KR20210069692A - 조작된 유전자 조정제 - Google Patents

Abstract

유전자 발현의 특이적 조정 및 활성 조정에 사용하기 위한 2개 이상의 인공 전사 인자를 포함하는 유전자 조정제가 제공된다.

Description

조작된 유전자 조정제

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 10월 2일에 출원된 미국 가출원 번호 62/740,156의 이익을 주장하며, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

기술 분야

본 개시내용은 2개 이상의 인공 전사 인자를 포함하는 유전자 조정제를 사용하여 유전자 발현을 조정하기 위한 조성물 및 방법의 분야의 것이다.

질환-연관 유전자의 억제 또는 활성화는 조작된 전사 인자의 사용을 통해 달성되었다. 조작된 아연 핑거 전사 인자 (ZFP-TF)를 설계하고 사용하는 방법은 널리 문서화되어 있고 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,534,261 참조), 전사 활성화제 유사 이펙터 전사 인자 (TALE-TF) 및 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 Cas 기반 전사 인자 (CRISPR-Cas-TF) 둘 다가 또한 기재되었다 (종설 논문 [Kabadi and Gersbach (2014) Methods 69(2): 188-197] 참조). 예를 들어, 유전자 발현을 억제하는 조작된 TF (리프레서)는 또한 트리뉴클레오티드 장애, 예컨대 헌팅틴병 (HD) (예를 들어, 미국 특허 번호 8,956,828 및 미국 특허 공개 번호 2015/0335708 참조) 및 타우병증 예컨대 알츠하이머병 (AD) (미국 공개 번호 20180153921 참조)을 치료하는데 효과적인 것으로 제시되었다.

그러나, 유전자 발현의 조정을 위한 증진된 활성 및/또는 특이성을 제공하는 추가의 방법 및 조성물에 대한 필요가 남아있다.

2개 이상의 인공 전사 인자를 포함하는 유전자 조정제, 및 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 이들 유전자 조정제를 제조 및 사용하는 방법이 본원에 개시된다. 특히, 유전자 조정제 조성물은 복수의 (2개 이상의) 인공 전사 인자를 포함하며, 여기서 각각의 인공 전사 인자는 DNA-결합 도메인 및 기능적 도메인을 포함한다. 놀랍게도 그리고 예상외로, 복수의 인공 전사 인자로 구성된 유전자 조정제는 하기 중 하나 이상의 예상외의 상승작용적 효과를 제공한다: 단일 인공 전사 인자를 포함하는 조성물 (동일한 용량 또는 용량의 2x 포함)과 비교하여 및/또는 다중 인공 TF의 사용 시의 임의의 예상되는 상가적 효과와 비교하여 특이성 및/또는 활성. 복수의 인공 전사 인자를 포함하는 유전자 조정제는 치료 효과, 예를 들어 헌팅톤병 (HD)의 치료를 위한 돌연변이체 헌팅틴 (Htt) 유전자 발현의 억제, 근위축성 측삭 경화증 (ALS)의 치료를 위한 돌연변이체 C9orf72 대립유전자의 억제, 프리온 질환의 치료를 위한 프리온 단백질 발현의 억제; 시뉴클레인병증 예컨대 파킨슨병 (PD) 및/또는 루이 소체 치매 (DLB)의 치료를 위한 α-시뉴클레인의 억제 및/또는 타우병증 예컨대 AD, FTD, PSP, CBD 및/또는 발작의 치료를 위한 MAPT 유전자 발현의 억제가 달성되도록 유전자 발현을 조정하고 오프-타겟 사건을 제한한다. 따라서, 시험관내, 생체외 및 생체내에서 유전자 발현을 조정하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다.

한 측면에서, 유전자 조정제가, 각각의 개별 인공 전사 인자가 개별적으로 투여된 경우의 유전자 발현 수준과 비교하여 더 높은 수준 (약 1 내지 10 또는 그 초과-배 이상)으로 유전자 발현을 조정 (활성화 또는 억제)하는, 2개 이상의 (복수의) 인공 전사 인자를 포함하는 유전자 조정제가 본원에 기재된다. 따라서, 유전자 조정제는 개별 전사 인자와 비교하여, 및 전사 인자의 조합의 사용 시 유전자 조정의 예상되는 (예를 들어 상가적) 수준과 비교하여 상승작용적 효과를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 유전자 조정제는 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 인공 전사 인자를 포함하며, 각각의 인공 전사 인자는 유전자 조정제가 유전자 발현을 조정하도록 (i) 12개 이상 (예를 들어, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 초과)의 뉴클레오티드의 표적 부위에 결합하는 임의의 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 아연 핑거 단백질 (ZFP), TAL-이펙터 도메인, CRISPR/Cas 시스템의 sgRNA 등) 및 (ii) 기능적 도메인 (예를 들어, 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인, DNMT 단백질, 히스톤 데아세틸라제 등으로부터의 도메인)을 포함한다.

본원에 기재된 바와 같은 인공 전사 인자의 DNA-결합 도메인은 임의의 선택된 표적 유전자의 적어도 12개의 뉴클레오티드 (인접 또는 비-인접)의 임의의 표적 부위에 결합할 수 있다. 또한, 인공 전사 인자의 DNA-결합 도메인은 동일하거나, 상이하거나 또는 중첩되는 표적 부위에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 상이한 비-중첩 표적에 결합한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, DNA-결합 도메인 중 적어도 2개는 중첩되는 표적 부위에 결합한다. 다른 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 서로 약 800개 염기 쌍 내의 표적 부위에 결합한다. 다른 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 서로 약 10,000개 (또는 그 초과)의 염기 쌍 내의 표적 부위에 결합한다. 추가 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 조정될 표적 유전자의 전사 개시 부위 (TSS)의 어느 하나의 측면의 근처 (예를 들어, 0 내지 약 600개 염기 쌍 (또는 그 사이의 임의의 값) 내), 예컨대 0- 약 300개 염기 쌍 (또는 그 사이의 임의의 값), 0- 약 200 (또는 그 사이의 임의의 값), 또는 0- 약 100개 염기 쌍 (또는 그 사이의 임의의 값) 내에 결합한다. 인공 전사 인자의 DNA-결합 도메인의 일부 또는 전부는 이중 가닥 표적 (예를 들어, 내인성 유전자)의 센스 가닥에 결합하거나; 일부 또는 전부는 안티센스 가닥에 결합할 수 있거나; 또는 1개 이상은 센스 가닥에 결합할 수 있고, 1개 이상은 안티센스 가닥에 결합할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 조성물은 조정 (예를 들어, 억제)을 위한 임의의 유전자를 표적화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 유전자는 타우 (MAPT) 유전자 또는 Htt 유전자이다. 일부 실시양태에서, 표적은 돌연변이체 C9orf72 유전자이다. 다른 비제한적 실시양태에서, 표적 유전자는 SNCA 유전자, SMA 유전자, ATXN1 유전자, ATXN2 유전자, ATXN3 유전자, ATXN7 유전자, PRNP 유전자, Ube3a-ATS-코딩 유전자, DUX4 유전자, PGRN 유전자, MECP2 유전자, FMR1 유전자, CDKL5 유전자, LRKK2 유전자, APOE 유전자, RHO 유전자, 또는 유전자 발현의 조정이 요구되는 임의의 유전자이다. DNA-결합 도메인의 임의의 조합이 본원에 기재된 유전자 조정제에 사용될 수 있다 (예를 들어, ZFP, TALE 및/또는 sgRNA, 중첩 및/또는 비-중첩 표적 부위, TSS에 대한 근접성, 센스 또는 안티센스 가닥 결합 등의 임의의 조합).

특정 실시양태에서, 유전자 조정제의 인공 전사 인자의 DNA-결합 도메인 중 1개 이상은 ZFP-TF를 형성하기 위해 ZFP를 포함한다. 본원에 기재된 아연 핑거 단백질 중 임의의 것은 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 아연 핑거를 포함할 수 있고, 각각의 아연 핑거는 선택된 표적 서열(들) (예를 들어, 유전자(들)) 내의 표적 하위부위에 결합하는 인식 나선을 갖는다. 표적 하위부위는 인접 또는 비-인접할 수 있다. 특정 실시양태에서, 유전자 조정제는 복수의 ZFP-TF, 예를 들어 복수의 ZFP-TF 리프레서를 포함한다. ZFP는 선택된 유전자 내의 임의의 표적 부위에 결합할 수 있다.

다른 실시양태에서, 유전자 조정제의 인공 전사 인자의 DNA-결합 도메인 중 1개 이상은 반복 가변 이잔기 (RVD) 영역이 12개 이상의 뉴클레오티드의 선택된 표적 부위에 결합하는 TAL-이펙터 도메인 단백질 (TALE)-TF를 형성하기 위해 TALE를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 RVD는 비-특이적 DNA 결합 특징을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 조정제의 인공 전사 인자의 DNA-결합 도메인 중 1개 이상은 선택된 표적 서열에 결합하는 단일 가이드 RNA (CRISPR/Cas-TF 시스템을 형성하기 위함)를 포함한다. DNA-결합 도메인은 모두 동일한 유형일 수 있거나, 또는 상이한 DNA-결합 도메인을 갖는 인공 전사 인자를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 유전자 조정제의 2개 이상의 인공 전사 인자는 동일한 유형 (예를 들어, 모두 ZFP-TF, 모두 TAL-TF, 모두 CRISPR/Cas-TF)일 수 있거나, 또는 상이한 유형의 인공 전사 인자 (예를 들어, ZFP-TF, TALE-TF, CRISPR/Cas-TF 등)의 조합을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 인공 전사 인자 (ZFP-TF, TALE-TF, CRISPR/Cas-TF 등)는 DNA-결합 도메인과 작동가능하게 연결되어 배치된 1개 이상의 기능적 도메인을 포함할 수 있다. 기능적 도메인은, 예를 들어, 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제 도메인을 포함할 수 있다. DNA-결합 도메인과 함께 사용하기 위한 활성화 도메인 또는 억제 도메인을 선택함으로써, 이러한 분자는 표적 유전자의 발현을 활성화시키거나 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 유전자 조정제의 인공 TF 중 임의의 것에서, 기능적 도메인 (예를 들어, 전사 활성화 도메인 또는 억제 도메인)은 야생형 (예를 들어, P65, KRAB, KOX)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 기능적 도메인은 시스로 연결된 ZFP 사이의 재조합을 방지하는 코돈-다양화된 억제 도메인 (예를 들어, nKOX, mKOX, cKOX)을 포함한다. 유전자 조정제의 인공 TF는 동일하거나 상이한 기능적 도메인 (예를 들어, 야생형 및 또는 변형된 (예를 들어, 코돈-다양화된) 억제 도메인의 상이한 조합)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 기능적 또는 조절 도메인은 히스톤 번역후 변형에서 소정의 역할을 할 수 있다. 일부 경우에, 기능적 도메인은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT), 히스톤 데아세틸라제 (HDAC), 히스톤 메틸라제, 또는 히스톤을 sumo화 또는 비오티닐화하는 효소, 또는 번역후 히스톤 변형 조절된 유전자 억제를 가능하게 하는 다른 효소 도메인이다 (Kousarides (2007) Cell 128:693-705). 다른 실시양태에서, 인공 전사 인자는 DNMT 도메인 (예를 들어, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 진핵생물을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 기능적 (조절) 도메인의 활성은 외인성 소분자 또는 리간드에 의해 조절되어 세포의 전사 기구와의 상호작용은 외인성 리간드의 부재 하에서는 일어나지 않을 것이다. 이러한 외부 리간드는 ZFP-TF, CRISPR/Cas-TF 또는 TALE-TF와 전사 기구의 상호작용의 정도를 제어한다. 조절 도메인(들)은 1개 이상의 ZFP, sgRNA/dCas 또는 TALE 사이, 1개 이상의 ZFP, sgRNA/dCas 또는 TALE의 외부, 및 그의 임의의 조합을 포함하여, ZFP, sgRNA/dCas 또는 TALE 중 1개 이상의 임의의 부분(들)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조절 도메인은 표적화된 유전자의 유전자 발현의 억제를 발생시킨다.

특정 실시양태에서, 2개 이상의 인공 전사 인자를 포함하는 유전자 조정제는 리프레서이고, 이는 표적 유전자의 발현을 야생형 발현 수준과 비교하여 적어도 50% 내지 100% (또는 그 사이의 임의의 값) 억제한다. 일부 실시양태에서, 유전자 리프레서는 표적 유전자의 발현을 야생형 발현 수준과 비교하여 적어도 75% 억제한다. 추가 실시양태에서, 유전자 조정제는 리프레서이고, 유전자가 단일 유전자 조정제 (인공 전사 인자)에 의해 조정되는 경우의 발현 수준과 비교하여 적어도 10% 내지 100%만큼 발현을 억제한다. 다른 실시양태에서, 유전자 조정제는 활성화제이고, 야생형 발현 수준 및/또는 유전자가 단일 유전자 조정제에 의해 조정되는 경우의 발현 수준과 비교하여 약 1 내지 5-배 또는 그 초과 (최대 100-배 이상 포함)만큼 유전자 발현을 활성화시킨다 (문헌 [Perez-Pinera et al., (2013) Nat Method 10(3):239-42] 참조). 본원에 기재된 유전자 조정제 중 임의의 것은 추가로 오프-타겟 유전자 조정을 감소시킬 수 있다 (예를 들어, 약 50% 또는 약 75% 또는 약 90% 또는 약 100% 초과의 오프-타겟 조정).

본원에 기재된 유전자 조정제는 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질 형태를 포함한 임의의 형태로 대상체에게 제공될 수 있을 뿐만 아니라 이러한 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질을 포함하는 제약 조성물로서도 제공될 수 있다.

일부 측면에서, 유전자 조정제 (또는 그의 성분, 예를 들어 인공 전사 인자의 1개 이상의 DNA-결합 도메인)는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 사용하여 폴리뉴클레오티드 형태로 제공된다. 특정 실시양태에서, 유전자 조정제의 모든 인공 전사 인자를 전달하기 위해 단일 폴리뉴클레오티드가 사용되는 한편, 다른 실시양태에서, 복수의 인공 전사 인자를 전달하기 위해 (동일하거나 상이한 유형의) 2개 이상의 폴리뉴클레오티드가 임의의 조합 또는 순서로 사용된다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 (예를 들어, 유전자 조정제 (리프레서)를 코딩하는) 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 유전자 전달 벡터이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, Ad5/F35 벡터), 통합 적격 또는 통합-결함 렌티바이러스 벡터를 포함한 렌티바이러스 벡터 (LV), 또는 아데노바이러스 연관 바이러스 벡터 (AAV)이다. 특정 실시양태에서, 유전자 조정제(들)는 관련 기술분야에 공지된 AAV 벡터 변이체 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,585,971 및 7,198,951; 미국 공개 번호 20170119906)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 1개 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV rh10, 이들 벡터의 유사형 (예를 들어, AAV2/8, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/9 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 적어도 1개의 AAV 벡터 (또는 그의 유사형 또는 변이체) 상에서 운반된다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있는 AAV 변이체이다 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,585,971). 일부 실시양태에서, 인공 전사 인자는 1개 이상의 다중-시스트론 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, AAV 벡터 또는 mRNA), 즉 본원에 기재된 유전자 조정제의 인공 전사 인자 중 적어도 2개 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 운반된다. 일부 실시양태에서, 단일 다중-시스트론 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, AAV 벡터 또는 mRNA)는 본원에 기재된 유전자 조정제의 모든 인공 전사 인자를 코딩한다. 다중-시스트론 폴리뉴클레오티드에서 코딩 서열은 자기-절단 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 분리될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 조정제의 2개 이상의 인공 전사 인자는 본원에 기재된 바와 같은 유전자 조정제를 코딩하는 바이러스 및 비-바이러스 유전자 전달 비히클 (예를 들어, mRNA, 플라스미드, AAV 벡터, 렌티바이러스 벡터, Ad 벡터)을 포함한 1개 이상의 벡터에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 조정제의 2개 이상의 인공 전사 인자는 별개의 벡터에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 조정제의 2개 이상의 인공 전사 인자의 성분 (예를 들어 sgRNA)은 다른 성분 (예를 들어 Cas)과 개별적으로 코딩된다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다. 일부 측면에서, mRNA는 화학적으로 변형될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kormann et al., (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157] 참조). 다른 측면에서, mRNA는 캡을 포함할 수 있다 (예를 들어, ARCA 캡 (미국 특허 번호 7,074,596 및 8,153,773 참조)). 추가 실시양태에서, mRNA는 비변형된 및 변형된 뉴클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있다 (미국 특허 공개 번호 2012/0195936 참조). 추가 실시양태에서, mRNA는 다중-시스트론일 수 있고, 예를 들어 IRES 또는 자기-절단 펩티드와 같은 서열에 의해 연결된 2개 이상의 전사 인자를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 발현의 조정 (예를 들어, 억제)을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 폴리뉴클레오티드, 1개 이상의 유전자 전달 비히클, 및/또는 유전자 조정제를 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것에 의하는 것을 포함하는, 유전자 발현의 조정 (예를 들어, 억제)을 필요로 하는 대상체에서 유전자 발현을 조정 (예를 들어, 억제)하기 위한 방법 및 용도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 유전자의 이상 발현과 연관된 질환을 치료 및/또는 예방하는 것을 포함하여, 대상체에서 유전자 발현을 억제하기 위해 사용된다 (예를 들어, 타우병증에서 타우, ALS의 치료를 위해 돌연변이체 C9orf72, HD에서 돌연변이체 Htt; 프리온 장애의 치료를 위해 프리온 유전자; PD의 치료를 위해 α-시뉴클레인 및/또는 상기 기재된 바와 같은 다른 유전자). 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 AD를 치료 및/또는 예방하기 위한 것을 포함하여, 대상체에서 타우 발현을 억제하기 위해 사용되는 한편, 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 (예를 들어, 대상체에서 돌연변이체 Htt의 양을 감소시킴으로써) HD를 치료 및/또는 예방하기 위한 것을 포함하여, 대상체에서 Htt 발현을 억제하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 ALS를 치료 및/또는 예방하기 위한 것을 포함하여, 대상체에서 돌연변이체 C9Orf72 (예를 들어 확장된) 발현을 억제하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 프리온 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 것을 포함하여, 대상체에서 프리온 발현을 억제하기 위해 사용된다. 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 PD를 치료 및/또는 예방하기 위한 것을 포함하여, 대상체에서 α-시뉴클레인 발현을 억제하기 위해 사용된다.

본원에 기재된 조성물은 지속적인 기간 (예를 들어, 약 4주, 약 3개월, 약 6개월 내지 약 1년 또는 그 초과) 동안 유전자 발현 수준을 감소시키고, 대상체의 임의의 부분에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 뇌 (예를 들어 전전두 피질, 두정 피질 엽, 후두 피질 엽을 포함한 전두 피질 엽; 예를 들어 내후각 피질, 해마, 뇌간, 선조체, 시상, 중뇌, 소뇌를 포함한 측두 피질 엽을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 및 척수 (요추, 흉추 및 경추 영역을 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 사용된다.

본원에 기재된 조성물은 정맥내, 근육내, 뇌실내, 척수강내, 두개내, 정맥내, 안와 (안와후 (RO)) 및/또는 수조내 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 투여 수단에 의해 대상체에게 제공될 수 있다. 전달은 정맥내로, 근육내로, 경구로, 점막으로 등을 포함하여 대상체의 임의의 부분으로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 전달은 캐뉼라의 사용을 통한 것을 포함한 임의의 적합한 수단 또는 임의의 다른 전달 기술에 의해 임의의 뇌 영역, 예를 들어, 해마 또는 내후각 피질에 대해 이루어진다. 임의의 AAV 벡터는 벡터가 직접 투여되지 못하는 뇌 영역으로의 진행성 및 역행성 축삭 이동을 통하는 것을 포함하여, 대상체의 뇌로의 리프레서의 광범위한 전달을 제공한다 (예를 들어, 피각으로의 전달은 다른 구조 예컨대 피질, 흑색질, 시상 등으로의 전달을 발생시킴). 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이고, 다른 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류 또는 설치류이다. 투여는 단일 용량으로, 동시에 주어지는 다중 투여로, 또는 (투여 사이의 임의의 시기에의) 다중 투여로 이루어질 수 있다.

또한, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 유전자 조정제는 목적하는 효과를 제공하는 임의의 농도 (용량)로 전달될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 유전자 조정제는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 약 10,000 내지 약 500,000개 벡터 게놈/세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다. 일부 실시양태에서, 유전자 조정제-AAV는 약 10,000 내지 약 100,000, 또는 약 100,000 내지 약 250,000, 또는 약 250,000 내지 약 500,000개 벡터 게놈 (VG)/세포 (또는 그 사이의 임의의 값)의 용량으로 전달된다. 특정 실시양태에서, 리프레서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 약 250 내지 약 1,000 (또는 그 사이의 임의의 값)의 감염 다중도 (MOI)로 전달된다. 다른 실시양태에서, 유전자 조정제는 플라스미드 벡터를 사용하여 약 0.01-약 1,000 ng/약 100,000개 세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다. 일부 실시양태에서, 유전자 조정제는 플라스미드 벡터를 사용하여 약 0.01 내지 약 1, 약 1 내지 약 100, 약 100 내지 약 500, 또는 약 500 내지 약 1000 ng/약 100,000개 세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다. 다른 실시양태에서, 유전자 조정제는 mRNA로서 약 0.01 내지 약 3000 ng/약 100,000개 세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다. 다른 실시양태에서, 유전자 조정제는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 약 1-300 μL의 고정 부피로 뇌 실질에 약 1E11-1E14개 VG/mL로 전달된다. 다른 실시양태에서, 리프레서는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 약 0.1-25 mL의 고정 부피로 CSF에 약 1E11-1E14개 VG/mL로 전달된다.

또 다른 측면에서, 2개 이상의 (상승작용적) 인공 전사 인자 (TF)를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 선택된 유전자에 대해 표적화된 복수의 인공 전사 인자 (예를 들어, ZFP-TF)를 유전자 발현에 대한 그의 영향에 대해 개별적으로 및 조합하여 스크리닝하고; 인공 ZFP-TF의 상승작용적 조합을 확인하는 것을 수반한다. 스크리닝은 공지된 기술을 사용하여 수행된다. 또한, 실시예를 참조한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (i) 약 1-600개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격된 표적 부위에 결합하는 2개 이상의 인공 전사 인자를 선택하는 단계 및/또는 (ii) TF의 기능적 도메인이, 표적 유전자에 결합된 경우에, 서로 약 1-600개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격되는 2개 이상의 인공 전사 인자를 선택하는 단계를 수반한다. 특정 실시양태에서, 방법은 주기적 방식으로 표적 서열 내의 표적 부위, 예를 들어, 대략 80개의 염기 쌍만큼 분리된 표적 부위 (예를 들어, 약 0-80개의 염기 쌍; 약 160 내지 240개의 염기 쌍; 약 320 내지 400개의 염기 쌍 또는 약 480 내지 560개의 염기 쌍만큼 분리된 표적 부위) 및/또는 대략 100개의 염기 쌍만큼 분리된 표적 부위 (예를 들어, 약 0 내지 약 100개의 염기 쌍; 약 200 내지 약 300개의 염기 쌍; 또는 약 400 내지 약 500개의 염기 쌍만큼 분리된 표적 부위)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 표적 부위에서 대략 80-100개의 뉴클레오티드 (또는 그 사이의 임의의 값)에 걸친 간격만큼 분리된 표적 부위에 결합하는 상승작용적 인공 TF를 스크리닝하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 부위는 0 내지 약 80 (또는 그 사이의 임의의 값); 0 내지 약 100 (또는 그 사이의 임의의 값); 약 160 내지 240 (또는 그 사이의 임의의 값); 약 200 내지 약 300 (또는 그 사이의 임의의 값); 약 220 내지 약 300 (또는 그 사이의 임의의 값); 약 300 내지 대략 0 내지 약 80 (또는 그 사이의 임의의 값), 대략 160 내지 약 220 (또는 그 사이의 임의의 값), 대략 260 내지 약 400 (또는 그 사이의 임의의 값), 또는 대략 500 내지 약 600개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격되어 분리된다.

