CN106086047A - 靶向基因组改造 - Google Patents

Abstract

本申请涉及靶向基因组改造。具体地，本申请公开了用于一种或多种序列向细胞中的靶向整合和/或靶向切除的方法和组合物，例如，用于一种或多种目的多肽的表达。

Description

靶向基因组改造

本申请是于2011年1月24日提交的申请号为201180013070.5(PCT申请号PCT/US2011/000125)，发明名称为“靶向基因组改造”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年1月22日提交的美国临时申请第61/336,457号的权益，所述申请的公开内容全文据此以引用的方式并入。

发明权益声明

通过联邦资助研究而完成

不适用。

技术领域

本申请属于基因组工程领域，特别是一种或多种外源序列向细胞基因组中的靶向整合和/或靶向切除。

发明背景

在满足对食品生产不断提高的世界性需求的挑战的努力中，生物技术已经成为关键的工具。改善农业生产率的常规方法，如提高产量或经工程改造的害虫抗性，依赖于突变培育或通过转化向作物物种的基因组内引入新基因。两种过程均具有本身固有的非特异性并且相对低效率。例如，常规植物转化方法递送在随机位置整合入所述基因组的外源DNA。因此，为鉴定和分离具有理想特性的转基因种系，必须产生数以千计的独特随机整合事件并且随后对所需个体进行筛选。因此，常规植物的性状工程改造是耗力、耗时并且不可预测的工作。此外，这些整合的随机性使得难以预测是否发生了由非计划的基因组破坏所导致的多效性(pleiotropic effects)。因此，对具有工程改造的基因或性状的植物种系的产生、分离和特征研究已经成为极度的劳动力和成本密集型的过程而且成功率低下。

靶向基因修饰克服了植物系统中常规方法对物力的挑战，并且其本身在基础植物生物学研究和农业生物科技中均已经成为存在已久但是又不易实现的目标。但是，除去经水稻中的阳性-阴性药物选择或使用工程预处理的限制性位点而进行的“基因靶向”的例外，在所有植物物种中，包括模式植物和作物，近来已经证明靶向基因组修饰是非常困难的。Terada等人(2002)Nat Biotechnol 20(10):1030；Terada等(2007)Plant Physiol 144(2):846；D'Halluin等(2008)Plant Biotechnology J.6(1):93。

在哺乳动物细胞中，稳定的转基因和靶向的基因插入在基因治疗和细胞工程中均具有大量潜在的应用。但是，当前的策略通常低效率并且将所述转基因非特异地插入基因组DNA。无法控制基因组插入的位置可能导致转基因表达在整个群体中的高变水平，其由所述基因组内的位置效应所导致。另外，当前的稳定转基因和转基因扩增的方法通常引起所述转基因的实体丢失、随时间而发生的转基因沉默、由基因和自主启动子(autonomouspromoter)向内源基因内部或其邻近的整合所导致的插入式突变发生(insertionalmutagenesis)、染色体异常的产生和重排基因产物(包含内源基因、所述插入转基因或两者均包含)的表达和/或来自源于载体的基因的载体相关毒性或免疫原性在体内的产生，所述源于载体的基因出于所述载体长期存留以提供稳定转基因表达的需要而永久性地表达。

近期，已经描述了用于基因组DNA的靶向切割的方法和组合物。这些靶向切割事件可被用于，例如，用于诱导靶向突变发生、诱导细胞DNA序列的靶向缺失，以及协助在预定染色体基因座上的靶向重组。参见，例如美国专利公开号第20030232410号；第20050208489号；第20050026157号；第20050064474号和第20060188987号，以及国际公开号第WO 2007/014275号，其公开内容全文出于全部目的以引用的方式并入。美国专利公开号第20080182332号描述了非标准锌指核酸酶(ZFN)对于植物基因组的靶向修饰的用途，并且美国专利公开第20090205083号描述了植物EPSPS基因座的ZFN介导的靶向修饰。另外，Moehle等人(2007)Proc.Natl.Acad,Sci.USA104(9):3055-3060)描述了将设计的ZFN用于在特定基因座进行的靶向基因加入。

但是，仍存在对用于靶向整合的组合物和方法的需求，包括用于向植物中进行靶向整合用以在所述植物及其子代中建立稳定的、可遗传的基因修饰的组合物和方法，以及用于向哺乳动物细胞中进行靶向整合以用于基因治疗和细胞系开发目的的组合物和方法。

发明概述

本申请提供了用于表达已被整合入多重插入位点的一个或多个外源核酸序列产物(即，蛋白质或RNA分子)的方法和组合物，所述多重插入位点整合于细胞基因组之中。所述细胞可以是真核细胞，例如植物、酵母或哺乳动物细胞。

通过多核苷酸序列向所述细胞基因组中的基因组整合而协助了外源核酸序列的整合，所述多核苷酸序列包含一种或多种核酸酶的多重靶点，例如锌指核酸酶(ZNF)。所述多核苷酸(本文也称为多重插入位点)实现了在所述细胞的基因组中的特异性的靶向双链切割，所述双链切割接下来导致了通过同源依赖性和同源不依赖性机制而进行的所述外源序列的整合。

因此，在一个方面，本文公开了核酸分子(也称为多重插入位点)，其包含核酸酶的一种或多种靶点，诸如锌指核酸酶(ZFN)。在特定的实施方案中，所述多重插入位点被整合进入的内源基因组中并不存在于所述靶点。所述多重插入位点可包含核酸酶的1种、2种、3种、4种、5种、6种或更多靶点。在特定的实施方案中，两个结合DNA-结合蛋白(binding DNA-binding proteins)的切割-半结构域(cleavage-half domains)的二聚化为切割所必需(例如，各结合一个位点的一对核酸酶为切割所需)，所述结合DNA-结合蛋白结合于邻近靶点(成对靶点)。在本文所述任意多重插入位点中，各对靶点的一个靶点可包含相同序列。参见，例如图1。在特定的实施方案中，至少一对的靶点是相同的。在其它的实施方案中，至少一对靶点包含来自不同靶的单独靶序列(例如，不同的基因和/或来自不同生物体的基因)。在特定的实施方案中，所述成对靶点中的至少一个包含选自由SEQ ID NO:1-20所组成的组的序列。在特定的实施方案中，所述多重插入位点可多包含一种编码序列，例如包含草胺膦乙酰转移酶(PAT)编码序列的植物转录单元(PTU)，或用于哺乳动物细胞的筛选标记物。

所述多重插入位点被整合进入细胞(例如，植物或哺乳动物细胞)的基因组中以向所述核酸酶(例如，ZFN)提供基因组靶。在特定的实施方案中，所述靶点经选位以使一对或多对所述锌指核酸酶作为同二聚体而结合并且切割。在其它实施方案中，所述靶点经选位以使一对或多对所述锌指核酸酶作为异二聚体而结合并且切割。

在另一个方面，本文公开了植物或种子，其包含本文所述的一种或多种多重插入位点和/或整合进入所述多重插入位点的一种或多种外源序列。在特定的实施方案中，将所述多重插入位点和/或外源序列整合进入玉米植物的配子体中。

在特定的方面，本文提供了经修饰的哺乳动物细胞系、经修饰的原代细胞、经修饰的干细胞和/或转基因动物，其包含本文所述的一种或多种多重插入位点和/或整合进入所述多重插入位点的一种或多种外源序列。

在另一个方面，本文提供了用于将外源序列整合进入所述多重插入位点的方法，所述多重插入位点整合于细胞(例如，植物或哺乳动物细胞)的基因组中，所述方法包括：(a)将包含一种或多种核酸酶靶点的多重插入位点多核苷酸整合进入所述细胞的基因组中；(b)提供和/或表达与所述多重插入位点多核苷酸中的第一种靶点结合的一种或多种核酸酶，从而使所述核酸酶与其靶点的结合切割了所述细胞的基因组；以及(c)将所述细胞接触包含外源核酸序列的多核苷酸，由此产生了所述外源序列向所述细胞的基因组中在所述多重插入位点多核苷酸内进行的同源性依赖的整合。

在另一个方面，本文提供了用于将多个外源序列整合进入细胞(例如，植物或哺乳动物细胞)基因组中的方法，所述方法包括：(a)将包含一种或多种核酸酶靶点的第一种多重插入位点多核苷酸整合进入所述细胞的基因组中，其中所述第一种多重插入位点多核苷酸包含至少一个第一种基因，所述第一种基因两侧具有第一种和第二种核酸酶的靶点；以及(b)在所述细胞中在第二种多重插入位点多核苷酸存在的情况下表达所述第一种或第二种核酸酶，所述第二种多重插入位点多核苷酸包含至少一个第二种基因，所述第二种基因两侧具有第三种和第四种核酸酶的靶点，由此而引起了所述第一种和第二种基因向所述细胞的基因组中的整合。在特定的实施方案中，所述方法进一步包含一次或多次的重复进行步骤，所述步骤对存在于所述被插入的多重插入位点上的适当的核酸酶进行表达用以整合额外的外源序列，包括编码序列和/或核酸酶位点。所述核酸酶可以是异二聚体的ZFN并且在一种或多种所述核酸酶之间可能具有相同的一个单体。在一些实施方案中，用于插入的所述外源DNA序列可包含ZFN半靶点，从而通过所述外源序列的整合而产生了新的ZFN靶点，其包含关联于所述供体DNA的半靶点以及关联于所述基因组DNA的半靶点。这一新型ZFN靶点可作为靶点用于类似的新型异二聚体ZFN。

在另一个方面，本文公开了用于在细胞中(例如，植物或哺乳动物细胞)表达一种或多种外源核酸序列产物的方法，所述方法包括：根据本文所述的任意方法整合一种或多种外源核酸序列，从而将所述外源序列整合进入所述细胞的基因组中的所述被整合的核酸分子内并且表达所述外源序列的产物。

还提供了对插入细胞基因组内的一种或多种基因进行缺失的方法，所述方法包括，通过本文所述的任意方法整合多个外源序列并且在所述细胞中表达所述适当的核酸酶从而将一种或多种所述外源序列从所述基因组中缺失。在特定的实施方案中，所述被缺失的外源序列是标记物基因。在特定的实施方案中，所述外源序列的缺失以及所述基因组内的末端随后的重新粘合在所述基因组位置产生了功能性的基因或序列，例如可表达的筛选标记物的产生。

在又一个方面，提供了提供经基因组改造的细胞的方法，所述方法包括根据本文所述的任意方法在第一种细胞中整合和/或切割一种或多种外源核酸序列，使所述第一种细胞发育成为第一种性成熟的生物体，将所述生物体与在等位基因位置包含基因组改造的第二种生物体杂交以产生第二种细胞，所述第二种细胞具有第一种和第二种生物体的基因组改造。在特定的实施方案中，所述生物体是植物。在其它的实施方案中，所述生物体是转基因动物。

在本文所述的任意方法中，可将所述方法与基因组改造的其它方法进行组合使用，所述基因组改造包括在一种或多种内源基因座处的靶向整合和/或靶向失活。此外，在本文所述的任意方法中，所述核酸酶可包含一种或多种融合蛋白，其包含锌指结合结构域和切割半结构域，其中已经对所述锌指结合结构域进行工程改造从而使其结合于所述多重插入位点的靶点。此外，在任意这些方法中，所述外源核酸序列包含一种或多种序列，其与多重插入位点的序列和/或所述多重插入位点所整合进入的区域的内源序列同源。

在本文所述的任意方法中，所述一种或多种多重插入位点可通过任意适当的方法被整合进入所述基因组，例如，通过以利用ZFN的核酸酶(如ZFN)进行的靶向整合，所述ZFN靶向于所需的受到插入的内源基因。或者，可使用标准技术将所述一种或多种多重插入位点随机整合进入所述细胞的基因组。

所述外源核酸序列可包含具有或不具有一种或多种启动子的编码一种或多种功能性多肽的序列(如，cDNA)，并且/或者可产生一种或多种RNA序列(如，通过一种或多种shRNA表达盒)，其向所述生物体提供所需性状。植物中的这些性状包括但不限于，除草剂抗性或耐受性；昆虫抗性或耐受性；疾病抗性或耐受性(病毒、细菌、真菌、线虫)；胁迫耐受性和/或抗性，例如对干旱、高温、寒冷、结冻、过潮湿、盐胁迫、氧化胁迫的抗性或耐受性；提高的产量；食物含量和组成；外观(physical appearance)；雄性不育；干化(drydown)；抗倒伏(standability)；多产；淀粉量和质量；油量和质量；蛋白量和质量；氨基酸组成；等等。当然，可根据需要使用任意描述的任意两种或更多种外源核酸，诸如产生除草剂、昆虫、疾病(病毒、细菌、真菌、线虫)或干旱抗性、雄性不育、干化、抗倒伏、多产、淀粉特征、油量和质量的外源核酸或提高产量或营养品质的外源核酸。在特定的实施方案中，所述外源核酸序列包含编码除草剂抗性蛋白(如，AAD(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)基因)和/或其功能片段的序列。所述整合序列的表达可由操作性地连接于所述整合序列的启动子所驱动。或者，所述整合序列是无启动子的并且通过所述多重插入位点多核苷酸的插入区域中的内源启动子驱动转录。在其它的实施方案中，对结合位点的所述切割和非精确修复可灭活或者激活目的基因。在特定的实施方案中，所述多核苷酸是质粒。在其它实施方案中，所述多核苷酸是线性DNA分子。

在哺乳动物细胞中，本发明的方法和组合物可被用于细胞系构建，例如用于构建表达多聚体多肽如抗体的细胞系。在一些实施方案中，可将所述细胞系用于研究目的，如用于构建表达目的通路成员的细胞系。在一些实施方案中，可将原代细胞或干细胞用于表达目的多聚体蛋白质以用于细胞治疗的目的。

在另一个方面，本文提供了测量锌指核酸酶活性的方法。在特定的实施方案中，所述方法包括：(a)提供根据本文所述的至少一种锌指核酸酶和核酸分子，其中所述各个成对靶点均包含两个锌指核酸酶半靶点，所述锌指核酸酶与其相结合，并且包含被所述结合锌指核酸酶切割的切点，所述切点位于所述半靶点之间；(b)将所述锌指核酸酶结合于所述核酸从而使所述锌指核酸酶至少在所述切点内部切割所述成对靶点；(c)对至少所述切点进行测序以产生序列数据；以及(d)在所述序列数据中将所述切点内部的碱基对缺失的数量和长度与缺乏所述锌指核酸酶情况下的所述切点内部的碱基对缺失的数量和长度进行比较，由此而测量了所述成对靶点处的所述锌指核酸酶活性。在特定的实施方案中，超过一个碱基对的缺失显示了所述锌指核酸酶的提高的活性。

在又一些实施方案中，本文提供了用于对锌指核酸酶在成对靶点处的活性进行最优化的方法。在特定的实施方案中，所述方法包括(a)提供根据本文所述的至少一种锌指核酸酶和核酸分子，其中所述各个成对靶点均包含两个锌指核酸酶半靶点，所述锌指核酸酶与其相结合，并且包含被所述结合锌指核酸酶切割的切点，所述切点位于所述半靶点之间；(b)将所述一种或多种锌指核酸酶结合于所述核酸从而使所述锌指核酸酶至少在所述切点内部切割所述成对靶点；(c)测定所述锌指核酸酶在所述切点处的活性水平；(d)变动所述切点内的碱基对数量；(e)多次重复步骤(b)-(d)；以及(f)选择用于并入所述核酸的切点，其包含提供了最高水平的锌指核酸酶活性的碱基对数量，由此而对锌指核酸酶在所述成对靶点处的活性进行了最优化。

在本文所述的涉及锌指核酸酶的任意方法中，所述第一种和第二种切割半结构域来自IIS型限制性核酸内切酶，例如FokI或StsI。此外，在本文所述的任意方法中，所述融合蛋白中的至少一种可在所述切割半结构域的二聚化界面的氨基酸序列中包含改动，例如包含改动以形成所述切割半结构域的专性异二聚体(obligate heterodimers)。

在本文所述的任意方法中，所述植物细胞可包含单子叶植物和双子叶植物细胞。在特定的实施方案中，所述植物细胞是作物植物，例如玉米。在特定的实施方案中，所述细胞可包含哺乳动物细胞，诸如原代细胞、细胞系或干细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞系可被用于目的多肽的生产。

具体地，本申请涉及如下各项：

1.一种分离的核酸，其包含用于一对或多对锌指核酸酶的多个成对靶点。

2.根据项1所述的核酸分子，其中来自各成对靶点的一个靶点包含相同的序列。

3.根据项1或2所述的核酸分子，其进一步包含一种或多种编码序列。

4.一种细胞或细胞系，其包含根据项1-3中任一项的核酸分子。

5.根据项1所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞，诸如植物细胞或哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系。

6.根据项4或项5所述的细胞，其中所述核酸分子被整合进入所述细胞的基因组。

7.一种用于将一种或多种外源序列整合进入细胞基因组的方法，所述方法包括

(a)向根据项6的细胞中提供一对或多对锌指核酸酶，其中所述锌指核酸酶结合于所述被整合核酸分子中的靶点，从而使所述核酸酶与其靶点的结合切割了所述细胞的基因组，以及

(b)将所述细胞接触包含外源序列的多核苷酸，其中所述外源序列被整合于细胞的基因组中所述被整合的核酸内。

8.根据项7所述的方法，其进一步包含使用另外的锌指核酸酶对步骤(a)和(b)的重复，所述锌指核酸酶在另外的外源序列存在的情况下切割所述整合的核酸分子中另外的靶点，由此将所述另外的外源序列插入所述细胞的基因组中。

