ES2275278T3 - Promotores de glutacion-s-transferasa de plantas. - Google Patents
Promotores de glutacion-s-transferasa de plantas. Download PDFInfo
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Abstract
UNA SECUENCIA QUIMICAMENTE INDUCIBLE DE UN PROMOTOR GENICO, Y EN PARTICULAR, PERO NO EXCLUSIVAMENTE, UNA SECUENCIA QUIMICAMENTE INDUCIBLE DE UN PROMOTOR GENICO BASADO EN ELEMENTOS CIS REGULADORES DEL GEN DE LA GLUTATION S-TRANSFERASA 27 (GST-27) DEL MAIZ. EN UNA APLICACION PREFERIDA, LA SECUENCIA DEL PROMOTOR ESTA OPERATIVAMENTE VINCULADA O FUNDIDA A UN GEN O SERIE DE GENES POR MEDIO DE LA CUAL PUEDE SER CONTROLADA LA EXPRESION DEL GEN O DE LA SERIE DE GENES POR LA APLICACION DE UN INDUCTOR EXOGENO EFECTIVO.
Description
Promotores de
glutatión-S-transferasa de
plantas.
La presente invención se refiere a un promotor y
a una construcción que comprende el mismo.
En particular, la presente invención se refiere
a una secuencia promotora de genes inducible químicamente, y en
particular, pero no exclusivamente, a una secuencia promotora de
genes inducible químicamente basada en elementos reguladores
cis procedentes del gen 27 de la glutatión
S-transferasa del maíz (GST-27). La
presente invención se refiere también a construcciones de genes,
sistemas de expresión, plantas y combinaciones promotor/inductor
que comprenden la secuencia promotora de genes químicamente
inducible.
Los avances recientes en técnicas de biología
molecular han dado como resultado una mejor comprensión de los
promotores de plantas. Se han identificado elementos reguladores
cis y se han utilizado para localizar actividad de genes
informadores para tipos de células específicas diferenciadas y a
etapas definidas del desarrollo de las plantas (Drews et
al., 1992: Guerrero et al., 1990). Si bien existe
tecnología actual para regular la actividad de genes trans
de una manera espacial o temporal, el control externo de los genes
introducidos por aplicación de un producto químico inductor no está
bien establecido en las plantas.
La capacidad para regular genes de una manera
inducible está bien establecida en bacterias. hongos, insectos y
cultivos de células animales. Para que los sistemas de regulación
inducibles sean eficaces debería existir un nivel de expresión cero
o bajo en ausencia de inductor, expresión alta después de
tratamiento con inductor y ausencia de efecto del inductor sobre
otras funciones celulares.
Si bien se han aislado numerosos genes
inducibles a partir de plantas (Kuhlemeier et al., 1987), no
es de uso común un sistema de regulación inducible bien definido.
Se ha descrito cierto número de genes que son activados por el
ataque patógeno o por estímulos ambientales, con inclusión de
niveles de luz, oxígeno y temperatura. Aunque algunos de éstos
están bien caracterizados al nivel molecular, no pueden utilizarse
para un sistema de genes inducible debido a la activación ilegítima
por señales ambientales.
La implicación de estímulos químicos, que
incluyen reguladores de crecimiento de las plantas, en la activación
de la transcripción génica está bien documentada en las plantas. La
aplicación de estos compuestos puede controlarse mejor, en
comparación con los estímulos ambientales, si bien los mismos nos
pueden considerarse para sistemas de genes inducibles debido a
efectos pleiotrópicos indeseables.
Varios estudios recientes han demostrado que el
control de los genes trans en plantas puede conseguirse por
aplicación de productos químicos exógenos. Estos incluyen activación
por ácido salicílico (Williams et al., 1992), tetraciclina
(Weinmann et al., 1994), glucocorticoides (Schena et
al., 1991) e iones cobre (Mett et al., 1993). Aunque
estos sistemas satisfacen los requisitos previos descritos
anteriormente, y por consiguiente tienen utilidad para aplicaciones
de investigación, su uso estará limitado dado que los productos
químicos descritos no son compatibles con la práctica agrícola
actual.
Un grupo potencialmente atractivo de productos
químicos que pueden tener utilidad en la regulación de la expresión
génica en plantas transgénicas son los agentes fitoprotectores
herbicidas. Estos compuestos se utilizan actualmente en agricultura
y funcionan para elevar selectivamente el metabolismo de ciertos
herbicidas, fundamentalmente por inducción de las enzimas
destoxificantes, glutatión S-transferasa (Hatzios,
1991) y las oxidasas de función mixta dependientes del citocromo
p450 (Fonne-Pfister y Kreuz, 1990). Las glutatión
S-transferasas (GSTs) son enzimas multifuncionales
que catalizan la conjugación del grupo tiol del glutatión con los
centros electrófilos de compuestos lipófilos conduciendo a su
destoxificación (Mannervik y Danielson, 1988). Las GSTs son ubicuas
y su papel en el metabolismo xenobiótico en los mamíferos y las
plantas (Lamoureux y Rusness, 1989) está bien
estable-
cido.
cido.
El sistema mejor caracterizado de las GSTs de
plantas se encuentra en el maíz, donde las mismas representan el
1-2% de la proteína soluble (Timmerman, 1989). Se
han descrito cuatro isoformas de GST en el maíz, GST I (Mozer et
al., 1983; Weigand et al., 1986), GST II (Mozer et
al., 1983; Holt et al., 1995), GST III (Moore et
al. 1986) y GST IV (Irzyk y Feurst, 1993).
GST-27 es un componente de GST II y GST IV que
exhibe inducibilidad dependiente de fitoprotectores.
En la Publicación de Patente Internacional No.
WO93/01294 de los autores de la presente invención, cuya doctrina
se incorpora por la presente por referencia, se demostraba que la
región promotora controladora de GST-27 puede
utilizarse para conseguir la expresión de genes trans
dependientes de fitoprotectores. Estos estudios revelaban que un
promotor de GST-27 de 3,8 kb, además de dirigir la
expresión de genes trans inducibles por fitoprotectores,
confería también un nivel constitutivo de expresión en tejidos de
las raíces.
La presente invención procura proporcionar, por
el uso de un análisis de promotores detallado, un promotor de GST
delecionado que mantiene todavía las ventajas de la inducibilidad
química. En relación con esto, los autores de la presente invención
han identificado, mediante el uso de deleciones y mapeado de
elementos reguladores cis, secuencias implicadas en la
sensibilidad a los fitoprotectores. El uso de estas secuencias puede
utilizarse para mejorar la eficiencia del cambio de genes. Por
ejemplo, una vez que ha sido identificado un elemento cis
implicado en la expresión inducible, es posible mejorar la
inducibilidad por ejemplo por multimerización del elemento.
