KR101439568B1 - 아연 손가락 뉴클레아제-매개 상동 재조합 - Google Patents

아연 손가락 뉴클레아제-매개 상동 재조합 Download PDF

Info

Publication number
KR101439568B1
KR101439568B1 KR1020097004953A KR20097004953A KR101439568B1 KR 101439568 B1 KR101439568 B1 KR 101439568B1 KR 1020097004953 A KR1020097004953 A KR 1020097004953A KR 20097004953 A KR20097004953 A KR 20097004953A KR 101439568 B1 KR101439568 B1 KR 101439568B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sequence
delete delete
dna
sequences
target
Prior art date
Application number
KR1020097004953A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090054986A (ko
Inventor
퀴후아 카이
제프리 밀러
윌리엄 마이클 애인리
로비 자넷 개리슨
조셉 에프. 페톨리노
베쓰 코리 루빈-윌슨
리사 린 슐렌버그
앤드류 프레데릭 워든
Original Assignee
다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
상가모 바이오사이언스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨, 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 filed Critical 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
Publication of KR20090054986A publication Critical patent/KR20090054986A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101439568B1 publication Critical patent/KR101439568B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding

Abstract

본 발명은 식물 게놈 내의 미리지정된 표적 부위에 외래 서열을 표적 통합하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
아연 손가락 뉴클레아제, 아연 손가락-FokI 융합 단백질, 상동 재조합, 유전자 표적화

