TWI424061B - 鋅指核酸酶媒介之同源重組方法 - Google Patents

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Description

鋅指核酸酶媒介之同源重組方法
本發明揭示內容屬於植物中之基因組工程、基因靶向、定向基因組整合及蛋白質表現之領域。
一在農業中引人關注之主要領域(尤其在測定多種植物基因組之完整核苷酸序列方面)係基因組序列之定向改變。尤其，轉化內源性植物序列之能力將會促進很多應用，例如對影響營養價值、產量、應激耐受力、病原抗性、及對農用化學藥品之抗性及/或植物用作用於製造醫藥化合物或工業化學品之生物學產品之適合性作物性狀之最佳化。
在真核生物中，人們已經做出許多努力以藉由利用天然同源重組現象來改變經培養細胞中之基因組序列。參見(例如)Capecchi(1989)Science 244：1288－1292；美國專利第6,528,313號及第6,528,314號。若多核苷酸與包含該擬改變序列之基因組區域具有充分同源性，則對於該多核苷酸序列之全部或部分而言有可能藉由同源重組來置換該基因組序列。然而，同源重組在該等情況下之頻率極低。此外，在缺少序列同源性之基因組位置處外源性多核苷酸之插入頻率超出內源性多核苷酸之頻率若干個數量級。
在經培養細胞中將一雙鏈斷裂引入基因組DNA(在具有與一外源性多核苷酸之同源性的基因組之區域中)已顯示可數千倍地促進此位點處之同源重組。Rouet等人(1994)Mol .Cell .Biol .14：8096－8106；Choulika等人(1995)Mol .Cell .Biol .15：1968－1973；Donoho等人(1998)Mol .Cell .Biol .18：4070－4078。亦參見Johnson等人(2001)Biochem .Soc .Trans .29：196－201；及Yanez等人(1998)Gene Therapy 5：149－159。在該等方法中，位於期望基因組區域中之DNA裂解係藉由將一大範圍核酸酶之識別位點(即一其識別序列如此之大以致於在目標基因組中不會出現或僅極少出現之內切核酸酶)插入期望的基因組區域而實現。
然而，經大範圍核酸酶裂解促進的同源重組依賴於一適宜大範圍核酸酶識別位點在擬改變之基因組區域之鄰近區中之偶然出現或直接插入。由於大範圍核酸酶識別位點在典型植物基因組中很稀少(或不存在)，並且一適宜大範圍核酸酶識別位點之插入受到與其他基因組改變相關聯之困難相同的困難的煩擾，該等方法未得以廣泛應用。
因此，當前仍需用於定向改變任一植物基因組序列之組合物及方法，並需要用於將一外源性序列定向引入基因組之組合物及方法。
本發明揭示內容提供在植物細胞中用於在一目標區域中定向分開細胞染色質及/或一預定目標區域中同源重組之組合物及方法。植物細胞可來自單子葉植物類(單子葉植物(monocots))或雙子葉植物類(雙子葉植物(dicots))，且亦包括經培養細胞、處於任一發育階段之植物中之細胞、及已自完整植物移出並將返回至該植物之植物細胞。
位於細胞染色質之目標區域可(例如)係基因組序列或其部分。組合物包括含有一經設計鋅指結合結構域(例如一具有新穎特異性之鋅指結合結構域)及一裂解結構域之融合多肽及含有一經設計鋅指結合區域及一裂解半結構域之融合多肽。裂解結構域及裂解半結構域可(例如)自多種限制性內切酶及/或歸巢內切酶獲得。
在一態樣中，本文所述係一包含第一及第二DNA序列之載體，其中(i)第一序列與第三序列係同源的且第二序列與第四序列係同源的；(ii)第三及第四序列係染色體DNA序列；及(iii)第三與第四序列之靠近邊緣藉由至少1個核苷酸對分開。在某些實施例中，第三及第四序列係內源序列。
在任一本文所述載體中，至少一第一或第二序列具有一100個核苷酸之長度。另外，任一本文所述載體可進一步包含一第五序列，其中該第五序列：(a)插入第一及第二序列之間；及(b)係外源性序列。在某些實施例中，第五序列具有一至少1個鹼基對之大小，但可大到22千個鹼基對。
該等載體(例如第五序列)亦可包含編碼蛋白質或蛋白質部分的序列。在某些實施例中，蛋白質編碼序列可編碼可選標記，例如綠色螢光蛋白(GFP)、β－葡萄糖苷酸酶(GUS)、草銨膦乙醯基轉移酶(PAT,BAR)、新黴素磷酸轉移酶、β－內醯胺酶、兒茶酚雙加氧酶、α－澱粉酶、酪胺酸酶、β－半乳糖苷酶、螢光素酶、發光蛋白、EPSP合成酶、腈水解酶、乙醯乳酸合成酶(ALS)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、茅草枯脫鹵素酶及鄰胺基苯甲酸合成酶。在其他實施例中，蛋白質編碼序列(例如第五序列)可編碼蛋白質或蛋白質部分，例如與染色體序列同源的序列。
在又一實施例中，該等載體(例如第五序列)可包含一或多個轉錄調節序列。在仍另一實施例中，該等載體(例如第五序列)可包含一突變型染色體序列之野生型對等物或(可選擇地)一野生型染色體序列之突變型對等物。
在任一本文所述載體中，第一序列與第三序列可具有至少35%的同源性。同樣，在任一本文所述載體中，第二序列與第四序列可具有至少35%的同源性。在一些實施例中，第一序列與第三序列具有至少35%至50%、至少50%至70%、至少70%至80%、至少80%至85%、至少85%至90%、至少90%至95%、至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的同源性。在一些實施例中，第二序列與第四序列具有至少35%至50%、至少50%至70%、至少70%至80%、至少80%至85%、至少85%至90%、至少90%至95%、至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的同源性。
在又一態樣中，本文所述為一將外源序列引入植物細胞之基因組之方法，該方法包括以下步驟：(a)使細胞與任一上述載體接觸；及(b)在該細胞內表現一或多種核酸酶，其中該等一或多種核酸酶可將染色體DNA裂解為介於0.4與3千鹼基對之間的第三或第四序列；如此在步驟(b)中染色體DNA之裂解可促進靶向載體藉由同源重組而併入基因組中。在某些實施例中，該等一或多種核酸酶係IIS型限制性核酸內切酶之裂解結構域與經設計之鋅指結合結構域之融合物。
在又一態樣中，本文提供一種在植物細胞中表現蛋白質之方法，該方法包括以下步驟：(a)使細胞與本文所述載體接觸；及(b)在該細胞內表現一或多種核酸酶，其中該等一或多種核酸酶可將染色體DNA裂解為介於0.1與3千鹼基對之間之第三或第四序列；如此在步驟(b)中染色體DNA之裂解可促進載體藉由同源重組而併入基因組中。在某些實施例中，該等一或多種核酸酶係IIS型限制性核酸內切酶之裂解結構域與經設計鋅指結合結構域之融合物。
在另一態樣中，本文所述為一包含下述部分之靶向載體：(a)第一及第二序列；及(b)第一、第二及第三靶序列；其中該等序列係以以下次序排列：第一靶序列、第一編碼序列、第二靶序列、第二編碼序列、第三靶序列；此外其中該第一靶序列與第一染色體序列同源且第三靶序列與第二染色體序列同源。第一及/或第二編碼序列可編碼一可選標記或，另外，第一及/或第二編碼序列可編碼非可選標記蛋白。第一及第二染色體序列可係內源染色體序列。此外，該等載體可包含一或多個第一、第二及/或第三靶序列之重複。
在另一態樣中，提供一種將外源序列引入植物細胞基因組之方法，該方法包括以下步驟：(a)使細胞與前文段落中所述之靶向載體接觸；及(b)在該細胞中表現一或多種核酸酶，其中該等一或多種核酸酶可將染色體DNA裂解為介於0.1與3千鹼基對之間之第一或第二染色體序列；如此在步驟(b)中染色體DNA之裂解可促進靶向載體藉由同源重組而合併入基因組中。在某些實施例中，該等一或多種核酸酶包含一裂解半結構域；例如，該核酸酶係IIS型限制性核酸內切酶之裂解結構域與經設計鋅指結合結構域之融合物。
在另一態樣中，提供一種在植物細胞中表現蛋白質之方法，該方法包括以下步驟：(a)使細胞與上面兩段中所闡述之靶向載體接觸；及(b)在該細胞中表現一或多種核酸酶，其中該一或多種核酸酶可將染色體DNA裂解為介於0.1與3千鹼基對之間之第一或第二染色體序列；如此在步驟(b)中染色體DNA之裂解可促進靶向載體藉由同源重組而併入基因組中。在某些實施例中，該等一或多種核酸酶係IIS型限制性核酸內切酶之裂解結構域與經設計鋅指結合結構域之融合物。
在再一態樣中，亦提供一根據任一本文所述方法獲得之基因轉殖植物細胞。
在另一態樣中，本文所提供係一包含如本文所述所獲得之基因轉殖植物細胞的植物。
亦提供一種自包含下述序列之基因轉殖植物細胞之基因組刪除序列的方法：第一及第二編碼序列；及第一、第二及第三靶序列；其中該等序列係以以下次序排列：第一靶序列、第一編碼序列、第二靶序列、第二編碼序列、第三靶序列，其中該方法包括：(a)提供一如本文所述之基因轉殖植物細胞；及(b)在該細胞中表現第一及第二核酸酶，其中該第一核酸酶可在該第一靶序列中裂解而該第二核酸酶可在該第二靶序列中裂解。
在另一態樣中，本文揭示一種自包含下述序列之基因轉殖植物細胞之基因組刪除序列的方法：第一及第二編碼序列；及第一、第二及第三靶序列；其中該等序列係以以下次序排列：第一靶序列、第一編碼序列、第二靶序列、第二編碼序列、第三靶序列，其中該方法包括：(a)提供一如本文所述之基因轉殖植物細胞；及(b)在該細胞中表現第一及第二核酸酶，其中該第一核酸酶可在該第二靶序列中裂解而該第二核酸酶可在該第三靶序列中裂解。
在再一態樣中，本文提供一種自包含下述序列之基因轉殖植物細胞之基因組刪除序列的方法：第一及第二編碼序列；及第一、第二及第三靶序列；其中該等序列係以以下次序排列：第一靶序列、第一編碼序列、第二靶序列、第二編碼序列、第三靶序列，其中該方法包括：(a)提供一如本文所述之基因轉殖植物細胞；及(b)在該細胞中表現第一及第二核酸酶，其中該第一核酸酶可在該第一靶序列中裂解而該第二核酸酶可在該第三靶序列中裂解。
在另一態樣中，提供一種在細胞(例如植物細胞)基因組中進行分子內同源重組的方法，該方法包括以下步驟：(a)提供一包含與第二序列同源之第一序列的DNA區段；及(b)使該DNA區段與核酸酶接觸，其中該核酸酶可在第三序列處裂解該DNA區段。在某些實施例中，該DNA區段對於該細胞係內源性的。在某些實施例中，同源重組於一染色體內，例如，當自該染色體刪除介於第一及第二序列之間之DNA時。自該染色體刪除之序列可編碼(例如)一可選標記之全部或部分。經刪除DNA可經一外源序列置換，例如其中該方法進一步包括：將多核苷酸引入該細胞，其中該多核苷酸包括：(a)第四及第五序列，其中該第四序列與鄰近第一序列之非刪除序列同源且該第五序列與鄰近第二序列之非刪除序列同源；及(b)該外源序列(例如可選標記、可選標記之外的蛋白質或蛋白質部分、RNA(例如siRNA等)。在任一本文所提供方法中，可選標記可係(例如)綠色螢光蛋白(GFP)、β－葡萄糖苷酸酶(GUS)、草銨膦乙醯基轉移酶(PAT,BAR)、新黴素磷酸轉移酶、β－內醯胺酶、兒茶酚雙加氧酶、α－澱粉酶、酪胺酸酶、β－半乳糖苷酶、螢光素酶、發光蛋白、EPSP合成酶、腈水解酶、乙醯乳酸合成酶(ALS)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、茅草枯脫鹵素酶及鄰胺基苯甲酸合成酶。
在任一該等方法中，該第三序列(即藉由核酸酶裂解之序列)在該基因組中可係唯一的及/或該核酸酶可係一對融合蛋白，其中各融合蛋白係裂解半結構域(例如IIS型限制性核酸內切酶之裂解結構域)與經設計鋅指結合區域之融合物。此外，該第三序列可係介於第一與第二序列(即同源序列)之間及/或來自第一及/或第二序列之至少1鹼基對。
在任一本文所述方法中，第一及第二序列之一或兩者皆對於該有機體而言係外源性的。
因此，本揭示內容涵蓋(但不限於)以下編號實施例：1.一包含第一及第二DNA序列之供體載體；其中該第一序列與一第三序列同源且該第二序列與一第四序列同源；其中該等第三及第四序列係染色體DNA序列；且其中該等第三及第四序列之靠近邊緣係藉由至少一核苷酸對分開。
2.實施例1之載體，其中該等第三及第四序列係內源性序列。
3.實施例1或2之載體，其中該第一或第二序列之至少一個具有100個核苷酸之長度。
4.實施例1至3中任一實施例之載體，其進一步包含一第五序列，其中該第五序列：(a)插入第一及第二序列之間；且(b)係外源性序列。
5.實施例4之載體，其中該第五序列具有至少1鹼基對之大小。
6.實施例4之載體，其中該第五序列包含編碼可選標記之序列。
7.實施例6之載體，其中該可選標記係選自由綠色螢光蛋白(GFP)、β－葡萄糖苷酸酶(GUS)、草銨膦乙醯基轉移酶(PAT,BAR)、新黴素磷酸轉移酶、β－內醯胺酶、兒茶酚雙加氧酶、α－澱粉酶、酪胺酸酶、β－半乳糖苷酶、螢光素酶、發光蛋白、EPSP合成酶、腈水解酶、乙醯乳酸合成酶(ALS)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、茅草枯脫鹵素酶及鄰胺基苯甲酸合成酶組成之群。
8.實施例4之載體，其中該第五序列包含編碼除可選標記之外之蛋白質的序列。
9.實施例4之載體，其中該第五序列包含一或多個轉錄調控序列。
10.實施例4之載體，其中該第五序列包含編碼一蛋白質部分之序列。
11.實施例10之載體，其中該編碼該蛋白質部分之序列包含與染色體序列同源之序列。
12.實施例4之載體，其中該第五序列包含突變型染色體序列之野生型對等物。
13.實施例4之載體，其中該第五序列包含野生型染色體序列之突變型對等物。
14.實施例1至13中任一實施例之載體，其中該第一序列與第三序列具有至少35%的同源性。
15.實施例1至14之載體，其中該第二序列與第四序列具有至少35%的同源性。
16.實施例14之載體，其中該第二序列與第四序列具有至少35%的同源性。
17.一種用於將外源性序列引入植物細胞基因組之方法，該方法包括以下步驟：(a)使該細胞與實施例1至16中任一實施例之靶向載體接觸；及(b)在該細胞內表現一或多種核酸酶，其中該一或多種核酸酶可將染色體DNA裂解為3千鹼基對以內之第三或第四序列；如此，在步驟(b)中染色體DNA之裂解可促進靶向載體藉由同源重組而併入基因組中。
18.實施例17之方法，其中該一或多種核酸酶係IIS型限制性核酸內切酶之裂解結構域與經設計鋅指結合結構域之融合物。
19.一種在植物細胞中表現蛋白質之方法，該方法包括以下步驟：(a)使該細胞與實施例8之靶向載體接觸；及(b)在該細胞內表現一或多種核酸酶，其中該一或多種核酸酶可將染色體DNA裂解為3千鹼基對以內之第三或第四序列；如此，在步驟(b)中染色體DNA之裂解可促進靶向載體藉由同源重組而併入基因組中。
20.實施例19之方法，其中該一或多種核酸酶係IIS型限制性核酸內切酶之裂解結構域與經設計鋅指結合結構域之融合物。
21.一種根據實施例17、18、19或20之方法所獲得的基因轉殖植物細胞。
22.一種包含實施例21之基因轉殖植物細胞的植物。
23.一種在細胞基因組中進行分子內同源重組之方法，該方法包括以下步驟：(a)提供一包含與第二序列同源之第一序列的DNA區段；及(b)使該DNA區段與一核酸酶接觸，其中該核酸酶可在一第三序列處裂解該DNA區段。
24.實施例23之方法，其中該DNA區段對於該細胞而言係內源性的。
25.實施例23或24之方法，其中該同源重組發生於一染色體中。
26.實施例25之方法，其中介於第一及第二序列間之DNA係自該染色體刪除的。
27.實施例23、24、25或26之方法，其中該第三序列在該基因組中係唯一的。
28.實施例23至26中任一實施例之方法，其中該細胞為植物細胞。
29.實施例23至28之方法，其中該核酸酶係一對融合蛋白，其中各融合蛋白係IIS型限制性核酸內切酶之裂解結構域與經設計鋅指結合結構域之融合物。
30.實施例23至29之方法，其中該第三序列為來自第一序列之至少100個鹼基對。
31.實施例23至30中任一實施例之方法，其中該第三序列為來自第二序列之至少100個鹼基對。
32.實施例23至31中任一實施例之方法，其中該第三序列位於第一與第二序列之間。
33.實施例23至32中任一實施例之方法，其中第一或第二序列之一對於該有機體而言係外源性的。
34.實施例23至32中任一實施例之方法，其中第一及第二序列兩者對於該有機體而言皆係外源性的。
35.實施例26之方法，其中該等自染色體刪除之序列編碼可選標記之全部或部分。
36.實施例35之方法，其中該可選標記係選自由綠色螢光蛋白(GFP)、β－葡萄糖苷酸酶(GUS)、草銨膦乙醯基轉移酶(PAT,BAR)、新黴素磷酸轉移酶、β－內醯胺酶、兒茶酚雙加氧酶、α－澱粉酶、酪胺酸酶、β－半乳糖苷酶、螢光素酶、發光蛋白、EPSP合成酶、腈水解酶、乙醯乳酸合成酶(ALS)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、茅草枯脫鹵素酶及鄰胺基苯甲酸合成酶組成之群。
37.實施例26之方法，其中該經刪除DNA係經外源性序列置換，該等方法進一步包括：將多核苷酸引入該細胞，其中該多核苷酸包含：(a)第四及第五序列，其中該第四序列與鄰近第一序列之非刪除序列同源且該第五序列與鄰近第二序列之非刪除序列同源；及(b)該外源性序列。
38.實施例37之方法，其中該外源性序列為可選標記。
39.實施例38之方法，其中該可選標記係選自由綠色螢光蛋白(GFP)、β－葡萄糖苷酸酶(GUS)、草銨膦乙醯基轉移酶(PAT,BAR)、新黴素磷酸轉移酶、β－內醯胺酶、兒茶酚雙加氧酶、α－澱粉酶、酪胺酸酶、β－半乳糖苷酶、螢光素酶、發光蛋白、EPSP合成酶、腈水解酶、乙醯乳酸合成酶(ALS)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、茅草枯脫鹵素酶及鄰胺基苯甲酸合成酶組成之群。
40.實施例23至39之方法，其中該外源性序列編碼除可選標記之外的蛋白質。
41.實施例23至39之方法，其中該外源性序列編碼RNA。
42.實施例41之方法，其中該RNA為siRNA。
43.靶向載體包含：(a)第一及第二編碼序列；及(b)第一、第二及第三靶序列；其中該序列係以下面次序排列：第一靶序列、第一編碼序列、第二靶序列、第二編碼序列、第三靶序列；此外其中該第一靶序列與第一染色體序列同源且該第三靶序列與第二染色體序列同源。
44.實施例43之載體，其中該第一編碼序列編碼可選標記。
45.實施例43或44之載體，其中該第二編碼序列編碼可選標記。
46.實施例43或45之載體，其中該第一編碼序列編碼非可選標記之蛋白質。
47.實施例43、44或46之載體，其中該第二編碼序列編碼非可選標記之蛋白質。
48.實施例43至47中任一實施例之載體，其中第一及第二染色體序列為內源性染色體序列。
49.實施例43至48中任一實施例之載體，進一步包含第一靶序列之一或多個重複。
50.實施例43至49中任一實施例之載體，進一步包含第二靶序列之一或多個重複。
51.實施例43至50中任一實施例之載體，進一步包含第三靶序列之一或多個重複。
52.一種用於將外源性序列引入植物細胞基因組之方法，該方法包括以下步驟：(a)使該細胞與實施例43至51中任一項之靶向載體接觸；及(b)在該細胞中表現一或多種核酸酶，其中該一或多種核酸酶可將染色體DNA裂解為介於0.1與3千鹼基對之間之第一或第二染色體序列；如此，在步驟(b)中染色體DNA之裂解可促進靶向載體藉由同源重組而併入基因組中。
53.實施例52之方法，其中該一或多種核酸酶係IIS型限制性核酸內切酶之裂解結構域與經設計鋅指結合結構域之融合物。
54.一種在植物細胞中表現蛋白質之方法，該方法包括以下步驟：(a)使該細胞與實施例43至51中任一實施例之靶向載體接觸；及(b)在該細胞中表現一或多種核酸酶，其中該一或多種核酸酶可將染色體DNA裂解為介於0.1與3千鹼基對之間之第一或第二染色體序列；如此，在步驟(b)中染色體DNA之裂解可促進靶向載體藉由同源重組而併入基因組中。
55.實施例54之方法，其中該一或多種核酸酶係IIS型限制性核酸內切酶之裂解結構域與經設計鋅指結合結構域之融合物。
56.一種根據實施例52或53之方法獲得的基因轉殖植物細胞。
57.一種包含實施例56之基因轉殖植物細胞的植物。
58.一種自基因轉殖植物細胞之基因組刪除序列之方法，其中該方法包括：(a)提供一實施例56之基因轉殖植物細胞；及(b)在該細胞中表現第一及第二核酸酶，其中該第一核酸酶可在該第一靶序列中裂解且該第二核酸酶可在該第二靶序列中裂解。
