JP2013526844A - 植物の酵素活性の改変 - Google Patents
植物の酵素活性の改変 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013526844A JP2013526844A JP2013500472A JP2013500472A JP2013526844A JP 2013526844 A JP2013526844 A JP 2013526844A JP 2013500472 A JP2013500472 A JP 2013500472A JP 2013500472 A JP2013500472 A JP 2013500472A JP 2013526844 A JP2013526844 A JP 2013526844A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- nucleotide sequence
- plant
- modified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
- C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
- C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
Abstract
Description
一般的には、N-グリコシル化は、グリコシル化されるタンパク質中のアスパラギン残基への前駆体Glc3-Man9-GlcNAc2オリゴ糖の付加で始まる。続いて前記グリコシル化タンパク質は、3つのグルコシダーゼ(グルコシダーゼI、グルコシダーゼIIおよびグルコシダーゼIII)で始まる多数の酵素によって小胞体(ER)中で連続的に処理されて、Man9-GlcNAc2-Asn N-グリカンを生じる。その後、マンノシダーゼI酵素は、マンノースに富むMan9-GlcNAc2-Asn N-グリカンをトリミングしてMan5-GlcNAc2-Asn N-グリカンを生成する。続いて、このグリコシル化タンパク質はERからcis-ゴルジネットワークへ輸送される。輸送は小胞および膜融合により媒介される。ER誘導小胞はER膜から出芽して分離し、cis-ゴルジネットワークと融合する。真核細胞のMan5-GlcNAc2-Asn N-グリカンはその後、多数のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの作用によりゴルジ装置内の種々の区画で成熟する。
植物(特にタバコの植物)で組換えタンパク質を製造するという可能性が与えられたとしたら、タンパク質のグリコシル化で活性を有する種々の内因性グリコシルトランスフェラーゼを同定する方法、およびそのようなグリコシルトランスフェラーゼの1つまたは2つ以上の活性を低下、阻害または実質的に阻害する方法が希求される。特に、該当植物のN-グリカンのアルファ-1,3-結合フコース残基、ベータ-1,2-結合キシロース残基を実質的に欠くタンパク質を生産する能力を有する植物および植物細胞を入手することが所望される。したがって、そのような植物によって生産されるタンパク質はヒトでの使用に対して好ましい免疫原性特性を有することができる。本発明の目的はこれらの要求を満たすことである。
本発明で用いられる“植物”という用語は、そのライフサイクルまたは発育の任意の時期における任意の植物およびその子孫を指す。
本発明で用いられる“植物細胞”は植物の構造的および生理学的ユニットを指す。植物細胞は、細胞壁をもたないプロトプラスト、単離された単一細胞もしくは培養された細胞、またはより高度な組織化されたユニット、例えば植物組織、植物器官または全植物(ただしこれらに限定されない)の形態であり得る。
本発明で用いられる“植物細胞培養”は、植物細胞(例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、培養植物組織の細胞、外植片の細胞(ただしこれらに限定されない))の培養および花粉培養を包含する。
本発明で用いられる“植物材料”は、植物から得ることができる任意の固体、液体又は気体組成物または前記の組合せを指し、葉、茎、根、花もしくは花部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿穂、分泌物、抽出物、細胞もしくは組織培養、または植物の任意の他の部分もしくは生成物が含まれる。
本明細書で用いられる“植物組織”は、構造的または機能的ユニットとして組織化された植物細胞群を意味する。植栽または培養植物の任意の組織が含まれる。この用語には全植物、植物器官および種子が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられる“植物器官”は植物の個別のまたは分化した部分、例えば根、茎、葉、花芽または胚に関する。
“ヌクレオチド配列”という用語は、ヌクレオチド(リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドが含まれるが、ただしこれらに限定されない)のポリマーの塩基配列を指す。本明細書で用いられる“遺伝子配列”という用語は、ポリペプチドまたは生物学的に活性なRNAをコードする核酸分子またはポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を指し、タンパク質のフラグメントしかコードしない部分的なコード配列のヌクレオチド配列を包含する。遺伝子配列はまた、遺伝子の発現に関し調節機能を有する、コード配列に対して上流または下流に位置する配列を、遺伝子のイントロン配列と同様に含むことができる。
本明細書で用いられる“異種タンパク質”という用語は、ある細胞によって生産されるが当該細胞に天然には存在しないタンパク質を指す。例えば、植物細胞で生産される異種タンパク質は哺乳動物またはヒトのタンパク質であり得る。異種タンパク質は、翻訳と同時のまたは翻訳後の改変で共有結合によりポリペプチドと結合したオリゴ糖鎖(グリカン)を含むことができる。非限定例として、そのようなタンパク質はタンパク質骨格のアスパラギン(Asn)と共有結合したオリゴ糖を含むことができ、前記オリゴ糖は、タンパク質骨格に結合する非還元末端に2つのN-アセチルグルコサミン(GlcNAc2)を有する少なくとも1つの3マンノシル(Man3)コア構造を含む(Man3-GlcNAc2-Asn)。特に、異種タンパク質は少なくとも1つのN-グリカンを含む。略語“GnT”はN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを指し、“Man”はマンノースを指し、“Glc”はグルコースを指し、“Xyl”はキシロースを指し、“Fuc”はフコースを指し、“GlcNAc”はN-アセチルグルコサミンを指す。
本明細書で用いられる“N-グリカン”という用語は、種々のアスパラギン残基(それぞれタンパク質骨格中のAsn-Xaa-Ybb-Xaa配列モチーフの部分である)と結合する炭水化物を指す。
本明細書で用いられる“N-グリカンの非還元末端”という用語は、タンパク質骨格のアスパラギンと結合するN-グリカンの部分を指す。
本発明で用いられる“アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ”(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)という用語は、フコシルトランスフェラーゼ(EC2.4.1.214と称される)を指し、前記は、N-グリカンの非還元末端の基部N-アセチルグルコサミン残基にフコースをアルファ-1,3-結合で付加する(α(1,3)-フコース)。
本発明で用いられる“N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI”はEC2.4.1.101と称される酵素を指し、前記は、Man5-GlcNAc2-Asnオリゴマンノシル受容体の1-3アームのマンノースにN-アセチルグルコサミンを付加する。
本明細書で用いられる“実質的に阻害する”または“実質的阻害”という用語は、量または活性(例えば酵素活性、転写活性およびタンパク質発現であるがただしこれらに限定されない)の約90%から約100%の低下、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%までの低下を指す。
本明細書で用いられる“阻害する”または“阻害”という用語は、量または活性(例えば酵素活性、転写活性およびタンパク質発現であるがただし前記に限定されない)の約98%から約100%の低下、または少なくとも98%、少なくとも99%、特に100%の低下を指す。
本発明のある目的は、治療薬としての使用に適切な異種タンパク質を植物で生産することであり、そのような異種タンパク質は、それが存在すれば望ましくない免疫原性特性を起こし得る1つまたは2つ以上の炭水化物を欠く。いずれの理論にも拘束されないが、植物または植物細胞で生産される異種タンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-結合フコース、ベータ-1,2-結合キシロースまたはその両方の存在は、(i)植物または植物細胞で1つまたは2つ以上の本発明のグリコシルトランスフェラーゼの酵素活性を低下、阻害または実質的に阻害することによって、または(ii)植物または植物細胞で1つまたは2つ以上の本発明のグリコシルトランスフェラーゼの発現を低下、阻害または実質的に阻害することによって、または(i)および(ii)の両方によって低下または排除することができる。
GlcNAc-Man3-Xyl-GlcNAc2-AsnまたはGlcNAc-Man3-Fuc-Xyl-GlcNAc2-Asn糖タンパク質(ただし前記に限定されない)を生じるキシロシルトランスフェラーゼである。特に、本発明のグリコシルトランスフェラーゼはタバコのグリコシルトランスフェラーゼである。特に、本発明のグリコシルトランスフェラーゼはニコチアナ・タバクムまたはニコチアナ・ベンタミアナ(N. benthamiana)のものである。
別の具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号:259に示される配列である。
さらに別の具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号:262に示される配列である。
具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号:257に示される配列である。
別の具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号:260に示される配列である。
さらに別の具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号:263に示される配列である。
ある実施態様では、改変した(すなわち遺伝的に改変した)ニコチアナ・タバクム植物細胞または本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変した植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物(その子孫を含む)は、異種タンパク質を生産する方法で用いることができる。前記方法は以下の工程を含む:本明細書に規定した改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞または植物に発現構築物(異種タンパク質、特にワクチン抗原、サイトカイン、ホルモン、凝固タンパク質、アポリポタンパク質、ヒトでの置換療法のための酵素、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチドを含む)を導入する工程;および異種タンパク質が生産されるように前記発現構築物を含む改変植物細胞を培養し、さらに場合によって前記植物細胞から植物を再生し、植物およびその子孫を生長させる工程。
(i)タバコの植物細胞のゲノムで
a.N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または
b.(a)の第一の標的ヌクレオチド配列およびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列、または
c.(a)の第一の標的ヌクレオチド配列および(b)の第二の標的ヌクレオチド配列およびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列、および場合によって
d.(a)、(b)もしくは(c)、または前述の標的ヌクレオチド配列の任意の2つ以上の組合せの対立遺伝子変種を含むゲノム領域内の標的ヌクレオチドを改変する工程;
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に改変を含む改変植物または植物細胞を同定する工程および場合によって選別する工程;
ここで、改変植物または植物細胞における(a)、(b)、(c)および(d)に規定したグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現、並びに場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種の活性または発現は、非改変植物細胞に比して低下、阻害または実質的に阻害され、さらに前記改変植物または植物細胞によって生産される糖タンパク質はそれらのN-グリカンでアルファ-1,3-結合フコース残基およびベータ-1,2-結合キシロース残基を欠いている。
(i)タバコの植物細胞のゲノムで
a.N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または
b.(a)の第一の標的ヌクレオチド配列およびN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの配列をコードする第二の標的ヌクレオチド配列、または
c.(a)の第一の標的ヌクレオチド配列および(b)の第二の標的ヌクレオチド配列、およびN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列を改変する工程、
ここで第二または第三の標的ヌクレオチド配列、または第二および第三の標的ヌクレオチド配列は(a)の対立遺伝子変種を含み;
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に改変を含む改変植物または植物細胞を同定する工程および場合によって選別する工程;
ここで、改変植物または植物細胞での(a)、(b)、および(c)に規定したグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現は、非改変植物細胞に比して低下、阻害または実質的に阻害され、さらに前記改変植物または植物細胞によって生産される糖タンパク質はそれらのN-グリカンでアルファ-1,3-結合フコース残基およびベータ-1,2-結合キシロース残基を欠いている。
特に、本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように、ヒト化糖タンパク質を生産できるニコチアナ・タバクム植物または植物細胞を生産する方法では、タバコ植物または植物細胞のゲノムの改変は以下の工程を含む:
a.ニコチアナ・タバクム植物または植物細胞の標的ヌクレオチド配列で、および場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種で標的部位を同定する工程、
b.本発明の標的ヌクレオチド配列を基にして、前記標的部位を認識しこれにまたはその近傍に結合することができる変異導入オリゴヌクレオチドを設計する工程、および
c.タバコ植物または植物細胞のゲノムで前記変異導入オリゴヌクレオチドを標的ヌクレオチド配列とゲノムが改変される条件下で結合させる工程。
ある実施態様では、本発明は、本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように生産した、ニコチアナ・タバクム植物細胞または改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物に関する。
本発明の別の実施態様では、本発明にしたがっておよび本明細書に記載したようにヒト化糖タンパク質を生産できるように改変された植物は、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132(受託番号NCIMB41802で寄託された)である。
本発明のさらに別の実施態様では、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132で同定され、受託番号NCIMB41802で寄託され、前記標的を認識しこれにまたはその近傍に結合できる変異導入オリゴヌクレオチドを設計するために用いられる標的ヌクレオチド配列は、配列番号:256、259、262、265、268、271、274、277および280から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%または100%同一の配列である。
具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号:256に示す配列である。
本発明のさらに別の実施態様では、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132で同定され、受託番号NCIMB41802で寄託され、前記標的を認識しこれにまたはその近傍に結合できる変異導入オリゴヌクレオチドを設計するために用いられる標的ヌクレオチド配列は、配列番号:257、260、263、266、269、272、275、278および281から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%または100%同一の配列である。
具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号:257に示す配列である。
また別には、公知のグリコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含むポリヌクレオチド(例えば第一の植物ですでに同定されたもの)を用いて、第二の植物(例えばタバコの植物)のエクソン配列の収集物をスクリーニングすることができる。公知のグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドと相同性を有するエクソン配列を用いて、第二の植物のゲノムDNAライブラリー(例えばタバコBACライブラリー)をスクリーニングするためのプローブを開発して、BACクローンを同定しさらに第二の植物のグリコシルトランスフェラーゼのゲノム配列を確定することができる。
したがって、非限定的な例として、ニコチアナ・タバクムのベータ-(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードするゲノムDNA配列は、ポリヌクレオチドプローブを用いてニコチアナ・タバクムBACライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。プローブは、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のベータ-(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼと相同性を示すニコチアナの配列を編集することによってアッセンブリングできるタバコのベータ-(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのエクソンのヌクレオチド配列にしたがって設計できる。エクソンの発現は、タバコのエクソンのポリヌクレオチドを含むマイクロアレイを用いてタバコの葉でそのmRNAを検出することによって試験することができる。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードするゲノムDNA配列を植物細胞で同定するまた別の方法を本発明の方法で用いることができる。本発明で開示するグリコシルトランスフェラーゼのポリヌクレオチド配列を用いて、これらのグリコシルトランスフェラーゼおよび関連する他のグリコシルトランスフェラーゼのさらに別の対立遺伝子を上記に開示した方法にしたがって同定することができる。
配列番号:10のフォワードプライマーおよび配列番号:11のリバースプライマー;
配列番号:15のフォワードプライマーおよび配列番号:16のリバースプライマー;
配列番号:23のフォワードプライマーおよび配列番号:24のリバースプライマー;
配列番号:25のフォワードプライマーおよび配列番号:26のリバースプライマー;
配列番号:30のフォワードプライマーおよび配列番号:31のリバースプライマー;
配列番号:35のフォワードプライマーおよび配列番号:36のリバースプライマー;
配列番号:45のフォワードプライマーおよび配列番号:46のリバースプライマー;
配列番号:231のフォワードプライマーおよび配列番号:232のリバースプライマー;
配列番号:236のフォワードプライマーおよび配列番号:237のリバースプライマー;
配列番号:238のフォワードプライマーおよび配列番号:239のリバースプライマー;
配列番号:240のフォワードプライマーおよび配列番号:241のリバースプライマー;
