JP2022504075A - 操作された遺伝子モジュレーター - Google Patents

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Abstract

Figure 2022504075000001
遺伝子発現の特異的かつ能動的なモジュレーションにおける使用のための２つ以上の人工転写因子を含む遺伝子モジュレーターが提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／７４０，１５６号の利益を請求し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、２つ以上の人工転写因子を含む遺伝子モジュレーターを使用して遺伝子発現をモジュレートするための組成物および方法の分野におけるものである。
疾患関連遺伝子の抑制または活性化は、操作された転写因子の使用によって達成されてきた。操作された亜鉛フィンガー転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）を設計および使用する方法は、十分に報告されており（例えば、米国特許第６，５３４，２６１号を参照されたい）、転写活性化因子様エフェクター転写因子（ＴＡＬＥ－ＴＦ）と、クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピートＣａｓに基づく転写因子（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ－ＴＦ）の両方も記載されている（Kabadi and Gersbach (2014) Methods 69(2): 188-197の概説を参照されたい）。例えば、遺伝子発現を抑制する操作されたＴＦ（リプレッサー）も、ハンチントン病（ＨＤ）などのトリヌクレオチド障害（例えば、米国特許第８，９５６，８２８号および米国特許出願公開第２０１５／０３３５７０８号を参照されたい）およびアルツハイマー病（ＡＤ）などのタウオパチー（米国特許出願公開第２０１８０１５３９２１号を参照されたい）を処置するのに有効であることが示されている。
しかしながら、遺伝子発現のモジュレーションのための活性および／または特異性の増強を提供するさらなる方法および組成物が依然として必要である。
２つ以上の人工転写因子を含む遺伝子モジュレーターならびに疾患の処置および／または防止のためにこれらの遺伝子モジュレーターを作製および使用するための方法が、本明細書に開示される。特に、遺伝子モジュレーター組成物は、それぞれの人工転写因子がＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインとを含む、複数（２つ以上）の人工転写因子を含む。驚くべきことに、また、予想外に、複数の人工転写因子を構成する遺伝子モジュレーターは、単一の人工転写因子（同じ用量、もしくは２回用量などの）を含む組成物と比較して、および／または任意の複数の人工ＴＦを使用する予想される相加効果と比較して、１つまたは複数の以下のもの：特異性および／または活性において予想外の相乗効果を提供する。複数の人工転写因子を含む遺伝子モジュレーターは、治療効果、例えば、ハンチントン病（ＨＤ）の処置のための突然変異ハンチンチン（Ｈｔｔ）遺伝子発現の抑制、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置のための突然変異Ｃ９ｏｒｆ７２アレルの抑制、プリオン病の処置のためのプリオンタンパク質発現の抑制、パーキンソン病（ＰＤ）および／もしくはレヴィー小体型認知症（ＤＬＢ）などのシヌクレイノパチーの処置のためのα－シヌクレインの抑制ならびに／またはＡＤ、ＦＴＤ、ＰＳＰ、ＣＢＤおよび／もしくは発作などのタウオパチーの処置のためのＭＡＰＴ遺伝子発現の抑制が達成されるように、遺伝子発現をモジュレートし、オフターゲット事象を制限する。かくして、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で遺伝子発現をモジュレートするための方法および組成物が、本明細書に提供される。
一態様では、それぞれ個々の人工転写因子が別々に投与される場合の遺伝子発現レベルと比較して、より高レベル（約１～１０倍以上）で遺伝子発現をモジュレートする（活性化する、または抑制する）２つ以上（複数）の人工転写因子を含む遺伝子モジュレーターが、本明細書に記載される。かくして、遺伝子モジュレーターは、個々の転写因子と比較して、および転写因子の組合せを使用する遺伝子モジュレーションの予想（例えば、相加）レベルと比較して、相乗効果を示す。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、２、３、４、５個以上の人工転写因子を含み、それぞれの人工転写因子が、（ｉ）１２ヌクレオチド以上（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド以上）の標的部位に結合する任意のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＴＡＬ－エフェクタードメイン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｓｇＲＮＡなど）ならびに（ｉｉ）遺伝子モジュレーターが遺伝子発現をモジュレートするような、機能ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、ＤＮＭＴタンパク質、ヒストンデアセチラーゼなどに由来するドメイン）を含む。
本明細書に記載の人工転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、任意の選択された標的遺伝子中の、少なくとも１２ヌクレオチド（連続的または非連続的）の任意の標的部位に結合することができる。さらに、人工転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、同じ、異なる、または重複する標的部位に結合してもよい。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、異なる、重複しない標的に結合する。あるいは、一部の実施形態では、少なくとも２つのＤＮＡ結合ドメインは、重複する標的部位に結合する。他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、互いに約８００塩基対以内にある標的部位に結合する。他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、互いに約１０，０００（以上）塩基対以内にある標的部位に結合する。さらなる実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、モジュレートしようとする標的遺伝子の０～約３００塩基対（もしくはその間の任意の値）、０～約２００（もしくはその間の任意の値）、または０～約１００塩基対（もしくはその間の任意の値）を含む、転写開始部位（ＴＳＳ）のいずれかの側の近く（例えば、０～約６００塩基対（もしくはその間の任意の値）以内）に結合する。人工転写因子のＤＮＡ結合ドメインの一部もしくは全部が、二本鎖標的（例えば、内因性遺伝子）中のセンス鎖に結合する；一部もしくは全部が、アンチセンス鎖に結合してもよい；または１つもしくは複数がセンス鎖に結合してもよく、１つもしくは複数がアンチセンス鎖に結合してもよい。
本明細書に記載の組成物は、任意の遺伝子をモジュレーション（例えば、抑制）のための標的としてもよい。ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子またはＨｔｔ遺伝子である。一部の実施形態では、標的は、突然変異Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子である。他の非限定的な実施形態では、標的遺伝子は、ＳＮＣＡ遺伝子、ＳＭＡ遺伝子、ＡＴＸＮ１遺伝子、ＡＴＸＮ２遺伝子、ＡＴＸＮ３遺伝子、ＡＴＸＮ７遺伝子、ＰＲＮＰ遺伝子、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳコード遺伝子、ＤＵＸ４遺伝子、ＰＧＲＮ遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＦＭＲ１遺伝子、ＣＤＫＬ５遺伝子、ＬＲＫＫ２遺伝子、ＡＰＯＥ遺伝子、ＲＨＯ遺伝子、または遺伝子発現のモジュレーションが望まれる任意の遺伝子である。ＤＮＡ結合ドメインの任意の組合せを、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターにおいて使用することができる（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥおよび／またはｓｇＲＮＡ、ＴＳＳに近い、重複および／または非重複標的部位、結合したセンスまたはアンチセンス鎖などの任意の組合せ）。
ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターの人工転写因子の１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＰを含み、ＺＦＰ－ＴＦを形成する。本明細書に記載の亜鉛フィンガータンパク質はいずれも、それぞれの亜鉛フィンガーが、選択された標的配列（例えば、遺伝子）中の標的サブ部位に結合する認識ヘリックスを有する、１、２、３、４、５、６個以上の亜鉛フィンガーを含んでもよい。標的サブ部位は、連続的または非連続的であってもよい。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、複数のＺＦＰ－ＴＦ、例えば、複数のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーを含む。ＺＦＰは、選択された遺伝子中の任意の標的部位に結合してもよい。
他の実施形態では、遺伝子モジュレーターの人工転写因子の１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬ－エフェクタードメインタンパク質（ＴＡＬＥ）を含み、反復可変二残基（ＲＶＤ）領域が１２ヌクレオチド以上の選択された標的部位に結合するＴＡＬＥ－ＴＦを形成する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＶＤは、非特異的なＤＮＡ結合特性を有する。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターの人工転写因子の１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的配列に結合する単一ガイドＲＮＡを含む（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦ系を形成する）。ＤＮＡ結合ドメインは、全部同じ型のものであってもよく、または異なるＤＮＡ結合ドメインを含む人工転写因子を含んでもよい。かくして、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターの２つ以上の人工転写因子は、同じ型のものであってもよく（例えば、全部ＺＦＰ－ＴＦ、全部ＴＡＬ－ＴＦ、全部ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦ）、または異なる型の人工転写因子（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦなど）の組合せを含んでもよい。
本明細書に記載の人工転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦなど）は、ＤＮＡ結合ドメインとの作動可能な連結に置かれた１つまたは複数の機能ドメインを含んでもよい。機能ドメインは、例えば、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインを含んでもよい。ＤＮＡ結合ドメインと共に使用するために活性化ドメインまたは抑制ドメインのいずれかを選択することにより、そのような分子を使用して、標的遺伝子の発現を活性化または抑制することができる。本明細書に記載の遺伝子モジュレーターの人工ＴＦのいずれかにおいて、機能ドメイン（例えば、転写活性化ドメインまたは抑制ドメイン）は、野生型（例えば、Ｐ６５、ＫＲＡＢ、ＫＯＸ）であってもよい。ある特定の実施形態では、機能ドメインは、ｃｉｓに連結されたＺＦＰ間での組換えを防止するために、コドン多様化された抑制ドメインを含む（例えば、ｎＫＯＸ、ｍＫＯＸ、ｃＫＯＸ）。遺伝子モジュレーターの人工ＴＦは、同じか、または異なる機能ドメイン（例えば、野生型および／または改変型（例えば、コドン多様化された）抑制ドメインの異なる組合せ）を含んでもよい。ある特定の実施形態では、機能または調節ドメインは、ヒストン翻訳後修飾において役割を果たし得る。一部の例では、機能ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチラーゼ、またはヒストンをＳＵＭＯ化もしくはビオチン化する酵素または翻訳後ヒストン修飾により調節される遺伝子抑制を可能にする他の酵素ドメインである（Kousarides (2007) Cell 128:693-705）。他の実施形態では、人工転写因子は、ＤＮＭＴドメイン（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ）を含む。
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物は、真核生物を処置するのに有用である。ある特定の実施形態では、機能（調節）ドメインの活性は、細胞の転写機構との相互作用が外因性リガンドの非存在下では起こらないように、外因性低分子またはリガンドによって調節される。そのような外部リガンドは、ＺＦＰ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦまたはＴＡＬＥ－ＴＦと、転写機構との相互作用の程度を制御する。調節ドメインを、１つまたは複数のＺＦＰ、ｓｇＲＮＡ／ｄＣａｓまたはＴＡＬＥの間、１つまたは複数のＺＦＰ、ｓｇＲＮＡ／ｄＣａｓまたはＴＡＬＥに対して外部およびその任意の組合せを含む、１つまたは複数のＺＦＰ、ｓｇＲＮＡ／ｄＣａｓまたはＴＡＬＥの任意の部分に作動可能に連結することができる。好ましい実施形態では、調節ドメインは、標的遺伝子の遺伝子発現の抑制をもたらす。
ある特定の実施形態では、２つ以上の人工転写因子を含む遺伝子モジュレーターは、リプレッサーであり、野生型発現レベルと比較して、標的遺伝子の発現を、少なくとも５０％～１００％（またはその間の任意の値）抑制する。一部の実施形態では、遺伝子リプレッサーは、野生型発現レベルと比較して、標的遺伝子の発現を、少なくとも７５％抑制する。さらなる実施形態では、遺伝子モジュレーターは、リプレッサーであり、遺伝子が単一の遺伝子モジュレーター（人工転写因子）によってモジュレートされる場合の発現レベルと比較して、発現を、少なくとも１０％～１００％抑制する。他の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、活性化因子であり、野生型発現レベルおよび／または遺伝子が単一の遺伝子モジュレーターによってモジュレートされる場合の発現レベルと比較して、遺伝子発現を、約１～５倍以上（最大で１００倍以上を含む）活性化する（Perez-Pinera et al (2013) Nat Method 10(3):239-42を参照されたい）。本明細書に記載の遺伝子モジュレーターはいずれも、オフターゲット遺伝子モジュレーションをさらに低下させることができる（例えば、約５０％または約７５％または約９０％または約１００％を超えるオフターゲットモジュレーション）。
本明細書に記載の遺伝子モジュレーターを、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質の形態を含む、任意の形態で対象に提供することができ、同様に、そのようなポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を含む医薬組成物として提供することができる。
一部の態様では、遺伝子モジュレーター（またはその成分、例えば、人工転写因子の１つもしくは複数のＤＮＡ結合ドメイン）は、１つまたは複数のポリヌクレオチドを使用してポリヌクレオチド形態で提供される。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターの全ての人工転写因子を送達するために、単一のポリヌクレオチドが使用されるが、他の実施形態では、任意の組合せまたは順序で複数の人工転写因子を送達するために、２つ以上のポリヌクレオチド（同じか、または異なる型の）が使用される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子モジュレーター（リプレッサー）をコードする）のいずれかを含む遺伝子デリバリーベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、組込み能力がある、もしくは組込み欠損レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）、またはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、限定されるものではないが、当業界で公知のＡＡＶベクター変異体（例えば、米国特許第９，５８５，９７１号および第７，１９８，９５１号；米国特許出願公開第２０１７０１１９９０６号）などの、限定されるものではないが、１つまたは複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、これらのベクターの偽型（例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／９としてなど）を含む、少なくとも１つのＡＡＶベクター（またはその偽型もしくは変異体）上で運ばれる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血液脳関門を横断することができるＡＡＶ変異体である（例えば、米国特許第９，５８５，９７１号）。一部の実施形態では、人工転写因子は、１つまたは複数の多シストロン性ポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクターまたはｍＲＮＡ）、すなわち、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターの少なくとも２つ以上の人工転写因子をコードするポリヌクレオチドによって運ばれる。一部の実施形態では、単一の多シストロン性ポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクターまたはｍＲＮＡ）は、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターの全ての人工転写因子をコードする。多シストロン性ポリヌクレオチド中の、コード配列を、自己切断性ペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターの２つ以上の人工転写因子は、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターをコードするウイルスおよび非ウイルス遺伝子デリバリー媒体（例えば、ｍＲＮＡ、プラスミド、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、Ａｄベクターとして）を含む、１つまたは複数のベクターによってコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターの２つ以上の人工転写因子は、別々のベクターによってコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターの２つ以上の人工転写因子の成分（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、他の成分（例えば、Ｃａｓ）とは別々にコードされる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の態様では、ｍＲＮＡを化学的に修飾してもよい（例えば、Kormann et al., (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157を参照されたい）。他の態様では、ｍＲＮＡは、キャップ（例えば、ＡＲＣＡキャップ（米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照されたい））を含んでもよい。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、非修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとの混合物を含んでもよい（米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号を参照されたい）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、多シストロン性であってもよく、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断性ペプチドなどの配列によって連結された２つ以上の転写因子を含んでもよい。
本発明はまた、それを必要とする対象に、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターを含む、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体、および／または医薬組成物を提供することなどによって、前記対象において遺伝子発現をモジュレートする（例えば、抑制する）ための方法および使用を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、遺伝子（例えば、タウオパチーにおけるタウ、ＡＬＳの処置のための突然変異Ｃ９ｏｒｆ７２、ＨＤにおける突然変異Ｈｔｔ；プリオン障害の処置のためのプリオン遺伝子；ＰＤの処置のためのα－シヌクレインおよび／または上記の他の遺伝子）の異常な発現と関連する疾患の処置および／または防止のためを含む、対象における遺伝子発現を抑制するために使用される。かくして、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ＡＤの処置および／または防止のためを含む、対象におけるタウ発現を抑制するために使用されるが、他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ＨＤの処置および／または防止のためを含む、対象におけるＨｔｔ発現を抑制するために使用される（例えば、対象における突然変異Ｈｔｔの量を減少させることによる）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ＡＬＳの処置および／または防止のためを含む、対象における突然変異Ｃ９Ｏｒｆ７２（例えば、拡大された）発現を抑制するために使用される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、プリオン病の処置および／または防止のためを含む、対象におけるプリオン発現を抑制するために使用される。さらなる実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ＰＤの処置および／または防止のためを含む、対象におけるα－シヌクレイン発現を抑制するために使用される。
本明細書に記載の組成物は、長期間（例えば、約４週間、約３カ月、約６カ月～約１年以上）にわたって遺伝子発現レベルを低下させ、対象の任意の部分において使用することができる。ある特定の実施形態では、組成物は、脳（限定されるものではないが、例えば、前頭前野皮質を含む前頭葉皮質、頭頂葉皮質、後頭葉皮質；例えば、内嗅皮質、海馬、脳幹、線条体、視床、中脳、小脳を含む側頭葉皮質を含む）および脊髄（限定されるものではないが、腰部、胸部および頸部領域を含む）において使用される。
本明細書に記載の組成物を、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、脳室内、髄腔内、頭蓋内、静脈内、眼窩（眼窩後方（ＲＯ））および／または嚢内投与などの任意の投与手段によって対象に提供することができる。デリバリーは、静脈内、筋肉内、経口、経粘膜などの対象の任意の部分に対するものであってよい。ある特定の実施形態では、デリバリーは、カニューレまたは他の任意のデリバリー技術の使用によるなど任意の好適な手段による、任意の脳領域、例えば、海馬または内嗅皮質に対するものである。任意のＡＡＶベクターが、ベクターを直接投与されない脳領域への順行性および逆行性軸索輸送によるなど、対象の脳へのリプレッサーの幅広いデリバリーを提供する（例えば、果核へのデリバリーは、皮質、黒質、視床などの他の構造へのデリバリーをもたらす）。ある特定の実施形態では、対象はヒトであり、他の実施形態では、対象は非ヒト霊長類または齧歯類である。投与は、単回用量、同時に与えられる複数回投与、または複数回投与（投与間の任意のタイミングでの）にあってもよい。
さらに、本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、遺伝子モジュレーターを、所望の効果を提供する任意の濃度（用量）で送達することができる。好ましい実施形態では、遺伝子モジュレーターは、約１０，０００～約５００，０００ベクターゲノム／細胞（またはその間の任意の値）でアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して送達される。一部の実施形態では、遺伝子モジュレーター－ＡＡＶは、約１０，０００～約１００，０００、または約１００，０００～約２５０，０００、または約２５０，０００～約５００，０００ベクターゲノム（ＶＧ）／細胞（またはその間の任意の値）の用量で送達される。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、約２５０～約１，０００（またはその間の任意の値）の感染多重度（ＭＯＩ）でレンチウイルスベクターを使用して送達される。他の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、約０．０１～約１，０００ｎｇ／約１００，０００細胞（またはその間の任意の値）のプラスミドベクターを使用して送達される。一部の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、約０．０１～約１、約１～約１００、約１００～約５００、または約５００～約１０００ｎｇ／約１００，０００細胞（またはその間の任意の値）のプラスミドベクターを使用して送達される。他の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、約０．０１～約３０００ｎｇ／約１００，０００細胞（またはその間の任意の値）のｍＲＮＡとして送達される。他の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、約１～３００μＬの固定容量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、約１Ｅ１１～１Ｅ１４ ＶＧ／ｍＬで脳実質に送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、約０．１～２５ｍＬの固定容量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、約１Ｅ１１～１Ｅ１４ ＶＧ／ｍＬでＣＳＦに送達される。
別の態様では、２つ以上の（相乗的）人工転写因子（ＴＦ）を含む組成物を作製する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、方法は、選択された遺伝子に標的化される複数の人工転写因子（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ）を、個別に、および組み合わせて、遺伝子発現に対するその効果についてスクリーニングすること；ならびに人工ＺＦＰ－ＴＦの相乗的組合せを同定することを含む。スクリーニングは、公知の技術を使用して行われる。実施例も参照されたい。ある特定の実施形態では、方法は、（ｉ）約１～６００（もしくはその間の任意の値）塩基対離れている標的部位に結合する２つ以上の人工転写因子を選択する工程および／または（ｉｉ）標的遺伝子に結合した場合、ＴＦの機能ドメインが互いに約１～６００（もしくはその間の任意の値）塩基対離れている２つ以上の人工転写因子を選択する工程を含む。ある特定の実施形態では、方法は、周期的な様式で、標的配列中の標的部位、例えば、限定されるものではないが、約８０塩基対隔てられた標的部位（例えば、約０～８０塩基対；約１６０～２４０塩基対；約３２０～４００塩基対もしくは約４８０～５６０塩基対隔てられた標的部位）および／または約１００塩基対隔てられた標的部位（例えば、約０～約１００塩基対；約２００～約３００塩基対；もしくは約４００～約５００塩基対隔てられた標的部位）を含む、標的部位において約８０～１００ヌクレオチド（またはその間の任意の値）にわたる間隔で隔てられた標的部位に結合する相乗的人工ＴＦをスクリーニングすることを含む。ある特定の実施形態では、標的部位は、０～約８０（もしくはその間の任意の値）；０～約１００（もしくはその間の任意の値）；約１６０～２４０（もしくはその間の任意の値）；約２００～約３００（もしくはその間の任意の値）；約２２０～約３００（もしくはその間の任意の値）；約３００～約０～約８０（もしくはその間の任意の値）、約１６０～約２２０（もしくはその間の任意の値）、約２６０～約４００（もしくはその間の任意の値）、または約５００～約６００（もしくはその間の任意の値）塩基対間隔で隔てられている。
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法はいずれも、限定されるものではないが、機能ドメインが、約８０塩基対隔てられている（例えば、約０～約８０塩基対；約１６０～約２４０塩基対；約３２０～約４００塩基対もしくは約４８０～約５６０塩基対隔てられた機能ドメインおよび／または約０～約１００塩基対；約２００～約３００塩基対；もしくは約４００～約５００塩基対隔てられた標的部位中で約１００塩基対隔てられた機能ドメイン）相乗的ＴＦを含む、機能ドメインが、周期的な様式で互いに隔てられている、例えば、機能ドメインが、標的遺伝子中で約８０～１００ヌクレオチド（またはその間の任意の値）にわたる間隔で隔てられている相乗的人工ＴＦをスクリーニングすることを含む。ある特定の実施形態では、機能ドメインは、互いに約０～８０（もしくはその間の任意の値）、約１６０～２２０（もしくはその間の任意の値）、約２６０～４００（もしくはその間の任意の値）、または約５００～６００（もしくはその間の任意の値）塩基対離れている。さらなる実施形態では、方法は、転写開始部位（ＴＳＳ）のいずれかの側の約８００塩基対（またはその間の任意の値）以内、好ましくはＴＳＳのいずれかの側の約６００塩基対以内、さらにより好ましくは、ＴＳＳの約３００塩基対以内にある標的部位に結合する相乗的人工ＴＦをスクリーニングすることを含む。ある特定の実施形態では、ＴＦは、ＴＳＳと、ＴＳＳの＋２００（またはその間の任意の値）との間にある標的部位に結合する。方法は、同じアンチセンス（－）もしくはセンス（＋）鎖または異なる鎖（＋／－、いずれかの配向）に結合する相乗的ＴＦをスクリーニングすることを含む。本発明の方法は、個々のＴＦ（および／または予想される相加効果）と比較して、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍を超える、またはそれ以上の相乗効果（活性および／または特異性の増加）を示す人工ＴＦを同定する。