59.一種自基因轉殖植物細胞之基因組刪除序列之方法，其中該方法包括：(a)提供實施例56之基因轉殖植物細胞；及(b)在該細胞中表現第一及第二核酸酶，其中該第一核酸酶可在該第二靶序列中裂解且該第二核酸酶可在該第三靶序列中裂解。
60.一種自基因轉殖植物細胞之基因組刪除序列之方法，其中該方法包括：(a)提供實施例56之基因轉殖植物細胞；及(b)在該細胞中表現第一及第二核酸酶，其中該第一核酸酶可在該第一靶序列中裂解且該第二核酸酶可在該第三靶序列中裂解。
本文揭示可用於定向裂解植物細胞染色質及用於(例如)藉由定向裂解及隨後染色體內同源重組或藉由定向裂解及隨後在外源多核苷酸(包含一或多個與細胞核苷酸序列同源的區)與基因組序列之間之同源重組而定向改變植物細胞核苷酸序列之組合物及方法。
基因組序列包括彼等存於染色體、游離基因、細胞器基因組(例如線粒體、葉綠體)、人工染色體及任何其他類型之存於細胞內之核酸(例如擴增序列、雙微染色體及內源性基因組)或感染細菌及病毒內之基因組序列。基因組序列可係正常型(即野生型)或突變型；突變型序列可包括(例如)插入、刪除、易位、重排、及/或點突變。基因組序列亦可包含許多不同等位基因之一。
可用於定向裂解及重組之組合物包括包含裂解結構域(或一裂解半結構域)及鋅指結合結構域之融合蛋白、編碼該等蛋白質之多核苷酸及多肽與編碼多肽之多核苷酸之組合。鋅指結合結構域可包含一或多個鋅指結構(例如)2、3、4、5、6、7、8、9或更多個鋅指結構)，且可經設計而結合任一基因組序列。因此，藉由鑑別一期望發生裂解或重組之目標靶基因組區域，可根據本文所揭示方法，構建一或多個包含一裂解結構域(或裂解半結構域)及一經設計以識別處於該基因組區域中之靶序列之鋅指結構域的融合蛋白。此一融合蛋白(多種蛋白)在細胞中之存在會導致該(等)融合蛋白與其結合位點結合及在該基因組區域內部或附近發生裂解。此外，若在此細胞中亦存在與該基因組區域同源之外源性多核苷酸，則在該基因組區域與該外源性多核苷酸之間會以較高速率發生同源重組。
概述
除非另外指明，該等方法之實施以及本文所揭示組合物之製備及利用可使用熟習此項技術者所掌握的分子生物學、生物化學、染色質構造及分析、計算化學、細胞培養、重組DNA及相關領域中之習用技術。本文獻中對該等技術進行了充分闡釋。參見(例如)Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989及第三版,2001；Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,New York,1987及定期更新資料；系列METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,第三版,Academic Press,San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY,第304卷,"Chromatin"(P.M.Wassarman及A.P.Wolffe編輯),Academic Press,San Diego,1999；及METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第119卷,"Chromatin Protocols"(P.B.Becker編輯)Humana Press,Totowa,1999。
定義
術語"核酸"、"多核苷酸"及"寡核苷酸"可互換使用，並指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，其係線形構象或環形構象且呈單鏈或雙鏈形式。就本揭示內容而言，不可將該等術語理解為對聚合物之長度加以限制。該等術語可涵蓋已知的天然核苷酸以及在鹼基、糖及/或磷酸酯部分(例如硫代磷酸酯骨架)中經修飾之核苷酸。一般而言，一特定核苷酸之類似物具有相同的鹼基配對特異性；即，A之類似物應與T進行鹼基配對。
術語"多肽"、"肽"及"蛋白質"可互換地用於指胺基酸殘基之聚合物。該術語亦適用於其中一或多個胺基酸係一相應天然產生胺基酸之化學類似物或經修飾衍生物之胺基酸聚合物。
"結合"指介於大分子之間(例如介於蛋白質與核酸之間)之序列特異性的非共價相互作用。並非一結合相互作用之所有組件皆需具有序列特異性(例如在DNA骨架中與磷酸殘基接觸)，只要該相互作用總體上具有序列特異性即可。此等相互作用通常藉由一10－6 M－1 或更低之離解常數(Kd )來表徵。"親和力"指結合強度：增強的結合親和力與更低的Kd 有關。
"結合蛋白質"係能夠非共價地結合至另一分子之蛋白質。結合蛋白質可結合至(例如)DNA分子(DNA結合蛋白)、RNA分子(RNA結合蛋白)及/或蛋白質分子(蛋白質結合蛋白)。當為蛋白質結合蛋白時，其可結合至自身(以形成同二聚體、同三聚體等)及/或其可結合至一不同蛋白質或多種蛋白質之一或多種分子。結合蛋白質可具有一種以上類型之結合活性。舉例而言，鋅指蛋白質具有DNA結合、RNA結合及蛋白結合活性。
"鋅指DNA結合蛋白"(或結合結構域)係可經由一或多個鋅指結構以序列特異性方式結合DNA之蛋白質或位於較大蛋白質中之結構域，其係處於結構係經由鋅離子之配位而穩定之結合結構域中的胺基酸序列之區域。術語鋅指DNA結合蛋白經常縮寫為鋅指蛋白或ZFP。
鋅指結合結構域可"經設計"以結合預定核苷酸序列。設計鋅指蛋白之方法之非限制性實例係繪製及選擇。繪製的鋅指蛋白係非天然產生蛋白，其圖樣/構成主要由合理標準產生。用於設計之合理標準包括應用替代法則及計算機算法來處理存於儲存現有ZFP圖樣及結合數據信息之數據庫中的信息。參見(例如)美國專利第6,140,081號；第6,453,242號；第6,534,261號；及第6,785,613號；亦參見WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536及WO 03/016496；及美國專利第6,746,838號；第6,866,997號；及第7,030,215號。
"經選擇"鋅指蛋白係在自然界中未發現的蛋白質，其主要係由實驗方法(例如噬菌體展示、相互捕獲或雜交體選擇法)產生。參見(例如)美國專利第5,789,538號；第5,925,523號；第6,007,988號；第6,013,453號；第6,200,759號；第6,733,970號；第RE39,229號；及WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197及WO 02/099084。
術語"序列"指任一長度之核苷酸序列，其可係DNA或RNA；可係線形的、環形的或具支鏈的且可單鏈的或雙鏈的。術語"供體序列"指插入一基因組之核苷酸序列。供體序列可具有任何長度，例如長度介於2及25,000核苷酸之間(或任何介於期間或高於其之整數值)、較佳長度介於約100及5,000核苷酸之間(或任何介於期間之整數)、更佳長度介於約200及2,500核苷酸之間。
"同源序列"指一與一第二序列享有一定程度之序列一致性之第一序列，且其序列可該第二序列之序列相同。"同源、非相同序列"指一雖與一第二序列享有一定程度之一致性但其序列與該第二序列之序列不完全相同之第一序列。舉例而言，一包含一突變型基因之野生型序列之多核苷酸與該突變基因之序列係同源而非相同的。在某些實施例中，介於兩序列之間之同源性程度足以容許兩者之間之同源重組(利用正常細胞機制)。兩同源但非相同序列可具有任何長度且其非同源之程度可小至一個單核苷酸(例如，對於藉由定向同源重組來修正一基因組點突變)或大至10千鹼基或更大(例如，對於在一染色體內在一預定位點插入一基因)。兩包含同源但非相同序列之多核苷酸不必具有相同長度。舉例而言，可使用一介於20與10,000核苷酸或核苷酸對之間的外源性多核苷酸(即供體多核苷酸)。
用於測定核酸及胺基酸序列一致性之技術已為業內人士所瞭解。通常，此等技術包括：測定一基因之mRNA的核苷酸序列及/或測定由此編碼之胺基酸序列，並將該等序列與一第二核苷酸或胺基酸序列進行比較。基因組序列亦可以此方式進行測定及比較。
一般而言，一致性分別指兩個多核苷酸或多肽序列之正確的核苷酸－對－核苷酸或胺基酸－對－胺基酸的對應性。兩或更多序列(多核苷酸或胺基酸)可藉由測定其百分比一致性來進行比較。兩序列之百分比一致性(無論是核酸序列或是胺基酸序列)係介於兩對齊序列間之正確匹配數除以較短序列之長度再乘以100。核酸序列之近似對準可參見Smith及Waterman之局部同源算法，Advances in Applied Mathematics 2：482－489(1981)。此算法可藉由利用Dayhoff之評分矩陣(Atlas of Protein Sequences and Structure ,M.O.Dayhoff編輯，增刊53：353－358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA)並藉由Gribskov(Nucl.Acids Res .14(6)：6745－6763(1986))實施歸一化而應用於胺基酸序列。此測定序列百分比一致性之算法之例示性實施方案由Genetics Computer Group(Madison,WI)於"BestFit"實用應用程式中提供。此方法之缺省參數闡述於Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual,第8版(1995)(可得自Genetics Computer Group,Madison,WI)。在本揭示內容之上下文中確定百分比一致性之較佳方法係使用由愛丁堡大學(University of Edinburgh)享有版權、由John F.Collins及Shane S.Sturrok開發並由IntelliGenetics公司(Mountain View,CA)經銷的MPSRCH程式包。藉由此程式包可採用Smith－Waterman算法，其中對於評分表使用缺省參數(例如，空位開放罰分為12，空位擴展罰分為1，且空隙為6)。自所產生數據之"匹配"值可反映出序列一致性。用於計算序列間百分比一致性及相似性之其他適宜程式通常為業內人士所瞭解，舉例而言，另一對準程式為BLAST，以缺省參數使用。舉例而言，BLASTN及LASTP可利用以下缺省參數進行使用：遺傳密碼＝標準；篩選＝無；鏈＝兩鏈；截止＝60；預期＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述＝50序列；分類依據＝高分；數據庫＝非重複，GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS翻譯庫＋Swiss蛋白＋Spupdate＋PIR。關於該等程式之詳細內容於因特網上查詢得到。關於本文所述序列，期望程度之序列一致性之範圍係約35%至100%及介於其間之任一整數值。通常，序列間百分比一致性係至少35%－40%；40%－45%；45%－50%；50%－60%；60%－70%；70－75%，較佳係80－82%，更佳係85－90%，甚至更佳係92%、仍更佳係95%，且最佳係98%序列一致性。
或者，多核苷酸之間序列相似性之程度可藉由下述加以測定：在容許同源區域之間形成穩定雙聯體之條件下進行多核苷酸雜交，隨後藉由利用單鏈特異性核酸酶實施消化，並對經消化片段之大小進行測定。如利用上文方法所測定，當兩核酸序列(或兩多肽序列)在分子之一經界定長度上顯示至少約70%－75%、較佳80%－82%、更佳85%－90%、甚至更佳92%、仍更佳95%、且最佳98%之序列一致性時，則該等序列係實質上同源的。如本文所用，實質上同源亦指顯示與一特定DNA或多肽序列之完全一致性之序列。實質上同源之DNA序列可在南方(Southern)雜交試驗中於(例如)嚴格條件下(如針對彼特定系統所界定)加以識別。界定適宜雜交條件可由業內熟練的技術人員實施。參見(例如)Sambrook等人，上文；Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach ,編輯B.D.Hames及S.J.Higgins,(1985)Oxford；Washington,DC；IRL Press。
兩核酸片段之選擇性雜交可按下述進行測定。兩核酸分子間序列一致性之程度會影響該等分子間雜交事件之效率及強度。部分一致性核酸序列會至少部分地抑制一完全一致性序列至一靶分子之雜交。對完全一致性序列之雜交的抑制可利用業內熟知雜交分析法(例如南方(DNA)印跡法、北方(Northern)(RNA)印跡法、溶液雜交法、或諸如此類，參見Sambrook等人之Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 第二版,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)進行評價。此等分析法可利用多種程度之選擇性(例如利用嚴格性自低至高變化的條件)來實施。若採用低嚴格度之條件，非特異性結合之缺失可藉由使用缺少甚至部分程度之序列一致性之輔探針(例如與該靶分子具有小於約30%序列一致性之探針)來評價，如此，在不存在非特異性結合事件之情況下，該輔探針應不與靶對象結合。
當利用一基於雜交的檢測系統時，選擇一與參照核酸序列互補的核酸探針，並隨後藉由選擇恰當的條件使該探針與參照序列選擇性地相互雜交或結合而形成雙鏈分子。一能夠在適度嚴格之雜交條件下選擇性地與一參照序列雜交之核酸分子通常可在容許檢測具有至少約10－14核苷酸之長度且與所選核酸探針序列具有至少約70%序列一致性的靶核酸序列之條件下發生雜交。嚴格雜交條件通常容許檢測具有至少約10－14核苷酸之長度且與所選核酸探針序列具有大於約90－95%之序列一致性的靶核酸序列。可用於探針/參照序列雜交之雜交條件(其中探針及雜交序列具有特定程度之序列一致性)可按業內已知方法進行測定(參見(例如)Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach ,編輯B.D.Hames及S.J.Higgins,(1985)Oxford；Washington,DC；IRL Press)。
雜交條件為彼等業內熟練技術人員所熟知。雜交嚴格性指雜交條件不利於包含不匹配核苷酸之雜交體之形成的程度，其中較高嚴格性與一較低的對不匹配雜交體之容許限度相關聯。影響雜交嚴格性之因素為彼等業內熟練技術人員所熟知並包括(但不限於)溫度、pH值、離子強度、及有機溶劑(例如甲醯胺及二甲基亞碸)之濃度。如彼等業內熟練技術人員所瞭解，雜交嚴格性可藉助較高溫度、較低離子強度及較低溶劑濃度而增加。
關於雜交之嚴格性條件，業內皆熟知，可採用許多等效條件來建立一特定嚴格性，例如，藉由改變(例如)以下因素而實現：序列之長度及性質、各種序列之鹼基組成、鹽及其他雜交溶液組份之濃度、雜交溶液中阻斷劑(例如硫酸葡聚糖及聚乙二醇)之存在或不存在、雜交反應溫度及時間參數、及洗滌條件。對一特定組之雜交條件之選擇係依照業內標準方法進行選擇(參見(例如)Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual ,第二版，(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)。
"重組"指兩多核苷酸之間的遺傳信息交換過程。就本揭示內容而言，"同源重組(HR)"指可(例如)在細胞內雙鍵斷裂之修復期間發生的此交換之特定形式。此過程需要核苷酸序列同源性，利用"供體"分子作為"靶"分子(即經受了雙鏈斷裂者)修復之模板，且在不同情況下稱為"非交換型基因轉變"或"短道基因轉變"，此乃因其可達成遺傳信息自供體至靶對象之轉移。不欲受任何特定理論限制，此傳遞可能包括在斷裂的靶對象及供體之間形成的異源雙鏈DNA之不匹配修正，及/或"合成依賴性鏈退火"，其中該供體係用於再合成將變成靶對象之部分的遺傳信息，及/或相關過程。此特定的HR經常導致靶分子之序列的改變，如此將供體多核苷酸之序列的部分或全部納入靶多核苷酸中。
"裂解"指DNA分子之共價主鏈的斷裂。裂解可由多種方法起始，該等方法包括(但不限於)磷酸二酯鍵之酶水解或化學水解。單鏈裂解及雙鏈裂解皆係可能的，且雙鏈裂解可作為兩特殊的單鏈裂解事件之結果而發生。DNA裂解可導致產生鈍端或交錯端。在某些實施例中，融合多肽係用於定向的雙鏈DNA裂解。
"裂解結構域"包含一或多個多肽序列，其擁有針對DNA裂解之催化活性。裂解結構域可包含於一單個多肽鏈中，或裂解活性可由兩(或更多)個多肽之締合而產生。
"裂解半結構域"係一與一第二多肽序列(可相同或不同)相結合可形成一具有裂解活性(較佳係雙鏈裂解活性)之複合物的多肽序列。
"染色質"係包含細胞基因組之核蛋白結構。細胞染色質包含核酸、主要DNA、及蛋白質(包括組蛋白及非組蛋白染色體蛋白質)。大多數真核生物細胞染色質呈核小體形式存在，其中核小體核心包含與八聚體聯合的約150個DNA鹼基對，該八聚體包含各兩個組蛋白H2A、H2B、H3及H4；且連接DNA(具有可端視有機體而變化之長度)於核小體核心之間延伸。組蛋白H1之分子通常與連接DNA相關聯。就本揭示內容而言，術語"染色質"意欲涵蓋所有類型之細胞核蛋白(包括原核的及真核的)。細胞染色質包括染色體染色質及游離型染色質。
"染色體"係包含細胞基因組之全部或部分的染色質複合物。細胞基因組經常藉由其核型來表徵，核型係包含細胞基因組之所有染色體之集合。細胞基因組可包含一或多條染色體。
"游離基因"係複製的核酸、核蛋白複合物或包含核酸之其他結構，其並非細胞染色體核型之部分。游離基因之實例包括質粒及某些病毒基因組。
"易接近區"係一細胞染色質內位點，其中一存於核酸中之靶位點可由一可識別該靶位點之外源性分子結合。非欲受限於任何特定理論，據認為，易接近區係未封裝至核小體結構中之區域。可接近區之獨特結構通常可藉由其對於化學探針及酶探針(例如核酸酶)之敏感性加以檢測。
"靶位點"或"靶序列"係可界定一結合分子將與之結合(前提條件係存在充分的結合條件)之核酸之部分的核酸序列。舉例而言，序列5'－GAATTC－3'係Eco RI限制性核酸內切酶之靶位點。
"外源性"分子係通常不存在於細胞中但可藉由一或多種遺傳方法、生物化學方法或其他方法引入細胞中之分子。"正常存於細胞中"係關於細胞之特定發育階段及環境條件而進行確定。因此(例如)，就成體肌肉細胞而論，僅在肌肉之胚胎發育期間的存在的分子係外源性分子。同樣，就非熱休克細胞而論，藉由熱休克誘導之分子係外源性分子。外源性分子可包含(例如)功能不良內源性分子之作用型式或正常功能內源性分子之功能不良型式。
外源性分子可尤其係小分子(例如藉由組合化學方法生成)或大分子，例如蛋白質、核酸、糖類、脂質、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子之任何經改良衍生物、或任何包含一或多種上述分子之複合物。核酸包括DNA及RNA，可為單鏈的或雙鏈的；可為線形的、具分支的或環形的；且可具有任何長度。核酸包括能夠形成二倍體之彼等、以及形成三倍體之核酸。參見(例如)美國專利第5,176,996號及第5,422,251號。蛋白質包括(但不限於)：DNA－結合蛋白、轉錄因子、染色質重構因子、甲基化的DNA結合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脫甲基酶、乙醯酯酶、脫乙醯基酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓撲異構酶、促旋酶及解螺旋酶。
外源性分子可係與內源性分子相同之類型的分子，例如一外源性蛋白質或核酸。舉例而言，外源性核酸可包含感染病毒基因組、根瘤土壤桿菌(Agrogacterium tumefacians )T－鏈、引入細胞內之質粒或游離基因、或通常不存在於細胞內之染色體。將外源性分子引入細胞中之方法為彼等業內熟練技術人員所瞭解，並包括(但不限於)脂質介導的轉移(即脂質體，包括中性脂質及陽離子脂質)、電穿孔、直接注射、細胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣協同沉澱、DEAE葡聚糖介導的轉移及病毒載體介導的轉移。
相比較而言，"內源性"分子係在特定環境條件下正常存於處於特定發育階段之特定細胞中之分子。舉例而言，內源性核酸可包括一染色體、一線粒體、葉綠體或其他細胞器之基因組、或一天然產生的游離型核酸。另外的內源性分子可包括蛋白質(例如轉錄因子及酵素)。