配列番号:242のフォワードプライマーおよび配列番号:243のリバースプライマー;
配列番号:244のフォワードプライマーおよび配列番号:245のリバースプライマー;
配列番号:246のフォワードプライマーおよび配列番号:247のリバースプライマー;
配列番号:248のフォワードプライマーおよび配列番号:249のリバースプライマー;
配列番号:250のフォワードプライマーおよび配列番号:251のリバースプライマー;
配列番号:252のフォワードプライマーおよび配列番号:253のリバースプライマー;
または
配列番号:254のフォワードプライマーおよび配列番号:255のリバースプライマー。
contig gDNA_c1736055のフラグメントの増幅に配列番号:2および3に示す配列を有するプライマー;ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナのGnTI-Bのフラグメントの増幅に配列番号:10および11に示す配列を有するプライマー;contig CHO_OF4335xn13f1のフラグメントの増幅に配列番号:15および16に示す配列を有するプライマー;ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナのGnTI-Aのフラグメントの増幅に配列番号:23および24に示す配列を有するプライマー;contig CHO_OF3295xj17f1のフラグメントの増幅に配列番号:25および26に示す配列を有するプライマー;contig gDNA_c1765694のフラグメントの増幅に配列番号:30および31に示す配列を有するプライマー;contig_CHO_OF4881xd22dr1のフラグメントの増幅に配列番号:35および36に示す配列を有するプライマー;またはcontig CHO_OF4486xe11f1の増幅に配列番号:45および46に示す配列を有するプライマー;ニコチアナ・タバクムのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIのイントロ−エクソン配列を含むcontig gDNA_c1690982のフラグメントの増幅に配列番号:231および232に示す配列を有するプライマー;N.タバクムPM132のFABIJI-ホモローグの増幅に配列番号:236および237に示す配列を有するプライマー;N.タバクムPM132のCPO GnTIゲノム配列の増幅に配列番号:238および239に示す配列を有するプライマー;N.タバクムPM132のCAC80702.1ホモローグの増幅に配列番号:240および242に示す配列を有するプライマー;N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅に配列番号:242および243に示す配列を有するプライマー;N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅に配列番号:244および245に示す配列を有するプライマー;5'UTRおよびエクソン1から7を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅に配列番号:246および247に示す配列を有するプライマー;エクソン4から13を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅に配列番号:248および249に示す配列を有するプライマー;エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅に配列番号:250および251に示す配列を有するプライマー;エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅に配列番号:252および253に示す配列を有するプライマー;エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅に配列番号:254および255に示す配列を有するプライマー。
上記に記載した本発明の方法に基づけば、本発明は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号:1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41および47、233を提供する。別の実施態様では、本発明は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号:256、259、262、265、268、271、274、277および280を提供する。別の実施態様では、本発明は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号:18、20、21、22、28、33、38、48、212、213、219、220、223、225、227、229、234を提供する。別の実施態様では、本発明は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号:257、260、263、266、269、272、275、278、281を提供する。
本発明のポリヌクレオチドのフラグメント(オリゴヌクレオチドまたはプライマーを含むが、ただしこれらに限定されない)は、少なくとも長さが16ヌクレオチドであり得る。種々の実施態様では、フラグメントは、長さが少なくとも約20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000の、またはそれより大きい連続したヌクレオチドであり得る。或いは、フラグメントは、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの約10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000の、またはそれより大きい連続したアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントはまた、機能的ドメイン(例えばシグナル配列および酵素の活性部位)をコードするポリヌクレオチドのコード領域の部分と同様に、発明のグリコシルトランスフェラーゼのイントロンまたはエクソンも指すことができる。多くのそのようなフラグメントを本発明のポリヌクレオチドの同定用核酸プローブとして用いることができる。
a.配列番号:214、215、217、218、221、222、224、228、230、235、258、264、267、270、273、276、279および282に示すアミノ酸配列を提示するN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ;
b.配列番号:9および19に示すアミノ酸配列を提示するβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ;
c.配列番号:29、34、39および49に示すアミノ酸配列を提示するα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ;
d.(i)、(ii)または(iii)のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%同一であるアミノ酸配列。
(a)N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または
(b)(a)の第一の標的ヌクレオチド配列およびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列、または
(c)(a)の第一の標的ヌクレオチド配列およびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列、または
(d)(a)、(b)および(c)の全ての標的ヌクレオチド配列において標的部位が同定される。
(a)N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または
(b)(a)の第一の標的ヌクレオチド配列および第二のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列、または
(c)(a)の第一の標的ヌクレオチド配列および第三のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列、または
(d)(a)、(b)および(c)の全ての標的ヌクレオチド配列において標的部位が同定される。 第二または第三のヌクレオチド配列、または第二および第三のヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列の対立遺伝子変種であり得る。
本発明の具体的な実施態様では、本明細書に規定するゲノムヌクレオチド配列またはコード配列と選択的に結合する非天然のジンクフィンガータンパク質は、標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つで二本鎖の切断を導入するジンクフィンガーヌクレアーゼを作製するために用いられる。
RNAi、shRNA(McIntyre and Fanning (2006), BMC Biotechnology 6:1)、リボザイム、アンチセンスヌクレオチド配列(アンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAの如きもの)、siRNA((Hannon (2003), Rnai: A Guide to Gene Silencing, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA)、および本発明のグリコシルトランスフェラーゼのゲノムDNA配列に対応するPNAもまた意図される。
本明細書で提供されるポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力を有するポリヌクレオチド配列は、例えば植物のゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーから単離できる。特に、そのようなポリヌクレオチドは植物起源であり、特に好ましくはニコチアナ属に属する植物(特にニコチアナ・ベンタミアナまたはニコチアナ・タバクム)に由来する。或いは、そのようなヌクレオチド配列は遺伝的操作または化学的合成によって調製できる。
当分野で公知の多くの方法を用いて、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を変異させることができる。遺伝子配列にランダムに変異を導入する方法は、化学的変異導入(例えばEMS変異導入および放射線照射変異導入であるがただし前記に限定されない)であり得るが、ただし前記に限定されない。細胞に標的設定変異を導入する方法には、ゲノム編集技術、特にジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入、チリング(targeting induced local lesion in genomes, tilling:ゲノム内標的設定局所病巣誘導)、相同組換え、オリゴヌクレオチド特異的変異導入およびメガヌクレアーゼ媒介変異導入が含まれるが、ただしこれらに限定されない(チリングは以下に記載されている:McCallum et al., Plant Physiol, June 2000, Vol. 123, pp. 439-442;およびHenikoff et al., Plant Physiology, 2004, 135:630-636)。変異した遺伝子配列をスクリーニングする当分野で公知の多くの方法を用いて、変異を同定または確認することができる。
多数のグリコシルトランスフェラーゼ、変種および対立遺伝子が植物細胞内で活性を有し得るとしたら、前記酵素活性の低下、実質的阻害または完全な阻害を達成するためには、グリコシルトランスフェラーゼをコードする2つ以上の遺伝子配列を植物細胞内で改変するべきであると考えられる。本発明の好ましい実施態様では、改変は当分野で公知の1つまたは2つ以上のゲノム編集技術を適用することによって実施される。本発明の改変植物細胞は多数の手法によって作製できる。
本発明の改変植物細胞または改変植物は、非改変植物または植物細胞で生成されるグリコシルトランスフェラーゼとは異なる分子量を有する変異グリコシルトランスフェラーゼの生成によって同定できる。変異グリコシルトランスフェラーゼは、非改変植物または植物細胞で生成されるグリコシルトランスフェラーゼの切端型または伸長型であり、改変植物または植物細胞の同定を容易にするマーカーとして用いることができる。前記ポリペプチドの切端または伸長は、典型的にはコード配列における終止配列の導入または、また別の読み枠内の終止コドンの使用を引き起こす読み枠におけるシフトから生じる。
交配または上記に記載したゲノム改変で用いられる改変植物または植物細胞は、改変植物または植物細胞における(i)1つまたは2つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの活性の低下または検出不能;(ii)1つまたは2つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの発現の低下または検出不能;(iii)植物タンパク質または異種タンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-結合フコース、ベータ-1,2-結合キシロースまたはその両方のレベルの低下または検出不能;(iv)高マンノース型N-グリカンの増加または蓄積によって同定または選別することができる。
前記構造のアルファ-ヘリックス(α-ヘリックス)はDNA二重らせんに挿入される。本発明で用いられる“アルファ-ヘリックス”(α-ヘリックス)は、右巻きまたは左巻きらせんのタンパク質二次構造モチーフを指し、前記モチーフではアミノ酸の各N-H基の水素は、第一のアミノ酸に対して-4位のアミノ酸のC=O基と結合する。本明細書で用いられる“ベータ-バレル”(β-バレル)は2つのベータ鎖(β-鎖)を含むタンパク質二次構造モチーフを指し、前記モチーフでは、第一の鎖は第二の鎖と水素結合して閉鎖構造を形成する。本明細書で用いられる“ベータ-ベータ-アルファ(ββα)構造”は、2つのアンチパラレルβ-鎖および1つのα-ヘリックスを含むβ-バレルから成るタンパク質の構造を指す。本発明で用いられる“ジンクフィンガーDNA結合ドメイン”は、亜鉛イオンを含み、特異的な3塩基対のDNA配列と結合することができるタンパク質ドメインを指す。本明細書で用いられる“非天然ジンクフィンガーDNA結合ドメイン”という用語は、改変されるべきDNAを含む細胞または生物では存在しないジンクフィンガーDNA結合ドメインを指す。
本明細書で用いられる二本鎖切断(DSB)は、DNAまたはRNAの両方の鎖の切断を指す。二本鎖切断は、標的部位の1つから5塩基対から1500塩基対未満、特に5塩基対から200塩基対未満、特に5塩基対から20塩基対未満離れた部位のゲノムDNA配列で生じ得る。二本鎖切断は、標的部位でのまたは標的部位近くでのゲノムDNA配列の変異をもたらす非相同性末端結合を促進することができる。本明細書で用いられる“非相同性末端結合”(NHEJ)は、相同性鋳型を必要としない直接連結によって二本鎖切断を修復する修復メカニズムを指し、したがって二本鎖切断が生じる前の配列に比して突然変異誘導性であり得る。
さらに別の実施態様では、本発明はジンクフィンガータンパク質およびエンハンサータンパク質を含む融合タンパク質(前記はジンクフィンガーアクチベーターを生じる)を提供する。ジンクフィンガーアクチベーターを用いて、植物細胞で標的遺伝子(例えば植物細胞でのN-グリコシル化で必要とされる遺伝子であるが、ただし前記に限定されない)の転写をアップレギュレートまたは活性化することができる。前記には以下の工程が含まれる:(i)プロモーターまたは標的遺伝子のコード配列に影響を及ぼすように連結されている配列内の領域と結合するジンクフィンガータンパク質を本発明の方法にしたがって操作する工程;(ii)前記ジンクフィンガータンパク質と転写活性化因子との融合タンパク質を作製する工程;(iii)植物細胞で活性を有するプロモーターの制御下で前記ジンクフィンガーアクチベーターをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物を作製する工程;(iv)前記遺伝子構築物を植物細胞に導入する工程;および(v)植物細胞を培養してジンクフィンガーアクチベーターを発現させる工程;および(vi)標的遺伝子の発現増加を示す植物細胞の性状を決定する工程。本発明で有用な標的遺伝子は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの発現を調節するタンパク質または核酸をコードする遺伝子である。
植物細胞で内因性グリコシルトランスフェラーゼ酵素の活性を低下、阻害または実質的に阻害する本発明の方法は、グリコシルトランスフェラーゼの酵素活性が低下、阻害または実質的に阻害された改変細胞を選別する工程を含む。
異種タンパク質は当分野で公知の技術によって濃縮、単離または精製することができる。したがって、本発明は、異種タンパク質が濃縮された植物組成物、または異種タンパク質が当該植物または植物細胞に出現する濃度に比してより高濃度の異種タンパク質を含む植物組成物を提供する。さらにまた提供されるものは、植物細胞(特にニコチアナ細胞)から得られる異種タンパク質(異種タンパク質と結合したN-グリカンに低レベルまたは検出不能レベルのアルファ-1,3-結合フコースおよび/またはベータ-1,2-結合キシロースを含む)および担体(例えば医薬的に許容できる担体)を含む医薬組成物または化粧組成物である。
“抗体”という用語は以下を指す:モノクローナル抗体、マルチ特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Fvs(scFv)、単鎖抗体、一ドメイン抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメント。特に、抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち抗原結合部位を含む分子が含まれる。免疫グロブリン分子はいずれのタイプ(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスでもよい。
配列番号:1はcontig gDNA_c1736055のヌクレオチド配列である;
配列番号:2は、ニコチアナベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)イントロン‐エクソン配列を含むcontig gDNA_c1736055のフラグメントの増幅に適切なNGSG10043フォワードプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:3は、ニコチアナベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)イントロン‐エクソン配列を含むcontig gDNA_c1736055のフラグメントの増幅に適切なNGSG10043リバースプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:4は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種1を含むNtPMI-BAC-TAKOMI_6のヌクレオチド配列の塩基対1−6,000である;
配列番号:5は、NtPMI-BAC-TAKOMI_6のベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)変種1のコードフラグメントのゲノムヌクレオチド配列である;
配列番号:6は、ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種1の上流NtPMI-BAC-TAKOMI_6のプロモーター領域のヌクレオチド配列である;
配列番号:7は、プライマーセットNGSG10043によって増幅され、NtPMI-BAC-TAKOMI_6を同定するためのプローブとして用いられた、NtPMI-BAC-TAKOMI_6のフラグメントのヌクレオチド配列である;
配列番号:8は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種1のcDNA配列である;
配列番号:9は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)タンパク質変種1のアミノ酸配列である;
配列番号:10は、ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナのフラグメントGnTI-Bの増幅のためのプライマー配列Big3FNである;
配列番号:12は、ニコチアナ・タバクムのフラグメントGnTI-Bの3504 bpゲノムフラグメントのヌクレオチド配列である;
配列番号:13は、ニコチアナ・タバクムのフラグメントGnTI-Bの2283 bpゲノムフラグメントのヌクレオチド配列である;
配列番号:14は、ニコチアナ・タバクムのフラグメントGnTI-Bの3765 bpゲノムフラグメントのヌクレオチド配列である;