Description

아연 손가락 뉴클레아제-매개 상동 재조합{ZINC FINGER NUCLEASE-MEDIATED HOMOLOGOUS RECOMBINATION}
본 발명은 식물에서의 게놈 조작, 유전자 표적화, 표적화된 염색체 통합 및 단백질 발현 분야에 속한다.
농업에서 흥미로운 주요 분야는, 특히 다수의 식물 게놈에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열의 결정의 견지에서, 게놈 서열의 표적화된 변경이다. 특히, 내인성 식물 서열을 전환시키는 능력은 수많은 용도, 예를 들어, 영양학적 가치, 수율, 스트레스 내성, 병원체 저항성 및 농약에 대한 저항성에 영향을 미치는 농작물 형질의 최적화 및/또는 제약 화합물 또는 산업용 화학물질의 생산을 위한 생물학적 공장으로 사용하기 위한 식물의 개조를 용이하게 할 것이다.
진핵생물에서, 배양된 세포에서 자연적인 상동 재조합 현상의 장점을 취함으로써 게놈 서열을 변경시키려는 시도가 이루어졌다. 예를 들어, [Capecchi (1989) Science 244:1288-1292], 미국 특허 번호 6,528,313 및 6,528,314 참조. 변경될 서열을 함유하는 게놈 영역에 대한 충분한 상동성이 폴리뉴클레오티드에 있으면, 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분 또는 전부가 상동 재조합에 의해 게놈 서열을 교체하는 것이 가능하다. 그러나, 이러한 상황 하에서의 상동 재조합의 빈도는 매우 낮다. 게다가, 서열 상동성이 없는 게놈 위치에서의 외인성 폴리뉴클레오티드의 삽입 빈도가 상동 재조합 빈도보다 여러 지릿수만큼 더 높다.
외인성 폴리뉴클레오티드에 대한 상동성을 보유하는 게놈의 영역에서 이중 가닥 파손부를 게놈 DNA 내로 도입하는 것이 배양된 세포에서 이러한 부위에서의 상동 재조합을 수천배만큼 자극하는 것으로 나타났다. [Rouet et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:8096-8106], [Choulika et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:1968-1973], [Donoho et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18:4070-4078]. 또한 [Johnson et al. (2001) Biochem. Soc. Trans. 29:196-201], 및 [Yanez et al. (1998) Gene Therapy 5:149-159] 참조. 이러한 방법에서, 메가뉴클레아제 (즉, 인식 부위가 너무 커서 당해 게놈 내에서 인식 부위가 나타나지 않거나 아주 드물게 나타나는 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 부위를 원하는 게놈 영역 내로 삽입함으로써 원하는 게놈 영역에서의 DNA 절단이 달성되었다.
그러나, 메가뉴클레아제 절단에 의해 자극되는 상동 재조합은 변경될 게놈 영역 부근에 적절한 메가뉴클레아제 인식 부위가 우연히 존재하는 것 또는 지시되어 삽입되는 것에 의존한다. 메가뉴클레아제 인식 부위는 전형적인 식물 게놈에서 드물고 (또는 존재하지 않음), 적절한 메가뉴클레아제 인식 부위의 삽입은 기타 게놈 변경에 관련된 난점과 동일한 난점에 시달리기 때문에, 이러한 방법은 광범위하게 적용가능하지는 않다.
따라서, 임의의 식물 게놈 내의 서열의 표적화된 변경을 위한 조성물 및 방법, 및 외인성 서열의 게놈 내로의 표적화된 도입을 위한 조성물 및 방법이 여전히 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 식물 세포에서 당해 영역 내의 세포 염색질의 표적화된 절단 및/또는 미리 결정된 당해 영역에서의 상동 재조합을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 식물 세포는 단자엽 또는 쌍자엽 식물 종으로부터 유래될 수 있고, 배양된 세포, 임의의 발달 단계의 식물 내의 세포, 및 전체 식물로부터 제거된 후 식물로 되돌아갈 (또는 이의 자손이 되돌아갈) 식물 세포를 또한 포함한다.
세포 염색질 내의 당해 영역은, 예를 들어, 게놈 서열 또는 이의 일부분일 수 있다. 조성물은 조작된 아연 손가락 결합 도메인 (예를 들어, 신규 특이성이 있는 아연 손가락 결합 도메인) 및 절단 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 조작된 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 절단 도메인 및 절단 절반 도메인은, 예를 들어, 다양한 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 귀소성 엔도뉴클레아제로부터 수득될 수 있다.
한 양상에서, 제1 및 제2 DNA 서열을 포함하고, 이때 (i) 제1서열은 제3서열에 상동성이고, 제2서열은 제4서열에 상동성이며, (ii) 제3서열 및 제4서열은 염색체 DNA 서열이고, (iii) 제3서열과 제4서열의 가까운 가장자리들은 1개 이상의 뉴클레오티드 쌍에 의해 분리되어 있는 벡터가 본원에서 기술된다. 특정 실시양태에서, 제3서열 및 제4서열은 내인성 서열이다.
임의의 본원에 기술된 벡터에서, 제1서열 또는 제2서열 중 하나 이상은 길이가 뉴클레오티드 100개이다. 또한, 임의의 본원에 기술된 벡터는 (a) 제1서열과 제2서열 사이에 개재되고 (b) 외인성 서열인 제5서열을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제5서열은 염기쌍 1개 이상의 크기이지만, 22 킬로베이스 쌍만큼 클 수 있다.
벡터 (예를 들어, 제5서열)는 단백질 또는 단백질의 일부를 코딩하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질-코딩 서열은 선별성 마커 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), β-글루쿠로니다제 (GUS), 포스피노트리신 N-아세틸 트랜스페라제 (PAT, BAR), 네오마이신 포스포트랜스페라제, β-락타마제, 카테콜 디옥시게나제, α-아밀라제, 티로시나제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 애큐오린, EPSP 신타제, 니트릴라제, 아세토락테이트 신타제 (ALS), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 달라폰 데할로게나제 및 안트라닐레이트 신타제)를 코딩한다. 또다른 실시양태에서, 단백질-코딩 서열 (예를 들어, 제5서열)은 단백질 또는 단백질의 일부분, 예를 들어 염색체 서열에 상동성인 서열을 코딩한다.
또다른 실시양태에서, 벡터 (예를 들어, 제5서열)는 하나 이상의 전사 조절 서열을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 벡터 (예를 들어, 제5서열)는 돌연변이체 염색체 서열의 야생형 대응물, 또는 별법적으로 야생형 염색체 서열의 돌연변이체 대응물을 포함할 수 있다.
임의의 본원에 기술된 벡터에서, 제1서열은 제3서열에 대한 상동성이 35％ 이상일 수 있다. 유사하게, 임의의 본원에 기술된 벡터에서, 제2서열은 제4서열에 대한 상동성이 35％ 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1서열은 제3서열에 대한 상동성이 적어도 35％ 내지 50％, 적어도 50％ 내지 70％, 적어도 70％ 내지 80 ％, 적어도 80％ 내지 85％, 적어도 85％ 내지 90％, 적어도 90％ 내지 95％, 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％이다. 일부 실시양태에서, 제2서열은 제4서열에 대한 상동성이 적어도 35％ 내지 50％, 적어도 50％ 내지 70％, 적어도 70％ 내지 80％, 적어도 80％ 내지 85％, 적어도 85％ 내지 90％, 적어도 90％ 내지 95％, 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％이다.
또다른 양상에서, (a) 세포를 임의의 상기 기술된 벡터와 접촉시키는 단계, 및 (b) 하나 이상의 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 하나 이상의 뉴클레아제가 제3서열 또는 제4서열 중 하나의 0.4 내지 3 킬로베이스 쌍 이내의 염색체 DNA를 절단하는 단계를 포함하여, 단계 (b)에서의 염색체 DNA의 절단이 상동 재조합에 의한 게놈 내로의 표적화 벡터의 혼입을 자극하는, 외인성 서열을 식물 세포의 게놈 내로 도입하는 방법이 본원에 기술된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 조작된 아연 손가락 결합 도메인 간의 융합물이다.
또다른 양상에서, (a) 세포를 본원에 기술된 벡터와 접촉시키는 단계, 및 (b) 하나 이상의 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 하나 이상의 뉴클레아제가 제3서열 또는 제4서열 중 하나의 0.1 내지 3 킬로베이스 쌍 이내의 염색체 DNA를 절단하는 단계를 포함하여, 단계 (b)에서의 염색체 DNA의 절단이 상동 재조합에 의한 게놈 내로의 벡터의 혼입을 자극하는, 식물 세포에서 단백질을 발현시키는 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 조작된 아연 손가락 결합 도메인 간의 융 합물이다.
또다른 양상에서, (a) 제1 및 제2 코딩 서열, 및 (b) 제1, 제2 및 제3 표적 서열을 포함하고, 이때 서열들은 제1 표적 서열, 제1 코딩 서열, 제2 표적 서열, 제2 코딩 서열, 제3 표적 서열의 순서로 정렬되며, 추가로 제1 표적 서열은 제1 염색체 서열에 상동성이고, 제3 표적 서열은 제2 염색체 서열에 상동성인 표적화 벡터가 본원에서 기술된다. 제1 및/또는 제2 코딩 서열은 선별성 마커를 코딩할 수 있거나, 또는 별법적으로 제1 및/또는 제2 코딩 서열은 선별성 마커가 아닌 단백질을 코딩할 수 있다. 제1 및 제2 염색체 서열은 내인성 염색체 서열일 수 있다. 또한, 벡터는 제1, 제2 및/또는 제3 표적 서열의 하나 이상의 반복물을 포함할 수 있다.
또다른 양상에서, (a) 세포를 상기 단락에 기술된 바와 같은 표적화 벡터와 접촉시키는 단계, 및 (b) 하나 이상의 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 하나 이상의 뉴클레아제가 제1 또는 제2 염색체 서열 중 하나의 0.1 내지 3 킬로베이스 쌍 이내의 염색체 DNA를 절단하는 단계를 포함하여, 단계 (b)에서의 염색체 DNA의 절단이 상동 재조합에 의한 게놈 내로의 표적화 벡터의 혼입을 자극하는, 외인성 서열을 식물 세포의 게놈 내로 도입하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 절단 절반-도메인을 포함하고, 예를 들어, 뉴클레아제는 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 조작된 아연 손가락 결합 도메인 간의 융합물이다.
또다른 양상에서, (a) 세포를 전전 단락에 기술된 바와 같은 표적화 벡터와 접촉시키는 단계, 및 (b) 하나 이상의 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 하나 이상의 뉴클레아제가 제1 또는 제2 염색체 서열 중 하나의 0.1 내지 3 킬로베이스 쌍 이내의 염색체 DNA를 절단하는 단계를 포함하여, 단계 (b)에서의 염색체 DNA의 절단이 상동 재조합에 의한 게놈 내로의 표적화 벡터의 혼입을 자극하는, 식물 세포에서 단백질을 발현시키는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 조작된 아연 손가락 결합 도메인 간의 융합물이다.
추가적인 양상에서, 임의의 본원에 기술된 방법에 따라 수득된 트랜스제닉(transgenic) 식물 세포가 또한 제공된다.
또다른 양상에서, 본원에 기술된 바와 같이 수득된 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 식물이 본원에서 제공된다.
(a) 본원에 기술된 바와 같은 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계, 및 (b) 제1 및 제2 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 제1 뉴클레아제는 제1 표적 서열에서 절단하고 제2 뉴클레아제는 제2 표적 서열에서 절단하는 단계를 포함하는, 제1 표적 서열, 제1 코딩 서열, 제2 표적 서열, 제2 코딩 서열, 제3 표적 서열의 순서로 정렬된, 제1 및 제2 코딩 서열, 및 제1, 제2 및 제3 표적 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포의 게놈으로부터 서열을 결실시키는 방법이 또한 제공된다.
추가적인 양상에서, (a) 본원에 기술된 바와 같은 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계, 및 (b) 제1 및 제2 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 제 1 뉴클레아제는 제2 표적 서열에서 절단하고 제2 뉴클레아제는 제3 표적 서열에서 절단하는 단계를 포함하는, 제1 표적 서열, 제1 코딩 서열, 제2 표적 서열, 제2 코딩 서열, 제3 표적 서열의 순서로 정렬된, 제1 및 제2 코딩 서열, 및 제1, 제2 및 제3 표적 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포의 게놈으로부터 서열을 결실시키는 방법이 본원에 개시된다.
또다른 양상에서, (a) 본원에 기술된 바와 같은 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계, 및 (b) 제1 및 제2 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 제1 뉴클레아제는 제1 표적 서열에서 절단하고 제2 뉴클레아제는 제3 표적 서열에서 절단하는 단계를 포함하는, 제1 표적 서열, 제1 코딩 서열, 제2 표적 서열, 제2 코딩 서열, 제3 표적 서열의 순서로 정렬된, 제1 및 제2 코딩 서열, 및 제1, 제2 및 제3 표적 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포의 게놈으로부터 서열을 결실시키는 방법이 본원에서 제공된다.
또다른 양상에서, (a) 제2서열에 상동성인 제1서열을 포함하는 DNA 절편을 제공하는 단계, 및 (b) 상기 DNA 절편을 뉴클레아제와 접촉시키고, 이때 뉴클레아제가 제3서열에서 DNA 절편을 절단하는 단계를 포함하는, 세포 (예를 들어, 식물 세포)의 게놈 내에서의 분자내 상동 재조합을 위한 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, DNA 절편은 세포에 대해 내인성이다. 특정 실시양태에서, 염색체 내에서, 예를 들어, 제1서열과 제2서열 사이의 DNA가 염색체로부터 결실될 때, 상동 재조합이 일어난다. 염색체로부터 결실된 서열은, 예를 들어, 선별성 마커 전체 또는 이의 일부분을 코딩할 수 있다. 예를 들어, (a) 제1서열에 근접한 비-결실 서열에 상동성인 제4서열, 및 제2서열에 근접한 비-결실 서열에 상동성인 제5서열, 및 (b) 외인성 서열 (예를 들어, 선별성 마커, 선별성 마커 이외의 단백질 또는 단백질의 일부분, RNA 예컨대 siRNA 등)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계가 방법에 추가로 포함되는 경우에, 결실된 DNA가 외인성 서열에 의해 교체될 수 있다. 임의의 본원에 기술된 방법에서, 선별성 마커는, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), β-글루쿠로니다제 (GUS), 포스피노트리신 N-아세틸 트랜스페라제 (PAT, BAR), 네오마이신 포스포트랜스페라제, β-락타마제, 카테콜 디옥시게나제, α-아밀라제, 티로시나제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 애큐오린, EPSP 신타제, 니트릴라제, 아세토락테이트 신타제 (ALS), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 달라폰 데할로게나제 및 안트라닐레이트 신타제일 수 있다.
임의의 방법에서, 제3서열 (즉, 뉴클레아제에 의해 절단된 서열)이 게놈 내에서 독특할 수 있고/있거나, 뉴클레아제가 한 쌍의 융합 단백질일 수 있고, 이때 각각의 융합 단백질은 절단 절반-도메인 (예를 들어 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인)과 조작된 아연 손가락 결합 도메인 간의 융합물이다. 또한, 제3서열이 제1서열과 제2서열 (즉, 상동성 서열) 사이에 있을 수 있고/있거나, 제1서열 및/또는 제2서열로부터 1개 이상의 염기쌍에 있을 수 있다.
임의의 본원에 기술된 방법에서, 제1서열 및 제2서열 중 하나 또는 양쪽 모두는 생물에 대해 외인성일 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기의 번호가 매겨진 실시양태들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다:
1. 제1 및 제2 DNA 서열을 포함하고,
이때 제1서열이 제3서열에 상동성이고, 제2서열이 제4서열에 상동성이며,
제3서열 및 제4서열은 염색체 DNA 서열이고,
제3서열 및 제4서열의 가까운 가장자리들은 1개 이상의 뉴클레오티드 쌍에 의해 분리된
도너(donor) 벡터.
2. 제1항에 있어서, 제3서열 및 제4서열이 내인성 서열인 벡터.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1서열 또는 제2서열 중 하나 이상의 길이가 뉴클레오티드 100개인 벡터.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 제1서열과 제2서열 사이에 개재되고,
(b) 외인성 서열인
제5서열을 추가로 포함하는 벡터.
5. 제4항에 있어서, 제5서열의 크기가 염기쌍 1개 이상인 벡터.
6. 제4항에 있어서, 제5서열이 선별성 마커를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터.
7. 제6항에 있어서, 선별성 마커가 녹색 형광 단백질 (GFP), β-글루쿠로니다제 (GUS), 포스피노트리신 N-아세틸 트랜스페라제 (PAT, BAR), 네오마이신 포스포트랜스페라제, β-락타마제, 카테콜 디옥시게나제, α-아밀라제, 티로시나제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 애큐오린, EPSP 신타제, 니트릴라제, 아세토락테이트 신타제 (ALS), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 달라폰 데할로게나제 및 안트라닐레이트 신타제로 구성된 군으로부터 선택되는 벡터.
8. 제4항에 있어서, 제5서열이 선별성 마커 이외의 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 벡터.
9. 제4항에 있어서, 제5서열이 하나 이상의 전사 조절 서열을 포함하는 벡터.
10. 제4항에 있어서, 제5서열이 단백질의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 벡터.
11. 제10항에 있어서, 단백질의 일부분을 코딩하는 서열이 염색체 서열에 상동성인 서열을 포함하는 벡터.
12. 제4항에 있어서, 제5서열이 돌연변이체 염색체 서열의 야생형 대응물을 포함하는 벡터.
13. 제4항에 있어서, 제5서열이 야생형 염색체 서열의 돌연변이체 대응물을 포함하는 벡터.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1서열이 제3서열에 대한 상동성이 35％ 이상인 벡터.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2서열이 제4서열에 대한 상동성이 35％ 이상인 벡터.
16. 제14항에 있어서, 제2서열이 제4서열에 대한 상동성이 35％ 이상인 벡터.
17. (a) 세포를 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 표적화 벡터와 접촉시키는 단계, 및
(b) 하나 이상의 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 하나 이상의 뉴클레아제가 제3서열 또는 제4서열 중 하나의 3 킬로베이스 쌍 이내의 염색체 DNA를 절단하는 단계를 포함하여,
단계 (b)에서의 염색체 DNA의 절단이 상동 재조합에 의한 게놈 내로의 표적화 벡터의 혼입을 자극하는,
외인성 서열을 식물 세포의 게놈 내로 도입하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레아제가 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 조작된 아연 손가락 결합 도메인 간의 융합물인 방법.
19. (a) 세포를 제8항에 따른 표적화 벡터와 접촉시키는 단계, 및
(b) 하나 이상의 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 하나 이상의 뉴클레아제가 제3서열 또는 제4서열 중 하나의 3 킬로베이스 쌍 이내의 염색체 DNA를 절단하는 단계를 포함하여,
단계 (b)에서의 염색체 DNA의 절단이 상동 재조합에 의한 게놈 내로의 표적화 벡터의 혼입을 자극하는,
식물 세포에서 단백질을 발현시키는 방법.
20. 제19항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레아제가 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 조작된 아연 손가락 결합 도메인 간의 융합물인 방법.
21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 트랜스제닉 식 물 세포.
22. 제21항에 따른 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 식물.
23. (a) 제2서열에 상동성인 제1서열을 포함하는 DNA 절편을 제공하는 단계, 및
(b) 상기 DNA 절편을 뉴클레아제와 접촉시키고, 이때 뉴클레아제가 제3서열에서 DNA 절편을 절단하는 단계를 포함하는,
세포의 게놈 내에서의 분자내 상동 재조합을 위한 방법.
24. 제23항에 있어서, DNA 절편이 세포에 대해 내인성인 방법.
25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상동 재조합이 염색체 내에서 일어나는 방법.
26. 제25항에 있어서, 제1서열과 제2서열 사이의 DNA가 염색체로부터 결실되는 방법.
27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제3서열이 게놈 내에서 유일한 서열인 방법.
28. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 식물 세포인 방법.
29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 한 쌍의 융합 단백질이고, 이때 각각의 융합 단백질이 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 조작된 아연 손가락 결합 도메인 간의 융합물인 방법.
30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제3서열이 제1서열로부터 100개 이상의 염기쌍에 있는 방법.
31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제3서열이 제2서열로부터 100개 이상의 염기쌍에 있는 방법.
32. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제3서열이 제1서열과 제2서열 사이에 있는 방법.
33. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1서열 또는 제2서열 중 하나가 생물에 대해 외인성인 방법.
34. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1서열 및 제2서열 모두가 생물에 대해 외인성인 방법.
35. 제26항에 있어서, 염색체로부터 결실된 서열이 선별성 마커 전체 또는 이의 일부분을 코딩하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 선별성 마커가 녹색 형광 단백질 (GFP), β-글루쿠로니다제 (GUS), 포스피노트리신 N-아세틸 트랜스페라제 (PAT, BAR), 네오마이신 포스포트랜스페라제, β-락타마제, 카테콜 디옥시게나제, α-아밀라제, 티로시나제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 애큐오린, EPSP 신타제, 니트릴라제, 아세토락테이트 신타제 (ALS), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 달라폰 데할로게나제 및 안트라닐레이트 신타제로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
37. 제26항에 있어서, 결실된 DNA가 외인성 서열에 의해 교체되고,
(a) 제1서열에 근접한 비-결실 서열에 상동성인 제4서열, 및 제2서열에 근접한 비-결실 서열에 상동성인 제5서열, 및
(b) 외인성 서열
을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계가 방법에 추가로 포함되는 방법.
38. 제37항에 있어서, 외인성 서열이 선별성 마커인 방법.
39. 제38항에 있어서, 선별성 마커가 녹색 형광 단백질 (GFP), β-글루쿠로니다제 (GUS), 포스피노트리신 N-아세틸 트랜스페라제 (PAT, BAR), 네오마이신 포스포트랜스페라제, β-락타마제, 카테콜 디옥시게나제, α-아밀라제, 티로시나제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 애큐오린, EPSP 신타제, 니트릴라제, 아세토락테이트 신타제 (ALS), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 달라폰 데할로게나제 및 안트라닐레이트 신타제로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
40. 제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열이 선별성 마커 이외의 단백질을 코딩하는 방법.
41. 제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 서열이 RNA를 코딩하는 방법.
42. 제41항에 있어서, RNA가 siRNA인 방법.
43. (a) 제1 및 제2 코딩 서열, 및
(b) 제1, 제2 및 제3 표적 서열
을 포함하고, 이때 서열들이 제1 표적 서열, 제1 코딩 서열, 제2 표적 서열, 제2 코딩 서열, 제3 표적 서열의 순서로 정렬되며,
추가로 제1 표적 서열은 제1 염색체 서열에 상동성이고, 제3 표적 서열은 제2 염색체 서열에 상동성인 표적화 벡터.
44. 제43항에 있어서, 제1 코딩 서열이 선별성 마커를 코딩하는 벡터.
45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 제2 코딩 서열이 선별성 마커를 코딩하는 벡터.
46. 제43항 또는 제45항에 있어서, 제1 코딩 서열이 선별성 마커가 아닌 단백질을 코딩하는 벡터.
47. 제43항, 제44항 또는 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 코딩 서열이 선별성 마커가 아닌 단백질을 코딩하는 벡터.
48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 염색체 서열이 내인성 염색체 서열인 벡터.
49. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 서열의 하나 이상의 반복물을 추가로 포함하는 벡터.
50. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 표적 서열의 하나 이상의 반복물을 추가로 포함하는 벡터.
51. 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 표적 서열의 하나 이상의 반복물을 추가로 포함하는 벡터.
52. (a) 세포를 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 표적화 벡터와 접촉시키는 단계, 및
(b) 하나 이상의 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 하나 이상의 뉴클레아제가 제1 또는 제2 염색체 서열 중 하나의 0.1 내지 3 킬로베이스 쌍 이내의 염색체 DNA를 절단하는 단계를 포함하여,
단계 (b)에서의 염색체 DNA의 절단이 상동 재조합에 의한 게놈 내로의 표적화 벡터의 혼입을 자극하는,
외인성 서열을 식물 세포의 게놈 내로 도입하는 방법.
53. 제52항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레아제가 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 조작된 아연 손가락 결합 도메인 간의 융합물인 방법.
54. (a) 세포를 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 표적화 벡터와 접촉시키는 단계, 및
(b) 하나 이상의 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 하나 이상의 뉴클레아제가 제1 또는 제2 염색체 서열 중 하나의 0.1 내지 3 킬로베이스 쌍 이내의 염색체 DNA를 절단하는 단계를 포함하여,
단계 (b)에서의 염색체 DNA의 절단이 상동 재조합에 의한 게놈 내로의 표적화 벡터의 혼입을 자극하는,
식물 세포에서 단백질을 발현시키는 방법.
55. 제54항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레아제가 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 조작된 아연 손가락 결합 도메인 간의 융합물인 방법.
56. 제52항 또는 제53항의 방법에 따라 수득된 트랜스제닉 식물 세포.
57. 제56항에 따른 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 식물.
58. (a) 제56항에 따른 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계, 및
(b) 제1 및 제2 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 제1 뉴클레아제는 제1 표적 서열에서 절단하고 제2 뉴클레아제는 제2 표적 서열에서 절단하는 단 계
를 포함하는, 트랜스제닉 식물 세포의 게놈으로부터 서열을 결실시키는 방법.
59. (a) 제56항에 따른 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계, 및
(b) 제1 및 제2 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 제1 뉴클레아제는 제2 표적 서열에서 절단하고 제2 뉴클레아제는 제3 표적 서열에서 절단하는 단계
를 포함하는, 트랜스제닉 식물 세포의 게놈으로부터 서열을 결실시키는 방법.
60. (a) 제56항에 따른 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계, 및
(b) 제1 및 제2 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키고, 이때 제1 뉴클레아제는 제1 표적 서열에서 절단하고 제2 뉴클레아제는 제3 표적 서열에서 절단하는 단계
를 포함하는, 트랜스제닉 식물 세포의 게놈으로부터 서열을 결실시키는 방법.
도 1A 및 1B는 pDAB1585로 지정된 표적화 구축물의 개략도이다. 도 1A는 구축물의 다양한 요소의 선형 묘사이다. 도 1B는 원형 구축물의 묘사이다.
도 2A 및 2B는 예시적인 ZFN 및 이의 표적 부위를 묘사한다. 도 2A는 ZFN 및 결합 영역을 묘사한다. 도 2B는 표적 부위를 묘사한다.
도 3은 플라스미드 pDAB1400의 개략도이다.
도 4는 플라스미드 pDAB782의 개략도이다.
도 5는 플라스미드 pDAB1582의 개략도이다.
도 6은 플라스미드 pDAB354의 개략도이다.
도 7은 플라스미드 pDAB1583의 개략도이다.
도 8은 플라스미드 pDAB2407의 개략도이다.
도 9는 플라스미드 pDAB1584의 개략도이다.
도 10은 플라스미드 pDAB2418의 개략도이다.
도 11은 플라스미드 pDAB4045의 개략도이다.
도 12는 플라스미드 pDAB1575의 개략도이다.
도 13은 플라스미드 pDAB1577의 개략도이다.
도 14는 플라스미드 pDAB1579의 개략도이다.
도 15는 플라스미드 pDAB1580의 개략도이다.
도 16은 플라스미드 pDAB3401의 개략도이다.
도 17은 플라스미드 pDAB1570의 개략도이다.
도 18은 플라스미드 pDAB1572의 개략도이다.
도 19는 플라스미드 pDAB4003의 개략도이다.
도 20은 플라스미드 pDAB1571의 개략도이다.
도 21은 플라스미드 pDAB7204의 개략도이다.
도 22는 플라스미드 pDAB1573의 개략도이다.
도 23은 플라스미드 pDAB1574의 개략도이다.
도 24는 플라스미드 pDAB1581의 개략도이다.
도 25는 플라스미드 pDAB1576의 개략도이다.
도 26A 및 26B는 pDAB1600으로 지정된 표적화 플라스미드 벡터의 개략도이다. 도 26A는 플라스미드의 다양한 요소의 선형 묘사이다. 도 26B는 원형 플라스미드의 묘사이다.
도 27은 플라스미드 pDAB7002의 개략도이다.
도 28은 플라스미드 pDAB7025의 개략도이다.
도 29는 플라스미드 pDAB1591의 개략도이다.
도 30은 플라스미드 pcDNA3.1-IL1-L0-FokI의 개략도이다.
도 31은 플라스미드 pcDNA3.1-SCD27-L0-FokI의 개략도이다.
도 32는 플라스미드 pDAB1592의 개략도이다.
도 33은 플라스미드 pDAB1594의 개략도이다.
도 34 A, B 및 C는 플라스미드 pDAB1596 및 pDAB1598의 개략도이다. 도 34A는 선형화된 플라스미드의 개략도이다. 도 34B는 pDAB1596을 나타낸다. 도 34C는 pDAB1598을 나타낸다.
도 35는 플라스미드 pDAB1577의 개략도이다.
도 36은 플라스미드 pDAB1578의 개략도이다.
도 37A 및 B는 플라스미드 pDAB1601의 개략도이다. 도 37A는 선형 형태의 다양한 요소들을 나타낸다. 도 37B는 원형 플라스미드를 나타낸다.
도 38은 IL-1 ZFN-FokI 융합물에 의해 자극되는, 예측되는 염색체간 상동 재조합을 묘사하는 개략도이다.
도 39는 Scd27 ZFN-FokI 융합물에 의해 자극되는, 예측되는 염색체간 상동 재조합을 묘사하는 개략도이다.
도 40은 재조합체의 PCR 분석을 나타낸다. 1-20으로 지정된 레인은 NT1-240의 SCD27-FokI 융합 단백질 구축물로의 형질전환으로부터의 상동 재조합 이벤트를 나타낸다. 21 및 22로 지정된 레인은 NT1-240의 SCD27-FokI 융합 단백질 구축물로의 형질전환으로부터의 상동 재조합 이벤트를 나타낸다. 대조군 레인은 가장 왼쪽의 3개의 레인에서 나타난다.
도 41은 재조합체의 서던 블롯(Southern blot) 분석을 나타낸다. 1-20으로 지정된 레인은 NT1-240의 SCD27-FokI 융합 단백질 구축물로의 형질전환으로부터의 상동 재조합 이벤트를 나타낸다. 21 및 22로 지정된 레인은 NT1-240의 SCD27-FokI 융합 단백질 구축물로의 형질전환으로부터의 상동 재조합 이벤트를 나타낸다. 대조군 레인은 가장 왼쪽의 2개의 레인에서 나타난다.
도 42는 IL-1 ZFN-FokI 융합물에 의해 자극되는, 예측되는 염색체내 상동 재조합을 묘사하는 개략도이다.
도 43은 GFP가 IL-1-FokI 융합 단백질을 발현하는 형광 조직에서 재구성된다는 것을 확인하는 PCR 분석이다.
도 44는 플라스미드 pSB11의 개략도이다.
도 45는 플라스미드 pSB1의 개략도이다.
도 46은 플라스미드 pDAB3872의 개략도이다.
도 47은 플라스미드 pDAB4365의 개략도이다.
식물 세포 염색질의 표적화된 절단, 및 식물 세포 뉴클레오티드 서열의 표적화된 변경, 예를 들어, 표적화된 절단에 이은 염색체내 상동 재조합 또는 표적화된 절단에 이은 외인성 폴리뉴클레오티드 (세포 뉴클레오티드 서열과 상동성이 있는 하나 이상의 영역을 포함)와 게놈 서열 간의 상동 재조합에 의한 변경에 유용한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다.
게놈 서열은 염색체, 에피솜, 세포소기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 인공 염색체 및 세포 내에 존재하는 임의의 기타 유형의 핵산, 예를 들어, 증폭된 서열, 이중 미세 염색체 및 내인성 또는 감염성 박테리아 및 바이러스의 게놈 내에 존재하는 것들을 포함한다. 게놈 서열은 정상이거나 (즉, 야생형), 또는 돌연변이체일 수 있고, 돌연변이체 서열은 삽입, 결실, 전위, 재배열 및/또는 점 돌연변이를 예를 들어 포함할 수 있다. 게놈 서열은 다수의 상이한 대립유전자들 중 하나를 또한 포함할 수 있다.
표적화된 절단 및 재조합에 유용한 조성물은 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인) 및 아연 손가락 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 이러한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 및 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드의 조합물을 포함한다. 아연 손가락 결합 도메인은 하나 이상의 아연 손가락 (예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 아연 손가락)을 포함할 수 있고, 임의의 게놈 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 절단 또는 재조합을 원하는 당해 표적 게놈 영역을 확인함으로써, 본원에 개시된 방법에 따라, 상기 게놈 영역 내의 표적 서열을 인식하도록 조작된 아연 손가락 도메인 및 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인)을 포함하는 하나 이상의 융합 단백질을 구축할 수 있다. 세포 내에 이같은 융합 단백질 (또는 단백질들)이 존재하면, 융합 단백질(들)의 이(들)의 결합 부위(들)에 대한 결합 및 상기 게놈 영역 내부 또는 근처에서의 절단이 초래될 것이다. 또한, 게놈 영역에 상동성인 외인성 폴리뉴클레오티드가 이같은 세포 내에 또한 존재하면, 게놈 영역과 외인성 폴리뉴클레오티드 사이에 높은 비율로 상동 재조합이 발생한다.
일반적인 내용
본원에 개시된 방법의 실행, 뿐만 아니라 조성물의 제조 및 사용은, 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 속하는 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 계산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야에서의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, [Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 & Third edition, 2001]; [Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 & 정기적인 개정판]; 시리즈 [METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego]; [Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998]; [METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999]; 및 [METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999] 참조.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용되고, 선형 또는 원형 형상이고 단일 또는 이중 가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 용어들은 중합체의 길이와 관련하여 제한적으로 해석되지 않아야 한다. 이러한 용어들은 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체, 뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티(moiety) (예를 들어, 포스포로티오에이트 골격)에서 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 염기쌍을 형성하는 특이성이 동일하고, 즉 A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산이 상응하는 천연-발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 또한 적용된다.
"결합"은 거대분자들 간의 (예를 들어, 단백질과 핵산 간의) 서열-특이적인 비-공유결합 상호작용을 지칭한다. 전체로서의 상호작용이 서열-특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 성분이 서열-특이적일 필요는 없다 (예를 들어, DNA 골격 내의 포스페이트 잔기와의 접촉). 일반적으로 이같은 상호작용은 10-6 M-1 이하의 해리 상수 (Kd)를 특징으로 한다. "친화력"은 결합 강도를 지칭하고, 증가된 결합 친화력은 더 낮은 Kd와 상관된다.
"결합 단백질"은 또다른 분자에 비-공유결합적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어, DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 이는 자신에게 결합할 수 있고/있거나 (동종이량체, 동종삼량체 등을 형성), 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 결합 활성의 유형이 한가지를 초과할 수 있다. 예를 들어, 아연 손가락 단백질은 DNA-결합 활성, RNA-결합 활성 및 단백질-결합 활성이 있다.
"아연 손가락 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 하나 이상의 아연 손가락을 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는, 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이고, 이때 상기 아연 손가락은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역이다. 용어 아연 손가락 DNA 결합 단백질은 종종 아연 손가락 단백질 또는 ZFP로 약기된다.
아연 손가락 결합 도메인은 미리 정해진 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 아연 손가락 단백질의 조작 방법의 비-제한적인 예는 디자인 및 선별이다. 디자인된 아연 손가락 단백질은 논리적인 기준으로부터 주로 디자인/조성되는, 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 디자인을 위한 논리적인 기준은 기존의 ZFP 디자인 및 결합 데이터의 정보가 저장된 데이터베이스 내의 정보를 프로세싱하기 위한 전산화된 알고리즘 및 치환 규칙의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 6,140,081; 6,453,242; 6,534,261; 및 6,785,613를 참조하고, WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496; 및 미국 특허 6,746,838; 6,866,997; 및 7,030,215를 또한 참조한다.
"선별된" 아연 손가락 단백질은 실험적인 프로세스 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩(trap) 또는 하이브리드(hybrid) 선별로부터 주로 생산되는, 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, 미국 5,789,538; 미국 5,925,523; 미국 6,007,988; 미국 6,013,453; 미국 6,200,759; 미국 6,733,970; 미국 RE39,229; 및 WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197 및 WO 02/099084 참조.
용어 "서열"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 이는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 선형, 원형 또는 분지형일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 용어 "도너(donor) 서열"은 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 도너 서열은 임의의 길이일 수 있고, 예를 들어 길이가 뉴클레오티드 2개 내지 25,000개 (또는 이들 사이이거나 이를 초과하는 임의의 정수값), 바람직하게는 뉴클레오티드 약 100개 내지 5,000개 (또는 이들 사이의 임의의 정수), 더욱 바람직하게는 뉴클레오티드 약 200개 내지 2,500개일 수 있다.
