CN101528924A

CN101528924A - 锌指核酸酶介导的同源重组

Info

Publication number: CN101528924A
Application number: CNA2007800367894A
Authority: CN
Inventors: 蔡其华; 杰弗里·米勒; 威廉·M·安利; 罗比·J·加里森; 约瑟夫·F·皮托利诺; 贝丝·C·鲁宾-威尔逊; 莉萨·L·舒伦伯格; 安德鲁·F·沃登
Original assignee: Dow AgroSciences LLC; Sangamo Biosciences Inc
Current assignee: Sangamo Therapeutics Inc; Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2009-09-09
Anticipated expiration: 2027-08-09
Also published as: JP2018029603A; AR108684A2; ZA200900787B; KR101439568B1; TWI424061B; JP2016195606A; US10669551B2; KR20090054986A; DK2049663T3; EP2049663A1; ES2532002T3; US20160326537A1; JP2014193179A; EP2395081A1; HK1134320A1; HK1221251A1; BRPI0716427A2; IL196942A; CN101528924B; EP2049663B1

Abstract

本发明公开了用于将外源序列靶向整合入植物基因组中预定靶位点的方法和组合物。

Description

锌指核酸酶介导的同源重组

发明领域

本公开在植物中基因组工程、基因靶向、靶向染色体整合及蛋白质表达领域中。

发明背景

农业中感兴趣的一个主要领域(尤其是根据大量植物基因组的全核苷酸序列的测定)是基因组序列的靶向改变。具体地，转换内源植物序列的能力会促进众多应用，诸如例如优化影响营养价值、产量、应力耐性、病原体抗性及农用化学品抗性的作物性状和/或使植物适于用作生物工厂以生产药用化合物或工业化学品。

在真核生物中，已经试图通过利用同源重组的自然现象来改变培养细胞中的基因组序列。参见例如Capecchi(1989)Science 244：1288-1292；美国专利No.6,528,313及6,528,314。如果多核苷酸与含有待改变序列的基因组区域具有足够的同源性，那么该多核苷酸的部分或整个序列通过同源重组来替换该基因组序列是可能的。然而，这些情况下的同源重组频率是极低的。此外，缺乏序列同源性的基因组位置处的外源多核苷酸插入频率超过同源重组频率达几个数量级。

在基因组中与外源多核苷酸具有同源性的区域中将双链断裂导入基因组DNA中已有显示刺激培养细胞中该位点处的同源重组达数千倍。Rouet等(1994)Mol.Cell.Biol.14：8096-8106；Choulika等(1995)Mol.Cell.Biol.15：1968-1973；Donoho等(1998)Mol.Cell.Biol.18：4070-4078。还可参见Johnson等(2001)Biochem.Soc.Trans.29：196-201；及Yanez等(1998)GeneTherapy 5：149-159。在这些方法中，期望基因组区域中对DNA的切割是通过将大范围核酸酶(即一种内切核酸酶，该内切核酸酶的识别序列如此之大以致它在感兴趣的基因组中不存在或仅罕见存在)的识别位点插入所述期望基因组区域中而实现的。

然而，大范围核酸酶切割作用刺激的同源重组依赖于待改变基因组区域附近合适的大范围核酸酶识别位点的偶然存在或定向插入。由于在典型的植物基因组中大范围核酸酶识别位点是罕见的(或是不存在的)，而合适的大范围核酸酶识别位点的插入受到与其它基因组改变有关的同样困难的困饶，因此这些方法不可广泛应用。

如此，仍然需要用于在任何植物基因组中靶向改变序列的组合物和方法及用于将外源序列靶向导入基因组中的组合物和方法。

发明概述

本公开提供了用于在植物细胞中靶向切割感兴趣区域中的细胞染色质和/或在感兴趣的预定区域处同源重组的组合物和方法。植物细胞可以来自单子叶(monocot)或双子叶(dicot)植物物种，而且还包括培养细胞、处于任何发育阶段的植物中的细胞、及已经从整个植物中取出且该细胞(或其后代)会返回所述植物的植物细胞。

细胞染色质中的感兴趣区域可以是例如基因组序列或其部分。组合物包括包含工程化(engineered)锌指结合结构域(例如具有新特异性的锌指结合结构域)和切割结构域的融合多肽，及包含工程化锌指结合结构域和切割半结构域(half-domain)的融合多肽。切割结构域和切割半结构域可以获自例如各种限制性内切核酸酶和/或归巢(homing)内切核酸酶。

一方面，本文所描述的是一种载体，其包含第一和第二DNA序列，其中(i)所述第一序列是与第三序列同源的，且所述第二序列是与第四序列同源的；(ii)所述第三和第四序列是染色体DNA序列；且(iii)所述第三和第四序列的近边缘(near edge)是由至少1个核苷酸对分开的。在某些实施方案中，所述第三和第四序列是内源序列。

在任何本文所述载体中，所述第一或第二序列中至少一种的长度为100个核苷酸。另外，任何本文所述载体还可以包含第五序列，其中所述第五序列：(a)是插入所述第一和第二序列之间的；且(b)是外源序列。在某些实施方案中，所述第五序列的大小为至少一个碱基对，但可以大到22千碱基对。

载体(例如第五序列)还可以包含编码蛋白质或蛋白质之一部分的序列。在某些实施方案中，所述蛋白质编码序列编码选择标志(例如绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase，GUS)、膦丝菌素N-乙酰转移酶(phosphinothricin N-acetyl transferase，PAT，BAR)、新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase)、β-内酰胺酶(β-lactamase)、儿茶酚双加氧酶(catechol dioxygenase)、α-淀粉酶(α-amylase)、酪氨酸酶(tyrosinase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、萤光素酶(luciferase)、水母发光蛋白(aequorin)、EPSP合酶(EPSP synthase)、腈水解酶(nitrilase)、乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS)、二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)、茅草枯脱卤素酶(dalapon dehalogenase)、及邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))。在其它实施方案中，所述蛋白质编码序列(例如第五序列)编码蛋白质或蛋白质之一部分，例如与染色体序列同源的序列。

在其它实施方案中，载体(例如第五序列)包含一种或多种转录调节序列。在还有一些实施方案中，载体(例如第五序列)可以包含突变型染色体序列的野生型对应物(counterpart)，或者，野生型染色体序列的突变型对应物。

在任何本文所述载体中，第一序列与第三序列可以具有至少35％的同源性。类似地，在任何本文所述载体中，第二序列与第四序列可以具有至少35％的同源性。在有些实施方案中，第一序列与第三序列具有至少35％至50％、至少50％至70％、至少70％至80％、至少80％至85％、至少85％至90％、至少90％至95％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性。在有些实施方案中，第二序列与第四序列具有至少35％至50％、至少50％至70％、至少70％至80％、至少80％至85％、至少85％至90％、至少90％至95％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性。

又一方面，本文所描述的是一种用于将外源序列导入植物细胞基因组中的方法，该方法包括以下步骤：(a)使所述细胞与任何上文所述载体接触；并(b)在所述细胞中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割距所述第三或第四序列之任一种0.4-3千碱基对内的染色体DNA；使得步骤(b)中对染色体DNA的切割刺激所述靶向载体通过同源重组而掺入所述基因组中。在某些实施方案中，所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

又一方面，本文所提供的是一种用于在植物细胞中表达蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：(a)使所述细胞与本文所述载体接触；并(b)在所述细胞中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割距所述第三或第四序列之任一种0.1-3千碱基对内的染色体DNA；使得步骤(b)中对染色体DNA的切割刺激所述载体通过同源重组而掺入所述基因组中。在某些实施方案中，所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

另一方面，本文所描述的是一种靶向载体，其包含：(a)第一和第二编码序列；及(b)第一、第二、和第三靶序列；其中所述序列是以如下次序排列的：第一靶序列、第一编码序列、第二靶序列、第二编码序列、第三靶序列；而且其中所述第一靶序列是与第一染色体序列同源的，且所述第三靶序列是与第二染色体序列同源的。所述第一和/或第二编码序列可以编码选择标志，或者所述第一和/或第二编码序列可以编码不是选择标志的蛋白质。所述第一和第二染色体序列可以是内源染色体序列。此外，所述载体可以包含所述第一、第二和/或第三靶序列的一个或多个重复(repeat)。

另一方面，提供了一种用于将外源序列导入植物细胞基因组中的方法，该方法包括以下步骤：(a)使所述细胞与前段所述靶向载体接触；并(b)在所述细胞中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割距所述第一或第二染色体序列之任一种0.1-3千碱基对内的染色体DNA；使得步骤(b)中对染色体DNA的切割刺激所述靶向载体通过同源重组而掺入所述基因组中。在某些实施方案中，所述一种或多种核酸酶包含切割半结构域；例如，所述核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

另一方面，提供了一种用于在植物细胞中表达蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：(a)使所述细胞与前两段所述靶向载体接触；并(b)在所述细胞中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割距所述第一或第二染色体序列之任一种0.1-3千碱基对内的染色体DNA；使得步骤(b)中对染色体DNA的切割刺激所述靶向载体通过同源重组而掺入所述基因组中。在某些实施方案中，所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

还一方面，还提供了依照任何本文所述方法而获得的转基因植物细胞。

另一方面，本文所提供的是一种植物，其包含如本文所述而获得的转基因植物细胞。

还提供的是一种用于从转基因植物细胞基因组中删除序列的方法，所述转基因植物细胞基因组包含第一和第二编码序列，及第一、第二和第三靶序列，其中所述序列是以如下次序排列的：第一靶序列、第一编码序列、第二靶序列、第二编码序列、第三靶序列；其中该方法包括：(a)提供本文所述转基因植物细胞；并(b)在所述细胞中表达第一和第二核酸酶，其中所述第一核酸酶在所述第一靶序列中切割，且所述第二核酸酶在所述第二靶序列中切割。

在进一步的方面，本文所公开的是一种用于从转基因植物细胞基因组中删除序列的方法，所述转基因植物细胞基因组包含第一和第二编码序列，及第一、第二和第三靶序列，其中所述序列是以如下次序排列的：第一靶序列、第一编码序列、第二靶序列、第二编码序列、第三靶序列；其中该方法包括：(a)提供本文所述转基因植物细胞；并(b)在所述细胞中表达第一和第二核酸酶，其中所述第一核酸酶在所述第二靶序列中切割，且所述第二核酸酶在所述第三靶序列中切割。

又一方面，本文所提供的是一种用于从转基因植物细胞基因组中删除序列的方法，所述转基因植物细胞基因组包含第一和第二编码序列，及第一、第二和第三靶序列，其中所述序列是以如下次序排列的：第一靶序列、第一编码序列、第二靶序列、第二编码序列、第三靶序列；其中该方法包括：(a)提供本文所述转基因植物细胞；并(b)在所述细胞中表达第一和第二核酸酶，其中所述第一核酸酶在所述第一靶序列中切割，且所述第二核酸酶在所述第三靶序列中切割。

另一方面，提供了一种用于在细胞(例如植物细胞)基因组中进行分子内同源重组的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供包含第一序列的DNA区段，所述第一序列是与第二序列同源的；并(b)使所述DNA区段与核酸酶接触，其中所述核酸酶在第三序列处切割所述DNA区段。在某些实施方案中，所述DNA区段对于所述细胞是内源的。在某些实施方案中，同源重组在染色体中发生，例如在从染色体中删除第一和第二序列之间的DNA时。从染色体中删除的序列可以编码例如选择标志的整个或部分。被删除的DNA可以由外源序列来替换，例如其中所述方法还包括：将多核苷酸导入所述细胞，其中所述多核苷酸包含：(a)第四和第五序列，其中所述第四序列是与邻近所述第一序列的未被删除的序列同源的，且所述第五序列是与邻近所述第二序列的未被删除的序列同源的；和(b)外源序列(例如选择标志、选择标志以外的蛋白质或蛋白质之一部分、RNA诸如siRNA、等等)。在任何本文所提供的方法中，所述选择标志可以是例如绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT，BAR)、新霉素磷酸转移酶、β-内酰胺酶、儿茶酚双加氧酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、茅草枯脱卤素酶、及邻氨基苯甲酸合酶。

在任何方法中，第三序列(即被核酸酶切割的序列)在基因组中可以是唯一的和/或核酸酶可以是一对融合蛋白，其中每个融合蛋白是切割半结构域(例如IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域)和工程化锌指结合结构域之间的融合物。此外，第三序列可以是在第一和第二序列(即同源序列)之间的和/或距离第一和/或第二序列至少1个碱基对。

在任何本文所述方法中，第一和第二序列之一或两者对于生物体可以是外源的。

如此，本公开涵盖但不限于下列有编号的实施方案：

1.一种供体载体，其包含第一和第二DNA序列；

其中所述第一序列是与第三序列同源的，且所述第二序列是与第四序列同源的；

其中所述第三和第四序列是染色体DNA序列；且

其中所述第三和第四序列的近边缘是由至少1个核苷酸对分开的。

2.1的载体，其中所述第三和第四序列是内源序列。

3.1或2的载体，其中所述第一或第二序列中至少一种的长度为100个核苷酸。

4.1至3中任一项的载体，其还包含第五序列，其中所述第五序列：

a)是插入所述第一和第二序列之间的；且

b)是外源序列。

5.4的载体，其中所述第五序列的大小为至少一个碱基对。

6.4的载体，其中所述第五序列包含编码选择标志的序列。

7.6的载体，其中所述选择标志选自：绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT，BAR)、新霉素磷酸转移酶、β-内酰胺酶、儿茶酚双加氧酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、茅草枯脱卤素酶、及邻氨基苯甲酸合酶。

8.4的载体，其中所述第五序列包含编码选择标志以外的蛋白质的序列。

9.4的载体，其中所述第五序列包含一种或多种转录调节序列。

10.4的载体，其中所述第五序列包含编码蛋白质之一部分的序列。

11.10的载体，其中所述编码蛋白质之一部分的序列包含与染色体序列同源的序列。

12.4的载体，其中所述第五序列包含突变型染色体序列的野生型对应物。

13.4的载体，其中所述第五序列包含野生型染色体序列的突变型对应物。

14.1至13中任一项的载体，其中所述第一序列与所述第三序列具有至少35％的同源性。

15.1至14中任一项的载体，其中所述第二序列与所述第四序列具有至少35％的同源性。

16.14的载体，其中所述第二序列与所述第四序列具有至少35％的同源性。

17.一种用于将外源序列导入植物细胞基因组中的方法，该方法包括以下步骤：

a)使所述细胞与依照1至16中任一项的靶向载体接触；并

b)在所述细胞中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割距所述第三或第四序列之任一种3千碱基对内的染色体DNA；

使得步骤(b)中对染色体DNA的切割刺激所述靶向载体通过同源重组而掺入所述基因组中。

18.17的方法，其中所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

19.一种用于在植物细胞中表达蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：

a)使所述细胞与依照8的靶向载体接触；并

20.19的方法，其中所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

21.一种依照17、18、19或20的方法而获得的转基因植物细胞。

22.一种植物，其包含依照21的转基因植物细胞。

23.一种用于在细胞基因组中进行分子内同源重组的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供包含第一序列的DNA区段，所述第一序列是与第二序列同源的；并

b)使所述DNA区段与核酸酶接触，其中所述核酸酶在第三序列处切割所述DNA区段。

24.23的方法，其中所述DNA区段对于所述细胞是内源的。

25.23或24的方法，其中所述同源重组在染色体中发生。

26.25的方法，其中从所述染色体中删除所述第一和第二序列之间的DNA。

27.23、24、25或26的方法，其中所述第三序列在所述基因组中是唯一的。

28.23至26中任一项的方法，其中所述细胞是植物细胞。

29.23至28中任一项的方法，其中所述核酸酶是一对融合蛋白，其中每个融合蛋白是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

30.23至29中任一项的方法，其中所述第三序列距离所述第一序列至少100个碱基对。

31.23至30中任一项的方法，其中所述第三序列距离所述第二序列至少100个碱基对。

32.23至31中任一项的方法，其中所述第三序列位于所述第一和第二序列之间。

33.23至32中任一项的方法，其中所述第一或第二序列之一对于所述生物体是外源的。

34.23至32中任一项的方法，其中所述第一和第二序列对于所述生物体都是外源的。

35.26的方法，其中从所述染色体中删除的所述序列编码选择标志的整个或部分。

36.35的方法，其中所述选择标志选自：绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT，BAR)、新霉素磷酸转移酶、β-内酰胺酶、儿茶酚双加氧酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、茅草枯脱卤素酶、及邻氨基苯甲酸合酶。

37.26的方法，其中以外源序列替换所述被删除的DNA，该方法还包括：

将多核苷酸导入所述细胞中，其中所述多核苷酸包含：

a)第四和第五序列，其中所述第四序列是与邻近所述第一序列的未被删除的序列同源的，且所述第五序列是与邻近所述第二序列的未被删除的序列同源的；和

b)所述外源序列。

38.37的方法，其中所述外源序列是选择标志。

39.38的方法，其中所述选择标志选自绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT，BAR)、新霉素磷酸转移酶、β-内酰胺酶、儿茶酚双加氧酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、茅草枯脱卤素酶、及邻氨基苯甲酸合酶。

40.23至39中任一项的方法，其中所述外源序列编码选择标志以外的蛋白质。

41.23至39中任一项的方法，其中所述外源序列编码RNA。

42.41的方法，其中所述RNA是siRNA。

43.一种靶向载体，其包含：

a)第一和第二编码序列；和

b)第一、第二、和第三靶序列；

其中所述序列是以如下次序排列的：第一靶序列、第一编码序列、第二靶序列、第二编码序列、第三靶序列；

而且其中所述第一靶序列是与第一染色体序列同源的，且所述第三靶序列是与第二染色体序列同源的。

44.43的载体，其中所述第一编码序列编码选择标志。

45.43或44的载体，其中所述第二编码序列编码选择标志。

46.43或45的载体，其中所述第一编码序列编码不是选择标志的蛋白质。

47.43、44或46的载体，其中所述第二编码序列编码不是选择标志的蛋白质。

48.43至47中任一项的载体，其中所述第一和第二染色体序列是内源染色体序列。

49.43至48中任一项的载体，其还包含所述第一靶序列的一个或多个重复。

50.43至49中任一项的载体，其还包含所述第二靶序列的一个或多个重复。

51.43至50中任一项的载体，其还包含所述第三靶序列的一个或多个重复。

52.一种用于将外源序列导入植物细胞基因组中的方法，该方法包括以下步骤：

a)使所述细胞与依照43至51中任一项的靶向载体接触；并

b)在所述细胞中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割距所述第一或第二染色体序列之任一种0.1-3千碱基对内的染色体DNA；

