CN101144087A - 盐生杜氏藻epsp合成酶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了盐生杜氏藻EPSP合成酶基因、重组质粒、EPSP合成酶及其它们的制备方法和用途。所述盐生杜氏藻EPSP合成酶基因来源于盐生杜氏藻，将所制备的盐生杜氏藻EPSP合成酶基因克隆到表达载体，即形成重组质粒，将重组质粒进行表达即形成EPSP合成酶。将制备的重组质粒I转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中，用于转化模式植物(野生型)，则可培育出对草甘膦产生耐受性的转基因植株。本发明为防止农作物受草甘膦危害提供了一种新酶，有利于促进农业的增产和发展。

Description

盐生杜氏藻EPSP合成酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种EPSP合成酶的基因、重组质粒、EPSP合成酶及其制备方法与应用。

背景技术

草甘膦(Glyphosate)是目前使用最为广泛的一种广谱性除草剂，具有对人畜低毒，杂草难对之产生抗性，低土壤残留量等特点，市场潜力巨大。但是，由于草甘膦的作用机制，它对农作物一样会产生致死效应。为适应大规模机械化生产及施用草甘膦的需要，从20世纪80年代中期开始，人们为培育抗草甘膦农作物做了大量的工作。已有的研究表明，通过向植物的基因组中稳定地转入5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate3-phosphate synthase，EPSP合成酶，EPSPS)基因，使其基因翻译产物在叶绿体中积累到相当的量或者通过定点突变降低酶对草甘膦亲和力等措施，均可以培育出对草甘膦产生耐受性的转基因植株(见Rogers S.G.等，1983，Amplificationof the aroA Gene from Escherichia coli Results in Tolerance to the Herbicide Glyphosate.Applied and environmental microbiology)。因此，开发出新型的EPSP合成酶是农业发展的需要，尤其是对于我国这样的农业大国，意义更为重大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的EPSP合成酶基因、重组质粒、EPSP合成酶，以便培育出更多的对草甘膦产生耐受性的转基因植株。本发明的再一目的是提供所述EPSP合成酶基因、重组质粒、EPSP合成酶的制备方法。

本发明的技术方案：

以盐生杜氏藻(Dunaliella salina)为原料制备EPSP合成酶基因，所述EPSP合成酶基因具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。盐生杜氏藻属绿藻门、绿藻纲、团藻目、多毛藻科、杜氏藻属，主要生长在高盐的水体中。细胞形态通常为卵圆形，当外界渗透压发生变化时，其形态可变为球形或纺锤形。它具有两条等长的鞭毛和一个杯状的叶绿体，在叶绿体的外缘可积累大量的β-胡萝卜素，使细胞呈橙红色。细胞无细胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。EPSP合成酶基因的制备方法依次包括以下步骤：

(1)盐生杜氏藻总RNA的提取与mRNA的分离；

(2)盐生杜氏藻cDNA文库的构建；

(3)盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的全长克隆、测序。

本发明所述EPSP合成酶的重组质粒，含有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，有两种制备方法。第一种制备方法是将所制备的盐生杜氏藻EPSP合成酶基因克隆至植物表达载体形成重组质粒，植物表达载体为pBI121或p2301G(第一种制备方法所构建的重组质粒在附图说明和具体实施方式中称为重组质粒I)。第二种制备方法是将所制备的盐生杜氏藻EPSP合成酶基因片段克隆至中间载体，再通过引入的酶切位点，亚克隆至原核表达载体形成重组质粒(第二种制备方法所构建的重组质粒在附图说明和具体实施方式中称为重组质粒II)。

本发明所述盐生杜氏藻EPSP合成酶是将重组质粒进行表达而成，在原核表达中其纯化包括以下步骤：

1)将重组质粒II转入大肠杆菌中进行原核表达；

2)通过GST亲和层析纯化获得重组的盐生杜氏藻EPSP合成酶。并具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

