CN109414414A - 用于治疗肥胖症和/或糖尿病以及用于鉴定候选治疗剂的方法和组合物 - Google Patents

用于治疗肥胖症和/或糖尿病以及用于鉴定候选治疗剂的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN109414414A
CN109414414A CN201780024269.5A CN201780024269A CN109414414A CN 109414414 A CN109414414 A CN 109414414A CN 201780024269 A CN201780024269 A CN 201780024269A CN 109414414 A CN109414414 A CN 109414414A
Authority
CN
China
Prior art keywords
clpp
mouse
cell
expression
medicament
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780024269.5A
Other languages
English (en)
Inventor
Y·黄
Q·徐
R·W·马利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
J David Gladstone Institutes
Original Assignee
J David Gladstone Institutes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by J David Gladstone Institutes filed Critical J David Gladstone Institutes
Publication of CN109414414A publication Critical patent/CN109414414A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

提供了用于鉴定用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂的方法和组合物。这些方法包括例如使哺乳动物细胞或细胞群与测试药剂接触，并测量哺乳动物细胞或细胞群细胞中ClpP的表达水平和/或活性水平。还提供了用于治疗个体(例如，肥胖和/或患有糖尿病患者)的方法和组合物。治疗方法包括向个体施用ClpP抑制剂(例如，用来预防或减少体重增加、增加胰岛素敏感性和/或增加葡萄糖耐量)。

Description

用于治疗肥胖症和/或糖尿病以及用于鉴定候选治疗剂的方 法和组合物
交叉引用
本申请要求2016年3月16日提交的美国临时专利申请No.62/309,311的权益，该申请通过引用整体并入本文。
背景技术
哺乳动物ClpXP是一种线粒体基质蛋白酶复合物，其需要ATP以解折叠和水解蛋白质底物。ClpXP复合物包括催化亚单位(ClpP)和调节亚单位(ClpX)。大肠杆菌ClpP同源物形成具有内部水解活性位点的桶形复合物，而大肠杆菌ClpX同源物形成附着于上述桶的每个末端并负责底物识别和解折叠的六聚体环。原核ClpXP蛋白酶促进受损或不需要的多肽的降解，用于蛋白质质量控制。与大肠杆菌ClpP一样，人ClpP也在ClpX存在下形成腔室样结构。ClpP在线粒体(在能量稳态和代谢调节中起关键作用的哺乳动物细胞的主要能量产生器)中的生理功能在很大程度上是未知的。
本领域需要用于鉴定用于治疗与能量稳态和代谢调节相关的疾病(例如肥胖症和糖尿病)的候选药剂的方法和组合物。例如，本领域需要用于鉴定候选药剂的方法和组合物，该候选药剂用于增加胰岛素敏感性，预防和/或减少体重增加，预防和/或减少脂肪组织(例如白色脂肪组织)等。本领域还需要用于治疗肥胖症和/或糖尿病的方法和组合物(例如通过增加胰岛素敏感性，预防和/或减少体重增加，预防和/或减少脂肪组织(例如白色脂肪组织)等)。
发明内容
提供了用于鉴定用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂的方法和组合物(例如，用于减少个体中脂肪组织的量、预防或减少个体的体重增加、增加个体的胰岛素敏感性、和/或增加个体的葡萄糖耐量的候选药剂)。在本公开的一些实施方案中，此类方法包括(a)用测试药剂接触哺乳动物细胞或细胞群(例如，啮齿动物细胞，小鼠细胞，大鼠细胞，非人灵长类动物细胞，猴细胞，人细胞，或其细胞群)，和(b)测量哺乳动物细胞(与药剂接触的细胞)或与药剂接触的细胞群的细胞中ClpP的表达水平(例如，蛋白质和/或mRNA)和/或活性水平。然后确定测试药剂是否导致ClpP表达和/或活性的降低。那些降低ClpP表达(例如，蛋白质和/或mRNA)和/或活性的测试药剂可以被鉴定为用于治疗的候选药剂。因此，在与细胞或细胞群接触之前(例如，体外、离体或体内)，化合物被认为是“测试药剂”，如果该化合物(测试药剂)降低ClpP表达(例如，正如能够通过测量ClpP蛋白和/或编码ClpP的mRNA和/或活性水平所示的)和/或活性水平，它被认为是“候选药剂”(例如，用于治疗例如用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂)。因此，在一些情况下，主题方法还包括步骤(c)：确定测试药剂是否引起ClpP表达和/或活性的降低(例如，此处ClpP表达的降低指示测试药剂是治疗的候选药剂)。在一些情况下，主题方法包括以下任一步骤：(步骤c)确定测试药剂导致ClpP的表达水平和/或活性水平降低(例如，相对于参考值，如在与测试药剂接触之前的ClpP表达水平和/或活性水平，接触已知不会降低ClpP表达的对照剂后ClpP的表达水平和/或活性水平等)，并将测试药剂鉴定为治疗肥胖和/或糖尿病的候选药剂，或(步骤d)确定测试药剂不会导致ClpP的表达水平和/或活性水平降低(例如，相对于参考值)。
在一些情况下，测试药剂是小分子或多肽。在一些情况下，(ClpP的)表达水平是RNA表达水平并且测量包括例如使用定量RT-PCR、微阵列或RNA测序。在一些情况下，(ClpP的)表达水平是蛋白质表达水平并且测量包括检测ClpP蛋白(例如使用抗ClpP抗体、质谱和/或酶联免疫吸附法(ELISA)测定)。在一些情况下，该方法包括筛选多种测试药剂以鉴定治疗肥胖症和/或糖尿病的一种或多种候选药剂。
在一些情况下，哺乳动物细胞(待与测试药剂接触的靶细胞)是肝脏细胞(肝细胞)。在一些情况下，接触是体外的(例如哺乳动物细胞是体外的)。在一些情况下，接触是离体的(例如哺乳动物细胞是离体的)。在一些情况下，接触是体内的(例如哺乳动物细胞是体内的)。在一些情况下，接触包括将测试药剂施用于小鼠。在一些情况下，该方法包括以下步骤：在步骤(a)之前测量小鼠中ClpP的表达水平和/或活性水平，以获得参考值。在一些情况下，该方法包括生成该测试药剂是用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂的报告的步骤。
在一些情况下，主题方法包括在确定测试药剂是治疗的候选药剂之后，将所鉴定的候选药剂施用于患有肥胖症和/或糖尿病的个体的步骤(例如作为治疗，或者作为测试候选药剂是否会产生预期结果的方法)。在一些情况下，个体是小鼠、非人灵长类动物或人。在一些情况下，该方法包括在将所鉴定的候选药剂施用于个体之后，测量个体的一个或多个特征，该特征选自：胰岛素敏感性；血糖水平；葡萄糖耐量；体脂肪质量；脂肪组织的量；白色脂肪组织的量；脂肪质量百分比；体重；内脏脂肪脂肪细胞大小；血浆瘦素水平；生长激素水平；基础能量消耗；肌肉和/或成纤维细胞中磷酸化AKT(p-AKT)水平；瘦体重百分比；肝细胞中线粒体数量；肝细胞中的线粒体质量；肝细胞中的线粒体形态；成纤维细胞的呼吸能力；成纤维细胞最大耗氧率(OCR)；和成纤维细胞对H2O2诱导的细胞毒性的抗性。
还提供了用于治疗个体(例如，肥胖和/或患有糖尿病的人或已被诊断为肥胖和/或患有糖尿病的人)的方法和组合物。治疗方法包括以减少个体脂肪组织量、预防或减少个体体重增加、增加个体胰岛素敏感性和/或增加个体葡萄糖耐量的有效量将ClpP抑制剂(例如降低ClpP蛋白的量和/或活性的药剂)施用于个体。在一些情况下，ClpP抑制剂是小分子，例如本文所描述的任何小分子ClpP抑制剂，例如β-内酯，如本文所描述的任何β-内酯分子。在一些情况下，小分子是(3RS，4RS)-3-(壬-8-烯-1-基)-4-(2-(吡啶-3-基)乙基)氧杂环丁烷-2-酮。在一些情况下，ClpP抑制剂是靶向ClpP的RNAi药剂或基因编辑药剂(例如，特异性降低ClpP蛋白的表达水平)。在一些情况下，施用ClpP抑制剂，使得ClpP表达的降低基本上是肝脏特异性的，并且所施用的量对于增加个体的胰岛素敏感性是有效的。在一些情况下，将ClpP抑制剂直接递送至个体的肝脏，并且所施用的量对于增加个体的胰岛素敏感性是有效的。在一些情况下，施用包括局部注射。在一些情况下，主题治疗方法包括测量个体的胰岛素敏感性的步骤。
附图说明
当结合附图阅读时，从以下详述中可以最好地理解本发明。需要强调的是，根据惯例，附图的各种特征不是按比例的。相反，为了清楚起见，各种特征的尺寸被任意扩大或缩小。附图中包括以下附图。
图1(a-m)提供的数据显示ClpP-/-小鼠具有较少体脂和对高脂肪饮食诱导的肥胖的抗性。图1(a)提供的图像显示ClpP-/-小鼠较小且体脂较低。图1(b)提供的图显示ClpP-/-小鼠的体重比野生型(WT)和ClpP+/-同窝出生仔畜更轻(WT雌性，n＝9，ClpP+/-雌性，n＝10，ClpP-/-雌性，n＝13，WT雄性，n＝13，ClpP+/-雄性，n＝13，ClpP-/-雄性，n＝10)。图1(图c)提供的图显示新生ClpP-/-幼崽(产后第1天)与WT和ClpP+/-幼崽具有相似的体重(WT，n＝5，ClpP+/-，n＝7，ClpP-/-，n＝6)。图1(d)、图1(e)提供的图显示5月龄雄性小鼠的脂肪质量和脂肪含量(n＝7)。图1(f)、图1(g)提供的图显示5月龄雄性小鼠的瘦体重和瘦肉含量(n＝7)。图1(h)、图1(i)提供的数据显示8月龄雄性小鼠的棕色脂肪组织质量和含量(WT和ClpP+/-，n＝7，ClpP-/-，n＝4)。图1(j)提供的图显示高脂饮食(HFD)的8月龄雄性小鼠的体重增加(WT和ClpP+/-，n＝8，ClpP-/-，n＝7)。图1(k)、图1(l)提供了40天的HFD之后8月龄雄性小鼠的脂肪质量和含量(WT，n＝8，ClpP+/-和ClpP-/-，n＝7)。图1(m)提供了WT、ClpP+/-和ClpP-/-小鼠的脂肪细胞大小分布的直方图。数据为平均值±SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005vs WT。
图2(a-i)提供的数据显示ClpP-/-小鼠已经改变了全身能量消耗。图2(a)、图2(b)提供的图显示7-8月龄雄性小鼠的食物的摄入量(WT和ClpP-/-，n＝12，ClpP+/-，n＝15)。图2(c)提供了禁食-重新进食实验的时间表。图2(d)、图2(e)提供的图显示24h禁食后7-8月龄雄性小鼠的体重减轻(WT和ClpP-/-，n＝14，ClpP+/-，n＝15)。图2(f)提供的图显示在0-8小时或0-24小时重新进食时间段期间7-8月龄雄性小鼠的食物的摄入量(WT和ClpP-/-，n＝3，ClpP+/-，n＝4)。图2(g)提供的图显示在8小时或24小时重新进食后7-8月龄雄性小鼠的体重增加百分比(WT和ClpP-/-，n＝14，ClpP+/-，n＝15)。图2(h)、图2(i)提供的图显示16h禁食后或自由进食期间8月龄雄性小鼠的体温(WT和ClpP+/-，n＝13，ClpP-/-，n＝14)。数据为平均值±SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005vs WT。
图3(a-o)提供的数据显示ClpP-/-小鼠已经增加了胰岛素敏感性。图3(a-c)提供的图显示正常饮食的8月龄雄性小鼠的血糖和血浆胰岛素水平(每组n＝8)。图3(d)、图3(e)提供的图显示高脂饮食的8月龄雄性小鼠的血糖和血浆胰岛素水平(每组n＝5)。图3(f)提供的图显示6-10月龄雄性小鼠的葡萄糖耐量曲线(每组n＝9)。图3(g)提供的图显示葡萄糖负荷后6-10月龄雄性小鼠的血浆胰岛素水平(每组n＝5)。图3(h)提供的图显示12月龄雄性小鼠的胰岛素耐量曲线(每组n＝7)。图3(i)提供的图显示14月龄雄性小鼠的丙酮酸耐量曲线(WT和ClpP-/-，n＝5，ClpP+/-，n＝7)。图3(j)、图3(k)提供的来自WT、ClpP+/-或ClpP-/-小鼠的小鼠成纤维细胞的pAKT免疫印迹的代表性图像(j)和定量(k)。图3(l)提供的图显示10月龄雄性小鼠的腓肠肌中的pAKT水平(每组n＝3)。图3(m)提供的图显示IGF处理后小鼠的成纤维细胞中的pAKT水平(每组每剂量n＝6)。图3(n)提供的图显示4h禁食后具有不同ClpP基因型的3-7月龄db/db小鼠的血糖水平(WT，n＝8，ClpP+/-，n＝7，ClpP-/-，n＝6)。图3(o)提供的图显示具有不同ClpP基因型的3-7月龄db/db小鼠的葡萄糖耐量曲线(WT，n＝8，ClpP+/-，n＝7，ClpP-/-，n＝6)。数据为平均值±SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005vs WT。
图4(a-l)提供的数据显示ClpP-/-小鼠已经增加了线粒体伴侣水平。图4(a-h)提供来自小鼠各器官的裂解物中TRAP1、Grp75、LRPPRC和ClpX的代表性的蛋白质印迹和定量(每组n＝3)。图4(i)、图4(j)提供了WT或ClpP-/-小鼠成纤维细胞裂解物中ClpX、TRAP1、LRPPRC和OAT的代表性蛋白质印迹(i)和定量(j)。图4(k)、图4(1)提供了用空载体(对照)或小鼠ClpP cDNA构建体转染的ClpP-/-成纤维细胞中ClpX、TRAP1、LRPPRC和OAT的代表性蛋白质印迹(k)和定量(1)。数据为平均值±SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005vs WT。
图5(a-j)提供的数据显示ClpP-/-小鼠具有增加的线粒体数量、改善的线粒体功能和增强的抗氧化应激能力。图5(a)提供了WT和ClpP-/-小鼠肝细胞中线粒体的代表性电子显微镜图像。比例尺是2μm。图5(b)、图5(c)提供了ClpP-/-小鼠肝细胞中线粒体数(b)和质量(c，通过线粒体面积测量)增加的图。在13,600倍放大倍数下对每个随机视野计数线粒体数目(WT，n＝17，ClpP-/-，n＝12)。在13,600倍放大倍数下通过Image J测量每个视野的总线粒体面积(WT，n＝17，ClpP-/-，n＝12)。图5(d)提供了在基础和解偶联条件下来自ClpP-/-和WT小鼠的成纤维细胞的耗氧率(OCR)曲线(每组n＝12)。图5(e)提供了显示与来自WT小鼠的成纤维细胞相比，来自ClpP-/-小鼠的成纤维细胞对H2O2诱导的细胞死亡具有抗性的图(每组n＝8)。图5(f)提供了显示小鼠ClpP的过表达降低ClpP-/-成纤维细胞的呼吸能力的图(每组n＝12)。图5(g)提供了显示小鼠ClpP的过表达消除了ClpP-/-成纤维细胞的H2O2抗性的图(每组n＝8)。图5(h)、图5(i)提供了显示慢病毒shRNA介导的TRAP1或Grp75敲低降低了ClpP-/-成纤维细胞对H2O2细胞毒性的抗性的图(每组n＝8)。图5(j)提供了显示慢病毒shRNA介导的不同线粒体蛋白敲低对ClpP-/-成纤维细胞最大呼吸能力的影响的图(每组n＝9)。数据为平均值±SD。*P＜0.01，**P＜0.01，***P＜0.005vs WT(b-e)或ClpP-/-(f-j)。
图6(a-i)提供的数据显示在肝脏中AAV-Cre介导的ClpP敲低增加了ClpP-cKO小鼠中的胰岛素敏感性。通过尾静脉以5×109gc/g的剂量向3-5月龄ClpP-cKO小鼠注射AAV-CMV-Cre(Cre组，n＝11)或对照AAV(Con组，n＝10)。图6(a)提供了ClpP免疫染色的图像，其显示与注射对照AAV的小鼠相比，注射AAV-Cre的ClpP-cKO小鼠的肝脏中ClpP显著降低。比例尺是50μm。图6(b-d)提供了在AAV注射之前和之后3周的ClpP-cKO小鼠的体重(b和c)的图。注射AAV-Cre的小鼠的体重增加显著低于对照AAV注射的小鼠(d)。图6(e)提供了在AAV注射之前和之后3周的ClpP-cKO小鼠的血浆胰岛素水平的图。图6(f)提供了在AAV注射之前和之后3周的ClpP-cKO小鼠的血糖的图。图6(g)提供AAV注射后4周的ClpP-cKO小鼠的葡萄糖耐量曲线。图6(h)提供了注射AAV-Cre或对照AAV和HFD 2周的ClpP-cKO小鼠的葡萄糖耐量曲线。图6(i)提供了给AAV注射之后6周的小鼠HFD之后收集的数据的图。在HFD 2或4周后未检测到体重增加的差异。数据为平均值±SD。*P＜0.01，***P＜0.005vs对照。
图7(a-i)提供了显示ClpP-/-小鼠的产生的数据。图7(a)提供了用于产生ClpP-/-小鼠的基因捕获策略的示意图。图7(b-i)提供了肝脏、脂肪组织、肌肉和脑的裂解物中ClpP蛋白质水平的蛋白质印迹和定量。数据为平均值±SD。***P＜0.005vs WT。
图8(a-b)提供的数据显示ClpP-/-小鼠具有正常的肝脏和肌肉组织学。图8(a)、图8(b)提供了WT、ClpP+/-和ClpP-/-小鼠中肝脏(a)和腓肠肌(b)的代表性H&E染色图像。比例尺是50μm。
图9(a-j)提供的数据显示ClpP-/-小鼠具有正常的神经学特征。图9(a-e)提供了对8月龄雄性小鼠进行抓握试验、倾斜试验、尾部悬吊试验和旋转棒试验所收集的数据图(每组n＝8)。图9(f)提供了用8-9月龄雄性小鼠进行的高架十字迷宫测试图(每组n＝8)。图9(g-j)提供了用8-9月龄雄性和雌性小鼠进行的莫里斯水迷宫测试的图(每组n＝8)(-◆-WT，-■-ClpP+/-，-▲-ClpP-/-)。H，隐藏试验；V，可见试验。数据为平均值±SEM。