かくして、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、１つまたは複数の遺伝子の望ましくない発現と関連する障害を処置および／または防止するための方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質（またはポリヌクレオチドおよび／もしくはタンパク質を含む医薬組成物）を、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）および／またはその組合せを使用して送達することができる組成物を含む。本明細書に記載の組成物（タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞ならびに／またはこれらのタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／もしくは細胞を含む医薬組成物）の投与は、限定されるものではないが、障害（例えば、ＨＤ、ＡＤ、ＡＬＳ、他のタウオパチーまたは発作）と関連する任意の臨床症状の改善もしくは除去ならびにＣＮＳ細胞（例えば、ニューロン、アストロサイト、ミエリンなど）の機能および／または数の増大を含む、治療（臨床）効果をもたらす。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、遺伝子発現を（本明細書に記載の遺伝子モジュレーターを受けていない対照と比較して）少なくとも約３０％、または約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または９０％を超えて減少させる。一部の実施形態では、少なくとも約５０％の減少が達成される。本明細書に記載の方法におけるいずれかの組成物の使用において、方法は、対象の１つまたは複数の細胞（例えば、ＨＤ、ＡＬＳまたはＡＤニューロン）中の標的アレル（例えば、Ｈｔｔ、プリオン、ＳＮＣＡ、タウまたはＣ９ＯＲＦ７２）の、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、または約９５％以上の抑制をもたらすことができる。
かくして、他の態様では、対象における望ましくない遺伝子発現（例えば、ＨＤ、ＡＤ、ＡＬＳ）と関連する疾患を防止および／または処置する方法であって、１つまたは複数のＡＡＶベクターを使用して、アレルのモジュレーターを対象に投与することを含む方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子モジュレーターをコードし、限定されるものではないが、脳室内、髄腔内、または嚢内デリバリーを含む任意のデリバリー方法によってＣＮＳ（脳および／またはＣＳＦ）に投与される。他の実施形態では、遺伝子モジュレーターをコードするＡＡＶは、対象の実質（例えば、海馬および／または内嗅皮質）中に直接投与される。他の実施形態では、遺伝子モジュレーターをコードするＡＡＶは、静脈内（ＩＶ）投与される。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、投与は、同時での複数の投与によって、１回行ってもよく（単回投与）、または投与１回あたり同じか、もしくは異なる用量で複数回（投与間の任意の時間で）行ってもよい。複数回投与する場合、同じか、または異なる、投与様式の投与量および／またはデリバリー媒体を使用してもよい（例えば、ＩＶおよび／またはＩＣＶで投与される異なるＡＡＶベクター）。一部の実施形態では、方法は、全て、方法を施されていない対象と比較して、または方法を施される前の対象自身と比較して、対象における、例えば、ＡＤを有する対象のＡＤニューロン、もしくはＨＤを有する対象のＨＤニューロン、もしくはＡＬＳを有する対象のＡＬＳニューロンにおける、突然変異タンパク質の凝集を低減させる（例えば、タウ凝集に特徴的な神経原線維変化（ＮＦＴ）を低減させる；突然変異Ｈｔｔ凝集を低減させる；Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子ＡＬＳにおける拡大されたＧＧＧＧＣＣの不完全なＲＮＡ転写物に由来するタンパク質の凝集体を低減させる）方法；ニューロンもしくはニューロンの集団（例えば、ＨＤもしくはＡＤニューロンまたはＨＤもしくはＡＤニューロンの集団）におけるアポトーシスを低減させる方法；ＡＬＳニューロンにおける拡大されたＧＧＧＧＣＣ遺伝子座の不完全なＲＮＡ転写物を含む核内フォーカスを低減させる方法；ニューロンの過剰興奮性を低減させる方法；アミロイドベータ誘導毒性（例えば、シナプス喪失および／もしくは神経突起変性）を低減させる方法；および／またはＨＤもしくはＡＤ対象における１つもしくは複数の認知機能の喪失を低減させる方法を含む。かくして、本明細書に記載の方法は、以下の１つまたは複数：神経毒性、グリオーシス、変性神経突起、脊椎喪失、興奮毒性、皮質および海馬の縮小、樹状タウ蓄積、認知（例えば、齧歯類モデルにおける放射状アーム迷路およびモリスの水迷路、恐怖条件付けなど）および／または運動障害を含む、ＨＤまたはタウオパチーのバイオマーカーおよび／または症状の低減をもたらす。
一部の態様では、細胞中の病原性種（例えば、タウ、Ｈｔｔ、Ｃ９ＯＲＦ７２、プリオン、ＳＮＣＡによりコードされるタンパク質）の量を減少させるための本発明の方法および組成物が提供される。一部の実施形態では、方法は、高リン酸化タウの低減をもたらす。一部の例では、高リン酸化タウの低減は、可溶性タウまたは粒状タウの低減をもたらす。他の実施形態では、病原性タウ種の低減は、本発明の方法に従って、および／または本発明の組成物を用いて処置されていない細胞または対象と比較して、タウ凝集を減少させ、神経原線維変化（ＮＦＴ）の低減を引き起こす。さらなる実施形態では、細胞中で観察されるＮＦＴの量を逆転させる方法が提供される。さらなる実施形態では、本発明の方法および組成物は、対象の脳内での病原性タウ種（ＮＦＴ、高リン酸化タウ）の増殖の遅延を引き起こす。一部の実施形態では、脳をわたる病原性タウの増殖は停止し、他の実施形態では、脳をわたる病原性タウの増殖は逆転する。さらなる実施形態では、脳におけるアミロイドβ斑と関連する変性神経突起の数が減少する。一部の実施形態では、変性神経突起の数は、年齢を一致させた野生型の脳に見出されるレベルまで減少する。さらなる実施形態では、対象の脳内のアミロイドβ斑と関連する高リン酸化タウを低減させるための方法および組成物が、本明細書で提供される。さらなる実施形態では、本明細書に記載の組成物（Ｈｔｔリプレッサー）および方法は、例えば、対象における細胞死を低減させる、アポトーシスを減少させる、細胞機能（代謝）を増加させる、および／または運動障害を低減させることによって、ＨＤ対象における治療利益を提供する。一部の実施形態では、突然変異Ｃ９ＯＲＦ７２拡大と関連する結果を低減させるための方法および組成物が本明細書で提供される。この拡大（野生型ヒトゲノム中の約３０コピーから、ｆＡＬＳ患者における数百またはさらには数千コピーまで）と関連する病理は、ＤＮＡ中の異常な構造の形成および一部の型のＲＮＡ媒介性毒性と関連すると考えられる（Taylor (2014) Nature 507:175）。拡大されたＧＧＧＧＣＣの不完全なＲＮＡ転写物は、ｆＡＬＳ患者の細胞中で核内フォーカスを形成し、また、そのＲＮＡも、反復関連非ＡＴＰ依存性翻訳を受けてもよく、凝集しやすい３つのタンパク質の産生をもたらす（Gendron et al (2013) Acta Neuropathol 126:829）。一部の実施形態では、α－シヌクレインの凝集と関連する結果を低減させるための方法および組成物が本明細書で提供される。この凝集と関連する病理は、ＰＤおよびレヴィー小体型認知症（ＤＬＢ）などのシヌクレイノパチーにおけるアルファ－シヌクレインのミスフォールディングおよび凝集と関連すると考えられる。他の実施形態は、突然変異プリオン株の形成と関連する結果を低減させるための方法および組成物である。
一部の実施形態では、対象への投与後、本明細書に記載の遺伝子モジュレーター（例えば、遺伝子リプレッサー）の２つ以上の人工転写因子（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦ）をコードする配列は、ゲノム中に挿入される（組み込まれる）が、他の実施形態では、遺伝子モジュレーターの２つ以上の人工転写因子をコードする配列は、エピソームに保持される。あるいは、１つまたは複数の人工転写因子をコードする配列は、ゲノム中に組み込まれてもよく、残りの１つまたは複数の人工転写因子をコードする配列は、エピソームに保持されてもよい。一部の例では、ＴＦ融合物をコードする核酸は、内因性プロモーターが発現を駆動するように、プロモーターを含むセーフハーバー部位に挿入される（例えば、ヌクレアーゼ媒介性組込みにより）。他の実施形態では、リプレッサー（ＴＦ）ドナー配列は、セーフハーバー部位に挿入され（ヌクレアーゼ媒介性組込みにより）、ドナー配列は、リプレッサーの発現を駆動するプロモーターを含む。一部の実施形態では、遺伝子モジュレーターをコードする配列は、デリバリー後、染色体外（エピソーム）に保持され、異種プロモーターを含んでもよい。プロモーターは、構成的または誘導性プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーター配列は広く発現されるが、他の実施形態では、プロモーターは組織または細胞／型特異的である。好ましい実施形態では、プロモーター配列は、神経細胞に特異的である。他の好ましい実施形態では、選択されるプロモーターは、それが低発現を有することを特徴とする。好ましいプロモーターの非限定例としては、神経特異的プロモーターＮＳＥ、ＣＭＶ、シナプシン、ＣＡＭＫｉｉａおよびＭＥＣＰが挙げられる。遍在性プロモーターの非限定例としては、ＣＡＳおよびＵｂｃが挙げられる。さらなる実施形態は、米国特許出願公開第２０１５０２６７２０５号に記載された自己調節性プロモーターの使用を含む。
本明細書に記載の１つまたは複数の組成物（例えば、遺伝子モジュレーター、ポリヌクレオチド、医薬組成物および／または細胞）ならびにこれらの組成物の使用のための使用説明書を含むキットも提供される。キットは、１つまたは複数の遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）ならびに／または本明細書に記載のモジュレーターの成分を含む、および／もしくはモジュレーター（もしくはその成分）をコードするポリヌクレオチドを含む。キットは、細胞（例えば、ニューロン）、試薬（例えば、ＣＳＦ中の標的遺伝子によってコードされるタンパク質を検出および／もしくは定量するための）ならびに／または本明細書に記載の方法を含む、使用のための使用説明書をさらに含んでもよい。
かくして、２つ以上の転写因子（ＴＦ）を含む組成物であって、それぞれの人工転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３ＬなどのＤＮＭＴタンパク質に由来するドメイン、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンメチラーゼ、またはヒストンをＳＵＭＯ化もしくはビオチン化する酵素および／または翻訳後ヒストン修飾により調節される遺伝子抑制を可能にする他の酵素ドメイン）を含み、人工転写因子が、細胞中での遺伝子発現を相乗的にモジュレートする（活性化または抑制する）、組成物が、本明細書に記載される。標的遺伝子は、タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子、Ｈｔｔ遺伝子、突然変異Ｈｔｔ遺伝子、突然変異Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子、ＳＭＡ遺伝子、ＡＴＸＮ２遺伝子、ＡＴＸＮ３遺伝子、ＰＲＰ遺伝子、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳコード遺伝子、ＤＵＸ４遺伝子、ＰＧＲＮ遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＦＭＲ１遺伝子、ＣＤＫＬ５遺伝子、および／またはＬＲＫＫ２であってもよい。細胞は、単離するか、または生きている対象中にあってもよい。本明細書に記載の相乗的ＴＦ組成物は、野生型発現レベル（および／または未処置の対照）と比較して、標的遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８倍以上のモジュレーションを示してもよい。ＤＮＡ結合ドメインは、１２ヌクレオチド以上の標的部位に結合してもよく、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＴＡＬ－エフェクタードメイン、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｓｇＲＮＡであってもよい。組成物の２つ以上の人工転写因子は、（ｉ）選択された標的遺伝子中の少なくとも１２ヌクレオチドの任意の標的部位に結合してもよい；（ｉｉ）互いに１０，０００塩基対以上以内の標的部位に結合してもよい；（ｉｉｉ）モジュレートしようとする標的遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）のいずれかの側の０～３００塩基対以内の標的部位に結合してもよい、ならびに／または（ｉｖ）二本鎖標的中のセンスおよび／もしくはアンチセンス鎖に結合してもよい。遺伝子モジュレーション（例えば、抑制）は、野生型発現レベルと比較して少なくとも５０％～１００％であってもよい。機能ドメインの活性を、細胞の転写機構との相互作用が外因性リガンドの非存在下では起こらないように、外因性低分子またはリガンドによって調節することができる。また、１つまたは複数の相乗的ＴＦ組成物を含む医薬組成物も本明細書で提供される。
１つもしくは複数の組成物および／または１つもしくは複数の組成物の相乗的ＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む細胞（例えば、単離された、または生きている対象中の）も提供される。細胞は、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞、肝細胞、神経上皮細胞、適宜、ＨＤもしくはＡＤニューロンもしくはグリア細胞、または肝細胞を含んでもよい。相乗的ＴＦをコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノム中に安定的に組み込まれてもよい、および／またはエピソームに保持されてもよい。組成物は、遺伝子モジュレーターを受けていない対照と比較して、または相乗的組成物の単一のＴＦを受けている細胞もしくは対象と比較して、遺伝子発現を３０％、４０％、５０％以上低減させることができる。
本明細書に記載の１つまたは複数の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患または障害を有する対象（例えば、対象のニューロン）における遺伝子発現をモジュレートする方法も提供される。ＣＮＳ疾患または障害は、ハンチントン病（ＨＤ）（Ｈｔｔの抑制による）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（Ｃ９ｏｒｆ遺伝子の抑制による）、プリオン病（プリオン遺伝子の抑制による）、パーキンソン病（ＰＤ）（α－シヌクレイン発現の抑制による）、レヴィー小体型認知症（ＤＬＢ）（α－シヌクレイン発現の抑制による）および／またはタウオパチー（ＭＡＰＴの抑制による）であってもよく、適宜、ＣＮＳ疾患または障害のバイオマーカー、病原性種および／または症状は、遺伝子モジュレーションによって低減される（例えば、神経毒性、グリオーシス、変性神経突起、脊椎喪失、興奮毒性、皮質および海馬の縮小、樹状タウ蓄積、認知障害、運動障害、アミロイドβ斑と関連する変性神経突起、タウ病原性種、ｍＨｔｔ凝集体、高リン酸化タウ、可溶型タウ、粒状タウ、タウ凝集、および／または神経原線維変化（ＮＦＴ）が低減される）。相乗的人工転写因子を含む組成物を、１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、非ウイルスまたはウイルスベクター）を使用して提供することができる（細胞または対象に）。非ウイルスベクターとしては、プラスミドおよび／または単もしくは多シストロン性ｍＲＮＡベクターが挙げられる。１つまたは複数の組成物のデリバリーのために使用することができるウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス（ＬＶ）および／またはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）のうちの１つまたは複数を含む。これらの方法のいずれかにおいては、遺伝子発現を、４週間、３カ月、６カ月～１年以上の期間にわたって対象の脳において低減させることができる。さらに、限定されるものではないが、対象の前頭葉皮質、頭頂葉皮質、後頭葉皮質；側頭葉皮質、海馬、脳幹、線条体、視床、中脳、小脳および／または脊髄などへの、静脈内、筋肉内、脳室内、髄腔内、頭蓋内、経粘膜、経口、静脈内、眼窩および／または嚢内投与を使用することができる。組成物を、（ｉ）１０，０００～５００，０００ベクターゲノム／細胞のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；（ｉｉ）２５０～１，０００のＭＯＩのレンチウイルスベクター；（ｉｉｉ）０．０１～１，０００ｎｇ／１００，０００細胞のプラスミドベクター；および／または（ｉｖ）０．０１～３０００ｎｇ／１００，０００細胞のｍＲＮＡ（単もしくは多シストロン性ｍＲＮＡ）を使用して送達することができる。方法は、１０，０００～１００，０００、または１００，０００～２５０，０００、または２５０，０００～５００，０００ベクターゲノム（ＶＧ）／細胞の用量；１Ｅ１１～１Ｅ１４ ＶＧ／ｍＬで脳実質に１～３００μＬの固定容量および／または１Ｅ１１～１Ｅ１４ ＶＧ／ｍＬでＣＳＦに０．５～１０ｍＬの固定容量でＡＡＶベクター（相乗的ＴＦ組成物を運ぶ）を送達することを含んでもよい。
本明細書に記載の相乗的人工転写因子を含む組成物を作製する方法であって、選択された遺伝子に標的化される２つ以上の人工転写因子の個体および組合せを、遺伝子発現に対するその効果についてスクリーニングすること；ならびに人工ＺＦＰ－ＴＦの相乗的組合せを同定することを含む方法も提供される。スクリーニングされる２つ以上の人工転写因子は、（ｉ）１～６００塩基対離れている、標的部位に結合してもよい、および／もしくは機能ドメインを含んでもよい；（ｉｉ）約１～８０；１６０～２２０；２６０～４００；もしくは５００～６００塩基対離れている標的部位に結合してもよい；（ｉｉｉ）互いに約１～８０；２６０～４００；もしくは５００～６００塩基対隔てられている機能ドメインを含んでもよい；（ｉｖ）転写開始部位（ＴＳＳ）のいずれかの側の４００塩基対以内にある標的部位に結合してもよい；ならびに／または（ｖ）同じアンチセンス（－）もしくはセンス（＋）鎖に、またはいずれかの配向の異なる鎖に結合してもよい。これらの方法によって得られる相乗的人工ＴＦは、個々のＴＦよりも少なくとも２倍活性が高くてもよい。
図１は、人工転写因子（例えば、ＺＦＰリプレッサー）をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中での示されたＺＦＰ－ＴＦによるタウ（ＭＡＰＴ）遺伝子の抑制の例示的結果を描写する。上２つのパネル（「ＺＦＰ１」および「ＺＦＰ２」）は、単独で使用した場合の示されたＺＦＰ－ＴＦ（米国特許出願公開第２０１８０１５３９２１号も参照されたい）の結果を示す。３番目のパネル（「ＺＦＰ１＋２」）は、２つの示されたＺＦＰを、個々のトランスフェクションの等用量で一緒に使用した場合の結果を示す。対照は３番目のパネルの右側に示される（ＭＡＰＴも標的とする陽性対照としてのＺＦＰ５２２８８（表１を参照されたい）（「２８８」）；ＢＣＬ１１Ａ（「ＢＣＬ」）；ＧＦＰ（「ＧＦＰ」）を標的とする陰性対照ＺＦＰ；およびモックトランスフェクトされた対照（「ＭＣＫ」））。上３つのパネルは、それぞれのＺＦＰ－ＴＦについて３つの異なる投与量（左から右に向かって３０、１０および３ｎｇのｍＲＮＡ）でのタウ抑制を示す。影付きのグラフも、影付きの領域の下に拡大された形態で示される（左に示されるＺＦＰ５２３２２、ＺＦＰ５２３３５、およびＺＦＰ５２３２２および５２３３５ならびに右に示されるＺＦＰ５２３６４、ＺＦＰ５２３７４およびＺＦＰ５２３６４および５２３７４）。６つの異なる用量（左から右に向かって３００、１００、３０、１０、３および１ｎｇのｍＲＮＡ）でのＺＦＰ－ＴＦのタウ抑制が示される。
図２は、２つ以上のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーを使用する驚くべき相乗効果および相乗効果スコアを誘導するために使用される方法を描写するグラフである。左パネルは、ＺＦＰリプレッサーの示されたレベルでの、一過的ｍＲＮＡトランスフェクション後のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中での正規化されたタウ発現を示す。中央パネルは、合わせた反応においてトランスフェクトされたさらなる量のｍＲＮＡの潜在的な効果を説明するために、２倍用量でトランスフェクトした場合の、より強い単一リプレッサー５２３２２に関する、内挿されたレベルの予想される正規化されたタウ抑制（青色の線、逆三角形）を示す。右パネルは、予想される抑制（逆三角形）と、ＺＦＰの組合せが使用される場合に観察される抑制（丸）との比として算出された、予想外の相乗効果とそのスコアを示す。
図３は、ＺＦＰリプレッサーをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中での示されたＺＦＰ－ＴＦによるタウ（ＭＡＰＴ）遺伝子の抑制の例示的結果と、それぞれの組合せに関する対応する相乗効果スコアを描写する。上２つのパネル（「ＺＦＰ１」および「ＺＦＰ２」）は、単独で使用した場合の示されたＺＦＰ－ＴＦ（米国特許出願公開第２０１８０１５３９２１号も参照されたい）の結果を示す。対照は３番目のパネルの右側に示される（ＭＡＰＴも標的とする陽性対照としてのＺＦＰ５２２８８（表１を参照されたい）（「２８８」）；ＢＣＬ１１Ａ（「ＢＣＬ」）；ＧＦＰ（「ＧＦＰ」）を標的とする陰性対照ＺＦＰ；およびモックトランスフェクトされた対照（「ＭＣＫ」））。下パネルは、示されたＺＦＰリプレッサー対に対する相乗効果を記載する相乗効果スコアを示す。
図４は、抑制ドメイン間としての様々な間隔；ＺＦＰ－ＴＦリプレッサー間としての標的部位の間隔；ＴＳＳからの標的部位の距離；およびＺＦＰ－ＴＦリプレッサーにより結合した鎖での相乗効果を示す例示的な結果の概要を描写する。左上パネルは、ＺＦＰ－ＴＦリプレッサーの抑制（ＫＲＡＢ）ドメイン間の示された距離での相乗効果を示し、ここで、それぞれのＫｒａｂドメイン位置は、Ｃ末端亜鉛フィンガーの最後の標的塩基の位置である。左下パネルは、ＴＳＳからの様々な示された距離での相乗効果を示し、ここで、ＴＳＳ距離は、ＴＳＳから、２つのＺＦＰ－ＴＦリプレッサー間のギャップ中の中心位置までの距離として算出される。右上パネルは、ＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが、示された塩基対のギャップで隔てられた標的部位に結合する場合の相乗効果を示す。右下パネルは、個々のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが示されたＤＮＡ鎖に結合する（＋／＋、両方のＺＦＰ－ＴＦがセンス鎖を標的とする；－／－、両方のＺＦＰ－ＴＦがアンチセンス鎖を標的とする；＋／－または－／＋、一方のＺＦＰ－ＴＦがセンス鎖を標的とし、一方がアンチセンス鎖を標的とする）場合の相乗効果を示す。
図５は、示されたＺＦＰ－ＴＦリプレッサーを使用するタウ発現の抑制を描写する（表１に示されるＺＦＰ設計）。個々のＺＦＰ－ＴＦ（上パネル）について、それぞれのグラフは、使用された８つの用量（左から右に、１０００、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３ｎｇのｍＲＮＡ）を示す。２つの示されたＺＦＰ－ＴＦを含む遺伝子モジュレーターについて、それぞれのグラフは、使用された８つの用量（左から右に、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１ｎｇのｍＲＮＡ）を示す。６つ全部の単一のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーも同時トランスフェクトし、８つの用量（左から右に、１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３ｎｇのｍＲＮＡ）でタウ抑制について評価した。それぞれの用量応答曲線に関するＥＣ５０を、右上に示す。
図６Ａ～図６Ｂは、示されたＺＦＰを使用した、オフターゲット効果およびタウ抑制レベルを描写する。図６Ａは、オフターゲット事象を示す：５２３３５は、２つの非標的遺伝子を抑制し、１つのオフターゲット遺伝子を活性化した；５２３８９は、１つのオフターゲット部位を活性化した；および５２３３５と５２３８９の対は、１つのオフターゲット部位を活性化し、１つのオフターゲット部位を抑制した。図６Ｂは、示されたＺＦＰ－ＴＦの投与後のタウ抑制を描写するグラフである。個々のＺＦＰ－ＴＦ（左および中央パネル）について、それぞれのグラフは、使用された８つの用量（左から右に、１０００、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３ｎｇのｍＲＮＡ）を示す。２つの示されたＺＦＰ－ＴＦを含む遺伝子モジュレーターについて（右パネル）、それぞれのグラフは、使用された８つの用量（左から右に、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１ｎｇのｍＲＮＡ）を示す。ｑＰＣＲ分析により、２つのＺＦＰ－ＴＦリプレッサーを含むリプレッサーが、個々のリプレッサーよりも大きくタウレベルを抑制することが示された（野生型レベルの０．０１２倍）。 図６Ａ～図６Ｂは、示されたＺＦＰを使用した、オフターゲット効果およびタウ抑制レベルを描写する。図６Ａは、オフターゲット事象を示す：５２３３５は、２つの非標的遺伝子を抑制し、１つのオフターゲット遺伝子を活性化した；５２３８９は、１つのオフターゲット部位を活性化した；および５２３３５と５２３８９の対は、１つのオフターゲット部位を活性化し、１つのオフターゲット部位を抑制した。図６Ｂは、示されたＺＦＰ－ＴＦの投与後のタウ抑制を描写するグラフである。個々のＺＦＰ－ＴＦ（左および中央パネル）について、それぞれのグラフは、使用された８つの用量（左から右に、１０００、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３ｎｇのｍＲＮＡ）を示す。２つの示されたＺＦＰ－ＴＦを含む遺伝子モジュレーターについて（右パネル）、それぞれのグラフは、使用された８つの用量（左から右に、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１ｎｇのｍＲＮＡ）を示す。ｑＰＣＲ分析により、２つのＺＦＰ－ＴＦリプレッサーを含むリプレッサーが、個々のリプレッサーよりも大きくタウレベルを抑制することが示された（野生型レベルの０．０１２倍）。
図７Ａ～図７Ｃは、多シストロン性ｍＲＮＡを使用したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中でのタウ抑制、相乗的ＺＦＰ－ＴＦ対を用いた投薬後の抑制の動力学、およびＺＦＰ遺伝子モジュレーターの一過的デリバリー後のタウ遺伝子座の長期サイレンシングを描写する。図７Ａは、Ｋｏｘ抑制ドメインのコドン多様化変異体（それぞれ、連結された構造内のＮ末端、中央、またはＣ末端位置について、ｎＫｏｘ、ｍＫｏｘ、およびｃＫｏｘと命名される）を含む、連結された（多シストロン性）および連結されていない人工ＴＦを使用した抑制を示す。結果を、グラフの上に示されるｍＲＮＡ形態で投与された示された対を使用して示す。上パネルは、示されたコドン多様化された抑制ドメイン（ｎＫＯＸ、ｍＫＯＸ、ｃＫＯＸ）を含む３シストロン性構造により連結された３つのＺＦＰの潜在的な構成ならびにウイルス切断ペプチドＴ２ＡおよびＰ２Ａによる連結を示す略図である。中央パネルは、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３および０．１ｎｇのｍＲＮＡ（それぞれのグラフで左から右に）の用量の連結されていないｍＲＮＡを用いたタウ抑制の結果を示し、下パネルは、６００、２００、６０、２０、６、２、０．６、および０．１ｎｇのｍＲＮＡ（それぞれのグラフで左から右に）の用量の、示されたリンカーと抑制ドメインとを含む２シストロン性ｍＲＮＡを用いたタウ抑制の結果を示す。図７Ｂは、ｍＲＮＡトランスフェクション後の示された時間でのタウ発現レベルを示す。上パネルは、トランスフェクションの２４時間後の収獲時のＺＦＰ－ＴＦ５２３２２／５２３３５を含むリプレッサーに関する典型的な抑制データを示すグラフも示す。下のグラフは、示された時点（２４時間、４８時間、６４時間、７２時間および１３６時間）での時間経過にわたる６つの用量（３００、１００、３０、１０、３、および１ｎｇのｍＲＮＡ；それぞれのグラフで左から右に）でのタウ抑制を示す。また、最右下のグラフは、陰性トランスフェクション対照（ＢＣＬ１１Ａ（「Ｂ」）；ＧＦＰ（「Ｇ」）を標的とする対照ＺＦＰ；およびモックトランスフェクト対照（「Ｍ」））である。図７Ｃは、一過的なＺＦＰデリバリー後、トランスフェクションの１、４、または７日後でのＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中でのタウ発現レベル（単一の因子については９００／３００／１００ｎｇのｍＲＮＡでの３用量のｍＲＮＡトランスフェクションおよびそれぞれ５７８９０－ＫＲＡＢ、５２３２２－ＤＮＭＴ３Ａ、および５７９３０－ＤＮＭＴ３Ｌの３００／１００／３０ｎｇのｍＲＮＡでの三重トランスフェクション）を示す。細胞を、増殖阻害された低血清培地中で培養して、細胞分裂を停止させた。 図７Ａ～図７Ｃは、多シストロン性ｍＲＮＡを使用したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中でのタウ抑制、相乗的ＺＦＰ－ＴＦ対を用いた投薬後の抑制の動力学、およびＺＦＰ遺伝子モジュレーターの一過的デリバリー後のタウ遺伝子座の長期サイレンシングを描写する。図７Ａは、Ｋｏｘ抑制ドメインのコドン多様化変異体（それぞれ、連結された構造内のＮ末端、中央、またはＣ末端位置について、ｎＫｏｘ、ｍＫｏｘ、およびｃＫｏｘと命名される）を含む、連結された（多シストロン性）および連結されていない人工ＴＦを使用した抑制を示す。結果を、グラフの上に示されるｍＲＮＡ形態で投与された示された対を使用して示す。上パネルは、示されたコドン多様化された抑制ドメイン（ｎＫＯＸ、ｍＫＯＸ、ｃＫＯＸ）を含む３シストロン性構造により連結された３つのＺＦＰの潜在的な構成ならびにウイルス切断ペプチドＴ２ＡおよびＰ２Ａによる連結を示す略図である。中央パネルは、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３および０．１ｎｇのｍＲＮＡ（それぞれのグラフで左から右に）の用量の連結されていないｍＲＮＡを用いたタウ抑制の結果を示し、下パネルは、６００、２００、６０、２０、６、２、０．６、および０．１ｎｇのｍＲＮＡ（それぞれのグラフで左から右に）の用量の、示されたリンカーと抑制ドメインとを含む２シストロン性ｍＲＮＡを用いたタウ抑制の結果を示す。図７Ｂは、ｍＲＮＡトランスフェクション後の示された時間でのタウ発現レベルを示す。上パネルは、トランスフェクションの２４時間後の収獲時のＺＦＰ－ＴＦ５２３２２／５２３３５を含むリプレッサーに関する典型的な抑制データを示すグラフも示す。下のグラフは、示された時点（２４時間、４８時間、６４時間、７２時間および１３６時間）での時間経過にわたる６つの用量（３００、１００、３０、１０、３、および１ｎｇのｍＲＮＡ；それぞれのグラフで左から右に）でのタウ抑制を示す。また、最右下のグラフは、陰性トランスフェクション対照（ＢＣＬ１１Ａ（「Ｂ」）；ＧＦＰ（「Ｇ」）を標的とする対照ＺＦＰ；およびモックトランスフェクト対照（「Ｍ」））である。図７Ｃは、一過的なＺＦＰデリバリー後、トランスフェクションの１、４、または７日後でのＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中でのタウ発現レベル（単一の因子については９００／３００／１００ｎｇのｍＲＮＡでの３用量のｍＲＮＡトランスフェクションおよびそれぞれ５７８９０－ＫＲＡＢ、５２３２２－ＤＮＭＴ３Ａ、および５７９３０－ＤＮＭＴ３Ｌの３００／１００／３０ｎｇのｍＲＮＡでの三重トランスフェクション）を示す。細胞を、増殖阻害された低血清培地中で培養して、細胞分裂を停止させた。 図７Ａ～図７Ｃは、多シストロン性ｍＲＮＡを使用したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中でのタウ抑制、相乗的ＺＦＰ－ＴＦ対を用いた投薬後の抑制の動力学、およびＺＦＰ遺伝子モジュレーターの一過的デリバリー後のタウ遺伝子座の長期サイレンシングを描写する。図７Ａは、Ｋｏｘ抑制ドメインのコドン多様化変異体（それぞれ、連結された構造内のＮ末端、中央、またはＣ末端位置について、ｎＫｏｘ、ｍＫｏｘ、およびｃＫｏｘと命名される）を含む、連結された（多シストロン性）および連結されていない人工ＴＦを使用した抑制を示す。結果を、グラフの上に示されるｍＲＮＡ形態で投与された示された対を使用して示す。上パネルは、示されたコドン多様化された抑制ドメイン（ｎＫＯＸ、ｍＫＯＸ、ｃＫＯＸ）を含む３シストロン性構造により連結された３つのＺＦＰの潜在的な構成ならびにウイルス切断ペプチドＴ２ＡおよびＰ２Ａによる連結を示す略図である。中央パネルは、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３および０．１ｎｇのｍＲＮＡ（それぞれのグラフで左から右に）の用量の連結されていないｍＲＮＡを用いたタウ抑制の結果を示し、下パネルは、６００、２００、６０、２０、６、２、０．６、および０．１ｎｇのｍＲＮＡ（それぞれのグラフで左から右に）の用量の、示されたリンカーと抑制ドメインとを含む２シストロン性ｍＲＮＡを用いたタウ抑制の結果を示す。図７Ｂは、ｍＲＮＡトランスフェクション後の示された時間でのタウ発現レベルを示す。上パネルは、トランスフェクションの２４時間後の収獲時のＺＦＰ－ＴＦ５２３２２／５２３３５を含むリプレッサーに関する典型的な抑制データを示すグラフも示す。下のグラフは、示された時点（２４時間、４８時間、６４時間、７２時間および１３６時間）での時間経過にわたる６つの用量（３００、１００、３０、１０、３、および１ｎｇのｍＲＮＡ；それぞれのグラフで左から右に）でのタウ抑制を示す。また、最右下のグラフは、陰性トランスフェクション対照（ＢＣＬ１１Ａ（「Ｂ」）；ＧＦＰ（「Ｇ」）を標的とする対照ＺＦＰ；およびモックトランスフェクト対照（「Ｍ」））である。図７Ｃは、一過的なＺＦＰデリバリー後、トランスフェクションの１、４、または７日後でのＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中でのタウ発現レベル（単一の因子については９００／３００／１００ｎｇのｍＲＮＡでの３用量のｍＲＮＡトランスフェクションおよびそれぞれ５７８９０－ＫＲＡＢ、５２３２２－ＤＮＭＴ３Ａ、および５７９３０－ＤＮＭＴ３Ｌの３００／１００／３０ｎｇのｍＲＮＡでの三重トランスフェクション）を示す。細胞を、増殖阻害された低血清培地中で培養して、細胞分裂を停止させた。
