JP7381476B2 - 希少疾患の処置のための方法および組成物 - Google Patents

希少疾患の処置のための方法および組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP7381476B2
JP7381476B2 JP2020543237A JP2020543237A JP7381476B2 JP 7381476 B2 JP7381476 B2 JP 7381476B2 JP 2020543237 A JP2020543237 A JP 2020543237A JP 2020543237 A JP2020543237 A JP 2020543237A JP 7381476 B2 JP7381476 B2 JP 7381476B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
domain
expression
cells
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020543237A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2021500079A (ja
Inventor
マイケル・シー・ホルムズ
ブリジット・イー・ライリー
トーマス・ウェクスラー
ブライアン・ザイトラー
レイ・ジャン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sangamo Therapeutics Inc
Original Assignee
Sangamo Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sangamo Therapeutics Inc filed Critical Sangamo Therapeutics Inc
Publication of JP2021500079A publication Critical patent/JP2021500079A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7381476B2 publication Critical patent/JP7381476B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Immunology (AREA)

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１７年１０月２４日に出願された米国特許仮出願第６２／５７６，５８４号の利益を主張する。
本開示は、希少疾患の診断学および治療学の分野にある。
多数の、おそらくはほとんどの生理学的および病態生理学的プロセスは、遺伝子発現の異常な上方または下方制御によって関連している可能性がある。例として、少し上げるだけでも、関節リウマチにおける炎症促進性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍａｔｏｒｙ）サイトカインの不適当な発現、高コレステロール血症における肝臓ＬＤＬ受容体の発現不足、固形腫瘍成長における血管新生促進因子の過剰発現および血管新生抑制因子の発現不足が挙げられる。さらに、ウイルス、細菌、真菌および原虫などの病原生物は、遺伝子発現を変更することによって制御され得る。
遺伝子のプロモーター領域は、通常、近位、コアおよび下流エレメントを含み、転写は、複数のエンハンサーによって調節され得る。これらの配列は、種々の転写因子の複数の結合部位を含有し、プロモーター配列に関する位置、距離または配向とは無関係に転写を活性化し得る。遺伝子発現調節を達成するために、エンハンサーが結合している転写因子は、介在配列をループアウトし、プロモーター領域と接触する。さらに、真核生物遺伝子の活性化は、クロマチン構造の脱圧縮を必要とすることがあり、これは、ヒストン修飾酵素またはＡＴＰ依存性クロマチンリモデリング複合体の動員によって実施されることができ、その結果、クロマチン構造は変更され、ＤＮＡの、遺伝子発現に関与するその他のタンパク質への到達性が増大される［Ong and Corces (2011) Nat Rev Genetics 12:283］。ＤＮＡメチル化はまた、遺伝子発現の調節における因子であり得る。例えば、ＤＮＡ鎖中のシトシンは、エチル化して、５－メチルシトシンになることがあり、シトシンがグアニンの隣に存在する場合には、これは高頻度で起こり得る（「ＣｐＧ」配置としても知られる）。実際、プロモーター領域中の高濃度のＣｐＧ、いわゆるＣｐＧアイランドは、プロモーター機能を調節するためにメチル化されるか脱メチル化されることが多い［Lister et al (2009) Nature 462(7271):315-22を参照のこと］。
クロマチン構造の撹乱は、いくつかの機序によって起こり得る－そのうちいくつかは、特定の遺伝子に局在し、ゲノムワイドであるその他のものは、クロマチンの凝縮が必要である有糸分裂などの細胞プロセスの際に生じる。ヒストン上のリシン残基は、アセチル化になることがあり、ヒストンタンパク質と染色体ＤＮＡとの間の電荷相互作用を効率的に中和する。これは、全般的な到達性の特徴であるＤＮアーゼ感受性であるとわかっている過剰アセチル化されたおよび高度に転写されたβ－グロビン遺伝子座で観察されている。観察されているその他の種類のヒストン修飾として、メチル化、リン酸化、脱アミノ化、ＡＤＰリボシル化、β－Ｎ－アセチルグルコサミン糖の付加、ユビキチン化およびＳＵＭＯ化が挙げられる［Bannister and Kouzarides (2011) Cell Res 21:381を参照のこと］。ＤＮＡメチル化はまた、ヒストン修飾に影響を及ぼし得るとも思われる。いくつかの場合には、メチル化ＤＮＡは、ヒストン修飾の増大と関連し、クロマチンのより凝縮された形態をもたらす［Cedar and Bergman (2009) Nature Rev Gene 10: 295-304］。
疾患関連遺伝子の抑制または活性化は、遺伝子操作された転写因子の使用によって達成されてきた。遺伝子操作されたジンクフィンガー転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）を設計し、使用する方法は、十分に実証されており（例えば、米国特許第６，５３４，２６１号を参照のこと）、より最近、転写アクチベーター様エフェクター転写因子（ＴＡＬＥ－ＴＦ）およびクラスター化された規則的な間隔の短い回文構造リピートＣａｓベースの転写因子（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ－ＴＦ）の両方が記載された［概説Kabadi and Gersbach (2014) Methods 69(2): 188-197を参照のこと］。標的化される遺伝子の非限定的な例として、ホスホランバン（Zhang et al (2012) Mol Ther 20(8): 1508-1515）、ＧＤＮＦ［Langaniere et al (2010) J. Neurosci 39(49): 16469］およびＶＥＧＦ（Liu et al (2001) J Biol Chem 276:11323-11334）が挙げられる。さらに、遺伝子の活性化は、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ－アセチルトランスフェラーゼ融合物の使用によって達成された［Hilton et al (2015) Nat Biotechnol 33(5):510-517］。遺伝子発現を抑制する遺伝子操作されたＴＦ（リプレッサー）はまた、ハンチントン病（ＨＤ）などのトリヌクレオチド障害に、およびタウオパチーに関与する遺伝子の調節において有効であるとわかっている。例えば、米国特許第９，２３４，０１６号、同第８，８４１，２６０号および同第８，９５６，８２８２号ならびに米国特許公開第２０１８０１５３９２１号および同第２０１５０３３５７０８号を参照のこと。さらに、遺伝子発現は、遺伝子操作されたヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系など）によって調節されることもあり、これでは、遺伝子は、遺伝子操作されたヌクレアーゼによって特異的に切断される。切断部位のエラープローン修復は、ヌクレオチドの挿入および欠失（「インデル」）をもたらすことが多く、遺伝子発現のノックアウトを引き起こす。
希少疾患は、患者とその家族に打撃を与えるものであり得ることが多い。例えば、アンジェルマン症候群、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＨＭＤ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）におけるｃ９Ｏｒｆ７２関連ならびに家族性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、すべて精神遅滞（アンジェルマン症候群）、認知欠損（例えば、ＦＴＤ）および／または筋肉衰弱（ＦＨＭＤ、ＳＭＡおよびＡＬＳ）などの生涯の影響を有し得る疾患である。
したがって、アンジェルマン症候群、ＦＨＭＤ、ＡＬＳ、ＦＴＤおよびＳＭＡなどの希少疾患の予防および／または処置のためを含む、希少疾患に関与する遺伝子を調節するための方法（異常に発現された遺伝子および／または突然変異体アレルの優先的調節を含む）は、依然として必要である。
アンジェルマン症候群、ＦＨＭＤ、ＡＬＳ、ＦＴＤおよびＳＭＡなどの希少疾患を診断、予防および／または処置するための方法および組成物が本明細書において開示される。特に、遺伝子操作された転写因子リプレッサーおよびヌクレアーゼの使用を含む、特定の遺伝子を修飾して（例えば、その発現を調節して）、これらの疾患を処置するための方法および組成物が、本明細書において提供される。
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の遺伝子モジュレーター、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子中の少なくとも１２ヌクレオチドの標的部位と結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＴＡＬエフェクタードメインタンパク質（ＴＡＬＥ）またはシングルガイドＲＮＡ）および転写調節ドメイン（例えば、抑制ドメインまたは活性化ドメイン）またはヌクレアーゼドメインを含むモジュレーターが本明細書において提供される。１つまたは複数の本明細書において記載される遺伝子モジュレーターをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、ウイルス性または非ウイルス性遺伝子デリバリー媒体、例えば、ＡＡＶベクター）も提供される。他の態様では、本明細書において提供されるような１つもしくは複数のポリヌクレオチドおよび／または１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体を含む医薬組成物が本明細書において記載される。遺伝子モジュレーターがヌクレアーゼドメインを含む態様では、遺伝子モジュレーター（および１つもしくは複数の遺伝子モジュレーターまたは１つもしくは複数の遺伝子モジュレーターをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物）は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子を切断し、遺伝子モジュレーターがレギュレータードメインを含む態様では、遺伝子モジュレーター（および１つもしくは複数の遺伝子モジュレーターまたは１つもしくは複数の遺伝子モジュレーターをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物）は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の発現を調節する（例えば、抑制するかまたは活性化する）。遺伝子のセンスおよび／またはアンチセンス鎖は、結合および／または調節され得る。１つまたは複数のヌクレアーゼ遺伝子モジュレーターを含む医薬組成物は、切断されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子中に組み込まれるドナー分子をさらに含み得る。また、本明細書において記載されるような１つもしくは複数の遺伝子モジュレーターを含む単離された細胞（細胞集団を含む）、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体および／または１つもしくは複数の医薬組成物も本明細書において提供される。細胞において［インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）またはエキソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）］Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子を発現すること（例えば、抑制すること）を調節するための方法および使用も提供され、方法は、［それだけには限らないが、脳室内、くも膜下腔内、頭蓋内、後眼窩（ＲＯ）、静脈内または大槽内を含む任意の方法によって］、本明細書において記載されるような１つもしくは複数の遺伝子モジュレーター、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体および／または１つもしくは複数の医薬組成物を細胞に投与することを含む。方法は、対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置および／または予防のために使用され得る。対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置および／または予防のための１つもしくは複数の遺伝子モジュレーター、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体および／または１つもしくは複数の医薬組成物の使用も提供される。また、本明細書において記載されるような１つもしくは複数の遺伝子モジュレーター、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体および／または１つもしくは複数の医薬組成物ならびに適宜、使用のための説明書を含むキットも提供される。
したがって、一態様では、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子操作された（天然に存在しない）遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）が提供される。これらの遺伝子モジュレーターは、アレルの発現を調節する（例えば、抑制する）系（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ－ＴＦ）を含み得る。野生型および／または突然変異体アレルの発現が調節され得る。ある特定の実施形態では、突然変異体アレルの調節は、野生型アレルよりも大きいレベルでである（例えば、野生型アレルは、正常の５０％以下抑制されるが、突然変異体アレルは、未処置対照と比較して少なくとも７０％抑制される）。例えば、一実施形態では、アンジェルマン症候群の処置のために、遺伝子操作された転写因子が、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ ＲＮＡの発現を抑制するために使用され得る。ＦＳＨＤ１では、体細胞組織［通常、生殖系列発達後エピジェネティックにサイレンシングされている、van der Maarel et al (2011) Trends Mol Med. 17(5):252-8. doi: 10.1016/j.molmed.2011.01.001を参照のこと］におけるＤＵＸ４の発現をもたらす突然変異。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された転写因子は、ＦＳＨＤ１の処置のために、その発現を抑制するために使用され得る。同様に、Ｃ９ｏｒｆ７２アレルにおける拡大突然変異は、ＡＬＳおよびＦＴＤとに関連するセンスおよびアンチセンスＲＮＡ産物両方の発現をもたらし、そのため、一実施形態では、ＡＬＳまたはＦＴＤの処置のために、これらの突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルの発現を抑制するように設計された遺伝子操作された転写因子が提供される。いくつかの実施形態では、ＳＭＡの処置のためにＳＭＮ１および／もしくはＳＭＮ２遺伝子の発現を誘導するように、またはＡＳの処置のためにＵＢＥ３４の父方アレルの発現と誘導するように遺伝子操作された転写因子が提供される。遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、認識ヘリックスまたはＲＶＤ）が予め選択された標的部位と結合するように変更されている（例えば、選択および／または合理的設計によって）天然に存在しないジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質である。本明細書において記載されるジンクフィンガータンパク質のいずれも、１、２、３、４、５、６つ以上のジンクフィンガーを含んでもよく、各ジンクフィンガーは、選択された配列（例えば、遺伝子）中の標的部分部位と結合する認識ヘリックスを有する。ある特定の実施形態では、ＺＦＰ－ＴＦは、表１の単一列に示されるような認識ヘリックス領域を有するＺＦＰを含む。同様に、本明細書において記載されるＴＡＬＥタンパク質のいずれも、任意の数のＴＡＬＥ ＲＶＤを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＶＤは、非特異的ＤＮＡ結合を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの認識ヘリックス（またはＲＶＤ）は、天然に存在しない。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥ－ＴＦは、表１に示されるような標的部位の少なくとも１２塩基対と結合するＴＡＬＥを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦは、標的配列と結合するシングルガイドＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された転写因子は、（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはｓｇＲＮＡ ＤＮＡ結合ドメインを介して）疾患と関連する遺伝子中の少なくとも９～１２塩基対の標的部位、例えば、これらの標的部位（例えば、表１に示されるような標的部位）内の連続または非連続配列を含む、少なくとも９～２０塩基対（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）を含む標的部位と結合する。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、転写抑制ドメインと作動可能に連結された（遺伝子リプレッサーを形成するために）または転写活性化ドメインと作動可能に連結された（遺伝子リプレッサーを形成するために）、本明細書において記載されるようなＤＮＡ結合分子（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、シングルガイドＲＮＡ）を含む。他の実施形態では、遺伝子リプレッサー（例えば、配列の修飾によって遺伝子の発現を抑制する）は、少なくとも１つのヌクレアーゼドメイン（例えば、１つ、２つ以上のヌクレアーゼドメイン）と作動可能に連結された本明細書において記載されるようなＤＮＡ結合分子（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、シングルガイドＲＮＡ）を含む。得られた人工ヌクレアーゼは、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列内の、切断部位内の、標的配列および／もしくは切断部位から近い（１～５０以上の塩基対）ならびに／またはヌクレアーゼの対が切断に使用され、その結果、遺伝子の発現が抑制される（不活性化される）場合には対形成された標的部位の間の標的遺伝子を遺伝子修飾（挿入および／または欠失によって）可能である。
したがって、本明細書において記載されるようなジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣａｓタンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、融合分子の一部として調節ドメイン（または機能的ドメイン）と作動性に連結して配置され得る。機能的ドメインは、例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメインおよび／またはヌクレアーゼ（切断）ドメインであり得る。ＤＮＡ結合分子とともに使用するために活性化ドメインまたは抑制ドメインのいずれかを選択することによって、このような分子は、遺伝子発現を活性化するかまたは抑制するために使用され得る。ある特定の実施形態では、機能的または調節ドメインは、ヒストン翻訳後修飾において役割を果たし得る。いくつかの例では、ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチラーゼ、またはヒストンをＳＵＭＯ化するかもしくはビオチン化する酵素または翻訳後ヒストン修飾によって調節される遺伝子抑制を可能にする他の酵素ドメインである［Kousarides (2007) Cell 128:693-705］。いくつかの実施形態では、遺伝子発現を下方制御するために使用され得る転写抑制ドメインに融合された、本明細書において記載されるような遺伝子（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ、ＤＵＸ４）を標的とするＺＦＰ、ｄＣａｓまたはＴＡＬＥを含む分子が提供される。他の実施形態では、遺伝子発現を活性化するために遺伝子（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＵＢＥ３４、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２）を標的とするＺＦＰ、ｄＣＡＳまたはＴＡＬＥを含む分子が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、真核生物を処置するために有用である。ある特定の実施形態では、調節ドメインの活性は、外因性小分子またはリガンドによって調節され、その結果、細胞の転写機構との相互作用は、外因性リガンドの不在下で起こらない。このような外部リガンドは、ＺＦＰ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦまたはＴＡＬＥ－ＴＦの転写機構との相互作用の程度を制御する。調節ドメインは、１つまたは複数のＺＦＰ、ｄＣａｓもしくはＴＡＬＥの間、１つまたは複数のＺＦＰ、ｄＣａｓもしくはＴＡＬＥの外部およびそれらの任意の組合せを含む、ＺＦＰ、ｄＣａｓまたはＴＡＬＥのうち１つまたは複数の任意の部分と作動可能に連結され得る。好ましい実施形態では、調節ドメインは、標的とされる遺伝子（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ、ＤＵＸ４）の遺伝子発現の抑制をもたらす。他の好ましい実施形態では、調節ドメインは、標的とされる遺伝子（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＵＢＥ３４、ＳＭＮ１および／またはＳＭＮ２）の遺伝子発現の活性化をもたらす。本明細書において記載される融合タンパク質のいずれも、医薬組成物に製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、本明細書において記載されるような２つ以上の融合分子、例えば、２つ以上のＣ９ｏｒｆ７２、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳおよび／またはＤＵＸ４モジュレーター（人工転写因子および／または人工ヌクレアーゼ）の使用を含む。２つ以上の融合分子は、異なる標的部位と結合し、同一または異なる機能的ドメインを含むこともある。あるいは、本明細書において記載されるような２つ以上の融合分子は、同一標的部位と結合するが、異なる機能的ドメインを含むこともある。いくつかの例では、３つ以上の融合分子が使用され、他方では、４つ以上の融合分子が使用され、他方では、５つ以上の融合分子が使用される。好ましい実施形態では、２つ以上、３つ以上の、４つ以上または５つ以上の融合分子（またはその構成成分）は、核酸として細胞にデリバリーされる。好ましい実施形態では、融合分子は、標的とされる遺伝子の発現の抑制を引き起こす。いくつかの実施形態では、２つの融合分子は、各分子が自身で活性であるが、組合せでは、抑制活性が相加的である用量で与えられる。好ましい実施形態では、２つの融合分子は、自身ではいずれも活性ではないが、組合せでは、抑制活性が相乗的である用量で与えられる。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるような遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインは、融合分子の一部としてヌクレアーゼ（切断）ドメインと作動性に連結して配置され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼを含む。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのヌクレアーゼ系は、ＤＮＡ中の標的位置にヌクレアーゼをターゲッティングするために特定のシングルガイドＲＮＡとともに利用され得る。ある特定の実施形態では、修飾された幹細胞、筋細胞および／または神経細胞を含む医薬組成物が提供される。
さらに別の態様では、本明細書において記載されるＤＮＡ結合ドメインのいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。
他の態様では、本発明は、ドナー核酸の標的細胞へのデリバリーを含む。ドナーは、ヌクレアーゼをコードする核酸の前に、その後に、またはそれとともにデリバリーされ得る。ドナー核酸は、細胞のゲノム、例えば、内因性遺伝子座中に組み込まれるべき外因性配列（導入遺伝子）を含み得る。いくつかの実施形態では、ドナーは、標的とされる切断部位と相同な領域と隣接している全長遺伝子またはその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、ドナーは、相同領域を欠き、相同性独立性機序（すなわち、ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座中に組み込まれる。ドナーは、任意の核酸配列、例えば、ヌクレアーゼ誘導性二本鎖切断の相同性指向性修復の基質として使用される場合に、内因性染色体遺伝子座、あるいは（またはさらに）、作出されるべき内因性遺伝子座の新規アレル形態（例えば、転写因子結合部位を切断する点突然変異）に、作製されるべきドナー指定欠失につながる核酸を含み得る。いくつかの態様では、ドナー核酸は、組込みが遺伝子補正事象または標的とされる欠失につながるオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ドナーは、標的遺伝子発現を抑制可能な転写因子をコードする。他の実施形態では、ドナーは、標的とされるタンパク質の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。いくつかの態様では、ｍＲＮＡは、化学修飾され得る［例えば、Kormann et al、(2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157を参照のこと］。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含み得る（米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照のこと）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、非修飾および修飾ヌクレオチドの混合物を含み得る（米国特許公開第２０１２－０１９５９３６号を参照のこと）。
さらに別の態様では、本明細書において記載されるようなポリヌクレオチド（例えば、リプレッサー）のいずれかを含む遺伝子デリバリーベクターが提供される。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、組込みコンピテントもしくは組込み欠陥レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９ベクターまたは偽型ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／９およびＡＡＶ２／６である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、血液脳関門を通過可能なＡＡＶベクターである（例えば、Ｕ．Ｓ．２０１５００７９０３８）。他の実施形態では、ＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃ－ＡＡＶ）または一本鎖（ｓｓ－ＡＡＶ）分子である。また、少なくとも１つのヌクレアーゼ（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）をコードする配列および／または標的遺伝子への標的化組込みのためのドナー配列を含む、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、ＬＶまたはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）も本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、Ａｄベクターは、キメラＡｄベクター、例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠陥レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）または組込みコンピテントレンチウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、ＶＳＶ－Ｇエンベロープを有する、またはその他のエンベロープを有する偽型である。
さらに、核酸および／または人工転写因子もしくはヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＰ、ＣａｓもしくはＴＡＬＥまたはＺＦＰ、ＣａｓもしくはＴＡＬＥを含む融合分子）などの融合物を含む医薬組成物も提供される。例えば、ある特定の組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わされた、調節配列と作動可能に連結された、本明細書において記載されるＺＦＰ、ＣａｓまたはＴＡＬＥのうち１つをコードする配列を含む核酸を含み、調節配列は、細胞における核酸の発現を可能にする。ある特定の実施形態では、コードされるＺＦＰ、Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥは、野生型および／または突然変異体アレルを調節する。いくつかの実施形態では、突然変異体アレルは、野生型アレルよりも優先的に調節される、例えば、抑制されるかまたは活性化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、突然変異体アレルを優先的に調節するＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥおよび神経栄養因子を調節するＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥを含む。タンパク質ベースの組成物は、１つまたは複数の本明細書において開示されるＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
さらに別の態様ではまた、本明細書において記載されるようなタンパク質、融合分子、ポリヌクレオチドおよび／または組成物のいずれかを含む単離された細胞も提供される。単離された細胞は、診断および／もしくはスクリーニング方法のための細胞または動物モデルの提供などの非治療的使用のために、ならびに／またはエキソビボ細胞療法などの治療的使用のために使用され得る。
さらに別の態様ではまた、本明細書において記載されるような１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子デリバリー媒体）および／または１つまたは複数の単離された細胞（例えば、その集団）を含む医薬組成物も提供される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２つ以上の遺伝子モジュレーターを含む。例えば、ある特定の組成物は、本明細書において記載されるような希少疾患と関連する遺伝子のうち１つ（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ、ＤＵＸ４）の１つまたは複数の遺伝子モジュレーターをコードする配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーター（例えば、本明細書において記載されるＺＦＰ、ＣａｓまたはＴＡＬＥを含む）は、調節配列に作動可能に連結され、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わされ、調節配列は、細胞における核酸の発現を可能にする。ある特定の実施形態では、コードされるＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥは、突然変異体または野生型アレル（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２）に特異的である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、突然変異体および／または野生型アレル（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２）を調節するＺＦＰ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦまたはＴＡＬＥ－ＴＦを含み、野生型アレルと比較して突然変異体アレルを優先的に調節する（より大きいレベルで活性化するかまたは抑制する）ＴＦを含む。タンパク質ベースの組成物は、本明細書において開示されるような１つまたは複数の遺伝子モジュレーターおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
本発明はまた、それを必要とする対象（例えば、本明細書において記載されるような希少疾患を有する対象）において遺伝子発現を抑制するための方法および使用であって、対象に、本明細書において記載されるような１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体および／または医薬組成物を提供することによってを含む方法および使用を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書において記載される組成物は、ＡＬＳもしくはＦＴＤの処置および／または予防のためを含む、対象において突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２発現を抑制するために使用される。本明細書において記載される組成物は、脳（嗅内皮質、海馬、脳幹、線条体、視床、中脳、小脳を含むが、それだけに限らない前頭前皮質、頭頂皮質葉、後頭皮質葉、側頭皮質葉を含むが、それだけには限らない、前頭皮質葉を含むが、それだけには限らない）および脊髄（腰髄、胸髄および頸髄領域を含むがそれだけには限らない）において遺伝子発現を長期間（４週間、３カ月、６カ月～１年以上）抑制する。本明細書において記載される組成物は、対象に、脳室内、くも膜下腔内、頭蓋内、静脈内の、眼窩［後眼窩（ＲＯ）］、鼻腔内および／または大槽内投与を含むがそれだけには限らない任意の投与手段によって提供され得る。本明細書において記載されるような組成物（例えば、遺伝子モジュレーター、ポリヌクレオチド、医薬組成物および／または細胞）のうち１つまたは複数ならびにこれらの組成物の使用のための説明書を含むキットも提供される。
別の態様では、本明細書において記載される方法および組成物を使用してＣＮＳ（例えば、ＡＳ、ＡＬＳ、ＦＴＤおよび／またはＳＭＡ）または筋肉障害（例えば、ＦＳＨＤ）を処置および／または予防するための方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質が、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）および／またはそれらの組合せを使用してデリバリーされ得る組成物に関与する。いくつかの実施形態では、方法は、本発明の人工転写因子または人工ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦ、Ｃａｓ－ＴＦ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｔｔａｇｏ）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む幹細胞集団を含む組成物に関与する。本明細書において記載されるような組成物（タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞ならびに／またはこれらのタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／もしくは細胞を含む医薬組成物）の投与が、それだけには限らないが、ＡＳ、ＦＳＨＤ、ＡＬＳ、ＦＴＤおよび／またはＳＭＡと関連する臨床症状のいずれかの寛解または排除ならびにＣＮＳ細胞（例えば、ニューロン、星状細胞、ミエリンなど）または筋肉細胞の機能および／または数の増大を含む治療（臨床）効果をもたらす。ある特定の実施形態では、本明細書において記載される組成物および方法は、それらの標的遺伝子（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２）の発現を、本明細書において記載されるような人工リプレッサーを受け取らずに、対照と比較して少なくとも３０％または４０％、好ましくは、少なくとも５０％、いっそうより好ましくは、少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または９５％より多く低減する。いくつかの実施形態では、少なくとも５０％の低減が達成される。ある特定の実施形態では、人工リプレッサーは、野生型アレルと比較して突然変異体アレル（例えば、拡大されたアレル）を例えば、少なくとも２０％優先的に抑制する（例えば、野生型アレルを５０％以下抑制し、突然変異体アレルを少なくとも７０％抑制する）。
なおさらなる態様では、ウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して遺伝子リプレッサーを対象の脳にデリバリーする方法が本明細書において記載される。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ９ベクターである。デリバリーは、カニューレの使用によって、を含む任意の好適な手段による任意の脳領域、例えば、海馬または嗅内皮質へであり得る。直接投与されるベクターではない、脳領域への順行性および逆行性軸索輸送によってを含む、遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）の対象の脳への広範なデリバリーを提供する任意のＡＡＶベクター（例えば、被殻へのデリバリーは、皮質、黒質、視床などといったその他の構造へのデリバリーをもたらす）。ある特定の実施形態では、対象はヒトであり、他の実施形態では、対象は非ヒト霊長類である。投与は、単回用量で、または同時に与えられる一連の用量で、または複数投与（投与間の任意のタイミングで）で、であり得る。
したがって、他の態様では、対象において疾患（例えば、ＡＳ、ＦＳＨＤ、ＡＬＳ、ＦＴＤおよび／またはＳＭＡ）を予防および／または処置する方法であって、ＡＡＶを使用して遺伝子のリプレッサーを対象に投与することを含む方法が本明細書において記載される。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、対象のＣＮＳ（例えば、海馬および／または嗅内皮質）またはＰＮＳ（例えば、脊髄／液）に投与される。他の実施形態では、リプレッサーは、静脈内に投与される。ある特定の実施形態では、対象においてＡＬＳまたはＦＴＤを予防および／または処置する方法であって、１つまたは複数のＡＡＶベクターを使用してＣ９ｏｒｆ７２アレル（野生型および／または突然変異体）のリプレッサーを対象に投与することを含む方法が本明細書において記載される。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターをコードするＡＡＶは、ＣＮＳ（脳および／またはＣＳＦ）に、それだけには限らないが、脳室内、くも膜下腔内、頭蓋内、静脈内の、鼻腔内の、後眼窩または大槽内デリバリーを含む任意のデリバリー方法によって投与される。他の実施形態では、リプレッサーをコードするＡＡＶが、対象の柔組織（例えば、海馬および／または嗅内皮質）中に直接的に投与される。他の実施形態では、リプレッサーをコードするＡＡＶは、静脈内に（ＩＶ）投与される。本明細書において記載される方法のいずれでも、投与することは、１回行われてもよく（単回投与）、または投与あたり同一または異なる用量で複数回行われてもよい（投与の間の任意の回数を用いて）。複数回投与される場合には、同一または異なる投与量および／または投与様式のデリバリー媒体が使用されてもよい（例えば、ＩＶおよび／またはＩＣＶ投与される異なるＡＡＶベクター）。方法は、すべて方法を受け取っていない対象との比較において、または方法を受け取ることに先立つ対象自体との比較において、筋肉機能の喪失、身体的協調の喪失、筋肉の硬化、筋肉攣縮、言語機能の喪失、嚥下の困難性、認知機能障害を低減する方法、運動機能の喪失を低減する方法および／またはＡＬＳ対象において１つもしくは複数の認知機能の喪失を低減する方法を含む。したがって、本明細書において記載される方法は、以下：筋肉機能の喪失、身体的協調の喪失、筋肉の硬化、筋肉攣縮、言語機能の喪失、嚥下の困難性、認知機能障害、血液ならびに／またはＧ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＴＮＦ－αおよびＶＥＧＦレベル［Chen et al (2018) Front Immunol. 9:2122. doi: 10.3389/fimmu.2018.02122を参照のこと］を含むＡＬＳと関連する脳脊髄液化学物質の変化、中心前回および中心後回皮質の環椎ベースの背側および腹側細区画の皮質厚の減少、小指外転筋のＡＬＳＦＲＳ－ＲおよびＭＵＮＩＸ［Wirth et al (2018) Front Neurol. 9:614. doi: 10.3389/fneur.2018.00614を参照のこと］ならびに／または当技術分野で公知の他のバイオマーカーの低減のうち１つまたは複数を含む、ＡＬＳまたはＦＴＤなどの希少疾患のバイオマーカーおよび／または症状の低減をもたらす。ある特定の実施形態では、方法は、例えば、ＦＴＤを有する対象において、タウ（ＭＡＰＴ）の１つまたは複数の遺伝子リプレッサーを投与することをさらに含み得る。例えば、米国特許公開第２０１８０１５３９２１号を参照のこと。
本明細書において記載される方法のいずれにおいても、標的とされるアレルのリプレッサーは、ＺＦＰ－ＴＦ、例えば、アレルと特異的に結合するＺＦＰおよび転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）を含む融合タンパク質であり得る。他の実施形態では、標的とされるアレルのリプレッサーは、ＴＡＬＥ－ＴＦ、例えば、遺伝子アレルと特異的に結合するＴＡＬＥポリペプチドおよび転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）を含む融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、標的とされるアレルリプレッサーは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦであり、Ｃａｓタンパク質中のヌクレアーゼドメインが不活性化されており、その結果、タンパク質がＤＮＡをもはや切断しない。得られたＣａｓ ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡ結合ドメインは、転写リプレッサー（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）に融合されて、標的とされるアレルを抑制する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された転写因子は、突然変異型アレルの発現を抑制可能であるが、野生型アレルは抑制可能ではない。さらなる実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ヘキサマーＧＧＧＧＣＣ拡大を優先的に認識する。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるような遺伝子リプレッサー（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦ）をコードする配列は、ゲノム中に挿入され（組み込まれ）、他の実施形態では、リプレッサーをコードする配列は、エピソームに維持される。いくつかの例では、ＴＦ融合物をコードする核酸は、プロモーターを含むセーフハーバー部位に挿入され（例えば、ヌクレアーゼ媒介性組込みによって）、その結果、内因性プロモーターが発現を駆動する。他の実施形態では、リプレッサー（ＴＦ）ドナー配列は、セーフハーバー部位中に挿入され（ヌクレアーゼ媒介性組込みによって）、ドナー配列は、リプレッサーの発現を駆動するプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、広く発現されるが、他の実施形態では、プロモーターは、組織または細胞／型特異的である。好ましい実施形態では、プロモーター配列は、神経細胞にとって特異的である。他の好ましい実施形態では、プロモーター配列は、筋肉細胞に特異的である。特に好ましい実施形態では、選択されるプロモーターは、低発現を有することを特徴とする。好ましいプロモーターの非限定的な例として、中性特異的プロモーターＮＳＥ、Ｓｙｎａｐｓｉｎ、ＣＡＭＫｉｉａおよびＭＥＣＰが挙げられる。遍在性プロモーターの非限定的な例として、ＣＭＶ、ＣＡＧおよびＵｂｃが挙げられる。さらなる実施形態は、米国特許公開第２０１５／０２６７２０５号に記載されるような自己調節性プロモーターの使用を含む。さらなる実施形態は、米国特許公開第２０１５０２６７２０５号に記載されるような自己調節性プロモーターの使用を含む。