图10(a-d)提供的数据显示ClpP-/-小鼠具有较小的脂肪细胞。图10(a-d)提供来自WT、ClpP+/-和ClpP-/-小鼠的H&E染色的脂肪组织的代表性图像。
图11(a-b)提供的数据显示ClpP-/-小鼠具有正常的棕色脂肪组织和胰腺组织学。图11(a)、图11(b)提供了WT、ClpP+/-和ClpP-/-小鼠中棕色脂肪组织(a)和胰腺(b)的代表性H&E染色图像。比例尺是100μm。
图12(a-d)提供了显示ClpP-/-小鼠对高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖具有抗性的数据。图12(a)、图12(b)提供了10天和20天的HFD之后8月龄雄性小鼠的体重增加的图(WT和ClpP+/-，n＝8，ClpP-/-，n＝7)。图12(c)、图12(d)提供了40天的HFD之后8月龄雄性小鼠的瘦体重的图(WT，n＝6，ClpP+/-和ClpP-/-，n＝7)。数据为平均值±SD。**P＜0.01，***P＜0.005vs WT。
图13(a-b)提供的数据显示ClpP-/-小鼠具有正常的运动活性(locomotoractivity)。图13(a)、图13(b)提供的图显示在开放场试验期间8-10月龄雄性小鼠的总运动和中心与总运动的比率(WT，n＝10，ClpP+/-和ClpP-/-，n＝12)。数据为平均值±SEM。
图14(a-c)提供了与敲除ClpP对db/db小鼠的肥胖和胰岛素抗性的影响有关的数据。图14(a)提供的图显示具有不同ClpP基因型的4-8月龄db/db小鼠的体重(WT，n＝10，ClpP+/-，n＝17，ClpP-/-，n＝8)。图14(b)、图14(c)提供的图显示16h禁食后具有不同ClpP基因型的3-7月龄db/db小鼠的血糖和血浆胰岛素水平(WT，n＝8，ClpP+/-，n＝7，ClpP-/-，n＝6)。数据为平均值±SD。*P＜0.05vs WT。
图15(a-c)提供来自对不同器官的比较2D荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)的代表性图像。图15(a)提供了WT vs ClpP-/-或WT vs ClpP+/-肝脏的2D-DIGE谱的图像。图15(b)提供了WT vs ClpP-/-或WT vs ClpP+/-肌肉的2D-DIGE谱的图像。图15(b)提供了WT vs ClpP-/-或WT vs ClpP+/-海马的2D-DIGE谱的图像。绿色，WT；红色，ClpP-/-或ClpP+/-。
图16(a-b)提供的数据显示ClpP的缺失增加了各种器官中许多线粒体蛋白的水平。图16(图a)，图16(图b)提供了在不同器官的裂解物中OAT、LonP、SDH2、ATP6V1A、VDAC、Hsp60、CPS1、Hsp70、Grp78和Hsp60的蛋白质印迹和定量。数据为平均值±SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005vs WT。
图17(a-d)提供的数据显示敲除ClpP改变的小鼠肝细胞中的线粒体数量和形态。图17(a)、图17(b)提供了WT(a)和ClpP-/-(b)小鼠肝细胞中线粒体的代表性电子显微镜图像。比例尺是2μm。图17(c)提供了WT和ClpP-/-小鼠肝细胞中线粒体大小分布的直方图(WT，n＝507，ClpP-/-，n＝529)。图17(d)提供了WT和ClpP-/-小鼠肝细胞中线粒体圆度分布的直方图(WT，n＝507，ClpP-/-，n＝529)。将圆度定义为4×(面积)/(π×(长轴)2)并且通过图像J在13，600倍放大倍数下测量。
图18(a-f)提供了与敲除ClpP-/-成纤维细胞中的ClpP靶向蛋白和细胞活力测定有关的数据。图18(a-d)提供了由不同慢病毒shRNA处理48小时的ClpP-/-成纤维细胞中LRPPRC、TRAP1、Grp75和ClpX蛋白质水平的代表性的蛋白质印迹和定量。图18(e)提供了描绘用H2O2处理用LRPPRC慢病毒shRNA处理的ClpP-/-成纤维细胞的细胞存活率的图(每组n＝8)(-◆-ClpP-/-，-■-ClpP-/-+LRPPRC-shRNA)。图18(e)提供了描绘用H2O2处理用ClpX慢病毒shRNA处理的ClpP-/-成纤维细胞的细胞存活率的图(每组n＝8)(-◆-ClpP-/-，-■-ClpP-/-+ClpX-shRNA)。数据为平均值±SD。**P＜0.01，***P＜0.005vs ClpP-/-。
图19(a-f)提供的数据显示ClpP的脂肪细胞特异性敲除不影响小鼠的体重、血糖水平和胰岛素敏感性。图19(a-b)提供了脂肪细胞特异性ClpP-cKO小鼠的脂肪组织中ClpP水平的蛋白质印迹，以及数据图。图19(c)提供了5-10月龄脂肪细胞特异性ClpP-cKO小鼠与对照(无Cre同窝出生仔畜)相比的体重的图(无Cre，n＝30，Ad-Cre，n＝24)。图19(d)提供了5-10月龄脂肪细胞特异性ClpP-cKO小鼠与对照(无Cre同窝出生仔畜)相比的血糖水平的图(无Cre，n＝30，Ad-Cre，n＝24)。图19(e)提供了3-6月龄脂肪细胞特异性ClpP-cKO小鼠与对照(无Cre同窝出生仔畜)相比的葡萄糖耐量曲线(无Cre，n＝13，Ad-Cre，n＝11)(-◆-无Cre，-■-Ad-Cre)。图19(f)提供了9-12月龄脂肪细胞特异性ClpP-cKO小鼠响应于HFD的体重增加的图(无Cre，n＝9，Ad-Cre，n＝11)。图19(g)提供了4周HFD之后9-12月龄脂肪细胞特异性ClpP-cKO小鼠的葡萄糖耐量曲线(无Cre，n＝9，Ad-Cre，n＝11)。***P＜0.005vs无Cre。
图20提供了在ClpP-KO组织中差异表达的蛋白质的表。
图21提供了ClpXP的潜在底物的表。
图22提供了显示如通过微阵列测定所确定的潜在的ClpXP底物的表达在转录水平上没有上调的表。
图23提供了用小分子ClpP抑制剂A2-32-01、AV167和AV179处理后ClpP底物的蛋白质印迹分析。
图24提供的图显示用小分子ClpP抑制剂A2-32-01、AV167和AV179处理后ClpP底物的蛋白质水平(针对GAPDH进行标准化)。
图25提供的图显示用小分子ClpP抑制剂A2-32-01、AV167和AV179处理后ClpP底物的蛋白质水平(针对肌动蛋白进行标准化)。
图26提供的图显示用A2-32-01处理后ClpP底物的mRNA水平。
图27提供了实施例9和10的体内研究设计的概述。
图28提供的图显示来自实施例9的体内12-32-01处理的前两天的体重数据。
图29提供的图显示在高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖症和糖尿病小鼠模型中体内施用ClpP抑制剂后葡萄糖耐量试验的结果。
具体实施方式
提供了用于鉴定用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂的方法和组合物。在一些实施方案中，这些方法包括(a)使哺乳动物细胞或细胞群与测试药剂接触，和(b)测量哺乳动物细胞(与药剂接触的细胞)或与药剂接触的细胞群细胞中ClpP的表达水平(例如蛋白质和/或mRNA)和/或活性水平。如果化合物(测试药剂)降低ClpP表达(例如，如能够通过测量ClpP蛋白和/或ClpP编码mRNA的水平显示的)和/或活性水平，则认为其为“候选药剂”(例如，治疗的候选药剂)。还提供了用于治疗个体(例如，肥胖和/或患有糖尿病的人或已被如此诊断的人)的方法和组合物。治疗方法包括向个体施用ClpP抑制剂(例如靶向ClpP的RNAi药剂或基因编辑药剂)(例如，用来预防或减少体重增加、增加胰岛素敏感性和/或增加葡萄糖耐量)。
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解本发明不限于所述的特定方法或组合物，因此当然可以改变。还应当理解的是，本文中所使用的术语仅用于描述特定实施方案，并且不旨在为限制性的，因为本发明的保护范围将仅由所附权利要求书进行限定。
在提供一系列值的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，其至下限单位的十分之一。在该范围内的任何规定值或中间值与该范围内的任何其他规定或中间值之间的每个较小范围包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且在较小范围内包括任一个、两个或两个限制的每个范围也包括在本发明内，受限于本发明规定的范围中的任何特别排除的限制。在该范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本发明中。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文中该的那些相似或等价的任何方法和材料可以用于实践或测试本发明，现在描述某些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。应当理解，在有矛盾的情况下，本公开内容取代所并入的出版物的任何公开内容。
对于本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独实施方案具有离散的组件和特征，其可以容易地与任何其他几个实施方案的特征分离或组合而不离开本发明的范围或精神。任何列举的方法可以按照该事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则本文和所附权利要求书中使用的单数形式包括复数引用。因此，例如，提及“一个细胞(a cell)”包括多个这样的细胞，并且对“该肽”的提及包括提及一种或多种肽及其等价物，例如本领域技术人员已知的多肽，等等。
这里讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供的。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权先于此类出版物。此外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要独立确认。
ClpP蛋自
哺乳动物ClpXP是蛋白质复合物(蛋白酶)，其具有催化亚单位(ClpP蛋白)和调节亚单位(ClpX蛋白)。如本文所描述的，已发现ClpP蛋白在哺乳动物细胞中的线粒体功能中起重要的生物学作用，并且改变ClpP的表达/功能具有广泛的生理学后果。
这里描述了野生型小鼠和人ClpP蛋白氨基酸序列(及其编码mRNA)。
野生型人ClpP(NP_006003.1)
*也被称为“酪蛋白溶解的线粒体基质肽酶蛋白水解亚单位”，DFNB81和PRLTS3
编码人ClpP(上述)的mRNA的DNA形式(NM_006012.2)
*ORF加下划线
野生型小鼠ClpP(NP_059089.1)
*也被称为“酪蛋白溶解线粒体基质肽酶蛋白水解亚单位”，AU019820和D17Wsu160e
编码小鼠ClpP(上述)的mRNA的DNA形式(NM_017393.2)
*ORF加下划线
筛选方法
提供了用于鉴定用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂的筛选方法。举例而言，这样的候选药剂可以包括用于减少个体中脂肪组织的量、预防或减少个体的体重增加、增加个体的胰岛素敏感性、和/或增加个体的葡萄糖耐量的候选药剂。在一些实施方案中，本文提供的筛选方法包括(a)用测试药剂接触哺乳动物细胞或细胞群(例如，小鼠细胞，大鼠细胞，非人灵长类动物细胞，人细胞，或其细胞群)，和(b)测量哺乳动物细胞(与药剂接触的细胞)或与药剂接触的细胞群的细胞中ClpP的表达水平和/或活性水平(例如，ClpP的蛋白质和/或mRNA表达水平或活性水平)，以确定测试药剂是否导致细胞群中细胞或细胞中ClpP表达和/或活性水平的降低。
降低ClpP表达(例如，蛋白质和/或mRNA)和/或活性水平的测试药剂可以被鉴定为用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂。因此，在与细胞或细胞群接触之前(例如，体外、离体或体内)，化合物被认为是“测试药剂”，并且如果化合物(测试药剂)降低ClpP表达(例如，如能够通过测量ClpP蛋白和/或编码ClpP的mRNA和/或活性水平的水平所示，它被认为是“候选药剂”(例如，用于治疗其中ClpP减少是有益的疾病(例如肥胖症和/或糖尿病)的候选药剂)。因此，所提供的筛选方法也可以称为鉴定ClpP抑制剂的方法，鉴定降低ClpP表达和/或活性水平的试剂的方法，鉴定ClpP表达和/或活性水平的抑制剂的方法，等等。
在一些实施方案中，主题方法(例如，如上述的方法)包括(a)使哺乳动物细胞(例如小鼠细胞、大鼠细胞、非人灵长类动物细胞、人细胞)与测试药剂接触；(b)测量由接触步骤引起的ClpP的表达水平和/或活性水平的降低(例如，相对于参考值，例如，在与测试剂接触之前ClpP的表达水平和/或活性水平，与已知不会降低ClpP表达的对照剂接触后的ClpP的表达水平和/或活性水平等)；(c)确定测试药剂导致相对于参考值的表达水平和/或活性水平降低；(d)将测试药剂鉴定为用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂。
在一些情况下，接触是体外的(例如细胞是培养的并且在体外接触)。在一些情况下，接触是离体的(例如细胞是培养的并且是分离白个体的原代细胞)。
主题筛选方法包括使细胞(或细胞群)与测试药剂接触的步骤。当测试药剂降低ClpP表达水平(例如，在ClpP蛋白或编码ClpP蛋白的mRNA水平)和/或活性水平时，该药剂被确定为候选药剂(例如，用于治疗肥胖症和/或糖尿病)。因此，接触通常持续一段时间，使得可以潜在地检测ClpP的表达水平和/或活性水平的变化(例如，蛋白质和/或mRNA表达水平)。换言之，接触时间将持续合适的时间段，之后可以合理地预期如果测试药剂实际上是治疗的候选药剂，则可检测到ClpP表达和/或活性水平的变化。在一些情况下，接触持续2分钟或更长时间(例如，5分钟或更多分钟，10分钟或更多分钟，15分钟或更多分钟，30分钟或更多分钟，1小时或更多小时，2小时或更多小时，5小时或更多小时，6小时或更多小时，12小时或更多小时，18小时或更多小时等)。在一些情况下，接触持续为2分钟至48小时(例如，5分钟至24小时，5分钟至6小时，5分钟至2小时，15分钟至24小时，15分钟至6小时，15分钟至2小时，1小时至24小时，1小时至6小时，或1小时至2小时)。
在某些情况下，接触是体内的。例如，在一些情况下，主题方法(例如筛选方法)包括向个体施用药剂(例如，测试药剂或候选药剂)的步骤。施用步骤可以用于许多不同的目的。例如，在一些情况下，主题方法包括向个体(例如，小鼠或大鼠)施用测试药剂，然后测量ClpP的表达水平和/或活性水平，以确定测试药剂是否是治疗的候选药剂的步骤。这种给药可以作为筛选的一部分进行，以鉴定作为治疗的候选药剂的那些药剂。
作为另一个实例，在一些情况下，主题方法(例如，筛选方法)包括施用候选药剂(即，已经确定降低ClpP的表达水平和/或活性水平的药剂，例如，使用主题方法并在体外、离体或体内接触细胞)。这种施用可以作为治疗步骤进行，或者例如，以确定候选药剂是否引起与肥胖症和/或糖尿病相关的特征的可测量的变化(例如，减少脂肪组织的量，预防或减少体重增加，胰岛素敏感性增加，葡萄糖耐量增加等)。
靶细胞
任何合适的哺乳动物细胞或细胞群可以在所提供的筛选方法中用作靶细胞或细胞群(即，与测试药剂接触的细胞或细胞群)。例如，在一些情况下，靶细胞或细胞群(与测试药剂接触的细胞或细胞群)是哺乳动物细胞，啮齿动物细胞(例如，小鼠细胞，大鼠细胞)，兔细胞，非人灵长类动物细胞，人细胞等。如上所述的，靶细胞或细胞群可以是体外的(例如，来自建立的细胞系)、离体的(例如，原代细胞)，或体内的。靶细胞可以是任何合适类型的细胞(例如，干细胞，祖细胞，脂肪细胞，神经元，胰腺的细胞，成纤维细胞，上皮细胞，肾细胞，胚胎细胞等)和在一些情况下，接触的细胞(靶细胞)是肝细胞。
用于主题筛选方法的合适哺乳动物细胞的实例包括但不限于：通过SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRl细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1.982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
测试药剂
在所提供的筛选方法中使用的“测试药剂”(例如，“测试化合物”)可以是任何合适的药剂(例如，包括但不限于有机分子，小分子，多核苷酸，RNA，DNA，蛋白质，抗体，肽，脂质，碳水化合物等)。测试药剂也可以是化学化合物的混合物。在一些情况下，可以使用空间定位的测试药剂的阵列(例如，肽阵列，多核苷酸阵列和/或组合小分子阵列；其中“阵列”是指固定在表面上的不同分子物质的集合)。在一些情况下，筛选小分子文库(即，测试药剂可以是小分子文库的成员)。测试药剂可以是生物大分子，可以是噬菌体肽展示文库的一部分，可以是噬菌体抗体(例如scFv)展示文库的一部分，多核糖体肽展示文库等。测试药剂可以是由生物材料如细菌、植物、真菌或动物(例如哺乳动物)细胞和/或组织制成的提取物。如在主题筛选方法中提供的，评估测试药剂作为治疗肥胖症和/或糖尿病的药剂的潜在活性(例如，用于减少个体中脂肪组织的量的候选药剂，预防或减少个体的体重增加，增加个体的胰岛素敏感性，和/或增加个体的葡萄糖耐量)。在一些情况下，主题方法用于筛选多种测试药剂。可以单独地(依次地)或并行地评估(筛选)测试药剂。
在一些情况下，测试药剂(例如，测试化合物)可具有小于10,000克/摩尔(例如，小于5,000克/摩尔，小于1,000克/摩尔，或小于500克/摩尔)的式量(formula weight)。测试药剂可以是天然存在的(例如草药或天然产物)、合成的，或可以包括天然和合成组分。小分子的实例包括肽，肽模拟物(例如拟肽)，氨基酸，氨基酸类似物，多核苷酸，多核苷酸类似物，核苷酸，核苷酸类似物和小分子，例如有机或无机化合物(例如杂有机或有机金属化合物)。