"상동성 서열"은 제2서열과 상당한 서열 동일성을 공유하고, 제2서열과 서열이 동일할 수 있는 제1서열을 지칭한다. "동일하지 않은 상동성 서열"은 제2서열과 상당한 서열 동일성을 공유하지만, 제2서열과 서열이 동일하지 않은 제1서열을 지칭한다. 예를 들어, 돌연변이체 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 돌연변이체 유전자의 서열에 대해 상동성이고 동일하지 않다. 특정 실시양태에서, 2개의 서열 간의 상동성의 정도는 일반적인 세포 메커니즘을 사용하여 이들 간에 상동 재조합이 일어나도록 하는데 충분한다. 2개의 동일하지 않은 상동성 서열들은 임의의 길이일 수 있고, 이들의 비-상동성 정도는 단일 뉴클레오티드만큼 작거나 (예를 들어, 표적화 상동 재조합에 의한 게놈 점 돌연변이의 수정을 위해), 또는 10 킬로베이스 이상만큼 클 수 있다 (예를 들어, 염색체 내의 미리 정해진 부위에서의 유전자의 삽입을 위해). 동일하지 않은 상동성 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드는 길이가 동일할 필요가 없다. 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 20개 내지 10,000개 사이의 외인성 폴리뉴클레오티드 (즉, 도너 폴리뉴클레오티드)가 사용될 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 이같은 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것 및/또는 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 결정하는 것, 및 이러한 서열을 제2의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열을 또한 이러한 방식으로 결정하여 비교할 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 일치를 지칭한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)을 이들의 ％ 동일성을 결정함으로써 비교할 수 있다. 2개의 서열 (핵산 또는 아미노산 서열)의 ％ 동일성은 정렬된 2개의 서열들 간의 정확한 매치(match)의 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 핵산 서열들에 대한 대략적인 정렬은 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소적인 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알고리즘은 [Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure. M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA]에 의해 개발되고 [Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 표준화된 채점 매트릭스를 사용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 ％ 동일성을 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적인 실행이 <Genetics Computer Group (Madison, WI)>에 의해 "BestFit" 유틸리티 애플리케이션에서 제공된다. 이러한 방법의 디폴트 파라메터가 [Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995)] (Genetics Computer Group (Madison, WI)으로부터 입수가능)에 기술되어 있다. 본 발명의 문맥에서 ％ 동일성을 수립하는 바람직한 방법은 <University of Edinburgh>에 저작권이 있고, John F. Collins 및 Shane S. Sturrok가 개발하였으며, IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)에서 공급하는 MPSRCH 패키지를 사용하는 것이다. 이러한 한벌의 패키지로부터, Smith-Waterman 알고리즘를 사용할 수 있고, 이때 디폴트 파라메터가 채점표에 사용된다 (예를 들어, 갭 오픈 패널티 12, 갭 확장 페널티 1, 및 갭 6). 생성된 데이터로부터, "매치" 값이 서열 동일성을 반영한다. 서열들 간의 ％ 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 기타 적절한 프로그램이 당업계에 일반적으로 알려져 있고, 예를 들어, 또다른 정렬 프로그램은 디폴트 파라메터와 함께 사용되는 BLAST이다. 예를 들어, 하기의 디폴트 파라메터를 사용하여 BLASTN 및 BLASTP를 사용할 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽; 컷오프(cutoff) = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개의 서열; 분류 방식 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복성, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 이러한 프로그램의 상세사항을 인터넷에서 확인할 수 있다. 본원에 기술된 서열과 관련하여, 원하는 서열 동일성 정도의 범위는 약 35％ 내지 100％ 및 이들 사이의 임의의 정수값이다. 전형적으로, 서열들 간의 ％ 동일성은 적어도 35％-40％; 40％-45％; 45％-50％; 50％-60％; 60％-70％; 70-75％, 바람직하게는 80-82％, 더욱 바람직하게는 85-90％, 더욱 더 바람직하게는 92％, 더더욱 바람직하게는 95％, 가장 바람직하게는 98％의 서열 동일성이다.
별법적으로, 상동성 영역들 간에 안정적인 듀플렉스(duplex)가 형성되도록 하는 조건 하에 폴리뉴클레오티드들을 혼성화시킨 후, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제(들)로 소화시키고, 소화된 단편들의 크기를 결정함으로써 폴리뉴클레오티드들 간의 서열 유사성 정도를 결정할 수 있다. 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩티드 서열들은, 상기의 방법들을 사용하여 결정했을 때 서열들이 적어도 약 70％-75％, 바람직하게는 80％-82％, 더욱 바람직하게는 85％-90％, 더욱 더 바람직하게는 92％, 더더욱 바람직하게는 95％, 가장 바람직하게는 98％의 서열 동일성을 나타내는 경우, 서로에 대해 실질적으로 상동성이다. 본원에서 사용된 실질적인 상동성은 특정 DNA 또는 폴리펩티드 서열에 완전한 동일성을 나타내는 서열을 또한 지칭한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열들은 서던 혼성화 실험, 예를 들어, 특정 시스템에 대해 정의되는 바와 같은 엄격한 조건 하에서의 실험에서 확인될 수 있다. 적합한 혼성화 조건을 규정하는 것은 당업계의 기술에 속한다. 예를 들어, [Sambrook et al., 상기 문헌]; [Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press] 참조.
2개의 핵산 단편의 선택적인 혼성화를 하기와 같이 결정할 수 있다. 2개의 핵산 분자 간의 서열 동일성 정도는 이같은 분자들 간의 혼성화 이벤트의 효율 및 강도에 영향을 미친다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자에 대한 완전히 동일한 서열의 혼성화를 적어도 부분적으로 억제할 것이다. 완전히 동일한 서열의 혼성화의 억제를 당업계에 주지된 혼성화 분석법 (예를 들어, 서던 (DNA) 블롯, 노던(Northern) (RNA) 블롯, 용액 혼성화 등; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y. 참조)을 사용하여 평가할 수 있다. 다양한 정도의 선택성을 사용하여, 예를 들어, 낮은 엄격도에서 높은 엄격도까지 다양한 조건을 사용하여, 이같은 분석법을 수행할 수 있다. 낮은 엄격도의 조건이 사용된 경우, 부분적인 정도의 서열 동일성도 없는 2차 프로브 (예를 들어, 표적 서열과의 서열 동일성이 약 30％ 미만인 프로브)를 사용하여 비-특이적 결합의 부재를 평가할 수 있고, 이때 비-특이적 결합 이벤트의 부재 하에 2차 프로브는 표적에 혼성화하지 않을 것이다.
혼성화를 기초로 하는 검출 시스템을 사용하는 경우, 기준 핵산 서열에 상보적인 핵산 프로브가 선택된 후, 적합한 조건의 선택에 의해 프로브 및 기준 서열이 선택적으로 서로 혼성화 또는 결합하여, 듀플렉스 분자를 형성한다. 전형적으로, 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건 하에 기준 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는 선택된 핵산 프로브의 서열과의 서열 동일성이 약 70％ 이상인, 길이가 뉴클레오티드 약 10-14개 이상인 표적 핵산 서열의 검출을 허용하는 조건 하에 혼성화한다. 전형적으로, 엄격한 혼성화 조건은 선택된 핵산 프로브의 서열과의 서열 동일성이 약 90-95％를 초과하는, 길이가 뉴클레오티드 약 10-14개 이상인 표적 핵산 서열의 검출을 허용한다. 프로브 및 기준 서열이 특정한 정도의 서열 동일성을 갖는 경우, 프로브/기준 서열 혼성화에 유용한 혼성화 조건은 당업계에 공지된 바와 같이 결정할 수 있다 (예를 들어, [Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press] 참조).
혼성화 조건은 당업자에게 주지되어 있다. 혼성화 엄격도는 혼성화 조건이 미스매칭(mismatching)된 뉴클레오티드들을 함유하는 하이브리드의 형성을 냉대하는 정도를 지칭하고, 엄격도가 높을수록 미스매칭된 하이브리드에 대한 허용이 낮아진다. 혼성화의 엄격도에 영향을 미치는 인자들은 당업자에게 주지되어 있고, 온도, pH, 이온 강도, 및 유기 용매 예컨대 포름아미드 및 디메틸술폭시드의 농도를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 당업자에게 주지된 바와 같이, 혼성화 엄격도는 온도가 높을수록, 이온 강도가 낮을수록, 그리고 용매 농도가 낮을수록 증가된다.
혼성화에 대한 엄격도 조건과 관련하여, 예를 들어, 서열의 길이 및 성질, 다양한 서열의 염기 조성, 염 및 기타 혼성화 용액 성분의 농도, 혼성화 용액 내의 차단제 (예를 들어, 덱스트란 술페이트, 및 폴리에틸렌 글리콜)의 존재 또는 부재, 혼성화 반응 온도 및 시간 파라메터를 변화시킴으로써, 뿐만 아니라 세정 조건을 변화시킴으로써, 수많은 등가의 조건을 사용하여 특정 엄격도를 수립할 수 있다는 것이 당업계에 주지되어 있다. 특정 셋트의 혼성화 조건의 선택은 당업계의 표준 방법을 따라 선택된다 (예를 들어, [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조).
"재조합"은 2개의 폴리뉴클레오티드 간의 유전자 정보의 교환 프로세스를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, "상동 재조합 (HR)"은 세포 내에서의 이중 가닥 파손의 복구 동안 예를 들어 일어나는, 특수화된 형태의 이같은 교환을 지칭한다. 이러한 프로세스는 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥이 파손된 분자)의 주형 복구를 위해 "도너" 분자를 사용하며, "비-교차 유전자 전환" 또는 "숏트랙(short tract) 유전자 전환"으로 다양하게 알려져 있는데, 이는 도너로부터 표적으로 유전자 정보가 전달되기 때문이다. 어떠한 특정 이론에도 구속되기를 원치 않으면서, 이같은 전달에는 파손된 표적과 도너 사이에 형성된 헤테로듀플렉스(heteroduplex) DNA의 미스매치 수정, 및/또는 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하는데 도너가 사용되는 "합성-의존적 가닥 어닐링(annealing)", 및/또는 관련된 프로세스가 수반될 수 있다. 이같은 특수화된 HR로 표적 분자의 서열의 변경이 종종 초래되어, 도너 폴리뉴클레오티드의 서열의 일부분 또는 전체가 표적 폴리뉴클레오티드 내로 혼입된다.
"절단"은 DNA 분자의 공유결합 골격의 파손을 지칭한다. 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 절단이 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단 및 이중 가닥 절단 모두가 가능하고, 이중 가닥 절단은 2개의 별도의 단일 가닥 절단 이벤트의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단으로 블런트(blunt) 말단 또는 엇갈린(staggered) 말단이 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 융합 폴리펩티드가 표적화된 이중 가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 도메인"은 DNA 절단을 위한 촉매적 활성을 지니는 폴리펩티드 서열을 하나 이상 포함한다. 절단 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 내에 함유될 수 있거나, 절단 활성이 2개 (또는 그 이상)의 폴리펩티드의 회합으로부터 초래될 수 있다.
"절단 절반-도메인"은, 제2의 폴리펩티드 (동일하거나 상이함)와 함께, 절단 활성 (바람직하게는 이중 가닥 절단 활성)이 있는 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다.
"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조물이다. 세포 염색질은 핵산 (주로 DNA), 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질이 포함되는 단백질을 포함한다. 대다수의 진핵생물 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하고, 이때 뉴클레오솜 코어(core)는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 각각 2개씩 포함하는 8량체와 회합된 약 150개의 염기쌍의 DNA를 포함하고, 링커(linker) DNA (생물에 따라 길이가 다양함)가 뉴클레오솜 코어들 사이에 연장된다. 히스톤 H1의 분자가 링커 DNA와 일반적으로 회합된다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "염색질"은 모든 유형의 세포 핵단백질 (원핵생물 및 진핵생물 모두)를 포함하도록 의도된다. 세포 염색질은 염색체 염색질 및 에피솜 염색질 모두를 포함한다.
"염색체"는 세포의 게놈 전체 또는 이의 일부분을 이루는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 세포의 게놈을 이루는 염색체 모두의 수집물인 핵형에 의해 종종 특성화된다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 세포의 염색체 핵형의 일부분이 아닌, 복제성 핵산, 핵단백질 복합체 또는 핵산을 포함하는 기타 구조물이다. 에피솜의 예로는 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈이 포함된다.
"접근가능 영역"은 핵산 내에 존재하는 표적 부위에 표적 부위를 인식하는 외인성 분자가 결합할 수 있는, 세포 염색질 내의 부위이다. 어떠한 특정한 이론에도 제한되기를 원치 않으면서, 접근가능 영역은 뉴클레오솜 구조물 내로 패키징되지 않는 영역인 것으로 여겨진다. 접근가능 영역의 독특한 구조는 화학적 및 효소적 프로브, 예를 들어, 뉴클레아제에 대한 감도에 의해 종종 검출될 수 있다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합에 충분한 조건이 존재하는 경우, 결합 분자가 결합할 핵산의 부분을 규정하는 핵산 서열이다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'은 Eco RI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위이다.
"외인성" 분자는 정상적으로는 세포 내에 존재하지 않지만 하나 이상의 유전학적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포 내의 정상적인 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건에 관하여 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배아 발달 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포에 대해 외인성 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유도된 분자는 열 충격을 받지 않은 세포에 대해 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어, 기능부전 내인성 분자의 기능화 버젼 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능부전 버젼을 포함할 수 있다.
특히, 외인성 분자는 소형 분자, 예컨대 조합 화학 프로세스에 의해 생성된 분자, 또는 거대 분자 예컨대 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자들의 임의의 변형 유도체, 또는 상기 분자를 하나 이상 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산에는 DNA 및 RNA가 포함되고, 이는 단일- 또는 이중 가닥일 수 있으며, 선형, 분지형 또는 원형일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 핵산에는 듀플렉스를 형성할 수 있는 것들, 뿐만 아니라 트리플렉스-형성 핵산이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,176,996 및 5,422,251 참조. 단백질에는 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 리컴비나제, 리가제, 토포이소머라제, 자이라제 및 헬라카제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 게놈, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) T-가닥, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 정상적으로는 세포 내에 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 당법은 당업자에게 주지되어 있고, 지질-매개 전달 (즉, 리포솜 (중성 및 양이온성 지질 포함)), 전기천공, 직접적인 주입, 세포 융합, 입자 포격, 인산칼슘 공침전, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
반면에, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하에 특정 발달 단계에서 특정 세포 내에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 기타 세포소기관의 게놈, 또는 천연-발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 내인성 분자에는 단백질, 예를 들어, 전사 인자 및 효소가 포함될 수 있다.
"융합" 분자는 2개 이상의 서브유닛 분자가 연결된, 바람직하게는 공유결합으로 연결된 분자이다. 서브유닛 분자들은 동일한 화학 유형의 분자일 수 있거나, 또는 상이한 화학 유형의 분자일 수 있다. 제1 유형의 융합 분자의 예에는 융합 단백질 (예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인 간의 융합물) 및 융합 핵산 (예를 들어, 상기에 기술된 융합 단백질을 코딩하는 핵산)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 제2 유형의 융합 분자의 예로는 트리플렉스-형성 핵산과 폴리펩티드 간의 융합물, 및 마이너 그루브(minor groove) 결합제와 핵산 간의 융합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
세포 내에서의 융합 단백질의 발현은 융합 단백질을 세포에 전달함으로써 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달함으로써 초래될 수 있고, 후자의 경우 상기 폴리뉴클레오티드가 전사되고, 전사물이 번역되어 융합 단백질이 생성된다. 트랜스-스플라이싱, 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 결찰이 세포 내에서의 단백질의 발현에서 또한 수반될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포에 전달하는 방법이 본 발명의 다른 곳에서 제시된다.
본 발명의 목적을 위해, "유전자"는 유전자 생성물 (하기 참조)를 코딩하는 DNA 영역을 포함하고, 뿐만 아니라 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다 (이같은 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 이웃하는지 여부와 상관없이). 따라서, 유전자에는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 도입 부위, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
"유전자 발현"은 유전자 내에 함유된 정보가 유전자 생성물로 전환되는 것을 지칭한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접적인 전사 생성물 (예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스(antisense) RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 임의의 기타 유형의 RNA), 또는 mRNA의 번역에 의해 생산되는 단백질일 수 있다. 유전자 생성물에는 캡핑(capping), 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집과 같은 프로세스에 의해 변형된 RNA, 및 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 예를 들어 변형된 단백질이 또한 포함된다.
유전자 발현의 "조정"은 유전자 활성에서의 변화를 지칭한다. 발현 조정에는 유전자 활성화 및 유전자 억제가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
"식물" 세포에는 단자엽 또는 쌍자엽 식물의 세포가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 단자엽 식물의 비-제한적인 예로는 곡초류 예컨대 옥수수, 쌀, 보리, 귀리, 밀, 수수, 호밀, 사탕수수, 파인애플, 양파, 바나나, 및 코코넛이 포함된다. 쌍자엽 식물의 비-제한적인 예로는 담배, 토마토, 해바라기, 면, 사탕무, 감자, 양상추, 멜론, 대두, 캐놀라 (평지씨), 및 알팔파가 포함된다. 식물 세포는 식물의 임의의 부분으로부터 및/또는 임의의 식물 발달 단계로부터 수득될 수 있다.
"당해 영역"은 이러한 영역 내에서 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한 세포 염색질의 임의의 영역, 예컨대 유전자 또는 유전자 내부의 또는 유전자에 이웃한 비-코딩 서열이다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합을 목적으로 할 수 있다. 예를 들어, 당해 영역은 염색체, 에피솜, 세포소기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 게놈 내에 존재할 수 있다. 당해 영역은 유전자의 코딩 영역 내에, 전사된 비-코딩 영역 예컨대 리더(leader) 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내에, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류의 비-전사 영역 내에 있을 수 있다. 당해 영역의 길이는 단일 뉴클레오티드 쌍만큼 작을 수 있거나, 또는 25,000개까지의 뉴클레오티드 쌍, 또는 임의의 정수값의 뉴클레오티드 쌍일 수 있다.
용어 "작동성 연결" 및 "작동적으로 연결된" (또는 "작동가능하게 연결된")은 2개 이상의 성분 (예컨대 서열 요소)의 병렬과 관련하여 상호교환가능하게 사용되고, 이때 성분들은 양쪽 성분 모두가 정상적으로 기능하고 하나 이상의 성분이 하나 이상의 다른 성분에 발휘되는 기능을 매개할 수 있게 하도록 정렬된다. 예를 들어, 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터는, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 응답하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 일반적으로 전사 조절 서열은 코딩 서열과 시스(cis) 형태로 작동적으로 연결되지만, 이에 직접적으로 이웃할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서와 코딩 서열이 인접성이지 않더라도, 인핸서는 코딩 서열에 작동적으로 연결된 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "작동적으로 연결된"은 각각의 성분이 다른 성분에 연결된 상태에서 이렇게 연결되지 않았을 때와 동일한 기능을 수행한다는 사실을 지칭할 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩티드와 관련하여, 융합 폴리펩티드 내에서, ZFP DNA-결합 도메인 부분이 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있으면서 절단 도메인이 표적 부위 부근에서 DNA를 절단할 수 있다면, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 작동적으로 연결되어 있다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능성 단편"은 서열이 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지는 않지만 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능성 단편은 상응하는 천연 분자보다 많거나, 적거나 또는 이와 동일한 개수의 잔기를 보유할 수 있고/있거나, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능 (예를 들어, 코딩 기능, 또다른 핵산에 혼성화하는 능력)을 결정하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 유사하게, 단백질의 기능을 결정하는 방법이 주지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 DNA-결합 기능을, 예를 들어, 필터-결합, 전기영동 이동도-시프트, 또는 면역침전 분석법에 의해 결정할 수 있다. 젤 전기영동에 의해 DNA 절단을 분석할 수 있다. [Ausubel et al., 상기 문헌] 참조. 또다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력을, 예를 들어, 공동-면역침전, 2-하이브리드 분석법 또는 상보성 (유전학적 및 생화학적 모두)에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, [Fields et al. (1989) Nature 340:245-246]; 미국 특허 번호 5,585,245 및 PCT WO 98/44350 참조.
표적 부위
개시된 방법 및 조성물은 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인) 및 아연 손가락 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 이때 아연 손가락 도메인은, 세포 염색질 내의 서열 (예를 들어, 표적 부위 또는 결합 부위)에 결합함으로써, 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인)의 활성을 상기 서열의 부근으로 지시하고, 따라서 표적 서열의 부근에서 절단을 유도한다. 본 발명의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 아연 손가락 도메인은 실제로 모든 원하는 서열에 결합되도록 조작될 수 있다. 따라서, 절단 또는 재조합을 원하는 서열을 함유하는 당해 영역을 확인한 후, 하나 이상의 아연 손가락 결합 도메인을 당해 영역 내의 하나 이상의 서열에 결합하도록 조작할 수 있다. 세포 내에서의 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질 (또는 각각 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질)의 발현은 당해 영역에서의 절단을 실행시킨다.
예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 번호 6,453,242 (2002년 9월 17일)에 개시된 방법에 따라, 아연 손가락 도메인이 결합하는 세포 염색질 내의 서열 (예를 들어, 표적 부위)을 선별할 수 있고, 상기 특허에는 선별된 서열에 결합하는 ZFP를 디자인하는 방법이 또한 개시되어 있다. 뉴클레오티드 서열의 간단한 육안 검사를 표적 부위의 선별에 또한 사용할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 청구된 방법에서 표적 부위 선별을 위한 임의의 수단이 사용될 수 있다.
표적 부위는 다수의 이웃한 표적 하위부위들로 일반적으로 구성된다. 표적 하위부위는 개별적인 아연 손가락이 결합하는 서열 (일반적으로 뉴클레오티드 3중자(triplet), 또는 이웃한 4중자(quadruplet)와 1개의 뉴클레오티드가 중첩될 수 있는 뉴클레오티드 4중자)을 지칭한다. 예를 들어, WO 02/077227 참조. 아연 손가락 단백질이 최대의 접촉을 이루는 가닥을 표적 가닥 "1차 인식 가닥" 또는 "1차 접촉 가닥"으로 지정하면, 일부 아연 손가락 단백질은 표적 가닥 내의 염기 3개의 3중자 및 비-표적 가닥 상의 4번째 염기에 결합한다. 표적 부위는 일반적으로 길이가 뉴클레오티드 9개 이상이고, 따라서 3개 이상의 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 결합 도메인에 의해 결합된다. 그러나, 예를 들어, 손가락 4개의 결합 도메인이 뉴클레오티드 12개의 표적 부위에, 손가락 5개의 결합 도메인이 뉴클레오티드 15개의 표적 부위에, 또는 손가락 6개의 결합 도메인이 뉴클레오티드 18개의 표적 부위에 결합하는 것이 또한 가능하다. 명백할 바와 같이, 더 큰 결합 도메인 (예를 들어, 손가락 7개, 8개, 9개 또는 그 이상)이 더 긴 표적 부위에 결합하는 것이 또한 가능하다.
표적 부위가 뉴클레오티드 3개의 배수일 필요는 없다. 예를 들어, 가닥-교차 상호작용이 발생하는 경우 (예를 들어, 미국 특허 6,453,242 및 WO 02/077227 참조), 다중-손가락 결합 도메인의 개별적인 아연 손가락들 중 하나 이상이 중첩성 4중자 하위부위에 결합할 수 있다. 그 결과, 손가락 3개의 단백질이 뉴클레오티드 10개의 서열에 결합할 수 있고, 이때 10번째 뉴클레오티드는 말단 손가락이 결합하는 4중자의 일부분인 것, 손가락 4개의 단백질이 뉴클레오티드 13개의 서열에 결합할 수 있고, 이때 13번째 뉴클레오티드는 말단 손가락이 결합하는 4중자의 일부분인 것 등이 가능하다.
다중-손가락 결합 도메인 내의 개별적인 아연 손가락들 사이의 아미노산 링커 서열의 길이 및 성질이 표적 서열에 대한 결합에 또한 영향을 미친다. 예를 들어, 다중-손가락 결합 도메인 내의 개별적인 아연 손가락들 사이의 소위 "비-정규(non-canonical) 링커", "긴 링커" 또는 "구조화(structured) 링커"의 존재는 이러한 손가락들이 바로 이웃하지 않은 하위부위들에 결합하도록 할 수 있다. 이같은 링커의 비-제한적인 예가, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,479,626 및 WO 01/53480에 기술되어 있다. 따라서, 아연 손가락 결합 도메인에 대한 표적 부위 내의 하나 이상의 하위부위가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 의해 서로로부터 분리될 수 있다. 하나만 예를 들면, 손가락 4개의 결합 도메인이 인접한 2개의 뉴클레오티드 3개의 하위부위, 개재성 뉴클레오티드, 및 인접한 2개의 3중자 하위부위를 포함하는, 뉴클레오티드 13개의 표적 부위에 결합할 수 있다.
서열들 (예를 들어, 표적 부위들) 간의 거리는 서로 가장 가까운 서열 가장자리들로부터 측정된, 2개의 서열 사이에 개재된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 개수를 지칭한다.
2개의 아연 손가락 도메인/절단 절반-도메인 융합 분자들이 별도의 표적 부위들에 결합하는 것에 절단이 좌우되는 특정 실시양태에서, 2개의 표적 부위는 마주보는 DNA 가닥들 상에 있을 수 있다. 또다른 실시양태에서는, 양쪽 표적 부위 모두가 동일한 DNA 가닥 상에 있다.
아연 손가락 결합 도메인
아연 손가락 결합 도메인은 하나 이상의 아연 손가락을 포함한다. [Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614]; [Rhodes (1993) Scientific American Feb.:56-65]; 미국 특허 번호 6,453,242. 전형적으로, 단일 아연 손가락 도메인은아미노산 약 30개의 길이이다. 각각의 아연 손가락 도메인 (모티프)이 2개의 베타 시트 (2개의 불변 시스테인 잔기를 함유하는 베타 회전으로 유지됨) 및 알파 나선 (2개의 불변 히스티딘 잔기 함유)을 함유하고, 이들은 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘에 의한 아연 원자의 배위를 통해 특정 형상으로 유지되는 것으로 구조 연구에서 나타났다.
아연 손가락은 정규 C2H2 아연 손가락 (즉, 아연 이온이 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘 잔기와 배위된 손가락), 및 비-정규 아연 손가락, 예를 들어, C3H 아연 손가락 (아연 이온이 3개의 시스테인 잔기 및 1개의 히스티딘 잔기와 배위된 손가락) 및 C4 아연 손가락 (아연 이온이 4개의 시스테인 잔기와 배위된 손가락) 양쪽 모두를 포함한다. WO 02/057293을 또한 참조.
아연 손가락 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, [Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141]; [Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340]; [Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660]; [Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637]; [Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416] 참조. 조작된 아연 손가락 결합 도메인에는 천연 발생 아연 손가락 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성이 있을 수 있다. 조작 방법에는 논리적 디자인 및 다양한 유형의 선별이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 논리적 디자인은, 예를 들어, 3중자 (또는 4중자) 뉴클레오티드 서열 및 개별적인 아연 손가락 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하고, 이때 각각의 3중자 또는 4중자 뉴클레오티드 서열이 특정 3중자 또는 4중자 서열에 결합하는 아연 손가락의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261 참조. 추가적인 디자인 방법이, 예를 들어, 미국 특허 6,746,838; 6,785,613; 6,866,997; 및 7,030,215에 개시되어 있다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템이 포함되는 예시적인 선별 방법이 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다.
아연 손가락 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 강화가, 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 번호 6,794,136에 기술되어 있다.
개별적인 아연 손가락이 뉴클레오티드 3개 (즉, 3중자)의 서열 (또는 이웃한 아연 손가락의 뉴클레오티드 4개의 결합 부위와 1개의 뉴클레오티드가 중첩될 수 있는 뉴클레오티드 4개의 서열)에 결합하기 때문에, 아연 손가락 결합 도메인이 결합하도록 조작되는 서열 (예를 들어, 표적 서열)의 길이는 조작된 아연 손가락 결합 도메인 내의 아연 손가락의 개수를 결정할 것이다. 예를 들어, 손가락 모티프가 중첩성 하위부위에 결합하지 않는 ZFP에 대해, 뉴클레오티드 6개의 표적 서열에 손가락 2개의 결합 도메인이 결합하고, 뉴클레오티드 9개의 표적 서열에 손가락 3개의 결합 도메인이 결합한다. 본원에 언급된 바와 같이, 표적 부위 내의 개별적인 아연 손가락들에 대한 결합 부위 (즉, 하위부위)는 인접할 필요가 없고, 다중-손가락 결합 도메인 내의 아연 손가락들 사이의 아미노산 서열 (즉, 손가락간 링커)의 길이 및 성질에 따라, 1개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
다중-손가락 아연 손가락 결합 도메인에서, 이웃한 아연 손가락들은 아미노산 약 5개의 아미노산 링커 서열 (소위 "정규" 손가락간 링커)에 의해, 또는 별법적으로 하나 이상의 비-정규 링커에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 번호 6,453,242 및 6,534,261 참조. 3개를 초과하는 손가락을 포함하는 조작된 아연 손가락 결합 도메인에 대해, 특정 아연 손가락들 사이에 더 긴 ("비-정규") 손가락간 링커를 삽입하는 것이 바람직할 수 있는데, 결합 도메인에 의한 결합의 친화력 및/또는 특이성을 증가시킬 수 있기 때문이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,479,626 및 WO 01/53480 참조. 따라서, 다중-손가락 아연 손가락 결합 도메인이 비-정규 손가락간 링커의 존재 및 위치와 관련하여 또한 특성화될 수 있다. 예를 들어, 3개의 손가락 (2개의 정규 손가락간 링커로 연결됨), 긴 링커 및 3개의 추가적인 손가락 (2개의 정규 손가락간 링커로 연결됨)을 포함하는 손가락 6개의 아연 손가락 결합 도메인은 2×3 형상으로 표시된다. 유사하게, 2개의 손가락 (사이에 정규 링커 있음), 긴 링커 및 2개의 추가적인 손가락 (정규 링커로 연결됨)을 포함하는 결합 도메인은 2×2 단백질로 표시된다. 손가락 2개의 단위 (각각의 단위 내에서 2개의 손가락은 정규 링커로 연결됨)를 3개 포함하고, 각각의 손가락 2개의 단위는 긴 링커에 의해 이웃한 손가락 2개의 단위에 연결된 단백질은 3×2 단백질로 칭해진다.
다중-손가락 결합 도메인 내의 2개의 이웃한 아연 손가락 사이에 긴 링커 또는 비-정규 손가락간 링커가 존재하면, 종종 2개의 손가락이 표적 서열 내에서 바로 인접하지 않은 하위부위들에 결합하게 된다. 따라서, 표적 부위 내의 하위부위들 사이에 뉴클레오티드 1개 이상의 갭이 있을 수 있고, 즉, 표적 부위가 아연 손가락에 접촉되지 않는 1개 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 2×2 아연 손가락 결합 도메인은 1개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 뉴클레오티드 6개의 서열 2개에 결합할 수 있고, 즉, 뉴클레오티드 13개의 표적 부위에 결합한다. [Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1432-1436]; [Moore et al. (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1437-1441] 및 WO 01/53480을 또한 참조.
앞서 언급된 바와 같이, 표적 하위부위는 단일 아연 손가락이 결합하는 뉴클레오티드 3개 또는 4개의 서열이다. 특정 목적을 위해, 손가락 2개의 단위가 결합 모듈(module)로 표시된다. 결합 모듈은, 예를 들어, 특정한 뉴클레오티드 6개의 표적 서열에 결합하는. 다중-손가락 단백질 (일반적으로 3개의 손가락)의 정황에서의 2개의 이웃한 손가락을 선별함으로써 수득될 수 있다. 별법적으로, 개별적인 아연 손가락들의 조립에 의해 모듈이 구축될 수 있다. WO 98/53057 및 WO 01/53480을 또한 참조.
절단 도메인
본원에 개시된 융합 단백질의 절단 도메인 부분은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제에는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소성 엔도뉴클레아제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, [2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA]; 및 [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388] 참조. DNA를 절단하는 추가적인 효소들이 공지되어 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코쿠스 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; [Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993]를 또한 참조). 이러한 효소들 (또는 이의 기능성 단편) 중 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 원천으로 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반-도메인 (예를 들어, 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 융합 단백질)은 절단 활성을 위해 이량체화를 필요로 하는, 상기 기재된 바와 같은 임의의 뉴클레아제 또는 이의 일부분으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함한다면 2개의 융합 단백질이 절단에 필요하다. 별법적으로, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인이 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질이 각각의 표적 부위에 결합하는 것이 절단 절반-도메인들이 기능성 절단 도메인을 형성 (예를 들어, 이량체화에 의해 형성)하도록 절단 절반-도메인들을 서로에 대해 공간적으로 배향시키도록, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위들이 서로 관련되어 배치되는 것이 바람직하다. 따라서, 특정 실시양태에서, 표적 부위들의 가까운 가장자리들은 뉴클레오티드 5-8개 또는 뉴클레오티드 15-18개에 의해 분리된다. 그러나, 임의의 정수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 2개의 표적 부위들 사이에 개재될 수 있다 (예를 들어, 2개 내지 50개의 뉴클레오티드 또는 그 이상). 일반적으로, 절단점은 표적 부위들 사이에 존재한다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 다수의 종 내에 존재하고, DNA에 서열-특이적으로 결합할 수 있고 (인식 부위에서), 결합 부위에서 또는 결합 부위 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예를 들어, IIS형)는 인식 부위에서 떨어진 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합 도메인 및 절단 도메인이 있다. 예를 들어, IIS형 효소 Fok I은 한쪽 가닥 상의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오티드, 및 다른쪽 가닥 상의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오티드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라 [Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279]; [Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768]; [Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887]; [Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982] 참조. 따라서, 한 실시양태에서, 융합 단백질은 하나 이상의 IIS형 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인), 및 조작되거나 조작되지 않을 수 있는 하나 이상의 아연 손가락 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 IIS형 제한 효소는 Fok I이다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성이다. [Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575]. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에서 사용된 Fok I 효소의 일부분은 절단 절반-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 손가락-Fok I 융합물을 사용하는 표적화된 이중 가닥 절단 및/또는 세포 서열의 표적화된 교체를 위해, 각각 Fok I 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성하는데 사용될 수 있다. 별법적으로, 아연 손가락 결합 도메인 및 2개의 Fok I 절단 절반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자가 또한 사용될 수 있다. 아연 손가락-Fok I 융합물을 사용하는 표적화된 절단 및 표적화된 서열 변경을 위한 파라메터가 본 발명의 다른 곳에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 보유하거나 또는 기능성 절단 도메인을 형성하기 위해 다량체화 (예를 들어, 이량체화)되는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