本明細書において記載される方法のいずれかにおいて、方法は、対象（例えば、ＡＬＳを有する対象）の１つまたは複数のニューロンにおける標的アレル（例えば、突然変異体または野生型Ｃ９ｏｒｆ７２）の約５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上または約９５％以上の抑制、９８％以上または９９％以上をもたらし得る。ある特定の実施形態では、野生型アレルの発現は、対象において（未処置対象と比較して）５０％以下抑制され、突然変異体アレルは、対象（未処置対象と比較して）において少なくとも７０％（７０％またはそれより上の任意の値）抑制される。
なおさらなる実施形態では、リプレッサーは、標的とされるアレルを切断し、それによって不活性化することによって標的とされるアレルを抑制するヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含み得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼによる切断後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって挿入および／または欠失（「インデル」）を導入する。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ドナー配列を導入し（相同性または非相同性に指示される方法によって）、ドナー組込みは、標的とされるアレルを不活性化する。いくつかの実施形態では、標的とされる遺伝子は、ＤＮＡ結合ドメインが結合する９～２０より多いヌクレオチドの標的部位を含む、野生型または突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２、Ｕｂｅ３２－ＡＴＳおよび／またはＤＵＸ４遺伝子である。
本明細書において記載される方法のいずれにおいても、レギュレーター（例えば、ヌクレアーゼ、リプレッサーまたはアクチベーター）は、対象（例えば、脳または筋肉）に、タンパク質、ポリヌクレオチドまたはタンパク質およびポリヌクレオチドの任意の組合せとしてデリバリーされ得る。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、ＡＡＶベクターを使用してデリバリーされる。他の実施形態では、レギュレーター（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｓｇＲＮＡ）の少なくとも１つの成分は、ＲＮＡ形態としてデリバリーされる。他の実施形態では、レギュレーターは、本明細書において記載される発現コンストラクト、例えば、１つの発現コンストラクト（ＡＡＶ９）上の１つのリプレッサー（またはその一部）および別個の発現コンストラクト（ＡＡＶまたはその他のウイルス性若しくは非ウイルス性コンストラクト）上の１つのリプレッサー（またはその一部）のいずれかの組合せを使用してデリバリーされる。
さらに、本明細書において記載される方法のいずれにおいても、レギュレーター（例えば、リプレッサー）は、細胞に（エキソビボまたはインビボで）所望の効果を提供する任意の濃度（用量）でデリバリーされ得る。好ましい実施形態では、レギュレーターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを１０，０００～５００，０００ベクターゲノム／細胞（またはその間の任意の値）で使用してデリバリーされる。ある特定の実施形態では、レギュレーターは、レンチウイルスベクターを、２５０から１，０００の間（またはその間の任意の値）のＭＯＩで使用してデリバリーされる。他の実施形態では、レギュレーターは、プラスミドベクターを０．０１～１，０００ｎｇ／１００，０００個細胞（またはその間の任意の値）で使用してデリバリーされる。他の実施形態では、リプレッサーは、ｍＲＮＡとして１５０～１，５００ｎｇ／１００，０００個細胞（またはその間の任意の値）でデリバリーされる。さらに、インビボ使用のために、本明細書において記載される方法のいずれかにおいて、遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）は、それを必要とする対象において所望の効果をもたらす任意の濃度（用量）でデリバリーされ得る。好ましい実施形態では、リプレッサーは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを１０，０００～５００，０００ベクターゲノム／細胞（またはその間の任意の値）で使用してデリバリーされる。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、レンチウイルスベクターを２５０から１，０００の間（またはその間の任意の値）のＭＯＩで使用してデリバリーされる。他の実施形態では、リプレッサーは、プラスミドベクターを０．０１～１，０００ｎｇ／１００，０００個細胞（またはその間の任意の値）で使用してデリバリーされる。他の実施形態では、リプレッサーは、ｍＲＮＡとして０．０１～３０００ｎｇ／細胞数（例えば、５０，０００～２００，０００個（例えば、１００，０００）個細胞（またはその間の任意の値）でデリバリーされる。他の実施形態では、リプレッサーは、１～３００ｕｌの固定容量のデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、１Ｅ１１～１Ｅ１４ＶＧ／ｍｌで脳柔組織へデリバリーされる。他の実施形態では、リプレッサーは、０．５～１０ｍｌの固定容量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、１Ｅ１１～１Ｅ１４ＶＧ／ｍｌでＣＳＦへデリバリーされる。
本明細書において記載される方法のいずれにおいても、方法は、対象の１つまたは複数の細胞において標的とされるアレルの約５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上または約９５％以上の調節（例えば、抑制）をもたらし得る。いくつかの実施形態では、野生型および突然変異体アレルは、異なって調節される、例えば、突然変異体アレルは、野生型アレルと比較して優先的に修飾される（例えば、突然変異体アレルは、少なくとも７０％抑制され、野生型アレルは、５０％以下抑制される）。
さらなる態様では、本明細書において記載されるような転写因子、例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ－ＴＦ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦのうち１つまたは複数、例えば、ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦを含む転写因子が、対象の脳（例えば、ニューロン）において、または筋肉細胞において突然変異体および／または野生型アレルの発現を抑制するために使用される。抑制は、対象の未処置（野生型）細胞と比較した、対象の１つまたは複数の細胞における、標的とされるアレルの約５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、約７５％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上または約９５％以上の抑制であり得る。ある特定の実施形態では、野生型アレルの抑制は、５０％以下（未処置細胞または対象と比較して）であり、突然変異体（罹患またはアイソフォーム変異体）の抑制は、少なくとも７０％である（未処置細胞または対象と比較して）。ある特定の実施形態では、標的とされる転写因子の調節は、本明細書において記載される方法のうち１つまたは複数を達成するために使用され得る。
したがって、外因性配列（人工ＴＦなど）の発現を用いるかまたは用いない抑制を含む、本明細書において開示される希少障害と関連する遺伝子の発現を調節するための方法および組成物が、本明細書において記載される。組成物および方法は、インビトロ（例えば、その調節による、薬物発見のためならびに／またはトランスジェニック動物および動物モデルを作製するための、標的遺伝子の研究のための細胞の提供のため）、インビボまたはエキソビボで使用するためである場合があり、適宜、ヌクレアーゼによる切断後に遺伝子中に組み込まれるドナーを有するヌクレアーゼの場合には、希少疾患と関連する遺伝子を標的とするＤＮＡ結合分子を含む人工転写因子またはヌクレアーゼを投与することを含む。いくつかの実施形態では、ドナー遺伝子（導入遺伝子）は、細胞において染色体外で維持される。ある特定の実施形態では、細胞は、疾患を有する患者中にある。他の実施形態では、細胞は、本明細書において記載される方法のいずれによっても修飾され、修飾された細胞は、それを必要とする対象（例えば、希少疾患を有する対象）に投与される。本明細書において記載される方法によって作製された細胞を含む、遺伝的に修飾された遺伝子（例えば、外因性配列）を含む遺伝的に修飾された細胞（例えば、幹細胞、前駆体細胞、Ｔ細胞、筋肉細胞など）も提供される。これらの細胞は、例えば、細胞をそれを必要とする対象に投与することによって、あるいは、細胞によって産生されるタンパク質を単離することおよびタンパク質をそれを必要とする対象に投与すること（酵素置換療法）によって、希少疾患を有する対象に治療用タンパク質を提供するために使用され得る。
また、本明細書において記載されるような遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）および／または標的－モジュレーター（またはその構成成分）の構成成分を含むポリヌクレオチドおよび／または標的－モジュレーター（またはその構成成分）をコードするポリヌクレオチドのうち１つまたは複数を含むキットも提供される。キットは、細胞（例えば、ニューロンまたは筋肉細胞）、試薬（例えば、例えば、ＣＳＦにおいてタンパク質を検出および／または定量化するための）および／または本明細書において記載されるような方法を含む使用するための説明書をさらに含み得る。
図１Ａおよび１Ｂは、ヒト染色体１５ｑ１１～１３領域の模式図であり、母方（図１Ｂ）および父方（図１Ａ）アレルにおける相違を示す。父性発現された遺伝子は、灰色四角として示されており、母性発現された遺伝子は黒色四角として示されている。両アレル性遺伝子は濃灰色四角として示されている。右矢印は、「＋」鎖上の遺伝子転写を示し、左矢印は、「－」鎖上の遺伝子転写を示す。ＡＳ－ＩＣ（三角）およびＰＷＳ－ＩＣ（楕円）は、その領域におけるヒストン修飾に応じて影が付けられている。ＡＳ－ＩＣは、父方染色体では休止状態（灰色三角）であるが、母方染色体では、Ｈ３－ｌｙｓ４でアセチル化され、メチル化され（三角）、したがって、活性である。ＰＷＳ－ＩＣは、Ｈ３－ｌｙｓ４でアセチル化され、メチル化されているので、父方染色体で活性である（上部楕円）。しかし、母方染色体でのＰＷＳ－ＩＣは、Ｈ３－ｌｙｓ９でメチル化され、抑制されている（下部楕円）。小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＮ（ＳＮＲＰＮ）エキソン１中の、異なってＣｐＧメチル化された領域（異なってメチル化された領域１［ＤＭＲ１］）は、ＰＷＳ－ＩＣと部分的に重複する。母方染色体上のＤＭＲ１はメチル化されるが、父方染色体上はメチル化されない（黒色ピン）ということに留意されたい。ＳＮＲＰＮの上流を起源とするユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａアンチセンス転写物（ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ）は、ＵＢＥ３Ａ転写物との分解性複合体であり得るかまたはユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）転写物の伸長を妨げ得る（「Ｘ」によって表される衝突または上流ヒストン修飾）。 図２Ａから２Ｄは、示された人工転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）を使用する示された細胞型におけるＣ９ｏｒｆ７２発現「総Ｃ９」の抑制を示す。さらに、図は、主にであるが、もっぱらではなく、拡大された突然変異体アレル：「アイソフォーム特異的」によって産生される、イントロン１Ａを含むより長いｍＲＮＡアイソフォームの発現の抑制を示す。図２Ａは、総Ｃ９アッセイおよびアイソフォーム特異的アッセイのために使用されたＰＣＲアッセイを表す。図の上部は、野生型および拡大されたアレルのゲノム配列を表し、図の底部は、各アレルから作製されたｍＲＮＡ産物を示す。ｍＲＮＡ図上の矢印セットは、総Ｃ９アッセイおよびアイソフォーム特異的アッセイにおいて使用されるＰＣＲ標的を表す。図２Ｂから２Ｄは、スクリーニングの第３ラウンド（「ラウンド３」）における野生型細胞株における総Ｃ９ｏｒｆ７２発現を表すグラフにおける異なる例示的ＺＦＰ－ＴＦのアッセイの結果を示す；左から２番目のグラフは、スクリーニングの第３ラウンド（「ラウンド３」）における、「Ｃ９」細胞株における総Ｃ９ｏｒｆ７２発現を示し（「５／＞１４５」として定義される；野生型アレル上のＧ４Ｃ２リピートの数、（５）／拡大されたアレル上のＧ４Ｃ２リピートと比較した、＞１４５を指す）、右から２番目のグラフは、スクリーニングの第２ラウンド（「ラウンド２」）における上記で定義されるようなＣ９細胞株における総Ｃ９ｏｒｆ７２発現を示す；最右のグラフは、アイソフォーム特異的Ｃ９ｏｒｆ７２アッセイからの結果を示す（実施例２を参照のこと）。ラウンド２では、スクリーニングは、ＺＦＰ処置後のアイソフォーム（または疾患）特異的Ｃ９対総Ｃ９レベルを評価する患者から得たＣ９株において実施した。ラウンド３では、Ｃ９ ＷＴアレルに対するＺＦＰ効果を評価するために、総Ｃ９が、健常個体から得た野生型（ＷＴ）株と比較して、患者から得たＣ９株において評価された。各ＺＦＰのために、１、３、１０、３０、１００および３００ｎｇのｍＲＮＡの濃度が、左から右に示されている（詳細については実施例２を参照のこと）。図２Ｂは、上部グラフにおいて７４９４９、７４９５１、７４９５４、７４９５５および７４９６４ならびに下部グラフにおいて７４９６９、７４９７１、７４９７３、７４９７８および７４９７９と名付けられたＺＦＰを含むＺＦＰ－ＴＦの結果を示す。図２Ｃは、上部グラフにおいて７４９８３、７４９８４、７４９８６、７４９８７および７４９８８ならびに下部グラフにおいて７４９９７、７４９９８、７５００１および７５００３と名付けられたＺＦＰを含むＺＦＰ－ＴＦの結果を示す。図２Ｄは、上部グラフにおいて７５０２３、７５０２７、７５０３１、７５０３２、７５０５５および７５０７８ならびに下部グラフにおいて７５０９０、７５１０５、７５１０９、７５１１４および７５１１５と名付けられたＺＦＰを含むＺＦＰ－ＴＦの結果を示す。グラフの底部の配列は、そのＺＦＰのＤＮＡ結合モチーフを表す。各ＺＦＰは、そのモチーフを含有する３つのヘキサヌクレオチドリピートと結合する。 図３は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の示されたリプレッサー（７５０２７および７５１１５）の特異性を示すマイクロアレイ解析結果の結果を示す。解析は、３００ｎｇのｍＲＮＡ形態でのリプレッサーのＣ９０２１細胞への投与の２４時間後に実施された。左のプロットは、ＺＦＰリプレッサー７５０２７を使用した結果を示し、右のプロットは、ＺＦＰリプレッサー７５１１５を使用した結果を示す。結果はまた、実施例３において論じられている。
希少疾患アンジェルマン症候群、ＦＨＭＤ、ＡＬＳおよび／またはＳＭＡの予防および／または処置のための組成物および方法が、本明細書において開示される。特に、本明細書において記載される組成物および方法は、これらの疾患を予防または処置するために疾患関連遺伝子の発現を抑制するために使用される。
アンジェルマン症候群（ＡＳ）は、神経発生障害であり、１／１０，０００から１／２０，０００個体の間の有病率を有する。知的障害、言語の欠如、ぎくしゃくした動き、睡眠障害およびてんかん発作を特徴とし、ＡＳ患者はまた、水に引きつけられながら頻繁に笑う幸福な態度を示す。生後１年以内にこれらの患者では発達遅延が明らかであり、通常、彼らは、生後２４から３０カ月の間に発達プラトーに到達する。さらに、８０％のＡＳ患者においててんかん発作は、診断を確認するために使用され得る特徴的なＥＥＧ特性を示し、発作発症は、生後およそ３年に起こり、成人期まで継続する［Clayton-Smith (2003) J Med Genet 40(2): 87-95］。ＡＳ患者の平均余命は、正常に近いが、若い患者ではある程度の頻度で溺死が生じる［Bird (2014) Appl Clin Gene (7):93-104を参照のこと］。
ＡＳは、Ｅ６関連タンパク質（Ｅ３ユビキチンリガーゼ）をコードするＵＢＥ３Ａ遺伝子の欠陥発現と関連している。Ｅ６関連タンパク質は、破壊に向けたタンパク質のユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｉｏｎ）に関与しており、そのため、疾患の表現型的特徴は、これらの基質の蓄積を含み得る。ＵＢＥ３Ａ遺伝子は、染色体１５上の１５ｑ１１～１３間隔に位置する（図１を参照のこと、Ｂｉｒｄ、同書から適応された）。この遺伝子座は、父方または母方アレルからの遺伝子の優先的発現につながるエピジェネティック調節の１種である遺伝的インプリンティングを受ける。インプリンティングは、ＤＮＡのいくつかの領域が、配偶子が男性であるか女性であるかに応じて異なってメチル化される配偶子形成において生じる。卵母細胞では、過剰メチル化ＣｐＧアイランドは、活性転写領域と関連しており、男性生殖系列では、メチル化はインプリント遺伝子においてそれほど集中しておらず、父方インプリントを有するこれらの遺伝子のプロモーターは、母方インプリント遺伝子との比較においてあまりＣｐＧリッチではない［Stewart et al (2016) Epigenomics 8(10):1399-1413］。ＵＢＥ３Ａは、脳のいくつかの特定の細胞を除いて身体中で両アレル性に発現される遺伝子である。発達中および成人脳両方におけるニューロンにおいて、ＵＢＥ３Ａは、母方アレルのみから発現され、母方アレル上のプロモーターは、重度にメチル化されている。したがって、母方アレル中のこの領域に突然変異がある場合には、父方アレルは、補償できない。分子診断を有するＡＳ患者では、患者のおよそ７８．２％は、母方ＵＢＥ３Ａ遺伝子を包含するいくつかの種類の欠失を有し、１１．２％は、ＵＢＥ３Ａ遺伝子自体内に特定の突然変異を有し、７．７％は、欠陥のある遺伝的インプリンティングと関連する突然変異を有する（Bird、同書）。
ニューロンにおける父方ＵＢＥ３Ａアレルのサイレンシングを確実にするために、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳとして知られる父方アレル上で産生される長いアンチセンスＲＮＡがある（図１を参照のこと）。このアンチセンスＲＮＡは、ｃｉｓで父方ＵＢＥ３Ａ発現を抑制すると思われる父方にインプリントされた遺伝子座からの非定型ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物である。Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳのプロモーターは、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）／アンジェルマン症候群（ＡＳ）領域インプリンティング中心として知られる（ＰＷＳ ＩＣとしても知られる）ＤＮＡメチル化の中心の上流にあると思われ、マウスではＰＷＳ ＩＣの欠失が、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳの発現を抑制し、父方ＵＢＥ３Ａアレルの抑制を軽減することがわかっている［Meng et al (2012) Hum Mol Genet 21(13): 3001-3012］。さらに、Bailus et al ［2016, Mol Ther 24(3): 548-55］には、父方ＵＢＥ３４プロモーターに向けられた人工ジンクフィンガー転写因子の使用は、ＡＳのマウスモデルにおける脳においてＵＢＥ３Ａの広く広がった発現を引き起こすことが示された。
現在、ＡＳの治癒はなく、これらの患者の処置は、支持療法および疾患の症状を緩和するアプローチに集中している。したがって、父方ＵＢＥ３Ａ発現を上方制御する（例えば、標的アレル中の少なくとも９～２０ヌクレオチドの標的部位と結合する本明細書において記載されるような人工転写因子を使用して）ための、および／または対象の細胞にドナーを挿入することによる組成物および方法であって、ドナーが野生型（機能的）ＵＢＥ３Ａをコードする、組成物および方法が、本明細書において記載される。したがって、父方ＵＢＥ３Ａを活性化することが、ＡＳを処置および／または予防するために使用され得る。
あるいは、または父方ＵＢＥ３Ａ発現の活性化に加えて、本明細書において記載される組成物および方法はまた、この疾患の処置を提供するためにＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ ＲＮＡの発現を抑制するために使用され得る。同様に、１つまたは複数の遺伝子操作されたヌクレアーゼの使用は、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳコーディング配列および／またはプロモーターをノックアウトし、それによってＡＳおよびその症状を処置および／または予防するために使用され得る。
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、ほとんどの筋ジストロフィーを有する場合と同様に、神経筋疾患であり、最も著しく影響を受ける身体の領域、顔面（ｆａｃｅ）［顔面（ｆａｃｉｏ）］、肩甲骨（ｓｈｏｕｌｄｅｒ ｂｌａｄｅｓ）［肩甲骨（ｓｃａｐｕｌａ）］および上腕（上腕骨（ｈｕｍｅｒａｌ））にちなんで名づけられた。デュシェンヌ型およびベッカー型筋ジストロフィーの後、３番目に最も一般的な筋疾患である。顔面筋または肩を含む脱力が、通常、この疾患の第１の症状である。顔面筋肉の脱力によって、ストローから飲むこと、笛を吹くことまたは笑うときに口角を挙げることが困難になることが多い。眼の周囲の筋肉における脱力は、人が眠っている間に眼を完全に閉じることを妨げることがあり、これは、ドライアイおよびその他の眼の問題につながり得る。ＦＳＨＤの徴候および症状は、通常、思春期に現れる。しかし、状態の発症および重症度は幅広く変わり、また非対称的に示されることもある［Bao et al (2016) Intractable Rare Dis Res 5(3): 168-176］。軽度の場合は、後年まで注目すべきものにならない場合もあるが、稀に重症の場合は、乳児期または初期小児期に明らかになる。疾患は、常染色体優性のものであり、１／８３００～１／２０，０００の範囲の有病率を有する［Ansseau et al (2017) Genes 8(3): p. 93］。
最近の研究が、ＦＳＨＤの病態形成を通常休止状態遺伝子、ＤＵＸ４の異常な発現に主な原因があるとした。ＤＵＸ４は、Ｄ４Ｚ４タンデムリピート内にコードされる二重ホメオドメイン転写因子（二重ホメオボックスタンパク質、４）である。健常個体では、染色体４ｑのサブテロメア領域は、３．３ｋｂのＤ４Ｚ４マクロサテライトリピートの１１～１００コピーを含有し、各々は、ＤＵＸ４のコピーを有する。しかし、ＤＵＸ４は、十分に分化した筋繊維などの正常に機能する体細胞組織では発現されない。ＤＵＸ４は初期発達では発現されるが、Ｄ４Ｚ４リピートのＣｐＧメチル化によって体細胞組織の細胞分化の間に転写的にサイレンシングされる。この遺伝子は、幹細胞における転写経路の活性化に関与している可能性がある転写因子をコードする。
Ｄ４Ｚ４アレイは、染色体４上の反復されるタンデム３．３－ｋｂリピートユニットの領域である。これらのアレイは、４ｑおよび１０ｑのサブテロメア領域中にあり、１～１００リピートユニットを有する。ＦＳＨＤは、４ｑ３５で１～１０ユニットのアレイと関連する。Ｄ４Ｚ４アレイ中に＜１１リピートユニットを有するＦＳＨＤ患者の大部分が、症状の発症を経験し、２０歳までに約９５％の浸透率を有する。ＦＳＨＤの効果を停止し得るかまたは逆転させ得る処置はないが、症状を軽減し得る薬物療法（例えば、ＮＳＡＩＤ）および手順（例えば、肩甲骨を安定化するための肩手術）はある。
２つの種類のＦＳＨＤ：ＦＳＨＤ１型（ＦＳＤＨ１）およびＦＳＨＤ２型（ＦＳＨＤ２）があり、その９５％がＦＳＨＤ１である。ＦＳＨＤ１は、染色体４中の多型Ｄ４Ｚ４マクロサテライトリピートアレイの収縮によって引き起こされる。Ｄ４Ｚ４マクロサテライトリピートは、１～１００回反復される３．３ｋｂのＤ４Ｚ４ ＤＮＡユニットからなり、リピートはまた、ＤＵＸ４オープンリーディングフレームを含有し、これは、通常、精巣において発現されるが、体細胞ではエピジェネティックに抑制されている。高レベルのＣｐＧメチル化およびヒストン修飾と関連する体細胞では、１０リピートより大きい大きさで、アレイは、抑制されたクロマチン構造をとる。ＦＳＨＤ１患者では、Ｄ４Ｚ４アレイは、１～１０コピーに短縮化されるかまたは収縮され、その時点で、領域は、部分的緩和された構造を想定し、ＤＵＸ４は転写的に抑制解除される。ＤＵＸ４遺伝子は、ポリＡシグナルを欠くが、抑制解除の際に、発現されるＲＮＡが、近くのｐＬＡＭ遺伝子座のポリＡテールにスプライシングされ得るので、末端ＤＵＸ４遺伝子が安定に発現される。ＤＵＸ４遺伝子は、通常、ホメオボックスモチーフと結合し、幹細胞および生殖系列発達と関連する遺伝子の発現を調節する転写因子をコードする。骨格筋におけるＤＵＸ４の誤発現は、細胞アポトーシスおよび萎縮筋管形成につながり、生殖系列特異的遺伝子の上方制御を引き起こし得る。さらに、ＤＵＸ４発現は、ナンセンス媒介性ＲＮＡ減衰の阻害につながり、これは、細胞が、通常分解されるであろう多数のＲＮＡ転写物を蓄積することを意味する［Daxinger et al (2015) Curr Opin Genet Dev 33:56-61］。したがって、本明細書において記載される組成物および方法は、ＦＳＨＤおよび／またはその症状の一部もしくはすべての処置および／または予防のために、ＤＵＸ４発現を抑制する（不活性化するを含む）ために使用され得る。
ＦＳＨＤ２患者では、臨床特徴は、ＦＳＨＤ１患者と同一であるが、患者は、より正常な大きさのＤ４Ｚ４アレイを有する。しかし、ＦＳＨＤ２患者では、Ｄ４Ｚ４アレイは低メチル化され、これは、エピジェネティック調節における機能障害を示唆する。実際、ＦＳＨＤ２患者の８５％において、疾患は、染色体の構造維持ヒンジドメイン含有１（ＳＭＣＨＤ１）遺伝子における突然変異と関係していることが実証されている。ＳＭＣＨＤ１タンパク質は、テロメアと結合すると思われ、実際、Ｄ４Ｚ４アレイと結合し得る。したがって、突然変異は、タンパク質のアレイとの結合を妨げるかまたは緩めることがあり、ＤＵＸ４の誤発現を可能にする（Daxinger、同書）。したがって、ＳＭＣＨＤ１を標的とする人工転写因子および／またはヌクレアーゼは、ＦＳＨＤ２および／またはその症状の処置および／または予防において有用である。いくつかの実施形態では、方法および組成物は、野生型ＳＭＣＨＤ１遺伝子の導入をさらに含み、野生型ＳＭＣＨＤ１は、ヌクレアーゼ依存性標的化組込みを使用してゲノム中に組み込まれるかまたは遺伝子は染色体外で維持される。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、最も一般的成人発症運動ニューロン障害であり、ほとんどの患者にとって最初の症状が現れた時から３年未満に致死性である。一般に、患者のおよそ９０～９５％におけるＡＬＳの発生は、完全に無作為（孤発性ＡＬＳ、ｓＡＬＳ）であり、５～１０％の患者のみが、任意の種類の同定された遺伝的リスクを示す（家族性ＡＬＳ、ｆＡＬＳ）と思われる。ＡＬＳは、１００，０００人あたり１～３症例の年間発生率を有する。Ｃ９ｏｒｆ７２（３０～４０％の患者）、ＳＯＤ１（２０～２５％）、ＴＤＰ４３／ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ１、（ＴＤＰ４３／ＴＡＲＤＢＰおよびＦｕｓ１一緒は、５％）、ＡＮＧ、ＡＬＳ２、ＳＥＴＸおよびＶＡＰＢ遺伝子を含む数種の遺伝子における突然変異は、家族性ＡＬＳを引き起こし、孤発性ＡＬＳの発生に寄与する。Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子における突然変異は、米国および欧州において家族性ＡＬＳの３０～４０パーセントの原因となっており、孤発性ＡＬＳの５～１０％を占める。Ｃ９ｏｒｆ７２突然変異は、通常、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の第１のイントロンにおけるＧＧＧＧＣＣのヘキサヌクレオチド拡大であり、この拡大が常染色体優性表現型をもたらすので、患者は、通常、ヘテロ接合性である。この拡大と関連する病理学（野生型ヒトゲノム中のおよそ３０コピーからｆＡＬＳ患者における数百さらには数千）は、センスおよびアンチセンス両転写物の発現と、ＤＮＡにおける異常な構造の形成と、いくつかの種類のＲＮＡ媒介性毒性とに［Taylor (2014) Nature 507:175］関連していると思われる。拡大されたＧＧＧＧＣＣの不完全ＲＮＡ転写物は、ｆＡＬＳ患者細胞において核内フォーカスを形成し、また、ＲＮＡはリピート関連非ＡＴＰ依存性翻訳を起こすことがあり、凝集する傾向がある３つのタンパク質の生成をもたらし得る［Gendron et al (2013) Acta Neuropathol 126:829］。ＡＬＳの民族的または人種的素因はなく、発生率は、７０から８０歳の間の集団においてピークに達し、疾患は、その他の神経変性障害と比較して迅速に（３～５年）進行する。したがって、本明細書において記載されるようなＣ９ｏｒｆ７２の遺伝子モジュレーターは、それを必要とする対象においてＡＬＳの処置および／または予防のために使用され得る。
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、行動、言語および運動に影響を及ぼし得る脳の進行性障害である。例えば、Benussi et al. (2015) Front Ag Neuro 7、art. 171を参照のこと。Ｃ９ｏｒｆ７２における突然変異は、ＦＴＤに関わっている。したがって、本明細書において記載されるＣ９ｏｒｆ７２調節性組成物および方法は、ＦＴＤの処置および／または予防のために使用され得る。さらに、ＦＴＤはまた、タウオパチーとして同定され、本明細書において記載される方法および組成物は、１つまたは複数のタウモジュレーター（リプレッサー）をＦＴＤ対象に投与することをさらに含み得る。例示的タウリプレッサーについては、例えば、米国特許公開第２０１８０１５３９２１号を参照のこと。抑制ドメインに連結されたジンクフィンガータンパク質は、ＨＤの処置のためのＣＡＧの拡張トラクト（ｔｒａｃｔ）との結合によって、ハンチントン患者に由来する細胞における拡大されたＨｔｔアレルの発現を優先的に抑制するために成功裏に使用されてきた。米国特許第９，２３４，０１６号および同第８，８４１，２６０号も参照のこと。同様に、本発明の方法および組成物（Ｃ９ｏｒｆ７２、ＳＯＤ１、ＴＤＰ４３／ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ１などのＡＬＳ関連遺伝子を標的とするＴＦおよび／またはヌクレアーゼ）は、ＡＬＳを処置、遅延または予防するために使用され得る。例えば、遺伝子操作されたＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ガイドＲＮＡ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２疾患関連アレルの拡大トラクトと結合し、センスおよびアンチセンス両発現を抑制するためにコンストラクトされ得る。あるいは、またはさらに、異常に拡大されたＧＧＧＧＣＣトラクトを欠くＣ９ｏｒｆ７２の野生型版は、ゲノム中に挿入されて、遺伝子産物の正常発現を可能にし得る。これらの分子をコードするこれらの人工転写因子、ヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドおよびこれらの分子を含む細胞またはこれらの分子によって修飾された細胞は、ＡＬＳを処置および／または予防するために使用され得る。
神経系の別の遺伝病として、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）がある。ＳＭＡは、乳児および幼児における死亡の最も頻繁な遺伝的原因であり（およそ６～１０，０００人の誕生中１人）、上腕および下肢の筋肉ならびに頭部および体幹の筋肉および肋間筋を含む進行性の全身性筋肉脱力を含む。さらに、脊髄における運動ニューロンの変性がある。ＳＭＡ発症は、以下のとおりに３つのカテゴリーに分けられてきた：タイプＩ、ＳＭＡ患者のおよそ６０％を有する最も一般的なものは、約６カ月の年齢での発症を有し、約２歳までに死亡をもたらす；タイプＩＩは、６から１８カ月の間の発症を有し、患者は、起き上がる能力を有する場合があるが歩くことはできない；１８カ月後に発症を有するタイプＩＩＩは、患者は、ある程度の時間量の間歩く、いくらかの能力を有する。すべてのタイプのＳＭＡのうち９５％が、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）タンパク質のホモ接合性喪失と関係している。ＳＭＮ１タンパク質は、ＲＮＡ成熟のためのスプライセオソーム複合体のアセンブリーにおける補助因子としてのその機能によって、すべての真核細胞の生存力のために必要である［Talbot and Tizzano (2017) Gene Ther 24(9): 529-533］。ＳＭＡの重症度は、ＲＮＡメッセージのスプライシングにおいて役割を果たす単一突然変異を除いてＳＭＮ１とほぼ同一であるＳＭＮ２タンパク質の発現によって埋め合わされ得る。ＳＭＮ２は、末端切断型であるが、迅速に分解され、そのため、ＳＭＮ２の高発現は、ＳＭＮ１の喪失を部分的に軽減するが、十分に補償できない［Iascone et al (2015) F1000 Pri Rep 7:04を参照のこと］。実際、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの量およびＳＭＡ疾患の重症度は、逆相関があると思われる。ＳＭＡは、ＳＭＮ１遺伝子のホモ接合性喪失と関連しているので、何人かの研究者が、ＡＡＶ９ウイルスベクターを介して、ＳＭＮ１遺伝子をＳＭＡの動物モデル中に導入しようとした［Bevan et al (2011) Mol Ther 19(11):1971-1980を参照のこと］。この初期の研究は、遺伝子は、ＩＶ投与または直接注射のいずれかによって脳脊髄液中にデリバリーされ得ることを示した。しかし、ウイルスの浸透および血液脳関門の通過に関連する合併症が依然として存在する。
したがって、本発明の方法および組成物は、ＳＭＡを予防または処置するために使用され得る。ＳＮＭ２に特異的な遺伝子操作された転写因子は、この遺伝子の発現を増大するように設計され得る。遺伝子操作されたヌクレアーゼは、ＳＭＮ２突然変異を切断し、補正し、ＳＭＮ１遺伝子中に本質的に調整することによって安定な発現を引き起こすために使用され得る。さらに、野生型ＳＭＮ１ ｃＤＮＡは、遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用する標的とされる挿入によってゲノム中に挿入され得る。野生型ＳＭＮ１遺伝子は、内因性ＳＭＮ１遺伝子中に挿入され、したがって、ＳＭＮ１プロモーターの調節下で発現され得るか、またはセーフハーバー遺伝子（例えば、ＡＡＶＳ１）中に挿入され得る。遺伝子はまた、ヌクレアーゼ指向性標的化組込みを介してニューロン性幹細胞中に挿入されてもよく、次いで、遺伝子操作された幹細胞は、患者中に再導入され、その結果、これらの幹細胞に由来するニューロンは、通常機能する。最後に、野生型ＳＭＮ１遺伝子は、ゲノムへの組込みではなくエピソーム維持のために設計されたｃＤＮＡベクターとしてＡＡＶデリバリーを介して脳中に導入され得る。この処置様式では、ｃＤＮＡベクターは、ＳＹＮ１またはＳＭＮ１などの神経特異的発現のためのプロモーターを含むであろう。
全般
本明細書において開示される、方法の実施ならびに組成物の調製および使用は、特に断りのない限り、当該技術分野内のもののような、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、コンピュータ化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連分野における従来技術を用いる。これらの技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989および Third edition, 2001；Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987および定期的更新物；the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998；METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999；およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols” (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照のこと。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用され、直鎖状または環状コンホメーションの、一本鎖または二本鎖形態いずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的上、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限すると解釈されてはならない。この用語は、天然ヌクレオチドの公知類似体ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されているヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同一塩基対合特異性を有する、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように同義的に使用される。この用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーに当てはまる。
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質および核酸間）の配列特異的、非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成成分が、配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格においてリン酸残基と接触する）。このような相互作用は、一般に、１０－６Ｍ－１またはそれより低い解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合力を指す：増大された結合親和性は、より低いＫｄと相関する。「非特異的結合」とは、標的配列に対して依存性ではない、目的の任意の分子（例えば、遺伝子操作されたヌクレアーゼ）および高分子（例えば、ＤＮＡ）間で生じる非共有結合相互作用を指す。
「ＤＮＡ結合分子」は、ＤＮＡと結合し得る分子である。このようなＤＮＡ結合分子は、ポリペプチド、タンパク質のドメイン、より大きなタンパク質またはポリヌクレオチド内のドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり、他の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ヌクレアーゼのタンパク質ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）であり、他の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのガイドＲＮＡ成分（例えば、Ｃａｓ９またはＣｆｐ１）である。
「結合タンパク質」は、別の分子と非共有結合的に結合可能であるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）と結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合には、自身と結合し得る（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）および／または異なるタンパク質（単数または複数）の１つもしくは複数の分子と結合し得る。結合タンパク質は、２つ以上の種類の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合性、ＲＮＡ結合性およびタンパク質結合性活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーによって配列特異的様式にＤＮＡと結合する、タンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略されることが多い。用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、標的遺伝子を二量体化して切断する１つのＺＦＮならびに１対のＺＦＮを含む。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥリピートドメイン／ユニットを含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥの、その同族標的ＤＮＡ配列との結合に関与する。単一「リピートユニット」（「リピート」とも呼ばれる）は、通常、３３～３５アミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内のその他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列と結合するように、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域を遺伝子操作すること（１つまたは複数のアミノ酸を変更すること）によって、またはＤＮＡ結合（リピート可変二残基（ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）またはＲＶＤ領域）に関与するアミノ酸を遺伝子操作することによって「遺伝子操作され」得る。したがって、遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質およびＴＡＬＥを遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたタンパク質は、天然に存在しないタンパク質であり、その設計／組成は、主に合理的基準に起因する。設計のための合理的基準は、既存のＺＦＰまたはＴＡＬＥ設計（正準および非正準ＲＶＤ）および結合データの情報を保存するデータベースにおいて情報を処理するための置換ルールおよびコンピュータ処理されるアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第９，４５８，２０５号、同第８，５８６，５２６号、同第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照のこと。用語「ＴＡＬＥＮ」は、標的遺伝子を二量体化して切断する１つのＴＡＬＥＮならびに１対のＴＡＬＥＮを含む。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に見出されず、その製造は、主にファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの経験的プロセスに起因する。例えば、Ｕ．Ｓ．５，７８９，５３８、Ｕ．Ｓ．５，９２５，５２３、Ｕ．Ｓ．６，００７，９８８、Ｕ．Ｓ．６，０１３，４５３、Ｕ．Ｓ．６，２００，７５９、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７およびＷＯ０２／０９９０８４を参照のこと。
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する。例えば、Swarts et al (2014) Nature 507(7491):258-261, G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652］を参照のこと。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、必要なすべての構成成分である。「組換え」とは、それだけには限らないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるドナー捕獲および相同組換えを含む、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。この開示の目的上、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同性指向性修復機序による細胞における二本鎖切断の修復の際に起こる、このような交換の特殊化形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を起こしたもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移動につながるので「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる特定の理論に捉われようとは思わないが、このような移動は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正および／または標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング」および／または関連プロセスを含み得る。このような特殊化ＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが、標的ポリヌクレオチド中に組み込まれるような標的分子の配列の変更をもたらすことが多い。
ジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列と結合するように、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域を遺伝子操作すること（１つまたは複数のアミノ酸を変更すること）によって、またはＴＡＬＥタンパク質のＲＶＤを遺伝子操作することによって「遺伝子操作され」得る。したがって、遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、天然に存在しないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥを遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。「設計された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、天然に存在しないタンパク質であり、その設計／組成は、主に合理的基準に起因する。設計のための合理的基準は、既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を保存するデータベースにおいて情報を処理するための置換ルールおよびコンピュータ処理されるアルゴリズムの適用を含む。「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、天然に見出されないタンパク質であり、その製造は、主にファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの経験的プロセスに起因する。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、同第６，７４６，８３８号、同第７，２４１，５７３号、同第６，８６６，９９７号、同第７，２４１，５７４号および同第６，５３４，２６１号を参照のこと、ＷＯ０３／０１６４９６も参照のこと。