Existen ejemplos (cambio inducible de cobre,
Mett et al., 1993) en los cuales se han desarrollado sistemas
promotores inducibles para plantas en los cuales el elemento
regulador cis que confiere inducibilidad se ha fusionado a
un promotor mínimo para generar un promotor quimérico sensible al
tratamiento químico. A este respecto, la presente invención trata
de proporcionar una secuencia quimérica promotora de genes inducible
químicamente que comprende una secuencia promotora génica
químicamente inducible de la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención es por
consiguiente utilizar los elementos cis para identificar los
factores de transcripción implicados en la regulación inducible. Los
factores de transcripción pueden manipularse luego para mejorar la
inducibilidad, por ejemplo un factor quimérico puede modificarse por
ingeniería genética con adición de activadores fuertes, tales como
la región VP16 del virus del herpes símplex.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un promotor de gen químicamente inducible
constituido por una secuencia seleccionada del grupo que se compone
de (i) la región de los pares de bases 1 a 570 inmediatamente aguas
arriba del punto de comienzo de la transcripción de la secuencia
promotora de genes de la subunidad de 27 kD de la glutatión
S-transferasa, (ii) la región de los pares de bases
1 a 378 situada inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo
de la transcripción de la secuencia promotora de genes de la
subunidad de 27 kD de la glutatión S-transferasa y
(iii) la región de los pares de bases 267 a 332 inmediatamente
aguas arriba del punto de comienzo de la transcripción de la
secuencia promotora de genes de la subunidad de 27 kD de la
glutatión S-transferasa, en la cual dicho promotor
tiene al menos 98% de homología con el promotor de la subunidad de
27 kD de la glutatión S-transferasa del maíz.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención se proporciona un promotor de genes químicamente
inducibles constituido por la secuencia de la región de los pares de
bases 275 a 290 inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo
de la transcripción de la secuencia promotora de genes de la
subunidad de 27 kD de la glutatión S-transferasa
del maíz.
De acuerdo con un tercer aspecto de la presente
invención se proporciona un elemento promotor de genes químicamente
inducible constituido por una secuencia seleccionada del grupo
constituido por (i) la región de los pares de bases 267 a 279
situada inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo de la
transcripción de la secuencia promotora de genes de la subunidad de
27 kD de la glutatión S-transferasa del maíz, (ii)
la región de los pares de bases 278 a 288 situada inmediatamente
aguas arriba del punto de comienzo de la transcripción de la
secuencia promotora de genes de la subunidad de 27 kD de la
glutatión S-transferasa del maíz, (iii) la región
de los pares de bases 286 a 296 situada inmediatamente aguas arriba
del punto de comienzo de la transcripción de la secuencia promotora
de genes de la subunidad de 27 kD de la glutatión
S-transferasa del maíz y (iv) la región de los
pares de bases 320 a 332 inmediatamente aguas arriba del punto de
comienzo de la transcripción de la secuencia promotora de genes de
la subunidad de 27 kD de la glutatión S-transferasa
del maíz.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente
invención se proporciona un multímero constituido por los
promotores de genes o elementos promotores de genes de la presente
invención.
De acuerdo con un quinto aspecto de la presente
invención se proporciona una construcción génica constituida por un
promotor de genes o elemento promotor de genes de la presente
invención, enlazada operativamente a un gen o una serie de genes
por la cual la expresión del gen o de la serie de genes puede
controlarse por aplicación de un inductor exógeno eficaz.
De acuerdo con un sexto aspecto de la presente
invención, se proporciona un sistema de expresión para una planta,
estando constituido el sistema de expresión por un gen o una serie
de genes fusionados a un promotor de genes o elemento promotor de
genes de la presente invención, en el cual el sistema de expresión
es capaz de ser expresado en la planta y en el cual la expresión
del gen o serie de genes puede controlarse por aplicación de un
inductor exógeno eficaz.
De acuerdo con un séptimo aspecto de la presente
invención se proporciona una planta transgénica que comprende una
construcción génica o un sistema de expresión de acuerdo con la
presente invención en donde la construcción o el sistema de
expresión está integrado, con preferencia integrado de manera
estable, en el DNA genómico de la
planta.
planta.
De acuerdo con un octavo aspecto de la presente
invención, se proporciona un proceso de expresión en una planta de
una construcción o un sistema de expresión de acuerdo con la
presente invención en donde el sistema de expresión o la
construcción está integrado, con preferencia integrado de manera
estable en el DNA genómico del material de la planta y en donde la
expresión del gen o la serie de genes puede controlarse por
aplicación de un inductor exógeno eficaz.
De acuerdo con un noveno aspecto de la presente
invención se proporciona el uso de un elemento promotor de genes de
la presente invención para identificar factores de transcripción
implicados en regulación inducible.
El promotor o elemento químicamente inducible
está situado con preferencia inmediatamente aguas arriba del punto
de comienzo de la transcripción de la secuencia del promotor génico
de la subunidad de 27 kD de la
glutatión-S-transferasa, isoforma
II o aguas arriba de la subunidad de 27 kD de la glutatión
S-transferasa, isoforma IV.
Con preferencia, la secuencia o elemento
promotor(a) químicamente inducible está situado
inmediatamente aguas arriba de punto de comienzo de la
transcripción de la subunidad de 27 kD de la
glutatión-S-transferasa del
maíz.
Preferiblemente, la secuencia que codifica el
promotor génico para la subunidad de 27 kD de la
glutatión-S-transferasa del maíz,
isoforma II, es como se muestra en la Figura 1.
Preferiblemente, el sistema de expresión
comprende una construcción génica de acuerdo con la presente
invención.
Una realización preferida de la presente
invención es una secuencia promotora de genes químicamente inducible
que está basada en elementos reguladores cis del gen de la
glutatión-S-transferasa 27 del maíz,
isoforma II (GST-27-II), como se
muestra en la Figura 1, o que tiene homología sustancial con la de
la Figura 1 o una variante de la misma, en donde la secuencia
promotora está enlazada operativamente o fusionada a una serie de
genes por lo que la expresión del gen o la serie de genes puede
controlarse por aplicación de un inductor exógeno.
Una realización todavía más preferida de la
presente invención es una secuencia promotora de genes químicamente
inducible que está basada en elementos reguladores cis del
gen de la glutatión-S-transferasa 27
del maíz, isoforma II (GST-17-II),
como se muestra en la Figura 1, o que tiene homología sustancial con
la de la Figura 1 o una variante de la misma, y que está integrada,
preferiblemente integrada de manera estable, dentro del DNA
genómico de un material vegetal, y en donde la expresión de un gen o
serie de genes puede controlarse por aplicación de un inductor
exógeno eficaz.
El término "material vegetal" incluye una
semilla en germinación, una planta de semillero, una plántula o una
planta, o tejidos o células de las mismas (v.g. en la raíz, las
hojas y el tallo).
El término "homología sustancial" abarca
homología con respecto a al menos los ácidos nucleicos/residuos de
ácido nucleico esenciales de la secuencia o elemento
promotor(a) con tal que la secuencia o elemento homólogo
actúe como un promotor químicamente inducible. Con preferencia,
existe al menos aproximadamente 70% de homología, de modo más
preferible al menos aproximadamente 80% de homología, y de modo aún
más preferible, existe al menos aproximadamente 90% de homología
con la secuencia de un elemento o secuencia promotor(a)
químicamente inducible de la presente invención.