配列番号:15は、ニコチアナベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)イントロン‐エクソン配列を含む、contig CHO_OF4335xn13f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10046フォワードプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:16は、ニコチアナベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF4335xn13f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10046リバースプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:17は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-SANIKI_1のヌクレオチド配列の塩基対15,921−23,200である;
配列番号:18は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)変種2のcDNA配列である;
配列番号:19は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)タンパク質変種2のアミノ酸配列である;
配列番号:20は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種1である;
配列番号:22は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種1である;
配列番号:23は、ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナのフラグメントGnTI-Aの増幅のためのプライマー配列Big1FNである;
配列番号:24は、ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナのフラグメントGnTI-Aの増幅のためのプライマー配列Big1RNである;
配列番号:25は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF3295xj17f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10041フォワードプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:26は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF3295xj17f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10041リバースプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:27は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種1を含むNtPMI-BAC-FETILA_9のヌクレオチド配列の塩基対2,961−10,160である;
配列番号:28は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種1のcDNAである;
配列番号:29は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)タンパク質変種1のアミノ酸配列である;
配列番号:30は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)イントロン‐エクソン配列を含むcontig gDNA_c1765694のフラグメントの増幅に適切なNGSG10032フォワードプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:32は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-JUMAKE_4のヌクレオチド配列の塩基対1,041−7,738である;
配列番号:33は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種2の部分的cDNA配列である;
配列番号:34は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)タンパク質変種2の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:35は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF4881xd22r1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10034フォワードプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:36は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF4881xd22r1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10034リバースプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:37は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種3を含むNtPMI-BAC-JEJOLO_22のヌクレオチド配列の塩基対19,001−23,871である;
配列番号:38は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種3の部分的cDNA配列である;
配列番号:39は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)タンパク質変種3の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:40は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Aの3152 bpゲノムフラグメントのヌクレオチド配列である;
配列番号:42は、メガヌクレアーゼ媒介変異導入のための、配列番号:5のエクソン2内の固有の22 bp標的配列である;
配列番号:43は、パリンドローム型の配列番号:42の左半分を表す第一の誘導体標的である;
配列番号:44は、パリンドローム型の配列番号:42の右半分を表す第二の誘導体標的である;
配列番号:45は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF4486xe11f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10035フォワードプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:46は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF4486xe11f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10035リバースプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:47は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種4を含む、NtPMI-BAC-JUDOSU_1のヌクレオチド配列の塩基対1−11,000である;
配列番号:48は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種4の部分的cDNA配列である;
配列番号:49は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)タンパク質変種4の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:50は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで4ヒットを有する15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:52は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:53は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:54は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:55は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:56は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで4ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:57は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで3ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:58は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで4ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:59は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで3ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:60は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで4ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:62は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:63は、実施例1において配列番号:5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である;
配列番号:64は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:65は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:66は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:67は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:68は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:69は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:70は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:72は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:73は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:74は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:75は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:76は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:77は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:78は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:79は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:80は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:82は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:83は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:84は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:85は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:86は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:87は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:88は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:89は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:90は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:92は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:93は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:94は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:95は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:96は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:97は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:98は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:99は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:100は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:102は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:103は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:104は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:105は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:106は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:107は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:108は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:109は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:110は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:112は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:113は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:114は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:115は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:116は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:117は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:118は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:119は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:120は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:121は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:122は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:123は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:124は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:125は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:126は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:127は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:128は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:129は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:130は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:132は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:133は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:134は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:135は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:136は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:137は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:138は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:139は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:140は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:142は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:143は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:144は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:145は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:146は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:147は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:148は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:149は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:150は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:152は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:153は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:154は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:155は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:156は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