대표적인 IIS형 제한 효소가 표 1에 열거된다. 추가적인 제한 효소들이 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 또한 함유하고, 이들은 본 발명에서 구현된다. 예를 들어, [Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420] 참조.
<표 1>
Figure 112009014396275-pct00001
아연 손가락 도메인-절단 도메인 융합물
융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 디자인 및 구축 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 아연 손가락 단백질을 포함하는 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 디자인 및 구축 방법이 공동 소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261에 기술되어 있다. 특정 실시양태에서, 이같은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 구축된다. 이러한 폴리뉴클레오티드가 벡터 내로 삽입될 수 있고, 벡터가 세포 내로 도입될 수 있다 (폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 벡터 및 방법에 관한 추가적인 개시를 위해 하기 참조).
본원에 기술된 방법의 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 아연 손가락 결합 도메인 및 Fok I 제한 효소로부터의 절단 절반-도메인을 포함하고, 2개의 이같은 융합 단백질이 세포 내에서 발현된다. 2개의 단백질을 세포에 전달하는 것, 1개의 단백질 및 단백질들 중 하나를 코딩하는 1개의 핵산을 세포에 전달하는 것, 단백질들 중 하나를 각각 코딩하는 2개의 핵산을 세포에 전달하는 것; 또는 양쪽 단백질 모두를 코딩하는 단일 핵산을 세포에 전달하는 것에 의해 세포 내에서 2개의 융합 단백질이 발현될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 융합 단백질은 2개의 절단 절반 도메인 및 아연 손가락 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 이러한 경우에, 단일 융합 단백질이 세포 내에서 발현되고, 이론에 제한되기를 원치 않으면서, 절단 절반-도메인들의 분자내 이량체가 형성된 결과로 DNA를 절단하는 것으로 여겨진다.
특정 실시양태에서, 아연 손가락 도메인이 융합 단백질의 가장 아미노 말단쪽에 있고, 절단 절반-도메인이 가장 카르복시 말단쪽에 있도록 융합 단백질 (예를 들어, ZFP-Fok I 융합물)의 성분들이 정렬된다. 이는 DNA-결합 도메인이 가장 아미노 말단쪽에 있고 절단 절반-도메인이 가장 카르복시 말단쪽에 있는, 이량체를 형성하는 천연 발생 절단 도메인들 예컨대 Fok I 효소로부터 유래된 것들에서의 절단 도메인의 상대적인 배향을 반영한다. 이러한 실시양태에서, 기능성 뉴클레아제를 형성하기 위한 절단 절반-도메인들의 이량체화는 융합 단백질들이 마주보는 DNA 가닥들 상의 부위에 결합하는 것에 의해 초래되고, 이때 결합 부위들의 5' 말단들이 서로에 대해 근접한다.
추가적인 실시양태에서, 절단 절반-도메인이 융합 단백질의 가장 아미노 말단쪽에 있고, 아연 손가락 도메인이 가장 카르복시 말단쪽에 있도록 융합 단백질 (예를 들어, ZFP-Fok I 융합물)의 성분들이 정렬된다. 이러한 실시양태에서, 기능성 뉴클레아제를 형성하기 위한 절단 절반-도메인들의 이량체화는 융합 단백질들이 마주보는 DNA 가닥들 상의 부위에 결합하는 것에 의해 초래되고, 이때 결합 부위들의 3' 말단들이 서로에 대해 근접한다.
또다른 추가적인 실시양태에서, 제1 융합 단백질은 융합 단백질의 가장 아미노 말단쪽에 있는 절단 절반-도메인 및 가장 카르복시 말단쪽에 있는 아연 손가락 도메인을 함유하고, 제2 융합 단백질은 아연 손가락 도메인이 융합 단백질의 가장 아미노 말단 쪽에 있고 절단 절반-도메인이 가장 카르복시 말단쪽에 있도록 정렬된다. 이러한 실시양태에서, 양쪽 융합 단백질이 동일한 DNA 가닥에 결합하고, 이때 가장 카르복시 말단 쪽에 아연 손가락 도메인을 함유하는 제1 융합 단백질의 결합 부위가 가장 아미노 말단 쪽에 아연 손가락 도메인을 함유하는 제2 융합 단백질의 결합 부위의 5' 측면에 위치한다.
개시된 융합 단백질의 특정 실시양태에서, 아연 손가락 도메인과 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인) 간의 아미노산 서열은 "ZC 링커"로 표시된다. ZC 링커는 상기 논의된 손가락간 링커와 구별되어야 한다. 절단을 최적화하는 ZC 링커를 수득하는 것에 관한 상세사항에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 공보 20050064474A1 및 20030232410, 및 국제 특허 공보 WO05/084190 참조.
표적화된 절단 방법
개시된 방법 및 조성물은 세포 염색질 내의 당해 영역 (예를 들어, 게놈, 예를 들어 유전자 (돌연변이체 또는 야생형) 내의 원하는 부위 또는 미리 정해진 부위)에서 DNA를 절단하는데 사용될 수 있다. 이같은 표적화된 DNA 절단을 위해, 아연 손가락 결합 도메인이 미리 정해진 절단 부위에서 또는 이러한 부위 근처에서 표적 부위에 결합하도록 조작되고, 조작된 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이 세포 내에서 발현된다. 융합 단백질의 아연 손가락 부분이 표적 부위에 결합하면, DNA가 절단 도메인에 의해 표적 부위 근처에서 절단된다. 정확한 절단 부위는 ZC 링커의 길이에 좌우될 수 있다.
별법적으로, 각각 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 세포 내에서 발현되고, 기능성 절단 도메인이 재구성되고 표적 부위 부근에서 DNA가 절단되는 방식으로 병렬된 표적 부위들에 결합한다. 한 실시양태에서, 절단은 2개의 아연 손가락 결합 도메인의 표적 부위들 사이에서 일어난다. 아연 손가락 결합 도메인들 중 하나 또는 양쪽 모두가 조작될 수 있다.
아연 손가락 결합 도메인-절단 도메인 융합 폴리펩티드를 사용하는 표적화된 절단을 위해, 결합 부위가 절단 부위를 포함할 수 있거나, 또는 결합 부위의 가까운 가장자리가 절단 부위로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 10개, 25개, 50개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 (또는 1개 내지 50개 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드)에 있을 수 있다. 절단 부위와 관련하여, 결합 부위의 정확한 위치는 특정 절단 도메인, 및 ZC 링커의 길이에 좌우될 것이다. 각각 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 폴리펩티드가 사용되는 방법을 위해, 일반적으로 결합 부위들은 절단 부위에 걸쳐진다. 따라서, 제1 결합 부위의 가까운 가장자리는 절단 부위의 한쪽 측면 상의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 10개, 25개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 (또는 1개 내지 50개 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드)에 있을 수 있고, 제2 결합 부위의 가까운 가장자리는 절단 부위의 또다른 측면 상의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 10개, 25개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 (또는 1개 내지 50개 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드)에 있을 수 있다. 시험관내 및 생체내에서 절단 부위의 지도를 작성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
따라서, 본원에 기술된 방법은 절단 도메인에 융합된 조작된 아연 손가락 결합 도메인을 사용할 것이다. 이러한 경우에, 결합 도메인은 절단을 원하는 곳에서 또는 근처에서 표적 서열에 결합하도록 조작된다. 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물 세포 내로 도입된다. 일단 세포 내부로 도입되거나 세포 내에서 발현되면, 융합 단백질이 표적 서열에 결합하고, 표적 서열에서 또는 표적 서열 근처에서 절단한다. 정확한 절단 부위는 절단 도메인의 성질 및/또는 결합 도메인과 절단 도메인 사이의 링커 서열의 존재 및/또는 성질에 좌우된다. 각각 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 사용되는 경우, 결합 부위의 가까운 가장자리들 간의 거리는 뉴클레오티드 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 25개 또는 그 이상 (또는 1개 내지 50개 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드)일 수 있다. 최적 수준의 절단은 2개의 융합 단백질의 결합 부위들 간의 거리 (예를 들어, [Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-3369]; [Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:289-297] 참조) 및 각각의 융합 단백질 내의 ZC 링커의 길이 모두에 또한 좌우될 수 있다. 미국 특허 공보 20050064474A1 및 국제 특허 공보 WO05/084190, WO05/014791 및 WO03/080809를 또한 참조.
특정 실시양태에서, 절단 도메인은 2개의 절단 절반-도메인을 포함하고, 이들은 결합 도메인, 제1 절단 절반-도메인 및 제2 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드의 일부분이다. 절단 절반-도메인들은 DNA를 절단하는 기능을 하는 한 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있다.
절단 절반-도메인들이 별개의 분자에서 또한 제공될 수 있다. 예를 들어, 2개의 융합 폴리펩티드가 세포 내로 도입될 수 있고, 이때 각각의 폴리펩티드가 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함한다. 절단 절반-도메인들은 DNA를 절단하는 기능을 하는 한 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있다. 추가로, 융합 폴리펩티드들이 결합되면, 절단 도메인의 재구성 (예를 들어, 절반-도메인들의 이량체화에 의한 재구성)을 허용하도록 2개의 절단 절반-도메인이 서로에 대해 공간적으로 배향됨으로써, 기능성 절단 도메인이 형성되도록 절단-도메인들이 서로에 대해 놓여, 당해 영역 내의 세포 염색질의 절단을 초래하는 방식으로 전형적으로 배열된 표적 서열들에 결합 도메인들이 결합한다. 일반적으로, 재구성된 절단 도메인에 의한 절단은 2개의 표적 서열들 사이에 위치한 부위에서 일어난다. 단백질들 중 하나 또는 양쪽 모두가 이의 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다.
2개의 융합 단백질이 동일한 극성 또는 반대의 극성으로 당해 영역에서 결합할 수 있고, 이들의 결합 부위 (즉, 표적 부위)는 임의의 개수의 뉴클레오티드, 예를 들어, 0개 내지 200개의 뉴클레오티드 또는 이들 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질에 대한 결합 부위들은 다른 결합 부위에 가장 가까운 각각의 결합 부위의 가장자리로부터 측정했을 때 5개 내지 18개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 5-8개의 뉴클레오티드, 또는 15-18개의 뉴클레오티드, 또는 6개의 뉴클레오티드, 또는 16개의 뉴클레오티드만큼 떨어져 있을 수 있고, 절단은 결합 부위들 사이에서 일어난다.
DNA가 절단되는 위치는 일반적으로 2개의 융합 단백질에 대한 결합 부위들 사이에 존재한다. DNA의 이중 가닥 파손은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 뉴클레오티드만큼 오프셋(offset)된 2개의 단일 가닥 파손 또는 "닉(nick)"으로부터 종종 초래된다 (예를 들어, 천연 Fok I에 의한 이중 가닥 DNA의 절단은 4개의 뉴클레오티드만큼 오프셋된 단일 가닥 파손들로부터 초래된다. 따라서, 절단이 반드시 각각의 DNA 가닥 상의 정확히 마주보는 부위들에서 일어나지는 않는다. 또한, 융합 단백질들의 구조 및 표적 부위들 간의 거리가 단일 뉴클레오티드 쌍 근처에서 절단이 일어나는지, 또는 여러 부위에서 절단이 일어나는지에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 표적화된 재조합 및 표적화된 돌연변이유발 (하기 참조)이 포함되는 다수의 용도에 대해, 광범위한 뉴클레오티드 내에서의 절단이 일반적으로 충분하고, 특정 염기쌍들 사이에서의 절단이 요구되지 않는다.
상기 언급된 바와 같이, 융합 단백질(들)이 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드로서 도입될 수 있다. 예를 들어, 각각 상기 언급된 폴리펩티드들 중 하나를 코딩하는 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있고, 폴리펩티드들이 발현되어 각각 이의 표적 서열에 결합하면, 표적 서열에서 또는 근처에서 절단이 일어난다. 별법적으로, 양쪽 융합 폴리펩티드를 코딩하는 서열들을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 임의의 변형 형태 또는 유사체 또는 DNA 및/또는 RNA일 수 있다.
절단 특이성을 강화하기 위해, 추가적인 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 절단 절반-도메인들이 제한된 이중 가닥 절단 활성을 나타낼 수 있다. 각각 손가락 3개의 아연 손가락 도메인 및 절단 절반-도메인을 함유하는 2개의 융합 단백질이 세포 내로 도입되는 방법에서, 한쪽 단백질이 뉴클레오티드 약 9개의 표적 부위를 특정한다. 포유류 게놈에서 뉴클레오티드 18개의 집합성 표적 서열은 유일할 수 있지만, 임의의 소정의 뉴클레오티드 9개의 표적 부위가 인간 게놈에서 평균적으로 약 23,000회 발생한다. 따라서, 단일 절반-도메인의 부위-특이적 결합으로 인해, 비-특이적 절단이 발생할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 방법에서, 절단 절반-도메인 예컨대 Fok I의 우성-음성 돌연변이체 (또는 이를 코딩하는 핵산)를 사용하는 것이 구현되고, 이는 2개의 융합 단백질과 함께 세포에서 발현된다. 우성-음성 돌연변이체는 이량체를 형성할 수 있지만, 절단할 수 없고, 또한 함께 이량체를 형성하는 절반-도메인의 절단 활성을 차단한다. 우성-음성 돌연변이체를 융합 단백질에 대해 몰 과량으로 제공함으로써, 양쪽 융합 단백질 모두가 결합된 영역에서만 기능성 절단 절반-도메인의 국소적인 농도가 이량체화 및 절단이 일어나기에 충분히 높을 것이다. 2개의 융합 단백질 중 하나만이 결합된 부위에서는, 이의 절단 절반-도메인이 우성-음성 돌연변이체 절반-도메인과 이량체를 형성하고, 원치 않는 비-특이적 절단이 발생하지 않는다.
Fok I 절단 절반-도메인 내의 3개의 촉매적 아미노산 잔기가 확인되었다: Asp 450, Asp 467 및 Lys 469. [Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575]. 따라서, 이러한 잔기들 중 하나에서의 하나 이상의 돌연변이를 사용하여, 우성-음성 돌연변이를 생성시킬 수 있다. 추가로, 또다른 IIS형 엔도뉴클레아제들의 다수의 촉매적 아미노산 잔기들이 공지되어 있고/있거나, 예를 들어, Fok I 서열과의 정렬에 의해 및/또는 촉매 활성에 대한 돌연변이체의 생성 및 테스트에 의해, 결정될 수 있다.
절단 절반-도메인에서의 이량체화 도메인 돌연변이
ZFP와 절단 절반-도메인 간의 융합물 (예를 들어, ZFP/FokI 융합물)의 사용을 수반하는 표적화된 절단 방법은 2개의 이같은 융합 분자의 사용을 필요로 하고, 일반적으로 이들은 각각 별개의 표적 서열에 대해 지시된다. 상기 논의된 바와 같이, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 서열은 표적화된 절단이 게놈 내의 유일한 부위에 대해 지시되도록 선택될 수 있다. 감소된 절단 특이성의 잠재적인 원인이 2개의 ZFP/절단 절반-도메인 융합물 중 하나의 동종이량체화로부터 초래될 수 있다. 이는, 예를 들어, 기능성 이량체의 형성을 허용하는 배향 및 간격으로 동일한 융합 단백질의 2개의 카피가 결합하도록 위치하는, 2개의 ZFP/절단 절반-도메인 융합물들 중 하나에 대한 표적 서열의 역위(inverted) 반복물이 게놈 내에 존재하기 때문에 일어날 수 있다.
의도된 표적 부위 이외의 서열에서 이러한 유형으로 비정상적으로 절단되는 가능성을 감소시키기 위한 한 접근법은 동종이량체화를 최소화하거나 방지하는 절단 절반-도메인의 변이체를 생성시키는 것을 수반한다. 바람직하게는, 이량체화에 수반되는 절반-도메인의 영역 내의 하나 이상의 아미노산이 변경된다. FokI 단백질 이량체의 결정 구조에서, 절단 절반-도메인들의 구조가 FokI에 의한 DNA 절단 동안의 절단 절반-도메인들의 정렬과 유사한 것으로 보고되었다. [Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569]. 이러한 구조는 위치 483 및 487에서의 아미노산 잔기가 FokI 절단 절반-도메인들의 이량체화에서 중요한 역할을 한다는 것을 가리킨다. 이러한 구조는 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에서의 아미노산 잔기들이 모두 이량체화 계면에 충분히 가까와서, 이량체화에 영향을 미친다는 것을 또한 가리킨다. 따라서, 상기 언급된 위치들 중 하나 이상에서의 아미노산 서열 변경은 절단 절반-도메인의 이량체화 성질을 변경시킬 것이다. 예를 들어, 이러한 위치들에서 상이한 아미노산 잔기를 함유하는 (또는 코딩하는) 라이브러리를 구축하고 원하는 성질이 있는 변이체를 선택함으로써, 또는 개별적인 돌연변이체들을 논리적으로 디자인함으로써, 이같은 변화가 도입될 수 있다. 동종이량체화를 방지하는 것에 더하여, 이러한 돌연변이들 중 일부가 절단 효율을 2개의 야생형 절단 절반-도메인으로 수득된 효율을 초과하도록 증가시킬 수 있는 것이 또한 가능하다.
따라서, 이량체화에 영향을 미치는 임의의 아미노산 잔기에서의 FokI 절단 절반-도메인의 변경을 사용하여, 원치 않는 서열에서의 절단에 이를 수 있는 동종이량체화가 한쌍의 ZFP/FokI 융합물 중 하나에 진행되는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 한쌍의 ZFP/FokI 융합물을 사용하는 표적화된 절단을 위해, 자가-이량체화를 억제하지만, 원하는 표적 부위에서 절단이 일어나도록 2개의 융합 단백질의 이종이량체화가 일어나도록 하는 하나 이상의 아미노산 변경을 융합 단백질들 중 하나 또는 양쪽 모두가 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 변경이 양쪽 모두의 융합 단백질에 존재하고, 변경에 추가적인 효과가 있으며, 즉, 부적절한 절단에 이르는, 어느 한쪽 융합물의 동종이량체화가 최소화되거나 폐지되면서, 야생형 절단 절반-도메인들로 수득되는 것에 비하여 2개의 융합 단백질의 이종이량체화가 용이해진다.
게놈 서열의 표적화된 변경 및 표적화된 재조합을 위한 방법
게놈 서열 (예를 들어, 세포 염색질 내의 당해 영역)을 동일하지 않은 상동성 서열로 교체하는 방법 (즉, 표적화된 재조합)이 본원에서 또한 기술된다. 특정 서열을 교체하려는 기존의 시도에서는, 세포를 염색체 영역에 대한 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (즉, 도너 DNA)와 접촉시킨 후, 도너 DNA 분자에 게놈 내로의 상동 재조합이 진행된 세포를 선별하는 것이 수반되었다. 불량한 효율의 상동 재조합, 및 표적 부위 이외의 게놈 영역 내로의 도너 DNA의 높은 빈도의 비-특이적 삽입으로 인해, 이러한 방법은 성공률이 낮다.
본 발명은 더 높은 효율의 표적화된 재조합 및 더 낮은 빈도의 비-특이적 삽입 이벤트를 특징으로 하는, 표적화된 서열 변경 방법을 제공한다. 이 방법은 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인)에 융합된 조작된 아연 손가락 결합 도메인을 제조 및 사용하여, 세포 DNA 내에 하나 이상의 표적화된 이중 가닥 파손을 만드는 것을 수반한다. 세포 DNA 내의 이중 가닥 파손은 절단 부위 부근에서 세포 복구 메커니즘을 수천배 자극하기 때문에, 이같은 표적화된 절단은 게놈 내의 실질적으로 모든 부위에서 서열을 변경 또는 교체시킨다 (상동성-지시 복구를 통해).
본원에 기술된 융합 분자에 더하여, 선별된 게놈 서열의 표적화된 교체는 교체 (또는 도너) 서열의 도입을 또한 필요로 한다. 도너 서열은 융합 단백질(들)의 발현 전에, 이와 동시에, 또는 이에 이어서 세포 내로 도입될 수 있다. 도너 폴리뉴클레오티드는 게놈 서열에 대한 충분한 상동성을 함유하여, 자신이 상동성인 게놈 서열과 자신 간의 상동 재조합 (또는 상동성-지시 복구)을 지지한다. 도너와 게놈 서열 간의 뉴클레오티드 약 25개, 50개, 100개, 200개, 500개, 750개, 1,000개, 1,500개, 2,000개 또는 그 이상 (또는 뉴클레오티드 10개 내지 2,000개 사이, 또는 그 이상의 임의의 정수값)의 서열 상동성이 이들 간의 상동 재조합을 지지할 것이다. 도너 서열의 길이는 10개 내지 5,000개의 뉴클레오티드 (또는 이들 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드) 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 도너 서열은 전형적으로 자신이 교체하는 게놈 서열과 동일하지 않다는 것이 명백할 것이다. 예를 들어, 염색체 서열과의 충분한 상동성이 존재하는 한, 도너 폴리뉴클레오티드의 서열은 게놈 서열과 관련하여 하나 이상의 단일 염기 교환, 삽입, 결실, 역위 또는 재배열을 함유할 수 있다. 별법적으로, 도너 서열은 2개의 상동성 영역이 플랭킹(flanking)된 비-상동성 서열을 함유할 수 있다. 추가적으로, 도너 서열은 세포 염색질 내의 당해 영역에 상동성이지 않은 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 일반적으로, 도너 서열의 상동성 영역(들)은 재조합을 원하는 게놈 서열과의 서열 동일성이 50％ 이상일 것이다. 특정 실시양태에서, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％, 99％, 또는 99.9％의 서열 동일성이 존재한다. 도너 폴리뉴클레오티드의 길이에 따라, 1％ 내지 100％ 사이의 임의의 값의 서열 동일성이 존재할 수 있다.
도너 분자는 세포 염색질에 대한 여러 개의 비연속적인 상동성 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 정상적으로는 당해 영역 내에 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열이 도너 핵산 분자 내에 존재할 수 있고, 당해 영역 내의 서열에 대한 상동성 영역이 상기 서열에 플랭킹될 수 있다.
도너 서열의 성공적인 삽입을 결정하기 위한 분석법 (예를 들어, 혼성화, PCR, 제한 효소 소화)을 단순화하기 위해, 게놈 서열과 비교하여 도너 서열 내에 특정한 서열 차이가 존재할 수 있다. 바람직하게는, 코딩 영역 내에 위치하는 경우, 이같은 뉴클레오티드 서열 차이는 아미노산 서열을 변화시키지 않거나, 또는 침묵 아미노산 변화 (즉, 단백질의 구조 또는 기능에 영향을 미치지 않는 변화)를 일으킬 것이다. 도너 폴리뉴클레오티드는 당해 영역 내의 아연 손가락 도메인 결합 부위에 상응하는 서열에서의 변화를 임의로 함유하여, 상동 재조합에 의해 세포 염색질 내로 도입된 도너 서열의 절단을 방지할 수 있다.
도너 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 선형 또는 원형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되면, 당업자에게 공지된 방법에 의해 도너 서열의 말단들이 보호될 수 있다 (예를 들어, 엑소뉴클레오라이틱(exonucleolytic) 분해로부터). 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 부가되고/되거나, 자가-상보적 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 결찰된다. 예를 들어, [Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963]; [Nehls et al. (1996) Science 272:886-889] 참조. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오티드를 보호하기 위한 추가적인 방법에는 말단 아미노 기(들)의 부가, 및 변형된 뉴클레오티드간 결합, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기의 사용이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
폴리뉴클레오티드는 복제 기원, 프로모터 및 항생제 저항성을 코딩하는 유전자와 같은 추가적인 서열이 있는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, 도너 폴리뉴클레오티드는 네이키드(naked) 핵산으로서, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체를 이룬 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 박테리아 또는 바이러스 (예를 들어, 아그로박테리움, 리조비움 종(Rhizobium sp.) NGR234, 시노리조비움 멜리오티(Sinorhizobium meliloti), 메조리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 담배 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X, 컬리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 엽맥 모자이크 바이러스)에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, [Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4 참조.
한가지 이론에 속박되지 않으면서, 세포 서열 내에 이중 가닥 파손이 존재하는 것은, 파손부에 이웃한 또는 파손부 주변의 영역에 대한 상동성이 있는 외인성 DNA 분자의 존재와 커플링되었을 때, 도너 분자로부터 세포 (예를 들어, 게놈 또는 염색체) 서열 내로의 서열 정보 전달에 의해, 즉, "유전자 전환"으로 또한 알려진 상동성-지시 복구 프로세스에 의해 파손을 복구하는 세포 메커니즘을 활성화시키는 것으로 보인다. 출원인의 방법은 조작된 ZFP의 강력한 표적화 능력을 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인)과 유리하게 조합시켜, 이중 가닥 파손을 외인성 서열의 삽입을 원하는 게놈의 영역으로 특이적으로 표적화시킨다.
염색체 서열의 변경을 위해, 원하는 서열 변경을 일으키도록 충분한 도너 서열이 카피되는 한, 도너의 전체 서열이 염색체 내부로 카피될 필요는 없다.
상동 재조합에 의한 도너 서열 삽입의 효율은 재조합을 원하는 부위와 이중 가닥 파손 간의 거리 (세포 DNA 내에서의 거리)에 반비례한다. 바꿔 말하면, 이중 가닥 파손이 재조합을 원하는 부위에 가까울수록 더 높은 상동 재조합 효율이 관찰된다. 정확한 재조합 부위가 미리 정해지지 않은 경우 (예를 들어, 원하는 재조합 이벤트가 게놈 서열의 간격에 걸쳐 일어날 수 있다), 도너 핵산의 길이 및 서열이, 절단 부위(들)과 함께, 원하는 재조합 이벤트가 수득되도록 선택될 수 있다. 원하는 이벤트가 게놈 서열 내의 단일 뉴클레오티드 쌍의 서열을 변화시키도록 디자인되는 경우, 세포 염색질이 이러한 뉴클레오티드 쌍의 어느 한쪽 측면 상의 뉴클레오티드 10,000개 이내에서 절단된다. 특정 실시양태에서, 절단은 서열이 변화되는 뉴클레오티드 쌍의 어느 한쪽 측면 상의 뉴클레오티드 1,000개, 500개, 200개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개, 30개, 20개, 10개, 5개, 또는 2개 이내, 또는 2개 내지 1,000개 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드 이내에서 일어난다.
상기 상술된 바와 같이, 각각 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질에 대한 결합 부위는 다른 결합 부위에서 가장 가까운 각각의 결합 부위의 가장자리로부터 측정했을 때 5-8개 또는 15-18개의 뉴클레오티드만큼 떨어져 있을 수 있고, 절단은 결합 부위들 사이에서 일어난다. 절단이 결합 부위들 사이의 단일 부위 또는 다중 부위에서 일어나는지 여부는 중요하지 않은데, 절단된 게놈 서열이 도너 서열로 교체되기 때문이다. 따라서, 표적화된 재조합에 의한 단일 뉴클레오티드 쌍의 서열의 효율적인 변경을 위해, 결합 부위들 사이의 영역의 중간점은 이러한 뉴클레오티드 쌍에서 뉴클레오티드 10,000개 이내, 바람직하게는 뉴클레오티드 1,000개 이내, 또는 뉴클레오티드 500개 이내, 또는 뉴클레오티드 200개 이내, 또는 뉴클레오티드 100개 이내, 또는 뉴클레오티드 50개 이내, 또는 뉴클레오티드 20개 이내, 또는 뉴클레오티드 10개 이내, 또는 뉴클레오티드 5개 이내, 또는 뉴클레오티드 2개 이내, 또는 뉴클레오티드 1개 이내에, 또는 당해 뉴클레오티드 쌍에 있다.
특정 실시양태에서, 상동 염색체가 도너 폴리뉴클레오티드로 작용할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 한 염색체 상의 돌연변이체 서열에 결합하여 이를 절단하지만, 상동 염색체 상의 야생형 서열은 절단하지 않는 융합 단백질을 조작함으로써, 이형접합체에서의 돌연변이를 수정할 수 있다. 돌연변이를 보유하는 염색체 상에서의 이중 가닥 파손은 절단된 염색체 내로 상동 염색체로부터의 야생형 서열이 카피되는, 상동성을 기반으로 하는 "유전자 전환" 프로세스를 자극하고, 따라서 야생형 서열의 2개의 카피가 복구된다.
표적화된 재조합의 수준을 강화시킬 수 있는 방법 및 조성물이 또한 제공되고, 여기에는 추가적인 ZFP-기능성 도메인 융합물을 사용하여, 상동 재조합에서 수반되는 유전자들, 예를 들어, RAD52 우위 군의 구성원 (예를 들어, Rad50, Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Rad52, Rad54, Rad54B, Mre11, XRCC2, XRCC3), 유전자의 생성물이 상기 언급된 유전자 생성물들과 상호작용하는 유전자 (예를 들어, BRCA1, BRCA2) 및/또는 NBS1 복합체 내의 유전자의 발현을 활성화시키는 것이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, [Boyko et al. (2006) Plant Physiology 141:488-497] 및 [LaFarge et al. (2003) Nucleic Acids Res 31(4):1148-1155] 참조. 유사하게, ZFP-기능성 도메인 융합물이, 본원에 기술된 방법 및 조성물과 조합되어, 비-상동성 말단 연결에 수반되는 유전자 (예를 들어, Ku70/80, XRCC4, 폴리(ADP 리보스) 폴리머라제, DNA 리가제 4)의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, [Riha et al. (2002) EMBO 21:2819-2826]; [Freisner et al. (2003) Plant J. 34:427-440]; [Chen et al. (1994) European Journal of Biochemistry 224:135-142] 참조. 아연 손가락 결합 도메인과 기능성 도메인 간의 융합물을 사용하는 유전자 발현의 활성화 및 억제 방법이, 예를 들어, 공동-소유의 미국 특허 6,534,261; 6,824,978 및 6,933,113에 개시되어 있다. 추가적인 억제 방법은 억제될 유전자의 서열에 대해 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및/또는 소형 간섭 RNA (siRNA 또는 RNAi)를 사용하는 것을 포함한다.
상동 재조합에 수반되는 유전자 생성물의 발현을 활성화시키는 것에 대한 별법으로서, 또는 이에 더하여, 이러한 단백질 (또는 이의 기능성 단편)과 당해 영역에 대해 표적화된 아연 손가락 결합 도메인의 융합물을 사용하여, 이러한 단백질들 (재조합 단백질)을 당해 영역에 보충함으로써, 이들의 국소적인 농도를 증가시키고, 추가로 상동 재조합 프로세스를 자극할 수 있다. 별법적으로, 상기 기술된 바와 같은 상동 재조합에 수반되는 폴리펩티드 (또는 이의 기능성 단편)는 아연 손가락 결합 도메인, 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인) 및 재조합 단백질 (또는 이의 기능성 단편)을 포함하는 3중 융합 단백질의 일부분일 수 있다. 상기 언급된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는, 유전자 전환 및 재조합-관련 염색질 리모델링에 수반되는 추가적인 단백질에는 히스톤 아세틸트랜스페라제 (예를 들어, Esa1p, Tip60), 히스톤 메틸트랜스페라제 (예를 들어, Dot1p), 히스톤 키나제 및 히스톤 포스파타제가 포함된다. [Bhat et al. (1999) Plant J. 33:455-469]를 또한 참조.
아연 손가락/뉴클레아제 융합 분자 및 도너 DNA 분자를 포함하는 세포에서, 상동성에 의해 구동되는 복구 프로세스가 최대로 활성일 때, 세포 주기의 G2 단계의 세포를 차단함으로써, 표적화된 재조합 효율이 추가적으로 증가된다. 이같은 정지는 다수의 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 세포를 G2 단계에 정지시키도록 세포-주기 진행에 영향을 미치는 약물, 화합물 및/또는 소형 분자로 예를 들어 세포를 처리할 수 있다. 예시적인 이러한 유형의 분자에는 미세관 중합에 영향을 미치는 화합물 (예를 들어, 빈블라스틴, 노코다졸, 탁솔), DNA와 상호작용하는 화합물 (예를 들어, 시스-플래티늄(II) 디아민 디클로라이드, 시스플라틴, 독소루비신) 및/또는 DNA 합성에 영향을 미치는 화합물 (예를 들어, 티미딘, 히드록시우레아, L-미모신, 에토포시드, 5-플루오로우라실)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 염색체 구조를 변화시켜 게놈 DNA가 세포 재조합 기계에 더욱 접근하기 쉽도록 만드는 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제 (예를 들어, 소듐 부티레이트, 트리코스타틴 A)를 사용함으로써 재조합 효율이 추가적으로 증가된다.
세포-주기 정지를 위한 추가적인 방법은, 예를 들어, 단백질을 코딩하는 cDNA를 세포 내로 도입함으로써 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 활성화시키는 조작된 ZFP를 세포 내로 도입함으로써, CDK 세포 주기 키나제의 활성을 억제하는 단백질을 과발현시키는 것을 포함한다. RNAi 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,506,559)을 예를 들어 사용하여 사이클린 및 CDK의 활성을 억제함으로써, 또는 세포 주기 진행에서 수반되는 하나 이상의 유전자 예컨대 사이클린 및/또는 CDK 유전자의 발현을 억제하는 조작된 ZFP를 세포 내로 도입함으로써, 세포 주기가 또한 정지될 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 조절을 위한 조작된 아연 손가락 단백질의 합성 방법에 대해서 공동 소유의 미국 특허 번호 6,534,261 참조.
별법적으로, 특정 경우에, 표적화된 절단이 도너 폴리뉴클레오티드의 부재 하에 수행될 수 있고 (바람직하게는 S 또는 G2 단계에서), 상동 염색체들 간에 재조합이 일어난다.
발현 벡터
하나 이상의 ZFP 또는 ZFP 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 복제 및/또는 발현을 위해 원핵생물 또는 진핵생물 세포 내로의 형질전환용 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 벡터는 원핵생물 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 또는 셔틀 벡터, 곤충 벡터, 또는 진핵생물 벡터일 수 있다. ZFP를 코딩하는 핵산은 식물 세포로의 투여를 위해 발현 벡터 내로 또한 클로닝될 수 있다.
ZFP 또는 ZFP 융합 단백질을 발현시키기 위해, ZFP 또는 ZFP 융합물을 코딩하는 서열이 전사를 지시하는 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 전형적으로 서브클로닝된다. 적절한 박테리아 및 진핵생물 프로모터들이 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 상기 문헌)]에 기술되어 있다. ZFP 발현을 위한 박테리아 발현 시스템은, 예를 들어, 대장균, 바실루스 종(Bacillus sp.), 및 살모넬라(Salmonella)에서 입수가능하다 ([Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)]). 이같은 발현 시스템을 위한 키트가 시판된다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포를 위한 진핵생물 발현 시스템은 당업자에게 주지되어 있고, 또한 시판된다.
ZFP-코딩 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용된 프로모터는 특정 용도에 좌우된다. 예를 들어, 숙주 세포에 적합한 강한 구성성 프로모터가 ZFP의 발현 및 정제에 전형적으로 사용된다.
반면에, 식물 유전자 조절을 위해 ZFP가 생체 내 투여되는 경우 (하기의 "식물 세포에의 핵산 전달" 섹션 참조), ZFP의 특정 용도에 따라 구성성 또는 유도성 프로모터가 사용된다. 식물 프로모터의 비-제한적인 예로는 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana) 유비퀴틴-3 (ubi-3) ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493]); 아그로박테리움 투메파시엔스 만노파인 신타제 (Δmas) (미국 특허 번호 6,730,824 (Petolino 등)); 및/또는 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 (CsVMV) ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129- 1139])로부터 유래된 프로모터 서열이 포함된다. 실시예를 또한 참조한다.
프로모터에 더하여, 발현 벡터는 숙주 세포 (원핵생물 또는 진핵생물)에서의 핵산 발현에 필요한 모든 추가적인 요소들을 함유하는 전사 단위 또는 발현 카셋트를 전형적으로 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카셋트는 ZFP를 코딩하는 핵산 서열에 예를 들어 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 신호, 예를 들어, 전사물의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위 또는 번역 종결에 필요한 신호를 함유한다. 카셋트의 추가적인 요소는, 예를 들어, 인핸서, 및 이종성 스플라이싱 신호를 포함할 수 있다.
유전자 정보를 세포 내로 전달하는데 사용되는 특정 발현 벡터는 ZFP의 의도된 용도, 예를 들어, 식물, 동물, 박테리아, 진균류, 원생동물 등에서의 발현과 관련하여 선택된다. (하기에 기술된 발현 벡터 참조). 표준 박테리아 및 동물 발현 벡터들이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 공보 20050064474A1 및 국제 특허 공보 WO05/084190, WO05/014791 및 WO03/080809에 상세하게 기술되어 있다.
표준 형질감염 방법을 사용하여, 다량의 단백질을 발현하는 박테리아, 포유류, 효모 또는 곤충 세포주를 생산한 후, 표준 기술을 사용하여 단백질을 정제할 수 있다 (예를 들어, [Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989)]; [Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)] 참조). 진핵생물 및 원핵생물 세포의 형질전환은 표준 기술에 따라 수행된다 (예를 들어, [Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977)]; [Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al, eds., 1983)] 참조).
외래 뉴클레오티드 서열을 이같은 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 주지된 절차를 사용할 수 있다. 여기에는 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법 (예를 들어, 초음파천공), 리포솜, 미세주사, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 (에피솜성 및 통합성 모두), 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 기타 외래 유전자 물질을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 기타 주지된 방법을 사용하는 것을 포함한다 (예를 들어, [Sambrook et al., 상기 문헌] 참조). 사용된 특정 유전자 조작 절차가 하나 이상의 유전자를 선택된 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 성공적으로 도입할 수 있는 것만이 필요하다.
식물 세포에의 핵산 전달
상기 언급된 바와 같이, 다양한 통상적인 기술에 의해 DNA 구축물이 원하는 식물 숙주 내로 (예를 들어, 이의 게놈 내로) 도입될 수 있다. 이같은 기술의 리뷰를 위해서, 예를 들어, [Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463]; 및 [Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9] 참조.
예를 들어, 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 미세주입과 같은 기술을 사용하여 DNA 구축물을 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입할 수 있거나, 또는 바이오리스틱(biolistic) 방법, 예컨대 DNA 입자 포격을 사용하여 DNA 구축물을 식물 조직으로 직접 도입할 수 있다 (예를 들어, [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73]). 별법적으로, DNA 구축물을 적절한 T-DNA 플랭킹 영역과 조합하여, 통상적인 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주 벡터 내로 도입할 수 있다. 무장해제 및 이원성 벡터의 사용을 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환 기술은 과학 문헌에 상술되어 있다. 예를 들어 [Horsch et al. (1984) Science 233:496-498], 및 [Fraley et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803] 참조.
또한, 비-아그로박테리움 박테리아 또는 바이러스 예컨대 리조비움 종 NGR234, 시노리조비움 멜리오티, 메소리조비움 로티, 감자 바이러스 X, 컬리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스를 사용하여 유전자를 전달할 수 있다. 예를 들어, [Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4] 참조.
아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 병원성 기능은 이원성 T DNA 벡터 ([Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721]) 또는 공동-배양 절차 ([Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231])를 사용하여 박테리아에 의해 세포가 감염되었을 때 구축물 및 이웃한 마커가 식물 세포 DNA 내로 삽입되도록 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템은 쌍자엽 식물을 조작하는데 사용된다 ([Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384]; [Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641]). 아그로박테리움 형질전환 시스템은 단자엽 식물 및 식물 세포에 DNA를 형질전환시키는데, 뿐만 아니라 전달하는데 또한 사용될 수 있다. 미국 특허 번호 5,591,616; [Hernalsteen et al. (1984) EMSO J 3:3039-3041]; [Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764]; [Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179]; [Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40]; 및 [Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434] 참조.