특정 측면에서, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것은 주기적 방식으로 기능적 도메인이 서로 분리되어 있는 상승작용적 인공 TF, 예를 들어, 기능적 도메인이 대략 80개 염기 쌍 (예를 들어, 약 0 내지 약 80개 염기 쌍; 약 160 내지 약 240개 염기 쌍; 약 320 내지 약 400개 염기 쌍 또는 약 480 내지 약 560개 염기 쌍만큼 분리된 기능적 도메인 및/또는 대략 100개 염기 쌍만큼 분리된; 약 0 내지 약 100개 염기 쌍; 약 200 내지 약 300개 염기 쌍; 또는 약 400 내지 약 500개 염기 쌍만큼 분리된 기능적 도메인)만큼 분리된 상승작용적 TF를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 표적 유전자에서 대략 80-100개의 뉴클레오티드 (또는 그 사이의 임의의 값)에 걸친 간격만큼 분리된 기능적 도메인을 스크리닝하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 기능적 도메인은 서로 대략 0 내지 80 (또는 그 사이의 임의의 값), 대략 160 내지 220 (또는 그 사이의 임의의 값), 대략 260 내지 400 (또는 그 사이의 임의의 값), 또는 대략 500 내지 600개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격된다. 추가 실시양태에서, 방법은 전사 개시 부위 (TSS)의 어느 하나의 측면의 약 800개 염기 쌍 (또는 그 사이의 임의의 값) 이내, 바람직하게는 TSS의 어느 하나의 측면의 약 600개 염기 쌍 이내, 보다 더 바람직하게는 TSS의 약 300개 염기 쌍 이내인 표적 부위에 결합하는 상승작용적 인공 TF에 대해 스크리닝하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, TF는 TSS와 TSS의 +200 (또는 그 사이의 임의의 값) 사이에 있는 표적 부위에 결합한다. 방법은 동일한 안티센스 (-) 또는 센스 (+) 가닥에 또는 상이한 가닥에 (어느 하나의 배향으로 +/-) 결합하는 상승작용적 TF에 대해 스크리닝하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 인공 TF가 개별 TF와 비교하여 약 1-배 초과, 약 2-배, 약 3-배, 약 4-배, 약 5-배, 약 6-배, 약 7-배, 약 8-배 또는 그 초과의 상승작용적 효과 (활성 및/또는 특이성의 증가) (및/또는 예상된 상가적 효과)를 나타낸다는 것을 확인시켜 준다.

따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 1종 이상의 유전자의 바람직하지 않은 발현과 연관된 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터 (예를 들어, 플라스미드) 및/또는 그의 조합을 사용하여 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질 (또는 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질을 포함하는 제약 조성물)이 전달될 수 있는 조성물을 수반한다. 본원에 기재된 바와 같은 조성물 (단백질, 폴리뉴클레오티드, 세포 및/또는 이들 단백질, 폴리뉴클레오티드 및/또는 세포를 포함하는 제약 조성물)의 투여는 장애 (예를 들어, HD, AD, ALS, 다른 타우병증 또는 발작)와 연관된 임상 증상 중 임의의 것의 호전 또는 제거, 뿐만 아니라 CNS 세포 (예를 들어, 뉴런, 성상세포, 미엘린 등)의 기능 및/또는 수의 증가를 포함하나 이에 제한되지는 않는 치료 (임상) 효과를 발생시킨다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 유전자 발현을 (본원에 기재된 바와 같은 유전자 조정제를 제공받지 않은 대조군과 비교하여) 적어도 약 30%, 또는 약 40%, 바람직하게는 적어도 약 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 약 90%, 또는 90% 초과만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 50% 감소가 달성된다. 본원에 기재된 방법에서 조성물 중 임의의 것을 사용하여, 방법은 대상체의 1개 이상의 세포 (예를 들어, HD, ALS 또는 AD 뉴런)에서 표적 대립유전자 (예를 들어, Htt, 프리온, SNCA, 타우 또는 C9ORF72)의 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 또는 약 95% 이상의 억제를 생성할 수 있다.

따라서, 다른 측면에서, 1개 이상의 AAV 벡터를 사용하여 대립유전자의 조정제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 바람직하지 않은 유전자 발현과 연관된 질환 (예를 들어, HD, AD, ALS)을 예방 및/또는 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, AAV는 유전자 조정제를 코딩하고, 뇌실내, 척수강내, 또는 수조내 전달을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 전달 방법을 통해 CNS (뇌 및/또는 CSF)에 투여된다. 다른 실시양태에서, 유전자 조정제를 코딩하는 AAV는 대상체의 실질 (예를 들어, 해마 및/또는 내후각 피질) 내로 직접 투여된다. 다른 실시양태에서, 유전자 조정제를 코딩하는 AAV는 정맥내로 (IV) 투여된다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 투여는 1회 (단일 투여) 수행될 수 있거나, 동시의 다중 투여에 의해 수행될 수 있거나, 또는 투여당 동일하거나 상이한 용량으로 다수회 (투여 사이에는 임의의 시간이 존재함) 수행될 수 있다. 다수회 투여되는 경우, 동일하거나 상이한 투여량 및/또는 투여 방식의 전달 비히클이 사용될 수 있다 (예를 들어, 상이한 AAV 벡터가 IV 및/또는 ICV로 투여됨). 일부 실시양태에서, 방법은, 모두 방법을 제공받지 않은 대상체와 비교하여, 또는 방법을 제공받기 전의 대상체 자신과 비교하여, 대상체에서, 예를 들어 AD를 갖는 대상체의 AD 뉴런, 또는 HD를 갖는 대상체의 HD 뉴런, 또는 ALS를 갖는 대상체의 ALS 뉴런에서 돌연변이체 단백질의 응집을 감소시키는 방법 (예를 들어, 타우 응집의 특징인 신경원섬유 엉킴 (NFT)을 감소시키는 방법; 돌연변이체 Htt 응집을 감소시키는 방법; C9ORF72 유전자 ALS에서 확장된 GGGGCC의 불완전 RNA 전사체로부터 유래된 단백질의 응집체를 감소시키는 방법); 뉴런 또는 뉴런의 집단 (예를 들어, HD 또는 AD 뉴런 또는 HD 또는 AD 뉴런의 집단)에서 아폽토시스를 감소시키는 방법; ALS 뉴런에서 확장된 GGGGCC 유전자좌의 불완전 RNA 전사체를 포함하는 핵 병소를 감소시키는 방법; 뉴런 과다흥분성을 감소시키는 방법; 아밀로이드 베타 유도된 독성 (예를 들어, 시냅스 손실 및/또는 신경염성 이영양증)을 감소시키는 방법; 및/또는 HD 또는 AD 대상체에서 1종 이상의 인지 기능의 손실을 감소시키는 방법을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 1종 이상의 하기: 신경독성, 신경교증, 이영양성 신경돌기, 척추 손실, 흥분독성, 피질 및 해마 수축, 수지상 타우 축적, 인지 (예를 들어, 설치류 모델에서의 방사상 미로 및 모리스 수중 미로, 공포 조건화 등), 및/또는 운동 결핍을 포함한, HD 또는 타우병증의 바이오마커 및/또는 증상의 감소를 발생시킨다.

일부 측면에서, 세포 내의 병원성 종 (예를 들어, 타우, Htt, C9ORF72, 프리온, SNCA 코딩된 단백질)의 양을 감소시키기 위한 본 발명의 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 과인산화된 타우의 감소를 발생시킨다. 일부 경우에, 과인산화된 타우의 감소는 가용성 또는 과립상 타우의 감소를 발생시킨다. 다른 실시양태에서, 병원성 타우 종의 감소는 본 발명의 방법 및/또는 조성물에 따라 치료되지 않은 세포 또는 대상체와 비교하여 타우 응집을 감소시키고, 신경원섬유 엉킴 (NFT)의 감소를 유발한다. 추가 실시양태에서, 세포에서 관찰되는 NFT의 양을 역전시키는 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 대상체의 뇌 내에서 병원성 타우 종 (NFT, 과인산화된 타우)의 증식의 둔화를 유발한다. 일부 실시양태에서, 뇌를 가로지르는 병원성 타우의 증식은 중지되고, 다른 실시양태에서, 뇌를 가로지르는 병원성 타우의 증식은 역전된다. 추가 실시양태에서, 뇌 내 아밀로이드 β 플라크와 회합된 이영양성 신경돌기의 수가 감소된다. 일부 실시양태에서, 이영양성 신경돌기의 수는 연령-매칭 야생형 뇌에서 발견되는 수준으로 감소된다. 추가 실시양태에서, 대상체의 뇌에서 아밀로이드 β 플라크와 회합된 과인산화된 타우를 감소시키기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 (Htt 리프레서) 및 방법은, 예를 들어 대상체에서 세포 사멸을 감소시키고/거나, 아폽토시스를 저하시키고/거나, 세포 기능 (대사)을 증가시키고/거나, 운동 결핍을 감소시킴으로써 HD 대상체에서 치료 이익을 제공한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C9ORF72 확장과 연관된 결과를 감소시키기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 확장 (야생형 인간 게놈에서의 대략 30개의 카피로부터 fALS 환자에서의 수백 또는 심지어 수천개까지)과 연관된 병리상태는 DNA에서 비통상적인 구조의 형성 및 일부 유형의 RNA-매개 독성과 관련이 있는 것으로 보인다 (Taylor (2014) Nature 507:175). 확장된 GGGGCC의 불완전 RNA 전사체는 fALS 환자 세포에서 핵 병소를 형성하고, 또한 RNA는 반복부-연관 비-ATP-의존성 번역을 거쳐, 응집되기 쉬운 3개의 단백질을 또한 생산할 수 있다 (Gendron et al., (2013) Acta Neuropathol 126:829). 일부 실시양태에서, α-시뉴클레인의 응집과 연관된 결과를 감소시키기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 응집과 연관된 병리상태는 시뉴클레인병증 예컨대 PD 및 루이 소체 치매 (DLB)에서의 알파-시뉴클레인의 미스폴딩 및 응집과 관련이 있는 것으로 보인다. 다른 실시양태에서 돌연변이체 프리온 균주의 형성과 연관된 결과를 감소시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

일부 실시양태에서, 대상체에의 투여 후, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 조정제 (예를 들어, 유전자 리프레서)의 인공 전사 인자 (예를 들어, ZFP-TF, TALE-TF 또는 CRISPR/Cas-TF) 중 2개 이상을 코딩하는 서열은 게놈 내로 삽입 (통합)되고, 한편 다른 실시양태에서, 유전자 조정제의 인공 전사 인자 중 2개 이상을 코딩하는 서열은 에피솜으로 유지된다. 대안적으로, 인공 전사 인자 중 1개 이상을 코딩하는 서열은 게놈 내로 통합될 수 있고, 나머지 1개 이상의 인공 전사 인자를 코딩하는 서열은 에피솜으로 유지될 수 있다. 일부 경우에, TF 융합체를 코딩하는 핵산은 내인성 프로모터가 발현을 구동하도록 프로모터를 포함하는 세이프 하버 부위에 (예를 들어, 뉴클레아제-매개 통합을 통해) 삽입된다. 다른 실시양태에서, 리프레서 (TF) 공여자 서열은 세이프 하버 부위 내로 (뉴클레아제-매개 통합을 통해) 삽입되고, 공여자 서열은 리프레서의 발현을 구동하는 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 조정제를 코딩하는 서열은 전달 후에 염색체외적으로 (에피솜으로) 유지되고, 이종 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 광범위하게 발현되고, 한편 다른 실시양태에서, 프로모터는 조직 또는 세포/유형 특이적이다. 바람직한 실시양태에서, 프로모터 서열은 뉴런 세포에 대해 특이적이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 선택된 프로모터는 낮은 발현을 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직한 프로모터의 비제한적 예는 신경 특이적 프로모터 NSE, CMV, 시냅신, CAMKiia 및 MECP를 포함한다. 편재성 프로모터의 비제한적 예는 CAS 및 Ubc를 포함한다. 추가 실시양태는 미국 특허 공보 번호 20150267205에 기재된 바와 같은 자기-조절 프로모터의 사용을 포함한다.

또한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 유전자 조정제, 폴리뉴클레오티드, 제약 조성물 및/또는 세포) 중 1종 이상 뿐만 아니라 이들 조성물의 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 본원에 기재된 바와 같은 유전자 조정제 (예를 들어, 리프레서) 및/또는 조정제의 성분을 포함하고/거나 조정제 (또는 그의 성분)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 포함한다. 키트는 세포 (예를 들어, 뉴런), 시약 (예를 들어 CSF에서, 예를 들어 표적 유전자에 의해 코딩된 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 것) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 방법을 포함한 사용에 대한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.

따라서, 2개 이상의 인공 전사 인자 (TF)를 포함하는 조성물이 본원에 기재되며, 각각의 인공 전사 인자는 DNA-결합 도메인 및 기능적 도메인 (예를 들어, 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인, DNMT 단백질 예컨대 DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT), 히스톤 메틸라제, 또는 히스톤을 sumo화 또는 비오티닐화하는 효소로부터의 도메인, 및/또는 번역후 히스톤 변형 조절된 유전자 억제를 가능하게 하는 다른 효소 도메인)을 포함하고, 여기서 인공 전사 인자는 세포에서 유전자 발현을 상승작용적으로 조정 (활성화 또는 억제)한다. 표적 유전자는 타우 (MAPT) 유전자, Htt 유전자, 돌연변이체 Htt 유전자, 돌연변이체 C9orf72 유전자, SNCA 유전자, SMA 유전자, ATXN2 유전자, ATXN3 유전자, PRP 유전자, Ube3a-ATS 코딩 유전자, DUX4 유전자, PGRN 유전자, MECP2 유전자, FMR1 유전자, CDKL5 유전자, 및/또는 LRKK2일 수 있다. 세포는 단리될 수 있거나, 또는 살아있는 대상체 내에 존재할 수 있다. 본원에 기재된 상승작용적 TF 조성물은 야생형 발현 수준 (및/또는 비처리 대조군)과 비교하여 표적 유전자의 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-배 또는 그 초과의 조정을 나타낼 수 있다. DNA-결합 도메인은 12개 이상의 뉴클레오티드의 표적 부위에 결합할 수 있고, 이는 아연 핑거 단백질 (ZFP), TAL-이펙터 도메인, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템의 sgRNA일 수 있다. 조성물의 2개 이상의 인공 전사 인자는 (i) 선택된 표적 유전자의 적어도 12개의 뉴클레오티드의 임의의 표적 부위에 결합할 수 있고/거나; (ii) 서로 10,000개 이상의 염기 쌍 내의 표적 부위에 결합할 수 있고/거나; (iii) 조정될 표적 유전자의 전사 개시 부위 (TSS)의 어느 하나의 측면의 0 내지 300개 염기 쌍 내의 표적 부위에 결합할 수 있고/거나; (iv) 이중 가닥 표적의 센스 및/또는 안티센스 가닥에 결합할 수 있다. 유전자 조정 (예를 들어, 억제)은 야생형 발현 수준과 비교하여 적어도 50% 내지 100%일 수 있다. 기능적 도메인의 활성은 외인성 소분자 또는 리간드에 의해 조절될 수 있어 세포의 전사 기구와의 상호작용은 외인성 리간드의 부재 하에서는 일어나지 않을 것이다. 또한, 1개 이상의 상승작용적 TF 조성물을 포함하는 제약 조성물이 본원에 기재된다.

1개 이상의 조성물 및/또는 1개 이상의 조성물의 상승작용적 TF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 (예를 들어, 단리된 것 또는 살아있는 대상체 내에 존재하는 것)가 또한 제공된다. 세포는 뉴런, 신경교 세포, 상의 세포, 간세포, 신경상피 세포, 임의로 HD 또는 AD 뉴런 또는 신경교 세포, 또는 간세포를 포함할 수 있다. 상승작용적 TF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있고/거나 에피솜으로 유지될 수 있다. 조성물은 유전자 조정제를 제공받지 않은 대조군과 비교하여 또는 상승작용적 조성물의 단일 TF를 제공받은 세포 또는 대상체와 비교하여 유전자 발현을 30%, 40%, 50% 또는 그 초과만큼 감소시킬 수 있다.

유전자 발현의 조정을 필요로 하는 중추 신경계 (CNS) 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 본원에 기재된 1종 이상의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 중추 신경계 (CNS) 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 (예를 들어, 대상체의 뉴런에서) 유전자 발현을 조정하는 방법이 또한 제공된다. CNS 질환 또는 장애는 헌팅톤병 (HD) (Htt의 억제에 의함), 근위축성 측삭 경화증 (ALS) (C9orf 유전자의 억제에 의함), 프리온 질환 (프리온 유전자의 억제에 의함), 파킨슨병 (PD) (α-시뉴클레인 발현의 억제에 의함), 루이 소체 치매 (DLB) (α-시뉴클레인 발현의 억제에 의함) 및/또는 타우병증 (MAPT의 억제에 의함)일 수 있고, 임의로 여기서 CNS 질환 또는 장애의 바이오마커, 병원성 종 및/또는 증상은 유전자 조정에 의해 감소된다 (예를 들어, 신경독성, 신경교증, 이영양성 신경돌기, 척추 손실, 흥분독성, 피질 및 해마 수축, 수지상 타우 축적, 인지 결핍, 운동 결핍, 아밀로이드 β 플라크와 연관된 이영양성 신경돌기, 타우 병원성 종, mHtt 응집체, 과인산화된 타우, 가용성 타우, 과립상 타우, 타우 응집, 및/또는 신경원섬유 엉킴 (NFT)이 감소됨). 상승작용적 인공 전사 인자를 포함하는 조성물은 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 비-바이러스 또는 바이러스 벡터)를 사용하여 (세포 또는 대상체에게) 제공될 수 있다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드 및/또는 단일 또는 다중-시스트론 mRNA 벡터를 포함한다. 1개 이상의 조성물의 전달에 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 (LV) 및/또는 아데노바이러스 연관 바이러스 벡터 (AAV) 중 1개 이상을 포함한다. 이들 방법 중 임의의 것에서, 유전자 발현은 대상체의 뇌에서 4주, 3개월, 6개월 내지 1년 또는 그 초과의 기간 동안 감소될 수 있다. 추가로, 예컨대 비제한적으로 대상체의 전두 피질 엽, 두정 피질 엽, 후두 피질 엽; 측두 피질 엽, 해마, 뇌간, 선조체, 시상, 중뇌, 소뇌 및/또는 척수에 대해 정맥내, 근육내, 뇌실내, 척수강내, 두개내, 점막, 경구, 정맥내, 안와 및/또는 수조내 투여가 사용될 수 있다. 조성물은 (i) 10,000 - 500,000개 벡터 게놈/세포의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터; (ii) 250 내지 1,000의 MOI의 렌티바이러스 벡터; (iii) 0.01-1,000 ng/100,000개 세포의 플라스미드 벡터; 및/또는 (iv) 0.01-3000 ng/100,000개 세포의 mRNA (단일 mRNA 또는 다중-시스트론)를 사용하여 전달될 수 있다. 방법은 AAV 벡터 (상승작용적 TF 조성물을 운반함)를 10,000 내지 100,000, 또는 100,000 내지 250,000, 또는 250,000 내지 500,000개 벡터 게놈 (VG)/세포의 용량으로; 1-300 μL의 고정 부피로 뇌 실질에 1E11-1E14개 VG/mL로 및/또는 0.5-10 mL의 고정 부피로 CSF에 1E11-1E14개 VG/mL로 전달하는 것을 수반할 수 있다.

선택된 유전자에 대해 표적화된 2개 이상의 인공 전사 인자의 개별 및 조합을 유전자 발현에 대한 그의 영향에 대해 스크리닝하고; 인공 ZFP-TF의 상승작용적 조합을 확인하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 상승작용적 인공 전사 인자를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 또한 제공된다. 스크리닝된 2개 이상의 인공 전사 인자는 (i) 표적 부위에 결합하고/거나 1-600개의 염기 쌍만큼 이격된 기능적 도메인을 포함할 수 있고/거나; (ii) 대략 1 내지 80; 160 내지 220; 260 내지 400; 또는 500 내지 600개의 염기 쌍만큼 이격된 표적 부위에 결합할 수 있고/거나; (iii) 서로 대략 1 내지 80; 260 내지 400; 또는 500 내지 600개의 염기 쌍만큼 이격되어 분리된 기능적 도메인을 포함할 수 있고/거나; (iv) 전사 개시 부위 (TSS)의 어느 하나의 측면의 400개 염기 쌍 내에 있는 표적 부위에 결합할 수 있고/거나; (v) 동일한 안티센스 (-) 또는 센스 (+) 가닥에 또는 상이한 가닥에 어느 하나의 배향으로 결합할 수 있다. 이들 방법에 의해 수득된 상승작용적 인공 TF는 개별 TF보다 적어도 2-배 더 활성일 수 있다.