53.52的方法，其中所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

54.一种用于在植物细胞中表达蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：

a)使所述细胞与依照43至51中任一项的靶向载体接触；并

55.权利要求54的方法，其中所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

56.一种依照52或53的方法而获得的转基因植物细胞。

57.一种植物，其包含依照56的转基因植物细胞。

58.一种用于从转基因植物细胞的基因组中删除序列的方法，其中该方法包括：

a)提供依照56的转基因植物细胞；并

b)在所述细胞中表达第一和第二核酸酶，其中所述第一核酸酶在所述第一靶序列中切割，且所述第二核酸酶在所述第二靶序列中切割。

59.一种用于从转基因植物细胞的基因组中删除序列的方法，其中该方法包括：

a)提供依照56的转基因植物细胞；并

b)在所述细胞中表达第一和第二核酸酶，其中所述第一核酸酶在所述第二靶序列中切割，且所述第二核酸酶在所述第三靶序列中切割。

60.一种用于从转基因植物细胞的基因组中删除序列的方法，其中该方法包括：

a)提供依照56的转基因植物细胞；并

b)在所述细胞中表达第一和第二核酸酶，其中所述第一核酸酶在所述第一靶序列中切割，且所述第二核酸酶在所述第三靶序列中切割。

附图简述

图1A和1B是称为pDAB1585的靶向构建体的图示。图1A是该构建体的各种元件的线性描绘。图1B是环状构建体的描绘。

图2A和2B描绘了例示性的ZFN及其靶位点。图2A描绘了ZFN和结合区域。图2B描绘了靶位点。

图3是质粒pDAB1400的图示。

图4是质粒pDAB782的图示。

图5是质粒pDAB1582的图示。

图6是质粒pDAB354的图示。

图7是质粒pDAB1583的图示。

图8是质粒pDAB2407的图示。

图9是质粒pDAB1584的图示。

图10是质粒pDAB2418的图示。

图11是质粒pDAB4045的图示。

图12是质粒pDAB1575的图示。

图13是质粒pDAB1577的图示。

图14是质粒pDAB1579的图示。

图15是质粒pDAB1580的图示。

图16是质粒pDAB3401的图示。

图17是质粒pDAB1570的图示。

图18是质粒pDAB1572的图示。

图19是质粒pDAB4003的图示。

图20是质粒pDAB1571的图示。

图21是质粒pDAB7204的图示。

图22是质粒pDAB1573的图示。

图23是质粒pDAB1574的图示。

图24是质粒pDAB1581的图示。

图25是质粒pDAB1576的图示。

图26A和26B是称为pDAB1600的靶向质粒载体的图示。图26A是该质粒的各种元件的线性描绘。图26B是环状质粒的描绘。

图27是质粒pDAB7002的图示。

图28是质粒pDAB7025的图示。

图29是质粒pDAB1591的图示。

图30是质粒pcDNA3.1-IL1-L0-FokI的图示。

图31是质粒pcDNA3.1-SCD27-L0-FokI的图示。

图32是质粒pDAB1592的图示。

图33是质粒pDAB1594的图示。

图34A、B及C是质粒pDAB1596和pDAB1598的图示。图34A是线性化质粒的图示。图34B显示了pDAB1596。图34C显示了pDAB1598。

图35是质粒pDAB1577的图示。

图36是质粒pDAB1578的图示。

图37A和B是质粒pDAB1601的图示。图37A显示了线性形式的各种元件。图37B显示了环状质粒。

图38是描绘预测的由IL-1 ZFN-FokI融合物所刺激的染色体间同源重组的图示。

图39是描绘预测的由Scd27 ZFN-FokI融合物所刺激的染色体间同源重组的图示。

图40显示了重组体的PCR分析。第1-20道显示了由使用SCD27-FokI融合蛋白构建体转化NT1-240所引起的同源重组事件。第21道和第22道显示了由使用SCD27-FokI融合蛋白构建体转化NT1-240所引起的同源重组事件。对照道显示于最左侧的3道。

图41显示了重组体的Southern印迹分析。第1-20道显示了由使用SCD27-FokI融合蛋白构建体转化NT1-240所引起的同源重组事件。第21道和第22道显示了由使用SCD27-FokI融合蛋白构建体转化NT1-240所引起的同源重组事件。对照道显示于最左侧的2道。

图42是描绘预测的由IL-1 ZFN-FokI融合物所刺激的染色体内同源重组的图示。

图43是证实GFP在表达IL-1-FokI融合蛋白的荧光组织中重建的PCR分析。

图44是质粒pSB11的图示。

图45是质粒pSB1的图示。

图46是质粒pDAB3872的图示。

图47是质粒pDAB4365的图示。

发明详述

本文所公开的是对于靶向切割植物细胞染色质及靶向改变植物细胞核苷酸序列有用的组合物和方法，例如通过靶向切割接着进行染色体内同源重组或通过靶向切割接着进行外源多核苷酸(其包含一个或多个与所述细胞核苷酸序列具有同源性的区域)和基因组序列之间的同源重组来实现。

基因组序列包括那些存在于染色体、附加体、细胞器基因组(例如线粒体、叶绿体)、人工染色体及细胞中存在的任何其它类型的核酸，诸如例如扩增序列、双微染色体、及内源的或感染的细菌和病毒的基因组。基因组序列可以是正常的(即野生型)或突变的；突变型序列可以包含例如插入、删除、易位、重排、和/或点突变。基因组序列还可以包含许多不同的等位基因之一。

对于靶向切割和重组有用的组合物包括包含切割结构域(或切割半结构域)和锌指结合结构域的融合蛋白，编码这些蛋白质的多核苷酸，及多肽和编码多肽的多核苷酸的组合。锌指结合结构域可以包含一个或多个锌指(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多个锌指)，而且可以改造成结合任何基因组序列。如此，通过鉴定期望进行切割或重组的感兴趣靶基因组区域，可以依照本文所公开的方法构建一种或多种如下融合蛋白，该融合蛋白包含切割结构域(或切割半结构域)和改造成识别所述基因组区域中靶序列的锌指结构域。细胞中存在此类融合蛋白会导致所述融合蛋白结合至其结合位点，并在所述基因组区域内或接近所述基因组区域处切割。此外，如果与该基因组区域同源的外源多核苷酸也存在于此类细胞中，那么该基因组区域和该外源多核苷酸之间会以高比率发生同源重组。

通用技术

除非另有说明，本文所公开方法的实施以及组合物的制备和使用采用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA及相关领域中的常规技术，这些技术是在本领域技术范围内的。这些技术在文献中有全面的解释。参见例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989及第三版，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987及定期更新；丛书METHODSIN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，第三版，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，卷304，″Chromatin″(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编)，Academic Press，San Diego，1999；及METHODS IN MOLECULARBIOLOGY，卷119，″Chromatin Protocols″(P.B.Becker编)Humana Press，Totowa，1999。

定义

术语“核酸”、“多核苷酸”、和“寡核苷酸”可互换使用，指处于线性或环状构象的，及或是单链或是双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开的目的，这些术语不解释为关于聚合物长度的限制。该术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物以及碱基、糖和/或磷酸模块中有修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯主链)。一般而言，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物会与T进行碱基配对。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语还应用于其中一个或多个氨基酸是相应天然存在氨基酸的化学类似物或修饰衍生物的氨基酸聚合物。

“结合”指大分子间(例如蛋白质和核酸间)序列特异性的、非共价的相互作用。结合相互作用的所有成分并非都必需是序列特异性的(例如与DNA主链中磷酸残基接触)，只要作为整体的相互作用是序列特异性的。一般地，此类相互作用的特征在于解离常数(K_d)为10^-6M^-1或更低。“亲和力”指结合强度：结合亲和力升高与K_d降低相关。

“结合蛋白”指能够非共价结合另一分子的蛋白质。结合蛋白可以结合例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白的情况中，它可以结合其本身(以形成同源二聚体、同源三聚体、等等)和/或它可以结合一个或多个分子的不同的一种或多种蛋白质。结合蛋白可以具有超过一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合及蛋白质结合活性。

“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)指经由一个或多个锌指、以序列特异性方式结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，所述锌指是结合结构域内的氨基酸序列区域且其结构通过锌离子配位而稳定化。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。

锌指结合结构域可以“改造或工程化”(engineered)成结合预定的核苷酸序列。设计和选择是用于工程化锌指蛋白的方法的非限制性例子。设计的锌指蛋白是自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要源自合理标准(rationalcriteria)。用于设计的合理标准包括应用替代规则和计算机化算法，用于处理存储现有ZFP设计和结合数据信息的数据库中的信息。参见例如美国专利6,140,081；6,453,242；6,534,261；及6,785,613；还可参见WO 98/53058；WO98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496；及美国专利6,746,838；6,866,997；及7,030,215。

“选择的”锌指蛋白指自然界中没有找到的蛋白质，其生成主要源自经验方法，诸如噬菌体展示、相互作用陷阱、或杂合物选择。参见例如US5,789,538；US 5,925,523；US 6,007,988；US 6,013,453；US 6,200,759；US6,733,970；US RE39,229；及WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197及WO 02/099084。

术语“序列”指任何长度的核苷酸序列，其可以是DNA或RNA；可以是线性的、环状的或分枝的，而且可以或是单链或是双链。术语“供体序列”指插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可以是任何长度，例如长度在2个和25,000个核苷酸之间(或者之间或之上的任何整数值)，优选长度在约100个和5,000个核苷酸之间(或者之间的任何整数)，更优选长度在约200个和2,500个核苷酸之间。

“同源序列”指与第二序列分享某种程度的序列同一性，而且其序列可以与第二序列的序列相同的第一序列。“同源但不相同的序列”指与第二序列分享某种程度的序列同一性，但其序列与第二序列的序列不相同的第一序列。例如，包含突变型基因之野生型序列的多核苷酸与突变型基因的序列同源但不相同。在某些实施方案中，两个序列之间的同源性程度足以容许它们之间利用正常细胞机制进行同源重组。两个同源但不相同的序列可以是任何长度，而且它们的非同源性程度可以小至单个核苷酸(例如用于通过靶向同源重组来校正基因组点突变)或大至10千碱基对或更多(例如用于在染色体中预定位点处插入基因)。包含同源但不相同序列的两个多核苷酸不必具有相同长度。例如，可以使用20和10,000个核苷酸或核苷酸对之间的外源多核苷酸(即供体多核苷酸)。

用于测定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。典型地，此类技术包括对基因测定mRNA的核苷酸序列和/或测定由其所编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。基因组序列也可以以这种方式进行测定和比较。一般而言，同一性指两个多核苷酸序列间准确的核苷酸与核苷酸(nucleotide-to-nucleotide)对应或两个多肽序列间准确的氨基酸与氨基酸(amino acid-to-amino acid)对应。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过测定它们的百分比同一性来进行比较。两个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的百分比同一性是两个比对序列之间的准确匹配的数目除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的近似比对由Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法提供。该算法可以通过使用如下得分矩阵而应用于氨基酸序列，所述得分矩阵由Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure，M.O.Dayhoff编，5suppl.3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.，USA开发，并由Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)标准化。该算法测定序列百分比同一性的例示性执行由Genetics Computer Group(Madison，WI)在“最佳拟合”(“BestFit”)实用申请(utility application)中提供。这种方法的缺省参数记载于Wisconsin Sequence Analysis Package ProgramManual，第8版(1995)(可得自Genetics Computer Group，Madison，WI)。在本公开的背景中建立百分比同一性的优选方法是使用MPSRCH程序包，所述MPSRCH程序包的版权为University of Edinburgh所有，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，并由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)销售。自这套程序包，可以采用Smith-Waterman算法，其中将缺省参数用于评分表(例如缺口打开罚分为12，缺口延伸罚分为1，且缺口为6)。自所产生的数据，“匹配”值反映序列同一性。其它适于计算序列间百分比同一性或相似性的程序是本领域普遍知道的，例如，另一种比对程序是与缺省参数一起使用的BLAST。例如，可以使用BLASTN和BLASTP，其使用以下缺省参数：遗传代码＝标准；滤器(filter)＝无；链＝双链(both)；截留(cutoff)＝60；期望(expect)＝10；矩阵(Matrix)＝BLOSUM62；描述(Descriptions)＝50个序列；排序(sort by)＝HIGH SCORE；数据库(Databases)＝非冗余的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白质+Spupdate+PIR。这些程序的详情可以在因特网上找到。关于本文所述序列，序列同一性的期望程度范围是大约35％至100％，且为其间的任何整数值。典型地，序列间百分比同一性是至少35％-40％；40％-45％；45％-50％；50％-60％；60％-70％；70-75％，优选80-82％，更优选85％-90％，甚至更优选92％，还更优选95％，并且最优选98％的序列同一性。

或者，多核苷酸间序列相似性的程度可以如下测定，即在容许同源区间形成稳定双链体的条件下进行多核苷酸杂交，接着使用单链特异性核酸酶进行消化，并测定消化后片段的大小。若根据使用上述方法的测定，两个核酸序列或两个多肽序列在限定长度的分子里展现至少大约70％-75％，优选80％-82％，更优选85％-90％，甚至更优选92％，还更优选95％，并且最优选98％的序列同一性，则所述两个核酸序列或两个多肽序列彼此基本上同源。在用于本文时，基本上同源还指相对于指定的DNA或多肽序列显示完全同一性的序列。基本上同源的DNA序列可以在Southern杂交实验中于例如严格条件(由那种特定系统所确定)下鉴定。确定合适杂交条件是在本领域技术范围内的。参见例如Sambrook等，见上文；Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach，编辑B.D.Hames和SJ.Higgins，(1985)Oxford；Washington，DC；IRL Press。

两个核酸片段的选择性杂交可以如下测定。两个核酸分子之间序列同一性的程度影响此类分子间杂交事件的效率和强度。部分相同的核酸序列至少会部分抑制完全相同序列与靶分子的杂交。对完全相同序列的杂交的抑制可以使用本领域公知的杂交测定法来评估(例如Southern(DNA)印迹、Northern(RNA)印迹、溶液杂交、等，参见Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。此类测定法可以使用不同程度的选择性(例如使用从低严格性至高严格性的不同条件)来实施。如果采用低严格性条件，那么非特异性结合的缺乏可以如下评估，即使用甚至缺乏部分程度序列同一性的第二探针(例如与靶分子具有小于大约30％序列同一性的探针)，使得在没有非特异性结合事件时，所述第二探针不会与靶物杂交。

在利用基于杂交的检测系统时，选择与参照核酸序列互补的核酸探针，然后通过选择合适的条件，使得所述探针和参照序列彼此选择性杂交或结合以形成双链体分子。能够在中等严格杂交条件下选择性杂交参照序列的核酸分子典型地在如下条件发生杂交，所述条件容许检测与所选核酸探针序列具有至少大约70％序列同一性的、长度为至少大约10-14个核苷酸的靶核酸序列。严格杂交条件典型地容许检测与所选核酸探针序列具有大于大约90-95％序列同一性的、长度为至少大约10-14个核苷酸的靶核酸序列。对于探针/参照序列杂交有用的杂交条件(其中探针和参照序列具有特定程度的序列同一性)可以如本领域所知的那样确定(参见例如Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach，编辑B.D.Hames和S.J.Higgins，(1985)Oxford；Washington，DC；IRL Press)。

杂交条件对于本领域技术人员是公知的。杂交严格性指杂交条件不利于形成含有错配核苷酸的杂合物所达到的程度，其中较高的严格性与对错配杂合物较低的耐受性相关。影响杂交严格性的因素对于本领域技术人员是公知的，并且包括但不限于温度、pH、离子强度、及有机溶剂(诸如例如甲酰胺和二甲亚砜)浓度。正如本领域技术人员所知的，杂交严格性由于温度升高、离子强度降低及溶剂浓度降低而增加。

关于杂交的严格性条件，本领域公知的是可以采用很多等同条件来建立特定的严格性，这通过改变例如下列因素来实现：序列的长度和性质、各种序列的碱基组成、盐类和其它杂交溶液成分的浓度、杂交溶液中是否存在封闭剂(例如硫酸右旋糖苷和聚乙二醇)、杂交反应温度及时间参数；以及改变洗涤条件来实现。杂交条件的具体集合的选择遵循本领域的标准方法进行(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。

“重组”指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。为了本公开的目的，“同源重组(HR)”指在例如细胞中双链断裂的修复过程中发生的此类交换的专门化形式。这种过程要求核苷酸序列同源性，使用“供体”分子来进行“靶物”分子(即经历了双链断裂的分子)的模板修复，并且因为其导致遗传信息从供体转移至靶物，因而不同地称为“非交叉型基因转换”(“non-crossovergene conversion”)或“短道基因转换”(“short tract gene conversion”)。在不希望被任何具体理论限制的前提下，这种转移可以牵涉断裂的靶物和供体之间所形成的异源双链体DNA的错配校正，和/或“合成依赖性链退火”(“synthesis-dependent strand annealing”)(其中使用供体来再合成会变为靶物一部分的遗传信息)，和/或相关过程。这种专门化的HR通常导致靶物分子序列的改变，使得供体多核苷酸序列的部分或整个掺入靶多核苷酸中。

“切割”指DNA分子共价主链的断裂。切割可以通过多种方法来启动，包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割两者都是可能的，而且双链切割可以因为两个不同的单链切割事件而发生。DNA切割可以导致平末端或交错末端的产生。在某些实施方案中，将融合多肽用于靶向双链DNA切割。

“切割结构域”包含拥有对DNA切割的催化活性的一种或多种多肽序列。切割结构域可以包含在单条多肽链中，或者切割活性可以源自两个(或更多个)多肽的结合。

“切割半结构域”指与第二多肽(或是相同的或是不同的)结合而形成具有切割活性(优选双链切割活性)的复合物的多肽序列。

“染色质”指包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸(主要是DNA)及蛋白质(其包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白质)。大多数真核细胞染色质以核小体形式存在，其中核小体核心包含大约150个碱基对的DNA，该DNA与包含双份各为组蛋白H2A、H2B、H3和H4的八聚体结合；并且连接区DNA(是可变长度的，取决于生物体)在核小体核心之间延伸。一般地，1分子组蛋白H1与连接区DNA结合。为了本公开的目的，术语“染色质”意图涵盖细胞核蛋白的所有类型，原核生物的及真核生物的两者。细胞染色质包括染色体型的和附加体型的染色质两者。

“染色体”指包含细胞基因组的整个或部分的染色质复合物。通常，细胞基因组的特征在于其核型，其是构成细胞基因组的所有染色体的集合(collection)。细胞基因组可包含一个或多个染色体。

“附加体”(episome)指复制型核酸、核蛋白复合物或包含不是细胞染色体核型一部分的核酸的其它结构。附加体的例子包括质粒和某些病毒基因组。

“可及区”(accessible region)指细胞染色质中的如下位点，其中核酸中存在的靶位点可以被识别该靶位点的外源分子结合。在不希望被任何具体理论限制的前提下，认为可及区是不被包装入核小体结构中的区域。不同的可及区结构通常可以通过其对化学和酶探针(例如核酸酶)的敏感性来检测。

“靶位点”或“靶序列”指对结合分子会结合(倘若条件足以使结合发生的话)的核酸部分进行限定的核酸序列。例如，序列5’-GAATTC-3’是Eco RI限制性内切核酸酶的靶位点。

“外源的”分子指正常情况下不存在于细胞中但可以通过一种或多种遗传的、生化的或其它方法而导入细胞中的分子。“正常存在于细胞中”是相对于细胞的特定发育阶段和环境条件而确定的。如此，例如，仅存在于肌肉的胚胎发育过程中的分子是相对于成年肌肉细胞的外源分子。类似地，由热休克所诱导的分子是相对于未热休克细胞的外源分子。外源分子可以包含例如机能失常的(malfunctioning)内源分子的机能(functioning)型式或正常机能的内源分子的机能失常型式。