별법적인 유전자 전달 및 형질전환 방법에는 네이키드 DNA의 칼슘-, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)- 또는 전기천공-매개 흡수를 통한 원형질체 형질전환 ([Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722], [Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177]; [Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828]; 및 [Shimamoto (1989) Nature 338:274-276] 참조) 및 식물 조직의 전기천공 ([D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505])이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 식물 세포 형질전환을 위한 추가적인 방법에는 미세주입, 탄화규소-매개 DNA 흡수 ([Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418]), 및 미세발사물 포격 ([Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309]; 및 [Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618] 참조)이 포함된다.
개시된 방법 및 조성물을 사용하여, 외인성 서열을 식물 세포 게놈 내의 미리 정해진 위치 내로 삽입할 수 있다. 이는 식물 게놈 내로 도입된 트랜스진의 발현이 이의 통합 부위에 결정적으로 좌우되기 때문에 유용하다. 따라서, 영양소, 항생제 또는 치료용 분자를 예를 들어 코딩하는 유전자가 표적화된 재조합에 의해 이의 발현에 유리한 식물 게놈의 영역 내로 삽입될 수 있다.
임의의 상기 형질전환 기술에 의해 생산된 형질전환된 식물 세포를 배양하여, 형질전환된 유전자형을 지니고, 따라서 원하는 표현형을 지니는 전체 식물을 재생시킬 수 있다. 이같은 재생 기술은 원하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생제 및/또는 제초제 마커에 전형적으로 의존하는, 조직 배양 성장 배지 내의 특정 식물 호르몬의 조작에 의존한다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생이 [Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983]; 및 [Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에 기술되어 있다. 식물 캘러스(callus), 외식편, 기관, 화분, 배아 또는 이의 일부분으로부터 재생이 또한 수득될 수 있다. 이같은 재생 기술이 일반적으로 [Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]에 기술되어 있다.
식물 세포 내로 도입된 핵산을 사용하여, 본질적으로 모든 식물에 원하는 소질을 부여할 수 있다. 본 발명의 핵산 구축물 및 상기 언급된 다양한 형질전환 방법을 사용하여 본원에 기술된 원하는 생리학적 및 농업적 특성에 대해 광범위한 식물 및 식물 세포 시스템을 조작할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조작하기 위한 표적 식물 및 식물 세포에는 단자엽 및 쌍자엽 식물, 예컨대 곡물 작물 (예를 들어, 밀, 옥수수, 쌀, 기장, 보리), 과일 작물 (예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물 (예를 들어, 알팔파), 근채류 작물 (예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 엽채류 작물 (예를 들어, 양상추, 시금치); 개화 식물 (예를 들어, 피튜니아, 장미, 국화), 침엽수 및 소나무 (예를 들어, 전나무, 가문비나무); 식물정화(phytoremediation)에 사용되는 식물 (예를 들어, 중금속 축적 식물); 유지 작물 (예를 들어, 해바라기, 평지씨) 및 실험 목적으로 사용되는 식물 (예를 들어, 아라비돕시스)가 포함되는 작물이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 개시된 방법 및 조성물은 아스파라거스(Asparagus) 속, 아베나(Avena) 속, 브라시카(Brassica) 속, 시트러스(Citrus) 속, 시트룰루스(Citrullus) 속, 캅시쿰(Capsicum) 속, 쿠쿠르비타(Cucurbita) 속, 다우쿠스(Daucus) 속, 글리신(Glycine) 속, 고십피움(Gossypium) 속, 호르데움(Hordeum) 속, 락투카(Lactuca) 속, 리코페르시콘(Lycopersicon) 속, 말루스(Malus) 속, 마니호트(Manihot) 속, 니코티아나(Nicotiana) 속, 오리자(Oryza) 속, 페르세아(Persea) 속, 피숨(Pisum) 속, 피러스(Pyrus) 속, 프루누스(Prunus) 속, 라파누스(Raphanus) 속, 세칼레(Secale) 속, 솔라눔(Solanum) 속, 소르굼(Sorghum) 속, 트리티쿰(Triticum) 속, 비티스(Vitis) 속, 비그나(Vigna) 속, 및 제아(Zea) 속으로부터의 종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 광범위한 식물에 걸쳐 사용된다.
당업자는 발현 카셋트가 트랜스제닉 식물 내로 안정적으로 혼입되고, 작동가능한 것으로 확인된 후, 유성 교배에 의해 다른 식물 내로 도입될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 교배될 종에 따라, 임의의 다수의 표준 번식 기술이 사용될 수 있다.
조작된 식물 물질을 형질전환 DNA 상에 존재하는 마커 유전자가 코딩하는 소질에 대해 선별 또는 스크리닝함으로써, 형질전환된 식물 세포, 캘러스, 조직 또는 식물을 확인 및 단리할 수 있다. 예를 들어, 조작된 식물 물질을 억제량의 항생제 또는 제조체 (형질전환 유전자 구축물이 이에 대한 저항성을 부여함)를 함유하는 배지 상에서 성장시킴으로써 선별할 수 있다. 추가로, 재조합 핵산 구축물 상에 존재할 수 있는 임의의 가시적인 마커 유전자 (예를 들어, β-글루쿠로니다제, 루시페라제, B 또는 C1 유전자)의 활성을 스크리닝함으로써 형질전환된 식물 및 식물 세포를 또한 확인할 수 있다. 이같은 선별 및 스크리닝 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
물리적 및 생화학적 방법을 또한 사용하여, 삽입된 유전자 구축물을 함유하는 식물 또는 식물 세포 형질전환체를 확인할 수 있다. 이러한 방법에는 1) 재조합 DNA 삽입물을 검출하고 이의 구조를 결정하기 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구축물의 RNA 전사물을 검출하고 시험하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-확장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소 분석법 (이같은 유전자 생성물이 유전자 구축물에 의해 코딩되는 경우); 4) 단백질 젤 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전, 또는 효소-결합 면역분석법 (유전자 구축물 생성물이 단백질인 경우)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 추가적인 기술, 예컨대 원위치 혼성화, 효소 염색, 및 면역염색을 또한 사용하여, 특정 식물 기관 및 조직에서의 재조합 구축물의 존재 또는 발현을 검출할 수 있다. 모든 이러한 분석법을 행하기 위한 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
본원에 개시된 방법을 사용하는 유전자 조작의 효과를, 예를 들어, 당해 조직으로부터 단리된 RNA (예를 들어, mRNA)의 노던 분석에 의해 관찰할 수 있다. 전형적으로, mRNA의 양이 증가되었으면, 상응하는 내인성 유전자가 이전보다 높은 속도로 발현되고 있는 것으로 가정할 수 있다. 유전자 및/또는 CYP74B 활성을 측정하는 또다른 방법을 사용할 수 있다. 사용된 기질 및 반응 생성물 또는 부산물의 증가 또는 감소를 검출하는 방법에 따라, 상이한 유형의 효소 분석법을 사용할 수 있다. 또한, 발현된 CYP74B 단백질 및/또는의 수준을 면역화학적으로, 즉, ELISA, RIA, EIA 및 당업자에게 주지된 기타 항체-기반 분석법에 의해, 예컨대 전기영동 검출 분석법 (염색 또는 웨스턴 블롯팅과 함께)에 의해 측정할 수 있다. 트랜스진이 식물의 일부 조직에서 또는 일부 발달 단계에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 또는 트랜스진이 실질적으로 모든 식물 조직에서, 실질적으로 전체적인 생활주기에 걸쳐 발현될 수 있다. 그러나, 임의의 조합형 발현 방식이 또한 적용가능하다.
본 발명은 트랜스진 또는 유전자 구축물이 있는, 상기 기술된 트랜스제닉 식물의 종자를 또한 포함한다. 본 발명은 트랜스진 또는 유전자 구축물이 있는, 상기 기술된 트랜스제닉 식물의 자손, 클론, 세포주 또는 세포를 추가로 포함한다.
ZFP 및 ZFP를 코딩하는 발현 벡터는 표적화된 절단 및/또는 재조합을 위해 식물에 직접 투여될 수 있다.
ZFP가 처리될 식물 세포와 궁극적으로 접촉하도록 하는데 일반적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 유효량이 투여된다. ZFP는 임의의 적절한 방식으로, 바람직하게는 제약상 허용가능한 담체와 함께 투여된다. 이같은 조정제를 투여하는 적절한 방법은 당업자가 이용가능하고 이들에게 주지되어 있으며, 한가지를 초과하는 경로가 특정 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 종종 특정 경로가 또다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공한다.
담체가 또한 사용될 수 있고, 이는 투여될 특정 조성물, 뿐만 아니라 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 이용가능한 제약 조성물의 광범위한 적절한 제형이 존재한다 (예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985] 참조).
용도
표적화된 절단을 위한 개시된 방법 및 조성물을 사용하여, 게놈 서열에서 돌연변이를 유도할 수 있다. 표적화된 절단을 유전자 녹아웃(knock-out)을 생성시키는데 (예를 들어, 기능 유전체학(genomics) 또는 표적 확인을 위해), 그리고 게놈 내로의 서열의 표적화된 삽입 (즉, 유전자 녹-인(knock-in))을 촉진하는데 또한 사용할 수 있다. 상동 재조합을 통한 염색체 서열의 교체에 의해, 또는 염색체 내의 당해 영역에 상동성인 서열이 플랭킹된 새로운 서열 (즉, 당해 영역에 존재하지 않는 서열)이 미리 정해진 표적 부위에서 삽입되는 표적화된 통합에 의해 삽입이 이루어질 수 있다. 동일한 방법이 야생형 서열을 돌연변이체 서열로 교체하는데, 또는 한 대립유전자를 다른 대립유전자로 전환시키는데 또한 사용할 수 있다.
감염성 또는 통합된 식물 병원체의 표적화된 절단을 사용하여, 예를 들어, 병원체의 게놈을 절단하여 병원성이 감소 또는 제거되도록 함으로써, 식물 숙주에서의 병원체 감염을 치료할 수 있다. 추가적으로, 식물 바이러스에 대한 수용체를 코딩하는 유전자의 표적화된 절단을 사용하여, 이같은 수용체의 발현을 차단함으로써, 식물에서의 바이러스 감염 및/또는 바이러스 확산을 방지할 수 있다.
예시적인 식물 병원체로는 식물 바이러스 예컨대 알파모바이러스(Alfamovirus), 알파크립토바이러스(Alphacryptovirus), 바드나바이러스(Badnavirus), 베타크립토바이러스(Betacryptovirus), 비게미니바이러스(Bigeminivirus), 브로모바이러스(Bromovirus), 비모바이러스(Bymovirus), 카필로바이러스(Capillovirus), 카를라바이러스(Carlavirus), 카르모바이러스(Carmovirus), 카울리모바이러스(Caulimovirus), 클로스테로바이러스(Closterovirus), 코모바이러스(Comovirus), 쿠쿠모바이러스(Cucumovirus), 사이토랍도바이러스(Cytorhabdovirus), 디안토바이러스(Dianthovirus), 에나모바이러스(Enamovirus), 파바바이러스(Fabavirus), 피지바이러스(Fijivirus), 푸로바이러스(Furovirus), 호르데이바이러스(Hordeivirus), 히브리게미니바이러스(Hybrigeminivirus), 이다에오바이러스(Idaeovirus), 일라르바이러스(Ilarvirus), 이포모바이러스(Ipomovirus), 루테오바이러스(Luteovirus), 마클로모바이러스(Machlomovirus), 마클루라바이러스(Macluravirus), 마라피바이러스(Marafivirus), 모노게미니바이러스(Monogeminivirus), 나나바이러스(Nanavirus), 네크로바이러스(Necrovirus), 네포바이러스(Nepovirus), 누클레오랍도바이러스(Nucleorhabdovirus), 오리자바이러스(Oryzavirus), 오우르미아바이러스(Ourmiavirus), 파이토레오바이러스(Phytoreovirus), 포텍스바이러스(Potexvirus), 포티바이러스(Potyvirus), 라이모바이러스(Rymovirus), 위성 RNA, 새틀리바이러스(satellivirus), 세퀴바이러스(Sequivirus), 소베모바이러스(Sobemovirus), 테누이바이러스(Tenuivirus), 토바모바이러스(Tobamovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 톰부스바이러스(Tombusvirus), 토스포바이러스(Tospovirus), 트리코바이러스(Trichovirus), 타이모바이러스(Tymovirus), 움브라바이러스(Umbravirus), 바리코사바이러스(Varicosavirus) 및 와이카바이러스(Waikavirus); 진균 병원체 예컨대 흑수병 (예를 들어 유스틸라기날레스(Ustilaginales)), 녹병 (유레디날레스(Uredinales)), 맥각병 (클라비셉트스 푸푸레아(Clavicepts pupurea)) 및 노균병; 사상균 (오오마이세테스(Oomycetes)) 예컨대 파이토프토라 인펜스탄스(Phytophthora infestans) (감자 잎마름병); 박테리아 병원체 예컨대 에르위니아(Erwinia) (예를 들어, 에르위니아 헤르비콜라(E. herbicola)), 슈도모나스(Pseudomonas) (예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 슈도모나스 시린가에(P. syringae), 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescense) 및 슈도모나스 푸티다(P. putidd)), 랄스토니아(Ralstonia) (예를 들어, 랄스토니아 솔라나세아룸(R. solanacearum)), 아그로박테리움 및 잔토모나스(Xanthomonas); 회충 (네마토다(Nematoda)); 및 파이토믹세아(Phytomyxea) (폴리믹사(Polymyxa) 및 플라스모디오포라(Plasmodiophora))가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
개시된 표적화된 재조합 방법을 사용하여, 임의의 게놈 서열을 동일하지 않는 상동성 서열로 교체할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 게놈 서열을 이의 야생형 대응물로 교체함으로써, 식물 질환 치료 방법을 제공하는 것, 식물 병원체에 대한 저항성을 제공하는 것, 작물 수율을 증가시키는 것 등이 가능하다. 유사한 방식으로, 본원에 개시된 표적화된 재조합 방법을 사용하여 유전자의 한 대립유전자를 다른 대립유전자로 교체할 수 있다.
다수의 이러한 사례에서, 당해 영역은 돌연변이를 포함하고, 도너 폴리뉴클레오티드는 상응하는 야생형 서열을 포함한다. 유사하게, 야생형 게놈 서열이 돌연변이체 서열로 교체될 수 있다 (이같은 교체가 바람직한 경우). 예를 들어, 종양유전자의 과발현이 이를 돌연변이시킴으로써 또는 이의 제어 서열을 더 낮은 비-병리학적 수준의 발현을 지지하는 서열로 교체함으로써 역전될 수 있다. 실제로, 임의의 방식으로 특정 게놈 서열에 의존하는 모든 병리학을 본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 수정 또는 경감시킬 수 있다.
표적화된 절단 및 표적화된 재조합을 비-코딩 서열 (예를 들어, 조절 서열 예컨대 프로모터, 인핸서, 개시인자, 종결인자, 스플라이스 부위)을 변경시켜 유전자 생성물의 발현 수준을 변경시키는데 또한 사용할 수 있다. 이같은 방법은, 예를 들어, 치료 목적, 기능 유전체학 및/또는 표적 확인 연구를 위해 사용될 수 있다.
공동 소유의 WO 01/83793에 개시된 바와 같은, 염색질 구조의 표적화된 변형을 사용하여, 세포 염색질에 대한 융합 단백질의 결합을 촉진할 수 있다.
추가적인 실시양태에서, 아연 손가락 결합 도메인과 리컴비나제 (또는 이의 기능성 단편) 간의 하나 이상의 융합물을 본원에 개시된 아연 손가락-절단 도메인 융합물에 더하여 또는 이러한 융합물 대신 사용하여, 표적화된 재조합을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 번호 6,534,261 및 [Akopian et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8688-8691] 참조.
추가적인 실시양태에서, 개시된 방법 및 조성물을 사용하여, ZFP 결합 도메인과 활성을 위해 이량체화 (동종이량체화 또는 이종이량체화)를 필요로 하는 전사 활성화 또는 억제 도메인의 융합물을 제공할 수 있다. 이러한 경우에서, 융합 폴리펩티드는 아연 손가락 결합 도메인 및 기능성 도메인 단량체 (예를 들어, 이량체성 전사 활성화 또는 억제 도메인으로부터의 단량체)를 포함한다. 2개의 이같은 융합 폴리펩티드가 적합하게 놓인 표적 부위들에 결합하면, 기능성 전사 활성화 또는 억제 도메인이 재구성되도록 이량체가 형성된다.
또한, 상기 개시된 바와 같이, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 세포의 게놈 내의 당해 영역, 예를 들어, 절단이 상동성-의존적 메커니즘을 통한 삽입을 강화시키는 영역 내로 외인성 서열을 표적화하여 통합시키는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 미리 정해진 게놈 서열 (즉, 표적 부위)과 동일하거나 또는 동일하지 않지만 상동성인 하나 이상의 서열과 함께 외인성 서열을 포함하는 도너 서열의 삽입).
전형적으로 도너 서열은, 외인성 서열에 플랭킹된 영역 내에, 게놈 서열 내의 이중 가닥 파손부의 상동성-지시 복구를 지지하는 충분한 상동성을 함유함으로써, 게놈 표적 부위에 외인성 서열을 삽입시킨다. 따라서, 도너 핵산은 상동성-의존적 메커니즘 (예를 들어, 상동 재조합)에 의한 외인성 서열의 통합을 지지하는데 충분한 임의의 크기일 수 있다. 어떠한 특정 이론에도 제한되기를 원치 않으면서, 외인성 서열에 플랭킹된 상동성 영역은 파손된 염색체 말단에 이중 가닥 파손 부위에서의 유전자 정보의 재합성을 위한 주형을 제공하는 것으로 생각된다. 특정 실시양태에서, 2개의 동일한 서열 또는 2개의 동일하지 않지만 상동성인 서열 (또는 각각 1개)가 외인성 서열에 플랭킹되어 존재한다. 외인성 서열 (또는 외인성 핵산 또는 외인성 폴리뉴클레오티드)은 정상적으로는 당해 영역 내에 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 서열이다.
예시적인 외인성 서열에는 cDNA, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 에피토프 태그(tag), 마커 유전자, 절단 효소 인식 부위 및 다양한 유형의 발현 구축물이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,833,252 참조. 추가적인 예시적인 귀소성 엔도뉴클레아제에는 I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII이 포함된다. 이들의 인식 서열은 공지되어 있다. 미국 특허 번호 5,420,032; [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]; [Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118]; [Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127]; [Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228]; [Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180]; [Argast et al. (1998) J. Mol. Biol 280:345-353] 및 New England Biolabs 카탈로그를 또한 참조.
마커 유전자에는 항생제 저항성 (예를 들어, 앰피실린 저항성, 네오마이신 저항성, G418 저항성, 푸로마이신 저항성)을 매개하는 단백질을 코딩하는 서열, 유색 또는 형광 또는 발광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시페라제)을 코딩하는 서열, 및 강화된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질 (예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서 예시적인 마커 유전자에는 β-글루쿠로니다제 (GUS), 포스피노트리신 N-아세틸 트랜스페라제 (PAT, BAR), 네오마이신 포스포트랜스페라제, β-락타마제, 카테콜 디옥시게나제, α-아밀라제, 티로시나제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 애큐오린, EPSP 신타제, 니트릴라제, 아세토락테이트 신타제 (ALS), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 달라폰 데할로게나제 및 안트라닐레이트 신타제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, RNA 발현 구축물, 예를 들어, 마이크로 RNA 또는 siRNA의 조절된 발현을 담당하는 서열을 삽입하는데 표적화된 통합이 사용된다. 상기 기술된 바와 같은 프로모터, 인핸서 및 추가적인 전사 조절 서열이 RNA 발현 구축물 내로 또한 혼입될 수 있다.
실시예 1 - 표적 벡터의 디자인 및 생성
A. 표적 서열의 전체적인 구조
담배 (쌍자엽 식물)용 표적 구축물은 도 1에 제시된 바와 같이 하기의 7개의 성분을 포함하였다: i) 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임-24 (orf-24) 3' 비-번역 영역 (UTR) (EP222493 (Gelvin 등, 1987))으로 종결되는 대장균 HPT 유전자 ([Waldron et al., 1985, Plant Mol. Biol. 18:189-200])를 구동시키는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴-3 (ubi-3) 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493])를 포함하는 히그로마이신 포스포트랜스페라제 (HPT) 발현 카셋트; ii) 니코티아나 타바쿰(N. tabacum) RB7 매트릭스 부착 영역 (MAR) (WO9727207 (Thompson 등, 1997))을 포함하는 상동성 서열-1; iii) 변형된 아그로박테리움 투메파시엔스 만노핀 신타제 (Δmas) 프로모터 (미국 특허 번호 6,730,824 (Petolino 등))에 의해 구동되는 5' 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자 단편 (Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia)); iv) 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 신타제 (nos) 3'UTR ([DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573])로 종결되는 GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5 :387-405])를 구동시키는 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 (CsVMV) 프로모터 ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139])를 포함하는 β-글루쿠로니다제 (GUS) 발현 카셋트 ; v) 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 3' UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])로 종결되는 3' GFP 유전자 단 편 (Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia)); vi) 아라비돕시스 탈리아나 4-쿠마로일-CoA 신타제 (4-CoAS) 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)를 포함하는 상동성 서열-2; 및 vii) 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF-25/26 3' UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))로 종결되는 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(S. viridochromogenes) 포스피노트리신 포스포트랜스페라제 (PAT) ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37]) 3' 유전자 단편.
아연 손가락-Fok1 융합 단백질 결합 부위 (IL-1-L0-Fok1) (미국 2005/0064474 (Urnov 등, 2005))를 CsVMV 프로모터 ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139])의 하류에 삽입하고, GUS 코딩 서열 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405])과 N-말단에서 융합시켰다. 제2의 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 결합 부위 (Scd27-L0-Fok1) (미국 2005/0064474 (Urnov 등, 2005))의 2개의 카피에 5' 및 3' GFP 유전자 단편 (Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia))을 플랭킹시켰다. 각각의 결합 부위는 특정 아연 손가락-Fok1 융합 단백질의 인식 서열의 4개의 직렬 반복물을 함유하여, 각각의 결합 부위는 크기가 약 200 bp였다 (도 2a). 이는 복잡한 염색질 환경에서 인식 서열이 아연 손가락-Fok1 융합 단백질에 접근하기 쉬울 것임을 확실히 하기 위해 디자인되었다. 각각의 인식 서열은 단일 아연 손가락-Fok1 융합 단백질이 동종이량체로서 결합하여 이중 가닥 DNA를 절단하는 역위 반복 서열을 포함하였다 (도 2b). 5' 및 3' GFP 유전자 단편은 표적 서열 내에서의 상동성을 제공하는 540 bp만큼 중첩되었고, 정지 코돈이 5' GFP 단편의 3' 말단에 삽입되어, 표 적 서열로부터 기능성 GFP가 번역되지 않는 것을 확실히 하였다. 표적 서열을 포함하는 형질전환 벡터가 히기 기술된 바와 같은 다중 단계 클로닝 프로세스를 통해 생성되었다.
B. HPT 이원성 벡터 (pDAB1584)의 구축
벡터 pDAB1400는 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])로 종결되는 GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405])를 구동시키는 아라비돕시스 탈리아나 ubi-3 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493])를 포함하는 GUS 발현 카셋트를 함유하였고, 이를 출발 기본 구축물로 사용하였다 (도 3).
표적 구축물 내의 모든 불필요한 반복된 조절 요소를 방지하기 위해, pDAB1400 내의 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])을 pDAB782 (도 4)로부터 SacI/XbaI 단편으로 절단되어 pDAB1400 내의 동일한 부위 내로 클로닝된 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-24 UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))로 교체하였다. 생성된 구축물은 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-24 UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))으로 종결되는 GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405])를 구동시키는 아라비돕시스 탈리아나 ubi-3 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493])를 함유하였고, pDAB1582(도 5)로 명명되었다.
HPT 코딩 서열 ([Waldron et al., 1985, Plant Mol. Biol. 18:189-200)]을 pDAB354 플라스미드 (도 6)로부터 프라이머 P1 및 P2를 사용하여 PCR 증폭시켰다. BbsI 부위가 프라이머 P1의 5' 말단에 부가되었고, SacI 부위가 프라이머 P2의 3' 말단에 보유되었다. HPTII PCR 단편을 BbsI/SacI로 절단하고, NcoI-SacI으로 소화된 pDAB1582 내로 클로닝하여, GUS 유전자를 PCR 단편으로부터의 HPT 유전자로 교체하였다. 생성된 플라스미드를 pDAB1583 (도 7)로 명명하였다.
그후, 아라비돕시스 탈리아나 ubi-3/HPT/아그로박테리움 투메파시엔스 orf-24 단편을 pDAB1583으로부터 NotI 소화에 의해 절제하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리하여, 블런트-말단을 생성시켰다. 블런트-말단 처리된 HPT 발현 카셋트를 이원성 기본 벡터인 pDAB2407 (도 8) 내로 PmeI 부위에서 클로닝하여, 플라스미드 pDAB1584 (도 9)가 생성되었다.
C. 상동성 서열 및 Scd27 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 결합 부위를 포함하는 벡터 (pDAB1580)의 구축
pDAB2418 (도 10) 내의 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])을 아그로박테리움 투메파시엔스 orf25/26 UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))로 교체하여, 표적 벡터 내의 반복된 서열을 방지하였다. UTR을 교환시키기 위해, 아그로박테리움 투메파시엔스 orf25/26 UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))을 pDAB4045 플라스미드 (도 11)로부터 프라이머 P3 및 P4를 사용하여 PCR 증폭시켰다. SmaI 및 AgeI 부위가 PCR 단편의 3' 말단에 부가되었고, SacI 부위가 5' 말단에 보유되었다. 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])로 종결되는 PAT 유전자 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37])를 구동시키는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴-10 (ubi-10) 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493])을 포함하는 PAT 유전자 발현 카셋트, 및 니코티아나 타바쿰 RB7 MAR 서열 (WO9727207 (Thompson 등, 1997))을 함유한 pDAB2418 플라스미드 DNA를 SacI 및 AgeI으로 소화시키고, 2개의 가장 큰 단편을 회수하였다. 이러한 단편들을 SacI 및 AgeI로 소화된 아그로박테리움 투메파시엔스 orf25/26 UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987)) PCR 생성물과 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 pDAB1575 (도 12)로 명명하였다. 니코티아나 타바쿰 RB7 MAR (WO9727207 (Thompson 등, 1997))은 표적 벡터 내의 상동성 서열-1로 작용한다.
아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS의 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)을 표적 벡터 내의 상동성 서열-2로 작용하도록 선택하였다. PAT 유전자 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37]) 코딩 서열을 분석하였고, 출발 코돈의 299/300 bp 하류가 적합한 5' 및 3' 스플라이싱 부위가 형성되도록 인트론을 삽입하기 위한 부위로 확인되었다. 그후, 전장 인트론을 DNA 합성에 의해 253 bp의 3' 부분적 PAT 코딩 서열 (Picoscript Ltd., LLP (Houston, Texas))과 융합시켰다. NotI 및 SacI 부위가 DNA 단편의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. 그후, 합성된 DNA 단편을 NotI/SacI으로 소화시키고, 동일한 부위에서 pDAB1575 내로 삽입하여, 전장 PAT 코딩 서열을 교체하였다. 생성된 구축물을 pDAB1577 (도 13)로 명명하였다.
Scd27-L0-Fok1의 4개의 직렬 반복물 (도 2)을 함유하는 241 bp DNA 단편을 합성하였고 (Picoscript Ltd., LLP (Houston, Texas)), 이때 단편의 5' 및 3' 말단 양쪽 모두에 SmaI 부위가 부가되었다. 그후, 합성된 아연 손가락-Fok1 결합 부위-함유 단편을 SmaI으로 소화시키고, pDAB1577 내로 MscI 부위에서 삽입하였다. 생성된 벡터를 pDAB1579 (도 14)로 명명하였다. 그후, SmaI으로 소화된 제2의 아연 손가락-Fok1 결합 부위-함유 단편을 pDAB1579 내로 SwaI 부위에서 삽입하였다. 생성된 구축물을 pDAB1580 (도 15)로 명명하였다. 이러한 벡터는 상동성 서열 1 및 2 (각각 니코티아나 타바쿰 RB7 MAR 및 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론 1), 및 각각 Scd27-L0-Fok1 인식 부위의 4개의 반복물을 함유하는 2개의 합성된 Scd27 아연 손가락-Fok1 결합 부위를 함유한다.
D. 2개의 부분적으로 중복된 비-기능성 GFP 단편을 함유하는 벡터 (pDAB1572)의 구축
GFP 유전자인 CopGFP를 Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia)로부터 구입하고, 전장 코딩 서열을 프라이머 P5 및 P6을 사용하여 PCR 증폭시켰다. BbsI 및 SacI 부위가 PCR 생성물의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. 그후, CopGFP PCR 생성물을 BbsI/SacI으로 소화시키고, 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 3' UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])로 종결되는 GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405])를 구동시키는 변형된 아그로박테리움 투메파시엔스 Δmas 프로모터 (US6730824 (Petolino 등))를 포함하는 pDAB3401 (도 16) 내로 NcoI/SacI 부위에서 클로닝하여, GUS 유전자를 교체시켰다. 생성된 벡터를 pDAB1570 (도 17)로 명명하였다.
2개의 부분적으로 중복된 비-기능성 GFP 단편을 만들기 위해, CopGFP의 코딩 서열 대부분을 함유하지만 5' 말단에서 47 bp가 결실된 DNA 단편을 프라이머 P9 및 P10을 사용하여 PCR 증폭시켰다. ApaI 부위가 5' 및 3' 말단 양쪽 모두에 부가되었고, 추가적인 StuI 부위가 ApaI 부위의 5' 말단 하류에 부가되었다. 그후, PCR 생성물을 ApaI으로 소화시키고, pDAB1570 내로 ApaI 부위에서 삽입함으로써, 2개의 비-기능성 GFP 단편이 동일한 벡터 내에 생성되었고, 이때 540 bp의 서열이 중복되었다. 생성된 구축물을 pDAB1572 (도 18)로 명명하였다.
E. IL-1 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 결합 부위/GUS 유전자 융합물을 함유하는 벡터 (pDAB1573)의 구축
IL-1_L0-Fok1 인식 부위의 4개의 직렬 반복물 (도 2)을 함유하는 233 bp DNA 단편이 Picoscript Ltd., LLP (Houston, Texas)에 의해 합성되었고, 이때 NcoI 및 AfIIII 부위가 각각 5' 및 3' 말단에 부가되었다. 그후, 합성된 단편을 NcoI/AflIII으로 소화시키고, CsVMV 프로모터 ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139])로 구동되고 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 3' UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])로 종결되는 GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405])를 함유하는 pDAB4003 (도 19) 내로 NcoI 부위에서 삽입하였다. 그후, IL-1_L0-Fok1 결합 부위와 GUS 코딩 서열 간의 N-말단 융합물이 생성되었다. 생성된 벡터를 pDAB1571 (도 20)로 명명하였다.
표적 벡터 내의 반복되는 3' UTR 요소를 방지하기 위해, 아그로박테리움 투메파시엔스 nos 3' UTR ([DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561- 573])을 pDAB7204 (도 21)에서 SacI/PmeI 단편으로 절제하고, SacI/NaeI로 소화된 pDAB1571 내로 클로닝하여, 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 3' UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])을 교체하였다. 생성된 플라스미드를 pDAB1573 (도 22)으로 명명하였다.
F. 최종 표적 벡터 (pDAB1585)의 구축
최종 표적 벡터를 만들기 위해, IL-1-Fok1 융합 단백질 표적 부위가 삽입된 GUS 발현 카셋트를 pDAB1573으로부터 NotI 소화에 의해 절제하고, 블런트-말단이 되도록 처리하고, pDAB1572 내로 StuI 부위에서 삽입하였다. 생성된 중간체 벡터를 pDAB1574 (도 23)로 명명하였다. 변형된 Δmas 프로모터 (US6730824 (Petolino 등)), 5' 부분 중복 GFP 서열 (Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia)), CsVMV 프로모터 ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139]), IL-1-Fok1 융합 단백질 표적 서열, GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405]) 코딩 영역, 아그로박테리움 투메파시엔스 nos 3' UTR ([DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573]), 3' 부분 중복 GFP (Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia)) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 3' UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])을 함유하는 전체 카셋트를 pDAB1574로부터 절제하고, pDAB1580 내로 NotI 부위에서 삽입하였다. 생성된 플라스미드를 pDAB1581 (도 24)로 명명하였다. 그후, pDAB1581의 AgeI 단편을 pDAB1584 내로 AgeI 부위에서 삽입함으로써, 최종 표적 구축물 pDAB1585 (도 1)이 생성되었다.
실시예 2 - 표적 서열이 통합된 트랜스제닉 세포주의 생성
2개의 상이한 담배 세포 현탁 배양물을 사용하여, 실시예 1의 표적 서열을 아그로박테리움 형질전환을 통해 안정적으로 통합시켰다. NT1으로 칭해지는 제1 배양물은 <University of Washington> (Seattle, WA, USA)의 Arnold Bendich로부터 수득하였다. 이러한 배양물은 세포 20-30개의 클러스터 내의 15-20 마이크로미터 직경의 세포로 증식하고, 이때 배가 시간은 약 48시간이다. NT1 세포 현탁 배양물을 MS 기초 염 (PhytoTechnology Labs M524), 137.4 ㎎/ℓ K2HPO4, 30 g/ℓ 수크로스, 2.22 ㎎/ℓ 2,4-D, 1 ㎎/ℓ 티아민-HCL, 100 ㎎/ℓ 마이오-이노시톨 및 0.5 g/ℓ MES를 함유하는 pH 5.7의 배지에서 유지시켰다. 1 ㎖ 충전 세포 용적 (PCV)에 40 ㎖의 신선한 MS계 배지를 첨가함으로써 NT1 세포를 7일마다 서브클로닝하였다.
BY2로 칭해지는 사용된 제2 담배 세포 배양물은 Japan Tobacco (Iwata, Shizuoka, Japan)의 Jun Ueki로부터 수득하였다. 이러한 배양물은 세포 100-150개의 클러스터 내의 5-10 마이크로미터 직경의 세포로 증식하고, 이때 배가 시간은 약 18시간이다. BY2 세포 현탁 배양물을 LS 기초 염 (PhytoTechnology Labs L689), 170 ㎎/ℓ KH2PO4, 30 g/ℓ 수크로스, 0.2 ㎎/ℓ 2,4-D 및 0.6 ㎎/ℓ 티아민-HCL을 함유하는 pH 6.0의 배지에서 유지시켰다. 0.25 ㎖ PCV에 50 ㎖의 LS계 배지를 첨가함으로써 BY2 세포를 7일마다 서브클로닝하였다. NT1 및 BY2 세포 현탁 배양물 양쪽 모두를 25℃ 및 125 RPM의 회전식 진탕기 상의 250-㎖ 플라스크에서 유지시켰다.
표적 서열이 통합된 트랜스제닉 NT1 및 BY2 세포 배양물을 생성시키기 위해, 하위배양 4일 후의 담배 현탁액의 플라스크를 10-12개의 4 ㎖ 분취량으로 나누고, 이들을 약 1.5의 OD600으로 하룻밤 동안 성장된 pDAB1585가 서식하는 아그로박테리움 균주 LBA4404 100 ㎕와 함께 100×25 mm 페트리접시에서 공동-배양하였다. 접시들을 파라필름으로 포장하고, 진탕하지 않으면서 25℃에서 3일 동안 인큐베이션한 후, 과량의 액체를 제거하고, 500 ㎎/ℓ 카르베니실린을 함유하는 11 ㎖의 기초 배지 (NT1 및 BY2에 대해 각각 MS계 또는 LS계)로 교체하였다.
담배 세포의 재현탁 후, 현탁액 1 ㎖를 8 g/ℓ TC 한천으로 고체화된 500 ㎎/ℓ 카르베니실린 및 200 ㎎/ℓ 히그로마이신을 함유하는 적합한 기본 배지의 100×25 mm 플레이트 상에 배분하고, 포장되지 않은 채로 28℃에서 암실에서 인큐베이션하였다. 이로써, 단일 처리를 위한 120-144개의 선별 플레이트가 생성되었다. 개별적인 히그로마이신-저항성 단리물들이 플레이팅하고 나서 10-14일 후에 나타났고 (표 1), 이를 개별적인 60×20 mm 플레이트 (플레이트 당 1개의 단리물)로 옮겨서, 분석 및 추후의 재-형질전환 실험에 필요할 때까지 14일 하위배양 스케쥴로 캘러스(callus)로 유지시켰다.
트랜스제닉 표적 세포 배양물 생성의 요약
담배 세포 배양물 선별 플레이트의 수 트랜스제닉 이벤트의 수
NT1 360 305
BY2 720 551
실시예 3 - 표적 트랜스제닉 이벤트의 스크리닝 및 특성화
BY2 또는 NT1 담배 세포 배양물 내로의 표적 벡터의 형질전환으로부터 생성된 히그로마이신-저항성 트랜스제닉 이벤트 (실시예 2에 기술됨)를 하기와 같이 분석하였다.
이러한 트랜스제닉 이벤트를 스크리닝하기 위해 수행된 처음의 분석법은 표적 서열의 접근가능성을 가리키기 위한 GUS 발현 분석, 표적 벡터의 존재 및 무손상성을 확인하기 위한 부분적 및 전장 표적 서열의 PCR 분석, 및 통합된 표적 서열의 카피수를 결정하기 위한 서던 블롯 분석을 포함하였다. GUS 발현을 나타낸 트랜스제닉 이벤트의 부분집합은 전장 표적 서열의 1개의 단일 카피를 함유하였고, 이들을 현탁 배양물을 재확립시키기 위해 선택하여, 후속 재-형질전환을 위한 표적 세포주를 생성시켰다. 이러한 재-확립된 표적 세포주를 또한 추가적으로 특성화하였고, 이러한 특성화는 더욱 철저한 서던 블롯 분석, 전체 표적 삽입물의 서열분석 확인, 및 플랭킹된 게놈 서열 분석을 포함하였다.