도 1은 인공 전사 인자 (예를 들어 ZFP 리프레서)를 코딩하는 mRNA로 형질감염된 Neuro2A 세포에서의 표시된 ZFP-TF에 의한 타우 (MAPT) 유전자의 억제의 예시적인 결과를 도시한다. 상부 2개의 패널 ("ZFP 1" 및 ZFP 2")은 단독으로 사용된 경우의 표시된 ZFP-TF (또한, 미국 공개 번호 20180153921 참조)의 결과를 보여준다. 제3 패널 ("ZFP 1 + 2")은 표시된 ZFP 중 2개를 개별 형질감염과 동등한 용량으로 함께 사용한 경우의 결과를 보여준다. 대조군은 제3 패널의 우측에 제시된다 (MAPT를 또한 표적화하는 양성 대조군으로서 ZFP 52288 (표 1 참조) ("288"); BCL11A를 표적화하는 음성 대조군 ZFP ("BCL"); GFP ("GFP"); 및 모의 형질감염된 대조군 ("MCK")). 상부 3개의 패널은 각각의 ZFP-TF에 대한 3종의 상이한 투여량 (좌측에서 우측으로 30, 10 및 3 ng mRNA)에서의 타우 억제를 보여준다. 또한 음영 구역 아래에 음영 그래프가 확대된 형태로 제시된다 (ZFP 52322, ZFP 52335, 및 ZFP 52322 및 52335는 좌측에 제시되고 ZFP 52364, ZFP 52374 및 ZFP 52364 및 52374는 우측에 제시됨). ZFP-TF의 6종의 상이한 용량 (좌측에서 우측으로 300, 100, 30, 10, 3 및 1 ng mRNA)에서의 타우 억제가 제시된다.
도 2는 2개 이상의 ZFP-TF 리프레서를 사용한 놀라운 상승작용적 효과 및 상승작용 점수를 유도하는데 사용된 방법을 도시한 그래프이다. 좌측 패널은 ZFP 리프레서의 표시된 수준으로의 일시적 mRNA 형질감염 후 Neuro2A 세포에서의 정규화된 타우 발현을 보여준다. 중간 패널은 조합 반응에서 형질감염되는 mRNA의 추가량의 잠재적 효과를 설명하기 위해, 용량의 2x로 형질감염된 경우의 보다 강력한 단일 리프레서 52322에 대해 예상되는 정규화된 타우 억제의 내삽 수준 (청색 선, 역삼각형)을 보여준다. 우측 패널은 예상외의 상승작용, 및 예상된 억제 (역삼각형) 및 ZFP 조합을 사용한 경우에 관찰된 억제 (원형)의 비로서 계산한 그의 점수를 보여준다.
도 3은 ZFP 리프레서를 코딩하는 mRNA로 형질감염된 Neuro2A 세포에서의 표시된 ZFP-TF에 의한 타우 (MAPT) 유전자의 억제의 예시적인 결과 및 각각의 조합에 대한 상응하는 상승작용 점수를 도시한다. 상부 2개의 패널 ("ZFP 1" 및 ZFP 2")은 단독으로 사용된 경우의 표시된 ZFP-TF (또한, 미국 공개 번호 20180153921 참조)의 결과를 보여준다. 대조군은 제3 패널의 우측에 제시된다 (MAPT를 또한 표적화하는 양성 대조군으로서 ZFP 52288 (표 1 참조) ("288"); BCL11A를 표적화하는 음성 대조군 ZFP ("BCL"); GFP ("GFP"); 및 모의 형질감염된 대조군 ("MCK")). 하부 패널은 표시된 ZFP 리프레서 쌍에 대해 상승작용적 효과를 기재한 상승작용 점수를 보여준다.
도 4는 억제 도메인 사이의 다양한 간격; ZFP-TF 리프레서 사이의 표적 부위 간격; TSS로부터의 표적 부위 거리; 및 ZFP-TF 리프레서에 의해 결합된 가닥에서의 상승작용적 효과를 보여주는 예시적인 결과의 요약을 도시한다. 상부 좌측 패널은 ZFP-TF 리프레서의 억제 (KRAB) 도메인 사이의 표시된 거리에서의 상승작용적 효과를 보여주며, 여기서 각각의 Krab 도메인 위치는 C-말단 아연 핑거의 마지막 표적화된 염기의 위치이다. 하부 좌측 패널은 TSS로부터의 다양한 표시된 거리에서의 상승작용적 효과를 보여주며, 여기서 TSS 거리는 TSS로부터 2개의 ZFP-TF 리프레서 사이의 갭 내 중심 위치까지의 거리로서 계산된다. 상부 우측 패널은 ZFP-TF 리프레서가 표시된 염기 쌍 갭만큼 분리된 표적 부위에 결합한 경우의 상승작용적 효과를 보여준다. 하부 우측 패널은 개별 ZFP-TF 리프레서가 표시된 DNA 가닥에 결합한 경우의 상승작용적 효과를 보여준다 (+/+, ZFP-TF 둘 다가 센스 가닥을 표적화함; -/-, ZFP-TF 둘 다가 안티센스 가닥을 표적화함; +/- 또는 -/+, 1개의 ZFP-TF는 센스 가닥을 표적화하고, 1개는 안티센스 가닥을 표적화함).
도 5는 표시된 ZFP-TF 리프레서 (표 1에 제시된 ZFP 설계)를 사용한 타우 발현의 억제를 도시한다. 개별 ZFP-TF에 대해 (상부 패널), 각각의 그래프는 사용된 8가지의 용량 (좌측에서 우측으로 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 ng mRNA)을 보여준다. 2개의 표시된 ZFP-TF를 포함하는 유전자 조정제에 대해, 각각의 그래프는 사용된 8가지의 용량 (좌측에서 우측으로 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 ng mRNA)을 보여준다. 모든 6개의 단일 ZFP-TF 리프레서를 또한 공동-형질감염시키고, 8가지의 용량 (좌측에서 우측으로 100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03 ng mRNA)에서 타우 억제에 대해 평가하였다. 각각의 용량 반응 곡선에 대한 EC50을 상부 우측에 나타낸다.
도 6a 내지 도 6b는 표시된 ZFP를 사용한 오프 타겟 효과 및 타우 억제 수준을 도시한다. 도 6a는 오프-타겟 사건을 보여주며: 52335는 2개의 비-표적 유전자를 억제하고 1개의 오프-타겟 유전자를 활성화시키고; 52389는 1개의 오프-타겟 부위를 활성화시키고; 52335 및 52389의 쌍은 1개의 오프-타겟 부위를 활성화시키고 1개의 오프-타겟 부위를 억제하였다. 도 6b는 표시된 ZFP-TF의 투여 후 타우의 억제를 도시한 그래프이다. 개별 ZFP-TF에 대해 (좌측 및 중간 패널), 각각의 그래프는 사용된 8가지의 용량 (좌측에서 우측으로 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 ng mRNA)을 보여준다. 2개의 표시된 ZFP-TF를 포함하는 유전자 조정제에 대해 (우측 패널), 그래프는 사용된 8가지의 용량 (좌측에서 우측으로 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 ng mRNA)을 보여준다. qPCR 분석은 2개의 ZFP-TF 리프레서를 포함하는 리프레서가 개별 리프레서보다 타우 수준을 더 많이 억제하였음을 입증하였다 (0.012x 야생형 수준).
도 7a 내지 도 7c는 다중-시스트론 mRNA를 사용한 Neuro2A 세포에서의 타우 억제, 상승작용적 ZFP-TF 쌍으로의 투여 후의 억제 동역학, 및 ZFP 유전자 조정제의 일시적 전달 후의 타우 유전자좌의 장기 침묵을 도시한다. 도 7a는 Kox 억제 도메인의 코돈-다양화된 변이체 (각각 연결된 아키텍처 내의 N-말단, 중간, 또는 C-말단 위치에 대해 nKox, mKox, 및 cKox로 지정됨)를 갖는 연결된 (다중-시스트론) 및 비연결된 인공 TF를 사용한 억제를 보여준다. 그래프 상에 제시된 바와 같은 mRNA 형태로 투여된 표시된 쌍을 사용한 결과를 제시한다. 상부 패널은 표시된 코돈-다양화된 억제 도메인 (nKOX, mKOX, cKOX)을 갖는 트리-시스트론 아키텍처에 의해 연결된 3개의 ZFP 및 바이러스 절단 펩티드 T2A 및 P2A에 의한 연결의 잠재적 배위를 보여주는 개략도이다. 중간 패널은 (각각의 그래프에서 좌측에서 우측으로) 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 및 0.1 ng mRNA의 용량으로의 비연결된 mRNA에 의한 타우 억제의 결과를 보여주고, 하부 패널은 (각각의 그래프에서 좌측에서 우측으로) 600, 200, 60, 20, 6, 2, 0.6, 및 0.1 ng mRNA의 용량으로의 표시된 링커 및 억제 도메인을 포함하는 비-시스트론 mRNA에 의한 타우 억제의 결과를 보여준다. 도 7b는 mRNA 형질감염 후 표시된 시간에서의 타우 발현 수준을 보여준다. 상부 패널은 형질감염 후 24시간 수거 시의 ZFP-TF 52322/52335를 포함하는 리프레서에 대한 전형적인 억제 데이터를 보여주는 그래프이다. 하부 그래프는 표시된 시점 (24시간, 48시간, 64시간, 72시간 및 136시간)에서의 시간 경과에 따른 6가지 용량 (300, 100, 30, 10, 3, 및 1 ng의 mRNA; 각각의 그래프에서 좌측에서 우측으로)에서의 타우 억제를 보여준다. 또한, 가장 우측의 하부 그래프에는 음성 형질감염 대조군을 제시한다 (BCL11A를 표적화하는 대조군 ZFP ("B"); GFP ("G"); 및 모의 형질감염된 대조군 ("M")). 도 7c는 일시적 ZFP 전달 (단일 인자의 경우 900/300/100 ng mRNA로의 3-용량 mRNA 형질감염 및 각각 57890-KRAB, 52322-DNMT3A, 및 57930-DNMT3L의 300/100/30 ng mRNA로의 삼중 형질감염) 후 형질감염 1, 4, 또는 7일 후의 Neuro2A 세포에서의 타우 발현 수준을 보여준다. 세포를 성장-억제된 저 혈청 배지에서 배양하여 세포 분열을 정지시켰다.
도 8a 내지 도 8c는 대조군 및 처리된 비인간 영장류 (NHP) 대상체로부터 채취한 샘플의 생체내로부터의 타우 발현 및 ZFP 수준을 도시한 그래프이다. 도 8a는 대조군 대상체 (NHP01, NHP02 및 NHP03)로부터의 결과를 보여준다. 도 8b는 단일 AAV2/9 벡터에 의해 운반된 유전자 리프레서 65918 ("918") 및 57890 ("890") (여기서 리프레서 (918 및 890)의 발현은 시냅신 (SYN1) 프로모터에 의해 구동됨) ("SYN1.918-890")으로 처리된 NHP 대상체 (NHP04, NHP05 및 NHP06)로부터의 결과를 보여준다. 도 8c는 단일 AAV2/9 벡터에 의해 운반된 유전자 리프레서 65918 ("918") 및 57890 ("890") (여기서 리프레서 (918 및 890)의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동됨) ("CMV.918-890")으로 처리된 대상체 (NHP07 및 NHP08)로부터의 결과를 보여준다 (좌측 패널). 각각의 패널에서 상부 플롯은 % 정규화된 타우 억제를 보여주고, 각각의 패널에서 하부 플롯은 ZFP 수준 (카피/ng mRNA)을 보여준다.
도 9a 내지 도 9c는 인간 iPS 뉴런에서의 타우 억제를 도시한다. 도 9a는 덜 활성인 ZFP의 조합이 조합되어 사용될 경우 상승작용을 나타낸다는 것을 보여준다 (2종이 함께 사용된 경우의 활성과 비교하여 단일 화합물로 처리된 세포에서의 3종의 단백질의 활성을 비교함). 인간 iPS 유래 뉴런을 Syn1 프로모터에 의해 조절되는 ZFP-TF를 포함하는 AAV6으로 처리하였고, 여기서 세포를 19일 후에 분석하였다. 세포를 1E5개 VG/세포로, 5-7회의 생물학적 반복실험으로 처리하였다. ****는 p < 0.0001인 유의성을 나타낸다는 것에 주목한다. 도 9b는 트랜스크립톰에서의 변화를 도시하며, 여기서 ZFP-TF가 단일 유전자 조정제로서 사용된 경우 MAPT 유전자의 약간의 억제가 발생한 반면에, 2개의 ZFP-TF가 함께 사용된 경우 MAPT 발현의 훨씬 더 큰 억제가 존재한다. 플롯은 좌측 상부 코너에 상향 또는 하향 조절된 유전자의 수를 도시하고, 여기서 이들 보고에 대한 컷 오프는 > 2배수의 상향 또는 하향 변화이다. 이들 실험에서, 19,959개의 코딩 전사체가 평가되었다. "65918n"은 65918 ZFP-TF가 nKOX 변이체를 포함한다는 것을 의미한다. "57890m"은 57890 ZFP-TF가 mKOX 변이체를 포함한다는 것을 의미한다. 도 9c는 다른 ZFP-TF 조합에 의해 발견된 결과를 도시한다. "65920n"은 65920 ZFP-TF가 nKOX 변이체를 포함한다는 것을 의미한다. "57890m"은 상기와 동일하다.
도 10은 ZFP 리프레서를 코딩하는 mRNA로 형질감염된 Neuro2A 세포에서의 예시적인 ZFP-TF (A에서 K로 지정됨)에 의한 마우스 프리온 (Prnp) 유전자의 억제의 결과 및 각각의 조합에 대한 상응하는 상승작용 점수를 도시한다. 상부 2개의 패널 ("ZFP 1" 및 ZFP 2")은 표시된 ZFP-TF의 단독으로 사용된 경우의 결과를 보여준다. 하부 패널은 표시된 ZFP 리프레서 쌍에 대한 상승작용적 효과를 기재하는 상승작용 점수를 보여준다 (조합하여 그의 용량의 2x로 시험한 경우에 보다 강한 ZFP에 의해 수득된 발현 수준 대 ZFP 조합에 의해 수득된 발현 수준의 비로서 계산됨).
도 11은 억제 도메인 사이의 다양한 간격; ZFP-TF 리프레서 사이의 표적 부위 간격; 및 TSS로부터의 표적 부위 거리에서 마우스 프리온 유전자를 표적화하는 ZFP-TF의 130개의 조합의 상승작용적 효과를 보여주는 요약을 도시한다. 상부 패널은 ZFP-TF 리프레서가 표시된 염기 쌍 갭만큼 분리된 표적 부위에 결합한 경우의 상승작용적 효과를 보여준다. 중간 패널은 ZFP-TF 리프레서의 억제 (KRAB) 도메인 사이의 표시된 거리에서의 상승작용적 효과를 보여주며, 여기서 각각의 KRAB 도메인 위치는 C-말단 아연 핑거의 마지막 표적화된 염기의 위치이다. 하부 패널은 TSS로부터의 다양한 표시된 거리에서의 상승작용적 효과를 보여주며, 여기서 TSS 거리는 TSS로부터 2개의 ZFP-TF 리프레서 사이의 갭 내 중심 위치까지의 거리로서 계산된다.
도 12는 ZFP 리프레서를 코딩하는 mRNA로 형질감염된 SK-N-MC 세포에서의 예시적인 ZFP-TF (hA에서 hJ로 지정됨)에 의한 인간 프리온 (PRNP) 유전자의 억제의 결과 및 각각의 조합에 대한 상응하는 상승작용 점수를 도시한다. 상부 2개의 패널 ("ZFP 1" 및 ZFP 2")은 표시된 ZFP-TF의 단독으로 사용된 경우의 결과를 보여준다. 하부 패널은 표시된 ZFP 리프레서 쌍에 대한 상승작용적 효과를 기재하는 상승작용 점수를 보여준다 (조합하여 그의 용량의 2x로 시험한 경우에 보다 강한 ZFP에 의해 수득된 발현 수준 : ZFP 조합에 의해 수득된 발현 수준의 비로서 계산됨).
도 13은 억제 도메인 사이의 다양한 간격; ZFP-TF 리프레서 사이의 표적 부위 간격; 및 TSS로부터의 표적 부위 거리에서 인간 프리온 유전자를 표적화하는 ZFP-TF의 130개의 조합의 상승작용적 효과를 보여주는 요약을 도시한다. 상부 패널은 ZFP-TF 리프레서가 표시된 염기 쌍 갭만큼 분리된 표적 부위에 결합한 경우의 상승작용적 효과를 보여준다. 중간 패널은 ZFP-TF 리프레서의 억제 (KRAB) 도메인 사이의 표시된 거리에서의 상승작용적 효과를 보여주며, 여기서 각각의 KRAB 도메인 위치는 C-말단 아연 핑거의 마지막 표적화된 염기의 위치이다. 하부 패널은 TSS로부터의 다양한 표시된 거리에서의 상승작용적 효과를 보여주며, 여기서 TSS 거리는 TSS로부터 2개의 ZFP-TF 리프레서 사이의 갭 내 중심 위치까지의 거리로서 계산된다.
도 14는 ZFP 리프레서를 코딩하는 mRNA로 형질감염된 SK-N-MC 세포에서의 예시적인 ZFP-TF (sA에서 sJ로 지정됨)에 의한 인간 α-시뉴클레인 (SNCA) 유전자의 억제의 결과 및 각각의 조합에 대한 상응하는 상승작용 점수를 도시한다. 상부 2개의 패널 ("ZFP 1" 및 ZFP 2")은 표시된 ZFP-TF의 단독으로 사용된 경우의 결과를 보여준다. 하부 패널은 표시된 ZFP 리프레서 쌍에 대한 상승작용적 효과를 기재하는 상승작용 점수를 보여준다 (조합하여 그의 용량의 2x로 시험한 경우에 보다 강한 ZFP에 의해 수득된 발현 수준 : ZFP 조합에 의해 수득된 발현 수준의 비로서 계산됨).
도 15는 억제 도메인 사이의 다양한 간격; ZFP-TF 리프레서 사이의 표적 부위 간격; 및 TSS로부터의 표적 부위 거리에서 인간 α-시뉴클레인 유전자를 표적화하는 ZFP-TF의 132개의 조합의 상승작용적 효과를 보여주는 요약을 도시한다. 상부 패널은 ZFP-TF 리프레서가 표시된 염기 쌍 갭만큼 분리된 표적 부위에 결합한 경우의 상승작용적 효과를 보여준다. 중간 패널은 ZFP-TF 리프레서의 억제 (KRAB) 도메인 사이의 표시된 거리에서의 상승작용적 효과를 보여주며, 여기서 각각의 KRAB 도메인 위치는 C-말단 아연 핑거의 마지막 표적화된 염기의 위치이다. 하부 패널은 TSS로부터의 다양한 표시된 거리에서의 상승작용적 효과를 보여주며, 여기서 TSS 거리는 TSS로부터 2개의 ZFP-TF 리프레서 사이의 갭 내 중심 위치까지의 거리로서 계산된다.

높은 특이성으로 표적 유전자의 유전자 발현을 조정하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 본원에 기재된 유전자 조정제는 적어도 2개의 인공 전사 인자를 포함하며, 이는 개별 인공 전사 인자와 비교하여 (상가적을 초과한) 상승작용적 효과를 제공한다. 특히, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 임의의 표적 유전자의 발현을 조정 (예를 들어, 억제 또는 활성화)하는데 사용된다. 이들 유전자 조정제는 표적 유전자의 바람직하지 않은 발현과 연관된 질환의 영향 및/또는 증상이 감소 또는 제거되도록 유전자 발현을 생체내 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 리프레서는 타우병증 (예를 들어, AD) 또는 HD를 갖는 대상체의 뇌에서 타우 또는 돌연변이체 Htt의 응집을 감소 또는 제거하고 질환의 증상을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

일반사항

본원에 개시된 방법의 실시 뿐만 아니라 조성물의 제조 및 용도는 달리 표시되지 않는 한, 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 전산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 기술분야의 기술 내에 있는 바와 같은 관련된 분야에서의 통상적인 기술을 이용한다. 이들 기술은 하기 문헌에서 충분히 설명된다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999]을 참조한다.

정의

용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용되고, 선형 또는 환상 입체 형태, 및 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 개시내용의 목적상, 이들 용어는 중합체의 길이에 대해 제한하는 것으로 해석되서는 안된다. 상기 용어는 자연 뉴클레오티드 뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티 (예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)에서 변형된 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정한 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-쌍형성 특이성을 가지며; 즉 A의 유사체는 T와 염기-쌍형성할 것이다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 1개 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.

"결합"은 거대분자 사이의 (예를 들어, 단백질 및 핵산 사이의) 서열-특이적, 비-공유 상호작용을 지칭한다. 결합 상호작용의 모든 성분이 반드시 서열-특이적 (예를 들어, DNA 백본 내의 포스페이트 잔기와의 접촉)일 필요는 없지만, 이러한 상호작용은 전체적으로 서열-특이적이어야 한다. 이러한 상호작용은 일반적으로, 10^-6 M^-1 이하의 해리 상수 (K_d)에 의해 특징화될 수 있다. "친화도"는 결합 강도를 지칭하며: 증가된 결합 친화도는 보다 낮은 K_d와 상관된다.

"결합 단백질"은 또 다른 분자에 비-공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어, DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 이는 그 자체에 결합할 수 있고/거나 (동종이량체, 동종삼량체 등을 형성하기 위함) 상이한 단백질(들)의 1개 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 1종 초과의 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 갖는다.

"아연 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 그의 구조가 아연 이온의 협조를 통해 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인, 1개 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 단백질, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종, 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로서 약칭된다.

"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 1개 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 반복 도메인은 TALE의 그의 동족 표적 DNA 서열에의 결합에 수반된다. 단일 "반복 단위" ("반복부"로도 지칭됨)는 전형적으로, 그 길이가 33-35개 아미노산이고 자연 발생 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,586,526을 참조한다.

"TtAgo"는 유전자 침묵에 수반되는 것으로 여겨지는 원핵 아르고노트 단백질이다. TtAgo는 박테리아 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus)로부터 유래된다. 예를 들어, 문헌 [Swarts et al., (2014) Nature 507(7491):258-261, G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652]을 참조한다. "TtAgo 시스템"은, 예를 들어 TtAgo 효소에 의한 절단을 위한 가이드 DNA를 포함한, 요구되는 모든 성분이다. "재조합"은 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 유전자 정보의 교환 프로세스를 지칭하며, 비-상동 말단 연결 (NHEJ) 및 상동 재조합에 의한 공여자 포획을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 목적상, "상동 재조합 (HR)"은, 예를 들어, 상동성-지정 복구 메카니즘을 통해 세포 내에서 이중 가닥 파괴의 복구 동안 일어나는 전문화된 형태의 상기 교환을 지칭한다. 이러한 프로세스는 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥 파괴를 경험한 것)의 주형 복구에 대한 "공여자" 분자를 이용하며, "비-교차 유전자 전환" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환"으로서 다양하게 공지되어 있으며, 이는 유전자 정보를 공여자에서 표적으로 전달해주기 때문이다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 전달은 파괴된 표적과 공여자 사이에 형성되는 헤테로듀플렉스 DNA의 불일치 교정, 및/또는 공여자가 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하는데 사용되는 "합성-의존적 가닥 어닐링", 및/또는 관련 프로세스를 포함할 수 있다. 이러한 전문화된 HR은 종종, 표적 분자의 서열의 변경을 초래하여, 공여자 폴리뉴클레오티드의 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오티드 내로 혼입되도록 한다.

DNA-결합 도메인 예컨대 sgRNA, 아연 핑거 결합 도메인 또는 TALE DNA 결합 도메인은, 예를 들어 선택된 표적 부위에 결합하는 sgRNA의 설계를 통해, 또는 자연 발생 아연 핑거 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (1개 이상의 아미노산의 변경)에 의해 또는 TALE 단백질의 RVD의 조작에 의해, 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 따라서, 조작된 아연 핑거 단백질 또는 TALE는 비-자연 발생인 단백질이다. DNA-결합 도메인을 조작하는 방법의 비제한적 예는 설계 및 선택이다. "설계된" 아연 핑거 단백질 또는 TALE는 자연에서 발생하지 않는 단백질로서, 그의 설계/조성은 주로 합리적인 기준으로부터 비롯된다. 합리적 설계 기준은 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이터에 관한 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용을 포함한다. "선택된" 아연 핑거 단백질 또는 TALE는 자연에서 발견되지 않고, 그의 생성은 주로 실험 과정, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택으로부터 비롯된다. 예를 들어, 미국 특허 8,586,526; 6,140,081; 6,453,242; 6,746,838; 7,241,573; 6,866,997; 7,241,574 및 6,534,261을 참조하고; 또한 국제 특허 공개 번호 WO 03/016496을 참조한다.

용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있고; 선형, 원형 또는 분지형일 수 있으며 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는, 임의의 길이의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "공여자 서열"은 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 공여자 서열은 임의의 길이, 예를 들어 2 내지 10,000개 뉴클레오티드 길이 (또는 그 사이 또는 그 위의 임의의 정수 값), 바람직하게 약 100 내지 1,000개 뉴클레오티드 길이 (또는 그 사이의 임의의 정수), 보다 바람직하게 약 200 내지 500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재한다면, 결합 분자가 결합할 핵산의 부분을 규정하는 핵산 서열이다.

"외인성" 분자는 정상적으로는 세포에 존재하지 않지만, 1종 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포에서의 정상적인 존재"는 세포의 특정한 발달 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배아 발생 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포에 대해 외인성 분자이다. 유사하게, 열 쇼크에 의해 유도된 분자는 비-열-쇼크 세포에 대해 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어, 오작동 내인성 분자의 기능적 버전 또는 정상 기능 내인성 분자의 오작동 버전을 포함할 수 있다.

외인성 분자는, 특히, 조합 화학 프로세스에 의해 생성되는 것과 같은 소분자, 또는 거대분자, 예컨대 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 폴리사카라이드, 상기 분자의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자 중 1종 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며; 선형, 분지형 또는 원형일 수 있고; 임의의 길이일 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 것 뿐만 아니라 트리플렉스-형성 핵산을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,176,996 및 5,422,251을 참조한다. 단백질은 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 재형성 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 레콤비나제, 리가제, 토포이소머라제, 리가제 및 헬리카제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 게놈, 세포 내로 도입되는 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 지질 매개된 전달 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함한 리포솜), 전기천공, 직접 주사, 세포 융합, 입자 충격, 인산칼슘 공동 침전, DEAE-덱스트란 매개된 전달 및 바이러스 벡터-매개된 전달을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 외인성 분자는 또한, 내인성 분자와 동일한 유형의 분자일 수 있지만, 세포가 유래된 것과 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간 핵산 서열은 원래 마우스 또는 햄스터로부터 유래된 세포주 내로 도입될 수 있다.