9.根据项8所述的方法，其中一种或多种所述外源序列包含锌指核酸酶的一种或多种靶点。

10.根据项9所述的方法，其中所述靶点是锌指核酸酶半靶点，其中通过所述半靶点的整合创建了靶点。

11.根据项7至10中任一项所述的方法，其中一种或多种所述外源序列包含编码序列并且所述细胞表达所述编码序列的产物。

12.一种用于使插入细胞基因组中的一个或多个序列缺失的方法，所述方法包括：

(a)对根据项7至11中任一项的多种外源序列进行整合；以及

(b)在所述细胞中表达所述适当的核酸酶，从而将一种或多种所述外源序列从所述基因组中缺失。

13.一种提供基因组改造的细胞的方法，所述方法包括

(a)根据项7至12中任一项所述的方法在至少第一种细胞中整合或缺失一种或多种外源序列：

(b)使所述第一种细胞发育成为性成熟的生物体；以及

(c)将所述生物体与包含基因组改造的第二种生物体进行杂交以产生第二种细胞，所述第二种细胞具有所述第一种和第二种生物体的至少一种基因组改造。

14.根据项13所述的方法，其中所述第二种细胞基因组改造在所述第二种细胞中单一基因组位置包含多种异源基因。

15.根据项7至14中任一项所述的方法，其中所述细胞在包含所述被整合的核酸分子的区域外进一步包含对其基因组的修饰。

16.根据项7至14中任一项所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。

附图简述

图1是描述本文所述的示例性多重插入位点的图示。图1示出了由7种ZFN靶点组成的多重插入位点。以几何图的形式描述了结合所述靶点的ZFN对。“条段(block)1”是在所述适当的ZFN对存在的情况下被整合进入所述多重插入位点的外源序列，同时维持了所述ZFN靶点(阴影和方格纹的三角形)。图1示出了“条段1”在所述适当的ZFN对存在的情况下向多重插入位点中的整合，其取代了所述ZFN靶点。

图2是描述图1中所示出的示例性多重插入位点的图示，其中“条段2”是在所述适当的ZFN对存在的情况下被整合进入所述多重插入位点的外源序列。

图3是受ZFN加强的等位基因间重组的图示。位于相同基因组位置但相互取代的两个插入在经ZFN进行的双链切割后可进行同源重组或链交换。可通过将表达所述ZFN对的植物与包含两种等位基因的植物在一起杂交或使用包含单等位基因的植物通过杂交双方引入所述两种ZFN对单体而提供所述ZFN对(两种ZFN单体表达在一起)。

图4是描述了异二聚体ZFN的“左”和“右”靶结构域的用途的图示。顶部线条描述了具有所述左和右靶ZFN结构域的基因组(阴影三角形和方格纹三角形)。当在包含侧连有不同异二聚体对的基因的外源分子存在的情况下加入所述适当的ZFN对时，根据示出而将所述基因和侧生核酸酶位点插入了所述基因组。

图5是描述了在整合入基因组的序列的两端各一侧上进行的外源序列(描述为“基因”)整合和切除的图示。所述加入的基因侧连有同源区域用以引导所述基因盒进入所述适当位点。通过在所述被插入DNA产生两个新组合而重组了用于插入的所述ZFN靶点的2个半靶点。通过将所述适当的ZFN对结合以在所述侧连ZFN靶点处切割，从而实现了对基因盒的切除。切除可能需要包含同源臂(homology arm)的模板以防止对所需DNA序列的缺失。各“基因”可包含一个或多个序列，例如一个或多个编码序列。

图6是描述了使用ZFN异二聚体(描述成具有不同填充的三角形的形式)对插入的标记物基因的切除和“再循环”的图示。

图7是pDAB105900的质粒图谱。

图8是pDAB105908的质粒图谱。

图9是所述锌指核酸酶同二聚体表达盒的示意图。

图10是所述锌指核酸酶异二聚体表达盒的示意图。

图11示出了玉米中的eZFN切割活性，其根据由切割后非同源性末端粘合所产生的缺失频率而测定。

图12示出了烟草中的eZFN切割活性，其通过由切割后非同源性末端粘合所产生的缺失频率而测定。

图13是进入相同基因座的两种转基因插入的示意图。顶部的线示出了将多重插入位点标记为MIS(本文也称为着位台(landing pad))的随机序列，其包含所述基因座处的同源重组所需的eZFN结合位点和包含卡那霉素可选择标记物基因和GUS可筛选标记物基因的条段1。中部的线描述了与顶部DNA相同的多重插入位点(MIS)，其与包含潮霉素抗性可选择标记物基因和黄色荧光蛋白可筛选标记物基因的条段2在一起。(HPT/YFP)。底部的线描述了所述重组之后的基因座。

图14示出了通过ZFN在等位基因位置进行的同源重组和两种不同的DNA插入在与图13中所述的相同基因座处的生成。将包含条段1(包含所述卡那霉素和GUC标记物，GUS/NPT)、多重插入位点(MIS或着位台)和条段2(包含所述潮霉素和黄色荧光标记物，HPT/YFP)的构建体转化进入拟南芥。为在独立的植物中产生与所述多重插入位点在一起的各单条段，将条段2从所述整合位点切除以生成单条段1结构，或将条段1从所述整合位点切除以生成单条段2结构。通过将包含所述原始转基因事件的植物与表达ZFN的植物进行杂交而完成对基因条段的去除，所述ZFN在侧连于各所述基因条段的eZFN结合位点进行切割。将所述被回收的单条段植物进行杂交以将所述两种结构共置于单一植物体内，并且将该植物杂交于表达减数分裂特异性启动子的植物以影响所述条段1和条段2两种等位基因间的DNA交换。

图15是描述用于获得位于所述相同基因座的两种DNA序列间重组的步骤的流程图，所述重组通过ZFN切割在所述两种序列间的中间位点上进行。图16中所描述的构建体被转化进入拟南芥。通过与表达eZFN的植物进行杂交而除去所述两种基因条段(图14中所描述)之一，其产生了包含条段1或条段2的植物，所述eZFN的结合位点侧连于所述条段。

图16是用于将交换基因座(Exchange Locus)引入拟南芥的质粒的图示。其包含根据图14中所描述的条段1和2以及所述多重插入位点序列。标示出了所述eZFN结合位点并且其侧连于条段1和2(条段1：eZFN 1和8；条段2：eZFN 3和6)或位于所述多重插入位点中心(eZFN 4和7)以协助同源重组。

发明详述

本申请涉及用于向基因组中的靶向整合(TI)的方法和组合物，例如作物植物如玉米，或哺乳动物细胞。将包含一种或多种核酸酶(如ZFN)的多个靶点的多重插入位点整合进入所述基因组。随着所述多重插入位点整合进入所述基因组，将所述适当的核酸酶与待插入的外源序列一起引入所述细胞。

在特定的实施方案中，所述核酸酶包含一种或多种ZFN。ZFN一般包含切割结构域(或切割半结构域)和锌指结合结构域，并且可作为蛋白质、作为编码这些蛋白质的多核苷酸或作为多肽和多肽编码多核苷酸的组合而被引入。锌指核酸酶一般随着所述切割半结构域的二聚化以二聚体蛋白质的形式发挥作用。专性二聚化ZFN已被描述，在其中结合所述“左”和“右”识别结构域的ZFN单体可结合以形成活性核酸酶。参见，例如，美国专利公开号第2008/0131962号。因此，如果存在适当的靶点，“左”单体可与任意的“右”单体形成活性的ZF核酸酶。基于可以通过多种组合进行使用的经验证的左和右结构域，这显著地增加了可使用的核酸酶位点的数量。例如，4种同二聚体ZF核酸酶的结合位点的重组产生了另外12种异二聚体ZF核酸酶。更重要的是，其实现了转基因设计的系统性方法从而使各个新引入的序列侧连以独特的ZFN位点，其可被用于切除所述基因使其离去或用于将另外的基因靶向于其邻侧。此外，该方法可简化向单基因座中进行堆叠(stacking)的策略，其通过ZFN依赖的双链断裂而进行。

锌指结合结构域可以是标准的(C2H2)锌指或非标准(如C3H)的锌指。此外，所述锌指结合结构域可包含一种或多种锌指(如2、3、4、5、6、7、8、9或更多种锌指)并且可经工程改造以结合所述多重插入位点中的任意序列。这样的一种融合蛋白(或多种融合蛋白)在细胞中的存在导致了所述融合蛋白与其结合位点的结合和在所述多重插入位点内的切割，其导致了所述外源序列的整合。

概述

除非另外地指明，否则本方法的实施以及本文所公开的组合物的制备和应用使用了分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA及相关领域的常规技术，其属于本领域的技术。在所述文献中全面地解释了这些技术。参见，例如Sambrook等人,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第二版,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989和第三版,2001；Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987以及定期的更新；METHODS IN ENZYMOLOGY系列,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,第3版,Academic Press,San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY,第304卷,“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编著),Academic Press,San Diego,1999；以及METHODS INMOLECULAR BIOLOGY,第119卷,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker编著)Humana Press,Totowa,1999。

定义

所述术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换地使用并且指的是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，其处于线状或环状构象，并且处于单链或双链形式。出于本申请的目的，不应将这些术语解释成为针对聚合体长度的限制。所述术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分受到修饰的核苷酸(如磷硫酰骨架)。特定核苷酸的类似物通常具有相同的碱基配对特异性，即，A的类似物应与T碱基配对。

所述术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换地用于指称氨基酸残基的聚合体。所述术语还适用于氨基酸聚合物，所述氨基酸聚合物中一种或多种氨基酸是对应于天然存在的氨基酸的化学类似物或修饰的衍生物的聚合物。

“结合”指的是大分子间(如，蛋白质和核酸之间)的序列特异的非共价相互作用。并非结合相互作用的所有组分均须是序列特异的(如，与DNA骨架中的磷酸残基的接触)，只要所述相互作用作为整体是序列特异的。这些相互作用特征通常在于10^-6M^-1或更低的解离常数(K_d)。“亲和性”指的是结合的强度：提高的结合亲和性关联于更低的K_d。

“结合蛋白”指的是能够结合另一种分子的蛋白质。结合蛋白可结合于，例如，DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。对于蛋白质结合蛋白，其可结合于自身(以形成同二聚体，同三聚体等)并且/或者其可结合于不同蛋白质的一个或多个分子。结合蛋白可具有超过一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白质结合活性。

“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是以序列特异性方式通过一个或多个锌指与DNA结合的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，所述锌指是所述结合结构域内的氨基酸序列区域，其结构通过与锌离子的配位而稳定化。所述术语锌指DNA结合蛋白通常简称为锌指蛋白或ZFP。

锌指结合结构域可经“工程改造”以结合预设的核苷酸序列。用于工程改造锌指蛋白的方法的非限制性实例是设计和选择。经设计的锌指蛋白是非天然存在的蛋白质，其设计/组成主要通过理性标准而产生。用于设计的理性标准包括替换法则和计算机算法的应用，所述计算机算法用于在已有ZFP设计和结合数据的信息存储数据库中加工处理信息。参见，例如，美国专利6,140,081；6,453,242；和6,534,261；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。

经“选择”的锌指蛋白是未见于天然情况下的蛋白质，其产生主要由于实证过程，诸如噬菌体展示、互作阱或杂交选择。参见，例如US 5,789,538；US 5,925,523；US 6,007,988；US 6,013,453；US 6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197和WO 02/099084。

所述术语“序列”指的是任意长度的核苷酸序列，其可以是DNA或RNA；可以是线状、环状或分支状，并且既可以是单链也可以是双链。所述术语“供体序列”指的是被插入基因组的核苷酸序列。供体序列可以是任意长度，例如长度介于2与10,000个核苷酸之间(或在其之间的或超出其上的任意整数值)，优选地长度介于约100与1,000个核苷酸之间(或在其之间的任意整数)，更优选地长度介于约200与500个核苷酸之间。

“同源非等同序列”指的是与第二种序列具有一定程度的序列一致性的第一种序列，但其序列并不等同于所述第二种序列。例如，包含突变体基因的野生型序列的多核苷酸与所述突变体基因的序列是同源并且非等同的。在特定的实施方案中，所述两种序列间的同源性程度足以利用正常细胞机制实现其之间的同源性重组。两个同源非等同序列可以是任意长度并且其非同源性程度可以低至一个单核苷酸(如，通过靶向同源性重组而进行的对基因组点突变的校正)或高达10个或更多千碱基(如，在染色体中在预设异位位点(ectopic site)的基因插入)。包含所述同源非等同序列的两种多核苷酸并不需要长度相同。例如，可使用介于20与10,000个核苷酸或核苷酸对的外源多核苷酸(即，供体多核苷酸)。

用于测定核酸和氨基酸序列一致性的技术在本领域中是已知的。这些技术一般包括测定基因的mRNA核苷酸序列和/或测定其所编码的氨基酸序列，并且将这些序列与第二种核苷酸或氨基酸序列进行比较。还可以通过这种方式测定和比较基因组序列。一致性通常分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸的对应。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可通过测定其百分比一致性而进行比较。无论是核酸或氨基酸序列，两个序列的百分比一致性是两个比对序列间精确匹配的数量除以较短序列的长度并乘以100。用于核酸序列的近似比对由Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)的局部同源性算法(local homology algorithm)而提供。通过使用由Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff编著,5suppl.3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA开发并由Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)进行归一化的计分矩阵(scoring matrix)可将这一算法用于氨基酸序列。Genetics Computer Group(Madison,WI)在“BestFit”功能应用中提供了将这一算法用于测定序列的百分比一致性的示例性应用。用于计算序列间百分比一致性或相似性的适当程序通常在本领域中是已知的，例如，另一种比对程序是以默认参数进行使用的BLAST。例如，BLASTN和BLASTP可通过遵循默认参数而使用：基因编码＝标准；过滤＝无；链＝两者兼有；截留＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝HIGH SCORE；数据库＝无冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的细节可见于互联网。对于本文所述的序列，序列一致性的所需程度的范围是约80％至100％以及其间的任意整数值。序列间的百分比一致性一般是至少70-75％，优选地80-82％，更优选地85-90％，甚至更优选地92％，愈加优选地95％，并且最优选地98％的序列一致性。

或者，可通过在实现同源区域间的稳定二联体形成的条件下进行的多核苷酸杂交而测定多核苷酸间的序列相似性的程度，所述杂交之后使用单链特异性核酸酶进行消化并且对被消化片段进行长度测定。根据上文方法测定，当两种核酸或两种多肽序列在所述分子限定长度上表现出至少约70-75％的序列一致性时，所述序列是实质上相互同源的，所述序列优选地表现出80％-82％的序列一致性，更优选地85-90％，甚至更优选地92％，愈加优选地95％，并且最优选地98％的序列一致性。本文所使用的实质上同源还指对特定DNA或多肽序列表现出完全一致性的序列。可通过Southern杂交实验而鉴定实质上同源的DNA序列，所述实验根据这一特定系统所限定在，例如，严苛条件下进行。对适当的杂交条件进行限定属于本领域的技术。参见，例如，Sambrook等人的上文引用；Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach,编辑B.D.Hames和S.J.Higgins,(1985)Oxford；Washington,DC；IRL Press)。

可根据下文测定两种核酸片段之间的选择性杂交。两种核酸分子间的序列一致性程度影响这些分子间的杂交事件的效率和强度。部分等同的核酸序列应至少部分地抑制完全等同的序列与靶分子的杂交。可使用本领域中众所周知的杂交分析(如，Southern(DNA)印迹、Northern(RNA)印迹、溶液杂交或类似方法，参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)估测对完全等同序列的杂交的抑制。可使用多种程度的选择性进行这些分析，例如使用从低严苛性至高严苛性变动的条件。如果使用了低严苛性的条件，可使用二级探针估测非特异性结合的缺乏，所述探针更为缺少部分程度的序列一致性(例如，对于所述靶分子具有低于约30％的序列一致性探针)，从而在缺乏非特异性结合事件的情况下使所述二级探针不与所述靶杂交。

当利用基于杂交的检测系统时，选择与参比核酸序列互补的核酸探针，并且随后所述探针与所述参比序列通过适当条件的选择而选择性地互相杂交或结合以形成二联体分子。能够在中度严苛杂交条件下与参比序列选择性地杂交的核酸分子一般在实现对至少长约10-14个核苷酸的靶核酸序列的检测的条件下杂交，所述靶核酸序列与所述被选择的核酸探针的序列具有至少约70％的序列一致性。严苛杂交条件一般实现对至少长约10-14个核苷酸的靶核酸序列的检测，所述靶核酸序列与所述被选择的核酸探针的序列具有超过约90-95％的序列一致性。在所述探针和参比序列具有一定特异程度的序列一致性的情况下，可根据本领域中所知测定可用于探针/参比序列杂交的杂交条件(参见，例如Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach,编辑B.D.Hames与S.J.Higgins,(1985)Oxford；Washington,DC；IRL Press)。

杂交条件为本领域的技术人员所熟知。杂交严苛性指的是杂交条件不利于形成包含错配核苷酸的杂交的程度，更高的严苛性关联于对错配杂交更低的容忍度。影响杂交严苛性的因素为本领域的技术人员所熟知并且包括但不限于，温度、pH、离子强度和有机溶剂如甲酰胺和二甲亚砜的浓度。根据本领域的技术人员所知，更高的温度、更低的离子强度和更低的溶剂浓度提高了杂交严苛性。

对于杂交的严苛性条件，本领域众所周知可使用大量的等价条件以产生特定的严苛性，其通过改变，例如，下列的因素而进行：所述序列的长度和特性、所述多种序列的碱基组成、盐和其它杂交溶液组分的浓度、封闭剂在所述杂交溶液(如，硫酸葡聚糖和聚乙二醇)中的存在与否、杂交反应温度和时间参数以及改变洗涤条件。根据本领域中的标准方法选定对杂交条件的特定组合的选择(参见，例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)。