El término "una variante de la misma" con
referencia a la presente invención significa cualquier sustitución
de, variación de, modificación de, reemplazamiento de, deleción de o
adición de uno o más ácidos nucleicos de o a la secuencia promotora
con tal que la secuencia resultante actúe como un promotor
químicamente inducible. El término incluye también secuencias que
pueden hibridarse sustancialmente a la secuencia promotora.
El término "construcción" - que es sinónimo
con términos tales como "casete", "híbrido" y
"conjugado" - incluye un gen o una serie de genes unidos
directa o indirectamente a la secuencia o elemento promotor. Ocurre
lo mismo para el término "fusionado" en relación con la
presente invención que incluye unión directa o indirecta.
El término "sistema de expresión" significa
que el sistema arriba definido puede expresarse en un organismo,
tejido, célula o medio apropiado. A este respecto, el sistema de
expresión de la presente invención puede comprender componentes
adicionales que aseguran el aumento de la expresión del gen o serie
de genes por el uso del promotor o elemento génico químicamente
inducible. Se incluyen también en este término factores de
transcripción que son capaces de fijarse a la secuencia o elemento
promotor químicamente inducible.
El término "transgénico" en relación con la
presente invención - particularmente en relación con las plantas de
semillero y plantas en germinación de la presente invención - no
incluye un promotor de tipo salvaje en su entorno natural en
combinación con su gen o serie de genes asociados en su entorno
natural. Así, el término incluye brotes o plantas que incorporan un
gen o una serie de genes que pueden ser naturales o no naturales
para el brote o planta en cuestión enlazado(s) operativamente
a la secuencia o elemento promotor de genes químicamente inducible
de la presente invención.
Así pues, cuando el cambio génico de la presente
invención está unido a un gen exógeno o extraño e introducido en
una planta por transformación, proporciona un medio para la
regulación externa de la expresión de dicho gen extraño. El método
empleado para transformación de las células vegetales no es
especialmente afín a esta invención y puede emplearse cualquier
método adecuado para la planta diana. Se obtienen plantas
transgénicas por regeneración a partir de las células
transformadas. Se conocen numerosos procedimientos de transformación
por la bibliografía, tales como agroinfección utilizando
Agrobacterium tumefaciens o su plásmido Ti, electroporación,
microinyección o células vegetales y protoplastos, transformación
con microproyectiles, para mencionar sólo unos cuantos. Puede
hacerse referencia a la bibliografía para detalles completos de los
métodos conocidos.
La especie de planta en la cual se inserta la
secuencia químicamente inducible no es tampoco particularmente afín
a la invención. Pueden transformarse plantas dicotiledóneas y
monocotiledóneas. Esta invención puede aplicarse a cualquier planta
para la cual están disponibles técnicas de transformación o puedan
llegar a estarlo. La presente invención puede utilizarse por tanto
para controlar la expresión génica en una diversidad de plantas
modificadas genéticamente, con inclusión de cosechas de campo tales
como canola, girasol, tabaco, remolacha azucarera, y algodón;
cereales tales como trigo, cebada, arroz, maíz y sorgo; frutos tales
como tomates, mangos, melocotones, manzanas, peras, fresas, bananas
y melones; y hortalizas tales como zanahoria, lechuga, col, patatas
y cebolla. El cambio es adecuado también para uso en una diversidad
de tejidos, con inclusión de raíces, hojas, tallos y tejidos
reproductores.
Una de las principales ventajas de la presente
invención como resultado de la identificación de elementos más
pequeños que pueden utilizarse para conseguir inducibilidad es que
los fragmentos menores son más convenientes para desarrollo de
vectores.
Otra ventaja de la definición de un elemento de
núcleo es que el mismo puede multimerizarse para mejorar la
sensibilidad a los fitoprotectores.
Una ventaja adicional de la utilización de un
elemento de núcleo es que el mismo permite la generación de
promotores quiméricos inducibles por fitoprotectores. Esto puede
incluir promotores específicos o de desarrollo de tejidos, que
podrían manipularse luego para llegar a ser mejorados por
fitoprotectores.
Otra ventaja es que un elemento de núcleo de
este tipo puede optimizarse por una estrategia de mutación.
La definición de un elemento de núcleo permite
el aislamiento del factor de transcripción correspondiente por
escrutinio South-Western. Este elemento podría
manipularse luego por mutación o sobre-expresión
para conseguir una expresión mejorada dependiente de
fitoprotectores.
El promotor puede ser inducido por ciertos
compuestos químicos tales como los indicados anteriormente en la
Solicitud de Patente Internacional No. WO90/08826 de los mismos
autores de la presente invención, cuya descripción se incorpora por
la presente por referencia, conocidos como "fitoprotectores
herbicidas", que pueden aplicarse, por ejemplo, como
pulverización, a la plana en crecimiento.
Los ejemplos siguientes describen la
identificación de elementos reguladores cis inducibles por
fitoprotectores herbicidas dentro del promotor
GST-27. Estos han sido identificados por una
combinación de deleción de promotores, toma de huella in vivo,
ensayos de desplazamiento de la movilidad por electroforesis,
ensayos de genes informadores estables y transitorios. Esto ha
definido fragmentos específicos y un elemento de núcleo específico
que tienen numerosas utilidades.
Se describirán a continuación diversas
características y realizaciones preferidas de la presente invención,
únicamente a modo de ejemplo no limitante con referencia a las
Figuras que se acompañan, en las cuales:
la Figura 1 es una secuencia de nucleótidos de
la secuencia promotora génica de la subunidad de 27 kD de la
glutatión-S-transferasa, isoforma
II;
la Figura 2 es un mapa circular del plásmido
pZM/RMS-3;
la Figura 3 es un mapa circular del plásmido
pZM/RMS-3-S;
la Figura 4 es un gráfico que muestra la
inducibilidad de pZM/RMS-3 y
pZM/RMS-3-S en el maíz;
la Figura 5 es un gráfico que muestra el efecto
del tratamiento con fitoprotectores sobre el maíz transformado de
manera estable con RMS-3-S;
la Figura 6 muestra los plásmidos pPUG1, pPUG3,
pPUG4, pPUG5, pPUG6 y pPUG7;
la Figura 7 muestra la inducibilidad de los
plásmidos pPUG3 a pPUG7, representados en la Figura 6;
la Figura 8 muestra una huella in vivo de
la cadena inferior del promotor GST-27;
la Figura 9 muestra que la huella de
GST-27 del maíz es complementaria a un elemento
sensible al etileno de GST-1 de la clavellina;
la Figura 10 muestra sondas de retardo para una
huella de G290;
la Figura 11 muestra una autorradiografía de
EMSA utilizando las sondas WT290 y MUT290;
la Figura 12 muestra una autorradiografía de un
ensayo de competición de EMSA;
la Figura 13 muestra los resultados de un ensayo
de transformación transitoria de mutaciones de pPUG5;
la Figura 14 muestra secuencias parciales de
sondas de retardo para el promotor GST-27 y
ERE_{1};
la Figura 15 muestra el retardo utilizando las
sondas WT y MUT de G275;
la Figura 16 muestra el retardo utilizando las
sondas WT y MUT de G326, G284 y el ERE;
la Figura 17 muestra los resultados de un ensayo
de competencia en el cual sondas WT frías compitieron con WT290
caliente.