:157は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:158は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:159は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:160は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:162は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:163は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:164は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:165は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:166は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:167は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:168は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:169は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:170は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:172は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:173は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:174は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:175は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:176は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:177は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:178は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:179は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:180は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:182は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:183は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:184は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:185は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:186は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:187は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:188は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:189は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:190は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:192は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:193は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:194は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:195は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:196は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:197は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:198は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:199は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:200は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:202は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:203は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:204は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:205は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:206は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:207は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:208は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:209は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:210は、実施例1において配列番号:5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である;
配列番号:212は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A変種1の部分的cDNA配列である;
配列番号:213は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A変種1の部分的cDNA配列である;
配列番号:214は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:215は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:216は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-B cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:217は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:218は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:219は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種2である;
配列番号:220は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種3である;
配列番号:222は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:223は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種2である;
配列番号:224は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種2の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:225は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種2である;
配列番号:226は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-B cDNA変種2の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:227は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A変種2の部分的cDNA配列である;
配列番号:228は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種2の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:229は、ニコチアナ・タバクムGnTI-A変種2の部分的 cDNA配列である;
配列番号:230は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種2の部分的アミノ酸配列である;
配列番号:232は、ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIイントロン‐エクソン配列を含むcontig gDNA_c1690982のフラグメントの増幅に適切なNGSG12045リバースプライマーのヌクレオチド配列である;
配列番号:233は、ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-FABIJI_1のヌクレオチド配列の塩基対1−15,000である;
配列番号:234は、ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI遺伝子変種2の予想されるcDNA配列である。
配列番号:235は、ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI遺伝子変種2のアミノ酸配列である。
配列番号:236は、N.タバクムPM132のFABIJI-ホモローグの増幅のためのプライマー配列FABIJI-フォワードである;
配列番号:237は、N.タバクムPM132のFABIJI-ホモローグの増幅のためのプライマー配列FABIJI-リバースである;
配列番号:238は、N.タバクムPM132のCPO GnTIゲノム配列の増幅のためのプライマー配列CPO-フォワードである;
配列番号:239は、N.タバクムPM132のCPO GnTIゲノム配列の増幅のためのプライマー配列CPO-リバースである;
配列番号:240は、N.タバクムPM132のCAC80702.1ホモローグの増幅のためのプライマー配列CAC80702.1-フォワードである;
配列番号:242は、N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅のためのプライマー配列FABIJI-1ホモローグ-フォワードである;
配列番号:243は、N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅のためのプライマー配列FABIJI-1ホモローグ-リバースである;
配列番号:244は、N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅のためのプライマー配列FABIJI-1ホモローグ-フォワードである;
配列番号:245は、N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅のためのプライマー配列FABIJI-1ホモローグ-リバースである;
配列番号:246は、5'UTRおよびエクソン1から7を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC181Fである;
配列番号:247は、5'UTRおよびエクソン1から7を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC190Rである;
配列番号:248は、エクソン4から13を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC191Fである;
配列番号:249は、エクソン4から13を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC192Rである;
配列番号:250は、エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC193Fである;
配列番号:252は、エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC193Fである;
配列番号:253は、エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC188Rである;
配列番号:254は、エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC193Fである;
配列番号:255は、エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC189Rである;
配列番号:256は、N.タバクムPM132のゲノムFABIJI-ホモローグのヌクレオチド配列である;
配列番号:257は、N.タバクムPM132のコード配列のヌクレオチド配列である;
配列番号:258は、N.タバクムPM132のFABIJI-ホモローグのアミノ酸配列である;
配列番号:259は、N.タバクムPM132のゲノムCPO-gDNAのヌクレオチド配列である;
配列番号:260は、N.タバクムPM132 CPO遺伝子の予想されるコード領域のヌクレオチド配列である;
配列番号:262は、N.タバクムPM132 CAC80702.1ホモローグのヌクレオチド配列である;
配列番号:263は、N.タバクムPM132 CAC80702.1ホモローグのヌクレオチド配列である;
配列番号:264は、N.タバクムPM132 CAC80702.1ホモローグの予想されるアミノ酸配列である;
配列番号:265は、N.タバクムPM132の GnTI contig 1#5のヌクレオチド酸配列である;
配列番号:266は、予想されるGnTIコード領域contig 1#5のヌクレオチド酸配列である;
配列番号:267は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#5の予想されるアミノ酸配列である;
配列番号:268は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#8のヌクレオチド酸配列である;
配列番号:269は、予想されるGnTIコード領域contig 1#8のヌクレオチド酸配列である;
配列番号:270は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#8の予想されるアミノ酸配列である;
配列番号:272は、予想されるGnTIコード領域contig 1#9のヌクレオチド酸配列である;
配列番号:273は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#の予想されるアミノ酸配列である;
配列番号:274は、N.タバクムPM132のGnTI T10 702のヌクレオチド酸配列である;
配列番号:275は、予想されるGnTIコード領域T10 702のヌクレオチド酸配列である;
配列番号:276は、N.タバクムPM132のGnTI T10 702の予想されるアミノ酸配列である;
配列番号:277は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#6のヌクレオチド酸配列である;
配列番号:278は、予想されるGnTIコード領域contig 1#6のヌクレオチド酸配列である;
配列番号:279は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#6の予想されるアミノ酸配列である;
配列番号:280は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#2ヌクレオチド酸配列である;
配列番号:281は、予想されるGnTIコード領域contig 1#2のヌクレオチド酸配列である;
配列番号:282は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#2の予想されるアミノ酸配列である。
本実施例は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)のゲノムヌクレオチド配列をどのようにして同定できるかを例証する。
タバコBACライブラリー:細菌人工染色体(BAC)ライブラリーを以下のようにして調製する。温室で生長させたニコチアナ・タバクム植物の品種ヒックスブロードリーフ(Hicks Broad Leaf)の葉から核酸を単離する。標準的方法にしたがって高分子量DNAを核酸から単離し、BamHIおよびHindIIIで部分的に消化し、BACベクターpINDIGO5のBamHIまたはHindIII部位でクローニングする。挿入物の平均の長さが135メガ塩基対である320,000を超えるクローンが得られる(前記クローンの全長はタバコゲノムのほぼ9.7倍をカバーする)。
ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種2は実施例1に記載したように同定されるが、ただしcontig CHO_OF4335xn13f1に基づくプライマー対NGSG10046(配列番号:15および16)がそれぞれ用いられる。配列番号:12は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-GEJUJO_2のヌクレオチド配列の塩基対60,001−65,698を提示する。配列番号:13は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種2のcDNA配列を提示する。配列番号:17は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-SANIKI_1のヌクレオチド配列の塩基対15,921−23,200を提示する。配列番号:18は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種2のcDNA配列を提示し、配列番号:19は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)タンパク質変種2のアミノ酸配列を提示する。
ニコチアナ・タバクムの4つのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種を、プライマー対NGSG10032(配列番号:30および31)、NGSG10034(配列番号:35および36)、NGSG10035(配列番号:56および46)およびNGSG10041(配列番号:25および26)を用いて本質的に実施例1に記載したように同定する。配列番号:27は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種1を含むNtPMI-BAC-FETILA_9のヌクレオチド配列の塩基対2,961−10,160を提示し、配列番号:28は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種1のcDNA配列を提示し、配列番号:29は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)タンパク質変種1のアミノ酸配列を提示する。配列番号:32は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-JUMAKE_4のヌクレオチド配列の塩基対1,041−7,738を提示し、配列番号:33は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種2の部分的cDNA配列を提示し、配列番号:34は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)タンパク質変種2の部分的アミノ酸配列を提示する。配列番号:37は、ニコチアナ・タバクムの部分的なアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種3を含むNtPMI-BAC-JEJOLO_22のヌクレオチド配列の塩基対9,001−23,871を提示し、配列番号:38は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種3の部分的cDNA配列を提示し、配列番号:39は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)タンパク質変種3の部分的アミノ酸配列を提示する。配列番号:47は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種4を含むNtPMI-BAC-JUDOSU_1のヌクレオチド配列の塩基対1−11,000を提示し、配列番号:48は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子変種4の部分的cDNA配列を提示し、配列番号:49は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)タンパク質変種4の部分的アミノ酸配列を提示する。