“重组”指的是在两种多核苷酸之间基因信息的交换过程。处于本发明的目的，“同源重组(HR)”指的是这样的交换的特化形式，其发生于，例如，对细胞内的双链断裂的修复期间。这一过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子以对“靶”分子(即，受到双链断裂的分子)进行模板式修复，并且被不同地称为“非交叉基因转换(non-crossover geneconversion)”或“短片基因转换(short tract gene conversion)”，这是因为其导致基因信息从所述供体向所述靶的转移。不期望受任何特定理论的束缚，这样的转移可参与对所述断裂的靶和所述供体间形成的异二联体DNA的错配校正，和/或参与“合成依赖的链退火”，其中将所述供体用于重新合成基因信息，所述基因信息将成为所述靶的一部分，和/或参与相关过程。这样特化的HR通常产生所述靶分子的序列的改动，从而将所述供体多核苷酸的部分或全部序列并入所述靶多核苷酸。

“切割”指的是DNA分子的共价骨架的断裂。切割可通过多种方法起始，其包括(但不限于)磷酸二酯键的酶学或化学水解。单链切割和双链切割均有可能，并且双链切割可由于两次不同的单链切割事件而发生。DNA切割可导致平末端或交错末端的产生。在特定的实施方案中，可将融合多肽用于靶向双链DNA切割。

“切割结构域”包含对于DNA切割具有催化活性的一个或多个多肽序列。切割结构域可包含于单条多肽链内，或切割活性可由两个(或更多)多肽的结合所产生。

“切割半结构域”是多肽序列，其结合第二个多肽(相同或不同)以形成具有切割活性(优选地是双链切割活性)的复合体。

“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白质结构。细胞染色质包含核酸，其主要为DNA，以及蛋白质，其包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白质。真核细胞染色质的大部分以核小体的形式存在，其中一个核小体核心包含约150个碱基对的DNA，其结合于包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个的八聚体；并且连接DNA(长度根据生物体而可变动)延伸于核小体核心之间。组蛋白H1分子通常与连接DNA结合。出于本申请的目的，所述术语“染色质”意在涵盖全部类型的细胞核蛋白质，原核与真核均包括在内。细胞染色质包括染色体和附加体染色质。

“染色体”是包含细胞基因组的全部或部分的染色质复合体。细胞的基因组通常特征在于其染色体组型，其为包含所述细胞基因组的全部染色体的集合。细胞基因组可包含一个或多个染色体。

“附加体”是复制性的核酸、核蛋白质复合体或包含核酸的其它结构，其并非细胞染色体的染色体组型的一部分。附加体的实例包括质粒和特定的病毒基因组。

“可接近区域”是细胞染色质中的位置，其中存在于所述核酸中的靶点可被识别所述靶点的外源分子结合。不期望受任何特定理论的束缚，据信可接近区域是未被包装进入核小体结构的区域。通常可通过其对于化学和酶学探针如核酸酶的敏感度而检测可接近区域的独特结构。

“靶点”或“靶序列”是限定核酸一部分的核酸序列，在充分的结合条件存在下结合分子应与之结合。例如，序列5’-GAATTC-3’是Eco RI限制性核酸内切酶的靶点。

“外源”分子是正常情况下不存在于细胞中的分子，但可通过一个或多个基因、生化或其它方法将其引入细胞。“在所述细胞中的正常存在”是相对于所述细胞的特定发育阶段和环境条件而决定的。因此，例如，仅在肌肉的胚胎发育期间存在的分子对于成人肌肉细胞是外源分子。类似地，热激活所诱导的分子对于非热激活细胞是外源分子。外源分子可包含，例如，任意多肽或其片段的编码序列，功能障碍的内源分子的功能性版本，或功能正常的内源分子的功能障碍版本。此外，外源分子可包含来自另一物种的编码序列，其为所述宿主细胞中的内源基因的直向同源物。

除其它物质外，外源分子还可以是，小分子(诸如组合化学过程所产生的小分子)或大分子(诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂类、糖蛋白、脂蛋白、多糖、以上分子的任意经修饰的衍生物)，或包含一种或多种以上分子的任意复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链，可以是线状、支链状或环状，并且可以是任意长度。核酸包括能够形成二联体的核酸以及形成三联体的核酸。参见，例如，美国专利第5,176,996号和第5,422,251号。蛋白质包括但不限于，DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰化酶、去乙酰化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、旋转酶和解旋酶。

外源分子可以是与内源分子相同类型的分子，例如，外源蛋白质或核酸。例如，外源核酸可包含感染性病毒基因组、被引入细胞的质粒或附加体或正常情况下不存在于所述细胞中的染色体。用于将外源分子引入细胞的方法为本领域的技术人员所知，并且包括但不限于，脂类介导的转移(即，脂质体，其包括中性和阳离子脂类)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击(particle bombardment)、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。

与之对比，“内源”分子是正常情况下存在于处于特定发育阶段中在特定的环境条件之下的特定细胞中的分子。例如，内源核酸可包含染色体，线粒体、叶绿体或其它细胞器的基因组或天然存在的附加体核酸。另外的内源分子可包括蛋白质，例如转录因子和酶。

本文所使用的术语“外源核酸的产物”包括多核苷酸和多肽产物，例如转录产物(多核苷酸如RNA)和翻译产物(多肽)。

“融合”分子是两种或更多种亚基分子在其中进行连接的分子，优选地进行共价连接。所述亚基分子可以是相同化学类型的分子，或可以是不同化学类型的分子。第一种类型的融合分子的实例包括但不限于，融合蛋白(例如，ZFP DNA结合结构域与切割结构域之间的融合蛋白)和融合核酸(例如，编码上文所述融合蛋白的核酸)。第二种类型的融合分子的实例包括但不限于，形成三联体的核酸和多肽之间的融合物，以及小沟结合物(minorgroove binder)和核酸之间的融合物。

融合蛋白在细胞中的表达可由所述融合蛋白向所述细胞中的递送或编码所述融合蛋白的多核苷酸向细胞中的递送所导致，其中所述多核苷酸被转录并且所述转录本被翻译从而产生所述融合蛋白。反式剪接、多肽切割和多肽连接也可参与蛋白质在细胞中的表达。用于多核苷酸和多肽向细胞中递送的方法在本申请的其它部分给出。

出于本申请的目的，“基因”包括编码基因产物(见下文)的DNA区域，以及调控所述基因产物产生的全部DNA区域，无论这些调控序列是否邻接于编码和/或被转录序列。因此，基因包括但不一定限于，启动子序列、终止子、翻译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、核基质附着位点和基因座控制区。

“基因表达”指的是基因内所包含的信息向基因产物的转换。基因产物可以是基因的直接转录产物(如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任意其它类型的RNA)或通过mRNA的翻译而产生的蛋白质。基因产物还包括经修饰的RNA，所述修饰通过诸如加帽、多腺苷酸化、甲基化和编辑这样的加工而进行，还包括经修饰的蛋白质，所述修饰通过，例如，甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、豆蔻酰化和糖基化而进行。

基因表达的“调节”指的是基因活性中的变化。表达的调节可包括(但不限于)基因激活和基因压制。

“植物”细胞包括(但不限于)单子叶(monocotyledonous(monocots))植物或双子叶(dicotyledonous(dicots))植物的细胞。单子叶植物的非限制性实例包括谷类植物如玉米、水稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦，甘蔗，菠萝，洋葱，香蕉和椰子。双子叶植物的非限制性实例包括烟草、番茄、向日葵、棉花、甜菜、马铃薯、莴苣、瓜、大豆、油菜(芥花子)和苜蓿。植物细胞可以来自所述植物的任意部分和/或来自植物发育的任意阶段。

“目的区域”是细胞染色质的任意区域，诸如，例如基因或基因内或邻接处的非编码序列，其中结合外源分子是理想的。结合可以是出于靶向DNA切割和/或靶向重组的目的。目的区域可以存在于，例如，染色体、附加体、细胞器基因组(如线粒体、叶绿体)或感染性病毒基因组。目的区域可以位于基因的编码区域中，位于被转录的非编码区域中，诸如，例如前导序列(leader sequence)、拖尾序列(trailer sequence)或内含子，或位于所述编码区域上游或下游的非转录区域。目的区域的长度可以小至一个单核苷酸对或高达2,000个核苷酸对，或任意整数值个核苷酸对。

所述“操作性的连接”和“操作性地连接”(或“可操作地连接”)可互换地用于两个或更多个组分(诸如序列元件)的毗邻存在，其中所述组分经排列以使两个组分正常地发挥功能并且允许了至少一个所述组分可介导施加于至少一个其它组分上的功能的可能性。在说明性的情况下，如果转录调控序列响应于一种或多种转录调控因子的存在与否而控制了编码序列的转录水平，那么所述转录调控序列如启动子被操作性地连接于所述编码序列。转录调控序列通常以顺式操作性地连接于编码序列，但无需直接与其邻接。例如，增强子是操作性地连接于编码序列的转录调控序列，即使它们并不相邻。

对于融合多肽，所述术语“操作性地连接”可以指各个组分在与其它组分连接的情况下行使与其未被这样连接的情况下相同的功能的实际情况。例如，对于ZFP DNA结合结构域融合于切割结构域的融合多肽，如果在所述融合多肽内所述ZFP DNA结合结构域部分能够结合其靶点和/或其结合位点，而所述切割结构域能够在所述靶点附近切割DNA，则所述ZFP DNA结合结构域和所述切割结构域处于操作性的连接中。

蛋白质、多肽或核酸的“功能性片段”是序列并不等同于所述全长蛋白质、多肽或核酸的蛋白质、多肽或核酸，但其保持了与所述全长蛋白质、多肽或核酸相同的功能。功能性片段可具有与对应的天然分子相比更多、更少或相同数量的残基，并且/或者可包含一个或多个氨基酸或核苷酸替换。用于测定核酸功能(如，编码功能，与另一个核酸杂交的能力)的方法在本领域中是众所周知的。类似地，用于测定蛋白质功能的方法是为人所熟知的。例如，可(例如)通过滤膜结合、电泳迁移率变动或免疫沉淀分析而测定多肽的DNA结合功能。可通过凝胶电泳而分析DNA切割。参见Ausubel等人的上文引用。可通过(例如)免疫共沉淀、双杂交分析或基因和生化的互补方法测定蛋白质与另一种蛋白质相互作用的能力。参见，例如Fields等人(1989)Nature 340:245-246；美国专利第5,585,245号和PCT WO 98/44350。

多重插入位点

本文公开了多重插入位点，即包含多个锌指核酸酶(ZFN)结合位点的多核苷酸，从而使所述多重插入位点在结合所述适当的ZFN对的情况下在所述ZFN对的靶点之间受到切割。

所述多重插入位点所包括的靶点在优选的情况下未见于其所整合进入的细胞的基因组中。因此，降低或消除了所述基因组中不期望的切割的发生。可将任意数量的靶点包含于所述多重插入位点多核苷酸中，例如1-50个(或其间任意数量)，优选地介于2和30之间(或其间任意数量)，并且甚至更优选地介于5和20之间(或其间任意数量)。对于锌指核酸酶，所述靶点一般成对，从而使所述锌指核酸酶形成同二聚体或异二聚体中以在所述适当位点进行切割。

此外，根据图1示出，各对所述靶点的一个靶点(图1的阴影三角形)在整个多重插入位点可以是相同的。或者，所述异二聚体对可以在位点间是不同的。

所述多重插入位点可包含仅被同二聚体结合的靶点、仅被异二聚体结合的靶点或被同二聚体和异二聚体结合的靶点的组合。被同二聚体结合的靶点可在某些情况下是优选的，其出于一种或多种下列原因：一种ZFN的递送可能比两种的递送更有效，同二聚化降低了由ZFN的不相等表达所导致的不相等的化学计量的问题；可能降低了脱靶位点(off-target site)的切割所带来的毒性；当使用CCHC(非标准)锌指结构域时所述同二聚体被破坏的可能减半；和/或可扩大独特可靶向位点的总数量。或者，异二聚体可在其它情况下是优选的，这是由于其实现了对不同靶点的混合和匹配，并且因此而潜在地增加了ZFN对的可靶向位点。此外，异二聚体可实现根据医生所需而对供体的依次添加。异二聚体组合还可实现通过使用新型ZFN对而对供体的任意所需部分的特异性缺失。

应很明显，靶点并非必须是用于锌指核酸酶的多组三核苷酸。例如，对于发生链间相互作用的情况(参见，例如美国专利第6,453,242号和WO 02/077227)，多锌指结合结构域的一个或多个单独锌指可结合于重叠的四联体子位点(quadruplet subsite)。因此，三锌指蛋白可结合10核苷酸序列，其中第十位核苷酸是末端锌指所结合的四联体的一部分，四锌指蛋白可结合13核苷酸序列，其中第十三位核苷酸是末端锌指所结合的四联体的一部分等。

多锌指结合结构域中单个锌指之间的氨基酸接头序列的长度和特性也影响与靶序列的结合。例如，多锌指结合结构域中的相邻锌指之间的所谓“非标准接头”、“长接头”或“结构化接头”的存在可使这些锌指结合并非直接相邻的子位点。这些接头的非限制性实例描述于，例如，美国专利第6,479,626号和WO 01/53480。因此，可通过1、2、3、4、5或更多个核苷酸而将在锌指结合结构域的靶点中的一个或多个子位点相互分隔。仅举一例，四锌指结合结构域可结合13-核苷酸靶点，其依次包含两个邻接的3-核苷酸子位点、一个中间核苷酸和两个邻接的三联体子位点。

序列间(如靶点)的距离指的是介于两个序列之间的核苷酸和核苷酸对的数量，其根据所述序列距对方最近的末端而测量。

在切割依赖于两个锌指结构域/切割半结构域融合分子与分离的靶点的结合的特定实施方案中，所述两个靶点可以在相对的DNA链上。在其它的实施方案中，两个靶点均位于相同的DNA链上。

可将所述多重插入位点整合进入所述植物基因组中的任意位置。在特定的实施方案中，所述多重插入位点被整合进入玉米基因组中的Zp15之中，根据美国专利申请第12/653,735号中的描述其对于外源序列的靶向整合是理想位点。

DNA结合结构域

可在本文公开的方法中使用任意DNA结合结构域。在特定的实施方案中，所述DNA结合结构域包含锌指蛋白。锌指结合结构域包含一个或多个锌指。Miller等人,(1985)EMBOJ.4:1609-1614；Rhodes(1993)Scientific American 2月:56-65；美国专利第6,453,242号。本文描述的锌指结合结构域一般包含2、3、4、5、6或甚至更多个锌指。

单独的锌指结构域一般长约30个氨基酸。结构研究已经表明，各锌指结构域(基元)包含两个β折片(维持于包含两个恒定的半胱氨酸残基的β转角之中)和一个α螺旋(包含两个恒定的组氨酸残基)，其通过所述两个半胱氨酸和所述两个组氨酸与锌原子配位而维持于特定的构象。

锌指包括标准C₂H₂锌指(即，所述锌离子在其中与两个半胱氨酸和两个组氨酸残基配位的锌指)和非标准锌指，诸如，例如C₃H锌指(所述锌离子在其中与三个半胱氨酸残基和一个组氨酸残基配位的锌指)和C₄锌指(所述锌离子在其中与四个半胱氨酸残基配位的锌指)。还参见WO 02/057293以及美国专利公开号第20080182332号中关于非标准ZFP对于植物的用途。

与天然存在的锌指蛋白相比较，经工程改造的锌指结合结构域可具有新型结合特异性。工程改造的方法包括(但不限于)理性设计和多种类型的选择。理性设计包括(例如)使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，在其中各三联体或四联体核苷酸序列被关联于一个或多个锌指氨基酸序列，所述锌指结合于所述特定的三联体或四联体序列。

包括噬菌体展示和双杂交系统在内的示例性的选择方法公开于美国专利第5,789,538号；第5,925,523号；第6,007,988号；第6,013,453号；第6,410,248号；第6,140,466号；第6,200,759号；和第6,242,568号；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO01/88197和GB 2,338,237。

对于锌指结合结构域的结合特异性的增强已被描述于(例如)共有的WO 02/077227之中。

由于单独的锌指结合于3-核苷酸(即，三联体)序列(或与邻接的锌指4-核苷酸结合位点可有一个核苷酸的重叠的4-核苷酸序列)，锌指结合结构域经工程改造而结合的序列长度(如，靶序列)将决定在工程改造的锌指结合结构域内的锌指数量。例如，对于其中所述锌指基元并非结合于重叠子位点的ZFP，6-核苷酸的靶序列可被双锌指结合结构域所结合；9-核苷酸的靶序列可被三锌指结合结构域所结合，等等。根据本文指出，靶点中的单个锌指的结合位点(即，子位点)无需邻接，而是可以由一个或多个核苷酸所分隔，这取决于在多锌指结合结构域中的锌指间氨基酸序列(即，所述锌指间接头)的长度和特性。

在多锌指的锌指结合结构域中，邻接的锌指可由约5个氨基酸(所谓“标准”锌指间接头)的氨基酸接头序列所分隔，或在替代的情况下由一个或多个非标准接头所分隔。参见，例如，共有的美国专利第6,453,242号和第6,534,261号。对于包含多于三个锌指的经工程改造的锌指结合结构域，在一些情况下在特定所述锌指间插入更长(“非标准”)的锌指间接头可能是理想的，因为其可提高所述结合结构域的结合亲和性和/或特异性。参见，例如，美国专利第6,479,626号和WO 01/53480。因此，多锌指的锌指结合结构域特征还可在于非标准锌指间接头的存在和定位。例如，包含3个锌指(由两个标准锌指间接头连接)、1个长接头和3个另外的锌指(由两个标准锌指间接头连接)的六锌指的锌指结合结构域被称为2×3结构。类似地，包含2个锌指(其间具有一个标准接头)、1个长接头和2个另外的锌指(以一个标准接头连接)的结合结构域被称为2×2结构。包含三个双锌指单元(各单元中所述2个锌指由1个标准接头相连接)并且其中各双锌指单元通过1个长接头与所述邻接双锌指单元相连接的蛋白质被称为3×2结构。