El aislamiento y la caracterización de la región
promotora de GST-27 se describe en la Publicación de
Patente Internacional No. WO93/01294. Como resumen, una sonda de
hibridación de 205 pb, correspondiente a la región 3' no traducida
de cDNA de GST-27, se amplificó utilizando PCR. El
producto PCR se marcó con ^{32}P cebado aleatoriamente y se
utilizó para escrutar 5 x 10^{6} recombinantes de una genoteca
genómica de maíz (Zea mays cv. W22) en 1EMBL3 (Clontech). Se
realizaron purificaciones de calvas como ha sido descrito por
Sambrook et al., 1989. Se aisló el DNA de 1EMBL3 de clones
genómicos y se utilizó para mapeado por digestión de restricción y
análisis de transferencia Southern. Se construyeron una gama de
subclones en vectores plasmídicos que incluían pG1E7 (fragmento
EcoRI de 3,9 kb en pBS (Stratagene)), pG1S15 (fragmento
SacI de 2,1 kb en pBluescript KS (Stratagene)) y pG1X3
(XhoI de 2,2 kb en pBluescript KS). El plásmido pG1E7 se
depositó en fecha 14 de junio de 1991 en las National Collections
of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) bajo el número de acceso
NCIMB 40426. La secuencia de nucleótidos del promotor
GST-II-27 se muestra en la Figura
1.
La secuencia de DNA de los subclones genómicos
se determinó por el método de terminación de cadenas didesoxi
utilizando la versión sequenase 2.0 (USB) (Sanger et al.,
1977). Se prepararon iniciadores de secuenciación
oligonucleotídicos utilizando un sintetizador de DNA ABI Modelo
380B. Los datos de las secuencias de DNA se analizaron por el uso
las series PC/Gene e IG del paquete de biología molecular
Intelligenetics.
Se adoptaron métodos estándar de DNA
recombinante en la construcción de vectores plasmídicos (Sambrook
et al, 1989). Una construcción de gen informador que contenía
una región flanqueante 5' EcoRI-Nde I de 3,8 kb de
GST-27 procedente de pG1E7 se hizo roma en los
extremos y se ligó al sitio SmaI del vector pTAK de
Agrobacterium Ti (Jefferson et al., 1987). el sitio
NdeI, que se encuentra en el codón de comienzo de la
traducción predicho de GST-27 se destruyó
después de hacer romo los extremos. Esto formó un punto conveniente
para fusión con el gen UidA de E. coli codificante de
b-glucuronidasa (GUS) en pTAK. Un fragmento
EcoRI que contenía 3,8 kb del gen informador GUS promotor de
GST y el terminador nos se aisló y se subclonó en el fragmento
pIJ109 de EcoRI, un vector basado en pUC19 que contenía la
casete marcadora seleccionable de PAT (promotor 35S de CaMV, intrón
A de H I,
fosfinotricin-acetil-transferasa
(PAK), y el terminador nos) para formar la casete de transformación
de maíz pZMRMS3 (véase la Figura 2). Se generó una construcción de
deleción pZMRMS3S que contenía 0,9 kb del promotor
GST-27, por eliminación de un fragmento de 1,9 kb
(EcoRI-EagI) (véase la Figura 3).
Se utilizaron pZMRMS3 y pZMRMS3S para generar
plantas de maíz transgénicas fértiles por bombardeo de suspensiones
de células embrionarias (Fromm et al., 1990).
Se seleccionaron plantas que llevaban el gen
trans utilizando la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Se preparó DNA genómico para análisis PCR de plantas
transgénicas. La PCR se realizó utilizando las condiciones
descritas por Jepson et al. (1991). Las plantas transformadas
con pZMRMS3 y pZMRMS3S se analizaron con los iniciadores GSTPCR
5'-CTCCCGTC-GACCAAATACACTTGGT-3'
específico para la región 3' del promotor GST-27 y
GUS 115
5'-GGATTCCGGCATAGTTAAAGAAATCAT-3',
específico para la porción 5' del gen GUS.
Para determinar si ambos fragmentos de 0,9 kb y
3,8 kb retenían expresión inducible en maíz transgénico, se
realizaron ensayos de la enzima GUS sobre material de hojas en
presencia o ausencia de fitoprotector. Se preparó tejido inducido
por plantas maduras de invernadero (ciclo de 16 h luz/8 h oscuridad)
por aplicación mediante pintura o pulverización de las hojas de
R-29148 de concentración 10 g/l formulado en 81,5
g/l de ciclohexanona, 3,3 g/l de NPE 1800 Synperonic, y 1,5 g/l de
Tween 85. Se realizaron ensayos fluorométricos para la actividad de
GUS con el sustrato
4-metilumbeliferil-D-glucurónido
(Sigma) como ha sido descrito por Jefferson et al., 1987.
Las incubaciones se realizaron durante 2 horas a 37ºC antes de
interrumpirlas con carbonato de sodio 0,2M, y se midieron por
fluorescencia con un fluorómetro Perkin-Elmer
LS-35. La concentración de proteínas en los
homogeneizados de tejidos se determinó por el ensayo de proteínas
Bio-Rad siguiendo el procedimiento sugerido por el
fabricante. Las Figuras 4 y 5 demuestran que tanto pZMRMS3 como
pZMRMS3S retienen inducibilidad.
El análisis de deleción preliminar generado en
plantas de maíz transgénicas sugiere que el o los elementos que
confieren inducibilidad deben estar comprendidos dentro de los 900
pb situados inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo de la
transcripción (TSP). Se produjeron una serie de construcciones de
deleción fina por fusión de fragmentos de 200 pb delecionados de la
región de 900 pb del gen marcador GUS. Se identificó un sitio
PstI adyacente al punto de comienzo de la transcripción del
promotor GST-27. Se diseñó un iniciador de PCR AI2
correspondiente a esta región
(5'-TGCCTGCTGCAGCTGCTACTTAT-3'). Se
utilizó el iniciador AI2 en combinación con cuatro iniciadores
(AI3, AI4, AI5 y AI6) flanqueados todos ellos con un sitio
Hind III. Se utilizaron AI3
(5'GTCAAAGCTTCGCAAGTCGCACCCCA-CTA3'), IA4
(5'CTGAAAGCTTCGGTGCACCGAAT3'), AI5
(5'GCGGCAAGCT-TAATATGTGATGATGATA3') y PI6
(5'TTACAAGCTTCGCAAGTATCGGTA-GGCAT3') en experimentos
PCR con AI3 para generar fragmentos de 217 pb, 378 pb, 570 pb y 760
pb, respectivamente. Los productos PCR producidos se cortaron con
Pst I y Hind III y los fragmentos se clonaron en
pZMRMS3 cortado con Pst I y Hind III. Los vectores
resultantes pUG4, pUG5, pPUG6 y pPUG7 se muestran en la Figura
6.