本実施例は、遺伝子発現の改変ツールを開発するために、与えられた遺伝子のゲノムヌクレオチド配列を検索し、与えられた遺伝子配列内の固有の標的部位の出現について与えられたゲノムデータベースと比較してスクリーニングする態様を例証する。本発明の方法(下記に開示するものを含む)によって同定される標的部位、配列モチーフ、および植物での改変における対応遺伝子配列の前記部位またはモチーフの使用が本発明に包含される。
1.標的クェアリーDNA配列
2.選択されるべきDNAデータベース
3.第一のサブストリングDNAモチーフの固定サイズ
4.スペーサーの固定サイズ
5.第二のサブストリングDNAモチーフの固定サイズ
6.プログラム入力4だけ分離された、プログラム入力3および5の組合せがプログラム入力2の選択DNAデータベースで出現する閾値回数
1.プログラム入力6の閾値を最大として各配列についてデータベース内で前記配列が生じる回数を含むヌクレオチド配列リスト
1.標的クェアリーDNA配列としてニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)配列番号:5
2.検索されるべきDNAデータベースとして実施例1のタバコゲノム配列アッセンブリー
3.固定6塩基対の第一のサブストリングDNAモチーフ
4.固定3塩基対のスペーサー
5.固定6塩基対の第二のサブストリングDNAモチーフ
6.プログラム入力4だけ分離された、プログラム入力3および5の組合せがプログラム入力2の選択DNAデータベースにおいて出現する5ヒットを最大とする閾値回数
ACCGTA NNN GGCGAC (配列番号:50): 4ヒット
CCGTAT NNN GCGACG (配列番号:51): 5ヒット
TATCCG NNN ACGGCG (配列番号:52): 5ヒット
GCGAGG NNN GTGCTA (配列番号:53): 5ヒット
TCTCGT NNN GGCGAG (配列番号:54): 5ヒット
CGGTTA NNN GTAGGA (配列番号:55): 5ヒット
AGTTAG NNN GCGCCG (配列番号:56): 4ヒット
CGTGGC NNN CAGGGT (配列番号:57): 3ヒット
CCTTAC NNN ACGTCT (配列番号:58): 4ヒット
GGCCAT NNN GGGGGC (配列番号:59): 3ヒット
GCCATA NNN GGGGCG (配列番号:60): 4ヒット
GCACGG NNN TCCGAG (配列番号:61): 4ヒット
GCGAAT NNN GGCGCC (配列番号:62): 5ヒット
本実施例は、その各々のジンクフィンガータンパク質が、与えられた標的配列(配列番号:5、ATG-開始コドンからTAA-終止コドンまでの完全なβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのゲノム配列を含み、3つのエクソンおよび2つのイントロンを収納する)に対して、2つの固定された6塩基対の長いDNA結合ドメインを固定された3塩基対の介在スペーサー配列と一緒に含むいずれのジンクフィンガーヌクレアーゼ対も、タバコゲノム配列内で少なくとも3つの別の部位を標的とするであろうということを立証する。本実施例はまた、13対のみがタバコゲノム内で5回以下の回数で生じ、他の全ての対は6回以上生じることを立証する。
本実施例は以下を例証する:
1.配列番号:5のニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)変種1のエクソン2におけるジンクフィンガー媒介変異導入のための標的部位リストがどのように編纂されたか、
2.コード配列に変異を導入する、対を構成する2つのジンクフィンガーヌクレアーゼの設計のために1対の標的部位がどのように選択された、
3.プログラムの出力をどのように用いて1対のジンクフィンガーヌクレアーゼを開発したか。
1.標的クェアリー配列として塩基対2,750から2,899(マイナス鎖がコード配列)の配列番号:5のエクソン2フラグメント
2.検索されるべきDNAデータベースとして実施例1のタバコゲノム配列アッセンブリー
3.固定12塩基対サイズの第一のサブストリングDNAモチーフ
4.固定0塩基対サイズのスペーサー
5.固定12塩基対サイズの第二のサブストリングDNAモチーフ
6.最大閾値回数が1回である選択DNAデータベースにおける出現
タバコゲノムデータベース内で最大1回の出現を閾値とするプログラムによって作製された、エクソン2について12-0-12の設計による24全ての塩基対配列(上記の入力設定に関して最初の数は第一のサブストリングの固定長を、第二の数はスペーサーの固定長を、第三の数は第二のサブストリングの固定長を表す)は以下のとおりである:
TTTTCATTTCAG TGGATTGAGGAG (配列番号:63): 0ヒット
TTTCATTTCAGT GGATTGAGGAGC (配列番号:64): 0 ヒット
TTCATTTCAGTG GATTGAGGAGCC (配列番号:65): 0 ヒット
TCATTTCAGTGG ATTGAGGAGCCG (配列番号:66): 0 ヒット
CATTTCAGTGGA TTGAGGAGCCGT (配列番号:67): 0 ヒット
ATTTCAGTGGAT TGAGGAGCCGTC (配列番号:68): 0 ヒット
TTTCAGTGGATT GAGGAGCCGTCA (配列番号:69): 0 ヒット
TTCAGTGGATTG AGGAGCCGTCAC (配列番号:70): 0 ヒット
TCAGTGGATTGA GGAGCCGTCACT (配列番号:71): 0 ヒット
CAGTGGATTGAG GAGCCGTCACTT (配列番号:72): 0 ヒット
AGTGGATTGAGG AGCCGTCACTTT (配列番号:73): 0 ヒット
GTGGATTGAGGA GCCGTCACTTTT (配列番号:74): 0 ヒット
TGGATTGAGGAG CCGTCACTTTTG (配列番号:75): 0 ヒット
GGATTGAGGAGC CGTCACTTTTGA (配列番号:76): 0 ヒット
GATTGAGGAGCC GTCACTTTTGAT (配列番号:77): 0 ヒット
ATTGAGGAGCCG TCACTTTTGATT (配列番号:78): 0 ヒット
TTGAGGAGCCGT CACTTTTGATTA (配列番号:79): 0 ヒット
TGAGGAGCCGTC ACTTTTGATTAC (配列番号:80): 0 ヒット
GAGGAGCCGTCA CTTTTGATTACA (配列番号:81): 0 ヒット
AGGAGCCGTCAC TTTTGATTACAC (配列番号:82): 0 ヒット
GGAGCCGTCACT TTTGATTACACG (配列番号:83): 0 ヒット
GAGCCGTCACTT TTGATTACACGA (配列番号:84): 0 ヒット
AGCCGTCACTTT TGATTACACGAT (配列番号:85): 0 ヒット
GCCGTCACTTTT GATTACACGATT (配列番号:86): 0 ヒット
CCGTCACTTTTG ATTACACGATTT (配列番号:87): 0 ヒット
CGTCACTTTTGA TTACACGATTTG (配列番号:88): 0 ヒット
GTCACTTTTGAT TACACGATTTGA (配列番号:89): 0 ヒット
TCACTTTTGATT ACACGATTTGAG (配列番号:90): 0 ヒット
CACTTTTGATTA CACGATTTGAGT (配列番号:91): 0 ヒット
ACTTTTGATTAC ACGATTTGAGTA (配列番号:92): 0 ヒット
CTTTTGATTACA CGATTTGAGTAT (配列番号:93): 0 ヒット
TTTTGATTACAC GATTTGAGTATG (配列番号:94): 0 ヒット
TTTGATTACACG ATTTGAGTATGC (配列番号:95): 0 ヒット
TTGATTACACGA TTTGAGTATGCA (配列番号:96): 0 ヒット
TGATTACACGAT TTGAGTATGCAA (配列番号:97): 0 ヒット
GATTACACGATT TGAGTATGCAAA (配列番号:98): 0 ヒット
ATTACACGATTT GAGTATGCAAAC (配列番号:99): 0 ヒット
TTACACGATTTG AGTATGCAAACC (配列番号:100): 0 ヒット
ACACGATTTGAG TATGCAAACCTT (配列番号:102): 0 ヒット
CACGATTTGAGT ATGCAAACCTTT (配列番号:103): 0 ヒット
ACGATTTGAGTA TGCAAACCTTTT (配列番号:104): 0 ヒット
CGATTTGAGTAT GCAAACCTTTTC (配列番号:105): 0 ヒット
GATTTGAGTATG CAAACCTTTTCC (配列番号:106): 0 ヒット
ATTTGAGTATGC AAACCTTTTCCA (配列番号:107): 0 ヒット
TTTGAGTATGCA AACCTTTTCCAC (配列番号:108): 0 ヒット
TTGAGTATGCAA ACCTTTTCCACA (配列番号:109): 0 ヒット
TGAGTATGCAAA CCTTTTCCACAC (配列番号:110): 0 ヒット
GAGTATGCAAAC CTTTTCCACACA (配列番号:111): 0 ヒット
AGTATGCAAACC TTTTCCACACAG (配列番号:112): 0 ヒット
GTATGCAAACCT TTTCCACACAGT (配列番号:113): 0 ヒット
TATGCAAACCTT TTCCACACAGTT (配列番号:114): 0 ヒット
ATGCAAACCTTT TCCACACAGTTA (配列番号:115): 0 ヒット
TGCAAACCTTTT CCACACAGTTAC (配列番号:116): 0 ヒット
GCAAACCTTTTC CACACAGTTACC (配列番号:117): 0 ヒット
CAAACCTTTTCC ACACAGTTACCG (配列番号:118): 0 ヒット
AAACCTTTTCCA CACAGTTACCGA (配列番号:119): 0 ヒット
AACCTTTTCCAC ACAGTTACCGAT (配列番号:120): 0 ヒット
ACCTTTTCCACA CAGTTACCGATT (配列番号:121): 0 ヒット
CCTTTTCCACAC AGTTACCGATTG (配列番号:122): 0 ヒット
CTTTTCCACACA GTTACCGATTGG (配列番号:123): 0 ヒット
TTTTCCACACAG TTACCGATTGGT (配列番号:124): 0 ヒット
TTTCCACACAGT TACCGATTGGTA (配列番号:125): 0 ヒット
TTCCACACAGTT ACCGATTGGTAT (配列番号:126): 0 ヒット
TCCACACAGTTA CCGATTGGTATA (配列番号:127): 0 ヒット
CCACACAGTTAC CGATTGGTATAG (配列番号:128): 0 ヒット
CACACAGTTACC GATTGGTATAGT (配列番号:129): 0 ヒット
ACACAGTTACCG ATTGGTATAGTG (配列番号:130): 0 ヒット
CACAGTTACCGA TTGGTATAGTGC (配列番号:131): 0 ヒット
ACAGTTACCGAT TGGTATAGTGCA (配列番号:132): 0 ヒット
CAGTTACCGATT GGTATAGTGCAT (配列番号:133): 0 ヒット
AGTTACCGATTG GTATAGTGCATA (配列番号:134): 0 ヒット
GTTACCGATTGG TATAGTGCATAC (配列番号:135): 0 ヒット
TTACCGATTGGT ATAGTGCATACG (配列番号:136): 0 ヒット
TACCGATTGGTA TAGTGCATACGT (配列番号:137): 0 ヒット
ACCGATTGGTAT AGTGCATACGTG (配列番号:138): 0 ヒット
CCGATTGGTATA GTGCATACGTGG (配列番号:139): 0 ヒット
CGATTGGTATAG TGCATACGTGGC (配列番号:140): 0 ヒット
GATTGGTATAGT GCATACGTGGCA (配列番号:141): 0 ヒット
ATTGGTATAGTG CATACGTGGCAT (配列番号:142): 0 ヒット
TTGGTATAGTGC ATACGTGGCATC (配列番号:143): 0 ヒット
TGGTATAGTGCA TACGTGGCATCC (配列番号:144): 0 ヒット
GGTATAGTGCAT ACGTGGCATCCA (配列番号:145): 0 ヒット
GTATAGTGCATA CGTGGCATCCAG (配列番号:146): 0 ヒット
TATAGTGCATAC GTGGCATCCAGG (配列番号:147): 0 ヒット
ATAGTGCATACG TGGCATCCAGGG (配列番号:148): 0 ヒット
TAGTGCATACGT GGCATCCAGGGT (配列番号:149): 0 ヒット
AGTGCATACGTG GCATCCAGGGTT (配列番号:150): 0 ヒット
TGCATACGTGGC ATCCAGGGTTAC (配列番号:152): 0 ヒット
GCATACGTGGCA TCCAGGGTTACT (配列番号:153): 0 ヒット
CATACGTGGCAT CCAGGGTTACTG (配列番号:154): 0 ヒット
ATACGTGGCATC CAGGGTTACTGG (配列番号:155): 0 ヒット
TACGTGGCATCC AGGGTTACTGGC (配列番号:156): 0 ヒット
ACGTGGCATCCA GGGTTACTGGCT (配列番号:157): 0 ヒット
CGTGGCATCCAG GGTTACTGGCTT (配列番号:158): 0 ヒット
GTGGCATCCAGG GTTACTGGCTTG (配列番号:159): 0 ヒット
TGGCATCCAGGG TTACTGGCTTGC (配列番号:160): 0 ヒット
GGCATCCAGGGT TACTGGCTTGCC (配列番号:161): 0 ヒット
GCATCCAGGGTT ACTGGCTTGCCC (配列番号:162): 0 ヒット
CATCCAGGGTTA CTGGCTTGCCCA (配列番号:163): 0 ヒット
ATCCAGGGTTAC TGGCTTGCCCAG (配列番号:164): 0 ヒット
TCCAGGGTTACT GGCTTGCCCAGT (配列番号:165): 0 ヒット
CCAGGGTTACTG GCTTGCCCAGTC (配列番号:166): 0 ヒット
CAGGGTTACTGG CTTGCCCAGTCG (配列番号:167): 0 ヒット
AGGGTTACTGGC TTGCCCAGTCGG (配列番号:168): 0 ヒット
GGGTTACTGGCT TGCCCAGTCGGC (配列番号:169): 0 ヒット
GGTTACTGGCTT GCCCAGTCGGCC (配列番号:170): 0 ヒット
GTTACTGGCTTG CCCAGTCGGCCA (配列番号:171): 0 ヒット
TTACTGGCTTGC CCAGTCGGCCAC (配列番号:172): 0 ヒット
TACTGGCTTGCC CAGTCGGCCACA (配列番号:173): 0 ヒット
ACTGGCTTGCCC AGTCGGCCACAT (配列番号:174): 0 ヒット
CTGGCTTGCCCA GTCGGCCACATT (配列番号:175): 0 ヒット
TGGCTTGCCCAG TCGGCCACATTT (配列番号:176): 0 ヒット
GGCTTGCCCAGT CGGCCACATTTG (配列番号:177): 0 ヒット
GCTTGCCCAGTC GGCCACATTTGG (配列番号:178): 0 ヒット
CTTGCCCAGTCG GCCACATTTGGT (配列番号:179): 0 ヒット
TTGCCCAGTCGG CCACATTTGGTT (配列番号:180): 0 ヒット
TGCCCAGTCGGC CACATTTGGTTT (配列番号:181): 0 ヒット
GCCCAGTCGGCC ACATTTGGTTTT (配列番号:182): 0 ヒット
CCCAGTCGGCCA CATTTGGTTTTT (配列番号:183): 0 ヒット
CCAGTCGGCCAC ATTTGGTTTTTG (配列番号:184): 0 ヒット
CAGTCGGCCACA TTTGGTTTTTGT (配列番号:185): 0 ヒット
AGTCGGCCACAT TTGGTTTTTGTA (配列番号:186): 0 ヒット
GTCGGCCACATT TGGTTTTTGTAG (配列番号:187): 0 ヒット
TCGGCCACATTT GGTTTTTGTAGA (配列番号:188): 0 ヒット
CGGCCACATTTG GTTTTTGTAGAT (配列番号:189): 0 ヒット
GGCCACATTTGG TTTTTGTAGATG (配列番号:190): 0 ヒット
GCCACATTTGGT TTTTGTAGATGG (配列番号:191): 0 ヒット
CCACATTTGGTT TTTGTAGATGGC (配列番号:192): 0 ヒット
CACATTTGGTTT TTGTAGATGGCC (配列番号:193): 0 ヒット
ACATTTGGTTTT TGTAGATGGCCA (配列番号:194): 0 ヒット
CATTTGGTTTTT GTAGATGGCCAT (配列番号:195): 0 ヒット
ATTTGGTTTTTG TAGATGGCCATT (配列番号:196): 0 ヒット
TTTGGTTTTTGT AGATGGCCATTG (配列番号:197): 0 ヒット
TTGGTTTTTGTA GATGGCCATTGT (配列番号:198): 0 ヒット
TGGTTTTTGTAG ATGGCCATTGTG (配列番号:199): 0 ヒット
GGTTTTTGTAGA TGGCCATTGTGA (配列番号:200): 0 ヒット
TTTTTGTAGATG GCCATTGTGAGG (配列番号:202): 0 ヒット
TTTTGTAGATGG CCATTGTGAGGT (配列番号:203): 0 ヒット
TTTGTAGATGGC CATTGTGAGGTA (配列番号:204): 0 ヒット
TTGTAGATGGCC ATTGTGAGGTAT (配列番号:205): 0 ヒット
TGTAGATGGCCA TTGTGAGGTATG (配列番号:206): 0 ヒット
GTAGATGGCCAT TGTGAGGTATGT (配列番号:207): 0 ヒット
TAGATGGCCATT GTGAGGTATGTT (配列番号:208): 0 ヒット
AGATGGCCATTG TGAGGTATGTTT (配列番号:209): 0 ヒット
GATGGCCATTGT GAGGTATGTTTG (配列番号:210): 0 ヒット
ATGGCCATTGTG AGGTATGTTTGA (配列番号:211): 0 ヒット