図８Ａ～図８Ｃは、対照および処置された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）対象から採取されたｉｎ ｖｉｖｏの試料に由来するタウ発現およびＺＦＰレベルを描写するグラフである。図８Ａは、対照の対象（ＮＨＰ０１、ＮＨＰ０２およびＮＨＰ０３）に由来する結果を示す。図８Ｂは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がシナプシン（ＳＹＮ１）プロモーター（「ＳＹＮ１．９１８－８９０」）によって駆動される単一のＡＡＶ２／９ベクターによって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置されたＮＨＰ対象（ＮＨＰ０４、ＮＨＰ０５およびＮＨＰ０６）に由来する結果を示す。図８Ｃは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がＣＭＶプロモーター（「ＣＭＶ．９１８－８９０」）によって駆動される単一のＡＡＶ２／９ベクターによって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置された対象（ＮＨＰ０７およびＮＨＰ０８）に由来する結果を示す（左パネル）。それぞれのパネルにおける上のプロットは、正規化されたタウ抑制（％）を示し、それぞれのパネルにおける下のプロットは、ＺＦＰレベル（コピー／ｎｇのｍＲＮＡ）を示す。 図８Ａ～図８Ｃは、対照および処置された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）対象から採取されたｉｎ ｖｉｖｏの試料に由来するタウ発現およびＺＦＰレベルを描写するグラフである。図８Ａは、対照の対象（ＮＨＰ０１、ＮＨＰ０２およびＮＨＰ０３）に由来する結果を示す。図８Ｂは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がシナプシン（ＳＹＮ１）プロモーター（「ＳＹＮ１．９１８－８９０」）によって駆動される単一のＡＡＶ２／９ベクターによって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置されたＮＨＰ対象（ＮＨＰ０４、ＮＨＰ０５およびＮＨＰ０６）に由来する結果を示す。図８Ｃは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がＣＭＶプロモーター（「ＣＭＶ．９１８－８９０」）によって駆動される単一のＡＡＶ２／９ベクターによって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置された対象（ＮＨＰ０７およびＮＨＰ０８）に由来する結果を示す（左パネル）。それぞれのパネルにおける上のプロットは、正規化されたタウ抑制（％）を示し、それぞれのパネルにおける下のプロットは、ＺＦＰレベル（コピー／ｎｇのｍＲＮＡ）を示す。 図８Ａ～図８Ｃは、対照および処置された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）対象から採取されたｉｎ ｖｉｖｏの試料に由来するタウ発現およびＺＦＰレベルを描写するグラフである。図８Ａは、対照の対象（ＮＨＰ０１、ＮＨＰ０２およびＮＨＰ０３）に由来する結果を示す。図８Ｂは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がシナプシン（ＳＹＮ１）プロモーター（「ＳＹＮ１．９１８－８９０」）によって駆動される単一のＡＡＶ２／９ベクターによって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置されたＮＨＰ対象（ＮＨＰ０４、ＮＨＰ０５およびＮＨＰ０６）に由来する結果を示す。図８Ｃは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がＣＭＶプロモーター（「ＣＭＶ．９１８－８９０」）によって駆動される単一のＡＡＶ２／９ベクターによって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置された対象（ＮＨＰ０７およびＮＨＰ０８）に由来する結果を示す（左パネル）。それぞれのパネルにおける上のプロットは、正規化されたタウ抑制（％）を示し、それぞれのパネルにおける下のプロットは、ＺＦＰレベル（コピー／ｎｇのｍＲＮＡ）を示す。 図８Ａ～図８Ｃは、対照および処置された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）対象から採取されたｉｎ ｖｉｖｏの試料に由来するタウ発現およびＺＦＰレベルを描写するグラフである。図８Ａは、対照の対象（ＮＨＰ０１、ＮＨＰ０２およびＮＨＰ０３）に由来する結果を示す。図８Ｂは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がシナプシン（ＳＹＮ１）プロモーター（「ＳＹＮ１．９１８－８９０」）によって駆動される単一のＡＡＶ２／９ベクターによって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置されたＮＨＰ対象（ＮＨＰ０４、ＮＨＰ０５およびＮＨＰ０６）に由来する結果を示す。図８Ｃは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がＣＭＶプロモーター（「ＣＭＶ．９１８－８９０」）によって駆動される単一のＡＡＶ２／９ベクターによって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置された対象（ＮＨＰ０７およびＮＨＰ０８）に由来する結果を示す（左パネル）。それぞれのパネルにおける上のプロットは、正規化されたタウ抑制（％）を示し、それぞれのパネルにおける下のプロットは、ＺＦＰレベル（コピー／ｎｇのｍＲＮＡ）を示す。 図８Ａ～図８Ｃは、対照および処置された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）対象から採取されたｉｎ ｖｉｖｏの試料に由来するタウ発現およびＺＦＰレベルを描写するグラフである。図８Ａは、対照の対象（ＮＨＰ０１、ＮＨＰ０２およびＮＨＰ０３）に由来する結果を示す。図８Ｂは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がシナプシン（ＳＹＮ１）プロモーター（「ＳＹＮ１．９１８－８９０」）によって駆動される単一のＡＡＶ２／９ベクターによって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置されたＮＨＰ対象（ＮＨＰ０４、ＮＨＰ０５およびＮＨＰ０６）に由来する結果を示す。図８Ｃは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がＣＭＶプロモーター（「ＣＭＶ．９１８－８９０」）によって駆動される単一のＡＡＶ２／９ベクターによって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置された対象（ＮＨＰ０７およびＮＨＰ０８）に由来する結果を示す（左パネル）。それぞれのパネルにおける上のプロットは、正規化されたタウ抑制（％）を示し、それぞれのパネルにおける下のプロットは、ＺＦＰレベル（コピー／ｎｇのｍＲＮＡ）を示す。
図９Ａ～図９Ｃは、ヒトｉＰＳニューロン中でのタウ抑制を描写する。図９Ａは、低活性ＺＦＰの組合せが、組み合わせて使用した場合に相乗効果を示すことを示す（単一の化合物で処置された細胞中での３つのタンパク質の活性と、２つを一緒に使用した場合の活性とを比較する）。ヒトｉＰＳ由来ニューロンを、Ｓｙｎ１プロモーターによって調節されるＺＦＰ－ＴＦを含むＡＡＶ６で処置し、細胞を１９日後に分析した。細胞を、５～７回の生物学的反復において、１Ｅ５ ＶＧ／細胞で処置した。＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である有意性を示すことに留意されたい。図９Ｂは、単一の遺伝子モジュレーターとして使用したＺＦＰ－ＴＦは、ＭＡＰＴ遺伝子のわずかな抑制をもたらすが、２つのＺＦＰ－ＴＦを一緒に使用した場合、ＭＡＰＴ発現のはるかにより大きい抑制が存在する、トランスクリプトームにおける変化を描写する。プロットは、左上の角に上方または下方調節される遺伝子の数を描写し、これらの報告に関するカットオフは、２倍を超える上方または下方への変化である。これらの実験では、１９，９５９個のコード転写物を評価した。「６５９１８ｎ」は、６５９１８個のＺＦＰ－ＴＦがｎＫＯＸ変異体を含んでいたことを意味する。「５７８９０ｍ」は、５７８９０個のＺＦＰ－ＴＦがｍＫＯＸ変異体を含んでいたことを意味する。図９Ｃは、他のＺＦＰ－ＴＦ組合せに関して見出された結果を描写する。「６５９２０ｎ」は、６５９２０個のＺＦＰ－ＴＦがｎＫＯＸ変異体を含んでいたことを意味する。「５７８９０ｍ」は、上と同じである。 図９Ａ～図９Ｃは、ヒトｉＰＳニューロン中でのタウ抑制を描写する。図９Ａは、低活性ＺＦＰの組合せが、組み合わせて使用した場合に相乗効果を示すことを示す（単一の化合物で処置された細胞中での３つのタンパク質の活性と、２つを一緒に使用した場合の活性とを比較する）。ヒトｉＰＳ由来ニューロンを、Ｓｙｎ１プロモーターによって調節されるＺＦＰ－ＴＦを含むＡＡＶ６で処置し、細胞を１９日後に分析した。細胞を、５～７回の生物学的反復において、１Ｅ５ ＶＧ／細胞で処置した。＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である有意性を示すことに留意されたい。図９Ｂは、単一の遺伝子モジュレーターとして使用したＺＦＰ－ＴＦは、ＭＡＰＴ遺伝子のわずかな抑制をもたらすが、２つのＺＦＰ－ＴＦを一緒に使用した場合、ＭＡＰＴ発現のはるかにより大きい抑制が存在する、トランスクリプトームにおける変化を描写する。プロットは、左上の角に上方または下方調節される遺伝子の数を描写し、これらの報告に関するカットオフは、２倍を超える上方または下方への変化である。これらの実験では、１９，９５９個のコード転写物を評価した。「６５９１８ｎ」は、６５９１８個のＺＦＰ－ＴＦがｎＫＯＸ変異体を含んでいたことを意味する。「５７８９０ｍ」は、５７８９０個のＺＦＰ－ＴＦがｍＫＯＸ変異体を含んでいたことを意味する。図９Ｃは、他のＺＦＰ－ＴＦ組合せに関して見出された結果を描写する。「６５９２０ｎ」は、６５９２０個のＺＦＰ－ＴＦがｎＫＯＸ変異体を含んでいたことを意味する。「５７８９０ｍ」は、上と同じである。 図９Ａ～図９Ｃは、ヒトｉＰＳニューロン中でのタウ抑制を描写する。図９Ａは、低活性ＺＦＰの組合せが、組み合わせて使用した場合に相乗効果を示すことを示す（単一の化合物で処置された細胞中での３つのタンパク質の活性と、２つを一緒に使用した場合の活性とを比較する）。ヒトｉＰＳ由来ニューロンを、Ｓｙｎ１プロモーターによって調節されるＺＦＰ－ＴＦを含むＡＡＶ６で処置し、細胞を１９日後に分析した。細胞を、５～７回の生物学的反復において、１Ｅ５ ＶＧ／細胞で処置した。＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である有意性を示すことに留意されたい。図９Ｂは、単一の遺伝子モジュレーターとして使用したＺＦＰ－ＴＦは、ＭＡＰＴ遺伝子のわずかな抑制をもたらすが、２つのＺＦＰ－ＴＦを一緒に使用した場合、ＭＡＰＴ発現のはるかにより大きい抑制が存在する、トランスクリプトームにおける変化を描写する。プロットは、左上の角に上方または下方調節される遺伝子の数を描写し、これらの報告に関するカットオフは、２倍を超える上方または下方への変化である。これらの実験では、１９，９５９個のコード転写物を評価した。「６５９１８ｎ」は、６５９１８個のＺＦＰ－ＴＦがｎＫＯＸ変異体を含んでいたことを意味する。「５７８９０ｍ」は、５７８９０個のＺＦＰ－ＴＦがｍＫＯＸ変異体を含んでいたことを意味する。図９Ｃは、他のＺＦＰ－ＴＦ組合せに関して見出された結果を描写する。「６５９２０ｎ」は、６５９２０個のＺＦＰ－ＴＦがｎＫＯＸ変異体を含んでいたことを意味する。「５７８９０ｍ」は、上と同じである。
図１０は、ＺＦＰリプレッサーをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中での例示的なＺＦＰ－ＴＦ（Ａ～Ｋと命名される）によるマウスプリオン（Ｐｒｎｐ）遺伝子の抑制の結果と、それぞれの組合せに関する対応する相乗効果スコアを描写する。上２つのパネル（「ＺＦＰ１」および「ＺＦＰ２」）は、単独で使用した場合の示されたＺＦＰ－ＴＦの結果を示す。下パネルは、示されたＺＦＰリプレッサー対に対する相乗効果を記載する相乗効果スコアを示す（組合せ中のその用量の２倍で試験した場合のより強力なＺＦＰを用いて得られた発現レベルの、ＺＦＰの組合せを用いて得られた発現レベルに対する比として算出される）。
図１１は、抑制ドメイン間の様々な間隔；ＺＦＰ－ＴＦリプレッサー間の標的部位の間隔；およびＴＳＳからの標的部位の距離でのマウスプリオン遺伝子を標的とするＺＦＰ－ＴＦの１３０の組合せの相乗効果を示す概要を描写する。上パネルは、ＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが、示された塩基対のギャップで隔てられた標的部位に結合する場合の相乗効果を示す。中央パネルは、ＺＦＰ－ＴＦリプレッサーの抑制（ＫＲＡＢ）ドメイン間の示された距離での相乗効果を示し、ここで、それぞれのＫＲＡＢドメインの位置は、Ｃ末端亜鉛フィンガーの最後の標的塩基の位置である。下パネルは、ＴＳＳからの様々な示された距離での相乗効果を示し、ここで、ＴＳＳ距離は、ＴＳＳから、２つのＺＦＰ－ＴＦリプレッサー間のギャップ中の中心位置までの距離として算出される。
図１２は、ＺＦＰリプレッサーをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトされたＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞中での例示的なＺＦＰ－ＴＦ（ｈＡ～ｈＪと命名される）によるヒトプリオン（ＰＲＮＰ）遺伝子の抑制の結果と、それぞれの組合せに関する対応する相乗効果スコアを描写する。上２つのパネル（「ＺＦＰ１」および「ＺＦＰ２」）は、単独で使用した場合の示されたＺＦＰ－ＴＦの結果を示す。下パネルは、示されたＺＦＰリプレッサー対に対する相乗効果を記載する相乗効果スコアを示す（組合せ中のその用量の２倍で試験した場合のより強力なＺＦＰを用いて得られた発現レベル：ＺＦＰの組合せを用いて得られた発現レベルの比として算出される）。
図１３は、抑制ドメイン間の様々な間隔；ＺＦＰ－ＴＦリプレッサー間の標的部位の間隔；およびＴＳＳからの標的部位の距離でのヒトプリオン遺伝子を標的とするＺＦＰ－ＴＦの１３０の組合せの相乗効果を示す概要を描写する。上パネルは、ＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが、示された塩基対のギャップで隔てられた標的部位に結合する場合の相乗効果を示す。中央パネルは、ＺＦＰ－ＴＦリプレッサーの抑制（ＫＲＡＢ）ドメイン間の示された距離での相乗効果を示し、ここで、それぞれのＫＲＡＢドメインの位置は、Ｃ末端亜鉛フィンガーの最後の標的塩基の位置である。下パネルは、ＴＳＳからの様々な示された距離での相乗効果を示し、ここで、ＴＳＳ距離は、ＴＳＳから、２つのＺＦＰ－ＴＦリプレッサー間のギャップ中の中心位置までの距離として算出される。
図１４は、ＺＦＰリプレッサーをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトされたＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞中での例示的なＺＦＰ－ＴＦ（ｓＡ～ｓＪと命名される）によるヒトα－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）遺伝子の抑制の結果と、それぞれの組合せに関する対応する相乗効果スコアを描写する。上２つのパネル（「ＺＦＰ１」および「ＺＦＰ２」）は、単独で使用した場合の示されたＺＦＰ－ＴＦの結果を示す。下パネルは、示されたＺＦＰリプレッサー対に対する相乗効果を記載する相乗効果スコアを示す（組合せ中のその用量の２倍で試験した場合のより強力なＺＦＰを用いて得られた発現レベル：ＺＦＰの組合せを用いて得られた発現レベルの比として算出される）。
図１５は、抑制ドメイン間の様々な間隔；ＺＦＰ－ＴＦリプレッサー間の標的部位の間隔；およびＴＳＳからの標的部位の距離でのヒトα－シヌクレイン遺伝子を標的とするＺＦＰ－ＴＦの１３２の組合せの相乗効果を示す概要を描写する。上パネルは、ＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが、示された塩基対のギャップで隔てられた標的部位に結合する場合の相乗効果を示す。中央パネルは、ＺＦＰ－ＴＦリプレッサーの抑制（ＫＲＡＢ）ドメイン間の示された距離での相乗効果を示し、ここで、それぞれのＫＲＡＢドメインの位置は、Ｃ末端亜鉛フィンガーの最後の標的塩基の位置である。下パネルは、ＴＳＳからの様々な示された距離での相乗効果を示し、ここで、ＴＳＳ距離は、ＴＳＳから、２つのＺＦＰ－ＴＦリプレッサー間のギャップ中の中心位置までの距離として算出される。
高い特異性で標的遺伝子の遺伝子発現をモジュレートするための組成物および方法が本明細書に開示される。本明細書に記載の遺伝子モジュレーターは、個々の人工転写因子と比較して相乗（相加を超える）効果を提供する、少なくとも２つの人工転写因子を含む。特に、本明細書に記載の組成物および方法は、任意の標的遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、抑制する、または活性化する）ために使用される。これらの遺伝子モジュレーターを使用して、標的遺伝子の望ましくない発現と関連する疾患の効果および／または症状が低減されるか、または除去されるように、インビボで遺伝子発現を改変
することができる。例えば、本明細書に記載のリプレッサーを使用して、タウオパチー（例えば、ＡＤ）またはＨＤを有する対象の脳におけるタウまたは突然変異Ｈｔｔの凝集を低減させるか、または除去し、疾患の症状を低減させることができる。
一般
本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、別途指摘しない限り、分子生物学、生化学、クロマチンの構造および分析、コンピュータ化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび当業者の知識の範囲内にある関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989およびThird edition, 2001；Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987およびその定期的アップデート；the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998；METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999；ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols” (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照されたい。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、線状または環状コンフォメーションの、一本鎖または二本鎖形態にあるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定と解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含してもよい。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成特異性を有する；すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対を形成するであろう。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有的相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用の全ての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）。そのような相互作用は一般に、１０－６Ｍ－１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指し、結合親和性の増大は、より低いＫｄと相関する。
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、自身に結合することができる（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／または異なるタンパク質もしくは複数のタンパク質の１つもしくは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１より多い型の結合活性を有してもよい。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つまたは複数の亜鉛フィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰと略されることが多い。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／ユニットを含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復ユニット」（「リピート」とも称される）は、典型的には、長さ３３～３５アミノ酸であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列との少なくともいくらかの配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、サームス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）細菌に由来する。例えば、Swarts et al., (2014) Nature 507(7491):258-261、G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡなどの、必要とされる全ての成分である。「組換え」とは、限定されるものではないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕捉を含む、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同組換え修復メカニズムによる細胞中での二本鎖切断の修復の間に起こる、特殊な形態のそのような交換を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、「非交叉遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として種々公知であるが、これは、それがドナーから標的への遺伝情報の移行をもたらすからである。いかなる特定の理論にも束縛されないが、そのような移行は、切断された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または、標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される、「合成に依存する鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを含んでもよい。そのような特殊なＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチド中に組み込まれるような、標的分子の配列の変更をもたらすことが多い。
ｓｇＲＮＡなどのＤＮＡ結合ドメイン、亜鉛フィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを、例えば、選択された標的部位に結合するｓｇＲＮＡの設計により、または天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つもしくは複数のアミノ酸の変更）により、またはＴＡＬＥタンパク質のＲＶＤの操作により、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。したがって、操作された亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、天然には存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインを操作するための方法の非限定例は、設計および選択である。「設計された」亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、設計／組成が主に合理的な基準に起因する天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的な基準は、存在するＺＦＰ設計および結合データのデータベース保存情報中の情報を処置するための置換規則およびコンピュータアルゴリズムの適用を含む。「選択された」亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、産生が主に、ファージディスプレイ、相互作用捕捉またはハイブリッド選択などの経験的プロセスに起因する、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；第６，１４０，０８１号；第６，４５３，２４２号；第６，７４６，８３８号；第７，２４１，５７３号；第６，８６６，９９７号；第７，２４１，５７４号；および第６，５３４，２６１号を参照されたい；また、国際特許出願公開ＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状、環状または分枝状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２～１０，０００ヌクレオチド長（またはその間もしくは上記の任意の整数値）、好ましくは約１００～１，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、より好ましくは約２００～５００ヌクレオチド長のものであってもよい。
「標的部位」または「標的配列」は、結合にとって十分な条件が存在するという条件で、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。
「外因性」分子は、細胞中には通常存在しないが、１つまたは複数の遺伝的、生化学的または他の方法によって細胞中に導入することができる分子である。「細胞中での通常の存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。かくして、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成熟筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能性バージョンまたは正常に機能している内因性分子の機能不全バージョンを含んでもよい。
外因性分子は、特に、コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるような低分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体などの高分子、または上記分子の１つもしくは複数を含む任意の複合体であってもよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく、線状、分枝状または環状であってもよく、任意の長さのものであってもよい。核酸は、二重鎖を形成することができるもの、ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入される感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞中に存在しない染色体を含んでもよい。外因性分子を細胞中に導入するための方法は、当業者には公知であり、限定されるものではないが、脂質媒介性導入（すなわち、中性および陽イオン脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、リン酸カルシウム共沈降、ＤＥＡＥデキストラン媒介性導入およびウイルスベクター媒介性導入が挙げられる。また、外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子であってもよいが、細胞が由来するものとは異なる種に由来してもよい。例えば、ヒト核酸配列を、元々はマウスまたはハムスターに由来する細胞系に導入することができる。
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下、特定の発生段階の特定の細胞中に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含んでもよい。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含んでもよい。
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有的に連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であってもよく、または異なる化学型の分子であってもよい。第１の型の融合分子の例としては、限定されるものではないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、１つまたは複数の活性化ドメインとの融合物）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。第２の型の融合分子の例としては、限定されるものではないが、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの融合物、および副溝結合剤と核酸との融合物が挙げられる。この用語はまた、ポリヌクレオチド成分がポリペプチド成分と会合して、機能的分子を形成する系（例えば、単一ガイドＲＮＡが機能ドメインと会合して遺伝子発現をモジュレートするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）も含む。