"融合"分子係一其中兩或更多個亞單位分子(較佳共價地)相連接之分子。亞單位分子可係相同化學類型之分子，或可係不同化學類型之分子。第一類型之融合分子之實例包括(但不限於)：融合蛋白(例如一介於ZFP DNA－結合結構域與裂解結構域之間的融合物)及融合核酸(例如編碼上述融合蛋白之核酸)。第二類型之融合分子之實例包括(但不限於)：介於形成三倍體之核酸與多肽之間的融合物及介於小溝黏結劑與核酸之間的融合物。
融合蛋白於細胞中之表現可由該融合蛋白向該細胞之遞送而引起，或可藉由一編碼該融合蛋白之多核苷酸向細胞之遞送而引起，其中該多核苷酸經轉錄，且該轉錄物經轉譯，而產生了該融合蛋白。分子間拼接、多肽裂解及多肽連接作用亦與蛋白質於細胞中之表現有關。本發明其他部分呈現用以將多核苷酸及多肽傳遞至細胞之方法。
就本發明內容而言，"基因"包括編碼基因產物(參見下文)之DNA區，以及所有調節基因產物產生之DNA區，無論是否此等調節序列接近於編碼序列及/或經轉錄序列。因此，基因可包括(但不限於)：啟動子序列、終止子、翻譯調控序列(例如核糖體結合位點及內部核糖體進入位點)、增強子、沉寂子、隔離子、邊界元件、複製起點、核基質結合位點及基因座控制區。
"基因表現"係指將包含於基因內之信息轉換成基因產物。基因產物可為基因之直接轉錄產物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核酶、結構RNA或任一其他類型之RNA)或一藉由mRNA之轉譯而產生的蛋白質。基因產物亦包括藉由諸如加帽、聚腺苷酸化作用、甲基化、及編輯等過程加以修飾的RNA及藉由(例如)甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、ADP－核糖基化、十四烷基化、及糖基化加以修飾的蛋白質。
基因表現之"調節"指基因活性之改變。調節表現作用包括(但不限於)：基因激活及基因阻遏。
"植物"細胞包括(但不限於)：單子葉植物(monocots)或雙子葉植物(dicots)的細胞。單子葉植物之非限制性實例包括穀物類植物，例如玉米、稻米、大麥、燕麥、小麥、高粱、黑麥、甘蔗、菠蘿、洋蔥、香蕉、及椰子。雙子葉植物之非限制性實例包括煙草、番茄、向日葵、棉花、甜菜、馬鈴薯、萵苣、甜瓜、大豆、油菜(油菜籽)、及苜蓿。植物細胞可取自任一植物部分及/或取自任一植物發育階段。
"目標區域"為期望將外源性分子結合於其中之任一細胞染色質區，例如基因或位於基因內部或與基因相鄰之非編碼序列。結合之目的可能係定向DNA裂解及/或定向重組。舉例而言，目標區域可存於染色體、游離基因、細胞器基因組(例如線粒體基因組，葉綠體)、或感染病毒基因組中。目標區域可位於基因編碼區中，位於經轉錄非編碼區(例如前導序列、尾隨序列或內含子)中、或位於非經轉錄區(編碼區之上游或下游)中。目標區域之長度可小至單個核苷酸對或大至25,000核苷酸對，或任何整數值個核苷酸對。
術語"有效鏈接"及"以有效方式連接"(或"以可操作方式連接")在提及兩或更多個組件(例如序列單元)之對合時可互換使用，其中該等組件之排列可使各組件正常地起作用並能使該等組件中之至少一個可介導施加於至少一個其他組件的功能。舉例而言，若一轉錄調節序列可根據一或多種轉錄調節因子之存在或不存在控制一編碼序列之轉錄水平，則該轉錄調節序列(例如啟動子)係以有效方式連接至該編碼序列。一轉錄調節順序通常係以有效方式呈順式與一編碼序列連接，但不必與之直接相鄰。舉例而言，一增強子為一以有效方式連接至一編碼序列之轉錄調節序列，即使其並不鄰接。
關於融合多肽，術語"以有效方式連接"可指如下事實：各組件可執行與若其未如此鏈接其所應執行功能相同的在與其他組件之鏈接中的功能。舉例而言，關於一融合多肽(其中ZFP DNA－結合結構域係融合至一裂解結構域)，若(在該融合多肽中)該ZFP DNA－結合結構域部分能夠結合其靶位點及/或其結合位點，同時該裂解結構域能夠裂解位於靶位點附近的DNA，則該ZFP DNA－結合結構域與該裂解結構域係處於有效鏈接中。
蛋白質、多肽或核酸之"功能性片段"係其序列不等同於全長型蛋白質、多肽或核酸但可保持與全長型蛋白質、多肽或核酸相同之功能的蛋白質、多肽或核酸。功能性片段可具有較相應的天然分子更多、更少、或與之相同之數目的殘基，及/或可包含一或多種胺基酸或核苷酸取代基。用於測定核酸功能之方法(例如編碼功能、與另一核酸雜交之能力)為來內所熟知。同樣，測定蛋白質功能之方法變為吾人所熟知。舉例而言，多肽之DNA－結合功能可(例如)藉由濾膜結合試驗、電泳遷移率－移位試驗、或免疫沉澱分析測定。DNA裂解可藉由凝膠電泳法進行分析。參見Ausubel等人，上文。一蛋白質與另一蛋白質相互作用之能力可(例如)藉由免疫共沉澱、雙雜交分析或互補作用(包括基因的及生物化學的)進行測定。參見(例如)Fields等人(1989)Nature 340：245－246；美國專利第5,585,245號及PCT WO 98/44350。
靶位點
所揭示方法及組合物包括包含一裂解結構域(或一裂解半結構域)及一鋅指結構域之融合蛋白，其中該鋅指結構域藉由與位於細胞染色質中之序列(例如靶位點或結合位點)結合可引導裂解結構域(或裂解半結構域)之活性至該序列之鄰近處並因此可導致該靶序列之鄰近處的裂解。如在本揭示內容之其他部分所給出，鋅指結構域可經設計而結合實質上任何期望序列。因此，當鑑別一包含期望裂解或重組之序列之目標區域後，可設計一或多個鋅指結合結構域來結合目標區域中之一或多個序列。在細胞內，包含一鋅指結合結構域及一裂解結構域(或具有兩融合蛋白，各包含一鋅指結合結構域及一裂解半結構域)之融合蛋白之表現可影響目標區域中之裂解。
對藉由一鋅指結構域結合的位於細胞染色質中之序列(例如靶位點)之選擇可(例如)根據共同擁有之美國專利第6,453,242號(2002年9月17日)中所揭示方法來實現，該專利亦揭示設計與一擇定序列結合之ZFP的方法。彼等業內熟練的技術人員應清楚地瞭解，亦可利用對核酸序列之單純目檢法來選擇靶位點。因此，用於靶位點選擇之任何方法皆可用於所要求之方法中。
靶位點通常由複數個相鄰的靶亞位點組成。靶亞位點指藉由單鋅指結合的序列(通常係核苷酸三聯體，或可藉助一核苷酸與相鄰四聯體重疊的核苷酸四聯體)。參見(例如)WO 02/077227。若一鋅指蛋白最多接觸之鏈被指定為靶鏈"主要識別鏈"或"主要接觸鏈"，則一些鋅指蛋白可結合至該靶鏈中之三鹼基三聯體及非靶鏈上之第四鹼基。靶位點通常具有一至少9個核苷酸之長度並由一包含至少三個鋅指結構之鋅指結合結構域結合。然而，(例如)4－指結合結構域至12－核苷酸靶位點之結合、5－指結合結構域至15－核苷酸靶位點之結合或6－指結合結構域至18－核苷酸靶位點之結合亦係可能的。如應清楚地瞭解，更大結合結構域(例如7－、8－、9－指及更多指)至更長靶位點之結合亦係可能的。
對於一靶位點而言，不必係大量三核苷酸。舉例而言，在其中發生交錯鏈相互作用之情況中(參見(例如)美國專利第6,453,242號及WO 02/077227)，多鋅指結合結構域之一或多個單獨鋅指可結合至重疊四聯體亞位點。結果，三指蛋白可結合一10－核苷酸序列，其中第十核苷酸係一藉由一末端指結合之四聯體之部分，四指蛋白可結合一13－核苷酸序列，其中第十三核苷酸係一藉由末端指結合之四聯體之部分，等等。
在多指結合結構域中介於單獨鋅指之間的胺基酸連接體序列之長度及性質亦可影響至靶序列之結合。舉例而言，在多指結合結構域中介於相鄰鋅指之間的所謂"非典型連接體"、"長連接體"或"有結構的連接體"之存在可容許彼等指結合不直接相鄰的亞位點。此等連接體之非限制性實例闡述於(例如)美國專利第6,479,626號及WO 01/53480中。因此，在鋅指結合結構域之靶位點中，一或多個亞位點可藉由1、2、3、4、5或更多個核苷酸而相互分開。僅為提供一實例，四指結合結構域可結合至一包含(順次)兩鄰接3－核苷酸亞位點、一插入核苷酸、及兩鄰接三聯體亞位點之13－核苷酸靶位點。
序列(例如靶位點)間距指插入兩序列之間的核苷酸或核苷酸對之數目，自彼此最接近之序列邊緣量測。
在某些實施例(其中裂解取決於兩鋅指結構域/裂解半結構域融合分子至分離的靶位點之結合)中，該等兩個靶位點可處於相對的DNA鏈上。在其他實施例中，兩靶位點皆位於相同的DNA鏈上。
鋅指結合結構域
鋅指結合結構域包含一或多個鋅指。Miller等人(1985)EMBO J .4：1609－1614；Rhodes(1993)Scientific American 二月：56－65；美國專利第6,453,242號。通常，單個鋅指結構域為約30胺基酸長。結構研究已經證明，各鋅指結構域(基序)包含兩β折疊(容納於一包含兩不變半胱胺酸殘基之β轉角中)及一α螺旋(包含兩個不變組胺酸殘基)，其經由鋅原子之配位作用藉由兩個半胱胺酸及兩個組胺酸保持特定構象。
鋅指包括典型C2 H2 鋅指(即彼等其中鋅離子係由兩半胱胺酸殘基及兩組胺酸殘基配位者)及非典型鋅指，例如C3 H鋅指(彼等其中鋅離子係由三個半胱胺酸殘基及一個組胺酸殘基配位者)及C4 鋅指(彼等其中鋅離子係由四個半胱胺酸殘基配位者)。亦參見WO 02/057293。
鋅指結合結構域可經設計而結合至選擇序列。參見(例如)Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20：135－141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313－340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19：656－660；Segal等人(2001)Curr .Opin .Biotechnol .12：632－637；Choo等人(2000)Curr .Opin .Struct .Biol .10：411－416。與天然產生之鋅指蛋白相比較，經設計鋅指結合結構域可具有一新穎的結合特異性。設計方法包括(但不限於)合理設計及多種類型之選擇。合理設計包括(例如)利用包含三聯體(或四聯體)核苷酸序列及單獨鋅指胺基酸序列之數據庫，其中各三聯體或四聯體核苷酸序列與一或多個可結合特定三聯體或四聯體序列之鋅指胺基酸序列相關聯。參見(例如)共同擁有之美國專利第6,453,242號及第6,534,261號。其他設計方法揭示於(例如)美國專利第6,746,838號；第6,785,613號；第6,866,997號；及第7,030,215號。
例示性選擇方法(包括噬菌體展示及雙雜交系統)揭示於美國專利第5,789,538號；第5,925,523號；第6,007,988號；第6,013,453號；第6,410,248號；第6,140,466號；第6,200,759號；及第6,242,568號；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197及GB 2,338,237中。
對鋅指結合結構域之結合特異性之增強已於(例如)共同擁有之美國專利第6,794,136號中加以闡述。
由於單獨鋅指可結合至三核苷酸(即三聯體)序列(或可藉助一核苷酸與相鄰鋅指之四核苷酸結合位點重疊之四核苷酸序列)，鋅指結合結構域經設計以便結合之序列(例如靶序列)的長度將決定經設計鋅指結合結構域中之鋅指數目。舉例而言，對於其中鋅指基序不結合至重疊亞位點之ZFP而言，六核苷酸靶序列係由兩鋅指結合結構域結合；九核苷酸靶序列係由三指結合結構域結合，等等。如本文所提醒，在多指結合結構域中，端視鋅指間胺基酸序列(即指間連接體)之長度及性質，靶位點中單獨鋅指之結合位點(即亞位點)不必相鄰接，但可由一或多個核苷酸隔開。
在多指鋅指結合結構域中，相鄰鋅指可藉由約5個胺基酸之胺基酸連接體序列(所謂"典型的"指間連接體)隔開或(另一選擇為)藉由一或多個非典型連接體隔開。參見(例如)共同擁有之美國專利第6,453,242號及第6,534,261號。對於包含三個以上鋅指之經設計鋅指結合結構域，介於某些鋅指間之較長("非典型的")指間連接體之插入可能係較佳的，因為其可增強藉由該結合結構域之結合的親和力及/或特異性。參見(例如)美國專利第6,479,626號及WO 01/53480。因此，多指鋅指結合結構域亦可在非典型指間連接體之存在及位置方面進行表徵。舉例而言，一包含三指(由兩典型指間連接體連接)、長連接體及另外三指(由兩典型指間連接體連接)之六指鋅指結合結構域可表示為2×3構型。同樣，一包含兩指(一典型連接體介於基間)、長連接體及另外兩指(由典型連接體連接)之結合結構域可表示為2×2蛋白。一包含三個兩指單元(在各兩指單元中兩指皆藉由一典型連接體連接)且其中各兩指單元係藉由長連接體連接至相鄰兩指之蛋白稱為3×2蛋白。
在多指結合結構域中兩相鄰鋅指間一長的或非典型的指間連接體之存在通常容許該兩指結合至靶序列中不直接鄰接的亞位點。因此，在一靶位點中於亞位點間可能存在包括一或多個核苷酸之缺口；即，一靶位點可包含一或多個未由一鋅指接觸的核苷酸。舉例而言，一2×2鋅指結合結構域可結合至兩個由一核苷酸隔開的六核苷酸序列，即，其可結合至一13個核苷酸之靶位點。亦參見Moore等人(2001a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1432－1436；Moore等人(2001b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1437－1441及WO 01/53480。
如上文所提及，一靶亞位點係一由一單獨鋅指結合的三核苷酸序列或四核苷酸序列。為某些目的，一兩指單元可表示為一結合模組。一結合模組可藉由(例如)在可結合一特定六核苷酸靶序列之多指蛋白(通常係三指)之背景中針對兩相鄰指進行選擇而獲得。或者，模組可藉由單獨鋅指之組裝而構建。亦參見WO 98/53057及WO 01/53480。
裂解結構域
本文所揭示融合蛋白之裂解結構域部分可自任何內切核酸酶或外切核酸酶獲得。可自其得到一裂解結構域之例示性內切核酸酶包括(但不限於)限制性內切酶及歸巢內切核酸酶。參見(例如)2002－2003 Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA；及Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379－3388。可裂解DNA之其他酵素係已知酵素(例如核酸酶S1；綠豆核酸酶；胰脫氧核糖核酸酶I；微球菌核酸酶；酵母HO內切核酸酶；亦參見Linn等人(編輯)Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。一或多種該等酵素(或其功能性片段)可用作裂解結構域及裂解半結構域之來源。
同樣，一裂解半結構域(例如包含一鋅指結合結構域及一裂解半結構域之融合蛋白)可自任何核酸酶或其部分獲得，如上文所給出，此需要針對裂解活性之二聚作用。一般而言，若融合蛋白包含裂解半結構域，則對於裂解而言需要兩個融合蛋白。或者，可使用一包含兩裂解半結構域之單獨蛋白質。兩裂解半結構域可自相同內切核酸酶(或其功能性片段)得到，或各裂解半結構域可自不同內切核酸酶(或其功能性片段)得到。另外，較佳對兩融合蛋白之靶位點進行彼此相關地排列以便兩融合蛋白至其各自靶位點之結合可將裂解半結構域置於彼此之容許該等裂解半結構域(例如)藉由二聚化形成一功能性裂解結構域之空間方位中。因此，在某些實施例中，靶位點之靠近邊緣係藉由5－8個核苷酸或藉由15－18個核苷酸隔開。然而，任何整數個核苷酸或核苷酸對可插入兩靶位點間(例如自2至50個核苷酸或更多)。一般而言，裂解位點位於靶位點之間。
限制性內切核酸酶(限制酵素(restriction enzymes))在許多物種中存在並能夠序列特異性地結合至DNA(在識別位點處)，及在結合位點處及接近於結合位點處裂解DNA。某些限制性內切酶(例如IIS型)可在自識別位點移除之位點處裂解DNA，且具有可分離的結合及裂解結構域。舉例而言，IIS型酵素Fok I可在一條鏈上自其識別位點9個核苷酸處及在另一條鏈上自其識別位點13個核苷酸處催化DNA之雙鏈裂解。參見(例如)美國專利第5,356,802號；第5,436,150號及第5,487,994號；以及Li等人(1992)Proc .Natl Acad .Sci .USA 89：4275－4279；Li等人(1993)Proc .Natl .Acad .Sci .USA 90：2764－2768；Kim等人(1994a)Proc .Natl .Acad .Sci .USA 91：883－887；Kim等人(1994b)J .Biol .Chem .269：31,978－31,982。因此，在一實施例中，融合蛋白包含來自至少一IIS型限制酵素及一或多個鋅指結合結構域之裂解結構域(或裂解半結構域)，其可係經設計的或未經設計的。
一例示性IIS型限制酵素(其裂解結構域可自結合結構域分離)係FokI。此特定酵素作為二聚體具有活性。Bitinaite等人(1998)Proc .Natl .Acad .Sci .USA 95：10,570－10,575。因此，就本揭示內容而言，在所揭示融合蛋白中所用FokI酵素之部分據認為係裂解半結構域。因此，對於利用鋅指－FokI融合物之對細胞序列之定向雙鏈裂解及/或定向置換，可利用兩融合蛋白(各包含一FokI裂解半結構域)重新構成一具催化活性的裂解結構域。或者，亦可使用包含鋅指結合結構域及兩個FokI裂解半結構域之單獨多肽分子。利用鋅指FokI融合物定向裂解及定向序列改變之參數於本揭示內容之別處提供。
裂解結構域或裂解半結構域可係保持裂解活性、或保持形成功能性裂解結構域之多聚化(例如二聚化)能力之任何蛋白質部分。
例示性IIS型限制酵素列示於表1中。其他限制酵素亦包含可分離之結合及裂解結構域，且該等皆涵蓋於本揭示內容中。參見(例如)Roberts等人(2003)Nucleic Acids Res.31：418－420。
鋅指結構域－裂解結構域融合物
設計及構建融合蛋白(及編碼其之多核苷酸)之方法為彼等業內熟練技術人員所瞭解。舉例而言，設計及構建包含鋅指蛋白(及編碼其之多核苷酸)之方法闡述於共同擁有之美國專利第6,453,242號及第6,534,261號中。在某些實施例中，構建了編碼此等融合蛋白之多核苷酸。該等多核苷酸可插入一載體且可將該載體引入一細胞中，關於將多核苷酸引入細胞之載體及方法的其他揭示內容可參見下文。
在本文所述方法之某些實施例中，一融合蛋白包含來自FokI限制酵素之一鋅指結合結構域及一裂解半結構域，且兩此類融合蛋白皆於一細胞中表現。兩融合蛋白於一細胞中之表現可由兩種蛋白質至該細胞中之遞送；一蛋白質及一編碼該等蛋白質之一之核酸向該細胞中之遞送；兩各編碼該等蛋白質之一之核酸向該細胞中之遞送；或由編碼全部兩種蛋白質之單獨核酸向該細胞中之遞送引起。在其他實施例中，一融合蛋白包含一包含兩裂解半結構域及一鋅指結合結構域之單獨多肽鏈。在此情況下，一單獨融合蛋白於一細胞中進行表現且(不欲受理論限制)據認為會因形成裂解半結構域之分子內二體而裂解DNA。
在某些實施例中，對融合蛋白之組件(例如ZFP－FokI融合物)進行排列以便鋅指結構域最接近於融合蛋白之胺基末端，且裂解半結構域最接近羧基末端。此可映出裂解結構域在天然產生之二聚化裂解結構域(例如自FokI酵素獲得之彼等)中之相對方位，其中DNA－結合結構域最接近胺基末端且裂解半結構域最接近羧基末端。在該等實施例中，為形成功能性核酸而發生的裂解半結構域之二聚化作用係藉由融合蛋白至位於相對DNA鏈上之位點的結合(其中結合位點之5'端係彼此接近)引起。
在其他實施例中，對融合蛋白之組件(例如ZFP－FokI融合物)進行排列以便裂解半結構域最接近融合蛋白之胺基末端且鋅指結構域最接近於羧基末端。在該等實施例中，為形成功能性核酸而發生的裂解半結構域之二聚化作用係藉由融合蛋白至位於相對DNA鏈上之位點的結合(其中結合位點之3'端係彼此接近)引起。
於再一實施例中，一第一融合蛋白包含最接近融合蛋白之胺基末端的裂解半結構域，及最接近羧基末端之鋅指結構域，且對一第二融合蛋白進行排列以便該鋅指結構域最接近融合蛋白之胺基末端，且該裂解半結構域最接近羧基末端。在該等實施例中，兩融合蛋白皆結合至相同的DNA鏈，其中包含最接近羧基末端之鋅指結構域之第一融合蛋白之結合位點位於包含最接近胺基末端之鋅指結構域之第二融合蛋白之結合位點的5'側。
在某些實施例中，所揭示融合蛋白介於鋅指結構域與裂解結構域(或裂解半結構域)之間的胺基酸序列表示為"ZC連接體"。ZC連接體係為了與上文所計論之指間連接體進行區別。關於獲得可最佳化裂解之ZC連接體之詳細內容，參見(例如)美國專利公開案第20050064474A1號及第20030232410號及國際專利公開案WO 05/084190。