ClpP的表达水平和/或活性水平
在一些情况下，主题筛选方法包括测量ClpP表达水平和/或活性水平的步骤。因为ClpP mRNA的减少可导致ClpP蛋白水平降低，所以可以使用任一测定(测量ClpP编码mRNA的测定或测量ClpP蛋白的测定)来测量表达水平。例如，在一些情况下，降低靶细胞(或靶细胞群的细胞)中ClpP蛋白水平的测试药剂将被鉴定为用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂。在一些情况下，降低靶细胞(或靶细胞群的细胞)中编码ClpP的mRNA的水平的测试药剂将被鉴定为用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂。
术语“测定”和“测量”在本文中用于包括操纵生物样品(例如，细胞样品)以产生与样品相关的数据的物理步骤(例如，测量生物样品的表达水平和/或活性水平)。在实施主题方法时，可以测量ClpP表达产物(例如mRNA或蛋白质)的表达水平和/或ClpP的活性水平。表达水平可以是细胞、细胞群、来自个体的生物样品等中的表达水平。表达水平和/或活性水平可以通过任何合适的方法测量。例如，RNA表达水平可以通过测量ClpP的一种或多种核酸转录物例如mRNA的水平/量来测量。可以通过测量ClpP蛋白的水平/量来检测ClpP的蛋白质表达水平。
“测量”可用于确定测量的表达水平和/或活性水平是否小于、大于、“小于或等于”、或“大于或等于”特定阈值，(阈值可以是预先确定或可以通过测定对照样品来确定)。另一方面，“测量以确定表达水平”(和/或活性水平)或简单地“测量表达水平”(和/或活性水平)可以意味着确定代表特定表达产物(例如，ClpP表达产物)的表达(例如，蛋白质和/或RNA的量，例如mRNA)和/或ClpP的活性水平的定量值(使用任何合适的度量)。表达和/或活性的水平可以表示为与特定测定相关的任意单位(例如，荧光单位例如平均荧光强度(MFI)、阈值循环(Ct)、定量循环(Cq)等)，或者可以表示为具有确定单位的绝对值(例如，mRNA转录物的数量、蛋白质分子的数量、蛋白质的浓度、切割的底物的量等)。
表达水平和/或活性水平可以是原始测量值，或者可以是从原始测量值导出的标准化和/或加权值。术语“表达水平”和“测量的表达水平”在本文中用于包括原始测量值以及以某种方式(例如，标准化和/或加权)操作的值。在一些情况下，标准化表达水平和/或活性水平是表达产物的测量表达水平和/或来自样品的活性水平，其中表达产物和/或活性水平的原始测量值已经标准化。例如，可以将表达产物(例如，编码ClpP的RNA、ClpP蛋白)的表达水平与一种或多种其他表达产物的表达水平(例如，持家基因的表达水平，多个基因的平均表达水平等)进行比较，以得到表示标准化表达水平的标准化值。标准化方法对于本领域普通技术人员来说是已知的，并且可以使用任何合适的标准化方法。选择的具体度量(或单位)并不重要，只要在评估多个标记物和/或多个生物样品(例如，来自多个个体的样品或来自同一个体的多个样品)时使用相同的单位(或转换为相同的单位)。
可以以许多不同方式确定ClpP表达水平和/或活性水平的降低。例如，在一些情况下，在与测试药剂接触之前和之后(或在向个体施用药剂之前和之后)，测量在细胞中(或在个体中，例如在来自个体的生物样品中)ClpP表达水平和/或活性水平，并且确定是否是由接触(或施用)引起的降低。在一些情况下，细胞群的一些细胞不与药剂(例如，测试药剂)接触，并且细胞群的其他细胞与药剂(例如，测试药剂)接触，并且可以在接触和未接触的细胞之间进行比较。在一些情况下，细胞群的一些细胞不与药剂(例如，测试药剂)接触，并且细胞群的其他细胞与模拟药剂(例如，已知不引起改变的药剂)接触，并且可以在与测试药剂接触的细胞和与模拟药剂(对照药剂)接触的细胞(对照细胞)之间进行比较。
这种比较通常可以是指将测量值与参考值进行比较，或者确定与参考值相比，药剂导致ClpP表达水平和/或活性水平的降低。参考值可以是在与药剂接触之前测量的ClpP(蛋白质和/或mRNA)的水平和/或ClpP的活性水平，在与模拟试剂(对照试剂)接触后测量的ClpP(蛋白质和/或mRNA)的水平和/或ClpP的活性水平，在不与试剂接触的情况下测量ClpP(蛋白质和/或mRNA)的水平和/或ClpP的活性水平等。在某些情况下，参考值也可以是预定(阈)值。
在一些情况下，主题方法包括确定测试药剂或候选药剂导致ClpP的表达水平和/或活性水平降低。在一些情况下，表达水平和/或活性水平与参考值(例如，在与药剂接触之前例如ClpP蛋白和/或mRNA的活性水平和/或表达水平；在模拟处理的细胞中或在模拟处理的对照个体中例如ClpP蛋白和/或mRNA的活性水平和/或表达水平；等等)相比，降低10％或更多(例如，20％或更多，30％或更多，40％或更多，50％或更多，60％或更多，70％或更多，80％或更多，或90％或更多)。在某些情况下，测量的表达水平和/或活性水平为参考值的95％或更少(例如，参考值的90％或更少，参考值的85％或更少，参考值的80％或更少，参考值的75％或更少，参考值的70％或更少，参考值的65％或更少，参考值的60％或更少，参考值的55％或更少，参考值的50％或更少，参考值的45％或更少，参考值的40％或更少，参考值的35％或更少，参考值的30％或更少，参考值的25％或更少，参考值的20％或更少，参考值的15％或更少，参考值的10％或更少，或参考值的5％或更少)。在一些情况下，ClpP的表达水平和/或活性水平的参考值是测量值的1.1倍或更多(例如，1.2倍或更多，1.3倍或更多，1.4倍或更多，1.5倍或更多，2倍或更多，2.5倍或更多，3倍或更多，4倍或更多，5倍或更多，7.5倍或更多，或10倍或更多)。
测量RNA
可以通过检测由目的基因(ClpP)编码的一种或多种RNA转录物或其片段的量或水平来测量ClpP的表达产物的表达水平。这种检测可以包括检测细胞提取物、固定细胞、活细胞、生物样品等中由ClpP基因编码的一种或多种RNA转录物或其片段的水平。对于测量RNA水平，测定样品中RNA的量或水平，例如mRNA的表达水平。在一些情况下，还可以测量一种或多种另外的RNA的表达水平，并且将ClpP RNA表达水平与一种或多种另外的RNA的水平进行比较，以提供ClpP表达水平的标准化值。
可以使用任何合适的方案检测样品中核酸的表达水平(例如，ClpP mRNA的表达水平)。用于测量样品中RNA(例如mRNA)表达水平的许多示例性方法是本领域普通技术人员已知的，例如在差异基因表达分析领域中使用的那些方法，并且可以使用任何合适的方法。示例性方法包括但不限于：基于杂交的方法(例如，Northern印迹，阵列杂交(例如，微阵列)；原位杂交；原位杂交，然后进行FACS；等)(Parker&Barnes，Methods in Molecular Biology106：247-283(1999))；RNA酶保护测定(Hod，Biotechniques 13：852-854(1992))；基于PCR的方法(例如，逆转录PCR(RT-PCR)，定量RT-PCR(qRT-PCR)，实时RT-PCR等)(Weis等，Trendsin Genetics 8：263-264(1992))；核酸测序方法(例如，Sanger测序，下一代测序(即，大规模并行高通量测序，例如，Illumina的可逆终止子方法，Roche的焦磷酸测序方法(454)，Life Technologies的连接测序(SOLiD平台)，Life Technologies′Ion Torrent平台，单分子测序等)；基于纳米孔的测序方法；等等。
在一些实施方案中，可以直接测定生物样品。在一些实施方案中，在测定之前扩增(例如，通过PCR)生物样品的核酸。因此，可以在杂交方法和/或上面讨论的测序方法之前使用诸如PCR(聚合酶链式反应)、RT-PCR(逆转录酶PCR)、qRT-PCR(定量RT-PCR，实时RT-PCR)等技术。
上面列出的一些方法的示例在以下参考文献中描述：Margulies等(Nature 2005437：376-80)；Ronaghi等(Analytical Biochemistry 1996 242：84-9)；Shendure(Science2005 309：1728)；Imelfort等(Brief Bioinform.2009 10：609-18)；Fox等(Methods MolBiol.2009；553：79-108)；Appleby等(Methods Mol Biol.2009；513：19-39)；Soni等，ClinChem 53：1996-2001 2007；和Morozova(Genomics.2008 92：255-64)在此引入作为方法的一般描述和方法的具体步骤的参考文献，包括每个步骤的起始产物、试剂和最终产物。
测量蛋白质
可以通过检测一种或多种蛋白质(例如ClpP)或其片段的量或水平来测量ClpP的表达产物的表达水平。这种检测可以包括检测细胞提取物、固定细胞、活细胞、生物样品等中ClpP蛋白或其片段的水平。对于测量蛋白质水平，测定样品(例如，细胞、细胞群、细胞提取物等)中蛋白质的量或水平。在一些情况下，还可以测量一种或多种另外的蛋白质的浓度，并且测量的表达水平与一种或多种另外的蛋白质的水平相比较，以提供测量的表达水平的标准化值。在一些实施方案中，测量的表达水平是通过比较一种蛋白质相对于另一种蛋白质的水平计算的相对值。在其他实施方案中，浓度是绝对测量值(例如，重量/体积或重量/重量)。
可以通过在样品中检测一种或多种蛋白质/多肽或其片段的量或水平来测量蛋白质(例如，ClpP)的表达水平。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。“多肽”是指氨基酸的聚合物(氨基酸序列)，并不是指分子的特定长度。因此肽和寡肽包括在多肽的定义内。在一些情况下，在测量表达水平之前，从生物样品中除去细胞(例如，通过离心、通过使细胞贴壁至培养皿或塑料等)。在一些情况下，通过裂解样品的细胞来测量细胞内蛋白质水平，以测量细胞内容物中蛋白质的水平。在一些情况下，可以在不破坏细胞形态的情况下测量蛋白质水平(例如，可以通过例如荧光抗体染色等可视化蛋白质水平)。
当要检测蛋白质水平时，可以使用任何合适的用于测量蛋白质水平的方案。用于测定蛋白质水平的方法的实例包括但不限于基于抗体的方法以及不基于抗体的方法。合适方法的实例包括但不限于：酶联免疫吸附法(ELISA)、质谱、蛋白质组阵列、xMAPTM微球技术、流式细胞术、蛋白质印迹、免疫荧光和免疫组织化学。
一些蛋白质检测方法是基于抗体的方法。术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2和Fv片段；scFv、双特异抗体；和由抗体片段形成的多特异性或多价结构。
ClpP活性水平
如上所述，ClpP作为复合物(ClpXP)的一部分起作用，其包括ClpP和ClpX，并且需要ATP以解折叠和水解蛋白质底物。因此，任何破坏ClpP和ClpX之间相互作用或降低ClpP/ClpX复合物活性(例如，减少蛋白质底物的水解)的药剂都可以被认为是降低ClpP活性水平的药剂。可以使用任何合适的方法测量ClpP的活性水平。例如，酶测定可用于测量ClpP活性。可以使用任何合适的方法测量诸如ClpXP水解ATP的动力学和/或ClpXP降解底物的参数。对于测量ClpP活性水平的各种方法的实例，参见例如Burton等，Protein Sci.2003May；12(5)：893-902；Joshi等，Nat Struct Mol Biol.2004May；11(5)：404-11；Kang等，JBiol Chem.2005 Oct 21；280(42)：35424-32；Baker等，Biochim Biophys Acta.2012 Jan；1823(1)：15-28，和Al-Furoukh等，(2014)PLoS ONE 9(7)：e103141，其公开内容通过引用并入本文。
此外，如以下实施例中所证明的，ClpP活性水平的降低(在这种情况下由敲除小鼠中缺乏ClpP引起)导致以下蛋白质的量增加：TNF受体相关蛋白1(TRAP1)(线粒体Hsp90)，热休克蛋白家族A(Hsp70)成员9(Grp75)(线粒体Hsp70)，富含亮氨酸的三角状五肽重复结构蛋白(LRPPRC)，酪蛋白溶解的线粒体基质肽酶伴侣亚单位(ClpX)(线粒体Hsp100)，鸟氨酸氨基转移酶(OAT)，和离子肽酶1，线粒体(LonP1)(线粒体蛋白酶)。因此，在一些情况下，测量ClpP的活性水平可以包括测量以下蛋白质中的一种或多种(例如，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，5种或更多种，或全部6种)的量：TRAP1、Grp75、LRPPRC、ClpX、OAT和LonP。例如，可以通过测量TRAP1、Grp75、LRPPRC、ClpX、OAT和LonP中的一种或多种(例如，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，5种或更多种，或全部6种)的水平(例如相对于合适的对照的增加)来检测ClpP活性的降低，该合适的对照例如在与本文所描述的测试药剂接触之前TRAP1、Grp75、LRPPRC、ClpX、OAT和LonP中的一种或多种的水平。
评估步骤
如下文实施例中所描述的，发明人已发现具有降低的ClpP表达的小鼠(由于ClpP基因的基因敲除，称为ClpP(-/-))表现出许多表型，包括但不限于降低：白色脂肪组织，体脂肪(通过总体脂肪质量或体脂含量(脂肪质量％)测量)，体重，内脏脂肪脂肪细胞大小，血浆瘦素水平和血糖水平(例如禁食后)；和增加：胰岛素敏感性，葡萄糖耐量，生长激素水平，能量消耗(例如，增加的基础能量消耗)，肌肉和/或成纤维细胞中磷酸化AKT(p-AKT)的水平和瘦含量(lean content)(瘦质量％(％lean mass))。ClpP-/-小鼠体重减轻，脂肪减少，同时消耗更多食物，并且ClpP-/-小鼠对高脂肪饮食(HFD)诱导的体重增加有抵抗力(例如，由于HFD引起的脂肪质量和体重增加小于野生型对照组中可见的增加)。
在一些情况下，主题方法(例如筛选方法或治疗方法)包括在向个体施用药剂(例如，用主题筛选方法鉴定的治疗候选药剂，ClpP的抑制剂如特异于ClpP的RNAi药剂或基因组编辑药剂等)后，测量个体的一个或多个特征(例如以验证药剂产生期望的结果)的步骤。能够被测量的合适的特征包括但不限于胰岛素敏感性，血糖水平，葡萄糖耐量，体脂肪质量，脂肪组织的量，白色脂肪组织的量；脂肪质量百分比，体重，内脏脂肪脂肪细胞大小，血浆瘦素水平，生长激素水平，基础能量消耗，肌肉和/或成纤维细胞中磷酸化AKT(p-AKT)水平，瘦质量(lean mass)百分比，肝细胞中线粒体数量，肝细胞中的线粒体质量，肝细胞中的线粒体形态，成纤维细胞的呼吸能力，成纤维细胞最大耗氧率(OCR)；和成纤维细胞对H2O2诱导的细胞毒性的抗性。评估步骤(例如，测量上述特征中的一个或多个的步骤)可以作为主题筛选方法(例如，鉴定候选药剂的方法)的一部分包括在内。评估步骤(例如，测量上述特征中的一个或多个的步骤)也可以作为主题治疗方法的一部分包括在内。
生成报告
在一些情况下，主题方法(例如上述任何筛选方法)包括生成报告(例如报告该测试药剂是用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂的)的步骤。如本文所描述的“报告”是电子或有形文档，其包括提供与主题方法(例如筛选方法)的结果和/或评估相关的感兴趣的信息的报告元素。在一些实施方案中，主题报告包括如上面更详细讨论的测量的表达水平和/或活性水平(例如，原始值、标准化值、标准化和加权值等)(例如，ClpP的活性或ClpP表达产物例如ClpP蛋白和/或编码ClpP的mRNA的表达水平)。在一些实施方案中，主题报告包括ClpP表达水平和/或活性水平。在一些情况下，主题报告包括评估(例如，确定一种或多种测试药剂是否导致ClpP表达水平和/或活性水平的降低)。例如，报告可以说明给定的测试药剂或测试药剂列表是否导致ClpP表达水平和/或活性水平的降低(例如，在蛋白质和/或mRNA的水平上)，和/或是否给定测试药剂或测试药剂列表是治疗的候选药剂。
治疗方法
提供了包括向个体施用ClpP抑制剂(例如对ClpP特异的RNAi药剂或基因编辑药剂)的方法，其中ClpP抑制剂降低ClpP的活性水平和/或表达水平(例如，如能够在蛋白质和/或mRNA水平检测到的)。此类方法可称为降低ClpP的表达水平和/或活性水平的方法，和/或治疗患有肥胖症和/或糖尿病的个体的方法。关于ClpP活性水平和表达水平(例如，在蛋白质和/或mRNA水平上)以及用于测量这种水平的方法的讨论可以在本文别处找到。
在一些实施方案中，此类方法是治疗患有肥胖症和/或糖尿病的个体的方法，增加能量输出的方法，减少脂肪组织(例如，白色脂肪组织)的量的方法，预防或减少体重增加的方法，增加胰岛素敏感性的方法和/或增加葡萄糖耐量的方法。例如，在一些情况下，主题方法是增加能量输出，减少脂肪组织的量，增加胰岛素敏感性，增加葡萄糖耐量和/或预防或减少体重增加的方法，并且该方法包括向个体施用ClpP抑制剂(例如对ClpP特异的RNAi药剂或基因编辑药剂)，其降低ClpP的表达水平和/或活性水平。在一些实施方案中，主题方法是治疗患有肥胖症和/或糖尿病的个体的方法，并且该方法包括向个体施用ClpP抑制剂(例如对ClpP特异的RNAi药剂或基因编辑药剂)，其降低ClpP的表达水平和/或活性水平。
在一些实施方案中，主题方法是以减少个体脂肪组织的量、预防或减少个体体重增加、增加个体胰岛素敏感性和/或增加个体葡萄糖耐量的有效量将ClpP抑制剂施用于个体(例如患有肥胖症和/或糖尿病的个体)的方法。
在一些情况下，任何上述主题治疗方法可以包括测量来自正在治疗的个体的生物样品中的ClpP表达水平和/或活性水平的步骤(例如，在来自ClpP抑制剂所针对其施用的个体的肝细胞中)。在一些情况下，主题治疗方法包括从个体获得生物样品并测量样品的ClpP的表达水平和/或活性水平的步骤。在一些情况下，在治疗之前和之后进行这样的步骤(例如，以验证施用具有期望的结果)。