长锌指间接头或非标准锌指间接头在多锌指结合结构域的2个邻接锌指之间的存在通常允许所述2个锌指结合于在所述靶序列中并不直接邻接的子位点。因此，在靶点中的子位点之间可存在一个或多个核苷酸组成的间隔；即，靶点可包含不被锌指接触的一个或多个核苷酸。例如，2×2的锌指结合结构域可结合于由一个核苷酸所分隔的两组6核苷酸序列，即，其结合于13核苷酸的靶点。还参见Moore等人,(2001a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:1432-1436；Moore等人,(2001b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:1437-1441和WO 01/53480。

根据前文所提及，靶子位点是被单一锌指所结合的3或4核苷酸序列。出于特定的目的，双锌指单元被称为“结合模块(binding module)”。可通过，例如，对处于多锌指蛋白(通常为3个锌指)环境中的结合特定的6核苷酸靶序列的两个邻接锌指进行选择，从而获得结合模块。或者，可通过单个锌指的组装而构建模块。还参见WO 98/53057和WO 01/53480。

或者，所述DNA结合结构域可源自于核酸酶。例如，归巢核酸内切酶(homingendonucleases)和兆碱基大范围核酸酶(meganucleases)，诸如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII，它们的识别序列是已知的。还参见美国专利第5,420,032号；美国专利第6,833,252号；Belfort等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3379–3388；Dujon等人,(1989)Gene82:115–118；Perler等人,(1994)Nucleic Acids Res.22,1125–1127；Jasin(1996)TrendsGenet.12:224–228；Gimble等人,(1996)J.Mol.Biol.263:163–180；Argast等人,(1998)J.Mol.Biol.280:345–353以及New England Biolabs的目录。此外，可对归巢核酸内切酶和兆碱基大范围核酸酶的DNA结合特异性进行工程改造以结合于非天然的靶点。参，例如Chevalier等人,(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等人,(2003)Nucleic AcidsRes.31:2952-2962；Ashworth等人,(2006)Nature441:656-659；Paques等人,(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美国专利公开号第20070117128号。

作为另一个替代，所述DNA结合结构域可源自亮氨酸拉链蛋白。亮氨酸拉链是在大量的真核调控蛋白中参与蛋白质-蛋白质相互作用的一类蛋白质，所述调控蛋白是关联于基因表达的重要转录因子。所述亮氨酸拉链指的是多个生物界中的转录因子中所共同的结构基元，所述生物界包括动物、植物、酵母等。所述亮氨酸拉链由两个多肽形成(同二聚体或异二聚体)，所述多肽结合于特定的DNA序列，在其结合方式中所述亮氨酸残基在一个α-螺旋中均匀地分布从而使所述两个多肽的亮氨酸残基位于所述螺旋的同一面上。可将亮氨酸拉链的DNA结合特异性用于本文所公开的DNA结合结构域。

在一些实施方案中，所述DNA结合结构域是来自TAL效应器的经工程改造的结构域，所述TAL效应器源自植物病原黄单胞菌(Xanthomonas)(参见Miller等人,(2010)NatureBiotechnology,12月22日[先于出版的电子版]；Boch等人,(2009)Science 2009年10月29日(10.1126/science.117881)以及Moscou与Bogdanove,(2009)Science 2009年10月29日(10.1126/science.1178817))。

切割结构域

根据上文指出，所述DNA结合结构域可结合于切割(核酸酶)结构域。例如，可对归巢核酸内切酶进行其DNA结合特异性的修饰，同时保持核酸酶功能。此外，还可将锌指蛋白融合于切割结构域以形成锌指核酸酶(ZFN)。本文所公开的融合蛋白的切割结构域部分可获自任意核酸内切酶或核酸外切酶。切割结构域可源自于的示例性核酸内切酶包括但不限于，限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见，例如，New England Biolabs,Beverly,MA的2002-2003年目录；以及Belfort等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。切割DNA的其它酶是已知的(如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；还参见Linn等人(编著),Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。归巢核酸内切酶和兆碱基大范围核酸酶的非限制性实例包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII，这些是已知的。还参见美国专利第5,420,032号；美国专利第6,833,252号；Belfort等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3379–3388；Dujon等人,(1989)Gene 82:115–118；Perler等人,(1994)Nucleic Acids Res.22,1125–1127；Jasin(1996)TrendsGenet.12:224–228；Gimble等人,(1996)J.Mol.Biol.263:163–180；Argast等人,(1998)J.Mol.Biol.280:345–353以及New England Biolabs的目录。可将这些酶(或其功能性片段)的一种或多种用作为切割结构域和切割半结构域的来源。

限制性核酸内切酶(限制性酶)存在于大量物种之中并且能够与DNA进行序列特异性结合(在识别位点上)并且能够在所述结合位点上或附近切割DNA。特定的限制性酶(如，IIS型)在远离所述识别位点的位点切割DNA，并且具有可分离的结合和切割结构域。例如，所述IIS型FokI酶在一条链上距其识别位点9核苷酸处以及在另一条链上距其识别位点13核苷酸处催化DNA的双链切割。参见，例如，美国专利第5,356,802号；第5,436,150号和第5,487,994号；以及Li等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Li等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人,(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等人,(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白质包含来自至少一种IIS型限制性酶的切割结构域(或切割半结构域)和一种或多种锌指结合结构域，其可能经过或可能未经过工程改造。

切割结构域与所述结合结构域可分离的一个示例性的IIS型限制性酶是FokI。这一特定的酶以二聚体的形式具有活性。Bitinaite等人,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。因此，出于本申请的目的，所述公开的融合蛋白中使用的FokI酶部分被视为切割半结构域。因此，对于使用锌指-FokI融合蛋白对细胞序列进行的靶向双链切割和/或靶向替换，可将各自包含一个FokI切割半结构域的两个融合蛋白用于重构一个具催化活性的切割结构域。或者，也可使用包含锌指结合结构域和两个FokI切割半结构域的单一多肽分子。使用锌指-FokI融合蛋白进行靶向切割和靶向序列改造的参数在本申请的其它部分提供。

切割结构域或切割半结构域可以是蛋白质的任意部分，其保持切割活性或其保持进行多聚体化(如二聚化)以形成功能性切割结构域的能力。

示例性的IIS型限制性酶被描述于共有的国际公开号第WO 2007/014275号中，其全文以引用的方式并入本文。

为增强切割特异性，还可修饰切割结构域。在特定的实施方案中，使用了所述切割半结构域的变体，这些变体最小化或防止了所述切割半结构域的同二聚化。这些经修饰的切割半结构域的非限制性实例在WO 2007/014275中有详细描述，其全文以引用的方式并入本文。还参见于实施例中。在特定的实施方案中，所述切割结构域包含经工程改造的切割半结构域(也称作二聚化结构域突变体)，其最小化或防止了同二聚化，其为本领域的技术人员所知并且描述于，例如，美国专利公开号第20050064474号和第20060188987号中，其全文以引用的方式并入本文。位于FokI的第446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538位氨基酸残基是用于影响所述FokI切割半结构域二聚化的全部靶。参见，例如，美国专利公开号第20050064474号和第20060188987号；国际专利公开号第WO 07/139898号；Miller等人,(2007)Nat.Biotechnol.25(7):778-785；以及Doyon等人,(2011)Nature Methods 8(1):74-79。

也可在本文描述的ZFN中使用另外的经工程改造的形成专性异二聚体的FokI切割半结构域。在一个实施方案中，所述第一种切割半结构域包含FokI的第490和538位氨基酸残基上的突变，并且所述第二种切割半结构域包含第486和499位氨基酸残基上的突变。

在特定的实施方案中，所述切割结构域包含两个切割半结构域，两者均为单一多肽的一部分，所述多肽包含结合结构域、第一种切割半结构域和第二种切割半结构域。所述切割半结构域可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列，只要它们能够行使切割所述DNA的功能。

如果所述融合蛋白包含切割半结构域，那么切割通常需要两个融合蛋白。或者，可使用包含两个切割半结构域的单一蛋白质。所述两个切割半结构域可源自所述相同的核酸内切酶(或其功能性片段)，或各个切割半结构域可源自不同的核酸内切酶(或其功能性片段)。此外，所述两个融合蛋白的靶点优选地相对对方进行排列，从而使所述两个融合蛋白与其各自靶点的结合将所述切割半结构域放置于一定的相互空间朝向，所述相互空间朝向使所述切割半结构域形成功能性切割结构域，例如，通过二聚化形成功能性切割结构域。因此，在特定的实施方案中，所述靶点的近端由5-8个核苷酸或15-18个核苷酸所分隔。然而，任意整数个的核苷酸或核苷酸对均可位于两个靶点之间(如，2至50个核苷酸或更多)。切点通常位于所述靶点之间。

融合蛋白

用于设计和构建融合蛋白(以及编码同样蛋白的多核苷酸)的方法为本领域的技术人员所知。例如，用于设计和构建包含DNA结合结构域(如锌指结构域)和调控或切割结构域(如切割半结构域)的融合蛋白，以及编码这些融合蛋白的多核苷酸被描述于共有的美国专利第6,453,242号和第6,534,261号以及美国专利申请公开号第2007/0134796号和第2005/0064474号中；其全文以引用的方式并入本文。在特定的实施方案中，构建了编码所述融合蛋白的多核苷酸。可将这些多核苷酸插入载体并且将所述载体引入细胞(有关用于将多核苷酸引入细胞的载体和方法的额外公开内容参见下文)。

在本文所描述的方法的特定实施方案中，锌指核酸酶包含融合蛋白并且在一种细胞中表达两种这样的融合蛋白，所述融合蛋白包含锌指结合结构域和来自所述FokI限制性酶的切割半结构域。两种融合蛋白在一种细胞中的表达可产生于所述两种蛋白质向所述细胞中的递送；一种蛋白质和编码所述蛋白质之一的核酸向所述细胞中的递送；各自编码所述蛋白质之一的两种核酸向所述细胞中的递送；或通过编码两种蛋白质的单一核酸向所述细胞中的递送。在另外的实施方案中，融合蛋白包含单一的多肽链，其包含两个切割半结构域和一个锌指结合结构域。在这一情况下，在细胞中表达了单一的融合蛋白并且，不期望受理论的束缚，其据信由于所述切割半结构域的分子内二聚体的形成而切割DNA。

在特定的实施方案中，所述融合蛋白(如，ZFP-FokI融合蛋白)的组分经排列以使所述锌指结构域最为靠近所述融合蛋白的氨基末端，并且所述切割半结构域最为靠近羧基末端。这仿照了天然存在的二聚化切割结构域中，诸如源自所述FokI酶的二聚化切割结构域中切割结构域的相对朝向，其中所述DNA结合结构域最为靠近所述氨基末端并且所述切割半结构域最为靠近所述羧基末端。在这些实施方案中，所述切割半结构域用以形成功能性核酸酶的二聚化由所述融合蛋白与朝向相对的DNA链上的位点的结合所导致，所述结合位点的5'末端互相靠近。

在另外的实施方案中，所述融合蛋白(如，ZFP-FokI融合蛋白)的组分经排列以使所述切割半结构域最为靠近所述融合蛋白的氨基末端，并且所述锌指结构域最为靠近羧基末端。在这些实施方案中，所述切割半结构域用以形成功能性核酸酶的二聚化由所述融合蛋白与朝向相对的DNA链上的位点的结合所导致，所述结合位点的3'末端互相靠近。

在又一些实施方案中，第一种融合蛋白包含最为靠近所述融合蛋白氨基末端的所述切割半结构域和最为靠近所述羧基末端的所述锌指结构域，并且第二种融合蛋白经排列以使所述锌指结构域最为靠近所述融合蛋白的氨基末端，并且所述切割半结构域最为靠近所述羧基末端。在这些实施方案中，两种融合蛋白均结合于相同的DNA链，包含最为靠近所述羧基末端的所述锌指结构域的所述第一种融合蛋白的结合位点位于所述第二种融合蛋白的结合位点的5'侧，所述第二种融合蛋白包含最为靠近所述氨基末端的所述锌指结构域。

在所述公开的融合蛋白的特定的实施方案中，介于所述锌指结构域和所述切割结构域(或切割半结构域)之间的氨基酸序列被称为“ZC接头”。所述ZC接头是用于与上文所讨论的锌指间接头相区分。获得使切割最优化的ZC接头的细节参见，例如，美国专利公开号第20050064474A1号和第20030232410号，以及国际专利公开号第WO 05/084190号。

在一个实施方案中，本申请提供了包含锌指蛋白的ZFN，所述锌指蛋白具有表1所示出的一个或多个识别螺旋氨基酸序列。在另一个实施方案中，本文提供了ZFP表达载体，其包含编码ZFP的核苷酸序列，所述ZFP具有表1所示出的一个或多个识别螺旋。

靶向整合

可将所述公开的方法和组合物用于在任意细胞基因组中切割DNA，所述基因组中已经整合进入了多重插入位点，所述多重插入位点在所述适当的ZFN对存在下辅助了外源序列向所述多重插入位点的稳定的靶向整合和/或外源序列的切除。参见图1和图2。

本文还描述了一些方法，所述方法中ZFN插入位点作为外源序列的一部分成系列地被引入所述细胞的基因组。参见图4和图5。例如，将侧连以异二聚体核酸酶位点的不同组合的外源序列插入所述基因组。随后，在另一外源序列存在的情况下向所述细胞中引入在所述适当的侧连ZFN位点中的一个位点处进行切割的ZFN对，所述外源序列也包含了异二聚体核酸酶位点的不同组合。可根据需要重复所述过程以插入外源序列。此外，在所述适当ZFN对存在的情况下，可将一个或多个外源序列从所述基因组上切除。

图6示出了另一个实施方案，其中所述外源序列包含标记物基因和目的基因。所述标记物基因和目的基因均被侧连以不同的ZFN基因结合位点(描述成具有不同底纹的三角形的形式)，从而使所述标记物基因可在适当情况下被缺失，例如，当插入另外的基因时。在有效可选择标记物的数量有限的生物体如植物中，这实现了对低至一种可选择标记物基因的使用，其极大地促进了堆叠目的基因的潜力。在特定的实施方案中，例如依赖于同源性引导的DNA修复效率的实施方案中，可使用“分割(split)”的可选择标记物。利用分割的可选择标记物对供体DNA序列进行的正确整合产生了可表达的可选择标记物基因。可将可选择标记物从被整合的DNA序列中切除并由此而将其循环利用。在另一个实施方案中，用于去除的所述外源序列在所述基因组中被侧连以分割的标记物基因的部分序列。通过切除，所述标记物基因被重新构建，导致了功能性标记物基因的生成。可选择标记物切除的使用将所需的可选择标记物数量限制于两种或有可能仅仅一种。

对于本文所描述的向被整合的多重插入位点中的靶向整合，一种或多种DNA结合结构域(如ZFP)经过工程改造以结合于预设切点处或其附近的靶点，并且在细胞中表达了包含所述经工程改造的DNA结合结构域和切割结构域的融合蛋白。通过所述融合蛋白的DNA结合(如锌指)部分与所述靶点的结合，所述切割结构域在所述靶点附近切割了所述DNA，其优选地通过双链断裂而进行。

所述多重插入位点中的双链断裂的存在辅助了通过同源重组而进行的外源序列整合。在特定的实施方案中，包含用于插入所述多重插入位点的外源序列的多核苷酸应包含一个或多个同源区域，所述同源区域具有所述多重插入位点多核苷酸和/或周边基因组以辅助同源重组。在供体和基因组序列之间的约25、50、100、200、500、750、1,000、1,500、2,000个核苷酸或更高的序列同源性(或介于10与2,000之间的任意整数值个核苷酸或更高)将支持两者之间的同源重组。在特定的实施方案中，所述同源臂长度低于1,000个碱基对。在其它的实施方案中，所述同源臂长度低于750个碱基对。还参见美国临时专利申请第61/124,047号，其以引用的方式并入本文。供体分子(外源序列)可包含多个不连续的与细胞染色质具有同源性的区域。例如，对于正常情况下不存在于目的区域的序列的靶向插入，所述序列可存在于供体核酸分子之中并且侧连以与所述目的区域中的基因序列具有同源性的区域。

可根据本文描述将任意目的序列(外源序列)引入多重插入位点或将其从中切除。示例性的外源序列包括但不限于，任意多肽编码序列(如cDNA)、启动子、增强子和其它调控序列(如，干扰RNA序列、shRNA表达盒)、抗原决定基标签、标记物基因、切割酶识别位点和多种类型的表达构建体。这些序列可使用标准分子生物学技术(克隆、合成等)容易地获得和/或通过商购获得。可在所述融合蛋白的表达之前、与其同时或在其之后将所述外源序列引入所述细胞。

所述供体多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA并且可以以线状或环状的形式引入细胞。如果以线状的形式引入，可通过本领域的技术人员所知的方法保护所述供体序列的末端(如，免受核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基加至线状分子的3'末端，并且/或者将自体互补的寡核苷酸连接于一个或两个末端。参见，例如Chang等人,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4959-4963；Nehls等人,(1996)Science 272:886-889。用于保护外源多核苷酸免于降解的另外的方法包括但不限于，末端氨基基团的添加和经修饰的核苷酸间连接物的使用，诸如，例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。

可将多核苷酸作为载体分子的一部分引入细胞，所述载体分子具有另外的序列，诸如，例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，可将供体多核苷酸以裸露核酸的形式，以与药剂如纳米颗粒、脂质体或泊洛沙姆的复合物的形式引入，或可以通过细菌或病毒(如，农杆菌(Agrobacterium)、根瘤菌NGR234(Rhizobium sp.NGR234)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti)、百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、花椰菜花叶病毒和木薯脉花叶病毒)递送入植物细胞。参见(例如)Chung等人,(2006)Trends Plant Sci.11(1):1-4。