外源分子可以是小分子(诸如通过组合式化学方法所生成的)、或大分子(诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖)、上述分子的任何修饰衍生物、或任何包含一种或多种上述分子的复合物等等。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链；可以是线性的、分枝的或环状的；而且可以是任何长度的。核酸包括那些能够形成双链体的核酸，以及形成三链体的核酸。参见例如美国专利No.5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重建因子(chromatin remodeling factor)、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰化酶(acetylase)、脱乙酰基酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶、及解旋酶。

外源分子可以是与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白质或核酸。例如，外源核酸可以包含感染性病毒基因组、根癌土壤杆菌(Agrogacteriumtumefacians)T链、导入细胞中的质粒或附加体、或正常情况下不存在于细胞中的染色体。用于将外源分子导入细胞中的方法对于本领域技术人员是已知的，并且包括但不限于脂质介导的转移(即脂质体，其包括中性脂质和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-右旋糖苷介导的转移、及病毒载体介导的转移。

比较而言，“内源的”分子指正常存在于特定环境条件下处于特定发育阶段的特定细胞中的分子。例如，内源核酸可以包含染色体，线粒体、叶绿体或其它细胞器的基因组，或天然存在的附加体型核酸。别的内源分子可以包括蛋白质，例如转录因子和酶。

“融合(物)”分子指其中有两个或更多个亚基分子连接(优选共价地)在一起的分子。亚基分子可以是相同化学类型的分子，或者可以是不同化学类型的分子。第一种类型的融合分子的例子包括但不限于融合蛋白(例如ZFPDNA结合结构域和切割结构域之间的融合物)和融合核酸(例如编码上文所述融合蛋白的核酸)。第二种类型的融合分子的例子包括但不限于形成三链体的核酸和多肽之间的融合物，及小沟结合物和核酸之间的融合物。

融合蛋白在细胞中的表达可以源自将该融合蛋白投递至细胞或者通过将编码该融合蛋白的多核苷酸投递至细胞，其中所述多核苷酸被转录，而且转录物被翻译，以生成所述融合蛋白。蛋白质在细胞中的表达还可以牵涉反式剪接、对多肽的切割和多肽连接。用于将多核苷酸和多肽投递至细胞的方法在本公开的别处提出。

“基因”为了本公开的目的包括编码基因产物的DNA区域(见下文)，以及调节基因产物生成的所有DNA区域，无论此类调节序列是否邻近编码序列和/或被转录序列。因而，基因包括但不必限于启动子序列、终止子、翻译调节序列(诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默基因(silencer)、绝缘子(insulator)、边界元件、复制起点、基质附着位点、及基因座控制区。

“基因表达”指基因中所含信息转换成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构性RNA或任何其它类型的RNA)或通过mRNA翻译所生成的蛋白质。基因产物还包括通过加帽、多腺苷酸化、甲基化和编辑等过程所修饰的RNA，及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、遍在蛋白化、ADP-核糖基化、肉豆蔻基化和糖基化所修饰的蛋白质。

基因表达的“调控”指基因活性的变化。表达调控可以包括但不限于基因激活和基因阻抑。

“植物”细胞包括但不限于单子叶(monocot)或双子叶(dicot)植物的细胞。单子叶植物的非限制性例子包括谷类植物，诸如玉米、稻、大麦、燕麦、小麦、高梁、黑麦、甘蔗、菠萝、洋葱、香蕉、及椰子。双子叶植物的非限制性例子包括烟草、番茄、向日葵、棉、甜菜、马铃薯、莴苣、甜瓜(melon)、大豆、芸苔(油菜)、及苜蓿。植物细胞可以来自植物的任何部分和/或来自植物发育的任何阶段。

“感兴趣区域”指期望与外源分子结合的任何细胞染色质区域，诸如例如基因或基因内或与基因邻近的非编码序列。结合可以是为了靶向DNA切割和/或靶向重组的目的。例如，感兴趣区域可以存在于染色体、附加体、细胞器基因组(例如线粒体的、叶绿体的)、或感染性病毒基因组中。感兴趣区域可以在基因的编码区内、转录的非编码区(诸如例如前导序列、尾随序列或内含子)内、或非转录区(或是编码区上游或是编码区下游)内。感兴趣区域的长度可以小至单个核苷酸对或高达25,000个核苷酸对，或任何整数值的核苷酸对。

术语“可操作连接”和“可操作连接的”关于两个或多个构件(诸如序列元件)并列时可互换使用，其中对所述构件进行排列使得两个构件都正常发挥功能，并容许所述构件中至少一个可以介导施加于其它构件中至少一个的功能的可能性。举例而言，若转录调节序列在应答一种或多种转录调节因子存在与否时控制编码序列的转录水平，则该转录调节序列(诸如启动子)可操作连接至该编码序列。转录调节序列一般顺式地与编码序列可操作连接，但不需直接与其邻近。例如，增强子是与编码序列可操作连接的转录调节序列，即使它们不是连续的。

关于融合多肽，术语“可操作连接的”可以指每个构件在连接另一个构件时执行的功能与其在不如此连接时其会执行的功能相同的实情。例如，关于其中ZFP DNA结合结构域融合至切割结构域的融合多肽，如果在该融合多肽中，ZFP DNA结合结构域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点，而切割结构域能够切割靶位点附近的DNA，那么该ZFP DNA结合结构域和该切割结构域是可操作连接的。

蛋白质、多肽或核酸的“功能性片段”指其序列与全长蛋白质、多肽或核酸不同，但仍保留与全长蛋白质、多肽或核酸相同功能的蛋白质、多肽或核酸。功能性片段可以拥有更多、更少或与相应天然分子相同的残基数目，和/或可以含有一处或多处氨基酸或核苷酸替代。用于测定核酸功能(例如编码功能、与另一核酸杂交的能力)的方法是本领域公知的。类似地，用于测定蛋白质功能的方法是公知的。例如，多肽结合DNA的功能可以通过例如滤器结合(filter-binding)、电泳迁移率变动、或免疫沉淀测定法来测定。对DNA的切割可以通过凝胶电泳来测定。参见Ausubel等，见上文。一种蛋白质与另一种蛋白质相互作用的能力可以通过例如免疫共沉淀、双杂交测定法或互补(遗传的和生化的两者)来测定。参见例如Fields等，(1989)Nature340：245-246；美国专利No.5,585,245及PCT WO 98/44350。

靶位点

所公开的方法和组合物包括融合蛋白，其包含切割结构域(或切割半结构域)和锌指结构域，其中所述锌指结构域通过结合至细胞染色质中的序列(例如靶位点或结合位点)来将切割结构域(或切割半结构域)的活性指导至所述序列附近，并因此在靶序列附近诱导切割。如本公开别处所提出，锌指结构域可以改造成结合至基本上任何期望序列。因而，在鉴定出含有期望发生切割或重组的序列的感兴趣区域后，一种或多种锌指结合结构域可以改造成结合至感兴趣区域中的一种或多种序列。在细胞中包含锌指结合结构域和切割结构域的融合蛋白(或两种融合蛋白，每种包含锌指结合结构域和切割半结构域)的表达在感兴趣区域中实现切割。

可以例如依照共有的美国专利No.6,453,242(2002年9月17日)所披露的方法来实现细胞染色质中供锌指结构域结合的序列(例如靶位点)的选择，该专利还披露了用于设计ZFP以结合所选序列的方法。对于本领域技术人员清楚的是，对核苷酸序列的简单视觉检查也可以用于选择靶位点。因而，用于靶位点选择的任何手段可以用于要求保护的方法中。

靶位点一般由多个相邻的靶亚位点(subsite)构成。靶亚位点指由锌指个体所结合的序列(通常或是核苷酸三联体，或是可以与相邻的四联体有一个核苷酸重叠的核苷酸四联体)。参见例如WO 02/077227。若与锌指蛋白产生最多接触的链称为靶链“主要识别链”或“主要接触链”，则有些锌指蛋白结合靶链中的3碱基三联体和非靶链上的第四个碱基。一般地，靶位点的长度为至少9个核苷酸，因而由包含至少三个锌指的锌指结合结构域所结合。然而，例如4个指的结合结构域结合12个核苷酸的靶位点，5个指的结合结构域结合15个核苷酸的靶位点，或着6个指的结合结构域结合18个核苷酸的靶位点也是可能的。显而易见的是，更大的结合结构域(例如7、8、9个指和更多)结合更长的靶位点也是可能的。

靶位点不必是三个核苷酸的倍数。例如，在发生交叉链(cross-strand)相互作用的情况中(参见例如美国专利6,453,242及WO 02/077227)，多指结合结构域中的一个或多个锌指个体可以结合交叠的四联体亚位点。结果，3个指的蛋白质可以结合10个核苷酸的序列，其中第10个核苷酸是由末端指所结合的四联体的一部分，4个指的蛋白质可以结合13个核苷酸的序列，其中第13个核苷酸是由末端指所结合的四联体的一部分，等等。

多指结合结构域中锌指个体之间氨基酸接头序列的长度和性质也影响对靶序列的结合。例如，多指结合结构域中相邻锌指之间存在所谓“非规范接头”(“non-canonical linker”)、“长接头”或“有结构的接头”(“structured linker”)可以容许这些指结合不紧密相邻的亚位点。此类接头的非限制性例子记载于例如美国专利No.6,479,626及WO 01/53480。因而，锌指结合结构域的靶位点中的一个或多个亚位点可以由1个、2个、3个、4个、5个或更多核苷酸彼此分开。为了提供仅一个例子，4个指的结合结构域可以结合13个核苷酸的靶位点，其依次包含2个连续的3核苷酸亚位点、1个间插核苷酸、及2个连续的三联体亚位点。

序列(例如靶位点)间的距离指两个序列之间插入的核苷酸或核苷酸对的数目，其从序列彼此最近的边缘测量。

在切割作用依赖于两个锌指结构域/切割半结构域融合分子结合至分开的靶位点的某些实施方案中，两个靶位点可以在对立的DNA链上。在其它实施方案中，两个靶位点在相同的DNA链上。

锌指结合结构域

锌指结合结构域包含一个或多个锌指。Miller等(1985)EMBO J.4：1609-1614；Rhodes(1993)Scientific American Feb.：56-65；美国专利No.6,453,242。典型地，单个锌指结构域的长度为大约30个氨基酸。结构研究证明了每个锌指结构域(基序)含有两个β片层(保持含有两个不变的半胱氨酸残基的β转角中)和一个α螺旋(含有两个不变的组氨酸残基)，它们通过两个半胱氨酸和两个组氨酸配位锌原子而以特定的构象保持。

锌指包括规范C₂H₂锌指(即那些其中锌离子由两个半胱氨酸和两个组氨酸残基所配位的)和非规范锌指两种，非规范锌指诸如例如C₃H锌指(那些其中锌离子由三个半胱氨酸残基和一个组氨酸残基所配位的)和C₄锌指(那些其中锌离子由四个半胱氨酸残基所配位的)。还可参见WO 02/057293。

锌指结合结构域可以改造成结合所选择的序列。参见例如Beerli等(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416。与天然存在的锌指蛋白相比，工程化锌指结合结构域可以具有新的结合特异性。改造方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。合理设计包括例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和各个锌指氨基酸序列的数据库，其中每种三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一种或多种氨基酸序列关联。参见例如共有的美国专利6,453,242和6,534,261。别的设计方法披露于例如美国专利6,746,838；6,785,613；6,866,997；及7,030,215。

包括噬菌体展示和双杂交系统的例示性选择方法披露于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；及6,242,568；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197及GB 2,338,237。

锌指结合结构域结合特异性的增强已经记载于例如共有的美国专利No.6,794,136。

由于锌指个体结合3个核苷酸的(即三联体)序列(或者可以与相邻锌指的4核苷酸结合位点有一个核苷酸重叠的4核苷酸序列)，所以锌指结合结构域改造后结合的序列(例如靶序列)长度将决定工程化锌指结合结构域中锌指的数目。例如，对于其中指基序不结合交叠亚位点的ZFP，6个核苷酸的靶序列由2个指的结合结构域所结合；9个核苷酸的靶序列由3个指的结合结构域所结合；等等。如本文所记录，靶位点中锌指个体的结合位点(即亚位点)不必是连续的，而是可以由一个或数个核苷酸分开，这取决于多指结合结构域中锌指间氨基酸序列(即指间接头)的长度和性质。

在多指锌指结合结构域中，相邻的锌指可以由大约5个氨基酸的氨基酸接头序列(所谓“规范的”指间接头)或者由一个或多个非规范接头所分开。参见例如共有的美国专利No.6,453,242及6,534,261。对于包含超过三个指的工程化锌指结合结构域，在某些锌指之间插入较长的(“非规范的”)指间接头可能是优选的，因为这可能提高结合结构域的结合亲和力和/或特异性。参见例如美国专利No.6,479,626和WO 01/53480。因而，多指锌指结合结构域还可以在非规范指间接头的存在和位置方面来表征。例如，包含三个指(由两个规范指间接头所连接)、一个长接头和另外三个指(由两个规范指间接头所连接)的6指锌指结合结构域称为2x3构型。类似地，包含两个指(其间具有一个规范接头)、一个长接头和另外两个指(由一个规范接头所连接)的结合结构域称为2x2蛋白质。包含三个2指单元(在每个2指单元中，两个指由规范接头所连接)且其中每个2指单元与相邻的2指单元通过长接头连接的蛋白质称为3x2蛋白质。

多指结合结构域中两个相邻锌指之间长的或非规范的指间接头的存在通常容许两个指结合靶序列中不紧密连续的亚位点。因而，靶位点中亚位点之间可以有一个或多个核苷酸的缺口；即靶位点可以包含一个或多个不被锌指所接触的核苷酸。例如，2x2锌指结合结构域可以结合由一个核苷酸所分开的两个6核苷酸序列，即其结合13个核苷酸的靶位点。还可参见Moore等(2001a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1432-1436；Moore等(2001b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1437-1441及WO 01/53480。

如先前所提及，靶亚位点是由单个锌指所结合的3个或4个核苷酸的序列。为了某些目的，2指单元称为结合组件(module)。结合组件可以通过例如在结合特定6核苷酸靶序列的多指蛋白质(一般是三个指)的背景中选择两个相邻的指来获得。或者，组件可以由锌指个体的装配来构建。还可参见WO 98/53057及WO 01/53480。

切割结构域

本文所公开融合蛋白的切割结构域部分可以获自任何内切核酸酶或外切核酸酶。可以衍生切割结构域的例示性内切核酸酶包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。参见例如2002-2003产品目录，New EnglandBiolabs，Beverly，MA；及Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388。别的切割DNA的酶是已知的(例如S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO内切核酸酶；还可参见Linn等(编)Nucleases，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1993)。这些酶(或其功能性片段)中的一种或多种可以用作切割结构域和切割半结构域的来源。

类似地，切割半结构域(例如包含锌指结合结构域和切割半结构域的融合蛋白)可以衍生自任何核酸酶或其部分，如上文所提出的，为了切割活性其需要二聚化。一般而言，如果所述融合蛋白包含切割半结构域，那么切割作用需要两个融合蛋白。或者，可以使用包含两个切割半结构域的单个蛋白质。两个切割半结构域可以衍生自相同的内切核酸酶(或其功能性片段)，或者每个切割半结构域可以衍生自不同的内切核酸酶(或其功能性片段)。另外，两个融合蛋白的靶位点优选相对于彼此布置成使得两个融合蛋白与它们各自靶位点的结合以相对于彼此的下述空间取向放置切割半结构域，所述空间取向容许切割半结构域形成功能性切割结构域，例如通过二聚化。如此，在某些实施方案中，靶位点的近边缘由5-8个核苷酸或由15-18个核苷酸分开。然而，任何整数数目的核苷酸或核苷酸对可以插入两个靶位点之间(例如从2个至50个核苷酸或更多)。一般而言，切割点位于靶位点之间。

限制性内切核酸酶(限制酶)存在于许多物种中，而且能够序列特异性结合DNA(在识别位点)，并且在结合位点处或接近结合位点处切割DNA。某些限制酶(例如IIS型)在与识别位点远离的位点切割DNA，而且具有可分的结合和切割结构域。例如，IIS型酶Fok I催化DNA的双链切割，在一条链上距离其识别位点9个核苷酸处而在另一条上距离其识别位点13个核苷酸处进行。参见例如美国专利5,356,802；5,436,150及5,487,994；以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269：31，978-31，982。如此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制酶的切割结构域(或切割半结构域)和一个或多个锌指结合结构域(其可以改造或不改造)。

切割结构域与结合结构域是可分的例示性IIS型限制酶是FokI。这种特定的酶作为二聚体是有活性的。Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：10，570-10，575。因而，为了本公开的目的，认为所公开融合蛋白中所使用的Fok I酶部分是切割半结构域。如此，对于使用锌指-Fok I融合物来对细胞序列进行的靶向双链切割和/或靶向替换，可以使用两个融合蛋白(每个包含Fok I切割半结构域)来重建具有催化活性的切割结构域。或者，也可以使用包含一个锌指结合结构域和两个Fok I切割半结构域的单个多肽分子。在本公开的别处提供了使用锌指-Fok I融合物来进行靶向切割和靶向序列改变的参数。

切割结构域或切割半结构域可以是蛋白质保留切割活性或保留多聚化(例如二聚化)能力以形成功能性切割结构域的任何部分。

例示性IIS型限制酶列于表1中。别的限制酶也含有可分的结合和切割结构域，并且这些为本公开所涵盖。参见例如Roberts等(2003)Nucleic Acids Res.31：418-420。

表1：一些IIS型限制酶

Aar I BsrB I SspD5 I

Ace III BsrD I Sth132 I

Aci I BstF5 I Sts I

Alo I Btr I TspDT I

Bae I Bts I TspGW I

Bbr7 I Cdi I Tth111 II

Bbv I CjeP I UbaP I

Bbv II Drd II Bsa I

BbvC I Eci I BsmB I

Bcc I Eco31 I

Bce83 I Eco57 I

BceA I Eco57M I

Bcef I Esp3 I

Bcg I Fau I

BciV I Fin I

Bfi I Fok I

Bin I Gdi II

Bmg I Gsu I

Bpu10 I Hga I

BsaX I Hin4II

Bsb I Hph I

BscA I Ksp632 I

BscG I Mbo II

BseR I Mly I

BseY I Mme I

Bsi I Mnl I

Bsm I Pfl1108 I

BsmA I Ple I

BsmF I Ppi I

Bsp24 I Psr I

BspG I RleA I

BspM I Sap I

BspNC I SfaN I

Bsr I Sim I

锌指结构域-切割结构域融合物

用于设计和构建融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的方法对于本领域技术人员是已知的。例如，用于设计和构建包含锌指蛋白的融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的方法记载于共有的美国专利6,453,242和6,534,261。在某些实施方案中，构建了编码此类融合蛋白的多核苷酸。可以将这些多核苷酸插入载体中，并可以将该载体导入细胞中(参见下文关于用于将多核苷酸导入细胞中的载体和方法的别的公开)。

在本文所述方法的某些实施方案中，融合蛋白包含锌指结合结构域和来自Fok I限制酶的切割半结构域，并在细胞中表达两种此类融合蛋白。两种融合蛋白在细胞中的表达可以源自将所述两种蛋白质投递至所述细胞；将一种蛋白质和编码所述蛋白质之一的一种核酸投递至所述细胞；将两种各编码所述蛋白质之一的核酸投递至所述细胞；或通过将编码两种蛋白质的单个核酸投递至所述细胞。在别的实施方案中，融合蛋白包含单条多肽链，其包含个种切割半结构域和一个锌指结合结构域。在这种情况中，在细胞中表达单个融合蛋白，并且(在不希望被理论限制的前提下)认为其由于形成切割半结构域的分子内二聚体而切割DNA。