在一些情况下，以有效减少个体脂肪组织的量、预防或减少个体体重增加、增加个体胰岛素敏感性和/或增加个体葡萄糖耐量的量将ClpP抑制剂(例如靶向ClpP的RNAi药剂或基因编辑药剂)施用于个体(例如患有肥胖症和/或糖尿病的个体)的方法。
RNAi药剂和基因组编辑药剂
在一些情况下，ClpP抑制剂(例如降低ClpP的表达水平和/或活性水平的药剂)是靶向ClpP(例如特异性针对ClpP)的RNAi药剂或基因组编辑药剂。术语“RNAi药剂”在本文中用于表示可用于在细胞中诱导基因特异性RNA干扰(RNAi)应答的任何药剂。RNAi药剂的合适实例包括但不限于短干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)和微RNA(miRNA)。对ClpP特异的RNAi药剂(例如，shRNA、siRNA、miRNA)是靶向编码ClpP蛋白的mRNA的试剂。通过选择合适的核苷酸序列，可以容易地设计RNAi药剂以特异性靶向任何所需的mRNA(例如，编码ClpP的mRNA)。
各种RNAi试剂设计(具有各种特征的RNAi药剂)是本领域已知的，并且可以使用靶向ClpP的任何合适的RNAi药剂。例如，RNAi药剂的各种设计(以及它们的递送方法)可见于许多专利包括但不限于美国专利No.7,022,828；7,176,304；7,592,324；7,667,028；7,718,625；7,732,593；7,772,203；7,781,414；7,807,650；7,879,813；7,892,793；7,910,722；7,947,658；7,973,019；7,973,155；7,981,446；7,993,925；8,008,271；8,008,468；8,017,759；8,034,922；8,399,653；8,415,319；8,426,675；8,466,274；8,524,679；8,524,679；8,569,065；8,569,256；8,569,258；9,233,102；9,233,170；和9,233,174；其所有均通过引用并入本文。适当时，可以以编码试剂的DNA的形式提供RNAi试剂(例如，编码shRNA的表达载体)。靶向ClpP(登录号NM_003321)编码序列的shRNA例如在Cole等，2015，Cancer Cell 27，864-876中提供，其公开内容通过引用整体并入本文并用于所有目的。这些shRNA包括5’-GCCCATCCACATGTACATCAA-3’(SEQ ID NO：5)；5’-CACGATGCAGTACATCCTCAA-3’(SEQ ID NO：6)；和5’-GCTCAAGAAGCAGCTCTATAA-3’(SEQ ID NO：7)。
术语“基因组编辑药剂”和“基因组靶向组合物”在本文中可互换使用，意指包括基因组编辑核酸酶的组合物。在一些实施方案中，基因组编辑核酸酶结合天然或内源识别序列。在一些实施方案中，基因组编辑核酸酶是修饰的内切核酸酶，其结合非天然或外源识别序列，并且不结合天然或内源识别序列。
合适的基因组编辑核酸酶的实例包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)，TAL-效应子DNA结合域-核酸酶融合蛋白(转录激活因子样效应核酸酶(TALEN))，CRISPR/Cas内切核酸酶(例如，2类CRISPR/Cas内切核酸酶例如II型、V型或VI型CRISPR/Cas内切核酸酶)和重组酶(例如Cre重组酶、Hin重组酶、RecA、RAD51、Tre、FLP等)。因此，在一些实施方案中，基因组编辑试剂是可以包括选自以下的一种或多种基因组编辑核酸酶的组合物：ZFN，TALEN，重组酶(例如Cre重组酶、Hin重组酶、RecA、RAD51、Tre、FLP等)，和CRISPR/Cas内切核酸酶(例如，2类CRISPR/Cas内切核酸酶，例如II型、V型或VI型CRISPR/Cas内切核酸酶)。
重组酶包括但不限于Cre重组酶、Hin重组酶、RecA、RAD51、Tre和FLP。
与2类II型CRISPR/Cas内切核酸酶Cas9蛋白和Cas9指导RNA(及其递送方法)相关的信息(以及与靶核酸中存在的原型间隔相邻基序(PAM)序列相关的要求的信息)可以在现有技术中找到，例如参见Jinek等，Science.2012 Aug 17；337(6096)：816-21；Chylinski等，RNA Biol.2013 May；10(5)：726-37；Ma等，Biomed Res Int.2013；2013：270805；Hou等，Proc Natl Acad Sci USA.2013 Sep 24；110(39)：15644-9；Jinek等，Elife.2013；2：e00471；Pattanayak等，Nat Biotechnol.2013 Sep；31(9)：839-43；Qi等，Cell.2013 Feb28；152(5)：1173-83；Wang等，Cell.2013 May 9；153(4)：910-8；Auer等，Genome Res.2013Oct 31；Chen等，Nucleic Acids Res.2013 Nov 1；41(20)：e19；Cheng等，Cell Res.2013Oct；23(10)：1163-71；Cho等，Genetics.2013 Nov；195(3)：1177-80；DiCarlo等，NucleicAcids Res.2013 Apr；41(7)：4336-43；Dickinson等，Nat Methods.2013 Oct；10(10)：1028-34；Ebina等，Sci Rep.2013；3∶2510；Fujii等，Nucleic Acids Res.2013 Nov 1；41(20)：e187；Hu等，Cell Res.2013 Nov；23(11)：1322-5；Jiang等，Nucleic Acids Res.2013Nov 1；41(20)：e188；Larson等，Nat Protoc.2013 Nov；8(11)：2180-96；Mali等，NatMethods.2013 Oct；10(10)：957-63；Nakayama等，Genesis.2013 Dec；51(12)：835-43；Ran等，Nat Protoc.2013 Nov；8(11)：2281-308；Ran等，Cell.2013 Sep 12；154(6)：1380-9；Upadhyay等，G3(Bethesda).2013 Dec 9；3(12)：2233-8；Walsh等，Proc Natl Acad SciUSA.2013 Sep 24；110(39)：15514-5；Xie等，Mol Plant.2013 Oct 9；Yang等，Cell.2013Sep 12；154(6)：1370-9；Briner等，Mol Cell.2014 Oct 23；56(2)：333-9；和美国专利和专利申请：8,906,616；8,895,308；8,889,418；8,889,356；8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；8,697,359；20140068797；20140170753；20140179006；20140179770；20140186843；20140186919；20140186958；20140189896；20140227787；20140234972；20140242664；20140242699；20140242700；20140242702；20140248702；20140256046；20140273037；20140273226；20140273230；20140273231；20140273232；20140273233；20140273234；20140273235；20140287938；20140295556；20140295557；20140298547；20140304853；20140309487；20140310828；20140310830；20140315985；20140335063；20140335620；20140342456；20140342457；20140342458；20140349400；20140349405；20140356867；20140356956；20140356958；20140356959；20140357523；20140357530；20140364333；和20140377868；所有这些都通过引用整体并入本文。与V型或VI型CRISPR/Cas内切核酸酶和指导RNA相关的实例和指导(以及关于靶核酸中存在的原型间隔相邻基序(PAM)序列的相关要求的信息)可以在现有技术中找到，例如参见Zetsche等，Cell.2015Oct 22；163(3)：759-71；Makarova等，Nat Rev Microbiol.2015 Nov；13(11)：722-36；和Shmakov等，Mol Cell.2015 Nov 5；60(3)：385-97。
有用的设计的锌指模块包括识别各种GNN和ANN三联体的那些(Dreier等，(2001)JBiol Chem 276：29466-78；Dreier等，(2000)J Mol Biol 303：489-502；Liu等，(2002)JBiol Chem 277：3850-6)，以及识别各种CNN或TNN三联体的那些(Dreier等，(2005)J BiolChem 280：35588-97；Jamieson等，(2003)Nature Rev Drug Discov 2：361-8)。还参见Durai等，(2005)Nucleic Acids Res 33：5978-90；Segal，(2002)Methods 26：76-83；Porteus and Carroll，(2005)Nat Biotechnol 23：967-73；Pabo等，(2001)Ann RevBiochem 70：313-40；Wolfe等，(2000)Ann Rev Biophys Biomol Struct 29：183-212；Segal and Barbas，(2001)Curr Opin Biotechnol 12：632-7；Segal等，(2003)Biochemistry 42：2137-48；Beerli and Barbas，(2002)Nat Biotechnol 20：135-41；Carroll等，(2006)Nature Protocols 1：1329；Ordiz等，(2002)Proc Natl Acad Sci USA99：13290-5；Guan等，(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99：13296-301。
关于ZFN和TALEN(及其递送方法)的更多信息，参考Sanjana等，Nat Protoc.2012Jan 5；7(1)：171-92以及国际专利申请WO2002099084；WO00/42219；WO02/42459；WO2003062455；WO03/080809；WO05/014791；WO05/084190；WO08/021207；WO09/042186；WO09/054985；WO10/079430；和WO10/065123；美国专利No.8,685,737；6,140,466；6,511,808；和6,453,242；和美国专利申请No.2011/0145940，2003/0059767，和2003/0108880；所有这些都通过引用整体并入本文。
小分子ClpP抑制剂
已知ClpP的小分子抑制剂可用于本文所描述的一种或多种筛选或治疗方法。例如β-内酯，例如(3RS，4RS)-3-(壬-8-烯-1-基)-4-(2-(吡啶-3-基)乙基)氧杂环丁烷-2-酮(也称为A2-32-01并且在本文中可互换地称为A2-32-01和A2-32)已被鉴定为细菌和哺乳动物ClpP的抑制剂。参见例如Cole等，2015，Cancer Cell 27，864-876，其公开内容通过引用整体并入本文并用于所有目的。
β-内酯例如美国专利申请公开2014/0243255中所述的，其公开内容通过引用整体并入本文并用于所有目的，并且β-内酯可以包括但不限于反式β-内酯，β-丙内酯，饱和脂肪族β-内酯，β-丁内酯，β-异丁内酯，β-戊内酯，β-异戊内酯，β-正己内酯，α-乙基β-丙内酯，α-异丙基-β-丙内酯，α-丁基-β-丙内酯，α异丙基-β-丙内酯，β异丙基-β-丙内酯，α-甲基-β-丁内酯，β-乙基-β-丁内酯，α-乙基-β-丁内酯，α-甲基β-丙内酯，含有环烷基的β-羟基-单羧酸的内酯，芳基和芳烷基取代基，如β-环己基-β-丙内酯，β-苯基-β-丙内酯，α-苯基-β-丙内酯，β-苄基-β-丙内酯和其衍生物。
可以在所公开的方法的上下文中使用的ClpP的β-内酰胺抑制剂包括美国专利申请公开No.2016/0221977中描述的那些，其公开内容通过引用整体并入本文并用于所有目的。这种β-内酯类ClpP抑制剂包括以下结构的化合物：
其中R2是苯环上任何位置的氢的单取代，其中取代的部分选自烷基，取代的烷基，炔基，取代的烷基，乙烯基，硝基，卤素(例如，包括溴，氯，氟和碘)，氰基，芳基，杂芳基，烷氧基；Cn是碳，n是1至5的数。
其中R1选自烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，炔基，取代的炔基，烷氧基，取代的烷氧基，烷氧基烷基，取代的烷氧基烷基，NH2，NHR，NR2，单-或多羟基-取代的烷基，芳基，取代的芳基，杂芳基和取代的杂芳基；R2是苯环上任何位置的氢的单取代，其中取代的部分选自烷基，取代的烷基，炔基，取代的烷基，乙烯基，硝基，卤素，氰基，芳基，杂芳基，烷氧基；并且，Cn是碳，n是1至5的数。下面提供了上述结构的具体形式：
小分子苯酯也已显示出抑制细菌ClpP。参见例如Hackl等，J.Am.Chem.Soc.，137，8475-8483(2015)，其公开内容通过引用整体并入本文并用于所有目的。这种小分子抑制剂包括，例如：
除了上述化合物外，还有药学上可接受的盐和其前药也用于本文所描述的方法。
药剂递送
在一些实施方案中，主题方法(例如，本文所描述的筛选方法或治疗方法)包括向个体施用药剂(例如，测试药剂，候选药剂，降低ClpP的表达水平和/或活性水平的ClpP抑制剂，例如特异性降低ClpP表达的RNAi药剂或基因编辑药剂等)的步骤。根据上下文，个体可以是任何合适的物种(例如，哺乳动物、啮齿动物、小鼠、大鼠、非人灵长类动物、人等)。例如，在一些情况下，将测试药剂施用于小鼠。在一些情况下，将候选药剂(例如，如通过主题筛选方法鉴定的)施用于小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人(例如，患有肥胖症、糖尿病、胰岛素敏感性降低、葡萄糖耐量降低等的个体)。在一些情况下，将如本文所描述的降低ClpP的表达水平和/或活性水平的ClpP抑制剂施用于小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人。
在一些情况下，全身施用如本文所描述的药剂。在一些情况下，局部施用如本文所描述的药剂(例如直接施用于所需组织例如肝脏)。在一些情况下，通过肠胃外、局部、静脉内、瘤内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌肉内施用如本文所描述的药剂。典型的施用途径是静脉内或瘤内施用，但其他途径可以同样有效。在一些情况下，经注射施用如本文所描述的药剂。在一些情况下，以组织特异性的方式施用如本文所描述的药剂(例如施用针对特定组织例如肝脏)。
本领域技术人员将容易理解，剂量水平可以根据具体化合物、症状的严重程度和受试者对副作用的敏感性而变化。本领域技术人员可通过各种方法容易地确定给定化合物的优选剂量。
在一些实施方案中，施用单剂量的ClpP抑制剂。在其它实施方案中，施用多剂量的ClpP抑制剂。如果在一段时间内施用多剂量，则在一段时间内每天两次(qid)，每日(qd)，隔天(qod)，每三天，每周三次(tiw)或每周两次(biw)施用ClpP抑制剂。例如，在一天至约2年或更长的时间内qid、qd、qod、tiw或biw施用ClpP抑制剂。例如，取决于各种因素，以任何上述频率施用ClpP抑制剂一周、两周、一个月、两个月、六个月、一年或两年或更长时间。
在一些情况下，将如本文所描述的小分子ClpP抑制剂，例如β-内酯，例如(3RS，4RS)-3-(壬-8-烯-1-基)-4-(2-(吡啶-3-基)乙基)氧杂环丁烷-2-酮或其药学上可接受的盐或前药以每天约50mg/kg至约1000mg/kg例如每天约100mg/kg至约900mg/kg、每天约200mg/kg至约800mg/kg、每天约300mg/kg至约700mg/kg、或每天约400mg/kg至约600mg/kg的量施用于有需要的受试者，例如如本文所描述的受试者。在一些情况下，将如本文所描述的小分子ClpP抑制剂，例如β-内酯，例如(3RS，4RS)-3-(壬-8-烯-1-基)-4-(2-(吡啶-3-基)乙基)氧杂环丁烷-2-酮或其药学上可接受的盐或前药以每天一次的剂量或每天两次的剂量施用于受试者。
在一些情况下，配置RNAi药剂或基因组编辑药剂，使得药剂引起的ClpP表达的减少限于特定的组织类型(例如，肝脏)。例如，RNAi药剂(例如，shRNA、siRNA)或基因组编辑药剂(CRISPR/Cas蛋白加指导RNA)的组分可以仅在特定组织中有活性，例如，可以将组分递送至特定组织，组分可以与组织特异性启动子等可操作地连接。例如，如下文实施例中所描述的，在其基因组中具有敲入的ClpP基因的等位基因的小鼠中将Cre重组酶递送至肝脏，概括了ClpP敲除小鼠表现出的胰岛素敏感性增加。因此，肝脏中ClpP表达的减少可导致胰岛素敏感性的增加，而没有降低整个个体中ClpP表达的潜在副作用。在一些情况下，降低ClpP表达和/或活性的ClpP抑制剂(例如，对ClpP特异的小分子抑制剂、RNAi药剂或基因编辑药剂)全身施用，并且在一些情况下局部施用(例如，至肝脏，如参见美国专利号8,524,679；和8,008,468，两者均通过引用整体并入本文)。