将上述第一种制备方法制备的重组质粒I转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105中，用于转化模式植物(野生型)，则可培育出对草甘膦产生耐受性的转基因植株。

本发明为防止农作物受草甘膦危害提供了一种新酶，有利于促进农业的增产和发展。

附图说明

图1是含有EPSP合成酶基因的重组质粒I的一种结构示意图，表达载体为pBI121；

图2是含有EPSP合成酶基因的重组质粒II的一种结构示意图，表达载体为pGEX-4T-1。

具体实施方式

实施例1盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的制备

1、盐生杜氏藻的采集

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)购自中国科学院武汉水生生物所藻种库。

2、Poly A⁺RNA的分离(Poly A⁺RNA isolation)

用Trizol试剂(购自Gibco)提取盐生杜氏藻总RNA。采用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。使用Olidotex mRNA Kits(购自Qiagen)提供的试剂盒操作说明书提取盐生杜氏藻的mRNA。

3、盐生杜氏藻cDNA文库的构建(Cloning ofFull-length cDNA)

使用SMART^TM cDNA Library Construction Kit(购自ClonTech)提供的试剂盒使用说明书，以λTriplEX2(购自ClonTech)为载体，构建盐生杜氏藻的cDNA文库。

4、盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

(1)通过对已构建好的cDNA文库进行随机测序，并将测序结果通过BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+Swissprot+Superdate+PIR数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，发现了一条与EPSP合成酶基因具有较高同源性的表达序列标签(EST)，其核苷酸序列见序列表中SEQID NO.3。

(2)盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的3’和5’RACE扩增

根据以上序列分析设计5’RACE引物和3’RACE引物如下(2条引物分别用于第一轮和第二轮的PCR扩增)：

5’RACE引物：5’TTGACAATGGCGACCATGCGTTCCGT3’

             5’TGCAGCGGCTTGCCAAAGGCTGAAG3’

3’RACE引物：5’CATTGTCAACGAGACCCGTAAG3’

             5’GGACTACTGTGTCATCACCCCT3’

使用SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit(购自ClonTech)，按照操作手册进行，得到盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的5’和3’端序列。

(3)PCR扩增获得盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的编码区

在拼接得到全长(包括完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物：P1(正向)：

5’ACGCGGGGGAAAAATCAAAGTTTA3’；P2(反向)：5’ACAACTCCAGCATCACAGTGATTAC3’，并以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，然后通过PCR扩增，并将扩增产物进行克隆、测序。结果验证了盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的全长编码序列的正确性。所获得的盐生杜氏藻EPSP合成酶基因具有序列表中SEQ IDNO.1所述的核苷酸序列。命名为DsEPSPS。

实施例2盐生杜氏藻EPSP合成酶重组质粒II的构建

根据实施例1所制备的盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的全长编码序列，并在保证正确阅读框的条件下，设计能扩增出完整编码读框的引物，正向：5’TCTGCTACTTTGGCGGCTCACAG3’，反向5’AAGGACCCCAGGACTCAGAAGTCC3’，并在正反引物上分别引入限制性酶切位点EcoRI和Xho I。经PCR扩增后，将盐生杜氏藻EPSP合成酶基因TA克隆至中间载体pMD18-T(购自TaKaRa)。用EcoR I和Xho I消化插入盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的中间载体pMD18-T，回收盐生杜氏藻EPSP合成酶基因片段。用EcoR I和Xho I消化表达载体pGEX-4T-1(购自Amersham)，回收经酶切的载体片段。将盐生杜氏藻EPSP合成酶基因插入至表达载体pGEX-4T-1的酶切位点EcoRI和Xho I之间，即形成重组质粒II。命名为pGEX-4T-1-DsEPSPS。