在某些实施方案中，将融合蛋白(例如ZFP-Fok I融合物)的构件排列成使得锌指结构域距离融合蛋白的氨基末端最近，并使得切割半结构域距离羧基末端最近。这反映了天然存在的二聚化切割结构域(诸如那些衍生自Fok I酶的)中切割结构域的相对取向，其中DNA结合结构域距离氨基末端最近而切割半结构域距离羧基末端最近。在这些实施方案中，切割半结构域二聚化而形成功能性核酸酶是通过融合蛋白结合至对立DNA链上的位点而引起的，其中结合位点的5’端彼此接近。

在别的实施方案中，将融合蛋白(例如ZFP-Fok I融合物)的构件排列成使得切割半结构域距离融合蛋白的氨基末端最近，并使得锌指结构域距离羧基末端最近。在这些实施方案中，切割半结构域二聚化而形成功能性核酸酶是通过融合蛋白结合至对立DNA链上的位点而引起的，其中结合位点的3’端彼此接近。

在别的实施方案中，第一融合蛋白包含距离该融合蛋白的氨基末端最近的切割半结构域和距离羧基末端最近的锌指结构域，并将第二融合蛋白排列成使得锌指结构域距离该融合蛋白的氨基末端最近，且使得切割半结构域距离羧基末端最近。在这些实施方案中，两种融合蛋白结合相同的DNA链，其中包含距离羧基末端最近的锌指结构域的第一融合蛋白的结合位点位于包含距离氨基末端最近的锌指结构域的第二融合蛋白的结合位点的5’侧。

在某些实施方案中，所公开融合蛋白中锌指结构域和切割结构域(或切割半结构域)之间的氨基酸序列称为“ZC接头”。ZC接头与上文所述指间接头有所区别。参见例如美国专利公开文本20050064474A1和20030232410，及国际专利公开文本WO 05/084190，其关于获得优化切割的ZC接头的详情。

用于靶向切割的方法

所公开的方法和组合物可以用于切割细胞染色质中感兴趣区域处的DNA(例如在基因组中期望的或预定的位点处，例如在或是突变型或是野生型的基因中)。对于这种靶向DNA切割，锌指结合结构域改造成结合预定切割位点处或接近预定切割位点处的靶位点，并在细胞中表达包含工程化锌指结合结构域和切割结构域的融合蛋白。在融合蛋白的锌指部分结合至靶位点后，通过切割结构域在靶位点附近切割DNA。切割的准确位点可以依赖ZC接头的长度。

或者，在细胞中表达两种各包含锌指结合结构域和切割半结构域的融合蛋白，并结合至靶位点，其以使得功能性切割结构域得以重建且DNA在靶位点附近得以切割的方式并列。在一个实施方案中，切割发生在两个锌指结合结构域的靶位点之间。锌指结合结构域之一或二者可以进行改造。

对于使用锌指结合结构域-切割结构域融合多肽进行的靶向切割，结合位点可以涵盖切割位点，或者结合位点的近边缘可以距离切割位点1个、2个、3个、4个、5个、6个、10个、25个、50个或更多核苷酸(或1个和50个核苷酸之间的任何整数值)。结合位点相对于切割位点的准确位置将取决于特定的切割结构域和ZC接头的长度。对于其中使用两种各包含锌指结合结构域和切割半结构域的融合蛋白的方法，结合位点一般跨越切割位点。如此，第一结合位点的近边缘可以是切割位点一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、10个、25个或更多核苷酸(或1个和50个核苷酸之间的任何整数值)，而第二结合位点的近边缘可以是切割位点另一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、10个、25个或更多核苷酸(或1个和50个核苷酸之间的任何整数值)。用于在体外和在体内对切割位点作图的方法对于本领域技术人员是已知的。

如此，本文所述方法可以利用与切割结构域融合的工程化锌指结合结构域。在这些情况中，结合结构域改造成结合靶序列，期望在其处或其附近进行切割。将融合蛋白或编码其的多核苷酸导入植物细胞中。一旦导入细胞中或在细胞中表达，融合蛋白结合至靶序列，并在靶序列处或接近靶序列处进行切割。切割的准确位点取决于切割结构域的性质和/或结合和切割结构域之间的接头序列的存在和/或性质。在其中使用两种各包含切割半结构域的融合蛋白的情况中，结合位点的近边缘之间的距离可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、25个或更多核苷酸(或1个和50个核苷酸之间的任何整数值)。切割作用的最佳水平还可以取决于两个融合蛋白的结合位点之间的距离(参见例如Smith等(2000)Nucleic Acids Res.28：3361-3369；Bibikova等(2001)Mol.Cell.Biol.21：289-297)和各个融合蛋白中ZC接头的长度两者。还可参见美国专利公开文本20050064474A1及国际专利公开文本WO 05/084190，WO 05/014791和WO 03/080809。

在某些实施方案中，切割结构域包含两种切割半结构域(两者都是包含结合结构域的单个多肽的一部分)，即第一切割半结构域和第二切割半结构域。切割半结构域可以具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列，只要它们发挥切割DNA的功能。

切割半结构域还可以在分开的分子中提供。例如，可以将两种融合多肽导入细胞中，其中每种多肽包含结合结构域和切割半结构域。切割半结构域可以具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列，只要它们发挥切割DNA的功能。此外，结合结构域结合靶序列，其典型地以如下方式排列，使得融合多肽结合后，两个切割半结构域以容许切割结构域重建(例如通过半结构域的二聚化)的相对于彼此的空间取向呈现，由此将半结构域相对于彼此放置以形成功能性切割结构域，导致对感兴趣区域中细胞染色质的切割。一般而言，由重建的切割结构域所进行的切割发生在位于两个靶序列之间的位点处。蛋白质之一或二者可以改造成结合其靶位点。

两种融合蛋白可以在感兴趣区域中以相同的或对立的极性结合，而且它们的结合位点(即靶位点)可以由任何数目的核苷酸(例如从0至200个核苷酸或其间的任何整数值)分开。在某些实施方案中，两个各包含锌指结合结构域和切割半结构域的融合蛋白的结合位点可以相距5个和18个核苷酸之间，例如相距5-8个核苷酸，或相距15-18个核苷酸，或相距6个核苷酸，或相距16个核苷酸，正如根据各结合位点与另一结合位点最接近的边缘所测量的，并且切割发生在结合位点之间。

对DNA进行切割所在的位点一般位于两个融合蛋白的结合位点之间。DNA的双链断裂通常源自两个单链断裂(break)或“切口”(nick)，其偏移(setoff)1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多核苷酸(例如，天然Fok I对双链DNA的切割源自偏移4个核苷酸的单链断裂)。如此，切割不必在各条DNA链上恰好对立的位点发生。另外，融合蛋白的结构和靶位点间的距离可以影响切割是否邻近单个核苷酸对发生，或切割是否在数个位点发生。然而，对于包括靶向重组和靶向诱变(见下文)的许多应用，一定范围核苷酸内的切割一般是足够的，并且不需要特定碱基对间的切割。

如上文所记录，可以以多肽和/或多核苷酸形式导入一种或多种融合蛋白。例如，可以将两种各包含编码上述多肽之一的序列的多核苷酸导入细胞中，并在多肽表达且各多肽结合至其靶序列后，在靶序列处或接近靶序列处发生切割。或者，将包含编码两种融合多肽的序列的单个多核苷酸导入细胞中。多核苷酸可以是DNA、RNA或DNA和/或RNA的任何修饰形式或类似物。

为了增强切割特异性，在本文所述方法中还可以采用别的组合物。例如，单个切割半结构域可以展现有限的双链切割活性。在其中将两种各包含3指锌指结构域和切割半结构域的融合蛋白导入细胞中的方法中，任一蛋白质规定大约9个核苷酸的靶位点。虽然在哺乳动物基因组中18个核苷酸的聚集靶序列(aggregate target sequence)有可能是唯一的，但是在人类基因组中任何给定的9核苷酸靶位点平均出现大约23,000次。如此，由于单个半结构域的位点特异性结合而可能发生非特异性切割。因而，本文所述方法涵盖与两种融合蛋白一起使用在细胞中表达的切割半结构域(诸如Fok I)的显性失活突变体(dominant-negative mutant)(或编码其的核酸)。该显性失活突变体能够二聚化但不能进行切割作用，而且还阻断与其二聚化的半结构域的切割活性。通过向融合蛋白提供摩尔过量的显性失活突变体，只有其中结合两种融合蛋白的区域会具有足够高的功能性切割半结构域局部浓度以发生二聚化和切割。在其中仅结合两种融合蛋白之一的位点处，其切割半结构域与显性失活突变型半结构域形成二聚体，并且不发生不想要的、非特异性切割。

已经鉴定出Fok I切割半结构域中的三个催化性氨基酸残基：Asp 450、Asp 467及Lys 469。Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10，570-10，575。如此，这些残基之一的一处或多处突变可以用于产生显性失活突变。此外，其它IIS型内切核酸酶的许多催化性氨基酸残基是已知的，和/或可以通过例如与Fok I序列比对和/或生成突变体并对突变体检验催化活性来确定。

切割半结构域中二聚化结构域突变

用于牵涉使用ZFP和切割半结构域之间融合物(诸如例如ZFP/FokI融合物)的靶向切割的方法需要使用两种此类融合分子，每种一般针对不同的靶序列。可以选择两种融合蛋白的靶序列，使得靶向切割针对基因组中的独特位点，正如上文所述的。切割特异性降低的潜在原因可以源自两种ZFP/切割半结构域融合物之一的同源二聚化(homodimerization)。这发生的可能原因是例如由于基因组中存在两种ZFP/切割半结构域融合物之一的靶序列的反向重复，使得容许两拷贝的相同融合蛋白以容许形成功能性二聚体的取向和间距结合。

一种用于降低在预期靶位点以外的序列处该类型异常切割的可能性的方法牵涉生成使同源二聚化最小化或阻止同源二聚化的切割半结构域变体。优选地，改变半结构域牵涉其二聚化的区域中的一个或多个氨基酸。在Fok I蛋白二聚体的晶体结构中，据报道切割半结构域的结构类似于Fok I切割DNA过程中切割半结构域的排列。Wah等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：10564-10569。这种结构表明第483位和第487位氨基酸残基在Fok I切割半结构域的二聚化中发挥关键作用。该结构还表明第446位、第447位、第479位、第483位、第484位、第486位、第487位、第490位、第491位、第496位、第498位、第499位、第500位、第531位、第534位、第537位、及第538位氨基酸残基均与二聚化界面足够接近以影响二聚化。因而，一处或多处上述位置的氨基酸序列改变有可能会改变切割半结构域的二聚化性质。可以通过例如构建在这些位置含有(或编码)不同氨基酸残基的文库并选择具有期望性质的变体，或者通过合理设计突变体个体来导入此类变化。除阻止同源二聚化之外，还可能的是，这些突变中的一些可以将切割效率提高到使用两种野生型切割半结构域所获得的切割效率之上。

因而，Fok I切割半结构域在任何影响二聚化的氨基酸残基处的改变可以用于阻止一对ZFP/Fok I融合物之一经受同源二聚化，该同源二聚化可以导致在不想要的序列处进行切割。如此，对于使用一对ZFP/Fok I融合物进行的靶向切割，融合蛋白之一或二者可以包含一处或多处下述氨基酸改变，其抑制自我二聚化(self-dimerization)但容许发生两种融合蛋白的异源二聚化，使得在期望的靶位点发生切割。在某些实施方案中，改变存在于两种融合蛋白中，并且改变具有叠加效应；即，使导致异常切割的任一融合物同源二聚化最小化或消除，而与使用野生型切割半结构域获得的异源二聚化相比，促进了所述两种融合蛋白的异源二聚化。

用于靶向改变基因组序列和靶向重组的方法

本文还描述的是用同源但不相同的序列来替换基因组序列(例如细胞染色质中的感兴趣区域)的方法(即靶向重组)。替换特定序列的先前尝试已经包括了：使细胞与包含与染色体区域具有同源性的序列的多核苷酸(即供体DNA)接触，接着选择如下细胞，其中供体DNA分子经受了同源重组而进入基因组中。这些方法的成功率是低的，这归咎于同源重组的低效率和供体DNA非特异性插入靶位点外的基因组区域中的高频率。

本公开提供了靶向序列改变的方法，其特征在于靶向重组效率较大而非特异性插入事件频率较低。该方法牵涉制备和使用与切割结构域(或切割半结构域)融合的工程化锌指结合结构域以在细胞DNA中产生一个或多个靶向双链断裂。因为细胞DNA中的双链断裂在切割位点附近刺激细胞修复机制达数千倍，此类靶向切割容许基因组中实际上任何位点的序列改变或替换(经由同源性指导的修复(homology-directed repair))。

除本文所述融合分子外，所选基因组序列的靶向替换还需要导入替换(或供体)序列。可以将供体序列在表达一种或多种融合蛋白之前、同时、或之后导入细胞中。供体多核苷酸与基因组序列含有足够的同源性以支持其和与其具有同源性的基因组序列之间的同源重组(或同源性指导的修复)。供体和基因组序列之间大约25个、50个、100个、200个、500个、750个、1,000个、1,500个、2,000个核苷酸或更多的序列同源性(或10个和2,000个核苷酸间的任何整数值，或更多)会支持其间的同源重组。供体序列的长度范围可以从10至5,000个核苷酸(或其间核苷酸的任何整数值)或更长。显而易见的是，典型地，供体序列与其替换的基因组序列不相同。例如，供体多核苷酸的序列可以含有一个或多个相对于基因组序列的单碱基变化、插入、删除、倒位或重排，只要与染色体序列存在足够的同源性。或者，供体序列可以包含侧翼为两个同源性区域的非同源序列。另外，供体序列可以包含载体分子，其含有与细胞染色质中感兴趣区域没有同源性的序列。一般而言，供体序列的同源区与期望重组的基因组序列会具有至少50％的序列同一性。在某些实施方案中，存在60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、或99.9％的序列同一性。可以存在1％和100％序列同一性之间的任何数值，这取决于供体多核苷酸的长度。

供体分子可以包含数个与细胞染色质具有同源性的不连续区域。例如，对于靶向插入正常情况下不存在于感兴趣区域中的序列，所述序列可以存在于供体核酸分子中，并且其侧翼为与感兴趣区域中的序列具有同源性的区域。

为了简化用于确定供体序列得到成功插入的测定法(例如杂交、PCR、限制酶消化)，供体序列中可以存在与基因组序列相比的某些序列差异。优选地，如果位于编码区中，那么此类核苷酸序列差异不会改变氨基酸序列，或者会产生沉默的氨基酸变化(即不影响蛋白质结构或功能的变化)。供体多核苷酸可以任选地包含感兴趣区域中与锌指结构域结合位点对应的序列中的变化，以阻止对已经通过同源重组而导入细胞染色质中的供体序列的切割。

供体多核苷酸可以是DNA或RNA，单链的或双链的，并可以以线性或环状形式导入细胞中。如果以线性形式导入，那么供体序列的末端可以通过对于本领域技术人员已知的方法来保护(例如免于核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基加至线性分子的3’末端和/或将自体互补的(self-complementary)寡核苷酸连接至一个或两个末端。参见例如Chang等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：4959-4963；Nehls等(1996)Science272：886-889。用于保护外源多核苷酸免于降解的别的方法包括但不限于添加末端氨基基团和使用经修饰的核苷酸间键合，诸如例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、及O-甲基核糖或脱氧核糖残基。

可以将多核苷酸作为载体分子的一部分导入细胞中，所述载体分子具有别的序列，诸如例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，可以以裸核酸形式、以与试剂(诸如脂质体或Poloxamer)复合的核酸形式来导入供体多核苷酸，或者可以通过细菌或病毒(例如土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌NGR234(Rhizobium sp.NGR234)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒)来投递供体多核苷酸。参见例如Chung等(2006)Trends Plant Sci.11(1)：1-4。

在不被一种理论限制的前提下，看来细胞序列中双链断裂的存在结合与接近该断裂或该断裂周围的区域具有同源性的外源DNA分子的存在激活了如下细胞机制，其通过将序列信息从供体分子转移至细胞(例如基因组或染色体)序列中来修复该断裂；即通过同源性指导的修复的过程(也称为“基因转换”)进行。申请人的方法有利地组合了工程化ZFP的强靶向能力和切割结构域(或切割半结构域)以将双链断裂特异性靶向基因组中期望进行外源序列插入的区域。

对于染色体序列的改变，不必将供体的全部序列复制到染色体中，只要复制的供体序列部分足以实现期望的序列改变。

通过同源重组进行的供体序列插入的效率与细胞DNA中双链断裂和期望进行重组的位点之间的距离成反比。换言之，在双链断裂与期望进行重组的位点较近时观察到较高的同源重组效率。在不预定精确的重组位点(例如期望的重组事件可以在一段基因组序列里发生)的情况中，对供体核酸的长度和序列，及切割位点进行选择以获得期望的重组事件。在期望的事件设计成改变基因组序列中单个核苷酸对的序列的情况中，在那个核苷酸对的任一侧10,000个核苷酸内切割细胞染色质。在某些实施方案中，在序列将被改变的核苷酸对的任一侧1,000个、500个、200个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个、10个、5个、或2个核苷酸，或2个和1,000个核苷酸间的任何整数值内发生切割。

如上文所详述，两种各包含锌指结合结构域和切割半结构域的融合蛋白的结合位点可以相距5-8个或15-18个核苷酸(正如根据各结合位点与另一结合位点最接近的边缘所测量的)，并且在结合位点间发生切割。切割是发生在结合位点间的单个位点还是多个位点是不重要的，因为切割后的基因组序列由供体序列替换。如此，对于通过靶向重组来有效改变单个核苷酸对的序列，结合位点间区域的中点在那个核苷酸对的10,000个核苷酸内，优选在1,000个核苷酸、或500个核苷酸、或200个核苷酸、或100个核苷酸、或50个核苷酸、或20个核苷酸、或10个核苷酸、或5个核苷酸、或2个核苷酸、或1个核苷酸内，或在感兴趣核苷酸对处。

在某些实施方案中，同源染色体可以充当供体多核苷酸。如此，例如，杂合子中突变的校正可以通过改造融合蛋白来实现，所述融合蛋白结合并切割一条染色体上的突变型序列，但不切割同源染色体上的野生型序列。带有突变的染色体上的双链断裂刺激基于同源性的“基因转换”过程，其中将来自同源染色体的野生型序列复制到切割后的染色体中，如此恢复两拷贝的野生型序列。