用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る、直鎖状、環状または分岐状であり得る、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さのもの、例えば、２から１０，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはその間もしくはそれより上の任意の整数値）、好ましくは、約１００から１，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはその間の任意の整数）、より好ましくは、約２００から５００ヌクレオチドの間の長さであり得る。本明細書において記載される方法のいずれにおいても、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、対象の領域においてゲノム配列に対して相同であるが、同一ではなく、それによって、相同組換えを刺激して、対象の領域中に非同一配列を挿入する配列を含有し得る。したがって、ある特定の実施形態では、対象の領域中の配列に対して相同であるドナー配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約８０～９９％（またはその間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、１００を超える連続する塩基対のドナーおよびゲノム配列間として１つのヌクレオチドのみが異なる場合、ドナーおよびゲノム配列間の相同性は、９９％よりも高い。ある特定の場合には、ドナー配列の非相同部分は、対象の領域中に存在しない配列を含有することがあり、その結果、目的の領域中に新しい配列が導入される。これらの場合には、非相同配列は、一般に、目的の領域中の配列に対して相同または同一である、５０～１，０００の塩基対（またはその間の任意の整数値）または１，０００より大きい任意の数の塩基対の配列が隣接している。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列に対して非相同であり、非相同組換え機序によってゲノム中に挿入される。
本明細書において記載される方法のいずれも、目的の遺伝子の発現を撹乱するドナー配列の標的化組込みによって、細胞における１つまたは複数の標的配列の部分または完全不活性化のために使用され得る。部分または完全不活性化された遺伝子を有する細胞株も提供される。
さらに、本明細書において記載されるような標的化組込みの方法はまた、１つまたは複数の外因性配列を組み込むために使用され得る。外因性核酸配列は、例えば、１つまたは複数の遺伝子またはｃＤＮＡ分子または任意の種類のコーディングもしくは非コーディング配列ならびに１つまたは複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、外因性核酸配列は、１つまたは複数のＲＮＡ分子（例えば、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を産生し得る。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞性クロマチンは、核酸、主に、ＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、各２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含むオクタマーと関連するおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じて可変長の）は、ヌクレオソームコアの間を伸長する。ヒストンＨ１の分子は、全般的に、リンカーＤＮＡと関連している。本開示の目的上、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物両方のすべての種類の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞性クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。
「染色体」とは、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、その核型を特徴とすることが多く、細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合体である。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含み得る。
「エピソーム」は、置換核酸、核タンパク質複合体または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含むその他の構造である。エピソームの例として、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する限り、結合分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。例えば、配列５’ＧＡＡＴＴＣ３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
「外因性」分子は、通常、細胞中に存在しないが、１つまたは複数の遺伝的、生化学的またはその他の方法によって細胞中に導入され得る分子である。「細胞中に通常存在する」は、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックによって導入される分子は、熱ショックを受けていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子として、例えば、機能不全内因性分子の機能性版または通常機能性の内因性分子の機能不全版を挙げることができる。
外因性分子は、中でも、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるものなどの小分子、または高分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾された誘導体または１つもしくは複数の上記の分子を含む任意の複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってよく、直鎖状、分岐状または環状であってよく、任意の長さであってよい。核酸は、二重鎖を形成可能なものならびに三重鎖形成性核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質として、それだけには限らないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼおよびヘリカーゼが挙げられる。
外因性分子は、内因性分子と同一種類の分子であり得る、例えば、外因性タンパク質または核酸。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入される感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソームまたは細胞中に通常存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞中に導入するための方法は、当業者に公知であり、それだけには限らないが、脂質媒介性移動（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介性移動およびウイルスベクター媒介性移動が挙げられる。外因性分子はまた、内因性分子と同一種類の分子であり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来する。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞株中に導入され得る。
対照的に、「内因性」分子とは、通常、特定の環境条件下で特定の発達段階で特定の細胞中に存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体またはその他のオルガネラまたは天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは、共有結合によって連結している分子である。サブユニット分子は、同一化学種の分子であってもよく、または異なる化学種の分子であってもよい。第１の種類の融合分子の例として、それだけには限らないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと１つまたは複数の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記で記載された融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。第２の種類の融合分子の例として、それだけには限らないが、三重鎖形成性核酸とポリペプチドとの間の融合物および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられる。用語はまた、ポリヌクレオチド成分が、ポリペプチド成分と会合して、機能的分子を形成する系（例えば、シングルガイドＲＮＡが機能的ドメインと会合して、遺伝子発現を調節するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含む。
細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞へのデリバリーに起因し得るか、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞へのデリバリーにより、ここで、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションはまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドデリバリーのための方法は、本開示中別の場所で提示される。
「多量体化ドメイン」（「二量体化ドメイン」または「タンパク質相互作用ドメイン」とも呼ばれる）は、ＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦのアミノ、カルボキシまたはアミノおよびカルボキシ末端領域で組み込まれるドメインである。これらのドメインは、複数のＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦユニットの多量体化を可能にし、その結果、トリヌクレオチドリピートドメインのより大きなトラクトが、野生型数の長さを有するより短いトラクトに対して、多量体化されたＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦによって優先的に結合されるようになる。多量体化ドメインの例として、ロイシンジッパーが挙げられる。多量体化ドメインはまた、小分子によって調節されることがあり、多量体化ドメインは、小分子または外部リガンドの存在下でのみ別の多量体化ドメインとの相互作用を可能にする適切なコンホメーションをとる。このようにして、外因性リガンドは、これらのドメインの活性を調節するために使用され得る。
「遺伝子」は、本開示の目的上、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照のこと）ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を、このような調節配列が、コーディングおよび／または転写配列に隣接しているかいなかにかかわらず含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、転写調節配列、例えば、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもそれに限らない。
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含有された情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物であり得る（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは任意のその他の種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物としてまた、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質が挙げられる。
遺伝子発現の「調節」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節は、それだけには限らないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含み得る。発現を調節するためにゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム突然変異）が使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書において記載されるようなＺＦＰまたはＴＡＬＥタンパク質を含まない細胞と比較した、遺伝子発現における任意の低減を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分である場合も完全である場合もある。
「目的の領域」は、細胞性クロマチンの任意の領域、例えば、外因性分子と結合することが望ましい、遺伝子または遺伝子内もしくはそれと隣接する非コーディング配列などである。結合は、標的とされるＤＮＡ切断および／または標的とされる組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリアの、葉緑体）または感染性ウイルス性ゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコーディング領域内、転写非コーディング領域、例えば、リーダー配列、トレイラー配列またはイントロンなど内またはコーディング領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内であり得る。目的の領域は、単一ヌクレオチド対ほど小さい場合も、最大２，０００ヌクレオチド対の長さである場合も、または任意の整数値のヌクレオチド対である場合もある。
「真核生物の」細胞として、それだけには限らないが、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。
用語「作動的連結」および「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」（または「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」）は、２つ以上の構成成分（配列エレメントなど）の近位に関して同義的に使用され、構成成分は、両構成成分が通常機能する、構成成分のうち少なくとも１つが、その他の構成成分のうち少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得る可能性を可能にするように配置される。例示として、プロモーターなどの転写調節配列は、転写調節配列が、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応じてコーディング配列の転写レベルを制御する場合にコーディング配列と作動可能に連結される。転写調節配列は、一般に、コーディング配列とｃｉｓで作動可能に連結されるが、直接的に隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、連続していなくとも、コーディング配列に作動可能に連結される転写調節配列である。
融合分子に関して、用語「作動可能に連結される」は、構成成分の各々が、その他の成分との連結において、そのように連結されない場合に果たすものと同一機能を果たすという事実を指すこともある。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、活性化ドメインに融合される融合ポリペプチドに関して、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、融合ポリペプチド中で、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位と結合可能であり、一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御可能である場合に作動性連結にある。遺伝子発現を調節可能である、ドメインに融合されたＺＦＰは、まとめて「ＺＦＰ－ＴＦ」または「ジンクフィンガー転写因子」と呼ばれ、一方で、遺伝子発現を調節可能である、ドメインに融合されたＴＡＬＥは、まとめて「ＴＡＬＥ－ＴＦ」または「ＴＡＬＥ転写因子」呼ばれる。ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメイン（「ＺＦＮ」または「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」）に融合されている融合ポリペプチドの場合は、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位と結合可能であり、一方で、切断ドメインが、標的部位の近傍にあるＤＮＡを切断可能である場合に作動性連結にある。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメイン（「ＴＡＬＥＮ」または「ＴＡＬＥ ヌクレアーゼ」）に融合されている融合ポリペプチドの場合には、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、融合ポリペプチド中で、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位と結合可能であり、一方で、切断ドメインが、標的部位の近傍にあるＤＮＡを切断可能である場合に作動性連結にある。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、融合ポリペプチド中で、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位と結合可能であり、一方で、活性化ドメインが、遺伝子発現を上方調節可能である場合に作動性連結にある。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合される融合ポリペプチドの場合には、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、融合ポリペプチド中で、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位と結合可能であり、一方で、切断ドメインが、標的部位の近傍にあるＤＮＡを切断可能である場合に作動性連結にある。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一機能をなお保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然分子とより多くの、より少ないもしくは同一数の残基を有し得る、および／または１つまたは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コーディング機能、別の核酸とハイブリダイズする能力）を決定する方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定する方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって決定され得る。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと。タンパク質の別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝的および生化学的療法の相補性によって決定され得る。例えば、Fields et al. (1989) Nature 340:245-246、米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照のこと。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移動可能である。通常、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」とは、目的の遺伝子の発現を指示可能な、遺伝子配列を標的細胞に移動できる任意の核酸コンストラクトを意味する。したがって、用語は、クローニングおよび発現媒体ならびに組込みベクターを含む。
「リポーター遺伝子」または「リポーター配列」とは、好ましくは、必ずしもではないが通例のアッセイにおいて容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なリポーター遺伝子として、それだけには限らないが、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、増強細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が挙げられる。エピトープタグは、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列のうち１つまたは複数のコピーを含む。「発現タグ」は、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために、所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るリポーターをコードする配列を含む。
用語「対象」および「患者」は、同義的に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物ならびに実験動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよびその他の動物を指す。したがって、用語「対象」または「患者」は、本明細書において使用する場合、本発明の発現カセットが投与され得る任意の哺乳動物患者または対象を意味する。本発明の対象は、障害を有するものまたは障害を発生するリスクにあるものを含む。
用語「処置すること」および「処置」とは、本明細書において使用する場合、症状の重症度および／または頻度の低減、症状および／または根底にある原因の排除、症状および／またはその根底にある原因の発生の予防ならびに損傷の改善または治療を指す。がんおよび移植片対宿主病は、本明細書において記載される組成物および方法を使用して処置され得る状態の非限定的な例である。したがって、「処置すること」および「処置」は、
（ｉ）特に、このような哺乳動物が状態になりやすいが、それを有するとまだ診断されていない場合に哺乳動物において疾患もしくは状態を発生から妨げること、
（ｉｉ）疾患もしくは状態を阻害すること、すなわち、その発生を停止すること、
（ｉｉｉ）疾患もしくは状態を軽減すること、すなわち、疾患または状態の退縮を引き起こすことならびに／または
（ｉｖ）疾患もしくは状態に起因する症状を軽減もしくは排除すること、すなわち、根底にある疾患もしくは状態に対処してもしくは対処せずに疼痛を軽減すること
を含む。
本明細書において使用する場合、用語「疾患」および「状態」は、同義的に使用され得る、または特定の病弊もしくは状態が既知原因物質を有さない場合があり（その結果、病因論がまだ解けていない）、したがって、疾患として認識されないが、望ましくない状態もしくは症候群としてのみ認識され、多かれ少なかれ特定のセットの症状が臨床医によって同定されている点で異なっていることもある。
「医薬組成物」とは、本発明の化合物の製剤および哺乳動物、例えば、ヒトへの生物学的に活性な化合物のデリバリーのための当技術分野で一般に許容される媒体を指す。このような媒体は、そのためのすべての薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
「有効量」または「治療有効量」とは、哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与されると、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおける処置を達成するのに十分である本発明の化合物の量を指す。「治療有効量」を構成する本発明の組成物の量は、化合物、状態またはその重症度、投与の様式および処置されるべき哺乳動物の年齢に応じて変わるが、自身の知識および本開示を考慮して当業者によって日常的に決定され得る。
ＤＮＡ結合ドメイン
本明細書において記載される方法は、内因性ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＵＢＥ３４またはＵｂｅ３４－ＡＴＳ遺伝子中の標的配列（例えば、９～２０以上の連続または非連続ヌクレオチドの標的部位）と特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物、例えば、遺伝子調節性転写因子を使用する。任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）またはＤＮＡ結合ポリヌクレオチド（例えば、シングルガイドＲＮＡ）は、本明細書において開示される組成物および方法において使用され得る。したがって、ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＵＢＥ３４またはＵｂｅ３４－ＡＴＳ遺伝子の遺伝子リプレッサーが記載されている。
ある特定の実施形態では、本明細書におけるリプレッサーまたはＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。標的部位；ＺＦＰの選択ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計およびコンストラクションのための方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号、同第５，７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＵＢＥ３４およびＵｂｅ３４－ＡＴＳを標的とするＺＦＰは、通常、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むが、複数のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６つ以上のフィンガー）を含み得る。ある特定の実施形態では、ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。ある特定のＺＦＰは、４つ、５つまたは６つのフィンガーを含み、一方で、一部のＺＦＰは、８、９、１０、１１または１２のフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、通常、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４つのフィンガーを含むＺＦＰは、通常、１２～１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、６つのフィンガーを有するＺＦＰは、１８～２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識し得る。ＺＦＰはまた、転写活性化または抑制ドメインであり得る１つまたは複数の調節ドメインを含む融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、一緒に連結された２つのＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを含む。したがって、これらのジンクフィンガータンパク質は、８、９、１０、１１、１２以上のフィンガーを含み得る。いくつかの実施形態では、２つのＤＮＡ結合ドメインは、拡大可能な可動性リンカーを介して連結され、その結果、その１つのＤＮＡ結合ドメインは、４、５または６つのジンクフィンガーを含み、第２のＤＮＡ結合ドメインは、さらに４、５または５つのジンクフィンガーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、標準フィンガー間リンカーであり、その結果、フィンガーアレイは、８、９、１０、１１または１２以上のフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含む。他の実施形態では、リンカーは、可動性リンカーなどの非定型リンカーである。ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つの調節ドメインに融合され、「ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＴＦ」構築物と考えられ得る。これらの実施形態の具体例は、ＫＯＸリプレッサーに融合された、可動性リンカーを用いて連結された２つのＤＮＡ結合ドメインを含む「ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＫＯＸ」および２つのＺＦＰ－ＫＯＸ融合タンパク質が、リンカーを介して一緒に融合されている「ＺＦＰ－ＫＯＸ－ＺＦＰ－ＫＯＸ」と呼ばれ得る。
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログを参照のこと。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位と結合するように遺伝子操作され得る。例えば、Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66;米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照のこと。
「両手型の」ジンクフィンガータンパク質は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの２つのクラスターが、介在アミノ酸によって分けられ、その結果、２つのジンクフィンガードメインが２つの不連続標的部位と結合するタンパク質である。両手型のジンクフィンガー結合タンパク質の一例として、ＳＩＰ１があり、４つのジンクフィンガーのクラスターが、タンパク質のアミノ末端に位置し、３つのフィンガーのクラスターが、カルボキシル末端に位置する［Remacle et al, (1999) EMBO Journal 18 (18): 5073-5084を参照のこと］。これらのタンパク質中のジンクフィンガーの各クラスターは、独特の標的配列と結合可能であり、２つの標的配列間の空間は、多数のヌクレオチドを含み得る。両手型ＺＦＰは、例えば、ＺＦＰの一方または両方に融合された機能的ドメインを含み得る。したがって、機能的ドメインは、一方もしくは両方のＺＦＰの外部に付着され得る、またはＺＦＰの間に位置し得る（両ＺＦＰに付着された）ことは明らかとなる。ある特定の実施形態では、ＺＦＰは、表１に示されるようなＺＦＰを含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは遺伝子操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質は、表１に示されるような標的部位の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続ヌクレオチドとの結合を含む。標的部位と結合するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質のＲＶＤは、天然に存在するまたは天然に存在しないＲＶＤであり得る。米国特許第８，５８６，５２２６号および同第９，４５８，２０５号を参照のこと。
キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多数の疾患を引きおこすとわかっている。キサントモナス属の病原性は、２５種より多い異なるエフェクタータンパク質を植物細胞中に注入する保存されたタイプＩＩＩ分泌（Ｔ３Ｓ）系に応じて変わる。これらの注入されたタンパク質の中に、植物転写アクチベーターを模倣し、植物トランスクリプトームを操作する転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある［Kay et al (2007) Science 318:648-651を参照のこと］。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最も十分に特性決定されたＴＡＬＥの１つに、キサントモナス・カンペストリスｐｖベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）由来のＡｖｒＢｓ３がある［Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136およびＷＯ２０１００７９４３０を参照のこと］。ＴＡＬＥは、タンデムリピートの集中ドメインを含有し、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要であるおよそ３４個のアミノ酸を含有する。さらに、それらは、核局在性配列および酸性転写活性化ドメインを含有する［概説については、Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272を参照のこと］。さらに、植物病原性細菌ラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と名付けられた２つの遺伝子は、Ｒ．ソラナセラム次亜種１株ＧＭＩ１０００において、および次亜種４株ＲＳ１０００においてキサントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリーに対して相同であるとわかった［Heuer et al (2007) ApplおよびEnvir Micro 73(13): 4379-4384を参照のこと］。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメイン中の１，５７５ｂｐの欠失によって異なる。しかし、両遺伝子産物は、キサントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
これらのＴＡＬＥの特異性は、タンデムリピート中に見出される配列に応じて変わる。反復された配列は、およそ１０２ｂｐを含み、リピートは、通常、互いに９１～１００％相同である（Bonas et al、同書）。リピートの多型は、普通、１２および１３位に位置し、１２および１３位の超可変二残基の同一性と、ＴＡＬＥの標的配列中の連続ヌクレオチドの同一性の間に１対１の対応があると思われる［Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501およびBoch et al (2009) Science 326:1509-1512を参照のこと］。実験によって、これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識のコードは、１２および１３位のＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）との結合につながり、ＮＧがＴと結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴと、ＮＮがＡまたはＧと結合し、ＮＧがＴと結合するように決定される。これらのＤＮＡ結合リピートは、新しい配列と相互作用可能である人工転写因子を作製するために、新しい組合せおよびリピート数を有するタンパク質にアセンブルされた。さらに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号および米国特許公開第２０１３０１９６３７３号には、Ｎキャップポリペプチド、Ｃキャップポリペプチドを有するＴＡＬＥ（例えば、＋６３、＋２３１または＋２７８）および／または新規（非定型）ＲＶＤが記載されている。このようなＴＡＬＥは、参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号および同第９，４５８，２０５号に記載されている。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、二量体化および／または多量体化ドメイン、例えば、コイルドコイル（ＣＣ）および二量体化ジンクフィンガー（ＤＺ）を含む。米国特許公開第２０１３０２５３０４０号を参照のこと。
なおさらなる実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、米国特許公開第２０１５００５６７０５号において開示されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のシングルガイドＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡを含む。
真核生物のＲＮＡｉ系に対応すると仮定されていた、古細菌および多数の細菌におけるＲＮＡ媒介性ゲノム防御経路の存在についての説得力のある証拠が最近現れた（概説については、Godde and Bickerton, 2006. J. Mol. Evol. 62:718-729; Lillestol et al., 2006. Archaea 2: 59-72；Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7.;Sorek et al., 2008. Nat. Rev. Microbiol. 6: 181-186を参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または原核生物のＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）として知られる経路は、進化的に２つの、多くは物理的に連結された遺伝子座：系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座に起因すると提唱されている（Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60）。微生物宿主においてＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラム可能な非コーディングＲＮＡエレメントの組合せを含有する。個々のＣａｓタンパク質は、真核生物のＲＮＡｉ機構のタンパク質構成成分と有意な配列類似性を共有しないが、類似の予測される機能（例えば、ＲＮＡ結合、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼなど）を有する（Makarova et al.,2006. Biol. Direct 1: 7）。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲリピートースペーサーアレイと関連することが多い。４０種より多い種々のＣａｓタンパク質ファミリーが記載されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Ｃａｓ１は、種々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のなかで遍在性であると思われる。ｃａｓ遺伝子およびリピート構造の特定の組合せが使用されて、８つのＣＲＩＳＰＲサブタイプ（イーコリ（Ｅｃｏｌｉ）、Ｙｐｅｓｔ、Ｎｍｅｎｉ、Ｄｖｕｌｇ、Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、ＡｐｅｒｎおよびＭｔｕｂｅ）が規定され、そのうち一部は、リピート関連の謎のタンパク質（ＲＡＭＰ）をコードするさらなる遺伝子モジュールと関連している。単一ゲノム中に２つ以上のＣＲＩＳＰＲサブタイプが生じ得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプの弧発性分布は、この系は、微生物進化の際に水平遺伝子導入を受けているということを示唆する。
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）において最初に記載されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最も十分に特性決定された系の１つであり、４つの連続工程で標的化ＤＮＡ二本鎖切断を実施する。第１に、２つの非コーディングＲＮＡ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのリピート領域とハイブリダイズし、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介し、プロセシングはＣａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖特異的ＲＮアーゼＩＩＩによって生じる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーの間のワトソン・クリック塩基対合、標的認識のさらなる必要性によってＣａｓ９を標的ＤＮＡに向ける。さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡもまた、ｃｒＲＮＡとその３’末端で塩基対合し、この会合がＣａｓ９活性の引き金となるので存在しなくてはならない。最後に、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作出する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つの工程：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防ぐための、異質なＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲアレイへの挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現ならびにアレイの発現およびプロセシングとそれに続く（ｉｉｉ）異質な核酸とのＲＮＡ媒介性干渉を含む。したがって、細菌細胞では、いくつかのいわゆる「Ｃａｓ」タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能と関与している。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、多数の異なる細菌において見出されている。Ｆｏｎｆａｒａら［(2013) Nuc Acid Res 42(4):2377-2590］による公的に入手可能なゲノムでのＢＬＡＳＴ検索によって、３４７種の細菌においてＣａｓ９オルソログが見出された。さらに、このグループによって、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、Ｎ．メニンギチデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、Ｐ．マルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）およびＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣａｓ９オルソログを使用してＤＮＡ標的のインビトロＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ 切断が実証された。したがって、用語「Ｃａｓ９」とは、ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのヌクレアーゼドメインを含むＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを指し、Ｃａｓ９をコードする遺伝子は、任意の好適な細菌に由来し得る。
Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有する：１つのヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと類似し、もう一方は、Ｒｕｖエンドヌクレアーゼドメインと似ている。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡと相補的であるＤＮＡ鎖の切断の原因となると思われ、一方でＲｕｖドメインは、非相補鎖を切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインのうち１つのみが機能的であり、Ｃａｓニッカーゼを作出するように遺伝子操作され得る（Jinek et al、同書を参照のこと）。ニッカーゼは、酵素の触媒ドメイン中のアミノ酸の特異的突然変異によって、またはもはや機能的ではないようなドメインの一部もしくはすべての末端切断によって作製され得る。Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメインを含むので、このアプローチは、いずれかのドメインでとられてもよい。二本鎖切断は、２つのこのようなＣａｓ９ニッカーゼの使用によって標的ＤＮＡで達成され得る。ニッカーゼは、各々ＤＮＡの１つの鎖を切断し、２つの使用が、二本鎖切断を作出する。
ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要性は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む遺伝子操作された「シングルガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって避けられ得る［Jinek et al (2012) Science 337:816およびCong et al (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143を参照のこと］。Ｓ．ピオゲネスでは、遺伝子操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物またはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ関連ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間で二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体が形成すると、Ｃａｓ９をガイドして、標的ＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９タンパク質とＰＡＭ配列を含有する遺伝子操作されたｓｇＲＮＡを含むこの系は、ＲＮＡ誘導型ゲノム編集のために使用され（Ramalingam、同書を参照のこと）、インビボでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集にとって有用であり［Hwang et al (2013) Nature Biotechnology 31 (3):227を参照のこと］、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様の編集効率を有していた。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の主産物は、侵入者を標的とする配列を含有する短いＲＮＡであると思われ、経路におけるそれらの仮定される役割に基づいてガイドＲＮＡまたは原核生物のサイレンシングＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ）と呼ばれる（Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1:7;Hale et al., 2008. RNA, 14: 2572-2579）。ＲＮＡ解析は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座転写物が、リピート配列内で切断されて、個々の侵入者を標的とする配列およびそれぞれの両端に位置するリピート断片を含有する約６０～７０ｎｔのＲＮＡ中間体を放出することを示す（Tang et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 7536-7541; Tang et al., 2005. Mol. Microbiol. 55: 469-481; Lillestol et al. 2006. Archaea 2: 59-72; Brouns et al. 2008. Science 321: 960-964; Hale et al, 2008. RNA, 14: 2572-2579）。古細菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）では、これらの中間体ＲＮＡは、大量の安定な約３５～４５ｎｔの成熟ｐｓｉＲＮＡにさらにプロセシングされる（Hale et al. 2008. RNA,14: 2572-2579）。
ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要性は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む遺伝子操作された「シングルガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって避けられ得る［Jinek et al (2012) Science 337:816およびCong et al (2013) Sciencexpress/10.1126/science. 1231143を参照のこと）。Ｓ．ピオゲネスでは、遺伝子操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物またはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ関連ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間で二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体が形成すると、Ｃａｓ９をガイドして、標的ＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９ タンパク質とＰＡＭ配列を含有する遺伝子操作されたｓｇＲＮＡを含むこの系は、ＲＮＡ誘導型ゲノム編集のために使用され（Ramalingam、同書を参照のこと）、インビボでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集にとって有用であり［Hwang et al (2013) Nature Biotechnology 31 (3):227を参照のこと］、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様の編集効率を有していた。
キメラまたはｓｇＲＮＡは、任意の所望の標的と相補的である配列を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、ほぼ約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５もしくはそれより多く、またはそれより多いヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２未満またはそれより少ないヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、疾患関連遺伝子（例えば、ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＵＢＥ３４またはＵｂｅ３４－ＡＴＳ）内の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多い連続ヌクレオチドの標的部位と結合する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、Ｓ．ピオゲネスＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系とともに使用するための、標的に対して相補性の、形態Ｇの［ｎ１９］２２塩基とそれに続く、形態ＮＧＧまたはＮＡＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。したがって、一方法では、ｓｇＲＮＡは、（ｉ）ＺＦＮヘテロ二量体の認識配列を、関連ゲノム（ヒト、マウスまたは特定の植物種のもの）の参照配列とアラインすること、（ｉｉ）ＺＦＮの半部位間のスペーサー領域を同定すること、（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近いモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの位置を同定すること（２つ以上のようなモチーフが、スペーサーと重複する場合には、スペーサーに対して中心にあるモチーフが選択される）、（ｉｖ）そのモチーフをｓｇＲＮＡのコアとして使用することによる、目的の遺伝子における既知ＺＦＮ標的の利用によって設計され得る。この方法は、証明されたヌクレアーゼ標的に頼ることが有利である。あるいは、ｓｇＲＮＡは、簡単に適した標的配列、Ｇ［ｎ２０］ＧＧ式に適合するものを同定することによって、目的の任意の領域を標的とするように設計され得る。ｓｇＲＮＡは、相補性領域とともに、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分のテール領域まで伸長するさらなるヌクレオチドを含み得る［Hsu et al (2013) Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647を参照のこと］。テールは、＋６７～＋８５ヌクレオチドまたはその間の任意の数のものであってよく、好ましい長さは＋８５ヌクレオチドである。末端切断型ｓｇＲＮＡ、「ｔｒｕ－ｇＲＮＡ」もまた使用され得る［Fu et al、(2014) Nature Biotech 32(3):279を参照のこと］。ｔｒｕ－ｇＲＮＡでは、相補性領域は、１７または１８ヌクレオチド長に減少される。
さらに、ＰＡＭ 配列が、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９を使用するＮＧＧの代替物としてのＮＡＧであり得る代替ＰＡＭ配列も利用され得る（Hsu 2014、同書）。さらなるＰＡＭ配列はまた、最初のＧを欠くものを含み得る［Sander and Joung (2014) Nature Biotech 32(4):347］。Ｓ．ピオゲネスによってコードされるＣａｓ９ ＰＡＭ配列に加えて、その他の細菌供給源に由来するＣａｓ９タンパク質に特異的であるその他のＰＡＭ配列が使用され得る。例えば、以下に示されるＰＡＭ配列［Sander and Joung、同書およびEsvelt et al, (2013) Nat Meth 10(11):1116から適応される］は、これらのＣａｓ９タンパク質に対して特異的である：
種 ＰＡＭ
Ｓ．ピオゲネス ＮＧＧ
Ｓ．ピオゲネス ＮＡＧ
Ｓ．ミュータンス ＮＧＧ
Ｓ．サーモフィルス ＮＧＧＮＧ
Ｓ．サーモフィルス ＮＮＡＡＡＷ
Ｓ．サーモフィルス ＮＮＡＧＡＡ
Ｓ．サーモフィルス ＮＮＮＧＡＴＴ
Ｃ．ジェジュニ ＮＮＮＮＡＣＡ
Ｎ．メニンギチデス ＮＮＮＮＧＡＴＴ
Ｐ．マルトシダ ＧＮＮＮＣＮＮＡ
Ｆ．ノビシダ ＮＧ
したがって、Ｓ．ピオゲネスＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と伴に使用するのに好適な標的配列は、以下のガイドラインにしたがって選択され得る：［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９またはｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇ。あるいは、ＰＡＭ配列は、ガイドラインＧ［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、ｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従い得る。Ｓ．ピオゲネスＰＡＭ配列の代わりに代替ＰＡＭが置換される場合、非Ｓ．ピオゲネス細菌に由来するＣａｓ９タンパク質について、同一ガイドラインが使用され得る。
オフターゲット配列の可能性を避ける、特異性の見込みが最も高い標的配列を選択することが最も好ましい。これらの望ましくないオフターゲット配列は、以下の特質を考慮することによって同定され得る：ｉ）利用されているＣａｓ９タンパク質とともに機能するとわかっているＰＡＭ配列が続く標的配列における類似性、ｉｉ）所望の標的配列に由来する３つのミスマッチよりも少ないものを有する同様の標的配列、ｉｉｉ）ミスマッチがすべてＰＡＭ近位領域ではなくＰＡＭ遠位領域中に位置するｉｉ）におけるような同様の標的配列［「シード」領域と呼ばれることもある（Wu et al (2014) Nature Biotech doi:10.1038/nbt2889）、ＰＡＭにすぐに隣接するかまたは近接するヌクレオチド１～５は、認識にとって最も重要であり、そのため、シード領域中に位置するミスマッチを有する推定オフターゲット部位は、ｓｇ ＲＮＡによって認識される可能性が最も低いものであり得るといういくつかの証拠がある］およびｉｖ）ミスマッチが連続して間隔を空けられていない、または４ヌクレオチドよりも大きく離れて間隔を空けられている同様の標的配列（Hsu 2014、同書）。したがって、上記のこれらの基準を使用して、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系が用いられているゲノム中の潜在的なオフターゲット部位の数の解析を実施することによって、ｓｇＲＮＡの好適な標的配列が同定され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系が使用される。フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種において同定されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系は、ヒト細胞における頑強なＤＮＡ干渉を媒介するクラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。機能的に保存されているが、Ｃｐｆ１およびＣａｓ９は、そのガイドＲＮＡおよび基質特異性を含む多数の態様において異なる［Fagerlund et al. (2015) Genom Bio 16:251を参照のこと］。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１タンパク質間の大きな相違は、Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、したがって、ｃｒＲＮＡのみを必要とするということである。ＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、４２～４４ヌクレオチド長（１９ヌクレオチドリピートおよび２３～２５ヌクレオチドスペーサー）であり、単一ステム－ループを含有し、二次構造を保持する配列変化を許容する。さらに、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９によって必要とされる約１００ヌクレオチドの遺伝子操作されたｓｇＲＮＡよりも有意に短く、ＦｎＣｐｆｌのＰＡＭ要件は、置換された鎖で５’－ＴＴＮ－３’および５’－ＣＴＡ－３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１の両方とも、標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断を行うが、Ｃａｓ９は、そのＲｕｖＣ－およびＨＮＨ－様ドメインを使用して、ガイドＲＮＡのシード配列内で平滑末端切断を行うのに対し、Ｃｐｆ１はＲｕｖＣ様ドメインを使用して、シードの外側にねじれ型切断をもたらす。Ｃｐｆ１は、重要なシード領域から離れてねじれ型切断を行うので、ＮＨＥＪは、標的部位を撹乱せず、したがって、Ｃｐｆ１が、所望のＨＤＲ組換え事象が起きるまで同一部位で切断し続けることができることが確実となる。したがって、本明細書において記載される方法および組成物では、用語「Ｃａｓ」は、Ｃａｓ９およびＣｆｐ１タンパク質の両方を含むことは理解される。したがって、本明細書において使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１系の両方を指し、ヌクレアーゼ、ニッカーゼおよび／または転写因子系の両方を含む。
いくつかの実施形態では、その他のＣａｓタンパク質が使用され得る。いくつかの例示的Ｃａｓタンパク質として、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても知られる）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａとしても知られる）、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、ＣａｓＸおよびＣａｓＹが挙げられ、その遺伝子操作されたおよび天然変異体［Burstein et al. (2017) Nature 542:237-241］、例えば、ＨＦ１／ｓｐＣａｓ９［Kleinstiver et al. (2016) Nature 529:490-495; Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm Genome 28(7):247-261］、スプリットＣａｓ９系［Zetsche et al. (2015) Nat Biotechnol 33(2):139-142］、インテイン－エクステイン系に基づくトランススプライシングＣａｓ９［Troung et al. (2015) Nucl Acid Res 43(13):6450-8］、ミニＳａＣａｓ９［Ma et al. (2018) ACS Synth Biol 7(4):978-985］が挙げられる。したがって、本明細書において記載される方法および組成物では、用語「Ｃａｓ」は、天然および遺伝子操作されたもの両方のすべてのＣａｓ変異体タンパク質を含むことは理解される。したがって、本明細書において使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」とは、任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を指し、ヌクレアーゼ、ニッカーゼおよび／または転写因子系の両方を含む。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」として、それだけには限らないが、それらが、対応する天然配列ポリペプチドと共通する生物活性を有する限り、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が挙げられる。本明細書において考慮される生物活性は、機能的誘導体の、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、その共有結合修飾および融合物の両方を包含する。いくつかの態様では、機能的誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の単一の生物学的特性を含み得る。他の態様では、機能誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の生物学的特性のサブセットを含み得る。Ｃａｓポリペプチドの好適な誘導体またはその断片は、それだけには限らないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合物、共有結合修飾を含む。Ｃａｓタンパク質またはその断片ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体を含むＣａｓタンパク質は、細胞から、または合成化学的に、またはこれら２つの手順の組合せによって得られる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であり得る、またはＣａｓタンパク質を天然に産生する細胞は、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、もしくは外因性に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作され、核酸は、内因性Ｃａｓと同一もしくは異なるＣａｓをコードする。いくつかの場合には、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
特定の遺伝子（セーフハーバー遺伝子を含む）を標的とする例示的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、例えば、米国特許公開第２０１５００５６７０５号に開示されている。
したがって、本明細書において記載される遺伝子モジュレーター（人工転写因子、ヌクレアーゼなど）は、任意の遺伝子中の標的部位と特異的に結合するＤＮＡ結合分子を含み、任意のＤＮＡ結合分子が使用され得る。
遺伝子モジュレーター
ＤＮＡ結合ドメインは、本明細書において記載される方法において使用するために、任意のさらなる分子（例えば、ポリペプチド）に融合され得る、そうでなければそれと会合する。ある特定の実施形態では、方法は、少なくとも１つのＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはシングルガイドＲＮＡ）および異種調節（機能的）ドメイン（またはその機能的断片）、例えば、希少疾患関連遺伝子中の標的部位と結合するＤＮＡ結合ドメインおよび転写調節ドメインを含む人工転写因子（アクチベーターまたはリプレッサー）を含む融合分子を用いる。
ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターの機能的ドメインは、転写調節ドメインを含む。一般的なドメインは、例えば、転写因子ドメイン（アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、発癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）、ＤＮＡ修復酵素およびその関連因子およびモディファイヤー、ＤＮＡ再配列酵素およびその関連因子およびモディファイヤー、クロマチン関連タンパク質およびそのモディファイヤー（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）およびＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）およびその関連因子およびモディファイヤーを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１３０２５３０４０号を参照のこと。
活性化を達成するために好適なドメインとして、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン［例えば、Hagmann et al.,J. Virol. 71,5952-5962 (1997)を参照のこと］核ホルモン受容体［例えば、Torchia et al.,Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383(1998)を参照のこと］、核因子カッパＢのｐ６５サブユニット［Bitko & Barik,J. Virol.72:5610-5618(1998)およびDoyle & Hunt,Neuroreport 8:2937-2942(1997)を参照のこと］；Liu et al.,Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)］またはＶＰ６４などの人工キメラ機能的ドメイン［Beerli et al.,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33］およびデグロン［Molinari et al.,(1999) EMBO J. 18、6439-6447］が挙げられる。さらなる例示的活性化ドメインとして、Ｏｃｔ １、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ－２およびＣＴＦ１［Seipel et al.,EMBO J. 11,4961-4968 (1992)ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ－２が挙げられる。例えば、Robyr et al. (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood et al. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275; Leo et al. (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna et al. (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik et al. (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; およびLemon et al. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504を参照のこと。さらなる例示的活性化ドメインとして、それだけには限らないが、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、－６、－７および－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰならびにＴＲＡＢ１が挙げられる。例えば、Ogawa et al. (2000) Gene 245:21-29; Okanami et al. (1996) Genes Cells 1:87-99; Goff et al. (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmason et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels et al. (2000) Plant J. 22:1-8; Gong et al. (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; およびHobo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353を参照のこと。
遺伝子リプレッサーを作製するために使用され得る例示的抑制ドメインとして、それだけには限らないが、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴ ファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、ＲｂおよびＭｅＣＰ２が挙げられる。例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450;およびRobertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照のこと。さらなる例示的抑制ドメインとして、それだけには限らないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; およびWu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照のこと。
いくつかの例では、ドメインは、染色体のエピジェネティック調節に関与する。いくつかの実施形態では、ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、例えば、Ａ型、核局在型、例えば、ＭＹＳＴファミリーメンバーＭＯＺ、Ｙｂｆ２／Ｓａｓ３、ＭＯＦおよびＴｉｐ６０、ＧＮＡＴファミリーメンバーＧｃｎ５またはｐＣＡＦ、ｐ３００ファミリーメンバーＣＢＰ、ｐ３００またはＲｔｔ１０９［Berndsen and Denu (2008) Curr Opin Struct Biol 18(6):682-689］である。他の例では、ドメインは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、例えば、クラスＩ（ＨＤＡＣ－１、２、３および８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣ ＩＩＡ（ＨＤＡＣ－４、５、７および９）、ＨＤＡＣ ＩＩＢ（ＨＤＡＣ ６および１０）］、クラスＩＶ（ＨＤＡＣ－１１）、クラスＩＩＩ［サーチュイン（ＳＩＲＴ）としても知られる；ＳＩＲＴ１－７］［Mottamal et al (2015) Molecules 20(3):3898-3941を参照のこと］である。いくつかの実施形態において使用される別のドメインは、ヒストンホスホリラーゼまたはキナーゼであり、例として、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＤＮＡ－ＰＫ、Ｂｕｂ１、ＶｐｒＢＰ、ＩＫＫ－α、ＰＫＣβ１、Ｄｉｋ／Ｚｉｐ、ＪＡＫ２、ＰＫＣ５、ＷＳＴＦおよびＣＫ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、メチル化ドメインが使用され、Ｅｚｈ２、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲＭＴ２／６、ＣＡＲＭ１、ｓｅｔ７／９、ＭＬＬ、ＡＬＬ－１、Ｓｕｖ ３９ｈ、Ｇ９ａ、ＳＥＴＤＢ１、Ｅｚｈ２、Ｓｅｔ２、Ｄｏｔ１、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲ－Ｓｅｔ７およびＳｕｖ４－２０ｈなどの群から選択され得る。いくつかの実施形態では、ＳＵＭＯ化およびビオチン化に関与するドメイン（Ｌｙｓ９、１３、４、１８および１２）もまた、使用され得る［概説Kousarides (2007) Cell 128:693-705を参照のこと］。
したがって、本明細書において記載されるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡなど）と会合される異種調節（機能的）ドメイン（またはその機能的断片）として、それだけには限らないが、例えば、転写因子ドメイン（アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、発癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）、ＤＮＡ修復酵素およびその関連因子およびモディファイヤー、ＤＮＡ再配列酵素およびその関連因子およびモディファイヤー、クロマチン関連タンパク質およびそのモディファイヤー（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）およびＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、デユニキチナーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）およびその関連因子およびモディファイヤーが挙げられる。このような融合分子として、本明細書において記載されるＤＮＡ結合ドメインおよび転写調節ドメインを含む転写因子ならびにＤＮＡ結合ドメインおよび１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを含むヌクレアーゼが挙げられる。
融合分子は、当業者に周知であるクローニングおよび生化学的コンジュゲーションの方法によってコンストラクトされる。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子はまた、核局在性シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原に由来するものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび血球凝集素など）を含んでもよい。融合タンパク質（およびそれをコードする核酸）は、転写リーディングフレームが融合物の構成成分の中で保存されるように設計される。
一方では、機能的ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド構成成分と、もう一方では非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、介入物、副溝結合剤、核酸）の間の融合物は、当業者に公知の生化学的コンジュゲーションの方法によってコンストラクトされる。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（イリノイ州、ロックフォード）カタログを参照のこと。副溝結合剤とポリペプチドとの間の融合物を作製するための方法および組成物が記載されている。Mapp et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935。同様に、ｓｇＲＮＡ核酸成分をポリペプチド構成成分機能ドメインと関連して含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦおよびヌクレアーゼも当業者に公知であり、本明細書において記載される。
融合分子は、当業者に公知であるように、薬学的に許容される担体とともに製剤化され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,1985;および共同所有されるＷＯ００／４２２１９を参照のこと。
融合分子の機能的成分／ドメインは、ひとたび融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列と結合すると、遺伝子の転写に影響を及ぼすことが可能な種々の異なる構成成分のいずれかから選択され得る。したがって、機能的構成成分として、それだけには限らないが、種々の転写因子ドメイン、例えば、アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサーおよびサイレンサーを挙げることができる。
ある特定の実施形態では、融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含んで、その遺伝子操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図される核酸標的を認識可能な機能的実体を作製し、ＤＮＡをヌクレアーゼ活性によってＤＮＡ結合部位の近くで切断されるようにするヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ）を作製する。この切断は、標的とされる遺伝子の不活性化（抑制）をもたらす。したがって、遺伝子リプレッサーはまた、標的とされるヌクレアーゼも含む。
ＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメインとの間の融合タンパク質（またはそれをコードする核酸）の形成において、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかは、機能的ドメインとして好適であるということは当業者には明らかであろう。活性化複合体および／または活性化活性（例えば、ヒストンアセチル化など）を標的遺伝子に動員可能な本質的に任意の分子が、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。融合分子において機能的ドメインとして使用するのに適している、インスレータードメイン、局在性ドメインおよびクロマチンリモデリングタンパク質、例えば、ＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質が、例えば、米国特許第７，０５３，２６４号に記載されている。
したがって、本明細書において記載される方法および組成物は、広く適用可能であり、目的の任意の人工ヌクレアーゼまたは転写因子を含み得る。ヌクレアーゼの非限定的な例として、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、異種切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含んでもよく、あるいは、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位と結合するように変更されてもよい（例えば、同族結合部位とは異なる部位と結合するように遺伝子操作されているメガヌクレアーゼ）。人工転写因子の非限定的な例として、ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦが挙げられる。
ヌクレアーゼドメインは、任意のヌクレアーゼ、例えば、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼに由来し得る。本明細書において記載されるような標的ＤＮＡ結合ドメインに融合され得る好適なヌクレアーゼ（切断）ドメインの非限定的な例として、任意の制限酵素、例えば、ＩＩＳ型制限酵素（例えば、ＦｏｋＩ）に由来するドメインが挙げられる。ある特定の実施形態では、切断ドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする切断半ドメインである。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号、同第８，４０９，８６１号および同第７，８８８，１２１号を参照のこと。一般に、融合タンパク質が切断半ドメインを含む場合には、切断には２つの融合タンパク質が必要である。あるいは、２つの切断半ドメインを含む単一タンパク質が使用され得る。２つの切断半ドメインは、同一エンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよく、または各切断半ドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよい。さらに、２つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、互いに関して、例えば、二量体化することによって２つの融合タンパク質のそのそれぞれの標的部位との結合が、切断半ドメインを互いに、切断半ドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にする空間的配向に位置付けるように配置される。
ヌクレアーゼドメインはまた、切断活性を有する任意のメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ドメインに由来してもよく、それだけには限らないが、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩを含む、本明細書において記載されるヌクレアーゼとともに使用されてもよい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、緻密なＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインと連結する一本鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、メガヌクレアーゼ（例えば、ＴｅｖＩ）ヌクレアーゼドメインに関してＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが位置付けられる場所に依存して、ＴＡＬＥ領域に位置するニッカーゼとして作用し得るか、または二本鎖切断を作出し得る［Beurdeley et al (2013) Nat Comm: 1-8 DOI: 10.1038/ncomms2782を参照のこと］。任意のＴＡＬＥＮは、さらなるＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のメガ－ＴＡＬを有する１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ－ＴＡＬＥＮ））またはその他のＤＮＡ切断酵素と組み合わせて使用され得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）または切断活性を示すその一部を含む。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５～４０塩基対の切断部位を認識し、一般に、４つのファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリー。例示的ホーミングエンドヌクレアーゼとして、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。その認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号、同第６，８３３，２５２号；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22、1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログを参照のこと。
他の実施形態では、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、モノマーとして活性であり、活性のために二量体化を必要としない［Boissel et al.,(2013) Nucl Acid Res: 1-13、doi: 10.1093/nar/gkt1224を参照のこと］。
さらに、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインはまた、ＤＮＡ結合機能性を示し得る。任意のＴＡＬＥＮが、さらなるＴＡＬＥＮ（例えば、１つもしくは複数のメガ－ＴＡＬを有する１つもしくは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ－ＴＡＬＥＮ）および／またはＺＦＮと組み合わせて使用され得る。
さらに、切断ドメインは、例えば、オフターゲット切断効果を低減または排除する絶対ヘテロ二量体の形成について、野生型と比較して１つまたは複数の変更を含み得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号を参照のこと。
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的ＩＩＳ型制限酵素として、ＦｏｋＩがある。この特定の酵素は、二量体として活性である。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575。したがって、本開示の目的上、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断半ドメインと考慮される。したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用する細胞性配列の標的化二本鎖切断および／または標的化置換のために、各々ＦｏｋＩ切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質が、触媒的に活性な切断ドメインを再構築するために使用され得る。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断半ドメインを含有する単一ポリペプチド分子も使用され得る。ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用する標的化切断および標的化配列変更のパラメーターは、本開示中別の場所で提供される。
切断ドメインまたは切断半ドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して、機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
例示的ＩＩＳ型制限酵素は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開公報ＷＯ０７／０１４２７５に記載されている。さらなる制限酵素はまた、分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらは、本開示によって考慮される。例えば、Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420を参照のこと。
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、すべて開示内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号および米国特許公開第２０１１０２０１０５５号に記載されるように、ホモ二量体化を最小化するかまたは防ぐ、１つまたは複数の遺伝子操作された切断半ドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基はすべて、Ｆｏｋ Ｉ切断半ドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。
絶対ヘテロ二量体を形成するＦｏｋ Ｉの例示的な遺伝子操作された切断半ドメインは、第１の切断半ドメインが、Ｆｏｋ Ｉの４９０および５３８位のアミノ酸残基に突然変異を含み、第２の切断半ドメインが、アミノ酸残基４８６および４９９に突然変異を含む対を含む。
したがって、一実施形態では、４９０の突然変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）と置き換え、５３８の突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）と置き換え、４８６の突然変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）と置き換え、４９９位の突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）と置き換える。具体的には、本明細書において記載される遺伝子操作された切断半ドメインは、１つの切断半ドメイン中で４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）に突然変異することによって調製され、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる遺伝子操作された切断半ドメインを製造し、別の切断半ドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）に突然変異することによって、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる遺伝子操作された切断半ドメインを製造した。本明細書において記載される遺伝子操作された切断半ドメインは、異常な切断が最小にされるかまたは消失される絶対ヘテロ二量体突然変異体である。例えば、すべての目的のために参照によりその開示内容がその全体で本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号を参照のこと。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された切断半ドメインは、４８６および４９９および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされた）に突然変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基と、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基と、４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基と置き換える突然変異を含む（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）。他の実施形態では、遺伝子操作された切断半ドメインは、４９０、５３８および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされた）に突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基と、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基と、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基と置き換える突然変異を含む（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）。他の実施形態では、遺伝子操作された切断半ドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされた）に突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基と、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基と置き換える突然変異を含む（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）。例えば、すべての目的のために参照によりその開示内容がその全体で本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号を参照のこと。他の実施形態では、遺伝子操作された切断半ドメインは、シャーキー（Ｓｈａｒｋｅｙ）」および／または「シャーキー」突然変異を含む［Guo et al,(2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107を参照のこと］。