用於定向裂解之方法
所揭示方法及組合物可用於裂解細胞染色質內目標區域處(例如於一突變型或野生型基因組內(例如於一基因內)之期望位點或預定位點處)之DNA。對於此定向DNA裂解，設計一鋅指結合結構域來結合位於預定裂解位點處或其附近的靶位點，並在細胞中表現一包含經設計鋅指結合結構域及一裂解結構域之結合蛋白。當融合蛋白之鋅指部分結合至靶位點後，藉助裂解結構域在該靶位點附近裂解DNA。裂解之確切位點可端視ZC連接體之長度而定。
或者，在細胞中表現兩融合蛋白(各包含一鋅指結合結構域及一裂解半結構域)，並使其結合至以可重建功能性裂解結構域並在靶位點附近處裂解DNA之方式對合的靶位點。在一實施例中，裂解發生於兩鋅指結合結構域之靶位點之間。可設計一個或兩個鋅指結合結構域。
對於定向裂解，使用鋅指結合結構域－裂解結構域融合多肽，結合位點可涵蓋裂解位點，或該結合位點之靠近邊緣可距離裂解位點1、2、3、4、5、6、10、25、50或更多個核苷酸(或介於1與50之間之任一整數值的核苷酸)。結合位點之確切位置(關於結合位點)應取決於特定裂解結構域及ZC連接體之長度。對於其中使用兩融合多肽(各包含一鋅指結合結構域及一裂解半結構域)之方法，結合位點一般跨越裂解位點。因此，第一結合位點之靠近邊緣可係於裂解位點之一側上1、2、3、4、5、6、10、25或更多核苷酸(或任何介於1與50之間之整數個核苷酸)，且第二結合位點之靠近邊緣可係於裂解位點之另一側上1、2、3、4、5、6、10、25或更多核苷酸(或任何介於1與50之間之整數值的核苷酸)。繪製活體外及活體內裂解位點圖之方法為彼等業內熟練技術人員所瞭解。
因此，本文所述可採用一融合至裂解結構域之經設計鋅指結合結構域。在該等情況下，設計結合結構域以結合至一期望於該處或於該處附近發生裂解之靶序列。將融合蛋白(或編碼其之多核苷酸)引入植物細胞。當引入細胞後，或於細胞內經表現後，融合蛋白可結合至靶序列並在該靶序列處或接近該靶序列處進行裂解。確切裂解位點取決於裂解結構域之性質及/或介於結合結構域與裂解結構域之間之連接體序列之存在及/或性質。在其中使用兩融合蛋白(各包含一裂解半結構域)之情況下，介於結合位點之靠近邊緣間之距離可係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25或更多個核苷酸(或介於1與50之間之任一整數值的核苷酸)。裂解之最適水平亦可取決於介於兩融合蛋白之結合位點間之距離(參見例如Smith等人(2000)Nucleic Acids Res .28：3361－3369；Bibikova等人(2001)Mol .Cell .Biol .21：289－297)及各融合蛋白中ZC連接體之長度。亦參見美國專利公開案第20050064474A1號國際專利公開案WO 05/084190、WO 05/014791及WO 03/080809。
在某些實施例中，裂解結構域包含兩裂解半結構域，兩者皆係包含一結合結構域、一第一裂解半結構域及一第二裂解半結構域之單獨多肽之部分。裂解半結構域可具有相同胺基酸序列或不同胺基酸序列，只要其可起到裂解DNA之作用即可。
裂解半結構域亦可呈分離分子之形式提供。舉例而言，可將兩融合多肽引入一細胞中，其中每一多肽包含一結合結構域及一裂解半結構域。裂解半結構域可具有相同胺基酸序列或不同胺基酸序列，只要其可起到裂解DNA之作用即可。此外，結合結構域結合至靶序列－－該等靶序列之排列通常可使當融合多肽結合時兩裂解半結構域出現於容許重建一裂解結構域的彼此之空間方位中(例如藉由半結構域之二聚作用)，藉此相對於彼此地定位該等半結構域以形成功能性裂解結構域，導致目標區域中細胞染色質之裂解。一般而言，藉助重建之裂解結構域之裂解發生於位於兩靶序列之間之位點處。兩蛋白質之一或兩個皆可經設計而與其靶位點結合。
兩融合蛋白可以相同或相反極性在目標區域中結合，且其結合位點(即靶位點)可由任何數目之核苷酸(例如自0至200個核苷酸或任何介於其間之整數值)隔開。在某些實施例中，兩融合蛋白之結合位點(各包含一鋅指結合結構域及一裂解半結構域)可經介於5及18個之間之核苷酸分開(例如經5－8個核苷酸分開、或經15－18個核苷酸分開、或經6個核苷酸分開、或經16個核苷酸分開)而定位，自最接近另一結合位點之各結合位點之邊緣所量測，且裂解發生於該等結合位點之間。
DNA發生裂解之位點通常位於兩融合蛋白之結合位點之間。DNA雙鏈斷裂通常由偏移1、2、3、4、5、6或更多個核苷酸之兩單鏈斷裂(或斷口)引起，(例如藉助天然FokI之雙鏈DNA斷裂可由偏移4個核苷酸之單鏈斷裂引起)。因此，裂解不必發生於各DNA鏈上恰好相對位點處。另外，融合蛋白之結構及介於靶位點間之間距可影響是否裂解發生於靠近一單核苷酸對處，或是否裂解發生於數個位點處。然而，對於許多應用而言，包括定向重組及定向突變(參見下文)，處於一定範圍之核苷酸內的裂解通常係充分的，而介於特定鹼基對之間的裂解係不需要的。
如上文所記錄，融合蛋白呈多肽及/或多核苷酸形式引入。舉例而言，可將兩多核苷酸(各包含編碼前文所提及多肽之一之序列)引入細胞，且在該等多肽經表現且每個皆結合至其靶序列時，裂解在該靶序列處或接近該靶序列處發生。或者，將一包含編碼兩融合多肽之序列的單獨多核苷酸引入細胞。多核苷酸可為DNA、RNA、或DNA及/或RNA之任何經修飾形式或類似物。
為增強裂解特異性，在本文所述方法中亦可採用其他組合物。舉例而言，單個裂解半結構域可顯示有限的雙鏈裂解活性。在其中將兩融合蛋白(各包含三指鋅指結構域及一裂解半結構域)引入細胞之方法中，任一蛋白質可指定一約9核苷酸靶位點。儘管18個核苷酸之聚合靶序列在一哺乳動物基因組中往往係唯一的，但任一給定之9核苷酸靶位點平均可在人類基因組中出現約23,000次。因此，因一單獨半結構域之位點特異性結合而引起的非特異性裂解係可發生的。因此，本文所述方法考慮使用一裂解半結構域之顯性負性突變體，例如在細胞內與兩融合蛋白一道經表現之FokI(或一編碼其之核酸)。該顯性負性突變體能夠二聚化，但不能裂解，且亦可阻斷其與之二聚化之半結構域的裂解活性。藉由以莫耳過量方式為融合蛋白提供顯性負性突變體，僅兩融合蛋白皆結合於其中之區域會具有一適於發生二聚化及裂解的足夠高濃度之功能性裂解半結構域。在其中僅結合兩融合蛋白之一之位點處，其裂解半結構域可形成一具有顯性負性突變體半結構域之二聚體，且不期望的非特異性裂解不會發生。
位於FokI裂解半結構域中之三催化胺基酸殘基已經識別出來：Asp 450、Asp 467及Lys 469。Bitinaite等人(1998)Proc .Natl .Acad .Sci .USA 95：10,570－10,575。因此，可利用該等殘基之一處之一或多個突變來產生顯性失活突變。此外，許多其他IIS型內切核酸酶之催化胺基酸殘基已為吾人所瞭解及/或可(例如)藉由與FokI序列對準及/或藉由產生突變體並測試其催化活性而確定。
裂解半結構域中二聚體化結構域突變體
涉及使用介於ZFP與裂解半結構域之間之融合物(例如ZFP/FokI融合物)的用於定向裂解之方法需要利用兩種此類融合物分子(通常各指向一獨特序列)。如上文所討論，可對兩融合蛋白之靶序列進行選擇以便定向裂解指向基因組中之唯一位點。一潛在的裂解特異性減小之根源可能由兩ZFP/裂解半結構域融合物之一之同源二聚化作用引起。舉例而言，此可能會由於在一基因組中針對兩ZFP/裂解半結構域融合物之一之靶序列的反向重複序列(經定位以便容許同一融合蛋白之兩拷貝以一容許形成功能性二體之方位及間距進行結合)之存在而發生。
一種用於在除預期靶位點之外之序列處減小此類型之異常裂解之可能性的途徑包括產生可最小化或防止同源二聚化作用之裂解半結構域之變型體。較佳對涉及自身二聚化之半結構域之區域中一或多個核苷酸實施改變。在FokI 蛋白質二聚物之晶體結構中，裂解半結構域之結構據報告類似於藉助FokI 之DNA裂解期間裂解半結構域之排列。Wah等人(1998)Proc .Natl .Acad .Sci .USA 95：10564－10569。此結構表明，位於位置483及487處之胺基酸殘基殘基在FokI 裂解半結構域之二聚化作用中起重要作用。此結構亦表明，位於位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537、及538處之胺基酸殘基皆足夠接近於二聚化介面從而會影響二聚化作用。因此，在一或多個前該提及之位置處之胺基酸序列改變往往會改變裂解半結構域之二聚化特性。此等變化可(例如)藉由構建一包含(或編碼)該等位置處之不同胺基酸殘基之庫並選擇具有期望特性之變體或藉由合理地設計單獨突變體而引入。除防止同源二聚化作用外，亦可能的是，該等突變可增強上文利用兩野生型裂解半結構域獲得之裂解效率。
因此，FokI 裂解半結構域在任一可影響二聚化作用之胺基酸殘基處之改變皆可用於防止ZFP/FokI 融合物之一或一對ZFP/FokI融合物發生可導致在非期望序列處裂解之同源二聚化作用。因此，對於利用一對ZFP/Fok I融合物之定向裂解，融合蛋白之一或兩者可包含一或多處可抑制自身二聚化作用但容許兩融合蛋白之異源二聚化作用發生之胺基酸改變以便在期望靶位點發生裂解。在某些實施例中，在兩融合蛋白中皆存在改變，且該等改變具有加性效應；即任一融合物之導致異常裂解之同源二聚化作用皆被最小化或消除，而兩融合蛋白之異源二聚化作用與野生型裂解半結構域相比皆受到促進。
基因組序列之定向改變及定向重組之方法
本文亦闡述用一同源但非相同序列置換一基因組序列(例如細胞染色質中之一目標區域)(即定向重組)之方法。置換特定序列之先前努力已經涉及到使一細胞與一包含與一染色體區具有同源性之序列的多核苷酸(即供體DNA)接觸，隨後對已將供體DNA分子同源重組至基因組中之細胞實施篩選。該等方法之成功率極低，此乃因同源重組效率很低且供體DNA非特異性插入基因組除靶位點之外之區域中之頻次很高。
本揭示內容提供特徵在於一更大效率之定向重組及一更低頻次之非特異性插入事件的改變靶序列之方法。該等方法包括製造及利用經設計的融合至裂解結構域(或裂解半結構域)之鋅指結合結構域以便在細胞DNA中獲得一或多個定向雙鏈斷裂。因細胞DNA內之雙鏈斷裂可激發細胞修復機制在裂解位點之鄰近區中達數千倍，此定向裂解容許在基因組中於實質上任一位點處序列之改變或置換(經由同源性定向修復)。
除本文所述融合分子外，所選基因組序列之定向置換亦需要引入置換(或供體)序列。供體序列可在表現融合蛋白之前、同時、或之後引入細胞。供體多核苷酸與一基因組序列具有足夠的同源性以便支持該供體多核苷酸與其與之具有同源性之基因組序列之同源重組(或同源性定向修復)。介於一供體及一基因組序列之間的約25、50、100、200、500、750、1,000、1,500、2,000或更多個核苷酸(或介於10與2,000之間之任一整數值之核苷酸，或更多)之序列同源性應支持介於其間之同源重組。供體序列之長度範圍可係自10至5,000個核苷酸(或介於其間之任一整數值之核苷酸)或更長。應易於理解，供體序列通常不會完全與其置換的基因組序列相同。舉例而言，供體多核苷酸之序列可包含一或多個關於基因組序列之單個鹼基變化、插入、刪除、倒位或重排，只要具有足夠的與染色體序列之同源性即可。或者，一供體序列可包含一由兩同源性區域位於側面之非同源序列。另外，供體序列可包含含有與細胞染色質中目標區域不同源之序列的載體分子。一般而言，一供體序列之同源區域應與期望與之結合之基因組序列具有至少50%序列一致性。在某些實施例中，存在60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或99.9%序列一致性。端視供體多核苷酸之長度，可存在介於1%與100%之間之任一值之序列一致性。
一供體分子可包含若干個與細胞染色質同源的非連續區域。舉例而言，對於定向插入通常不存在於目標區域中之序列而言，該等序列可存在於一供體核酸分子中且兩側可為與目標區域中序列同源之區域。
為簡化用於測試供體序列之成功插入之測試法(例如雜交、PCR、限制酵素消化)，當與基因組序列相比較時在供體序列中可存在某些序列差異。較佳地，若位於一編碼區中，此核苷酸序列差異將不會改變胺基酸序列，或將產生隱性胺基酸變化(即不會影響蛋白質結構或功能之變化)。供體多核苷酸可視情況包含對應於目標區域中鋅指結構域結合位點之序列中的變化，以防止已藉助同源重組引入細胞染色質中之供體序列之裂解。
供體多核苷酸可係DNA或RNA(單鏈的或雙鏈的)且可呈線形或環形引入細胞中。若呈線形引入，可藉由彼等業內熟練技術人員所瞭解之方法對供體序列之末端加以保護(例如自核酸外切降解作用)。舉例而言，將一或多個雙脫氧核苷酸殘基加至一線型分子之3'末端及/或將自互補寡核苷酸連接至一或兩個末端。參見(例如)Chang等人(1987)Proc .Natl .Acad .Sci .USA 84：4959－4963；Nehls等人(1996)Science 272：886－889。其他防止外源性多核苷酸降解之方法包括(但不限於)：添加末端胺基及使用經修飾的核苷酸間鏈接，例如硫代磷酸酯類、胺基磷酸酯類、及O－甲基核糖或脫氧核糖殘基。
可作為一具有其他序列(例如複製起點、啟動子編碼抗生素抗性之基因)之載體分子之部分將多核苷酸引入細胞。此外，供體多核苷酸可呈裸露核苷酸形式、呈與一諸如脂質體或聚羥亞烴之試劑複合的核苷酸形式引入，或可藉由細菌或病毒(土壤桿菌(Agrobacterium )、根瘤菌(Rhizobium sp .)NGR234、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti )、百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti )、煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、花椰菜花葉病毒及木薯葉脈花葉病毒)遞送。參見(例如)Chung等人(2006)Trends Plant Sci .11(1)：1－4。
未受理論限制，似乎細胞序列中一雙鏈斷裂之存在(聯合一與一鄰近或包圍該斷裂之區域具有同源性之外源性DNA分子之存在)可激活細胞內修復該斷裂之機制，其中該修復過程係藉由自該供體分子將序列信息遞送至該細胞(例如基因組的或染色體的)序列；即藉由一同源性定向的修復，亦稱為"基因轉變"。申請者之方法可有利地將經設計ZFP之強尋靶能力與一裂解結構域(或裂解半結構域)結合起來，以便特異性地尋靶一期望插入外源性序列之基因組區域之雙鏈斷裂。
對於改變染色體序列，不必將供體之整個序列複製至該染色體中，只要複製對於影響期望序列改變係足夠之供體序列即可。
在細胞DNA中，供體序列藉由同源重組之插入效率與該雙鏈斷裂與該期望發生重組之位點間之距離呈逆相關性。換言之，當該雙鏈斷裂越接近於期望發生重組之位點時，所觀察到的同源重組效率越高。在其中未預定精確重組位點(例如該期望的重組事件可越過基因組序列而發生)之情況下，對供體核酸之長度及序列(連同裂解位點)進行選擇以獲得期望重組事件。在其中對期望事件進行設計以改變基因組序列中一單核苷酸對之序列之情況下，在該核苷酸對之任一側於10,000個核苷酸之範圍內對細胞染色質進行裂解。在某些實施例中，裂解發生於於擬改變序列之核苷酸對之任一側1,000、500、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、或2個核苷酸(或任一介於2與1,000之間之整數值的核苷酸)之範圍內。
如上文所詳述，兩融合蛋白之結合位點(各包含一鋅指結合結構域及一裂解半結構域)之位置可相距5－8或15－18個核苷酸，如自最接近於另一結合位點之各結合位點過緣所量測，且裂解發生於該等結合位點之間。裂解是發生於該等結合位點間之一單位點處還是多位點處並不重要，此乃因裂解的基因組序列係由供體序列置換。因此，對於單核苷酸對之序列藉由定向重組之有效改變，介於結合位點間區域之中點係處於該核苷酸對之10,000個核苷酸範圍內，較佳係處於1,000個核苷酸、或500個核苷酸、或200個核苷酸、或100個核苷酸、或50個核苷酸、或20個核苷酸、或10個核苷酸、或5個核苷酸、或2個核苷酸、或一個核苷酸之範圍內，或在該目標核苷酸對處。
在某些實施例中，一同源染色體可擔當供體多核苷酸。因此，舉例而言，一雜合子中突變之修正可藉由設計於一染色體上可結合且可裂解突變序列、但不裂解位於同源染色體上之野生型序列的融合蛋白來實現。位於帶有突變之染色體上的雙鏈斷裂可促進一基於同源性之"基因轉變"過程，在該過程中來自同源染色體之野生型序列被複製至經裂解染色體中，由此修復野生型序列之兩拷貝。
亦提供可增強定向重組水平的方法及組合物，包括(但不限於)利用其他ZFP－功能性結構域融合物來激活涉及同源重組之基因的表現，例如RAD52上位顯性組之成員(例如Rad50、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad52、Rad54、Rad54B、Mre11、XRCC2、XRCC3 )、其產物可與前文提及之基因產物相互作用之基因(例如BRCA1、BRCA2)及/或NBS1複合物中之基因。參見(例如)Boyko等人(2006)Plant Physiology 141：488－497及LaFarge等人(2003)Nucleic Acids Res 31(4)：1148－1155。同樣地，ZFP－功能性結構域融合物(與本文所揭示方法及組合物組合)可用於抑制涉及非同源端連接之基因的表現(例如Ku70/80、XRCC4、聚(ADP核糖)聚合酶、DNA連接酶4)。參見(例如)Riha等人(2002)EMBO 21：2819－2826；Freisner等人(2003)Plant J .34：427－440；Chen等人(1994)European Journal of Biochemistry 224：135－142。利用介於鋅指結合結構域與功能性結構域間之融合物激活及抑制基因表現之方法揭示於(例如)共同擁有之美國專利第6,534,261號；第6,824,978號及第6,933,113號中。其他抑制方法包括利用定向至擬抑制基因之序列的反義寡核苷酸及/或小干擾RNA(siRNA或RNAi)。
做為激活涉及同源重組之基因產物表現的替代方式或另外，該等蛋白(或其功能性片段)與一定向至該目標區域之鋅指結合結構域之融合物可用於補充該等蛋白(重組蛋白)至目標區域，藉此增加其局部濃度並進一步促進同源重組過程。或者，一如上文所述涉及同源重組之多肽(或其功能性片段)可係一包含鋅指結合結構域、一裂解結構域(或裂解半結構域)及該重組蛋白(或其功能性片段)之三聯融合蛋白之部分。涉及基因轉變及重組相關染色質重構之其他蛋白(可用於前文所提及之方法及組合物中)包括組蛋白乙醯轉移酶(例如Esalp、Tip60)、組蛋白甲基轉移酶(例如Dotlp)、組蛋白激酶及組蛋白磷酸酶。參見(例如)Bhat等人(1999)Plant J .33：455－469。
在包含一鋅指/核酸融合分子及一供體DNA分子之細胞中，定向重組效率之進一步增強係藉由阻斷處於細胞週期之G2 期中(當同源性驅動的修復過程達最大活性時)之該等細胞而實現。此阻止可以多種方法實現。舉例而言，可用(例如)可影響細胞週期前進之藥物、化合物及/或小分子對細胞進行處理，以便阻止處於G2 期中之細胞。此類型之例示性分子包括(但不限於)：影響微管聚合之化合物(例如長春滅瘟鹼(vinblastine)、噻胺酯噠唑(nocodazole)、紅豆杉醇)、與DNA相互作用之化合物(例如順氯胺鉑(II)(cis－platinum(II)diamine dichloride)、順鉑(Cisplatin)、多柔比星(doxorubicin))及/或影響DNA合成之化合物(例如胸苷、羥基脲、L－含羞草鹼(L－mimosine)、依託泊苷(etoposide)、5－氟尿嘧啶)。重組效率之額外增加係藉由利用組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)抑制劑((例如丁酸鈉、曲古抑菌素A(trichostatin A))達成，該等抑制劑可改變染色質結構從而使基因組DNA更易接近於細胞重組機構。