还提供了可以增强靶向重组水平的方法和组合物，包括但不限于使用别的ZFP-功能性结构域融合物以激活同源重组中所牵涉的基因的表达，诸如例如RAD52上位性(epistasis)组的成员(例如Rad50、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad52、Rad54、Rad54B、Mre11、XRCC2、XRCC3)、其产物与上述基因产物相互作用的基因(例如BRCA1、BRCA2)和/或NBS1复合物中的基因。参见例如Boyko等(2006)Plant Physiology 141：488-497和LaFarge等(2003)Nucleic Acids Res 31(4)：1148-1155。类似地，ZFP-功能性结构域融合物可以与本文所公开的方法和组合物联合用于阻遏非同源末端连接中所牵涉基因的表达(例如Ku70/80、XRCC4、聚(ADP核糖)聚合酶、DNA连接酶4)。参见例如Riha等(2002)EMBO 21：2819-2826；Freisner等(2003)Plant J.34：427-440；Chen等(1994)European Journal of Biochemistry 224：135-142。使用锌指结合结构域和功能性结构域之间的融合物来激活和阻遏基因表达的方法披露于例如共有的美国专利6,534,261；6,824,978及6,933,113。别的阻遏方法包括使用靶向待阻遏基因序列的反义寡核苷酸和/或小干扰RNA(siRNA或RNAi)。

作为激活同源重组中所牵涉基因产物的表达的备选或者在激活同源重组中所牵涉基因产物的表达之外，可以使用这些蛋白质(或其功能性片段)与靶向感兴趣区域的锌指结合结构域的融合物来将这些蛋白质(重组蛋白)募集至感兴趣区域，由此增加其局部浓度，并进一步刺激同源重组过程。或者，上文所述同源重组中所牵涉多肽(或其功能性片段)可以是包含锌指结合结构域、切割结构域(或切割半结构域)和重组蛋白(或其功能性片段)的三元融合蛋白的一部分。基因转换和重组相关染色质重建中所牵涉的别的蛋白质(其可用于上述方法和组合物)包括组蛋白乙酰转移酶(例如Esa1p、Tip60)、组蛋白甲基转移酶(例如Dot1p)、组蛋白激酶和组蛋白磷酸酶。还可参见Bhat等(1999)Plant J.33：455-469。

包含锌指/核酸酶融合分子和供体DNA分子的细胞中靶向重组效率的进一步增加是如下实现的，即在同源性驱动的修复过程具有最大活性时，将细胞阻断在细胞周期的G₂期。这种阻滞可以以许多方式来实现。例如，可以用例如影响细胞周期进程的药物、化合物和/或小分子来处理细胞，使得将细胞阻滞在G₂期。这种类型的例示性分子包括但不限于影响微管聚合的化合物(例如长春碱(vinblastine)、诺考达唑(nocodazole)、泰素(Taxol))、与DNA相互作用的化合物(例如顺式-铂(II)二氨二氯化物(cis-platinum(II)diaminedichloride)、顺铂(Cisplatin)、多柔比星(doxorubicin))和/或影响DNA合成的化合物(例如胸苷、羟基脲、L-含羞草氨酸(L-mimosine)、依托泊苷(etoposide)、5-氟尿嘧啶)。重组效率的再增加是如下实现的，即使用改变染色质结构的组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂(例如丁酸钠、制滴菌素A(trichostatin A))来使基因组DNA更易被细胞重组机器(machinery)接近。

用于细胞周期阻滞的别的方法包括过表达抑制CDK细胞周期激酶活性的蛋白质，例如通过将编码该蛋白质的cDNA导入细胞中或通过将激活编码所述蛋白质的基因表达的工程化ZFP导入细胞中来实现。细胞周期阻滞还可以如下实现，即使用例如RNAi方法(例如美国专利No.6,506,559)来抑制细胞周期蛋白和CDK的活性，或通过将如下改造ZFP导入细胞中，所述工程化ZFP阻遏细胞周期进程中所牵涉的一种或多种基因(诸如例如细胞周期蛋白和/或CDK基因)的表达。参见例如共有的美国专利No.6,534,261，其关于合成用于调节基因表达的工程化锌指蛋白的方法。

或者，在某些情况中，在没有供体多核苷酸的情况下进行靶向切割(优选处于S或G₂期)，并在同源染色体间发生重组。

表达载体

可以将编码一种或多种ZFP或ZFP融合蛋白的核酸克隆入载体，用以转化入原核细胞或真核细胞以复制和/或表达。载体可以是原核载体，例如质粒、或穿梭载体、昆虫载体、或真核载体。还可以将编码ZFP的核酸克隆入表达载体，用于给植物细胞施用。

为了表达ZFP或ZFP融合蛋白，典型地将编码ZFP或ZFP融合物的序列亚克隆入含有指导转录的启动子的表达载体。合适的细菌和真核启动子在本领域是公知的，并记载于例如Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(第2版.1989；第3版，2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，见上文)。在例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)中可以获得用于表达ZFP的细菌表达系统(Palva等，Gene 22：229-235(1983))。这些表达系统的试剂盒是商品化的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统对于本领域技术人员是公知的，而且也是商品化的。

用于指导编码ZFP的核酸表达的启动子取决于特定的应用。例如，典型地使用适合于宿主细胞的强组成型启动子来表达和纯化ZFP。

比较而言，在体内施用ZFP用于植物基因调节时(参见下文“将核酸投递至植物细胞”部分)，使用或是组成型或是诱导型启动子，这取决于ZFP的特定用途。植物启动子的非限制性例子包括自下组衍生的启动子序列：拟南芥(A.thaliana)泛素-3(ubi-3)(Callis等，1990，J.Biol.Chem.265：12486-12493)；根癌土壤杆菌(A.tumifaciens)甘露碱合酶(Δmas)(Petolino等，美国专利No.6,730,824)；和/或木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)(Verdaguer等，1996，PlantMolecular Biology 31：1129-1139)。还可参见实施例。

除启动子外，表达载体典型地包含转录单元或表达盒，其包含在宿主细胞(或是原核的或是真核的)中表达核酸所需的所有别的元件。如此，典型的表达盒包含与例如编码ZFP的核酸序列可操作连接的启动子，及所需的信号，例如用于转录物的有效多腺苷化、转录终止、核糖体结合位点、或翻译终止。该盒的别的元件可以包括例如增强子，及异源剪接信号。

根据ZFP的预定用途，例如在植物、动物、细菌、真菌、原生动物等中表达，对用于将遗传信息转运入细胞的特定表达载体进行选择(参见下文所述表达载体)。标准的细菌和动物表达载体在本领域中是已知的，并详细记载于例如美国专利公开文本20050064474A1及国际专利公开文本WO05/084190，WO05/014791和WO03/080809。

标准的转染方法可以用于产生表达大量蛋白质的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后可以使用标准技术来纯化所述蛋白质(参见例如Colley等，J.Biol.Chem.264：17619-17622(1989)；Guide to Protein Purification，于Methods in Enzymology，卷182(Deutscher编，1990))。真核细胞和原核细胞的转化依照标准技术实施(参见例如Morrison，J.Bact.132：349-351(1977)；Clark-Curtiss和Curtiss，Methods in Enzymology 101：347-362(Wu等编，1983))。

可以使用任何用于将外来核苷酸序列导入此类宿主细胞中的公知规程。这些包括使用磷酸钙转染、Polybrene、原生质体融合、电穿孔、超声方法(例如声穿孔(sonoporation))、脂质体、显微注射、裸DNA、质粒载体、病毒载体(附加体型的和整合型的两种)、及任何用于将所克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来遗传物质导入宿主细胞中的其它公知方法(参见例如Sambrook等，见上文)。仅必需的是，使用的特定遗传工程规程能够成功地将至少一种基因导入能够表达所选蛋白质的宿主细胞中。

将核酸投递至植物细胞

如上文所记录，DNA构建体可以通过多种常规技术来导入期望的植物宿主中(例如导入其基因组中)。对于此类技术的综述，参见例如Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology(1988，Academic Press，N.Y.)节VIII，页421-463；及Grierson和Corey，Plant Molecular Biology(1988，第2版)，Blackie，London，章7-9。

例如，DNA构建体可以使用诸如电穿孔和显微注射植物细胞原生质体等技术来直接导入植物细胞的基因组DNA中，或者DNA构建体可以使用生物射弹法(biolistic method)来直接导入植物组织中，诸如DNA粒子轰击(参见例如Klein等(1987)Nature 327：70-73)。或者，DNA构建体可以与合适的T-DNA侧翼区组合，并导入常规的根癌土壤杆菌宿主载体中。根癌土壤杆菌介导的转化技术(包括二元载体的使用和消除(disarming))完全记载于科学文献中。参见例如Horsch等(1984)Science 233：496-498，及Fraley等(1983)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 80：4803。

此外，基因转移可以使用非土壤杆菌属的细菌或病毒(诸如根瘤菌NGR234、苜蓿中华根瘤菌、百脉根中生根瘤菌、马铃薯X病毒、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒和/或烟草花叶病毒)来实现，参见例如Chung等(2006)Trends Plant Sci.11(1)：1-4。

根癌土壤杆菌宿主的毒力功能会在使用二元T DNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12：8711-8721)或共培养规程(Horsch等(1985)Science227：1229-1231)由所述细菌感染所述细胞后指导构建体和邻近标志物插入植物细胞DNA中。一般而言，使用土壤杆菌属转化系统来改造双子叶植物(Bevan等(1982)Ann.Rev.Genet 16：357-384；Rogers等(1986)MethodsEnzymol.118：627-641)。土壤杆菌属转化系统还可以用于转化以及转移DNA至单子叶植物和植物细胞。参见美国专利No.5,591,616；Hernalsteen等(1984)EMBO J 3：3039-3041；Hooykass-Van Slogteren等(1984)Nature 311：763-764；Grimsley等(1987)Nature 325：1677-179；Boulton等(1989)Plant Mol.Biol.12：31-40；及Gould等(1991)Plant Physiol.95：426-434。

备选的基因转移和转化方法包括但不限于通过钙、聚乙二醇(PEG)或电穿孔介导的裸DNA摄取进行的原生质体转化(参见Paszkowski等(1984)EMBO J 3：2717-2722；Potrykus等(1985)Molec.Gen.Genet.199：169-177；Fromm等(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：5824-5828；及Shimamoto(1989)Nature 338：274-276)和植物组织的电穿孔(D′Halluin等(1992)PlantCell 4：1495-1505)。用于植物细胞转化的别的方法包括显微注射、碳化硅介导的DNA摄取(Kaeppler等(1990)Plant Cell Reporter 9：415-418)、及微粒轰击(参见Klein等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：4305-4309；及Gordon-Kamm等(1990)Plant Cell 2：603-618)。

所公开的方法和组合物可以用于将外源序列插入植物细胞基因组中预定的位置。这是有用的，因为导入植物基因组中的转基因的表达关键取决于其整合位点。因而，编码例如养分、抗生素或治疗性分子的基因可以通过靶向重组而插入植物基因组中有利于其表达的区域。

可以培养通过任何上述转化技术产生的经转化植物细胞以再生拥有所转化的基因型和因此期望的表型的完整植株。此类再生技术依赖于组织培养生长培养基中某些植物激素的操作，典型地依赖于已经与期望的核苷酸序列一起导入的杀虫剂和/或除草剂标志物中。从培养的原生质体再生植物记载于Evans等，″Protoplasts Isolation and Culture″于Handbook of Plant Cell Culture，pp.124-176，Macmillian Publishing Company，New York，1983；及Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985。还可以从植物胼胝体(callus)、外植体、器官、花粉、胚或其部分获得再生。此类再生技术一般性地记载于Klee等(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38：467-486。

导入植物细胞中的核酸可用于赋予基本上任何植物以期望性状。可以使用本公开的核酸构建体和上述各种转化方法来对极其多种植物和植物细胞系统改造本文所述期望的生理学和农学特征。在优选的实施方案中，用于改造的目标植物和植物细胞包括不限于那些单子叶和双子叶植物，诸如农作物，其包括谷类作物(例如小麦、玉米、稻、黍(millet)、大麦)、水果作物(例如番茄、苹果、梨、草莓、柑/桔/橙)、草料作物(例如苜蓿)、根菜作物(root vegetable crop)(例如胡萝卜、马铃薯、甜菜、薯蓣)、叶菜作物(leafyvegetable crop)(例如莴苣、菠菜)；有花植物(例如矮牵牛、蔷薇/玫瑰、菊)、松柏植物和松树(例如冷杉(pine fir)、云杉)；用于植物除污(phytoremediation)的植物(例如重金属积累植物(heavy metal accumulating plant))；油料作物(例如向日葵、油菜籽)和用于实验目的的植物(例如拟南芥属)。如此，所公开的方法和组合物在广泛的植物上有用途，其包括但不限于来自如下属的物种：天门冬属(Asparagus)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑桔属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、大麦属(Hordeum)、莴苣属(Lactuca)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、鳄梨属(Persea)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)、及玉蜀黍属(Zea)。

本领域技术人员会认可的是，在表达盒被稳定掺入转基因植物中并证实是可操作的后，其可以通过有性杂交而导入其它植物中。可以使用许多标准育种技术之任一种，这取决于待杂交的物种。

经转化的植物细胞、胼胝体、组织或植株可以通过对改造后的植物材料选择或筛选由所转化DNA上存在的标志物基因所编码的性状来鉴定和分离。例如，可以如下实施选择，即将改造后的植物材料在含有抑制量抗生素或除草剂的培养基上培养，所转化基因构建体赋予对所述抗生素或除草剂的抗性。此外，经转化的植物和植物细胞还可以通过筛选可以存在于重组核酸构建体上的任何可见标志物基因(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、B或C1基因)的活性来鉴定。此类选择和筛选方法对于本领域技术人员是公知的。

物理和生物化学方法也可以用于鉴定含有所插入的基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不限于：1)Sourthern分析或PCR扩增，用于检测和测定重组DNA插入物的结构；2)Northern印迹、S1RNA酶保护、引物延伸或反转录酶-PCR扩增，用于检测和检查基因构建体的RNA转录物；3)酶测定法，用于检测酶或核酶活性，其中此类基因产物由基因构建体编码；4)蛋白质凝胶电泳、Western印迹技术、免疫沉淀、或酶联免疫测定法，其中基因构建体产物是蛋白质。别的技术(诸如原位杂交、酶染色、及免疫染色)也可以用于检测重组构建体在特定植物器官和组织中的存在或表达。用于进行所有这些测定法的方法对于本领域技术人员是公知的。

使用本文所公开方法进行的基因操作的效果可以通过例如自感兴趣组织分离的RNA(例如mRNA)的Northern印迹来观察。典型地，如果mRNA的量增加了，那么可以认为相应的内源基因正以比之前更快的速度表达。可以使用测量基因和/或CYP74B活性的其它方法。可以使用不同类型的酶测定法，取决于使用的底物和检测反应产物或副产物增加或减少的方法。另外，所表达的蛋白质和/或CYP74B蛋白的水平可以通过免疫化学方法测量，即ELISA、RIA、EIA及对于本领域技术人员公知的其它基于抗体的测定法，诸如通过电泳检测测定法(或是使用染色或是使用Western印迹)。转基因可以在植物的一些组织中或在一些发育阶段选择性表达，或者转基因可以在基本上所有的植物组织中，基本上在其整个生命周期中表达。然而，任何组合表达模式也是可应用的。

本公开还涵盖上文所述转基因植物的种子，其中所述种子具有转基因或基因构建体。本公开还涵盖上述转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞具有所述转基因或基因构建体。

ZFP和编码ZFP的表达载体可以直接给植物施用，用于靶向切割和/或重组。

有效量的施用通过通常用于导入ZFP并最终与待处理的植物细胞接触的任何路径进行。ZFP以任何合适的方式施用，优选与药学可接受载体一起。施用此类调节剂的合适方法是可获得的，并且对于本领域技术人员是公知的，并且虽然超过一种的路径可以用于施用特定的组合物，但是特定的路径通常可以提供比另一种路径更及时(immediate)且更有效的反应。

还可以使用载体，并且其部分根据正在施用的特定组合物，以及根据用于施用该组合物的特定方法来决定。因而，存有可使用的极其多种合适的药物组合物配制剂(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985))。

应用

所公开的用于靶向切割的方法和组合物可以用于诱导基因组序列中的突变。靶向切割还可以用于产生基因敲除(例如用于功能基因组学或靶标确认(target validation))及用于促进序列靶向插入基因组中(即基因敲入)。可以如下实现插入，即通过同源重组或通过靶向整合来替换染色体序列，其中将侧翼为与染色体中感兴趣区域同源的序列的新序列(即感兴趣区域中不存在的序列)插在预定的靶位点。相同的方法还可以用于用突变型序列替换野生型序列，或用于将一个等位基因转换成不同的等位基因。

对所感染的或所整合的植物病原体的靶向切割可以用于治疗植物宿主中的病原体感染，例如通过对病原体的基因组进行切割使得其病原性降低或消除来实现。另外，对编码植物病毒受体的基因的靶向切割可以用于阻断此类受体的表达，由此阻止植物中的病毒感染和/或病毒传播。

例示性的植物病原体包括但不限于植物病毒，诸如苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)、α潜隐病毒属(Alphacryptovirus)、杆状DNA病毒属(Badnavirus)、β潜隐病毒属(Betacryptovirus)、Bigeminivirus、雀麦花叶病毒属(Bromovirus)、大麦黄化花叶病毒属(Bymovirus)、毛状病毒属(Capillovirus)、香石竹病毒属(Carlavirus)、香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)、花椰菜花叶病毒组(Caulimovirus)、长线形病毒组(Closterovirus)、豇豆花叶病毒组(Comovirus)、黄瓜花叶病毒组(Cucumovirus)、质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)、石竹病毒属(Dianthovirus)、碗豆耳突花叶病毒组(Enamovirus)、蚕豆萎蔫病毒组(Fabavirus)、斐济病毒属(Fijivirus)、真菌传杆状病毒组(Furovirus)、大麦病毒属(Hordeivirus)、Hybrigeminivirus、悬钩子病毒属(Idaeovirus)、烟草线条病毒组(Ilarvirus)、甘薯轻型斑驳病毒属(Ipomovirus)、大麦黄矮病毒组(Luteovirus)、玉米退绿斑驳病毒属(Machlomovirus)、橙桑花叶病毒属(Macluravirus)、玉米雷亚多非纳病毒属(Marafivirus)、Monogeminivirus、矮缩病毒属(Nanavirus)、坏死病毒属(Necrovirus)、线虫传多角体病毒组(Nepovirus)、核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)、水稻病毒属(Oryzavirus)、Ourmiavirus、植物呼肠病毒(Phytoreovirus)、马铃薯X病毒组(Potexvirus)、马铃薯Y病毒组(Poteyvirus)、黑麦草花叶病毒属(Rymovirus)、卫星RNA、卫星病毒(satellivirus)、伴生病毒属(Sequivirus)、南方菜豆花叶病毒组(Sobemovirus)、纤细病毒属(Tenuivirus)、烟草花叶病毒组(Tobamovirus)、烟草脆裂病毒组(Tobravirus)、番茄丛矮病毒组(Tombusvirus)、番茄斑萎病毒属(Tospovirus)、发状病毒属(Trichovirus)、芜菁黄花叶病毒组(Tymovirus)、伞形植物病毒属(Umbravirus)、巨脉病毒属(Varicosavirus)及矮化病毒属(Waikavirus)；真菌病原体诸如黑粉菌(例如黑粉菌目(Ustilaginales))、锈菌(锈菌目(Uredinales))、麦角菌(Clavicepts pupurea)和霉；霉菌(卵菌纲(Oomycetes))，诸如马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)(马铃薯疫病)；细菌病原体，诸如欧文氏菌属(Erwinia)(例如草生欧文氏菌属(E.herbicola))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、丁香假单胞菌(P.syringae)、荧光假单胞菌(P.fluorescense)和恶臭假单胞菌(P.putida))、Ralstonia(例如R.solanacearum)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和黄单胞菌属(Xanthomonas)；线虫(线虫纲(Nematoda))；及Phytomyxea(Polymyxa和根种菌属(Plasmodiophora))。