Se realizaron ensayos de transformación
transitoria con los vectores pPUG en células de suspensión de BMS
(Black Mexican Sweet) que se dejaron crecer en presencia o ausencia
de fitoprotector (Dichlormid, 40 ppm). El DNA se suministró
utilizando transformación con triquitas de carburo de silicio (Wang
et al., 1994). La actividad promotora se registró por
recuento de unidades formadoras de color. La Figura 7 revela que
todas las construcciones de pPUG eran inducibles, excepto una que
contenía solamente 217 pb (designada pPUG7) del promotor. Una
construcción que contenía 378 pb (designada pPUG6) confería todavía
inducibilidad. Este dato sugiere que el o los elementos inducibles
se encuentran entre las posiciones -217 y -378 pb aguas arriba del
punto de comienzo de la transcripción.
La huella in vivo (véase el método más
adelante) se utilizó para detectar interacciones de proteínas con
el promotor y localizar así el elemento que confiere inducibilidad.
Se utilizó sulfato de dimetilo (DMS) para modificar residuos
guanina in vivo por metilación de la posición N7. Si está
asociada una proteína estrechamente con el DNA, esta reacción será
inhibida y por tanto los factores de fijación de DNA pueden mapearse
a las bases implicadas. Después de tratamiento con DMS, el DNA se
amplifica y se secuencia. Los puntos de contacto se identifican en
las autorradiografías genómicas como residuos G que son menos
intensos cuando se comparan con la pista del DNA no inducido.
Se diseñaron iniciadores de tal modo que el área
comprendida entre -217 y -378 pudiera analizarse utilizando este
método. Se trató una planta de maíz con fitoprotector para inducir
la expresión de GST-27. Se realizó el análisis de
la huella in vivo antes del tratamiento (0 horas) y al cabo
de 6, 24 y 48 horas después del tratamiento. Los resultados se
muestran en la Figura 8. Puede verse que una proteína se fija a un
residuo G en la posición -290 a las 24 horas después del
tratamiento de la planta con fitoprotector (ausencia de banda
visible) pero no al cabo de 0, 6 ó 48 horas (banda visible). Las
posiciones -275, -283 y -284 tienen también bandas más tenues a las
24 horas. Este resultado es reproducible. En resumen, se han
identificado dos elementos supuestos que parecen fijar factores de
proteínas de una manera dependiente de fitoprotectores.
Estos elementos comparten homología unos con
otros. Además de ello, es interesante observar que las regiones
homólogas son complementarias para un elemento sensible a etileno en
el gen GST1 de la clavellina (Itzhaki et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, Vol. 19, 8925-8929, 1994) como se
muestra en la Figura 9.
(Modificado por Hammond-Kosack y
Bevan, Plant Mol. Biol. Reporter, Vol. 11, No. 3, septiembre de
1993).
1. Se aplicaron tratamientos in vivo con
DMS durante 1 minuto y se relajaron luego lentamente. Después de 5
minutos, se retiró el medio y el tejido se lavó varias veces en
medios MS. El tejido se secó con papel secante y se guardó a -70ºC
hasta que se recogieron todos los momentos (0, 6, 24 y 48
horas).
El tejido tratado con DMS congelado se trituró a
un polvo fino utilizando un mortero con mano y nitrógeno líquido.
Se añadieron 30 ml de tampón de extracción caliente (65ºC) (Tris HCl
100 mM de pH 8,0, EDTA 50 mM de pH 8,0, NaCl 500 mM, SDS al 1,25%,
NaOH 8,3 mM, 0,38 g/100 ml de bisulfito de Na), se mezcló y se
incubó durante 15 minutos a 65ºC. Se añadieron 6,16 ml de KAc 5M, y
después de ello se incubó la muestra en hielo durante 20 minutos.
Después de centrifugación a 3,5 K durante 5 minutos, se filtró el
sobrenadante a través de Miracloth y se añadieron 0,7 volúmenes de
propan-2-ol. El material resultante
se centrifugó a 4 K durante 10 minutos, se lavó 2 veces el pélet en
etanol al 70% y se resuspendió luego en 0,84 ml de T5E y 0,36 ml de
NH4Ac 10 mM. Esta solución se centrifugó durante 5 minutos a 13 K.
El sobrenadante se precipitó con 0,73 ml de
propan-2-ol.
El pélet se precipitó una vez más antes de
disolverlo en 100 ml de T10E. El DNA se digirió con Hind
III.
Las muestras de DNA se amplificaron utilizando
LMPCR. Se diseñaron tres iniciadores anidados para amplificar ambas
cadenas del promotor GST-27 entre los pares de bases
0 y 350 aguas arriba del TSP. El primer iniciador de cada cadena se
reasoció y se dejó luego que tuviera lugar la extensión hasta el
extremo de la molécula. Se reasoció al extremo de cada molécula
extendida un enlazador de secuencia conocida. Se llevó a cabo luego
la PCR normal utilizando un iniciador específico para el enlazador y
el segundo de los iniciadores anidados. Cuando se amplificaron, las
moléculas de DNA se marcaron utilizando el tercer iniciador que
incorporaba un marcador en el extremo. Las muestras se extrajeron
con fenol-cloroformo, se precipitaron con
propan-2-ol y se resuspendieron en
tampón de carga de secuenciación. Para visualizar la huella, las
muestras se pasaron en un gel de secuenciación al 6%.
Este método se utilizó para ensayar la hipótesis
de que las áreas de huella in vivo podrían fijarse a
proteínas nucleares específicas in vitro. Los fragmentos
radiomarcados cortos (sondas) de un promotor migrarán a través de
un gel de electroforesis a una velocidad determinada por su tamaño y
su carga. Sí una sonda tiene una proteína asociada con ella, se
retardará la migración. En una autorradiografía, esto se visualizará
como una banda que no está presente en ausencia de proteína. Los
ensayos de competencia con sondas frías determinan si la fijación
es específica.
Se prepararon extractos nucleares de proteína a
partir de hojas de maíz inducidas y no inducidas. Se prepararon dos
sondas cortas (25 pb) (véase la Figura 10) para incubación con la
proteína:
1. WT290 - que cubre el área de la huella -290 y
-283/284
2. MUT290 - como 1, pero incluyendo una mutación
de 5 pb alrededor de -290.
Los resultados se muestran en la Figura 11. La
sonda WT fija una proteína (banda visible en las pistas 3 y 5). La
mutación en MUT290 anula la fijación (banda más débil en las pistas
4 y 6). El patrón es idéntico tanto si el extracto de proteína
nuclear procede de hojas inducidas como si procede de hojas no
inducidas. Por consiguiente, la proteína de fijación debe estar
presente siempre. In vivo, esta proteína debe modificarse de
tal manera que la fijación ocurra sólo cuando se induce el gen. La
Fig. 12 representa los resultados de ensayos de competencia. La
sonda WT290 fría compite con éxito con la sonda WT290 radiomarcada
para fijar la proteína, dando como resultado la pérdida de la banda
(pistas 6, 7, 8 y 14, 15, 16). Por consiguiente, la fijación
observada es específica.