根据上文的详述，各自包含锌指结合结构域和切割半结构域的两种融合蛋白(同二聚体或异二聚体)在所述多重插入位点中的结合位点可间距5-8或15-18个核苷酸并且切割在所述结合位点之间进行，所述距离根据各结合位点最靠近另一结合位点的端部而测得。切割发生在所述结合位点间的单一位置或多个位置并不重要，因为被切割的基因组序列被所述供体序列所替换。因此，为通过靶向重组进行单核苷酸对的有效序列改造，介于所述结合位点之间的区域的中点是位于该核苷酸对的10,000个核苷酸之内的位置，优选地位于1,000个核苷酸之内，或500个核苷酸之内，或200个核苷酸之内，或100个核苷酸之内，或50个核苷酸之内，或20个核苷酸之内，或10个核苷酸之内，或5个核苷酸之内，或2个核苷酸之内，或1个核苷酸之内，或位于目的核苷酸对之处。

还提供了可增强靶向重组水平的方法和组合物，其包括但不限于，另外的ZFP功能性结构域融合蛋白对于激活参与同源重组的基因的表达的应用，诸如，例如RAD54异位显性组(epistasis group)的植物基因(如，AtRad54、AtRad51)，以及其产物与上述基因产物相互作用的基因。参见，例如Klutstein等人,Genetics.2008年4月；178(4):2389-97。

可类似地将ZFP功能性结构域融合蛋白与本文所公开的方法和组合物进行结合使用以压制参与非同源末端连接的基因(如，Ku70/80、XRCC4、多(ADP核糖)聚合酶、DNA连接酶4)的表达。参见，例如Riha等人,(2002)EMBO 21:2819–2826；Freisner等人,(2003)PlantJ.34:427-440；Chen等人,(1994)European Journal of Biochemistry 224:135-142。通过使用锌指结合结构域和功能性结构域之间的融合蛋白而激活和压制基因表达的方法被公开于，例如，共有的美国专利第6,534,261号、第6,824,978号和第6,933,113号中。另外的压制方法包括反义寡核苷酸和+/或小干扰RNA(siRAN或RNAi)或shRNA的使用，其靶向于待压制的基因序列。

在包含锌指/核酸酶融合分子和供体DNA分子的细胞中，通过将所述细胞阻断于细胞周期的G₂期而实现了靶向重组效率的进一步提高，在所述期间同源性驱动的修复过程活性最高。可通过多种方式实现这样的阻滞。例如，可以使用诸如影响细胞周期进程的药物、化合物和/或小分子处理细胞以将细胞阻滞于G₂期。这一类型的示例性分子包括但不限于，影响微管聚合的化合物(如长春碱、诺考达唑、紫杉醇)、与DNA相互作用的化合物(如顺二氯二氨铂(II)、顺铂、多柔比星(doxorubicin))和/或影响DNA合成的化合物(如，胸苷、羟基脲、L-含羞草碱、依托泊苷(etoposide)、5-氟尿嘧啶)。通过组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(如丁酸钠、曲古柳菌素A(trichostatin A))的使用实现了重组效率的进一步提高，所述抑制剂改变了染色质结构以使基因组DNA更易于为所述细胞重组装置所接近。

用于细胞周期阻滞的另外的方法包括对抑制CDK细胞周期激酶活性的蛋白质的过表达，例如，通过将编码所述蛋白质的cDNA引入所述细胞或向所述细胞引入经工程改造的ZFP，其激活编码所述蛋白质的基因的表达。还可通过抑制细胞周期蛋白和CDK的活性而实现细胞周期阻滞，例如，通过使用RNAi方法(如，美国专利第6,506,559号)或通过向所述细胞引入经工程改造的ZFP，其压制参与细胞周期进程的一种或多种基因的表达，诸如，例如细胞周期蛋白和/或CDK基因。用于基因表达调控的经工程改造的锌指蛋白的合成方法参见，例如，共有的美国专利第6,534,261号。

或者，在特定的情况下，在供体多核苷酸不存在的情况下进行靶向切除(优选地在S或G₂期)，并且重组在同源染色体之间发生。

表达载体

可将编码根据本文所描述的一种或多种融合蛋白(如ZFN)的核酸克隆入用于转化进入原核或真核细胞的载体以进行复制和/或表达。载体可以是原核载体，如质粒，或是穿梭载体，昆虫载体或真核载体。还可将编码融合蛋白的核酸克隆入表达载体以施用于细胞。

为表达所述融合蛋白(如ZFN)，一般将编码所述融合蛋白的序列亚克隆入表达载体，所述表达载体包含启动子以引导转录。适当的细菌和真核启动子在本领域中是众所周知的并且被描述于，例如Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1989年第二版；2001年第三版)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A LaboratoryManual(1990)；以及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等的上文引用)。用于表达所述ZFP的细菌表达系统可来自，例如，大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillussp.)和沙门氏菌(Salmonella)(Palva等人,Gene 22:229-235(1983))。用于这些表达系统的试剂盒可商购获得。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统为本领域的技术人员所熟知并且也可商购获得。

用于引导编码融合蛋白的核酸表达的启动子取决于特定的应用。例如，适用于所述宿主细胞的强组成型启动子一般用于融合蛋白的表达和纯化。

与之对比，当将融合蛋白体内施用于植物基因的调控时(参见下文“向植物细胞中的核酸递送”部分)，使用了组成型或受调控的(如，发育期间，受组织或细胞类型调控，或受环境调控)或诱导型启动子，这取决于所述融合蛋白的特定用途。植物启动子的非限制性实例包括源自拟南芥(A.thaliana)泛素-3(ubi-3)(Callis等人,1990,J.Biol.Chem.265-12486-12493)的启动子序列；源自根癌农杆菌(A.tumifaciens)的甘露碱合成酶(Δmas)(Petolino等人，美国专利第6,730,824号)的启动子序列；和/或源自木薯脉花叶病毒(CsVMV)(Verdaguer等人,1996,Plant Molecular Biology 31:1129-1139)的启动子序列。还参见于实施例中。

除所述启动子之外，所述表达载体一般还包含转录单位或表达盒，其包含所述核酸在原核或者真核宿主细胞中进行表达所需的全部其它元件。因此，典型的表达盒包含启动子，其可操作地连接于，例如，编码所述融合蛋白的核酸序列，还包含信号，例如，所述转录体有效的多腺苷酸化、转录终止、核糖体结合位点或翻译终止所需的信号。所述盒的另外的元件可包括，如增强子、异源剪接信号和/或细胞核定位信号(NLS)。

用于将所述基因信息转运进入所述细胞的特定表达载体根据所述融合蛋白的预期用途而进行选择，例如，植物、动物、细菌、真菌、原生动物等中的表达(参见下文所描述的表达载体)。标准的细菌和动物表达载体在本领域中是已知的并且详细描述于，例如，美国专利公开号第20050064474A1号和国际专利公开号第WO 05/084190号、第WO 05/014791号和第WO 03/080809号中。

可使用标准的转染方法以制备细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，所述细胞系表达大量蛋白质，其可随后使用标准技术进行纯化(参见，例如Colley等人,J.Biol.Chem.264:17619-17622(1989)；Guide to Protein Purification,in Methods inEnzymology,第182卷(Deutscher编著,1990))。真核和原核细胞的转化根据标准技术进行(参见，例如Morrison,J.Bact.132:349-351(1977)；Clark-Curtiss&Curtiss,Methods inEnzymology101:347-362(Wu等人编著,1983))。

可使用用于将外源核苷酸序列引入这些宿主细胞的任意众所周知的方法。这些方法包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、超声方法(如，声致穿孔)、脂质体、微注射、附加体中或整合型的裸DNA、质粒载体、病毒载体，以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源基因物质引入宿主细胞的任意其它众所周知的方法(参见，例如，Sambrook等人的上文引用)。唯一必须的是所使用的特定基因工程方法能够成功地将至少一种基因引入能够表达选定蛋白质的宿主细胞。

对植物细胞的核酸递送

根据上文指出，可通过多种常规技术将DNA构建体引入所需的植物宿主(例如，引入其基因组)。这些技术的综述参见，例如，Weissbach&Weissbach Methods for PlantMolecular Biology(1988,Academic Press,N.Y.)第VIII部分,pp.421-463；以及Grierson&Corey,Plant Molecular Biology(1988年第二版),Blackie,London,第7-9章。

例如，可使用诸如植物细胞原生质体的电穿孔和微注射这样的技术将所述DNA构建体直接引入所述植物细胞的基因组中，或可使用基因枪方法如DNA粒子轰击(particlebombardment)将所述DNA构建体直接引入植物组织(参见，例如，Klein等人,(1987)Nature327:70-73)。或者，可通过纳米颗粒转化将所述DNA构建体引入所述植物细胞(参见，例如，美国专利申请第12/245,685号，其全文以引用的方式并入本文)。或者，所述DNA构建体可与适当的T-DNA边界/侧连区域组合并被引入常用的根癌农杆菌宿主载体。根癌农杆菌介导的转化技术(包括解毒(disarming)和双元载体(binary vector)的使用)在科技文献中有完善描述。参见，例如，Horsch等人,(1984)Science233:496-498以及Fraley等人,(1983)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 80:4803。

此外，可使用非农杆菌细菌或病毒实现基因转移，如根瘤菌NGR234、苜蓿中华根瘤菌、百脉根根瘤菌、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、花椰菜花叶病毒和木薯脉花叶病毒，参见，例如Chung等人,(2006)Trends Plant Sci.11(1):1-4。

当使用双元T DNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12:8711-8721)或共培养法(Horsch等人,(1985)Science 227:1229-1231)使所述细胞被所述细菌感染时，所述根癌农杆菌宿主的病毒毒性将引导包含所述构建体和邻接标记物的T链向所述植物细胞DNA中的插入。所述农杆菌转化系统通常被用于对双子叶植物进行工程改造(Bevan等人,(1982)Ann.Rev.Genet 16:357-384；Rogers等人,(1986)Methods Enzymol.118:627-641)。所述农杆菌转化系统还可被用于将DNA转化以及转移进入单子叶植物和植物细胞。参见美国专利第5,591,616号；Hernalsteen等人,(1984)EMBO J 3:3039-3041；Hooykass-Van Slogteren等人,(1984)Nature 311:763-764；Grimsley等人,(1987)Nature325:1677-179；Boulton等人,(1989)Plant Mol.Biol.12:31-40；以及Gould等人,(1991)Plant Physiol.95:426-434。

替代性的基因转移和转化方法包括但不限于，通过钙、聚乙二醇(PEG)或电穿孔介导的裸DNA摄取而进行的原生质体转化(参见Paszkowski等人,(1984)EMBO J 3:2717-2722；Potrykus等人,(1985)Molec.Gen.Genet.199:169-177；Fromm等人,(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82:5824-5828；以及Shimamoto(1989)Nature 338:274-276)以及对植物组织的电穿孔(D'Halluin等人,(1992)Plant Cell 4:1495-1505)。用于植物细胞转化的另外方法包括微注射、碳化硅介导的DNA摄取(Kaeppler等人,(1990)Plant CellReporter9:415-418)和基因枪(microprojectile bombardment)(参见Klein等人,(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85:4305-4309；以及Gordon-Kamm等人,(1990)Plant Cell 2:603-618)。

所述公开的方法和组合物可被用于将外源序列插入所述多重插入位点，其已被插入植物细胞的基因组中。这一点是有用的，因为被引入植物基因组的转基因的表达非常依赖于其整合位置。因此，可通过靶向重组将编码诸如除草剂耐受性、昆虫耐受性、营养物、抗生素或治疗分子的基因插入有利于其表达的植物基因组区域。

可培养通过任意上文转化技术所制备的转化植物以再生完整植物体，其具有所述被转化的基因型并且因此而具有所需的表型。这些再生技术依赖于特定植物激素在组织培养生长培养基中的使用，其一般依赖于生物杀灭剂和/或除草剂标记物，所述标记物已与所述所需的核苷酸序列被共同引入。通过培养的原生质体进行的植物再生被描述于Evans等人,"Protoplasts Isolation and Culture"in Handbook of Plant Cell Culture,pp.124-176,Macmillian Publishing Company,New York,1983；以及Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,pp.21-73,CRC Press,Boca Raton,1985。还可通过植物愈合组织、外植体、器官、花粉、胚或其部分获得再生。这些再生技术基本描述于Klee等人,(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467-486。

引入植物细胞的核酸可被用于向实质上任意植物提供所需的性状。可使用本申请的核酸构建体和上述多种转化方法对广泛多种的植物和植物细胞进行工程改造以获得本文所述的所需生理和农艺特征。在优选的实施方案中，用于工程改造的靶植物和植物细胞包括但不限于，单子叶和双子叶植物，诸如作物，包括粮食作物(如小麦、玉米、水稻、小米、大麦)、果实作物(如番茄、苹果、梨、草莓、橙)、饲料作物(如苜蓿)、根状蔬菜作物(如胡萝卜、马铃薯、糖用甜菜、甘薯)、叶部蔬菜作物(如莴苣、菠菜)；成花植物(如，矮牵牛、玫瑰、菊)、针叶树及松树(如松树、杉树、云杉)、植物修复(phytoremediation)中使用的植物(如重金属累积植物)；油料作物(如向日葵、芥花子)和用于实验目的的植物(如拟南芥)。因此，所述公开的方法和组合物对于广泛的植物具有用途，所述植物包括(但不限于)来自天门冬属、燕麦属、芸苔属、柑橘属、西瓜属、辣椒属、南瓜属、胡萝卜属、飞蓬属、大豆属、棉属、大麦属、莴苣属、黑麦草属、番茄属、苹果属、木薯属、烟草属、诸葛菜属、稻属、鳄梨属、菜豆属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、黑麦属、茄属、高粱属、小麦属、葡萄属、豇豆属和玉蜀黍属的物种。

本领域的技术人员应了解，在所述外源序列被稳定地并入转基因植物中并且经证实是可操作的之后，其可通过有性杂交而引入其它植物。可以根据用于杂交的物种使用大量标准培育技术中的任意技术。

可通过针对所述转化用DNA上存在的标记物基因所编码的性状对所述经工程改造的植物物质进行选择或筛选以鉴定和分离被转化的植物细胞、愈合组织、组织或植物。例如，可通过将所述经工程改造的植物物质生长于包含抑制量抗生素或除草剂的培养基中而进行选择，所述转化用基因构建体产生了对于所述抗生素或除草剂的抗性。此外，还可通过针对任意可见标记物基因(如β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、B或C1基因)的活性进行的筛选而鉴定被转化的植物和植物细胞，所述可见标记物基因可存在于所述重组核酸构建体中。这些选择和筛选方法为本领域的技术人员所熟知。

也可将物理和生物化学方法用于鉴定包含插入基因构建体的植物或植物细胞转化子。这些方法包括但不限于：1)用于检测和测定所述重组DNA插入物的结构的Southern分析或PCR扩增；2)用于检测或检验所述基因构建体的RNA转录体的RNA印迹、S1RNA酶保护、引物延伸或逆转录PCR扩增；3)用于检测酶或核酶活性的酶学分析，其中这些基因产物由所述基因构建体所编码；4)蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹技术、免疫沉淀或酶联免疫吸附分析(ELISA)，其中所述基因构建体产物是蛋白质。另外的方法，诸如原位杂交、酶染色和免疫染色，也可被用于检测所述重组构建体在特定植物器官和组织中的存在或表达。实施所有这些分析的方法为本领域的技术人员所熟知。

可通过(例如)对分离自目标组织的RNA(如mRNA)进行的RNA印迹而观测使用本文公开的方法进行的基因操作的效果。一般情况下，如果所述mRNA存在或mRNA的量有所提高，则可以认为所述对应的转基因处于表达中。可使用测量基因和/或所编码的多肽的活性的其它方法。根据所使用的底物和检测反应产物或副产物的增加或减少的方法，可使用不同类型的酶学分析。此外，可对被表达的多肽水平进行免疫化学测量，即，ELISA、RIA、EIA和本领域的技术人员所熟知的基于抗体的其它分析，诸如通过电泳检测分析(通过染色或蛋白质印迹)。作为非限制性实例，使用ELISA分析对所述AAD-1和PAT蛋白的检测被描述于美国专利申请第11/587,893号中，该参考文献全文以引用的方式并入本文。所述转基因可选择性地表达于所述植物的一些组织或表达于一些发育阶段，或所述转基因可实质上表达于全部植物组织中，实质上在其全部生命周期中进行。但是，任意组合性表达模式也是适当的。

本申请还涵盖上文描述的转基因植物的种子，其中所述种子具有所述转基因或基因构建体。本申请进一步涵盖了上述转基因植物的子代、克隆、细胞系或细胞，其中所述子代、克隆、细胞系或细胞具有所述转基因或基因构建体。

可将融合蛋白(如ZFN)和编码融合蛋白的表达载体直接施用于所述植物以进行基因调控、靶向切割和/或重组。在特定的实施方案中，所述植物包含多个平行同源(paralogous)的靶基因。因此，可对植物施用一种或多种不同的融合蛋白或编码融合蛋白的表达载体以将一种或多种这些平行同源的基因(如Zp15，参见PCT专利公开号第WO2010077319号)靶向于所述植物中的基因。

通过在正常情况下用于将融合蛋白引入与待处理植物细胞的最终接触的任意途径而进行有效量的施用。所述ZFP通过任意适当的方式施用，优选地使用可接受载体进行施用。施用这些调节剂的适当的方法为本领域的技术人员所具备并且熟知，并且虽然可使用多于一种途径施用特定的组合物，但是特定的途径通常可提供比其它途径更为直接并且更为有效的反应。

还可使用载体并且其部分地由被施用的特定组合物所决定，还由用于施用所述组合物的方法所决定。因此，存在广泛多种适当的可用载体制剂。

对哺乳动物细胞的递送

可通过任意适当的方法将本文所描述的ZFN递送至靶哺乳动物细胞，所述方法包括，例如，通过ZFN mRNA的注射。参见，Hammerschmidt等人,(1999)Methods Cell Biol.59:87-115。

递送包含锌指的蛋白质的方法被描述于，例如，美国专利第6,453,242号；第6,503,717号；第6,534,261号；第6,599,692号；第6,607,882号；第6,689,558号；第6,824,978号；第6,933,113号；第6,979,539号；第7,013,219号；以及第7,163,824号，全部公开内容全文以引用的方式并入本文。

