。含有前述二元質體中之一者的經選擇的農桿菌群落用來接種一或多個含觀黴素(100毫克/升)及康黴素(50毫克/升)的YEP培養醪之100毫升預培養。該培養於28℃使用225 rpm的恆定攪動培養隔夜。細胞於室溫於約5000 xg造粒10分鐘，拋棄所得上清液。細胞丸粒溫和再度懸浮於400毫升浸泡培養基含有：5%(w/v)蔗糖、10微克/升6-苯甲胺基嘌呤、及0.04%希維特(Silwet)L-77。約1月齡植物以溫和攪動浸沒於培養基內5-10分鐘。植物以側鋪及覆蓋透明或不透明塑膠袋2-3小時，然後轉為面向上。植物於22℃生長，具有16小時亮/8小時暗的照明週期。浸泡約4週後，收穫種子。
轉形植物的選擇。許可新鮮收穫的T1種子[含有dgt及DSM-2表現卡匣]於室溫乾燥7日。T1種子播種於26.5x51厘米發芽托盤，各自接收200毫克分層T1種子(約10,000顆種子)，先前已經懸浮於40毫升0.1%瓊脂糖溶液，及於4℃儲存2日以完成休眠要求及確保種子同步發芽。
日照混合物(Sunshine Mix)LP5覆蓋細小蛭石下方灌溉荷格蘭(Hoagland)溶液直到濕潤，允許藉重力排水。 每份各40毫升分層種子使用滴量管均勻播種於蛭石上及覆蓋濕度拱頂4-5日。在初步轉形體選擇前一日移開拱頂，該選擇係使用嘉磷賽萌後噴灑(選擇共同轉形DSM-2基因)。
栽種後日數(DAP)7日及再度11 DAP，T1植物(分別為子葉及2至4葉期)使用戴維比斯(DeVilbiss)壓縮空氣噴槍頭遞送每次施用280 g ai/ha嘉磷賽的有效施用率，以10毫升/托盤(703 L/ha)的噴灑體積噴灑0.2%利伯提(Liberty)除草劑溶液(200 g ai/L嘉磷賽，拜耳作物科學公司(Bayer Crop Sciences)，密蘇里州堪薩斯城)。於末次噴灑後4至7日識別倖存者(活性生長的植物)，及個別地移植入使用盆栽培養基(美崔混合(Metro Mix)360)準備的3吋盆內。移植的植物於溫室內生長(22±5℃，50±30% RH，14小時亮：10小時暗，至少500 μE/m2s1自然光+補充光)。在存活T1植物完成分子證實分析，證實嘉磷賽耐受性基因已經穩定地整合入植物的基因體。
分子驗證。證實使用pDAB107527、pDAB105530、pDAB105531、pDAB105532、pDAB105533、或pDAB105534轉形的擬南芥植物的基因體內部存在有dgt-28及DSM-2轉移基因。此等多核苷酸序列的存在係透過水解探子檢定分析、基因表現卡匣PCR(如植物轉錄單元PCR--PTU PCR所述)、南方墨點分析、及定量反錄PCR分析獲得證實。
T1擬南芥植物初步透過水解探子篩檢類似TAQMAN篩選而證實DSM-2及dgt-28轉移基因的存在。事 件透過基因表現卡匣PCR篩選來決定dgt表現卡匣是否完全整合入植物基因體而無需重排。由此等研究所得資料用來決定轉移基因複本數目及識別選擇擬南芥事件用於自體受精及進階至T2代。進階T2擬南芥植物也透過水解探子檢定分析篩檢來證實DSM-2及dgt基因的存在及估計植物染色體內部DSM-2及dgt基因的套數。最後使用南方墨點分析來證實估計T1擬南芥植物子集上的套數。
類似的檢定分析用來證實得自以pDAB4101轉形植物之dgt-1轉移基因的存在、得自以pDAB107532轉形植物之dgt-32轉移基因的存在、得自以pDAB102715轉形植物之dgt-3轉移基因的存在、得自以pDAB102716轉形植物之dgt-3轉移基因的存在、得自以pDAB102717轉形植物之dgt-3轉移基因的存在、及得自以pDAB102785轉形植物之dgt-7轉移基因的存在。
水解探子檢定分析。使用後述水解探子檢定分析決定T1及T2擬南芥植物的套數。具有不同轉移基因數目的植物經識別且進階進行隨後之嘉磷賽耐受性研究。
於96孔孔板收集組織樣本及凍乾2日。使用克里科(KLECO)組織粉化器及鎢珠粒(英維隆金屬公司(Environ Metal INC.)，俄勒岡州史維虹)進行組織軟化。組織軟化後依據製造商提示的方案，使用百歐林特(Biosprint)96植物套組(葵亞貞(Qiagen)，馬里蘭州德國鎮)以高產出量格式分離。基因體DNA藉匡提特皮初DNA檢定分析套組(QUANT-IT PICO GREEN DNA ASSAY KIT)(分子探子，英 維崔因，加州卡斯貝)定量基因體DNA。量化的基因體DNA使用百洛波特(BIOROBOT)3000自動液體處理器(葵亞真，馬里蘭州德國鎮)針對水解探子檢定分析調整至2奈克/微升。藉水解探子檢定分析決定轉移基因套數係使用光循環器(LIGHTCYCLER)480系統(羅氏應用科學公司，印第安那州印第安那波利)藉即時PCR進行。檢定分析係針對DSM-2、dgt-28及內部參考基因TAFII15設計(基因存庫ID：NC 003075；Duarte等人，(201)BMC Evol.Biol.,10：61)。
為了擴增，LIGHTCYCLER480探子主混合物(Probes Master mix)(羅氏應用科學公司，印第安那州印第安那波利)係以1 X終濃度於10微升體積複合反應製備，其中含有0.1 μM針對DSM-2及dgt-28各自之引子，0.4 μM針對TAFII15各自的引子及0.2 μM各個探子。表4。於60℃ 40秒以螢光獲得藉由延伸進行二步驟擴增反應。全部樣本皆進行處理，平均週期臨界值(Ct)用於各樣本的分析。使用LIGHTCYCLER軟體1.5版使用相對定量模組進行即時PCR資料分析且係基於△△Ct方法。為了達成此項目的，各回合包括得自單一複本校準器及已知2複本檢查的基因體DNA樣本。水解探子篩檢的套數結果係針對T1及T2基因轉殖擬南芥植物決定。
透過南方墨點分析之dgt-28整合驗證。南方墨點分析用來建立插入T股DNA片段的整合樣式及識別含dgt-28之事件。產生基因來證實整合及擬南芥基因體內部轉移基因插子的完整性。南方墨點分析用來識別T股DNA完整複本的簡單整合。使用dgt-28基因表現卡匣的特異性PCR擴增探子進行詳細南方墨點分析。探子與已經使用特定限剪酶消化的基因體DNA雜交識別特定分子量之基因體DNA片段，其樣式用來識別全長簡單插入T1轉移基因事件用以進階至下一代。
於2毫升錐形試管(伊本朵夫試管)收集組織樣本及凍乾2日。使用克里科組織粉化器及鎢珠進行組織軟化。於組織軟化後，使用CTAB分離程序分離基因體DNA。基因體DNA進一步使用葵亞真基因體梢(Qiagen Genomic Tips)套組純化基因體DNA。基因體DNA藉匡提特皮初DNA檢定分析套組(分子探子，英維崔因，加州卡斯貝)定量。已定量的基因體DNA調整至4克獲得一致濃度。
針對各樣本，4微克基因體DNA徹底使用限剪酶SwaI(新英格蘭生物實驗室，麻州比佛利)徹底消化及於25℃培養隔夜，然後添加NsiI至反應及於37℃培養6小時。藉由使用快速沈澱溶液(Quick Precipitation Solution)(艾吉 生物系統公司(Edge Biosystems)，馬里蘭州蓋瑟堡)根據製造商提示的方案藉沈澱濃縮。然後基因體DNA於25微升水中於65℃再度懸浮1小時。再度懸浮的樣本載荷至於1X TAE中製備的0.8%瓊脂糖凝膠上及於1.1伏特/厘米於1X TAE緩衝液內電泳隔夜。凝膠循序接受變性(0.2 M NaOH/0.6 M NaCl)30分鐘，及中和(0.5 M Tris-HCl(pH 7.5)/1.5 M NaCl)30分鐘。
藉透過凝膠被動地芯吸20 X SSC溶液至經處理的伊莫比隆(IMMOBILON)NY+轉移膜(密利波(Millipore)，麻省比雷瑞卡)，進行DNA片段轉移至尼龍膜，該芯吸係使用層析紙芯及紙巾。轉移後，膜以2X SSC簡短洗滌，與史翠林克(STRATALINKER)1800(史翠基因，加州拉優拉)交聯，及於80℃真空烤乾3小時。
使用400型號雜交孵育器(羅賓科學(Robbins Scientific)，加州桑尼維爾)於玻璃滾軸瓶內於65℃，墨點與預雜交溶液(波菲海(Perfect Hyb)+，希格瑪，密蘇李州聖路易)培養1小時。探子係從含有完整編碼序列的PCR片段製備。PCR擴增子係使用葵亞士(QIAEX)II凝膠萃取套組純化，及透過蘭登RT普安IT(Random RT Prime IT)標記套組(史翠基因，加州拉優拉)以α32P-dCTP標記。墨點與直接添加至雜交緩衝液的變性探子於65℃雜交隔夜，該變性探子的添加係添加至約2百萬/墨點/毫升。雜交後，墨點於65℃一次使用0.1X SSC/0.1% SDS洗滌40分。最後，墨點曝光於儲存磷成像屏，使用分子動態史東(Molecular Dynamics Storm)860成像系統成像。
於本研究完成的南方墨點分析用來決定套數及證實選擇事件含有dgt-28轉移基因於擬南芥基因體。
透過PCR分析dgt-28基因表現卡匣驗證。於T1植物事件所含的dgt-28基因表現卡匣的存在係藉端點PCR反應檢測。AtUbi10啟動子v2及dgt-28基因表現卡匣之AtuORF23 3’UTR v1區的專一性引子(表5)用於檢測。
PCR反應要求標準三步驟PCR循環協定來擴增基因表現卡匣。全部PCR反應皆係使用如下PCR條件完成：94℃三分鐘接著為35週期94℃ 30秒，60℃ 30秒，及72℃三分鐘。反應係使用愛斯泰克(EX-TAQ)PCR套組(寶酒造生技公司(TaKaRa Biotechnology Inc.)，日本滋賀縣大津市)遵照製造商指示完成。在最末週期後，反應於72℃培養10分鐘。TAE瓊脂糖凝膠電泳用來決定PCR擴增子的大小。預期大小的PCR擴增子指示全長基因表現卡匣係存在於基因轉殖擬南芥事件的基因體。
透過量化反錄PCR分析驗證dgt-28相對轉錄。dgt-28基因轉殖植物的組織樣本收集於96孔孔板及冷凍於80℃。使用克里科組織粉化器及鎢珠(英維隆金屬公司，俄勒岡州史維虹)進行組織軟化。於組織軟化後使用葵亞貞瑞吉(Rneasy)96套組(葵亞貞，馬里蘭州德國鎮)根據製造商提 示的方案以高產出量格式分離全RNA，該方案係包括於管柱上的選擇性迪耐斯I(DnaseI)處理。此步驟隨後接著額外迪耐斯I(安比恩(Ambion)，德州奧斯汀)處理經洗提的全RNA。使用高容量cDNA反錄套組(應用生物系統公司(Applied Biosystems)，德州奧斯汀)遵照製造商提示的程序，添加寡核苷酸TVN使用全RNA作為樣板進行cDNA合成。藉水解探子檢定分析完成表現的量化，使用LIGHTCYCLER480系統(羅氏應用科學公司，印第安那州印第安那波利)藉即時PCR進行。檢定分析係設計用於dgt-28及內部參考基因「未知蛋白質」(基因存庫存取號碼：AT4G24610)，使用LIGHTCYCLER探子設計軟體2.0。用於擴增，LIGHTCYCLER 480探子主混合物(羅氏應用科學公司，印第安那州，印第安那波利)係以1X終濃度製備於含0.4 μM各種引子，及0.2 μM各探子的10微升體積單一反應。表6。
二步驟擴增反應係使用螢光獲取於60℃使用延伸進行40秒。全部樣本重複三次，平均週期臨界值(Ct)用於各樣本的分析。針對各樣本進行負反錄反應來確定不存在有gDNA污染。即時PCR資料分析係基於△△Ct法進行。本檢 定分析係用來決定dgt-28於基因轉殖擬南芥事件的相對表現，該事件係決定為半接合子及同型接合子。dgt-28 mRNA的相對轉錄程度比內部標準品高2.5倍至207.5倍之範圍。此等資料指示dgt-28基因轉殖植物含有功能性dgt-28基因表現卡匣，植物可轉錄dgt-28轉移基因。
西方墨點分析。DGT-28係於得自基因轉殖擬南芥植物的葉樣本檢測。得自dgt-28基因轉殖植物的植物萃取物及DGT-28蛋白質標準品與含DTT之紐沛吉(NUPAGE)LDS樣本緩衝液(英維崔因，加州卡斯伯)於90℃培養10分鐘及於丙烯醯胺預鑄凝膠電泳分離。然後使用製造商方案將蛋白質電氣移轉至硝基纖維素膜上。使用威騰柏茲(WESTERNBREEZE)阻斷混合液(英維崔因)阻斷後，藉抗DGT-28抗血清接著藉山羊抗兔磷酸酶檢測DGT-28蛋白質。檢測得的蛋白質藉化學發光酶基質BCIP/NBT西方分析試劑(KPL，馬里蘭州蓋塞堡)目測觀察。透過西方墨點製造完整DGT-28蛋白質，指示dgt-28基因轉殖植物經檢測分析可表現DGT-28蛋白質。
實施例7：嘉磷賽耐受性
含dgt-28轉移基因的基因轉殖T1擬南芥植物噴灑不同施用率的嘉磷賽。本研究中升高施用率來決定相對抗性程度(105、420、1,680或3,360 g ae/ha)。典型將控制未經轉形擬南芥的嘉磷賽1X使用率為420 g ae/ha。添加磷酸銨的嘉磷賽配方係施用至T1植物，追蹤噴灑劑係校準於187升/公頃。本研究使用的T1擬南芥植物係可變套數的dgt-28轉 移基因。低套數dgt-28 T1擬南芥植物係自我授粉且用於製造T2植物。表7顯示dgt-28基因轉殖植物繪至嘉磷賽除草劑抗性基因dgt-1及野生型對照之比較。表8顯示dgt-32及dgt-33繪至嘉磷賽除草劑抗性基因dgt-1及野生型對照之比較。表9顯示新穎細菌性EPSP合成酶至類別I EPSP合成酶及對照於1,680 g ae/ha嘉磷賽施用率的比較。
轉形dgt-28擬南芥植物之嘉磷賽選擇結果。使用嘉磷賽選擇方案從未經轉形的種子背景首先選擇擬南芥T1轉形株。針對各種T1組成體分析三盒或30,000顆種子。如上選擇的T1植物經分子特徵化，具有可變套數的代表性植物隨後移植入個別盆內及噴灑前述各種施用率之商業嘉磷賽。此等植物之反應係以處理後二週(WAT)的%目測傷害呈示。資料呈示於表中，顯示個別植物具有極少或無傷害(<20%)、中等傷害(20-40%)、或重度傷害(>40%)。對用於擬南芥轉形的各個組成體呈示的算術平均及標準差。個別反應之範圍也針對各個施用率及轉形指示於末欄。野生型未經轉形的擬南芥(變種哥倫比亞(c.v.Columbia))用作為嘉磷賽敏感對照。
植物反應改變程度。此變因可歸因於各個植物表示獨立轉形事件，如此關注基因的套數因不同植物而異。注意某些含有轉移基因的植物無法耐受嘉磷賽；徹底分析決定表現轉移基因的此等植物是否不完全。可能在T1擬南芥植物內存在有高套數轉移基因結果導致轉移基因的靜默，或其它漸成效應(表現型的改變，epigenetic effects)結 果導致儘管存在有dgt-28轉移基因仍然對嘉磷賽不敏感。
表9針對1,680 g ae/ha嘉磷賽施用率呈示依不同施用率之總族群傷害平均來驗證使用dgt-3、dgt-7、dgt-28、dgt-32及dgt-33轉形植物相對於dgt-1及野生型對照間的顯著差異。
由新穎細菌性EPSP合成酶提供的耐受性隨特定酶而異。DGT-28、DGT-32及DGT-33出乎意外地提供對嘉磷賽的顯著耐受性。dgt基因對個別T1擬南芥植物跨越全部測試的轉運肽提供除草劑抗性。如此，使用額外葉綠體轉運肽(亦即TraP8-dgt-32或TraP8-dgt-33)將提供對嘉磷賽的保護，如在給定處理組報告具有相似的傷害程度。
dgt-28作為可選擇標記。使用dgt-28作為嘉磷賽選擇因子的可選擇標記係使用前述擬南芥轉形植物測試。約50 T4世代擬南芥種子(dgt-28之同型接合子)釘入約5,000野生型(對嘉磷賽敏感)種子。種子發芽，小植株噴灑選擇劑量的嘉磷賽。比較嘉磷賽的數個處理組；植株的各個托盤接受一次或兩次下列處理方案中之一者的嘉磷賽施用時間：7 DAP(栽種後日數)、11 DAP、或7 DAP接著11 DAP。由於全部植物在相同的轉形載體含有嘉磷賽抗性基因，故使用嘉磷賽選擇的含dgt-28植物可與含DSM-2或pat的使用嘉磷賽選擇的植物做比較。
嘉磷賽處理組使用如前述DeVilbiss噴灑梢端施用。含dgt-28之基因轉殖植物識別為「抗性」或「敏感性」17 DAP。栽種後7日及11日(DAP)施用26.25-1680 g ae/ha嘉磷賽的處理組顯示含dgt-28之基因轉殖擬南芥植物的有效選擇性。敏感性植物及抗性植物經計數，發現嘉磷賽耐受性植物的數目與所播種的含dgt-28轉移基因的基因轉殖種子的原先數目有相關性。此等結果指示dgt-28可有效用作為轉形擬南芥族群的另一種可選擇標記。
遺傳性。經過證實的基因轉殖T1擬南芥事件係自我授粉來產生T2種子。此等種子為藉施用含嘉磷賽的伊格 奈特(Ignite)除草劑(200 g ae/ha)至100隨機T2同型株測試的子代。個別T2植株移植至7.5厘米方形盆內隨後進行噴灑施用(軌道噴灑器於187 L/ha施用率)。於針對具有孟德爾遺傳性的顯性遺傳單一位置之預期3抗性：1敏感性模型中，藉χ平方分析(P>0.05)測定T1家族(T2植物)為孤立。具有預期孟德爾遺傳性的孤立的T1家族百分比顯示於表10，驗證dgt-28特徵係透過孟德爾遺傳性傳遞給T2世代。自5至15個T2個體收集種子(T3種子)。得自3至4個隨機選擇T2家族各25株T3同型株為如前述測試的子代。資料顯示無孤立，如此驗證dgt-28及dgt-3係穩定整合於染色體內部，以孟德爾方式繼承至至少三個時代。