대조적으로, "내인성" 분자는 특정한 환경 조건 하에서 특정한 발달 단계의 특정한 세포에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아의 게놈, 엽록체 또는 다른 소기관, 또는 자연 발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자는 단백질, 예를 들어, 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.

"융합" 분자는 2개 이상의 서브유닛 분자가, 바람직하게 공유 연결된 분자이다. 서브유닛 분자는 동일한 화학적 유형의 분자일 수 있거나, 또는 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 제1 유형의 융합 분자의 예는 융합 단백질 (예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 1개 이상의 활성화 도메인 사이의 융합체) 및 융합 핵산 (예를 들어, 상기 기재된 융합 단백질을 코딩하는 핵산)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제2 유형의 융합 분자의 예는 트리플렉스-형성 핵산과 폴리펩티드 사이의 융합체, 및 작은 홈 결합제와 핵산 사이의 융합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 용어는 또한, 폴리뉴클레오티드 성분이 폴리펩티드 성분과 회합되어 기능적 분자를 형성한 시스템 (예를 들어, 단일 가이드 RNA가 기능적 도메인과 회합되어 유전자 발현을 조정하는 CRISPR/Cas 시스템)을 포함한다.

세포에서의 융합 단백질의 발현은 이러한 세포로의 융합 단백질의 전달로부터 비롯되거나 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달함으로써 비롯될 수 있으며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드가 전사되고, 전사체가 번역되어 융합 단백질이 생성된다. 트랜스-스플라이싱, 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 라이게이션이 또한, 세포에서의 단백질의 발현에 수반될 수 있다. 세포에의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 전달 방법은 본 개시내용의 다른 곳에 제시된다.

"다량체화 도메인" (또한 "이량체화 도메인" 또는 "단백질 상호작용 도메인"으로도 지칭됨)은 ZFP TF 또는 TALE TF의 아미노, 카르복시 또는 아미노 및 카르복시 말단 영역에 혼입된 도메인이다. 이들 도메인은 다중 ZFP TF 또는 TALE TF 유닛의 다량체화를 가능하게 하여, 트리뉴클레오티드 반복 도메인의 보다 큰 트랙이 야생형 개수의 길이를 갖는 보다 짧은 트랙에 비해 다량체화된 ZFP TF 또는 TALE TF에 의해 우선적으로 결합되게 한다. 다량체화 도메인의 예는 류신 지퍼를 포함한다. 다량체화 도메인은 또한 소분자에 의해 조절될 수 있고, 여기서 다량체화 도메인은 소분자 또는 외부 리간드의 존재 하에서만 또 다른 다량체화 도메인과의 상호작용을 허용하는 적절한 입체형태를 취한다. 이러한 방식으로, 외인성 리간드를 사용하여 이들 도메인의 활성을 조절할 수 있다.

"유전자"는 본 개시내용의 목적상, 유전자 생성물 (하기 참조)을 코딩하는 DNA 영역, 뿐만 아니라 조절 서열이 코딩 및/또는 전사된 서열에 인접하는지에 상관없이, 유전자 생성물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 사일렌서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함하나, 이에 반드시 제한되지는 않는다.

"유전자 발현"은 유전자 내에 함유된 정보를 유전자 생성물로 전환시키는 것을 지칭한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접 전사 생성물 (예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한, 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 프로세스에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.

유전자 발현의 "조정"은 유전자의 활성의 변화를 지칭한다. 발현의 조정은 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 게놈 편집 (예를 들어, 절단, 변경, 불활성화, 무작위 돌연변이)을 사용하여 발현을 조정할 수 있다. 유전자 불활성화는 본원에 기재된 바와 같은 ZFP 또는 TALE 단백질을 포함하지 않는 세포와 비교하여 유전자 발현에서의 임의의 감소를 지칭한다. 따라서, 유전자 불활성화는 부분적이거나 또는 완전할 수 있다.

"유전자 조정제"는 1개 이상의 유전자의 발현 및/또는 서열을 변경시키는 임의의 분자를 지칭한다. 유전자 조정제의 비제한적 예는 표적 유전자에 결합하고 그의 발현을 변경시키는 전사 인자 (예컨대 본원에 기재된 바와 같은 인공 전사 인자) 및 표적 유전자의 서열을 변형시키고, 차례로 그의 발현을 변경시키는 (예를 들어, 삽입 및/또는 결실을 통한 표적의 불활성화) 뉴클레아제를 포함한다. 따라서, 유전자 조정제는 유전자 리프레서 (유전자 발현을 억제하고/거나 불활성화함) 또는 유전자 활성화제일 수 있다.

"관심 영역"은 세포 염색질의 임의의 영역, 예컨대, 예를 들어, 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한 유전자, 또는 유전자 내의 또는 이와 인접한 비-코딩 서열을 지칭한다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합의 목적을 위한 것일 수 있다. 관심 영역은, 예를 들어 염색체, 에피솜, 소기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 관심 영역은 유전자의 코딩 영역 내에, 전사된 비-코딩 영역, 예컨대, 예를 들어, 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내에, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류의 비-전사된 영역 내에 존재할 수 있다. 관심 영역은 단일 뉴클레오티드 쌍 정도로 작을 수 있거나 또는 최대 2,000개의 뉴클레오티드 쌍 길이, 또는 임의의 정수 값의 뉴클레오티드 쌍일 수 있다.

"진핵" 세포는 진균 세포 (예컨대 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포 및 인간 세포 (예를 들어, T-세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

용어 "작동적 연결" 및 "작동가능하게 연결된" (또는 "작동적으로 연결된")은 2가지 이상의 성분 (예컨대, 서열 요소)의 병렬배치와 관련하여 상호교환가능하게 사용되며, 여기서는 둘 다의 성분이 정상적으로 기능하고 성분 중 적어도 하나가, 다른 성분 중 적어도 하나 상에서 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 성분들이 배열된다. 예시로서, 전사 조절 서열이 1개 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어하는 경우에, 이러한 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 전사 조절 서열은 일반적으로, 코딩 서열과 시스로 작동가능하게 연결되지만, 이에 직접적으로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 코딩 서열과 비록 인접하지 않더라도 이러한 코딩 서열과 작동가능하게 연결되는 전사 조절 서열이다.

융합 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 각각의 성분이 다른 성분과 연결되어, 그렇게 연결되지 않았을 경우와 동일한 기능을 수행한다는 사실을 지칭할 수 있다. 예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인이 활성화 도메인과 융합된 융합 분자와 관련하여, 융합 폴리펩티드 내의 ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편 활성화 도메인은 유전자 발현을 상향조절할 수 있다면, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인은 작동가능하게 연결되어 있다. 유전자 발현을 조절할 수 있는 도메인에 융합된 ZFP는 집합적으로 "ZFP-TF" 또는 "아연 핑거 전사 인자"로 지칭되며, 유전자 발현을 조절할 수 있는 도메인에 융합된 TALE는 집합적으로 "TALE-TF" 또는 "TALE 전사 인자"로 지칭된다. ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩티드 ("ZFN" 또는 "아연 핑거 뉴클레아제")의 경우에, 융합 폴리펩티드 내의 ZFP DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편 절단 도메인은 표적 부위 부근에서 DNA를 절단할 수 있다면, ZFP DNA-결합 도메인 및 절단 도메인은 작동가능하게 연결되어 있다. TALE DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩티드 ("TALEN" 또는 "TALE 뉴클레아제")의 경우에, 융합 폴리펩티드 내의 TALE DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편 절단 도메인은 표적 부위 부근에서 DNA를 절단할 수 있다면, TALE DNA-결합 도메인 및 절단 도메인은 작동가능하게 연결되어 있다. Cas DNA-결합 도메인 (예를 들어, 단일 가이드 RNA)이 활성화 도메인에 융합된 융합 분자와 관련하여, 융합 폴리펩티드 내의 Cas DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편 활성화 도메인은 유전자 발현을 상향조절할 수 있다면, Cas DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인은 작동가능하게 연결되어 있다. Cas DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩티드의 경우에, 융합 폴리펩티드 내의 Cas DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편 절단 도메인은 표적 부위 부근에서 DNA를 절단할 수 있다면, Cas DNA-결합 도메인 및 절단 도메인은 작동가능하게 연결되어 있다.

단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 그의 서열이 완전한 길이의 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지는 않지만, 완전한 길이의 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하고 있는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능적 단편은 상응하는 천연 분자보다 더 많거나, 더 적거나, 또는 천연 분자와 동일한 수의 잔기를 보유할 수 있고/거나 1개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능 (예를 들어, 코딩 기능, 또 다른 핵산과 혼성화할 수 있는 능력)을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 유사하게, 단백질 기능을 결정하는 방법이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 DNA-결합 기능은, 예를 들어, 필터-결합, 전기영동 이동-시프트, 또는 면역침전 검정에 의해 결정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해 검정될 수 있다. 상기 문헌 [Ausubel, et al.]을 참조한다. 또 다른 단백질과 상호작용할 수 있는 단백질의 능력은, 예를 들어, 공동 면역침전, 2-하이브리드 검정 또는 상보성 (유전적 및 생화학적 둘 다)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Fields, et al., (1989) Nature 340:245-246]; 미국 특허 번호 5,585,245 및 국제 특허 공개 번호 WO 98/44350을 참조한다.

"벡터"는 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 구축물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 관심 유전자의 발현을 지시할 수 있고, 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 구축물을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝, 및 발현 비히클 뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다.

"리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은, 반드시는 아니지만 바람직하게 상용 검정에서, 용이하게 측정되는 단백질 생성물을 생산하는 임의의 서열을 지칭한다. 적합한 리포터 유전자는 항생제 저항성 (예를 들어, 암피실린 저항성, 네오마이신 저항성, G418 저항성, 퓨로마이신 저항성)을 매개하는 단백질을 코딩하는 서열, 착색 또는 형광 또는 발광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, 증진된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시페라제)을 코딩하는 서열, 및 증진된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질 (예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제)을 코딩하는 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 에피토프 태그는, 예를 들어, FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출가능한 아미노산 서열의 1개 이상의 카피를 포함한다. "발현 태그"는 관심 유전자의 발현을 모니터링하기 위해 목적하는 유전자 서열과 작동가능하게 연결될 수 있는 리포터를 코딩하는 서열을 포함한다.

용어 "상승작용" 및 "상가적"은 달성된 유전자 조정 효과를 지칭하는데 사용된다. 2개 이상의 인공 전사 인자가 개별 인공 전사 인자보다 및/또는 함께 사용된 2개 이상의 인공 전사 인자의 예상되는 ("상가적") 조정보다 더 높은 수준으로 유전자 발현을 조정하는 경우에, 조정은 상승작용을 나타내는 것으로 언급된다. "상승작용"은 개별 성분이 주어진 용량에서 모두 활성인 기능적 상승작용, 및 유전자 모듈의 개별 인공 전사 인자 중 적어도 1개가 주어진 용량에서 불활성인 협동적 상승작용을 포함한다. 상승작용은 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 (1) 가장 강한 단일 인공 전사 인자에 대한 동일한 용량에서의 표적 유전자의 예상된 정규화된 발현 대 조합이 사용된 경우에 관찰된 정규화된 유전자 발현의 비를 계산함으로써 또는 (2) 보다 강한 ZFP-TF에 의해 (조합으로 사용된 그의 용량의 2X에서) 수득된 발현 수준 대 ZFP 조합에 의해 수득된 것의 비를 결정함으로써 결정될 수 있다.

유전자 조정제

본원에 기재된 유전자 조정제는 2개 이상의 인공 전사 인자 (예를 들어, 리프레서 또는 활성화제)를 포함하며, 각각의 인공 전사 인자 (TF)는 DNA-결합 도메인 및 1개 이상의 기능적 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 유전자 조정제는 특이성 (오프-타겟 유전자의 조정을 제한 또는 제거함) 및/또는 활성 (조정의 양)에 대한 상승작용적 효과를 포함하여, 단일 전사 인자와 비교하여 상승작용적 효과를 나타낸다. 따라서, 상승작용은 개별 TF (및/또는 예상된 상가적 효과)와 비교하여 약 1-배, 약 2-배, 약 3-배, 약 4-배, 약 5-배, 약 6-배, 약 7-배, 약 8-배 또는 그 초과의 활성 및/또는 특이성의 임의의 증가이다.

본원에 기재된 조성물 중 임의의 것에서, 2개 이상의 인공 전사 인자는 약 1 내지 약 600개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격된, 바람직하게는 약 1 내지 약 300개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격된, 보다 더 바람직하게는 약 1 내지 약 100개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격된 표적 부위에 (TF의 DNA-결합 도메인을 통해) 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상승작용적 TF 조성의 성분은 대략 1 내지 약 80 (또는 그 사이의 임의의 값), 대략 160 내지 약 220 (또는 그 사이의 임의의 값), 대략 260 내지 약 400 (또는 그 사이의 임의의 값), 또는 대략 500 내지 약 600개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격된 표적 부위에 결합한다. 예를 들어, 도 4; 11; 13; 및 15를 참조한다.

본원에 기재된 조성물 중 임의의 것에서, 2개 이상의 인공 전사 인자의 기능적 도메인 (예를 들어, 전사 활성화 또는 억제 도메인, 예컨대 KRAB 또는 DNMT) (TF의 DNA-결합 도메인을 통함)은 서로 약 1 내지 약 600개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격되어, 바람직하게는 약 1 내지 약 300개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격되어, 보다 더 바람직하게는 약 1 내지 약 100개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격되어 위치한다. 특정 실시양태에서, 상승작용적 TF 조성의 기능적 도메인은 이들이 서로 대략 1 내지 약 80개 (또는 그 사이의 임의의 값), 대략 160 내지 약 220개 (또는 그 사이의 임의의 값), 대략 260 내지 약 400개 (또는 그 사이의 임의의 값), 또는 대략 500 내지 약 600개 (또는 그 사이의 임의의 값)의 염기 쌍만큼 이격되도록 위치한다. 예를 들어, 도 4; 도 11; 도 13; 및 도 15를 참조한다.

본원에 기재된 상승작용적 조성물은 코딩 서열 및 인접 또는 원위 제어 요소 (예를 들어, 인핸서, 프로모터 등)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 표적 유전자 내의 임의의 위치의 표적 부위에 결합할 수 있다. 특정 측면에서, 조성물의 TF는 전사 개시 부위 (TSS)의 어느 하나의 측면에 0-600개의 염기 쌍 (또는 그 사이의 임의의 값) 내에 있는 표적 부위에 결합한다. 특정 실시양태에서, TF는 TSS와 TSS의 +200 (또는 그 사이의 임의의 값) 사이에 있는 표적 부위에 결합한다. 예를 들어, 도 4; 도 11; 도 13; 및 도 15를 참조한다.

또한, 본원에 기재된 조성의 2개 이상의 TF는 표적 부위 (예를 들어, 내인성 유전자)의 동일한 및/또는 상이한 가닥에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상승작용적 조성물은 동일한 안티센스 (-) 또는 센스 (+) 가닥에 결합하는 TF를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상승작용적 조성물은 상이한 가닥에 (어느 하나의 배향으로 +/-) 결합하는 TF를 포함한다. 예를 들어, 도 4; 도 11; 도 13; 및 도 15를 참조한다.

DNA-결합 도메인

임의의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 DNA-결합 도메인, 예를 들어 DNA-결합 단백질 (예를 들어, ZFP 또는 TALE) 또는 DNA-결합 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 단일 가이드 RNA)가 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 유전자 조정제의 DNA-결합 도메인은 질환 또는 장애에서 비정상적으로 발현되는 1개 이상의 유전자를 포함한 임의의 관심 유전자에 대해 표적화될 수 있다. DNA-결합 도메인에 의해 인식되는 표적 부위 중 2개 이상은 중첩 또는 비-중첩될 수 있다. DNA-결합 도메인 중 2개에 대한 표적 부위는 표적 유전자의 전사 개시 부위로부터 (어느 하나의 측면으로) 최대 약 600개 또는 그 초과의 염기 쌍만큼 분리될 수 있고, 최대 300개 또는 그 초과의 염기 쌍일 수 있다. 또한, 이중-가닥 DNA, 예컨대 내인성 게놈을 표적화하는 경우에, 인공 전사 인자의 DNA-결합 도메인은 동일하거나 상이한 가닥을 (1개 이상은 양성 가닥을 및/또는 1개 이상은 음성 가닥을) 표적화할 수 있다. 추가로, 동일하거나 상이한 DNA-결합 도메인이 본 발명의 유전자 조정제에 사용될 수 있다. 따라서, 임의의 유전자의 유전자 조정제 (리프레서)가 기재된다.

특정 실시양태에서, 적어도 1개의 DNA 결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 표적 부위의 선택; 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구축을 위한 ZFP 및 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 미국 특허 번호 6,140,081; 5,789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; 및 국제 특허 공개 번호 WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496에 상세히 기재되어 있다.

ZFP DNA-결합 도메인은 적어도 1개의 아연 핑거를 포함하지만, 복수의 아연 핑거 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 핑거)를 포함할 수 있다. 통상적으로, ZFP는 적어도 3개의 핑거를 포함한다. 특정의 ZFP는 4개, 5개 또는 6개의 핑거를 포함하며, 일부 ZFP는 8 9, 10, 11 또는 12개 또는 그 초과의 핑거를 포함한다. 3개의 핑거를 포함하는 ZFP는 전형적으로, 9개 또는 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식하고; 4개의 핑거를 포함하는 ZFP는 전형적으로, 12 내지 14개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식하는 반면; 6개의 핑거를 갖는 ZFP는 18 내지 21개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식할 수 있다. ZFP는 또한, 1개 이상의 기능적 (조절) 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있으며, 이러한 도메인은 전사 활성화 또는 억제 도메인 또는 다른 도메인, 예컨대 DNMT 도메인일 수 있다. DNA 결합 도메인은 적어도 1개의 조절 (기능적) 도메인에 융합되고, 이는 'ZFP-TF' 아키텍처로 생각될 수 있다.

조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연-발생 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어, 트리플렛 (또는 쿼드루플렛) 뉴클레오티드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 트리플렛 또는 쿼드루플렛 뉴클레오티드 서열은 특정한 트리플렛 또는 쿼드루플렛 서열에 결합하는 아연 핑거의 1개 이상의 아미노산 서열과 회합된다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 공동-소유 미국 특허 번호 6,453,242 및 6,534,261, 및 8/772,453을 참조한다.

또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중 핑거 아연 핑거 단백질은 임의의 적합한 링커 서열, 예를 들어, 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 아연 핑거 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

ZFP는 1개 이상의 전사 조절 (예를 들어, 억제 도메인)에 작동가능하게 회합 (연결)되어 ZFP-TF (예를 들어, 리프레서)를 형성할 수 있다. 방법 및 조성물은 또한, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 20180087072에 기재된 바와 같이 ZFP 백본에 대한 돌연변이에 의해 오프-타겟 부위로서 공지된 다른 비의도된 절단 부위에 비해 그의 의도된 표적에 대한 ZFP의 특이성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 유전자 조정제는 그의 DNA 결합 도메인 백본 영역 중 1개 이상에서의 돌연변이 및/또는 그의 전사 조절 도메인에서의 1개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이들 ZFP는 DNA 백본 상의 포스페이트와 비-특이적으로 상호작용할 수 있는 ZFP DNA 결합 도메인 ('ZFP 백본') 내의 아미노산에 대한 돌연변이를 포함할 수 있지만, DNA 인식 나선에서는 변화를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명은 뉴클레오티드 표적 특이성에 요구되지 않는 ZFP 백본에서의 양이온성 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, ZFP 백본에서의 이들 돌연변이는 양이온성 아미노산 잔기를 중성 또는 음이온성 아미노산 잔기로 돌연변이시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, ZFP 백본에서의 이들 돌연변이는 극성 아미노산 잔기를 중성 또는 비-극성 아미노산 잔기로 돌연변이시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 DNA 결합 나선 대비 위치 (-5), (-9) 및/또는 위치 (-14)에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거는 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서 1개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 다중-핑거 아연 핑거 단백질 내의 1개 이상의 아연 핑거는 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌 (R) 또는 리신 (K))은 알라닌 (A), 류신 (L), Ser (S), Asp (N), Glu (E), Tyr (Y) 및/또는 글루타민 (Q)으로 돌연변이된다.

대안적으로, DNA-결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열이 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; 문헌 [Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al., (1989) Gene 82:115-118; Perler et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al., (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al., (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue]을 참조한다. 또한, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-자연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chevalier et al., (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al., (2006) Nature 441:656-659; Paques et al., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 번호 2007/0117128을 참조한다.

특정 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) TAL 이펙터 (TALE) DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,586,526을 참조한다. 특정 실시양태에서, TALE DNA-결합 단백질은 미국 공개 번호 20180153921에 제시된 바와 같은 타우 표적 부위의 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드에 결합한다. 타우 표적 부위에 결합하는 TALE DNA-결합 단백질의 RVD는 자연 발생 또는 비-자연 발생 RVD일 수 있다. 미국 특허 번호 8,586,526 및 9,458,205를 참조한다.

크산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 농작물에서 많은 질병을 유발시키는 것으로 공지되어 있다. 크산토모나스의 병원성은 식물 세포 내로 25종 초과의 상이한 이펙터 단백질을 주입하는 보존된 유형 III 분비 (T3S) 시스템에 좌우된다. 이들 중에서 주입된 단백질은 식물 전사 활성화제를 모방하고 식물 전사체를 조작하는 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)이다 (문헌 [Kay et al., (2007) Science 318:648-651] 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 가장 널리 특징규명된 TALE 중 하나가 크산토모나스 캄페스트그리스 pv. 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다 (문헌 [Bonas et al., (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136] 및 WO2010079430 참조). TALE는 탠덤 반복 서열의 중앙 집중화된 도메인을 포함하며, 각각의 반복 서열은 이들 단백질의 DNA 결합 특이성의 핵심인 대략 34개의 아미노산을 함유한다. 또한, 이들은 핵 국재화 서열과 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다 (고찰을 위해, 문헌 [Schornack S, et al., (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272] 참조). 또한, 식물병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에서는, brg11 및 hpx17로 지정된 2개의 유전자가 알. 솔라나세아룸(R. solanacearum) 생물변이형 1 균주 GMI1000 및 생물변이형 4 균주 RS1000에서 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리에 상동인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Heuer et al., (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384] 참조). 이들 유전자는 뉴클레오티드 서열에 있어서 서로 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인에 있어서 1,575 bp의 결실만큼 상이하다. 그러나, 둘 다의 유전자 생성물은 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다.

이들 TALE의 특이성은 탠덤 반복부에서 발견되는 서열에 좌우된다. 반복 서열은 대략 102개의 bp를 포함하고, 반복부는 전형적으로, 서로 91-100% 상동이다 (Bonas et al., 상기 동일 문헌). 반복부의 다형성은 통상적으로 위치 12 및 13에 위치하고, 위치 12 및 13에서의 초가변 이잔기의 동일성과 TALE의 표적 서열 내의 인접 뉴클레오티드의 동일성 사이에는 1 대 1 상응도가 있는 것으로 보인다 (문헌 [Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501 및 Boch et al., (2009) Science 326:1509-1512] 참조). 실험적으로, 이들 TALE의 DNA 인식에 대한 코드는, 위치 12 및 13에서의 HD 서열이 시토신 (C)에 대한 결합으로 이어지고, NG가 T에 결합하며, NI가 A, C, G 또는 T에 결합하고, NN이 A 또는 G에 결합하며, NG가 T에 결합하도록 결정되어 있다. 이들 DNA 결합 반복부는 새로운 조합 및 수의 반복부를 갖는 단백질로 어셈블리되어, 새로운 서열과 상호작용할 수 있는 인공 전사 인자를 만들었다. 또한, 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,586,526 및 미국 특허 공개 번호 2013/0196373은 N-캡 폴리펩티드, C-캡 폴리펩티드 (예를 들어, +63, +231 또는 +278) 및/또는 신규 (비정형) RVD를 갖는 TALE를 기재한다.

예시적인 TALE는 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,586,526 및 9,458,205에 기재되어 있다.