所公开的用于靶向重组的方法可以用于用同源但不相同的序列替换任何基因组序列。例如，突变型基因组序列可以用其野生型对应物(counterpart)替换，由此提供了用于治疗植物疾病的方法；提供对植物病原体的抗性；提高作物产量等等。类似地，基因的一个等位基因可以用不同的等位基因替换，使用本文所公开的靶向重组方法进行。

在许多这些情况中，感兴趣区域包含突变，而供体多核苷酸包含相应的野生型序列。类似地，野生型基因组序列可以用突变型序列替换，如果想要这样的话。例如，可以逆转癌基因的过表达，这或是通过使该基因突变，或是通过用支持较低的、非病理性的表达水平的序列替换其控制序列来实现。确实，以任何方式依赖于特定基因组序列的任何病理可以使用本文所公开的方法和组合物来纠正或缓和。

靶向切割和靶向重组还可以用于改变非编码序列(例如调节序列，诸如启动子、增强子、起始子、终止子、剪接位点)以改变基因产物的表达水平。此类方法可以用于例如治疗目的、功能基因组学和/或靶标确认研究。

染色质结构的靶向修饰(正如共有的WO 01/83793所披露的)可以用于促进融合蛋白对细胞染色质的结合。

在别的实施方案中，在本文所公开的锌指-切割结构域融合物之外或代替本文所公开的锌指-切割结构域融合物，锌指结合结构域和重组酶(或其功能性片段)之间的一种或多种融合物可以用于促进靶向重组。参见例如共有的美国专利No.6,534,261及Akopian等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：8688-8691。

在别的实施方案中，所公开的方法和组合物可用于提供ZFP结合结构域与转录激活或阻抑结构域的融合物，所述转录激活或阻抑结构域的活性需要二聚化(或是同源二聚化或是异源二聚化)。在这些情况中，融合多肽包含锌指结合结构域和功能性结构域单体(例如来自二聚体转录激活或阻抑结构域的单体)。两个此类融合多肽与适当定位的靶位点结合容许进行二聚化，使得重建功能性转录激活或阻抑结构域。

此外，如上文所公开，本文所提出的方法和组合物可以用于将外源序列靶向整合入细胞基因组中感兴趣区域，例如其中切割经由同源性依赖性机制而增强插入(例如插入如下供体序列，其包含外源序列和一种或多种与预定基因组序列(即靶位点)或是相同的，或是同源但不相同的序列)。

典型地，供体序列在外源序列侧翼区域中含有足够的同源性以支持基因组序列中双链断裂的同源性指导的修复，由此在基因组靶位点插入外源序列。因此，供体核酸可以是足以支持通过同源性依赖性修复机制(例如同源重组)而整合外源序列的任何大小。在不希望被任何具体理论限制的前提中，认为外源序列侧翼的同源性区域给断裂的染色体末端提供了用于再合成双链断裂位点遗传信息的模板。在某些实施方案中，外源序列侧翼存在两个相同的序列或两个同源但不相同的序列(或每种一个)。外源序列(或外源核酸或外源多核苷酸)含有正常情况下不存在于感兴趣区域中的核苷酸序列。

例示性外源序列包括但不限于cDNA、启动子序列、增强子序列、表位标签、标志物基因、切割酶识别位点和各种类型的表达构建体。参见例如美国专利No.6,833,252。别的例示性归巢内切核酸酶包括I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII及I-TevIII。它们的识别序列是已知的。还可参见美国专利No.5,420,032；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等(1989)Gene82：115-118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22：1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280：345-353及New England Biolabs产品目录。

标志物基因包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列，编码有色的或荧光的或发光的蛋白质(例如绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、萤光素酶)，及介导增强的细胞生长和/或基因扩增的蛋白质(例如二氢叶酸还原酶)的序列。如此，例示性标志物基因包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT，BAR)、新霉素磷酸转移酶、β-内酰胺酶、儿茶酚双加氧酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、茅草枯脱卤素酶、及邻氨基苯甲酸合酶。在某些实施方案中，靶向整合可用于插入RNA表达构建体，例如负责微小RNA或siRNA的受调节表达的序列。RNA表达构建体中还可以掺入启动子、增强子或上文所述别的转录调节序列。

实施例

实施例1——靶载体的设计和生成

A.靶序列的总体结构

用于烟草(双子叶植物)的靶构建体包括以下7种构件，如图1所示：i)潮霉素磷酸转移酶(HPT)表达盒，其包含驱动由根癌土壤杆菌(A.tumifaciens)可读框-24(orf-24)3’非翻译区(UTR)(Gelvin等，1987，EP222493)所终止的大肠杆菌HPT基因(Waldron等，1985，Plant Mol.Biol.18：189-200)的拟南芥(A.thaliana)泛蛋白-3(ubi-3)启动子(Callis等，1990，J.Bio.Chem.265：12486-12493)；ii)同源序列-1，其包含烟草(N.tabacum)RB7基质附着区(MAR)(Thompson等，1997，WO9727207)；iii)5’绿色荧光蛋白(GFP)基因片段(Evrogen Joint Stock Company，Moscow，Russia)，其由经修饰的根癌土壤杆菌甘露碱合酶(Δmas)启动子(Petolino等，美国专利No.6,730,824)所驱动；iv)β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)表达盒，其包含驱动由根癌土壤杆菌胭脂碱合酶(nos)3’UTR(DePicker等，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)所终止的GUS基因(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)的木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子(Verdaguer等，1996，Plant Molecular Biology 31：1129-1139)；v)由根癌土壤杆菌orf-1 3’UTR(Huang等，J.Bacteriol.172：1814-1822)所终止的3’GFP基因片段(Evrogen Joint Stock Company，Moscow，Russia)；vi)同源序列-2，其包含拟南芥4-香豆酰-CoA合酶(4-CoAS)内含子-1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)；及vii)由根癌土壤杆菌ORF-25/263’UTR(Gelvin等，1987，EP222493)所终止的绿色产色链霉菌(S.viridochromogenes)膦丝菌素磷酸转移酶(PAT)(Wohlleben等，1988，Gene 70：25-37)3’基因片段。

将锌指-Fok1融合蛋白结合位点(IL-1-L0-Fok1)(Urnov等，2005，US2005/0064474)插入CsVMV启动子(Verdaguer等，1996，Plant MolecularBiology 31：1129-1139)下游，并与GUS编码序列(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)在N端融合。在5’和3’GFP基因片段(Evrogen Joint StockCompany，Moscow，Russia)侧翼有两拷贝的第二锌指-Fok1融合蛋白结合位点(Scd27-L0-Fok1)(Urnov等，2005，US 2005/0064474)。每个结合位点含有特定锌指-Fok1融合蛋白识别序列的四个串联重复，使得每个结合位点的大小为约200bp(图2a)。这种设计是为确保识别序列在复杂的染色质环境中会被锌指-Fok1融合蛋白所易接近。每个识别序列包括反向重复序列，单个锌指-Fok1融合蛋白以同二聚体形式结合至该反向重复序列并切割双链DNA(图2b)。5’和3’GFP基因片段交叠达540bp，这提供了靶序列内的同源性，并将终止密码子插在5’GFP片段的3’端以确保没有来自靶序列的功能性GFP翻译。如下文所述通过多步骤克隆方法来产生包含靶序列的转化载体。

B.HPT二元载体(pDAB 1584)的构建

将含有GUS表达盒的载体pDAB1400用作开始的基础构建体(图3)，所述GUS表达盒包含驱动由根癌土壤杆菌orf-1 UTR(Huang等，J.Bacteriol.172：1814-1822)所终止的GUS基因(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)的拟南芥ubi-3启动子(Callis等，1990，J.Bio.Chem.265：12486-12493)。

为了消除靶构建体中任何不必要的重复调节元件，用根癌土壤杆菌orf-24 UTR(Gelvin等，1987，EP222493)替换pDAB1400中的根癌土壤杆菌orf-1 UTR(Huang等，J.Bacteriol.172：1814-1822)，所述根癌土壤杆菌orf-24UTR作为SacI/XbaI片段切自pDAB782(图4)，并克隆入pDAB1400中的相同位点。所得的构建体含有驱动由根癌土壤杆菌orf-24 UTR(Gelvin等，1987，EP222493)所终止的GUS基因(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)的拟南芥ubi-3启动子(Callis等，1990，J.Bio.Chem.265：12486-12493)，并命名为pDAB1582(图5)。

使用引物P1和P2从pDAB354质粒(图6)PCR扩增HPT编码序列(Waldron等，1985，Plant Mol.Biol.18：189-200)。在引物P1的5’端添加BbsI位点，而在引物P2的3’端保留SacI位点。将HPTII PCR片段用BbsI/SacI消化，并克隆入经NcoI-SacI消化的pDAB1582中，以用来自PCR片段的HPT基因替换GUS基因。所得的质粒命名为pDAB1583(图7)。

然后通过NotI消化从pDAB1583中切除拟南芥ubi-3/HPT/根癌土壤杆菌orf-24片段，并用T4DNA聚合酶处理以产生平末端。将经过末端补平处理的HPT表达盒在PmeI位点克隆入pDAB2407(图8)(一种二元基础载体)，产生质粒pDAB1584(图9)。

C.包含同源序列和Scd27锌指-Fok1融合蛋白结合位点的载体 (pDAB1580)的构建

用根癌土壤杆菌orf25/26 UTR(Gelvin等，1987，EP222493)替换pDAB2418(图10)中的根癌土壤杆菌orf-1 UTR(Huang等，J.Bacteriol.172：1814-1822)，以消除靶载体中的重复调节序列。为了进行UTP交换，使用引物P3和P4从pDAB4045质粒(图11)中PCR扩增根癌土壤杆菌orf25/26UTR(Gelvin等，1987，EP222493)。在PCR片段的3’端添加SmaI和AgeI位点，而在5’端保留SacI位点。将pDAB2418质粒DNA用SacI和AgeI消化，并回收两种最大的片段，所述pDAB2418质粒DNA含有PAT基因表达盒(其包含驱动由根癌土壤杆菌orf-1 UTR(Huang等，J.Bacteriol.172：1814-1822)所终止的PAT基因(Wohlleben等，1988，Gene 70：25-37)的拟南芥泛蛋白-10(ubi-10)启动子(Callis等，1990，J.Biol.Chem.265：12486-12493))和烟草RB7 MAR序列(Thompson等，1997，WO9727207)。将这些片段与经SacI和AgeI消化的根癌土壤杆菌orf25/26UTR(Gelvin等，1987，EP222493)PCR片段连接。所得的质粒命名为pDAB1575(图12)。烟草RB7MAR(Thompson等，1997，WO9727207)充当靶载体中的同源序列-1。

选择拟南芥4-CoAS的内含子-1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)充当靶载体中的同源序列-2。对PAT基因(Wohlleben等，1988，Gene 70：25-37)编码序列进行了分析，并将起始密码子下游299/300bp处鉴定为用于插入内含子的位点，使得会形成合适的5’和3’剪接位点。然后通过DNA合成(PicoscriptLtd.，LLP，Houston，Texas)将全长内含子与253bp的3’部分PAT编码序列融合在一起。分别将NotI和SacI位点添加至DNA片段的5’和3’端。然后将合成的DNA片段用NotI/SacI消化，并在相同位点插入pDAB1575以替换全长PAT编码序列。所得的构建体命名为pDAB1577(图13)。

对含有Scd27-L0-Fok1的4个串联重复(图2)的241bp DNA片段进行合成(Picoscript Ltd.，LLP，Houston，Texas)，其中将SmaI位点添加至该片段的5’和3’端。然后将合成的含锌指-Fok1结合位点的片段用SmaI消化，并在MscI位点插入pDAB 1577。所得的载体命名为pDAB 1579(图14)。然后将第二个经SmaI消化的含锌指-Fok1结合位点的片段在SwaI位点插入pDAB1579。所得的构建体命名为pDAB1580(图15)。该载体包含同源序列1和2(分别是烟草RB7MAR和拟南芥4-CoAS内含子1)及两个合成的Scd27锌指-Fok1结合位点(各含有Scd27-L0-Fok1识别位点的4个串联重复)。

D.包含两个部分重复的非功能性GFP片段的载体(pDAB1572)的构建

GFP基因CopGFP购自Evrogen Joint Stock Company(Moscow，Russia)，并使用引物P5和P6来PCR扩增全长编码序列。分别将BbsI和SacI位点添加至PCR产物的5’和3’端。然后将CopGFP PCR产物用BbsI/SacI消化，并在NcoI/SacI位点克隆入pDAB3401(图16)(其包含驱动由根癌土壤杆菌orf-13’UTR(Huang等，J.Bacteriol.172：1814-1822)所终止的GUS基因(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)的经修饰根癌土壤杆菌Δmas启动子(Petolino等，US6730824))以替换GUS基因。所得的载体命名为pDAB1570(图17)。

为了制备两种部分重复的非功能性GFP片段，使用引物P9和P10来PCR扩增如下DNA片段，该DNA片段含有在5’端有47bp删除的CopGFP编码序列的大部分。将ApaI位点添加至5’和3’两端，并且将额外的StuI位点添加至5’端且在ApaI位点的下游。然后将PCR产物用ApaI消化，并在ApaI位点插入pDAB 1570，由此在相同的载体中产生具有540bp重复的两个非功能性GFP片段。所得的构建体命名为pDAB1572(图18)。

E.包含IL-1锌指-Fok1融合蛋白结合位点/GUS基因融合物的载体 (pDAB1573)的构建

由Picoscript Ltd.，LLP，(Houston，Texas)合成包含IL-1L0-Fok1识别位点的4个串联重复(图2)的233bp DNA片段，其中分别将NcoI和AflIII位点添加至5’和3’末端。然后将合成的片段用NcoI/AflIII消化，并在NcoI位点插入pDAB4003(图19)，其包含由CsVMV启动子(Verdaguer等，1996，PlantMolecular Biology 31：1129-1139)所驱动、由根癌土壤杆菌orf-13’UTR(Huang等，J.Bacteriol.172：1814-1822)所终止的GUS基因(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)。然后产生IL-1_L0-Fok1结合位点和GUS编码序列之间的N端融合物。所得的载体命名为pDAB1571(图20)。

为了消除靶载体中的重复3’UTR元件，将根癌土壤杆菌nos 3’UTR(DePicker等，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)作为SacI/PmeI片段从pDAB7204(图21)中切出，并克隆入经SacI/NaeI消化的pDAB1571以替换根癌土壤杆菌orf-13’UTR(Huang等，J.Bacteriol.172：1814-1822)。所得的质粒命名为pDAB1573(图22)。

F.最终的靶载体(pDAB1585)的构建

为了构建最终的靶载体，通过NotI消化从pDAB 1573中切出具有IL-1-Fok1融合蛋白靶位点插入的GUS表达盒，补平末端，并在StuI位点插入pDAB1572。所得的中间载体命名为pDAB1574(图23)。从pDAB1574中切出完整的盒，并在NotI位点插入pDAB1580，所述完整的盒包含经修饰的Δmas启动子(Petolino等，US6730824)、5’部分重复GFP序列(Evrogen Joint StockCompany，Moscow，Russia)、CsVMV启动子(Verdaguer等，1996，PlantMolecular Biology 31：1129-1139)、IL-1-Fok1融合蛋白靶序列、GUS基因(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)编码区、根癌土壤杆菌nos 3’UTR(DePicker等，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)、3’部分重复GFP(Evrogen Joint Stock Company，Moscow，Russia)、及根癌土壤杆菌orf-1 3’UTR(Huang等，J.Bacteriol.172：1814-1822)。所得的质粒命名为pDAB1581(图24)。然后将pDAB1581的AgeI片段在AgeI位点插入pDAB1584，由此产生最终的靶构建体pDAB1585(图1)。

实施例2——具有整合的靶序列的转基因细胞系的生成

使用两种不同的烟草细胞悬浮培养物，所述烟草细胞中经由土壤杆菌属转化而稳定整合有实施例1的靶序列。称为NT1的第一培养物获自ArnoldBendich(University of Washington，Seattle，WA，USA)。该培养物在20-30个细胞簇(cell cluster)中增殖为15-20μ直径的细胞，其中倍增时间为大约48小时。将NT1细胞悬浮培养物维持在含有下列成分的培养基中：MS基础盐类(PhytoTechnology Labs M524)、137.4mg/L K₂HPO₄、30g/L蔗糖、2.22mg/L2，4-D、1mg/L盐酸硫胺素、100mg/L肌肉-肌醇及0.5g/L MES，pH 5.7。通过添加40mL新鲜的基于MS的培养基(MS-based medium)至1mL压紧的细胞体积(packed cell volume，PCV)来每7天对NT1细胞进行传代培养。

使用的第二烟草细胞培养物(其称为BY2)获自Jun Ueki(Japan Tobacco，Iwata，Shizuoka，Japan)。该培养物在100-150个细胞簇(cell cluster)中增殖为5-10μ直径的细胞，其中倍增时间为大致18小时。将BY2细胞悬浮培养物维持在含有下列成分的培养基中：LS基础盐类(PhytoTechnology Labs L689)、170mg/L KH₂PO₄、30g/L蔗糖、0.2mg/L 2，4-D及0.6mg/L盐酸硫胺素，pH 6.0。通过添加50mL新鲜的基于LS的培养基(LS-based medium)至0.25mL PCV来每7天对BY2细胞进行传代培养。将NT1和BY2细胞悬浮培养物两者维持在旋转式摇瓶机(25℃，125RPM)上的250mL烧瓶中。

为了产生具有整合的靶序列的转基因NT1和BY2细胞培养物，将一瓶传代培养后4天的烟草悬浮液分成10-12份4mL的等分试样，将其与100μL过夜培养至OD₆₀₀约1.5的包含pDAB1585的土壤杆菌菌株LBA4404共培养于100x25mm培养皿中。将各皿用石蜡封口膜包裹，并在25℃在不进行摇动的情况下温育3天，之后，将过量的液体除去，并用11mL含有500mg/L羧苄青霉素的基础培养基(对于NT1和BY2分别为基于MS或基于LS的培养基)替换。

使烟草细胞重悬浮后，将1mL悬浮液分配至用8g/L TC琼脂固化的、含有500mg/L羧苄青霉素和200mg/L潮霉素的适当基础培养基的100x25mm平板上，并在28℃以未包裹形式在黑暗中温育。一次处理产生120-144块选择平板。在铺板后10-14天出现各个潮霉素抗性分离群(isolate)(表1)，并将其转移至各个60x20mm平板(每块平板一个分离群)，其中按照14天传代培养日程表将它们以胼胝体形式维持，直至需要用于分析和随后的再转化实验。

表1：转基因靶细胞培养物生成的汇总表

烟草细胞培养物	选择平板的数目	转基因事件的数目
烟草细胞培养物	选择平板的数目	转基因事件的数目	NT1	360	305
BY2	720	551	NT1	360	305