T2擬南芥資料。含有低套數dgt-28轉移基因的經擇定的T1擬南芥事件之第二世代植物(T2)進一步針對嘉磷 賽耐受性特徵化。嘉磷賽係如前述施用。植物的反應係以處理後2週(WAT)目測觀察傷害百分比表示。資料係以具有極少或無傷害(<20%)、中等傷害(20-40%)、或重度傷害(大於40%)的個體的直方圖呈示。算術平均及標準差係針對用於擬南芥轉形之各個組成體呈示。個別反應範圍也指示於各個施用率及轉形的末欄。野生型未經轉形的擬南芥(變種哥倫比亞)用作為嘉磷賽敏感性對照。於T2世代中，半接合子及同型接合子植物可用於各事件測試，因此含括於各個嘉磷賽測試施用率。半接合子植物於一個基因座含有兩個不同對偶基因，相較於同型接合子，在一個基因座含有相同的兩個對偶基因。由於對半接合子比較同型接合子植物的基因劑量差異結果，於T2世代預期有對嘉磷賽反應的變異性。對嘉磷賽反應的變異性係反映在標準差及反應範圍。
於T2世代中，單套及多套dgt-28事件係針對嘉磷賽耐受性特徵化。於一事件中，單套植物顯示針對嘉磷賽的相似耐性程度。單套T2事件之特性資料呈示於表11。比較含有其它Trap轉運肽的dgt-28組成體，含dgt-28鏈接TraP5 v2事件無法提供對嘉磷賽的穩健耐受性。但比較非轉形哥倫比亞對照，dgt-28 TraP5組成體確實提供低度嘉磷賽耐受性。有些情況事件顯示含有二或更多套dgt-28對提高的嘉磷賽施用率更敏感(資料未顯示)。此種對嘉磷賽的敏感度增高係類似前文對T1植物所述資料，其也含有高套數dgt-28轉移基因。可能在擬南芥植物內部存在有高套數轉移基因，結果導致轉移基因靜默或其它表現型改變效應，導致對嘉磷 賽敏感，儘管存在有dgt-28轉移基因亦如此。
此等事件含有dgt-28鏈接TraP5 v2(pDAB105530)、TraP12 v2(pDAB105533)及TraP13 v2(pDAB105534)。
除了dgt-28外，以dgt-3轉形的T2擬南芥事件係呈示於表12。如於表11中，對dgt-28事件所述，資料表含有對各個組成體對嘉磷賽反應的特徵性代表事件。針對dgt-3特徵，具有dgt-3基因係由AtUbi10啟動子所驅動的含單一PTU(植物轉形單位)的組成體(pDAB102716，圖45及pDAB102715，圖10)係與含2 PTU基因的相同基因的組成體(pDAB1027198，圖32；pDAB102718，圖33)做比較。含2 PTU的組成體使用AtUbi10啟動子驅動一套基因及CsVMV啟動子驅動另一套基因。雙套PTU的使用係結合而比較dgt-3基因轉殖植物與含兩套轉移基因的dgt-28基因轉殖植物。資料證實只有單一PTU的單套T2 dgt-3事件比較測試單套dgt-28事件對嘉磷賽更敏感，但比較非轉形對照更具有耐受性。比較1 PTU組成體，含2 PTU dgt-3基因的T1家族提供對嘉磷賽更高的目測耐受性。兩種情況下，T1家族係與dgt-1對照及野生型對照做比較。T2資料證實dgt-28提供如同單套事件的穩健耐受性。
T3擬南芥資料。含低套數dgt-28轉移基因的經擇定的T2擬南芥事件之第三代植物(T3)係進一步針對嘉磷賽耐受性特徵化。每個種系25株植物如前述使用草胺膦選 出，得自每個測試組成體之種系針對可選擇標記基因並不孤立。嘉磷賽係如前文說明施用。植物的反應係以處理後2週(WAT)的%目測傷害表示。資料呈示為個別直方圖具有極少或無傷害(小於20%)、中等傷害(20-40%)、或嚴重傷害(大於40%)。針對用於擬南芥轉形的各個組成體呈示算術平均及標準差。個別反應範圍也針對各個施用率及轉形指示於末欄。野生型未經轉形擬南芥(變種哥倫比亞)係用作為嘉磷賽敏感性對照。
轉形植物之選擇。剛收穫的T1種子[dgt-31、dgt-32、及dgt-33 v1基因]許可於室溫乾燥及運送至印第安那波利市接受測試。T1種子播種於26.5x51厘米托盤(T.O.塑膠公司，明尼蘇達州克里瓦特)，各自接收每份200毫克成層化T1種子(約10,000顆種子)，種子事先懸浮於40毫升0.1%瓊脂糖溶液內及儲存於4℃來完成休眠要求及確保種子同步發芽。
日照混合物LP5(桑格園藝公司(Sun Gro Horticulture Inc.)，華盛頓州貝利佛)覆蓋細小蛭石及使用荷格蘭溶液從底下灌溉直到濕潤，然後允許藉重力排水。每份40毫升分層種子使用滴量管均勻播種在蛭石上及以濕度圓頂(寇德產品公司(KORD Products)，加拿大安大略省，布拉瑪里)覆蓋4至5日。一旦植物已經發芽移開圓頂，隨後使用草胺膦萌後噴灑進行初步轉形株選擇(選擇共同轉形的dsm-2基因)。
栽種後6日(DAP)及再度10 DAP，T1植物(分別為子葉期及2至4葉期)噴灑0.1%伊格奈除草劑溶液(280 g ai/L草胺膦，拜耳作物科學公司，密蘇里州堪薩斯市)，噴灑體積為10毫升/托盤(703 L/ha)，使用戴維比斯壓縮空氣噴灑梢端來遞送每次施用200 g ae/ha草胺膦的有效施用率。末次噴灑後4至7日識別倖存株(積極生長的植物)。倖存植物個別轉
移入使用盆栽培養基(美崔混合物360)準備的3吋盆內。植物於溫室內至少培養1日隨後取樣接受套數分析。
T1植物經取樣及完成針對dgt-31、dgt-32、及dgt-33 v1基因之套數分析。然後T1植物分配至各個嘉磷賽施用率，讓套數範圍係在各個施用率間分布。針對擬南芥，26.25 g ae/ha嘉磷賽為區別敏感性植物與具有有意義的抗性程度之有效劑量。施用較高施用率來決定相對抗性程度(105、420、1680或3360 g ae/ha)。表15顯示對dgt-1所做比較。
藉軌道噴灑器以187 L/ha噴灑體積進行全部嘉磷賽除草劑施用。所使用的嘉磷賽為市售杜蘭格(Durango)二甲基胺鹽配方(480 g ae/L，陶氏農業科學公司(Dow AgroSciences,LLC))。對草胺膦或嘉磷賽具有抗性的低套數T1植物係於T2世代進一步評估。
第一擬南芥轉形係使用dgt-31、dgt-32及dgt-33 v1進行。T1轉形株係使用草胺膦選擇方案首先選自非轉形種子背景。三盒或30,000顆種子針對各個T1組成體分析。計算轉形頻率，T1 dgt-31、dgt-32、及dgt-33組成體結果列舉於表14。
如上選擇之T1植物隨後移植至個別盆，使用各種商業嘉磷賽施用率噴灑。表15比較dgt-31、dgt-32、及dgt-33 v1及對照基因的反應以對擬南芥T1轉形株賦與嘉磷賽抗性。反應係以2 WAT%目測傷害表示呈現。資料係以具有極少或無傷害(<20%)、中等傷害(20-40%)、或重度傷害(>40%)的個別直方圖呈現。算術平均及標準差係針對各個處理組呈現。個別反應範圍也指示於各施用率及轉形的末欄。野生型非轉形擬南芥(變種哥倫比亞)作為嘉磷賽敏感性對照。比較陰性對照，具有轉運肽TraP23之DGT-31(v1)基因對個別T1擬南芥植物賦與些微除草劑耐受性，但該基因具有轉運肽TraP8之改良耐受性。DGT-32及DGT-33於測試的施用率驗證對嘉磷賽具有穩健耐受性，具有TraP8及個別不同的葉綠體轉運肽(分別為TraP14及TraP24)。於給定之處理組內部，植物反應程度有重大改變，可能歸因於下述事實：各個植物表示一個獨立的轉形事件，如此關注基因的套數因植物而異。要緊地須注意，於各個測試的嘉磷賽施用率，有些個體比其它個體更具有耐受性。以施用率表示總體族群傷害平均值示於表15來證實以dgt-31、dgt-32及dgt-33 v1轉形的植物相對於dgt-1 v1或野生型對照間有顯著差異。
實例8：dgt-32及dgt-33作為可選擇標記
dgt-32及dgt-33 v1用作為可選擇標記，使用嘉磷賽作為選擇因子。此等標記的效能係使用轉形擬南芥分析。約50 T4世代擬南芥種子(針對dgt-32及dgt-33 v1)為同型接合子釘入約5,000野生型(敏感性)種子。比較若干處理，各托盤植物接受一或二次嘉磷賽施用，採用下列處理方案中之一者：7 DAP、11 DAP、或7 DAP接著11 DAP。由於全部個體在相同轉形載體內也含有dsm-2基因，故使用嘉磷賽選擇的dgt-32及dgt-33能夠直接比較使用草胺膦選擇dsm-2。處理係以戴維比斯噴灑梢端施用。17 DAP識別植物為抗性或敏感性。栽種後7日及11日(DAP)施用26.25-280 g ae/ha 2,4-D處理在選擇頻率上同等有效。此等結果指示dgt-32及dgt-33 v1可有效用作為可選擇標記。
遺傳性。多個T1試驗係自我授粉來產生T2種子。此等種子為藉施用伊格奈特(200 g ae/ha)至100隨機T2親族的測試子代。個別T2植物於噴灑施用(軌道噴灑器以187 L/ha施用率)施用前移植至7.5厘米平方盆。決定藉χ平方分析(P>0.05)所決定的於針對具有孟德爾遺傳性的顯性遺傳單一基因座之預期3抗性：1敏感性模型中孤立的T1家族(T2植物)。
由5至15個T2個體收集種子(T3種子)。由3個隨機選擇T2家族各25個T3親族作為測試子代。資料顯示無孤立，證實dgt-32及dgt-33 v1各自以孟德爾方式穩定整合及遺傳至至少三代。
T3 DGT種系的額外除草劑耐受性特性。T3世代擬南芥種子分層及播種於選擇托盤。含dgt-1之轉形對照種 系及非轉形對照係以類似方式種植。小苗轉移入溫室內個別3吋盆內。全部植物使用軌道噴灑器設定於187 L/ha噴灑。植物噴灑420-3360 g ae/ha(杜蘭格DMA，陶氏農業科學公司)之嘉磷賽施用範圍。全部施用皆於水中配方。各處理重複4次，處理後7及14日評估植物。
實例9：額外作物物種的轉形
大豆以dgt-28、dgt-31、dgt-32、及/或dgt-33(有或無葉綠體轉運肽)轉形來提供對除草劑嘉磷賽之高度抗性，轉形係利用熟諳技藝人士已知方法，例如實質上與前文於PCT國際專利申請案第WO 2007/053482號之實例11或實例13所述技術相同，該等參考案全文以引用方式併入此處。
棉利用熟諳技藝人士已知方法，例如實質上於美國專利案7,838,733實例14或PCT國際專利公告案第WO 2007/053482號實例12所述相同技術，各案全文以引用方式併入此處，以dgt-28、dgt-31、dgt-32、及/或dgt-33(有或無葉綠體轉運肽)轉形來提供對除草劑嘉磷賽之高度抗性。
油菜籽利用熟諳技藝人士已知方法，例如實質上如先前於美國專利案第7,838,733號實例26或PCT國際專利公告案第WO 2007/053482號實例22所述相同技術，以dgt-28、dgt-31、dgt-32、及/或dgt-33(有或無葉綠體轉運肽)轉形而提供對除草劑嘉磷賽之高度抗性。
實例10：玉米轉形
玉米轉形之DNA組成體。如前述，標準選殖方法用於玉米根瘤農桿菌媒介的轉形組成二元載體。表16列舉 針對玉米轉形所組成的載體。下列基因元體用於載體：含有dgt-28；玉米泛肽素1啟動子(ZmUbi 1；美國專利案第5,510,474號)用以驅動dgt-28編碼序列，旁出有玉米脂肪分解酶3’非轉譯區(ZmLip 3’UTR；美國專利案第7179902號)，可選擇標記卡匣係由玉米泛肽素1啟動子用以驅動aad-1編碼序列(美國專利第7,838,733號)旁出玉米脂肪分解酶3’非轉譯區所組成。aad-1編碼序列提供對苯氧基植物生長素除草劑諸如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)及對芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)除草劑的耐受性。
dgt-28組成體係建構為標準二元載體及農桿菌超二元系統載體(日本菸草公司(Japan Tobacco)，日本東京)。標準二元載體包括：pDAB107663、pDAB107664、pDAB107665、及pDAB107665。農桿菌超二元系統載體包括pDAB108384、pDAB108385、pDAB108386、及pDAB108387。
完成額外組成體，含有黃螢光蛋白(yfp；美國專利申請案第2007/0298412號)通報子基因。pDAB109812含有yfp通報子基因卡匣，該卡匣藉玉米泛肽素1啟動子驅動，及旁出有玉米/每5個3’非轉譯區(Zm per5 3’UTR；美國專利案第7179902號)，可選擇標記卡匣係由甘蔗桿形病毒啟動子(SCBV；美國專利案第5,994,123號)組成，該啟動子係用以驅動aad-1的表現及旁出有玉米脂肪分解酶3’非轉譯區。pDAB101556含有yfp卡匣，該卡匣由玉米泛肽素1啟動子驅動及旁出由玉米/每5個3’非轉譯區，該可選擇標記卡匣係由 用以驅動aad-1表現之玉米泛肽素1啟動子組成及旁出有玉米脂肪分解酶3’非轉譯區。pDAB107698含有一個dgt-28卡匣係由玉米泛肽素1啟動子驅動且旁出有玉米脂肪分解酶3’非轉譯區，yfp卡匣係由玉米泛肽素1啟動子驅動且旁出有玉米每5個3’非轉譯區，可選擇標記卡匣係由甘蔗桿形病毒啟動子組成，用以驅動aad-1的表現且旁出有玉米脂肪分解酶3’非轉譯區。此等組成體三個皆為標準二元載體。
雌花穗消毒及胚分離。為了獲得玉米的不成熟胚，玉米自交種系B104植株於溫室內生長及自我授粉或同種授粉來產生雌花穗。自我授粉後約9至12日收穫雌花穗。 實驗當天，藉浸泡於20%次氯酸鈉溶液(5%)內及振搖20至30分鐘，將雌花穗表面消毒，接著以無菌水清洗三次。消毒後，從各個雌花穗以無菌方式切下不成熟的接合子胚(1.5-2.4毫米)及隨機分配入含有液體感染培養基(LS基礎培養基，4.43 gm/L；N6維生素溶液[1000X]，1.00 mL/L；L-脯胺酸，700.0毫gm/L；蔗糖，68.5 gm/L；D(+)葡萄糖，36.0 gm/L；10 mg/ml的2,4-D，150 μL/L)的微離心管。針對一組給定實驗，對各個轉形使用得自三個雌花穗的匯集胚。
農桿菌培養起始： 含前述二元轉形載體之農桿菌之甘油備料在含適當抗生素的AB最低培養基平板上畫線培養及於20℃生長3-4日。拾取單一菌落及畫線培養至含有相同抗生素的YEP平板上及於28℃培養1-2日。
農桿菌培養及共同培養。農桿菌菌落取自YEP平板，懸浮於50毫升拋棄試管的10毫升感染培養基內，細胞密度使用分光光度計調整至0.2-0.4 OD600奈米。農桿菌培養置於125 rpm室溫的旋轉振搖器上，同時進行胚切開。大小為1.5-2.4毫米的不成熟接合子胚係分離自無菌玉米穗者，置於1毫升感染培養基內及於相同培養基洗一次。農桿菌懸浮液(2毫升)添加至各試管，試管置於振搖器平台上10-15分鐘。胚移轉至共同培養基上(Ms鹽，4.33 gm/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；肌-肌糖醇，100.0 mg/L；酪蛋白酶水解產物100.0 mg/L；30 mM麥草畏-KOH，3.3 mg/L；蔗糖，30.0 gm/L；膠贊(Gelzan)，3.00 gm/L；改性MS-維生素[1000X]， 1.00 ml/L；8.5 mg/ml硝酸銀，15.0 mg/L；DMSO，100 μM)，以子葉面向上及於25℃於24小時照明於50微莫耳米-2秒-1光強度培養3日。
推定事件的胼胝體選擇及再生。共同培養週期後，胚轉移至休止培養基(MS鹽，4.33 gm/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；1,2,3,5/4,6-六羥基環己烷，100毫克/升；MES[(2-(N-啉)-乙烷磺酸)，自由酸]0.500 gm/L；酪胺酸酶水解產物100.0 mg/L；30 mM麥草畏-KOH，3.3毫克/升；蔗糖，30.0 gm/L；膠贊2.30 gm/L；改性MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；8.5 mg/ml硝酸銀，15.0 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)不含選擇因子及於24小時照明於50微莫耳米-2秒-1光強度及於25℃培養3日。