最小数のヒット=0は、実施例1のタバコゲノムデータベースで当該配列が存在しないことを意味する。固有のDNA結合ドメインの設計のために、検索配列がDNAデータベースに存在することを条件にして閾値を1に設定する。検索配列がデータベースに存在しない場合は、閾値を0に設定する。高い配列同一性を有する多数の遺伝子座が存在する場合、2、3または4以上の閾値の設定は、標的グリコシルトランスフェラーゼのためのジンクフィンガーヌクレアーゼの作製に適した出力が得られることは当業者には明白であろう。同様なスコア表を、固定長サブストリングDNAモチーフ、閾値設定および固定長スペーサーの任意の組合せについて構築することができる。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ発現カセットの開発:タバコのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)変種1(配列番号:5)の変異導入のために、エクソン2に特異的でかつ各々が配列番号:5の12bp配列と結合する、1対のジンクフィンガーDNA結合ドメインを実施例6に記載したように選択する。FokI制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合させた前記1対のジンクフィンガーDNA結合ドメインをコードする合成遺伝子配列を、コドン偏向に適合させることによってタバコ細胞での最適発現を得ることができるように構築する。最初に、ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)変種1遺伝子の第一の標的配列のジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)変種1遺伝子の第二の標的配列のジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼを、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターの下流およびCaMV35Sターミネーターの上流で標準的クローニング方法にしたがってクローニングする。続いて、この遺伝子発現カセットをpBINPLUS-誘導二元性ベクターでクローニングして植物発現カセットを作製する。合成遺伝子配列は、3'-オーバーラップ合成オリゴヌクレオチドを用いるPCRによって、またはリン酸化した相補性オリゴヌクレオチドを含むフラグメントの結合によって、当分野で報告されている標準的な方法にしたがって作製できる。本構成では、コドン偏向はタバコ細胞での発現のために最適化される。他の構成では、コドン偏向は最適化できない。本構成では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子は、カリフラワー35Sプロモーターおよびターミネーター配列の制御下でクローニングされる。他の構成では、遺伝子は、ササゲモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、アルファルファのプラストシアニンプロモーター、またはタバコ植物細胞で活性な任意の他のプロモーター、およびノパリンシンターゼターミネーター配列、プラストシアニンターミネーター配列、またはタバコ植物細胞で転写ターミネーターとして機能する任意の他の配列の制御下でクローニングできる。両方の遺伝子を1つの二元性ベクターでクローニングしても別々にクローニングしてもよい。本構成では、発現カセットはpBINPLUS二元性ベクターでクローニングされる。他の構成では、カセットはpBIN19ベクターまたは任意の他の二元性ベクターでクローニングされる。さらに別の構成では、発現カセットは、粒子ボンバードメントによりタバコ細胞に導入されるベクターまたは植物ウイルス発現ベクターでクローニングすることができる。
タバコのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)変種1のエクソン2を切断するI-Crel誘導体の操作:タバコのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)変種1遺伝子(配列番号:5)のエクソン2の変異導入のために、エクソン2内の第一の固有22bp標的配列を選択する。これは、スペーサーのために0塩基対固定サイズ並びに第一および第二のサブストリングDNAモチーフのために合計22bpを用い、実施例4の検索プロトコルにしたがって実施できる。しかしながら本例では、固有の22bp配列は、実施例6の出力を用いて選択され、さらに出力配列の配列番号:64の最後の2bpを廃棄しその結果以下の配列が得られる:TTTTCATTTCAGTGGATTGAGG。パリンドローム形の配列番号:42の左右の半分を表す2つの誘導標的が設計される。配列番号:43(TTTTCATTTCATGAAATGAAAA)は左半分を表し、配列番号:44(CCTCAATCCTCGTGGATTGAGG)は右半分を表す。文献(Smith et al. (2006), Nucleic Acid Res. 34:e149)に記載されたように、これら2つのパリンドローム標的配列誘導体(配列番号:43、配列番号:44)に対して新規な特異性を有する変異エンドヌクレアーゼについて、コンビナトリアルI-Crel変異体ライブラリーをスクリーニングする。本例では、一本鎖ヌクレアーゼは標的配列、配列番号:42のために開発される。他の例では、当業者は強制的ヘテロダイマーメガヌクレアーゼを開発できる。本例では、I-Crel第まーメガヌクレアーゼは、配列番号:42を標的とする22bpの特異的変異エンドヌクレアーゼの開発のための足場として用いられる。他の例では、他の足場を用いて、エクソン2の部分配列を標的とする変異エンドヌクレアーゼが開発できる。例えばI-HmuI、I-HmuII、I-BasI、I-TevIII、I-CmoeI、I-PpoI、I-SspI、I-SceI、I-CeuI、I-MsoI、I-DmoI、H-DreI、PI-SceIまたはPI-PfuIであるが、ただしこれらに限定されない。
タバコ植物を温室条件下で生長させる。種々の改変タバコ植物に存在する変異遺伝子座は交配によって一体化される。交配のために、花粉が飛散する前に花の発達の6−10ステージでタバコの花を除雄する(Koltunow et al., 1990, The Plant Cell 2: 1201-1224)。受容植物の除雄した雌ずいを開花期に類似する発達段階で供与植物の花粉で受粉させ、受粉花に個々に袋をかけて交差受粉を予防する。交配は、供与体および受容体として親1を、さらに受容体および供与体として親2をそれぞれ用いて両方向で実施し、潜在的な受精に関する問題を回避する。種子を採集し、実施例7に記載したように子孫植物をシークェンシングおよび酵素活性によって変異について解析する。一体化された変異を有する植物を成熟するまで生長させ、自家受粉させ子孫植物を以前のようにシークェンシングおよび酵素活性によって変異について解析する。変異が一体化した植物を選別し、自家受粉させ、それらの子孫をホモ接合性について解析する。ホモ接合植物を選別する。交配によって種々の改変タバコ植物に存在するベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子配列の変異遺伝子座を一体化するか、または種々の植物に存在するアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子配列の変異遺伝子座を一体化するか、またはベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)遺伝子配列およびアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)遺伝子配列の変異遺伝子座を一体化して、ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)酵素活性の無い、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)酵素活性の無い、またはベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ)酵素活性も無くアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ)酵素活性も無いタバコ植物を作製できることは当業者には明白であろう。
本実施例は、PCRを用いてN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIのゲノムヌクレオチド配列を同定する態様を例証する。
高分子量DNAをニコチアナ・ベンタミアナおよびニコチアナ・タバクムの核から標準的プロトコルにしたがって単離する。プライマーセットを開発し、公知のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの配列を基にして、約3100bp(GnTI-A)および3500bp(GnTI-B)フラグメントを増幅する。用いられるプライマーセットは、フラグメントGnTI-Aの増幅にはプライマー配列、配列番号:23(Big1FN)およびプライマー配列、配列番号:24(Big1RN)であり、フラグメントGnTI-Bの増幅にはプライマーセット、配列番号:10プライマー配列Big3FNおよび配列番号:11プライマー配列Big3RNである。PCRは、標準的プロトコルを用い高分子量ゲノムDNAで実施する。ニコチアナ・タバクムのフラグメントGnTI-A並びにニコチアナ・ベンタミアナおよびニコチアナ・ベンタミアナのフラグメントGnTI-Bを標準的プロトコルにしたがって配列を決定する。ニコチアナ・ベンタミアナの高分子量DNAを用いてフラグメントGnTI-Aに一致するヌクレオチドフラグメントは増幅されない。
配列番号:41は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Aのゲノムフラグメントに対応する3140bpヌクレオチド配列を開示する。
配列番号:212は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A(配列番号:40)の部分的cDNA配列変種1を開示し、配列番号:227はFgeneSHによって予想される部分的cDNA配列変種2を開示する。
配列番号:213および229は、FgeneSHによって予想されるニコチアナ・タバクムGnTI-A(配列番号:41)の部分的cDNA配列変種1および2を開示する。
配列番号:217および配列番号:228は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種1(配列番号:213)および変種2(配列番号:229)の予想される部分的アミノ酸配列を開示する。
配列番号:218および配列番号:230は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種1(配列番号:213)および変種2(配列番号:229)の予想される部分的アミノ酸配列を開示する。
配列番号:12は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bのゲノムフラグメントに対応する3504bpのヌクレオチド配列を開示する。
配列番号:13は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bのゲノムフラグメントに対応する2283bpのヌクレオチド配列を開示する。
配列番号:14は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-Bのゲノムフラグメントに対応する3765bpのヌクレオチド配列を開示する。
配列番号:20は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B(配列番号:12)の部分的cDNA配列変種1を開示し、配列番号:219は部分的cDNA配列変種2を、配列番号:220はニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B(配列番号:12)の部分的cDNA配列変種3をFgeneSHによって予測されるように開示する。
配列番号:214および配列番号:221および配列番号:222は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種1(配列番号:20)、変種2(配列番号:219)および変種3(配列番号:220)の予想される部分的アミノ酸配列をそれぞれ開示する。
配列番号:21は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B(配列番号:13)の部分的cDNA配列変種を開示し、配列番号:223はFgeneSHによって予想される部分的cDNA配列変種を開示する。
配列番号:215および配列番号:224は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種1(配列番号:21)および変種2(配列番号:223)の予想される部分的アミノ酸配列をそれぞれ開示する。
配列番号:22は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-B(配列番号:14)の部分的cDNA配列変種1を開示し、配列番号:225はFgeneSHによって予想される部分的cDNA配列変種2を開示する。
配列番号:216および配列番号:226は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-B cDNA変種1(配列番号:22)および変種2(配列番号:225)の予想されるアミノ酸配列をそれぞれ開示する。
contig gDNA_c1690982を基にしたプライマー対NGSG12045(配列番号:231および232)を用いて、ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの遺伝子変種2のゲノムヌクレオチド配列を、実施例1に記載した方法によって同定する。配列番号:233は、ニコチアナ・タバクムのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの遺伝子変種2を含む、BACクローン、BAC-FABIJI_1のゲノムヌクレオチド配列の15,000塩基対を表す。配列番号:233内のイントロンおよびエクソンの位置はFgeneSHおよびAugustusを用いて予想され、さらに配列番号:234はN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの遺伝子変種2の予想されるcDNA配列を提供する。配列番号:235は、配列番号:234に示されるcDNA配列のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの遺伝子変種2の一文字アミノ酸配列を表す。
実施例10および11では、N.タバクムのいくつかのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI遺伝子配列が同定されている。配列番号:12は、N.タバクムPM132のGnTI遺伝子の一部分を含む3504bpゲノム領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号:40は、N.タバクムPM132のGnTI遺伝子の一部分を含む3152bpゲノム領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号:13は、N.タバクムPO2のGnTI遺伝子の一部分を含む2283bpゲノム領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号:41は、N.タバクムPO2のGnTI遺伝子の一部分を含む3140bpゲノム領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号:233は、N.タバクムHicks BroadleafのGnTIの全コード領域(“FABIJI”)を5’および3’UTRとともに含む15,000bpゲノムヌクレオチド配列を開示する。
上述のように、完全なGnTIをコードする唯一のGnTI遺伝子配列はN.タバクムHicks Broadleafから得られたものである(配列番号:233)。PM132は、本発明の方法で使用されるニコチアナ・タバクムの好ましい品種の1つである。PM132の種子は、受託番号NCIMB41802によりNCIMB Ltd.(ブダペスト条約による国際寄託機関、所在地:Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, United Kingdom)に2011年1月6日に寄託された。
配列番号:262は、CAC80702.1のホモローグをコードするN.タバクムPM132のゲノム領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号:263は、N.タバクムPM132のホモローグのコード領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号:264は、N.タバクムPM132のCAC80702.1ホモローグの予想されるアミノ酸配列を開示する。
12.1.1 GnTIのゲノム配列およびcDNA配列のFABIJIホモローグを得る方法
ゲノムDNAは、CTAB系抽出方法を用いてN.タバクムPM132の葉の組織から抽出される。N.タバクムPM132の葉を液体窒素中ですり潰して粉末にする。RNA抽出キット(Qiagen)を用い、供給業者の指示にしたがいながらRNAを200mgの粉末から抽出する。続いて1μgの抽出RNAをDNaseI(NEB)で処理する。500ngのDNase処理RNAから出発して、AMV-逆転写酵素(Invitrogen)を用いてcDNAを合成する。続いて第一鎖のcDNAサンプル10倍希釈して、PCR鋳型として供する。植物cDNAまたはgDNAは、マスターサイクラー(Mastercycler)グラジエントマシーン(Ependorf)によって増幅する。反応は50μL(25 μl の2x フション(Phusion)マスターミックス(Finnzyme)、20 μlの水、1μLの稀釈cDNAおよび表に列挙したプライマー(10μM)の各々2μLを含む)で実施する。サーモサイクラーの条件は、供給業者の指示にしたがい設定し、アニーリング温度として58℃を用いる。PCRの後、生成物の3’末端をアデニル化する。50μLの2X Taqマスターミックス(NEB)を前記PCR反応に添加し、これらを72℃で10分間インキュベートする。続いてPCR精製キット(Qiagen)を用いてPCR生成物を精製する。精製した前記生成物をTOPO-TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてpCR2.1でクローニングする。TOPO反応物でTOP10大腸菌を形質転換する。個々のクローンを液体培地へ採取し、培養物からプラスミドDNAを調製し、プライマーM13およびM13Rによるシークェンシングに用いる。配列データは、Contig Express and AlignXソフトウェア(Vector NTI, Invitrogen)を用いて編集する。アッセンブリングしたコンティーグを既知配列と比較する。
表2:GnT1のためにHicks Broadleaf BACに由来するゲノムFABIJIホモローグのスクリーニングに用いられるプライマー
N.タバクムPM132のシークェンシングRT-PCRフラグメントから得られたヌクレオチド配列は、N.タバクムHicks Broadleafの 完全なゲノムFABIJI_1配列に対してアラインメントされる。
配列番号:256:N.タバクムPM132-FABIJIのゲノムDNA配列
ゲノムDNAは、CTAB系抽出方法を用いてN.タバクムPM132の葉の組織から抽出される。N.タバクムPM132の葉を液体窒素中ですり潰して粉末にする。RNA抽出キット(Qiagen)を用い、供給業者の指示にしたがいながらRNAを200mgの粉末から抽出する。続いて1μgの抽出RNAをDNaseI(NEB)で処理する。500ngのDNase処理RNAから出発して、AMV-逆転写酵素(Invitrogen)を用いてcDNAを合成する。続いて第一鎖のcDNAサンプル10倍希釈して、PCR鋳型として供する。植物cDNAまたはgDNAは、マスターサイクラーグラジエントマシーン(Ependorf)によって増幅する。反応は50μL(25 μl の2x フションマスターミックス(Finnzyme)、20 μlの水、1μLの稀釈cDNAおよび表に列挙したプライマー(10μM)の各々2μLを含む)で実施する。サーモサイクラーの条件は、供給業者の指示にしたがい設定し、アニーリング温度として58℃を用いる。PCRの後、生成物の3’末端をアデニル化する。50μLの2X Taqマスターミックス(NEB)を前記PCR反応に添加し、これらを72℃で10分間インキュベートする。続いてPCR精製キット(Qiagen)を用いてPCR生成物を精製する。精製した前記生成物をTOPO-TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてpCR2.1でクローニングする。TOPO反応物でTOP10大腸菌を形質転換する。個々のクローンを液体培地へ採取し、培養物からプラスミドDNAを調製し、プライマーM13およびM13Rによるシークェンシングに用いる。配列データは、Contig Express and AlignXソフトウェア(Vector NTI, Invitrogen)を用いて編集する。アッセンブリングしたコンティーグを既知配列と比較する。
シークェンシングは、N.タバクムPM132品種およびN.タバクムPO2品種由来のgDNAの増幅によって得られたオーバーラップPCRフラグメントで以下のプライマーを用いて実施される:
表4: N.タバクムPM132品種およびN.タバクムPO2品種由来gDNAを得るためにPCRで用いられるプライマー
ヌクレオチド配列は、以下のプライマーを用いてPM132(その種子は受託番号NCIMB 41802で寄託された)およびN.タバクムPO2品種のgDNAの増幅によって得られたオーバーラップPCRフラグメントのシークェンシングによって確認される:
表6:N.タバクムPM132およびN.タバクムPO2品種からgDNAを得るためにPCRで用いられるプライマー
配列番号:259:CPO遺伝子由来gDNA
実施例1に記載したN.タバクムHicks Broadleaf BACライブラリーをCAC80702と相同な配列を有するクローンについてスクリーニングする。BACクローンは全く同定されなかった。GnTI配列と相同性を有するN.タバクムPM132のさらに別のヌクレオチド配列が同定され、下記に開示される。
N.タバクムPM132の同定された個々のGnTI配列変種は以下のとおりである:
配列番号:262:N.タバクムPM132 CAC80702.1ホモローグ
これまで本発明を詳細にかつ上述のように説明してきたが、そのような説明は例証および例示であって限定的なものではない。変更および改変は以下の特許請求の範囲内で当業者が為し得るものであることは理解されよう。多様な刊行物および特許が本明細書を通して引用されている。それら刊行物および特許の各々の開示内容は参照によりその全体が本明細書に含まれる・