특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 이량체화 및/또는 다량체화 도메인, 예를 들어 코일드-코일 (CC) 및 이량체화 아연 핑거 (DZ)를 포함한다. 미국 특허 공개 번호 2013/0253040을 참조한다.

추가 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 CRISPR/Cas 시스템의 단일-가이드 RNA, 예를 들어 20150056705에 개시된 바와 같은 sgRNA를 포함한다.

최근, 진핵생물 RNAi 경로에 대응하는 것으로 가설화되는, 고세균 및 많은 박테리아에서의 RNA-매개된 게놈 방어 경로의 존재에 대한 유력한 증거가 대두되었다 (검토를 위해, 문헌 [Godde and Bickerton, 2006. J. Mol. Evol. 62: 718-729; Lillestol et al., 2006. Archaea 2: 59-72; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7.; Sorek et al., 2008. Nat. Rev. Microbiol. 6: 181-186] 참조). CRISPR-Cas 시스템 또는 원핵생물 RNAi (pRNAi)로서 공지된 경로는 2개의 진화적으로 및 종종 물리적으로 연관된 유전자좌로부터 발생하는 것으로 제안된다: 시스템의 RNA 성분을 코딩하는 CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부) 유전자좌, 및 단백질을 코딩하는 cas (CRISPR-연관) 유전자좌 (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60). CRISPR 유전자좌는 미생물 숙주에서 CRISPR-연관 (Cas) 유전자 뿐만 아니라 CRISPR-매개된 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-코딩 RNA 요소의 조합을 함유한다. 개개의 Cas 단백질은 진핵생물 RNAi 기구의 단백질 성분과 유의한 서열 유사성을 공유하지 않지만, 유사한 예측되는 기능 (예를 들어, RNA 결합, 뉴클레아제, 헬리카제 등)을 갖는다 (Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7). CRISPR-연관 (cas) 유전자는 종종 CRISPR 반복-스페이서 어레이와 연관된다. 40개 초과의 상이한 Cas 단백질 패밀리가 기재되어 있다. 이들 단백질 패밀리 중에서, Cas1은 상이한 CRISPR/Cas 시스템 사이에 편재되어 있는 것으로 보인다. 8가지의 CRISPR 하위유형 (이. 콜라이(E. coli), 와이. 페스트(Y. pest), 엔. 메니(N. meni), 디. 불그(D. vulg), 티. 네아프(T. neap), 에이치; 마리(H; mari), 에이; 페르느(A; pern), 및 엠. 투베(M. tube))을 규정하는데 cas 유전자 및 반복 구조의 특정한 조합이 사용되어 왔고, 이들 중 일부는 반복부-연관 불가사의 단백질 (RAMP)을 코딩하는 추가의 유전자 모듈과 연관된다. 1종 초과의 CRISPR 하위유형이 단일 게놈에서 발생할 수 있다. CRISPR/Cas 하위유형의 산발적 분포는 시스템이 미생물 진화 동안 수평적 유전자 전달에 적용된다는 것을 시사한다.

에스. 피오게네스(S. pyogenes)에서 최초로 기재된 유형 II CRISPR은 가장 널리 특징규명된 시스템 중 하나이고, 4가지 일련의 단계에서 표적화된 DNA 이중 가닥 파괴를 수행한다. 첫째, 2개의 비-코딩 RNA인 프리-crRNA 어레이 및 tracrRNA가 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 둘째, tracrRNA는 프리-crRNA의 반복 영역과 혼성화되고, 프리-crRNA가 개별 스페이서 서열을 함유하는 성숙한 crRNA로 프로세싱되는 것을 매개하며, 여기서 프로세싱은 Cas9 단백질의 존재 하에 이중 가닥 특이적 RNase III에 의해 일어난다. 셋째, 성숙한 crRNA:tracrRNA 복합체는 crRNA 상의 스페이서와, 표적 인식을 위해 추가적으로 요구되는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 다음에 있는 표적 DNA 상의 프로토스페이서 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기-쌍형성을 통해 Cas9를 표적 DNA로 지시한다. 또한, tracrRNA는 그의 3' 말단에서 crRNA과 염기 쌍형성하므로 또한 존재해야 하고, 이러한 회합은 Cas9 활성을 촉발한다. 마지막으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에 이중 가닥 파괴를 생성한다. CRISPR/Cas 시스템의 활성은 3가지 단계를 포함한다: (i) '적응'으로 불리는 프로세스에서, 향후의 공격을 방지하기 위한 CRISPR 어레이 내로의 외부 DNA 서열의 삽입, (ii) 관련 단백질의 발현, 뿐만 아니라 어레이의 발현 및 프로세싱, 이어서 (iii) 외부 핵산으로의 RNA-매개된 간섭. 따라서, 박테리아 세포에서는, 소위 'Cas' 단백질 중 몇 가지가 CRISPR/Cas 시스템의 천연 기능에 수반된다.

유형 II CRISPR 시스템은 많은 상이한 박테리아에서 발견되었다. 문헌 [Fonfara et al., ((2013) Nuc Acid Res 42(4):2377-2590]에 의한 공개적으로 이용가능한 게놈에 대한 BLAST 검색으로 347종의 박테리아에서 Cas9 오르토로그를 발견하였다. 추가적으로, 이러한 군은 에스. 피오게네스, 에스. 뮤탄스(S. mutans), 에스. 써모필루스(S. thermophilus), 씨. 제주니(C. jejuni), 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis), 피. 물토시다(P. multocida) 및 에프. 노비시다(F. novicida)로부터의 Cas9 오르토로그를 사용한 DNA 표적의 시험관내 CRISPR/Cas 절단을 입증하였다. 따라서, 용어 "Cas9"는 DNA 결합 도메인 및 2개의 뉴클레아제 도메인을 포함하는 RNA 가이드 DNA 뉴클레아제를 지칭하며, 여기서 Cas9를 코딩하는 유전자는 임의의 적합한 박테리아로부터 유래될 수 있다.

Cas9 단백질은 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인을 갖는다: 하나의 뉴클레아제 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 유사하고, 다른 것은 Ruv 엔도뉴클레아제 도메인과 비슷하다. HNH-유형 도메인은 crRNA에 상보적인 DNA 가닥의 절단을 담당하는 것으로 보이고, Ruv 도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. Cas 9 뉴클레아제는 뉴클레아제 도메인 중 오직 1개만이 기능적이도록 조작되어 Cas 니카제를 생성할 수 있다 (문헌 [Jinek et al., (2012) Science 337:816] 참조). 니카제는 효소의 촉매 도메인 내의 아미노산의 특이적 돌연변이에 의해, 또는 도메인의 일부 또는 전부를 말단절단하여 그것이 더 이상 기능하지 않도록 하는 것에 의해 생성될 수 있다. Cas 9는 2개의 뉴클레아제 도메인을 포함하기 때문에, 이러한 접근법은 어느 하나의 도메인에 대해 이루어질 수 있다. 이중 가닥 파괴는 표적 DNA에서 2개의 이러한 Cas 9 니카제를 사용하는 것에 의해 달성될 수 있다. 니카제는 각각 DNA의 1개의 가닥을 절단할 것이고, 2개의 사용은 이중 가닥 파괴를 생성할 것이다.

crRNA-tracrRNA 복합체의 요건은 crRNA 및 tracrRNA의 어닐링에 의해 정상적으로 형성된 헤어핀을 포함하는 조작된 "단일-가이드 RNA" (sgRNA)를 사용하는 것에 의해 피할 수 있다 (문헌 [Jinek et al., 상기 동일 문헌 및 Cong et al., (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143] 참조). 에스. 피로게네스에서, 조작된 tracrRNA:crRNA 융합체 또는 sgRNA는, 이중 가닥 RNA:DNA 이종이량체가 Cas 회합된 RNA와 표적 DNA 사이에 형성된 경우에, Cas9가 표적 DNA를 절단하도록 가이드한다. Cas9 단백질 및 PAM 서열을 함유하는 조작된 sgRNA를 포함하는 이러한 시스템은 RNA 가이드 게놈 편집에 사용되어 왔고 (문헌 [Ramalingam et al., Stem Cells and Development 22(4):595-610 (2013)] 참조), ZFN 및 TALEN과 유사한 편집 효율로 생체내 제브라피쉬 배아 게놈 편집에 유용하다 (문헌 [Hwang et al., (2013) Nature Biotechnology 31 (3):227] 참조).

CRISPR 유전자좌의 주요 생성물은 유입 표적화 서열을 함유하는 짧은 RNA인 것으로 보이고, 이는 경로에서의 그의 가설화되는 역할에 기초하여 가이드 RNA 또는 원핵 침묵 RNA (psiRNA)로 불린다 (Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Hale et al., 2008. RNA, 14: 2572-2579). RNA 분석은 CRISPR 유전자좌 전사체가 반복 서열 내에서 절단되어 개별 유입 표적화 서열 및 플랭킹 반복 단편을 함유하는 ~60- 내지 70-nt RNA 중간체를 방출한다는 것을 보여준다 (Tang et al., 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 7536-7541; Tang et al., 2005. Mol. Microbiol. 55: 469-481; Lillestol et al., 2006. Archaea 2: 59-72; Brouns et al., 2008. Science 321: 960-964; Hale et al., 2008. RNA, 14: 2572-2579). 고세균 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)에서, 이들 중간체 RNA는 풍부한, 안정한 ~35- 내지 45-nt 성숙 psiRNA로 추가로 프로세싱된다 (Hale et al., 2008. RNA, 14: 2572-2579).

crRNA-tracrRNA 복합체의 요건은 crRNA 및 tracrRNA의 어닐링에 의해 정상적으로 형성된 헤어핀을 포함하는 조작된 "단일-가이드 RNA" (sgRNA)를 사용하는 것에 의해 피할 수 있다 (문헌 [Jinek et al., (2012) Science 337:816 및 Cong et al., (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143] 참조). 에스. 피로게네스에서, 조작된 tracrRNA:crRNA 융합체 또는 sgRNA는, 이중 가닥 RNA:DNA 이종이량체가 Cas 회합된 RNA와 표적 DNA 사이에 형성된 경우에, Cas9가 표적 DNA를 절단하도록 가이드한다. Cas9 단백질 및 PAM 서열을 함유하는 조작된 sgRNA를 포함하는 이러한 시스템은 RNA 가이드 게놈 편집에 사용되어 왔고 (Ramalingam, 상기 동일 문헌 참조), ZFN 및 TALEN과 유사한 편집 효율로 생체내 제브라피쉬 배아 게놈 편집에 유용하다 (문헌 [Hwang et al., (2013) Nature Biotechnology 31 (3):227] 참조).

키메라 또는 sgRNA는 임의의 목적하는 표적에 상보적인 서열을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 또는 약 그 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 미만 또는 그 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, sgRNA는 미국 공개 번호 20180153921에 제시된 바와 같은 타우 표적 부위의 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드에 결합하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA는 표적에 대해 상보성을 갖는 22개 염기를 포함하고, 에스. 피오게네스 CRISPR/Cas 시스템과 함께 사용하기 위해 형태 G[n19]에 이어 형태 NGG 또는 NAG의 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)를 포함한다. 따라서, 한 방법에서, sgRNA는 관심 유전자 내의 공지된 ZFN 표적을 사용하여 (i) ZFN 이종이량체의 인식 서열을 관련 게놈 (인간, 마우스, 또는 특정한 식물 종)의 참조 서열과 정렬하고; (ii) ZFN 절반-부위 사이의 스페이서 영역을 확인하고; (iii) 스페이서 영역에 가장 가까운 모티프 G[N20]GG의 위치를 확인하고 (1개 초과의 이러한 모티프가 스페이서와 중첩되는 경우, 스페이서에 대해 중심에 있는 모티프가 선택됨); (iv) 그러한 모티프를 sgRNA의 코어로서 사용함으로써 설계될 수 있다. 이러한 방법은 유리하게는 입증된 뉴클레아제 표적에 의존한다. 대안적으로, sgRNA는 단순히 G[n20]GG 형식과 일치하는 적합한 표적 서열을 확인함으로써, 임의의 관심 영역을 표적화하도록 설계될 수 있다. 상보성 영역과 함께, sgRNA는 sgRNA의 tracrRNA 부분의 테일 영역까지 연장되는 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다 (문헌 [Hsu et al., (2013) Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647] 참조). 테일은 +67 내지 +85개 뉴클레오티드, 또는 그 사이의 임의의 수일 수 있고, 바람직한 길이는 +85개 뉴클레오티드이다. 말단절단된 sgRNA, "tru-gRNA"가 또한 사용될 수 있다 (문헌 [Fu et al., (2014) Nature Biotech 32(3): 279] 참조). tru-gRNA에서, 상보성 영역은 17 또는 18개 뉴클레오티드 길이로 감소된다.

또한, 대안적 PAM 서열이 또한 사용될 수 있으며, 여기서 PAM 서열은 에스. 피오게네스 Cas9를 사용하는 NGG에 대한 대안으로서 NAG일 수 있다 (Hsu 2013, 상기 동일 문헌). 추가의 PAM 서열은 또한 처음 G가 결여된 것을 포함할 수 있다 (Sander and Joung (2014) Nature Biotech 32(4):347). 에스. 피오게네스 코딩된 Cas9 PAM 서열에 더하여, 다른 박테리아 공급원으로부터의 Cas9 단백질에 대해 특이적인 다른 PAM 서열이 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 제시된 PAM 서열 (문헌 [Sander and Joung, 상기 동일 문헌, 및 Esvelt et al., (2013) Nat Meth 10(11):1116]으로부터 적합화됨)은 이들 Cas9 단백질에 대해 특이적이다:

따라서, 에스. 피오게네스 CRISPR/Cas 시스템과 함께 사용하기에 적합한 표적 서열은 하기 가이드라인에 따라 선택될 수 있다: [n17, n18, n19, 또는 n20](G/A)G. 대안적으로 PAM 서열은 가이드라인 G[n17, n18, n19, n20](G/A)G를 따를 수 있다. 비-에스. 피오게네스 박테리아로부터 유래된 Cas9 단백질의 경우, 다른 PAM이 에스. 피오게네스 PAM 서열을 대체한 동일한 가이드라인이 사용될 수 있다.

잠재적인 오프 타겟 서열을 피해 특이성의 가장 높은 가능성을 갖는 표적 서열을 선택하는 것이 가장 바람직하다. 이들 바람직하지 않은 오프 타겟 서열은 다음과 같은 속성을 고려함으로써 확인될 수 있다: i) 사용되는 Cas9 단백질과 함께 기능하는 것으로 공지된 PAM 서열이 이어지는 표적 서열에서의 유사성; ii) 목적하는 표적 서열과 3개 미만의 미스매치를 갖는 유사한 표적 서열; iii) 미스매치가 모두, PAM 근위 영역보다는 PAM 원위 영역에 위치하는 것인, ii)에서와 같은 유사한 표적 서열 (때때로 '시드' 영역으로 지칭되는 (Wu et al., (2014) Nature Biotech doi:10.1038/nbt2889), PAM에 바로 인접하거나 근접한 뉴클레오티드 1-5개가 인식에 있어서 가장 중요하고, 따라서 미스매치가 시드 영역에 위치하는 추정 오프 타겟 부위는 sg RNA에 의해 인식될 가능성이 가장 적다는 일부 증거가 존재함); 및 iv) 미스매치가 연속적으로 이격되어 있지 않거나 또는 4개 초과의 뉴클레오티드만큼 이격되어 있는 유사한 표적 서열 (Hsu 2014, 상기 동일 문헌). 따라서, 어떤 CRIPSR/Cas 시스템을 사용해서든 이들 상기 기준을 사용하여 게놈 내의 잠재적인 오프 타겟 부위의 수의 분석을 수행함으로써, sgRNA에 적합한 표적 서열을 확인할 수 있다.

일부 실시양태에서, CRISPR-Cpf1 시스템이 사용된다. 프란시셀라(Francisella) 종에서 확인된 CRISPR-Cpf1 시스템은 인간 세포에서 강건한 DNA 간섭을 매개하는 부류 2 CRISPR-Cas 시스템이다. 기능적으로 보존되어 있지만, Cpf1 및 Cas9는 그의 가이드 RNA 및 기질 특이성을 포함한 많은 측면에서 상이하다 (문헌 [Fagerlund et al., (2015) Genom Bio 16:251] 참조). Cas9 및 Cpf1 단백질 사이의 주요 차이는 Cpf1이 tracrRNA를 활용하지 않고, 따라서 crRNA 만을 필요로 한다는 것이다. FnCpf1 crRNA는 42-44개 뉴클레오티드 길이 (19개-뉴클레오티드 반복부 및 23-25개-뉴클레오티드 스페이서)이고, 2차 구조를 유지시키는 서열 변화를 견디는 단일 줄기-루프를 함유한다. 또한, Cpf1 crRNA는 Cas9에 의해 요구되는 ~100개-뉴클레오티드 조작된 sgRNA보다 상당히 더 짧고, FnCpfl에 대한 PAM 요건은 대체된 가닥 상의 5'-TTN-3' 및 5'-CTA-3'이다. Cas9 및 Cpf1 둘 다가 표적 DNA 내에 이중 가닥 파괴를 만들기는 하지만, Cas9는 그의 RuvC- 및 HNH-유사 도메인을 사용하여 가이드 RNA의 시드 서열 내에 평활-말단 커트를 만드는 반면에, Cpf1은 RuvC-유사 도메인을 사용하여 시드의 외부에 엇갈림 커트를 생성한다. Cpf1은 중요한 시드 영역으로부터 멀리 떨어져 엇갈림 커트를 만들기 때문에, NHEJ는 표적 부위를 파괴하지 않을 것이고, 따라서 목적하는 HDR 재조합 사건이 일어날 때까지 Cpf1이 동일한 부위를 계속해서 컷팅할 수 있도록 보장한다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서, 용어 "Cas"는 Cas9 및 Cfp1 단백질 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에 사용된 "CRISPR/Cas 시스템"은 뉴클레아제, 니카제 및/또는 전사 인자 시스템 둘 다를 포함한 CRISPR/Cas 및/또는 CRISPR/Cfp1 시스템 둘 다를 지칭한다.

일부 실시양태에서, 다른 Cas 단백질이 사용될 수 있다. 일부 예시적인 Cas 단백질은 Cas9, Cpf1 (또한 Cas12a로도 공지됨), C2c1, C2c2 (또한 Cas13a로도 공지됨), C2c3, Cas1, Cas2, Cas4, CasX 및 CasY를 포함하고; 그의 조작된 변이체 및 천연 변이체 (Burstein et al., (2017) Nature 542:237-241) 예를 들어 HF1/spCas9 (Kleinstiver et al., (2016) Nature 529: 490-495; Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm Genome (2017) 28(7):247-261); 분할 Cas9 시스템 (Zetsche et al., (2015) Nat Biotechnol 33(2):139-142), 인테인-엑스테인 시스템에 기초한 트랜스-스플라이싱된 Cas9 (Troung et al., (2015) Nucl Acid Res 43(13):6450-8); 미니-SaCas9 (Ma et al., (2018) ACS Synth Biol 7(4):978-985)를 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서, 용어 "Cas"는 모든 Cas 변이체 단백질, 천연 및 조작된 것 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에 사용된 "CRISPR/Cas 시스템"은 뉴클레아제, 니카제 및/또는 전사 인자 시스템 둘 다를 포함한 임의의 CRISPR/Cas 시스템을 지칭한다.

특정 실시양태에서, Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질의 "기능적 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩티드의 "기능적 유도체"는 천연 서열 폴리펩티드와 공통으로 정성적 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능적 유도체"는 천연 서열의 단편, 및 천연 서열 폴리펩티드 및 그의 단편의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 단 이들은 상응하는 천연 서열 폴리펩티드와 공통으로 생물학적 활성을 가져야 한다. 본원에서 고려된 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해시킬 수 있는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 공유 변형물, 및 그의 융합물 모두를 포괄한다. 일부 측면에서, 기능적 유도체는 자연 발생 Cas 단백질의 단일 생물학적 특성을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 기능적 유도체는 자연 발생 Cas 단백질의 생물학적 특성의 하위세트를 포함할 수 있다. Cas 폴리펩티드 또는 그의 단편의 적합한 유도체는 Cas 단백질 또는 그의 단편의 돌연변이체, 융합물, 공유 변형물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. Cas 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 Cas 단백질 뿐만 아니라 Cas 단백질 또는 그의 단편의 유도체는 세포로부터 수득가능할 수 있거나 또는 화학적으로 합성될 수 있거나 또는 이들 두 절차의 조합에 의해 수득가능할 수 있다. 상기 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하는 세포, 또는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하고 내인성 Cas 단백질을 더 높은 발현 수준으로 생산하도록 유전자 조작되거나 또는 외인적으로 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작되는 세포일 수 있으며, 핵산은 내인성 Cas와 동일하거나 또는 상이한 Cas를 코딩한다. 일부 경우에, 상기 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하지 않고 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다.

특이적 유전자 (세이프 하버 유전자 포함)에 대해 표적화된 예시적인 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 예를 들어 미국 공개 번호 2015/0056705에 개시되어 있다.

따라서, 뉴클레아제는 DNA를 절단하는 뉴클레아제 도메인과 조합하여 공여자 (트랜스진)를 삽입하는 것을 목적으로 하는 임의의 유전자 내의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함한다.

기능적 도메인

DNA-결합 도메인은 1개 이상의 기능적 도메인에 융합되거나 또는 달리 그와 회합되어 본원에 기재된 바와 같은 인공 전사 인자를 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 DNA-결합 분자 (예를 들어, ZFP, TALE 또는 단일 가이드 RNA) 및 이종 조절 (기능적) 도메인 (또는 그의 기능적 단편)을 포함하는 융합 분자를 사용한다.

특정 실시양태에서, 유전자 조정제의 인공 전사 인자의 기능적 도메인은 전사 조절 도메인을 포함한다. 통상적인 도메인은, 예를 들어, 전사 인자 도메인 (활성화제, 리프레서, 공동-활성화제, 공동-리프레서), 사일렌서, 종양유전자 (예를 들어, myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 패밀리 구성원 등); DNA 복구 효소 및 그의 연관 인자 및 변형인자; DNA 재배열 효소 및 그의 연관 인자 및 변형인자; 염색질 연관 단백질 및 그의 변형인자 (예를 들어 키나제, 아세틸라제 및 데아세틸라제); 및 DNA 변형 효소 (예를 들어, 메틸트랜스퍼라제, 예컨대 DNMT 패밀리의 구성원 (예를 들어, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L 등, 토포이소머라제, 헬리카제, 리가제, 키나제, 포스파타제, 폴리머라제, 엔도뉴클레아제) 및 그의 연관 인자 및 변형인자를 포함한다. 예를 들어, 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 공개 번호 2013/0253040을 참조한다.

활성화를 달성하는데 적합한 도메인은 HSV VP16 활성화 도메인 (예를 들어, 문헌 [Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1997)] 참조) 핵 호르몬 수용체 (예를 들어, 문헌 [Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998)] 참조); 핵 인자 카파 B의 p65 서브유닛 (Bitko & Barik, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) and Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)), 또는 인공 키메라 기능적 도메인, 예컨대 VP64 (Beerli et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33), 및 데그론 (Molinari et al., (1999) EMBO J. 18, 6439-6447)을 포함한다. 추가의 예시적인 활성화 도메인은 Oct 1, Oct-2A, Sp1, AP-2, 및 CTF1 (Seipel et al., EMBO J. 11, 4961-4968 (1992)) 뿐만 아니라 p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A 및 ERF-2를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Robyr et al., (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood et al., (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275; Leo et al., (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna et al., (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik et al., (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; 및 Lemon et al., (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504]을 참조한다. 추가의 예시적인 활성화 도메인은 OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5,-6,-7, 및 -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, 및 TRAB1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Ogawa et al., (2000) Gene 245:21-29; Okanami et al., (1996) Genes Cells 1:87-99; Goff et al., (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho et al., (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmason et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels et al., (2000) Plant J. 22:1-8; Gong et al., (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; 및 Hobo et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353]을 참조한다.