生長抑制劑量反應實驗提示0.25 mM及以上的嘉磷賽濃度係足夠於非轉形B104玉米種系抑制細胞生長。胚轉移至含0.5 mM嘉磷賽之選擇1培養基(MS鹽，4.33 gm/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；肌-肌糖醇，100毫克/升；MES[(2-(N-啉)-乙烷磺酸)，自由酸]0.500 gm/L；酪胺酸酶水解產物100.0 mg/L；30 mM麥草畏-KOH，3.3毫克/升；蔗糖，30.0 gm/L；膠贊2.30 gm/L；改性MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；8.5 mg/ml硝酸銀，15.0 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)及於暗處及/或於24小時照明於50微莫耳米-2秒-1光強度下於28℃培養7-14日。
增生中的胚發生胼胝體轉移至含1.0 mM嘉磷賽的選擇2培養基(MS鹽，4.33 gm/L；1,2,3,5/4,6-六羥基環己 烷，100毫克/升；L-脯胺酸，700.0 mg/L；MES[(2-(N-啉)-乙烷磺酸)，自由酸]0.500 gm/L；酪胺酸酶水解產物100.0 mg/L；30 mM麥草畏-KOH，3.3毫克/升；蔗糖，30.0 gm/L；膠贊2.30 gm/L；改性MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；8.5 mg/ml硝酸銀，15.0 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L；R-哈洛希佛酸(Haloxyfop acid)0.1810 mg/L)，及於暗處及/或於24小時照明以50微莫耳米-2秒-1光強度於28℃培養14日。本選擇步驟許可基因轉殖胼胝體進一步增生及分化。胼胝體選擇週期持續三至四週。
增生的胚發生胼胝體移轉至含有0.5 mM嘉磷賽的培瑞格(PreReg)培養基(MS鹽，4.33 gm/L；1,2,3,5/4,6-六羥基環己烷，100毫克/升；L-脯胺酸，350.0 mg/L；MES[(2-(N-啉)-乙烷磺酸)，自由酸]0.250 gm/L；酪胺酸酶水解產物50.0 mg/L；NAA-NaOH 0.500毫克/升；ABA-EtOH 2.50 mg/L；BA 1.00 mg/L；蔗糖，45.0 gm/L；膠贊2.50 gm/L；改性MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；8.5 mg/ml硝酸銀，1.00 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)及於24小時照明下以50微莫耳米-2秒-1光強度於28℃培養7日。
具有枝狀芽的胚胎發生胼胝體移轉至含0.5 mM嘉磷賽之再生培養基(MS鹽，4.33 gm/L；1,2,3,5/4,6-六羥基環己烷，100毫克/升；蔗糖，60.0 gm/L；吉蘭膠(Gellan Gum)G434 3.00 gm/L；改性MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；卡本西林，125.0 mg/L)及於24小時照明下以50微莫耳米-2秒-1光強度培養7日。
具有一次根的小嫩枝移轉入植物托盤內的發根培養基(MS鹽，4.33 gm/L；改性MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；1,2,3,5/4,6-六羥基環己烷，100毫克/升；蔗糖，60.0 gm/L；吉蘭膠G434 3.00 gm/L；卡本西林，250.0 mg/L)及於16/8小時亮/暗於140-190微莫耳米-2秒-1光強度下於27℃培養7日。推定基因轉殖小珠使用前述協定分析基因轉殖套數及移轉至土壤。
dgt-28及aad-1轉移基因於玉米植物內存在之分子證實。dgt-28及aad-1多核苷酸序列的存在係透過水解探子檢定分析證實。經分離的T0玉米植物初步透過類似塔克曼(TAQMAN)的水解探子檢定分析篩選來證實aad-1及dgt-28轉移基因的存在。由此等研究所產生的資料係用來決定轉移基因套數及用來選擇基因轉殖玉米事件的反向交配及前進至T1世代。
組織樣本收集於96孔孔板，組織軟化係使用KLECO組織粉化器及不銹鋼珠(胡佛精密產品公司(Hoover Precision Products)，喬治亞州康明)，於葵亞真RLT緩衝液內進行組織軟化。於組織軟化後，使用百歐林特96植物套組(葵亞真，馬里蘭州德國鎮)依據製造商提示方案於高產出量格式中分離基因體DNA。基因體DNA係藉匡提特皮初DNA檢定分析套組(分子探子，英維崔因，加州卡斯貝)定量。已定量的基因體DNA使用百洛波特(BIOROBOT)3000自動液體處理器(葵亞真，馬里蘭州德國鎮)調整至約2奈克/微升用以水解探子檢定分析。藉類似泰克曼檢定分析的水 解探子檢定分析決定轉移基因套數係使用光循環器480系統(羅氏應用科學公司，印第安那州印第安那波利)藉即時PCR進行。檢定分析係使用光循環器探子設計軟體2.0設計aad-1、dgt-28及內部參考基因反錄酶(基因存庫存取號碼：U16123.1)。為了擴增，光循環器480探子主混合物(羅氏應用科學公司，印第安那州印第安那波利)係製備成1X終濃度於10微升體積複合反應含有各0.4 μM之aad-1及dgt-28及各0.2 μM之各探子(表17)。
二步驟擴增反應係使用螢光獲得於60℃擴延40秒進行。跑全部樣本，平均週期臨界值(Ct)用於各樣本的分析。即時PCR資料係使用LightCycler軟體1.5版使用相對量模組進行，且係基於△△Ct方法。對照包括含有單套校準者的基因體DNA樣本，及已知含括於各回合的二套檢查。表18列舉水解探子檢定分析結果。
實例11：於dgt-28轉形玉米之除草劑耐受性
玉米dgt-28轉形事件(T0)允許於溫室內水土適應及生長直到植物從組織培養變遷至溫室生長條件(亦即2-4新正常外觀葉已經從年輪萌出)。植物於溫室內於16小時亮：8小時暗條件下於27℃生長。然後植物使用杜蘭格DMA(含有除草劑嘉磷賽)添加2% w/v硫酸銨的商業配方處理。除草劑配方係使用軌道噴灑器以187 L/ha，50 cm噴灑高度噴灑體積進行噴灑。T0植物噴灑280-4480 g ae/ha嘉磷賽之嘉磷賽範圍，其可顯著傷害非轉形玉米種系。致命劑量係定義為對B104自交造成大於95%傷害率。
T0 dgt-28玉米植物的結果證實於高達4480 g ae/ha的施用率對嘉磷賽具有耐受性。特定培養基型別用於 T0世代。轉形植物比較非轉形對照最小矮化及總植物生長驗證dgt-28當鏈接至TraP5、TraP8、及TraP23葉綠體轉運肽時提供對嘉磷賽的穩健耐受性。
經擇定的T0植物自我交配或自交來進一步決定下一代的特徵。100株選定的含dgt-28種系之T1植物噴灑140-1120 g ae/ha草胺膦或105-1680 g ae/ha嘉磷賽。在相同植體上組成可選擇標記及嘉磷賽抗性基因。因此，若藉噴灑除草劑選擇一個除草劑耐受性基因，則相信存在有二基因。於14 DAT，計數抗性及敏感性植物來決定藉開平方分析決定為單一基因座顯性孟德爾特徵(3R：1S)的孤立種系百分比。此等資料證實dgt-28在單子葉植物遺傳為穩健嘉磷賽抗性。增高施用率的嘉磷賽施用至T1或F1倖存者來進一步決定由dgt-28基因所提供的耐受性及保護特性。
於dgt-28轉形T0玉米的萌後除草劑耐受性。與TraP4、TraP5、TraP8及TraP23鏈接的dgt-28之T0事件係藉農桿菌轉形而產生，允許於控制的生長隔間條件下水土適應至2-4個正常外觀葉已經從年輪萌出為止。植物被標示個別的識別號碼，針對dgt-28及aad-1的分析套數取樣。基於套數分析，選擇植物進行蛋白質表現分析。植物移植入含有新鮮生長培養基的大型盆內，於16小時亮：8小時暗條件下於溫室內於27℃生長。其餘植物未取樣蛋白質的表現，然後使用杜蘭格DMA(嘉磷賽)商業配方添加2% w/v硫酸銨處理。處理經分配使得各組植物含有不等套數的T0事件。除草劑的施用係使用軌道噴灑器於180 L/ha噴灑體積50厘米 噴灑高度進行。T0植物噴灑280-4480 g ae/ha嘉磷賽之嘉磷賽範圍，可能對轉形玉米種系造成顯著傷害。致命劑量係定義為造成B104自交系大於95%傷害之施用率。B104為轉形株的遺傳背景。
T0 dgt-28玉米植物結果證實對嘉磷賽的耐受性高達4480 g ae/ha。表19。比較非轉形對照，轉形植物的最小發育受阻及總植物生長證實dgt-28當鏈接至TraP5、TraP8、及TraP23時，提供穩健的嘉磷賽保護。
藉標準ELISA進行蛋白質表現分析證實跨測試組成體DGT-28蛋白質之平均範圍為12.6-22.5奈克/平方厘米。
於溫室條件下於F1世代嘉磷賽耐受性之證實。未經噴灑的單套T0植物雜交至未經轉形的背景B104進一步決定下一代的特徵。於T1世代中，評估嘉磷賽耐受性來證實dgt-28基因的遺傳性。針對T1家族，除草劑俄秀(ASSURE)II(35 g ae/ha葵茲洛佛(quizalofop)-甲基)於V1生長期施用來選擇AAD-1蛋白質。可選擇標記及抗嘉磷賽基因組成在相同質體上。因此若選擇一個基因，則相信存在有二基因。於7 DAT後，抗性植物及敏感性植物經計算數目，從族群中去除無效植物。此等資料證實dgt-28(v1)遺傳為單子葉物種的穩健嘉磷賽抗性基因。植物藉標準ELISA及RNA轉錄本 濃度決定DGT-28蛋白質特性。如前述對抗性植物噴灑560-4480 g ae/ha嘉磷賽。資料證實dgt-28鏈接葉綠體轉運肽TraP4、TraP5、TraP8及TraP23對高達4480 g ae/ha嘉磷賽具有穩健耐受性。表20。
蛋白質表現資料驗證橫跨T1事件及測試組成體，平均DGT-28蛋白質之範圍為42.2-88.2奈克/平方厘米，確立蛋白質於T1世代表現。
於田野條件下dgt-28玉米之特徵化。單套T1事件送至田間位置來建立雜交體半接合子及自交同型接合子種子進行額外特徵化。雜交種子係藉於玉米轉形種系B104的T1事件交配至自交種系4XP811產生雜交族群針對該事件孤立1：1(半接合子：無)的玉米轉形種系B104。所得種子運送至2個分開位置。每個組成體共5單套事件以隨機完整區塊設計栽種於各個位置，重複三次。田間係針對V4生長期施用嘉磷賽及V8生長期施用分開植物族群設計。4XP811/B104習知雜交體係用作為陰性對照。
實驗列使用184 g ae/ha俄秀II(106 g ai/L，葵茲洛佛-甲基)處理來去除無效孤立株。全部實驗分錄就俄秀II施 用而言，孤立1：1(敏感性：抗性)(p=0.05)。所選擇的抗性植物係由各事件取樣用以藉標準ELISA定量DGT-28蛋白質。
葵茲洛佛-甲基抗性植物使用商業除草劑杜蘭格DMA(480 g ae/L嘉磷賽)添加2.5% w/v硫酸銨於V4或V8生長期處理。除草劑之施用係使用吊桿噴灑器進行，校準而遞送187 L/ha體積，50厘米噴灑高度。植物噴灑1120-4480 g ae/ha嘉磷賽之嘉磷賽範圍，對非轉形玉米種系可能造成顯著傷害。致命劑量係定義為對XP811自交係造成大於95%傷害的施用率。目測傷害評估係於7、14、及21 DAT(處理後日數)針對目測黃化百分比、壞死百分比、生長抑制百分比及總目測傷害進行。評估係與針對各種系未經處理的檢查及陰性對照做比較。
針對全部評估時間之目測傷害資料證實於二位置及施用時間對高達4480 g ae/ha杜蘭格DMA具有穩健耐受性。V4施用之代表性事件呈示於一個位置且與其它事件、施用時間及位置一致。表21。得自含dgt-28鏈接TraP23(pDAB107665)的組成體之一個事件對俄秀II針對AAD-1蛋白質的選擇具有耐受性，但對全部嘉磷賽施用率敏感。
在生殖生長階段針對4480 g ae/ha嘉磷賽施用率進行額外評估。雄花序、授粉時間及雌花穗填充的目測評估對各種系針對全部組成體、施用時間及位置的未經處理檢查皆類似。DGT-28蛋白質之量化結果證實186.4-303.0奈 克/平方厘米之平均蛋白質表現範圍。資料證實透過繁殖生長階段的田間條件下使用DGT-28轉形的玉米對高達4480 g ae/ha嘉磷賽具有穩健耐受性。資料也證實基於噴灑耐受性結果DGT-28之蛋白質檢測及功能。
於同型接合狀態dgt-28玉米之遺傳性及耐受性驗證。得自T1S2的種子於前述溫室條件下栽種。相同的五個單套種系係在田間條件下決定特徵及於同型接合狀態下決定特徵。植物生長至V3生長階段，分開成1120-4480 g ae/ha嘉磷賽(杜蘭格DMA)範圍的三種嘉磷賽施用率及每個處理組重複四次。施用係使用前述軌道噴灑器進行且係配方於2.0% w/v硫酸銨。硫酸銨之施用係用作為各種系的未處理檢查。如前述於處理後7日及14日進行目測評估。資料證實針對全部測試事件對高達4480 g ae/ha嘉磷賽具有穩健耐受性。表22。
於田間條件下為非耐受性的pDAB107665種系驗證對嘉磷賽不具耐受性，因此符合田間觀察(資料未顯示)。一個前述種系例外，全部重複處理使用對嘉磷賽不敏感的該等種系以嘉磷賽處理進行。因此資料證實以孟德爾方式對dgt-28至同源族群之遺傳性。藉標準ELISA的DGT-28蛋白質之表現證實橫跨對嘉磷賽具耐受性單套事件平均蛋白質表現範圍為27.5-65.8奈克/平方厘米。資料證實功能蛋白質及DGT-28蛋白質橫跨各世代的安定性。
實例12：使用嘉磷賽作為可選擇標記萌後除草劑之耐受性
如前述，T0植物係從組織培養移出且在溫室內水土適應。測試的事件含有dgt-28鏈接至TraP5、TraP8及TraP23葉綠體轉運肽。證實此等T0植物提供高達4480 g ae/ha嘉磷賽的穩健耐受性，及非轉形植物係使用低抵280-4480 g ae/ha的嘉磷賽控制。此等資料證實，使用280-4480 g ae/ha範圍的嘉磷賽濃度利用dgt-28作為可選擇標記。
得自含dgt-28轉移基因的固定種系玉米多顆種子被釘入多顆非轉形玉米種子。該種子經種植且允許其生長至V1-V3發育期，此時小株植物噴灑280-4480 g ae/ha範圍之選擇劑量的嘉磷賽。7-10日後，計算敏感性及抗性植物數目，嘉磷賽耐受性植物數目與所種植的含dgt-28轉移基因之原先基因轉殖種子數目有關。
實施例13：dgt-28玉米之堆疊
AAD-1蛋白質係用於dgt-28轉形玉米作為可選擇標記用於研究目的。aad-1基因也用作為玉米的除草劑耐受性特徵來於作物提供高達V8施用的穩健2,4-D耐受性。得自組成體pDAB107663(TraP4：：dgt-28)、pDAB107664(TraP8：：dgt-28)及pDAB107666(TraP5：：dgt-28)的四個事件決定對槽混合施用嘉磷賽及2,4-D的耐受性特徵。特性研究係使用F1種子於溫室條件下完成。以如所述的軌道噴灑器於下列施用率進行施用：1120-2240 g ae/ha嘉磷賽(針對dgt-28基因選擇)、1120-2240 g ae/ha 2,4-D(針對aad-1基因選 擇)、或於所述施用率兩種除草劑的槽混合物。植物係於7 DAT及14 DAT評級。於2240 g ae/ha施用除草劑的噴灑結果顯示於表23。
結果證實dgt-28可成功地與aad-1堆疊，如此增加可施用至關注作物的除草劑有效範圍(分別針對dgt-28及aad-1的嘉磷賽+苯氧基乙酸類)。於作物生產中，當難以控制闊葉莠草或抗性莠草時，生物種型存在堆疊可用作為莠草控制及關注作物保護的手段。額外輸入特徵及輸出特徵也可與玉米及其它作物中的dgt-28基因堆疊。
實施例14：其它作物的轉形
額外作物使用已知技術轉形。針對農桿菌媒介黑麥的轉形例如參考Popelka JC、Xu J、Altpeter F.，「於生物槍基因移轉後具有低轉移基因套數的黑麥之產生及即刻不 含標記的基因轉殖黑麥的黑麥(Secale cereale L.)植物的生產」，轉殖基因研究2003年10月；12(5)：587-96)。針對高粱之農桿菌媒介轉形，例如Zhao等人，「農桿菌媒介的高粱轉形」，Plant Mol Biol.2000 Dec；44(6)：789-98。針對農桿菌媒介的大麥轉形例如參考Tingay等人，「根瘤農桿菌媒介的大麥轉形」，植物期刊，(1997)11：1369-1376。針對農桿菌媒介的小麥轉形例如參考Cheng等人，「藉根瘤農桿菌媒介小麥之基因轉形」，Plant Physiol.1997 Nov；115(3)：971-980。針對稻米之農桿菌媒介轉形，例如參考Hiei等人，「藉根瘤農桿菌媒介稻子轉形」，Plant Mol Biol.1997 Sep；35(1-2)：205-18。前述參考文獻各自全文以引用方式併入此處。