还可使用包含编码一种或多种ZFN的序列的载体递送根据本文所述的ZFN。可使用任意载体系统，其包括但不限于，质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体和腺附属病毒载体等。还参见，美国专利第6,534,261号；第6,607,882号；第6,824,978号；第6,933,113号；第6,979,539号；第7,013,219号；以及第7,163,824号，其全文以引用的方式并入本文。此外，很明显这些载体中的任意载体可包含一种或多种ZFN编码序列。因此，当将一对或多对ZFN引入所述细胞时，可在同一载体上或不同载体上携带所述ZFN。当使用多种载体时，各载体可包含编码一种或多种ZFN的序列。

常用的基于病毒和非基于病毒的基因转移方法可被用于将编码经工程改造的ZFP的核酸引入哺乳动物细胞。还可使用这些方法将编码ZFP的核酸体外地施用于哺乳动物细胞。在特定的实施方案中，施用编码ZFP的核酸以用于体内或离体用途。

非病毒载体递送系统包括电穿孔、脂质体转染(lipofection)、微注射、基因枪、病毒小体、脂质体、免疫脂质体、多聚阳离子或脂:核酸偶联物、裸DNA、人工病毒粒子和药剂增强的DNA摄取。使用诸如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声致穿孔也可被用于核酸递送。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在对所述细胞递送之后具有附加体或被整合的基因组。另外的示例性核酸递送系统包括Amaxa Biosystems(Cologne,Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville,Maryland)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston,MA)和Copernicus Therapeutics Inc所提供的系统(参见，例如US6008336)。脂质体转染被描述于(例如)US 5,049,386、US 4,946,787和US 4,897,355之中，并且脂质体转染试剂被商业销售(如，TRANSFECTAM^TM和LIPOFECTIN^TM)。适用于多核苷酸的高效的受体识别脂质体转染的阳离子和中性脂类包括Felgner的WO 91/17424、WO 91/16024的脂类。递送可以针对细胞(离体施用)或靶组织(体内施用)。脂:核酸复合物的制备为本领域的技术人员所熟知(参见，例如，Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese等人,Cancer Gene Ther.2:291-297(1995)；Behr等人,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy等人,BioconjugateChem.5:647-654(1994)；Gao等人,Gene Therapy 2:710-722(1995)；Ahmad等人,CancerRes.52:4817-4820(1992)；美国专利第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号以及第4,946,787号)，其包括靶向脂质体，诸如免疫脂类复合物。

根据上文指出，可将所述公开的方法和组合物用于任意类型的哺乳动物细胞。可通过任意适当的方法将本文所描述的蛋白质(如ZFP)、编码同样蛋白质的多核苷酸和包含所述蛋白质和/或多核苷酸的组合物递送至靶细胞。适当的细胞包括但不限于真核和原核细胞和/或细胞系。这些细胞和由这些细胞所产生的细胞系的非限定实例包括COS、CHO(如CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(如HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞以及昆虫细胞如草地夜蛾(Spodoptera fugiperda)(Sf)，或真菌细胞如酵母菌(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces)。在特定的实施方案中，所述细胞系是CHO-K1、MDCK或HEK293细胞系。适当的原代细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和其它血细胞亚型，诸如但不限于CD4+T细胞或CD8+T细胞。适当的细胞还包括干细胞，诸如，举例而言，胚胎干细胞，诱导多潜能干细胞、造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞。

实施例

实施例1：质粒设计

实施例1.1：eZFN结合位点

将8种经工程改造的锌指核酸酶(eZFN)结合位点(CL:AR—SEQ ID NO:1、RL:PR—SEQ ID NO:2、AL:PR—SEQ ID NO:3、PL:AR—SEQ ID NO:4、CL:RR—SEQ ID NO:5、RL:CR—SEQ ID NO:6、CL:PR—SEQ ID NO:7、RL:AR—SEQ ID NO:8)组合进入单一DNA片段(多eZFN结合位点)，其中侧连的PCR引物位点对于各个eZFN结合位点是独特的。此外，还已经设计了其它eZFN结合位点并且其在酵母中表现出高水平切割(参见，例如，美国专利公开号第2009/0111119号)，其包括PL:RR—SEQ ID NO:9、AL:RR—SEQ ID NO:10、AL:CR—SEQ IDNO:11、PL:CR—SEQ ID NO:12以及同二聚体eZFN的RR:RR—SEQ ID NO:13、RL:RL—SEQ IDNO:14、PR:PR—SEQ ID NO:15、PL:PL—SEQ ID NO:16、CL:CL—SEQ ID NO:17、CR:CR—SEQID NO:18、AR:AR—SEQ ID NO:19和AL:AL—SEQ ID NO:20。“CL”和“CR”分别指“左”和“右”手锌指设计，其用于名为8266和8196的CCR5受体，所述受体具有在美国专利公开号第2008/0159996号中示出的序列并且结合于其中示出的靶点。“AL”和“AR”分别指“左”和“右”手锌指设计，其用于名为15556和15590的AAVS1基因座，并且其具有在美国专利公开号第2008/0299580号中示出的识别螺旋序列并且结合于其中示出的靶点。下文表1和表2中列出了“PL”和“PR”设计以及“RL”和“RR”设计的识别螺旋序列和靶点。PL和PR均指的是ZFN的“左”和“右”手锌指设计，所述ZFN特异于人PRMT1基因，而RL和RR指的是ZFN的“左”和“右”手锌指设计，所述ZFN特异于小鼠Rosa26基因座。

根据生物信息学分析估计，这些靶点均不存在于玉米基因组中。所述PCR引物位点被包括用于NHEJ的评估，所述NHEJ由所述eZFN对所述染色体定位的DNA片段的双链切割所导致。

表1：ZFN设计

表2：ZFN靶结合位点

所述合成DNA片段中包含Att位点并且使用TOPO克隆(Invitrogen,Carlsbad,CA)将所述片段克隆进入质粒。使用Gateway LR CLONASE^TM(Invitrogen)反应将这一片段转移进入pDAB101834和pDAB101849。这些载体分别包含适用于烟草和玉米的可选择标记物。pDAB101834包含所述木薯脉花叶病毒启动子(CsVMV；源自于木薯脉花叶病毒的启动子和5'非翻译区；Verdaguer等人,(1996)Plant Molecular Biology,31(6)1129-1139)、所述草胺膦乙酰转移酶基因(PAT；Wohlleben等人,(1988)Gene 70(1),25-37)和所述AtuORF1 3’UTR(3'非转录区(UTR)，其包含所述转录终止子和根癌农杆菌pTi15955的开放读码框1(ORF1)的多腺苷酸化位点；Barker等人,(1983)Plant Molecular Biology,2(6),335-50)。所述玉米pDAB101849载体包含所述可选择标记物盒，其包含所述水稻肌动蛋白1基因启动子(OsAct1；启动子、5'非转录区(UTR)和内含子，其源自粳稻肌动蛋白1(Act1)基因；McElroy等人,(1990)Plant Cell 2(2):163-71)和所述ZmLip 3’UTR(3'非转录区(UTR)，其包含所述转录终止子和玉米LIP基因的多腺苷酸化位点；GenBank获取号第L35913号)。

使用电穿孔将所产生的烟草载体pDAB105900(图7)转移进入根癌农杆菌。在经限制性酶验证之后，以甘油储存株的方式保存所述农杆菌直至使用。将所述玉米载体pDAB105908(图8)扩增并且根据所述制造商的方案使用Qiagen QIAfilter Plasmid Giga试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)将其纯化。

实施例1.2：用于表达eZFN的载体

制备了表达处于标准(C2H2)或非标准(C3H)骨架中的适当的识别螺旋的ZFN载体，所述制备实质上根据美国专利公开号第2008/0182332号和第2008/0159996号中的描述而进行。

在根据实施例1.1中所描述的eZFN多重插入位点上测试了所述ZFN的功能，所述eZFN多重插入位点被插入于酵母ZFN筛选系统(参见，美国专利公开号第2009/0111119号)。受测试的全部ZFN对在所述酵母系统中具有活性。

将8种eZFN克隆进入载体，所述载体包含在植物细胞中表达所必需的调控序列。用于所述构建的克隆策略实质上描述于美国专利公开号第2009/0111188A1号和第20100199389号中。图9和图10示出了概要性的eZFN表达盒示意图。

实施例2：eZFN在玉米中的评估

实施例2.1：WHISKERS ^TM 介导的DNA递送

制备了玉米的胚胎Hi-II细胞培养物并且将其用作展示整合的活体植物细胞的来源。本领域的技术人员可构想使用源自于多种植物物种的细胞培养物或源自于多种植物物种的分化植物组织作为展示整合的活体植物细胞的来源。

在本实施例中，包含PAT植物可选择标记物盒和所述多eZFN结合位点插入序列的质粒(pDAB105908)被用于产生转基因事件。使用eZFN转化所述转基因分离株以评估双链切割。

特别地，在500ml爱伦美氏烧瓶(Erlenmeyer flask)中将来自先前冻存细胞系的12ml细胞压积(PCV)加上28ml的条件化培养基在80ml的GN6液体培养基(N6培养基(Chu等人,(1975)Scientia Sin 18:659-668)，2.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖，pH 5.8)内传代培养，并将所述烧瓶置于28℃下125rpm的振荡器上。使用同样的细胞系将这一步骤重复2次以使总计36ml的PCV被分入3个烧瓶中。在24小时后，除去所述GN6液体培养基并代之以72ml的GN6S/M渗透压培养基(N6培养基，2.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、45.5g/L山梨醇、45.5g/L甘露醇、100mg/L肌醇，pH 6.0)。使用中度搅拌(125rpm)在28℃下将所述烧瓶在黑暗中孵育30-35分钟。在所述孵育期间，通过将8.1ml GN6S/M液体培养基加至405mg的无菌碳化硅晶须(Advanced Composite Materials,LLC,Greer,SC)而制备50mg/ml的碳化硅晶须悬浮物。

在GN6S/M渗透压培养基中进行孵育之后，将各烧瓶中的内容物合并于250ml的离心瓶内。在所述烧瓶中的所有细胞沉积于底部之后，超过约14ml GN6S/M液体的内容物体积被排出并且收集于无菌的1-L烧瓶中以用于未来用途。在漩涡混合器上以最大速度将晶须的预湿悬浮物混合60秒钟并随后将其加至所述离心瓶。

在这一实施例中，向各瓶中加入了170μg来自pDAB105908质粒DNA的纯化片段。一旦加入DNA，立即将所述瓶置于经调整的Red Devil 5400商业涂料混合器(Red DevilEquipment Co.,Plymouth,MN)中并且搅拌10秒钟。在搅拌之后，将细胞、培养基、晶须和DNA的混合物与125ml新鲜的GN6液体培养基一起加入1-L烧瓶之中，所述新鲜的GN6液体培养基用于降低渗透压(osmoticant)。使所述细胞在设定于125rpm的振荡器中恢复2小时。使用连接以家用吸尘器管线的玻璃腔收集器单元将6ml的分散悬浮物过滤于Whatman 4号滤纸(5.5cm)之上，从而使每瓶获得了60张滤纸。将滤纸置于GN6固体培养基的60×20mm平板之上(除具有2.5g/L的Gelrite胶凝剂之外与GN6液体培养基相同)并且在28℃下在黑暗中培养1周。

实施例2.2：推测性转基因事件的鉴定和分离

DNA递送1周后，将滤纸转移至包含选择剂的60×20mm的GN6(1H)选择培养基(N6培养基，2.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、100mg/L肌醇、2.5g/L Gelrite，pH5.8)平板上。在黑暗中将这些选择平板在28℃下孵育1周。在黑暗中进行1周的选择之后，通过将各平板一半的细胞刮入包含3.0ml GN6琼脂糖培养基(N6培养基，2.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、100mg/L肌醇、7g/L SeaPlaque琼脂糖，pH5.8，在121℃下仅仅进行10分钟的高压消毒)的保持在37-38℃下的试管内而将所述组织植入新鲜培养基上。

使用刮铲将所述琼脂糖/组织混合物破碎并且随后将3ml的琼脂糖/组织混合物均匀地倒至包含GN6(1H)培养基的100×15mm皮氏培养皿表面。对各平板的两组半份重复这一过程。一旦将所有的组织植入，使用或PARAFILM将平板各自密封并且在28℃下在黑暗中培养最长达10周。

从被植入的平板中除去在这些选择条件下生长的推测性转化分离株并将其转移至60×20mm平板内的新鲜选择培养基中。如果在约2周后持续的生长明显，则认为是对所使用的除草剂(选择剂)具有抗性的事件并且随后采集细胞分样用于基因型分析。

实施例2.3：基因组DNA提取

从根据实施例2.2中所描述的分离的玉米细胞中提取基因组DNA(gDNA)并将其作为模板用于PCR基因分型实验。根据在DNeasy 96Plant Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)中详细描述的制造商的方案从约100-300μl细胞压积(PCV)的Hi-II愈合组织中提取gDNA，所述愈合组织根据上文所述被分离。将基因组DNA洗脱于100μl由试剂盒提供的洗脱缓冲液中，其产生了20-200ng/μl的最终浓度，并且随后通过下文所述的基于PCR的基因分型方法进行分析。

实施例2.4：拷贝数的分子分析

进行了分析以筛选除草剂抗性愈合组织的样品，用以鉴定包含所述pDAB105908转基因的单拷贝整合的样品。使用特异于基因表达盒的引物和探针进行详细分析。单拷贝事件被鉴定以用于另外的分析。

Third Wave Technologies(Madison,WI)开发了自定义分析以用于在Hi-II愈合组织中进行的PAT基因分析。首先在96孔平板设置中通过在95℃下孵育使所述基因组DNA样品变性并随后冷却至常温。下一步，将主混合物(除缓冲液外还包含用于PAT的探针混合物和内参基因)加至各孔并且使用矿物油覆盖所述样品。将平板密封并在BioRad热循环仪中进行孵育。在荧光分析仪上读值之前将平板冷却至常温。所有的平板包含1拷贝、2拷贝和4拷贝的标准物以及野生型对照样品和不含样品的空白孔。收集读出值并将其对各通道的超出零值(即背景)倍数进行比较，其通过将所述样品原始信号除以无模板的原始信号而对各样品测定。

通过该数据构建了标准曲线并且以线性回归分析测定最佳拟合。使用通过这一拟合所鉴定的参数，随后对各样品估测了表观PAT拷贝数。

实施例2.5：用于PCR基因分型的引物设计

在本实施例中，PCR基因分型被理解为包括但不限于对源自分离的玉米愈合组织的基因组DNA的聚合酶链反应(PCR)扩增，所述愈合组织预计包含植入所述基因组的供体DNA，随后进行对PCR扩增产物的标准克隆和序列分析。PCR基因分型方法已被详述(例如，Rios,G.等人,(2002)Plant J.32:243-253)并且可被用于源自任意植物物种或组织类型的基因组DNA，包括源自细胞培养物的基因组DNA。

本领域的技术人员可设计用于PCR基因分型的策略，其包括(但不限于)所述植物基因组中的特定序列的扩增、所述植物基因组中多个特定序列的扩增、所述植物基因组中非特定序列的扩增，或其组合。扩增后可进行克隆和测序，其根据本实施例中的描述或通过对扩增产物的直接序列分析而进行。本领域的技术人员可构想替代性的方法以用于本文所产生的扩增产物的分析。在本文所述的一个实施方案中，特异于所述基因靶的寡核苷酸引物被用于PCR扩增。

在本文提供的实施例中，寡核苷酸引物由(例如)Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,IA)通过标准脱盐条件而合成并且使用水将其稀释至100μM的浓度。所述寡核苷酸引物被设计用于与所述DNA插入物的侧连区域退火。在分离自非转基因植物的DNA存在的情况下使用所述质粒DNA的稀释物测试所述引物。使用所述引物通过推测性事件的基因组DNA对所述pDAB105908转基因进行PCR扩增。将所产生的片段克隆进入质粒载体并且对其测序以证实所述多eZFN结合位点序列在所述转化期间被完整地整合进入所述植物基因组。

实施例2.6：使用所述靶DNA对转基因事件的选择

针对完整的对多eZFN结合位点序列和所述PAT基因而通过PCR筛选低拷贝(1-2)事件。使用标准方法通过以PAT基因探针进行的Southern分析证实拷贝数。对来自携带单拷贝的完整插入物的选定转基因事件的愈合组织进行维持以用于随后使用瞬时表达的eZFN进行评估。

实施例3：eZFN DNA向植物细胞中的递送

为实现eZFN介导的双链切割，根据了解其需要编码eZFN的DNA的递送，其后在所述植物细胞中表达eZFN蛋白。本领域的技术人员可以构想通过多种方法可实现功能性ZFN蛋白的表达，所述方法包括但不限于，所述ZFN编码构建物的转基因处理，或所述ZFN编码构建物的瞬时表达。

在本文提及的实施例中，描述了用于编码eZFN的DNA向植物细胞中递送的方法。本领域的技术人员可使用适用于植物细胞的任意多种DNA递送方法，其包括(但不限于)农杆菌介导的转化、基于基因枪的DNA递送或WHISKERS^TM介导的DNA递送。在本文所述的一个实施方案中，使用多种编码eZFN的DNA构建物进行了基因枪介导的DNA递送实验。

实施例3.1：基因枪介导的DNA递送

根据上文所述，制备了玉米的胚胎Hi-II细胞培养物并且将其用作评估eZFN功能的活体植物的来源。本领域的技术人员可构想使用源自于多种植物物种的细胞培养物或源自于多种植物物种的分化植物组织作为展示靶向整合的活体植物细胞的来源。

将表达8种eZFN其中一种的质粒与内部对照(IPK-1)一同轰击进入来自5-10个转基因分离株的一组愈合组织，所述eZFN结合于所述多eZFN结合位点上的特定靶序列。