在一些情况下，如本文所描述的药剂的作用基本上是肝脏特异性的(例如，基因组编辑核酸酶，例如Cre重组酶、CRISPR/Cas内切核酸酶、ZFN、TALEN等，可以组织特异性方式或可以在组织特异性启动子的控制下递送)。“基本上肝脏特异性”是指ClpP表达的大部分降低是在肝脏中。这可以通过许多不同的方式实现。应理解，ClpP表达的降低可能不仅限于肝脏，而是一种或多种其他组织也可表现出ClpP表达的降低。例如，如果使用启动子(例如，作为表达载体的一部分以驱动ClpP抑制剂的表达，例如基因组编辑核酸酶，或ClpP抑制剂的组分，例如CRISPR/Cas指导RNA)，该启动子不必完全仅限于肝脏。这种启动子可能在其他组织中表现出“渗漏”表达，或者可能仅限于肝脏以外的组织(例如，肝脏加上一种或多种其他组织，但不是所有组织，即启动子不是组成型的)。作为另一实例，如果药剂是局部递送的(例如，通过直接注射)，则应理解一些药剂还可以影响除肝脏之外的组织(例如，邻近器官、血液等)。因此，当使用术语“基本上肝脏特异性”时，意指全局ClpP表达(例如，遍及全身)不降低，而肝脏ClpP表达降低。
例如，当试剂是RNAi药剂时，可以通过将药剂直接递送至肝脏(例如，注射到肝脏等中)来实现肝脏特异性。另一方面，肝脏特异性可以通过从编码药剂的DNA(例如，编码shRNA的表达载体)表达RNAi药剂来实现，其中驱动药剂表达的启动子驱动药剂在肝脏中的表达(例如，肝脏特异性启动子)。同样地，基因组编辑药剂可以直接递送至肝脏，或者可以在肝脏中起作用(例如，通过表达具有驱动肝脏中表达的启动子的表达载体中的一种或多种组分，如肝脏特异性启动子)。在一些情况下，施用ClpP抑制剂使得ClpP表达的降低基本上是肝脏特异性的，并且所施用的量对于增加个体的胰岛素敏感性是有效的。
当降低ClpP表达和/或活性的ClpP抑制剂处于无活性形式，除非通过肝脏特异性酶转化为活性形式，也可以实现肝脏特异性。例如，ClpP的抑制剂可以以前药的形式递送，然后在肝脏中转化为活性形式，例如通过羧酸酯酶如人肝羧酸酯酶1(hCE1)、对氧磷酶如PON3、碱性磷酸酶、人类伐昔洛韦酶(VACVase)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)等。参见例如Yang，等，Enzyme-mediated hydrolytic activation of prodrugs，Acta PharmaceuticaSinicaB 2011；1(3)：143-159。
药剂可以制成注射剂、液体溶液或悬浮液；也可以制备适于在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。如上所描述的，制剂也可以乳化或包封在脂质体或微粒如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中，以增强佐剂效果。参见Langer，Science 249：1527，1990和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28：97-119，1997。主题药剂可以以长效注射剂或植入制剂的形式施用，其可以以允许活性成分持续或脉冲释放的方式配制。药剂可以配制成无菌的，基本上是等渗的，并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。
试剂盒也在本公开的范围内。例如，在一些情况下，主题试剂盒可包括(i)用于检测ClpP活性水平和/或表达水平(例如，蛋白质、mRNA)的检测药剂，例如抗ClpP抗体，和(ii)对照药剂(例如，已知降低ClpP活性水平和/或表达水平的阳性对照药剂，和/或已知不降低ClpP活性水平和/或表达水平的阴性对照药剂)。在一些情况下，主题试剂盒可包括使用说明。试剂盒通常包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的任何书写或记录材料，或者试剂盒附带的任何书写或记录材料。
本公开的示例性非限制性方面
与一个或多个其他方面或实施方案一起，上述本主题的各方面(包括实施方案)可以单独或组合地具有有益效果。在不限制前述描述的情况下，下面提供了编号为1-26的本公开的某些非限制性方面。对于本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的是，可以使用或与前面或后面的任何单独编号的方面组合使用每个单独编号的方面。这旨在为所有这些方面的组合提供支持，并且不限于以下明确提供的方面的组合：
1.一种鉴定用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂的方法，该方法包括：
(a)使哺乳动物细胞与测试药剂接触；
(b)测量接触后的哺乳动物细胞中ClpP的相对于参考值的表达水平和/或活性水平；
(c)确定测试药剂导致的相对于参考值的表达水平和/或活性水平的降低；和
(d)将测试药剂鉴定为用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂。
2.根据1所述的方法，其中哺乳动物细胞是小鼠细胞。
3.根据1所述的方法，其中哺乳动物细胞是人细胞。
4.根据1-3中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞是体外的。
5.根据1-3中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞是离体的。
6.根据1-3中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞是体内的。
7.根据1-6中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞是肝细胞。
8.根据2所述的方法，其中接触包括将测试药剂施用于小鼠。
9.根据8所述的方法，其进一步包括：在步骤(a)的接触之前测量小鼠中ClpP的表达水平和/或活性水平，以获得参考值。
10.根据1-9中任一项所述的方法，其进一步包括：在步骤(d)之后，将所鉴定的候选药剂施用于患有肥胖症和/或糖尿病的个体。
11.根据10所述的方法，其中个体是小鼠、非人灵长类动物或人。
12.根据10或11所述的方法，还包括在将所鉴定的候选药剂施用于个体之后，测量个体的一个或多个特征，所述特征选自：胰岛素敏感性，血糖水平，葡萄糖耐量，体脂肪质量，脂肪组织的量，白色脂肪组织的量；脂肪质量百分比，体重，内脏脂肪脂肪细胞大小，血浆瘦素水平，生长激素水平，基础能量消耗，肌肉和/或成纤维细胞中磷酸化AKT(p-AKT)水平，瘦质量百分比(percent lean mass)，肝细胞中线粒体数量，肝细胞中的线粒体质量，肝细胞中的线粒体形态，成纤维细胞的呼吸能力，成纤维细胞最大耗氧率(OCR)和成纤维细胞对H2O2诱导的细胞毒性的抗性。
13.根据1-12中任一项所述的方法，其中测试药剂是小分子或多肽。
14.根据1-13中任一项所述的方法，其包括测量ClpP的表达水平，其中表达水平是RNA表达水平并且测量包括使用定量RT-PCR、微阵列或RNA测序。
15.根据1-13中任一项所述的方法，其包括测量ClpP的表达水平，其中表达水平是蛋白质表达水平并且测量包括使用抗ClpP抗体、质谱和/或酶联免疫吸附法(ELISA)测定检测ClpP蛋白。
16.根据1-13中任一项所述的方法，其包括通过测量选自以下的一种或多种蛋白质的量的增加来测量ClpP活性水平的降低：TNF受体相关蛋白1(TRAP1)，热休克蛋白家族A(Hsp70)成员9(Grp75)，富含亮氨酸的三角状五肽重复结构蛋白(LRPPRC)，酪蛋白溶解的线粒体基质肽酶伴侣亚单位(ClpX)，鸟氨酸氨基转移酶(OAT)，和离子肽酶1(LonPl)。
17.根据1-16中任一项所述的方法，其中该方法包括筛选多种测试药剂以鉴定治疗肥胖症和/或糖尿病的一种或多种候选药剂。
18.治疗患有肥胖症和/或糖尿病的个体的方法，该方法包括：
以降低个体脂肪组织量、预防或减少个体体重增加、增加个体胰岛素敏感性和/或增加个体葡萄糖耐量的有效量将ClpP抑制剂施用于个体。
19.根据18所述的方法，其中ClpP抑制剂是特异性降低ClpP表达的RNAi药剂或基因编辑药剂。
20.根据18或19所述的方法，其中施用ClpP抑制剂，使得ClpP表达的降低基本上是肝脏特异性的，并且所施用的量对于增加个体的胰岛素敏感性是有效的。
21.根据18所述的方法，其中ClpP抑制剂是小分子。
22.根据21所述的方法，其中小分子是β-内酯。
23.根据22所述的方法，其中所述β-内酯是(3RS，4RS)-3-(壬-8-烯-1-基)-4-(2-(吡啶-3-基)乙基)氧杂环丁烷-2-酮或其药学上可接受的盐。
24.根据18-23中任一项所述的方法，其中将ClpP抑制剂直接递送至个体的肝脏，并且所施用的量对于增加个体的胰岛素敏感性是有效的。
25.根据18-24中任一项所述的方法，其中施用包括局部注射。
26.根据18-25中任一项所述的方法，其进一步包括测量个体的胰岛素敏感性的步骤。
对于本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以进行各种改变和修改。
实施例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并不旨在限制本发明的范围，也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经努力确保所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但是应当考虑到一些实验误差和偏差的存在。除非另有说明，份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。
已经根据发现或提出的包括用于实施本发明的优选模式的特定实施方案描述了本发明。本领域技术人员将理解，根据本公开内容，在不脱离本发明的预期范围的情况下，可以对示例的特定实施方案进行多种修改和改变。例如，由于密码子冗余，可以在基础DNA序列中进行改变而不影响蛋白质序列。此外，由于生物功能等效性考虑，可以在蛋白质结构中进行改变而不影响种类或量的生物作用。所有这些修改旨在包括在所附权利要求的范围内。
材料与方法
在本文描述的实施例中使用以下方法：
动物。在无病原体的动物设施中将所有小鼠维持在12小时光照/黑暗循环中。对于所有代谢研究，根据其基因型分开饲养小鼠。对于高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖研究，给动物喂食指定时间段的HFD(21％重量，来自脂肪的42％千卡，0.2％总胆固醇；TD.01064，Harlan-Teklad)。用异氟烷(存活程序)或用阿佛丁(终末程序)诱导麻醉。所有程序均经过加州大学旧金山分校动物研究委员会的批准，并遵循NIH指南。基于先前的文献选择用于不同测定的动物样品大小。根据基因型对动物进行分组；没有使用随机分组。对于所有行为测试，测试者对所有动物ID都不知情。对于其他测定，测试者并非不知情的。
ClpP敲除(ClpP-/-)和ClpP条件敲除(ClpP-cKO)小鼠的产生和维持。回收冷冻的ClpP+/-精子并产生ClpP+/-小鼠。将ClpP-/-小鼠回交至C57BL/6遗传背景中三代或更多代。由于ClpP-/-小鼠是不育的，因此将ClpP+/-小鼠彼此繁殖以产生具有三种不同基因型(WT、ClpP+/-、ClpP-/-)的同窝出生仔畜，并用于维持该系。
ClpP条件性敲除(Clp-cKO)小鼠的产生和维持。通过侧翼ClpP基因制备ClpP-cKO构建体，其具有长臂同源性(5′末端，约6Kb)和短臂同源性(3′末端，约3Kb)。将LoxP位点添加到含有ClpP外显子1-3的区域的两端以供将来去除。在3′末端loxP位点之前插入侧翼为F3位点的嘌呤霉素抗性基因。选择携带靶向ClpP等位基因的小鼠ES细胞克隆并用于显微注射。将得到的嵌合体与Flp小鼠一起繁殖以产生携带靶向ClpP等位基因的后代。然后繁殖杂合的ClpP-cKO小鼠以产生纯合的ClpP-cKO小鼠。在C57BL/6遗传背景上产生ClpP-cKO小鼠。纯合的ClpP-cKO小鼠用于维持该系。
身体组成分析。通过双能X射线吸收测定法(DEXA)和PIXImus2扫描仪(GEHealthcare Lunar)在异氟烷麻醉下分析4小时禁食后小鼠的身体组成。
食物摄入研究。根据其基因型分开饲养小鼠。对于每个笼子，每天上午10点对食物进行称重，持续4天。通过从开始时的食物重量中减去24小时结束时的食物重量来计算每个笼子的每日食物摄入量。每日食物摄入量通过动物数量或体重来标准化。
禁食-重新进食研究。将小鼠禁食24小时，然后恢复自由进食。在禁食前后测量小鼠的体重。在8和24小时的重新进食时间段后监测食物摄入量和体重增加。
体温测量。用啮齿动物直肠温度计获取小鼠的核心体温。
测量血糖和血浆胰岛素。用血糖仪和葡萄糖测试条(Free Style Lite)测量血糖。用胰岛素Elisa试剂盒(Crystal Chem)定量血浆胰岛素。
葡萄糖、胰岛素和丙酮酸耐量测试。在禁食后通过腹膜内注射葡萄糖(2g/kg)、胰岛素(0.5单位/kg)或丙酮酸盐(2g/kg)进行葡萄糖、胰岛素和丙酮酸耐量测试，其中对于葡萄糖和丙酮酸，过夜禁食，或对于胰岛素，4小时禁食。在注射前和注射后的不同时间点测量血糖水平。为了评估葡萄糖刺激的胰岛素释放，将小鼠禁食过夜(16小时)，然后腹膜内注射葡萄糖(2g/kg)。在注射前和注射后的不同时间点从尾静脉收集血液样品。
行为测试。通过握力、倾斜和尾部悬吊测试评估ClpP-/-小鼠的一般神经行为特征。通过旋转棒测试确定这些小鼠的运动功能。通过高架十字迷宫确定焦虑水平。通过旷场测试研究活动水平。使用莫里斯水迷宫检查这些小鼠的学习和记忆。通过前脉冲抑制试验测试听觉功能。
组织学分析。将组织(肝脏、内脏脂肪、腓肠肌、肩胛间棕色脂肪和胰腺)在4％多聚甲醛(pH7.4)中固定过夜，包埋在石蜡中，并以7-8μm连续切片。进行标准苏木精和伊红染色。
脂肪细胞大小测量。进行脂肪组织切片的苏木精和伊红染色，并用Image J分析图像。
肝脏切片的电子显微镜分析。用EM固定剂灌注WT或ClpP-/-小鼠。收集肝脏组织并在EM固定剂中固定2天。处理组织并使用JEOL JEM-1230透射电子显微镜收集电子显微镜图像。通过Image J软件在13,600倍放大倍数下测量线粒体数、面积和圆度。
产生脂肪细胞特异性ClpP-cKO小鼠。通过用ap2-Cre小鼠繁殖ClpP-cKO小鼠产生脂肪细胞特异性ClpP敲除小鼠。Cre+小鼠在脂肪组织中大大降低了ClpP蛋白水平，并且Cre-同窝出生仔畜在代谢测定中用作对照。
尾静脉注射AAV-CMV-Cre。使用AAV8.2-CMV-Cre和对照AAV8.2。通过尾静脉以5×109个基因组拷贝/克(gc/克)体重的剂量将这些病毒注射到3-5月龄ClpP-cKO小鼠中。每周测量一次注射小鼠的体重。在注射前和注射后3周测量血糖和血浆胰岛素水平。注射后4周对这些小鼠进行葡萄糖耐量试验。注射后6周给予这些小鼠HFD。接着是响应于HFD的体重增加并且在HFD两周后进行葡萄糖耐量试验。
蛋白质印迹。在低洗涤剂缓冲液(50mM Tris/HCl，pH 8.0，150mM NaCl，0.1％SDS，0.5％Nonidet P-40，0.5％脱氧胆酸钠)与蛋白酶抑制剂的混合物中裂解组织或细胞。磷酸酶抑制剂也包括在裂解物缓冲液中。将裂解物以13,000rpm离心10分钟以除去沉淀。使用来自Invitrogen的NuPAGE bis-tris系统，按照供应商的方案进行SDS-PAGE。用IRDye标记的二抗(Li-cor)使用标准的蛋白质印迹方案。使用Li-cor图像系统扫描蛋白质印迹图像。
2D荧光差异凝胶电泳。来自ClpP-/-、ClpP+/-或WT小鼠的器官进行2D荧光差异凝胶电泳分析。从凝胶上切下最显著变化的斑点进行质谱分析以鉴定蛋白质，这是由同一家公司完成的。
小鼠成纤维细胞制备。从由新出生的幼崽收集的皮肤组织制备小鼠成纤维细胞。将组织切成小块并置于100-mm细胞培养皿上，皮肤朝上。5-10分钟后，将10ml成纤维细胞培养基(含10％FBS的DMEM)缓慢加入培养皿中。将植入物在潮湿的37℃、5％CO2培养箱中培养。成纤维细胞在培养7-10天后最终增殖。将小鼠成纤维细胞维持在相同的培养基中多次传代。
ClpP在ClpP-/-成纤维细胞中的过表达。用Life Technologies的pLenti7.3TOPOTA克隆试剂盒构建人ClpP的慢病毒过表达载体。用Life Technologies的ViraPowerTM慢病毒包装混合物包装慢病毒。将携带空载体(对照)或人ClpP cDNA的慢病毒加入到ClpP-/-成纤维细胞中，并在进一步实验前孵育48小时。
shRNA敲低ClpP-/-成纤维细胞中的不同基因。获得慢病毒shRNA构建体。用LifeTechnologies的ViraPowerTM慢病毒包装混合物包装慢病毒。将携带空载体(对照)或不同shRNA的慢病毒加入到ClpP-/-成纤维细胞中，并在进一步实验前孵育48小时。
细胞活力测定●将小鼠成纤维细胞以每孔10,000个细胞接种在黑色透明底96孔板上。孵育24小时后，将细胞在OPTI-MEM培养基中培养过夜。用不同剂量的H2O2处理细胞4小时。然后将Alamar蓝试剂(Invitrogen)加入孔中(1∶10比例)。孵育2小时后，在590nm发射(560nm激发)下测量荧光强度。
Seahorse OCR分析。将小鼠成纤维细胞维持在成纤维细胞生长培养基中直至汇合。在测定前一天，将成纤维细胞用胰蛋白酶消化并以每孔40,000个细胞接种在96孔Seahorse培养板上。在测定之前，将培养基更换为Seahorse Bioscience提供的不依赖CO2的培养基。然后将细胞在37℃下不含CO2温育0.5-1小时。根据供应商的方案，使用XF细胞有丝分裂应激测试试剂盒和XF细胞外通量分析仪(Seahorse Bioscience)进行耗氧率(OCR)测定。