其它(非農桿菌)轉形技術係用以將dgt-28、dgt-32或dgt-33(舉例)轉形入玉米(Zea mays)、小麥(Triticum spp.)、稻(Oryza spp.及Zizania spp.)、大麥(Hordeum spp.)、棉(Abroma augusta及Gossypium spp.)、大豆(Glycine max)、甜菜(Beta spp.)、甘蔗(Arenga pinnata)、蕃茄(Lycopersicon esculentum及其它種屬、Physalis ixocarpa、Solanum incanum及其它種屬、及Cyphomandra betacea)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、甘薯(Ipomoea batatas)、黑麥(Secale spp.)、甜椒(Capsicum annuum、chinense、及frutescens)、萵苣(Lactuca sativa、perennis、及pulchella)、甘藍(Brassica spp.)、芹(Apium graveolens)、茄(Solanum melongena)、花生(Arachis hypogea)、高粱(Sorghum spp.)、苜蓿(Medicago sativa)、胡蘿蔔(Daucus carota)、豆(Phaseolus spp.及其它屬)、燕麥 (Avena sativa及strigosa)、豌豆(Pisum、Vigna、及Tetragonolobus spp.)、向日葵(Helianthus annuus)、南瓜(Cucurbita spp.)、黃瓜(Cucumis sativa)、菸草(Nicotiana spp.)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、草坪草(Lolium、Agrostis、Poa、Cynodon、及其它屬)、丁香(Trifolium)、蠶豆(Vicia)。
由dgt-28、dgt-32及dgt-33提供嘉磷賽抗性增加於許多落葉及常綠木材作物系統季節性使用嘉磷賽除草劑的施用率。嘉磷賽除草劑抗性木材種屬提高此等除草劑於頂上使用的彈性而無傷害擔憂。如此dgt-28、dgt-32及/或dgt-33被轉形入木材物種：赤楊木(Alnus spp.)、白蠟木(Fraxinus spp.)、楊木及白楊木物種(Populus spp.)、山毛櫸(Fagus spp.)、樺木(Betula spp.)、櫻木(Prunus spp.)、桉木(Eucalyptus spp.)、山核桃木(Carya spp.)、楓木(Acer spp.)、橡木(Quercus spp.)、及松木(Pinus spp.)。
於觀賞用及結果物種嘉磷賽除草劑抗性可提高嘉磷賽除草劑用於選擇性莠草控制的施用率。如此dgt-28、dgt-32及/或dgt-33轉形入觀賞用及結果實物種：薔薇(Rosa spp.)、衛矛(Euonymus spp.)、矮牽牛(Petunia spp.)、秋海棠(Begonia spp.)、杜鵑(Rhododendron spp.)、小蘋果或蘋果(Malus spp.)、梨(Pyrus spp.)、桃(Prunus spp.)、及萬壽菊(Tagetes spp.)。
實例15：與其它特徵堆疊
含昆蟲抗性(IR)特徵的基因轉殖作物普遍出現 於南美的玉米、高粱及棉植物，此等特徵的使用擴展至全球。已經有多個種子公司發展出組合昆蟲抗性及除草劑耐受性(HT)特徵的商業基因轉殖作物。此等特徵包括蘇雲金芽胞桿菌特徵(例如於網站lifesci.sussex.ac.uk,2006列舉的Bt毒素)、非Bt昆蟲抗性特徵及前述HT特徵中之任一者或全部。經由IR特徵控制多種害蟲問題的能力乃有價值的商業產品構想。但若莠草控制及昆蟲控制彼此獨立，則此種產品構想的方便性有限。
dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33單獨或與一或多個額外HT特徵堆疊，係與一或多個額外輸入特徵(例如昆蟲抗性、真菌抗性或壓力抗性等)(參考www.isb.vt.edu)，透過習知育種或聯合作為新穎轉形事件堆疊。IR特徵係與dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33堆疊。當獲得IR特徵的編碼序列時，表現元體(例如啟動子、內含子、3’UTR等)經添加，IR特徵係與dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33透過重組DNA方法分子堆疊。
IR特徵包括：Cry1F(美國專利案第5,126,133；5,188,960；5,691,308；6,096,708；6,573,240；及6,737,273號)、Cry1A(c)(美國專利案第6,114,138；5,710,020；6,251,656；及6,229,004號)、呈與dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33的三聯體堆疊Cry1F及Cry1A(c)、Cry34Ab(1)(美國專利案第7,323,556；7,897,342；7,888,495；7,875,430；7,932,033；7,956,246；6,340,593號)、Cry35 Ab(1)(美國專利案第6,340,593；7,323,556；7,897,342；7,888,495； 7,875,430；7,932,033；7,956,246號)，及/或呈與dgt-28、dgt-31、dgt-32及/或dgt-33的三聯體堆疊的Cry35Ab(1)及Cry34Ab(1)。
好處包括由dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33提供莠草控制的改良，述於先前實例，與管理昆蟲害蟲及/或其它農藝壓力的能力有關。包含此等特徵與dgt-28、dgt-31、dgt-32及/或dgt-33堆疊的植物提供改良作物品質之完整農藝封裝體具有彈性及有效地控制任何數目的農藝問題的能力。組合IR及HT特徵的應用於大部分農藝及園藝/觀賞作物及森林。
dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33與由任何數目的Bt或非Bt IR基因提供的相當的除草劑耐受性及昆蟲抗性的組合可施用至此處列舉的作物物種。使用此處列舉的多種商業除草劑於此等作物藉由dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33轉形及與相對應HT特徵或IR特徵藉習知育種或基因改造堆疊而變成可能。具有此等化學之代表性除草劑的特定施用率係由在CPR(作物保護參考)書中編譯的或類似編譯的除草劑標籤、線上編譯標籤(例如cdms.net/manuf/manuf.asp)或任何商業或學術作物保護指南諸如Agriliance(2005)作物保護指南決定。
實例16：於任何作物中DGT特徵與AAD特徵堆疊
藉由堆疊dgt特徵與aad特徵(例如aad-1述於美國專利案第7,838,733號；或aad-12述於PCT國際專利公告案第2007/053482 A2號)，經由習知育種或聯合作為新穎轉形事 件，改良莠草控制效率、彈性及管理莠草移位及除草劑抗性發展的能力。
具有aad-1的轉形作物允許種植者選擇性施用芳氧基烷酸酯除草劑於單子葉作物。此種單子葉作物將具有較高的苯氧基植物生長素安全性邊際。此外，苯氧基植物生長素選擇性施用至以aad-1轉形的雙子葉作物。具有aad-12的轉形作物允許種植者選擇性施用吡啶基氧基植物生長素及芳氧基烷酸酯除草劑於雙子葉作物來控制莠草物種。藉由堆疊dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33與aad-1或aad-12特徵，種植者被提供較寬廣的管理莠草之除草劑範圍。此外使用除草劑組合結果導致更有彈性地管理莠草物種的內部的除草劑抗性。
針對植物提供下列莠草控制選項，其中dgt特徵及aad特徵係於任何單子葉及雙子葉作物堆疊。
A.嘉磷賽係以標準萌後施用率(420至2160 g ae/ha，例如560至1120 g ae/ha)用於大部分青草及闊葉莠草物種的控制。dgt特徵可於此等嘉磷賽施用率提供耐受性。為了控制嘉磷賽抗性闊葉莠草例如小蓬草(Conyza canadensis)或特性上難以使用嘉磷賽控制的莠草(例如鴨跖草屬(Commelina spp.)，循序施用、槽混合、或呈與嘉磷賽的預拌劑施用280-2240 g ae/ha(例如560-1120 g ae/ha)2,4-D來提供額外控制。aad-1及aad-12二者可對2,4-D提供耐受性。此外，aad-12提供對吡啶基氧基植物生長素除草劑諸如崔克皮爾(triclopyr)及福洛喜皮爾(fluroxypyr)的耐受性。吡 啶基氧基植物生長素除草劑係施用來控制抗嘉磷賽闊葉莠草例如小蓬草及鴨跖草。至於崔克皮爾，施用率典型為70-1120 g ae/ha，例如140-420 g ae/ha。至於福洛喜皮爾，施用率典型為35-560 g ae/ha例如70-280 g ae/ha。
B.嘉磷賽係以標準萌後施用率(420至2160 g ae/ha，例如560至1120 g ae/ha)施用以控制大部分青草及闊葉莠草物種。為了控制抗嘉磷賽青草物種例如黑麥草(Lolium rigidum)或牛筋草(Eleusine indica)，循序施用、槽混合或作為與嘉磷賽的預拌劑施用10-200 g ae/ha(例如20-100 g ae/ha)葵茲洛佛而提供有效控制。aad-1提供對葵茲洛佛的耐受性。於作物物種內aad-1組合dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33的堆疊，結果導致作物對前述除草劑具有耐受性。
C.嘉磷賽可有效控制闊葉莠草物種以外的青草物種。Aad-1與dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33堆疊特徵允許嘉磷賽(105-840 g ae/ha，例如210-420 g ae/ha)的有效青草施用率。然後循序施用、槽混合或呈與青草有效嘉磷賽施用率的預拌劑施用2,4-D(於280-2240 g ae/ha，例如560-1120 g ae/ha)來提供所需闊葉莠草控制。AOPP莠草例如葵茲洛佛於10-200 g ae/ha(例如20-100 g ae/ha及20-35 g ae/ha)用於莠草的更穩健控制及/或延遲抗嘉磷賽青草的出現。嘉磷賽的低施用率也提供若干好處給闊葉莠草控制；但主要控制係來自於2,4-D。
D.同理，aad-12及dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33堆疊特徵允許除草有效嘉磷賽施用率的施用(105-840 g ae/ha，例如210-420 g ae/ha)。然後2,4-D(於280-2240 g ae/ha，例如560-1120 g ae/ha)循序施用、槽混合、或與除草有效嘉磷賽施用率呈預拌劑施用而提供闊葉莠草控制。以前述施用率使用的崔克皮爾及福洛喜皮爾也為治療計畫中可接受的成分。嘉磷賽低施用率也提供若干好處給闊葉莠草控制；但主要控制係來自於2,4-D、崔克皮爾或福洛喜皮爾。
一或多種商業芳氧基植物生長素除草劑單獨使用或組合使用(循序或分開使用)可藉助於aad-12轉形入作物。同理，一或多種商業苯氧基植物生長素除草劑單獨使用或組合(循序或分開)一或多種商業AOPP除草劑的使用可藉助於aad-1。此等特徵中之任一者與dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33堆疊允許更穩健的管理莠草物種。此等化學之其它代表性除草劑的特定施用係由除草劑標籤偶合CPR(作物保護參考)簿冊或類似彙編、線上彙編標籤(例如cdms.net/manuf/manuf.asp)、或任何其它商業或學術作物保護指南諸如得自Agriliance的作物保護指南(2005)。
實例17：任何作物中DGT特徵堆疊AHAS特徵
編碼咪唑啉酮除草劑耐受性的特徵(AHAS)目前存在於多種北美栽種的作物包括但非限於玉米、稻、向日葵、及小麥。額外咪唑啉酮耐受性作物(例如玉米及甜菜)正在發展中。許多咪唑啉酮除草劑(例如伊馬澤摩(imazamox)、伊馬沙珀(imazethapyr)、伊馬澤昆(imazaquin)、及伊馬澤匹(imazapic))目前選擇性用於各種習知作物。伊馬沙珀、伊馬澤摩及非選擇性伊馬澤珀(imazapyr) 已經透過咪唑啉酮耐受性特徵例如AHAS的協助。今日咪唑啉酮耐受性HTC具有非基因轉殖的優點。此種化學類別也具有顯著土壤殘留活性，如此能夠提供超越施用時間的莠草控制，而不似以嘉磷賽或草胺膦為主的系統。但藉咪唑啉酮除草劑控制的莠草範圍不如嘉磷賽寬廣(Agriliance，2003)。此外，咪唑啉酮除草劑具有許多莠草已經發展出抗性(Heap I(2004)。國際除草劑抗性莠草研究，得自www.weedscience.com)的作用模式(乙醯乳酸合成酶ALS之抑制)。
dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33係透過習知育種或聯合作為新穎轉形事件而與咪唑啉酮耐受性特徵堆疊，改良莠草控制效率、彈性、及管理莠草移位及莠草抗性發展的能力。
針對植物提供下列莠草控制選項，其中dgt特徵及咪唑啉酮耐受性特徵係堆疊於任何單子葉或雙子葉作物物種：A.伊馬沙珀係以標準萌後施用率(35至280 g ae/ha，例如70-140 g ae/ha)用於許多青草及闊葉莠草物種的控制。
i)ALS抑制劑耐受性闊葉莠草例如莧(Amaranthus rudis)、葉豚草(Ambrosia trifida)、藜(Chenopodium album)(包括Heap，2004)係藉槽混合嘉磷賽以420至2160 g ae/ha例如560至1120 g ae/ha控制。
ii)本質上對咪唑啉酮除草劑更具耐受性的闊葉物種例 如蕃薯屬(Ipomoea spp.)係藉槽混合嘉磷賽以420至2160 g ae/ha，例如560至1120 g ae/ha控制。
iii)ALS抑制劑抗性青草莠草例如強生草(Sorghum halepense)及黑麥草屬(Lolium spp.)係藉槽混合嘉磷賽以420至2160 g ae/ha例如560至1120 g ae/ha控制。
iv)本質上耐受性青草莠草(例如冰草(Agropyron repens))係藉槽混合嘉磷賽以420至2160 g ae/ha例如560至1120 g ae/ha控制。
單獨或以多重組合使用各種商業咪唑啉酮除草劑或嘉磷賽除草劑中之任一者係由使用dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33進行dgt-28轉形協助，且藉習知育種或基因工程而與任何咪唑啉酮耐受性特徵堆疊。此等化學之代表性其它除草劑的特定施用率係由彙編於CPR(作物保護參考)簿冊或類似彙編、線上彙編標籤(例如cdms.net/manuf/manuf.asp)或任何商業或學術作物保護指南諸如得自Agriliance(2005)之作物保護指南決定。
實例18：大豆轉形
含有穩定整合dgt-28轉移基因的基因轉殖大豆(Glycine max)係經由大豆子葉節點外植體的透過農桿菌媒介的轉形產生。攜帶含功能性dgt-28之二元載體的已解除武裝的農桿菌種系用以啟動轉形。
農桿菌媒介的轉形係使用Zeng等人之經修改的半子葉節點程序進行(Zeng P.、Vadnais D.A.、Zhang Z.、Polacco J.C.(2004)，植物細胞Rep.，22(7)：478-482)。簡言 之，大豆種子(變種馬弗迪克(Maverick))在基礎培養基上發芽，分離子葉節點且以農桿菌感染。嫩枝啟動、嫩枝延長、及發根培養基補充希福塔贊(cefotaxime)、提曼亭(timentin)及萬古黴素(vancomycin)用以去除農桿菌。採用透過除草劑的選擇來抑制非轉形嫩枝的生長。經轉形的嫩枝移轉至發根培養基用以根發育，及然後轉移至土壤混合物用於小苗的水土適應。
選定之小苗的末端小葉局部使用除草劑處理(葉塗布技術)來篩選推定的轉形體。篩選出的小苗轉移至溫室，允許其水土適應，然後葉使用除草劑塗布來重新驗證耐受性。此等推定的轉形T0植物經取樣，使用分子分析來證實除草劑可選擇標記，及dgt-28轉移基因的存在。允許T0植物於溫室內自我授精來製造T1種子。