将所述转基因Hi-II玉米愈合组织在GN6(1H)培养基上逐周传代培养。在培养7天后，将约400mg的细胞以薄层平铺于2.5cm直径的圈中，所述圈处于100×15mm的皮氏培养皿中心，其包含使用2.5g/L gelrite进行固化的GN6S/M培养基。将所述细胞在黑暗条件下培养4小时。为使用DNA包被所述基因枪颗粒，使用100％的乙醇洗涤3mg直径0.6微米的金颗粒一次，使用无菌蒸馏水洗涤两次，并且重悬浮于硅化Eppendorf管内的50μl水中。将总计5μg质粒DNA、20μl亚精胺(0.1M)和50μl氯化钙(2.5M)分开加入至所述金悬浮物中并且在漩涡混合器上轻柔地混合。将所述混合物在室温下孵育10min，在桌面型微离心机中以10,000rpm离心沉淀10秒钟，重悬浮于60μl冰冷的100％乙醇中，并向各个载体膜片(macrocarrier)分配以8-9μl。

使用Biolistic PDS-1000/HE^TM系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)进行轰击。将包含所述细胞的平板置于在1100psi和27英寸汞柱的真空下的中部架上，并且根据操作手册对其轰击。轰击后24小时将所述组织以小块转移至GN6固体培养基上。

实施例4：Solexa测序和分析

实施例4.1：样品制备

使用所述eZFN和对照IPK1-ZFN(Shukla等人,(1990)Nature 459,437-441)进行轰击后72小时，将组织收集于2mL微型离心管内并且进行冻干至少48小时。根据制造商的说明使用gDNA提取试剂盒从冻干的组织中提取基因组DNA。最后将DNA重悬浮于200μl水中并且使用Nanodrop分光光度计(Thermo Scientific,Wilmington,DE)测定浓度。通过将全部样品在0.8％琼脂糖E-gel(Invitrogen,Carlsbad,CA)上电泳而估测DNA的完整度。对全部样品进行用于PCR扩增的归一化(25ng/ul)以产生用于Solexa测序的扩增子(amplicon)。

PCR引物购自IDT(Integrated DNA Technologies,San Jose,CA)，其用于对包含来自靶向(经ZFN处理)和对照样品的各所述eZFN切点以及所述IPK1-ZFN靶点的区域进行扩增。通过梯度PCR鉴定用于这些引物的最佳扩增条件，所述梯度PCR在23.5μL反应中使用了0.2μM的适当引物、Accuprime Pfx Supermix(1.1×,Invitrogen,Carlsbad,CA)和100ng的模板基因组DNA。循环参数包括在95℃(5分钟)下进行的初始变性，继之以35个循环的变性(95℃，15秒钟)、退火[55-72℃，30秒钟]、延伸(68℃，1分钟)，以及最终的延伸(72℃，7分钟)。在3.5％的TAE琼脂糖凝胶上分析扩增产物。在鉴定出最佳退火温度后，进行了制备性PCR反应以验证各组PCR引物并且生成所述Solexa扩增子。下文表3中示出了用于对玉米和烟草中的eZFN靶向区域进行扩增的寡核苷酸。使用引物(SEQ ID NO:27GCAGTGCATGTTATGAGC(正向引物)和SEQ ID NO:28CAGGACATAAATGAACTGAATC(反向引物))扩增了IPK1靶向区域。

表3：用于扩增所述eZFN切点的引物序列。

为进行制备性PCR，使用上述条件对于各个模板完成了8个独立的小规模PCR反应，并且将所述产物合并在一起并使用Qiagen MinElute^TM凝胶纯化试剂盒在3.5％的琼脂糖凝胶上将其纯化。使用Nanodrop分光光度计测定所述经凝胶纯化的扩增子的浓度，并且通过合并约100ng扩增子制备Solexa样品，所述扩增子来自靶向eZFN和对应的野生型对照以及所述归一化的靶向IPK-1和野生型对照。通过所述eZFN+IPK-1靶向样品、IPK-1靶向样品以及野生型对照，产生了包含扩增子的4种最终Solexa样品并对其测序。在进行Solexa测序之前将所述扩增子克隆进入PCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen)并且提交测序以验证所述引物。

实施例4.2：Solexa测序和分析

Solexa测序导致了成千种序列的产生。使用DAS下一代测序(NGS)分析脚本分析序列。低质量的序列(质量计分阈<5的序列)被滤去。随后使用所述参比序列比对所述序列并且对所述ZFN切点中的插入/缺失(Indel)进行计分，其由所述ZFN介导的切割和NHEJ介导的修复所导致，所述切割和修复通常导致作为ZFN活性表征的indel。在减去所述背景活性之后，根据在所述ZFN蛋白的结合位点之间的“间隔(gap)”序列中高于1个bp的缺失的数量而测定校正活性。通过与所述野生型对照进行比较并对所述IPK-1ZFN活性进行归一化而计算所述研究中各eZFN的活性。随后比较各eZFN经归一化的活性以对本研究中使用的eZFN评级。还根据所述eZFN切点中indel的存在而在序列比对水平上(与Solexa输出进行比较的参比)估测了活性。

根据图11中所示出，8种eZFN中的7种eZFN在玉米中表现出校正活性。

实施例5：eZFN在烟草中的评估

实施例5.1：多eZFN结合位点序列的稳定整合

为使用上文所描述的多eZFN结合位点序列的整合拷贝产生转基因植物事件，切割自Petit Havana烟草植物(如，事件1585-10，其包含此前整合的ZFN-IL1结合位点)并在PhytaTrays(Sigma,St.Louis,MO)内无菌生长于MS培养基(Phytotechnology Labs,Shawnee Mission,KS)和30g/L蔗糖中的叶片(1cm²)被漂浮于生长至OD₆₀₀～1.2的携带质粒pDAB105900的农杆菌LBA4404的过夜培养物上，在无菌滤纸上吸干并且随后将其在60×20mm培养皿中(每培养皿5个叶片)放置于添加1mg/L吲哚乙酸和1mg/L苄氨基嘌呤的相同培养基上。共培养72小时后，将叶片转移至包含250mg/L头孢噻肟(cephotaxime)和5mg/L的相同培养基中。3-4周后，在采集叶片和分子分析前，将小植物体(plantlet)转移至PhytaTrays内包含250mg/L头孢噻肟和10mg/L的MS培养基中再持续2-3周。

实施例5.2：多eZFN结合位点序列转基因事件的拷贝数和PTU分析

DNA分离。从抗性小植物体中采集转基因烟草植物组织并在96孔收集平板中将其冻干至少2天。随后根据所述制造商的指导使用DNEASY^TM 96孔提取试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)分离DNA。使用2-96A型Kleco组织粉碎机(Garcia Manufacturing,Visalia CA)进行组织破坏。

DNA定量。使用Pico Green DNA分析试剂盒(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)对所产生的基因组DNA进行定量。将20ng/μL至1.25ng/μL(系列地稀释)的5种预先定量的DNA标准物用于标准曲线的生成。首先以1:10或1:20的稀释度稀释未知样品以使其处于所述分析的线性范围之内。使用100μL的稀释Pico Green底物(1:200)与5μL的稀释样品和标准物混合并且在黑暗中孵育10分钟。随后使用Synergy2酶标仪(Biotek,Winooski,VT)记录荧光。通过经背景荧光校准后计算出的标准曲线估测基因组DNA浓度。随后使用Biorobot3000自动化液体操作仪(automated liquid handler)以TE或水将DNA稀释至10ng/μL的相同浓度。

拷贝数估测。使用多重DNA水解探针分析(multiplexed DNA hydrolysis probeassay)针对整合的复合度(complexity)而分析推测性的转基因事件，所述分析与分析相似。使用针对所述PAT转基因和内源烟草参比基因PAL的序列特异性引物和探针估测多位点构建体的拷贝数。使用探针设计软件2.0设计两种基因的分析。使用480系统(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)对两种基因的实时PCR进行估测。为进行扩增，以1×浓度将480探针主混合物(Probes Master mix)制备于10μl体积的多重反应物中，所述反应物包含0.4μM的各种引物以及0.2μM的各种探针(下文表4)。使用在58℃下持续38秒钟的进行荧光获取的延伸而实施了两步扩增反应。三次重复地运行全部样品并且将所述平均Ct值用于各样品的分析。对实时PCR数据的分析通过软件使用所述相对定量组件(relative quant module)而进行并且其基于所述ΔΔCt方法。为此目的，将来自单拷贝校准器(calibrator)的各DNA样品包含在内以对结果归一化。通过Southern分析而鉴定所述单拷贝校准剂事件并且其被证实具有所述PAT基因的单一插入。

表4：用于PAT和PAL水解探针分析的引物和探针

PCR.随后针对所述PAT基因的完整植物转录单元(PTU)以及完整的eZFN结合位点而通过PCR筛选低拷贝(1-2)事件。

实施例6：在所述多eZFN结合位点序列中测试eZFN切割

为测试eZFN协助在整合的多eZFN结合位点序列中靶向切割的能力，使用了基于eZFN构建体的瞬时表达的瞬时分析，所述瞬时表达通过转基因烟草叶片的农杆菌共培养而进行。切自包含单一全长拷贝的包含所述多eZFN结合位点序列的构建体(以及单一全长拷贝的ZFN-IL1构建体)的转基因事件的叶片(1cm²)被漂浮于生长至OD₆₀₀～1.2的农杆菌的过夜培养物上，在无菌滤纸上吸干并且随后将其放置于添加1mg/L吲哚乙酸和1mg/L苄氨基嘌呤的相同培养基上。对于各受测eZFN使用了3种处理：pDAB1601(阴性对照—仅有PAT)、仅使用pDAB4346(阳性对照—仅有ZFN-IL1)和pDAB4346+pDABeZFN-X(ZFN-IL1+受测eZFN)，每种处理使用20个叶片。

实施例6.1：序列分析

使用Qiagen DNA提取试剂盒从经农杆菌处理的转基因烟草叶片中分离基因组DNA。全部处理被重复2次进行并且将来自全部样品的基因组DNA重悬浮于100μl水中并通过Nanodrop测定浓度。对于各独立处理，将来自各重复组的等量基因组DNA合并在一起并且将其用作为Solexa复制子生成的起始模板。

用于从靶向(经eZFN处理)与对照样品中对涵盖所述多eZFN结合位点序列和切点的区域进行扩增的PCR引物来自于Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)并且经HPLC纯化。通过梯度PCR鉴定最佳扩增条件，所述梯度PCR在23.5μL反应中使用了0.2μM的适当引物、Accuprime Pfx Supermix(1.1×,Invitrogen,Carlsbad,CA)和100ng的模板基因组DNA。循环参数是在95℃(5分钟)下进行的初始变性，继之以35个循环的变性(95℃，15秒钟)、退火[55-72℃，30秒钟]、延伸(68℃，1分钟)，以及最终的延伸(72℃，7分钟)。在3.5％的TAE琼脂糖凝胶上分析扩增产物。在鉴定出最佳退火温度后(56.1℃)，进行了制备性PCR反应以验证各组PCR引物并且生成所述Solexa扩增子。

为进行制备性PCR，使用上述条件对于各个模板完成了8个独立的小规模PCR反应，并且将所述产物合并在一起并使用Qiagen MinElute凝胶纯化试剂盒在3.5％的琼脂糖凝胶上将其纯化。通过使用Nanodrop分光光度计测定所述经凝胶纯化的扩增子的浓度并且将约200ng的各个扩增子合并在一起以制备所述最终Solexa测序样品(800ng总样品)。在进行Solexa测序之前将所述扩增子克隆进入PCR Blunt II-TOPO并且提交常规测序以验证所述引物。进行了Solexa分析(Shendure等人,(2008)Nat.Biotechnology,26:1135-1145)并对序列进行分析。

实施例6.2：Solexa测序和分析

进行了Solexa测序，其导致了成千种序列的产生。使用DAS NGS分析脚本分析序列。低质量的序列(质量计分阈<5的序列)被滤去。随后使用所述参比序列(包含所述多eZFN结合位点的pDAB105900)比对所述序列并且针对所述切点中的插入/缺失(Indel)对其进行计分。对各eZFN和未处理对照的校正活性(％NHEJ)进行了计算(具有indel的高质量序列数量/高质量序列总数量×100)并且在下文图12中示出。所显示的是所述8种eZFN在两个转基因烟草事件(105900/#33和105900/#45)中的活性(图12)。所述8种eZFN中的3种在所述受测的两个转基因烟草事件中具有活性。还根据所述经eZFN处理的样品中indel在ZFN切点处的存在而在序列比对水平上(参比Solexa输出)估测了活性。

ZFN单体(“左”和“右”)半部分的全部组合在所述酵母分析中均有活性。描述所述玉米和烟草实验的数据表明，某些或多数所述组合在植物中具有活性，这支持了使用所述两种ZFN单体的显著数量的排列的可能性，所述两种ZFN单体来自于为本研究而选定的4种原始ZFN。

实施例7：等位基因内重组

等位基因内重组实现了对两个独立条段的转基因的开发和优化，所述转基因可随后通过重组而在一个基因座中堆叠在一起。为增强所述两个条段之间的重组水平，双链切割起始了通过基因转换(gene conversion)或染色单体交换而进行的DNA交换。

为在植物中展示这一理念，在拟南芥中制备了图13中示出的转基因插入物。所述构建体包含基因条段，其包含可选择标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)或潮霉素磷酸转移酶(HPT))和可计分标记物(β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或黄色荧光蛋白(YFP))。这些基因条段处于相同的基因位置，但相互间距离约2kb。通过将携带所述两个条段中各一个的染色体组合于单一植物中而实现了所述两个条段之间的重组，所述组合通过杂交和所述子代与表达ZFN的植物的再度杂交而进行，所述ZFN在所述两个条段之间的中间位置(图13中MIS上方的黑条)进行切割。使用减数分裂特异性/优选的启动子表达所述ZFN。所使用的着位台序列包括描述于美国专利申请第61/297,641号中的序列，其以引用的方式并入本文。

为在相同的基因组位置产生独立的条段，制备了包含紧邻排列的两个条段的构建体(图14)。为产生携带单独的所述独立条段的植物，在独立的杂交中使用ZFN将各条段切下，所述ZFN被设计用于分别在各条段的两侧之一的对应ZFN结合位点处(红色和蓝色条块)切割DNA。图15显示，在与适当的种系(表达ZFN的拟南芥)杂交后所述条段被切下，其产生了单个条段插入物。这些种系携带所述PAT基因作为可选择标记物。通过表型筛选(HygR、KanR和PAT基因的除草剂抗性或GUS和YFP的可计分标记物基因表达)或分子分析如PCR和Southerns而证实了具有预期表型(HygR+,KanR-,PAT+,YFP+，或者KanR+,HygR-,PAT+,GUS+)的植物的恢复(recovery)。将携带两种不同条段之一的植物进行杂交以生成HygR+,KanR+,PAT-,GUS+,YFP+子代。

在对所产生的植物进行分析特征研究之后，将具有经证实的插入物的植物与表达ZFN的种系进行杂交，所述ZFN的结合位点位于所述两种条段之间，通过使用减数分裂特异性启动子表达所述ZFN以进行DNA的交换。这导致了所述两种条段在同一DNA位置堆叠在一起。所述最终堆叠基因的植物携带了作为单一的分离基因座的HygR+,KanR+,GUS+,YFP+结构。或者，将包含所述条段之一的植物与包含所述减数分裂启动子/ZFN构建体的两种单体之一进行杂交，获得了对于所述两种插入物而言是纯合的植物并且随后将其在一起杂交。

实施例7.1：DNA构建

用于构建所述ZFN构建体的克隆策略实质上根据美国专利公开号第2009/0111188A1号和第2010/0199389号中的描述。图9描述了示例性的eZFN表达盒。使用所述ZmUbi1启动子(启动子、5'非翻译区(UTR)和内含子，其源自源自玉米泛素1(Ubi-1)基因；Christensen等人,(1992)Plant Molec.Biol.18(4),675-89)表达编码ZFN的序列。这些序列随后被克隆进入双元GATEWAY目的载体(binary GATEWAY^TM destination vector)，所述载体包含驱动所述PAT基因表达的水稻actin1启动子。所产生的质粒pDAB105951(ZFN1；CL:AR)、105954(ZFN8；RL:AR)、105952(ZFN3；AL:PR)、105953(ZFN6；CL:RR)分别被命名为条段1切割体(Block1Excisor)(eZFN1,8)或条段2切割体(Block2Excisor)(eZFN3,6)，其被转移进入农杆菌菌株DA2552recA。

通过将来自甘油储存株的DA2552菌株接种进入包含大观霉素(spec)(100μg/mL)和红霉素(ery)(150μg/mL)的10ml的YEP而制备起始培养物，从而将所述农杆菌DA2552菌株制备成用于电穿孔的感受态。在28℃下以200rpm将所述10ml培养物接种过夜。在适当标记的1.5L爱伦美氏烧瓶中使用5毫升的所述起始培养物接种具有适当抗生物的500ml YEP。在28℃下以200rpm将所述培养物接种过夜。在过夜孵育后，通过将所述培养物置于湿冰水浴中并轻柔晃动而将其冷却。将所述细胞在4℃保存以用于全部后续步骤。通过在预冷的转子中以4000×g在4℃下离心10分钟而将所述细胞沉淀在标记的无菌离心管中。将所述上清倒出并丢弃，随后加入5至10mL的冰冷无菌双蒸水，并轻柔地用微量吸头吸打所述细胞直至无结块存留。使用冰冷的无菌双蒸水将所述悬浮液体积调至约500ml。通过在预冷的转子中以4000×g在4℃下离心10分钟而沉淀所述细胞。丢弃所述上清并加入5至10ml冰冷的无菌双蒸水；随后使用无菌的广口吸头轻柔地吸打细胞直至无结块存留。使用冰冷的无菌双蒸水将所述悬浮液体积调至约250ml并且再次通过在预冷的转子中以4000×g在4℃下离心10分钟而沉淀所述细胞。丢弃所述上清并加入5至10ml冰冷的无菌双蒸水，轻柔地重悬浮所述沉淀并用冰冷的无菌双蒸水将最终体积调至约50ml。通过在预冷的转子中以4000×g在4℃下离心10分钟而沉淀细胞。将细胞重悬浮于最终体积5ml的10％冰冷无菌甘油中。将细胞以50μl分样分入无菌的0.5ml微量离心管内并且在液氮中冷冻。