实施例3盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的活性鉴定

将实施例2构建的盐生杜氏藻EPSP合成酶重组质粒转入大肠杆菌JM109中，用于该酶的功能鉴定。

1、体内活性的鉴定

选取转入盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的大肠杆菌JM109，并选取转入pGEX-4T-1空载体的大肠杆菌JM109和野生型的大肠杆菌JM109做为对照，在对照菌和阳性菌中分别加入等量的草甘膦，通过比较对照菌和阳性菌受抑制的情况来确定转入的盐生杜氏藻EPSP合成酶的生物学功能。实验表明转入了盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的大肠杆菌对草甘瞵有明显的抗性。

2、体外活性的鉴定

通过表达载体pGEX-4T-1上的GST融合表达标签，纯化出重组的盐生杜氏藻EPSP合成酶，再根据以下的酶活性测定方法来确定所述酶的活性：

40μl酶促反应体系(1L溶液含50mmol pH7.5的HEPES缓冲液、1mmol(NH₄)₆Mn₇O₂₄、1mmol磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyrurate，PEP)、2mmol 3-磷酸莽草酸(shikimate-3-phosphate，S3P)、1000mg BSA)于25℃下预热5min，加入10μl重组的盐生杜氏藻EPSP合成酶，25℃下酶促反应10min，迅速放入沸水中停止酶促反应，冷却至室温，再加800μl孔雀绿显色反应1min，再加100μl34％的柠檬酸钠溶液，于分光光度计上测定OD₆₆₀值。

实施例4盐生杜氏藻EPSP合成酶的分离与纯化

将转入盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的大肠杆菌JM109接种于4ml LB液体培养基中，37℃过夜振荡培养。次日转接到400ml LB液体培养基中37℃培养，监测菌液OD₆₀₀至0.6-0.7时，在0.5mmol/LIPTG浓度下，29℃诱导4h，离心收集菌体，菌体沉淀经PBS(140mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，5mmol/L Na₂HPO₄，1.8mmol/L KH₂PO₄及5mmol/L EDTA，pH7.2)缓冲液洗涤后重悬浮于20ml PBS(含0.5mol/L NaCl，1mmol/LPMSF及1mmol/L DTT)中，超声破壁，离心收集上清。于此上清中加入Triton X-100至终浓度2％(V/V)，冰上增溶1h，每10min振摇一次，离心得上清与沉淀，上清即为表达蛋白的可溶性粗提液。

将上清上样于已平衡好的Glutathione Sepharose4Fast Flow亲合层析柱(购自Amersham)，用洗脱缓冲液(PBS，含0.5mol/L NaCl)将背景洗脱至基线以完全洗除杂蛋白。将溶解好的Thrombin上柱(10U Thrombin/mg融合蛋白)，柱上切割，于22℃孵育16h，再用PBS洗脱，得到去GST的目的蛋白。此溶液进一步经过分子筛层析，去掉残余Thrombin，收集目的蛋白洗脱峰，得到纯化了的重组盐生杜氏藻EPSP合成酶。

实施例5盐生杜氏藻EPSP合成酶重组质粒I的构建

以植物表达载体pBI121(购自ClonTech)为载体，根据实施例1所制备的盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的全长编码序列，设计扩增出完整编码读框的引物，正向：5’ATGCTGGCGAGGCAGGGTGGCTC3’，反向：5’AAGGACCCCAGGACTCAGAAGTCC3’，并在正反引物上分别引入限制性酶切位点Xba I和Sac I。经PCR扩增后用Xba I和Sac I消化扩增产物，并回收。用Xba I和Sac I消化载体pBI121，回收经酶切的载体片段。将盐生杜氏藻EPSP合成酶基因插入至表达载体pBI121的酶切位点Xba I和Sac I之间，即形成重组质粒I。命名为pBI121-DsEPSPS。

实施例6利用根癌农杆菌叶盘法转化烟草

将实施例5构建的重组质粒转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(购自Pierce)中，获得阳性克隆，用于叶盘法转化烟草(野生型)，步骤如下：