선별된 이벤트로부터 시작된 트랜스제닉 담배 캘러스 조직 또는 현탁 배양물을 150 ㎕의 분석 완충제 내의 50 ㎎ 샘플을 24-48시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 GUS 활성에 대해 분석하였다. 분석 완충제는 0.2 M 인산나트륨 (pH 8.0,) 각각 0.1 mM의 페리시안화칼륨 및 페로시안화칼륨, 1.0 mM 소듐 EDTA, 0.5 mg/㎖ 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-글루쿠로니드 및 0.6％ (v/v) 트리톤(Triton) X-100으로 구성되었다 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405]). 청색 영역의 출현을 GUS 유전자 발현의 지표로 사용하였고, 이러한 발현은 표적 서열 삽입물이 전사적으로 활성이고, 따라서 국소적인 게놈 환경에서 접근가능하였음을 가리켰다.
GUS를 발현하는 트랜스제닉 이벤트를 표적 서열의 5' 말단의 HTP 발현 카셋트의 3' UTR에서 표적 서열의 3' 말단의 부분적 PAT 발현 카셋트의 3' UTR까지 연장된 10kb DNA 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍 P15/P16을 사용하여 PCR에 의해 분석하였다. 모든 이벤트가 히그로마이신 선별 하에 수득되기 때문에, HPT 발현 카셋트가 모든 표적 이벤트에서 무손상인 것으로 가정하였다. 따라서, HPT 발현 카셋트의 3' UTR만이 전장 PCR 분석에서 커버되었다. 이벤트들의 부분집합을 프라이머 쌍 P15/P17 및 P18/P19를 사용하여 또한 PCR 분석하여, 표적 서열의 5' 및 3' 말단의 무손상성을 각각 결정하였다. PCR 분석으로 확인된 모든 표적 이벤트들을 서던 블롯 분석으로 추가로 분석하여, 통합된 표적 서열의 카피수를 결정하였다.
GUS 발현 및 전장 PCR의 스크리닝을 통과한 모든 표적 이벤트에 대해 서던 블롯 분석을 수행하였다. 10 ㎍의 게놈 DNA를 표적 서열 내의 독특한 절단기인 NsiI로 소화시켰다. 소화된 게놈 DNA를 0.8％ 아가로스 젤 상에서 분리하고, 나일론 막으로 옮겼다. 가교 후, 막 상의 옮겨진 DNA를 HPT 유전자 프로브와 혼성화시켜, 표적 서열의 5' 말단의 카피수를 결정하였다. 그후, 동일한 블롯을 벗겨내고, PAT 유전자 프로브와 재-혼성화시켜, 표적 서열의 3' 말단의 카피수를 결정하였다.
GUS 발현을 나타내고 전장 표적 서열의 단일 카피를 함유한 3개의 이벤트를 더욱 철저한 서던 블롯 분석, 전체적인 표적 서열 확인 및 플랭킹된 게놈 서열 분석을 포함하는 추가적인 특성화를 위해 선별하였다 (표 2). 이러한 3개의 이벤트는 BY2-380, NT1-240 및 NT1-260이었다. 도너 DNA 및 아연 손가락- Fok1 융합 단백질 유전자를 포함하는 벡터를 사용하는 추후의 재-형질전환을 위해, 이러한 3개의 이벤트로부터 현탁 배양물을 재-확립시켰다.
Figure 112009014396275-pct00002
표적 이벤트 BY2-380, NT1-240 및 NT1-260으로부터 확립된 3개의 현탁 배양물이 예상 대로 표적 서열을 함유하였음을 확실히 하기 위해, 표적 서열의 5' 말단의 HPT 발현 카셋트의 3' UTR에서 표적 서열의 3' 말단의 부분적 PAT 유전자 카셋트의 3' UTR까지의 주요 표적 서열을 프라이머 쌍 P15/P16을 사용하여 PCR 증폭시키고, pCR2.1 TOPO 벡터 (Invitrogen (Carlsbad, California)) 내로 클로닝하였다. TOPO 벡터 내로 삽입된 PCR 생성물을 Lark technology, Inc. (Houston, Texas)에 의해 서열분석하였다. 서열 결과는 BY2-380 및 NT1-240에는 예상대로 완전한 표적 서열이 있었지만, NT1-260에는 5475 bp의 DNA 삽입물이 있었음을 가리켰다. 삽입물은 3' 부분적 PAT 서열의 3' 말단의 27 bp 상류에 위치하였다. 흥미롭게도, 이러한 삽입물 내에 2883 bp의 orf가 있었다. NBCI 데이터베이스에 대한 이러한 orf의 BLAST 검색은 orf가 아그로박테리움으로부터의 트랜스포존과 매칭되었음을 나타냈다. 이러한 표적 세포주 NT1-260은 PAT 선별성 마커 유전자 내의 여분의 삽입 서열로 인해 염색체간 상동 재조합 실험에 적절하지 않을 수 있지만, 표적 벡터 내에 디자인된 GFP 리포터 시스템을 사용하여 염색체내 상동 재조합을 테스트하는데 사용될 수 있다.
3개의 세포주 모두를 추가로 분석하여, 플랭킹된 게놈 서열을 Universal Genome Walker Kit (Clontech (Mountain View, California))를 사용하여 수득하였다. 간략하게, 2.5 ㎍의 게놈 DNA를 3개의 블런트-말단 제한 효소 EcoRV, DraI 및 StuI로 개별적인 반응들에서 소화시켰다. 소화된 DNA를 페놀/클로로포름 추출을 통해 정제하고, BD Genome Walker Adaptor와 결찰시켰다. 결찰물을 주형으로 사용하여, 1차 PCR 반응을 위한 프라이머 P20 (표적 서열 삽입물의 5' 말단의 상류에서 보행) 및 P21 (표적 서열 삽입물의 3' 말단의 상류에서 보행), 및 2차 PCR 반응을 위한 프라이머 P22 (표적 서열 삽입물의 5' 말단의 상류에서 보행) 및 P23 (표적 서열 삽입물의 3' 말단의 상류에서 보행)으로 네스티드(nested) PCR 증폭을 수행하였다. 2차 PCR 반응으로부터의 증폭된 단편을 pCR2.1 TOPO 또는 pCR Blunt II TOPO 벡터 (Invitrogen (Carlsbad, California)) 내로 클로닝하고, Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Beckman Coulter (Fullerton, CA))를 사용하여 서열분석하였다. 이러한 프로세스를 통해 3개의 표적 세포주 모두로부터 플랭킹된 게놈 서열을 수득하였다. 그후, 플랭킹된 게놈 서열을 기초로 프라이머를 디자인하여, 전체 표적 서열을 증폭시키는데 사용하였다. 이러한 표적 세포주들로부터 수득된 증폭된 단편은 예상된 크기였다. 증폭된 단편들의 양쪽 말단을 서열분석에 의해 확인하였다.
실시예 4: 도너 DNA 벡터의 디자인 및 생성
도너 DNA 구축물은 상동성 서열-1 (니코티아나 타바쿰 RB7 MAR) (WO9727207 (Thompson 등, 1997)), 전장 아라비돕시스 탈리아나 ubi10 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493]), 299 bp의 5' 부분적 PAT 유전자 코딩 서열 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37]) 및 상동성 서열-2 (아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1) (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)를 포함하였다. 도너 벡터 내의 상동성 서열-1 및 서열-2 모두는 표적 벡터 (pDAB1585) 내의 상응하는 상동성 서열-1 및 서열-2와 동일하였다.
도너 벡터를 구축하기 위해, 299 bp의 5' 부분적 PAT 코딩 서열을 Picoscript Ltd., LLP (Houston, Texas)에 의해 DNA 합성을 통해 전장 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)와 융합시켰다. NcoI 및 XhoI 부위가 단편의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. 그후, 이러한 합성된 DNA 단편을 NcoI/XhoI으로 소화시키고, pDAB1575 내로 동일한 부위에서 삽입하여, 전장 PAT 유전자 코딩 서열 및 이의 3' UTR을 교체하였다. 생성된 구축물을 pDAB1576 (도 25)로 명명하였다.
그후, pDAB1576을 AgeI으로 소화시키고, 상동성 서열-1 및 상동성 서열-2가 플랭킹된 5' 부분적 PAT 발현 카셋트를 함유하는 전체 단편을 이원성 기본 벡터인 pDAB2407 내로 동일한 부위에서 삽입하였다. 생성된 구축물을 pDAB1600로 명명하였고, 이는 식물 세포 재-형질전환을 위한 이원성 버젼의 도너 벡터였다 (도 26).
실시예 5 - 아연 손가락 뉴클레아제 발현 벡터의 디자인 및 생성
아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자가 CsVMV 프로모터 및 5' UTR ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139])에 의해 구동되었다. 카셋트 내에 니코티아나 타바쿰 오스모틴 5' 및 3' UTR (US2005102713 (Merlo 등))이 또한 포함되었다. 이러한 벡터를 만들기 위해, pDAB7002 (도 27) 내의 PAT를 구동시키는 CsVMV 프로모터 및 5'UTR을 포함하는 HindIII/SacI 단편을 pDAB7025 (도 28)로부터 HindIII/SacI으로 절제된, GUS를 구동시키는 CsVMV 프로모터 및 5' UTR 및 니코티아나 타바쿰 5' UTR을 포함하는 단편으로 교체하였다. 생성된 플라스미드를 pDAB1591 (도 29)로 명명하였다.
IL1-L0-Fok1 및 Scd27-L0-Fok1 코딩 서열을 이들의 원래의 벡터인 pCDNA3.1-IL1-L0-FokI (도 30) 및 pCDNA3.1-SCD27a-L0-FokI (도 31)으로부터 프라이머 쌍 P11/P12 및 P13/P14를 각각 사용하여 PCR 증폭시켰다. BbsI 및 SacI 부위가 PCR 단편의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. pDAB1591 내의 PAT 유전자를 SacI/NcoI 클로닝을 통해 아연 손가락 융합 단백질 유전자 PCR 단편으로 교체하였다. 생성된 플라스미드를 IL-1-Fok1 및 Scd27-Fok1에 대해 각각 pDAB1592 (도 32) 및 pDAB1594 (도 33)로 명명하였다.
이원성 버젼의 이러한 벡터들을 pDAB1592 및 pDAB1594로부터 아연 손가락 융합 단백질 유전자 발현 카셋트를 PmeI/XhoI 단편으로 절제하고, 말단들을 채우고, pDAB2407 내로 PmeI 부위에서 클로닝함으로써 구축하였다 (도 34A). 생성된 플라스미드들을 IL-1 ZFN 및 Scd27 ZFN에 대해 각각 pDAB1596 (도 34B) 및 pDAB1598 (도 34C)로 명명하였고, 이들은 식물 세포 재-형질전환을 위한 이원성 버젼의 아연 손가락 융합 단백질 유전자 벡터였다.
실시예 6 - 양성 대조군 벡터의 디자인 및 생성
재조합 빈도를 변칙화시키고, 양성 대조군으로서 작용하기 위해, PAT 유전자 발현 카셋트를 함유하는 벡터를 사용하였다. 최종 재조합체와 유사하게 하기 위해, 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)을 PAT 코딩 서열 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37])의 299/300 bp에서 삽입하였다. 이러한 구축물을 만들기 위해, 2559 bp의 pDAB1576으로부터의 SwaI/ClaI 단편을 동일한 제한 효소들로 소화된 pDAB1577 (도 35)의 골격 단편과 결찰시켰다. 생성된 벡터는 1743 bp의 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)이 PAT 코딩 서열 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37])의 중앙에 삽입된 PAT 유전자 발현 카셋트를 함유하였다. 이러한 벡터를 pDAB1578 (도 36)로 명명하였다.
이원성 버젼의 pDAB1578을 만들기 위해, 아라비돕시스 탈리아나 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)이 있는 PAT 유전자 발현 카셋트를 pDAB1578로부터 PmeI/XhoI로 절제하였다. 단편의 3' 말단을 블런트-말단 처리한 후, 이를 이원성 기본 벡터인 pDAB2407 내로 PmeI 부위에서 삽입하였다. 생성된 벡터를 pDAB1601 (도 37)로 명명하였고, 이는 아라비돕시스 탈리아나 ubi10 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493])에 의해 구동되고 아그로박테리움 투메파시엔스 orf25/26 3' UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))로 종결되는 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) 서열을 함유하는 PAT 유전자 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37])를 포함하였다.
실시예 7: 아연 손가락 뉴클레아제 유전자 및 도너 DNA 서열로의 표적 세포 배양물의 재-형질전환
각각 표적 서열의 통합된 단일 전장 카피를 함유하는 3개의 독립적인 히그로마이신-저항성 트랜스제닉 세포 배양물 (NT1-240, NT1-260 및 BY2-380)을 선별하여, 약 250-500 mg의 캘러스 조직을 100 ㎎/ℓ의 히그로마이신을 함유하는 기초 배지 (NT1 및 BY2에 대해 각각 MS계 또는 LS계) 40-50 ㎖에 놓고 상기 기술된 바와 같이 7일마다 하위배양함으로써 현탁 배양물을 다시 개시시켰다. 재-형질전환 전에, 현탁 배양물을 히그로마이신이 없는 기초 배지로 옮겼다.
표적 세포 배양물의 아그로박테리움-매개 형질전환을 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 각각의 실험에 대해, 10개의 공동배양 플레이트를 생성시켰고, 이때 플레이트 1개는 pDAB1600 (도너 DNA)이 서식하는 아그로박테리움 균주 100 ㎕와 함께 공동배양된 세포를 포함하였고, 플레이트 1개는 pDAB1601 (PAT 선별성 마커)이 서식하는 아그로박테리움 균주 100 ㎕와 함께 공동배양된 세포를 포함하였으며, 플레이트 4개는 pDAB1600 (도너 DNA)가 서식하는 아그로박테리움 균주 50 ㎕ 및 pDAB1596 (IL-1 ZFP-Fok1)이 서식하는 아그로박테리움 균주 250 ㎕와 함께 공동배양된 세포를 포함하였고, 플레이트 4개는 pDAB1600 (도너 DNA)가 서식하는 아그로박테리움 균주 50 ㎕ 및 pDAB1598 (Scd 27a ZFP-Fok1)이 서식하는 아그로박테리움 균주 250 ㎕와 함께 공동배양된 세포를 포함하였다. 상기 기술된 방법을 사용하여 공동배양한 후, 세포들을 500 ㎎/ℓ 카르베니실린 및 NT1 또는 BY2에 대해 각각 10 ㎎/ℓ 또는 15 ㎎/ℓ Bialaphos®을 함유하는 기초 배지 (NT1 및 BY2에 대해 각각 MS계 또는 LS계) 상에 플레이팅하였다. 개별적인 Bialaphos®-저항성 단리물들이 플레이팅하고 나서 2-4주 후에 나타났고 (표 3), 이들을 개별적인 60×20 ㎜ 플레이트 (플레이트 당 1개의 단리물)로 옮겨서, 분석에 필요할 때까지 14일 하위배양 스케쥴로 캘러스로 유지시켰다.
Figure 112009014396275-pct00003
실시예 8 - 상동 재조합의 확인
A. 염색체간 상동 재조합
2가지 전략을 개발하여, 실시예 1 내지 7에 기술된 예시적인 담배 시스템에서 아연 손가락-Fok1 융합 단백질에 의해 촉진되는 염색체간 상동 재조합에 대해 테스트하였다.
전략 1에서, 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 (IL-1-L0-Fok1)에 대한 결합 부위가 표적 구축물의 중앙에 포함되었다 (도 37). 이러한 전략에서, 결합 부위에 약 3 kb의 비-상동성 서열이 양쪽 측면 상에서 플랭킹되었고, 여기에 상동성 서열-1 (니코티아나 타바쿰 RB7 MAR) 및 상동성 서열-2 (아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1)가 상류 및 하류에 각각 이어졌다 (도 38). IL-1 아연 손가락-Fok1 융합 단백질의 존재 하에, IL-1-L0-Fok1 결합 서열이 인식되고, 이러한 특정 부위에서 이중 가닥 DNA 파손이 유도될 것이며, 이러한 파손은 내인성 DNA 복구 프로세스를 자극할 것으로 가정되었다. 표적 서열 내의 것과 동일한 상동성 서열을 함유한 도너 DNA의 존재 하에, 5' 부분적 PAT 유전자 (이의 프로모터와 함께)가 상동 재조합을 통해 표적 내의 상동성 서열들 간의 전체 약 6 kb의 DNA 단편을 교체할 것이다. 이러한 프로세스를 통해, 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1이 사이에 개재된 2개의 부분적 PAT 유전자 서열이 기능성 PAT 유전자를 재구성하여, PAT 발현 및 제초제 저항성 표현형이 초래될 것이다.
전략 2에서, 2개의 아연 손가락-Fok1 결합 부위 (Scd27-L0-Fok1)가 표적 벡터 내에 포함되었고, 이때 1개는 니코티아나 타바쿰 RB7 MAR의 하류에 직접적으로, 나머지 1개는 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론 1의 상류에 직접적으로 포함되었다 (도 39). 2개의 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 결합 부위 사이에 5' GFP 단편, GUS 발현 카셋트 및 3' GFP 단편을 포함한 약 6 kb의 서열이 있었다. Scd27 아연 손가락-Fok1 융합 단백질의 존재 하에, 2개의 결합 서열이 인식되고, 양쪽 위치에서 이중 가닥 DNA 파손이 유도될 것이며, 이러한 파손은 이러한 2개의 결합 서열 사이의 약 6 kb의 DNA 단편을 제거하고 내인성 DNA 복구 프로세스를 자극할 것으로 가정되었다. 전략 1과 유사하게, 표적 서열 내의 것과 동일한 상동성 서열을 함유한 도너 DNA의 존재 하에, 5' 부분적 PAT 유전자 (이의 프로모터와 함께)가 이중 가닥 DNA 파손이 유도된 부위에서 상동 재조합을 통해 표적 서열 내로 삽입될 것이다. 이러한 프로세스를 통해, 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1이 사이에 개재된 2개의 부분적 PAT 유전자 서열이 기능성 PAT 유전자를 재구성하여, PAT 발현 및 제초제 저항성 표현형이 초래될 것이다.
제초제 (Bialaphos®) 선별 후 수득된 모든 단리물들을 재구성된 PAT 유전자에 스패닝(spanning)된 DNA 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍 P24/25을 사용하여 PCR에 의해 1차로 분석하였다. 프라이머 P24는 도너 DNA 내의 PAT 코딩 서열의 5' 말단에 상동성이었고, 프라이머 P25는 표적 DNA 내의 PAT 코딩 서열의 3' 말단에 상동성이었다. 2개의 PAT 코딩 서열이 상동 재조합을 통해 연결되면, 2.3 kb PCR 단편이 초래되었다. 도 40에 나타난 바와 같이, 다수의 분석된 단리물들로부터 2.3 kb PCR 생성물이 수득되었다. 이러한 단리물들은 IL-1 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자/도너 DNA 및 Scd27 아연 손가락-Fok 융합 단백질 유전자/도너 DNA의 공동-형질전환 모두로부터 수득되었다. IL-1 아연 손가락-Fok1 및 Scd27 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자 형질전환 양쪽 모두로부터 유래된 것들을 대표하는 여러 독립적인 단리물들로부터의 2.3kb PCR 생성물을 아가로스 젤로부터 정제하고, pCR2.1 TOPO 벡터 (Invitrogen (Carlsbad, California)) 내로 클로닝하였다. 그후, TOPO 벡터 내에 삽입된 2.3 kb PCR 생성물을 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Beckman Coulter)를 사용하여 서열분석하였다. 서열분석 결과로, TOPO 벡터 내에 클로닝된 모든 PCR 생성물이 5' 및 3' 부분적 PAT 유전자 서열 + 개재성 니코티아나 타바쿰 4-CoAS 인트론-1을 포함하는 예상된 바와 같은 재조합된 서열을 함유하였음이 확인되었다. 이러한 결과들로, 테스트된 양쪽 전략 모두에 대해 예상된 염색체간 재조합이 확인되었고, 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자 발현을 통한 유전자 표적화가 예시되었다.
한쌍의 샘플을 재조합된 전체 영역에 걸쳐 DNA 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍 P26/P25를 사용하여 PCR에 의해 추가로 분석하였다. 프라이머 P26은 표적 서열 내의 HPT 유전자 코딩 영역의 3' 말단에 상동성이었고, 프라이머 P25는 표적 서열 내의 PAT 유전자 코딩 영역의 3' 말단에 상동성이었다. 표적 서열과 도너 DNA 사이에 상동 재조합이 일어나면, 예측된 5.2 kb PCR 생성물이 수득되었다. 재조합되지 않은 표적에서는 약 10 kb의 PCR 생성물이 산출되었다. 5.2 kb PCR 생성물이 분석된 양쪽 샘플 모두로부터 수득되었다. 분석된 샘플들 중 하나로부터의 5.2 kb PCR 생성물을 아가로스 젤로부터 정제하고, pCR2.1 TOPO 벡터 (Invitrogen (Carlsbad, California)) 내로 클로닝하였다. 그후, PCR 생성물을 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Beckman Coulter (Fullerton, CA))를 사용하여 서열분석하였다. 서열분석 결과로, HPT 코딩 영역의 3' 말단 (표적 서열로부터), 아라비돕시스 탈리아나 orf-24 3' UTR (표적 서열로부터), 니코티아나 타바쿰 RB7 MAR (상동성 서열- 1), 아라비돕시스 탈리아나 ubi-10 프로모터 (도너 DNA로부터), 5' 부분적 PAT 유전자 (도너 DNA로부터), 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1 (상동성 서열-2), 3' 부분적 PAT 유전자 (표적 서열로부터)를 (5'에서 3' 방향으로) 포함하는 재조합된 서열을 PCR 생성물이 함유하였음이 확인되었다. 이러한 결과로, PCR 생성물들이 염색체간 상동 재조합으로부터 초래되었음이 추가로 확인되었다.
재조합체를 게놈 수준에서 추가로 분석하기 위해, IL-1 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자/도너 DNA 및 Scd27 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자/도너 DNA 형질전환 모두로부터 선별된 단리물 22개의 셋트로 서던 블롯 분석을 수행하였다. 모든 샘플이 PCR 분석에 의해 재조합체인 것으로 확인되었다. 각각의 샘플로부터의 게놈 DNA 10 ㎍을 BanII로 소화시켰다. 소화된 게놈 DNA을 0.8％ 아가로스 젤 상에서 분리하고, 나일론 막으로 옮겼다. 막 상에서의 가교 후, DNA를 3' PAT 프로브와 혼성화시켰다. 예상된 재조합체에서는 2079 bp의 밴드가 산출될 것이고, 재조합되지 않은 표적 서열에서는 3018 bp의 밴드가 산출될 것이다. 결과는 분석된 22개의 샘플 중 18개의 샘플에서, 예상된 약 2 kb 크기의 밴드가 있었음을 나타냈고, 이는 이러한 이벤트들이 2개의 부분적 PAT 단편 부근에서의 상동 재조합을 통해 유래되었음을 가리켰다 (도 41). 2개의 샘플은 예상되지 않은 크기의 밴드를 나타냈고 (표적 대조군보다 1개는 크고, 1개는 작음), 이는 이러한 2개의 샘플에서의 재조합이 전적으로 상동성-의존적이지 않았거나 또는 추가적인 서열 재배열이 재조합 동안 또는 재조합 후에 일어났음을 시사한다. 또다른 2개의 샘플은 표적 대조군과 동일한 밴드 (약 3 kb)를 나타냈고, 이는 이러한 샘플들이 제초제 선별로부터의 이탈물이거나, 또는 적은 비율의 세포들만이 서던 블롯 분석에 대한 검출 수준 미만의 상동 재조합으로부터 유래된 혼합 세포 집단이었음을 시사한다. 아마도, 후자는 이러한 샘플들이 PCR로 분석했을 때 상동 재조합에 상응하는 예상 증폭 생성물을 나타냈기 때문인 경우였다. 예상된 재조합 밴드를 나타낸 18개의 샘플 중에서, 4개의 샘플에는 표적 대조군과 동일한 크기의 추가적인 밴드가 또한 있었고, 이는 이러한 샘플들이 일부 세포들이 재조합되지 않은 혼합 세포 집단을 나타냈음을 가리킨다. 또다른 4개의 샘플에는 다양한 크기의 추가적인 밴드들이 있었고, 이는 이러한 샘플들이 비-상동성-의존적 이벤트가 진행된 일부 세포들을 포함하는 유전자 키메라(chimera)였음을 가리킨다. 종합적으로, 22개의 샘플 중 10개가, 적어도 2개의 부분적 PAT 단편 내에 수반되는 영역에서, 예측된 대로 상동 재조합이 진행된 것으로 서던 블롯 분석에 의해 확인되었다,
B. 염색체내 상동 재조합
아연 손가락-Fok1-촉진 염색체내 상동 재조합을 테스트하기 위해, 540 bp의 중첩 서열이 있는 2개의 비-기능성 GFP 단편이 도 42에 묘사된 바와 같이 표적 벡터 내에 포함되었다. 이러한 2개의 단편 사이에 GUS 유전자 발현 카셋트가 있었다. IL-1-Fok1 융합 단백질 결합 서열이 GUS 코딩 서열과 이의 N-말단에서 융합되었다. IL-1-Fok1 융합 단백질의 존재 하에, IL-1 ZFN 결합 서열이 인식될 것이고, 이중 가닥 DNA 파손이 유도될 것이며, 이러한 파손은 내인성 DNA 복구 프로세스를 자극할 것으로 가정되었다. 도너 DNA가 존재하지 않으면, 2개의 부분적으로 상동성인 GFP 단편들에 염색체내 상동 재조합 프로세스가 진행될 것이고, 기능성 GFP 유전자가 재구성될 것이다.
2개의 표적 세포주 BY2-380 및 NT1-260을 상기 기술된 바와 같이 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 플라스미드 pDAB1596 (IL-11-Fok1 융합 단백질 유전자 이원성 벡터)로 형질전환시켰다. 도너 DNA (pDAB1600) 및 PAT 대조군 DNA (pDAB1601) 양쪽 모두가 별도의 대조군 처리로서 포함되었다. 세포를 형질전환 후에 비-선별 배지 상에 플레이팅하였다. 구성된 기능성 GFP 유전자의 명백한 발현으로 형질전환 약 5-8일 후에 눈에 보이는 형광이 초래되었다. 표 4에 요약된 바와 같이, 약 50개의 형광 반점이 IL-1-Fok1 융합 단백질 유전자 구축물 (pDAB1596)로 형질전환된 각각의 플레이트에서 관찰되었다. 테스트된 2개의 표적 세포주 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 경미한 배경을 넘어서는 감지할 수 있는 형광이 도너 DNA 또는 PAT 유전자 구축물로 형질전환된 음성 대조군에서 관찰되지 않았다.
Figure 112009014396275-pct00004
녹색 형광 반점이 기능성 GFP 유전자의 재구성으로부터 초래되었음을 확인하기 위해, GFP 발현 조직의 분자적 분석을 수행하였다. 모든 세포를 비-선별 배지 상에 플레이팅하였기 때문에, GFP 발현에 관하여 균질성인 세포 집단을 수득하기가 어려웠다. 다수의 형광 조직 절편을 플레이트로부터 단리하고 (해부 현미경으로 보조), 여러 계대의 선별적 하위 배양을 통해 강화시켰다. 이러한 시각적으로 강화된 조직들로부터 게놈 DNA를 단리하고, 프라이머 쌍 P27/P28을 사용하여 PCR에 의해 분석하였다. 프라이머 P27은 표적 DNA 서열 내의 5' 부분적 GFP 단편의 5' 말단에 상동성이었고, 프라이머 P28은 표적 DNA 서열 내의 3' 부분적 GFP 단편의 3' 말단에 상동성이었다. 이러한 2개의 GFP 단편 간의 염색체내 상동 재조합을 통해 GFP 유전자가 재구성되면, 예측된 0.6 kb PCR 생성물이 수득된다. 재조합되지 않은 표적으로는 4.1 kb의 PCR 생성물이 산출된다. 도 43에 나타난 바와 같이, 형광 조직으로부터 강화된 모든 샘플에 예측된 0.6 kb PCR 생성물이 있었고, 이는 기능성 GFP 유전자가 이러한 조직에서 재구성되었음을 가리켰다. 제2의 4.1 kb PCR 생성물이 이러한 강화된 샘플 모두에서 또한 관찰되었고, 이는 재조합되지 않은 세포 집단의 존재를 가리켰다. 이는 이러한 샘플들이 형광을 지표로 사용하는 시각적 선별을 통해서 강화되었을 뿐이기 때문에 뜻밖이었다. PCR 생성물을 0.8％ 아가로스 젤 상에서 분리하고, 나일론 막으로 옮기고, GFP 유전자 코딩 서열로 프로빙하였다. 결과는 0.6 kb 및 4.1 kb의 2개의 PCR 생성물이 GFP 서열을 함유하였음을 가리켰고, 이에 의해 재구성된 GFP 유전자의 발현으로부터 형광이 초래되었음이 확인되었다.
실시예 9: 단자엽식물 내의 유전자에 표적화된 아연 손가락-Fok1 융합 단백질의 디자인
단자엽식물 (예를 들어, 옥수수, 수수, 밀, 보리, 쌀)에서의 상동성-지시 복구를 촉진하기 위한 아연 손가락 뉴클레아제를 하기와 같이 디자인하고 합성하였다. 당해 유전자를 선별하였고, 바람직하게는 이러한 유전자는 아미노산 치환을 위해 표적화될 수 있는 하나 이상의 코돈을 포함하였다. 선별된 유전자의 관련된 부분을 클로닝하였고, 클론의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다.
이렇게 수득된 서열을, 개별적인 아연 손가락들 및 이들의 표적 부위의 목록 및/또는 손가락 2개의 모듈들 및 이들의 표적 부위의 목록을 함유하는 컴퓨터 프로그램을 임의로 사용하여, 5-6개의 뉴클레오티드 쌍만큼 떨어진 한쌍의 표적 서열에 대해 스캐닝하였고, 이때 각각의 표적 서열에 손가락 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아연 손가락 단백질이 결합될 수 있었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,785,613; WO 98/53057; WO 01/53480 및 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0092000 참조. ZFP 디자인을 위한 추가적인 방법이, 예를 들어, 미국 특허 5,789,538; 6,013,453; 6,410,248; 6,733,970; 6,746,838; 6,785,613; 6,866,997; 7,030,215; WO 01/088197; WO 02/099084; 및 미국 특허 출원 공보 2003/0044957; 2003/0108880; 2003/0134318 및 2004/0128717에 개시되어 있다.
전단계에서 확인된 각각의 표적 서열에 대해, FokI 절단 절반-도메인과 표적 서열에 결합하는 아연 손가락 단백질 간의 융합물을 코딩하는 유전자를 합성하였다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,436,150; WO 2005/084190 및 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0064474 참조. 그후, [Bartsevich et al. (2003) Stem Cells 21:632-637]에 예를 들어 기술된 바와 같은 ELISA 분석법을 사용하여, 각각의 융합 단백질을 표적 서열에 결합하는 친화력에 대해 테스트하였다. 표적 서열 결합 친화력이 미리 정해진 역치를 초과하는 단백질을 세포-기반 리포터 분석법에서 추가로 테스트하였다.
임의로, 미국 특허 번호 6,794,136에 기술된 방법을 사용하여, 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 융합 단백질의 결합 친화력을 평가할 수 있고, 필요하다면 개선시킬 수 있다.
예를 들어, [Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651] 및 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0064474에 기술된 바와 같이, 세포-기반 테스트를 수행하였다. 간략하게, 상기 기술된 바와 같이 확인된 표적 서열 쌍을 적합한 세포주에서 독시사이클린-유도성 프로모터의 전사 제어 하에 결손성 염색체 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자 내로 삽입하였다. 세포를 2개의 아연 손가락/FokI 융합 단백질 (각각 표적 서열들 중 하나에 결합함)을 코딩하는 핵산, 및 결손성 염색체 GFP 유전자의 상동성-지시 복구를 위한 주형으로 작용하는 경우 기능성 GFP 유전자를 재구성할 서열을 함유하는 핵산으로 형질감염시켰다. 상동성-지시 복구가 일어난 세포를 독시사이클린으로의 유도 후에 형광-활성화 세포 분류에 의해 확인 및 정량할 수 있었다.
실시예 10: 단자엽식물용 도너 DNA 벡터의 디자인 및 생성
도너 DNA 구축물은 선별된 유전자에 대한 코딩 서열 (CDS) 및 CDS의 상류 및/또는 하류의 게놈 서열을 포함하였다. CDS 및/또는 게놈 서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스 및/또는 식물 게놈 데이터베이스로부터 수득되었다. 부분적 서열과 공지된 서열 간의 "contig" 매치를 사용하여, 서열들이 선별된 단자엽식물 게놈 내의 동일한 유전자좌로부터 유래되었음을 확인하였다. 아연 손가락 뉴클레아제 결합 서열이 재조합 후에 반복적으로 절단되는 것을 방지하기 위해, 코딩된 아미노산 서열의 변화를 야기하지 않는 2개의 단일 뉴클레오티드 돌연변이가 도너 DNA 내의 아연 손가락 뉴클레아제 (ZFN) 결합 서열 내에 또한 만들어졌다. 1개의 돌연변이 또는 양쪽 모두가 하류 분자적 특성화를 용이하게 하는 제한 효소 부위를 생성시킬 수 있다.
도너 DNA 벡터를 구축하기 위해, CDS 및 하류 서열의 일부를 커버하는 DNA 단편을 선별된 단자엽식물의 게놈 DNA로부터 적절한 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 바람직하게는 제한효소 부위 (예를 들어, SacI 및 BamHI 부위)가 PCR 단편의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. PCR 생성물을 pCR Blunt II TOPO 벡터 (Invitrogen (Carlsbad, California)) 내로 클로닝하였다.
하나 이상의 선별된 뉴클레오티드를 QuickChange® 부위-지정 돌연변이유발 키트 (Stratagene (La Jolla, California))를 사용하여 교체함으로써 원하는 위치에서의 돌연변이를 도입할 수 있었다. 상기 언급된 바와 같이, 추가적인 단일 침묵 돌연변이 (예를 들어, 2개, 3개 또는 그 이상의 단일 돌연변이)를 QuickChange? 부위-지정 돌연변이유발 키트 (Stratagene (La Jolla, California))를 사용하여 유사한 방식으로 아연 손가락-Fok1 결합 서열 내에 또한 도입할 수 있었다. 치환 돌연변이 및 추가적인 침묵 단일 돌연변이가 있는 PCR 단편을 적합한 소화에 의해 pCR Blunt II TOPO 벡터로부터 단리하고, pSB11 (도 44) 내로 동일한 부위에서 클로닝하였다. 그후, 생성된 플라스미드 DNA를 pSB1 플라스미드 (도 45)가 서식하는 아그로박테리움 균주 내로 형질전환시켜, 상동 재조합을 통해 식물 세포 형질전환을 위한 수퍼-이원성 도너 벡터가 형성되었다.
실시예 11: 형질전환을 위한 단자엽식물 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자 벡터의 디자인 및 생성
아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자가 적절한 단자엽식물 프로모터 (예를 들어, 제아 메이스(Z. mays) ubi1 프로모터 (US5614399 (Quail등)))에 의해 구동되었다. 카셋트는 제아 메이스 페록시다제-5 (per5) 3' UTR (WO9856921 (Ainley 등))을 또한 포함하였다. 이러한 벡터를 만들기 위해, 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자를 원래의 원천 벡터로부터 NcoI/SacI 소화에 의해 단리하고, pDAB3872 (도 46) 내로 동일한 부위에서 클로닝하였다. 제아 메이스 ubi-1 프로모터, 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자 및 제아 메이스 per-5 3' UTR을 포함하는 발현 카셋트를 상기에서 제조된 중간체 벡터로부터 HindIII/MscI 소화에 의해 단리하고, pSB11 내로 HindIII/PmeI 부위에서 삽입하였다. 그후, 생성된 플라스미드를 pSB1 플라스미드가 서식하는 아그로박테리움 균주 내로 형질전환시켜, 상동 재조합을 통해 수퍼-이원성 벡터 pDAB4365가 형성되었다 (도 47). pDAB4365는 식물 세포 형질전환을 위한 수퍼-이원성 버젼의 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자 발현 벡터였다.
실시예 12: 아연 손가락 뉴클레아제 유전자 및 도너 DNA로의 옥수수 세포의 형질전환, 및 세포 배양물의 생성
시판되는 토양 믹스 (Conrad Fafard, Inc. (Springfield); Soil Mix #3)를 함유하는 5갤런 단지에 '하이(High) II' F1 교배 ([Armstrong, et al., 1991, Maize Genet. Coop. News Lett. 65:92-93])의 종자를 직접 뿌렸다. 약 1,500 ft-촉광의 조명을 일으키는 고압 나트륨 및 금속 할로겐화물 램프의 조합이 보충된 16시간 광주기로 온실에서 식물을 성장시켰다. 낮과 밤의 온도를 27/20 ± 2℃에서 유시시켰다. 표준 비료 탱크 믹스와 함께 필요에 따라 식물에 물을 공급하였다.
미성숙 배아를 수득하기 위해, 제어 수분(受粉) (근친 또는 자가)이 수행될 수 있었다. 수분 하루 전날 수염 뒤에서 절단함으로써 최대의 수정 및 종자 셋트를 위한 완전한 수염 브러시를 생산하는 것에 의해, 개화기의 식물을 수분용으로 제조하였다. 수분 당일에, 활발하게 벗겨진 수염들을 자루에 담고, 신선한 화분을 수집하여, 수염 상에 조심스럽게 적용하였다. 발달 중인 배아의 크기가 1.0-1.2 mm에 도달했을 때 (수분 9-10일 후), 알갱이들을 잘라내어 표면을 멸균하였다. 간략하게, 알갱이들들을 70％ 에탄올에 2-5분 동안, 20％ 시판 표백제 (0.1％ 차아염소산나트륨)에 30-45분 동안 함침시킨 후, 무균성 증류수에서 3번 헹구었다. 멸균 후, 미성숙 배아를 단리할 수 있었다.
2개의 상이한 아그로박테리움 균주가 형질전환에 사용되었다. 첫번째 균주에는 실시예 9-11에 기술된 바와 같은 아연 손가락 뉴클레아제 유전자 구축물이 서식하였고, 두번째 균주에는 치환 돌연변이를 포함하는 도너 DNA 서열이 서식하였다. 미국 특허 5,591,616에 기술된 Japan Tobacco로부터의 '수퍼 이원성' 벡터 시스템을 사용할 수 있었다.
아그로박테리움 현탁액을 제조하기 위해, 스트리크(streak) 플레이트 (5 g/ℓ 효모 추출물, 10 g/ℓ 박토-펩톤(Bacto-Peptone), 5 g/ℓ 염화나트륨, 50 ㎎/ℓ 스펙티노마이신, 10 ㎎/ℓ 테트라사이클린 및 15 g/ℓ 박토 아가(Bacto Agar) 함유)로부터의 1-2 루프의 박테리아를 5 ㎖의 '침윤' 배지 내에 놓았다. '침윤' 배지는 LS 기초 염 ([Linsmaier et al., 1965, Physiol. Plant.]), N6 비타민 ([Chu et al., 1975, Sci. Sinica 18:659-668]), 1.5 ㎎/ℓ 2,4-D, 68.5 g/ℓ 수크로스, 36 g/ℓ 글루코스, 6 mM 프롤린 (필터 멸균 전에 pH 5.2로 조정됨)으로 구성되었다. 균일한 현탁액이 달성될 때까지 혼합물을 와동시켰다. 용액의 밀도를 판독함으로써 Klett-Summerson 광전 비색계를 사용하여 박테리아 농도를 결정하였다. 용액을 Klett 200 (약 1×109 cfu/㎖)의 농도로 조정하고, 100μM의 최종 농도가 달성되도록 아세토시린곤을 첨가하였다.
미성숙 배아를 2 ㎖의 '침윤' 배지를 함유하는 미세원심분리 튜브 내로 직접 단리하였다. 약 100개의 배아를 함유하는 각각의 튜브를 3-5초 동안 와동시켰다. 배지를 제거하고, 동일한 조성의 신선한 액체 배지로 교체하고, 와동을 반복하였다. 액체 배지를 다시 제거하고, 1 ㎖의 Klett 200 농도의 아그로박테리움 용액 (800 ㎕의 아연 손가락 뉴클레아제 균주 및 200 ㎕의 도너 DNA 균주)로 교체하였다. 아그로박테리움 및 배아 혼합물을 30초 동안 와동시켰다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 배아를 배아 축을 아래로 하여 '공동-배양' 배지로 옮겨서, 5일 동안 25℃의 암실에 놓았다. '공동-배양' 배지는 LS 기초 염 ([Linsmaier et al., 1965, Physiol. Plant.]), N6 비타민 ([Chu et al., 1975, Sci. Sinica 18:659-668]), 1.5 ㎎/ℓ 2,4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 6 mM 프롤린, 0.85 ㎎/ℓ 질산은, 100 μM 아세토시린곤, 3 g/ℓ GELRITE® (필터 멸균 전에 pH 5.8로 조정됨)로 구성되었다.
실시예 13: 상동 재조합체의 선별
아연 손가락 뉴클레아제 유전자 카셋트 및 도너 DNA가 각각 서식하는 2개의 아그로박테리움 균주의 5:1 혼합물과의 공동배양 후, 배아를 아그로박테리움의 추가적인 성장을 정지시키는 성분 (예를 들어, 250 ㎎/ℓ Cefotaxime 및/또는 500 nM Pursuit®)을 포함할 수 있는 '캘러스' 배지로 이동시켰다. '캘러스 형성' 배지는 LS 기초 염 ([Linsmaier et al., 1965, Physiol. Plant.]), N6 비타민 ([Chu et al., 1975, Sci. Sinica 18:659-668]), 1.5 ㎎/ℓ 2,4-D, 0.5 g/ℓ MES, 30 g/ℓ 수크로스, 6 mM 프롤린, 1 ㎎/ℓ 질산은, 8 g/ℓ TC 한천 (PhytoTechnology Laboratories (Shawnee Mission, KS)) (오토클레이빙 전에 pH 5.8로 조정됨)으로 구성되었다. 선별 단계 내내, 배아를 28℃의 암실에서 배양하였다.
식물 재생을 위해, 캘러스 배양물을 '유도' 배지로 옮기고, 냉-백색 형광 램프에 의해 제공되는 약한 빛 (13 μE/㎡/s)에서 1주일 동안, 이어서 강한 빛 (40 μE/㎡/s)에서 1주일 동안 16/8 명/암 광주기로 27℃에서 인큐베이션하였다. '유도' 배지는 MS 기초 염 및 비타민 ([Murashige et al., 1962, Physiol. Plant. 15:473-497), 30 g/ℓ 수크로스, 5 ㎎/ℓ 6-벤질아미노퓨린, 0.025 ㎎/ℓ 2,4-D, 2.5 g/ℓ GELRITE® (오토클레이빙 전에 pH 5.7로 조정됨)으로 구성되었다. 이러한 2주 유도 기간 후, 캘러스를 '재생' 배지로 옮기고, 강한 빛 (40 μE/㎡/s)에서 27℃에서 인큐베이션하였다. '재생' 배지는 호르몬이 없는 것을 제외하고는 '유도' 배지와 동일하였다. 발아물이 나타날 때까지 2주마다 캘러스를 신선한 '재생' 배지로 하위배양하였다.
묘목의 길이가 약 3-5 cm에 도달했을 때, SH 기초 염 및 비타민 ([Schenk et al., 1972, Can. J. Bot. 50:199-204]), 10 g/ℓ 수크로스, 1 g/ℓ 마이오-이노시톨 및 2.5 g/ℓ GELRITE? (오토클레이빙 전에 pH 5.8로 조정됨)을 함유하는 150×25 mm 배양 튜브로 옮겼다. 일단 발아물이 튜브의 정상에 도달하면, 묘목을 약 0.25 kg의 상업용 토양 믹스 (Conrad Fafard, Inc. (Springfield); Soil Mix #3)를 함유하는 10 cm 단지로 옮기고, 충분히 물에 적시고, 투명한 플라스틱 컵을 2-4일 동안 덮었다. 3-5일의 잎 단계에, 식물을 5-갤런 단지로 옮기고, 성숙기까지 성장시켰다.
표적화된 절단, 표적화된 재조합 및 표적화된 통합과 관련된 추가적인 정보를 미국 특허 출원 공보 US-2003-0232410; US-2005-0026157; US-2005-0064474; US-2005-0208489 및 US-2007-0134796에서 확인할 수 있고, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 전문이 거명에 의해 포함된다.
본원에서 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 모든 목적을 위해 전문이 거명에 의해 본원에 포함된다.
명료한 이해를 위해 설명 및 예의 방식으로 명세서가 다소 상세하게 제공되었지만, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 실행될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 상기의 상세한 설명 및 예는 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> DOW AGROSCIENCES LLC SANGAMO BIOSCIENCES INC Cai, Qihua Miller, Jeffrey Ainley , William Garrison, Robbi Petolino, Joseph Rubin-Wilson, Beth Schulenberg, Lisa Worden, Andrew <120> ZINC FINGER NUCLEASE-MEDIATED HOMOLOGOUS RECOMBINATION <130> 64409A <140> PCT/US2007/017748 <141> 2007-08-09 <150> US 60/837,147 <151> 2006-08-11 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zinc finger nuclease IL-1 recognition sequence <400> 1 attatccgag tttaatagaa ctcggataat 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zinc finger nuclease IL-1 recognition sequence <400> 2 attatccgag ttctattaaa ctcggataat 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zinc finger nuclease Scd27 recognition sequence <400> 3 cgagttcttg tacaccagta caagaactcg 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zinc finger nuclease Scd27 recognition sequence <400> 4 cgagttcttg tactggtgta caagaactcg 30