第二大豆轉形方法可用以製造額外基因轉殖大豆植物。攜帶含有功能性dgt-28的二元載體之解除武裝的農桿菌種系用以啟動轉形。
使用Paz等人經修改的半種子程序進行農桿菌媒介的轉形(Paz M.、Martinez J.、Kalvig A.、Fonger T.、及Wang K.(2005)植物細胞Rep.、25：206-213)。簡言之，成熟大豆種子使用氯氣消毒隔夜及吸收無菌水20小時，隨後進行農桿菌媒介的植物轉形。種子沿種臍縱切切成對半來分開種子及去除種皮。切除胚軸及從子葉節點去除任何軸向嫩枝及芽。所得半種子外植體感染農桿菌。嫩枝啟動、嫩枝延長、及發根培養基補充希福塔贊、提曼亭及萬古黴素 用以去除農桿菌。採用除草劑選擇來抑制非轉形嫩枝的生長。經轉形的嫩枝轉移至發根培養基用於嫩枝發育，然後轉移至土壤混合物用於小苗的水土適應。
推定轉形T0植物經取樣，使用分子分析來證實可選擇標記及dgt-28轉移基因的存在。若干事件被識別為含有轉移基因。此等T0植物前進接受進一步分析且允許於溫室內自我授精來產生T1種子。
dgt-28遺傳至T1世代的證實。DGT-28蛋白質遺傳至T1世代之遺傳性係以兩種方式中之一者評比。第一方法包括栽種T1種子至美崔混合培養基，於第一3-葉生長期施用411 g ae/ha伊格奈特280 SL於發芽植物上。第二方法包含使用滾珠軸承及高通量組織研磨機(genogrinder)均化種子共重複8次。然後使用ELISA長條測試檢測PAT蛋白質來檢測遺傳事件作為在與dgt-28相同質體上的可選擇標記。針對任一種方法若單一植物對草胺膦具有耐受性或使用PAT ELISA試片測試檢測，則該事件證實具有遺傳至T1世代的遺傳性。
如前述共篩選五個組成體的遺傳性。質體含有dgt-28鏈接TraP4、TraP8及TraP23。跨組成體之事件證實PAT：：DGT-28蛋白質至T1世代具有68%遺傳性。
於dgt-28轉形T1大豆之萌後除草劑耐受性。藉前述篩檢方法證實為可遺傳的得自T1事件的種子於溫室條件下種植於美崔混合培養基。植物生長至第一三小葉完全展開，使用411 g ae/ha伊格奈特280 SL處理用以如前文描述選擇pat基因。得自各個事件的抗性植物被給予獨特識別符及 取樣進行dgt-28基因的接合子形式分析。接合子形式資料用以指定2半接合子及2同型接合子重複本給各個嘉磷賽施用率，當存在有足夠植物時允許每個處理組共有4個重複本。此等植物對野生型矮小哈瓦那菸草做比較。全部植物使用設定於187 L/ha的軌道噴灑器噴灑。植物被噴灑560-4480 g ae/ha杜蘭格二甲基胺鹽(DMA)之範圍。全部施用皆係於水中調配添加2% w/v硫酸銨(AMS)。處理後7日及14日評估植物。就總體目測矮短、黃化、及壞死植物被指定傷害評級。分開T1世代，預期某些可變反應係由於接合子形式的差異。
於T2世代對升高嘉磷賽施用率之dgt-28的保護。每個組成體於2至5 dgt-28 T2細胞系組成45植物子代測試。同型接合子細胞系係基於在前一世代完成的接合子形式分析做選擇。種子係如前述種植。然後植物噴灑411 g ae/ha伊格奈特280 SL用以如前述選擇pat可選擇標記。3 DAT後，計算耐受性及敏感性植物數目。
針對含TraP4鏈接dgt-28的組成體(pDAB107543 及pDAB107548)，所測試的12細胞系中有9個細胞系不分離，藉此證實T2世代的同型細胞系。含TraP8鏈接dgt-28之細胞系(pDAB107545)證實四個細胞系中有二者不含分離株，驗證於大豆孟德爾遺傳性至少通過DGT-28兩代。組織樣本取自抗性植物，DGT-28蛋白質藉標準ELISA方法定量。資料證實32.8-107.5奈克/平方厘米之平均DGT-28蛋白質範圍用於非分離T2細胞系測試。得自組成體pDAB107553(TraP23：：dgt-28)的細胞系先前未使用草胺膦選擇，嘉磷賽的劑量反應用作為測試均質度及對升高嘉磷賽施用率的耐受性二者。得自組成體pDAB107553之細胞系的重複本對560-4480 g ae/ha範圍的嘉磷賽施用率具有耐受性，因此證實為均質族群且可遺傳至少兩代。
560-4480 g ae/ha嘉磷賽之杜蘭格DMA施用率範圍係施用至如前述2至3株三葉期大豆。14 DAT目測傷害資料證實於T1世代驗證的耐受性結果。
實例19：以dgt-28轉形稻
於一個方法實例中，含有穩定整合dgt-28轉移基因的基因轉殖水稻(Oryza sativa)係透過以殺菌稻米種子的 農桿菌媒介轉形而產生。使用攜帶含功能性dgt-28的二元載體之解除武裝的農桿菌種系來啟動轉形。
培養基使用1 M KOH調整至pH 5.8，及使用2.5 g/l植物凝膠(Phytagel)(希格瑪亞利需，密蘇里州聖路易)固化。胚產生性胼胝體係於含30毫升半固體培養基的100x20毫米培養皿內培養。稻秧於馬貞塔(MAGENTA)箱內50毫升培養基上生長。細胞懸浮液維持於含35毫升液體培養基的125毫升錐形瓶內及以125 rpm旋轉。胚產生性培養的誘導及維持係於暗處於25-26℃進行，植物再生及全株植物培養係於照明室內以16小時光照週期進行(Zhang等人，1996)。
胚產生性胼胝體的誘導及培養係於前述改性NB基礎培養基上進行(Li等人，1993)，其中該培養基經調整而含有500毫克/升麩胺。啟動懸浮液培養及維持於含括30克/升蔗糖替代麥芽糖的SZ液體培養基(Zhang等人，1998)。滲透壓培養基(NBO)包含NB培養基添加各0.256 M甘露糖醇及山梨糖醇。於補充有適當除草劑選擇劑的NB培養基上選擇除草劑抗性胼胝體3至4週。再生前期係於培養基(PRH50)進行一週，培養基包含NB培養基含有2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、1毫克/升α-萘乙酸(NAA)、5毫克/升離層酸(ABA)及選擇性除草劑。接著稻秧再生於包含NB培養基含有2,4-D、0.5毫克/升NAA、及選擇性除草劑的再生培養基(RNH50)上培養直到推定的基因轉殖嫩枝再生。嫩枝移轉至發根培養基含有半強度Murashige and Skoog基礎鹽及Gamborg’s B5維生素補充1%蔗糖及選擇性除草劑。
日本水稻變種台北309的成熟乾燥種子如Zhang等人1996所述滅菌。藉培養無菌成熟稻種子於NB培養基上於暗處而誘導胚發生組織。從胚盤去除直徑約1毫米的一次胼胝體且用以啟動於SZ液體培養基的細胞懸浮液。然後懸浮液如Zhang 1996所述維持。先前次培養後3至5日，從液體培養移出懸浮液衍生的胚發生組織，置於NBO滲透壓培養基上來於培養皿形成約2.5厘米之圓，轟炸前培養4小時。轟炸後16至20小時，組織從NBO培養基移轉至NBH50選擇培養基上，確保轟炸表面面向上，及於暗處培養14至17日。然後新形成的胼胝體從原先轟炸的外質體分離，置於相同培養基上附近。又經8至12日後，目測識別相對緊密的不透明胼胝體，於暗處移轉至PRH50前再生培養基達7天。生長的胼胝體變成更緊密及不透明，然後於16小時亮週期於RNH50再生培養基上次培養14至21日。再生嫩枝移轉至含1/2 MSH50培養基的馬貞塔箱。從單一外質體再生的多個植株被視為小苗，作為一個獨立植物系處理。若植物產生粗白根且在1/2 MSH50培養基上激烈生長，則植物評比為dgt-28基因為陽性。一旦小苗長到馬貞塔箱的頂部，則移轉至6厘米盆內土壤於100%濕度下經歷1週，然後移至生長隔間，於30℃ 14小時光照週期及21℃暗週期經歷2至3週，隨後移植入溫室的13厘米盆內。收集種子，於37℃乾燥1週，隨後儲存於4℃。
稻的T0分析。透過農桿菌轉形獲得的移植稻轉形體移植入培養基內及水土適應適應溫室條件。全部植物取樣進行dgt-28之PCR檢測，結果證實22個針對 pDAB110827(TraP8：：dgt-28)之PCR陽性事件及至少16個針對pDAB110828(TraP23：：dgt-28)之PCR陽性事件。PCR陽性事件之dgt-28的南方分析驗證二組成體之簡單(1-2複本)事件。經選擇的T0事件之蛋白質表現驗證從低檢測濃度至130奈克/平方厘米範圍之DGT-28蛋白質表現範圍。得自組成體pDAB110828之經選擇的T0事件如前述使用2240 g ae/ha杜蘭格DMA處理及於處理後7日及14日評估。資料證實對嘉磷賽施用率具有穩健耐受性。允許全部PCR陽性植物產生T1種子用於進一步決定特徵。
於稻之dgt-28遺傳性。100個植物子代測試係在得自含葉綠體轉運肽TraP8的組成體pDAB110827之四個dgt-28 T1細胞系上進行。種子種植於填充培養基的盆內。然後全部植物噴灑560 g ae/ha杜蘭格DMA用於如前述選擇dgt-28。7 DAT後，計算抗性及耐受性植物數目。針對各個組成體測試的四個細胞系中有二系分離為單一基因座顯性孟德爾特徵(3R：1S)，如χ平方分析決定。於多個物種中dgt-28為可遺傳的嘉磷賽抗性基因。
於dgt-28轉形T1稻中萌後除草劑耐受性。用於子代測試得自各事件的T1抗性植物被給定獨特識別符及取樣用於dgt-28基因的接合子型式分析。接合子資料用來將2半接合子及2同型接合子重複本分派至各個嘉磷賽施用率允許每個處理組共有4個重複本。此等植物對野生型崎達凱(kitaake)稻做比較。全部植物使用軌道噴灑器設定於187 L/ha噴灑。植物噴灑560-2240 g ae/ha杜蘭格DMA之範圍。 全部施用皆配方於水添加2% w/v硫酸銨(AMS)。植物係於處理後7日及14日評估。植物係就總目測矮短、黃化及壞死進行傷害評級。T1世代為分離，故某些可變反應預期係由於接合子形式差異之故。
噴灑結果驗證於7 DAT(處理後日數)檢測得對嘉磷賽升高施用率的植物傷害最低(資料未顯示)。
針對由pDAB110827測試的全部四個T1種系的重 複本評估DGT-28的蛋白質檢測。資料證實DGT-28平均蛋白質針對半接合子及同型接合子重複本分別係於20-82奈克/平方厘米及21-209奈克/平方厘米之範圍。此等結果證實施用560 g ae/ha嘉磷賽用以選擇對T1世代有穩定蛋白質表現，dgt-28稻耐受性高達2240 g ae/ha嘉磷賽。
實施例20：使用dgt-28轉形草坪草
於匍匐常綠草dgt-28轉移基因之根瘤農桿菌媒介的基因轉形係透過從種子(cv.Penn-A-4)起始的胚發生胼胝體達成。參考「根瘤農桿菌媒介草坪草(Agrostis stolonifera L)轉形效率」(Luo等人，2004)。
胼胝體細胞使用攜帶超二元載體的根瘤農桿菌感染，該載體含有藉單子葉特定啟動子驅動的除草劑抗性轉移基因(例如dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33)。總穩定轉形效率係於18%至45%。南方墨點及遺傳分析證實於匍匐常綠草內部的轉移基因整合及轉移基因於T1世代的正常傳遞及穩定表現。全部獨立轉形事件攜帶轉移基因的1至3個複本，大部分(60-65%)只含有單套轉移基因而無顯著重排。
成熟種子以砂紙去皮，表面於10%(v/v)克洛士(Clorox)漂白劑(6%次氯酸鈉)加0.2%(v/v)吐溫(Tween)20(聚山梨酸酯20)以激烈振搖90分鐘滅菌。於無菌蒸餾水中清洗五次後，種子置於胼胝體誘導介質上(MS基礎鹽及維生素，30 g/l蔗糖，500 mg/l酪蛋白水解產物、6.6 mg/l 3,6-二氯-鄰-茴香酸(麥草畏)，0.5 mg/l 6-苯甲基胺基嘌呤(BAP)及2 g/l植物凝膠。介質的pH調整至5.7隨後於120℃高壓蒸氣滅 菌20分鐘)。
含有經製備的種子外植體之培養平板維持於室溫於暗處6週。胚發生胼胝體經目測選擇及於新鮮胼胝體誘導培養基上於暗處於室溫次培養1週，然後進行共同培養。
於農桿菌媒介的感染前一日，胚胎發生胼胝體分割成1厘米至2厘米小塊，放置於含有100 μM亞托喜剛(acetosyringgone)之胼胝體誘導培養基上。含dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33轉移基因的一份10微升農桿菌懸浮液(OD=1.0於660奈米)然後施用至各塊胼胝體，接著於25℃於暗處共同培養3日。然後胼胝體轉移至胼胝體誘導培養基加125毫克/升希福塔贊及250毫克/升卡本西林上培養2週來抑制細菌生長。
基因轉殖植物的選擇係出現在胼胝體移動至含250毫克/升希福塔贊及除草劑的胼胝體誘導培養基。胼胝體材料維持於此培養基上8週，選擇次培養間隔3週。選擇程序係於暗處於室溫進行。
用於植物再生，除草劑抗性增殖胼胝體事件首先移動至補充希福塔贊及除草劑用於選擇的再生培養基(MS基礎培養基，30 g/l蔗糖，100 mg/l肌-肌糖醇，1 mg/l BAP及2 g/l植物凝膠)。此等培養基於室溫於暗處維持1週，然後移至亮處2至3週而發育嫩枝。
發育的嫩枝經分離及轉移至含除草劑及希福塔贊之不含激素再生培養基來促進根生長，同時維持選擇壓力及遏止任何其餘農桿菌細胞。具有明確發育根的小苗(3-5 週)然後移至土壤及於溫室或在田間生長。
基因轉殖植物維持於室外苗圃(3至6個月)直到12月冬至。然後春化植物移至溫室維持於25℃ 16/8小時光照週期且由非基因轉殖對照植物所環繞，該等植物以物理方式隔開基因轉殖植物與其它花粉來源。移回溫室後3至4週基因轉殖植物開始開花。此等植物與來自周圍對照植物的花粉雜交。從個別基因轉殖植物收集種子於土壤中於25℃發芽，T1植物於溫室內生長接受進一步分析。
其它青草根據所述方案使用dgt-28轉形，包括一年生早熟禾(Poa annua)、百喜草、常綠草、狗牙根、藍草、藍莖草、臂形草、雀麥草、褐頂常綠草(Agrostis capillaries)、水牛草、金黃草、地毯草、百足草、咀嚼牛毛草(Festuca rubra commutate)、蟹草、匍匐常綠草(Agrostis stolonifera)、有隆起髮草(Koeleria macrantha)、毛花雀稗、牛毛草、費斯托林(Festolium)、硬/綿羊牛毛草(Festuca ovina)、格蘭馬草、印第安草、強生草、畫眉草、混合草(馬、牧場等)、土生青草、鴨茅、多年生黑麥草(Lolium perenne)、小糠草、扁穗雀麥、一年生及多年生黑麥草、纖細匍匐紅牛毛草(Festuca rubra trichophylla)、光滑柄早熟禾(Poa pratensis)、聖奧古斯丁草、強匍匐紅狐草(Festuca rubra rubra)、蘇丹草、柳枝稷、高狐草(Festuca arundinacea)、簇生髮草(Deschampsia caespitosa)、草坪草、小麥草、及高麗草。
實施例21：以DGT特徵轉形蕓薹屬
賦與對嘉磷賽抗性的dgt-28、dgt-31、dgt-32或 dgt-33基因使用農桿菌媒介的轉形而轉形西洋油菜變種奈喜拉(Brassica napus var.Nexera)710。
西洋油菜種子使用10%商業漂白劑表現消毒10分鐘及使用無菌蒸餾水清洗。然後種子置於半濃度MS基礎培養基(Murashige及Skoog，1962)上及維持設定於25℃的生長計畫，及16小時亮/8小時暗的光照週期。
從5至7日齡秒切下胚莖節段(3-5毫米)及置於胼胝體誘導培養基K1D1(MS培養基含1毫克/升裂殖素(kinetin)及1毫克/升2,4-D)上經歷3日作為前培養。然後節段移轉至培養皿及使用含有包含dgt-28之組成體的根瘤農桿菌種系處理。根瘤農桿菌於振搖機上以150 rpm於暗處於28℃培養隔夜及隨後再度懸浮於培養基。
使用農桿菌處理胚莖節段30分鐘後，此等節段放回胼胝體誘導培養基內3日。於共同培養後，節段置於K1D1TC(含250毫克/升卡本西林及300毫克/升提曼亭(Timentin)的胼胝體誘導培養基)歷經一周時間復原。另外，節段直接置於選擇培養基K1D1H1(含除草劑的前述培養基)上。卡本西林及提曼亭為用來殺死農桿菌的抗生素。選擇因子許可轉形細胞的生長。
得自分離獨立事件的胼胝體樣本藉PCR測試。測試得dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33存在陽性的樣本經證實且前進至再生培養基。胼胝體化胚莖節段然後置於B3Z1H1(MS培養基，3毫克/升苯甲基胺基嘌呤，1毫克/升玉米素(Zeatin)，0.5 gm/l MES[2-(N-啉基)乙烷磺酸]，5 mg/l硝 酸銀，選擇性除草劑，卡本西林及提曼亭)嫩枝再生培養基上。嫩枝開始再生3週後，胚莖節段連同嫩枝轉移至B3Z1H3培養基(MS培養基，3毫克/升苯甲基胺基嘌呤，1毫克/升玉米素，0.5 gm/l MES[2-(N-啉基)乙烷磺酸]，5 mg/l硝酸銀，選擇性除草劑，卡本西林及提曼亭)上又經3週。