实施例3——靶转基因事件的筛选和表征

对自靶载体转化入BY2或NT1烟草细胞培养物所产生的潮霉素抗性转基因事件(如实施例2所述)进行如下分析。

为了筛选这些转基因事件而进行的最初分析包括GUS表达分析以表明靶序列的可接近性、部分和全长靶序列的PCR分析以证实靶载体的存在和完整性、及Southern印迹分析以测定所整合的靶序列的拷贝数。显示GUS表达的转基因事件的一个子集包含一个单拷贝的全长靶序列；对它们选择重建悬浮培养物以产生供随后再转化用的靶系。这些重建的靶系还经历进一步的表征，其包括更全面的Southern印迹分析、整个靶插入物的测序确证、及侧翼基因组序列分析。

对自所选事件启动的转基因烟草胼胝体组织或悬浮培养物如下分析GUS活性，即将50mg样品在150μL测定缓冲液中在37℃温育24-48小时。测定缓冲液包含0.2M磷酸钠pH 8.0、各0.1mM的铁氰化钾和亚铁氰化钾、1.0mM钠盐EDTA、0.5mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸和0.6％(v/v)TritonX-100(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)。将蓝色有色区域的出现用作GUS基因表达的指示物，其表明靶序列插入是具有转录活性的，因此在局部的基因组环境中是可接近的。

通过使用引物对P15/P16的PCR来对表达GUS的转基因事件进行测定，所述使用引物对P15/P16的PCR导致从靶序列5’端的HTP表达盒的3’UTR延伸至靶序列3’端的部分PAT基因盒的3’UTR的10kb DNA片段扩增。因为所有的事件都是在潮霉素选择下获得的，因此认为HPT表达盒在所有靶事件中都是完整的。因此，全长PCR分析中仅覆盖HPT表达盒的3’UTR。还对事件的一个子集使用引物对P15/P17和P18/P19进行PCR测定以分别测定靶序列的5’和3’端的完整性。通过Southern印迹分析对所有经PCR分析证实的靶事件进行进一步测定以测定所整合的靶序列的拷贝数。

对所有通过GUS表达和全长PCR筛选的靶事件实施Southern印迹分析。将10μg基因组DNA用靶序列内唯一的切割者NsiI消化。将经消化的基因组DNA在0.8％琼脂糖凝胶上分开，并转移至尼龙膜上。在交联后，用HPT基因探针来杂交所述膜上的转移DNA以测定靶序列的5’端的拷贝数。然后将相同的印迹剥离，并与PAT基因探针再杂交以测定靶序列的3’端的拷贝数。

选择三个显示了GUS表达并含有单拷贝全长靶序列的事件用于进一步表征，其包括更全面的Southern印迹分析、整个靶序列确证、及侧翼基因组序列分析(表2)。这三个事件是BY2-380、NT1-240及NT1-260。从这三个事件重建悬浮培养物，用于随后的使用包含供体DNA和锌指-Fok1融合蛋白基因的载体进行的再转化。

为了确保自靶事件BY2-380、NT1-240及NT1-260建立的三种悬浮培养物包含预期的完整靶序列，使用引物对P15/P16将主要靶序列(从靶序列5’端的HPT表达盒的3’UTR至靶序列3’端的部分PAT基因盒的3’UTR)进行PCR扩增，并克隆入pCR2.1 TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，California)。TOPO载体中插入的PCR产物由Lark technology，Inc.(Houston，Texas)进行测序。序列结果表明，虽然BY2-380和NT1-240都具有预期的完整靶序列，但NT1-260具有5475bp的DNA插入。插入位于3’部分PAT序列的3’端下游27bp。有趣地，在该插入中有2883bp的orf。该orf针对NBCI数据库的BLAST搜索显示，其与来自土壤杆菌属的转座子匹配。虽然这种靶系即NT1-260可能由于PAT选择标志基因内的额外插入序列而不适于染色体间同源重组实验，但它仍可以用于测试使用靶载体中设计的GFP报道系统的染色体内同源重组。

使用通用GenomeWalker试剂盒(Clontech，Mountain View，California)来对所有三种系进行进一步分析以获得侧翼基因组序列。简言之，在分开的反应中使用三种平端限制酶EcoRV、DraI及StuI来消化2.5μg的基因组DNA。将经消化的DNA通过酚/氯仿抽提来纯化，并与BD GenomeWalker衔接物连接。实施嵌套式PCR扩增，其中该连接作为模板且引物P20(在靶序列插入的5’端上游步行)和P21(在靶序列插入的3’端下游步行)用于一级PCR反应，而引物P22(在靶序列插入的5’端上游步行)和P23(在靶序列插入的3’端下游步行)用于二级嵌套式PCR反应。将来自二级PCR反应的扩增片段克隆入pCR2.1 TOPO或pCR Blunt II TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，California)，并使用染料终止物循环测序试剂盒(Dye Terminator Cycle Sequencing Kit，Beckman Coulter，Fullerton，CA)来测序。

实施例4——供体DNA载体的设计和生成

供体DNA构建体包括同源序列-1(烟草RB7MAR)(Thompson等，1997，WO9727207)、全长拟南芥ubi10启动子(Callis等，1990，J.Biol.Chem.265：12486-12493)、299bp的5′部分PAT基因编码序列(Wohlleben等，1988，Gene70：25-37)及同源序列-2(拟南芥4-CoAS内含子-1)(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)。供体载体中的同源序列-1和序列-2两者与靶载体(pDAB 1585)中相应的同源序列-1和序列-2是相同的。

为了构建供体载体，通过Picoscript Ltd.，LLP，(Houston，Texas)进行的DNA合成来将299bp的5’部分PAT编码序列与全长拟南芥4-CoAS内含子-1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)融合。分别将NcoI和XhoI位点添加至该片段的5’和3’端。然后将该合成的DNA片段用NcoI/XhoI消化，并在相同位点插入pDAB1575以替换全长PAT基因编码序列及其3’UTR。所得的构建体命名为pDAB1576(图25)。

然后将pDAB1576用AgeI进行消化，并将包含侧翼为同源序列-1和同源序列-2的5’部分PAT表达盒的整个片段在相同位点插入pDAB2407(一种二元基础载体)。所得的构建体命名为pDAB1600，并且是供植物细胞再转化用的供体载体的二元型式(图26)。经由这种方法从所有的三种靶系中获得侧翼基因组序列。然后基于侧翼基因组序列设计引物，并用于扩增整个靶序列。从这些靶系中获得的扩增片段具有预期的大小。通过测序来证实扩增片段的两末端。

实施例5——锌指核酸酶表达载体的设计和生成

锌指-Fok1融合蛋白基因由CsVMV启动子和5’UTR所驱动(Verdaguer等，1996，Plant Molecular Biology 31：1129-1139)。该盒中还包含的是烟草渗透蛋白5’和3’UTR(Merlo等，US2005102713)。为了制备这些载体，将包含驱动pDAB7002(图27)中PAT的CsVMV启动子和5’UTR的HindIII/SacI片段用包含驱动GUS的CsVMV启动子和5’UTR和烟草5’UTR的片段(其是用HindIII/SacI从pDAB7025(图28)中切出的)替换。所得的质粒命名为pDAB1591(图29)。

分别使用引物对P11/P12和P13/P14将IL1-L0-Fok1和Scd27-L0-Fok1编码序列从它们最初的载体pCDNA3.1-IL1-L0-FokI(图30)和pCDNA3.1-SCD27a-L0-FokI(图31)中PCR扩增。分别将BbsI和SacI位点添加至这些PCR片段的5’和3’端。通过SacI/NcoI克隆用锌指融合蛋白基因PCR片段替换pDAB 1591中的PAT基因。用于IL-1-Fok1和Scd27-Fok1的所得质粒分别命名为pDAB1592(图32)和pDAB1594(图33)。

如下构建这些载体的二元型式，即将锌指融合蛋白基因表达盒作为PmeI/XhoI片段从pDAB1592和pDAB1594中切出，补平末端，并在PmeI位点克隆入pDAB2407(图34A)。用于IL-1ZFN和Scd27 ZFN的所得质粒分别命名为pDAB1596(图34B)和pDAB1598(图34C)，并且是锌指融合蛋白基因载体植物细胞再转化的二元型式。

实施例6——阳性对照载体的设计和生成

为了评估不合理(illegitimate)重组频率并充当阳性对照，使用含有PAT基因表达盒的载体。为了可与最终的重组体进行比较，在PAT编码序列(Wohlleben等，1988，Gene 70：25-37)的299/300bp处插入拟南芥4-CoAS内含子-1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)。为了制备这种构建体，将来自pDAB 1576的2559bp SwaI/ClaI片段连接经相同限制酶消化的pDAB 1577(图35)的主链片段。所得的载体包含PAT基因表达盒且其在PAT编码序列(Wohlleben等，1988，Gene 70：25-37)中间有1743bp的拟南芥4-CoAS内含子-1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)插入。该载体命名为pDAB 1578(图36)。

为了制备pDAB 1578的二元型式，用PmeI/XhoI从pDAB 1578中切出具有拟南芥内含子-1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)的PAT基因表达盒。在对该片段的3’端进行补平末端处理后，将其在PmeI位点插入二元基础载体pDAB2407。所得的载体命名为pDAB1601(图37)，其包含由拟南芥ubi10启动子(Callis等，1990，J.Biol.Chem.265：12486-12493)所驱动的且由根癌土壤杆菌orf25/263’UTR(Gelvin等，1987，EP222493)所终止的包含拟南芥4-CoAS内含子-1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)的PAT基因(Wohlleben等，1988，Gene 70：25-37)。

实施例7——用锌指核酸酶基因和供体DNA序列再转化靶细胞培养物

选择三种独立的、潮霉素抗性的、转基因细胞培养物(NT1-240、NT1-260和BY2-380)(各包含单个全长整合拷贝的靶序列)并用于再启动悬浮培养，即将约250-500mg的胼胝体组织放入40-50mL含有100mg/L潮霉素的基础培养基(供NT1用的基于MS的培养基或供BY2用的基于LS的培养基)，并如上文所述每7天进行转代培养。在再转化前，将悬浮培养物转移到不含潮霉素的基础培养基。

如上文所述实施土壤杆菌属介导的靶细胞培养物转化。对于每个实验，如下产生10块共培养平板：一块平板包含与100μL包含pDAB1600(供体DNA)的土壤杆菌菌株共培养的细胞；一块平板包含与100μL包含pDAB 1601(PAT选择标志)的土壤杆菌菌株共培养的细胞；四块平板包含与50μL包含pDAB 1600(供体DNA)的土壤杆菌菌株和250μL包含pDAB 1596(IL-1ZFP-Fok1)的土壤杆菌菌株共培养的细胞；且四块平板包含与50μL包含pDAB 1600(供体DNA)的土壤杆菌菌株和250μL包含pDAB 1598(Scd 27aZFP-Fok1)的土壤杆菌菌株共培养的细胞。在使用上文所述方法进行共培养后，将细胞铺于含有500mg/L羧苄青霉素和用于NT1的10mg/L

或用于BY2的15mg/L

的基础培养基(供NT1用的基于MS的培养基或供BY2用的基于LS的培养基)上。在铺板后2-4周出现各个

抗性分离群，并将其转移至各个60x20mm平板(每块平板一个分离群)，其中按照14天传代培养日程表将它们以胼胝体形式维持，直至需要用于分析。

表3：用锌指-Fok1融合蛋白基因和供体DNA再转化靶细胞培养物的汇总表

实施例8——同源重组的证实

A.染色体间同源重组

针对实施例1至7所述例示性烟草系统中进行的锌指-Fok1融合蛋白促进的染色体间同源重组开发和测试两种策略。

策略1中，靶构建体(图37)中间包括锌指-Fok1融合蛋白结合位点(IL-1-L0-Fok1)。在该策略中，结合位点侧翼均为约3kb的非同源序列，接着上游和下游分别为同源序列-1(烟草RB7 MAR)和同源序列-2(拟南芥4-CoAS内含子-1)(图38)。假定在IL-1锌指-Fok1融合蛋白存在下，IL-1-L0-Fok1结合序列会被识别，并且双链DNA断裂会在该特定位点被诱导，这会刺激内源DNA修复过程。在供体DNA(其包含的同源序列与靶序列中的同源序列相同)存在下，5’部分PAT基因及其启动子会通过同源重组来替换靶物中同源序列间的全部约6kb DNA片段。通过这种方法，两个部分PAT基因序列(拟南芥4-CoAS内含子-1插入其间)会重建功能性PAT基因，导致PAT表达和除草剂抗性表型。

策略2中，靶载体中包括两个锌指-Fok1结合位点(Scd27-L0-FokI)：一个直接位于烟草RB7MAR下游，而另一个直接位于拟南芥4-CoAS内含子-1上游(图39)。两个锌指-Fok1融合蛋白结合位点之间的是约6kb的序列，其包括5’GFP片段、GUS表达盒和3’GFP片段。假定在Scd27锌指-Fok1融合蛋白存在下，两个结合序列会被识别，并且双链DNA断裂会在两个位置被诱导，这会除去这两个结合序列之间的约6kb DNA片段，并刺激内源DNA修复过程。与策略1类似，在供体DNA(其包含的同源序列与靶序列中的同源序列相同)存在下，5’部分PAT基因及其启动子会通过在诱导双链DNA断裂的位点处进行的同源重组而被插入靶序列。通过这种方法，两个部分PAT基因序列(及插入其间的拟南芥4-CoAS内含子-1)会重建功能性PAT基因，导致PAT表达和除草剂抗性表型。

首先通过使用引物对P24/25的PCR对除草剂(

)选择后获得的所有分离群进行分析，所述使用引物对P24/25的PCR扩增跨越重建的PAT基因的DNA片段。引物P24与供体DNA中PAT编码序列的5’端是同源的，而引物P25与靶DNA中PAT编码序列的3’端是同源的。若两个部分PAT编码序列通过同源重组来连接，则会产生2.3kb PCR片段。如图40所示，从所分析的许多分离群中获得2.3kb PCR片段。从IL-1锌指-Fok1融合蛋白基因/供体DNA的共转化和Scd27锌指-Fok1融合蛋白基因/供体DNA的共转化两者中获得这些分离群。将来自多个独立分离群(其代表自IL-1锌指-Fok1和Scd27锌指-Fok1融合蛋白基因转化两者衍生的分离群)的2.3kb PCR产物从琼脂糖凝胶中纯化，并克隆入pCR2.1TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，California)。然后使用染料终止物循环测序试剂盒(Beckman Coulter)对TOPO载体中插入的2.3kbPCR产物进行测序。测序结果证实，TOPO载体中克隆的所有PCR产物包含预测的重组序列，其包括5’和3’部分PAT基因序列以及插入的烟草4-CoAS内含子-1。这些结果证实了经由锌指-Fok1融合蛋白基因表达所发生的所测试的两种策略的预测染色体间重组及所扩增的基因靶向。

通过使用引物对P26/P25的PCR对一对样品进行进一步分析，所述使用引物对P26/P25的PCR扩增贯穿整个重组区域的DNA片段。引物P26与靶序列中HPT基因编码区的3’端是同源的，而引物P25与靶序列中PAT基因编码区的3’端是同源的。若靶序列和供体DNA之间发生同源重组，则会获得预期的5.2kbPCR产物。非重组靶物会产生约10kb的PCR产物。从所分析的两个样品中获得5.2kb PCR产物。将来自分析样品之一的5.2kb PCR产物从琼脂糖凝胶中纯化，克隆入pCR2.1TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，California)。然后使用染料终止物循环测序试剂盒(Beckman Coulter，Fullerton，CA)对该PCR产物进行测序。测序结果证实，该PCR产物包含重组序列，其包括(从5’至3’)：HPT编码区的3’端(来自靶序列)、拟南芥orf-243’UTR(来自靶序列)、烟草RB7MAR(同源序列-1)、拟南芥ubi-10启动子(来自供体DNA)、5’部分PAT基因(来自供体DNA)、拟南芥4-CoAS内含子-1(同源序列-2)、3’部分PAT基因(来自靶序列)。该结果进一步证实，PCR产物源自染色体间同源重组。

为了在基因组水平进一步分析重组体，实施Southern印迹分析，其中一组22个分离群选自IL-1锌指-Fok1融合蛋白基因/供体DNA转化和Scd27锌指-Fok1融合蛋白基因/供体DNA转化两者。通过PCR分析证实所有样品为重组体。用BanII消化来自每个样品的10μg基因组DNA。将经消化的基因组DNA在0.8％琼脂糖凝胶上分离，并转移至尼龙膜上。在该膜上进行交联后，将DNA与3’PAT探针杂交。期望的重组体会产生2079bp的条带，而非重组靶序列会产生3018bp的条带。结果显示，22个分析样品中18个样品具有约2kb的期望大小的条带，这表明这些事件是通过在两个部分PAT片段附近进行的同源重组而衍生的(图41)。两个样品展现一条非期望大小的条带(与靶物对照相比一个更大而一个更小)，这表明这两个样品中进行的重组不是完全同源性依赖的或者在重组期间或重组后发生了别的序列重排。另外2个样品显示一条与靶物对照(约3kb)相同的条带，表明这些样品或是逃脱除草剂选择或是细胞的混合群体，其中仅有小部分衍生自同源重组且低于Southern印迹分析的检测水平。最可能是后一种情况，因为这些样品在使用PCR进行分析时显示与同源重组相对应的期望的扩增产物。显示期望重组条带的18个样品中，4个样品还具有与靶物对照具有相同大小的别的条带，表明这些样品代表其中一些细胞未重组的细胞混合群体。另外4个样品具有各种大小的别的条带，表明这些样品是包含一些经历了非同源性依赖性事件的细胞的遗传嵌合体。总体上，通过Southern印迹分析证实，22个样品中的10个经历了预测的同源重组，至少在两个部分PAT片段中所牵涉的区域中发生。

B.染色体内同源重组

为了测试锌指-Fok1促进的染色体内同源重组，图42所述靶载体中包括两个具有540bp交叠序列的非功能性GFP片段。GUS基因表达盒在这两个片段之间。将IL-1-Fok1融合蛋白结合序列与GUS编码序列在其N端融合。假定在IL-1-Fok1融合蛋白存在下，IL-1 ZFN结合序列会被识别，并且双链DNA断裂会被诱导，这会刺激内源DNA修复过程。在没有供体DNA存在下，两个部分同源的GFP片段会经历染色体内同源重组过程，并且功能性GFP基因会被重建。

通过上述土壤杆菌属介导的转化，用质粒pDAB1596(IL-1-Fok1融合蛋白基因二元载体)转化两种靶系BY2-380和NT1-260。将供体DNA(pDAB1600)和PAT对照DNA(pDAB1601)两者作为分开的对照处理包括在内。转化后将细胞铺于非选择培养基上。转化后约5-8天，所组建的功能性GFP基因的明显表达导致可见荧光。如表4中所总结，在每个用IL-1-Fok1融合蛋白基因构建体(pDAB1596)转化的平板中观察到约50个荧光位点。在试验的两种靶系之间没有观察到显著差异。在用供体DNA或PAT基因构建体转化的阴性对照中没有观察到超过微弱背景的可觉察荧光。