Claims (60)

  1. (a) 식물 세포를, 제1 DNA 서열, 제2 DNA 서열 및 제5 DNA 서열을 포함하는 도너(donor) DNA 벡터와 접촉시키며,
    여기서 제5 DNA 서열은 도입되는 도너 DNA 벡터의 외인성 서열을 포함하고 도너 DNA 벡터의 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열 사이에 개재되고,
    제1 DNA 서열은 식물 세포 게놈의 제3 DNA 서열에 대한 상동성이 90％ 이상이고, 제2 DNA 서열은 식물 세포 게놈의 제4 DNA 서열에 대한 상동성이 90％ 이상이고, 식물 세포 게놈의 제3 및 제4 DNA 서열은 염색체 DNA 서열이고, 제3 DNA 서열과 제4 DNA 서열의 가까운 가장자리들은 1개 이상의 뉴클레오티드 쌍에 의해 분리되어 있는 것인 단계, 및
    (b) 하나 이상의 뉴클레아제를 상기 식물 세포 내에서 발현시키고, 여기서 하나 이상의 뉴클레아제는 각각 한 쌍의 융합 단백질이고, 각각의 융합 단백질은 Fok I 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 조작된 아연 손가락 결합 도메인 간의 융합물이고, 하나 이상의 뉴클레아제가 제3 DNA 서열과 제4 DNA 서열 사이의 하나 이상의 상응하는 표적 서열에서 염색체 DNA를 절단하고, 하나 이상의 뉴클레아제가 식물 세포 게놈의 제3 또는 제4 DNA 서열 중 하나로부터 0.4 내지 3 킬로베이스 쌍 떨어진 위치에서 염색체 DNA를 절단하는 단계를 포함하여,
    단계 (b)에서의 염색체 DNA의 절단이 상동 재조합에 의한 게놈 내로의 제5 DNA 서열의 혼입을 자극하는,
    외인성 서열을 식물 세포의 게놈 내로 도입하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 외인성 서열이 선별성 마커인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 선별성 마커가 녹색 형광 단백질 (GFP), β-글루쿠로니다제 (GUS), 포스피노트리신 N-아세틸 트랜스페라제 (PAT, BAR), 네오마이신 포스포트랜스페라제, β-락타마제, 카테콜 디옥시게나제, α-아밀라제, 티로시나제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 애큐오린, EPSP 신타제, 니트릴라제, 아세토락테이트 신타제 (ALS), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 달라폰 데할로게나제 및 안트라닐레이트 신타제로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제5 DNA 서열이 하나 이상의 전사 조절 서열을 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 제5 DNA 서열이 단백질 또는 단백질의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제5 DNA 서열이 돌연변이체 염색체 서열의 야생형 대응물 또는 야생형 염색체 서열의 돌연변이체 대응물을 포함하는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
KR1020097004953A 2006-08-11 2007-08-09 아연 손가락 뉴클레아제-매개 상동 재조합 KR101439568B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US83714706P 2006-08-11 2006-08-11
US60/837,147 2006-08-11
PCT/US2007/017748 WO2008021207A2 (en) 2006-08-11 2007-08-09 Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090054986A KR20090054986A (ko) 2009-06-01
KR101439568B1 true KR101439568B1 (ko) 2014-09-12