從胚莖節段切除嫩枝及移轉至嫩枝伸長培養基MESH10(MS，0.5 gm/l MES，選擇性除草劑，卡本西林，提曼亭)歷時2至4週。延長嫩枝在MSI.1(MS含0.1毫克/升吲哚丁酸)上誘導發根培養。一旦植物已經建立根系，植物移植入土壤。植物於康維隆(Conviron)中於控制的環境條件下水土適應1至2週隨後轉移至溫室。
轉型T0植物在溫室內自我授粉而獲得T1種子。T0植物及T1後代噴灑某個範圍的嘉磷賽除草劑濃度來建立由dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33基因的保護程度。
實例22：使用dgt-28轉型菸草
菸草(變種矮小哈瓦那)葉片使用含dgt-28轉移基因的根瘤農桿菌轉形。含有含dgt-28轉移基因的質體之單一菌落接種於含觀黴素(50微克/毫升)及鏈黴素(125微克/毫升)的4毫升YEP培養基內及於振搖器上以190 rpm於28℃培養隔夜。隨後4毫升種子培養接種於125毫升有檔板的錐形瓶內的25毫升相同培養基。此培養於28℃以190 rpm振搖培養直到達到約1.2 OD600。然後10毫升農桿菌懸浮液置於無菌60x20毫米培養皿內。
於含30克/升蔗糖的MS培養基(植物技術實驗室 (Phytotechnology Labs)，堪薩斯州修尼米森)於植物托盤(PhytaTrays)(希格瑪，密蘇里州聖路易)上無菌生長的植物獲得新鮮切下葉片(0.5平方厘米)置於10毫升農桿菌的隔夜培養上歷時數分鐘，在無菌濾紙上吸乾墨點然後置於添加1毫克/升吲哚乙酸及1毫克/升6-苯甲基胺基嘌呤的相同培養基上。3日後，葉片與含dgt-28轉移基因的農桿菌共同培養移轉至含5毫克/升巴斯塔(Basta)及250毫克/升希法塔贊(cephotaxime)的相同培養基。
3週後，個別T0小苗移轉至含10毫克/升巴斯塔及250毫克/升希法塔贊的MS培養基又經3週，隨後移植至土壤及轉移至溫室。選出的T0植物(使用前述分子分析方案識別)允許其自我授粉及當完全乾燥後從包囊中收集種子。T1小苗篩選接合子型式及通報子基因表現(容後詳述)及識別選出含有dgt-28轉移基因的植物。
植物轉移至溫室，藉著從根部洗滌瓊脂，移植入13.75厘米方形盆內的土壤，盆放置於吉普克(Ziploc)袋(SC嬌生公司(SC Johnson & Son,Inc.))，將自來水置於袋底部，及放置於間接光線下於30℃溫室歷時1週。3至7日後開啟袋；植物經滅菌及允許於開口袋內生長直到植物於溫室中水土適應，此時去除袋。植物於正常溫暖溫室條件下生長(27℃白晝，24℃夜晚，16小時白晝，最小天然+補充光=1200 μE/m2s1)。
於增殖之前，T0植物取樣用於DNA分析來藉即時PCR決定插子dgt-28套數。新鮮組織置於試管內及於4℃凍 乾2日。組織完全乾燥後，鎢珠(法里奈(Valenite))置於試管內，樣本使用開爾可(Kelco)球磨機接受1分鐘乾燥研磨。然後接著為標準迪尼希(DNeasy)DNA分離程序(葵亞真，迪尼希69109)。然後整份萃取出的DNA使用皮可綠(Pico Green)(分子探子(Molecular Probes)P7589)染色，及使用已知標準於螢光計(百歐泰(BioTek))內讀取來獲得濃度，單位為奈克/微升。共使用100奈克總DNA作為樣板。於9700基因安(Geneamp)熱循環器(應用生物系統公司)進行PCR反應，樣本接受94℃ 3分鐘，及94℃ 30秒，64℃ 30秒，及72℃ 1分45秒，接著72℃ 10分鐘共35週期。PCR產物於1%瓊脂糖凝膠上使用EtBr染色接受電泳分析及藉南方墨點證實。
得自含不同葉綠體轉運肽序列(TraP4、TraP8及TraP23)的三個組成體之5至9個具有1至3套dgt-28基因的PCR陽性事件經再生且移至溫室。
全部PCR陽性植物皆藉標準ELISA取樣用於DGT-28蛋白質的定量。DGT-28蛋白質係於全部PCR陽性植物檢測及注意以dgt-28套數的增加觀察蛋白質濃度的增高趨勢。
菸草中aad-12(v1)之遺傳性。100植物子代測試係在每個組成體五個dgt-28 T1系進行。組成體含有下列葉綠體轉運肽序列中之一者：TraP4、TraP8或TraP23。種子經分層、播種、及移植，採用的程序類似前文舉例說明的擬南芥程序，但在移植之前並無任何植物藉初期選擇去除。然後全部植物噴灑280 g ae/ha伊格奈特280 SL如前述選擇pat 可選擇標記。3 DAT後，計算抗性植物及敏感性植物數目。
針對各個組成體測試的五系中有四系分離為單一基因座，藉χ平方分析決定顯性孟德爾特徵(3R：1S)。dgt-28為多個物種中具有遺傳性的嘉磷賽抗性基因。
於dgt-28轉形T1菸草中萌後除草劑耐受性。用於子代測試的得自各事件的T1抗性植物給予獨特識別符及取樣接受dgt-28基因的接合子形式分析。接合子形式資料用來分配2半接合子及2同型接合子重複本給各種嘉磷賽施用率許可每個處理組共有四個重複本。此等植物與野生型矮小哈瓦那菸草做比較。全部植物皆使用設定於187 L/ha的軌道噴灑器噴灑。植物噴灑560-4480 g ae/ha杜蘭格DMA之範圍。全部施用皆係調配於水中添加2% w/v硫酸銨(AMS)。處理後7日及14日評估植物。植物就總體目測發育不良、黃化及壞死被指定傷害評級。分離T1世代，由於接合子形式的差異預期有若干可變反應。
噴灑結果證實於7 DAT(處理後日數)檢測得對升高的嘉磷賽施用率植物傷害極小(資料未顯示)。14 DAT後，目測傷害資料證實含TraP4組成體的單套事件比較得自組成體TraP8及TraP23的單套事件傷害增加。表27。
此等結果證實dgt-28之耐受性高達4480 g ae/ha嘉磷賽，以及由鏈接至dgt-28基因的葉綠體轉運肽序列提供的耐受性差異。
於T2世代對升高嘉磷賽施用率的dgt-28保護。25 植物子代試驗係對每個組成體2至3個dgt-28之T2系進行。基於在前一個世代完成的接合子形式分析選出同型接合子系。種子如前述分層、播種、及移植。然後全部種子如前述噴灑280 g ae/ha伊格奈特280 SL用以選擇pat可選擇標記。3 DAT後，計算抗性植物及敏感性植物。針對全部組成體測試的全部細胞系皆不孤立，因而證實於T2世代的同質系，證實於菸草孟德爾遺傳性至少通過兩個dgt-28世代。
420-3360 g ae/ha嘉磷賽的杜蘭格DMA範圍的施用率如前述施用至2至3葉期菸草。14 DAT目測傷害資料證實於T1世代的耐受性結果。得自含TraP4組成體的二套種系之葉結果具有與單套TraP8及TraP23種系的耐受性相似(資料未顯示)。
資料證實對高達3360 g ae/ha嘉磷賽dgt-28菸草的穩健耐受性比較未經轉形對照組可通過兩個世代。
在施用嘉磷賽前，得自各事件的選用植物取樣接受藉標準DGT-28 ELISA分析DGT-28蛋白質。資料驗證橫跨組成體的簡單(1-2套)種系的DGT-28平均蛋白質表現係於72.8-114.5 ng/cm2之範圍。資料驗證dgt-28為轉形菸草T2世代的表現蛋白質，耐受性資料證實功能性DGT-28蛋白質。
於菸草(變種矮小哈瓦那)dgt-28的堆疊來增高除草劑有效範圍。同型接合子dgt-28(pDAB107543及pDAB107545)及aad-12 v1(pDAB3278)植物(參考PCT/US2006/042133有關後者，全文以引用方式併入此處) 皆往復交叉及收集F1種子。來自各基因兩次往復交叉的F1種子經分層及處理，各交叉有6顆代表性種子使用1120 g ae/ha嘉磷賽(選擇dgt-28基因)、1120 g ae/ha 2,4-D(選擇aad-12基因)，或兩種除草劑的槽混合物如前述處理。植物於14 DAT分級。噴灑結果顯示於表29。
結果證實dgt-28與aad-12(v1)成功堆疊，如此增加可施用至關注作物的除草劑有效範圍(嘉磷賽+苯氧基乙酸分別用於dgt-28及aad-12)。於作物生產中，其中存在有難以控制的闊葉莠草或抗性莠草生物型，該堆疊可用作為莠草控制及保護關注作物的手段。額外輸入或輸出特徵也可與dgt-28基因堆疊。
實例23：於小麥對嘉磷賽抗性
編碼DGT-28之二元載體的製造。使用熟諳技藝人士一般已知的技巧及技術設計及組裝含DGT-28表現及PAT選擇卡匣的二元載體。各個DGT-28表現卡匣含有啟動子、5’非轉譯區及得自玉米的泛肽素(Ubi)基因的內含子(Toki等人植物生理學1992，100 1503-07)，接著為編碼序列，該編碼序列係由四個轉運肽(TraP4、TraP8、TraP23或TraP5)融合至5-烯醇丙酮醯基莽草酸-3-磷酸合成酶基因 (DGT-28)之合成版本的5’端中之一者組成，已經針對於植物表現進行密碼子的最佳化。DGT-28表現卡匣係以3’非轉譯區(UTR)為端基包含得自玉米的脂肪分解酶基因(Vp1)的轉錄終結子及聚腺苷酸化位置(Paek等人，Mol Cells 1998 30；8(3)336-42)。PAT選擇卡匣包含啟動子、5’非轉譯區及得自水稻(Oryza sativa)之肌動蛋白(Act1)基因的內含子(McElroy等人，植物細胞1990 2(2)163-171)，接著為分離自綠色產色鏈絲菌(Streptomyces viridochromogenes)的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶(PAT)基因的合成版本，已經針對於植物表現進行密碼子最佳化。PAT基因包含一種蛋白質提供對麩胺合成酶抑制劑包含草胺膦(phophinothricin)、草胺膦(glufosinate)及百拉弗斯(bialaphos)的抗性之蛋白質(Wohlleben等人，基因1988，70(1)，25-37)。選擇卡匣以3’UTR終結，包含得自花椰菜嵌紋病毒(CaMV)35s基因之轉錄終結子及聚腺苷酸化位置(Chenault等人，植物生理學1993 101(4)，1395-1396)。
選擇卡匣係由商業基因合成供應商(基因亞特，生命技術公司)合成及選殖入閘道致能二元載體。DGT-28表現卡匣次選殖入pDONR221。所得ENTRY純株用於使用編碼草胺膦乙醯基轉移酶(PAT)表現卡匣的閘道致能二元載體之LR選殖酶(Clonase)II(英維崔因，生命技術)反應。 全部組裝植體的群落使用得自新英格蘭生物實驗室(NEB；馬里蘭州伊普威屈)及波美佳(Promega)(波美佳公司，威斯康辛州)的限剪核酸內切酶藉限剪消化已純化的 DNA初步篩檢。植體DNA製劑係使用葵亞波旋轉迷你製備套組(QIAprep Spin Miniprep Kit)(葵亞真，希爾敦(Hilden))或純產率質體最大製備系統(Pure Yield Plasmid Maxiprep System)(波美佳公司，威斯康辛州)遵照供應商的指示進行。選出純株的質體DNA使用ABI山哲定序及大染料終結子(ABI Sanger Sequencing and Big Dye Terminator)v3.1循環定序方案定序(應用生物系統公司，生命技術)。序列資料使用SEQUENCHER軟體(基因密碼公司(Gene Codes Corporation)，密希根州安哈伯)組裝及分析。
所得四個二元體純株：pDAS000122(TraP4-DGT28)、pDAS000123(TraP8-DGT28)、pDAS000124(TraP23-DGT28)、及pDAS000125(TraP5-DGT28)各自轉形入根瘤農桿菌種系EHA105。
具有dgt-28表現組成體的基因轉殖小麥事件的製造。表現四個DGT-28表現組成體中之一者的基因轉殖小麥植物係遵照類似Wu等人基因轉殖研究2008，17：425-436的方案，使用施體小麥細胞系Bobwhite MPB26RH藉農桿菌媒介的轉形而產生。推定T0基因轉殖事件係針對草胺膦(PPT)耐受性選擇，表現型由PAT可選擇標記提供且轉移至土壤。T0植物在溫室的限制條件下生長及產生T1種子。整體而言，針對各種DGT-28表現組成體產生約45個獨立T0事件。
於T0小麥dgt-28小麥事件的嘉磷賽抗性。允許T0事件在溫室內水土適應及生長至從年輪已經長出2至4片新的正常外觀葉(亦即植物已經從組織培養變換成溫室生長 條件)。植物於溫室內於12小時補充照明於25℃生長至成熟。於前述相同條件下生長的T1植物上完成嘉磷賽耐受性的初始篩檢及塔克曼(Taqman)分析。資料允許決定進一步特徵化遺傳性T1事件。六個低套(1-2套)及兩個多套T1事件於溫室條件下移植及生長至3葉期。T1植物噴灑420-3360 g ae/ha範圍的嘉磷賽商用配方(杜蘭格DMA)，對非轉形小麥種系產生顯著傷害。添加2% w/v硫酸銨含括於施用。致命劑量係定義為對鮑伯白(Bob White)MPB26RH非轉形對照組造成大於75%傷害的施用率。施用除草劑。
本實例中，嘉磷賽施用係用以決定T1世代中dgt-28基因的孤立以及驗證對增高濃度嘉磷賽的耐受性。植物反應係以處理後21日(DAT)目測傷害等級表示。資料係以具有小於25%目測傷害(4)、25%-50%目測傷害(3)、50%-75%目測傷害(2)及大於75%傷害(1)的個別直方圖呈現。針對用於小麥轉形的各個組成體呈現算術平均及標準差。個別反應的評分範圍也指示於各個施用率及轉形的末欄。野生型非轉形小麥(變種鮑伯白MPB26RH)用作為嘉磷賽敏感性對照。於T1世代中，針對各事件可利用半接合子及同型接合子植物測試各個事件，因而含括於各嘉磷賽測試率。半接合子植物將含有同型接合子植物基因的一半劑量，因此預期於T1世代出現對嘉磷賽反應的變異。
T1 dgt-28小麥植物的結果驗證使用葉綠體轉運肽TraP4、TraP5、TraP8及TraP23於高達3360 g ae/ha的施用率可達成對嘉磷賽的耐受性。表30。資料為低套T1事件的 資料但代表各個組成體族群。
於21 DAT，計算抗性及敏感性植物數目來決定 藉χ平方分析分隔為單一基因座顯性孟德爾特徵(3R：1S)的種系百分比。表31。此等資料證實dgt-28在單子葉植物中可遺傳作為穩健嘉磷賽抗性基因。
編碼DGT-28之T-DNA整合之T0基因轉殖植物之分子驗證。基因體DNA係萃取自全部推定T0小麥植物的冷凍乾燥葉材。新鮮收穫葉組織於液態氮內簡短冷凍及於-40℃及133x10-3毫巴壓力下於雷康可冷凍基(Labconco Freezone)4.5(雷康可(Labconco)公司，密蘇里州堪薩斯市)冷凍乾燥24小時。凍乾材料遵照製造商的指示使用迪尼希植物DNA萃取迷你套件組(葵亞真)接受DNA萃取。
得自T0植物的DNA測試攜帶根瘤農桿菌種系的存在-不存在及編碼DGT-28之T-DNA整合套數。根瘤農桿菌的存在-不存在係使用雙塔克曼qPCR檢定分析進行來擴增內生性泛肽素基因(正向引子及反向引子及探子)：5’GCGAAGATCCAGGACAAGGA 3’(SEQ ID NO：85；正向引子)5’CTGCTTACCGGCAAAGATGAG 3’(SEQ ID NO：86；反向引子) 5’TTCCCCCGGACCAGCAGCGT 3’(SEQ ID NO：87；探子)得自小麥基因體，及virC得自pTiBo542：5’CCGACGAGAAAGACCAGCAA 3’(SEQ ID NO：88；正向引子)5’CTTAAGTTGTCGATCGGGACTGT 3’(SEQ ID NO：89；反向引子)5’TGAGCCTCTCGTCGCCGATCACAT 3’(SEQ ID NO：90；探子).
遵照Livak及Schmittgen(方法2001 25：402-8)之程序，使用雙重塔克曼qPCR檢定分析估計整合T-DNA套數。檢定分析擴增於六倍體小麥的D-基因體中內生性單套嘌呤吲哚啉-b(puroindoline-b)(Pinb)基因(Gautier等人，植物科學2000 153，81-91)：5’ATTTTCCATTCACTTGGCCC 3’(SEQ ID NO：91；正向引子)5’TGCTATCTGGCTCAGCTGC 3’(SEQ ID NO：92；反向引子)5’ATGGTGGAAGGGCGGTTGTGA 3’(SEQ ID NO：93；探子)及存在於T-DNA上的肌動蛋白(Act1)啟動子區：5’CTCCCGCGCACCGATCTG 3’(SEQ ID NO：94；正向引子)5’CCCGCCCCTCTCCTCTTTC 3’(SEQ ID NO：95；反向引子)5' AAGCCGCCTCTCGCCCACCCA 3’(SEQ ID NO：96；探子).
不從virC擴增產物及使用對內生性泛肽素及植物肌動蛋白啟動子的引子擴增正確產物的植物歸類為基因轉殖植物。依據Livak及Schmittgen(方法2001 25：402-8)估計得自2△△c(T)的整合T-DNA數目。總體而言，約95%全部T0植物具有整合的一套T-DNA。表32。