表4：通过IL-1-Fok1锌指融合蛋白刺激的染色体内同源重组构建功能性GFP

为了证实绿色荧光位点源自功能性GFP基因的重建，对表达GFP的组织实施分子分析。因为所有细胞铺在非选择性培养基上，所以难以获得关于GFP表达为均质的细胞群体。将许多发荧光的组织区段从该平板中分离(借助于解剖显微镜)，并通过数代选择性传代培养来富集。从这些在视觉上看富集的组织中分离基因组DNA，并将其通过使用引物对P27/P28的PCR来测定。引物P27与靶DNA序列中5’部分GFP片段的5’端是同源的，而引物P28与靶DNA序列中3’部分GFP片段的3’端是同源的。若已经通过这两个部分GFP片段之间进行的染色体内同源重组而将GFP基因重建，则会获得预测的0.6kbPCR产物。非重组的靶物会产生4.1kb的PCR产物。如图43中所示，从发荧光的组织所富集的所有样品具有预测的0.6kb PCR产物，表明在这些组织中重建了功能性GFP基因。在所有这些富集的样品中还观察到第二种4.1kb PCR产物，表明存在非重组的细胞群体。这在预料之中，因为这些样品仅通过将荧光用作指示物的视觉选择来富集。将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离，转移至尼龙膜上，并使用GFP基因编码序列来探查。结果表明两种PCR产物即0.6kb和4.1kb包含GFP序列，由此证实荧光源自重建的GFP基因的表达。

实施例9——靶向单子叶植物中基因的锌指-Fok1融合蛋白的设计

如下设计并合成用于促进单子叶植物(例如玉米、高粱、小麦、大麦、水稻)中同源性指导的修复的锌指核酸酶。选择感兴趣基因，该基因优选包括至少一个可以作为氨基酸替换靶物的密码子。克隆所选基因的相关部分，并测定该克隆的核苷酸序列。

扫描如此获得的序列(任选地，使用包含各个锌指及其靶位点的列表和/或2指组件及其靶位点的列表的电脑程序)以寻找由5-6个核苷酸对所分隔的一对靶序列，其中每个靶序列可以被3、4、5或6个指的锌指蛋白所结合。参见例如美国专利No.6,785,613；WO 98/53057；WO 01/53480及美国专利申请公开文本No.2003/0092000。别的ZFP设计方法披露于例如美国专利5,789,538；6,013,453；6,410,248；6,733,970；6,746,838；6,785,613；6,866,997；7,030,215；WO 01/088197；WO 02/099084；及美国专利申请公开文本2003/0044957；2003/0108880；2003/0134318及2004/0128717。

对于在先前步骤中所鉴定的每种靶序列，合成编码FokI切割半结构域和能与该靶序列结合的锌指蛋白之间的融合物的基因。参见例如美国专利No.5,436,150；WO 2005/084190及美国专利申请公开本文No.2005/0064474。然后对每种融合蛋白测试它结合其靶序列所具有的亲和力，这使用例如Bartsevich等(2003)Stem Cells 21：632-637所述ELISA测定法进行。具有超过预定阈值的靶序列结合亲和力的蛋白质在基于细胞的报道测定法中接受进一步的测试。

任选地，可以对一种或多种上述融合蛋白的结合特异性进行评估，并在需要时进行改进，其使用记载于美国专利No.6,794,136的方法进行。

如在例如Urnov等(2005)Nature 435：646-651和美国专利申请公开文本No.2005/0064474中所述的那样进行基于细胞的测试。简言之，将如上文所述鉴定的靶序列对插入合适细胞系中在多西环素诱导型启动子转录控制下的缺陷型染色体绿色荧光蛋白(GFP)基因中。用编码两种锌指/FokI融合蛋白(其中每种能结合靶序列之一)的核酸及用包含如下序列的核酸转染细胞，所述序列如果其充当缺陷型染色体GFP基因的同源性指导的修复的模板，会重建功能性GFP基因。可以在使用多西环素诱导后通过荧光激活细胞分选术对发生了同源性指导的修复的细胞进行鉴定和定量。

实施例10——用于单子叶植物的供体DNA载体的设计和生成

供体DNA构建体包括所选基因的编码序列(CDS)和CDS上游和/或下游的基因组序列。CDS和/或基因组序列获自美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库和/或植物基因组数据库(Plant Genome Database)。部分序列和已知序列之间的“重叠群”(contig)匹配可以用于证实该序列衍生自所选单子叶植物基因组中的相同基因座。为了避免锌指核酸酶结合序列在重组后被重复切割，还可以在供体DNA中锌指核酸酶(ZFN)结合序列内进行两个单核苷酸突变(其不引起所编码氨基酸序列中的变化)。所述突变之一或两者可以产生便于下游分子表征的限制酶位点。

为了构建供体DNA载体，使用合适的引物从所选单子叶植物基因组DNA中PCR扩增出覆盖一些CDS和下游序列的DNA片段。优选分别将限制性位点(例如SacI和BamHI位点)添加至PCR片段的5’和3’端。将PCR产物克隆入pCR Blunt II TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，California)。

可以使用

定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，California)通过替换一个或多个所选核苷酸在想要的位置导入突变。如上文所记录，还可以使用

定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，California)以相似的方式在锌指-Fok1结合序列中导入别的单沉默突变(例如2处、3处或更多单突变)。通过合适的消化从pCR Blunt II TOPO载体中分离具有替换突变和别的沉默单突变的PCR片段，并在相同的位点将其克隆入pSB11(图44)。然后将所得的质粒DNA转化入包含pSB1质粒(图45)的土壤杆菌菌株以通过同源重组来形成供植物细胞转化用的超二元供体载体(super-binary donorvector)。

实施例11——供转化用的单子叶植物锌指-Fok1融合蛋白基因载体的设计和生成

锌指-Fok1融合蛋白基因由合适的单子叶植物启动子(例如玉米(Z.mays)ubi1启动子(Quail等，US5614399))驱动。该盒还可以包括玉米过氧化物酶-5(per5)3’UTR(Ainley等，WO9856921)。为了制备这种载体，通过NcoI/SacI消化将锌指-Fok1融合蛋白基因从其最初来源载体中分离，并在相同位点克隆入pDAB3872(图46)。通过HindIII/MscI消化将包括玉米ubi-1启动子、锌指-Fok1融合蛋白基因和玉米per-53’UTR的表达盒从上面制备的中间载体中分离，并在HindIII/PmeI位点插入pSB11。然后将所得的质粒转化入包含pSB1质粒的土壤杆菌菌株以通过同源重组来形成超二元载体pDAB4365(图47)。pDAB4365是供植物细胞转化用的锌指-Fok1融合蛋白基因表达载体的超二元型式。

实施例12——用锌指核酸酶基因和供体DNA转化玉米细胞并产生细胞培养物

可以将‘High II’F1杂交的种子(Armstrong等，1991，Maize Genet.Coop.News Lett.65：92-93)直接种植到含有商品化土壤混合物(soil mix)(ConradFafard，Inc.，Springfield；Soil Mix#3)的5加仑罐中。将植物培养于温室中，其中16小时光周期由导致约1,500英尺-烛光照度的高压钠和金属卤化物灯组合补充。将白天和黑夜温度维持在27/20±2℃。在需要时用标准肥料池混合物(standard fertilizer tank mix)给植物浇水。

为了获得未成熟的胚，可以实施受控授粉(近缘授粉或自花传粉)。通过在传粉前一天修剪穗丝来将花开期的植物准备用于授粉，由此产生穗丝的全刷(full brush)以使受精和结籽最大化。授粉当天，将主动脱落的雄穗装入袋中，收集新鲜的花粉并小心地施加到穗丝上。在发育中的胚达到1.0-1.2mm大小时(授粉后9-10天)，可以穗切下并进行表面灭菌。简言之，使穗浸没在70％乙醇中达2-5分钟，在20％商品化漂白剂(0.1％次氯酸钠)中达30-45分钟，接着在无菌蒸馏水中进行3次漂洗。灭菌后，可以分离未成熟的胚。

将两种不同的土壤杆菌菌株用于转化。第一种包含实施例9-11中所述锌指核苷酸基因构建体，而第二种含有包含替代突变的供体DNA序列。可以使用美国专利5,591,616所述来自Japan Tobacco的“超二元”载体系统。

为了制备土壤杆菌属悬浮液，将1-2个接种环的来自划线平板(其含有5g/L酵母提取物、10g/L细菌用蛋白胨、5g/L氯化钠、50mg/L大观霉素、10mg/L四环素及15g/L细菌用琼脂)的细菌放入5mL“入渗”培养基(‘inflitration’medium)中。该“入渗”培养基含LS基础盐类(Linsmaier等，1965，Physiol.Plant.)、N6维生素(Chu等，1975，Sci.Sinica 18：659-668)、1.5mg/L2，4-D、68.5g/L蔗糖、36g/L葡萄糖、6mM脯氨酸，调节至pH5.2，之后过滤除菌。将混合物进行涡旋振荡，直至获得均匀的悬浮液。可以使用Klett-Summerson光电比色计通过读取溶液的密度来测定细菌浓度。将该溶液调节至Klett 200(约1x10⁹cfu/mL)的浓度，并添加乙酰丁香酮以达到100μM的终浓度。

将未成熟的胚直接分离至装有2mL“入渗”培养基的微离心管中。对装有约100个胚的每个管进行涡旋振荡达3-5秒。将培养基除去，并用相同组成的新鲜液体培养基替换，并重复涡旋振荡。再次将液体培养基除去，并用1mL在Klett 200浓度的土壤杆菌溶液(800μL锌指核酸酶菌株和200μL供体DNA菌株)替换。将土壤杆菌属和胚混合物进行涡旋振荡达30秒。室温温育5分钟后，可以将该胚转移并放于(胚轴向下)“共培养”培养基上，在黑暗中于25℃达5天。“共培养”培养基含LS基础盐类(Linsmaier等，1965，Physiol.Plant.)、N6维生素(Chu等，1975，Sci.Sinica 18：659-668)、1.5mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖、6mM脯氨酸、0.85mg/L硝酸银、100μM乙酰丁香酮、3g/L调节至pH5.8，之后过滤除菌。

实施例13——同源重组体的选择

在与两种分别包含锌指核酸酶基因盒和供体DNA的土壤杆菌属菌株的5∶1混合物共培养后，将胚移至“胼胝体”培养基，其可以包括停止土壤杆菌属进一步生长的成分(例如250mg/L头孢噻肟和/或500nM

)。该“胼胝体”培养基含LS基础盐类(Linsmaier等，1965，Physiol.Plant.)、N6维生素(Chu等，1975，Sci.Sinica 18：659-668)、1.5mg/L 2，4-D、0.5g/L MES、30g/L蔗糖、6mM脯氨酸、1mg/L硝酸银、8g/L TC琼脂(Phyto Technology Laboratories，Shawnee Mission，KS)，调节至pH5.8，之后高压灭菌。整个选择阶段，在黑暗中于28℃培养胚。

对于植物再生，将胼胝体培养物转移至“诱导”培养基，并在27℃以16/8光照/黑暗光周期在低光照(13μE/m²/s)中温育1周，接着在由冷白色荧光灯所提供的高光照(40μE/m²/s)中培育1周。“诱导”培养基含MS基础盐类和维生素(Murashige等，1962，Physiol.Plant.15：473-497)、30g/L蔗糖、5mg/L 6-苄氨基嘌呤(benzylaminopurine)、0.025mg/L 2，4-D、2.5g/L

，将pH调节至5.7，之后高温灭菌。在这种两周诱导期后，将胼胝体转移至“再生”培养基，并在高光照(40μE/m²/s)中于27℃温育。“再生”培养基与“诱导”培养基相同，只是其缺乏激素。可以将胼胝体每两周传代培养至新鲜“再生”培养基，直至出现枝条(shoot)。

在小植株长度达到约3-5cm时，将它们转移至装有如下成分的150x25mm培养管：SH基础盐类和维生素(Schenk等，1972，Can.J.Bot.50：199-204)、10g/L蔗糖、1g/L肌肉-肌醇及2.5g/L

且将pH调节至5.8，之后高温灭菌。一旦枝条到达管的顶部，则将小植株转移至装有约0.25kg商品化土壤混合物(Conrad Fafard，Inc.，Springfield；Soil Mix#3)的10cm罐中，彻底湿润，并用干净的塑料杯覆盖2-4天。在3-5叶阶段，将植物移植至5加仑罐，并培养至成熟。

可以在美国专利申请公开文本US-2003-0232410；US-2005-0026157；US-2005-0064474；US-2005-0208489及US-2007-0134796中找到与靶向切割、靶向重组及靶向整合相关的别的信息，通过提及完整收录这些申请的公开内容以用于所有目的。

通过提及完整收录本文中所提及的所有专利、专利申请和出版物以用于所有目的。

尽管为了理解清楚的目的已经较详细地通过说明和例子来提供公开内容，但是对本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本公开精神或范围的前提下实施各种变化和修饰。因而，以上描述和例子不应当解释为限制。

Claims

1.一种供体载体，其包含第一和第二DNA序列；

其中所述第三和第四序列是染色体DNA序列；且

2.权利要求1的载体，其中所述第三和第四序列是内源序列。

3.权利要求1或权利要求2的载体，其中所述第一或第二序列中至少一种的长度为100个核苷酸。

4.权利要求1至3中任一项的载体，其还包含第五序列，其中所述第五序列：

(a)是插入所述第一和第二序列之间的；且

(b)是外源序列。

5.权利要求4的载体，其中所述第五序列的大小为至少一个碱基对。

6.权利要求4的载体，其中所述第五序列包含编码选择标志的序列。

7.权利要求6的载体，其中所述选择标志选自：绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT，BAR)、新霉素磷酸转移酶、β-内酰胺酶、儿茶酚双加氧酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、茅草枯脱卤素酶、及邻氨基苯甲酸合酶。

8.权利要求4的载体，其中所述第五序列包含编码选择标志以外的蛋白质的序列。

9.权利要求4的载体，其中所述第五序列包含一种或多种转录调节序列。

10.权利要求4的载体，其中所述第五序列包含编码蛋白质之一部分的序列。

11.权利要求10的载体，其中所述编码蛋白质之一部分的序列包含与染色体序列同源的序列。

12.权利要求4的载体，其中所述第五序列包含突变型染色体序列的野生型对应物。

13.权利要求4的载体，其中所述第五序列包含野生型染色体序列的突变型对应物。

14.权利要求1至13中任一项的载体，其中所述第一序列与所述第三序列具有至少35％的同源性。

15.权利要求1至14中任一项的载体，其中所述第二序列与所述第四序列具有至少35％的同源性。

16.权利要求14的载体，其中所述第二序列与所述第四序列具有至少35％的同源性。

(a)使所述细胞与依照权利要求1至16中任一项的靶向载体接触；并

(b)在所述细胞中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割距所述第三或第四序列之任一种3千碱基对内的染色体DNA；

18.权利要求17的方法，其中所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

(a)使所述细胞与依照权利要求8的靶向载体接触；并

20.权利要求19的方法，其中所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

21.一种依照权利要求17、18、19或20中任一项的方法而获得的转基因植物细胞。

22.一种植物，其包含依照权利要求21的转基因植物细胞。

(a)提供包含第一序列的DNA区段，所述第一序列是与第二序列同源的；并

(b)使所述DNA区段与核酸酶接触，其中所述核酸酶在第三序列处切割所述DNA区段。

24.权利要求23的方法，其中所述DNA区段对于所述细胞是内源的。

25.权利要求23或权利要求24的方法，其中所述同源重组在染色体中发生。

26.权利要求25的方法，其中从所述染色体中删除所述第一和第二序列之间的DNA。

27.权利要求23、24、25或26中任一项的方法，其中所述第三序列在所述基因组中是唯一的。

28.权利要求23至26中任一项的方法，其中所述细胞是植物细胞。

29.权利要求23至28中任一项的方法，其中所述核酸酶是一对融合蛋白，其中每个融合蛋白是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

30.权利要求23至29中任一项的方法，其中所述第三序列距离所述第一序列至少100个碱基对。

31.权利要求23至30中任一项的方法，其中所述第三序列距离所述第二序列至少100个碱基对。

32.权利要求23至31中任一项的方法，其中所述第三序列位于所述第一和第二序列之间。

33.权利要求23至32中任一项的方法，其中所述第一或第二序列之一对于所述生物体是外源的。

34.权利要求23至32中任一项的方法，其中所述第一和第二序列对于所述生物体都是外源的。

35.权利要求26的方法，其中从所述染色体中删除的所述序列编码选择标志的整个或部分。

36.权利要求35的方法，其中所述选择标志选自：绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT，BAR)、新霉素磷酸转移酶、β-内酰胺酶、儿茶酚双加氧酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、茅草枯脱卤素酶、及邻氨基苯甲酸合酶。

37.权利要求26的方法，其中以外源序列替换所述被删除的DNA，该方法还包括：

将多核苷酸导入所述细胞中，其中所述多核苷酸包含：

(a)第四和第五序列，其中所述第四序列是与邻近所述第一序列的未被删除的序列同源的，且所述第五序列是与邻近所述第二序列的未被删除的序列同源的；和

(b)所述外源序列。

38.权利要求37的方法，其中所述外源序列是选择标志。

39.权利要求38的方法，其中所述选择标志选自绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT，BAR)、新霉素磷酸转移酶、β-内酰胺酶、儿茶酚双加氧酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、茅草枯脱卤素酶、及邻氨基苯甲酸合酶。

40.权利要求23至39中任一项的方法，其中所述外源序列编码选择标志以外的蛋白质。

41.权利要求23至39中任一项的方法，其中所述外源序列编码RNA。

42.权利要求41的方法，其中所述RNA是siRNA。

43.一种靶向载体，其包含：

(a)第一和第二编码序列；和

(b)第一、第二、和第三靶序列；

44.权利要求43的载体，其中所述第一编码序列编码选择标志。

45.权利要求43或权利要求44的载体，其中所述第二编码序列编码选择标志。

46.权利要求43或权利要求45的载体，其中所述第一编码序列编码不是选择标志的蛋白质。

47.权利要求43、44或46中任一项的载体，其中所述第二编码序列编码不是选择标志的蛋白质。

48.权利要求43至47中任一项的载体，其中所述第一和第二染色体序列是内源染色体序列。

49.权利要求43至48中任一项的载体，其还包含所述第一靶序列的一个或多个重复。

50.权利要求43至49中任一项的载体，其还包含所述第二靶序列的一个或多个重复。

51.权利要求43至50中任一项的载体，其还包含所述第三靶序列的一个或多个重复。

(a)使所述细胞与依照权利要求43至51中任一项的靶向载体接触；并

(b)在所述细胞中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割距所述第一或第二染色体序列之任一种0.1-3千碱基对内的染色体DNA；

53.权利要求52的方法，其中所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。

56.一种依照权利要求52或权利要求53的方法而获得的转基因植物细胞。

57.一种植物，其包含依照权利要求56的转基因植物细胞。

(a)提供依照权利要求56的转基因植物细胞；并

(b)在所述细胞中表达第一和第二核酸酶，其中所述第一核酸酶在所述第一靶序列中切割，且所述第二核酸酶在所述第二靶序列中切割。

(a)提供依照权利要求56的转基因植物细胞；并

(b)在所述细胞中表达第一和第二核酸酶，其中所述第一核酸酶在所述第二靶序列中切割，且所述第二核酸酶在所述第三靶序列中切割。

(a)提供依照权利要求56的转基因植物细胞；并

(b)在所述细胞中表达第一和第二核酸酶，其中所述第一核酸酶在所述第一靶序列中切割，且所述第二核酸酶在所述第三靶序列中切割。