細胞中での融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質のデリバリーの結果生じるか、またはポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞へのデリバリーによって生じてもよい。ｔｒａｎｓスプライシング、ポリペプチドの切断およびポリペプチドのライゲーションを、細胞中でのタンパク質の発現に含ませてもよい。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドのデリバリーのための方法は、本開示の他の箇所に提示される。
「多量体化ドメイン」（「二量体化ドメイン」または「タンパク質相互作用ドメイン」とも称される）は、ＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦのアミノ、カルボキシまたはアミノおよびカルボキシ末端領域に組み込まれるドメインである。これらのドメインは、トリヌクレオチド反復ドメインのより大きい路が、野生型数の長さを有するより短い路と比較して多量体化されたＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦによって選択的に結合するようになるような、複数のＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦユニットの多量体化を可能にする。多量体化ドメインの例としては、ロイシンジッパーが挙げられる。多量体化ドメインが適切なコンフォメーションをとって、低分子または外部リガンドの存在下でのみ、別の多量体化ドメインとの相互作用を可能にする低分子によって、多量体化ドメインを調節することもできる。このように、外因性リガンドを使用して、これらのドメインの活性を調節することができる。
「遺伝子」は、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（上記参照）、ならびに調節配列がコード配列および／または転写される配列に隣接するかどうかに関係なく、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、必ずしも限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域を含む。
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡもしくは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションは、限定されるものではないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含んでもよい。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活化、無作為突然変異）を使用して、発現をモジュレートすることができる。遺伝子不活化とは、本明細書に記載のＺＦＰまたはＴＡＬＥタンパク質を含まない細胞と比較した、遺伝子発現の任意の低減を指す。かくして、遺伝子不活化は、部分的または完全であってもよい。
「遺伝子モジュレーター」とは、１つまたは複数の遺伝子の発現および／または配列を変更する任意の分子を指す。遺伝子モジュレーターの非限定例としては、標的遺伝子に結合し、その発現を変更する転写因子（本明細書に記載の人工転写因子など）および標的遺伝子の配列を改変し、次いで、その発現を変更するヌクレアーゼ（例えば、挿入および／または欠失による標的の不活化）が挙げられる。かくして、遺伝子モジュレーターは、遺伝子リプレッサー（遺伝子発現を抑制する、および／もしくは不活化する）または遺伝子活性化因子であってもよい。
「目的の領域」は、例えば、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子内または遺伝子に隣接する遺伝子または非コード配列などの、細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えのためのものであってもよい。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在してもよい。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレイラー配列もしくはイントロンなどの転写される非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流にある非転写領域内にあってもよい。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ぐらいの小さいもの、または最大で２，０００ヌクレオチド対の長さのもの、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。
「真核」細胞としては、限定されるものではないが、菌類細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」（または「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、両方の成分が正常に機能し、少なくとも１つの成分が、他の成分のうちの少なくとも１つに対して及ぼされる機能を媒介することができる可能性を許容するように成分が配置される、２つ以上の成分（配列エレメントなど）の並列を参照して互換的に使用される。実例として、プロモーターなどの転写調節配列は、その転写調節配列が１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配列は、一般に、コード配列とｃｉｓに作動可能に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続的ではないにも拘わらず、コード配列に作動可能に連結される転写調節配列である。
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結された」とは、それぞれの成分が、他の成分との連結において、それがそのように連結されていなかった場合に実行したであろうものと同じ機能を実行するという事実を指してもよい。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合分子に関して、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、活性化ドメインとは、融合ポリペプチド中で、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節することができる場合、作動可能な連結にある。遺伝子発現を調節することができるドメインに融合されたＺＦＰは、「ＺＦＰ－ＴＦ」または「亜鉛フィンガー転写因子」と集合的に称されるが、遺伝子発現を調節することができるドメインに融合されたＴＡＬＥは、「ＴＡＬＥ－ＴＦ」または「ＴＡＬＥ転写因子」と集合的に称される。ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチドの場合（「ＺＦＮ」または「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」）、融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができる場合、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメインとは、作動可能に連結されている。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチドの場合（「ＴＡＬＥＮ」または「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」）、融合ポリペプチド中で、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができる場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメインとは、作動可能に連結されている。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、単一ガイドＲＮＡ）が活性化ドメインに融合された融合分子に関して、融合ポリペプチド中で、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節することができる場合、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインと、活性化ドメインとは、作動可能に連結されている。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチド中で、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができる場合、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメインとは、作動可能に連結されている。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を依然として保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然分子よりも多い、少ない、もしくはそれと同じ数の残基を有してもよく、および／または１つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有してもよい。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当業界で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能を、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断を、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ausubel et al., supraを参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力を、例えば、同時免疫沈降、２ハイブリッドアッセイまたは遺伝的と生化学的との両方の相補性によって決定することができる。例えば、Fields et al., (1989) Nature 340:245-246；米国特許第５，５８５，２４５号および国際特許出願公開ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指令することができ、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸コンストラクトを意味する。かくして、この用語は、クローニング、および発現媒体、ならびに組込みベクターを含む。
「リポーター遺伝子」または「リポーター配列」とは、好ましくは、必須ではないが、日常的なアッセイにおいて容易に測定されるタンパク質産物をもたらす任意の配列を指す。好適なリポーター遺伝子としては、限定されるものではないが、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞増殖および／または遺伝子増幅（例えば、ジヒドロ葉酸リダクターゼ）の増強を媒介するタンパク質が挙げられる。エピトープタグとしては、例えば、１または複数コピーのＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列が挙げられる。「発現タグ」は、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結されていてもよいリポーターをコードする配列を含む。
用語「相乗効果」および「相加効果」は、達成される遺伝子モジュレーション効果を指すために使用される。２つ以上の人工転写因子が、個々の人工転写因子および／または一緒に使用される２つ以上の人工転写因子の予想される（「相加的」）モジュレーションよりも高いレベルで遺伝子発現をモジュレートする場合、モジュレーションは、相乗効果を示すと言われる。「相乗効果」は、個々の成分が所与の用量で全て活性である機能的相乗効果および遺伝子モジュレーターの個々の人工転写因子の少なくとも１つが所与の用量で不活性である協調的相乗効果を含む。任意の好適な手段、例えば、（１）最も強力な単一の人工転写因子と同じ用量での標的遺伝子の予想される正規化された発現の、組合せが使用される場合の観察される正規化された遺伝子発現に対する比を算出すること、または（２）より強力なＺＦＰ－ＴＦ（組み合わせて使用されるその用量の２倍）に関して得られる発現レベルの、ＺＦＰの組合せに関して得られるものに対する比を決定することにより、相乗効果を決定することができる。
遺伝子モジュレーター
本明細書に記載の遺伝子モジュレーターは、それぞれの人工転写因子（ＴＦ）がＤＮＡ結合ドメインと、１つまたは複数の機能ドメインとを含む、２つ以上の人工転写因子（例えば、リプレッサーまたは活性化因子）を含む。本明細書に記載の遺伝子モジュレーターは、特異性（オフターゲット遺伝子のモジュレーションを限定する、もしくは除去する）および／または活性（モジュレーションの量）に対する相乗効果を含む、単一の転写因子と比較して相乗効果を示す。かくして、相乗効果は、個々のＴＦ（および／または予想される相加効果）と比較して、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍を超える、またはそれ以上の活性および／または特異性の任意の増加である。
本明細書に記載の組成物のいずれかにおいて、２つ以上の人工転写因子は、約１～約６００（またはその間の任意の値）塩基対離れている、好ましくは、約１～約３００（またはその間の任意の値）塩基対離れている、さらにより好ましくは、約１～約１００（またはその間の任意の値）塩基対離れている標的部位に（ＴＦのＤＮＡ結合ドメインを介して）結合することができる。ある特定の実施形態では、相乗的ＴＦ組成物の成分は、約１～約８０（もしくはその間の任意の値）、約１６０～約２２０（もしくはその間の任意の値）、約２６０～約４００（もしくはその間の任意の値）、または約５００～約６００（もしくはその間の任意の値）塩基対離れている標的部位に結合する。例えば、図４、図１１、図１３、および図１５を参照されたい。
本明細書に記載の組成物のいずれかにおいて、２つ以上の人工転写因子の機能ドメイン（例えば、ＫＲＡＢまたはＤＮＭＴなどの転写活性化または抑制ドメイン）は、（ＴＦのＤＮＡ結合ドメインを介して）互いに約１～約６００（またはその間の任意の値）塩基対離れて、好ましくは約１～約３００（またはその間の任意の値）塩基対離れて、さらにより好ましくは約１～約１００（またはその間の任意の値）塩基対離れて配置される。ある特定の実施形態では、相乗的ＴＦ組成物の機能ドメインは、それらが互いに約１～約８０（もしくはその間の任意の値）、約１６０～約２２０（もしくはその間の任意の値）、約２６０～約４００（もしくはその間の任意の値）、または約５００～約６００（もしくはその間の任意の値）塩基対離れるように配置される。例えば、図４、図１１、図１３、および図１５を参照されたい。
本明細書に記載の相乗的組成物は、限定されるものではないが、コード配列および隣接または遠位制御エレメント（例えば、エンハンサー、プロモーターなど）を含む、標的遺伝子中のどこにでもある標的部位に結合することができる。ある特定の態様では、組成物のＴＦは、転写開始部位（ＴＳＳ）のいずれかの側の０～６００塩基対（またはその間の任意の値）以内にある標的部位に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＦは、ＴＳＳと、ＴＳＳの＋２００（またはその間の任意の値）との間にある標的部位に結合する。例えば、図４、図１１、図１３、および図１５を参照されたい。
さらに、本明細書に記載の組成物の２つ以上のＴＦは、標的部位（例えば、内因性遺伝子）の同じ、および／または異なる鎖に結合することができる。ある特定の実施形態では、相乗的組成物は、同じアンチセンス（－）またはセンス（＋）鎖に結合するＴＦを含む。他の実施形態では、相乗的組成物は、異なる鎖（＋／－、いずれかの配向）に結合するＴＦを含む。例えば、図４、図１１、図１３、および図１５を参照されたい。
ＤＮＡ結合ドメイン
任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰもしくはＴＡＬＥ）またはＤＮＡ結合ポリヌクレオチド（例えば、単一ガイドＲＮＡ）を、本明細書に開示される組成物および方法において使用することができる。遺伝子モジュレーターのＤＮＡ結合ドメインを、疾患または障害において異常に発現される１つまたは複数の遺伝子などの、目的の任意の遺伝子に標的化することができる。ＤＮＡ結合ドメインによって認識される２つ以上の標的部位は、重複していても、または重複していなくてもよい。２つのＤＮＡ結合ドメインのための標的部位は、最大で約６００塩基対以上隔てられていてもよく、標的遺伝子の転写開始部位（いずれかの側の）から最大で３００塩基対以上であってもよい。さらに、内因性ゲノムなどの二本鎖ＤＮＡを標的化する場合、人工転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、同じか、または異なる鎖を（１つもしくは複数がプラス鎖を、および／または１つもしくは複数がマイナス鎖を）標的としてもよい。さらに、同じか、または異なるＤＮＡ結合ドメインを、本発明の遺伝子モジュレーター中で使用することができる。かくして、任意の遺伝子の遺伝子モジュレーター（リプレッサー）が記載される。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質を含む。標的部位の選択；ＺＦＰならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者には公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；第５，７８９，５３８号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；ならびに国際特許出願公開ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６；およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つの亜鉛フィンガーを含むが、複数の亜鉛フィンガー（例えば、２、３、４、５、６個以上のフィンガー）を含んでもよい。通常、ＺＦＰは、少なくとも３個のフィンガーを含む。ある特定のＺＦＰは、４、５または６個のフィンガーを含むが、一部のＺＦＰは、８、９、１０、１１、または１２個以上のフィンガーを含む。３個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、１２～１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識するが、６個のフィンガーを有するＺＦＰは、１８～２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰはまた、１つまたは複数の機能（調節）ドメインを含む融合タンパク質であってもよく、そのドメインは、転写活性化もしくは抑制ドメインまたはＤＮＭＴドメインなどの他のドメインであってもよい。少なくとも１つの調節（機能）ドメインに融合されたＤＮＡ結合ドメインは、「ＺＦＰ－ＴＦ」構造と考えてよい。
操作された亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新しい結合特異性を有してもよい。操作方法としては、限定されるものではないが、合理的設計および様々な型の選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、それぞれの３つ組または４つ組のヌクレオチド配列が、特定の３つ組または４つ組の配列に結合する亜鉛フィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と関連する、３つ組（または４つ組）のヌクレオチド配列および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、共同所有された米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号、ならびに第８，７７２，４５３号を参照されたい。
さらに、これらの、および他の参考文献に開示されたように、亜鉛フィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー亜鉛フィンガータンパク質を、例えば、長さ５アミノ酸以上のリンカーなどの任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。また、長さ６アミノ酸以上の例示的リンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガー間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。
ＺＦＰを、１つまたは複数の転写調節（例えば、抑制ドメイン）に作動可能に結合（連結）して、ＺＦＰ－ＴＦ（例えば、リプレッサー）を形成させることができる。また、方法および組成物を使用して、例えば、米国特許出願公開第２０１８００８７０７２号に記載されたＺＦＰ骨格に対する突然変異によって、オフターゲット部位として知られる、他の意図しない切断部位と比較してその意図される標的に対するＺＦＰの特異性を増大させることもできる。かくして、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターは、１つもしくは複数のそのＤＮＡ結合ドメイン骨格領域中に突然変異および／またはその転写調節ドメイン中に１つもしくは複数の突然変異を含んでもよい。これらのＺＦＰは、ＤＮＡ骨格上のリン酸と非特異的に相互作用することができるＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン（「ＺＦＰ骨格」）内のアミノ酸に対する突然変異を含んでもよいが、それらはＤＮＡ認識ヘリックス中に変化を含まない。かくして、本発明は、ヌクレオチド標的特異性にとって必要とされないＺＦＰ骨格中に陽イオン性アミノ酸残基の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格中のこれらの突然変異は、陽イオン性アミノ酸残基を、中性または陰イオン性アミノ酸残基に突然変異させることを含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格中のこれらの突然変異は、極性アミノ酸残基を、中性または非極性アミノ酸残基に突然変異させることを含む。好ましい実施形態では、突然変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して位置（－５）、（－９）および／または位置（－１４）で導入される。一部の実施形態では、亜鉛フィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）に１つまたは複数の突然変異を含んでもよい。さらなる実施形態では、マルチフィンガー亜鉛フィンガータンパク質中の１つまたは複数の亜鉛フィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）に突然変異を含んでもよい。一部の実施形態では、（－５）、（－９）および／または（－１４）でのアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）に突然変異される。
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来してもよい。例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩなどの、エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼをホーミングする認識配列が公知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388；Dujon et al., (1989) Gene 82:115-118；Perler et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127；Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228；Gimble et al., (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180；Argast et al., (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびNew England Biolabs catalogueも参照されたい。さらに、エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼをホーミングするＤＮＡ結合特異性を、非天然標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Chevalier et al., (2002) Molec. Cell 10:895-905；Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962；Ashworth et al., (2006) Nature 441:656-659；Paques et al., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８を参照されたい。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するか、または操作された（天然には存在しない）ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質は、米国特許出願公開第２０１８０１５３９２１号に示されたタウ標的部位の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続するヌクレオチドに結合する。タウ標的部位に結合するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質のＲＶＤは、天然に存在する、または天然には存在しないＲＶＤであってもよい。米国特許第８，５８６，５２６号および第９，４５８，２０５号を参照されたい。
キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原性細菌は、重要作物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。キサントモナスの病原性は、植物細胞中に２５種を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらのうち、注入されるタンパク質は、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）である（Kay et al., (2007) Science 318:648-651を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインと、転写活性化ドメインとを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥの１つは、キサントモナス・カンペストグリスｐｖ．ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ． Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）に由来するＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al., (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136およびＷＯ２０１００７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬＥは、それぞれのリピートがこれらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となる約３４個のアミノ酸を含有する、タンデムリピートの中央ドメインを含有する。さらに、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Schornack S, et al., (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272を参照されたい）。さらに、病原性細菌ラルストニア・ソラナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と命名された２つの遺伝子は、ラルストニア・ソラナセアルム次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００におけるキサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出された（Heuer et al., (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384を参照されたい）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメイン中に１，５７５ｂｐの欠失がある点が異なる。しかしながら、両遺伝子産物とも、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質との４０％未満の配列同一性を有する。
これらのＴＡＬＥの特異性は、タンデムリピート中に見出される配列に依存する。反復配列は、約１０２ｂｐを含み、リピートは典型的には、互いに９１～１００％相同である（Bonas et al., ibid）。リピートの多型性は通常、１２および１３位に位置し、１２および１３位の超可変性２残基のアイデンティティーと、ＴＡＬＥの標的配列中の連続するヌクレオチドのアイデンティティーとの間には、１体１の対応があると考えられる（Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501およびBoch et al., (2009) Science 326:1509-1512を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識のためのコードが決定され、１２および１３位のＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに、ＮＮがＡまたはＧに、ＮＧがＴに結合するという具合であった。これらのＤＮＡ結合リピートは、リピートの新しい組合せおよび数を有するタンパク質にアセンブリーされて、新しい配列と相互作用することができる人工転写因子が作製された。さらに、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号および米国特許出願公開第２０１３／０１９６３７３号は、Ｎキャップポリペプチド、Ｃキャップポリペプチド（例えば、＋６３、＋２３１もしくは＋２７８）および／または新規（非定型）ＲＶＤを有するＴＡＬＥを記載している。
例示的なＴＡＬＥは、その全体が参照により組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号および第９，４５８，２０５号に記載されている。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、二量体化および／または多量体化ドメイン、例えば、コイルドコイル（ＣＣ）および二量体化亜鉛フィンガー（ＤＺ）を含む。米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号を参照されたい。
さらなる実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡ、例えば、第２０１５００５６７０５号に開示されたｓｇＲＮＡを含む。