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット－酵素」技術を使用して核酸標的部位でインビボでアセンブルされ得る（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照のこと）。このようなスプリット酵素の構成成分は、別個の発現コンストラクトで発現され得るかまたは例えば、自己切断性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって個々の構成成分が分けられている１つのオープンリーディングフレーム中に連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されるような酵母ベースの染色体系において使用に先立って活性についてスクリーニングされてもよい。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主においてＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラム可能な非コーディングＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最も十分に特性決定された系の１つであり、４つの連続工程で標的化ＤＮＡ二本鎖切断を実施する。第１に、２つの非コーディングＲＮＡ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのリピート領域とハイブリダイズし、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン・クリック塩基対合、標的認識のさらなる必要性によってＣａｓ９を標的ＤＮＡに向ける。最後に、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作出する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つの工程：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防ぐための、異質なＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲアレイへの挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現ならびにアレイの発現およびプロセシングとそれに続く（ｉｉｉ）異質な核酸とのＲＮＡ媒介性干渉を含む。したがって、細菌細胞では、いくつかのいわゆる「Ｃａｓ」タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能と関与しており、異質なＤＮＡなどの挿入といった機能において役割を果たす。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」として、それだけには限らないが、それらが、対応する天然配列ポリペプチドと共通する生物活性を有する限り、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が挙げられる。本明細書において考慮される生物活性は、機能的誘導体の、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、その共有結合修飾および融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドの好適な誘導体またはその断片は、それだけには限らないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合物、共有結合修飾を含む。Ｃａｓタンパク質またはその断片ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体を含むＣａｓタンパク質は、細胞から、または合成化学的に、またはこれら２つの手順の組合せによって得られる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であり得る、またはＣａｓタンパク質を天然に産生する細胞は、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、もしくは外因性に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作され、核酸は、内因性Ｃａｓと同一もしくは異なるＣａｓをコードする。いくつかの場合には、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
例示的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、例えば、米国特許公開第２０１５００５６７０５号に開示されている。
ヌクレアーゼは、標的部位において１つまたは複数の二本鎖および／または一本鎖切断を行うことができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒的に不活性の切断ドメインを含む（例えば、ＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）。例えば、米国特許第９，２００，２６６号、同第８，７０３，４８９号およびGuillinger et al. (2014) Nature Biotech. 32(6):577-582を参照のこと。触媒的に不活性の切断ドメインは、触媒的に活性のドメインと組み合わせて、ニッカーゼとして作用して、一本鎖切断を行うことができる。したがって、２つのニッカーゼを組み合わせて使用して、特定の領域において二本鎖切断を行うことができる。さらなるニッカーゼもまた、当技術分野で公知である、例えば、McCaffrey et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi: 10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19。
本明細書において記載されるようなヌクレアーゼは、二本鎖標的（例えば、遺伝子）中に二本鎖または一本鎖切断を生成できる。一本鎖切断（「ニック」）の生成は、例えば、ヌクレアーゼドメインのうちの１つの触媒ドメインの突然変異がニッカーゼをもたらす方法を記載する、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７０３，４８９号および同第９，２００，２６６号に記載されている。
したがって、ヌクレアーゼ（切断）ドメインまたは切断半ドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して、機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット－酵素」技術を使用して核酸標的部位でインビボでアセンブルされ得る（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照のこと）。このようなスプリット酵素の構成成分は、別個の発現コンストラクトで発現され得るかまたは例えば、自己切断性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって個々の構成成分が分けられている１つのオープンリーディングフレーム中に連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
ヌクレアーゼは、例えば、米国特許公開第２００９０１１１１１９号に記載されるような酵母ベースの染色体系において使用に先立って活性についてスクリーニングされてもよい。ヌクレアーゼ発現コンストラクトは、当技術分野で公知の方法を使用して容易に設計され得る。
融合タンパク質（またはその構成成分）の発現は、構成プロモーターまたは誘導プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化され（抑制解除され）、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。好ましいプロモーターの非限定的な例として、神経特異的プロモーターＮＳＥ、シナプシン、ＣＡＭＫｉｉａおよびＭＥＣＰが挙げられる。遍在性（ｕｂｉｑｕｉｔｉｏｕｓ）プロモーターの非限定的な例として、ＣＡＳおよびＵｂｃが挙げられる。さらなる実施形態として、米国特許公開第２０１５０２６７２０５号）に記載されるような自己調節性プロモーター（標的ＤＮＡ結合ドメインに対する高親和性結合部位を含めることによる）の使用が挙げられる。
デリバリー
本明細書において記載される転写因子、ヌクレアーゼおよび／またはポリヌクレオチド（例えば、遺伝子モジュレーター）ならびにタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、タンパク質の注射によって、ｍＲＮＡを介して、および／または発現コンストラクト（例えば、プラスミド、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、Ａｄベクターなど）を使用して、を含む任意の好適な手段によって標的細胞にデリバリーされ得る。好ましい実施形態では、遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）は、それだけには限らないが、米国特許第９，５８５，９７１号に記載されるようなＡＡＶ９ベクター［またはその偽型（ｐｓｅｕｏｔｙｐｅｄ）ベクター］（米国特許７，１９８，９５１を参照のこと）またはＡＡＶベクターを含む、ＡＡＶベクターを使用してデリバリーされる。
本明細書において記載されるようなジンクフィンガータンパク質を含むタンパク質をデリバリーする方法は、例えば、開示内容がすべて参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号に記載されている。
それだけには限らないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含む任意のベクター系が使用され得る。また、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号も参照のこと。さらに、これらのベクターのいずれも、１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質をコードする配列を含み得るということは理解されよう。したがって、１つまたは複数のモジュレーター（例えば、リプレッサー）が細胞中に導入される場合、タンパク質構成成分および／またはポリヌクレオチド構成成分をコードする配列は、同一ベクターまたは異なるベクター上で運ばれ得る。複数のベクターが使用される場合には、各ベクターは、１つまたは複数の遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）またはその構成成分をコードする配列を含み得る。
遺伝子操作された遺伝子モジュレーターをコードする核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入するために、従来のウイルス性および非ウイルス性ベースの遺伝子導入法が使用され得る。このような方法はまた、このようなリプレッサー（またはその構成成分）をコードする核酸を細胞にインビトロで投与するためにも使用され得る。ある特定の実施形態では、リプレッサーをコードする核酸は、インビボまたはエキソビボ遺伝子療法使用のために投与される。非ウイルスベクターデリバリー系として、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸およびリポソームまたはポロキサマーなどのデリバリー媒体と複合体形成された核酸が挙げられる。ウイルスベクターデリバリー系として、エピソームゲノムまたは細胞へのデリバリー後に組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の概説については、Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm (eds.) (1995); およびYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照のこと。
核酸の非ウイルス性デリバリーの方法として、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、人工ビリオンおよびＤＮＡの薬剤増強型取込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションはまた、核酸のデリバリーのために使用され得る。好ましい実施形態では、１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとしてデリバリーされる。また、翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増大するためにキャップされたｍＲＮＡの使用が好ましい。ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップ類似体）キャップまたはその変異体が特に好ましい。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許ＵＳ７０７４５９６およびＵＳ８１５３７７３を参照のこと。
さらなる例示的核酸デリバリー系として、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ドイツ、ケルン）、Ｍａｘｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．（メリーランド州、ロックビル）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（マサチューセッツ州、ホリストン）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ（例えば、ＵＳ６００８３３６を参照のこと）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号および同第４，８９７，３５５号）に記載され、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質として、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。デリバリーは細胞へ（エキソビボ投与）または標的組織へ（インビボ投与）であり得る。
免疫脂質複合体などの標的とされるリポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である［例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992);米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号および同第４，９４６，７８７号を参照のこと］。
さらなるデリバリー方法として、デリバリーされるべき核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣデリバリー媒体（ＥＤＶ）にパッケージングすることの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対して特異性を有し、もう一方が、ＥＤＶに対して特異性を有する二重特異性抗体を使用して標的組織に具体的にデリバリーされる。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いで、エンドサイトーシスによってＥＤＶが細胞中に取り込まれる。ひとたび細胞中となると、内容物が放出される［MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643を参照のこと］。
遺伝子操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸のデリバリーのためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを身体中に特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核へ輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは患者に直接投与されてもよく（インビボ）、またはそれらは、インビトロで細胞を処置するために使用されてもよく、修飾された細胞は患者に投与される（エキソビボ）。ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のデリバリーのための従来のウイルスベースの系としては、それだけには限らないが、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノムへの組込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法を用いた場合に可能性があり、挿入された挿入遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、多数の異なる細胞型および標的組織において高い形質導入効率が観察されている。
レトロウイルスの指向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって変更され得、可能性ある標的細胞の標的集団を拡大する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入し、感染可能であり、通常、高ウイルス力価をもたらすレトロウイルスベクターである。レトロウイルス性遺伝子導入系の選択は、標的組織次第である。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列に対するパッケージング能を有するｃｉｓ作用性の長い末端反復配列からなる。ベクターの複製およびパッケージングのためには、最小のｃｉｓ作用性ＬＴＲで十分であり、次いで、これを使用して、治療用遺伝子を標的細胞中に組み込み、恒久的な導入遺伝子発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとして、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするものおよびそれらの組合せが挙げられる［例えば、Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991);ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと］。
一過性発現が好ましい適用では、アデノウイルスベースの系が使用され得る。アデノウイルスベースのベクターは、多数の細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いた場合、高力価および高レベルの発現が得られてきた。このベクターは、比較的簡単な系で多量に製造され得る。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、インビボおよびエキソビボ遺伝子療法手順のための核酸およびペプチドのインビトロ製造において標的核酸を用いて細胞に形質導入するために使用される［例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987);米国特許第４，７９７，３６８号; ＷＯ９３／２４６４１; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照のこと。組換えＡＡＶベクターのコンストラクションは、米国特許第５，１７３，４１４号;Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984);およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含むいくつかの刊行物に記載されている。
臨床治験において遺伝子導入のために、少なくとも６種のウイルスベクターアプローチが現在利用可能であり、これらは、形質導入物質を作製するためのヘルパー細胞株に挿入される遺伝子による欠陥ベクターの補完を含むアプローチを利用する。
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床治験において使用されてきたレトロウイルスベクターの例である［Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)］。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法治験において使用された最初の治療用ベクターであった［Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)］。ＭＦＧ－Ｓパッケージングされたベクターについて５０％以上の形質導入効率が観察された［Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997)。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥のある、非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスをベースとする有望な代替遺伝子デリバリー系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットの両端に位置するＡＡＶ１４５ｂｐ逆方向末端反復配列のみを保持するプラスミドに由来する。効率的な遺伝子導入および形質導入された細胞のゲノムへの組込みによる安定な導入遺伝子デリバリーは、このベクター系の重大な特徴である［Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)］。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶ ｒｈ１０ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などの偽型ＡＡＶを含むその他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用され得る。血液脳関門を通過可能なＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用され得る（例えば、米国特許第９，５８５，９７１号を参照のこと）。好ましい実施形態では、ＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９の変異体および偽型を含む）が使用される。
複製欠陥組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で製造されることができ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染する。ほとんどのアデノウイルスベクターが、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子と置き換わるように遺伝子操作され、続いて、複製欠損ベクターは、欠失された遺伝子機能をｔｒａｎｓで供給するヒト２９３細胞中で増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉中に見出されるものなどの非分裂細胞、分化細胞を含む複数の種類の組織にインビボで形質導入できる。従来のＡｄベクターは、大きな保持能を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用の一例は、筋肉内注射を用いる抗腫瘍免疫処置のためのポリヌクレオチド療法を含んでいた［Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)］。臨床治験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例として、Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)が挙げられる。
パッケージング細胞が使用されて、宿主細胞に感染可能であるウイルス粒子を形成する。このような細胞として、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスベクターをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、普通、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞株によって作製される。ベクターは、通常、パッケージングおよびその後の宿主への組込み（適当な場合）に必要な最小のウイルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、発現されるべきタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。失われているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってｔｒａｎｓで供給される。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、通常、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに必要である、ＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、その他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含有するが、ＩＴＲ配列を欠く細胞株にパッケージングされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染させる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くために有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスでの汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処置によって低減され得る。
２９３またはバキュロウイルス系からのＡＡＶ粒子の精製は、通常、ウイルスを製造する細胞の成長と、それに続く細胞上清からのウイルス粒子の回収または細胞の溶解および粗溶解物からのウイルスの回収を含む。次いで、ＡＡＶは、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、米国特許第７，４１９，８１７号および同第６，９８９，２６４号を参照のこと）、イオン交換クロマトグラフィーおよびＣｓＣｌ密度遠心分離（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１０９４１９８Ａ１０）、イムノアフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＷＯ２０１６１２８４０８）またはＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する精製を含む当技術分野で公知の方法によって精製される。
多数の遺伝子療法適用では、遺伝子療法ベクターが高度の特異性で特定の組織型へデリバリーされることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、リガンドを、ウイルスの外表面上にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質として発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように修飾され得る。リガンドは、目的の細胞型上に存在するとわかっている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Han et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)では、モロニーマウス白血病ウイルスは、ｇｐ７０と融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾されることができ、組換えウイルスは、ヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染すると報告された。この原理は、標的細胞が、受容体を発現し、ウイルスが、細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、その他のウイルス標的細胞対に拡大され得る。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞性受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように遺伝子操作され得る。上記の説明は、ウイルスベクターに主に当てはまるが、同じ原理が非ウイルスベクターに当てはまり得る。このようなベクターは、特定の標的細胞による取込みを好む、特定の取込み配列を含有するように遺伝子操作され得る。
遺伝子療法ベクターは、通常、以下に記載されるような、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または脳中への直接注射を含む頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によってインビボでデリバリーされ得る。あるいは、ベクターは、エキソビボで細胞、例えば、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検）またはユニバーサルドナー造血幹細胞へデリバリーされ得、続いて、普通、ベクターを組み込んだ細胞についての選択後に細胞が患者に再移植される。
ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるような組成物（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）は、インビボで直接デリバリーされる。組成物（細胞、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）は、中枢神経系（ＣＮＳ）中に直接投与されてもよく、脳または脊髄への直接注射を含むがそれだけには限らない。それだけには限らないが、海馬、黒質、マイネルト基底核（ＮＢＭ）、線条体および／または皮質を含む脳の１つまたは複数の領域が標的とされ得る。あるいは、またはＣＮＳデリバリーに加えて、組成物は全身投与されてもよい（例えば、静脈内、腹腔内、心臓内、筋肉内、くも膜下腔内、皮下および／または頭蓋内注入）。対象への本明細書において記載されるような組成物の直接的なデリバリー（直接ＣＮＳへを含む）のための方法および組成物として、それだけには限らないが、ニードル組立体による直接注射（例えば、定位的注射）が挙げられる。このような方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、組成物（発現ベクターを含む）の脳へのデリバリーに関する米国特許第７，８３７，６６８号、同第８，０９２，４２９号および米国特許公開第２００６０２３９９６６号に記載されている。
投与されるべき有効量は、患者毎に、ならびに投与様式および投与部位に従って変わる。したがって、有効量は、組成物を投与する医師によって最良に決定され、適切な投与量は、当業者によって容易に決定され得る。組込みおよび発現にとって十分な時間（例えば、通常、４～１５日）を可能にした後に、治療用ポリペプチドの血清またはその他の組織レベルの解析および投与の前の初期レベルとの比較によって、投与される量が低すぎる、正しい範囲内、高すぎるか否かが決定される。初期およびその後の投与のための好適な投与計画（ｒｅｇｉｍｅｓ）も可変であるが、初期投与と、必要な場合には、それに続くその後の投与が典型的である。その後の投与は、毎日から毎年、数年毎の範囲の可変間隔で投与され得る。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、ヒト脳に直接本明細書において記載される組成物をデリバリーするために、線条体あたり１×１０１０～５×１０１５（またはその間の任意の値）ベクターゲノムの用量範囲が適用され得る。記載したように、その他の脳構造のために、また異なるデリバリープロトコールのために投与量は変わり得る。直接脳へＡＡＶベクターをデリバリーする方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第９，０８９，６６７号、同第９，０５０，２９９号、同第８，３３７，４５８号、同第８，３０９，３５５号、同第７，１８２，９４４号、同第６，９５３，５７５号および同第６，３０９，６３４号を参照のこと。
診断学、研究のため、または遺伝子療法（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入による）のためのエキソビボ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい実施形態では、細胞が、少なくとも１つの遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）またはその構成成分を用いてトランスフェクトされた対象生物から単離され、対象生物（例えば、患者）に再注入して戻される。好ましい実施形態では、遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）の１つまたは複数の核酸が、ＡＡＶ９を使用してデリバリーされる。他の実施形態では、遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）の１つまたは複数の核酸が、ｍＲＮＡとしてデリバリーされる。また、転写効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増大するためにキャップされたｍＲＮＡの使用が好ましい。ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップ類似体）キャップまたはその変異体が特に好ましい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号。エキソビボトランスフェクションに好適な種々の細胞型は、当業者に周知である［例えば、Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)］および患者由来の細胞を単離および培養する方法の考察のためにそこで引用される参考文献を参照のこと）。
一実施形態では、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのエキソビボ手順において幹細胞が使用される。幹細胞を使用する利点は、それらがインビトロでその他の細胞型に分化され得る、または哺乳動物（細胞のドナーなど）に導入されて、そこで骨髄に生着し得るという点である。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインを使用してＣＤ３４＋細胞をインビトロで臨床上重要な免疫細胞型に分化させる方法は公知である［Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)を参照のこと］。
幹細胞は、既知方法を使用して形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、骨髄細胞を望ましくない細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（汎Ｂ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）と結合する抗体を用いてパニングすることによって骨髄細胞から単離される［Inaba et al.,J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)を参照のこと］。
いくつかの実施形態では、修飾されている幹細胞も使用され得る。例えば、アポトーシスに対して耐性にされているニューロン幹細胞が、幹細胞がまた本発明のＺＦＰ ＴＦも含有する治療用組成物として使用され得る。アポトーシスに対する耐性は、例えば、幹細胞においてＢＡＸ－もしくはＢＡＫ－特異的ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮを使用してＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすることによって、あるいは例えば、カスパーゼにおいて撹乱されているものにおいて、やはりカスパーゼ－６特異的ＺＦＮを使用して生じ得る（米国特許第８，５９７，９１２号を参照のこと）。これらの細胞は、標的遺伝子を調節するとわかっているＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦを用いてトランスフェクトされ得る。
治療用ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）も、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。あるいは、裸のＤＮＡが投与されてもよい。投与は、分子を血液または組織細胞との最終接触に導入するために通常使用される経路のいずれかによってであり、それだけには限らないが、注射、注入、局所適用およびエレクトロポレーションを含む。このような核酸を投与する好適な方法は利用可能であり、当業者には周知であるが、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用されてもよく、特定の経路が別の経路よりもより即時の、より有効な反応を提供することが多い場合がある。
ＤＮＡを造血幹細胞中に導入する方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。導入遺伝子を造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞へ導入するために有用なベクターとして、アデノウイルス３５型が挙げられる。
導入遺伝子を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入するのに好適なベクターとして、非組込み性レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222を参照のこと。
薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって幾分か決定される。したがって、以下に記載されるような広範な好適に利用可能な医薬組成物の製剤がある（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences，17th ed.,1989を参照のこと）。
上記で記載したように、開示された方法および組成物は、それだけには限らないが、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む任意の型の細胞において使用され得る。タンパク質発現に好適な細胞株は、当業者には公知であり、それだけには限らないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、ｐｅｒＣ６、昆虫細胞、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）および真菌細胞、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｓｃｈｉａ）およびシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。これらの細胞株の後代、変異体および誘導体も使用され得る。好ましい実施形態では、方法および組成物は、脳細胞に、例えば、線条体中に直接デリバリーされる。
ＣＮＳ障害のモデル
ＣＮＳ障害の研究は、非ヒト霊長類などの動物モデル系において実施され得る［例えば、パーキンソン病（Johnston and Fox (2015) Curr Top Behav Neurosci 22: 221-35］、筋萎縮性側索硬化症［Jackson et al, (2015) J. Med Primatol: 44(2):66-75］、ハンチントン舞踏病［Yang et al (2008) Nature 453(7197):921-4］、アルツハイマー病［Park et al (2015) Int J Mol Sci 16(2):2386-402］、てんかん発作［Hsiao et al (2016) EBioMed 9:257-77］、イヌ［例えば、MPS VII(Gurda et al (2016) Mol Ther 24(2):206-216］、アルツハイマー病［Schutt et al (J Alzheimers Dis 52(2):433-49］、てんかん発作［Varatharajah et al (2017) Int J Neural Syst 27(1):1650046］およびマウス［例えば、てんかん発作（Kadiyala et al (2015) Epilepsy Res 109:183-96］、アルツハイマー病［Li et al (2015) J Alzheimers Dis Parkin 5(3) doi 10:4172/2161-0460］、［概説:Webster et al (2014) Front Genet 5 art 88, doi:10.3389f/Gene.2014.00088］。これらのモデルは、ＣＮＳ疾患を完全に再現する動物モデルがない場合でさえ、疾患の特異的症状のセットを調べるために有用であり得るので使用され得る。モデルは、本明細書において記載される治療方法および組成物（遺伝子リプレッサー）の有効性および安全性プロファイルの決定において役立ち得る。
適用
本明細書において記載されるようなＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＵＢＥ３４、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏなど）を含む本明細書において記載されるような遺伝子モジュレーターおよびそれらをコードする核酸は、種々の適用のために使用され得る。これらの適用は、ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＵＢＥ３４、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２結合分子（ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む）が、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）または非ウイルスベクターを使用して対象に投与され、対象内で標的遺伝子の発現を調節するために使用される治療方法を含む。調節は、抑制、例えば、ＡＬＳまたはＦＴＤ病状に寄与しているＣ９ｏｒｆ７２（例えば、突然変異体）発現の抑制またはＡＳ病状に寄与しているＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ発現の抑制の形態であり得る。あるいは、調節は、内因性細胞性遺伝子の発現の活性化または発現の増大が、罹患状態を寛解させ得る場合には活性化の形態であり得る。なおさらなる実施形態では、調節は、例えば、ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＵＢＥ３４、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子の不活性化のための、切断（例えば、１つまたは複数のヌクレアーゼによる）による抑制であり得る。上記で記載したように、このような適用のために、標的結合分子またはより通常は、それらをコードする核酸は薬学的に許容される担体とともに医薬組成物として製剤化される。
ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＵＢＥ３４、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ、ＳＭＮ１もしくはＳＭＮ２結合分子またはそれらをコードするベクターは、単独またはその他の好適な構成成分（例えば、リポソーム、ナノ粒子または当技術分野で公知のその他の構成成分）と組み合わせて、吸入によって投与されるべきエアゾール製剤にされ得る（すなわち、それらは「噴霧」され得る）。エアゾール製剤は、加圧された許容される噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに入れられ得る。例えば、静脈内、筋肉内、皮内および皮下経路などによる非経口投与に好適な製剤として、抗酸化物質、バッファー、静菌剤および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性、等張性滅菌注射溶液ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存料を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。組成物は、例えば、静脈内注入によって、経口的に、局所的に、腹膜内に、膀胱内に、頭蓋内にまたはくも膜下腔内に投与され得る。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量の密閉容器中で提示され得る。注射溶液および懸濁液は、これまでに記載された種類の滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製され得る。
患者に投与される用量は、患者において経時的に有益な治療応答を達成するのに十分でなくてはならない。用量は、用いられる特定の標的遺伝子分子の有効性およびＫｄ、標的細胞および患者の状態ならびに治療されるべき患者の体重または表面積によって決定される。用量の大きさはまた、特定の患者における特定の化合物またはベクターの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。
以下の実施例は、本開示の例示的実施形態に関する。これは単に例示目的であり、それだけには限らないが、ＴＡＬＥ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、さらなるＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するさらなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含むその他の遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）が使用され得るということが認められよう。以下に例示されるような標的部位と結合するこれらのモジュレーターは、当業者に公知の方法を使用して容易に得られることは明らかとなろう。
実施例
人工転写因子
ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＵＢＥ３４、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２を標的とするジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥおよびｓｇＲＮＡを、本質的に米国特許第６，５３４，２６１号、同第８，５８６，５２６号および米国特許公開第２０１５００５６７０５号、同第２０１１００８２０９３号、同第２０１３０２５３０４０号および同第２０１５０３３５７０８号に記載されるとおりに遺伝子操作する。リプレッサーのセットも、マウスおよびヒト両方においてＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＵＢＥ３４、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２配列を標的とするように作製する。リプレッサーを、標準ＳＥＬＥＸ解析によって評価し、その標的部位と結合すると示される。リンカーを使用して、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを転写リプレッサーと連結させ、リンカーは以下のアミノ酸配列：ＬＲＱＫＤＡＡＲＧＳ（配列番号３３）を有していた。Ｃ９ｏｒｆ７２を標的とする例示的ＺＦＰが、以下に表１中に示されており、すべてその標的部位と結合すると示された。
表1: C9orf72 ZFP設計