用於細胞週期阻止之其他方法包括可抑制CDK細胞週期激酶活性之蛋白質之過表現，例如，藉由將一編碼該蛋白質之cDNA引入該細胞或藉由向該細胞中引入一可激活編碼該蛋白之基因之表現的經設計ZFP。細胞週期阻止亦藉由抑制細胞週期蛋白及CDK之活性(例如利用RNAi方法(如美國專利第6,506,559號))或藉由向該細胞中引入一可抑制一或多種涉及細胞週期前進之基因(例如細胞週期蛋白及/或CDK基因)之表現的經設計ZFP而實現。關於合成用於調節基因表現之經設計鋅指蛋白之方法參見(例如)共同擁有之美國專利第6,534,261號。
或者，在某些情況下，定向裂解係於不存在供體多核苷酸之條件下(較佳在S期或G2 期)實施，且重組可發生於同源染色體之間。
表現載體
可將編碼一或多種ZFP或ZFP融合蛋白之核酸選殖至一向用於複製及/或表現之原核或真核細胞中轉化之載體中。載體可係原核載體，例如質粒或穿梭載體、昆蟲載體、或真核生物載體。亦可將編碼ZFP之核酸選殖至表現載體中，用於投與至一植物細胞。
為表現ZFP或ZFP融合蛋白，通常將編碼ZFP或ZFP融合物之序列亞選殖至一包含直接轉錄啟動子的表現載體中。適合的細菌及真核生物啟動子為業內所熟知並闡述於(例如)Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版1989；第3版，2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual (1990)；及Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人，上文用於表現ZFP之細菌表現系統可呈大腸桿菌(E .coli )、芽孢桿菌(Bacillus sp .)、及沙門氏菌屬(Salmonella )形式獲得(Palva等人，Gene 22：229－235(1983))。用於此等表現系統之套組可以商業方式得到。用於哺乳動物細胞、酵母、及昆蟲細胞之真核表現系統為彼等業內熟練技術人員所熟知並亦可以商業方式得到。
用於直接表現編碼ZFP之核酸的啟動子端視特定應用而定。舉例而言，通常用適合於宿主細胞之強組成型啟動子來表現及提純ZFP。
相比之下，當活體內投與ZFP用於植物基因調節時(參見下文"Nucleic Acid Deliveryto Plant Cells"節段)，端視ZFP之特定用途，使用任一組成型或誘導型啟動子。植物啟動子之非限制性實例包括源自下列之啟動子序列：擬南芥(A .thaliana )泛素－3(ubi－3)(Callis，等人，1990,J.Biol.Chem.265－12486－12493)；根瘤土壤桿菌(A .tumifaciens )甘露鹼合成酶(△mas)(Petolino等人，美國專利第6,730,824號)；及/或木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)(Verdaguer等人，1996,Plant Molecular Biology 31：1129－1139)。亦參見實例。
除啟動子外，表現載體通常包含一含有在宿主細胞(真核的或原核的)中表現核酸所需之所有其他組件的轉錄單位或表現序列盒。因此，典型表現序列盒包含一以可操作方式連結至(例如)編碼ZFP之核酸序列的啟動子及(例如)轉錄物、轉錄端、核糖體結合位點、或翻譯端之有效聚腺苷酸化作用所需的信號。該序列盒之其他組件可包括(例如)增強子及異源性剪接信號。
用於向細胞中轉運遺傳信息之特定表現載體係關於ZFP之特定用途(例如在植物、動物、細菌、真菌、原生動物等等中之表現)而進行選擇(參見下文所述之表現載體)。標準細菌及動物表現載體為業內人士所瞭解並詳細闡述於(例如)美國專利公開案第20050064474A1號及國際專利公開案WO 05/084190、WO 05/014791及WO 03/080809中。
標準轉染方法可用於產生表現大批量蛋白質之細菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細胞系，該等蛋白質可隨後利用標準技術加以純化(參見(例如)Colley等人，J.Biol.Chem.264：17619－17622(1989)；Guideto Protein Purification,in Methods in Enzymology, 第182卷(Deutscher，編輯，1990))。真核細胞及原核細胞之轉化係根據標準技術實施(參見(例如)Morrison,J .Bact .132：349－351(1977)；Clark－Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology 101：347－362(Wu等人，編輯，1983))。
任何用於將外來核苷酸序列引入此等宿主細胞中之著名方法皆可採用。該等方法包括使用磷酸鈣轉染、聚凝胺、原生質體融合、電穿孔、超音法(例如聲致穿孔法)、脂質體、顯微注射、裸露DNA、質粒載體、病毒載體(游離型的及整合型的)、及其他用於將選殖的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其他外來遺傳物質引入宿主細胞之方法(參見(例如)Sambrook等人，上文)。唯一要求係，所用特定遺傳工程方法能夠成功地將至少一種基因引入能夠表現所選蛋白質之宿主細胞中。
至植物細胞中之核酸遞送
如上文所記錄，DNA構成物可藉由多種習用技術引入至一期望植物宿主中(例如引入至其基因組中)。對於此等技術之綜述參見(例如)Weissbach & WeissbachMethods for Plant Molecular Biology (1988,Academic Press,N.Y.)Section VIII,第421－463頁；及Grierson & Corey,Plant Molecular Biology (1988，第2版)，Blackie,London,Ch.7－9。
舉例而言，可使用諸如植物細胞原生質體之電穿孔及顯微注射等技術將DNA構成物直接引入植物細胞之基因組DNA中，或可使用基因槍法(如DNA粒子轟擊)將DNA構成物直接引入植物組織中(參見(例如)Klein等人(1987)Nature 327：70－73)。或者，DNA構成物可與適合的T－DNA側翼區結合並被引入一習知根瘤土壤桿菌宿主載體中。科學文獻中詳細闡述了根瘤土壤桿菌介導的轉化技術，包括雙載體之消除及使用。參見(例如)Horsch等人(1984)Science 233：496－498及Fraley等人(1983)Proc .Nat'l .Acad .Sci .USA 80：4803。
另外，基因轉移可利用非土壤桿菌或病毒(例如根瘤菌)NGR234、苜蓿中華根瘤菌、百脈根根瘤菌、馬鈴薯X病毒、花椰菜花葉病毒及木薯葉脈花葉病毒及/或煙草花葉病毒，參見(例如)Chung等人(2006)Trends Plant Sci .11(1)：1－4。
當該細胞經細菌感染時，利用雙體TDNA載體(Bevan(1984)Nuc .Acid Res .12：8711－8721)或共同培養操作(Horsch等人(1985)Science 227：1229－1231)，根瘤土壤桿菌宿主之侵入性功能應引導該構成物及相鄰標記插入植物細胞DNA中。一般而言，土壤桿菌轉化系統係用於設計雙子葉植物(Bevan等人(1982)Ann .Rev .Genet 16：357－384；Rogers等人(1986)Methods Enzymol .118：627－641)。土壤桿菌轉化系統亦可用於轉化(以及轉移)DNA至單子葉植物及植物細胞。參見美國專利第5,591,616號；Hernalsteen等人(1984)EMBO J 3：3039－3041；Hooykass－Van Slogteren等人(1984)Nature 311：763－764；Grimsley等人(1987)Nature 325：1677－179；Boulton等人(1989)Plant Mol .Biol .12：31－40.；及Gould等人(1991)Plant Physiol .95：426－434。
可選基因轉移及轉化方法包括(但不限於)：經由鈣－、聚乙二醇(PEG)－或電穿孔－介導的對裸露DNA之攝取的原生質體轉化(參見Paszkowski等人(1984)EMBO J 3：2717－2722,Potrykus等人(1985)Molec .Gen .Genet .199：169－177；Fromm等人(1985)Proc .Nat .Acad .Sci .USA 82：5824－5828；及Shimamoto(1989)Nature 338：274－276)及植物組織之電穿孔(D'Halluin等人(1992)Plant Cell 4：1495－1505)。植物細胞轉化之其他方法包括：顯微注射、碳化矽介導的DNA攝取(Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reporter 9：415－418)、及微粒轟擊(參見Klein等人(1988)Proc .Nat .Acad .Sci .USA 85：4305－4309；及Gordon－Kamm等人(1990)Plant Cell 2：603－618)。
可用所揭示方法及組合物將外源性序列插入植物細胞基因組中之預定位置。此係有用的，因為經引入至一植物基因組中之基因轉殖之表現關鍵取決於其整合位點。因此，藉由定向重組可將編碼(例如)營養素、抗生素或治療性分子之基因插入對其表現有利之植物基因組區域中。
可對藉由任一種上述轉化技術產生的經轉化植物細胞實施培養以再生成一具有經轉化基因型並因此具有所期望表現型之完整植株。此類再生成技術依靠在組織培養生長培養基中對某些植物激素之控制，通常依靠一種與所期望核苷酸序列一起引入之除蟲劑及/或除草劑標記。自經培養植物原生質體之植物再生闡述於EVans等人，"Protoplasts Isolation and Culture"，於Handbook of Plant Cell Culture 中，第124－176頁，Macmillian Publishing Company,New York,1983；及Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts ,第21－73頁，CRC Press，Boca Raton，1985。此外，再生亦可自植物愈傷組織、外植體、器官、花粉、胚芽或其部分來獲得。此類再生技術大體闡述於Klee等人(1987)Ann .Rev .of Plant Phys .38：467－486中。
引入一植物細胞中之核酸可用於將所期望的性狀賦予實質上任何植物。利用本發明內容之核酸構成物及上文所提及之多種轉化方法可針對所期望之生理學及農學特徵對廣範圍之植物及植物細胞系統進行設計。在較佳實施例中，用於設計之靶植物及植物細胞包括(但不限於)：彼等單子葉植物及雙子葉植物，例如包括下列之作物：糧食作物(例如小麥、玉米、稻米、穀子、大麥)、果實作物(例如番茄、蘋果、梨、草莓、橙)、飼料作物(例如苜蓿)、根菜類作物(例如胡蘿蔔、馬鈴薯、甜菜、山藥)、多葉蔬菜作物(例如萵苣、菠菜)；顯花植物(例如矮牽牛、玫瑰、菊花)、針葉植物及松樹(例如松樅樹、雲杉)；在植物修復中所使用的植物(例如重金屬聚積植物)；油料作物(例如向日葵、油菜籽)及用於試驗目的之植物(例如芥菜)。因此，所揭示方法及組合物可應用於廣範圍之植物，包括(但不限於)下述種類：蘆筍、燕麥屬、芸苔屬、柑桔屬、西瓜屬、辣椒屬、南瓜屬、胡蘿蔔屬、甘胺酸、棉屬、大麥屬、萵苣屬、西紅柿屬、蘋果屬、木薯屬、煙草屬、稻屬、鱷梨屬、豌豆屬、犁屬、李屬、蘿蔔屬、黑麥屬、茄屬、高粱、小麥屬、葡萄屬、豇豆屬、及玉蜀黍屬。
業內熟練技術者應認識到，將表現序列盒穩定地納入基因轉殖植物並經確認可行後，可藉由有性雜交將其引入其他植物中。可利用多種標準育種技術中之任一種，端視擬雜交之物種不同而定。
藉由針對藉助存於轉化DNA上之標記基因編碼的性狀對經設計植物材料進行選擇或篩分可鑑別及分離經轉化植物細胞、癒合組織、組織或植物。舉例而言，選擇可藉由在含有抑制數量之抗生素或除草劑之培養基上培養經設計植物材料(轉化基因構成物可賦予其抗性)而實施。此外，經轉化植物及植物細胞亦可藉由針對可存於重組核酸構成物上之任何可見標記基因(例如β－葡萄糖苷酸酶、螢光素酶、B或C1基因)之活性進行篩選而加以鑑別。此選擇及篩分操作法為彼等業內熟練的技術人員所熟知。
亦可使用物理的及生物化學的方法來鑑別含有經插入基因構成物之植物或植物細胞轉化體。該等方法包括(但不限於)：1)用於檢測或測定重組DNA插入片段之結構的南方印跡分析法或PCR擴增；2)用於檢測及檢驗基因構成物之RNA轉錄物的北方印跡法、S1 RNA酶保護術、引物延伸或逆轉錄酶PCR擴增法；3)用於檢測酵素或核酶活性之酶分析法，其中此等基因產物係由基因構成物編碼；4)蛋白質凝膠電泳、西方印跡分析技術、免疫沉澱作用、或酶聯免疫分析法，其中該等基因構成物產物係蛋白質。其他技術(例如原位雜交、酵素染色法、及免疫染色法)亦可用於檢測特定重組體構成物於植物器官及組織中之存在度或表現。實施所有該等測試之方法皆為彼等業內熟練的技術人員所熟知。
利用本文所揭示方法進行基因操作之效果可藉由(例如)對自目標組織分離出來之RNA(例如mRNA)實施北方吸印法而觀察到。通常，若mRNA之數量已經增加，則可推斷，相應內源基因係以較先前更高之速率進行表現。亦可使用測定基因及/或CYP74B活性之其他方法。端視所用底物及檢測一反應產物或副產物之增加或減少之方法，可使用不同類型之酶分析。另外，所表現基因及/或CYP74B蛋白之含量可以免疫化學方法進行量測，即ELISA、RIA、EIA及彼等業內熟練技術人員所熟知之其他基於抗體之測試法，例如電泳檢測測試法(利用染色或西方印跡分析)。可在某些植物組織中或在某些發育階段中選擇性地表現基因轉殖，或可在實質上所有植物組織中(實質上沿其整個生活週期)表現基因轉殖。然而，亦可應用任何組合的表現模式。
本揭示內容亦涵蓋上述基因轉殖植物之種子(其中該種子具有基因轉殖或基因構成物)。本揭示內容進一步涵蓋上文所述基因轉殖植物之子代、純系、細胞系或細胞(其中該子代、純系、細胞系或細胞具有該基因轉殖或基因構成物)。
ZFP及編碼ZFP之表現載體可直接投與植物用於定向裂解及/或重組。
有效量之投與係藉由任何常用途徑實現以將ZFP引入與擬處理植物細胞之最終接觸點中。ZFP係以任一適宜方式投與，較佳利用醫藥上可接受之載劑投與。投與此等調節劑之適宜方法係現有方法且為彼等業內熟練技術人員所熟知，並且，儘管可採用一種以上途徑來投與一特定組合物，但一特定途徑通常可提供一較另一途徑更直接且更有效之反應。
亦可使用載劑，且該等載劑係部分地依據所投與之特定組合物加以確定，以及依據用於投與該組合物之特定方法加以確定。因此，存在廣泛種類之可用醫藥組合物之適宜調配物(參見(例如)Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，1985))。
應用
所揭示用於定向裂解之方法及組合物可用於在基因組序列中誘導突變。定向裂解亦可用於構建基因敲除(例如用於功能性基因組學或靶標確認)及用於促進序列向基因組中之定向插入(即基因敲入)。插入可藉助經由同源重組之染色體序列置換或藉由定向整合(其中在一預定靶位點處插入一新序列(即一在目標區域中不存在之序列)，由與該染色體中目標區域同源之序列側接)而實現。亦可利用相同方法用突變序列置換野生型序列或將一等位基因轉換成不同的等位基因。
在一植物宿主細胞中可利用侵染的或整合的植物病原體之定向裂解來處理病原感染，舉例而言，藉由對病原體之基因組實施裂解以便減小或消除其病原性而實施。另外，可用編碼植物病毒受體之基因之定向裂解來阻斷此類受體之表現，藉此防止植物中之病毒感染及/或病毒播散。
例示性植物病原體包括(但不限於)：植物病毒，例如苜蓿花葉病毒屬(Alfamoviruses )、α潛隱病毒屬(Alphacryptoviruses )、杆狀DNA病毒屬(Badnaviruses )、β潛隱病毒屬(Betacryptoviruses )、二聯病毒組(Bigeminiviruses )、雀麥花葉病毒組(Bromoviruses )、大麥黃化花葉病毒屬(Bymoviruses )、毛狀病毒(Capilloviruses )、香石竹潛伏病毒群(Carlaviruses )、香石竹斑駁病毒屬(Carmoviruses )、花椰菜花葉病毒組(Caulimoviruses )、長線形病毒組(Closteroviruses )、豇豆花葉病毒組(Comoviruses )、黃瓜花葉病毒組(Cucumoviruses )、質型彈狀病毒屬(Cytorhabdoviruses )、香石竹病毒屬(Dianthoviruses )、碗豆耳突花葉病毒組(Enamoviruses )、蠶豆萎蔫病毒組(Fabaviruses )、斐濟病毒組(Fijiviruses )、真菌傳杆狀病毒組(Furoviruses )、大麥病毒(Hordeiviruses )、雜雙粒病毒組(Hybrigeminiviruses )、懸鉤子病毒屬(Idaeoviruses )、等徑易變病毒組(Ilarviruses )、番薯屬病毒屬(Ipomoviruses )、大麥黃矮病毒組(Luteoviruses )、玉蜀黍萎黃斑點病毒屬(Machlomoviruses )、橙桑花葉病毒屬(Macluraviruses )、玉米雷亞多非納病毒屬(Marafiviruses )、單雙粒病毒組(Monogeminiviruses )、矮縮病毒屬(Nanaviruses )、壞死病毒屬(Necroviruses )、線蟲傳多角體病毒組(Nepoviruses )、核型彈狀病毒屬(Nucleorhabdoviruses )、水稻病毒屬(Oryzaviruses )、歐爾密病毒屬(Ourmiaviruses )、植物呼腸病毒(Phytoreoviruses )、馬鈴薯X病毒組(Potexviruses )、馬鈴薯Y病毒組(Potyviruses )、黑麥草鑲嵌病毒屬(Rymoviruses )、衛星RNA、衛星病毒(satelliviruses )、歐防風黃點病毒屬(Sequiviruses )、南方菜豆花葉病毒組(Sobemoviruses )、水稻條紋葉枯病毒組(Tenuiviruses )、煙草花葉病毒組(Tobamoviruses )、煙草脆裂病毒組(Tobraviruses )、番茄叢矮病毒組(Tombusviruses )、番茄斑萎病毒屬(Tospoviruses )、蘋果退綠葉斑病毒屬(Trichoviruses )、蕪菁黃花葉病毒組(Tymoviruses )、傘形植物病毒屬(Umbraviruses )、巨脈病毒屬(Varicosaviruses )及水稻矮化病毒屬(Waikaviruses )；真菌病原體，例如黑粉病(例如黑粉目(Ustilaginales ))、銹病(鏽菌目(Uredinales ))、麥角症(絳紅色麥角目(Clavicepts pupurea ))及黴病；黴菌(卵菌)，例如致病疫黴菌(Phytophthora infestans )(馬鈴薯晚疫病(potato blight ))；細菌病原體，例如歐文氏菌(Erwinia )(例如草生歐文氏菌(E.herbicola ))、假單胞菌(例如綠膿桿菌(P.aeruginosa )、丁香假單胞菌(P.syringae )、螢光假單胞菌(P.fluorescense)及惡臭假單胞菌(P.putida )、青枯病(例如茄科雷爾氏菌(R.solanacearum ))、土壤桿菌屬(Agrobacterium )及黃單胞菌屬(Xanthomonas )；線蟲(線蟲綱(Nematoda ))；及植物菌目(Phytomyxea )(多黏菌(Polymyxa )及根腫菌屬(Plasmodiophora ))。
可利用所揭示定向重組方法用一同源但非相同序列置換任何基因組序列。舉例而言，一突變基因組序列可經其野生型對等物置換，藉此提供治療植物疾病之方法；提供對植物病原體之抵抗性；增強作物產量等。以類似方式，利用本文所揭示之定向重組方法，基因之一等位基因可藉由不同等位基因置換。
在許多該等情況下，一目標區域包含一突變，且供體核苷酸包含相應的野生型序列。同樣，若期望，一野生型基因組序列可經一突變型序列置換。舉例而言，一致癌基因之過表現可藉由使該基因突變或藉由用支持一更低且非病理學等級之表現的序列來置換其控制序列而逆轉。實際上，任何由特定基因組序列(呈任何形式)決定之病狀皆可利用本文所揭示方法及組合物加以校正或減輕。