根据所述制造商的预先设定以及用于农杆菌电穿孔的方案使用GENE电穿孔系统(BioRad Hercules,CA.)使用50ng质粒DNA对20微升的感受态DA2552细胞实施电穿孔。在28℃下将所述细胞在SOC中恢复2小时并且随后平铺于YEP spec/ery琼脂平板之上并且在28℃下生长48小时。

实施例7.2：交换基因座构建体

通过GATEWAY^TM入门载体(entry vector)制备所述交换基因座DNA构建体，所述入门载体包括载体1：AtAct2启动子(AtAct2启动子v2(启动子、5'非翻译区以及内含子，其来自拟南芥肌动蛋白基因(ACT2)；An等人,(1996)Plant J.10,107-121))/GUS(Jefferson,(1987)EMBO J.6,3901-3907)/AtuORF23 3'UTR(3'非翻译区(UTR)，其包含根癌农杆菌pTi15955的开放读码框23(ORF23)的转录终止子和多腺苷酸化位点；Barker等人,(1983)Plant Molec.Biol.2(6):335-50)::AtAct2启动子/NPTII(Bevan等人,(1983)Nature 304,184-187)/AtuORF23 3'UTR，其侧连以eZFN 1和8，载体2：eZFN4和7处于所述序列中心的合成2kb区域，以及载体3：CsVMV启动子/HPT(Kaster等人,(1983)Nucleic Acids Res.11(19),6895-6911(1983))/AtuORF233’UTR::AtUbi10启动子(启动子、5'非翻译区以及内含子，其来自拟南芥多聚泛素10(UBQ10)基因；Norris等人,(1993)Plant Molecular Biology21(5):895-906)/PhiYFP(Shagin等人,(2004)Molecular Biol.EVol21:841-850)/AtuORF233'UTR，其侧连以eZFN 3和6。通过将两个1kb随机化合成的DNA序列插入农杆菌双元载体骨架而制备所述目的载体，所述DNA序列之间包含有限制性位点以克隆GATEWAY^TMccdB负性可选择标记物盒。通过LR Clonase反应将所述入门载体克隆进入所述目的载体。根据上文所述将所产生的载体pDAB100646(图16)转移至农杆菌。

实施例7.3：拟南芥转化

根据Clough&Bent(1998Plant J.,16,735-743)所描述的方法而实施进入拟南芥的全部转化。

切割体种系

“切割体”种系构建体具有所述草胺膦乙酰转移酶(PAT)基因，其产生针对草胺磷的抗性。在种植7、10和13天后，使用284mg/L的Liberty除草剂溶液(200克活性成分每升(gai/L)草胺膦，Bayer Crop Sciences,Kansas City,MO)以10ml/盘(703L/ha)的喷洒体积通过DeVilbiss压缩空气喷咀喷洒T₁植物，用以递送每应用200g ai/ha草胺膦的有效速度。在最终的喷洒后4-7天鉴定存活体(活跃生长的植物)并将其各自移植入3英寸的植物盆(pot)中，所述植物盆使用盆栽介质(Metro Mix 360)而制备。

通过逆转录PCR(RT PCR)测定所述eZFN在所述切割体事件中的表达，并且对所述PAT基因进行根据本文所述的qPCR以测定拷贝数并且通过Southern分析对其进行证实。将高水平表达所述eZFN的3个低拷贝事件与交换基因座事件进行杂交。

交换基因座种系

根据Clough&Bent(1998Plant J.,16,735-743)所描述的方法在拟南芥中产生了交换基因座种系，所述方法包括在包含潮霉素或卡那霉素的培养基上进行的选择。

实施例7.4：拟南芥杂交和子代恢复(progency recovery)

使用标准方法进行所述交换基因座事件与条段1和条段2切割体种系的两个组进行的杂交。

将来自所述杂交的种子在潮霉素(条段1缺失)或卡那霉素(条段2缺失)上生长并且针对GUS表达(条段1缺失)或YFP表达(条段2缺失)对抗性植物进行分析。使用组织化学分析(Jefferson等人,(1987)Plant Mol.Biol.Rep 5,387-405)测定GUS活性并且使用荧光显微法测定YFP。通过PCR和Southerns分析具有所需表型(条段1阳性：GUS+,NPT+,HPT-,YFP-；条段2阳性：GUS-,NPT-,HPT+,YFP+)的植物以证实所述所需基因结构。使用双丙氨磷溶液涂布来自被选定植物的叶以估测哪一植物是PAT+。

将包含所述条段1和条段2基因盒的植物进行杂交并且在潮霉素/卡那霉素平板上选择子代。通过PCR和表型筛选而针对所有基因的存在分析HygR/KanR植物。生长具有所需表型的F1植物并且将其与减数分裂启动子/ZFN植物进行杂交以实施条段1和条段2的重组。在潮霉素/卡那霉素平板上生长所产生的子代。针对GUS和YFP对从所述选择中存活的植物进行筛选。使用PCR、Southern、测序和分离分析进行对所述重组子的证实和特征研究。

实施例8：eZFN位点的基因堆叠

可使用以下方法实现图1、2、4、5和6中示出的策略。

构建体设计

可以以串联体形式将异二聚体eZFN位点的多种组合组装于适用于植物转化的质粒载体中。图1、图2和图4展示了多种版本的异二聚体eZFN位点，其可被并入载体并且转化进入植物的染色体。

WHISKERS ^TM 转化

根据美国专利第7,179,902号中的描述制备玉米的胚胎Hi-II细胞培养物并且将其用作为活体植物细胞的来源，靶向整合在所述植物细胞中进行例示。将包含连接于植物可选择标记物盒的所述异二聚体eZFN位点的DNA片段用于产生转基因事件。转基因事件被分离并受到特征研究。

在500ml爱伦美氏烧瓶中将来自先前冻存细胞系的12ml细胞压积(PCV)加上28ml的条件化培养基在80ml的GN6液体培养基(N6培养基(Chu等人,(1975)Sci Sin 18:659-668)，2.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖，pH 5.8)内传代培养，并将所述烧瓶置于28℃下125rpm的振荡器上。使用同样的细胞系将这一步骤重复2次从而使总计36ml的PCV被分入3个烧瓶中。

在24小时后，除去所述GN6液体培养基并代之以72ml的GN6S/M渗透压培养基(N6培养基，2.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、45.5g/L山梨醇、45.5g/L甘露醇、100mg/L肌醇，pH 6.0)。使用中度搅拌(125rpm)在28℃下将所述烧瓶在黑暗中孵育30-35分钟。在所述孵育期间，通过将8.1ml GN6S/M液体培养基加至405mg的无菌碳化硅晶须(Advanced CompositeMaterials,LLC,Greer,SC)而制备50mg/ml(w/v)的碳化硅晶须悬浮物。在GN6S/M渗透压培养基中进行孵育之后，将各烧瓶中的内容物合并于250ml的离心瓶内。在所述烧瓶中的所有细胞沉积于底部之后，超过约14mL GN6S/M液体的内容物体积被排出并且收集于无菌的1-L烧瓶中以用于未来用途。在漩涡混合器上以最大速度将晶须的预湿悬浮物混合60秒钟并随后将其加至所述离心瓶。

向各瓶中加入85μg纯化DNA片段的分样。一旦加入DNA，立即将所述瓶置于经调整的Red Devil 5400商业涂料混合器(Red Devil Equipment Co.,Plymouth,MN)中并且搅拌10秒钟。在搅拌之后，将细胞、培养基、晶须和DNA的混合物与125ml新鲜的GN6液体培养基一起加入1-L烧瓶之中，所述新鲜培养基用于降低渗透压。使所述细胞在设定于125rpm的振荡器中恢复2小时。使用连接以家用吸尘器管线的玻璃腔收集器单元将6ml的分散悬浮物过滤于Whatman 4号滤纸(5.5cm)之上，从而使每瓶获得了60张滤纸。将滤纸置于GN6固体培养基的60×20mm平板之上(除具有2.5g/L的Gelrite胶凝剂之外与GN6液体培养基相同)并且在28℃下在黑暗条件下培养1周。

推测性靶向整合转基因事件的鉴定和分离

DNA递送1周后，将滤纸转移至包含选择剂的60×20mm的GN6(1H)选择培养基(N6培养基，2.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、100mg/L肌醇、2.5g/L Gelrite，pH5.8)平板上。在黑暗中将这些选择平板在28℃下孵育1周。在黑暗中进行1周的选择之后，通过将各平板的1/2细胞刮入包含3.0ml GN6琼脂糖培养基的(N6培养基，2.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、100mg/L肌醇、7g/L 琼脂糖，pH5.8，在121℃下进行10分钟的高压消毒)保持在37-38℃下的试管内而将所述组织植入新鲜培养基。

使用刮铲破碎所述琼脂糖/组织混合物并且随后将3ml的琼脂糖/组织混合物均匀地倒至包含GN6(1H)培养基的100×25mm培养皿表面。对各平板的两组半份重复这一过程。一旦将所有的组织植入，在28℃下将平板在黑暗条件下培养最长达10周。从被植入的平板中除去在这些选择条件下生长的推测性转化分离株并将其转移至60×20mm平板内的新鲜选择培养基中。如果在约2周后持续的生长明显，则认为是对所使用的除草剂(选择剂)具有抗性的事件并且随后采集细胞分样用于基因型分析。稳定的植物转化产生了单拷贝整合子(integrant)，其被用于堆叠实验。

事件的分子特征研究

从所描述的分离的玉米细胞中提取基因组DNA(gDNA)并将其作为模板用于PCR基因分型实验。根据在96植物试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)中详细描述的制造商方案从约100-300μl细胞压积(PCV)的被分离的Hi-II愈合组织中提取gDNA。将基因组DNA洗脱于100μl由试剂盒提供的洗脱缓冲液中，其产生了20-200ng/μl的最终浓度，并且随后通过基于PCR的基因分型方法对其进行分析。

拷贝数的分子分析

进行了或水解探针分析以筛选除草剂抗性愈合组织的样品，用以鉴定包含所述T链DNA的单拷贝整合的样品。使用特异于基因表达盒的引物和探针进行详细分析。单拷贝事件被鉴定以用于另外的分析。

Third Wave Technologies(Madison,WI)开发了自定义分析以用于在Hi-II愈合组织中进行的所述可选择标记物分析。使用所述分析试剂盒扩增所述基因组样品并收集读出值。通过这些读出值，根据将所述样品原始信号除以无模板的原始信号而对于各样品测定了各通道的超出零值(即背景)倍数。通过该数据构建了标准曲线并且以线性回归分析测定最佳拟合。使用通过这一拟合所鉴定的参数，随后对各样品估测了表观可选择标记物拷贝数。

使用靶DNA对转基因事件的选择

对于包含所述可选择标记物基因盒的完整植物转录单元(PTU)和完整eZFN位点，根据上文描述筛选了低拷贝(1-2拷贝的所述转基因)事件。使用标准方法通过以所述可选择标记物基因进行的Southern分析进一步证实拷贝数。对来自被选中转基因事件的愈合组织加以维持，其携带单拷贝完整插入物。

向包含eZFN的植物细胞中进行的基因枪介导的DNA递送

根据上文所述，制备了玉米的胚胎Hi-II细胞培养物并且将其用作为展示靶向整合的活体植物细胞的来源。根据上文描述在进行试验之前将玉米的胚胎悬浮物在GN6液体培养基中传代培养约24小时。除去过量的液体培养基，并将约0.4mL PCV的细胞以薄层平铺于2.5cm直径的圈中，所述圈处于100×15mm的皮氏培养皿中心，其包含使用2.5g/Lgelrite进行固化的GN6S/M培养基。

将所述细胞在黑暗条件下培养4小时。为使用包含供体DNA片段(图1中的条段1、图2中的条段2或图4中的基因1)的DNA包被所述基因枪颗粒，使用100％的乙醇洗涤3mg直径1.0微米的金颗粒一次，使用无菌蒸馏水洗涤两次，并且重悬浮于硅化Eppendorf管内的50μl水中。将总计5μg的质粒DNA(在单一载体或各自独立的载体中包含编码所述eZFN和供体DNA片段的核酸分子)、20μl的亚精胺(0.1M)和50μl氯化钙(2.5M)各自独立地加入至所述金悬浮液中并且在漩涡混合器上混合。将所述混合物在室温下孵育10分钟，在桌面型微离心机中以10,000rpm离心沉淀10秒钟，重悬浮于60μl冰冷的100％乙醇中，并将8-9μl向各个载体膜片(macrocarrier)分配。

使用Biolistic PDS-1000/HE^TM系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)进行轰击。将包含所述细胞的平板置于在1,100psi和27英寸汞柱的真空下的中部架上，并且根据操作手册对其轰击。进行轰击16小时后，将所述组织以小细胞团转移至GN6(1H)培养基并且在28℃下在黑暗条件中培养2-3周。每2-4周继续转移一次，直至由供体DNA的整合所产生的推测性转基因分离株开始出现。通常使用上文详述的方法通过PCR和DNA印迹对所述双丙氨磷抗性细胞群落进行分析以产生包含所述靶序列的分离株。

通过PCR基因分型对靶向整合事件的筛选

为研究完整拷贝的所述供体DNA的存在而进行了PCR反应。另外的反应聚焦于所述靶和供体之间的5'边界和所述供体和靶之间的3'边界。根据标准方案对被扩增的片段进行凝胶切割和纯化。随后根据制造商的方案使用TOPO TA试剂盒(使用pCR2.1载体)和ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)将纯化的片段克隆进入pCR2.1质粒。

对单个群落进行了选择并证实其包含所述被扩增的PCR片段。进行了质粒克隆的双链测序反应以证实所述PCR扩增基因组序列包含所述被整合的供体。经鉴定包含所述供体片段的事件代表了靶，在其中对ZFN介导的双链切割的同源性驱动的修复和供体DNA在特定基因中的靶向整合靶定于所述靶。

使用eZFN位点进行的基因堆叠的特定用途

图1示出了由稳定转化入植物染色体的七(7)种eZFN靶向位点组成的多重插入位点的改造。以几何图的形式描述了结合所述靶点的eZFN对。“条段1”是外源序列序列，当与设计用于切割特定eZFN位点的eZFN一起被转化时所述条段可被整合入所述适当eZFN对的多重插入位点。可使用上文所述的基因枪转化方法实施eZFN和“条段1”供体DNA序列的共转化。所述多种其它eZFN位点的保真度受到保持，因为转化进入所述植物细胞的eZFN并不在这些其它位点上进行切割。“条段1”通过同源性重组整合进入所述植物染色体，其产生了包含“条段1”序列的植物细胞。可将所产生的植物细胞生长成为植物体并且针对“条段1”的存在对其筛选，所述筛选使用本领域中已知的分析分子生物学方法进行，诸如DNA印迹、Taqman分析或Invader分析。

图2示出了图1的另一种变型，其中靶向了不同的eZFN结合位点与多核苷酸供体序列“条段2”。所导致的所述DNA片段的整合产生了在所述基因组中包含“条段2”的稳定植物。

图4展示了eZFN“左”和“右”结构域的使用。所述顶部线条描述了使用所述左和右eZFN结构域(阴影三角形和方格纹三角形)进行转化的植物基因组。当在包含侧连有新的并且不同的异二聚体eZFN位点的“基因1”的适当的外源分子存在下加入所述适当的eZFN时，所述“基因1”和侧连的eZFN被插入了所述基因组。对所产生的包含“基因1”和侧连eZFN位点的子代进行鉴定并且随后可使用所述亲本植物中不存在的新异二聚体eZFN位点(即，包含所述阴影三角形和方格纹三角形的eZFN位点)再度靶向于这些植物。

图5和图6展示了如何将eZFN位点用于向染色体位置中堆叠新的转基因。此外，这一策略实现了其它基因表达盒的切除。在一些情况下可完全去除基因表达盒(图5)，在其它情况下可在植物的特定代系中除去所述基因表达盒并将其最终重新引入这些植物的子代，由此而实现了基因表达框的再循环。可使用上文所述的方案通过同源重组介导的基因靶向而重新引入被缺失的标记物(图6)序列。使用上述方法完成进入所述异二聚体eZFN位点的基因靶向。在本实施例中，将eZFN结合位点用于实现从转化植物中进行任意转基因的植物在体缺失(in planta deletion)，所述转基因包括可选择标记物基因。还参见2010年1月22日提交的美国专利申请第61/297628号，其以引用的方式并入本文。

出于全部目的，本文所述的全部专利、专利申请和出版物的全文特此以引用的方式并入本文。

尽管出于澄清了解的目的通过说明和实施例的方式已经以一定详细程度提供了本申请，本领域的技术人员应当明了在不背离本申请的精神或范围的前提下可以作出多种改变和修改。因此，前述描述和实施例不应被解释为进行限制。

Claims (8)

1.一种分离的核酸分子，其包含(i)基本上由用于三对或更多对锌指核酸酶的多个成对靶点组成的序列。

2.权利要求1的核酸分子，其中其中各成对靶点的第一靶点包含相同的序列。

3.权利要求1或2的核酸分子，其进一步包含(ii)一种或多种编码序列。

4.权利要求1的核酸分子，其中每个对的靶点之间分隔5-8或15-18个核苷酸。

5.权利要求1-4中任一项的核酸分子，其中所述成对靶点中的至少一个在细胞的基因组中不存在。

6.权利要求5的核酸分子，其中所述细胞是真核细胞。

7.权利要求5的核酸分子，其中所述核酸分子被整合进入所述细胞的基因组。

8.权利要求7的核酸分子，其中所述细胞是植物细胞。