1、用无菌牙签挑取YEB培养基，选择平板上的根癌农杆菌(EHA105)阳性克隆，接种于2mol/LYEB液体(SM⁺，kan⁺)，28℃,200rpm振荡培养24-36h；

2、室温下4,000g离心10min；

3、弃上清，根癌农杆菌菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使根癌农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.5左右；

4、取生长两周左右的无菌叶片，去掉其主脉，将其剪成约1cm²见方的小片；

5、将叶片放入置备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

6、把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃，暗培养48h；

7、将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+羧苄青霉素250mg/L)上，同时在培养基中加入0-0.8mmol/L的草甘膦，25-28℃光照下培养，7-15d可见愈伤组织形成；

8、约20d后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，同时在培养基中加入0-0.8mmol/L的草甘膦，2-7d左右生根。

9、再进一步通过PCR和Southern杂交筛选，确定阳性植株。

待根系发达后，将植株取出，用无菌水清洗附着在根部的固体培养基，移栽到土壤中，刚开始用玻璃罩罩住培养，待植株健壮后取下玻璃罩，室温培养。

实施例7转基因烟草植株的草甘膦抗性鉴定

将实施6培育的转基因植株在转移到土壤中温室培养40d后，使用1.8g/L、17L/100m²浓度的草甘膦喷洒植株叶片，同时喷洒野生型烟草和转入pBI121空载体的烟草作为对照。第一次喷洒7d后进行第二次喷洒，通过对照和转基因烟草的生长状况来鉴定转基因烟草对草甘膦的抗性。

SEQUENCE LISTING

<101>四川大学

<120>盐生杜氏藻EPSP合成酶及其制备方法与应用

<140>

<141>

<160>3

<170>PatentIn version3.2

<210>1

<211>1542

<212>DNA

<213>盐生杜氏藻(Dunaliella salina)