すべての抑制性転写因子（ＴＦ）を、抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ）に作動可能に連結して、ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２またはＵｂｅ３ａ－ＡＴＳを抑制するＴＦを形成する。ＴＦをマウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞にトランスフェクトする。２４時間後、全ＲＮＡを抽出し、ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２またはＵｂｅ３ａ－ＡＴＳおよび２種の参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＲＰＬ３８）の発現を、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを使用してモニタリングする。
ＴＦは、ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２またはＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ発現の抑制において有効であり、多様な用量応答および標的遺伝子抑制活性を有することがわかる。特に、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＺＦＰ－ＴＦリプレッサー（表１のＺＦＰを含む）および転写抑制ドメイン（ＫＲＡＢ）は、コロンビア大学のＡＬＳ研究所から入手したＣ９０２１細胞中に導入した。この株は、その正常アレル上に５つのＧ４Ｃ２リピートを、およびその拡大されたアレル上に１４５より多いリピートを含有する。野生型細胞株は、ＮＩＮＤＳから入手したＮＤＳ０００３５であり、各アレル上に２つのＧ４Ｃ２リピートを含有していた。Ｌｏｎｚａ製の９６ウェルＳｈｕｔｔｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ系を使用してｍＲＮＡトランスフェクションを実施した。ＣＡ－１３７プログラムを使用してＡｍａｘａ Ｐ２ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌｓ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを使用して、４０，０００個細胞あたり１、３、１０、３０、１００および３００ｎｇのＺＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした。一晩インキュベートした後、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、トランスフェクトされた細胞からｃＤＮＡを作製し、続いて、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して遺伝子発現解析をした。
例示的結果が図２に示されており、野生型および突然変異体アレルの抑制を観察した。総Ｃ９ｏｒｆ７２抑制を調べることに加えて、野生型（より短い）ｍＲＮＡメッセージに対してより長いｍＲＮＡメッセージ（イントロン１Ａを含む）を検出した「アイソフォーム特異的」ＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用した。「アイソフォーム特異的アッセイ」は、より長いｍＲＮＡ種の抑制を検出する（図２Ａを参照のこと）。より長いｍＲＮＡアイソフォームは、主に、拡大された（疾患の）アレルによって産生されるが、野生型アレルによっても、かなり少ない程度に産生される。アッセイは、２つのプライマー／プローブセットを使用し、第１のセットは、アイソフォーム特異的アッセイにおいて使用され、疾患のまたは拡大されたアイソフォーム中に存在するイントロン領域１ａを標的とする（図２Ａを参照のこと）。Ｃ９株においてこのアッセイを使用することによって、本発明者らは、ＺＦＰ、例えば、７５１１４および７５１１５が、疾患のアイソフォームを７０％より多く抑制することを示した（図２Ｂから２Ｄ）。したがって、より長いｍＲＮＡアイソフォームの発現の低減は、拡大された（疾患の）アレルからのｍＲＮＡ発現の抑制の提示である。
野生型アイソフォームの抑制を評価するために、エキソン領域８および９をコードするｍＲＮＡを検出する「総Ｃ９」と表されたプライマー／プローブセット（図２Ａ）を使用した。これらの領域は、疾患および野生型アイソフォームの両方に存在しており、したがって、総Ｃ９アッセイにおいてＣ９株において観察されたＣ９ｏｒｆ７２発現の抑制（図２Ｂから２Ｄ）は、ＺＦＰ処置に応じた疾患および野生型両アイソフォームの発現の抑制を表す。したがって、主に野生型アイソフォームを含む野生型株における総Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡレベルを解析し、ＺＦＰ－ＴＦ処置に応じて野生型アイソフォームの５０％より多くの保持が観察された。
同様に、すべての活性化ＴＦを、活性化ドメイン（例えば、ＨＳＶ ＶＰ１６）に作動可能に連結して、父方ＵＢＥ３４、ＳＭＣＨＤ１、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２を活性化するＴＦを形成する。ＺＦＰ ＴＦを、マウスＮｅｕｒｏ２ａまたは線維芽細胞にトランスフェクトする。２４時間後、全ＲＮＡを抽出し、ＵＢＥ３４、ＳＭＣＨＤ１、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２および２種の参照遺伝子の発現を、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを使用してモニタリングする。
ＴＦは、ＵＢＥ３４、ＳＭＣＨＤ１、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２発現の抑制において有効であり、多様な用量応答および標的遺伝子抑制活性を有するとわかった。
Ｃ９ｏｒｆ７２抑制の特異性
表１に示されるＺＦＰ－ＴＦの全体的な特異性を、Ｃ９０２１細胞においてマイクロアレイ解析によって評価した。手短には、１００ｎｇのＺＦＰ－ＴＦをコードするｍＲＮＡを、生物学的に４連で１５０，０００個のＣ９０２１細胞にトランスフェクトした。２４時間後、全ＲＮＡを抽出し、製造業者のプロトコール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ ＭＴＡ１．０）によって処理した。ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）を使用して、各プローブセットからの生シグナルを正規化した。解析は、「遺伝子レベル差次的発現解析」オプションを備えたトランスクリプトーム解析コンソール３．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して実施した。ＺＦＰがトランスフェクトされたサンプルを、無関係のＺＦＰ－ＴＦ（Ｃ９ｏｒｆ７２標的部位と結合しない）を用いて処理されているサンプルと比較した。変化呼び出しは、対照に対して平均シグナルにおいて＞２倍の相違およびＰ値＜０．０５（各プローブセットについて一元ＡＮＯＶＡ解析、独立Ｔ検定）を有する転写物（プローブセット）について報告される。
図３に示されるように、ＳＢＳ番号７５０２７は、Ｃ９ｏｒｆ７２に加えて４種の遺伝子を抑制した（丸で示される）が、ＳＢＳ番号７５１１５は、Ｃ９ｏｒｆ７２のみを抑制した。これらの結果は、ＺＦＰ－ＴＦは、Ｃ９ｏｒｆ７２に対して高度に特異的であることを実証する。
マウスニューロンにおける遺伝子調節
マウスＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２またはＵｂｅ３ａ－ＡＴＳを標的とするすべてのリプレッサーを、発現を駆動するためのＣＭＶプロモーターを使用してｒＡＡＶ２／９ベクターにクローニングする。ウイルスは、当技術分野で公知の方法に従って、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生され、ＣｓＣｌ密度勾配を使用して精製され、リアルタイムｑＰＣＲによって力価測定される。３Ｅ５、１Ｅ５、３Ｅ４および１Ｅ４ＶＧ／細胞で培養一次マウス皮質ニューロンに感染させるために精製ウイルスが使用される。７日後、全ＲＮＡを抽出し、ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２またはＵｂｅ３ａ－ＡＴＳおよび２種の参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４ａ２）の発現を、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを使用してモニタリングした。
すべてのＴＦをコードするＡＡＶベクターが、広範な感染用量にわたってマウスの標的を効率的に抑制するとわかり、いくつかのＺＦＰは、複数用量で標的を９５％より多く低減した。対照的に、同等用量で試験されたｒＡＡＶ２／９ ＣＭＶ－ＧＦＰウイルスまたは偽処置ニューロンについて遺伝子抑制は観察されない。
したがって、本明細書において記載されるような遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサーまたはアクチベーター）は、プラスミドとして、ｍＲＮＡ形態で、Ａｄベクター中に、および／またはＡＡＶベクター中に製剤化された場合機能的リプレッサーまたはアクチベーターである。
ＡＡＶによってデリバリーされるＴＦによって駆動されるインビボ遺伝子抑制
ＴＦを、マウス海馬にデリバリーし、インビボでＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２またはＵｂｅ３ａ－ＡＴＳの抑制を評価する。手短には、半球あたりｒＡＡＶ２／９－ＣＭＶ－ＺＦＰ－ＴＦの８Ｅ９ＶＧの総用量を、二重両側性２μＬ注射による定位的注射によって投与する。注射の５週間後に動物を犠牲にし、各半球を解析のために３片に切開する。ＤＵＸ４、Ｃ９ｏｒｆ７２またはＵｂｅ３ａ－ＡＴＳおよびＺＦＰ－ＴＦ発現をリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲによって解析し、３種のハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４ａ２およびＧＡＰＤＨ）の幾何平均に対して正規化する。
データは、ＰＢＳ処置コホートに対して、ＴＦはその標的を効率的に抑制可能であるということを示す。
さらに、遺伝子モジュレーターを、本質的に米国特許公開第２０１８０１５３９２１号に記載されるとおりに、例えば、ＳＹＮ１プロモーターまたはＣＭＶプロモーターを用いてＡＡＶベクター（ＡＡＶ２／９またはその変異体）にクローニングする。使用されるＡＡＶベクターは、以下を含んでいた：表１のＺＦＰを含む１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦを含むリプレッサーの発現を駆動するＳＹＮ１プロモーターを有するベクター。２つ以上のＺＦＰ－ＴＦを、好適なＩＲＥＳまたは２Ａペプチド配列（例えば、Ｔ２ＡまたはＰ２Ａ）によって連結し、ＡＬＳまたはＦＴＤを有するまたは有さないヒトおよび非ヒト霊長類対象に１Ｅ１０～１Ｅ１３（例えば、６Ｅ１１）ｖｇ／半球（各半球に）の投与量で、好ましくは、海馬に投与する。一部の対象は、１回または複数のさらなる投与量を任意の時間で受ける。
結果は、脳にＡＡＶによってデリバリーされた本明細書において記載されるような遺伝子リプレッサーが、標的遺伝子（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２）の発現の低減およびＡＬＳまたはＦＴＤ対象の症状の寛解をもたらすことを示す。
本明細書で言及したすべての特許、特許出願および出版物は、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
理解を明確にする目的で、例示および例として開示をいくらか詳細に提供したが、開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々の変法および改変を実施できることは当業者には明らかであろう。したがって、前述の説明および例は、限定的と解釈するべきではない。