真核生物ＲＮＡｉ経路と似ていると仮説を立てられた古細菌および多くの細菌におけるＲＮＡ媒介性ゲノム防御経路の存在に関する説得力のある証拠が最近明らかになった（概説については、Godde and Bickerton, 2006. J. Mol. Evol. 62: 718-729；Lillestol et al., 2006. Archaea 2: 59-72；Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7.；Sorek et al., 2008. Nat. Rev. Microbiol. 6: 181-186を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または原核生物ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）として知られる経路は、２つの進化的に、そしてしばしば、物理的に連鎖した遺伝子座：系のＲＮＡ成分をコードする、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードする、ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座から生じると提唱されている（Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575；Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496；Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7；Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60）。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。個々のＣａｓタンパク質は、真核生物ＲＮＡｉ機構のタンパク質成分との有意な配列類似性を共有しないが、類似する予測された機能を有する（例えば、ＲＮＡ結合、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼなど）（Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7）。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲリピート－スペーサーアレイと関連していることが多い。４０種を超える異なるＣａｓタンパク質ファミリーが記載されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Ｃａｓ１は異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系間に遍在すると考えられる。ｃａｓ遺伝子の特定の組合せおよびリピート構造を使用して、８つのＣＲＩＳＰＲサブタイプが定義されたが（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｙ．ｐｅｓｔ、Ｎ．ｍｅｎｉ、Ｄ．ｖｕｌｇ、Ｔ．ｎｅａｐ、Ｈ．ｍａｒｉ、Ａ．ｐｅｒｎ、およびＭ．ｔｕｂｅ）、これらのいくつかはリピート関連ミステリアスタンパク質（ＲＡＭＰ）をコードするさらなる遺伝子モジュールと関連している。１つより多いＣＲＩＳＰＲサブタイプが、単一のゲノム中に存在し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプの散在的分布は、系が微生物進化中に水平遺伝子導入にかけられることを示唆している。
最初はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに記載されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの連続工程において標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実行する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレ－ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレ－ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、プレ－ｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介し、そこで、プロセシングはＣａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖特異的ＲＮａｓｅＩＩＩによって起こる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識のためのさらなる要件である、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間でのワトソン・クリック塩基対形成によって、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに指向させる。さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡもまた、それがその３’末端でｃｒＲＮＡと塩基対を形成し、この結合がＣａｓ９活性を誘発するので、存在していなければならない。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を生成する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つの工程：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおいて、将来の攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイへの外来ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、次いで、（ｉｉｉ）ＲＮＡにより媒介性される外来核酸の阻害を含む。かくして、細菌細胞中では、いくつかのいわゆる「Ｃａｓ」タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与している。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、多くの様々な細菌に見出されている。Fonfara et al., ((2013) Nuc Acid Res 42(4):2377-2590)による公共利用可能なゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索により、３４７種の細菌中にＣａｓ９オルトログが発見された。さらに、このグループは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａおよびＦ．ｎｏｖｉｃｉｄａに由来するＣａｓ９オルトログを使用して、ＤＮＡ標的のインビトロでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断を証明した。かくして、用語「Ｃａｓ９」とは、Ｃａｓ９をコードする遺伝子が任意の好適な細菌に由来するものであってもよい、ＤＮＡ結合ドメインと、２つのヌクレアーゼドメインとを含むＲＮＡ依存性ＤＮＡヌクレアーゼを指す。
Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有する：一方のヌクレアーゼドメインはＨＮＨエンドヌクレアーゼと類似するが、他方はＲｕｖエンドヌクレアーゼドメインと類似する。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡと相補的であるＤＮＡ鎖を切断するが、Ｒｕｖドメインは、非相補鎖の切断を担うと考えられる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ただ１つのヌクレアーゼドメインが機能的であり、Ｃａｓニッカーゼを作出するように操作することができる（Jinek et al., (2012) Science 337:816を参照されたい）。酵素の触媒ドメイン中のアミノ酸の特異的突然変異によって、またはそれが最早機能的でなくなるようなドメインの一部もしくは全部のトランケーションによって、ニッカーゼを生成することができる。Ｃａｓ９は２つのヌクレアーゼドメインを含むため、この手法はいずれかのドメイン上で行ってもよい。二本鎖切断を、２つのそのようなＣａｓ９ニッカーゼの使用によって標的ＤＮＡ中で達成することができる。ニッカーゼは、ＤＮＡの１つの鎖をそれぞれ切断し、２つの使用は二本鎖切断を生成するであろう。
ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の要件を、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む操作された「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避することができる（Jinek et al., ibid およびCong et al., (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓに結合したＲＮＡと、標的ＤＮＡとの間で形成される場合、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物、またはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９を誘導して、標的ＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９タンパク質と、ＰＡＭ配列を含有する操作されたｓｇＲＮＡとを含むこの系は、ＲＮＡ依存性ゲノム編集のために使用されてきたが（Ramalingam et al., Stem Cells and Development 22(4):595-610 (2013)を参照されたい）、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様の編集効率で、インビボでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集にとって有用であった（Hwang et al., (2013) Nature Biotechnology 31 (3):227）。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の主要産物は、インベーダー標的配列を含有する短いＲＮＡであると考えられ、経路におけるその仮説的役割に基づいて、ガイドＲＮＡまたは原核生物サイレンシングＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ）と呼ばれる（Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7；Hale et al., 2008. RNA, 14: 2572-2579）。ＲＮＡ分析により、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座転写物が反復配列内で切断されて、個々のインベーダー標的配列およびフランキングするリピート断片を含有する約６０～７０ｎｔのＲＮＡ中間体を遊離することが示される（Tang et al., 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 7536-7541；Tang et al., 2005. Mol. Microbiol. 55: 469-481；Lillestol et al., 2006. Archaea 2: 59-72；Brouns et al., 2008. Science 321: 960-964；Hale et al., 2008. RNA, 14: 2572-2579）。古細菌ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）では、これらの中間体ＲＮＡは、豊富な、安定した約３５～４５ｎｔの成熟ｐｓｉＲＮＡにさらにプロセシングされる（Hale et al., 2008. RNA, 14: 2572-2579）。
ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の要件を、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む操作された「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避することができる（Jinek et al., (2012) Science 337:816およびCong et al., (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓに結合したＲＮＡと、標的ＤＮＡとの間で形成される場合、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物、またはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９を誘導して、標的ＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９タンパク質と、ＰＡＭ配列を含有する操作されたｓｇＲＮＡとを含むこの系は、ＲＮＡ依存性ゲノム編集のために使用されてきたが（Ramalingam, ibidを参照されたい）、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様の編集効率で、インビボでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集にとって有用であった（Hwang et al., (2013) Nature Biotechnology 31 (3):227を参照されたい）。
キメラまたはｓｇＲＮＡを、任意の所望の標的と相補的な配列を含むように操作することができる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上、またはそれより長い。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満、またはそれより短い。ある特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１８０１５３９２１号に示されたタウ標的部位の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続するヌクレオチドに結合する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用するために、形態Ｇ［ｎ１９］の標的、次いで、形態ＮＧＧまたはＮＡＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に対する２２塩基の相補性を含む。かくして、１つの方法では、ｓｇＲＮＡを、（ｉ）ＺＦＮヘテロ二量体の認識配列と、関連ゲノム（ヒト、マウス、または特定の植物種）の参照配列とを整列させること；（ｉｉ）ＺＦＮ半部位間のスペーサー領域を同定すること；（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近いモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの位置を同定すること（１つを超えるそのようなモチーフがスペーサーと重複する場合、スペーサーに対して中心にあるモチーフが選択される）；（ｉｖ）ｓｇＲＮＡのコアとしてそのモチーフを使用することによって、目的の遺伝子中の公知のＺＦＮ標的の利用によって設計することができる。この方法は、有利には、証明されたヌクレアーゼ標的に依拠する。あるいは、単にＧ［ｎ２０］ＧＧ式に従う好適な標的配列を同定することによって、目的の任意の領域を標的とするように、ｓｇＲＮＡを設計することができる。相補性領域と共に、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分の尾部領域に及ぶ追加のヌクレオチドを含んでもよい（Hsu et al., (2013) Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647を参照されたい）。尾部は、＋６８～＋８５ヌクレオチド、またはその間の任意の数のものであってもよいが、好ましい長さは、＋８５ヌクレオチドである。トランケートされたｓｇＲＮＡ、「ｔｒｕ－ｇＲＮＡ」を使用することもできる（Fu et al., (2014) Nature Biotech 32(3): 279を参照されたい）。ｔｒｕ－ｇＲＮＡでは、相補性領域は、１７または１８ヌクレオチド長に減少する。
さらに、ＰＡＭ配列が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９を使用するＮＧＧ（Hsu 2013, ibid）の代替手段としてのＮＡＧであってもよい、代替的なＰＡＭ配列を使用することもできる。さらなるＰＡＭ配列はまた、初期のＧを欠くものを含んでもよい（Sander and Joung (2014) Nature Biotech 32(4):347）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓによりコードされるＣａｓ９ ＰＡＭ配列に加えて、他の細菌源に由来するＣａｓ９タンパク質に特異的な他のＰＡＭ配列を使用することができる。例えば、以下に示されるＰＡＭ配列（Sander and Joung, ibid, and Esvelt et al., (2013) Nat Meth 10(11):1116から適合させた）は、これらのＣａｓ９タンパク質に特異的である：
種 ＰＡＭ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＮＧＧ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＮＡＧ
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＮＧＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＧＧＮＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＡＡＡＷ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＡＧＡＡ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＮＧＡＴＴ
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＮＮＮＡＣＡ
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ ＮＮＮＧＡＴＴ
Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＧＮＮＮＣＮＮＡ
Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ ＮＧ
かくして、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用するための好適な標的配列を、以下のガイドラインに従って選択することができる：［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、またはｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇ。あるいは、ＰＡＭ配列は、ガイドラインＧ［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、ｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従ってもよい。非Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌に由来するＣａｓ９タンパク質については、代替的なＰＡＭがＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＰＡＭ配列に置換される同じガイドラインを使用することができる。
最も好ましいのは、潜在的なオフターゲット配列を回避する特異性の可能性が最も高い標的配列を選択することである。以下の属性：ｉ）使用されるＣａｓ９タンパク質との、機能することが知られるＰＡＭ配列が後ろにある標的配列における類似性；ｉｉ）所望の標的配列から３個より少ないミスマッチを有する類似する標的配列；ｉｉｉ）ミスマッチが全て、ＰＡＭ近位領域よりもむしろＰＡＭ遠位領域に位置する（「シード」領域（Wu et al., (2014) Nature Biotech doi:10.1038/nbt2889）と呼ばれることもある、ＰＡＭにすぐ隣接する、または近いヌクレオチド１～５が、認識にとって最も重要であり、したがって、シード領域中に位置するミスマッチを有する推定オフターゲット部位は、少なくともｓｇＲＮＡによって認識される可能性があることを示すいくつかの証拠がある）、ｉｉ）と類似する標的配列；およびｉｖ）ミスマッチが連続した間隔を有さないか、または４ヌクレオチドを超える間隔を有する、類似する標的配列（Hsu 2014, ibid）を考慮することによって、これらの望ましくないオフターゲット配列を同定することができる。かくして、上記のこれらの基準を使用して、用いられるどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系についてもゲノム中の潜在的なオフターゲット部位の数の分析を実施することによって、ｓｇＲＮＡのための好適な標的配列を同定することができる。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系が使用される。フランシセラ種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ）において同定された、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系は、ヒト細胞中でロバストなＤＮＡ干渉を媒介するクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。機能的に保存されているが、Ｃｐｆ１とＣａｓ９は、そのガイドＲＮＡおよび基質特異性などの多くの態様において異なる（Fagerlund et al. (2015) Genom Bio 16:251を参照されたい）。Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との大きな差異は、Ｃｐｆ１がｔｒａｃｒＲＮＡを使用せず、かくして、ｃｒＲＮＡのみを必要とするということである。ＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、４２～４４ヌクレオチド長（１９ヌクレオチドのリピートおよび２３～２５ヌクレオチドのスペーサー）であり、二次構造を保持する配列変化を許容する、単一のステムループを含有する。さらに、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９によって必要とされる約１００ヌクレオチドの操作されたｓｇＲＮＡよりも有意に短く、ＦｎＣｐｆ１に関するＰＡＭの要件は、置換された鎖上の５’－ＴＴＮ－３’および５’－ＣＴＡ－３’である。Ｃａｓ９とＣｐｆ１は両方とも標的ＤＮＡ中に二本鎖切断を生成するが、Ｃａｓ９はそのＲｕｖＣおよびＨＮＨ様ドメインを使用して、ガイドＲＮＡのシード配列内に平滑末端の切断を生成する一方、Ｃｐｆ１はＲｕｖＣ様ドメインを使用して、シードの外側に互い違いの切断をもたらす。Ｃｐｆ１は重要なシード領域から離れて互い違いの切断を生成するため、ＮＨＥＪは標的部位を破壊せず、したがって、Ｃｐｆ１が、所望のＨＤＲ組換え事象が起こるまで同じ部位を切断し続けることができることを確保する。かくして、本明細書に記載の方法および組成物では、用語「Ｃａｓ」は、Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との両方を含むことが理解される。かくして、本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の両方を指し、ヌクレアーゼ、ニッカーゼおよび／または転写因子系の両方を含む。
一部の実施形態では、他のＣａｓタンパク質を使用することができる。一部の例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても知られる）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａとしても知られる）、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、ＣａｓＸおよびＣａｓＹが挙げられ；操作された、および天然のその変異体（Burstein et al. (2017) Nature 542:237-241）、例えば、ＨＦ１／ｓｐＣａｓ９（Kleinstiver et al. (2016) Nature 529: 490-495；Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm Genome (2017) 28(7):247-261）；スプリットＣａｓ９系（Zetsche et al. (2015) Nat Biotechnol 33(2):139-142）、インテイン－エクステイン系に基づくｔｒａｎｓスプライシングされたＣａｓ９（Troung et al. (2015) Nucl Acid Res 43(13):6450-8）；ミニ－ＳａＣａｓ９（Ma et al. (2018) ACS Synth Biol 7(4):978-985）が挙げられる。かくして、本明細書に記載の方法および組成物において、用語「Ｃａｓ」は、天然のものと、操作されたものの両方の、全てのＣａｓ変異体タンパク質を含むことが理解される。かくして、本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」とは、ヌクレアーゼ、ニッカーゼおよび／または転写因子系の両方を含む、任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を指す。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと定性的生物特性を共有する化合物である。「機能的誘導体」としては、限定されるものではないが、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が挙げられるが、但し、それらは対応する天然配列ポリペプチドと生物活性を共有する。本明細書で企図される生物活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有的改変体、およびその融合物の両方を包含する。一部の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の単一の生物特性を含んでもよい。他の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の生物特性のサブセットを含んでもよい。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体としては、限定されるものではないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合物、共有的改変体が挙げられる。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から得られるか、または化学的に合成されるか、またはこれらの２つの手順の組合せによって得られるものであってよい。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生する、もしくは内因性Ｃａｓと同じか、もしくは異なるＣａｓをコードする、外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。一部の場合、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
特定の遺伝子（セーフハーバー遺伝子を含む）に標的化される例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号に開示されている。
かくして、ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断するヌクレアーゼドメインと共に、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望ましい任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。
機能ドメイン
ＤＮＡ結合ドメインを、１つまたは複数の機能ドメインに融合するか、またはそうでなければそれと結合して、本明細書に記載の人工転写因子を形成させることができる。ある特定の実施形態では、方法は、少なくとも１つのＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたは単一ガイドＲＮＡ）と、異種調節（機能）ドメイン（またはその機能的断片）とを含む融合分子を用いる。
ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターの人工転写因子の機能ドメインは、転写調節ドメインを含む。一般的なドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、がん遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素ならびにその関連する因子および修飾因子；ＤＮＡ再配列酵素ならびにその関連する因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびその修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、例えば、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌなど、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼなど）ならびにその関連する因子および修飾因子が挙げられる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号を参照されたい。
活性化を達成するための好適なドメインとしては、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1997)を参照されたい）、核ホルモン受容体（例えば、Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998)を参照されたい）；核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Bitko & Barik, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) およびDoyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)）；Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)）、またはＶＰ６４（Beerli et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33）などの人工キメラ機能ドメイン、およびデグロン（Molinari et al., (1999) EMBO J. 18, 6439-6447）が挙げられる。さらなる例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ－２、およびＣＴＦ１（Seipel et al., EMBO J. 11, 4961-4968 (1992)）ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ－２が挙げられる。例えば、Robyr et al., (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347；Collingwood et al., (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275；Leo et al., (2000) Gene 245:1-11；Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89；McKenna et al., (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12；Malik et al., (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283；およびLemon et al., (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504を参照されたい。さらなる例示的な活性化ドメインとしては、限定されるものではないが、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、－６、－７、および－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が挙げられる。例えば、Ogawa et al., (2000) Gene 245:21-29；Okanami et al., (1996) Genes Cells 1:87-99；Goff et al., (1991) Genes Dev. 5:298-309；Cho et al., (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429；Ulmason et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849；Sprenger-Haussels et al., (2000) Plant J. 22:1-8；Gong et al., (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44；およびHobo et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353を参照されたい。