<400>1

atgctggcga ggcagggtgg ctctctcagg gcctcgcagt gtaatgcagg  50

gctggctagg agggtcgagg tgggcgccct ggttgtgcca cgtcccatct  100

cggtaaatga cgtggtccct catgtgtaca gcgcccccct ttcggtggcg  150

aggagaagtt gcagcaagag cagcatcagg agcacgaggc gcctgcagac  200

gacagtttgc tctgctactt tggcggctca cagcgcccct gaccagctag  250

tgctgcaacc catcaagcaa atatcgggca cagtcaggct gcctggatcc  300

aaatccattt ccaaccgcgt tctgctgctg gctgccctgg cggaaggcac  350

cactgtggtg aagaacctgt tggacagcga tgacatccgc tacatggtgg  400

gcgccctgaa gggcttggga attgagctgg aggagcgctg ggacaagggc  450

gagatggttg tcaagggctg cggtggtcag ttctcggccg agggcggcga  500

gctgtttctg ggcaatgcag gcactgccat gcggccctta actgcggctg  550

tggctgctgc tggccgagga aagtttgtgc tggacggcac cgcgcgcatg  600

cgtgagcgtc ccattcagga ccttgtggac ggcttggtgc agctgggcgt  650

ggatgcaaag tgccccttgg gcacggggtg cccgcctgtg gaggtcaatg  700

cacaggggct cccttctggc aaggtgcaac tgaaaggcag cgtgagcagt  750

cagtacctga cagccctcct gatggctgca ccgctctcca aaggcacaga  800

gggcatcgaa atcgtgatca ctgatgagct ggtcagccaa ccatatgtgg  850

atatgactgt ccagatcatg gagcgctttg gcgtgaccgt agagcggctt  900

aatgggctgc agcacatgcg gattccgccc aaccagacat acaagacctc  950

tggcgaggca ttcgtggagg gtgacgcctc gtctgcctcc tacttccttg  1000

ctggggccac gattacaggg gggactgtgg tcgtggaagg ttgcgggtct  1050

gcgtctgtgc agggcgatgt gcgctttgct gaggtcatgg gcctcatggg  1100

tgcaaaagtg gagtggtcct tgtactccat caagatcaca ggcccttcag  1150

cctttggcaa gccgctgcag ggcatcgatc atgactgcaa tgacattccg  1200

gatgcggcca tgacgctggc ggtagcagcc ttgtttgctg acaagcccac  1250

caccatccgc aacgtgtaca actggcgggt gaaggagacg gaacgcatgg  1300

tcgccattgt caacgagacc cgtaagctgg gggccaccgt ggaggaaggg  1350

cgggactact gtgtcatcac ccctcccaag cagatccaga gcgcggccat  1400

cgacacctat gatgaccacc gcatggccat ggccttctcc ttggctgcct  1450

gcggccctgt gcctgtgacc atcaatgacc ctgggtgcac acgcaagacc  1500

ttccctgatt acttccgggt cctggagtcc gtgacgcagc ac          1542

<210>2

<211>514

<212>PRT

<213>盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)

<400>2

Met Leu Ala Arg Gln Gly Gly Ser Leu Arg Ala Ser Gln Cys Asn

1           5                       10                  15

Ala Gly Leu Ala Arg Arg Val Glu Val Gly Ala Leu Val Val Pro

            20                      25                  30

Arg Pro Ile Ser Val Asn Asp Val Val Pro His Val Tyr Ser Ala

            35                      40                  45

Pro Leu Ser Val Ala Arg Arg Ser Cys Ser Lys Ser Ser Ile Arg

            50                      55                  60

Ser Thr Arg Arg Leu Gln Thr Thr Val Cys Ser Ala Thr Leu Ala

            65                      70                  75

Ala His Ser Ala Pro Asp Gln Leu Val Leu Gln ProIle Lys Gln

            80                      85                  90

Ile Ser Gly Thr Val Arg Leu Pro Gly Ser Lys Ser Ile Ser Asn

            95                      100                 105

Arg Val Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Glu Gly Thr Thr Val Val

            110                     115                 120

Lys Asn Leu Leu Asp Ser Asp Asp Ile Arg Tyr Met Val Gly Ala

            125                     130                 135

Leu Lys Gly Leu Gly Ile Glu Leu Glu Glu Arg Trp Asp Lys Gly

            140                     145                 150

Glu Met Val Val Lys Gly Cys Gly Gly Gln Phe Ser Ala Glu Gly

            155                     160                 165

Gly Glu Leu Phe Leu G1y Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu

            170                     175                 180

Thr Ala Ala Val Ala Ala Ala Gly Arg Gly Lys Phe Val Leu Asp

            185                     190                 195

Gly Thr Ala Arg Met Arg Glu Arg Pro I1e Gln Asp Leu Val Asp

            200                     205                 210

Gly Leu Val Gln Leu Gly Val Asp Ala Lys Cys Pro Leu Gly Thr

            215                     220                 225

Gly Cys Pro Pro Val Glu Val Asn Ala Gln Gly Leu Pro Ser Gly

                230                 235                 240

Lys Val Gln Leu Lys Gly Ser Val Ser Ser Gln Tyr Leu Thr Ala

                245                 250                 255

Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ser Lys Gly Thr Glu Gly Ile Glu

                260                 265                 270

Ile Val Ile Thr Asp Glu Leu Val Ser Gln Pro Tyr Val Asp Met

                275                 280                 285

Thr Val Gln Ile Met Glu Arg Phe Gly Val Thr Val Glu Arg Leu

                290                 295                 300

Asn Gly Leu Gln His Met Arg Ile Pro Pro Asn Gln Thr Tyr Lys

                305                 310                 315

Thr Ser Gly Glu Ala Phe Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser

                320                 325                 330

Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Thr Ile Thr Gly Gly Thr Val Val Val