追蹤轉移基因遺傳性的PCR接合子形式檢定分析的發展。旁出於T-DNA整合位置的序列之識別方式係使用八種限剪核酸內切酶消化已純化的基因體DNA，接著接合特定雙股配接子至藉限剪核酸內切酶所產生的凸出部。配接子接合後，使用編碼DGT-28的T-DNA之3’或5’端之生物素化引子及各個配接子的引子進行PCR。PCR產物經捕捉及在安普爾固相可逆制動(Ampure Solid Phase Reversible Immobilization)(SPRI)珠粒(亞吉科特生科公司(Agencourt Bioscience Corporation)，貝克曼庫特公司(Beckman Coulter Company))上純化。進行巢套PCR，擴增產物係使用BigDye v3.1化學(應用生物系統公司)在ABI3730x1自動毛細管電泳平台上進行山哲排序。使用Sequencher軟體(基因密碼公司，密希根州安哈伯)進行序列分析用來產生(可能時)一同位序列。所得同位序列單倍體用作為BlastN查詢已組裝的基因體研究序列片段重疊群(contigs)有關小麥變種中國泉(www.wheatgenome.org)之經流動分選的染色體臂還決定其中已經出現T-DNA整合的染色體，及許可設計次基因體專一性引子用於PCR接合子形式檢定分析的發展。
針對各個基因轉殖事件發展兩個PCR檢定分析來在隨後的世代允許追蹤轉移基因遺傳。設計第一檢定分析(後文稱做出-出PCR)來橫跨T-DNA整合位置擴增。於本檢定分析中次基因體專一性擴增係使用開-關PCR達成，引子設計來定位倒數第二鹼基(含有硫代磷酸根鍵聯)於核苷酸序列變化區別標靶基因座與在小麥基因體其它位置的基因座之雙套 (部分同源及旁系同源二者)複本。第二檢定分析(後文稱作為進-出PCR)係設計來從T-DNA擴增入內生序列。本檢定分析利用得自出-出PCR檢定分析的引子，一個引子設計用於編碼DGT-28的T-DNA之3’或5’端。PCR引子設計成長18至27個核苷酸，具有60℃至65℃的熔點，最佳為63℃。出-出及進-出PCR檢定分析係以25微升反應體積進行，使用0.2 mM dNTP、1x融合(Phusion)PCR緩衝液(新英格蘭生物實驗室)、1.5 mM MgCl2、0.5單位熱始達(Hotstart)融合DNA聚合酶(新英格蘭生物實驗室)、25奈克純基因體DNA及0.4 μM各引子。PCR循環條件為98℃ 30秒然後(98℃ 10s、65℃ 20s、72℃ 60s)歷經40週期。基因轉殖植物的接合子形式係指定如表33所示。
T1基因轉殖植物之嘉磷賽耐受性的表現型評估。為了決定具有DGT-28表現組成體的基因轉殖事件是否具有嘉磷賽耐受性，衍生自個別事件的T1植物係在溫室限制條件下接受表現型評估。進行兩次表現型篩檢。於第一(初步)篩檢中，基因轉殖事件(對兩次表現型篩檢有足夠T1種子)評估草胺膦耐受性及嘉磷賽耐受性來證實DGT-28的表現，及建立在各事件間除草劑耐受性的排名順序。於第二(詳細)篩檢中，選定的基因轉殖事件評估於不同噴灑劑量的嘉磷賽耐受性來建立在事件內部及在DGT-28表現組成體間所賦與的除草劑耐受性程度。
每個選擇事件12顆T1種子及非轉形施體小麥種系鮑伯白MPB26RH三個重複本(各12顆種子)播種於85毫米盆內及在有良好澆水條件下於25℃使用補充光照提供12小時光照週期生長至2葉期。盆係以隨機方式放置來去除資料分析期間的環境影響。所篩檢的基因轉殖事件列舉於表34。於2葉期，12個非轉形施體小麥植物的全部T1植物及第一重複本係以420 g ai/ha的劑量噴灑草胺膦。4日後，目測檢查植物，使用捕捉表現型反應範圍的代表性植物來發展0至6的評分。表35。
試驗中的各植物然後相對於評分等級評分，評分者對植物的基因型為「盲目」來去除評分偏差。草胺膦評分後5日，全部T1植物及非轉形施體小麥植物的第一及第二重複本以420 g ai/ha之施用率噴灑嘉磷賽。其餘非轉形施體小麥種系的第三重複本(共12植物)未經噴灑。噴灑後7日、14日及21日目測檢查植物。捕捉表現型反應範圍的評分等級對各個時間點展開用來評分整個試驗。於各個時間點，有關植物表現型評分者為「盲目」。噴灑後7日的評分等級為0至7(表36)，及噴灑後14日及21日為1至4(表37)。針對各植物於嘉磷賽噴灑後14日也記錄植物長度、分蘗數目及型態學異常。具有延遲發芽或不良確立的植物從隨後分析中排除。
嘉磷賽反應分析並未顯示接受噴灑的非轉形施體小麥植物及未經噴灑的非轉形施體小麥植物間有明確表現型差異(資料未顯示)。結果，無法可靠的評估基因轉殖事件對嘉磷賽的耐受性。相反地，噴灑後21日的嘉磷賽反應分析顯示經噴灑及未經噴灑的非轉形施體植物間有明確表現型差異。表38。因此，基因轉殖事件間的嘉磷賽耐受性分析係根據噴灑後21日收集的反應分數。當針對該事件的12株T1植物中有4株或以上具有反應分數大於或等於3時， 基因轉殖事件被考慮為具有嘉磷賽耐受性。此項標準係基於預期針對T1世代的轉移基因各個事件將孤立1：2：1(同型接合存在：半接合：同型接合不存在)，且許可識別具有微弱DGT28表現的事件。使用從個別耐受性植物計算的任意聚合分數針對觀察得嘉磷賽耐受性將基因轉殖事件排名。聚合分數係從14日及21日的反應分數及噴灑後14日記錄的植物長度、分蘖數目及型態學異常求出。
整體而言，所篩檢的92個基因轉殖事件中之67者顯示對嘉磷賽耐受性證據。表39。六個基因轉殖事件估計具有3整合轉移基因複本，兩個基因轉殖事件估計具有4個或以上的整合轉移基因針對各個DGT-28表現載體選用來含括於第二(詳細)表現型篩檢。
詳細表現型篩檢。每個選定事件12顆T1種子的四個重複本及非轉形施體小麥種系鮑伯白MPB26RH之八個重複本(各12顆種子)播種於85毫米盆內及於經過良好澆水的條件下於25℃使用補充光照提供12小時的光照週期生長至2葉期。盆以隨機設計放置來允許資料分析期間去除環境影響。篩檢的基因轉殖事件列舉於表40。於2葉期，使用嘉 磷賽噴灑前記錄各個植物的植物長度及葉子數目。針對各選定事件及非轉形施體小麥種系的T1植物之第一、第二、第三及第四重複本分別噴灑420、840、1680及3360 g ai/ha劑量施用率。非轉形施體小麥種系的第五、第六、第七及第八重複本(共48植物)未經噴灑。噴灑後7、14及21日，使用表37的評分等級評分植物長度、葉數目及對嘉磷賽的表現型反應。也記錄任何型態學異常。為了評分，評分者對植物的基因型及噴灑劑量施用率為「盲目」以免有評分偏差。於噴灑評分前期具有延遲發芽及不良確立的植物(標準：植物長度小於6厘米)從隨後的分析中排除。
噴灑後7、14及21日的嘉磷賽反應分析顯示經噴灑與未經噴灑非轉形施體小麥植物間有明確表現型差異。此項差異於21日時為最大且觀察得橫跨全部嘉磷賽施用率。表41。為了評估於各個噴灑劑量率基因轉殖事件對嘉磷賽的耐受性，無效T1植物(亦即未攜帶轉移基因的亦即未攜帶轉移基因的植物)從隨後的分析中排除。噴灑後21日具有反應分數低於3的T1植物被考慮具有無效基因型。基於耐受性表現型的變因分析(ANOVA)顯示對DGT-28表現組成體、基因轉殖事件及嘉磷賽噴灑劑量有顯著影響。表41。但多項比較試驗未能揭露對此等差異的起源做有意義的生 物學解釋，原因在於用以記錄個別植物的表現型之反應分數範圍有限(亦即1至4；表40)。一般而言，針對各個DGT-28表現組成體測試八個獨立基因轉殖事件，顯示於各個噴灑劑量率對嘉磷賽有類似的耐受性，指示全部四個DGT-28轉移基因賦與顯性表現型，單套足夠賦與嘉磷賽耐受性。DGT-28表現組成體各自顯示對至少3360 g ai/ha嘉磷賽的有效耐受性。
T-DNA存在於嘉磷賽耐受性T1植物的分子驗證。實例2中發展的PCR接合子形式檢定分析用來驗證保留用於T2種子產生的嘉磷賽耐受性T1植物中存在有編碼DGT-28的T-DNA(參考實例6)。總而言之，PCR接合子形式測試係對104株T1植物進行，其中89%證實含有至少一套轉移基因。表43。此等結果證實由編碼DGT-28的T-DNA的存在賦與觀察得嘉磷賽耐受性。
針對嘉磷賽耐受性基因轉殖事件之T2種子的產生。針對32個基因轉殖事件從表現型篩檢保留約8株嘉磷賽耐受性T1植物選用來含括於詳細表現型篩檢(表40)。植物轉移至200毫米盆內及於良好澆水條件下於25℃使用補充照明提供12小時的光照週期生長。各植物上的花穗在開花 前個別套袋以防雜交。
雖然已經於若干實施例說明本發明之面相，但於本文揭示之精髓範圍內進一步修正。因此本案意圖涵蓋使用概略原理之本發明實施例之任何變異、運用、或調整。又復，本案意圖涵蓋此等實施例相關的且落入於隨附之申請專利範圍內在技藝界已知或尋常實務範圍內此等背離本文揭示。
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<400> 55
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 56
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 57
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 58
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸探子序列
<400> 59
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 60
<210> 61
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸探子序列
<400> 61
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 62
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 63
<210> 64
<211> 18
<213> 人造序列
<212> DNA
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 64
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸探子序列
<400> 65
<210> 66
<211> 17
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 66
<210> 67
<211> 72
<212> PRT
<213> 灰白鏈絲菌(Streptomyces griseus)
<400> 67
<210> 68
<211> 72
<212> PRT
<213> 玫瑰孢鏈絲菌(Streptomyces roseosporus)
<400> 68
<210> 69
<211> 71
<212> PRT
<213> 史氏鏈絲菌(Streptomyces sviceus)
<400> 69
<210> 70
<211> 70
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知起源，美國專利案第7834249號描述為SEQ ID NO：29
<400> 70
<210> 71
<211> 72
<212> PRT
<213> 根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)
<400> 71
<210> 72
<211> 80
<212> PRT
<213> 矮小芥(Brassica napus)
<400> 72
<210> 73
<211> 80
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 73
<210> 74
<211> 80
<212> PRT
<213> 小麥(Triticum aestivum)
<400> 74
<210> 75
<211> 74
<212> PRT
<213> 大腸桿菌(Escherichia coli)
<400> 75
<210> 76
<211> 516
<212> PRT
<213> 矮小芥(Brassica napus)
<400> 76
<210> 77
<211> 455
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 77
<210> 78
<211> 456
<212> PRT
<213> 小麥(Triticum aestivum)
<400> 78
<210> 79
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP4 v2之框內融合
<400> 79
<210> 80
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP5 v2之框內融合
<400> 80
<210> 81
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP8 v2之框內融合
<400> 81
<210> 82
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP9 v2之框內融合
<400> 82
<210> 83
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP12 v2之框內融合
<400> 83
<210> 84
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP13 v2之框內融合
<400> 84
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 85
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 86
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸探子序列
<400> 87
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 88
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 89
<210> 90
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸探子序列
<400> 90
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 91
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 92
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸探子序列
<400> 93
<210> 94
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 94
<210> 95
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 95
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸探子序列
<400> 96
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 97
<210> 98
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 98
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 99
<210> 100
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 100
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 101
<210> 102
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 102
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 103