Además de la región 290, se ha demostrado
también que la región -275 (véase la Figura 14), está implicada de
la fijación de factores de transcripción. La Fig. 15 muestra los
resultados de un EMSA en el cual la sonda 275 se fija mientras que
el elemento 275 mutado no logra fijar factores de transcripción. En
un experimento subsiguiente se ha demostrado que las regiones 284 y
326 (véase la Figura 14) están implicadas con la fijación de
proteína a partir de extractos nucleares no inducidos e inducidos
(véase la Figura 16). Los ensayos de competencia (véase la Figura
17) con las regiones 275, 284, 290 y 326 muestran que la fijación
observada en el estudio EMSA es específica. Las diversas sondas
mutadas y salvajes utilizadas en el estudio EMSA se enumeran a
continuación:
Estos datos, tomados junto con los datos de la
huella in vivo indican que esta región del promotor
GST-27 está implicada en la fijación químicamente
dependiente de factores de transcripción que conducen a la
activación génica.
(Modificado por Watson y Thompson, Meth.
Enzymol. Vol. 118, pp. 57-75, 1986 y Holdsworth y
Laties, Planta, Vol. 179, pp. 17-23, 1989).
Se aplicó una solución al 1% del fitoprotector
R-29148 a las superficies superior e inferior de
hojas de maíz de 3 semanas. Se recogieron 15 g de material al cabo
de 0 y 24 horas. El tejido se trituró para dar un polvo fino
utilizando un mortero con mano y nitrógeno líquido. El tejido se
dividió en 2; se añadieron a cada muestra 70 ml de tampón de
extracto (sacarosa 0,25M, NaCl 10 mM, MES-NaOH 10 mM
de pH 6,0, EDTA 5 mM, espermina 0,15 mM, espermidina 0,5 mM, PMSF
0,2 mM, NaF 10 mM, b-Me 20 mM, BSA al 0,1%, 0,6% de
non-idet P40). El material homogeneizado se filtró
a través de tres capas de Miracloth a un tubo de Corex. Se añadió un
cojín de Percoll al 25% al fondo del tubo. Se centrifugó éste a 3 K
en un rotor de cubetas oscilantes a 4ºC durante 30 minutos. Se
recogieron los núcleos del fondo del tubo y se resuspendieron en
tampón de extracto (que no incluía BSA). La muestra se centrifugó a
5 K durante 5 minutos a 4ºC. Los núcleos se resuspendieron en 100 ml
de tampón de diálisis (KCl 40 mM, HEPES-NaOH 24,7
mM de pH 7,9, 5 mg/ml de leupeptina, EDTA 5 mM, 5 mg/ml de
antipaína, DTT 1 mM, glicerol al 25%, NaF 10 mM). Se añadió 1/10 de
su volumen de sulfato de amonio y la muestra se incubó en hielo
durante 30 minutos, después de lo cual se centrifugó a 13 K durante
20 minutos. Se añadieron 1,5 volúmenes de sulfato de amonio al
sobrenadante, que se incubó en hielo durante 60 minutos y se
centrifugó luego a 13 K durante 20 minutos. La muestra se
resuspendió en 100 ml de tampón de diálisis y se dializó en el
tampón durante 2 x 2 horas. La concentración de proteína en la
muestra final se midió utilizando el ensayo de Bradford.
Se incubó 1 mg de extracto de proteína durante
20 minutos a la temperatura ambiente con 20.000 cpm (c. 0,5 ng) de
sonda (marcada por llenado en los términos rebajados en 3' con dNTPs
marcados utilizando Klenow), 1 mg de
poli-d(I-C), DTT 5 mM, KCl 50
mM, MgCl_{2} 100 mM en 10 ml de tampón de fijación (HEPES 250 mM
de pH 7,6, EDTA 10 mM, glicerol al 50%). Las muestras se cargaron
en un gel de poliacrilamida al 6%, y se corrieron en tampón 0,25 X
TBE.
\vskip1.000000\baselineskip
Para probar que las áreas de huella indican las
posiciones de elementos inducibles se realizaron ensayos
transitorios. Por mutación de los fragmentos inducibles supuestos
para prevenir la fijación de factores de proteína con acción
trans, debería perderse la inducibilidad. Se demostró
previamente que una construcción (pPUG5) que contenía 570 pb del
promotor fusionado a GUS retenía inducibilidad. Se mutó ésta,
utilizando PCR anclada, en las áreas de las que se había tomado la
huella. Se prepararon 3 construcciones, cada una de las cuales
contenía una mutación de 10 pb:
1. MUT290 que contenía una mutación de 10 pb
alrededor de G-290
2. MUT284 que contenía una mutación de 10 pb
alrededor de G-284
3. MUT326 que contenía una mutación de 10 pb
alrededor de G-326
La construcción MUT326 se preparó dado que se
observó una huella convincente a las 48 horas, que implicaba
G-325/326. Las construcciones se transformaron en
células de suspensión BMS utilizando la denominada técnica de las
triquitas de fibras de silicio como se describe en la Patente US No.
5.302.523 de los mismos autores. Los resultados se muestran en la
Tabla 1 (Figura 13). Las construcciones mutadas eran todavía
inducibles. La multiplicidad de inducción para todas las
construcciones era comparable a la de WTpPUG5.
Después de este resultado, se realizó una
búsqueda de homología en el fragmento de 570 pb en pPUG5 para
identificar cualquier duplicación de los elementos supuestos. Si
están presentes elementos múltiples, puede no ser visible el efecto
de la mutación de uno de ellos. No se encontraron duplicaciones
directas. Sin embargo, se observó que había una alta homología
(67%) dentro del fragmento. A partir de los datos se cree que había
ocurrido un suceso de duplicación e inversión que implicaba 150 pb.
Adicionalmente, dado que la región -290 y -275 cuya huella se había
tomado muestran homología significativa, se repitió el experimento
de ensayo transitorio en el promotor de fondo pPUG6 (378 pb), con
las tres mutaciones en el mismo vector.
\vskip1.000000\baselineskip
Se requirieron cuatro iniciadores para la
mutagénesis mediada por PCR, enumerándose a continuación los
iniciadores utilizados:
\newpage
Iniciadores utilizados para crear 3XMUT en
pPUG6:
Los iniciadores R1 y R2 flanquean el promotor a
ambos lados de la región que debe mutarse y contienen sitios de
restricción con enzimas adecuadas para clonación. Los extremos 5' y
3' del iniciador M son idénticos al promotor mientras que la
sección media contiene la secuencia alterada. El iniciador rev es
idéntico al extremo 5' de tipo salvaje del iniciador M.