유전자 리프레서를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 억제 도메인은 KRAB A/B, KOX, TGF-베타-유도성 초기 유전자 (TIEG), v-erbA, SID, MBD2, MBD3, DNMT 패밀리의 구성원 (예를 들어, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L 등), Rb, 및 MeCP2를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al., (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al., (1999) Cell 99:447-450; 및 Robertson et al., (2000) Nature Genet. 25:338-342]을 참조한다. 추가의 예시적인 억제 도메인은 ROM2 및 AtHD2A를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Chem et al., (1996) Plant Cell 8:305-321; 및 Wu et al., (2000) Plant J. 22:19-27]을 참조한다.

일부 경우에, 도메인은 염색체의 후성적 조절에 수반된다. 일부 실시양태에서, 도메인은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT), 예를 들어 유형-A, 핵 국재화된 것, 예컨대 MYST 패밀리 구성원 MOZ, Ybf2/Sas3, MOF, 및 Tip60, GNAT 패밀리 구성원 Gcn5 또는 pCAF, p300 패밀리 구성원 CBP, p300 또는 Rtt109 (Berndsen and Denu (2008) Curr Opin Struct Biol 18(6):682-689)이다. 다른 경우에 도메인은 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 예컨대 부류 I (HDAC-1, 2, 3, 및 8), 부류 II (HDAC IIA (HDAC-4, 5, 7 및 9), HDAC IIB (HDAC 6 및 10)), 부류 IV (HDAC-11), 부류 III (또한 시르투인 (SIRT); SIRT1-7로도 공지됨)이다 (문헌 [Mottamal et al., (2015) Molecules 20(3):3898-3941] 참조). 일부 실시양태에서 사용되는 또 다른 도메인은 히스톤 포스포릴라제 또는 키나제이고, 예는 MSK1, MSK2, ATR, ATM, DNA-PK, Bub1, VprBP, IKK-α, PKCβ1, Dik/Zip, JAK2, PKC5, WSTF 및 CK2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 메틸화 도메인이 사용되고, Ezh2, PRMT1/6, PRMT5/7, PRMT 2/6, CARM1, set7/9, MLL, ALL-1, Suv 39h, G9a, SETDB1, Ezh2, Set2, Dot1, PRMT 1/6, PRMT 5/7, PR-Set7 및 Suv4-20h와 같은 군으로부터 선택될 수 있다. sumo화 및 비오티닐화에 수반되는 도메인 (Lys9, 13, 4, 18 및 12)이 또한 일부 실시양태에서 사용될 수 있다 (검토, 문헌 [Kousarides (2007) Cell 128:693-705] 참조).

융합 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 클로닝 및 생화학적 접합 방법에 의해 구축된다. 융합 분자는 DNA-결합 도메인 및 기능적 도메인 (예를 들어, 전사 활성화 또는 억제 도메인)을 포함한다. 융합 분자 또한 임의로, 핵 국재화 신호 (예컨대, 예를 들어, SV40 매질 T-항원으로부터의 것) 및 에피토프 태그 (예컨대, 예를 들어, FLAG 및 적혈구 응집소)를 포함한다. 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 핵산)은 번역 리딩 프레임이 융합 성분들 사이에 보존되도록 설계된다.

한편으로는 기능적 도메인 (또는 그의 기능적 단편)의 폴리펩티드 성분과, 다른 한편으로는 비-단백질 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 항생제, 삽입제, 작은 홈 결합제, 핵산) 사이의 융합물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 생화학적 접합 방법에 의해 구축된다. 예를 들어, 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Company) (일리노이주 록포드) 카탈로그를 참조한다. 작은 홈 결합제와 폴리펩티드 사이에 융합물을 제조하는 방법 및 조성물이 기재되어 있다. 문헌 [Mapp et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935]. 마찬가지로, 폴리펩티드 성분 기능 도메인과 회합된 sgRNA 핵산 성분을 포함하는 CRISPR/Cas TF 및 뉴클레아제가 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 본원에서 상세화된다.

융합 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 공지된 바와 같은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985]; 및 공동-소유 국제 특허 공개 번호 WO 00/42219를 참조한다.

융합 분자의 기능적 성분/도메인은, 일단 이러한 융합 분자가 그의 DNA 결합 도메인을 통해 표적 서열에 결합하면, 유전자의 전사에 영향을 미칠 수 있는 각종 상이한 성분 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 기능적 성분은 다양한 전사 인자 도메인, 예컨대 활성화제, 리프레서, 공동 활성화제, 공동 리프레서, 및 사일렌서를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

특정 실시양태에서, 융합 분자는 그의 조작된 (ZFP 또는 TALE 또는 sgRNA) DNA 결합 도메인을 통해 그의 의도되는 핵산 표적을 인식할 수 있는 기능적 엔티티를 생성하고, 뉴클레아제 활성을 통해 DNA가 DNA 결합 부위 근처를 컷팅하게 하는 뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 TALE 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제)를 생성하기 위해, DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 이러한 절단은 타우 유전자의 불활성화 (억제)를 초래한다. 따라서, 유전자 리프레서는 또한 뉴클레아제를 포함한다.

따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 광범위하게 적용가능하고, 임의의 관심 뉴클레아제를 수반할 수 있다. 뉴클레아제의 비제한적 예는 메가뉴클레아제, TALEN 및 아연 핑거 뉴클레아제를 포함한다. 뉴클레아제는 이종 DNA-결합 및 절단 도메인 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제; TALEN; 이종 절단 도메인을 갖는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인, 뉴클레아제 도메인과 회합된 sgRNA)을 포함할 수 있거나, 또는 대안적으로, 자연 발생 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인이 특정의 선택된 표적 부위에 결합하기 위해 변경될 수 있다 (예를 들어, 동족 결합 부위와 상이한 부위에 결합하도록 조작된 메가뉴클레아제).

뉴클레아제 도메인은 임의의 뉴클레아제, 예를 들어 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 DNA-결합 도메인에 융합될 수 있는 적합한 뉴클레아제 (절단) 도메인의 비제한적 예는 임의의 제한 효소, 예를 들어 유형 IIS 제한 효소 (예를 들어, FokI)로부터의 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 절단 도메인은 절단 활성을 위해 이량체화를 필요로 하는 절단 절반-도메인이다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,586,526; 8,409,861; 및 7,888,121을 참조한다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함하는 경우, 절단을 위해 2개의 융합 단백질이 필요하다. 대안적으로, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위는 바람직하게는, 서로에 대해, 2개의 융합 단백질의 그의 각각의 표적 부위에 대한 결합이 절단 절반-도메인을 서로, 절단 절반-도메인이 예를 들어 이량체화에 의해 기능적 절단 도메인을 형성하게 하는 공간적 배향으로 위치되도록 배치된다.

뉴클레아제 도메인은 또한 절단 활성을 갖는 임의의 메가뉴클레아제 (귀소 엔도뉴클레아제) 도메인으로부터 유래될 수 있고, 또한 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함하나 이에 제한되지는 않는 본원에 기재된 뉴클레아제와 함께 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 치밀 TALEN (cTALEN)을 포함한다. 이들은 TALE DNA 결합 도메인을 TevI 뉴클레아제 도메인에 연결시키는 단일 쇄 융합 단백질이다. 융합 단백질은 TALE 영역에 의해 국재화된 니카제로서 작용할 수 있거나, 또는 TALE DNA 결합 도메인이 메가뉴클레아제 (예를 들어, TevI) 뉴클레아제 도메인에 대해서 위치되는 곳에 따라 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있다 (문헌 [Beurdeley et al., (2013) Nat Comm: 1-8 DOI: 10.1038/ncomms2782] 참조).

다른 실시양태에서, TALE-뉴클레아제는 메가 TAL이다. 이들 메가 TAL 뉴클레아제는 TALE DNA 결합 도메인과 메가뉴클레아제 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 메가뉴클레아제 절단 도메인은 단량체로서 활성이고, 활성을 위해 이량체화를 필요로 하지 않는다 (문헌 [Boissel et al., (2013) Nucl Acid Res: 1-13, doi: 10.1093/nar/gkt1224] 참조).

또한, 메가뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인도 또한 DNA-결합 기능을 나타낼 수 있다. 임의의 TALEN은 추가의 TALEN (예를 들어, 1개 이상의 메가-TAL을 갖는 1종 이상의 TALEN (cTALEN 또는 FokI-TALEN)) 및/또는 ZFN과 조합되어 사용될 수 있다.

또한, 절단 도메인은 야생형과 비교하여, 예를 들어, 오프-타겟 절단 효과를 감소시키거나 제거하는 편성 이종이량체의 형성을 위해 1개 이상의 변경을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,914,796; 8,034,598; 및 8,623,618을 참조한다.

본원에 기재된 바와 같은 뉴클레아제는 이중-가닥 표적 (예를 들어, 유전자)에서 이중- 또는 단일-가닥 파괴를 생성할 수 있다. 단일-가닥 파괴 ("닉")의 생성은, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,703,489 및 9,200,266에 기재되어 있고, 이는 뉴클레아제 도메인 중 하나의 촉매 도메인의 돌연변이가 어떻게 니카제를 생성하는지를 기재하고 있다.

따라서, 뉴클레아제 (절단) 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 보유하거나 또는 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 다량체화 (예를 들어, 이량체화)하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.

대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소" 기술을 이용하여 핵산 표적 부위에서 생체내에서 어셈블리될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2009/0068164 참조). 이러한 분할 효소의 성분은 별개의 발현 구축물 상에서 발현될 수 있거나, 또는 개별 성분이, 예를 들어, 자기 절단 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 분리되는 하나의 오픈 리딩 프레임 내에서 연결될 수 있다. 성분은 개별 아연 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인일 수 있다.

뉴클레아제를 대상으로 하여, 사용하기 전에, 예를 들어 미국 공개 번호 2009/0111119에 기재된 바와 같은 효모 기반 염색체 시스템에서 활성에 관하여 스크리닝할 수 있다. 뉴클레아제 발현 구축물은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 용이하게 설계될 수 있다.

융합 단백질 (또는 그의 성분)의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들어 라피노스 및/또는 갈락토스의 존재 하에 활성화 (탈-억제)되고 글루코스의 존재 하에 억제되는 갈락토키나제 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 바람직한 프로모터의 비제한적 예는 신경 특이적 프로모터 NSE, CMV, 시냅신, CAMKiia 및 MECP를 포함한다. 편재성 프로모터의 비제한적 예는 CAS 및 Ubc를 포함한다. 추가 실시양태는 미국 특허 공개 번호 2015/0267205에 기재된 바와 같은 자기-조절 프로모터의 사용 (DNA-결합 도메인에 대한 고친화도 결합 부위의 포함을 통함)을 포함한다.

전달

본원에 기재된 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자 조정제) 및 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은, 예를 들어, 단백질의 주사에 의하는 것, mRNA를 통하는 것 및/또는 발현 구축물 (예를 들어, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, AAV 벡터, Ad 벡터 등)을 사용하는 것을 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 표적 세포에 전달될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 리프레서는 AAV2/6 또는 AAV2/9 (미국 특허 번호 7,198,951 참조), 미국 특허 번호 9,585,971에 기재된 바와 같은 AAV 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는 AAV 벡터를 사용하여 전달된다.

본원에 기재된 바와 같은 아연 핑거 단백질을 포함하는 단백질을 전달하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824에 기재되어 있고, 이들 모두의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 벡터 시스템을 사용할 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 8,586,526; 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824를 참조하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 더욱이, 이들 벡터 중 임의의 것이 1개 이상의 DNA-결합 단백질-코딩 서열을 포함할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 따라서, 1개 이상의 조정제 (예를 들어, 리프레서)가 세포 내로 도입되는 경우, 단백질 성분을 코딩하는 서열 및/또는 폴리뉴클레오티드 성분은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에서 운반될 수 있다. 다수의 벡터가 사용되는 경우, 각각의 벡터는 1개 또는 다수의 조정제 (예를 들어, 리프레서) 또는 그의 성분을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 벡터 시스템은 AAV 벡터, 예를 들어 AAV6 또는 AAV9 또는 미국 특허 번호 9,585,971 또는 미국 공개 번호 20170119906에 기재된 AAV 변이체이다.

통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법을 사용하여 세포 (예를 들어, 포유동물 세포) 및 표적 조직에 조작된 조정제를 코딩하는 핵산을 도입할 수 있다. 또한 이러한 방법을 사용하여 이러한 리프레서 (또는 그의 성분)를 코딩하는 핵산을 세포에 시험관내 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 리프레서를 코딩하는 핵산은 생체내 또는 생체외 유전자 요법 사용을 위하여 투여된다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 전달 비히클, 예컨대 리포솜 또는 폴록사머와 복합체를 형성한 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포로의 전달 후에 에피솜성 또는 통합된 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 유전자 요법 절차에 관한 고찰을 위해, 문헌 [Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm (eds.) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)]을 참조한다.

핵산의 비-바이러스 전달 방법은 전기천공, 리포펙션, 미세주사, 바이오리스틱, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 네이키드 RNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-증진된 흡수를 포함한다. 예를 들어, 소니트론(Sonitron) 2000 시스템 (Rich-Mar)을 사용하는 초음파천공이 또한, 핵산의 전달을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 1개 이상의 핵산이 mRNA로서 전달된다. 번역 효율 및/또는 mRNA 안정성을 증가시키기 위해 캡핑된 mRNA를 사용하는 것이 또한 바람직하다. 특히 바람직한 것은 ARCA (항-역전 캡 유사체) 캡 또는 그의 변이체이다. 미국 특허 번호 7,074,596 및 8,153,773을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다.

추가의 예시적인 핵산 전달 시스템은 아막사 바이오시스템즈(Amaxa Biosystems) (독일 쾰른), 맥스사이트, 인크.(Maxcyte, Inc.) (매릴랜드주 록빌), BTX 몰레큘라 딜리버리 시스템즈(BTX Molecular Delivery Systems) (매사추세츠주 홀리스톤) 및 코페르니쿠스 테라퓨틱스 인크.(Copernicus Therapeutics Inc.)에 의해 제공된 것을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,008,336 참조). 리포펙션은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,049,386; 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)™ 및 리포펙틴(Lipofectin)™ 및 리포펙타민(Lipofectamine)™ RNAiMAX). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 펠그너(Felgner), 국제 특허 공개 번호 WO 91/17424 및 WO 91/16024의 것을 포함한다. 세포 (생체외 투여) 또는 표적 조직 (생체내 투여)에 전달될 수 있다.

표적화된 리포솜, 예컨대 면역지질 복합체를 포함한 지질:핵산 복합체의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 번호 4,186,183; 4,217,344; 4,235,871; 4,261,975; 4,485,054; 4,501,728; 4,774,085; 4,837,028; 및 4,946,787 참조).

추가의 전달 방법은 EnGeneIC 전달 비히클 (EDV) 내로 전달될 핵산의 패키징을 이용하는 것을 포함한다. 이들 EDV는 항체의 하나의 아암이 표적 조직에 대한 특이성을 갖고 있고 다른 아암이 EDV에 대한 특이성을 갖고 있는 이중특이적 항체를 사용하여 표적 조직에 특이적으로 전달된다. 항체는 표적 세포 표면에 EDV를 가져온 다음 EDV를 세포내 이입에 의해 세포 내로 가져온다. 일단 세포 내에 있으면, 그 내용물이 방출된다 (문헌 [MacDiarmid et al., (2009) Nature Biotechnology 27(7):643] 참조).

조작된 ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 코딩하는 핵산의 전달을 위하여 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템을 사용하는 것은 바이러스가 체내의 특이적 세포를 표적으로 하고 바이러스 페이로드를 핵으로 트래피킹하기 위한 고도로 진화된 프로세스를 활용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접적으로 투여될 수 있거나 (생체내) 또는 시험관 내에서 세포를 처리하기 위해 사용될 수 있고, 이와 같이 변형된 세포가 환자에게 투여된다 (생체외). ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 전달하기 위한 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관, 백시니아 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 숙주 게놈에서의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 유전자 전달 방법을 이용하여 가능하며, 이로써 종종 삽입된 트랜스진의 장기간 발현이 초래된다. 추가적으로, 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다.

레트로바이러스의 지향성은 외래 외막 단백질을 혼입시켜, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시킴으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분할 세포를 형질도입 또는 감염시킬 수 있고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 좌우된다. 레트로바이러스 벡터는 6-10 kb 이하의 외래 서열에 대한 패키징 성능을 지닌 시스 작용성 장 말단 반복 서열로 구성된다. 최소한의 시스 작용성 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하므로, 이어서 이를 사용하여 치료용 유전자를 표적 세포 내로 통합시켜 영구적인 트랜스진 발현을 제공한다. 광범위하게 사용된 레트로바이러스 벡터는 마우스 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스 (GaLV), 유인원의 면역결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 그의 조합에 기초한 것을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991)]; 국제 특허 공개 번호 WO 1994/026877 참조).

일시적인 발현이 바람직한 적용에서는, 아데노바이러스 기반 시스템을 사용할 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 나타낼 수 있고 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 이용하여, 높은 역가 및 높은 수준의 발현이 수득되었다. 이러한 벡터는 비교적 단순한 시스템에서 다량으로 생성될 수 있다. 아데노-연관 바이러스 ("AAV") 벡터는 또한, 예를 들어, 핵산 및 펩티드의 시험관내 생성에서, 및 생체내 및 생체외 유전자 요법 절차의 경우에, 세포를 표적 핵산으로 형질도입하기 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌 [West et al., Virology 160:38-47 (1987)]; 미국 특허 번호 4,797,368; 국제 특허 공개 번호 WO 93/24641; [Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)] 참조). 재조합 AAV 벡터의 구축이 수많은 공개에 기재되어 있으며, 이러한 공개는 미국 특허 번호 5,173,414; 문헌 [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)]을 포함한다.

형질도입 작용제를 생성하기 위해 헬퍼 세포주 내로 삽입된 유전자에 의한 결함있는 벡터의 보완을 포함하는 접근 방식을 활용하는 적어도 6가지의 바이러스 벡터 접근 방식이 임상 시험에서 유전자 전달을 위해 현재 이용가능하다.

pLASN 및 MFG-S가 임상 시험에 사용되었던 레트로바이러스 벡터의 예이다 (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN은 유전자 요법 시험에 사용된 최초의 치료 벡터였다 (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). 50% 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 패키지된 벡터에 대하여 관찰되었다 (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997)).

재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV)는 결함있는 비병원성의 파르보바이러스 아데노-연관 유형 2 바이러스에 기초한 유망한 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 트랜스진 발현 카세트를 플랭킹하는 AAV 대략 145 bp 역위 말단 반복 서열만을 보유하고 있는 플라스미드로부터 유래된다. 형질도입된 세포의 게놈 내로의 통합에 기인한 효율적인 유전자 전달 및 안정한 트랜스진 전달이 상기 벡터 시스템에 대한 중요한 특징이다 (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). 다른 AAV 혈청형, 예를 들어 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9, 및 AAV rh10 및 유사형화 AAV, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5, AAV2/9 및 AAV2/6이 또한, 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있는 신규 AAV 혈청형이 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,585,971 참조). 바람직한 실시양태에서, AAV9 벡터 (AAV9의 변이체 및 유사형 포함)가 사용된다.

복제-결핍 재조합 아데노바이러스 벡터 (Ad)는 높은 역가로 생성될 수 있고 수많은 상이한 세포 유형을 용이하게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 트랜스진이 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 대체하도록 조작되고; 연속해서 상기 복제 결함있는 벡터는 트랜스로 결실된 유전자 기능을 공급하는 인간 293 세포에서 번식된다. Ad 벡터는 여러 가지 유형의 조직을 생체내에서 형질도입시킬 수 있으며, 이는 비-분할, 분화된 세포, 예컨대 간, 신장 및 근육에서 발견된 것을 포함한다. 통상적인 Ad 벡터는 큰 운반 능력을 가지고 있다. 임상 시험에서 Ad 벡터를 사용하는 것의 한 예는 근육내 주사를 이용하여 항종양 면역을 위한 폴리뉴클레오티드 요법을 포함하였다 (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). 임상 시험에서 유전자 전달을 위하여 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것의 추가의 예는 하기 문헌 [Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)]을 포함한다.

패키징 세포를 사용하여 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성시킨다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키지하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키지하는 Ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용된 바이러스 벡터는 통상적으로, 핵산 벡터를 바이러스 입자 내로 패키지하는 생산자 세포주에 의해 생성된다. 이러한 벡터는 전형적으로, 패키징 및 숙주 내로의 후속 통합 (적용가능한 경우)에 필요한 최소한의 바이러스 서열을 함유하고, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 코딩하는 발현 카세트에 의해 대체된다. 누락된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용된 AAV 벡터는 전형적으로, 패키징 및 숙주 게놈 내로의 통합에 필요한 AAV 게놈으로부터의 역위 말단 반복 (ITR) 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap를 코딩하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만, ITR 서열이 결여된 세포주에서 패키지된다. 이러한 세포주는 또한, 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제, 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 증진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 상당한 양으로 패키지되지 않는다. 아데노바이러스로의 오염은, 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 감수성인 열 처리에 의해 감소될 수 있다.

많은 유전자 요법 적용에서는, 유전자 요법 벡터가 고도의 특이성으로 특정한 조직 유형에 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스의 외부 표면 상에 바이러스 코트 단백질을 갖는 융합 단백질로서 리간드를 발현시킴으로써 소정의 세포 유형에 대한 특이성을 갖도록 변형될 수 있다. 관심 세포 유형 상에 존재하는 것으로 공지된 수용체에 대한 친화성을 갖는 리간드가 선택된다. 예를 들어, 문헌 [Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)]에는 gp70과 융합된 인간 헤레굴린을 발현하도록 몰로니 마우스 백혈병 바이러스를 변형시킬 수 있고, 재조합 바이러스가 인간 표피 성장 인자 수용체를 발현하는 특정의 인간 유방암 세포를 감염시킨다고 보고되었다. 이러한 원리는 표적 세포가 수용체를 발현하고 바이러스가 세포 표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 다른 바이러스-표적 세포 쌍으로 확장될 수 있다. 예를 들어, 섬유상 파지는 사실상 임의의 선택된 세포 수용체에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 항체 단편 (예를 들어, FAB 또는 Fv)을 표시하도록 조작될 수 있다. 상기 설명이 주로 바이러스 벡터에 적용되긴 하지만, 동일한 원리가 비-바이러스 벡터에도 적용될 수 있다. 이러한 벡터는 특이적 표적 세포에 의한 흡수를 선호하는 특이적 흡수 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.