                335                 340                 345

Glu Gly Cys Gly Ser Ala Ser Val Gln Gly Asp Val Arg Phe Ala

                350                 355                 360

Glu Val Met Gly Leu Met Gly Ala Lys Val Glu Trp Ser Leu Tyr

                365                 370                 375

Ser Ile Lys Ile Thr Gly Pro Ser Ala Phe Gly Lys Pro Leu Gln

                380                 385                 390

Gly Ile Asp His Asp Cys Asn Asp Ile Pro Asp Ala Ala Met Thr

                395                 400                 405

Leu Ala Val Ala Ala Leu Phe Ala Asp Lys Pro Thr Thr Ile Arg

                410                 415                 420

Asn Val Tyr Asn Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala

                425                 430                 435

Ile Val Asn Glu Thr Arg ly sLeu Gly Ala Thr Val Glu Glu Gly

                440                 445                 450

Arg Asp Tyr Cys Val Ile Thr Pro Pro Lys Gln Ile Gln Ser Ala

                455                 460                 465

Ala Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser

                470                 475                 480

Leu Ala Ala Cys Gly Pro Val Pro Val Thr Ile Asn Asp Pro Gly

                485                 490                 495

Cys Thr Arg lys Thr Phe Pro Asp Tyr Phe Arg Val Leu Glu Ser

                500                 505                 510

Val Thr Gln His

<210>3

<211>466

<212>DNA

<213>盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)

<400>3

ggggactgtg gtcgtggaag gttgcgggtc tgcgtctgtg cagggcgatg  50

tgcgctttgc tgaggtcatg ggcctcatgg gtgcaaaagt ggagtggtcc  100

ttgtactcca tcaagatcac aggcccttca gcctttggca agccgctgca  150

gggcatcgat catgactgca atgacattcc ggatgcggcc atgacgctgg  200

cggtagcagc cttgtttgct gacaagccca ccaccatccg caacgtgtac  250

aactggcggg tgaaggagac ggaacgcatg gtcgccattg tcaacgagac  300

ccgtaagctg ggggccaccg tggaggaagg gcgggactac tgtgtcatca  350

cccctcccaa gcagatccag agcgcggcca tcgacaccta tgatgaccac  400

cgcatggcca tggccttctc cttggctgcc tgcggccctg tgcctgtgac  450

catcaatgac cctggg

Claims (9)

1.一种盐生杜氏藻EPSP合成酶基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

2.一种盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的重组质粒，其特征在于含有权利要求1所述的核苷酸序列。

3.一种盐生杜氏藻EPSP合成酶，其特征在于它由权利要求2所述的重组质粒表达而成，具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

4.一种权利要求1所述的盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的制备方法，其特征在于以盐生杜氏藻为原料，依次包括以下步骤：

(1)盐生杜氏藻总RNA的提取与mRNA的分离；

(2)盐生杜氏藻cDNA文库的构建；

(3)盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的全长克隆、测序。

5.一种权利要求2所述盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的重组质粒的的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：

(1)按照权利要求4所述方法制备盐生杜氏藻EPSP合成酶基因；

(2)将步骤(1)所制备的盐生杜氏藻EPSP合成酶基因克隆至植物表达载体即形成重组质粒。

6.根据权利要求5所述的盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的重组质粒的制备方法，其特征在于植物表达载体为pBI121或p2301G。

7.一种权利要求2所述盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的重组质粒的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：

(1)按照权利要求4所述方法制备盐生杜氏藻EPSP合成酶基因；

(2)将步骤(1)所制备的盐生杜氏藻EPSP合成酶基因克隆至中间载体，再通过引入的酶切位点，亚克隆至原核表达载体，即形成重组质粒。

8.一种权利要求3所述盐生杜氏藻EPSP合成酶的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：

1)将权利要求7制备的重组质粒转入大肠杆菌中进行原核表达；

2)通过GST亲和层析纯化获得重组的盐生杜氏藻EPSP合成酶。

9.权利要求3所述盐生杜氏藻EPSP合成酶作为农作物防草甘膦致死的应用。

Images