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 104
<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 105
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 106
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 107
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 108
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 109
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 110
<210> 111
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 111
<210> 112
<211> 28
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 112
<210> 113
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 113
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 114
<210> 115
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 115
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 116
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 117
<210> 118
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 118
<210> 119
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 119
<210> 120
<211> 32
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 120
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 121
<210> 122
<211> 37
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 122
<210> 123
<211> 32
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 123
<210> 124
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 124
<210> 125
<211> 37
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 125
<210> 136
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 126
<210> 127
<211> 37
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 127
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 128
<210> 129
<211> 37
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 129
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 130
<210> 131
<211> 32
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 131
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 132
<210> 133
<211> 37
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 133
<210> 134
<211> 28
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 134
<210> 135
<211> 32
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 135
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 136
<210> 137
<211> 37
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 137
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 138
<210> 139
<211> 32
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 139
<210> 140
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 140
<210> 141
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 多肽序列
<400> 141
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 多肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為Ala、Ser、或Thr
<400> 142
<210> 143
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DGT-31與TRAP23之組成體
<400> 143
<210> 144
<211> 1245
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DGT-31 v3核苷酸
<400> 144
<210> 145
<211> 414
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> DGT-31蛋白質
<400> 145

Claims (39)

  1. 一種經分離之核酸分子，其係選自於由下列所組成之組群：一核酸分子，包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之核苷酸序列具有至少80%序列相同度的一核苷酸序列；一核酸分子，編碼與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少90%序列相同度的一多肽；及包含一核苷酸序列的一異源核酸，該核苷酸序列係於高度嚴苛條件下雜交至具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之該核苷酸序列的另一核酸。
  2. 如申請專利範圍第1項之核酸分子，其中該核酸係包含設計用以於一植物表現的一合成序列。
  3. 一種載體，其係包含如申請專利範圍第1項之核酸分子。
  4. 如申請專利範圍第3項之載體，其係進一步包含編碼一異源多肽的一核酸。
  5. 如申請專利範圍第3項之載體，其中該核酸係為可操作式地鍵聯至一啟動子。
  6. 一種宿主細胞，其係含有如申請專利範圍第1項之核酸分子作為可操作式地鍵聯至一啟動子的一異源核酸。
  7. 如申請專利範圍第5項之載體，其中該啟動子係為該AtUbi10啟動子。
  8. 如申請專利範圍第6項之宿主細胞，其中該宿主細胞係 為一植物細胞。
  9. 一種基因轉殖植物、植物部分、植物器官、植物種子、或植物細胞，其係包含如申請專利範圍第1項之核酸分子。
  10. 如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物、植物部分、植物器官、植物種子、或植物細胞，其中當與該等相同物種的野生型植物作比較時，該植物、植物部分、植物器官、植物種子、及/或植物細胞係對嘉磷賽(glyphosate)具有耐受性。
  11. 如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物、植物部分、植物器官、植物種子、或植物細胞，其中該核酸係不編碼LGNAAT(SEQ ID NO：141)及不編碼ALLMXAPLT，其中X係選自於由丙胺酸、絲胺酸、及蘇胺酸所組成之組群(SEQ ID NO：142)。
  12. 如申請專利範圍第9項之植物、植物部分、植物器官、植物種子、或植物細胞，其中該核酸係編碼與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少90%序列相同度的一多肽，當與SEQ ID NO：1對齊時，該多肽係包含在SEQ ID NO：1的位置84的該相對應位置之丙胺酸及/或在SEQ ID NO：1的位置172的該相對應位置之蘇胺酸。
  13. 一種從如申請專利範圍第9項之植物、植物部分、植物器官、植物種子、及/或植物細胞所產生的可再生細胞之組織培養。
  14. 一種從如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物、植物部分、植物器官、植物種子、或植物細胞所產生的原生質體。
  15. 如申請專利範圍第13項之組織培養，其中該等可再生細胞係從選自於由下列所組成之組群的一組織型別製造：葉、花粉、胚、子葉、下胚軸、分生細胞、根、根尖、花藥、花、莖、及莢。
  16. 一種從如申請專利範圍第13項之組織培養所再生的植物，其中該植物係對嘉磷賽具有抗性。
  17. 如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物、植物部分、植物器官、植物種子、或植物細胞，其中該基因體係包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少95%序列相同度的一核酸分子。
  18. 一種產生抗嘉磷賽之一植物、植物部分、植物器官、植物種子、或植物細胞的方法，該方法係包含：以如申請專利範圍第1項之核酸分子轉形該植物、植物部分、植物器官、植物種子、或植物細胞；及表現與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的一多肽。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該已轉形的植物、植物部分、植物器官、植物種子、或植物細胞係對嘉磷賽具有抗性。
  20. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該多肽係不包含LGNAAT(SEQ ID NO：141)及/或不包含ALLMXAPLT，其中X係選自於由丙胺酸、絲胺酸、及蘇胺酸所組成之組群(SEQ ID NO：142)。
  21. 如申請專利範圍第18項之方法，其中當與SEQ ID NO：1 對齊時，該多肽係包含在SEQ ID NO：1的位置84的該相對應位置之丙胺酸及/或在SEQ ID NO：1的位置172的該相對應位置之蘇胺酸。
  22. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該核酸分子係與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少95%序列相同度。
  23. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該核酸分子係包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。
  24. 一種於含有除草劑抗性植物的一耕地中控制莠草之方法，該方法係包含：於該耕地中栽種包含如申請專利範圍第1項之核酸分子的一植物或一植物種子；及施用足量除草劑至該耕地以控制該耕地中的莠草而不顯著地影響該植物或植物種子。
  25. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該除草劑係為嘉磷賽。
  26. 如申請專利範圍第24項之方法，其中包含如申請專利範圍第1項之核酸分子的該植物或植物種子係包含編碼一異源多肽的一第二核酸。
  27. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該第二核酸係包含aad-1或aad-12。
  28. 一種於一植物賦與對除草劑的抗性之方法，該方法係包含：以一DNA組成體轉形該植物，該組成體係包含可操作式地鍵聯如申請專利範圍第1項之核酸分子的一啟動子； 再生一已轉形植物；及表現該核酸分子而製造與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同度的一多肽。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該除草劑係為嘉磷賽。
  30. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該DNA組成體係包含可於該植物表現的編碼一異源多肽之一第二核酸分子。
  31. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該異源多肽係包含aad-1或aad-12。
  32. 一種具有如申請專利範圍第1項之核酸穩定地整合入其基因體內作為一異源核酸之植物，其中該核酸係可操作式地鍵聯至一啟動子。
  33. 如申請專利範圍第32項之植物，其中該植物係為大豆植物。
  34. 如申請專利範圍第32項之植物，其中該植物係為玉米植物。
  35. 如申請專利範圍第32項之植物，其中該植物係選自於由下列所組成之組群：小麥、玉米、大豆、菸草、臂形草(brachiaria)、稻、粟、大麥、蕃茄、蘋果、梨、草莓、柑橘、苜蓿、棉、胡蘿蔔、馬鈴薯、甜菜、山藥、萵苣、菠菜、牽牛花、玫瑰花、菊花、草坪草、松木、杉木、雲杉木、重金屬積聚植物、向日葵、紅花、油菜籽、及擬南芥屬(Arabidopsis)。
  36. 如申請專利範圍第32項之植物，其中該植物係為選自於由下列各屬所組成之組群中之一種：天門冬屬(Asparagus)、燕麥屬(Avena)、臂形草屬(Brachiaria)、蕓薹屬(Brassica)、柑桔屬(Citrus)、西瓜屬(Citrullus)、辣椒屬(Capsicum)、南瓜屬(Cucurbita)、胡蘿蔔屬(Daucus)、蓬屬(Erigeron)、大豆屬(Glycine)、棉屬(Gossypium)、大麥屬(Hordeum)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、毒麥屬(Lolium)、蕃茄屬(Lycopersicon)、蘋果屬(Malus)、木薯屬(Manihot)、菸草屬(Nicotiana)、諸葛菜屬(Orychophragmus)、稻屬(Oryza)、酪梨屬(Persea)、菜豆屬(Phaseolus)、豌豆屬(Pisum)、梨屬(Pyrus)、李屬(Prunus)、蘿蔔屬(Raphanus)、黑麥屬(Secale)、茄屬(Solanum)、高粱屬(Sorghum)、小麥屬(Triticum)、葡萄屬(Vitis)、豇豆屬(Vigna)、及玉蜀黍屬(Zea)。
  37. 如申請專利範圍第8項之宿主細胞，其中該植物細胞係不可再生以製造一植物。
  38. 如申請專利範圍第9項之植物細胞，其中該植物細胞係不可再生以製造一植物。
  39. 如申請專利範圍第18項之方法，其中不可再生以製造一植物的一植物細胞係經轉形。
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