生长激素(GH)和瘦素水平测定。通过小鼠GH ELISA试剂盒和来自Crystal Chem，Inc.的超灵敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒测定小鼠血浆中的GH和瘦素水平。
抗体。所使用的抗体是抗ClpP(兔，Novus Biologicals)、抗ClpX(SDI，自制)、抗Akt(兔，Cell Signaling)、抗磷酸化的Akt(兔，Cell Signaling)、抗Grp75(兔，CellSignaling)、抗TRAP1(小鼠mAb，AbCam)、抗LRPPRC(兔，Proteintech Group)、抗LonP(兔，Sigma-Aldrich)、抗OAT(小鼠，Abcam)、抗SDH2(兔，aric antibodies)、抗ATP6V1A(兔，Proteintech Group)、抗CPS1(小鼠，Lifespan)、抗Hsp70(兔，Cell Signaling)、抗GAPDH(小鼠mAb，Millipore)、抗Hsp60(兔，AbCam)、抗VDAC(小鼠mAb，EMD Chemical)和抗肌动蛋白(兔，Sigma-Aldrich)。
统计分析。除非另有说明，否则数据表示为平均值±SD。使用Prism 6软件(GraphPad)进行所有统计学分析。通过t检验、单因素方差分析(one-way ANOVA)或重复测量方差分析，然后进行Bonferroni或Tukey-Kramer事后检验。在所有情况下，P＜0.05被认为具有统计学意义。
哺乳动物ClpXP是一种ATP酶复合物(由催化亚单位ClpP和调节亚单位ClpX组成)是一种线粒体蛋白酶，具有不明确的生理功能。以下实施例中呈现的数据显示，与野生型对照相比，ClpP敲除(ClpP-/-)小鼠消耗更多能量并且具有减少的脂肪组织和增强的胰岛素敏感性。在ClpP-/-小鼠的各种器官中检测到线粒体伴侣的急剧增加，伴随着线粒体数量的增加。消除ClpP通过提高LRPPRC和/或TRAP1水平(两者都是具有线粒体功能作用的蛋白质)来增加细胞的线粒体功能和抗应激能力，其通过敲低任一蛋白质而逆转。肝ClpP负责调节胰岛素敏感性，而脂肪细胞ClpP则不然。因此，ClpP是线粒体功能和应激反应的主要调节因子，其进而调节能量稳态、脂质储存和胰岛素敏感性。这些数据突出显示ClpP作为治疗肥胖和糖尿病的治疗靶标。
实施例1：小鼠中缺乏ClpP减少了正常饮食或高脂肪饮食情况下的脂肪组织
为了理解哺乳动物ClpXP蛋白酶的生理作用，通过基因捕获策略产生ClpP敲除(ClpP-/-)小鼠模型(图7a)。定量聚合酶链反应(qPCR)(未显示)和蛋白质印迹证实Clpp基因在不同器官中被有效缺失(图7b-i)。ClpP-/-幼崽出生时是活的并且处于正常的孟德尔比率。肝脏和肌肉的形态学评估显示6个月大的纯合(ClpP-/-)或杂合(ClpP+/-)敲除小鼠没有异常(图8)。在一般神经行为、运动功能(旋转和游泳速度测试)、焦虑(高架加迷宫测试)或学习和记忆(莫里斯水迷宫测试)中，ClpP-/-和WT同窝出生仔畜之间没有差异(图9)，表明正常的神经学特征。
然而，雄性和雌性成年ClpP-/-小鼠的重量和大小均显著小于WT和ClpP+/-同窝出生仔畜(图1a-b)。相反，无论其ClpP基因型如何，所有新出生的幼崽都具有相似的体重(图1c)。此外，5-6月龄ClpP-/-小鼠的生长激素水平高于其他组的小鼠(ClpP-/-，8.54±5.41ng/ml；ClpP+/-，2.48±0.67ng/ml；WT，0.91±0.53ng/ml；对于每种基因型，n＝3-5只小鼠；单因素方差分析，p＝0.0053)，因此成年小鼠体重差异不是源于早期发育缺陷或生长激素缺乏。
与WT小鼠相比，如通过总体脂肪量或体脂含量(脂肪质量％)测量的，ClpP-/-小鼠具有显著降低的体脂(图1d-e)。尽管C中P+/-小鼠具有与WT小鼠相似的体重，但它们倾向于具有较低的体脂肪(图1d-e)。相反，尽管瘦质量显著降低，ClpP-/-小鼠的瘦含量(瘦质量％)显著高于ClpP+/-和WT小鼠(图1g)(图1f)。有趣的是，对于产热和对代谢调节有益的肩胛间棕色脂肪组织的定量显示出三种ClpP基因型之间如瘦组织般相似的特征(图1h-i)。与它们的较低的体脂肪含量一致，来自ClpP-/-小鼠的内脏脂肪与来自ClpP+/-和WT小鼠的脂肪细胞相比具有更小的脂肪细胞(图1m和图10)。相反，ClpP-/-、ClpP+/-和WT小鼠中棕色脂肪组织的形态是相似的(图11a)。因此，敲除ClpP大大减少了白色脂肪组织，这可能有助于成年ClpP-/-小鼠中观察到的较低体重。
接下来，给小鼠喂食高脂肪饮食(HFD)2个月以确定消除ClpP对HFD诱导的肥胖症的影响。ClpP-/-小鼠对HFD诱导的体重增加具有抗性，并且ClpP+/-小鼠在前10天内显示出延迟的体重增加(图1j，和图12a)。在HFD的第40天，当所有三组的体重变化达到稳定时，ClpP-/-小鼠的脂肪量和体重仅略有增加，而ClpP+/-和WT小鼠显著增加更多体重(图1k，图11)。因此，ClpP-/-小鼠对HFD诱导的肥胖症具有抗性。HFD没有改变各组小鼠的瘦体重和含量的差异(比较图1f-g与图12c-d)。
与较低体脂含量一致，ClpP-/-小鼠的血浆瘦素水平比其他组小鼠低得多(ClpP-/-，0.409±0.224ng/ml；ClpP+/-，1.927±1.928ng/ml；WT，2.06±2.022；n＝11-12只5-6个月龄小鼠；单因素方差分析，p＜0.05)。有趣的是，ClpP-/-小鼠是不育的，如在瘦素耗尽的动物模型中观察到的。虽然不打算受任何特定理论的束缚，但低瘦素水平可能是ClpP-/-小鼠生殖缺陷的原因。
实施例2：小鼠中缺乏ClpP改变了能量消耗曲线
低瘦素水平导致WT小鼠的摄食行为和脂肪沉积。尽管所有组的小鼠每只动物每天的食物摄入量相近(图2a)，与较低的血清瘦素水平相一致，ClpP-/-小鼠的体重指数与体重相比显著高于WT和ClpP+/-小鼠(图2b)。因此，ClpP-/-小鼠增重较少并且生成的脂肪也较少，同时消耗更多食物，这表明它们要么消耗更多能量，要么没有正确利用营养。
使用禁食-重新进食方法来剖析这两种可能性(图2c)。禁食24小时后，ClpP-/-小鼠失去与WT和ClpP+/-小鼠相同的重量(图2d)。由于ClpP-/-小鼠体重较轻，其体重失去百分比显著高于WT和ClpP+/-同窝出生仔畜(图2e)，这表明ClpP-/-小鼠消耗更多能量。在重新进食的时间段期间，与WT和ClpP+/-同窝出生仔畜相比，ClpP-/-小鼠消耗了显著更多的食物并且增重百分比显著更高(图2f-g)。
更高的能量消耗可归因于活动过度或高产热。旷场试验表明所有组的活动水平相似(图13)。令人惊讶的是，ClpP-/-小鼠的核心体温显著低于WT和ClpP+/-小鼠(图2h-i)，这表明ClpP-/-小鼠没有使用更多的能量进行产热。因此，ClpP-/-小鼠可能具有更高的基础能量消耗。
实施例3：小鼠中缺乏ClpP改善了胰岛素敏感性
分析ClpP-/-小鼠的血糖水平和血浆胰岛素水平。ClpP-/-小鼠的血糖水平显著低于ClpP+/-和WT小鼠(图3a)。在自由进食和禁食条件下，ClpP-/-小鼠的血浆胰岛素水平也显著低于WT对照，而ClpP+/-小鼠的血浆胰岛素水平则在中间(图3b-c)。基于形态学数据，胰腺不足(pancreas deficit)不太可能导致胰岛素水平低(图11b)。因此，尽管具有非常低的胰岛素水平，ClpP-/-小鼠仍维持正常的血糖水平。在2个月的HFD后，WT和ClpP+/-小鼠的血糖水平大大增加。相反，ClpP-/-小鼠在HFD的情况下维持低得多的血糖和胰岛素水平(图3d-e)。葡萄糖和胰岛素耐量试验进一步揭示了ClpP-/-小鼠中增强的胰岛素敏感性(图3f-h)。检测到ClpP-/-小鼠中丙酮酸耐量具有增加的趋势，尽管没有达到显著性(图3i)。为了支持增加的胰岛素敏感性，在ClpP-/-小鼠的肌肉和成纤维细胞中发现了更高的p-AKT水平(胰岛素信号传导途径的主要成分)(图3j-1)。另外，ClpP-/-成纤维细胞比WT成纤维细胞对培养中IGF诱导的AKT活化更敏感(图3m)。这些数据强烈支持消除ClpP可改善小鼠胰岛素敏感性的结论。
将ClpP-/-小鼠与db/db小鼠(肥胖症、糖尿病和血脂异常的模型)杂交以确定耗尽ClpP是否以及如何影响db/db小鼠的肥胖和糖尿病表型。敲除ClpP导致db/db小鼠体重的少量但显著的降低(图14a)。禁食4小时后，ClpP敲除也显著降低db/db小鼠的血糖水平(图3n)，尽管这种效应在禁食16小时后消失，可能是因为禁食16小时后具有WT ClpP的db/db小鼠的葡萄糖水平已经降至正常水平(图14bc)。更重要的是，消除ClpP极大地改善了db/db小鼠的葡萄糖耐量(图3o)。
实施例4：小鼠中缺乏ClpP上调线粒体伴侣水平
为了鉴定ClpP的下游效应物，使用二维(2D)荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)来比较来自具有不同ClpP基因型的小鼠的各种器官的蛋白质谱(图15)。然后使用质谱法鉴定ClpP-/-小鼠的不同器官中最显著改变的蛋白质(图20)。蛋白质印迹的验证证实了六种潜在的ClpXP下游效应子(TRAP1、Grp75、LRPPRC、ClpX、OAT和LonP；图21)；它们的蛋白质水平在多个器官中大大增加(图4a-h和图16)，但在大多数情况下它们的mRNA水平保持相同(图22)。因此，ClpP可能在转录后控制这些蛋白质的水平。在胚胎第19天幼崽(未显示)中也检测到显著增加的蛋白质水平，而体重没有降低，这表明这些蛋白质的积累可能是观察到的表型的原因而不是结果。在小鼠成纤维细胞中也检测到相同蛋白质水平的增加(图4i-j)，其随后通过过表达小鼠ClpP而减少(图4k-1)，这表明ClpP以细胞自主的方式特异性调节细胞中的这些蛋白质水平。
引人注目的是，许多潜在的ClpP下游效应子与线粒体蛋白稳态有关，包括分子伴侣ClpX(线粒体Hsp100)、TRAP1(线粒体Hsp90)和Grp75(线粒体Hsp70)以及线粒体蛋白酶LonP(图4a-h，图16)。ClpP敲除对线粒体蛋白VDAC和Hsp60的水平没有显著影响(图16)。此外，许多胞质溶胶和内质网(ER)热休克蛋白如Bip和Hsp90没有显著差异(图16)。因此，ClpP直接或间接地控制一组特定的线粒体蛋白，尤其是伴侣。
实施例5：缺乏ClpP增加线粒体数量和增强线粒体功能和抗应激能力
在ClpP-/-小鼠中分析线粒体数量和功能。ClpP-/-肝脏切片的电子显微镜(EM)研究显示，ClpP的消耗增加了肝细胞中线粒体数量并改变了线粒体形态(图5a-b和图17a-b)。在ClpP-/-肝细胞中线粒体质量(通过每个视野的总线粒体面积测量)也显著增加(图5c，和图17a-b)。与WT相比，ClpP-/-线粒体具有更密集的基质(图5a和图17a-b)，可能是由于ClpP-/-线粒体中蛋白质含量增加。尽管在ClpP-/-和WT肝细胞之间线粒体的大小分布相似(图17c)，但是具有较低圆度的ClpP-/-线粒体的百分比较高(图17d)，表明更多ClpP-/-线粒体具有细长的形状。
为了确定ClpP是否调节线粒体功能，使用Seahorse XF分析仪比较来自ClpP-/-和WT小鼠的成纤维细胞的呼吸能力。ClpP-/-成纤维细胞具有相似的基础氧消耗速率(OCR)，但与WT成纤维细胞相比具有显著更高的最大OCR(图5d)，这表明在不存在ClpP的情况下线粒体功能增强。与WT成纤维细胞相比，ClpP-/-成纤维细胞也显示出对H2O2诱导的细胞毒性的抗性(图5e)，这表明在不存在ClpP的情况下抗氧化应激能力增加。小鼠ClpP在ClpP-/-成纤维细胞中的过表达不仅导致ClpP下游效应子的水平降低(图4k-1)，而且还消除了在ClpP-/-细胞中观察到的线粒体功能的增强和对H2O2诱导的细胞毒性的抗性(图5f-g)。
实施例6：线粒体效应子TRAP1、Grp75和LRPPRC介导ClpP缺失对线粒体功能和抗应 激能力的影响
为了确定ClpP调节的线粒体效应子是否以及哪种线粒体效应子介导ClpP-/-成纤维细胞中所见的增强的线粒体功能，使用慢病毒shRNA在ClpP-/-成纤维细胞中敲除了它们中的每一种。然后进行功能测定(图18a-d)。敲除TRAP1或Grp75，但不是LRPPRC和ClpX，消除或降低了ClpP-/-成纤维细胞对H2O2细胞毒性的抗性(图5h-i和图18e-f)。敲低LRPPRC或TRAP1消除了ClpP-/-细胞增强的呼吸能力，而降低ClpX或Grp75的水平则没有这种效果(图5j)。这些数据表明ClpP通过控制其效应子水平，特别是TRAP1、Grp75和LRPPRC来调节线粒体功能。这些蛋白质可能通过不同的途径影响线粒体功能或对同一途径具有协同作用。
实施例7：肝ClpP负责调节胰岛素敏感性
多种组织可通过不同机制影响胰岛素敏感性。ClpP条件性敲除小鼠(ClpP-cKO)用于进一步剖析ClpP-/-小鼠表型下的组织特异性机制。在该小鼠模型中，插入LoxP位点以侧接含有ClpP外显子1-3的小鼠基因组区域，以备将来去除。为了特异性缺失肝脏中的ClpP，通过尾静脉将AAV-CMV-Cre注射到ClpP-cKO小鼠中。与注射对照AAV的小鼠相比，通过免疫染色检测的肝脏中的ClpP水平在注射Cre的小鼠中显著降低(图6a)。在注射后3周，尽管两组小鼠的总体重没有显著差异(图6b-c)，注射Cre的小鼠体重增加显著低于对照小鼠(图6d)。注射Cre的小鼠的血糖水平也显著低于对照小鼠的血糖水平(图6f)，而未检测到血浆胰岛素水平的差异(图6e)。在正常饮食或HFD两周的小鼠中通过葡萄糖耐量试验显示注射Cre的小鼠的胰岛素敏感性(图6g-h)。与ClpP-/-小鼠不同，ClpP的肝特异性敲低不影响HFD诱导的体重增加(图6i)。这些数据表明，肝脏ClpP水平负责调节ClpP-/-小鼠中观察到的胰岛素敏感性，而不影响脂肪含量。
还将ClpP-cKO小鼠与ap2-Cre小鼠杂交以建立脂肪细胞特异性ClpP-KO小鼠。ClpP-cKO/ap2-Cre小鼠的脂肪组织中的ClpP水平约为对照小鼠的四分之一(图19a-b)。尚不清楚残留ClpP水平是否是由于ap2-Cre未完成的Clpp缺失或收集的脂肪组织中其他组织或细胞(如血管或免疫细胞)的污染。在ClpP-cKO/ap2-Cre小鼠中未检测到体重、血糖水平和葡萄糖耐量的显著变化(图19c-e)。HFD的ClpP-cKO/ap2-Cre小鼠的体重增加和葡萄糖耐量也与相同饮食的对照小鼠相似(图19f-g)。因此，脂肪细胞ClpP不太可能归因于ClpP-/-小鼠中脂肪沉积减少和胰岛素敏感性增强。
实施例8：小分子ClpP抑制剂在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞中的体外分析
在处理前一天，在6孔板中以每孔200,000个细胞接种野生型小鼠MEF细胞。用OPTI-MEM中的10μM小分子ClpP抑制剂A2-32-01、AV167和AV179(本文先前描述)处理细胞，每天两次，持续2天(48小时)。对于每次处理，会除去旧培养基并将新鲜培养基加入孔中。处理48小时后，收获细胞用于ClpP底物的蛋白质印迹分析或qPCR测定。
如图24和25所示，用ClpP抑制剂A2-32-01处理增加了小鼠MEF细胞中ClpP底物蛋白水平，模拟了在ClpP敲除MEF和ClpP敲除小鼠器官中观察到的表型。如图26所示，在A2-32-01处理后，小鼠MEF细胞中这些基因的mRNA水平保持不变，这通过转录调节排除了A2-32-01的潜在脱靶效应。
基于这些体外数据，如以下实施例9中所描述的进行高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖症和糖尿病小鼠模型中A2-32-01的进一步体内测试。
实施例9：高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖症和糖尿病小鼠模型中小分子ClpP抑制剂 A2-32-01的体内分析
7-9月龄WT雌性(20只小鼠)喂食高脂肪饮食3周。测量响应于HFD的体重变化和血糖/血浆胰岛素水平。在第4周开始时，对于处理组，每天两次以300mg/kg腹膜内注射A2-32-01，持续8天。对于对照组，注射玉米油(媒介物)。以HFD维持小鼠。每天密切注意体重变化。在A2-32-01注射的第8天，测量血糖水平，并应用葡萄糖耐量试验来测量胰岛素敏感性。来自体内A2-32-01治疗的前七天的体重数据在图28中提供，图28显示与载体对照组相比，第2天至第7天的体重显著降低。在第8天进行反映胰岛素敏感性的葡萄糖耐量试验，并且在图29中提供数据，图29显示与载体对照小鼠相比，A2-32-01处理的小鼠中胰岛素敏感性的显著改善。
实施例10：高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖症和糖尿病小鼠模型中小分子ClpP抑制 剂A2-32-01的持续体内分析(预测)
继续实施例9的体内分析，在A2-32-01注射的第9天收集血液和多个器官(肝/肌肉/脑)。从小鼠肝脏分离线粒体，并使用肽底物测试ClpP活性，例如，如本文所描述的。进行蛋白质印迹分析以检测ClpP底物水平。

Claims (26)

1.一种鉴定用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂的方法，所述方法包括：
(a)使哺乳动物细胞与测试药剂接触；
(b)测量所述接触后的哺乳动物细胞中ClpP的相对于参考值的表达水平和/或活性水平；
(c)确定所述测试药剂导致的相对于所述参考值的所述表达水平和/或活性水平的降低；和