En el paso 1, se realizaron dos PCRs en un
volumen de 25 \mul con 20 ng de plásmido molde de tipo salvaje,
tampón 10X PCR, 2,5 \mul de dNTPs 2 mM, 2 \mul de iniciador R1 o
M 20 mM, 2 \mul de iniciador rev o R2 20 mM y 0,25 \mul de
Amplitaq (Perkin Elmer). El programa utilizado fue 94ºC durante 2,5
minutos, seguido por 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 50ºC
durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto. Las reacciones se
llevaron a cabo cada una 4 veces para generar suficiente producto
para el paso 2. Los fragmentos R1/rev y M/R2 resultantes se
purificaron y cuantificaron.
En el paso 2, los fragmentos R1/rev y M/R2, que
comparten una región de secuencia de solapamiento, se reasociaron.
Se mezclaron 250 ng de cada fragmento en un volumen de 25 \mul con
tampón 10X PCR, 2,5 \mul de dNTPs 2 mM y 0,25 \mul de Amplitaq.
La reasociación seguida por extensión del producto reasociado se
realizaron utilizando el programa de 94ºC durante 2,5 minutos
seguido por 9 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 40ºC durante 1
minuto y 72ºC durante 1 minuto.
En el paso 3, los heterodímeros extendidos, que
comprendían la secuencia promotora total que contenía la mutación,
se amplificaron por la adición de los iniciadores R1 y R2. Se
añadieron a la misma reacción procedente del paso 2, 2,5 \mul de
tampón 10X PCR, 2,5 \mul de dNTPs 2 mM, 2 ml de R1 20 mM, 2 ml de
R2 20 mM, 15,75 \mul de agua y 0,25 \mul de Amplitaq. La PCR se
llevó a cabo utilizando el mismo programa que el usado en el paso
1. El fragmento resultante se purificó y se clonó en el vector
pGEM-T (Promega) y se secuenció para asegurar que
se habían mutado las bases correctas. 3XMUTBin/6 contenía mutaciones
de 5 pb para los residuos G de huella-290,
G-283/284 y G-275 y sus nucleótidos
flanqueantes.
Se adopto una estrategia similar para generar 4
mutaciones en el fondo de pPUG6 utilizando los iniciadores
indicados a continuación.
Iniciadores utilizados para crear 4X MUT en
pPUG6:
Se realizó una mutagénesis ulterior mediada por
PCR utilizando p3XMUT/PUG6 como DNA molde a fin de mutar los
residuos G de huella G-325/236 y cuatro nucleótidos
flanqueantes. El 4XMUTBin/6 contenía mutaciones de 5 pb para los
residuos G de huella G-290,
G-283/284, G-275 y
G-325/236 y sus nucleótidos flanqueantes.
Los fragmentos mutados se introdujeron en el
promotor GST-27 por corte de los vectores
pGEM-T con HindIII y PstI y se clonaron en pPUG6
que se había linealizado con las mismas enzimas. De este modo, el
promotor de tipo salvaje en pPUG6 se retiró y se reemplazó con la
versión 3XMUT o 4XMUT, creando así el plásmido p3XMUT/PUG6 o
p4XMUT/PUG6. Éste se clonó en pBin400 utilizando la misma estrategia
que se ha descrito arriba para el plásmido pPUG6 de tipo salvaje, a
fin de formar 3XMUT/Bin6 o 4XMUT/Bin6.
\newpage
Se transformaron plantas de tabaco con cinco
construcciones, todas las cuales estaban basadas en el vector
binario pBin400 (Spychalla y Bevan, 1993). Se prepararon tres
deleciones 5' del promotor GST-27 fusionado al gen
informador GUS, que contenían 570, 378 y 217 pb del promotor aguas
arriba del TSP. Estas fusiones promotor truncado:GUS estaban
presentes en las construcciones pPUG5 (570 pb), pPUG6 (378 pb) y
pPUG7 (217 pb). Los promotores truncados fusionados a GUS se
cortaron en un fragmento HindIII, EcoRI a partir de estos tres
plásmidos y se clonaron directamente en pBin400, que se había
linealizado con las mismas enzimas. Las construcciones resultantes
se designaron pBin/5, pBin/6 y pBin/7. Se transformaron también
3XMUT/Bin6 y 4XMUT/Bin6.
Se dispuso un cultivo nocturno de A.
tumefaciens (cepa T37SE) en 10 ml de caldo YEP (1% (p/v)) de
Bactopeptona [Difco], 1% (p/v) extracto de levadura [Difco], 0,5%
NaCl) con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejó crecer a
30ºC. Se utilizaron cuatro ml de este cultivo para inocular 100 ml
de caldo YEP, que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina,
que se dejó crecer durante 4-5 horas. Las células se
redujeron a un sedimento a 2500 rpm durante 10 minutos (centrífuga
Sorvall RC3C, rotor H6000A), se resuspendieron en 2 ml de caldo YEP
y se enfriaron en hielo durante 5 minutos en partes alícuotas de 200
\mul. Se añadieron a las células diez microlitros de DNA de pBin
a 0,1-0,2 \mug/ml. Las células se congelaron
inmediatamente en nitrógeno líquido durante aproximadamente 15
segundos seguido por un choque térmico a 37ºC durante 5 minutos. Se
añadió luego 1 ml de YEP y las células se dejaron crecer a 30ºC
durante 1-2 horas. Una parte alícuota de 100 ml de
cada transformación se extendió sobre placas YEP (YEP con 1,5% (p/v)
de agar) que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina para
seleccionar respecto a Agrobacterium y 50 \mug/ml de
hidrocloruro de espectinomicina para seleccionar respecto al vector
binario. Las placas se inspeccionaron en cuanto a crecimiento
después de 48 horas de incubación a 30ºC. Las colonias simples se
aplicaron en bandas sobre placas T Minimal (350 ml de agar agua
[1,5% (p/v) agar], 20 ml de sales 20X, 20 ml de tampón T 20X, 20%
glucosa), que contenían los antibióticos seleccionantes, y se
dejaron crecer durante 3 días a 30ºC. Se utilizaron colonias
bacterianas de estas placas para inocular cultivos líquidos para la
preparación de DNA.
Se inocularon 10 ml de caldo YEP, que contenía
antibiótico para seleccionar respecto al vector binario y el
Agrobacterium, con una sola colonia de A. tumefaciens
y se dejaron crecer durante una noche a 30ºC. Se recogieron las
células por centrifugación a 2500 rpm durante 20 minutos (centrífuga
Sorvall RC3C, rotor H6000A), se resuspendieron luego en 200 ml de
solución I enfriada en hielo (Horsch et al., 1985) y se
dejaron en reposo durante 30 minutos a la temperatura ambiente,
después de lo cual se agitaron enérgicamente. Se añadieron 200 ml
de solución II, se mezclaron por agitación suave mediante sacudidas
y se incubaron a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Se
llenaron luego 150 ml de solución III enfriada en hielo y la mezcla
se incubó en hielo durante 5 minutos. La muestra se centrifugó
durante 5 minutos a 13.000 rpm (microcentrífuga de sobremesa MSE
Microcentaur). Se extrajo el sobrenadante con un volumen igual de
fenol/cloroformo y se precipitó luego con IPA. Se resuspendió el
pélet en 50 ml de T10E1. Se digirió el RNA por adición de 1 ml de
RNasa A de concentración 1 mg/ml, seguido por incubación a 37ºC
durante 30 minutos. Se utilizaron 10 microlitros de éste DNA en las
digestiones con enzimas de restricción y se confirmó la identidad
del plásmido binario por electroforesis en gel de agarosa.