유전자 요법 벡터는, 전형적으로 하기 기재된 바와 같은, 전신 투여 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척수강내, 수조내, 뇌실내, 또는 해마, 피질, 선조체 등과 같은 뇌의 임의의 영역 내로의 것을 포함한 뇌 내로의 직접 주사를 포함한 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해 개별 환자에게 투여함으로써 생체내 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 생체외 세포, 예컨대 개별 환자로부터 체외 이식된 세포 (예를 들어, 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 만능 공여자 조혈 줄기 세포에 전달한 다음, 통상적으로 벡터가 혼입된 세포를 선택한 후에, 세포를 환자 내로 재이식할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질)은 생체내로 직접 전달된다. 조성물 (세포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질)은 중추 신경계 (CNS) 내로 직접 투여될 수 있고, 뇌 또는 척수로의 직접 주사를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 해마, 흑색질, 마이네르트 핵저조 (NBM), 선조체 및/또는 피질을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 뇌의 하나 이상의 영역이 표적화될 수 있다. 대안적으로 또는 CNS 전달에 더하여, 조성물은 전신 투여될 수 있다 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 심장내, 근육내, 피하, 척수강내, 수조내, 뇌실내 및/또는 두개내 주입). 본원에 기재된 조성물을 직접 대상체에게 (직접 CNS 내로 포함) 전달하기 위한 방법 및 조성물은 바늘 어셈블리를 통한 직접 주사 (예를 들어, 정위 주사)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 방법은, 예를 들어, 뇌에의 조성물 (발현 벡터 포함)의 전달에 관하여 미국 특허 번호 7,837,668 및 8,092,429, 및 미국 특허 공개 번호 2006/0239966에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

투여되는 유효량은 환자마다 및 투여 방식 및 투여 부위에 따라 달라질 것이다. 따라서, 유효량은 조성물을 투여하는 의사에 의해 가장 잘 결정되고, 적절한 투여량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 통합 및 발현을 위한 충분한 시간을 허용한 후 (예를 들어, 전형적으로 4-15일), 치료 폴리펩티드의 혈청 또는 다른 조직 수준의 분석 및 투여 전 초기 수준과의 비교는, 투여되는 양이 너무 적은지, 옳은 범위 내인지, 또는 너무 많은지를 결정할 것이다. 초기 및 후속 투여에 적합한 요법은 또한 가변적이지만, 초기 투여에 이은 필요한 경우의 후속 투여에 의해 전형화된다. 후속 투여는 매일 내지 매년 내지 수년마다의 범위의 가변 간격으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서,

아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 인간 뇌에 직접 ZFP를 전달하기 위해, 선조체당 1x10¹⁰-5x10¹⁵개 (또는 이들 사이의 임의의 값) 벡터 게놈의 용량 범위를 적용할 수 있다. 언급된 바와 같이, 투여량은 다른 뇌 구조 및 상이한 전달 프로토콜에 따라 달라질 수 있다. AAV 벡터를 뇌에 직접 전달하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 9,089,667; 9,050,299; 8,337,458; 8,309,355; 7,182,944; 6,953,575; 및 6,309,634를 참조한다.

진단, 연구를 위한 또는 (예를 들어, 형질감염된 세포의 숙주 유기체 내로의 재-주입을 통한) 유전자 요법을 위한 생체외 세포 형질감염은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포를 대상 유기체로부터 단리하고, 적어도 1종의 조정제 (예를 들어, 리프레서) 또는 그의 성분으로 형질감염시키고, 대상 유기체 (예를 들어, 환자) 내로 재주입한다. 바람직한 실시양태에서, 조정제 (예를 들어, 리프레서)의 1개 이상의 핵산은 AAV9를 사용하여 전달된다. 다른 실시양태에서, 조정제 (예를 들어, 리프레서)의 1개 이상의 핵산은 mRNA로서 전달된다. 번역 효율 및/또는 mRNA 안정성을 증가시키기 위해 캡핑된 mRNA를 사용하는 것이 또한 바람직하다. 특히 바람직한 것은 ARCA (항-역전 캡 유사체) 캡 또는 그의 변이체이다. 미국 특허 번호 7,074,596 및 8,153,773을 참조하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 생체외 형질감염에 적합한 다양한 세포 유형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)], 환자로부터 세포를 단리하고 배양하는 방법에 관한 논의에 대해서는 상기 문헌에 인용된 참고문헌 참조).

한 실시양태에서, 세포 형질감염 및 유전자 요법을 위한 생체외 절차에 줄기 세포가 사용된다. 줄기 세포를 사용하는 경우의 이점은 이들이 시험관 내에서 다른 세포 유형으로 분화될 수 있거나, 또는 이들이 골수에 생착될 포유동물 (예컨대, 세포의 공여자) 내로 도입될 수 있다는 것이다. 시토카인, 예컨대 GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α를 사용하여 시험관 내에서 CD34+ 세포를 임상적으로 중요한 면역 세포 유형으로 분화시키는 방법이 공지되어 있다 (문헌 [Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)] 참조).

줄기 세포는 공지된 방법을 사용하여 형질도입 및 분화시키기 위해 단리된다. 예를 들어, 줄기 세포는 원치않는 세포, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ (T 세포), CD45+ (panB 세포), GR-1 (과립구), 및 Iad (분화된 항원 제시 세포)에 결합하는 항체로 골수 세포를 패닝함으로써 골수 세포로부터 단리된다 (문헌 [Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)] 참조).

일부 실시양태에서는 변형시켰던 줄기 세포를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 아폽토시스에 대해 저항성이 되도록 만든 뉴런의 줄기 세포가 치료 조성물로서 사용될 수 있으며, 여기서 상기 줄기 세포는 또한, 본 발명의 ZFP TF를 함유한다. 아폽토시스에 대한 저항성은, 예를 들어, 줄기 세포 내에서 BAX- 또는 BAK-특이적 TALEN 또는 ZFN (미국 특허 번호 8,597,912 참조)을 사용하여 BAX 및/또는 BAK를 녹아웃시킴으로써, 또는 예를 들어, 카스파제-6 특이적 ZFN을 또한 사용하여 카스파제에서 파괴되는 것에 의해 발생될 수 있다. 이들 세포는 표적 유전자를 조절하는 것으로 공지되어 있는 ZFP TF 또는 TALE TF로 형질감염시킬 수 있다.

치료용 ZFP 핵산을 함유하는 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포솜 등)는 또한, 생체내에서 세포의 형질도입을 위하여 유기체에 직접적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA를 투여할 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 분자를 혈액 또는 조직 세포와 궁극적으로 접촉시켜 이들 내로 도입하는데 정상적으로 사용되는 어떠한 경로에 의해서도 수행된다. 이러한 핵산의 적합한 투여 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능하고 널리 공지되어 있으며, 2가지 이상의 경로를 사용하여 특정한 조성물을 투여할 수 있긴 하지만, 특정한 경로가 종종, 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 유효한 반응을 제공할 수 있다.

DNA를 조혈 줄기 세포 내로 도입하는 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,928,638에 개시된다. 트랜스진을 조혈 줄기 세포, 예를 들어, CD34+ 세포 내로 도입하는데 유용한 벡터는 아데노바이러스 유형 35를 포함한다.

트랜스진을 면역 세포 (예를 들어, T-세포) 내로 도입하는데 적합한 벡터는 비-통합 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Ory et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al., (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al., (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al., (2000) Nature Genetics 25:217-222]을 참조한다.

제약상 허용되는 담체는 부분적으로, 투여되는 특정한 조성물에 의해서 결정될 뿐만 아니라 이러한 조성물을 투여하는데 사용되는 특정한 방법에 의해 결정된다. 따라서, 아래에 기재되는 바와 같이, 제약 조성물의 광범위한 적합한 제제가 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989] 참조).

상기 제시된 바와 같이, 개시된 방법 및 조성물은 원핵 세포, 진균 세포, 고세균 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 척추 동물 세포, 포유동물 세포 및 인간 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유형의 세포에 사용될 수 있다. 단백질 발현에 적합한 세포주는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이는 COS, CHO (예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, 곤충 세포, 예컨대 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (Sf), 및 진균 세포 예컨대 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 세포주의 자손, 변이체 및 유도체가 또한 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태, 방법 및 조성물은 뇌 세포에, 예를 들어 선조체 내로 직접 전달된다.

CNS 장애의 모델

CNS 장애의 연구는 동물 모델 시스템 예컨대 비-인간 영장류 (예를 들어, 파킨슨병 (Johnston and Fox (2015) Curr Top Behav Neurosci 22: 221-35); 근위축성 측삭 경화증 (Jackson et al., (2015) J. Med Primatol: 44(2):66-75), 헌팅톤병 (Yang et al., (2008) Nature 453(7197):921-4); 알츠하이머병 (Park et al., (2015) Int J Mol Sci 16(2):2386-402); 발작 (Hsiao et al., (2016) E Bio Med 9:257-77), 개 (예를 들어, MPS VII (Gurda et al., (2016) Mol Ther 24(2):206-216); 알츠하이머병 (Schutt et al., (2016) J Alzheimers Dis 52(2):433-49); 발작 (Varatharajah et al., (2017) Int J Neural Syst 27(1):1650046) 및 마우스 (예를 들어 발작 (Kadiyala et al., (2015) Epilepsy Res 109:183-96); 알츠하이머병 (Li et al., (2015) J Alzheimers Dis Parkin 5(3) doi 10:4172/2161-0460), (검토: Webster et al., (2014) Front Genet 5 art 88, doi:10.3389f/gene.2014.00088)에서 수행될 수 있다. 이들 모델은 질환의 특정 증상 세트를 조사하는데 유용할 수 있기 때문에 CNS 질환을 완전히 재현하는 동물 모델이 없는 경우에도 사용될 수 있다. 모델은 본원에 기재된 치료 방법 및 조성물 (유전자 리프레서)의 효능 및 안전성 프로파일을 결정하는데 도움이 될 수 있다.

적용

복수의 인공 전사 인자를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 유전자 조정제 (예를 들어, 리프레서)는 유전자 발현의 특이적 조정이 요구되는 임의의 적용을 위해 사용될 수 있다. 이들 적용은 적어도 1개의 유전자 조정제가 바이러스 (예를 들어, AAV) 또는 비-바이러스 벡터를 사용하여 대상체에게 투여되고, 대상체 내의 표적 유전자의 발현을 조정하기 위해 사용되는 치료 방법을 포함한다. 조정은 억제, 예를 들어, 질환 상태에 기여하는 유전자 발현 (예를 들어, HD에서의 Htt, ALS에서의 돌연변이체 C9ORF72, PD 및 DLB에서의 SNCA, AD에서의 타우, 프리온 질환에서의 PRNP)의 억제의 형태일 수 있다. 대안적으로, 조정은 내인성 세포 유전자의 발현의 활성화 또는 증가된 발현이 질환 상태를 호전시킬 수 있는 경우에 활성화의 형태일 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 이러한 적용을 위해, 본원에 기재된 유전자 조정제를 코딩하는 핵산은 제약상 허용되는 담체와 함께 제약 조성물로서 제제화된다.

유전자 조정제 또는 이를 코딩하는 벡터는, 단독으로 또는 다른 적합한 성분 (예를 들어, 리포솜, 나노입자 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 성분)과 조합되어 에어로졸 제제로 제조되어 (즉, 이는 "연무화"될 수 있음) 흡입을 통해 투여될 수 있다. 에어로졸 제제는 가압된 허용되는 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 내에 배치될 수 있다. 예를 들어 정맥내, 근육내, 피내 및 피하 경로에 의한 것과 같은 비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정박테리아제, 및 제제가 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성, 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 조성물은 예를 들어 정맥내 주입에 의해, 경구로, 국소로, 복강내로, 방광내로, 안와후로 (RO), 두개내로 (예를 들어, 해마 및/또는 피질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 뇌의 임의의 구역으로), 또는 척수강내로 투여될 수 있다. 화합물 제제는 단위-용량 또는 다중-용량의 밀봉된 용기, 예컨대 앰플 및 바이알로 제공될 수 있다. 주사 용액 및 현탁액은 상기 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

환자에게 투여되는 용량은 시간이 경과함에 따라 환자에서 유익한 치료 반응을 제공하는데 충분하여야 한다. 용량은 사용된 특정한 유전자 조정제의 효능 및 K_d, 표적 세포, 및 환자의 상태 뿐만 아니라, 치료될 환자의 체중 또는 체표면적에 의해 결정된다. 용량의 크기는 또한 특정한 환자에서 특정한 화합물 또는 벡터의 투여가 동반하는 임의의 유해 부작용의 존재, 성질, 및 정도에 의해 결정된다.

하기 실시예는 유전자 조정제가 표적 유전자에 결합하는 적어도 2개의 아연 핑거 단백질을 포함하는 본 개시내용의 예시적인 실시양태에 관한 것이다. 이는 단지 예시 목적이고, 조작된 DNA-결합 도메인을 갖는 TALE-TF, CRISPR/Cas 시스템, 추가의 ZFP, ZFN, TALEN, 추가의 CRISPR/Cas 시스템, 귀소 엔도뉴클레아제 (메가뉴클레아제)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 임의의 표적 유전자에 대한 유전자 조정제 (예를 들어, 리프레서)가 사용될 수 있음이 인지될 것이다. 이들 조정제는 하기 예시된 바와 같이 표적 부위에 결합하도록 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 용이하게 수득될 수 있다는 것은 분명할 것이다. 유사하게, 하기 실시예는 전달 비히클이 임의의 AAV 벡터인 예시적인 실시양태에 관한 것이지만, 임의의 바이러스 (Ad, LV 등) 또는 비-바이러스 (플라스미드, mRNA 등)가 본원에 기재된 조정제를 전달하는데 사용될 수 있다는 것이 명백할 것이다.

본 명세서 및 실시양태 전반에 걸쳐, 단어 "갖다" 및 "포함하다" 또는 변형, 예컨대 "갖는다", "갖는", "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 언급된 모든 공개 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 다수의 문헌이 본원에 인용되었지만, 이러한 인용은 이들 문헌 중 임의의 것이 관련 기술분야의 통상의 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것은 아니다.

1개 이상의 관심 값에 적용된 바와 같은, 본원에 사용된 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상기 용어는, 달리 언급되지 않는 한 또는 다르게는 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 언급된 참조 값의 어느 한 방향 (초과 또는 미만)으로의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.

실시예

실시예 1: 상승작용적 ZFP-TF 리프레서

ZFP-TF의 패널을 개별적으로 및 다양한 조합으로 스크리닝함으로써 상승작용적 ZFP-TF 리프레서를 포함하는 조성물을 확인하였다.

A. 타우 (MAPT)

미국 공개 번호 20180153921에 기재된 바와 같이 대략 185개의 아연 핑거 단백질의 스크린을 수행하였다. ZFP 및 억제 도메인을 포함하는 ZFP-TF를 또한 시험하였고, 이는 발현을 억제한다는 것을 발견하였다. 또한, 개별 ZFP에 의한 억제를 조합된 다양한 쌍과 비교하고 시험하였다.

ZFP 리프레서를 하기와 같이 마우스 Neuro2A (N2A) 세포에서 타우의 억제에 대해 개별적으로 또는 쌍으로 평가하였다. 간략하게, 3가지 상이한 용량 (약 30, 10 또는 3 ng)의 많은 상이한 개별 ZFP-TF 및 쌍별 조합 ZFP-TF 코딩 mRNA를 약 100,000개의 Neuro2A 세포 내로 형질감염시켰다. ZFP TF를 마우스 Neuro2a 세포 내로 형질감염시켰다. 약 24시간 후, 총 RNA를 추출하고, MAPT 및 2종의 참조 유전자 (ATP5b, RPL38)의 발현을 실시간 RT-qPCR을 사용하여 모니터링하였다.

초기 스크린의 결과에 기초하여 (도 1의 상부 3개의 패널에 제시됨), 4개의 ZFP-TF 52322, 52335, 52364, 52374 및 그의 쌍별 조합을 추가의 연구를 위해 선택하였고, 개별 또는 조합 ZFP-TF의 6가지의 상이한 용량 (300, 100, 30, 10, 3 및 1 ng)을 N2A 세포 내로 형질감염시키고 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 또한 개별 ZFP-TF와 복수의 ZFP-TF를 포함하는 유전자 조정제 사이의 억제 수준을 비교함으로써 상승작용을 평가하였다. 상승작용 점수는 가장 강한 단일 ZFP-TF 또는 조정제에 대한 동일한 핵산 용량에서의 예상된 정규화된 타우 발현 및 ZFP 또는 조정제 조합이 사용된 경우에 관찰된 정규화된 타우 발현의 비로서 계산하였다.

도 1의 하부 패널에 제시된 바와 같이, 2개의 ZFP-TF 리프레서를 포함하는 유전자 조정제는 동일한 투여량에서 개별 ZFP-TF보다 타우 발현을 유의하게 더 많이 억제하였다.

추가로, 도 2 및 3에 제시된 바와 같이, 복수의 ZFP-TF를 포함하는 ZFP-TF를 사용한 유전자 발현의 억제는 관찰된 억제에서 2개의 ZFP를 함께하는 경우에 예상된 억제 수준보다 2- 내지 10-배 또는 그 초과인 놀라운 상승작용적 효과를 제공하였다.

표 1 및 2는 다양한 연구에 사용된 예시적인 설계를 보여준다.

표 1: 예시적인 MAPT ZFP 설계

상기 기재된 2개의 인공 전사 인자를 포함하는 유전자 조정제를 또한 하기와 같이 (1) 억제 (KRAB) 도메인 사이의 거리 (뉴클레오티드에서); (2) 전사 개시 부위 (TSS)로부터 결합된 표적 부위의 거리; (3) 2개의 ZFP-TF 사이의 표적 부위의 거리; 및 (4) 개별 ZFP-TF가 결합하는 가닥에 기초하여 상승작용적 효과에 대해 평가하였다. 상승작용 점수는 가장 강한 단일 ZFP-TF 또는 조정제에 대한 동일한 핵산 용량에서의 예상된 정규화된 타우 발현 및 ZFP 또는 조정제 조합이 사용된 경우에 관찰된 정규화된 타우 발현의 비로서 계산하였다. 368개의 쌍 (43개의 단일의 조합으로부터 제조됨)에 대해 제시된 30 ng 용량에서 상승작용을 평가하였다.

도 4에 제시된 바와 같이, 상승작용적 효과 (억제)는 2개의 표적 부위 또는 억제 도메인 사이의 최대 600개 염기 쌍의 거리에서 2개의 ZFP-TF를 사용하여 용이하게 달성되었고; TSS의 200개의 염기 쌍 (3' 또는 5') 내에 그의 2개의 표적 부위 사이의 중심 거리를 갖는 ZFP-TF에 의해 용이하게 달성되었고; ZFP-TF가 표적 서열의 어느 가닥에 결합하는지는 무관하였다.

후속적으로, 상승작용적으로 작용하는 적어도 2개의 인공 전사 인자를 포함하는 유전자 리프레서를 추가로 평가하기 위해 연구를 수행하였다. 활성 개별 ZFP-TF의 패널을 확인하고, 모든 쌍형성된 조합의 전체 매트릭스로 시험하고, 뿐만 아니라 함께 전달된 모든 6개의 ZFP-TF를 시험하였다.

예시적인 확인된 단일, 쌍, 및 다중 조합에 대한 결과를 도 5에 제시하며, 이는 2개 이상의 ZFP-TF를 거의 임의의 조합으로 조합하는 것에 의해 상승작용적 효과가 용이하게 달성된다는 것을 확인시켜 준다. 모든 6개의 ZFP-TF를 공동-전달한 실험은 가장 큰 수준의 타우 감소 및 가장 강력한 ZFP 쌍 52322-52335보다 대략 3x 더 낮은 가장 낮은 EC50을 발생시켰다.

B. 마우스 프리온 (Prnp)

마우스 Prnp 유전자에 대해 표적화된 ZFP-TF를 또한 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 상승작용적 효과에 대해 스크리닝하였다. 간략하게, 32개의 상이한 개별 ZFP-TF 및 이들 ZFP-TF의 130개의 상이한 쌍별 조합을 코딩하는 mRNA의 3가지 상이한 용량 (개별 ZFP-TF의 경우 200, 60, 20 ng 및 쌍형성된 조합의 경우 100, 30 및 10 ng)을 Neuro2A 세포 내로 형질감염시켰다. 24시간 후, 총 RNA를 추출하고, Prnp 및 2종의 참조 유전자 (ATP5b, EIF4A)의 발현을 실시간 RT-qPCR을 사용하여 모니터링하였다. 상승작용은, 조합하여 그의 용량의 2x로 시험한 경우에 보다 강한 ZFP에 의해 수득된 발현 수준 대 ZFP 조합에 의해 수득된 것의 비로서 계산하였다.

시험된 130개의 ZFP-TF 조합에 대한 상승작용적 효과를 보여주는 결과를 하기 표 A에 제시한다.

표 A: 전체 상승작용 마우스 Prnp

이에 따라, 시험된 조합의 75% 초과에서 (단일 TF와 비교하여) 상승작용적 효과가 관찰되었고, 시험된 조합의 40% 초과에서 2-배 초과의 상승작용적 효과가 관찰되었다.

또한, 도 10은 개별적으로 ZFP-TF와 비교하여 8개의 예시적인 ZFT-TF 조합의 상승작용적 효과를 그래프로 보여준다. 제시된 예시적인 ZFP-TF는 A 내지 K로 지정된다.

마우스 프리온 ZFP-TF의 130개의 조합을 또한 (1) 억제 (KRAB) 도메인 사이의 거리 (뉴클레오티드에서); (2) 전사 개시 부위 (TSS)로부터 결합된 표적 부위의 거리; 및 (3) 2개의 ZFP-TF 사이의 표적 부위의 거리에 기초하여 상승작용적 효과에 대해 평가하였다. 상승작용은 상기 기재된 바와 같이 계산하였다.

도 11에 제시된 바와 같이, 상승작용적 효과 (억제)는 2개의 표적 부위 사이 또는 억제 도메인 사이의 최대 600개 염기 쌍의 거리에서 2개의 ZFP-TF를 사용하여 용이하게 달성되었고; TSS의 600개 염기 쌍 (3' 또는 5') 내에 그의 2개의 표적 부위 사이의 중심 거리를 갖는 ZFP-TF에 의해 용이하게 달성되었다.

C. 인간 프리온 (PRNP)

인간 PRNP 유전자에 대해 표적화된 ZFP-TF를 또한 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 상승작용적 효과에 대해 스크리닝하였다. 간략하게, 32개의 상이한 개별 ZFP-TF 및 이들 ZFP-TF의 130개의 상이한 쌍별 조합을 코딩하는 mRNA의 3가지 상이한 용량 (개별 ZFP-TF의 경우 200, 60, 20 ng 및 쌍형성된 조합의 경우 100, 30 및 10 ng)을 SK-N-MC 세포 내로 형질감염시켰다. 24시간 후, 총 RNA를 추출하고, PRNP 및 2종의 참조 유전자 (ATP5b, EIF4A)의 발현을 실시간 RT-qPCR을 사용하여 모니터링하였다. 상승작용은, 조합하여 그의 용량의 2x로 시험한 경우에 보다 강한 ZFP에 의해 수득된 발현 수준 대 ZFP 조합에 의해 수득된 발현 수준의 비로서 계산하였다.

시험된 130개의 ZFP-TF 조합에 대한 상승작용적 효과를 보여주는 결과를 하기 표 B에 제시한다.

표 B: 전체 상승작용 인간 PRNP

이에 따라, 시험된 조합의 66% 초과에서 (단일 TF와 비교하여) 상승작용적 효과가 관찰되었고, 시험된 조합의 23% 초과에서 2-배 초과의 상승작용적 효과가 관찰되었다.

또한, 도 12는 개별적으로 ZFP-TF와 비교하여 8개의 예시적인 ZFT-TF 조합의 상승작용적 효과를 그래프로 보여준다. 제시된 예시적인 ZFP-TF는 hA 내지 hJ로 지정된다.

인간 프리온 ZFP-TF의 130개의 조합을 또한 (1) 억제 (KRAB) 도메인 사이의 거리 (뉴클레오티드에서); (2) 전사 개시 부위 (TSS)로부터 결합된 표적 부위의 거리; 및 (3) 2개의 ZFP-TF의 표적 부위 사이의 거리에 기초하여 상승작용적 효과에 대해 평가하였다. 상승작용은 상기 기재된 바와 같이 계산하였다.

도 13에 제시된 바와 같이, 상승작용적 효과 (억제)는 2개의 표적 부위 사이 또는 억제 도메인 사이의 최대 600개 염기 쌍의 거리에서 2개의 ZFP-TF를 사용하여 용이하게 달성되었고; TSS의 600개 염기 쌍 (3' 또는 5') 내에 그의 2개의 표적 부위 사이의 중심 거리를 갖는 ZFP-TF에 의해 용이하게 달성되었다.

D. 인간 α-시뉴클레인 (SNCA)

인간 SNCA에 대해 표적화된 ZFP-TF를 또한 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 상승작용적 효과에 대해 스크리닝하였다. 간략하게, 30개의 상이한 개별 ZFP-TF 및 이들 ZFP-TF의 132개의 상이한 쌍별 조합을 코딩하는 mRNA의 3가지 상이한 용량 (개별 ZFP-TF의 경우 200, 60, 20 ng 및 쌍형성된 조합의 경우 100, 30 및 10 ng)을 SK-N-MC 세포 내로 형질감염시켰다. 24시간 후, 총 RNA를 추출하고, SNCA 및 2종의 참조 유전자 (ATP5b, EIF4A)의 발현을 실시간 RT-qPCR을 사용하여 모니터링하였다. 상승작용은, 조합하여 그의 용량의 2x로 시험한 경우에 보다 강한 ZFP에 의해 수득된 발현 수준 대 ZFP 조합에 의해 수득된 것의 비로서 계산하였다.