Claims (18)

  1. Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の遺伝子モジュレーターであって、
    Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子中の標的部位と結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインであって、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、配列の配列番号が括弧内に示される以下の表の単一列に示される認識ヘリックス領域を含み、そして、それぞれの標的部位は、以下の表の配列番号１および２の大文字によって示される、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと、


    転写調節ドメインまたはヌクレアーゼドメインと
    を含む、遺伝子モジュレーター。
  2. 転写調節ドメインが、抑制ドメインまたは活性化ドメインを含む、請求項１に記載の遺伝子モジュレーター。
  3. 遺伝子モジュレーターが、遺伝子の突然変異体アレルの発現を、未処置対照と比較して少なくとも５０％抑制することができる、請求項１または２に記載の遺伝子モジュレーター。
  4. ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと抑制ドメインが、配列番号３３を含むリンカーによって連結される、請求項２または３に記載の遺伝子モジュレーター。
  5. 請求項１から４のいずれかに記載の遺伝子モジュレーターをコードするポリヌクレオチド。
  6. 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子デリバリーベクター。
  7. ＡＡＶベクターを含む、請求項６に記載の遺伝子デリバリーベクター。
  8. 請求項５に記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは請求項６もしくは７に記載の１つもしくは複数の遺伝子デリバリーベクターを含む医薬組成物。
  9. 遺伝子モジュレーターがヌクレアーゼドメインを含み、遺伝子モジュレーターがＣ９ｏｒｆ７２遺伝子を切断する、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 切断されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子中に組み込まれるドナー分子をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 請求項１から４のいずれかに記載の１つもしくは複数の遺伝子モジュレーター、請求項５に記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７に記載の１つもしくは複数の遺伝子デリバリーベクターおよび／または請求項８から１０のいずれかに記載の１つもしくは複数の医薬組成物を含む単離細胞。
  12. 細胞においてＣ９ｏｒｆ７２遺伝子発現を調節する方法において使用するための医薬組成物であって、方法が、請求項１から４のいずれかに記載の１つもしくは複数の遺伝子モジュレーター、請求項５に記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７に記載の１つもしくは複数の遺伝子デリバリーベクターおよび／または請求項８から１０のいずれかに記載の１つもしくは複数の医薬組成物を投与することを含む、医薬組成物。
  13. Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子発現が抑制される、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. Ｃ９ｏｒｆ７２センスおよびアンチセンス両方の遺伝子発現が抑制される、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 投与が、脳室内、くも膜下腔内、頭蓋内、後眼窩（ＲＯ）、静脈内、鼻腔内または大槽内である、請求項１２から１４のいずれかに記載の医薬組成物。
  16. 対象において筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を処置および／または予防する方法において使用するための医薬組成物であって、方法が、請求項８から１０のいずれかに記載の医薬組成物によってＣ９ｏｒｆ７２発現を抑制することを含む、医薬組成物。
  17. 請求項１から４のいずれかに記載の１つもしくは複数の遺伝子モジュレーター、請求項５に記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７に記載の１つもしくは複数の遺伝子デリバリーベクターおよび／または請求項８から１０のいずれかに記載の１つもしくは複数の医薬組成物および適宜、使用のための説明書を含む、キット。
  18. 対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置および／または予防のための、請求項１から４のいずれかに記載の１つもしくは複数の遺伝子モジュレーター、請求項５に記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７に記載の１つもしくは複数の遺伝子デリバリーベクターおよび／または請求項８から１０のいずれかに記載の１つもしくは複数の医薬組成物を含む、医薬組成物。
JP2020543237A 2017-10-24 2018-10-24 希少疾患の処置のための方法および組成物 Active JP7381476B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762576584P 2017-10-24 2017-10-24
US62/576,584 2017-10-24
PCT/US2018/057312 WO2019084140A1 (en) 2017-10-24 2018-10-24 METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF RARE DISEASES