(d)将所述测试药剂鉴定为用于治疗肥胖症和/或糖尿病的候选药剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是小鼠细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是体外的。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是离体的。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是体内的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是肝细胞。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述接触包括将所述测试药剂施用于小鼠。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括：在步骤(a)的所述接触之前测量所述小鼠中ClpP的表达水平和/或活性水平，以获得所述参考值。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其进一步包括：在步骤(d)之后，将所述鉴定的候选药剂施用于患有肥胖症和/或糖尿病的个体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述个体是小鼠、非人灵长类动物或人。
12.根据权利要求10或11所述的方法，还包括在将所述鉴定的候选药剂施用于所述个体之后，测量所述个体的一个或多个特征，所述特征选自：胰岛素敏感性，血糖水平，葡萄糖耐量，体脂肪质量，脂肪组织的量，白色脂肪组织的量；脂肪质量百分比，体重，内脏脂肪脂肪细胞大小，血浆瘦素水平，生长激素水平，基础能量消耗，肌肉和/或成纤维细胞中磷酸化AKT(p-AKT)水平，瘦质量百分比，肝细胞中线粒体数量，肝细胞中的线粒体质量，肝细胞中的线粒体形态，成纤维细胞的呼吸能力，成纤维细胞最大耗氧率(OCR)和成纤维细胞对H2O2诱导的细胞毒性的抗性。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述测试药剂是小分子或多肽。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其包括测量ClpP的表达水平，其中所述表达水平是RNA表达水平并且所述测量包括使用定量RT-PCR、微阵列或RNA测序。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其包括测量ClpP的表达水平，其中所述表达水平是蛋白质表达水平并且所述测量包括使用抗ClpP抗体、质谱和/或酶联免疫吸附法(ELISA)测定检测ClpP蛋白。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其包括通过测量选自以下的一种或多种蛋白质的量的增加来测量ClpP活性水平的降低：TNF受体相关蛋白1(TRAP1)，热休克蛋白家族A(Hsp70)成员9(Grp75)，富含亮氨酸的三角状五肽重复结构蛋白(LRPPRC)，酪蛋白溶解的线粒体基质肽酶伴侣亚单位(ClpX)，鸟氨酸氨基转移酶(OAT)，和离子肽酶1(LonP1)。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法包括筛选多种测试药剂以鉴定治疗肥胖症和/或糖尿病的一种或多种候选药剂。
18.一种治疗患有肥胖症和/或糖尿病的个体的方法，所述方法包括：
以降低所述个体中脂肪组织量、预防或减少所述个体的体重增加、增加所述个体的胰岛素敏感性和/或增加所述个体的葡萄糖耐量的有效量，将ClpP抑制剂施用于所述个体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述ClpP抑制剂是特异性降低ClpP表达的RNAi药剂或基因编辑药剂。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中施用所述ClpP抑制剂使得ClpP表达的所述降低基本上是肝脏特异性的，并且所施用的量对于增加所述个体的胰岛素敏感性是有效的。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述ClpP抑制剂是小分子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述小分子是β-内酯。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述β-内酯是(3RS，4RS)-3-(壬-8-烯-1-基)-4-(2-(吡啶-3-基)乙基)氧杂环丁烷-2-酮或其药学上可接受的盐。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中将所述ClpP抑制剂直接递送至所述个体的肝脏，并且所施用的量对于增加所述个体的胰岛素敏感性是有效的。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述施用包括局部注射。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其进一步包括测量所述个体的胰岛素敏感性的步骤。
CN201780024269.5A 2016-03-16 2017-03-15 用于治疗肥胖症和/或糖尿病以及用于鉴定候选治疗剂的方法和组合物 Pending CN109414414A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662309311P 2016-03-16 2016-03-16
US62/309,311 2016-03-16
PCT/US2017/022584 WO2017161043A1 (en) 2016-03-16 2017-03-15 Methods and compositions for treating obesity and/or diabetes and for identifying candidate treatment agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109414414A true CN109414414A (zh) 2019-03-01

Family

ID=59852240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780024269.5A Pending CN109414414A (zh) 2016-03-16 2017-03-15 用于治疗肥胖症和/或糖尿病以及用于鉴定候选治疗剂的方法和组合物

Country Status (5)

Country Link
US (2) US11376242B2 (zh)
EP (1) EP3429567B1 (zh)
JP (2) JP2019515654A (zh)
CN (1) CN109414414A (zh)
WO (1) WO2017161043A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11376242B2 (en) 2016-03-16 2022-07-05 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for treating obesity and/or diabetes and for identifying candidate treatment agents
CN117695395A (zh) * 2024-02-04 2024-03-15 首都儿科研究所附属儿童医院 H3K36ac抑制剂在制备治疗肥胖的药物中的应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019112996A1 (en) * 2017-12-04 2019-06-13 Oklahoma Medical Research Foundation Method and compositions for treating obesity and insulin resistance

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010059942A1 (en) * 2008-11-21 2010-05-27 The J. David Gladstone Institutes Inhibition of apoe cleavage activity in the treatment of apoe-related disorders

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
CZ295567B6 (cs) * 1997-02-05 2005-08-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Tetrahydrolipstatin pro výrobu orálního farmaceutického prostředku pro ošetřování typu II diabetes mellitus
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US6511808B2 (en) 2000-04-28 2003-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods for designing exogenous regulatory molecules
US20030082561A1 (en) 2000-07-21 2003-05-01 Takashi Sera Zinc finger domain recognition code and uses thereof
US7273923B2 (en) 2001-01-22 2007-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
EP1386004A4 (en) 2001-04-05 2005-02-16 Ribozyme Pharm Inc MODULATION OF GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH INFLAMMATORY PROLIFERATION AND GROWTH OF NEURITIES BY METHODS INVOLVING NUCLEIC ACID
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
JP2005507658A (ja) * 2001-10-12 2005-03-24 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド タンパク質修飾および維持分子
AU2003218382B2 (en) 2002-03-21 2007-12-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
AU2003291618A1 (en) 2002-07-31 2004-04-30 City Of Hope Adenoviral va1 pol iii expression system for rna expression
US7892793B2 (en) 2002-11-04 2011-02-22 University Of Massachusetts Allele-specific RNA interference
US7618948B2 (en) 2002-11-26 2009-11-17 Medtronic, Inc. Devices, systems and methods for improving and/or cognitive function through brain delivery of siRNA
SG179290A1 (en) 2003-04-01 2012-04-27 Intradigm Corp Targets for tumor growth inhibition
EP1633767B1 (en) 2003-06-02 2018-11-21 University of Massachusetts Methods and compositions for controlling efficacy of rna silencing
JP4555292B2 (ja) 2003-08-08 2010-09-29 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 標的化された切断及び組換えの方法及び組成物
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7947658B2 (en) 2003-09-12 2011-05-24 University Of Massachusetts RNA interference for the treatment of gain-of-function disorders
WO2005096781A2 (en) 2004-04-06 2005-10-20 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating gain-of-function disorders using rna interference
NZ553126A (en) 2004-08-09 2010-11-26 Bionomics Ltd Compositions and methods for angiogenesis related molecules and treatments
US7718625B2 (en) 2005-01-27 2010-05-18 University Of South Florida Polynucleotides targeted against the extended 5′-UTR region of argininosuccinate synthase and uses thereof
TW200639253A (en) 2005-02-01 2006-11-16 Alcon Inc RNAi-mediated inhibition of ocular targets
FR2882062B1 (fr) 2005-02-14 2007-06-15 Commissariat Energie Atomique Vecteurs d'expression stable et de longue duree de sirna et leurs applications
US8008468B2 (en) 2005-02-16 2011-08-30 Benitec, Inc. RNAi expression constructs with liver-specific enhancer/promoter
GB0505081D0 (en) 2005-03-14 2005-04-20 Genomica Sau Downregulation of interleukin-12 expression by means of rnai technology
US20070044164A1 (en) 2005-05-31 2007-02-22 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing microRNAs
CA2660485C (en) 2006-08-11 2016-04-12 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination
EP2799547B1 (en) 2006-11-08 2016-12-21 Veritas Bio, LLC In Vivo Delivery of RNA to a Target Cell
US7910722B2 (en) 2007-07-05 2011-03-22 Florida State University Research Foundation RNAi therapeutic for treatment of hepatitis C infection
WO2009042186A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Genomic editing in zebrafish using zinc finger nucleases
US7973019B1 (en) 2007-10-03 2011-07-05 Alcon Research, Ltd. Transferrin/transferrin receptor-mediated siRNA delivery
EP2205752B1 (en) 2007-10-25 2016-08-10 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for targeted integration
TW200930405A (en) 2007-11-15 2009-07-16 Alcon Res Ltd Low density lipoprotein receptor-mediated siRNA delivery
US7981446B2 (en) 2007-11-26 2011-07-19 Forhumantech. Co., Ltd. Pharmaceutical compositions and methods for delivering nucleic acids into cells
TW200932274A (en) 2007-12-18 2009-08-01 Alcon Res Ltd Interfering RNA delivery system and uses thereof