Se transformó tabaco utilizando el método
desarrollado por Horsch et al. (1985). El
Agrobacterium que contenía la construcción del vector
binario se dejó crecer en caldo YEP, que contenía los antibióticos
apropiados, a 30ºC durante 24 horas antes de la transformación. Se
redujeron las células a un sedimento por centrifugación a 3000 rpm
durante 20 minutos a la temperatura ambiente (centrífuga Sorvall
RC3C, rotor H6000A) y se resuspendieron en 10 ml de YEP de nuevo
aporte. Se cortaron discos foliares a partir de hojas de
Nicotiana tabacum var. Samsun utilizando un taladracorchos
(7 mm) y se transfirieron a una cápsula Petri de 14 cm. Se añadió
Agrobacterium a la cápsula Petri que se dejó a la temperatura
ambiente durante 30 minutos. Se prepararon placas alimentadoras
antes del comienzo del experimento. Fue necesario un medio 1 NBM
(4,6 g de sales MS [Flow Laboratories], 30 g de sacarosa, 0,1 mg de
EtOH NAA [Sigma], 0,1 mg de BAP [Sigma], 8 g de agar (Difco), 100X
B5 VITS, pH 5,9) para 40 placas. Se extendió uniformemente 1 ml de
un cultivo de suspensión de células de tabaco sobre la superficie
de las placas, y se cubrió luego con un disco de filtro estéril de
9 cm Whatman No. 1. Los discos foliares se transformaron en las
placas alimentadoras, con la epidermis inferior hacia arriba.
Después de 2 días de co-cultivo con
Agrobacterium, los discos se transfirieron a placas NMB que
contenían 100 \mug/ml de sulfato de kanamicina y 500 \mug/ml de
sal de sodio de carbenicilina, a fin de eliminar el
Agrobacterium y seleccionar respecto a transformantes. Los
discos foliares se transfirieron cada dos semanas a placas NMB
recientes que contenían los antibióticos. Después de aproximadamente
4 semanas, eran visibles pequeños brotes en los discos foliares. Se
transfirieron éstos a medio MS (4,6 g de sales MS, 30 g de
sacarosa, 8 g de agar, pH 5,9) que contenía 200 \mug/ml de sal de
sodio de carbenicilina y 100 \mug/ml de sulfato de kanamicina.
Los transformantes enraizaron después de
aproximadamente 14 días mientras que las plantas no transformadas
se decoloraron y murieron. Cuando las plantas transformadas
estuvieron establecidas, se transfirieron a suelo y se dejaron
crecer en el invernadero.
Otras modificaciones de la presente invención
serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del
alcance de la invención.
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Claims (11)
1. Un promotor génico químicamente inducible
constituido por una secuencia seleccionada del grupo constituido
por:
- (i)
- la región de los pares de bases 1 a 570 inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo de la transcripción de la secuencia promotora génica de la subunidad de 27 kD de la glutatión-S-transferasa;
- (ii)
- la región de los pares de bases 1 a 378 situada inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo de la transcripción de la secuencia promotora génica de la subunidad de 27 kD de la glutatión-S-transfe- rasa; y
- (iii)
- la región de los pares de bases 277 a 332 situada inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo de la transcripción de la secuencia promotora génica de la subunidad de 27 kD de la glutatión-S-transferasa;
en el cual dicho promotor tiene al
menos 90% de homología con el promotor de la subunidad de 27 kD de
la glutatión-S-transferasa del
maíz.
2. Un promotor génico químicamente inducible
constituido por la secuencia de la región de los pares de bases 275
a 290 inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo de la
transcripción de la secuencia del promotor génico de la subunidad de
27 kD de la glutatión-S-transferasa
del maíz.
3. Un elemento promotor génico químicamente
inducible constituido por una secuencia seleccionada del grupo
constituido por:
- (i)
- la región de los pares de bases 267 a 279 situada inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo de la transcripción de la secuencia promotora de genes de la subunidad de 27 kD de la glutatión S-transferasa del maíz;
- (ii)
- la región de los pares de bases 278 a 288 situada inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo de la transcripción de la secuencia promotora de genes de la subunidad de 27 kD de la glutatión S-transferasa del maíz;
- (iii)
- la región de los pares de bases 286 a 296 situada inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo de la transcripción de la secuencia promotora de genes de la subunidad de 27 kD de la glutatión S-transferasa del maíz; y
- (iv)
- la región de los pares de bases 320 a 332 inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo de la transcripción de la secuencia promotora de genes de la subunidad de 27 kD de la glutatión S-transferasa del maíz.
4. Un promotor génico químicamente inducible de
acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el promotor génico está
situado inmediatamente aguas arriba del punto de comienzo de la
transcripción de la secuencia del promotor génico de la subunidad de
27 kD de la glutatión-S-transferasa
del maíz.
5. Un promotor génico o elemento de promotor
génico químicamente inducible de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual la secuencia del promotor
génico de la subunidad de 27 kD de la
glutatión-S-transferasa, isoforma
II, es como se muestra en la Figura 1.
6. Un multímero constituido por los promotores
génicos o los elementos promotores génicos de una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5.
7. Una construcción génica constituida por un
promotor génico o elemento de promotor génico, de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6 enlazada operativamente a un gen o una
serie de genes, por los cuales la expresión del gen o la serie de
genes puede controlarse por aplicación de un inductor exógeno
eficaz.
8. Un sistema de expresión para una planta,
estando constituido el sistema de expresión por un gen o una serie
de genes fusionados a un promotor génico o elemento de promotor
génico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
en el cual el sistema de expresión es susceptible de ser expresado
en la planta y en el cual la expresión del gen o la serie de genes
puede controlarse por aplicación de un inductor exógeno eficaz.
9. Una planta transgénica que comprende una
construcción génica de acuerdo con la reivindicación 7 o un sistema
de expresión de acuerdo con la reivindicación 8, en la cual la
construcción o el sistema de expresión está integrado,
preferiblemente integrado de manera estable, en el DNA genómico de
la planta.
10. Un proceso de expresión de una construcción
de acuerdo con la reivindicación 7 en una planta, o un sistema de
expresión de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual el sistema
de expresión o la construcción está integrado, preferiblemente
integrado de manera estable, dentro del DNA genómico del material de
la planta y por el cual la expresión del gen o la serie de genes
puede controlarse por aplicación de un inductor exógeno eficaz.
11. Uso de un elemento promotor génico
constituido por el elemento del promotor génico de acuerdo con la
reivindicación 3 o la reivindicación 5, para identificar factores de
transcripción implicados en regulación inducible.
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