遺伝子リプレッサーを作製するために使用することができる例示的な抑制ドメインとしては、限定されるものではないが、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌなど）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。例えば、Bird et al., (1999) Cell 99:451-454；Tyler et al., (1999) Cell 99:443-446；Knoepfler et al., (1999) Cell 99:447-450；およびRobertson et al., (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照されたい。さらなる例示的な抑制ドメインとしては、限定されるものではないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば、Chem et al., (1996) Plant Cell 8:305-321；およびWu et al., (2000) Plant J. 22:19-27を参照されたい。
一部の例では、ドメインは、染色体のエピジェネティック調節に関与する。一部の実施形態では、ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、例えば、ＭＹＳＴファミリーメンバーＭＯＺ、Ｙｂｆ２／Ｓａｓ３、ＭＯＦ、およびＴｉｐ６０、ＧＮＡＴファミリーメンバーＧｃｎ５またはｐＣＡＦ、ｐ３００ファミリーメンバーＣＢＰ、ｐ３００またはＲｔｔ１０９などの、Ａ型核局在化ドメインである（Berndsen and Denu (2008) Curr Opin Struct Biol 18(6):682-689）。他の例では、ドメインは、クラスＩ（ＨＤＡＣ－１、２、３、および８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣ ＩＩＡ（ＨＤＡＣ－４、５、７および９）、ＨＤＡＣ ＩＩＢ（ＨＤＡＣ６および１０））、クラスＩＶ（ＨＤＡＣ－１１）、クラスＩＩＩ（サーチュイン（ＳＩＲＴ）としても知られる；ＳＩＲＴ１～７）などのヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）である（Mottamal et al., (2015) Molecules 20(3):3898-3941を参照されたい）。一部の実施形態において使用される別のドメインは、ヒストンホスホリラーゼまたはキナーゼであり、その例としては、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＤＮＡ－ＰＫ、Ｂｕｂ１、ＶｐｒＢＰ、ＩＫＫ－α、ＰＫＣβ１、Ｄｉｋ／Ｚｉｐ、ＪＡＫ２、ＰＫＣ５、ＷＳＴＦおよびＣＫ２が挙げられる。一部の実施形態では、メチル化ドメインが使用され、Ｅｚｈ２、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲＭＴ２／６、ＣＡＲＭ１、ｓｅｔ７／９、ＭＬＬ、ＡＬＬ－１、Ｓｕｖ３９ｈ、Ｇ９ａ、ＳＥＴＤＢ１、Ｅｚｈ２、Ｓｅｔ２、Ｄｏｔ１、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲ－Ｓｅｔ７およびＳｕｖ４－２０ｈなどの群から選択することができる。一部の実施形態では、ＳＵＭＯ化およびビオチン化に関与するドメイン（Ｌｙｓ９、１３、４、１８および１２）を使用することもできる（概説については、Kousarides (2007) Cell 128:693-705を参照されたい）。
融合分子は、当業者には周知のクローニングおよび生化学的コンジュゲーションの方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインと、機能ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）とを含む。融合分子はまた、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０ミディアムＴ抗原に由来するものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよびヘマグルチニンなど）を含んでもよい。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、転写の読み枠が融合物の成分間で保存されるように設計される。
一方では機能ドメインのポリペプチド成分（またはその機能的断片）と、他方では非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、挿入剤、副溝結合剤、核酸）との融合物は、当業者には公知の生化学的コンジュゲーションの方法によって構築される。例えば、Pierce Chemical Company (Rockford, IL) Catalogueを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの融合物を作製する方法および組成物が記載されている。Mapp et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935。同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦおよびポリペプチド成分機能ドメインと結合した、ｓｇＲＮＡ核酸成分を含むヌクレアーゼも、当業者には公知であり、本明細書に詳述される。
融合分子を、当業者には公知のように、薬学的に許容される担体と共に製剤化することができる。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985；および共同所有された国際特許出願公開ＷＯ００／４２２１９を参照されたい。
融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合したら、遺伝子の転写に影響することができる様々な異なる成分のいずれかから、融合分子の機能成分／ドメインを選択することができる。したがって、機能成分は、限定されるものではないが、活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、およびサイレンサーなどの様々な転写因子ドメインを含んでもよい。
ある特定の実施形態では、融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインと、ヌクレアーゼドメインとを含み、その操作された（ＺＦＰもしくはＴＡＬＥもしくはｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図される核酸標的を認識することができる機能的実体を作出する、またはヌクレアーゼ活性によりＤＮＡ結合部位の近くでのＤＮＡの切断を引き起こすヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼもしくはＴＡＬＥヌクレアーゼもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）を作出する。この切断は、タウ遺伝子の不活化（抑制）をもたらす。かくして、遺伝子リプレッサーは、ヌクレアーゼも含む。
かくして、本明細書に記載の方法および組成物は、広く適用可能であり、目的の任意のヌクレアーゼを含んでもよい。ヌクレアーゼの非限定例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよび亜鉛フィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬＥＮ；異種切断ドメインを含むメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインと結合したｓｇＲＮＡ）を含んでもよく、またはあるいは、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、選択された標的部位に結合するように変更することができる（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）。
ヌクレアーゼドメインは、任意のヌクレアーゼ、例えば、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼに由来してもよい。本明細書に記載のＤＮＡ結合ドメインに融合することができる好適なヌクレアーゼ（切断）ドメインの非限定例としては、任意の制限酵素、例えば、ＩＩＳ型制限酵素（例えば、ＦｏｋＩ）に由来するドメインが挙げられる。ある特定の実施形態では、切断ドメインは、切断活性にとって二量体化を必要とする切断ハーフドメインである。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号、第８，４０９，８６１号および第７，８８８，１２１号を参照されたい。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断のためには２つの融合タンパク質が必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来するものであってよく、またはそれぞれの切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来するものであってもよい。さらに、２つの融合タンパク質の、その対応する標的部位への結合が、切断ハーフドメインを、例えば、二量体化によって、切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成できる互いの空間的配向に置くように、２つの融合タンパク質のための標的部位が互いに関して配置されるのが好ましい。
ヌクレアーゼドメインはまた、任意のメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ドメインに由来してもよいが、切断活性を、限定されるものではないが、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩなどの本明細書に記載のヌクレアーゼと共に使用することもできる。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらのものは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを、ＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する一本鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ領域によって局在化されるニッカーゼとして作用することができるか、またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがメガヌクレアーゼ（例えば、ＴｅｖＩ）ヌクレアーゼドメインに関して位置する場所に応じて、二本鎖切断を生成することができる（Beurdeley et al., (2013) Nat Comm: 1-8 DOI: 10.1038/ncomms2782を参照されたい）。
他の実施形態では、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、メガヌクレアーゼ切断ドメインとを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない（See Boissel et al., (2013) Nucl Acid Res: 1-13, doi: 10.1093/nar/gkt1224）。
さらに、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインも、ＤＮＡ結合機能を示してもよい。任意のＴＡＬＥＮを、さらなるＴＡＬＥＮ（例えば、１つもしくは複数のメガ－ＴＡＬと共に１つもしくは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮもしくはＦｏｋＩ－ＴＡＬＥＮ））および／またはＺＦＮと共に使用することができる。
さらに、切断ドメインは、例えば、オフターゲット切断効果を低減させるか、または除去する必須のヘテロ二量体の形成のために、野生型と比較して１つまたは複数の変更を含んでもよい。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号、第８，０３４，５９８号、および第８，６２３，６１８号を参照されたい。
本明細書に記載のヌクレアーゼは、二本鎖標的（例えば、遺伝子）中に二本鎖または一本鎖切断を生成してもよい。一本鎖切断（「ニック」）の生成は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７０３，４８９号および第９，２００，２６６号に記載されており、１つのヌクレアーゼドメインの触媒ドメインの突然変異がどのようにニッカーゼをもたらすかを記載している。
かくして、ヌクレアーゼ（切断）ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して、機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってもよい。
あるいは、ヌクレアーゼを、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して、核酸標的部位でインビボで集合させることができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／００６８１６４号を参照されたい）。そのようなスプリット酵素の成分を、別々の発現コンストラクト上で発現させるか、または個々の成分が、例えば、自己切断性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離された１つのオープンリーディングフレーム中で連結することができる。成分は、個々の亜鉛フィンガードメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。
ヌクレアーゼを、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１１１１９号に記載された酵母に基づく染色体系において、使用前に活性についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現コンストラクトを、当業界で公知の方法を使用して容易に設計することができる。
融合タンパク質（またはその成分）の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（脱抑制）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあってもよい。好ましいプロモーターの非限定例としては、神経特異的プロモーターＮＳＥ、ＣＭＶ、シナプシン、ＣＡＭＫｉｉａおよびＭＥＣＰが挙げられる。遍在性プロモーターの非限定例としては、ＣＡＳおよびＵｂｃが挙げられる。さらなる実施形態は、米国特許出願公開第２０１５／０２６７２０５号に記載された自己調節性プロモーターの使用（ＤＮＡ結合ドメインのための高親和性結合部位の含有による）を含む。
デリバリー
タンパク質および／またはポリヌクレオチド（例えば、遺伝子モジュレーター）ならびに本明細書に記載のタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物を、例えば、ｍＲＮＡによるタンパク質の注入および／または発現コンストラクト（例えば、プラスミド、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、Ａｄベクターなど）の使用などの、任意の好適な手段によって、標的細胞に送達することができる。好ましい実施形態では、リプレッサーは、限定されるものではないが、ＡＡＶ２／６またはＡＡＶ２／９（米国特許第７，１９８，９５１号を参照されたい）、米国特許第９，５８５，９７１号に記載のＡＡＶベクターなどの、ＡＡＶベクターを使用して送達される。
本明細書に記載の亜鉛フィンガータンパク質を含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５０３，７１７号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，６０７，８８２号；第６，６８９，５５８号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号に記載されており、それらの全ての開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
限定されるものではないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどの任意のベクター系を使用することができる。また、その全体が参照により組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号；第６，５３４，２６１号；第６，６０７，８８２号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターはいずれも、１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質コード配列を含んでもよいと考えられる。かくして、１つまたは複数のモジュレーター（例えば、リプレッサー）が細胞中に導入される場合、タンパク質成分および／またはポリヌクレオチド成分をコードする配列は、同じベクターまたは異なるベクター上で運ばれ得る。複数のベクターを使用する場合、それぞれのベクターは、１つもしくは複数のモジュレーター（例えば、リプレッサー）またはその成分をコードする配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ベクター系は、ＡＡＶベクター、例えば、米国特許第９，５８５，９７１号または米国特許出願公開第２０１７０１１９９０６号に記載されたＡＡＶ６またはＡＡＶ９またはＡＡＶ変異体である。
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入法を使用して、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織中に操作されたモジュレーターをコードする核酸を導入することができる。そのような方法を使用して、そのようなリプレッサー（またはその成分）をコードする核酸をインビトロで細胞に投与することもできる。ある特定の実施形態では、リプレッサーをコードする核酸は、インビボまたはエクスビボでの遺伝子療法における使用のために投与される。非ウイルスベクターデリバリー系としては、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどのデリバリー媒体と複合体化した核酸が挙げられる。ウイルスベクターデリバリー系は、細胞へのデリバリー後に、エピソーム性ゲノムまたは組み込まれたゲノムを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含んでもよい。遺伝子療法手順の概説については、Anderson, Science 256:808-813 (1992)；Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993)；Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993)；Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993)；Miller, Nature 357:455-460 (1992)；Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988)；Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995)；Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995)；Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm (eds.) (1995)；およびYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照されたい。
核酸の非ウイルスデリバリーの方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、微量注射、ビオリスティクス、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強性取込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００系（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションを、核酸のデリバリーのために使用することもできる。好ましい実施形態では、１つまたは複数の核酸を、ｍＲＮＡとして送達する。また、翻訳効率および／またはｍＲＮＡの安定性を増大させるためには、キャップ付ｍＲＮＡの使用が好ましい。特に好ましいのは、ＡＲＣＡ（抗リバースキャップアナログ）キャップまたはその変異体である。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照されたい。
さらなる例示的な核酸デリバリー系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；第４，９４６，７８７号；および第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）である。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションにとって好適である陽イオン脂質および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒの国際特許出願公開ＷＯ９１／１７４２４およびＷＯ９１／１６０２４に記載のものが挙げられる。デリバリーは、細胞（エクスビボでの投与）または標的組織（インビボでの投与）に対するものであってよい。
イムノリピド複合体などの標的リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者には周知である（例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995)；Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995)；Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)；Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994)；Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995)；Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)；米国特許第４，１８６，１８３号；第４，２１７，３４４号；第４，２３５，８７１号；第４，２６１，９７５号；第４，４８５，０５４号；第４，５０１，７２８号；第４，７７４，０８５号；第４，８３７，０２８号；および第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
さらなるデリバリー方法としては、ＥｎＧｅｎｅＩＣデリバリー媒体（ＥＤＶ）中に送達される核酸のパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方のアームがＥＤＶに対する特異性を有する、二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に持って行った後、ＥＤＶはエンドサイトーシスによって細胞中に持って行かれる。細胞に入ったら、その内容物が放出される（MacDiarmid et al., (2009) Nature Biotechnology 27(7):643を参照されたい）。
操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸のデリバリーのためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターを患者に直接投与することができる（インビボ）か、またはそれらを使用してインビトロで細胞を処理し、改変された細胞を患者に投与することができる（エクスビボ）。ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のデリバリーのための従来のウイルスに基づく系としては、限定されるものではないが、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノム中への組込みは、挿入される導入遺伝子の長期的発現をもたらすことが多い、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法を用いて行うことができる。さらに、高い形質導入効率は、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されてきた。
外来エンベロープタンパク質を組み込むこと、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって、レトロウイルスの指向性を変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的には、高いウイルス力価をもたらすことができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大で６～１０ｋｂの外来配列のためのパッケージング能力を有するｃｉｓ作用性の長い末端反復を含む。後に、治療遺伝子を標的細胞中に組み込んで、持続的な導入遺伝子発現をもたらすために使用される、ベクターの複製およびパッケージングのためには、最小限のｃｉｓ作用性ＬＴＲで十分である。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組合せ（例えば、Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992)；Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992)； Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990)；Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989)；Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991)；国際特許出願公開ＷＯ１９９４／０２６８７７を参照されたい）が挙げられる。
一過的発現が好ましい適用では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率を可能にし、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られた。このベクターを、比較的単純な系で大量に生産することができる。また、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのインビトロでの産生において、ならびにインビボおよびエクスビボでの遺伝子療法手順のために、細胞に標的核酸を形質導入するために使用される（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987)；米国特許第４，７９７，３６８号；国際特許出願公開ＷＯ９３／２４６４１；Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)；Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984)；Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984)；およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含む、いくつかの刊行物に記載されている。
少なくとも６つのウイルスベクター手法が、臨床試験における遺伝子導入のために現在利用可能であり、形質導入剤を産生するためのヘルパー細胞系に挿入される遺伝子による欠損ベクターの補完を含む手法を使用する。
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例である（Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995)；Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995)；Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法試験において使用された初めての治療用ベクターであった（Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)）。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ－Ｓパッケージベクターについて観察された（Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997)；Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997)）。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損および非病原性パルボウイルスアデノ随伴型２ウイルスに基づく有望な代替的な遺伝子デリバリー系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットを挟むＡＡＶの約１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入される細胞のゲノム中への組込みに起因する効率的な遺伝子導入および安定な導入遺伝子デリバリーは、このベクター系にとっての鍵となる特徴である（Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998)、Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ ｒｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／９およびＡＡＶ２／６などの偽型化されたＡＡＶを、本発明に従って使用することもできる。血液脳関門を横断することができる新規ＡＡＶ血清型を、本発明に従って使用することもできる（例えば、米国特許第９，５８５，９７１号を参照されたい）。好ましい実施形態では、ＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９の変異体および偽型を含む）が使用される。