시험된 132개의 ZFP-TF 조합에 대한 상승작용적 효과를 보여주는 결과를 하기 표 C에 제시한다.

표 C: 전체 상승작용 인간 SNCA

이에 따라, 시험된 조합의 대략 66%에서 (단일 TF와 비교하여) 상승작용적 효과가 관찰되었고, 시험된 조합의 17% 초과에서 2-배 초과의 상승작용적 효과가 관찰되었다.

또한, 도 14는 개별적으로 ZFP-TF와 비교하여 8개의 예시적인 ZFT-TF 조합의 상승작용적 효과를 그래프로 보여준다. 제시된 예시적인 ZFP-TF는 sA 내지 sJ로 지정된다.

인간 α-시뉴클레인 ZFP-TF의 132개의 조합을 또한 (1) 억제 (KRAB) 도메인 사이의 거리 (뉴클레오티드에서); (2) 전사 개시 부위 (TSS)로부터 결합된 표적 부위의 거리; 및 (3) 2개의 ZFP-TF의 표적 부위 사이의 거리에 기초하여 상승작용적 효과에 대해 평가하였다. 상승작용은 상기 기재된 바와 같이 계산하였다.

도 15에 제시된 바와 같이, 상승작용적 효과 (억제)는 2개의 표적 부위 사이 또는 억제 도메인 사이의 최대 600-800개 염기 쌍의 거리에서 2개의 ZFP-TF를 사용하여 용이하게 달성되었고; TSS의 600-800개 염기 쌍 (3' 또는 5') 내에 그의 2개의 표적 부위 사이의 중심 거리를 갖는 ZFP-TF에 의해 용이하게 달성되었다.

실시예 2: 오프-타겟 효과

오프-타겟 효과를 또한 하기와 같이 분석하였다. 먼저, 실시예 1에서 확인된 쌍 52335 및 52389를 글로벌 마이크로어레이 프로파일링에 사용하였다. 간략하게, 약 300 ng의 각각의 ZFP-TF 코딩 mRNA를 150k Neuro2A 세포 내로 개별적으로 또는 조합하여 생물학적으로 사중으로 형질감염시켰다. 약 24시간 후, 총 RNA를 추출하고, 제조업체의 프로토콜 (아피메트릭스 진칩 MTA1.0(Affymetrix Genechip MTA1.0))을 통해 프로세싱하였다. 강건한 멀티-어레이 평균 (RMA)을 사용하여 각각의 프로브 세트로부터 미가공 신호를 정규화하였다. 분석은 트랜스크립톰 분석 콘솔 3.0 (아피메트릭스)을 사용하여 "유전자 수준 차등 발현 분석" 옵션으로 수행하였다. ZFP-형질감염된 샘플을 비관련 ZFP-TF (MAPT 표적 부위에 결합하지 않음)로 처리된 샘플과 비교하였다. 대조군 대비 평균 신호에서 >2배 차이, 및 P-값 < 0.05를 갖는 전사체 (프로브 세트)에 대해 변화 호출을 보고하였다 (각각의 프로브세트에 대해 일원 ANOVA 분석, 독립표본 T-검정).

도 6a에 제시된 바와 같이, 개별 ZFP-TF 52335는 2개의 비-표적 유전자를 억제하고 1개의 유전자를 활성화시켰고; 개별 ZFP-TF 52389는 1개의 유전자를 활성화시킨 반면에; ZFP-TF 52335 및 52389의 조합은 1개의 오프-타겟 부위를 활성화시키고 1개의 오프-타겟 부위를 억제하였다. 또한, 도 6b에 제시된 바와 같이, 2개의 ZFP-TF 리프레서를 포함하는 유전자 조정제는 개별 리프레서보다 타우 수준을 더 많이 억제하였고 (0.012x 야생형 수준), 이는 오프-타겟의 수를 증가시키지 않으면서 온-타겟 억제의 실질적인 증가가 달성가능하다는 것을 입증한다.

실시예 3: 전달

다중-시스트론 전달 및 코돈-다양화된 억제 도메인을 또한 하기와 같이 분석하였다. 단일 ZFP-TF (비연결됨)를 코딩하는, 또는 다중 인공 전사 인자를 운반하는 1개의 mRNA (자기-절단 펩티드 서열, T2A 및 P2A에 의해 분리됨)를 갖는 다중-시스트론 (연결됨)으로서 mRNA를 생성하였다. 또한, ZFP-TF는 전달 벡터에서 반복 서열을 피하기 위해 Kox 억제 도메인의 코돈-다양화된 변이체 (각각 연결된 아키텍처 내의 N-말단, 중간, 또는 C-말단 위치에 대해 nKox, mKox, 및 cKox로 지정됨) 또는 야생형을 포함하였다.

mRNA를 하기 용량으로 Neuro2A 세포 내로 형질감염시켰다: 비연결된 mRNA를 약 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 및 01 ng mRNA의 용량으로 형질감염시키고, 비-시스트론 mRNA를 약 600, 200, 60, 20, 6, 2, 0.6 및 0.1 ng mRNA의 용량으로 형질감염시켰다. 타우 유전자 발현 수준을 약 24시간 후에 측정하였다.

도 7a에 제시된 바와 같이, 유전자 발현은 Kox 도메인 변이체 또는 시스트론 아키텍처와 무관하게, 연결된 및 비연결된 구축물 둘 다에 의해 유사한 크기 및 EC50으로 효과적으로 억제되었다.

유전자 리프레서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터를 또한 생성한다. 전달 비히클은 단일 ZFP-TF (비연결됨)를 운반하거나, 또는 1개의 AAV 벡터가 유전자 조정제의 2개 이상의 인공 전사 인자를 운반한다는 점에서 다중-시스트론 (연결됨)이다. mRNA와 마찬가지로, 단일 및 다중-시스트론 AAV 벡터 둘 다는 타우 발현을 억제하였고, 이는 본원에 기재된 유전자 리프레서의 모든 성분을 코딩하는 단일 AAV 벡터가 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

유전자 조정 (억제)의 동역학을 또한 시간 경과에 따라 시험하였다. 특히, 유전자 발현 (타우) 수준을 mRNA 형질감염 약 24, 48, 64, 72 및 136시간 후에 평가하였다. 도 7b에 제시된 바와 같이, 억제는 형질감염 후 약 72시간 이상에서는 검출가능하지 않았다.

또한, 추가의 기능적 도메인 (DMNT)의 영향을 또한 다양한 시점에 걸쳐 평가하였다. 하기와 같이 3개의 ZFP 융합 단백질: KRAB 억제 도메인에 작동가능하게 연결된 ZFP 57890 (57890-K); DNMT3A 기능적 도메인에 작동가능하게 연결된 ZFP 52322 (52322-D3A) 및 DNMT3L 기능적 도메인에 작동가능하게 연결된 ZFP 57930을 생성하고, N2A 세포 내로 약 900, 300 또는 100 ng의 용량으로 개별적으로 또는 약 300, 100 또는 30 ng의 용량으로 함께 형질감염시켰다. 세포를 약 24, 96 또는 168시간 후에 수거하고, 유전자 발현 수준을 평가하였다.

도 7c에 제시된 바와 같이, 삼중 형질감염은 형질감염 후 최대 약 168시간까지 강건한 수준의 억제를 제공한 반면, 임의의 단일 ZFP 조정제의 전달은 24시간을 넘어 타우 발현을 억제할 수 없었다.

실시예 4: 생체내 비-인간 영장류 연구

영장류 (비-인간 영장류 (NHP) 모델)에서의 타우 발현의 억제를 관찰하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 유전자 리프레서를 시노몰구스 원숭이 (엠. 파시쿨라리스(M. fascicularis))에서 시험하였다. 시노몰구스 원숭이를 자동 급수 시스템이 장착된 스테인레스 스틸 케이지에 수용하였다. 연구는 동물 복지법 규정집의 최종 규칙 (미국 연방 규정집, 표제 9) 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침, 실험실 동물 자원을 위한 기관, 생명 과학 위원회, 국립 연구 협의회, 8판의 모든 적용가능한 섹션을 준수하였다.

유전자 리프레서를 본질적으로 미국 공개 번호 20180153921에 기재된 바와 같이 SYN1 프로모터 또는 CMV 프로모터를 갖는 AAV 벡터 (AAV2/9, 또는 그의 변이체) 내로 클로닝하였다. 사용된 AAV 벡터는 65918 및 57890을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 유전자 조정제의 발현을 구동하는 SYN1 프로모터를 갖는 벡터 (SYN918-890) 및 65918 및 57890을 포함하는 유전자 조정제의 발현을 구동하는 CMV 프로모터를 갖는 벡터 (CMV918-890)를 포함하였다.

NHP 대상체를 하기 표에 제시된 바와 같이 처리하였다:

표 4

실험에서, hSYN1 또는 CMV 구동되는 ZFP TF를 포함하는 AAV9 벡터를 약 6E11개 vg/반구로 좌측 반구에 전달하고, 약 6E11개 vg/반구로 우측 반구에 전달한다. 동물은 좌측 반구에 약 60 μL의 부피의 시험 물품의 단일 용량을 제공받았고, 우측 반구에 약 60 μL의 단일 용량을 제공받았다. 모든 시험 물품에 대해, 용량 농도는 약 1E13개 vg/mL였다.

28일 후, 동물을 희생시키고, 뇌를 떼어내고, 빙냉 PBS 중 관상 뇌 매트릭스 안에 넣었다. 뇌를 3 mm 관상 슬라이스 두께로 슬라이싱하였다 (대략 17개의 슬라이스로 나눔). 일부 뇌 슬라이스 (우측 및 좌측 반구)를 조직병리학 및 계내 혼성화 분석을 위해 10% 중성-완충 포르말린 중에 저장하였다. 모든 다른 뇌 슬라이스 (우측 및 좌측 반구)를 RNA레이터 (퀴아젠(Qiagen))에 넣고, 대략 24시간 동안 냉장시킨 후, 미리 규정된 뇌 표준판에 따라 2-3 mm 직경 펀치를 수집하였다. 펀치를 qRT-PCR 및 생체분포 분석을 위해 프로세싱하였다. 추가적으로, 타우 단백질 분석을 위해 CSF를 수집하였다.

해마 및 내후각 피질 영역을 포함하는 슬라이스를 사용하여 qRT-PCR을 통해 타우, ZFP, 신경교 및 뉴런 세포 마커, 및 하우스키핑 유전자의 mRNA 발현 수준을 분석하였다. 결과는 ZFP-TF가 AAV에 의해 해마 영역으로 전달되었고 이는 타우 발현의 감소로 이어졌음을 보여준다.

대상체를 주입 후 28일째에 부검하고, 뇌를 떼어내고, 문측-미측 접근법에 따라 3 mm 관상 블록으로 절편화하고, 해마 및 내후각 피질을 포함한 여러 뇌 영역에 대한 각각의 블록으로부터 펀치 생검을 수집하였다. qRT-PCR을 사용하여 상이한 뇌 절편으로부터의 74개의 펀치에서 타우 발현, 하우스키핑 유전자 (ATP5b, EIF4a2, 및 GAPDH), 및 ZFP 발현 수준을 평가하였다.

도 8에 제시된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 인공 전사 인자를 포함하는 유전자 조정제를 제공받은 대상체에서의 타우 발현은 대조군 (비히클) 대상체와 비교하여 유의하게 억제되었다.

연구는 본 발명의 유전자 조정제가 영장류 뇌에서 생체내에서 유전자 발현을 (예컨대 치료 수준으로) 조정한다는 것을 입증한다.

데이터는 본원에 기재된 유전자 리프레서가 고도로 활성이며, 간격 비의존적 (표적 부위 사이가 최대 약 600 bp 및 TSS로부터 최대 약 300개 이상의 염기 쌍) 포화 억제가 최대 3.5 로그의 ZFP 용량 수준에 걸쳐 달성되었음을 입증한다. 또한, 유전자 리프레서는 오프-타겟이 거의 내지 전혀 확인되지 않았다는 점에서 고도로 특이적이다. 마지막으로, 유전자 리프레서는 mRNA 형태로 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV 예컨대 AAV9)를 사용하여 전달될 수 있고, 시험관내 및 생체내에서 높은 활성 및 특이성을 나타낸다.

실시예 5: 인간 iPS 뉴런에서의 ZFP-TF 활성

AAV2/6을 사용하여 인간 iPS-유래된 뉴런을 약 1E5개 VG/세포 (아이셀 뉴런즈(iCell Neurons), 셀룰러 다이나믹스 인터내셔널 인크.(Cellular Dynamics International Inc.))로 감염시켰다. 약 19일 후에, 총 RNA를 추출하고, 인간 MAPT, ZFP-KRAB, 및 3종의 참조 유전자 (ATP5b, EIF4a2, GAPDH)의 발현을 실시간 RT-qPCR을 사용하여 평가하였다.

ZFP-TF 특이성을 또한 인간 iPS-유래된 뉴런에서 1E5개 VG/세포 (아이셀 뉴런즈, 셀룰러 다이나믹스 인터내셔널 인크.)로 평가하였다. 약 1e5개 VG/세포의 AAV6 ZFP-TF로 이루어진, 각각의 처리의 5-7회의 생물학적 반복실험을 사용하였다. 감염 약 19일 후, 총 RNA를 추출하고, 제조업체의 프로토콜 (아피메트릭스 휴먼 클라리옴 에스 피코(Affymetrix Human Clariom S Pico))을 통해 프로세싱하였다. 강건한 멀티-어레이 평균 (RMA)을 사용하여 각각의 프로브 세트로부터 미가공 신호를 정규화하였다. 분석은 트랜스크립톰 분석 콘솔 4.0 (아피메트릭스)을 사용하여 "유전자 수준 차등 발현 분석" 옵션으로 수행하였다. ZFP-형질감염된 샘플을 비관련 ZFP-TF (MAPT 표적 부위에 결합하지 않음)로 처리된 샘플과 비교하였다. 대조군 대비 평균 신호에서 >2배 차이, 및 FDR P-값 < 0.05를 갖는 전사체 (프로브 세트)에 대해 변화 호출을 보고하였다 (각각의 프로브세트에 대해 일원 ANOVA 분석, 독립표본 T-검정).

결과는 특정 ZFP-TF 조합이 인간 세포에서 MAPT의 발현을 억제하는데 상승작용적 활성을 나타내었음을 입증하였다.

본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공개는 모든 목적상 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

이해의 명확성의 목적으로 예시 및 예로서 개시내용이 일부 상세히 제공되었지만, 개시내용의 취지 또는 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 실시될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다. 따라서, 상기 설명 및 실시예는 제한적인 것으로서 해석되지 않아야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO THERAPEUTICS, INC. <120> ENGINEERED GENETIC MODULATORS <130> 8325-0183.40 <140> PCT/US2019/054347 <141> 2019-10-02 <150> 62/740,156 <151> 2018-10-02 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 cgacagaagg cgaggacaga agaggaca 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ccgttgcgcc tgattgatgc ccagctcc 28 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 gtggcggaga ctgagagcgc gcgcggcc 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 cttctgtcga ttatcaggta agcgccgc 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Claims (26)

1. 각각 DNA-결합 도메인 및 기능적 도메인을 포함하는 2개 이상의 인공 전사 인자를 포함하는 조성물이며, 여기서 인공 전사 인자는 세포에서 유전자 발현을 상승작용적으로 조정하는 것인 조성물.
2. 제1항에 있어서, 세포가 단리된 것이거나 또는 살아있는 대상체 내에 존재하는 것인 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, HD, 프리온 질환, 파킨슨병, 루이 소체 치매 (DLB), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 및/또는 타우병증인 질환 또는 장애의 생체외 또는 생체내 치료에 사용하기 위한 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상승작용적 조정이 개별 전사 인자와 비교하여 적어도 약 2배인 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 인공 전사 인자가 12개 이상의 뉴클레오티드의 표적 부위에 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함하는 것인 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 전사 인자의 DNA-결합 도메인이 아연 핑거 단백질 (ZFP), TAL-이펙터 도메인, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템의 sgRNA를 포함하는 것인 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 도메인이 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인, DNMT 단백질 예컨대 DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT), 히스톤 메틸라제, 또는 히스톤을 sumo화 또는 비오티닐화하는 효소로부터의 도메인, 및/또는 번역후 히스톤 변형 조절된 유전자 억제를 가능하게 하는 다른 효소 도메인을 포함하는 것인 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 인공 전사 인자가:
   (i) 선택된 표적 유전자의 적어도 12개의 뉴클레오티드의 임의의 표적 부위에 결합하고, 임의로 인공 전사 인자 중 2개 이상이 동일한, 상이한 및/또는 중첩 표적 부위에 결합하고/거나;
   (ii) 서로 10,000개 이상의 염기 쌍 내의 표적 부위에 결합하고/거나;
   (iii) 조정될 표적 유전자의 전사 개시 부위 (TSS)의 어느 하나의 측면의 0 내지 300개 염기 쌍 내의 표적 부위에 결합하고/거나;
   (iv) 이중 가닥 표적의 센스 및/또는 안티센스 가닥에 결합하는 것인
   조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자가 타우 (MAPT) 유전자, Htt 유전자, 돌연변이체 Htt 유전자, 돌연변이체 C9orf72 유전자, SNCA 유전자, 프리온 유전자, SMA 유전자, ATXN2 유전자, ATXN3 유전자, PRP 유전자, Ube3a-ATS 코딩 유전자, DUX4 유전자, PGRN 유전자, MECP2 유전자, FMR1 유전자, CDKL5 유전자, 또는 LRKK2 유전자인 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 인공 전사 인자가 유전자 리프레서, 임의로 야생형 발현 수준과 비교하여 및/또는 단일 인공 전사 인자를 사용한 발현 수준과 비교하여 표적 유전자의 발현을 적어도 50% 내지 100% (또는 그 사이의 임의의 값) 억제하는 리프레서인 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 인공 전사 인자가 유전자 활성화제, 임의로 야생형 발현 수준 및/또는 유전자가 단일 유전자 조정제에 의해 조정된 경우의 발현 수준과 비교하여 표적 유전자의 발현을 1 내지 5-배 또는 그 초과로 활성화시키는 활성화제인 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 도메인의 활성이 외인성 소분자 또는 리간드에 의해 조절되어 세포의 전사 기구와의 상호작용은 외인성 리간드의 부재 하에서는 일어나지 않을 것인 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 제약 조성물.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 전사 인자가 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 임의로 인공 전사 인자 중 1개 이상을 코딩하는 서열을 운반하는 1개 이상의 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 사용하여 대상체에게 제공되며, 임의로 여기서 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 (LV) 및/또는 아데노바이러스 연관 바이러스 벡터 (AAV)를 포함하고, 비-바이러스 벡터는 임의로 플라스미드 및/또는 단일- 또는 다중-시스트론 mRNA를 포함하는 것인 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 뇌에서 약 4주, 약 3개월, 약 6개월 내지 약 1년 또는 그 초과의 기간 동안 유전자 발현을 감소시키는 것에 의해, 임의로 전두 피질 엽 예컨대 전전두 피질, 두정 피질 엽, 후두 피질 엽; 측두 피질 엽 예컨대 내후각 피질, 해마, 뇌간, 선조체, 시상, 중뇌, 소뇌 및/또는 척수 예컨대 척수의 요추, 흉추 및/또는 경추 영역을 포함한 대상체의 뇌에 조성물을 투여하는 것에 의해, MAPT 유전자 발현을 억제함으로써 CNS 질환 또는 장애, 예컨대 타우병증; 프리온을 억제함으로써 프리온 질환; α-시뉴클레인을 억제함으로써 파킨슨병; 돌연변이체 C9orf72 유전자 발현을 억제함으로써 ALS; 유전자 mHtt 발현을 억제함으로써 HD를 치료하는 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 정맥내, 근육내, 뇌실내, 척수강내, 두개내, 점막, 경구, 정맥내, 안와 (안와후 (RO)) 및/또는 수조내 투여를 통해 투여되는 조성물.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 약 10,000 - 500,000개 벡터 게놈/세포로, 임의로 약 10,000 내지 100,000, 또는 약 100,000 내지 250,000, 또는 약 250,000 내지 500,000개 벡터 게놈 (VG)/세포의 용량으로, 임의로 약 1-300 μL의 고정 부피로 뇌 실질에 약 1E11-1E14개 VG/mL로 및/또는 약 0.5-10 mL의 고정 부피로 CSF에 약 1E11-1E14개 VG/mL로 전달되는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터;
    (ii) 약 250 내지 1,000의 MOI로의 렌티바이러스 벡터;
    (iii) 약 0.01-1,000 ng/100,000개 세포로의 플라스미드 벡터; 및/또는
    (iv) 약 0.01-3000 ng/100,000개 세포로의 mRNA
    를 사용하여 전달되는 조성물.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현이 본원에 기재된 바와 같은 유전자 조정제를 제공받지 않은 대조군과 비교하여 세포에서 적어도 30%, 또는 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 90%, 또는 90% 초과만큼 감소되는 것인 조성물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 뉴런, 임의로 HD 또는 AD 뉴런인 조성물.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 1회 투여되거나 또는 다수회 투여되는 조성물.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커, 병원성 종 및/또는 질환 또는 장애의 증상을 감소시키는데 사용하기 위한 것이며, 임의로 여기서 신경독성, 신경교증, 이영양성 신경돌기, 척추 손실, 흥분독성, 피질 및 해마 수축, 수지상 타우 축적, 인지 결핍, 운동 결핍, 아밀로이드 β 플라크와 연관된 이영양성 신경돌기, 타우 병원성 종, mHtt 응집체, 과인산화된 타우, 가용성 타우, 과립상 타우, 타우 응집, 및/또는 신경원섬유 엉킴 (NFT)이 감소되는 것인 조성물.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포이며, 여기서 인공 전사 인자 중 1개 이상을 코딩하는 서열은 게놈 내로 안정하게 통합되고/거나 인공 전사 인자를 코딩하는 1개 이상의 서열은 에피솜으로 유지되고, 임의로 여기서 안정한 통합은 뉴클레아제에 의해 매개되는 표적화된 통합인 세포.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 1개 이상의 조성물 및/또는 1개 이상의 세포를 포함하고, 임의로 시약 및/또는 사용에 대한 지침서를 추가로 포함하는 키트.
24. 선택된 유전자에 대해 표적화된 2개 이상의 인공 전사 인자의 개별 및 조합을 유전자 발현에 대한 그의 영향에 대해 스크리닝하고; 인공 ZFP-TF의 상승작용적 조합을 확인하는 것
    을 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 상승작용적 인공 전사 인자를 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 2개 이상의 인공 전사 인자가:
    (i) 표적 부위에 결합하고/거나 1 내지 600개의 염기 쌍만큼 이격된 기능적 도메인을 포함하고/거나;
    (ii) 대략 1 내지 80; 160 내지 220; 260 내지 400; 또는 500 내지 600개의 염기 쌍만큼 이격된 표적 부위에 결합하고/거나;
    (iii) 서로 대략 1 내지 80; 260 내지 400; 또는 500 내지 600개의 염기 쌍만큼 이격되어 분리된 기능적 도메인을 포함하고/거나;
    (iv) 전사 개시 부위 (TSS)의 어느 하나의 측면의 약 400개 염기 쌍 내에 있는 표적 부위에 결합하고/거나;
    (v) 동일한 안티센스 (-) 또는 센스 (+) 가닥에 또는 상이한 가닥에 어느 하나의 배향으로 결합하는 것인
    방법.
26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상승작용적 인공 TF가 개별 TF보다 표적 유전자를 조정하는데 적어도 2-배 더 활성인 방법.

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