Claims (19)
- 遺伝的に改変されたニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)の植物細胞または前記改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクムの植物であって、前記改変植物細胞が、N-アセチル-グルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内に第一の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変を含み、その結果、(i)改変植物細胞でグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が非改変植物細胞に比して低下し、さらに(ii)改変植物細胞で生産されるタンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が非改変植物細胞に比して低下する、前記植物細胞または植物細胞を含む植物。
- さらに、(a)β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、または(b)α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、または(a)および(b)の組合せを含む、請求項1に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。
- さらに、第一の標的ヌクレオチド配列、第二の標的ヌクレオチド配列、第三の標的ヌクレオチド配列、または前述の標的ヌクレオチド配列の任意の2つ以上の組合せの対立遺伝子変種に改変を含む、請求項1に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。
- 第一の標的ヌクレオチド配列が、
a.配列番号:12、13、40、41、233、256、259、262、265、268、271、274、277、280から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、特に少なくとも80%、特に少なくとも90%同一であるか、
b.配列番号:20、21、212、213、219、220、223、227、229、234、257、260、263、266、269、272、275、278、281から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95%、特に少なくとも98%、特に少なくとも99%同一である、
請求項1から3のいずれか1項に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。 - 第二の標的ヌクレオチド配列が、
a.配列番号:1、4、5および17から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、特に少なくとも80%、特に少なくとも90%同一であるか、
b.配列番号:8および18から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95%、特に少なくとも98%、特に少なくとも99%同一である、
請求項2から4のいずれか1項に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。 - 第三の標的ヌクレオチド配列が、
a.配列番号:27、32、37および47から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、特に少なくとも80%、特に少なくとも90%同一であるか、
b.配列番号:28、33、38および48から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95%、特に少なくとも98%、特に少なくとも99%同一である、
請求項2から5のいずれか1項に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。 - 植物が、受託番号NCIMB41802で寄託されたニコチアナ・タバクム栽培品種PM132である、請求項1から6のいずれか1項に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。
- 請求項1から7のいずれか1項に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物の子孫であって、前記子孫植物が請求項1から7のいずれか1項に規定された少なくとも1つの改変を含み、グリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が非改変植物に比して低下し、さらに(ii)改変植物で生産されるタンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたは両方が非改変植物に比して低下する、前記植物の子孫。
- 異種タンパク質を生産する方法であって、前記方法が、請求項1から8のいずれか1項に規定された改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞または植物に、異種タンパク質、特にワクチン抗原、サイトカイン、ホルモン、凝固タンパク質、アポリポタンパク質、ヒトの交換療法のための酵素、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を導入する工程、異種タンパク質が生産されるように前記発現構築物を含む改変植物細胞を培養する工程、および場合によって前記植物細胞から植物を再生する工程、並びに前記植物およびその子孫を生長させる工程を含む、前記異種タンパク質を生産する方法。
- 以下のa−cを含むポリヌクレオチド:
a.N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が、
(i)配列番号:12、13、40、41、233、256、259、262、265、268、271、274、277および280から成る群から選択されるか、
(ii)配列番号:20、21、212、213、219、220、223、227、229、234、257、260、263、266、269、272、275、278および281から成る群から選択されるか、
(iii)(i)または(ii)のヌクレオチド配列と少なくとも95%、特に少なくとも98%、特に少なくとも99%同一であるか、
(iv)(i)、(ii)もしくは(iii)のヌクレオチド配列またはその相補鎖から成るポリヌクレオチドプローブが特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる、
前記ヌクレオチド配列;
b.β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が、
(i)配列番号:1、4、5、7および17から成る群から選択されるか、
(ii)配列番号:8および18から成る群から選択されるか、
(iii)(i)または(ii)のヌクレオチド配列と少なくとも95%、特に少なくとも98%、特に少なくとも99%同一であるか、
(iv)(i)、(ii)もしくは(iii)のヌクレオチド配列またはその相補鎖から成るポリヌクレオチドプローブが特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる、
前記ヌクレオチド配列;
c.α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が、
(i)配列番号:27、32、37および47から成る群から選択されるか、
(ii)配列番号:28、33、38および48から成る群から選択されるか、
(iii)(i)または(ii)のヌクレオチド配列と少なくとも95%、特に少なくとも98%、特に少なくとも99%同一であるか、
(iv)(i)、(ii)もしくは(iii)のヌクレオチド配列またはその相補鎖から成るポリヌクレオチドプローブが特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる、
前記ヌクレオチド配列。 - 前記グリコシルトランスフェラーゼが、
a.配列番号:214、215、217、218、221、222、224、228、230、235、258、264、267、270、273、276、279および282に示されるアミノ酸配列を提示するN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ;
b.配列番号:9および19に示すアミノ酸配列を提示するβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ;
c.配列番号:29、34、39および49に示すアミノ酸配列を提示するα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ;
d.(i)、(ii)または(iii)のアミノ酸配列と少なくとも95%、特に少なくとも98%、特に少なくとも99%同一であるアミノ酸配列;
である、請求項10に記載のポリヌクレオチドによってコードされるグリコシルトランスフェラーゼ。 - 請求項10に規定されたゲノムヌクレオチド配列の使用であって、前記使用が、
a.N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または
b.(a)の第一の標的ヌクレオチド配列およびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列、または
c.(a)の第一の標的ヌクレオチド配列およびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列、
d.(a)、(b)および(c)の全ての標的ヌクレオチド配列
内の標的部位を、
(i)N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの、またはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼの、またはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼの、またはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼおよびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼの活性または発現が、および場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種の活性または発現が、改変を含む改変植物細胞で非改変植物細胞に比して低下し、さらに(ii)アルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が、改変を含む改変植物細胞のタンパク質のN-グリカンで非改変植物細胞に比して低下する改変のために同定する、前記ゲノムヌクレオチド配列の使用。 - 請求項10に規定されるゲノムヌクレオチド配列またはコード配列と選択的に結合する非天然ジンクフィンガータンパク質の、標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つで二本鎖切断を導入するジンクフィンガーヌクレアーゼを作製するための使用。
- 請求項1から8のいずれか1項で規定される改変植物細胞を含む植物から入手できる、異種タンパク質を含む植物組成物であって、前記異種タンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が、未改変植物細胞で生産されるものに比して低下する、前記植物組成物。
- ヒト化糖タンパク質を生産する能力を有する改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物細胞またはニコチアナ・タバクム植物を生産する方法であって、前記方法が、
(i)タバコ植物細胞のゲノムで、(a)N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または(b)(a)の第一の標的ヌクレオチド配列、並びにβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼおよびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列、または(c)第一の標的ヌクレオチド配列および第二の標的ヌクレオチド配列およびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列、および場合によって(d)(a)、(b)もしくは(c)の、または前述の標的ヌクレオチド配列の任意の2つ以上の組合せの対立遺伝子変種を含むゲノム領域内の標的ヌクレオチド配列を改変する工程;
(ii)標的ヌクレオチド配列に改変を含む改変植物を同定、および場合によって選別する工程を含み、
ここで、改変植物または植物細胞で、(a)、(b)、(c)および(d)に規定したグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が、および場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種の活性または発現が、改変植物または植物細胞で非改変植物細胞に比して低下し、さらに前記改変植物または植物細胞によって生産される糖タンパク質が、それらのN-グリカンでアルファ-1,3-結合フコース残基およびベータ-1,2-結合キシロース残基を欠く、前記植物生産方法。 - 標的ヌクレオチド配列が請求項10に規定するヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載の方法。
- 植物が、受託番号NCIMB41802で寄託された、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132である、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
- タバコ植物または植物細胞のゲノムの改変が以下の工程を含む、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法:
a.ニコチアナ・タバクム植物または植物細胞の標的ヌクレオチド配列で、および場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種で標的部位を同定する工程、
b.請求項10に規定したヌクレオチド配列を基にして、前記標的部位を認識し、さらにこの標的部位またはその近傍に結合する能力を有する変異導入オリゴヌクレオチドを設計する工程、および
c.タバコ植物または植物細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列とゲノムが改変される条件下で前記変異導入オリゴヌクレオチドを結合させる工程。 - 変異導入オリゴヌクレオチドが、ゲノム編集技術、特にジンクフィンガー媒介変異導入、チリング、相同組換え、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、またはメガヌクレアーゼ媒介変異導入または前述の技術の組合せで用いられる、請求項18に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP10157243 | 2010-03-22 | ||
EP10157243.6 | 2010-03-22 | ||
PCT/EP2011/054367 WO2011117249A1 (en) | 2010-03-22 | 2011-03-22 | Modifying enzyme activity in plants |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017120275A Division JP2017158592A (ja) | 2010-03-22 | 2017-06-20 | 植物の酵素活性の改変 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013526844A true JP2013526844A (ja) | 2013-06-27 |
Family
ID=42144982
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013500472A Pending JP2013526844A (ja) | 2010-03-22 | 2011-03-22 | 植物の酵素活性の改変 |
JP2017120275A Abandoned JP2017158592A (ja) | 2010-03-22 | 2017-06-20 | 植物の酵素活性の改変 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017120275A Abandoned JP2017158592A (ja) | 2010-03-22 | 2017-06-20 | 植物の酵素活性の改変 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20130198897A1 (ja) |
EP (1) | EP2550358A1 (ja) |
JP (2) | JP2013526844A (ja) |
CN (1) | CN103025866A (ja) |
CA (1) | CA2794037A1 (ja) |
WO (1) | WO2011117249A1 (ja) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6037395B2 (ja) * | 2011-01-17 | 2016-12-07 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物におけるタンパク質発現 |
WO2012129373A2 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for producing a complex transgenic trait locus |
CA2850571C (en) * | 2011-10-04 | 2021-01-05 | Icon Genetics Gmbh | Nicotiana benthamiana plants deficient in fucosyltransferase activity |
WO2013068593A1 (en) * | 2011-11-11 | 2013-05-16 | Philip Morris Products S.A. | Influenza virus -like particles (vlps) comprising hemagglutinin produced nicotiana tabacum |
EP2861737B1 (en) | 2012-06-19 | 2019-04-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Gene targeting in plants using dna viruses |
US11555198B2 (en) * | 2012-11-01 | 2023-01-17 | Cellectis Sa | Method for making nicotiana plants with mutations in XylT and FucT alleles using rare-cutting endonucleases |
PL2934097T3 (pl) | 2012-12-21 | 2018-11-30 | Cellectis | Ziemniaki o ograniczonej słodkości indukowanej chłodem |
US9957515B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-05-01 | Cibus Us Llc | Methods and compositions for targeted gene modification |
KR102339732B1 (ko) * | 2013-03-15 | 2021-12-15 | 시버스 유에스 엘엘씨 | 올리고뉴클레오타이드 매개 유전자 보수를 사용한 표적화된 유전자 변형의 효율을 증가시키기 위한 방법 및 조성물 |
US10113162B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-30 | Cellectis | Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the FAD2-1A/1B genes |
WO2015193858A1 (en) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | Cellectis | Potatoes with reduced granule-bound starch synthase |
KR101606918B1 (ko) * | 2014-08-04 | 2016-03-28 | 경상대학교산학협력단 | 인간화 저-만노스형 엔-당질 합성 식물 및 이의 용도 |