Family

ID=38624400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097004953A KR101439568B1 (ko) 2006-08-11 2007-08-09 아연 손가락 뉴클레아제-매개 상동 재조합

Country Status (19)

Country Link
US (2) US9428756B2 (ko)
EP (2) EP2395081A1 (ko)
JP (4) JP2010500029A (ko)
KR (1) KR101439568B1 (ko)
CN (2) CN105296527B (ko)
AR (3) AR062336A1 (ko)
AU (1) AU2007284748B2 (ko)
BR (1) BRPI0716427A2 (ko)
CA (1) CA2660485C (ko)
DK (1) DK2049663T3 (ko)
ES (1) ES2532002T3 (ko)
HK (2) HK1221251A1 (ko)
IL (1) IL196942A (ko)
PL (1) PL2049663T3 (ko)
SI (1) SI2049663T1 (ko)
TW (1) TWI424061B (ko)
UA (1) UA106193C2 (ko)
WO (1) WO2008021207A2 (ko)
ZA (1) ZA200900787B (ko)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8106255B2 (en) 2002-01-23 2012-01-31 Dana Carroll Targeted chromosomal mutagenasis using zinc finger nucleases
US7528643B2 (en) * 2003-02-12 2009-05-05 Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. Semiconductor device, electronic device having the same, and driving method of the same
WO2008076290A2 (en) * 2006-12-14 2008-06-26 Dow Agrosciences Llc Optimized non-canonical zinc finger proteins
CA2691440A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for altering the genome of a monocot plant cell
CA2700231C (en) * 2007-09-27 2018-09-18 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
EP2247736B1 (en) 2008-02-29 2013-05-15 Monsanto Technology, LLC Corn plant event mon87460 and compositions and methods for detection thereof
WO2009114321A2 (en) 2008-03-11 2009-09-17 Precision Biosciencs, Inc. Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering
AU2009238629C1 (en) * 2008-04-14 2015-04-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Linear donor constructs for targeted integration
US8703489B2 (en) * 2008-08-22 2014-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
AR076225A1 (es) * 2009-04-07 2011-05-26 Dow Agrosciences Llc Administracion de nanoparticulas revestidas de una secuencia de nucleasa especifica
WO2011022469A2 (en) 2009-08-19 2011-02-24 Dow Agrosciences Llc Aad-1 event das-40278-9, related transgenic corn lines, and event-specific identification thereof
US8598413B2 (en) 2009-08-19 2013-12-03 Dow AgroSciecnes, LLC. AAD-1 event DAS-40278-9, related transgenic corn lines, event-specific identification thereof, and methods of weed control involving AAD-1
US20130074220A1 (en) * 2009-10-26 2013-03-21 National Institute Of Agrobiological Sciences Method for producing genetically modified plant cell
EP2319872A1 (en) 2009-11-04 2011-05-11 BASF Plant Science GmbH Amylopectin type starch with enhanced retrogradation stability
UA113610C2 (xx) 2009-11-24 2017-02-27 Рослина трансгенної сої, яка включає подію 416 сої aad-12
GEP20176628B (en) * 2010-01-22 2017-02-27 Sangamo Biosciences Inc Targeted genomic alteration
JP2013526844A (ja) * 2010-03-22 2013-06-27 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 植物の酵素活性の改変
US8771985B2 (en) * 2010-04-26 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a Rosa locus using zinc-finger nucleases
US9175280B2 (en) 2010-10-12 2015-11-03 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating hemophilia B
WO2012074868A2 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Ms Technologies, Llc Optimized expression of glyphosate resistance encoding nucleic acid molecules in plant cells
KR102031625B1 (ko) 2010-12-03 2019-10-21 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 스태킹된 제초제 내성 이벤트 ８２６４.４４.０６.１, 관련된 트랜스제닉 대두 계통, 및 이의 검출
CN102174649B (zh) * 2011-01-18 2013-06-12 陕西师范大学 快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法
SG194089A1 (en) 2011-04-27 2013-11-29 Amyris Inc Methods for genomic modification
AU2012250879B2 (en) 2011-05-02 2017-06-08 Nutech Ventures Plants with useful traits and related methods
US9187567B2 (en) 2011-05-18 2015-11-17 Parkinson's Institute Assay to determine LRRK2 activity in parkinson's disease
EP2535416A1 (en) 2011-05-24 2012-12-19 BASF Plant Science Company GmbH Development of phytophthora resistant potato with increased yield
BR102012019434B1 (pt) 2011-07-26 2021-11-09 Dow Agrosciences Llc Métodos de controle de pestes, de insetos, molécula e sequência de dna diagnóstica para o evento de soja 9582.814.19.1
WO2013044008A2 (en) 2011-09-21 2013-03-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
EP2612918A1 (en) 2012-01-06 2013-07-10 BASF Plant Science Company GmbH In planta recombination
CN104427863B (zh) 2012-01-23 2019-06-28 陶氏益农公司 除草剂耐受性棉花事件pDAB4468.19.10.3
JP6349261B2 (ja) 2012-02-01 2018-06-27 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチド
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
AR092482A1 (es) * 2012-09-07 2015-04-22 Dow Agrosciences Llc Enriquecimiento de la clasificacion de las celulas activadas por fluorescencia (facs) para generar plantas
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
CN105264067B (zh) 2012-09-07 2020-11-10 美国陶氏益农公司 Fad3性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
EP2981166B1 (en) 2013-04-05 2020-09-09 Dow AgroSciences LLC Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
EP3008186B1 (en) 2013-06-14 2018-11-28 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
US10767188B2 (en) 2013-09-25 2020-09-08 Nutech Ventures Methods and compositions for obtaining useful plant traits
US10093940B2 (en) 2013-11-04 2018-10-09 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci
MX358066B (es) 2013-11-04 2018-08-03 Dow Agrosciences Llc Óptimos loci de soya.
CN107223156A (zh) 2013-11-04 2017-09-29 美国陶氏益农公司 最优玉米座位
JP6560203B2 (ja) * 2013-11-04 2019-08-14 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 遺伝子ターゲッティングのためのユニバーサルドナー系
CN106029886B (zh) 2013-12-19 2021-02-05 阿迈瑞斯公司 基因组整合的方法
US10683513B2 (en) 2013-12-31 2020-06-16 Dow Agrosciences Llc Tissue-specific expression and hybrid plant production
CN107072183B (zh) 2014-07-14 2022-01-04 华盛顿州立大学 消除种系细胞的nanos敲除
WO2016098078A2 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novartis Ag Dimerization switches and uses thereof
US20160281055A1 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Dow Agrosciences Llc Incorporation of phosphatidylcholine in a media composition
JP2018525000A (ja) 2015-08-06 2018-09-06 ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリＴｈｅ Ｃｕｒａｔｏｒｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ 改変ｃｄ１６３遺伝子を有する病原体抵抗性動物
AU2017212713B2 (en) 2016-01-27 2023-01-19 Oncorus, Inc. Oncolytic viral vectors and uses thereof
WO2017143071A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
EP3429567B1 (en) 2016-03-16 2024-01-10 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for treating obesity and/or diabetes and for identifying candidate treatment agents
EP4219731A3 (en) 2016-05-18 2023-08-09 Amyris, Inc. Compositions and methods for genomic integration of nucleic acids into exogenous landing pads
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
MX2019002207A (es) 2016-08-24 2019-07-15 Sangamo Therapeutics Inc Regulacion de la expresion genica usando nucleasas modificadas.
SG11201901364VA (en) * 2016-08-24 2019-03-28 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target specific nucleases
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
CN110582302A (zh) 2016-12-14 2019-12-17 利甘达尔股份有限公司 用于核酸和/或蛋白有效负载递送的组合物和方法
CA3067382A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral dna insertions
SG11202000691XA (en) 2017-07-26 2020-02-27 Oncorus Inc Oncolytic viral vectors and uses thereof
BR112020008201A2 (pt) 2017-10-27 2020-10-06 The Regents Of The University Of California substituição-alvo de receptores de células t endógenos
EP3861130A4 (en) * 2018-10-02 2022-08-03 Sangamo Therapeutics, Inc. GENETIC MODULATORS
US20200157531A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Method to enhance screening for homologous recombination in genome edited cells using recombination-activated fluorescent donor delivery vector
WO2020163856A1 (en) 2019-02-10 2020-08-13 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Modified mitochondrion and methods of use thereof
WO2021011936A2 (en) 2019-07-18 2021-01-21 University Of Rochester Cell-type selective immunoprotection of cells
WO2021028359A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Sangamo Therapeutics France Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells
CN111462823B (zh) * 2020-04-08 2022-07-12 西安交通大学 一种基于dna测序数据的同源重组缺陷判定方法
EP4243609A1 (en) 2020-11-16 2023-09-20 Pig Improvement Company UK Limited Influenza a-resistant animals having edited anp32 genes
WO2023081756A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
WO2023105244A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Pig Improvement Company Uk Limited Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024013514A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pig Improvement Company Uk Limited Gene edited livestock animals having coronavirus resistance
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0222493A1 (en) 1985-10-04 1987-05-20 Lubrizol Genetics Inc. TR-based sub-TI plasmids
US5422251A (en) 1986-11-26 1995-06-06 Princeton University Triple-stranded nucleic acids
CA1339684C (en) 1988-05-17 1998-02-24 Peter H. Quail Plant ubquitin promoter system
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5420032A (en) 1991-12-23 1995-05-30 Universitge Laval Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
ATE398679T1 (de) 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
CA2681922C (en) 1994-01-18 2012-05-15 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
EP2022856B1 (en) 1994-08-20 2011-09-14 Gendaq Limited Improvements in or relating to binding proteins for recognition of DNA
US5789538A (en) * 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5773695A (en) 1996-01-26 1998-06-30 North Carolina State University Plant nuclear scaffold attachment region and method for increasing gene expression in transgenic cells
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
JP2002504824A (ja) 1997-06-12 2002-02-12 ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー トランスジェニック植物用の調節配列
DE69831265T2 (de) * 1997-11-18 2006-06-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Zusammensetzungen und verfahren für die genetische modifikation von pflanzen
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AR014491A1 (es) 1998-01-29 2001-02-28 Dow Agrosciences Llc Metodo para obtener plantas transgenicas fertiles de gossypium hirsutum.
US6410248B1 (en) * 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
EP1060261B1 (en) 1998-03-02 2010-05-05 Massachusetts Institute of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
WO2001040798A2 (en) 1999-12-06 2001-06-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
WO2001053480A1 (en) 2000-01-24 2001-07-26 Sangamo Biosciences, Inc. Nucleic acid binding polypeptides characterized by flexible linkers connected nucleic acid binding modules
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
DE60126483T2 (de) 2000-04-28 2007-12-06 Sangamo BioSciences, Inc., Richmond Gezielte Modifikation der Chromatinstruktur
WO2001088197A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
CA2435394C (en) 2001-01-22 2018-01-09 Sangamo Biosciences, Inc. Modified zinc finger binding proteins
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
EP1377248A2 (en) 2001-04-05 2004-01-07 The Regents of the University of California Robotic device for locomotor training
US20040224385A1 (en) 2001-08-20 2004-11-11 Barbas Carlos F Zinc finger binding domains for cnn
AU2002360986A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 Sungene Gmbh And Co. Kgaa Methods for the transformation of vegetal plastids
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
US8106255B2 (en) 2002-01-23 2012-01-31 Dana Carroll Targeted chromosomal mutagenasis using zinc finger nucleases
AU2003218382B2 (en) 2002-03-21 2007-12-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
AU2003298574B2 (en) 2002-09-05 2008-04-24 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
CA2534296C (en) 2003-08-08 2013-03-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US20050102713A1 (en) 2003-11-07 2005-05-12 Merlo Donald J. Use of untranslated region of osmotin gene to enhance transgene expression in plants
CA2558372C (en) 2004-03-17 2017-01-17 Basf Plant Science Gmbh Improved constructs for marker excision based on dual-function selection marker
EP1794305A2 (en) 2004-09-23 2007-06-13 BASF Plant Science GmbH Recombination cassettes and methods for sequence excision in plants
CN101155921B (zh) 2005-04-04 2013-02-06 拜尔作物科学公司 用于去除所选择dna序列的方法和手段
KR101419729B1 (ko) 2005-07-26 2014-07-17 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Porteus 등. Nature Biotechnology. Vol. 23, No. 8, 페이지 967-973 (2005) *
Sundar Durai 등. Nucleic Acids Research. Vol. 33, No. 18, 페이지 5978-5990 (2005) *
Sundar Durai 등. Nucleic Acids Research. Vol. 33, No. 18, 페이지 5978-5990 (2005)*

Also Published As

Publication number Publication date
CA2660485C (en) 2016-04-12
AR105435A2 (es) 2017-10-04
CN105296527B (zh) 2020-11-27
JP6652952B2 (ja) 2020-02-26
JP6442442B2 (ja) 2018-12-19
IL196942A (en) 2014-06-30
AU2007284748A1 (en) 2008-02-21
CN101528924A (zh) 2009-09-09
CN101528924B (zh) 2015-11-25
JP2010500029A (ja) 2010-01-07
DK2049663T3 (en) 2015-06-01
AR108684A2 (es) 2018-09-19
US10669551B2 (en) 2020-06-02
JP2016195606A (ja) 2016-11-24
EP2049663B1 (en) 2015-02-25
BRPI0716427A2 (pt) 2014-03-11
TWI424061B (zh) 2014-01-21
AR062336A1 (es) 2008-10-29
US9428756B2 (en) 2016-08-30
US20100257638A1 (en) 2010-10-07
HK1221251A1 (zh) 2017-05-26
KR20090054986A (ko) 2009-06-01
JP5964884B2 (ja) 2016-08-03
JP2018029603A (ja) 2018-03-01
CN105296527A (zh) 2016-02-03
WO2008021207A2 (en) 2008-02-21
ES2532002T3 (es) 2015-03-23
SI2049663T1 (sl) 2015-12-31
HK1134320A1 (zh) 2010-04-23
ZA200900787B (en) 2010-05-26
UA106193C2 (ru) 2014-08-11
AU2007284748B2 (en) 2013-05-16
US20160326537A1 (en) 2016-11-10
EP2395081A1 (en) 2011-12-14
IL196942A0 (en) 2011-08-01
TW200815593A (en) 2008-04-01
JP2014193179A (ja) 2014-10-09
EP2049663A1 (en) 2009-04-22
PL2049663T3 (pl) 2015-08-31
CA2660485A1 (en) 2008-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101439568B1 (ko) 아연 손가락 뉴클레아제-매개 상동 재조합
JP6127297B2 (ja) Ｚｐ１５遺伝子座内への標的組込み
TWI424062B (zh) 以５－烯醇丙酮基莽草酸－３－磷酸合成酶基因為標的之工程化鋅指蛋白
KR101520507B1 (ko) 최적화된 비-정규 아연 손가락 단백질
AU2017216446B2 (en) Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination
AU2013216688B2 (en) Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170804

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180730

Year of fee payment: 5