亦可用定向裂解及定向重組來改變非編碼序列(例如調節序列，如啟動子、增強子、起始因子、終止子、剪接位點)以便基因產物之表現水平。舉例而言，可將此等方法用於治療目的、功能性基因組學及/或靶標確認研究。
染色質結構之定向改良(如共同擁有之WO 01/83793)可用於促進融合蛋白至細胞染色質之結合。
在其他實施例中，除本文所揭示鋅指－裂解結構域融合物之外或替代該等鋅指－裂解結構域融合物，可利用一或多種介於鋅指結合結構域與重組酶(或其功能性片段)之間的融合物來促進定向重組。參見(例如)共同擁有之美國專利第6,534,261號及Akopian等人(2003)Proc .Natl .Acad .Sci .USA 100：8688－8691。
在其他實施例中，所揭示方法及組合物係用於提供ZFP結合結構域與轉錄激活或抑制結構域(其需要二聚化作用(同源二聚化作用或異源二聚化作用)才會具有活性)之融合物。在該等情況下，一融合多肽包含一鋅指結合結構域及一功能性結構域單體(例如源自二聚的轉錄激活或抑制結構域之單體)。兩此融合多肽至經正確定位之位點之結合容許發生二聚化作用，以便重組功能性轉錄激活或抑制結構域。
此外，如上文所揭示，本文所給出之方法及組合物可用於將外源性序列定向重組至細胞基因組中之目標區域中，例如，其中裂解可增強經由同源性依賴機制之插入(例如插入一包含一外源性序列連同一或多個與一預定基因組序列(即一靶位點)相同、或同源但不相同之序列的供體序列)。
供體序列通常在側接外源性序列之區域中包含充分的同源性，以便支持基因序列中雙鏈斷裂之同源性定向的修復，藉此在基因組之靶位點處插入外源性序列。因此，供體核酸可具有足以支持外源性序列藉助同源性依賴之修復機制(例如同源性重組)進行整合之任何大小。不欲受限於任何特定理論，側接外源性序列之同源性區域據認為可為斷裂的染色體末端提供一用於在雙鏈斷裂位點處重新合成遺傳信息之模板。在某些實施例中，與外源性序列側接，存在兩相同序列或兩同源但非相同序列(或各一個)。一外源性序列(或外源性核酸或外源性多核苷酸)係一包含在目標區域中通常不存在之核苷酸序列的序列。
例示性外源性序列包括(但不限於)：cDNA、啟動子序列、增強子序列、抗原決定部位標籤、標記基因、裂解酵素識別位點及多種類型之表現構成物。參見(例如)美國專利第6,833,252號。其他例示性歸巢內切核酸酶包括I－CeuI 、PI－Psp I、PI－Sce 、I－Sce IV、I－Csm I、I－Pan I、I－Sce II、I－Ppo I、I－Sce III、I－Cre I、I－Tev I、I－Tev II及I－Tev III。其識別序列係已知的。亦參見：美國專利第5,420,032號；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res .25：3379－3388；Dujon等人(1989)Gene 82：115－118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22,1125－1127；Jasin(1996)Trends Genet .12：224－228；Gimble等人(1996)J .Mol .Biol 263：163－180；Argast等人(1998)J .Mol .Biol .280：345－353及New England Biolabs產品目錄。
標記基因包括(但不限於)：編碼可介導對抗生素之耐藥性(例如對胺苄青黴素之耐藥性、對新黴素之耐藥性、對G418之耐藥性、對嘌呤黴素之耐藥性)之蛋白質的序列、編碼有色或螢光或發光蛋白質(例如綠色螢光蛋白、增強的綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白質、螢光素酶)之序列、及編碼可介導增強的細胞生長及/或基因擴增之蛋白質(例如二氫葉酸還原酶)之序列。因此，例示性標記基因包括(但不限於)：β－葡萄糖苷酸酶(GUS)、草銨膦乙醯基轉移酶(PAT，BAR)、新黴素磷酸轉移酶、β－內醯胺酶、兒茶酚雙加氧酶、α－澱粉酶、酪胺酸酶、β－半乳糖苷酶、螢光素酶、發光蛋白、EPSP合成酶、腈水解酶、乙醯乳酸合成酶(ALS)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、茅草枯脫鹵素酶及鄰胺基苯甲酸合成酶。在某些實施例中，利用定向整合插入一RNA表現構成物，例如負責微RNA或siRNA之可調型表現之序列。亦可將啟動子、增強子及其他轉錄調節序列(如上文所述)併入RNA表現構成物中。
實例 實例1－設計及產生靶序列之靶載體總體結構
A.未譯 煙草(一雙子葉植物)之靶構成物包括如圖1中所示之以下7種組份：i)包含擬南芥泛素－3(ubi－3)啟動子(Callis，等人，1990，J.Biol.Chem.265－12486－12493)之潮黴素磷酸轉移酶(HPT)表現序列盒，其中該啟動子係用於驅動以根瘤土壤桿菌開放閱讀框－24(orf－24)3'未翻譯區域(UTR)(Gelvin等人，1987，歐洲專利第EP222493號)為末端的大腸桿菌HPT基因(Waldron等人，1985，Plant Mol.Biol.18：189－200)；ii)包含普通煙草(N .tabacum )RB7基質附著區(MAR)(Thompson等人，1997，WO 9727207)之同源序列－1；iii)由改良的根瘤土壤桿菌甘露鹼合成酶(△mas)啟動子(Petolino等人，美國專利第6,730,824)驅動之5'綠色螢光蛋白(GFP)基因片段(Evrogen Joint Stock公司，Moscow，Russia)；iv)包含木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子(Verdaguer等人，1996，Plant Molecular Biology 31：1129－1139)之β－葡萄糖苷酸酶(GUS)表現序列盒，其中該啟動子可驅動以根瘤土壤桿菌胭脂鹼合成酶(nos)3'UTR(DePicker等人，1982,J.Mol.Appl.Genet.1：561－573)為末端的GUS基因(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387－405)；v)以根瘤土壤桿菌orf－1 3' UTR(Huang等人，J.Bacteriol.172：1814－1822)為末端之3' GFP基因片段(Evrogen Joint Stock公司，Moscow，Russia)；vi)同源序列－2，包含擬南芥4－香豆醯基－CoA合成酶(4－CoAS)內含子－1(基因座At3 g21320，GenBank NC 003074)及；vii)一由根瘤土壤桿菌ORF－25/26 3' UTR(Gelvin等人，1987，EP222493)為末端的綠色產色鏈黴菌抗草丁膦磷酸轉移酶(PAT)(Wohlleben等人，1988,Gene 70：25－37)3'基因片段。
將一鋅指－Fok1融合蛋白結合位點(IL－1－L0－Fok1)(Urnov等人，2005，US 2005/0064474)插入CsVMV啟動子(Verdaguer等人，1996，P1ant Molecular Biology 31：1129－1139)之下游並使之與位於N末端之GUS編碼序列(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387－405)融合。兩個拷貝之第二鋅指－Fok1融合蛋白結合位點(Scd27－L0－Fok1)(Urnov等人，2005，US 2005/0064474)側接5'及3' GFP基因片段(Evrogen Joint Stock公司，Moscow，Russia)。每一結合位點皆包含四個串聯的特定鋅指－Fok1融合蛋白識別序列之重複，如此各結合位點係約200 bp大小(圖2a)。對此進行設計以確保識別序列可在複雜的染色質環境中接近鋅指－Fok1融合蛋白。各識別序列包含一單個鋅指－Fok1融合蛋白與之結合的逆向重複序列作為同型二聚體並裂解該雙鏈DNA(圖2b)。5'及3' GFP基因片段交疊540 bpd在靶序列中提供同源性，並在5' GFP片段之3'端插入一終止密碼子以確保自靶序列無功能性GFP翻譯。經由一下述多步驟選殖過程產生包含靶序列之轉化載體。
B. HPT二元載體(pDAB1584)之構建 將載體pDAB1400(其包含一GUS表現序列盒，該表現序列盒包含一可驅動以根瘤土壤桿菌orf－1 UTR(Huang等人，J.Bacteriol.172：1814－1822)為末端之GUS基因(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387－405)的擬南芥ubi－3啟動子(Callis等人，1990，J.Biol.Chem.265－12486－12493))用作起始基礎構成物(圖3)。
為在靶構成物中避免任何不必要的重複調節組件，用根瘤土壤桿菌orf－24 UTR(Gelvin等人，1987，EP222493)置換pDAB1400中之根瘤土壤桿菌orf－1 UTR(Huang等人，J.Bacteriol.172：1814－1822)，根瘤土壤桿菌orf－24 UTR係作為SacI/XbaI片段自pDAB782(圖4)切下並經選殖至pDAB1400中相同位點中。所得構成物包含可驅動以根瘤土壤桿菌orf－24 UTR(Gelvin等人，1987，EP222493)為末端之GUS基因(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep.5：387－405)的擬南芥ubi－3啟動子(Callis，等人，1990,J.Biol.Chem.265－12486－12493)並被稱為pDAB1582(圖5)。
利用引物P1及P2自pDAB354質粒(圖6)對HPT編碼序列(Waldron等人，1985，Plant Mol.Biol.18：189－200)實施PCR擴增。在引物P1之5'端處添加一BbsI位點並在引物P2之3'端處保留SacI位點。用BbsI/SacI對HPTII PCR片段實施消化並將其選殖至經NcoI－SacI消化的pDAB1582中以便用來自PCR片段之HPT基因置換GUS基因。所得質粒稱為pDAB1583(圖7)。
然後藉助NotI消化自pDAB1583切下擬南芥ubi－3/HPT/根瘤土壤桿菌orf－24片段並用T4 DNA聚合酶進行處理以產生鈍端。在PmeI位點處將經鈍端處理之HPT表現序列盒選殖至之pDAB2407(二元基載體)(圖8)中，產生質粒pDAB1584(圖9)。
C.包含同源序列及Scd27鋅指－Fok1融合蛋白結合位點之載體(pDAB1580)的構建 用根瘤土壤桿菌orf25/26 UTR(Gelvin等人，1987，EP222493)置換pDAB2418(圖10)中之根瘤土壤桿菌orf－1 UTR(Huang等人，J.Bacteriol.172：1814－1822)以避免在靶載體中存在重複調節序列。為達成UTR調換，利用引物P3及P4自pDAB4045質粒(圖11)對根瘤土壤桿菌orf25/26 UTR(Gelvin等人，1987，EP222493)實施PCR擴增。向PCR片段之3'端添加Smal及Agel位點，並在5'端處保留SacI位點。用SacI及AgeI對pDAB2418質粒DNA(包含一PAT基因表現序列盒，該表現序列盒包含可驅動以根瘤土壤桿菌orf－1 UTR(Huang等人，J.Bacteriol.172：1814－1822)為末端之PAT基因(Wohlleben等人，1988,Gene 70：25－37)的擬南芥泛素－10(ubi－10)啟動子(Callis等人，1990,J.Biol.Chem.265－12486－12493)及一普通煙草RB7 MAR序列(Thompson等人，1997，WO 9727207))實施消化並回收兩最大片段。將該等片段與經SacI及AgeI消化的根瘤土壤桿菌orf25/26 UTR(Gelvin等人，1987，EP222493)PCR產物連接。所得質粒稱為pDAB1575(圖12)。普通煙草RB7 MAR(Thompson等人，1997，WO9727207)可擔當靶載體中之同源序列－1。
選擇擬南芥4－CoAS之內含子－1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)擔當靶載體中之同源序列－2。對PAT基因(Wohlleben等人，1988,Gene 70：25－37)編碼序列進行分析，識別起始密碼子之299/300 bp下游作為插入內含子之位點，以便形成適宜的5'及3'剪接位點。然後，藉助DNA合成法(Picoscript有限公司，LLP，Houston，Texas)使全長型內含子與3'部分PAT編碼序列之253 bp融合。將NotI及SacI位點分別添加至DNA片段之5'及3'端。然後，用NotI/SacI對合成的DNA片段進行消化，並在相同位點處將其插入pDAB1575中以置換全長型PAT編碼序列。所得構成物稱為pDAB1577(圖13)。
合成一包含4個串聯的Scd27－L0－Fok1之重複的241 bp DNA片段(圖2)(Picoscript有限公司，LLP，Houston，Texas)，其中在該片段之5'及3'端皆添加一Smal位點。然後，用Smal對包含合成的鋅指－Fok1結合位點之片段實施消化並於MscI位點處將其插入pDAB1577中。所得載體稱為pDAB1579(圖14)。然後在SwaI位點處將包含一第二Smal消化的鋅指－Fok1結合位點之片段插入pDAB1579中。所得構成物稱為pDAB1580(圖15)。此載體包含同源序列1及2(分別係普通煙草RB7 MAR及擬南芥4－CoAS內含子1)及兩個合成的Scd27鋅指－Fok1結合位點(各包含4個串聯的Scd27－L0－Fok1識別位點之重複)。
D.包含兩個部分重複的非功能性GFP片段之載體(pDAB1572)之構建 GFP基因(CopGFP)係購自Evrogen Joint Stock公司(Moscow,Russia)並利用引物P5及P6對全長型編碼序列實施PCR擴增。向PCR產物之5'及3'端分別添加BbsI及SacI位點。然後，用BbsI/SacI對CopGFP PCR產物實施消化並於NcoI/SacI位點處將其選殖至pDAB3401(圖16)中，其中該pDAB3401包含可驅動以根瘤土壤桿菌orf－1 3' UTR(Huang等人，J.Bacteriol.172：1814－1822)為末端之GUS基因(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387－405)的改良根瘤土壤桿菌△mas啟動子(Petolino等人，US 6730824)，以置換GUS基因。所得載體稱為pDAB1570(圖17)。
為獲得兩個部分重複的非功能性GFP片段，利用引物P9及P10對一包含CopGFP編碼序列之大部分且在5'端具有一47 bp缺失之DNA片段實施PCR擴增。向5'及3'末端皆添加一ApaI位點並向ApaI位點下游之5'端添加一另外的StuI位點。然後，用ApaI對PCR產物實消化並在ApaI位點處將其插入pDAB1570中，藉此在具有一540 bp重複序列之同一載體中產生兩個非功能性GFP片段。所得構成物稱為pDAB1572(圖18)。
E.包含IL－1鋅指－Fok1融合蛋白結合位點/GUS基因融合之載體(pDAB1573)之構建 藉由Picoscript有限公司，LLP，(Houston,Texas)合成一包含4個串聯的IL－1_LO－Fok1識別位點之重複的233 DNA片段(圖2)，其中向5'及3'末端分別加入NcoI及AflIII位點。然後，用NcoI/AflIII對合成的片段實施消化，並在NcoI位點處將其插入pDAB4003(圖19)中，其中該pDAB4003包含一藉由以根瘤土壤桿菌orf－1 3' UTR(Huang等人，J.Bacteriol.172：1814－1822)為末端之CsVMV啟動子(Verdaguer等人，1996，Plant Molecular Biology 31：1129－1139)驅動的GUS基因(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep.5：387－405)。然後，產生一介於IL－1_L0－Fok1結合位點與GUS編碼序列間之N端融合物。所得載體稱為pDAB1571(圖20)。
為避免在靶載體中重複3' UTR組件，自pDAB7204(圖21)中切下根瘤土壤桿菌nos 3' UTR(DePicker等人，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561－573)作為SacI/PmeI片段並將其選殖至經SacI/NaeI消化的pDAB1571中以置換根瘤土壤桿菌orf－1 3' UTR(Huang等人，J.Bacteriol.172：1814－1822)。所得質粒稱為pDAB1573(圖22)。
F.最終靶載體(pDAB1585)之構建 為製造最終靶載體，藉由NotI消化自pDAB1573上切下具有IL－1－Fok1融合蛋白靶位點插入段之GUS表現序列盒，實施鈍端處理並在StuI位點處插入pDAB1572中。所得中間載體稱為pDAB1574(圖23)。自pDAB1574切下包含改良的△mas啟動子(Petolino等人，US6730824)、一5'部分重複的GFP序列(Evrogen Joint Stock公司，Moscow，Russia)、CsVMV啟動子(Verdaguer等人，1996，Plant Molecular Biology 31：1129－1139)、一IL－1－Fok1融合蛋白靶序列、該GUS基因(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol.Rep.5：387－405)編碼區、一根瘤土壤桿菌nos 3' UTR(DePicker等人，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561－573)、一3'部分重複的GFP(Evrogen Joint Stock公司，Moscow，Russia)及根瘤土壤桿菌orf－1 3' UTR(Huang等人，J.Bacteriol.172：1814－1822)之整個序列盒，並在NotI位點處將其插入pDAB1580中。所得質粒稱為pDAB1581(圖24)。然後，在AgeI位點處將pDAB1581之AgeI片段插入pDAB1584中，藉此產生最終靶構造，pDAB1585(圖1)。
實例2－具有整合靶序列之基因轉殖細胞系之產生
使用兩種不同的煙草細胞懸液培養物，經由土壤桿菌屬轉化將實例2之靶序列穩定的整合於其中。第一培養物(稱為NT1)係自University of Washington(Seattle,WA,USA)之Arnold Bendich獲得。此培養物用約48小時之倍增時間可增殖為存於20－30個細胞簇中之15－20微米直徑細胞。將NT1細胞懸液培養物保持於pH值為5.7的包含MS基礎鹽(PhytoTechnology Labs M524)、137.4毫克/公升K2 HPO4 、30克/公升蔗糖、2.22毫克/公升2,4－D、1毫克/公升硫胺素－HCL、100毫克/公升肌醇及0.5克/公升MES的培養基中。每隔7天藉由將40毫升新鮮的MS基礎培養基添加至1毫升壓緊細胞體積(PCV)中對NT1細胞實施一次繼代培養。
所用第二煙草細胞培養物(稱為BY2)係自Jun Ueki of Japan Tobacco(Iwata,Shizuoka,Japan)獲得。此培養物用一大致18小時的倍增時間可增殖為存於100－150個細胞簇中之5－10微米直徑細胞。將BY2細胞懸液培養物保持於pH值為6.0的包含LS基礎鹽(PhytoTechnology Labs L689)、170毫克/升KH2 PO4 、30克/升蔗糖、0.2毫克/升2,4－D及0.6毫克/升硫胺素－HCL之培養基中。每隔7天藉由將50毫升LS基礎培養基添加至0.25毫升PCV中對BY2細胞實施一次繼代培養。在25℃下將NT1及BY2細胞懸液培養物兩者皆保持於位於一旋轉振盪器上之250－毫升燒瓶中，並以125 RPM進行旋轉。