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2021500079A JP2021500079A (ja) 2021-01-07
JP7381476B2 true JP7381476B2 (ja) 2023-11-15

Family

ID=66246683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020543237A Active JP7381476B2 (ja) 2017-10-24 2018-10-24 希少疾患の処置のための方法および組成物

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20190167815A1 (ja)
EP (1) EP3716767A4 (ja)
JP (1) JP7381476B2 (ja)
KR (1) KR20200077529A (ja)
CN (1) CN111526720B (ja)
AU (1) AU2018355343A1 (ja)
CA (1) CA3079727A1 (ja)
IL (1) IL273959A (ja)
WO (1) WO2019084140A1 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016196185A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a disruption in a c9orf72 locus
JP7026678B2 (ja) 2016-09-30 2022-02-28 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ９ｏｒｆ７２座位中にヘキサヌクレオチドリピート伸長を有する非ヒト動物
AU2018309187C1 (en) 2017-08-04 2023-09-07 Skyhawk Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating splicing
EP3758714A4 (en) * 2018-02-27 2021-12-01 The University of North Carolina at Chapel Hill METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF ANGELMAN'S SYNDROME
EP3732291A1 (en) 2018-12-20 2020-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
JP2022521467A (ja) 2019-02-05 2022-04-08 スカイホーク・セラピューティクス・インコーポレーテッド スプライシングを調節するための方法および組成物
JP2022519323A (ja) 2019-02-06 2022-03-22 スカイホーク・セラピューティクス・インコーポレーテッド スプライシングを調節するための方法および組成物
WO2021159008A2 (en) 2020-02-07 2021-08-12 Maze Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
GB202010075D0 (en) 2020-07-01 2020-08-12 Imp College Innovations Ltd Therapeutic nucleic acids, peptides and uses
WO2022104381A1 (en) * 2020-11-13 2022-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University A MINIMAL CRISPRi/a SYSTEM FOR TARGETED GENOME REGULATION
JP2024513237A (ja) 2021-04-06 2024-03-22 メイズ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｔｄｐ－４３プロテイノパチーを処置するための組成物及び方法
GB202105455D0 (en) 2021-04-16 2021-06-02 Ucl Business Ltd Composition
WO2024077109A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Maze Therapeutics, Inc. Unc13a antisense oligonucleotides and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015153760A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a nervous system disorder
JP2016537341A (ja) 2013-11-11 2016-12-01 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ハンチントン病を処置するための方法および組成物

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2562421T3 (es) * 2010-10-12 2016-03-04 The Children's Hospital Of Philadelphia Métodos y composiciones para tratar la hemofilia B
SG10201811736QA (en) * 2011-09-21 2019-02-27 Sangamo Therapeutics Inc Methods and compositions for regulation of transgene expression
FI2906696T4 (fi) * 2012-10-15 2023-03-18 Menetelmiä c9orf72:n ilmentymisen moduloimiseksi
CA2932472A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
US9970001B2 (en) * 2014-06-05 2018-05-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease design
EP3344756A4 (en) * 2015-09-02 2019-09-04 University of Massachusetts DETECTION OF LOCI OF GENES COMPRISING MATRIX REPETITIONS OF CRISPR AND / OR POLYCHROMATIC MONO-GUIDE RIBONUCLEIC ACIDS
EP3352776A4 (en) * 2015-09-23 2019-03-13 Sangamo Therapeutics, Inc. HTT REPRESSORS AND USES THEREOF
WO2017091630A1 (en) * 2015-11-23 2017-06-01 The Regents Of The University Of California Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
AU2016376191A1 (en) * 2015-12-23 2018-07-12 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis and/or frontal temporal lobular degeneration
WO2017180835A1 (en) * 2016-04-13 2017-10-19 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing c9orf72 expression
AU2017312132A1 (en) * 2016-08-19 2019-03-21 Bluebird Bio, Inc. Genome editing enhancers

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016537341A (ja) 2013-11-11 2016-12-01 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ハンチントン病を処置するための方法および組成物
WO2015153760A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a nervous system disorder

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell Mol Life Sci.，2007年，64(22)，2933-2944

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021500079A (ja) 2021-01-07
CA3079727A1 (en) 2019-05-02
WO2019084140A1 (en) 2019-05-02
KR20200077529A (ko) 2020-06-30
CN111526720A (zh) 2020-08-11
IL273959A (en) 2020-05-31
CN111526720B (zh) 2023-01-31
EP3716767A4 (en) 2021-11-24
US20190167815A1 (en) 2019-06-06
AU2018355343A1 (en) 2020-05-07
EP3716767A1 (en) 2020-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7381476B2 (ja) 希少疾患の処置のための方法および組成物
US11110154B2 (en) Methods and compositions for treating Huntington's Disease
US20200109406A1 (en) Engineered genetic modulators
US20230270774A1 (en) Tau modulators and methods and compositions for delivery thereof
US20200101133A1 (en) Methods and compositions for modulation of tau proteins
US20220064237A1 (en) Htt repressors and uses thereof
JP2020518245A (ja) 嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ｃｆｔｒ）遺伝子の改変のための方法および組成物
RU2789459C2 (ru) Модуляторы тау и способы и композиции для их доставки

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20211014

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20220922

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221011

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230110

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230411

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230710

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230906

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20231003

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231102

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7381476

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150