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を、高力価で産生させ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染させることができる。多くのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作される；続いて、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をｔｒａｎｓに供給するヒト２９３細胞中で増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉中に見出されるものなどの非分裂性の分化した細胞を含む、インビボの複数の型の組織に形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きい運搬能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を含んでいた（Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)）。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996)；Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998)；Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995)；Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997)；Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998)；Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)が挙げられる。
宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成させるために、パッケージング細胞が使用される。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングする、Ψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする生産細胞系によって生成される。典型的には、ベクターは、パッケージングおよびその後の宿主への組込み（適用可能な場合）にとって必要とされる最小限のウイルス配列、発現させようとするタンパク質をコードする発現カセットで置き換えられる他のウイルス配列を含有する。失われているウイルス機能は、パッケージング細胞系によってｔｒａｎｓに供給される。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みにとって必要とされるＡＡＶゲノムに由来する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含有するが、ＩＴＲ配列を欠く、細胞系中にウイルスＤＮＡをパッケージングする。細胞系はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染させる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染を、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理によって低減させることができる。
多くの遺伝子療法適用においては、特定の組織型に対する高い特異度で遺伝子療法ベクターを送達することが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するようにウイルスベクターを改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが知られる受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができると報告したが、その組換えウイルスはヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染する。この原理を、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス－標的細胞対に拡張することができる。例えば、実質的に任意の選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を展示するように、繊維性ファージを操作することができる。上の説明は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターにも適用することができる。そのようなベクターを、特定の標的細胞による取込みを促進する特異的取込み配列を含有するように操作することができる。
遺伝子療法ベクターを、個々の患者への投与により、典型的には、以下に記載されるような、全身投与（例えば、海馬、皮質、線条体などの脳の任意の領域を含む脳への直接注入を含む、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、髄腔内、嚢内、脳室内、または頭蓋内輸注）または局所適用により、インビボで送達することができる。あるいは、ベクターを、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）などのエクスビボの細胞、または普遍的なドナー造血幹細胞に送達した後、通常は、ベクターを組み込んだ細胞に関する選択の後、細胞を患者に再度移植することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）は、インビボで直接送達される。組成物（細胞、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）を、限定されるものではないが、脳または脊髄への直接注射などを含む、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接投与することができる。限定されるものではないが、海馬、黒質、マイネルト基底核（ＮＢＭ）、線条体および／または皮質などの、脳の１つまたは複数の領域を標的化することができる。あるいは、またはＣＮＳデリバリーに加えて、組成物を、全身投与することができる（例えば、静脈内、腹腔内、心臓内、筋肉内、皮下、髄腔内、嚢内、脳室内および／または頭蓋内輸注）。本明細書に記載の組成物を対象に直接送達するための方法および組成物（ＣＮＳへの直接デリバリーを含む）としては、限定されるものではないが、針アセンブリーによる直接注射（例えば、定位固定注射）が挙げられる。そのような方法は、例えば、脳への組成物（発現ベクターを含む）のデリバリーに関する、米国特許第７，８３７，６６８号および第８，０９２，４２９号ならびに米国特許出願公開第２００６／０２３９９６６号に記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
投与される有効量は、患者間で、また、投与の様式および投与部位に応じて変化するであろう。したがって、有効量は、組成物を投与する医師によって最良に決定され、当業者であれば、適切な投与量を容易に決定することができる。十分な時間にわたって組込みおよび発現をさせた後（典型的には、例えば、４～１５日）、治療ポリペプチドの血清または他の組織でのレベルの分析および投与前の初期レベルとの比較は、投与される量が低すぎる、正しい範囲内にある、または高すぎるかどうかを決定するであろう。初期およびその後の投与のための好適なレジメンも可変性であるが、典型的には、初期投与の後、必要に応じて、その後の投与である。その後の投与を、毎日から毎年から数年毎の範囲の可変的な間隔で投与することができる。ある特定の実施形態では、
ヒト脳に直接的にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用してＺＦＰを送達するためには、線条体あたり、１ｘ１０１０～５ｘ１０１５（またはその間の任意の値）個のベクターゲノムの用量範囲を適用することができる。上述の通り、投与量は、他の脳構造および異なるデリバリープロトコールのために変化してもよい。脳に直接的にＡＡＶベクターを送達する方法は、当業界で公知である。例えば、米国特許第９，０８９，６６７号；第９，０５０，２９９号；第８，３３７，４５８号；第８，３０９，３５５号；第７，１８２，９４４号；第６，９５３，５７５号；および第６，３０９，６３４号を参照されたい。
診断、研究、または遺伝子療法（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再輸注による）のためのエクスビボでの細胞トランスフェクションは、当業者には周知である。好ましい実施形態では、細胞は、対象生物から単離され、少なくとも１つのモジュレーター（例えば、リプレッサー）またはその成分をトランスフェクトされ、対象生物（例えば、患者）に再度輸注して戻される。好ましい実施形態では、モジュレーター（例えば、リプレッサー）の１つまたは複数の核酸は、ＡＡＶ９を使用して送達される。他の実施形態では、モジュレーター（例えば、リプレッサー）の１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。また、翻訳効率および／またはｍＲＮＡの安定性を増大させるためには、キャップ付ｍＲＮＡの使用が好ましい。特に好ましいのは、ＡＲＣＡ（抗リバースキャップアナログ）キャップまたはその変異体である。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照されたい。エクスビボでのトランスフェクションにとって好適である様々な細胞型が、当業者には周知であり（例えば、Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)ならびに患者から細胞を単離および培養する方法の考察に関するその中に引用された参考文献を参照されたい）。
一実施形態では、幹細胞が、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのエクスビボでの手順において使用される。幹細胞を使用する利点は、それらをインビトロで他の細胞型に分化させることができること、またはそれらが骨髄に生着する哺乳動物（細胞のドナーなど）に導入することができることである。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインを使用して、臨床的に重要な免疫細胞型にインビトロでＣＤ３４＋細胞を分化させるための方法は、公知である（Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)を参照されたい）。
幹細胞は、公知の方法を使用して形質導入および分化のために単離されている。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（パンＢ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）などの、望ましくない細胞に結合する抗体を用いて骨髄細胞をパンすることによって、骨髄細胞から単離される（Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)を参照されたい）。
一部の実施形態では、改変された幹細胞を使用することもできる。例えば、アポトーシスに対して耐性にされた神経幹細胞を、幹細胞が本発明のＺＦＰ ＴＦをも含有する治療組成物として使用することができる。アポトーシスに対する耐性は、例えば、幹細胞中で、ＢＡＸもしくはＢＡＫ特異的ＴＡＬＥＮもしくはＺＦＮ（米国特許第８，５９７，９１２号を参照されたい）を使用して、ＢＡＸおよび／もしくはＢＡＫ、または再度、例えば、カスパーゼ－６特異的ＺＦＮを使用して、カスパーゼ中で破壊されるものをノックアウトすることにより、生じてもよい。これらの細胞に、標的遺伝子を調節することが知られるＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦをトランスフェクトすることができる。
治療的ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）を、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、限定されるものではないが、注射、輸注、局所適用およびエレクトロポレーションなどの、ある分子を、血液または組織細胞との最終的な接触に導入するために通常使用される任意の経路による。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者には利用可能かつ周知であり、１より多い経路を使用して、特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりも即時的かつ有効な反応をもたらし得ることが多い。
造血幹細胞中にＤＮＡを導入するための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。導入遺伝子の、造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞への導入にとって有用なベクターとしては、３５型アデノウイルスが挙げられる。
導入遺伝子の、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入にとって好適なベクターとしては、非組込みレンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Ory et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388；Dull et al., (1998) J. Virol. 72:8463-8471；Zuffery et al., (1998) J. Virol. 72:9873-9880；Follenzi et al., (2000) Nature Genetics 25:217-222を参照されたい。
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって一部決定される。したがって、以下に記載されるような、利用可能な医薬組成物の様々な好適な製剤が存在する（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照されたい）。
上述の通り、開示される方法および組成物を、限定されるものではないが、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞などの任意の型の細胞中で使用することができる。タンパク質発現のための好適な細胞系は、当業者には公知であり、限定されるものではないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、ｐｅｒＣ６、スポドプテラ・フギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）などの昆虫細胞、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｓｃｈｉａ）およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真菌細胞が挙げられる。これらの細胞系の子孫、変異体および誘導体を使用することもできる。好ましい実施形態では、方法および組成物は、脳細胞に、例えば、線条体に直接送達される。
ＣＮＳ障害のモデル
ＣＮＳ障害の試験を、非ヒト霊長類（例えば、パーキンソン病（Johnston and Fox (2015) Curr Top Behav Neurosci 22: 221-35）；筋萎縮性側索硬化症（Jackson et al., (2015) J. Med Primatol: 44(2):66-75）、ハンチントン病（Yang et al., (2008) Nature 453(7197):921-4）；アルツハイマー病（Park et al., (2015) Int J Mol Sci 16(2):2386-402）；発作（Hsiao et al., (2016) E Bio Med 9:257-77））、イヌ科（例えば、ＭＰＳ ＶＩＩ（Gurda et al., (2016) Mol Ther 24(2):206-216）；アルツハイマー病（Schutt et al., (2016) J Alzheimers Dis 52(2):433-49）；発作（Varatharajah et al., (2017) Int J Neural Syst 27(1):1650046））およびマウス（例えば、発作（Kadiyala et al., (2015) Epilepsy Res 109:183-96）；アルツハイマー病（Li et al., (2015) J Alzheimers Dis Parkin 5(3) doi 10:4172/2161-0460））などの動物モデル系において実行することができる（概説：Webster et al., (2014) Front Genet 5 art 88, doi:10.3389f/gene.2014.00088）。これらのモデルは疾患の特定の症状セットを精査するのに有用であり得るため、ＣＮＳ疾患を完全に再現する動物モデルが存在しない場合であっても、これらのモデルを使用することができる。このモデルは、本明細書に記載の治療方法および組成物（遺伝子リプレッサー）の効能および安全性プロファイルを決定するのに役立ち得る。
適用
複数の人工転写因子を含む本明細書に記載の遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）を、遺伝子発現の特異的モジュレーションが望まれる任意の適用のために使用することができる。これらの適用は、少なくとも１つの遺伝子モジュレーターが、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）または非ウイルスベクターを使用して対象に投与され、対象内での標的遺伝子の発現をモジュレートするために使用される治療方法を含む。モジュレーションは、抑制、例えば、疾患状態に寄与している遺伝子発現（例えば、ＨＤにおいてはＨｔｔ、ＡＬＳにおいては突然変異Ｃ９ＯＲＦ７２、ＰＤおよびＤＬＢにおいてはＳＮＣＡ、ＡＤにおいてはタウ、プリオン病においてはＰＲＮＰ）の抑制の形態にあってもよい。あるいは、モジュレーションは、内因性細胞遺伝子の発現の活性化または発現の増加が疾患状態を改善することができる場合、活性化の形態にあってもよい。上述の通り、そのような適用のために、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターをコードする核酸は、医薬組成物として薬学的に許容される担体と共に製剤化される。
遺伝子モジュレーター、またはそれらをコードするベクターを単独で、または他の好適な成分（例えば、リポソーム、ナノ粒子または当業界で公知の他の成分）と共に、吸入により投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらを「噴霧」することができる）にすることができる。エアロゾル製剤を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される推進剤の中に入れることができる。例えば、静脈内、筋肉内、皮内、および皮下経路などによる、非経口投与にとって好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有してもよい、水性および非水性の等張性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含んでもよい水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。例えば、静脈内輸注、経口、局所、腹腔内、膀胱内、眼窩後方（ＲＯ）、頭蓋内（例えば、限定されるものではないが、海馬および／もしくは皮質などの脳の任意の領域に）または髄腔内投与により、組成物を投与することができる。化合物の製剤を、アンプルおよびバイアルなどの、単回用量または複数回用量の密閉容器中で提供することができる。注射溶液および懸濁液を、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
患者に投与される用量は、長時間にわたって患者における有益な治療応答を提供するのに十分なものであるべきである。用量は、用いられる特定の遺伝子モジュレーターの効能およびＫｄ、標的細胞、および患者の状態、ならびに処置しようとする患者の体重または表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の患者における特定の化合物またはベクターの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。
以下の実施例は、遺伝子モジュレーターが標的遺伝子に結合する少なくとも２つの亜鉛フィンガータンパク質を含む本開示の例示的実施形態に関する。これは例示だけのためのものであり、限定されるものではないが、ＴＡＬＥ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、さらなるＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、さらなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含む、任意の標的遺伝子のための遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）を使用することができることが理解されるであろう。以下に例示されるような標的部位に結合するこれらのモジュレーターを、当業者には公知の方法を使用して容易に取得することができることが理解されるであろう。同様に、以下の実施例は、デリバリー媒体が任意のＡＡＶベクターである例示的実施形態に関するものであるが、任意のウイルス（Ａｄ、Ｌｖなど）または非ウイルス（プラスミド、ｍＲＮＡなど）を使用して本明細書に記載のモジュレーターを送達することができることが理解されるであろう。
本明細書および実施形態を通して、単語「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述される整数または整数の群を含めることを暗示するが、任意の他の整数または整数の群の除外を暗示しないことが理解されるであろう。本明細書に記載される全ての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの文献が本明細書で引用されるが、この引用は、これらの文献のいずれかが当業界における共通一般知識の一部を形成するとの承認を構成するものではない。本明細書で使用される場合、目的の１つまたは複数の値に適用される用語「およそ」または「約」は、記述される参照値と類似する値を指す。ある特定の実施形態では、この用語は、別途記述しない限り、または文脈から明らかでない限り、記述される参照値のいずれかの方向に（より大きい、またはより小さい）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内、またはそれ未満にある値の範囲を指す。
実施例１
相乗的ＺＦＰ－ＴＦリプレッサー
相乗的ＺＦＰ－ＴＦリプレッサーを含む組成物を、ＺＦＰ－ＴＦのパネルを、個別に、および様々な組合せでスクリーニングすることによって同定した。
Ａ．タウ（ＭＡＰＴ）
約１８５個の亜鉛フィンガータンパク質のスクリーニングを、米国特許出願公開第２０１８０１５３９２１号に記載のように行った。ＺＦＰと抑制ドメインとを含むＺＦＰ－ＴＦも試験し、発現を抑制することを見出した。さらに、個々のＺＦＰによる抑制を、組み合わせ、試験した様々な対と比較した。
ＺＦＰリプレッサーを、以下のようにマウスＮｅｕｒｏ２Ａ（Ｎ２Ａ）細胞中でのタウの抑制について、個別に、または対において評価した。簡単に述べると、３つの異なる用量（約３０、１０または３ｎｇ）の多くの異なる個々のＺＦＰ－ＴＦおよびＺＦＰ－ＴＦの対合した組合せをコードするｍＲＮＡを、約１００，０００個のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中にトランスフェクトした。ＺＦＰ ＴＦを、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞中にトランスフェクトした。約２４時間後、全ＲＮＡを抽出し、ＭＡＰＴおよび２つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＲＰＬ３８）の発現を、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを使用してモニタリングした。
初期スクリーニングの結果（図１の上３つのパネルに示される）に基づいて、４つのＺＦＰ－ＴＦ、５２３２２、５２３３５、５２３６４、５２３７４およびその対合した組合せを、６つの異なる用量（３００、１００、３０、１０、３、および１ｎｇ）の個々の、または組合せのＺＦＰ－ＴＦをＮ２Ａ細胞中にトランスフェクトし、上記のように分析するさらなる試験のために選択した。個々のＺＦＰ－ＴＦと、複数のＺＦＰ－ＴＦを含む遺伝子モジュレーターとの間の抑制レベルを比較することによって、相乗効果も評価した。最も強力な単一のＺＦＰ－ＴＦまたはモジュレーターに関して同じ核酸用量での予想される正規化されたタウ発現と、ＺＦＰまたはモジュレーターの組合せを使用する場合の観察される正規化されたタウ発現との比として、相乗効果スコアを算出した。
図１の下パネルに示されるように、２つのＺＦＰ－ＴＦリプレッサーを含む遺伝子モジュレーターは、同じ用量で個々のＺＦＰ－ＴＦよりも有意にタウ発現を抑制した。
さらに、図２および図３に示されるように、複数のＺＦＰ－ＴＦを含むＺＦＰ－ＴＦを使用した遺伝子発現の抑制は、観察される抑制における驚くべき相乗効果を提供し、２つのＺＦＰ同時の予想される抑制レベルの２～１０倍以上であった。
表１および表２は、様々な試験において使用された例示的設計を示す。
Figure 2022504075000002
Figure 2022504075000003
Figure 2022504075000004
Figure 2022504075000005
Figure 2022504075000006
Figure 2022504075000007
上記の２つの人工転写因子を含む遺伝子モジュレーターも、（１）抑制（ＫＲＡＢ）ドメイン間の距離（ヌクレオチドでの）；（２）転写開始部位（ＴＳＳ）からの結合した標的部位の距離；（３）２つのＺＦＰ－ＴＦ間としての標的部位の距離；および（４）個々のＺＦＰ－ＴＦが結合する鎖に基づいて相乗効果について、以下のように評価した。最も強力な単一のＺＦＰ－ＴＦまたはモジュレーターに関して同じ核酸用量での予想される正規化されたタウ発現と、ＺＦＰまたはモジュレーターの組合せを使用する場合の観察される正規化されたタウ発現との比として、相乗効果スコアを算出した。相乗効果を、３６８対について示された３０ｎｇの用量で評価した（４３のシングルの組合せから作製された）。
図４に示されるように、２つの標的部位または抑制ドメイン間の最大で６００塩基対の距離にある２つのＺＦＰ－ＴＦ；ＴＳＳの２００塩基対（３’または５’）以内のその２つの標的部位間の中心距離を有するＺＦＰ－ＴＦを使用して；および標的配列のどちらの鎖がＺＦＰ－ＴＦに結合したかに関係なく、相乗効果（抑制）が容易に達成された。
続いて、相乗的に作用する少なくとも２つの人工転写因子を含む遺伝子リプレッサーをさらに評価するために、試験を行った。活性な個々のＺＦＰ－ＴＦのパネルを同定し、全ての対合した組合せの完全なマトリックス、ならびに一緒に送達された６つ全てのＺＦＰ－ＴＦの試験において試験した。
例示的な同定されたシングル、対、および複数の組合せに関する結果を図５に示し、ほぼ任意の組合せにおいて２つ以上のＺＦＰ－ＴＦを組み合わせることによって、相乗効果が容易に達成されることが確認される。６つ全部のＺＦＰ－ＴＦを同時送達した実験により、最も高いレベルのタウ減少および最も強力なＺＦＰ対５２３２２－５２３３５よりも約３倍低い、最も低いＥＣ５０が得られた。
Ｂ．マウスプリオン（Ｐｒｎｐ）
また、マウスＰｒｎｐ遺伝子に標的化されたＺＦＰ－ＴＦを、本質的には上記のように、相乗効果についてスクリーニングした。簡単に述べると、３２個の異なる個々のＺＦＰ－ＴＦおよび１３０個の異なるこれらのＺＦＰ－ＴＦの対合した組合せをコードする３つの異なる用量（個々のＺＦＰ－ＴＦについては２００、６０、２０ｎｇおよび対合した組合せについては１００、３０および１０ｎｇ）のｍＲＮＡを、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、全ＲＮＡを抽出し、Ｐｒｎｐおよび２つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４Ａ）の発現を、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを使用してモニタリングした。組合せ中でその用量の２倍で試験した場合のより強力なＺＦＰについて得られた発現レベルの、ＺＦＰ組合せについて得られたものに対する比として、相乗効果を算出した。
試験した１３０個のＺＦＰ－ＴＦの組合せに関して相乗効果を示す結果を、以下の表Ａに示す。
Figure 2022504075000008
かくして、相乗効果（単一のＴＦと比較した場合）が、７５％を超える試験した組合せにおいて観察され、２倍を超える相乗効果が４０％を超える試験した組合せにおいて観察された。
さらに、図１０は、個別のＺＦＰ－ＴＦと比較した、８つの例示的なＺＦＴ－ＴＦの組合せの相乗効果を図示する。示された例示的なＺＦＰ－ＴＦは、Ａ～Ｋと命名される。
また、マウスプリオンＺＦＰ－ＴＦの１３０の組合せを、（１）抑制（ＫＲＡＢ）ドメイン間の距離（ヌクレオチドでの）；（２）転写開始部位（ＴＳＳ）からの結合した標的部位の距離；および（３）２つのＺＦＰ－ＴＦ間としての標的部位の距離に基づいて、相乗効果について評価した。相乗効果を、上記のように算出した。
図１１に示されるように、２つの標的部位間または抑制ドメイン間で最大６００塩基対の距離にある２つのＺＦＰ－ＴＦを使用して；およびＴＳＳの６００塩基対（３’または５’）以内のその２つの標的部位間の中心距離を有するＺＦＰ－ＴＦを用いて、相乗効果（抑制）が容易に達成された。
Ｃ．ヒトプリオン（ＰＲＮＰ）
また、ヒトＰＲＮＰ遺伝子に標的化されたＺＦＰ－ＴＦを、本質的には上記のように、相乗効果についてスクリーニングした。簡単に述べると、３２個の異なる個々のＺＦＰ－ＴＦおよび１３０個の異なるこれらのＺＦＰ－ＴＦの対合した組合せをコードする３つの異なる用量（個々のＺＦＰ－ＴＦについては２００、６０、２０ｎｇおよび対合した組合せについては１００、３０および１０ｎｇ）のｍＲＮＡを、ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、全ＲＮＡを抽出し、ＰＲＮＰおよび２つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４Ａ）の発現を、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを使用してモニタリングした。組合せ中でその用量の２倍で試験した場合のより強力なＺＦＰについて得られた発現レベルの、ＺＦＰ組合せについて得られた発現レベルに対する比として、相乗効果を算出した。
試験した１３０個のＺＦＰ－ＴＦの組合せに関して相乗効果を示す結果を、以下の表Ｂに示す。
Figure 2022504075000009
かくして、相乗効果（単一のＴＦと比較した場合）が、６６％を超える試験した組合せにおいて観察され、２倍を超える相乗効果が２３％を超える試験した組合せにおいて観察された。
さらに、図１２は、個別のＺＦＰ－ＴＦと比較した、８つの例示的なＺＦＴ－ＴＦの組合せの相乗効果を図示する。示された例示的なＺＦＰ－ＴＦは、ｈＡ～ｈＪと命名される。
また、ヒトプリオンＺＦＰ－ＴＦの１３０の組合せを、（１）抑制（ＫＲＡＢ）ドメイン間の距離（ヌクレオチドでの）；（２）転写開始部位（ＴＳＳ）からの結合した標的部位の距離；および（３）２つのＺＦＰ－ＴＦの標的部位間の距離に基づいて、相乗効果について評価した。相乗効果を、上記のように算出した。
図１３に示されるように、２つの標的部位間または抑制ドメイン間で最大６００塩基対の距離にある２つのＺＦＰ－ＴＦを使用して；およびＴＳＳの６００塩基対（３’または５’）以内のその２つの標的部位間の中心距離を有するＺＦＰ－ＴＦを用いて、相乗効果（抑制）が容易に達成された。