為產生帶有經整合靶序列之基因轉殖NT1及BY2細胞培養物，將一燒瓶經繼代培養四天後之煙草懸浮液分成10－12份四毫升等分試樣，並在100×25毫米陪替氏(Petri)培養皿中與100微升含pDAB1585之土壤桿菌屬菌株LBA4404共同培養，經生長過夜為OD600 ~1.5。用石蠟膜包裹培養皿在25℃及未進行搖動之條件下進行3天培養，然後去除過量液體並用11毫升含有500毫克/公升羧苄青黴素之基礎培養基(對於NT1及BY2分別為基於MS或基於LS的培養基)置換之。
將煙草細胞重新懸浮後，將1毫升懸浮液分散至適宜基礎培養基之100×25毫米平皿上，其中該適宜培養基含有500毫克/升羧苄青黴素及200毫克/升潮黴素並經8克/升TC瓊脂固化，並在28℃下於黑暗中在未打開的情況下實施培養。此可產生針對一單獨處理之120－144選擇平皿。經平皿接種10－14後出現了個別抗潮黴素分離菌群(表1)，將其轉移至單獨的60×20毫米平皿中(每個平皿中一個分離菌群)，其在此處以14日繼代培養方案保持愈傷狀態，直至需要用於分析及繼後重新轉化試驗之時。
實例3－靶基因轉殖事件之篩選及特徵分析
對由將靶載體向BY2或NT1煙草細胞培養物中之轉化所引起的抗潮黴素置基因事件(如實例2中所述)進行如下分析。
為篩選此等基因轉殖事件所實施之初始分析包括：為證明靶序列之可接近性之GUS表現分析、為證實靶載體之存在性及完整性的部分及全長靶序列之PCR分析、及為測定經整合之靶序列之拷貝數之南方印跡分析。該等顯示GUS表現之基因轉殖事件之一子集包括一單拷貝之全長靶序列；該等子集基因轉殖事件係經選擇用於重新構建懸浮培養物以產生用於繼後重新轉化之靶細胞系。亦對該等重新建立之靶細胞系實施進一步特徵分析，包括更詳盡的南方印跡分析、整個靶插入部分之序列確認、及側接基因組之序列分析。
藉由在37℃下於150微升分析緩衝液中對50毫克試樣進行24－48小時培養，對始於所選擇事件之基因轉殖煙草愈傷組織或懸浮培養物分析GUS活性。分析緩衝液由0.2 M磷酸鈉(pH值為8.0)、鐵氰化鉀及亞鐵氰化鉀各0.1 mM、1.0 mM乙二胺四乙酸鈉、0.5毫克/毫升5－溴－4－氯－3－吲哚－β－葡萄糖苷酶及0.6%(v/v)Triton X－100(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep.5：387－405)組成。將染成藍色區域之外觀用作GUS基因表現之指示，其表明靶序列插入具有轉錄活性並因此而在局部基因環境中係可接近的。
GUS表現基因轉殖事件係利用引物對P15/P16藉由PCR進行分析，該引物對導致10 kb DNA片段自位於靶序列5'端之HTP表現序列盒之3' UTR延伸至位於靶序列3'端之部分PAT基因序列盒之3' UTR之擴增。由於所有事件皆係在潮黴素選擇下獲得，故據推斷該HPT表現序列盒在所有靶事件中皆係完整的。因此，僅HPT表現序列盒之3' UTR在全長PCR分析中係經覆蓋的。亦利用引物對P15/P17及P18/P19對一子集之事件實施PCR分析以分別測定靶序列之5'端及3'端之完整性。藉由南方印跡分析法對所有經PCR分析證實之靶事件進一步實施分析以測定經整合靶序列之拷貝數。
針對所有通過GUS表現及全長PCR篩選之靶事件實施南方印跡分析法。用NsiI對10微克基因組DNA實施消化，NsiI係靶序列中之一獨特的切削工具。在0.8%瓊脂糖凝膠上對經消化的基因組DNA實施分離並將其轉移至尼龍薄膜上。經交聯後，用一HPT基因探針對位於薄膜上之經轉移DNA實施雜交，以測定靶序列5'端之拷貝數。然後，將該同一污漬剝下並用一PAT基因探針實施再次雜交，以測定靶序列之3'端的拷貝數。
選擇三個顯示了GUS表現並包含全長靶序列單拷貝之事件進行進一步特徵分析，包括更詳盡的南方印跡分析、整個靶序列測定及側接基因組序列分析(表2)。該等三個事件係BY2－380、NT1－240及NT1－260。針對繼後之重新轉化，利用包含供體DNA及鋅指Fok1融合蛋白基因之載體自該等三個事件重新構建懸浮培養物。
為確保自包含所期望之完整靶序列之靶事件BY2－380、NT1－240及NT1－260建立該等三種懸浮液培養物，利用引物對P15/P16對自位於該靶序列5'端之HPT表現序列盒之3' UTR至位於該靶序列3'端之部分PAT基因序列盒之3' UTR的主要靶序列實施PCR擴增並將其選殖至pCR2.1 TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,California)中。藉由Lark技術(Houston,Texas)對經插入至TOPO載體中之PCR產物實施定序。序列結果表明，BY2－380及NT1－240具有所期望之完整靶序列，然而NT1－260具有一5475 bp之DNA插入。該插入位於3'部分PAT序列之3'末端之27 bp上游處。令人感興趣地，在此插入中具有一2883 bp之orf。比照NBCI數據庫對此orf實施的BLAST檢索顯示，其與一來自土壤桿菌之轉位子相匹配。儘管此靶細胞系(NT1－260)可能不適用於染色體間同源重組試驗(因處於PAT可選標記基因中之額外插入序列)，其仍可用於利用在靶載體中所設計的GFP報告系統來測試染色體內同源重組。
利用Universal Genome Walker Kit(Clontech,Mountain View,California)對所有三種細胞系實施進一步分析，以獲得側接基因組序列。簡言之，在分開的反應中用三種鈍端限制酵素(EcoRV、DraI及StuI)對2.5微克基因組DNA實施消化。經由苯酚/氯仿萃取法對經消化之DNA實施純化並用BD GenomeWalker Adaptor實施連接。實施巢式PCR擴增，其中連接物作為模板並針對初級PCR反應使用引物P20(向靶序列插入物5'端之上游移行)及P21(向靶序列插入物3'端之下游移行)，且針對次級巢式PCR反應使用引物P22(向靶序列插入物5'端之上游移行)及P23(向靶序列插入物3'端之下游移行)。將來自次級PCR反應之擴增片段選殖至pCR2.1 TOPO或pCR Blunt II TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,California)中，並利用一Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Beckman Coulter,Fullerton,CA)實施定序。經由此方法，自所有三種靶細胞系獲取側接基因組序列。然後基於側接基因組序列設計引物並用於擴增整個靶序列。自該等靶細胞系獲取之擴增片段具有期望大小。藉由序列測定來確定經擴增片段之兩端。
實例4：供體DNA載體之設計及產生
供體DNA構成物包括同源序列－1(普通煙草RB7 MAR)(Thompson等人，1997，WO9727207)、一全長型擬南芥ubi10啟動子(Callis，等人，1990，J.Biol.Chem.265－12486－12493)、299 bp之5'部分PAT基因編碼序列(Wohlleben等人，1988,Gene 70：25－37)及同源序列－2(擬南芥4－CoAS內含子－1)(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)。供體載體中之同源序列－1及序列－2與靶載體(pDAB1585)中之對應的同源序列－1及序列－2相同。
為構建該供體載體，由Picoscript有限公司，LLP，(Houston,Texas)經由DNA合成使299 bp之5'部分PAT編碼序列與全長型擬南芥4－CoAS內含子－1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)融合。向該片段之5'及3'端分別添加NcoI及XhoI位點。然後，用NcoI/XhoI對此合成的DNA片段實施消化，在相同位點處將其插入pDAB1575中以置換全長型PAT基因編碼序列及其3' UTR。所得構成物稱為pDAB1576(圖25)。
然後，用AgeI對pDAB1576實施消化，並於相同位點處將包含5'部分PAT表現序列盒並由同源序列－1及同源序列－2側接之整個片段插入pDAB2407(二元基礎載體)中。所得構成物稱為pDAB1600並係用於植物細胞重新轉化之供體載體的二元變型(圖26)。
實例5－鋅指核酸酶表現載體之設計及產生
鋅指－Fok1融合蛋白基因係藉由一CsVMV啟動子及5' UTR進行驅動(Verdaguer等人，1996,Plant Molecular Biology 31：1129－1139)。該序列盒中亦包括普通煙草逆滲透蛋白5'及3' UTR(Merlo等人，US2005102713)。為製造該等載體，用一包含CsVMV啟動子及5' UTR及普通煙草5' UTR驅動GUS之片段(其係用HindIII/SacI自pDAB7025(圖28)切下)置換pDAB7002(圖27)中包含CsVMV啟動子及5'UTR驅動PAT之HindIII/SacI片段。所得質粒稱為pDAB1591(圖29)。
分別利用引物對P11/P12及P13/P14自IL1－L0－Fok1及Scd27－L0－Fok1編碼序列之初始載體(pCDNA3.1－IL1－L0－FokI(圖30)及pCDNA3.1－SCD27a－L0－FokI(圖31))對其實施PCR擴增。分別向PCR片段之5'及3'端添加BbsI及SacI位點。經由SacI/NcoI選殖利用鋅指融合蛋白基因PCR片段置換pDAB1591中之PAT基因。所得質粒分別稱為pDAB1592(圖32)及pDAB1594(圖33)，用於IL－1－Fok1及Scd27－Fok1。
該等載體之二元變型係藉由呈一PmeI/XhoI片段形式自pDAB1592及pDAB1594切下該鋅指融合蛋白基因表現序列盒、末端填充及在PmeI位點處選殖至pDAB2407中(圖34A)而構建。所得質粒分別稱為pDAB1596(圖34B)及pDAB1598(圖34C)，用於IL－1 ZFN及Scd27 ZFN，且其係鋅指融合蛋白基因載體植物細胞重新轉化之二元變型。
實例6－陽性對照載體之設計及產生
為估計異常重組頻率並擔當陽性對照，使用一包含PAT基因表現序列盒之載體。為與最終重組體可比較，在該PAT編碼序列之299/300 bp處插入擬南芥4－CoAS內含子－1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)(Wohlleben等人，1988,Gene 70：25－37)。為製造此構成物，使來自pDAB1576之2559 bp SwaI/ClaI片段與經相同限制酵素消化的pDAB1577(圖35)骨架片段連接。所得載體包含帶有位於PAT編碼序列中間部位之1743 bp擬南芥4－CoAS內含子－1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)插入物的PAT基因表現序列盒(Wohlleben等人，1988,Gene 70：25－37)。此載體稱為pDAB1578(圖36)。
為製造pDAB1578之二元變型，利用PmeI/XhoI自pDAB1578切下帶有擬南芥內含子－1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)之PAT基因表現序列盒。對該片段之3'端實施鈍端處理後，在PmeI位點處將其插入pDAB2407(二元基礎載體)中。所得載體稱為pDAB1601(圖37)，其包含含有擬南芥4－CoAS內含子－1(基因座At3g21320，GenBank NC 003074)序列之PAT基因(Wohlleben等人，1988，Gene 70：25－37)，該PAT基因由擬南芥ubi10啟動子(Callis等人，1990,J.Biol.Chem.265－12486－12493)驅動並以根瘤土壤桿菌orf25/26 3' UTR(Gelvin等人，1987，EP222493)為末端。
實例7：利用鋅指核酸酶基因及供體DNA序列對靶細胞進行重新轉化
選擇三種獨立且抗潮黴素之基因轉殖培養物(NT1－240、NT1－260及BY2－380)(各包含一單個全長型經整合之靶序列拷貝)，並藉由將約250－500毫克愈傷組織置於40－50毫升含有100毫克/升潮黴素之基礎培養基(對於NT1及BY2分別為基於MS或基於LS之培養基)中並按上文所述每隔7天實施繼代培養來重新開始懸浮培養。在重新轉化之前，將懸浮液培養物轉移至不含潮黴之基礎培養基中。
按上文所述實施靶細胞培養物之土壤桿菌介導的轉化。對於各實驗，按下述生成10個共同培養平皿：一包含經100微升含有pDAB1600(供體DNA)之土壤桿菌菌株共同培養之細胞的平皿；一包含經100微升含有pDAB1601(PAT可選標記)之土壤桿菌 菌株共同培養之細胞的平皿；四個經50微升含有pDAB1600(供體DNA)之土壤桿菌菌株及250微升含有pDAB1596(IL－1 ZFP－Fok1)之土壤桿菌菌株共同培養之細胞的平皿；及四個包含經50微升含有pDAB1600(供體DNA)之土壤桿菌菌株及250微升含有pDAB1598(Scd 27a ZFP－Fok1)之土壤桿菌菌株共同培養之細胞的平皿。繼利用上述方法之共同培養之後，將細胞析出置於含有500毫克/升羧苄青黴素及分別針對NT1或BY2之10毫克/升或15毫克/升Bialaphos的基礎培養基介質上(對於NT1及BY2分別為基於MS或基於LS之培養基)。經平皿接種2－4周後出現了個別抗Bialaphos分離菌群(表3)，將其轉移至單獨的60×20毫米平皿中(每個平皿中一個分離菌群)，其在此處以14日繼代培養方案保持愈傷狀態，直至需要用於分析之時。
實例8同源重組之證實
A.染色體間同源重組 在實例1至7中所闡述之例示性煙草系統中，針對鋅指Fok1融合蛋白促進的染色體間同源重組對兩種策略進行了研究及測試。
在策略1中，針對鋅指－FOk1融合蛋白(IL－1－L0－Fok1)之結合位點包含在靶構成物之中間部位(圖37)。在此策略中，該結合位點在兩側均由約3 kb之非同源序列側接，然後分別在上游及下游由同源序列－1(普通煙草RB7 MAR)及同源序列－2(擬南芥4－CoAS內含子－1)側接。據猜測，在IL－1鋅指－Fok1融合蛋白之存在下，IL－1－L0－Fok1結合序列應被識別且在此特定位點處應受誘發雙鏈DNA斷裂，此應促進內源DNA修復過程。在供體DNA(包含與靶序列中相同之同源序列)之存在下，5'部分PAT基因連同其啟動子應經由同源重組置換介於靶標中同源序列之間的整個約6 kb DNA片段。經由此方法，兩個部分PAT基因序列(擬南芥4－CoAS內含子－1介於其間)應重構成一功能性PAT基因，引起PAT表現及一抗除草劑表現型。
在策略2中，兩鋅指－Fok1結合位點(Scd27－L0－Fok1)包含於該靶載體中：一個直接位於普通煙草RB7 MAR之下游，且另一個直接位於擬南芥4－CoAS內含子1之上游(圖39)。介於兩鋅指Fok1融合蛋白結合位點之間係約6 kb序列，其包含5' GFP片段、一GUS表現序列盒及3' GFP片段。據猜測，在Scd27鋅指Fok1融合蛋白之存在下，兩結合序列應被識別且在兩位點處皆應誘發雙鏈DNA斷裂，此應移除介於該等兩結合序列間之約6 kb DNA片段，並促進內源DNA修復過程。與策略1相類似，在供體DNA(包含與靶序列中相同之同源序列)之存在下，5'部分PAT基因連同其啟動子應經由同源重組在誘發了雙鏈DNA斷裂之位點處插入靶序列中。經由此方法，兩個部分PAT基因序列(擬南芥4－CoAS內含子－1介於其間)應重構成一功能性PAT基因，引起PAT表現及一抗除草劑表現型。
首先藉由PCR利用引物對P24/25(擴增了一跨躍經重組PAT基因之DNA片段)對經除草劑(Bialaphos)選擇後所獲得之所有分離菌群進行分析。引物P24與供體DNA中之PAT編碼序列之5'端同源，且引物P25與靶DNA中PAT編碼序列之3'端同源。若兩部分PAT編碼序列經由同源重組結合，將產生一2.3 kb PCR片段。如圖40中所示，一2.3 kb PCR產物係自許多所分析之隔離菌群獲得。該等隔離群係自IL－1鋅指－Fok1融合蛋白基因/供體DNA及Scd27鋅指－Fok1融合蛋白基因/供體DNA之共轉化獲得。自瓊脂糖凝膠中純化出該等來自彼等源自IL－1鋅指－Fok1及Scd27鋅指－Fok1融合蛋白基因轉化之多個獨立的代表性隔離菌群的2.3 kb PCR產物，並將其選殖至pCR2.1 TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,California)中。然後利用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Beckman Coulter)對插入TOPO載體中之2.3 kb PCR產物實施定序。序列測定結果證實，所有選殖至該TOPO載體中之PCR產物皆包含所預測之重組序列，包括具有介入普通因草4－CoAS內含子－1之5'及3'部分PAT基因序列。該等結果證實了所預測的針對所測試之策略及所例示之經由鋅指－Fok1融合蛋白基因表現之基因靶向作用的染色體間重組。
藉由PCR利用引物對P26/P25(擴增一跨躍整個重組區域之DNA片段)對兩份試樣實施進一步分析。引物P26與靶序列中HPT基因編碼區之3'端同源，且引物P25與靶序列中PAT基因編碼區之3'端同源。若在靶序列與供體DNA之間發生同源重組，則應獲得一預測的5.2 kb PCR產物。應非重組靶標應產生一約10 kb之PCR產物。自所分析之兩試樣皆獲得了一5.2 kb PCR產物。自瓊脂糖凝膠對來自所分析之該等試樣之一的5.2 kb PCR產物實施純化，並選殖至pCR2.1 TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,California)中。然後利用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Beckman Coulter,Fullerton,CA)對該PCR產物進行定序。序列測定結果證實，PCR產物包含重組序列，包括(自5'至3')：HPT編碼區之3'端(來自靶序列)、擬南芥 orf－24 3' UTR(來自靶序列)、普通煙草RB7 MAR(同源序列－1)、擬南芥ubi－10啟動子(來自供體DNA)、5'部分PAT基因(來自供體DNA)、擬南芥4－CoAS內含子－1(同源序列－2)、3'部分PAT基因(來自靶序列)。此結果進一步證實，PCR產物由染色體間同源重組產生。
為在基因組水平上進一步分析該等重組體，用一組選自IL－1鋅指－Fok1融合蛋白基因/供體DNA及Scd27鋅指－Fok1融合蛋白基因/供體DNA轉化之22個分離菌群實施南方印跡分析法。藉助PCR分析證實了所有該等試樣皆係重組體。用BanII對來自各試樣之10微克基因組DNA實施消化。將經消化的基因組DNA分離至0.8%瓊脂糖凝膠上，並轉移至尼龍薄膜上。在薄膜上經交聯後，用3' PAT探針對DNA實施雜交。所期之重組體應產生一2079 bp之帶，而非重組靶序列應產生一3018 bp之帶。結果顯示，在所分析的22份試樣中，有18份試樣具有一約2 kb之預期大小之帶，此表明，該等事件係經由兩部分PAT片段附近之同源重組而得到(圖41)。有兩試樣顯示一非預期大小之帶(與靶對照比較，一個較大，一個較小)，此表明該等兩試樣中之重組並非完全依賴於同源性或在重組期間或之後發生了額外序列重排。另外2試樣顯示一與靶對照(約3 kb)相同之帶，表明該等試樣或者係自除草劑選擇脫逸者或者係一混合種群之細胞(其中僅一小部分源自同源重組，低於南方印跡分析法之檢出限度)。最可能之情況係後者，此乃因當經PCR分析時該等試樣顯示了與同源重組相對應之預期擴增產物。在該等顯示了預期重組帶之18份試樣中，有4份試樣亦具有與靶對照大小相同之附加譜帶，表明該等試樣代表一具有一些非重組細胞之混合種群。另外4種試樣具有額外的多種大小之帶，表明該等試樣係包含一些經歷了非同源性依賴事件之細胞的遺傳嵌合體。總之，藉由南方印跡分析法證實了22份試樣中有10份試樣經歷了所預期之同源重組(至少在涉及兩部分PAT片段之區域中)。