RU2017112324A (ru) | 2014-09-12 | 2018-10-15 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Создание сайтов сайт-специфической интеграции для сложных локусов признаков в кукурузе и сое, а также способы применения |
US10837024B2 (en) | 2015-09-17 | 2020-11-17 | Cellectis | Modifying messenger RNA stability in plant transformations |
UY37108A (es) | 2016-02-02 | 2017-08-31 | Cellectis | Modificación de la composición de aceites de soja mediante el knockout dirigido de los genes fad3a/b/c |
WO2018092072A1 (en) | 2016-11-16 | 2018-05-24 | Cellectis | Methods for altering amino acid content in plants through frameshift mutations |
WO2018198049A1 (en) | 2017-04-25 | 2018-11-01 | Cellectis | Alfalfa with reduced lignin composition |
JP2021519064A (ja) | 2018-03-28 | 2021-08-10 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物体における還元糖含有量の調節 |
JP7463284B2 (ja) | 2018-03-28 | 2024-04-08 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物におけるアミノ酸含有量の調節 |
WO2020141062A1 (en) | 2018-12-30 | 2020-07-09 | Philip Morris Products S.A. | Modulation of nitrate levels in plants via mutation of nitrate reductase |
WO2023117661A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Philip Morris Products S.A. | Increasing anatabine in tobacco leaf by regulating methyl putrescine oxidase |
WO2023117701A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Philip Morris Products S.A. | Modulation of nicotine production by alteration of nicotinamidase expression or function in plants |
WO2024079137A1 (en) | 2022-10-13 | 2024-04-18 | Philip Morris Products S.A. | Increasing leaf biomass and nitrogen use efficiency by regulating ntp2 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001055434A1 (de) * | 2000-01-27 | 2001-08-02 | Mpb Cologne Gmbh Molecular Plant & Protein Biotechnology | Hemmung von kohlenhydrat-modifizierenden enzymen in wirts-organismen |
WO2004067736A2 (en) * | 2003-01-28 | 2004-08-12 | Cellectis | Custom-made meganuclease and use thereof |
JP2006212019A (ja) * | 2004-04-30 | 2006-08-17 | National Institute Of Agrobiological Sciences | 植物を用いたユビキノン−10の製造方法 |
WO2006097853A1 (en) * | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Cellectis | I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
WO2007084926A2 (en) * | 2006-01-17 | 2007-07-26 | Biolex Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for humanization and optimization of n-glycans in plants |
WO2007107296A1 (en) * | 2006-03-23 | 2007-09-27 | Bayer Bioscience N.V. | Novel nucleotide sequences encoding nicotiana beta-1,2-xylosyltransferase |
WO2008021207A2 (en) * | 2006-08-11 | 2008-02-21 | Dow Agrosciences Llc | Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination |
WO2009042164A1 (en) * | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Dow Agrosciences Llc | Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes |
WO2009056155A1 (en) * | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Bayer Bioscience N.V. | Method to produce modified plants with altered n-glycosylation pattern |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
US5792632A (en) | 1992-05-05 | 1998-08-11 | Institut Pasteur | Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof |
US6453242B1 (en) | 1999-01-12 | 2002-09-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites |
US6534261B1 (en) | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US7273923B2 (en) | 2001-01-22 | 2007-09-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants |
DK1427828T3 (da) | 2001-09-14 | 2010-07-19 | Cellectis | Tilfældig integration af et polynucleotid efter in vivo-linearisering |
ES2292994T3 (es) | 2002-03-15 | 2008-03-16 | Cellectis | Meganucleasas hibridas y de cadena sencilla y su utilizacion. |
US7951557B2 (en) * | 2003-04-27 | 2011-05-31 | Protalix Ltd. | Human lysosomal proteins from plant cell culture |
US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
US7723569B2 (en) * | 2004-04-30 | 2010-05-25 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Method for producing ubiquinone-10 in plant |
EP3246403B1 (en) | 2005-10-18 | 2020-08-26 | Precision Biosciences | Rationally designed meganucleases with altered sequence specificity and dna-binding affinity |
AU2008253212A1 (en) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means for producing glycoproteins with altered glycosylation pattern in higher plants |
EP2660317B1 (en) | 2007-10-31 | 2016-04-06 | Precision Biosciences, Inc. | Rationally-designed single-chain meganucleases with non-palindromic recognition sequences |
-
2011
- 2011-03-22 US US13/636,409 patent/US20130198897A1/en not_active Abandoned
- 2011-03-22 JP JP2013500472A patent/JP2013526844A/ja active Pending
- 2011-03-22 CA CA2794037A patent/CA2794037A1/en not_active Abandoned
- 2011-03-22 WO PCT/EP2011/054367 patent/WO2011117249A1/en active Application Filing
- 2011-03-22 CN CN2011800237558A patent/CN103025866A/zh active Pending
- 2011-03-22 EP EP11712501A patent/EP2550358A1/en not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-06-20 JP JP2017120275A patent/JP2017158592A/ja not_active Abandoned
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001055434A1 (de) * | 2000-01-27 | 2001-08-02 | Mpb Cologne Gmbh Molecular Plant & Protein Biotechnology | Hemmung von kohlenhydrat-modifizierenden enzymen in wirts-organismen |
WO2004067736A2 (en) * | 2003-01-28 | 2004-08-12 | Cellectis | Custom-made meganuclease and use thereof |
JP2006212019A (ja) * | 2004-04-30 | 2006-08-17 | National Institute Of Agrobiological Sciences | 植物を用いたユビキノン−10の製造方法 |
WO2006097853A1 (en) * | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Cellectis | I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
WO2007084926A2 (en) * | 2006-01-17 | 2007-07-26 | Biolex Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for humanization and optimization of n-glycans in plants |
WO2007084922A2 (en) * | 2006-01-17 | 2007-07-26 | Biolex Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for humanization and optimization of n-glycans in plants |
WO2007107296A1 (en) * | 2006-03-23 | 2007-09-27 | Bayer Bioscience N.V. | Novel nucleotide sequences encoding nicotiana beta-1,2-xylosyltransferase |
WO2008021207A2 (en) * | 2006-08-11 | 2008-02-21 | Dow Agrosciences Llc | Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination |
WO2009042164A1 (en) * | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Dow Agrosciences Llc | Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes |
WO2009056155A1 (en) * | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Bayer Bioscience N.V. | Method to produce modified plants with altered n-glycosylation pattern |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
HUETHER,C.M.ET AL., PUTATIVE BETA 1,2-XYLOSYLTRANSFERASE [NICOTIANA TABACUM], [ONLINE], 2008.12.24, JPN6015021961 * |
STRASSER R.ET AL.: "Generation of Arabidopsis thaliana plants with complex N-glycans lacking beta1,2-linked xylose and c", FEBS LETT., JPN6015021964, 12 March 2004 (2004-03-12), pages 561(1-3) * |
STRASSER R.ET AL.: "Generation of glyco-engineered Nicotiana benthamiana for the production of monoclonal antibodies wit", PLANT BIOTECHNOL J., vol. 6(4), JPN6015021959, May 2008 (2008-05-01), pages 392 - 402, XP009104007, DOI: doi:10.1111/j.1467-7652.2008.00330.x * |
STRASSER R.ET AL.: "Unaltered complex N-glycan profiles in Nicotiana benthamiana despite drastic reduction of beta1,2- N", GLYCOCONJ J., vol. 21(5), JPN6015021965, 2004, pages 275 - 82, XP019207019, DOI: doi:10.1023/B:GLYC.0000045099.29038.04 * |
VON SCHAEWEN A.ET AL.: "Isolation of a mutant Arabidopsis plant that lacks N-acetyl glucosaminyl transferase I and is unable", PLANT PHYSIOL., vol. 102(4), JPN6015021962, August 1993 (1993-08-01), pages 1109 - 18, XP000645269, DOI: doi:10.1104/pp.102.4.1109 * |
WENDEROTH I.ET AL.: "Isolation and characterization of plant N-acetyl glucosaminyltransferase I (GntI) cDNA sequences. Fu", PLANT PHYSIOL., vol. 123(3), JPN6015021957, July 2000 (2000-07-01), pages 1097 - 108 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103025866A (zh) | 2013-04-03 |
WO2011117249A1 (en) | 2011-09-29 |
US20130198897A1 (en) | 2013-08-01 |
JP2017158592A (ja) | 2017-09-14 |
CA2794037A1 (en) | 2011-09-29 |
EP2550358A1 (en) | 2013-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2017158592A (ja) | 植物の酵素活性の改変 | |
EP2443234B1 (en) | Nicotiana benthamiana plants deficient in xylosyltransferase activity | |
JP6388474B2 (ja) | 植物中の重金属の削減 | |
AU2012320847B2 (en) | Nicotiana benthamiana plants deficient in fucosyltransferase activity | |
CN110892074A (zh) | 用于增加香蕉的保质期的组成物及方法 | |
US20220364105A1 (en) | Inir12 transgenic maize | |
JP2017131225A (ja) | 植物由来アルファ−マンノシダーゼ及びそれを使用する方法 | |
CA3188408A1 (en) | Inir12 transgenic maize | |
CA2890281C (en) | Plants for production of therapeutic proteins | |
KR102348638B1 (ko) | 비푸코실화된 담배를 이용하여 생산한 항체 및 이의 용도 | |
WO2001064865A1 (fr) | Promoteurs ameliores et utilisation de ceux-ci | |
CN117858952A (zh) | 编辑香蕉基因的方法 | |
JP2021519064A (ja) | 植物体における還元糖含有量の調節 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140324 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150603 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150902 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151203 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160624 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20160713 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20160923 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170522 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170620 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180322 |