Ｄ．ヒトα－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）
また、ヒトＳＮＣＡに標的化されたＺＦＰ－ＴＦを、本質的には上記のように、相乗効果についてスクリーニングした。簡単に述べると、３０個の異なる個々のＺＦＰ－ＴＦおよび１３２個の異なるこれらのＺＦＰ－ＴＦの対合した組合せをコードする３つの異なる用量（個々のＺＦＰ－ＴＦについては２００、６０、２０ｎｇおよび対合した組合せについては１００、３０および１０ｎｇ）のｍＲＮＡを、ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、全ＲＮＡを抽出し、ＳＮＣＡおよび２つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４Ａ）の発現を、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを使用してモニタリングした。組合せ中でその用量の２倍で試験した場合のより強力なＺＦＰについて得られた発現レベルの、ＺＦＰ組合せについて得られたものに対する比として、相乗効果を算出した。
試験した１３２個のＺＦＰ－ＴＦの組合せに関して相乗効果を示す結果を、以下の表Ｃに示す。
Figure 2022504075000010
かくして、相乗効果（単一のＴＦと比較した場合）が、約６６％の試験した組合せにおいて観察され、２倍を超える相乗効果が１７％を超える試験した組合せにおいて観察された。
さらに、図１４は、個別のＺＦＰ－ＴＦと比較した、８つの例示的なＺＦＴ－ＴＦの組合せの相乗効果を図示する。示された例示的なＺＦＰ－ＴＦは、ｓＡ～ｓＪと命名される。
また、ヒトα－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦの１３２の組合せを、（１）抑制（ＫＲＡＢ）ドメイン間の距離（ヌクレオチドでの）；（２）転写開始部位（ＴＳＳ）からの結合した標的部位の距離；および（３）２つのＺＦＰ－ＴＦの標的部位間の距離に基づいて、相乗効果について評価した。相乗効果を、上記のように算出した。
図１５に示されるように、２つの標的部位間または抑制ドメイン間で最大６００～８００塩基対の距離にある２つのＺＦＰ－ＴＦを使用して；およびＴＳＳの６００～８００塩基対（３’または５’）以内のその２つの標的部位間の中心距離を有するＺＦＰ－ＴＦを用いて、相乗効果（抑制）が容易に達成された。
実施例２
オフターゲット効果
また、オフターゲット効果を、以下のように分析した。第１に、実施例１で同定された５２３３５と５２３８９との対を、全体マイクロアレイプロファイリングにおいて使用した。簡単に述べると、約３００ｎｇのそれぞれのＺＦＰ－ＴＦをコードするｍＲＮＡを、個別に、または組み合わせて、生物学的４回反復において１５０ｋのＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中にトランスフェクトした。約２４時間後、全ＲＮＡを抽出し、製造業者のプロトコール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ ＭＴＡ１．０）によって処理した。ロバストなマルチアレイ平均（ＲＭＡ）を使用して、それぞれのプローブセットに由来する生のシグナルを正規化した。「Ｇｅｎｅ Ｌｅｖｅｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ」オプションを用いるＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｌｅ ３．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、分析を実施した。ＺＦＰをトランスフェクトした試料を、無関係のＺＦＰ－ＴＦ（ＭＡＰＴ標的部位に結合しない）で処理した試料と比較した。対照と比較した平均シグナルの２倍を超える差異、および０．０５未満のＰ値（それぞれのプローブセットに関する一元配置分散分析、対応のないＴ検定）を示す転写物（プローブセット）についてチェンジコールを報告した。
図６Ａに示されるように、個々のＺＦＰ－ＴＦ ５２３３５は、２個の非標的遺伝子を抑制し、１個の遺伝子を活性化した；個々のＺＦＰ－ＴＦ ５２３８９は、１個の遺伝子を活性化したが、ＺＦＰ－ＴＦと、５２３３５および５２３８９との組合せは、１個のオフターゲット部位を活性化し、１個のオフターゲット部位を抑制した。さらに、図６Ｂに示されるように、２つのＺＦＰ－ＴＦリプレッサーを含む遺伝子モジュレーターは、個々のリプレッサーよりもタウレベルを抑制し（野生型レベルの０．０１２倍）、オンターゲット抑制の実質的な増加が、オフターゲットの数を増加させることなく達成可能であることを示している。
実施例３
デリバリー
多シストロン性デリバリーおよびコドン多様化された抑制ドメインも以下のように分析した。単一のＺＦＰ－ＴＦ（非連結）または複数の人工転写因子（自己切断性ペプチド配列、Ｔ２ＡおよびＰ２Ａによって隔てられている）を運ぶ１つのｍＲＮＡと共に多シストロン性（連結）としてコードするｍＲＮＡを生成した。さらに、ＺＦＰ－ＴＦは、Ｋｏｘ抑制ドメインの野生型またはコドン多様化された変異体（それぞれ、連結された構造内のＮ末端、中央、またはＣ末端位置について、ｎＫｏｘ、ｍＫｏｘ、およびｃＫｏｘと指定）を含み、デリバリーベクター中の反復配列を回避した。
ｍＲＮＡを、以下の用量でＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中にトランスフェクトした：非連結ｍＲＮＡを、約３００、１００、３０、１０、３、１、０．３および０．１ｎｇのｍＲＮＡの用量でトランスフェクトし、２シストロン性ｍＲＮＡを、約６００、２００、６０、２０、６、２、０．６、および０．１ｎｇのｍＲＮＡの用量でトランスフェクトした。タウ遺伝子発現レベルを、約２４時間後に測定した。
図７Ａに示されるように、遺伝子発現は、連結コンストラクトと非連結コンストラクトの両方によって、Ｋｏｘドメイン変異体またはシストロン性構造に関係なく、類似する規模およびＥＣ５０まで効率的に抑制された。
遺伝子リプレッサーをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターも生成した。デリバリー媒体は、単一のＺＦＰ－ＴＦ（非連結）を運ぶか、または１つのＡＡＶベクターが遺伝子モジュレーターの２つ以上の人工転写因子を運ぶ点で多シストロン性（連結）である。ｍＲＮＡと同様、単一および多シストロン性のＡＡＶベクターは両方とも、タウ発現を抑制し、本明細書に記載の遺伝子リプレッサーの全ての成分をコードする単一のＡＡＶベクターを使用することができることを示している。
遺伝子モジュレーション（抑制）の動力学も経時的に試験した。特に、遺伝子発現（タウ）レベルを、ｍＲＮＡ転写の約２４、４８、６４、７２、および１３６時間後に評価した。図７Ｂに示されるように、抑制は、トランスフェクション後、約７２時間以上で検出可能ではなかった。
さらに、さらなる機能ドメイン（ＤＭＮＴ）の効果も、様々な時点にわたって評価した。以下のような３つのＺＦＰ融合タンパク質を、生成した：ＫＲＡＢ抑制ドメインに作動可能に連結されたＺＦＰ ５７８９０（５７８９０－Ｋ）；ＤＮＭＴ３Ａ機能ドメインに作動可能に連結されたＺＦＰ ５２３２２（５２３２２－Ｄ３Ａ）およびＤＮＭＴ３Ｌ機能ドメインに作動可能に連結され、約９００、３００もしくは１００ｎｇの用量で個別に、または約３００、１００もしくは３０ｎｇの用量で一緒にＮ２Ａ細胞中にトランスフェクトしたＺＦＰ ５７９３０。細胞を、約２４、９６または１６８時間後に収獲し、遺伝子発現レベルを評価した。
図７Ｃに示されるように、三重トランスフェクションは、トランスフェクションの約１６８時間後までロバストな抑制レベルを与えたが、任意の単一のＺＦＰモジュレーターのデリバリーは２４時間を超えてタウ発現を抑制することはできなかった。
実施例４
インビボでの非ヒト霊長類試験
本明細書に記載の遺伝子リプレッサーを、カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において試験して、霊長類（非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデル）におけるタウ発現の抑制を観察した。カニクイザルを、自動給水系を装備したステンレススチール製のケージ中で飼育した。試験は、Ｆｉｎａｌ Ｒｕｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ規則（Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｔｉｔｌｅ ９）およびＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ、８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎの全ての適用可能なセクションを順守した。
遺伝子リプレッサーを、本質的には、米国特許出願公開第２０１８０１５３９２１号に記載のように、ＳＹＮ１プロモーターまたはＣＭＶプロモーターと共に、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ２／９、またはその変異体）中にクローニングした。使用したＡＡＶベクターは、６５９１８および５７８９０を含む本明細書に記載の遺伝子モジュレーターの発現を駆動するＳＹＮ１プロモーターを有するベクター（ＳＹＮ９１８－８９０）および６５９１８および５７８９０を含む遺伝子モジュレーターの発現を駆動するＣＭＶプロモーターを有するベクター（ＣＭＶ９１８－８９０）を含んでいた。
ＮＨＰ対象を、以下の表に示されるように処置した。
Figure 2022504075000011
この実験では、ｈＳＹＮ１またはＣＭＶにより誘導されるＺＦＰ ＴＦを含むＡＡＶ９ベクターを、左半球には約６Ｅ１１ ｖｇで、および右半球には約６Ｅ１１ ｖｇで送達する。動物は、左半球では約６０μＬの容量で単回用量の被験物質、および右半球では約６０μＬの単回用量を受けた。全ての被験物質について、用量の濃度は、約１Ｅ１３ ｖｇ／ｍＬであった。
２８日後、動物を犠牲にし、脳を取り出し、氷冷ＰＢＳ中の冠状ブレインマトリックス中に入れた。脳を３ｍｍの冠状スライス厚にスライスした（約１７個のスライスに分割した）。一部の脳スライス（右および左半球）を、組織病理検査およびインサイチューハイブリダイゼーション分析のために１０％中性緩衝化ホルマリン中で保存した。他の全ての脳スライス（右および左半球）を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中に入れ、約２４時間冷蔵した後、所定の脳鋳型に従って２～３ｍｍ直径のパンチを収集した。パンチをｑＲＴ－ＰＣＲおよび生体分布分析のために処理した。さらに、タウタンパク質分析のためにＣＳＦを収集した。
海馬および内嗅皮質領域を含むスライスを使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲにより、タウ、ＺＦＰ、グリアおよび神経細胞マーカー、ならびにハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを分析した。結果は、ＺＦＰ－ＴＦがＡＡＶによって海馬領域に送達され、タウ発現の低減をもたらしたことを示している。
対象を、輸注後２８日目に剖検し、脳を取り出し、吻側－尾側アクセスに沿って３ｍｍの冠状ブロックに切片化し、海馬および内嗅皮質を含む、いくつかの脳領域について各ブロックからパンチ生検を収集した。ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、異なる脳切片を形成する７４個のパンチ中でのタウ発現、ハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４ａ２、およびＧＡＰＤＨ）、およびＺＦＰ発現レベルを評価した。
図８に示されるように、本明細書に記載の少なくとも２つの人工転写因子を含む遺伝子モジュレーターを受けている対象におけるタウ発現は、対照（媒体）対象と比較して有意に抑制された。
試験は、本発明の遺伝子モジュレーターが霊長類の脳においてインビボでの遺伝子発現をモジュレートする（治療レベルを含む）ことを示す。
データは、本明細書に記載の遺伝子リプレッサーが高度に活性であり、最大３．５ｌｏｇのＺＦＰ用量レベルにわたって間隔非依存的（標的部位間で最大約６００ｂｐおよびＴＳＳからの最大約３００塩基対以上）飽和抑制が達成されたことを示す。さらに、遺伝子リプレッサーは、わずかなオフターゲットが同定されたか、オフターゲットが同定されなかったという点で高度に特異的である。最後に、遺伝子リプレッサーを、ｍＲＮＡ形態で、またはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ９などのＡＡＶ）を使用して送達することができ、インビトロおよびインビボで高い活性および特異性を示す。
実施例５
ヒトｉＰＳニューロン中でのＺＦＰ－ＴＦの活性
ＡＡＶ２／６を使用して、約１Ｅ５ ＶＧ／細胞（ｉＣｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）でヒトｉＰＳ由来ニューロンに感染させた。約１９日後、全ＲＮＡを抽出し、ヒトＭＡＰＴ、ＺＦＰ－ＫＲＡＢ、および３つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４ａ２、ＧＡＰＤＨ）の発現を、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを使用して評価した。
また、ＺＦＰ－ＴＦ特異性を、１Ｅ５ ＶＧ／細胞（ｉＣｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）でヒトｉＰＳ由来ニューロン中で評価した。約１ｅ５ ＶＧ／細胞のＡＡＶ６ ＺＦＰ－ＴＦからなる、それぞれの処置の５～７回の生物学的反復を使用した。感染の約１９日後、全ＲＮＡを抽出し、製造業者のプロトコール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｃｌａｒｉｏｍ Ｓ Ｐｉｃｏ）により処理した。ロバストなマルチアレイ平均（ＲＭＡ）を使用して、それぞれのプローブセットに由来する生のシグナルを正規化した。「Ｇｅｎｅ Ｌｅｖｅｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ」オプションを用いるＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｌｅ ４．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、分析を実施した。ＺＦＰをトランスフェクトした試料を、無関係のＺＦＰ－ＴＦ（ＭＡＰＴ標的部位に結合しない）で処理した試料と比較した。対照と比較した平均シグナルの２倍を超える差異、および０．０５未満のＦＤＲ Ｐ値（それぞれのプローブセットに関する一元配置分散分析、対応のないＴ検定）を示す転写物（プローブセット）についてチェンジコールを報告する。
結果は、特定のＺＦＰ－ＴＦの組合せが、ヒト細胞中でのＭＡＰＴの発現の抑制において相乗的活性を示すことを示していた。
本明細書に記載の全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は明確な理解のための実例および例としていくらか詳細に提供されてきたが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変更形態および修飾形態を実行することができることが当業者には明らかであろう。したがって、前記説明および実施例は、限定と解釈されるべきではない。

Claims (26)

  1. ２つ以上の人工転写因子を含む組成物であって、それぞれの人工転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインとを含み、人工転写因子が細胞中の遺伝子発現を相乗的にモジュレートする、組成物。
  2. 細胞が単離されているか、または生きている対象中にある、請求項１に記載の組成物。
  3. ＨＤ、プリオン病、パーキンソン病、レヴィー小体型認知症（ＤＬＢ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および／またはタウオパチーである疾患または障害のエクスビボまたはインビボでの処置における使用のための、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 相乗的モジュレーションが個々の転写因子と比較して少なくとも約２倍である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. それぞれの人工転写因子が、１２ヌクレオチド以上の標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. それぞれの転写因子のＤＮＡ結合ドメインが、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＴＡＬ－エフェクタードメイン、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｓｇＲＮＡを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 機能ドメインが、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３ＬなどのＤＮＭＴタンパク質、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンメチラーゼ、またはヒストンをＳＵＭＯ化もしくはビオチン化する酵素に由来するドメインおよび／または翻訳後ヒストン修飾により調節される遺伝子抑制を可能にする他の酵素ドメインを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. ２つ以上の人工転写因子が、
    （ｉ）選択された標的遺伝子中の少なくとも１２ヌクレオチドの任意の標的部位に結合し、適宜、人工転写因子のうちの２つ以上が、同じ、異なる、および／もしくは重複する標的部位に結合する；
    （ｉｉ）互いに１０，０００塩基対以上以内にある標的部位に結合する；
    （ｉｉｉ）モジュレートしようとする標的遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）のいずれかの側の０～３００塩基対以内にある標的部位に結合する；ならびに／または
    （ｉｖ）二本鎖標的中のセンスおよび／もしくはアンチセンス鎖に結合する、
    請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 標的遺伝子が、タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子、Ｈｔｔ遺伝子、突然変異Ｈｔｔ遺伝子、突然変異Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子、プリオン遺伝子、ＳＭＡ遺伝子、ＡＴＸＮ２遺伝子、ＡＴＸＮ３遺伝子、ＰＲＰ遺伝子、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳコード遺伝子、ＤＵＸ４遺伝子、ＰＧＲＮ遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＦＭＲ１遺伝子、ＣＤＫＬ５遺伝子、またはＬＲＫＫ２遺伝子である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. ２つ以上の人工転写因子が、遺伝子リプレッサー、適宜、野生型発現レベルと比較して、および／または単一の人工転写因子を使用した場合の発現レベルと比較して、標的遺伝子の発現を少なくとも５０％～１００％（またはその間の任意の値）抑制するリプレッサーである、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. ２つ以上の人工転写因子が、遺伝子活性化因子、適宜、野生型発現レベルと比較して、および／または遺伝子が単一の遺伝子モジュレーターによってモジュレートされる場合の発現レベルと比較して、標的遺伝子の発現を１～５倍以上活性化する活性化因子である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 機能ドメインの活性が、細胞の転写機構との相互作用が外因性リガンドの存在下では起こらないように、外因性低分子またはリガンドによって調節される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。
  14. 人工転写因子が、１つまたは複数のポリヌクレオチドを使用して、適宜、１つまたは複数の人工転写因子をコードする配列を運ぶ１つまたは複数のウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して、対象に提供され、ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター（ＬＶ）および／またはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含んでもよく、非ウイルスベクターがプラスミドおよび／または単もしくは多シストロン性ｍＲＮＡを含んでもよい、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 対象の脳内で約４週間、約３カ月、約６カ月～約１年以上の期間にわたって遺伝子発現を低減させることによって、適宜、前頭前野皮質などの前頭葉皮質、頭頂葉皮質、後頭葉皮質；内嗅皮質などの側頭葉皮質、海馬、脳幹、線条体、視床、中脳、小脳ならびに／または脊髄の腰部、胸部および／もしくは頸部領域などの脊髄を含む、対象の脳に組成物を投与することによって、ＭＡＰＴ遺伝子発現を抑制することによってタウオパチーなどのＣＮＳ疾患もしくは障害を処置する；プリオンを抑制することによってプリオン病を処置する；α－シヌクレインを抑制することによってパーキンソン病を処置する；突然変異Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子発現を抑制することによってＡＬＳを処置する；ｍＨｔｔ遺伝子発現を抑制することによってＨＤを処置する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 静脈内、筋肉内、脳室内、髄腔内、頭蓋内、粘膜、経口、静脈内、眼窩（眼窩後方（ＲＯ））および／または嚢内投与によって対象に投与される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. （ｉ）約１０，０００～１００，０００、もしくは約１００，０００～２５０，０００、もしくは約２５０，０００～５００，０００ベクターゲノム（ＶＧ）／細胞の用量、適宜、約１Ｅ１１～１Ｅ１４ ＶＧ／ｍＬで脳実質に約１～３００μＬの固定容量で、および／もしくは約１Ｅ１１～１Ｅ１４ ＶＧ／ｍＬでＣＳＦに約０．５～１０ｍＬの固定容量で送達される、約１０，０００～５００，０００ベクターゲノム／細胞のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；
    （ｉｉ）約２５０～１，０００のＭＯＩのレンチウイルスベクター；
    （ｉｉｉ）約０．０１～１，０００ｎｇ／１００，０００細胞のプラスミドベクター；ならびに／または
    （ｉｖ）約０．０１～３０００ｎｇ／１００，０００細胞のｍＲＮＡ
    を使用して送達される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 遺伝子発現が、本明細書に記載の遺伝子モジュレーターを受けていない対照と比較して、細胞中で少なくとも３０％、または４０％、好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または９０％、または９０％を超えて減少する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 細胞が、ニューロンであり、ＨＤまたはＡＤニューロンであってもよい、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. １回投与されるか、または複数回投与される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 疾患または障害のバイオマーカー、病原性種および／または症状を低減させるのに使用するためのものであり、神経毒性、グリオーシス、神経突起変性、脊椎喪失、興奮毒性、皮質および海馬の縮小、樹状タウ蓄積、認知障害、運動障害、アミロイドβ斑と関連する神経突起変性、タウ病原性種、ｍＨｔｔ凝集体、高リン酸化タウ、可溶性タウ、粒状タウ、タウ凝集、および／または神経原線維変化（ＮＦＴ）が低減されてもよい、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. １つもしくは複数の人工転写因子をコードする配列が、ゲノム中に安定に組み込まれる、および／または人工転写因子をコードする１つもしくは複数の配列が、エピソームに保持され、安定な組込みがヌクレアーゼによって媒介される標的化された組込みであってよい、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞。
  23. 試薬および／または使用のための使用説明書をさらに含んでもよい、請求項１から２２のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の組成物および／または１つもしくは複数の細胞を含むキット。
  24. 請求項１から２３のいずれか一項に期待の相乗的人工転写因子を含む組成物を作製する方法であって、
    選択された遺伝子に標的化される、個々の２つ以上の人工転写因子およびその組合せを、遺伝子発現に対するその効果についてスクリーニングすること；ならびに
    人工ＺＦＰ－ＴＦの相乗的組合せを同定すること
    を含む方法。
  25. ２つ以上の人工転写因子が、
    （ｉ）１～６００塩基対離れている、標的部位に結合する、および／もしくは機能ドメインを含む；
    （ｉｉ）約１～８０；１６０～２２０；２６０～４００；もしくは５００～６００塩基対離れている標的部位に結合する；
    （ｉｉｉ）互いに約１～８０；２６０～４００；もしくは５００～６００塩基対隔てられている機能ドメインを含む；
    （ｉｖ）転写開始部位（ＴＳＳ）のいずれかの側の約４００塩基対以内にある標的部位に結合する；ならびに／または
    （ｖ）同じアンチセンス（－）もしくはセンス（＋）鎖、またはいずれかの配向の異なる鎖に結合する、
    請求項２４に記載の方法。
  26. 相乗的人工ＴＦが、個々のＴＦよりも標的遺伝子のモジュレーションにおいて少なくとも２倍活性が高い、請求項２４または２５に記載の方法。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
ES2929110T3 (es) 2015-08-25 2022-11-24 Univ Duke Composiciones y métodos para mejorar la especificidad en ingeniería genética usando endonucleasas guiadas por ARN
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
AU2017367722B2 (en) 2016-12-01 2024-02-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Tau modulators and methods and compositions for delivery thereof
CA3096713A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for gene editing
AU2021209699A1 (en) 2020-01-22 2022-07-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc finger protein transcription factors for repressing tau expression
WO2022009987A1 (en) * 2020-07-09 2022-01-13 Modalis Therapeutics Corporation Method for treating alzheimer's disease by targeting mapt gene
CA3197644A1 (en) * 2020-10-02 2022-04-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel zinc finger protein transcription factors for repressing alpha-synuclein expression
WO2023184107A1 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 Huigene Therapeutics Co., Ltd. Crispr-cas13 system for treating mecp2-associated diseases
WO2023184108A1 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 Huigene Therapeutics Co., Ltd. Crispr-cas13 system for treating ube3a-associated diseases
WO2024032679A1 (zh) * 2022-08-11 2024-02-15 益杰立科(上海)生物科技有限公司 一种表观编辑靶点的方法及用途
WO2024032677A1 (zh) * 2022-08-11 2024-02-15 益杰立科(上海)生物科技有限公司 一种表观编辑靶点的方法及用途
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Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9428756B2 (en) * 2006-08-11 2016-08-30 Dow Agrosciences Llc Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination
WO2011139349A1 (en) * 2010-05-03 2011-11-10 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking zinc finger modules
EP2820159B1 (en) * 2012-02-29 2019-10-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2017197141A2 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted treatment of androgenic alopecia
WO2018039471A2 (en) * 2016-08-25 2018-03-01 Trustees Of Boston University Synthetic transcriptional and epigenetic regulators based on engineered, orthogonal zinc finger proteins
US10960085B2 (en) * 2016-09-07 2021-03-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
US11371023B2 (en) * 2016-11-22 2022-06-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Artificial transcription factors and uses thereof
AU2017367722B2 (en) * 2016-12-01 2024-02-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Tau modulators and methods and compositions for delivery thereof

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