B.染色體內同源重組 為測試鋅指－Fok1促進的染色體內同源重組，將兩具有540 bp之重疊序列的非功能性GFP片段包括於圖42中所闡述之靶載體中。介於兩片段之間係GUS基因表現序列盒。使IL－1－Fok1融合蛋白結合序列與GUS編碼序列在其N末端融合。據推測，在IL－1－Fok1融合蛋白之存在下，IL－1 ZFN結合序列應被識別，且應誘發一雙鏈DNA斷裂，此應促進內源DNA修復過程。在不存在供體DNA之情況下，兩部分同源GFP片段應經歷一染色體內同源重組過程，且應重新構建一功能性GFP基因。
經由如上文所述土壤桿菌屬 介導的轉化作用利用質粒pDAB1596(IL－1－Fok1融合蛋白基因二元載體)對兩靶細胞系(BY2－380及NT1－260)實施轉化。包括供體DNA(pDAB1600)及PAT對照DNA(pDAB1601)兩種作為分開的對照處理。經轉化後，將細胞鋪於非選擇培養基上。在轉化後5－8天時，經構成之GFP基因之明顯表現產生了可見螢光。如在表4中所總結，在各經IL－1－Fok1融合蛋白基因構成物(pDAB1596)轉化的平皿中觀察到了約50個螢光部位。在所測試之兩靶細胞系之間未觀察到顯著差異。在經供體DNA或PAT基因構成物轉化的陰性對照中，未觀察到超出輕度本底之可見螢光。
表4功能性GFP經由IL－1－Fok1鋅指融合蛋白促進的染色體內同源重組之構建
為證實自功能性GFP基因之重構得到的綠色螢光部位，實施了GFP表現組織之分子分析。由於所有細胞皆鋪於非選擇培養基上，故難以獲得關於GFP表現同質之細胞種群。藉助於解剖顯微鏡自平皿中分離出若干螢光組織節段並經由數個傳代之選擇性繼代培養實施富集。自該等在外觀上經濃縮之組織分離出基因組DNA，並藉由PCR利用引物對P27/P28實施分析。引物P27與靶DNA序列中5'部分GFP片段之5'端同源，且引物P28與靶DNA序列中3'部分GFP片段之3'端同源。若該GFP基因已經經由介於該等兩部分GFP片段之間的染色體內同源重組而重新構成，則應獲得一預測的0.6 kb PCR產物。此非重組靶標應產生一4.1 kb之PCR產物。如圖43中所示，所有自螢光組織富集之試樣皆具有該預期的0.6 kb PCR產物，此表明在該等組織中已經重新構成了一功能性GFP基因。在所有該等經富集試樣中亦觀察到了一第二4.1 kb PCR產物，此表明存在非重組細胞種群。此並不意外，此乃因該等試樣僅係藉助利用螢光作為指示之視覺選擇法而經富集。將PCR產物分離至一0.8%瓊脂糖凝膠上，轉移至一尼薄膜上並用GFP基因編碼序列實施探查。結果表明，兩PCR產物(0.6 kb及4.1 kb)皆包含GFP序列，藉此證實該螢光係由重新構成之GFP基因之表現產生。
實例9：靶向至單子葉植物中基因之鋅指－Fok1融合蛋白之設計
為促進單子葉植物(例如玉米、高粱、小麥、大麥、稻米)同源性定向的修復，按下述設計並合成鋅指核酸酶。選擇一目標基因，該基因較佳包括至少一對於胺基酸取代而言可進行尋靶之密碼子。對所選基因之相關部分進行選殖，並對該純系之核苷酸序列進行測定。
視情況利用一包含一個體鋅指結構及其靶位點之列表及/或一雙指模組及其靶位點之列表的電腦程式，針對一對靶序列(由5－6個核苷酸對分開)對由此獲得之序列進行掃描，其中各靶序列可由3指、4指、5指或6指鋅指蛋白結合。參見(例如)美國專利第6,785,613號；WO 98/53057；WO 01/53480及美國專利申請公開案第2003/0092000號。用於ZFP設計之其他方法揭示於(例如)美國專利第5,789,538號；第6,013,453號；第6,410,248號；第6,733,970號；第6,746,838號；第6,785,613號；第6,866,997號；第7,030,215號；WO 01/088197；WO 02/099084；及美國專利申請公開案第2003/0044957號；第2003/0108880號；第2003/0134318號及第2004/0128717號。
針對在前文步驟中經鑑別之各靶序列，合成編碼介於Fok1裂解半結構域與可結合至該靶序列之鋅指蛋白之間之融合物的基因。參見(例如)美國專利第5,436,150號；WO 2005/084190及美國專利申請公開案第2005/0064474號。然後，針對各融合蛋白與其靶序列結合之親和力利用一如Bartsevich等人((2003)Stem Cells 21：632－637)所闡述之ELISA分析法對各融合蛋白進行測試。在一基於細胞之報導子分析中對具有超過預定臨限值之靶序列結合親和力的蛋白質實施進一步測試。
視情況，可對上文所述一或多種融合蛋白之結合親和力進行評價，並視需要利用美國專利第6,794,136號中所闡述之方法加以改良。
如(例如)Urnov等人((2005)Nature 435：646－651)及美國專利申請公開案第2005/0064474號中所述，實施基於細胞之測試。簡言之，於一適宜細胞系中在一強力黴素(doxycycline)誘導型啟動子之轉錄控制下將一如上文所述經識別之靶序列對插入至一有缺陷的染色體綠色螢光蛋白(GFP)基因中。用編碼兩鋅指/Fok1融合蛋白(其各結合至該等靶序列之一)之核酸並用包含若其擔當用於該有缺陷染色體GFP基因之同源性定向修復的模板則將重新構成一功能性GFP基因之序列的核酸對細胞進行轉染。其中已經發生同源性定向之修復的細胞可藉由螢光激活細胞分類術(伴隨利用強力黴素之誘導)進行鑑別及定量。
實例10：用於單子葉植物之供體DNA載體之設計及產生
供體DNA構成物包括針對所選基因之編碼序列(CDS)及該CDS之基因組序列上游及/或下游。CDS及/或基因組序列係自美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))數據庫及/或植物基因組數據庫(Plant Genome Database)獲得。介於部分序列與已知序列間的"毗連群"可用於證實該等序列係源自所選單子葉植物基因組之相同基因座。為避免該鋅指核酸酶結合序列繼重組後被重複地裂解，亦可在供體DNA中於鋅指核酸酶(ZFN)結合序列內引入兩單獨的核苷酸突變(其不會引起所編碼胺基酸序列之改變)。該等突變體之一或兩個皆可構建一限制酵素位點，此有助於下游分子特徵化。
為構建該供體DNA載體，利用適宜引物自所選單子葉植物之基因組DNA對一覆蓋一些CDS及下游序列之DNA片段實施PCR擴增。較佳向該PCR片段之5'及3'端分別添加限制位點(例如SacI及BamHI位點)。將該PCR產物選殖至pCR Blunt II TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,California)中。
可藉由利用QuickChange定點誘變套組(Stratagene,La Jolla,California)置換一或多個選定的核苷酸而引入一位於期望位置處之突變。如上文所述，亦可以類似方式利用QuickChange定點誘變套組(Stratagene,La Jolla,California)在鋅指－Fok1結合序列中引入其他單個的沉默突變(例如2個、3個或更多個單個的突變)。藉由適宜的消化作用將具有取代突變及其他沉默單個突變之PCR片段自pCR Blunt II TOPO載體中分離出來並在相同位點處將其選殖至pSB11(圖44)中。隨後將所得質粒DNA轉化至一含有pSB1質粒(圖45)之土壤桿菌菌株中，以便經由同源重組形成一用於植物細胞轉化之超二元供體載體。
實例11：用於轉化之單子葉植物鋅指－Fok1融合蛋白基因載體之設計及產生
鋅指－Fok1融合蛋白基因係藉由一適宜的單子葉植物啟動子(例如玉米ubi1啟動子(Quail等人，US5614399))進行驅動。序列盒亦可包括玉米過氧化物酶－5(per5)3' UTR(Ainley等人，W09856921)。為製造此載體，藉由NcoI/SacI消化將該鋅指－Fok1融合蛋白基因自其原初源載體中分離出來並在相同位點處將其選殖至pDAB3872(圖46)中。藉由HindIII/MscI消化將包括玉米ubi－1啟動子、鋅指－Fok1融合蛋白基因及玉米per－5 3' UTR之表現序列盒自上文製造的中間體載體中分離出來並在HindIII/PmeI位點處將其插入pSB 11中。隨後，將所得質粒轉化至一含有pSB1質粒之土壤桿菌菌株中，以便經由同源重組形成超二元載體(pDAB4365)(圖47)。pDAB4365係用於植物細胞轉化之鋅指－Fok1融合蛋白基因表現載體的超二元變型。
實例12：帶有鋅指核酸酶基因及供體DNA之玉米細胞之轉化及細胞培養物之產生
可將"High II" F1 雜交(Armstrong等人，1991，Maize Genet.Coop.News Lett.65：92－93)之種子直接植入含有一市售土壤混合物(Conrad Fafard公司，Springfield；Soil Mix #3)之5加侖盆中。在溫室中利用一藉由一組產生約1,500 ft－candles之照度的高壓鈉及金屬鹵化物燈增補之16小時光週期對該等植物進行培養。日夜溫度保持在27/20±2℃。利用標準的肥料桶混按需要為該等植物澆水。
為獲得未成熟胚，可實施受控的授粉(靠近邊緣授粉或自花受粉)。在授粉前一天藉由修剪花絲使開花期植物準備好授粉，藉此產生全束花絲以達成最大授粉及結實。在授粉之日，將活躍脫落的雄花穗裝入袋中，並採集新鮮的花粉小心地塗至花絲上。當顯現的胚達1.0－1.2毫米大小時(經授粉後9－10天)，可將耳部切下並實施表現滅菌。簡言之，將耳部浸入70%乙醇中經2－5分鐘，再浸入20%市售漂白劑(0.1%次氯酸鈉)中經30－45分鐘，隨後用無菌蒸餾水沖洗3次。消毒後，可對未成熟胚實施分離。
用兩種不同的土壤桿菌菌株進行轉化。第一種包含如實例9－11中所闡述之鋅指核酸酶基因構成物，且第二種包含含有取代突變之供體DNA序列。可使用美國專利第5,591,616號中所闡述之得自Japan Tobacco之"超二元"載體系統。
為製備土壤桿菌懸浮液，將1－2環來自一劃線平板(包含5克/公升酵母抽提物、10克/公升Bacto－Peptone、5克/公升氯化鈉、50毫克/公升大觀黴素(spectinomycin)、10毫克/公升四環素及15克/公升Bacto Agar)之細菌置入5毫升"滲透"培養基中。該"滲透"培養基由LS基礎鹽(Linsmaier等人，1965，Physiol.Plant.)、N6維生素(Chu等人，1975，Sci.Sinica 18：659－668)、1.5毫克/升2,4－D、68.5克/升蔗糖、36克/升葡萄糖、6 mM脯胺酸組成，在過濾滅菌前調節至pH值為5.2。對混合物實施渦旋，直至達均勻的懸浮液。細菌濃度可利用Klett－Summerson光電比色計藉由讀取溶液密度而進行測定。將溶液調節至一Klett 200(約1×109 菌落生成單位/毫升)之濃度，並添加乙醯丁香酮以達100 μM之最終濃度。
將未成熟胚直接分離至包含2毫升"滲透"培養基之微量離心管中。對包含約100個胚之各試管實施3－5秒鐘渦旋。將該培養基移去，並用相同組合物之新鮮培養基置換之，並重複該渦旋過程。再次將該液體培養基去除，並用1毫升Klett 200濃度之土壤桿菌溶液(800微升鋅指核酸酶菌株及200微升供體DNA菌株)置換之。對土壤桿菌及胚混合物實施30秒鐘渦旋。繼在室溫下進行5分鐘培養後，可將胚轉移並將其胚軸向下地置於"共培養"培養基上，於25℃下於黑暗中封閉5天。該"共培養"培養基由LS基礎鹽(Linsmaier等人，1965，Physiol.Plant.)、N6維生素(Chu等人，1975，Sci.Sinica 18：659－668)、1.5毫克/公升2,4－D、30克/公升蔗糖、6 mM脯胺酸、0.85毫克/公升硝酸銀、100 μM乙醯丁香酮、3克/公升GELRITE組成，在過濾滅菌前調節至pH值為5.8。
實例13：同源重組體之選擇
分別用兩種包含鋅指核酸酶基因序列盒及供體DNA之土壤桿菌 之一5：1混合物實施共培養，將胚轉移至"愈傷"培養基中，該"愈傷"培養基中可包括阻止該土壤桿菌進一步生長之組份(例如250毫克/升頭孢噻肟(Cefotaxime)及/或500 nM Pursuit)。該"愈傷"培養基由LS基礎鹽(Linsmaier等人，1965，Physiol.Plant.)、N6維生素(Chu等人，1975，Sci.Sinica 18：659－668)、1.5毫克/公升2,4－D、0.5克/公升MES、30克/公升蔗糖、6 mM脯胺酸、1毫克/公升硝酸銀、8克/公升TC瓊脂(PhytoTechnology Laboratories,Shawnee Mission,KS)組成，在高壓蒸汽滅菌前調節至pH值為5.8。在整個選擇期內，該等胚皆係在28℃下於黑暗中進行培養。
對於植物再生，將愈傷培養物轉移至"誘導"培養基中，並在27℃下用16/8之明/暗光週期以低光照(13 μE/m2 /s)實施一周培養，隨後以高光照(40 μE/m2 /s)實施一周培養，其中光照係由冷的白色螢光燈提供。該"誘導"培養基由MS基礎鹽及維生素(Murashige等人，1962，Physiol.Plant.15：473－497)、30克/公升蔗糖、5毫克/公升6－苯甲酸嘌呤、0.025毫克/公升2,4－D、2.5克/公升GELRITE組成，在高壓蒸汽滅菌前將pH值調節至5.7。經此兩週誘導期後，將愈傷轉移至"再生"培養基中，並於27℃及高光照(40 μE/m2 /s)下實施培養。該"再生"培養基除不含荷爾蒙外與該"誘導"培養基相同。可每兩週一次將愈傷繼代培養至新鮮的"再生"培養基中直至出現枝條。
當小植株達約3－5公分長時，將其轉移至包含SH基礎鹽及維生素(Schenk等人，1972，Can.J.Bot.50：199－204)、10克/公升蔗糖、1克/公升肌－肌醇及2.5克/公升GELRITE(在高壓蒸汽滅菌前將pH值調節至5.8)之150×25毫米培養試管中。當枝條達該試管之頂部時，將小植株轉移至包含約0.25公斤市售土壤混合物(Conrad Fafard公司，Springfield；Soil Mix #3)之10公分盆中，將其徹底潤濕，並用透明塑料杯覆蓋2－4天。在3－5葉期，將植物移至5加侖盆中培養至成熟。
關於定向裂解、定向重組及定向整合之其他信息可參見美國專利申請公開案第US－2003－0232410號；第US－2005－0026157號；第US－2005－0064474號；第US－2005－0208489號及第US－2007－0134796號，其揭示內容皆以引用的方式併入本文中，用於所有目的。
本文所提及之所有專利、專利申請案及公開案皆以引用的方式全部併入本文中，用於所有目的。
儘管為清楚理解之目的，已藉由圖解及實例詳細地提供了揭示內容，但彼等業內熟練的技術人員應明瞭，可實施多種變化及修改而不背離本揭示內容之精神及範圍。因此，不應將前文闡述及實例理解為對本發明加以限制。
圖1A及1B 係稱為pDAB1585之靶向構成物之示意圖。圖1A係該構成物各構件的線形繪示。圖1B係環形構成物之繪示。
圖2A及2B 繪示例示性ZFN及其靶位點。圖2A繪示ZFN及結合區域。圖2B繪示靶位點。
圖3 係質粒pDAB1400之示意圖。
圖4 係質粒pDAB782之示意圖。
圖5 係質粒pDAB1582之示意圖。
圖6 係質粒pDAB354之示意圖。
圖7 係質粒pDAB1583之示意圖。
圖8 係質粒pDAB2407之示意圖。
圖9 係質粒pDAB1584之示意圖。
圖10 係質粒pDAB2418之示意圖。
圖11 係質粒pDAB4045之示意圖。
圖12 係質粒pDAB1575之示意圖。
圖13 係質粒pDAB1577之示意圖。
圖14 係質粒pDAB1579之示意圖。
圖15 係質粒pDAB1580之示意圖。
圖16 係質粒pDAB3401之示意圖。
圖17 係質粒pDAB1570之示意圖。
圖18 係質粒pDAB1572之示意圖。
圖19 係質粒pDAB4003之示意圖。
圖20 係質粒pDAB1571之示意圖。
圖21 係質粒pDAB7204之示意圖。
圖22 係質粒pDAB1573之示意圖。
圖23 係質粒pDAB1574之示意圖。
圖24 係質粒pDAB1581之示意圖。
圖25 係質粒pDAB1576之示意圖。
圖26A及26B 係稱為pDAB1600之靶向質粒載體之示意圖。圖26A係該質粒各構件的線形繪示。圖26B係該環形質粒之繪示。
圖27 係質粒pDAB7002之示意圖。
圖28 係質粒pDAB7025之示意圖。
圖29 係質粒pDAB1591之示意圖。
圖30 係質粒pcDNA3.1－IL1－L0－FokI之示意圖。
圖31 係質粒pcDNA3.1－SCD27－L0－FokI之示意圖。
圖32 係質粒pDAB1592之示意圖。
圖33 係質粒pDAB1594之示意圖。
圖34A、B及C 係質粒pDAB1596及pDAB1598之示意圖。圖34A係線性化質粒之示意圖。圖34B顯示pDAB1596。圖34C顯示pDAB1598。
圖35 係質粒pDAB1577之示意圖。
圖36 係質粒pDAB1578之示意圖。
圖37A及B 係質粒pDAB1601之示意圖。圖37A顯示呈線形形式之各構件。圖37B顯示環形質粒。
圖38 係一示意圖，其描繪由IL－1 ZFN－FokI融合物促進的預測染色體間同源重組。
圖39 係一示意圖，其描繪由Scd27 ZFN－FokI融合物促進的預測染色體間同源重組。
圖40 顯示對重組體之PCR分析。泳道1－20顯示來自具有SCD27－FokI融合蛋白構成物之NT1－240之轉化的同源重組事件。泳道21及22顯示來自具有SCD27－FokI融合蛋白構成物之NT1－240轉化的同源重組事件。對照泳道示於3個最左側泳道中。
圖41 顯示對重組體之南方印跡分析(Southern blot analysis)。泳道1－20顯示來自具有SCD27－FokI融合蛋白構成物之NT1－240之轉化的同源重組事件。泳道21及22顯示來自具有SCD27－FokI融合蛋白構成物之NT1－240之轉化的同源重組事件。對照泳道示於2個最左側泳道中。
圖42 係一示意圖，其描繪藉由IL－1 ZFN－FokI融合物促進的染色體內同源重組。
圖43 係PCR分析，其證實GFP係在表現IL－1－FokI融合蛋白之螢光組織中經重構成。
圖44 係質粒pSB11之示意圖。
圖45 係質粒pSB1之示意圖。
圖46 係質粒pDAB3872之示意圖。
圖47 係質粒pDAB4365之示意圖。
(無元件符號說明)

Claims (6)

  1. 一種用於將外源性序列引入至植物細胞基因組之方法，該方法包括以下步驟：(a)使該細胞與供體DNA載體接觸，該供體DNA載體包含第一、第二及第五DNA序列，該第五序列包含擬引入之DNA載體之外源性序列且係介於該供體DNA載體之第一及第二序列之間；其中該第一序列與該植物細胞基因組中之第三序列具有至少90%至95%之同源性，該第二序列與該植物細胞基因組中之第四序列具有至少90%至95%之同源性，其中該植物細胞基因組中之第三及第四序列係染色體DNA序列且該第三及第四序列之靠近邊緣係以至少1個核苷酸對分開；及(b)在該細胞內表現一或多種核酸酶，其中該一或多種核酸酶係各為一對融合蛋白，其中各融合蛋白為Fok I限制性核酸內切酶之裂解結構域與經設計鋅指結合結構域之融合物，及其中該一或多種核酸酶可於介於第三及第四序列間之對應靶序列裂解染色體DNA，其中該一或多種核酸酶可於植物細胞基因組中之第三或第四序列之一者之0.4至3千鹼基對處裂解染色體DNA；如此，在步驟(b)中染色體DNA之裂解可促進該第五DNA序列藉由同源重組作用而併入該基因組中。
  2. 如請求項1之方法，其中該外源性序列為可選標記。
  3. 如請求項2之方法，其中該可選標記係選自由以下所組 成之群：綠色螢光蛋白(GFP)、β-葡糖苷酸酶(GUS)、草銨膦乙醯基轉移酶(PAT,BAR)、新黴素磷酸轉移酶、β-內醯胺酶、兒茶酚雙加氧酶、α-澱粉酶、酪胺酸酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、發光蛋白、EPSP合成酶、腈水解酶、乙醯乳酸合成酶(ALS)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、茅草枯脫鹵素酶及鄰胺基苯甲酸合成酶。
  4. 如請求項1之方法，其中該第五序列包括一或多個轉錄調控序列。
  5. 如請求項1之方法，其中該第五序列包括編碼蛋白質或蛋白質一部分的序列。
  6. 如請求項1之方法，其中該第五序列包括一突變型染色體序列之野生型對等物，或一野生型染色體序列之突變型對等物。
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