CA2716868A1 (en) 2008-02-26 2009-09-03 Ludwig-Maximilians-Universitat Munchen Beta-lactones as antibacterial agents
US8945885B2 (en) 2008-07-03 2015-02-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Minicircle DNA vector preparations and methods of making and using the same
US8034922B2 (en) 2008-08-22 2011-10-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for modulating activity of capped small RNAs
EP3156494B8 (en) 2008-12-04 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US8569065B2 (en) 2009-03-13 2013-10-29 Egen, Inc. Compositions and methods for the delivery of biologically active RNAs
US8569256B2 (en) 2009-07-01 2013-10-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US8586363B2 (en) 2009-12-10 2013-11-19 Regents Of The University Of Minnesota TAL effector-mediated DNA modification
US8685737B2 (en) 2011-04-27 2014-04-01 Amyris, Inc. Methods for genomic modification
WO2013059622A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 President And Fellows Of Harvard College Treatments for mycobacterium tuberculosis
WO2013134546A1 (en) 2012-03-07 2013-09-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
PL3401400T3 (pl) 2012-05-25 2019-12-31 The Regents Of The University Of California Sposób i kompozycje do modyfikacji docelowego dna przez ukierunkowujący RNA oraz do modulacji transkrypcji przez ukierunkowujący RNA
PL2898075T3 (pl) 2012-12-12 2016-09-30 PROJEKTOWANIE i OPTYMALIZACJA ULEPSZONYCH SYSTEMÓW, SPOSOBY I KOMPOZYCJE ENZYMÓW DO MANIPULACJI SEKWENCJĄ
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
ES2542015T3 (es) 2012-12-12 2015-07-29 The Broad Institute, Inc. Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3825401A1 (en) 2012-12-12 2021-05-26 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
JP2016501531A (ja) 2012-12-12 2016-01-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作および治療適用のための系、方法および組成物の送達、エンジニアリングおよび最適化
DK2931898T3 (en) 2012-12-12 2016-06-20 Massachusetts Inst Technology CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS
DK2921557T3 (en) 2012-12-12 2016-11-07 Broad Inst Inc Design of systems, methods and optimized sequence manipulation guide compositions
US9493844B2 (en) 2012-12-13 2016-11-15 Dow Agrosciences Llc DNA detection methods for site specific nuclease activity
DK2931891T3 (da) 2012-12-17 2019-08-19 Harvard College Rna-styret modificering af menneskelige genomer
US10227610B2 (en) 2013-02-25 2019-03-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
DK3620534T3 (da) 2013-03-14 2021-12-06 Caribou Biosciences Inc Crispr-cas sammensætninger af nucleinsyre-targeting nucleinsyrer
MX2015011985A (es) 2013-03-15 2016-04-07 Univ Minnesota Ingenieria genomica de plantas utilizando sistemas crispr/cas.
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
EP2970208A4 (en) 2013-03-15 2016-11-30 Gen Hospital Corp SPECIFICITY INCREASES FOR RNA-MEDIATED CHANGES
US20140349400A1 (en) 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US20140364333A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
KR102223568B1 (ko) 2013-04-05 2021-03-04 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물
SG11201508028QA (en) 2013-04-16 2015-10-29 Regeneron Pharma Targeted modification of rat genome
EP2994531B1 (en) 2013-05-10 2018-03-28 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
WO2014190181A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
US20160221977A1 (en) 2013-08-27 2016-08-04 Brown University Antibacterial beta-lactones, and methods of identification, manufacture and use
JP2019515654A (ja) 2016-03-16 2019-06-13 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 肥満及び／又は糖尿病を処置するための方法及び組成物、並びに候補処置薬剤を識別するための方法及び組成物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010059942A1 (en) * 2008-11-21 2010-05-27 The J. David Gladstone Institutes Inhibition of apoe cleavage activity in the treatment of apoe-related disorders

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COLE ET AL.: "《Inhibition of the mitochondrial protease, ClpP, as a therapeutic strategy for human acute myeloid leuekmia》", 《CANCER CELL》 *
LEE ET AL.: "《ApoE polymorphism May Determine Low-Density Lipoprotein Cholesterol Level in Association with Obesity and Metabolic Syndrome in Postmenopausal Korean Women》", 《YONSEI MED J.》 *
RATH ET AL.: "《Inhibition of dsRNA-activated protein kinase links mitochondrial unfolded protein response to the pathogenesis of intestinal inflammation》", 《GUT》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11376242B2 (en) 2016-03-16 2022-07-05 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for treating obesity and/or diabetes and for identifying candidate treatment agents
CN117695395A (zh) * 2024-02-04 2024-03-15 首都儿科研究所附属儿童医院 H3K36ac抑制剂在制备治疗肥胖的药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019515654A (ja) 2019-06-13
EP3429567B1 (en) 2024-01-10
WO2017161043A1 (en) 2017-09-21
US20190000817A1 (en) 2019-01-03
US11376242B2 (en) 2022-07-05
US20220257576A1 (en) 2022-08-18
EP3429567A4 (en) 2019-12-11
JP2022065081A (ja) 2022-04-26
EP3429567A1 (en) 2019-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Deliu et al. Haploinsufficiency of the intellectual disability gene SETD5 disturbs developmental gene expression and cognition
Reed et al. Phosphodiesterase 1B knock-out mice exhibit exaggerated locomotor hyperactivity and DARPP-32 phosphorylation in response to dopamine agonists and display impaired spatial learning
Chartier et al. Mitochondrial dysfunction reveals the role of mRNA poly (A) tail regulation in oculopharyngeal muscular dystrophy pathogenesis
US20220257576A1 (en) Methods and compositions for treating obesity and/or diabetes and for identifying candidate treatment agents
CN101407815B (zh) 甘氨酸n-甲基转移酶在制备预防或治疗黄曲霉素所引发的疾病的药物中的应用
Peng et al. Trio is a key guanine nucleotide exchange factor coordinating regulation of the migration and morphogenesis of granule cells in the developing cerebellum
Rawnsley et al. The transcription factor Atonal homolog 8 regulates Gata4 and Friend of Gata-2 during vertebrate development
Docquier et al. eIF3f depletion impedes mouse embryonic development, reduces adult skeletal muscle mass and amplifies muscle loss during disuse
Ricketts et al. A nonsense mutation in mouse Tardbp affects TDP43 alternative splicing activity and causes limb-clasping and body tone defects
McCaul et al. Deletion of mFICD AMPylase alters cytokine secretion and affects visual short-term learning in vivo
Zhang et al. Nmf9 encodes a highly conserved protein important to neurological function in mice and flies
US8058502B2 (en) Increasing lifespan by modulation of WWP-1 and UBC-18
Apolinario et al. Behavioral and neurological effects of Vrk1 deficiency in zebrafish
Lan et al. Molecular mechanisms of dietary restriction in aging—insights from Caenorhabditis elegans research
Iwasa et al. Characterization of RSF-1, the Caenorhabditis elegans homolog of the Ras-association domain family protein 1
Martinez Miguel The role of decreasing protein synthesis in delaying ageing–emphasis on translation accuracy
Dutta The role of RNA splicing factors in the regulation of longevity
CN105744948B (zh) 进食节律提前综合征的识别方法及其应用
WO2016125266A1 (ja) 延寿命活性を有する物質をスクリーニングする方法
Malinow Novel signaling mechanisms downstream of NIPI-3/Tribbles regulate development in Caenorhabditis elegans
Popkes-van Oepen Novel insights into the regulation of nucleolar function and longevity by ncl-1
Tran Transcription Factor Ztf-17 Regulates Oxidative Stress Responses in Caenorhabditis Elegans
Musawi New insights into physiopathogenetics of spinal muscular atrophy
Schreiber Targeting the Frataxin Transcriptional Defect as a Therapeutic Approach for Friedreich's Ataxia
Gavriilidis Exploring the possibility of improving longevity through late-life intervention

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination