CN116904404A - 溶瘤病毒载体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗和预防癌症的重组病毒载体。溶瘤病毒载体包括以下一种或多种特征：通过将肿瘤抑制性微小RNA(miRNA)靶序列插入病毒基因组中限制病毒复制；破坏致癌miRNA功能；癌症微环境重塑；以及通过将蛋白酶活化的抗体并入病毒颗粒中以靶向癌细胞。

Description

溶瘤病毒载体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年1月27日提交的美国临时申请第62/287,619号的优先权，其内容以全文引用的方式并入本文中。
关于序列表的说明
与本申请相关的序列表是以文本格式代替纸印本提供，并以引用方式并入本申请中。含有序列表的文本文件的名称是ONCR_001_01WO_ST2.txt。文本文件是7KB，创建于2017年1月26日，且通过EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本发明涉及用于治疗和预防癌症的重组病毒载体。病毒载体利用以下方面中的一种或多种：通过将肿瘤抑制性微小RNA(miRNA)靶序列插入病毒基因组中限制病毒复制；破坏致癌miRNA功能；癌症微环境重塑；和/或通过将蛋白酶活化的抗体并入病毒颗粒中以靶向癌细胞。
发明背景
由于肿瘤蛋白质表达特性的异质性，目前的靶向性癌症治疗剂仅在窄范围的癌症中有效。此外，许多癌症治疗，包括现有的病毒载体、化学疗法、放射和手术缺乏选择性治疗癌细胞，同时维持正常、非癌细胞的健康和活力的特异性，并且会产生不期望的脱靶效应。因此，业内需要在多种癌症中广泛有效并且能够选择性消除癌细胞的癌症疗法。
溶瘤病毒是优先感染癌细胞的病毒并且已经被用于癌症治疗的多种临床前和临床研究中。使用溶瘤病毒会带来非特异性病毒感染健康细胞，从而导致非癌细胞和组织死亡的风险。然而，遗传操纵病毒以利用在正常组织与在癌组织中差异表达的路径、蛋白质和基因可以增加这些病毒的特异性并限制脱靶感染和细胞死亡。
微小RNA(miRNA或miR)是小的非编码内源性RNA，这些RNA通过引导其靶信使RNA降解或翻译抑制来调控基因表达。miRNA与正常细胞过程紧密相关并因此，miRNA失调会导致多种疾病，包括癌症。许多miRNA基因位于癌症相关基因组区域或脆性位点中，这进一步强化miRNA在癌症中起重要作用的证据。miRNA在癌组织中的表达与在正常组织中不同并且可与肿瘤形成具有因果关系。通过利用不同肿瘤类型中的这一差异miRNA表达，本文所述的癌症治疗剂具有广谱安全性和性能特性，其中基于一种特定miRNA或一组miRNA的表达来调控溶瘤病毒复制。此外，本文所述的溶瘤病毒还可以表达促进病毒在整个肿瘤中扩散的蛋白质，如改变调控细胞外基质的基因和蛋白质表达，由此增加其治疗性能的蛋白质。
发明概要
本发明涉及用于治疗和预防癌症的重组病毒载体。溶瘤病毒载体包含以下个别方面或其组合：通过将肿瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列插入病毒基因组中将病毒载体复制限于癌症或肿瘤细胞；将一个或多个基因并入病毒基因组中，该病毒基因组的产物会破坏致癌miRNA和/或癌症细胞外基质的功能；以及通过将蛋白酶活化的抗体并入病毒颗粒中使载体高度选择性靶向癌症/肿瘤细胞。
在一些实施方案中，本发明提供一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含一个或多个肿瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列的一个或多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中。在一些实施方案中，病毒是单纯疱疹病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒、正粘液病毒、小病毒、马拉巴病毒(marabavirus)或柯萨奇病毒(coxsackievirus)。在一些实施方案中，病毒是单纯疱疹病毒并且其中病毒复制所需的一个或多个病毒基因是选自由以下组成的组：UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是选自表3的miR的靶序列。在一些实施方案中，将一个或多个肿瘤抑制性miR靶序列并入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’不翻译区(UTR)或3’UTR中。
在一些实施方案中，本发明提供一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含一个或多个肿瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列的一个或多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中，其中与第二细胞中的病毒复制相比，第一细胞中的病毒复制减少或减弱。在一些实施方案中，与第二细胞中能结合至一个或多个肿瘤抑制性miR靶序列的肿瘤抑制性miR的表达相比，第一细胞中肿瘤抑制性miR的表达增加。在一些实施方案中，第一细胞中肿瘤抑制性miR的表达量比第二细胞中肿瘤抑制性miR的表达量高至少5％。在一些实施方案中，与第一细胞中能结合至一个或多个肿瘤抑制性miR靶序列的肿瘤抑制性miR的表达相比，第二细胞中肿瘤抑制性miR的表达减少。在一些实施方案中，第二细胞中肿瘤抑制性miR的表达量比第一细胞中肿瘤抑制性miR的表达量低至少5％。在一些实施方案中，第二细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，本发明提供一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含一个或多个肿瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列的一个或多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中，其中肿瘤抑制性miR靶序列是针对miR-124、miR-451a、miR-143-3p及miR-559。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗胰腺癌、肺癌和/或结肠癌。在一些实施方案中，溶瘤病毒包含针对miR-124、miR-451、miR-143-3p、miR-1及miR-559的肿瘤抑制性miR靶序列。在一些实施方案中，溶瘤病毒包含针对miR-124、miR-451、miR-145-5p及miR-559的肿瘤抑制性miR靶序列。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗源自任何类型癌症的肿瘤。在一些实施方案中，溶瘤病毒包含针对miR-205p、miR-141-5p、miR-31-5p及miR-124的肿瘤抑制性miR靶序列。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗神经鞘瘤。在其它实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列被插入ICP4、ICP27、UL19和/或UL30基因座中。
在一些实施方案中，本发明提供一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含一个或多个肿瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列的一个或多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中，其中肿瘤抑制性miR靶序列是针对以下的靶序列：miR-136-3p、miR-432-5p、miR-1-3p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-493-5p、miR-223-5p、miR-223-5p、miR-136-5p、miR-451a、miR-487b-3p、miR-370-3p、miR-410-3p、miR-431-3p、miR-4485-3p、miR-4485-5p、miR-127-5p、miR-409-3p、miR-338-3p、miR-559、miR-411-5p、miR-133a-5p、miR-143-3p、miR-376b-3p、miR-758-3p、miR-1、miR-101、miR-1180、miR-1236、miR-124-3p、miR-125b、miR-126、miR-1280、miR-133a、miR-133b、miR-141、miR-143、miR-144、miR-145、miR-155、miR-16、miR-18a、miR-192、miR-195、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205、miR-214、miR-218、miR-23b、miR-26a、miR-29c、miR-320c、miR-34a、miR-370、miR-409-3p、miR-429、miR-451b、miR-490-5p、miR-493、miR-576-3p和/或miR-99a。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗膀胱癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是针对以下的靶序列：miR-1251-5p、miR-219a-5p、miR-219a-2-3p、miR-124-3p、miR-448、miR-138-2-3p、miR-490-5p、miR-129-1-3p、miR-1264、miR-3943、miR-490-3p、miR-383-5p、miR-133b、miR-129-2-3p、miR-128-2-5p、miR-133a-3p、miR-129-5p、miR-1-3p、miR-885-3p、miR-124-5p、miR-759、miR-7158-3p、miR-770-5p、miR-135a-5p、miR-885-5p、let-7g-5p、miR-100、miR-101、miR-106a、miR-124、miR-124a、miR-125a、miR-125a-5p、miR-125b、miR-127-3p、miR-128、miR-129、miR-136、miR-137、miR-139-5p、miR-142-3p、miR-143、miR-145、miR-146b-5p、miR-149、miR-152、miR-153、miR-195、miR-21、miR-212-3p、miR-219-5p、miR-222、miR-29b、miR-31、miR-3189-3p、miR-320、miR-320a、miR-326、miR-330、miR-331-3p、miR-340、miR-342、miR-34a、miR-376a、miR-449a、miR-483-5p、miR-503、miR-577、miR-663、miR-7、miR-7-5p、miR-873、let-7a、let-7f、miR-107、miR-122、miR-124-5p、miR-139、miR-146a、miR-146b、miR-15b、miR-16、miR-181a、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b、miR-181b-1、miR-181b-2、miR-181c、miR-181d、miR-184、miR-185、miR-199a-3p、miR-200a、miR-200b、miR-203、miR-204、miR-205、miR-218、miR-23b、miR-26b、miR-27a、miR-29c、miR-328、miR-34c-3p、miR-34c-5p、miR-375、miR-383、miR-451、miR-452、miR-495、miR-584、miR-622、miR-656、miR-98、miR-124-3p、miR-181b-5p、miR-200b和/或miR-3189-3p。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗脑癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是针对以下的靶序列：miR-10b-5p、miR-126-3p、miR-145-3p、miR-451a、miR-199b-5p、miR-5683、miR-3195、miR-3182、miR-1271-5p、miR-204-5p、miR-409-5p、miR-136-5p、miR-514a-5p、miR-559、miR-483-3p、miR-1-3p、miR-6080、miR-144-3p、miR-10b-3p、miR-6130、miR-6089、miR-203b-5p、miR-4266、miR-4327、miR-5694、miR-193b、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-100、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122、miR-124、miR-1258、miR-125a-5p、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-129、miR-130a、miR-132、miR-133a、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-149、miR-152、miR-153、miR-15a、miR-16、miR-17-5p、miR-181a、miR-1826、miR-183、miR-185、miR-191、miR-193a-3p、miR-195、miR-199b-5p、miR-19a-3p、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-205、miR-206、miR-211、miR-216b、miR-218、miR-22、miR-26a、miR-26b、miR-300、miR-30a、miR-31、miR-335、miR-339-5p、miR-33b、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-374a、miR-379、miR-381、miR-383、miR-425、miR-429、miR-450b-3p、miR-494、miR-495、miR-497、miR-502-5p、miR-517a、miR-574-3p、miR-638、miR-7、miR-720、miR-873、miR-874、miR-92a、miR-98、miR-99a、mmu-miR-290-3p和/或mmu-miR-290-5p。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗乳癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是针对以下的靶序列：miR-143、miR-145、miR-17-5p、miR-203、miR-214、miR-218、miR-335、miR-342-3p、miR-372、miR-424、miR-491-5p、miR-497、miR-7、miR-99a、miR-99b、miR-100、miR-101、miR-15a、miR-16、miR-34a、miR-886-5p、miR-106a、miR-124、miR-148a、miR-29a和/或miR-375。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗子宫颈癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是针对以下的靶序列：miR-133a-5p、miR-490-5p、miR-124-3p、miR-137、miR-655-3p、miR-376c-3p、miR-369-5p、miR-490-3p、miR-432-5p、miR-487b-3p、miR-342-3p、miR-223-3p、miR-136-3p、miR-136-3p、miR-143-5p、miR-1-3p、miR-214-3p、miR-143-3p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-451a、miR-127-3p、miR-133a-3p、miR-145-5p、miR-145-3p、miR-199a-5p、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-100、miR-101、miR-126、miR-142-3p、miR-143、miR-145、miR-192、miR-200c、miR-21、miR-214、miR-215、miR-22、miR-25、miR-302a、miR-320、miR-320a、miR-34a、miR-34c、miR-365、miR-373、miR-424、miR-429、miR-455、miR-484、miR-502、miR-503、miR-93、miR-98、miR-186、miR-30a-5p、miR-627、let-7a、miR-1、miR-124、miR-125a、miR-129、miR-1295b-3p、miR-1307、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-137、miR-138、miR-139、miR-139-5p、miR-140-5p、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150-5p、miR-154、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-18a、miR-191、miR-193a-5p、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-198、miR-199a-5p、miR-203、miR-204-5p、miR-206、miR-212、miR-218、miR-224、miR-24-3p、miR-26b、miR-27a、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-29b、miR-30a-3p、miR-30b、miR-328、miR-338-3p、miR-342、miR-345、miR-34a-5p、miR-361-5p、miR-375、miR-378、miR-378a-3p、miR-378a-5p、miR-409-3p、miR-422a、miR-4487、miR-483、miR-497、miR-498、miR-518a-3p、miR-551a、miR-574-5p、miR-625、miR-638、miR-7、miR-96-5p、miR-202-3p、miR-30a和/或miR-451。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗结肠癌或结肠直肠癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中的针对以下的靶序列：miR-101、miR-130a、miR-130b、miR-134、miR-143、miR-145、miR-152、miR-205、miR-223、miR-301a、miR-301b、miR-30c、miR-34a、miR-34c、miR-424、miR-449a、miR-543和/或miR-34b。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗子宫内膜癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中的针对以下的靶序列：miR-125b、miR-138、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-16-1、miR-16-1-3p、miR-16-2、miR-181a、miR-181b、miR-195、miR-223、miR-29b、miR-34b、miR-34c、miR-424、miR-10a、miR-146a、miR-150、miR-151、miR-155、miR-2278、miR-26a、miR-30e、miR-31、miR-326、miR-564、miR-27a、let-7b、miR-124a、miR-142-3p、let-7c、miR-17、miR-20a、miR-29a、miR-30c、miR-720、miR-107、miR-342、miR-34a、miR-202、miR-142-5p、miR-29c、miR-145、miR-193b、miR-199a、miR-214、miR-22、miR-137和/或miR-197。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗血液癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中的针对以下的靶序列：miR-1、miR-145、miR-1826、miR-199a、miR-199a-3p、miR-203、miR-205、miR-497、miR-508-3p、miR-509-3p、let-7a、let-7d、miR-106a*、miR-126、miR-1285、miR-129-3p、miR-1291、miR-133a、miR-135a、miR-138、miR-141、miR-143、miR-182-5p、miR-200a、miR-218、miR-28-5p、miR-30a、miR-30c、miR-30d、miR-34a、miR-378、miR-429、miR-509-5p、miR-646、miR-133b、let-7b、let-7c、miR-200c、miR-204、miR-335、miR-377和/或miR-506。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗肾癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因中的5’UTR或3’UTR中的针对以下的靶序列：let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-105、miR-122、miR-122a、miR-1236、miR-124、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-1271、miR-128-3p、miR-129-5p、miR-130a、miR-130b、miR-133a、miR-134、miR-137、miR-138、miR-139、miR-139-5p、miR-140-5p、miR-141、miR-142-3p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-148a、miR-148b、miR-150-5p、miR-15b、miR-16、miR-181a-5p、miR-185、miR-188-5p、miR-193b、miR-195、miR-195-5p、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a-5p、miR-199b、miR-199b-5p、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-203、miR-204-3p、miR-205、miR-206、miR-20a、miR-21、miR-21-3p、miR-211、miR-212、miR-214、miR-217、miR-218、miR-219-5p、miR-22、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-29b-1、miR-29b-2、miR-29c、miR-302b、miR-302c、miR-30a、miR-30a-3p、miR-335、miR-338-3p、miR-33a、miR-34a、miR-34b、miR-365、miR-370、miR-372、miR-375、miR-376a、miR-377、miR-422a、miR-424、miR-424-5p、miR-433、miR-4458、miR-448、miR-450a、miR-451、miR-485-5p、miR-486-5p、miR-497、miR-503、miR-506、miR-519d、miR-520a、miR-520b、miR-520c-3p、miR-582-5p、miR-590-5p、miR-610、miR-612、miR-625、miR-637、miR-675、miR-7、miR-877、miR-940、miR-941、miR-98、miR-99a、miR-132和/或miR-31。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗肝癌。在其它实施方案中，肝癌是肝细胞癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因中的5’UTR或3’UTR中的针对以下的靶序列：miR-143-3p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-1266-3p、miR-6130、miR-6080、miR-511-5p、miR-143-5p、miR-223-5p、miR-199b-5p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-451a、miR-142-5p、miR-144、miR-150-5p、miR-142-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-199a-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-1297、miR-141、miR-145、miR-16、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-29b、miR-381、miR-409-3p、miR-429、miR-451、miR-511、miR-99a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-1、miR-101、miR-133b、miR-138、miR-142-5p、miR-144、miR-1469、miR-146a、miR-153、miR-15a、miR-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-182、miR-192、miR-193a-3p、miR-194、miR-195、miR-198、miR-203、miR-217、miR-218、miR-22、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-29c、miR-33a、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-365、miR-449a、miR-449b、miR-486-5p、miR-545、miR-610、miR-614、miR-630、miR-660、miR-7515、miR-9500、miR-98、miR-99b、miR-133a、let-7a、miR-100、miR-106a、miR-107、miR-124、miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-126、miR-126*、miR-129、miR-137、miR-140、miR-143、miR-146b、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-152、miR-154、miR-155、miR-17-5p、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b、miR-181b-1、miR-181b-2、miR-181c、miR-181d、miR-184、miR-186、miR-193b、miR-199a、miR-204、miR-212、miR-221、miR-224、miR-27a、miR-27b、miR-29a、miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-32、miR-335、miR-338-3p、miR-340、miR-342-3p、miR-361-3p、miR-373、miR-375、miR-4500、miR-4782-3p、miR-497、miR-503、miR-512-3p、miR-520a-3p、miR-526b、miR-625*和/或miR-96。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗肺癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因中的5’UTR或3’UTR中的针对以下的靶序列：let-7b、miR-101、miR-125b、miR-1280、miR-143、miR-146a、miR-146b、miR-155、miR-17、miR-184、miR-185、miR-18b、miR-193b、miR-200c、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-20a、miR-211、miR-218、miR-26a、miR-31、miR-33a、miR-34a、miR-34c、miR-376a、miR-376c、miR-573、miR-7-5p、miR-9和/或miR-98。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗黑色素瘤。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因中的5’UTR或3’UTR中的针对以下的靶序列：let-7d、miR-218、miR-34a、miR-375、miR-494、miR-100、miR-124、miR-1250、miR-125b、miR-126、miR-1271、miR-136、miR-138、miR-145、miR-147、miR-148a、miR-181a、miR-206、miR-220a、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-32、miR-323-5p、miR-329、miR-338、miR-370、miR-410、miR-429、miR-433、miR-499a-5p、miR-503、miR-506、miR-632、miR-646、miR-668、miR-877和/或miR-9。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗口腔癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因中的5’UTR或3’UTR中的针对以下的靶序列：let-7i、miR-100、miR-124、miR-125b、miR-129-5p、miR-130b、miR-133a、miR-137、miR-138、miR-141、miR-145、miR-148a、miR-152、miR-153、miR-155、miR-199a、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-212、miR-335、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-409-3p、miR-411、miR-429、miR-432、miR-449a、miR-494、miR-497、miR-498、miR-519d、miR-655、miR-9、miR-98、miR-101、miR-532-5p、miR-124a、miR-192、miR-193a和/或miR-7。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗卵巢癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因中的5’UTR或3’UTR中的针对以下的靶序列：miR-216a-5p、miR-802、miR-217、miR-145-3p、miR-143-3p、miR-451a、miR-375、miR-214-3p、miR-216b-3p、miR-432-5p、miR-216a-3p、miR-199b-5p、miR-199a-5p、miR-136-3p、miR-216b-5p、miR-136-5p、miR-145-5p、miR-127-3p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-559、miR-129-2-3p、miR-4507、miR-1-3p、miR-148a-3p、miR-101、miR-1181、miR-124、miR-1247、miR-133a、miR-141、miR-145、miR-146a、miR-148a、miR-148b、miR-150*、miR-150-5p、miR-152、miR-15a、miR-198、miR-203、miR-214、miR-216a、miR-29c、miR-335、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-373、miR-375、miR-410、miR-497、miR-615-5p、miR-630、miR-96、miR-132、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-126、miR-135a、miR-143、miR-144、miR-150、miR-16、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-217、miR-218、miR-337、miR-494和/或miR-98。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗胰腺癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因中的5’UTR或3’UTR中的针对以下的靶序列：let-7a-3p、let-7c、miR-100、miR-101、miR-105、miR-124、miR-128、miR-1296、miR-130b、miR-133a-1、miR-133a-2、miR-133b、miR-135a、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-154、miR-15a、miR-187、miR-188-5p、miR-199b、miR-200b、miR-203、miR-205、miR-212、miR-218、miR-221、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-29b、miR-302a、miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d、miR-30e、miR-31、miR-330、miR-331-3p、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-374b、miR-449a、miR-4723-5p、miR-497、miR-628-5p、miR-642a-5p、miR-765和/或miR-940。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗前列腺癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因中的5’UTR或3’UTR中的针对以下的靶序列：miR-101、miR-183、miR-204、miR-34a、miR-365b-3p、miR-486-3p和/或miR-532-5p。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗成视网膜细胞瘤。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是针对以下的靶序列：miR-143-3p、miR-133b、miR-1264、miR-448、miR-1298-5p、miR-490-5p、miR-138-2-3p、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-150-5p、miR-129-1-3p、miR-559、miR-1-3-p、miR-143-5p、miR-223-3p、miR-3943、miR-338-3p、miR-124-3p、miR-219a-5p、miR-219a-2-3p、miR-451a、miR-142-5p、miR-133a-3p、miR-145-5p和/或miR-145-3p。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗成胶质细胞瘤。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是针对以下的靶序列：miR-143-3p、miR-223-3p、miR-6080、miR-208b-3p、miR-206、miR-133a-5p、miR-133b、miR-199a-5p、miR-199b-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-150-5p、miR-142-3p、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-338-3p、miR-214-3p、miR-559、miR-133a-3p、miR-1-3p、miR-126-3p、miR-142-5p、miR-451a、miR-199a-3p和/或miR-199b-3p。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗头颈癌。
在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR靶序列是针对以下的靶序列：miR-133b、miR-208b-3p、miR-6130、miR-141-5p、miR-31-3p、miR-1293、miR-129-2-3p、miR-129-5p、miR-124-3p、miR-219a-5p、miR-219a-2-3p、miR-490-3p、miR-488-3p、miR-935、miR-124-5p、miR-122-3p、miR-122-5p、miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-375、miR-141-3p、miR-31-5p、miR-205-5p、miR-200c-3p和/或miR-203a-3p。在其它实施方案中，溶瘤病毒用于治疗神经鞘瘤。
在一些实施方案中，本发明提供了包含以下一种或多种的重组溶瘤病毒：(a)插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中的一个或多个肿瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列；(b)编码一种或多种蛋白质或寡核苷酸的一个或多个聚核苷酸，其中所述蛋白质或寡核苷酸降低miR、基因或TIMP的表达或抑制其功能；(c)至少一种蛋白酶活化的抗体；和/或(d)编码至少一种蛋白酶活化的抗体的聚核苷酸。在一些实施方案中，miR是致癌miR或微环境重塑miR。在一些实施方案中，致癌miR选自表4中所列举的miR。在一些实施方案中，基因是致癌基因。在一些实施方案中，致癌基因选自表7中所列举的基因。在一些实施方案中，微环境重塑miR选自表5中所列举的miR。在一些实施方案中，TIMP选自TIMP1、TIMP2、TIMP3和TIMP4。在一些实施方案中，(b)的寡核苷酸是shRNA或诱饵寡核苷酸。
在一些实施方案中，本发明提供了包含以下一种或多种的重组溶瘤病毒：(a)插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中的一个或多个肿瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列；(b)编码一种或多种蛋白质或寡核苷酸的一个或多个聚核苷酸，其中所述蛋白质或寡核苷酸降低miR、基因或TIMP的表达或抑制其功能；(c)至少一种蛋白酶活化的抗体；和/或(d)编码至少一种蛋白酶活化的抗体的聚核苷酸，其中蛋白质是核酸酶、双特异性T细胞接合器(BiTE)、抗免疫抑制性蛋白、或免疫原性抗原。在一些实施方案中，核酸酶选自成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的内切核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)。在一些实施方案中，CRISPR相关的内切核酸酶选自SpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9-HF2、SpCas9-HF3、SpCas9-HF4、SaCas9、FnCpf、FnCas9、eSpCas9、C2C1、C2C3、Cpf1、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3及Csf4。在其它实施方案中，溶瘤病毒还包含编码tracr-RNA(trRNA)及crispr-RNA(crRNA)的异源聚核苷酸，其中crRNA靶向编码miR或TIMP的基因组DNA序列且其中trRNA促进CRISPR相关的内切核酸酶的结合和活化。
在一些实施方案中，抗免疫抑制性蛋白是抗调节性T细胞(Treg)蛋白或抗骨髓源性抑制性细胞(MDSC)蛋白。在一些实施方案中，抗免疫抑制性蛋白是VHH源性阻断剂或VHH源性BiTE。
在一些实施方案中，蛋白质诱导抗肿瘤免疫反应。在其它实施方案中，蛋白质选自EpCAM、叶酸盐、IFNβ、抗CTLA_4、抗PD1、A2A、抗FGF2、抗FGFR/FGFR2b、抗SEMA4D、CCL5、CD137、CD200、CD38、CD44、CSF-1R、CXCL10、CXCL13、内皮素B受体、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-35、ISRE7、LFA-1、NG2(也称为SPEG4)、SMAD蛋白、STING、TGFβ及VCAM1。
在一些实施方案中，本发明提供了包含以下一种或多种的重组溶瘤病毒：(a)插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中的一个或多个肿瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列；(b)编码一种或多种蛋白质或寡核苷酸的一个或多个聚核苷酸，其中所述蛋白质或寡核苷酸降低miR、基因或TIMP的表达或抑制其功能；(c)至少一种蛋白酶活化的抗体；和/或(d)编码至少一种蛋白酶活化的抗体的聚核苷酸，其中至少一种蛋白酶活化的抗体被并入病毒糖蛋白包膜中。在一些实施方案中，蛋白酶活化的抗体是由选自以下的蛋白酶活化：半胱氨酸组织蛋白酶、天冬氨酸组织蛋白酶、激肽释放酶(hK)、丝氨酸蛋白酶、半胱天冬酶、基质金属蛋白酶(MMP)及解整合素金属蛋白酶(ADAM)。在一些实施方案中，蛋白酶选自组织蛋白酶K、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、组织蛋白酶E、组织蛋白酶D、hK1、PSA(hK3)、hK10、hK15、uPA、uPAR、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-18、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP-23A、MMP-23B、MMP-24、MMP-25、MMP-26、MMP-27、MMP-28或表6中所列举的蛋白酶。
在一些实施方案中，蛋白酶活化的抗体结合至癌细胞或在癌症微环境中表达量高于非癌细胞或在非癌症微环境中的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白酶活化的抗体结合NKG2D、c-met、HGFR、CD8、硫酸乙酰肝素、VSPG4(也称为NG2)、EGFR、EGFRvIII、CD133、CXCR4、癌胚抗原(CEA)、CLC-3、膜联蛋白II、人类运铁蛋白受体或EpCAM。
在一些实施方案中，将miR靶序列和/或一个或多个聚核苷酸插入病毒基因组的基因座中。在一些实施方案中，病毒是单纯疱疹病毒且其中所述至少一个聚核苷酸插入或位于一个或多个选自由以下组成的组的病毒基因座中或之间：内部重复接头区(包含二倍体基因ICP0、ICP34.5、LAT、ICP4及ICP47启动子各一个拷贝)、ICP0、LAT、UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。
在一些实施方案中，本发明提供一种编码本文所述的溶瘤病毒的核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的溶瘤病毒的病毒原液。在一些实施方案中，本发明提供一种组合物，所述组合物包含本文所述的溶瘤病毒和药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，本发明提供一种杀死癌细胞的方法，该方法包括在足以使溶瘤病毒感染所述癌细胞并在所述癌细胞内复制的条件下，使所述癌细胞暴露于本文所述的溶瘤病毒或其组合物，且其中溶瘤病毒在癌细胞内复制引起细胞死亡。在一些实施方案中，与非癌细胞中能结合至一个或多个肿瘤抑制性miR-靶序列的肿瘤抑制性miR的表达相比，癌细胞中肿瘤抑制性miR的表达减少。在一些实施方案中，癌细胞中肿瘤抑制性miR的表达量比非癌细胞中肿瘤抑制性miR的表达量低至少5％。在一些实施方案中，在能结合至一个或多个肿瘤抑制性miR-靶序列的肿瘤抑制性miR表达降低的癌细胞中，溶瘤病毒的复制增加或维持。在一些实施方案中，癌细胞中的病毒复制比非癌细胞中的病毒复制高至少5％。在一些实施方案中，细胞是在体内。在一些实施方案中，细胞是在肿瘤内。
在一些实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的溶瘤病毒或其组合物。在一些实施方案中，受试者是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、马、非人类灵长类动物或人类。在一些实施方案中，溶瘤病毒或其组合物是经静脉内、皮下、肿瘤内、肌内或鼻内施用。在一些实施方案中，癌症选自肺癌、乳癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠直肠癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、头颈癌、甲状腺癌、恶性胶质瘤、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)及边缘区淋巴瘤(MZL)。在一些实施方案中，肺癌是小细胞肺癌或非小细胞肺癌。在一些实施方案中，肝癌是肝细胞癌(HCC)。
附图简述
图1示出了对应于25个选择的miRNA的癌症和非癌症脑组织中miRNA表达谱的热图。
图2示出了对应于25个选择的miRNA的癌症和非癌症膀胱组织中miRNA表达谱的热图。
图3示出了对应于25个选择的miRNA的癌症和非癌症乳房组织中miRNA表达谱的热图。
图4示出了对应于25个选择的miRNA的癌症和非癌症结肠组织中miRNA表达谱的热图。
图5示出了对应于25个选择的miRNA的成胶质细胞瘤及非癌脑组织中miRNA表达谱的热图。
图6示出了对应于25个选择的miRNA的癌症和非癌症头颈组织中miRNA表达谱的热图。
图7示出了对应于25个选择的miRNA的癌症和非癌症肺组织中miRNA表达谱的热图。
图8示出了对应于25个选择的miRNA的癌症和非癌症胰腺组织中miRNA表达谱的热图。
图9示出了对应于25个选择的miRNA的神经鞘瘤及非神经鞘瘤组织中miRNA表达谱的热图。
图10示出了所有肿瘤类型(CA)中miR-451a的表达相较于非癌症组织(Norm)下调。
图11示出了所有肿瘤类型(CA)中miR-1的表达下调、非癌症组织(Norm)中miR-1的中等表达及非癌症头颈组织(H&N)中miR-1的高表达。
图12示出了所有肿瘤类型(CA)中miR-559的表达下调、非癌症组织(Norm)中miR-559的低表达及非癌症肺组织中miR-559的高表达。
图13示出了所有肿瘤类型(CA)中miR-145-5p的表达下调以及大多数非癌症组织(Norm)中miR-145-5p的高表达。
图14示出了结肠、肺和胰腺肿瘤类型(CA)中miR-143-3p的表达下调以及大多数非癌症组织(Norm)中miR-143-3p的高表达。
图15A至图15C示出了实施例2中所述的miRNA表达和减毒报导基因系统。图15A显示了诱导miRNA表达质粒表达的pTetR tet阻遏物质粒的示意图。图15B显示了含有tet诱导性mCherry和miRNA表达盒的pTF-002miRNA表达质粒的示意图。图15C显示了能够读出去稳定GFP(dsGFP)的pTF-004miRNA减毒报导基因的示意图。
图16示出了使用图15中所示且实施例2中所述的报导基因系统进行的miR-122表达和减毒。
图17示出了使用图15中所示且实施例2中所述的报导基因系统进行的miR-122、miR-184、miR-34a及Let7a介导的GFP减毒。加圆圈的孔指示GFP表达量降低。
图18示出了由mCherry表达指示的使用图15中所示且实施例2中所述的报导基因系统进行的miR-122、miR-184、miR-34a及Let7a的表达。
图19示出了使用图15中所示且实施例2中所述的报导基因系统进行的miR-122、miR-124、miR-145、miR-199及miR-451介导的GFP减毒。加圆圈的孔指示GFP表达量降低。
图20示出了由mCherry表达指示的使用图15中所示且实施例2中所述的报导基因系统进行的miR-122、miR-124、miR-145、miR-199及miR-451的表达。
图21显示miR-122和miR-184减毒的GFP荧光的定量。
图22显示miR-34a和miR-184减毒的GFP荧光的定量。
图23显示Let7a和miR-184减毒的GFP荧光的定量。
图24显示miR-124和miR-184减毒的GFP荧光的定量。
图25显示miR-145和miR-184减毒的GFP荧光的定量。
图26显示miR-199和miR-451减毒的GFP荧光的定量。
图27显示miR-125和miR-451减毒的GFP荧光的定量。
图28显示miR-126和miR-451减毒的GFP荧光的定量。
图29显示miR-127和miR-451减毒的GFP荧光的定量。
图30显示miR-133和miR-451减毒的GFP荧光的定量。
图31显示miR-223和miR-451减毒的GFP荧光的定量。
图32显示具有针对各种miRNA的靶序列插入ICP27及ICP4基因中的miR减毒的HSV构筑体。
图33示出了非癌症(有丝分裂后的肺)和癌症(A253)细胞中miR-125使HSV减毒。
图34显示非癌症(PM肺)和癌症(A253)肺细胞中miR-125使HSV减毒的基于qPCR的定量。
图35示出了HCC1395与A253细胞中miR-145使HSV减毒的基于荧光的定量比较。
图36显示HCC1395与A253细胞中miR-145使HSV减毒的基于qPCR的定量比较。
图37示出了在正常肺细胞中利用miR-199a-5p与利用miR-143-3p使HSV减毒的基于荧光的定量比较。
图38显示在正常肺细胞中利用miR-199a-5p与利用miR-143-3p使HSV减毒的基于qPCR的定量比较。
图39示出了用于治疗癌症或良性过度增殖性病症的ICP4-TmiRNA减毒的HSV载体的示意图。其中，gB：NT：gB基因中的病毒进入增强双重突变；BAC：loxP侧接的氯霉素抗性和lacZ序列；A接头：包括ICP4基因的一个拷贝的完整内部重复区的缺失；ICP4：TmiRNA：miRNA靶序列(例如let-7、miR-34a、miR-101、miR-125b、miR-145等)插入其余ICP4基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)。
图40显示用于治疗癌症或良性过度增殖性病症的ICP27-TmiRNA减毒的HSV载体的示意图。其中，gB：NT：gB基因中的病毒进入增强双重突变；BAC：loxP侧接的氯霉素抗性和lacZ序列；Δ接头：包括ICP4基因的一个拷贝的完整内部重复区的缺失；ICP27：TmiRNA：miRNA靶序列(例如let-7、miR-34a、miR-101、miR-125b、miR-145等)插入ICP27基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)。
图41显示用于治疗癌症或良性过度增殖性病症的UL19-TmiRNA减毒的HSV载体的示意图。其中，gB：NT：gB基因中的病毒进入增强双重突变；BAC：loxP侧接的氯霉素抗性和lacZ序列；Δ接头：包括ICP4基因的一个拷贝的完整内部重复区的缺失；UL19：TmiRNA：miRNA靶序列(例如let-7、miR-34a、miR-101、miR-125b、miR-145等)插入UL19基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)。
图42显示用于治疗癌症或良性过度增殖性病症的UL19-TmiRNA和ICP27-TmiRNA减毒的HSV载体的示意图。其中，gB：NT：gB基因中的病毒进入增强双重突变；BAC：loxP侧接的氯霉素抗性和lacZ序列；Δ接头：包括ICP4基因的一个拷贝的完整内部重复区的缺失；UL19：TmiRNA和ICP27：TmiRNA：miRNA靶序列(例如let-7、miR-34a、miR-101、miR-125b、miR-145等)插入UL19和ICP27基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)。
图43显示用于治疗癌症或良性过度增殖性病症的UL19-TmiRNA和ICP4-TmiRNA减毒的HSV载体的示意图。其中，gB：NT：gB基因中的病毒进入增强双重突变；BAC：loxP侧接的氯霉素抗性和lacZ序列；Δ接头：包括ICP4基因的一个拷贝的完整内部重复区的缺失；UL19：TmiRNA和ICP4：TmiRNA：miRNA靶序列(例如let-7、miR-34a、miR-101、miR-125b、miR-145等)插入UL19和ICP4基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)。
图44显示用于治疗癌症或良性过度增殖性病症的UL19-TmiRNA、ICP27-TmiRNA及ICP4-TmiRNA减毒的HSV载体的示意图。其中，gB：NT：gB基因中的病毒进入增强双重突变；BAC：loxP侧接的氯霉素抗性和lacZ序列；Δ接头：包括ICP4基因的一个拷贝的完整内部重复区的缺失；UL19：TmiRNA、ICP27：TmiRNA和ICP4：TmiRNA：miRNA靶序列(例如let-7、miR-34a、miR-101、miR-125b、miR-145等)插入UL19、ICP27和ICP4基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)。
图45显示用于治疗癌症的ICP4-TmiRNA减毒、基因组编辑的HSV载体的示意图。其中，gB：NT：gB基因中的病毒进入增强双重突变；BAC：loxP侧接的氯霉素抗性和lacZ序列；Δ接头：包括ICP4基因的一个拷贝的完整内部重复区的缺失；ICP4：TmiRNA：肿瘤抑制性miRNA靶序列(例如let-7、miR-34a、miR-101、miR-125b、miR-145等)插入其余ICP4基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)；Pol II启动子：组成型CAG、UbC、EFlα、PGK)或细胞特异性(例如TRPV1、Nav1.7、hSYN)；内切核酸酶：CRISPR相关的内切核酸酶(例如SpCas9、SaCas9、FnCpf1、FnCas9等)；聚腺苷酸：聚腺苷酸化信号(例如bGH)；gRNA：单一crRNA-trRNA融合物(DR-crRNA-DR-trRNA)；crRNA靶向致癌微小RNA(例如miR-17、miR-21、miR-155)；Pol III启动子：例如U6、H1、7SK。
图46显示用于治疗癌症的ICP4-TmiRNA减毒、基因组编辑、微环境重塑的HSV载体的示意图。其中，gB：NT：gB基因中的病毒进入增强双重突变；BAC：loxP侧接的氯霉素抗性和lacZ序列；Δ接头：包括ICP4基因的一个拷贝的完整内部重复区的缺失；ICP4：TmiRNA：肿瘤抑制性miRNA靶序列(例如let-7、miR-34a、miR-101、miR-125b、miR-145等)插入其余ICP4基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)；Pol II启动子：组成型CAG、UbC、EFlα、PGK)或细胞特异性(例如TRPV1、Nav1.7、hSYN)；内切核酸酶：CRISPR相关的内切核酸酶(例如SpCas9、SaCas9、FnCpf1、FnCas9等)；聚腺苷酸：聚腺苷酸化信号(例如bGH)；gRNA1：单一crRNA-trRNA融合物(DR-crRNA-DR-trRNA)；crRNA靶向致癌微小RNA(例如miR-17、miR-21、miR-155)；gRNA2：crRNA靶向微环境重塑miRNA(例如miR-143、miR-218)或TIMP(例如TIMP1、TIMP2)；Pol III启动子：例如U6、H1、7SK。
图47显示用于治疗胰腺癌、肺癌及结肠癌的ICP4-TmiRNA和ICP27-TmiRNA减毒的HSV载体的示意图。其中，gB：NT：gB基因中的病毒进入增强双重突变；BAC：loxP侧接的氯霉素抗性和lacZ序列；Δ接头：包括ICP4基因的一个拷贝的完整内部重复区的缺失；ICP4：TmiRNA：miR-124靶序列盒插入其余ICP4基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)；ICP27：TmiRNA：miR-451a、miR-143-3p和miR-559靶序列盒插入ICP27基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)。
图48显示用于治疗多种癌症类型的ICP4-TmiRNA和ICP27-TmiRNA减毒的HSV载体的示意图。其中，gB：NT：gB基因中的病毒进入增强双重突变；BAC：loxP侧接的氯霉素抗性和lacZ序列；Δ接头：包括ICP4基因的一个拷贝的完整内部重复区的缺失；ICP4：TmiRNA：miR-124靶序列盒插入其余ICP4基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)；ICP27：TmiRNA：miR-451a、miR-145-5p和miR-559靶序列盒插入ICP27基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)。
图49显示用于治疗神经鞘瘤的ICP4-TmiRNA和ICP27-TmiRNA减毒的HSV载体的示意图。其中，gB：NT：gB基因中的病毒进入增强双重突变；BAC：loxP侧接的氯霉素抗性和lacZ序列；Δ接头：包括ICP4基因的一个拷贝的完整内部重复区的缺失；ICP4：TmiRNA：miR-124靶序列盒插入其余ICP4基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)；ICP27：TmiRNA：miR-205p、miR-141-5p和miR-31-5p靶序列盒插入ICP27基因的3’UTR中(也可以放在5’UTR中)。
发明详述
在一些方面，本发明利用差异miRNA表达谱有效地将病毒载体复制限于肿瘤细胞。在一些实施方案中，本文所述的病毒载体还破坏特异性miRNA的表达以减少肿瘤增殖、转移，和/或重塑肿瘤微环境，由此使病毒扩散增加。在一些实施方案中，本文所述的病毒载体涵盖利用病毒载体上的表面分子以便利靶向肿瘤细胞。这些方面可个别应用或组合应用以开发潜在地能够利用单一病毒载体治疗多种癌症类型的病毒载体。因此，本发明进一步涵盖重组溶瘤病毒载体，其用于治疗和预防疾病和病症(例如癌症)。在一些实施方案中，本发明利用内源性微小RNA(miRNA)以使得安全且有效的重组病毒载体能够适于治疗多种癌症。
本文所用的小标题仅用于组织目的，且不应解释为限制所描述的主题。本文引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书和论文都以全文引用方式并入本文中用于任何目的。如果并入的文件或文件的部分中的一种或多种所定义的术语与本申请中术语的定义有矛盾，则以本申请中出现的定义为准。不过，提到的本文所引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开及专利申请并非且不应视为承认或以任何形式表明其构成有效现有技术或形成世界上任何国家中常用的一般知识的一部分。
在本发明的描述中，除非另外指示，否则任何浓度范围、百分含量范围、比率范围或整数范围应理解为包括在所述范围内的任一整数值且适当时，包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。应理解，除非另外指示，否则如本文所使用的术语“一个(种)(a/an)”是指所列举组分中的“一种或多种”。使用替代形式(例如“或”)应理解为意思指替代形式中的一种、二种或其任何组合。如本文所使用的术语“包括”和“包含”是同义使用。如本文所用，“多个(种)”可指一个或多个组分(例如一个或多个miRNA靶序列)。
溶瘤病毒
在一些实施方案中，本发明提供重组溶瘤病毒，其中一个或多个肿瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列的一个或多个拷贝被插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中。如本文所使用的术语“溶瘤病毒”是指被修饰成或天然地优先感染癌细胞的病毒。溶瘤病毒的实例是本领域中已知的，包括但不限于单纯疱疹病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒、正粘液病毒、小病毒、马拉巴病毒或柯萨奇病毒。在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒被并入病毒载体中。术语“载体”在本文中用于指能转移或转运核酸分子的核酸分子。被转移核酸通常连接至核酸分子中，例如插入载体核酸分子中。载体可包括引导在细胞中自主复制的序列，或可包括足以允许整合至宿主细胞DNA中的序列。病毒载体有时可称作“重组病毒”或“病毒”。术语“溶瘤病毒”与“溶瘤载体”在本文中可互换使用。在特定实施方案中，重组病毒载体是能进行肿瘤选择性载体复制的单纯疱疹病毒，如国际PCT公开第WO 2015/066042号中所述，该案以全文引用的方式并入本文中。
术语“微小RNA”、“miRNA”和“miR”在本文中可互换使用且意思指通过引导其靶信使RNA(mRNA)降解或翻译阻遏来调控基因表达的小的非编码内源性RNA。miR在多种疾病状态，包括多种类型的癌症中差异性表达。在一些方面，给定癌症类型或组织的癌细胞展现与非癌症对照细胞不同的miR表达。如本文所使用的术语“oncomiR”是指与致癌作用、恶性转化或癌转移相关(正相关或负相关)的miR。在一些方面，特定oncomiR的表达量与特定癌症的发生或维持相关。此类miR在本文中称作“致癌miR”。
在一些实施方案中，与非癌症对照相比，癌细胞或组织中致癌miR的表达增加。例如，与非癌症细胞或组织中致癌miR的表达相比，癌细胞中致癌miR的表达可增加至少5％。在一些实施方案中，与非癌症细胞或组织中致癌miR的表达相比，致癌miR的表达增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多。在一些方面，癌细胞或组织可表达在非癌症对照细胞或组织中不表达的致癌miR。在一些实施方案中，一种癌细胞或组织中致癌miR的表达相较于源自不同癌症类型的癌细胞有所增加。例如，一种癌细胞中致癌miR的表达相较于源自不同癌症类型的癌细胞增加至少5％。在一些实施方案中，致癌miR的表达相较于源自不同癌症类型的癌细胞增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多。在癌症组织中通常过表达的致癌miRNA的实例包括但不限于miR-21、miR-155和miR-17-92。致癌miR的其它实例列于表4中。
在一些实施方案中，特定oncomiR的表达与致癌作用和/或转移的预防和/或延迟相关。此类oncomiR在本文中称作“肿瘤-抑制剂miR”或“肿瘤抑制性miR”，因为其表达可预防或抑制癌症的发生。在一些实施方案中，肿瘤抑制性miR的表达不足可导致癌症。因此，在一些方面，肿瘤抑制性miR在健康细胞中表达，而在癌细胞中不表达。在一些方面，与癌细胞相比，健康细胞中特定肿瘤抑制性miR的表达增加。例如，与癌细胞中肿瘤抑制性miR的表达相比，健康(例如非癌症)细胞中肿瘤抑制性miR的表达增加至少5％。在一些实施方案中，与癌细胞中肿瘤抑制性miR的表达相比，肿瘤抑制性miR的表达增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多。在一些实施方案中，正常细胞或组织中肿瘤抑制性miR的表达相较于源自体内不同组织类型或位置的正常细胞有所增加。例如，正常细胞中肿瘤抑制性miR的表达相较于源自体内不同组织类型或位置的正常细胞增加至少5％。在一些实施方案中，正常细胞中肿瘤抑制性miR的表达相较于源自体内不同组织类型或位置的正常细胞增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多。肿瘤抑制性miRNA的实例包括但不限于miR-15a、miR-16-1、miR-34以及1et-7家族的miRNA。肿瘤抑制性miR的其它实例列于表3和表8中。
癌症致病性是一个异质性且多基因的过程。因此，特定路径的活化和特定基因的表达在一种情形中可能导致癌症发生，而在不同情形中活化或表达时引起不同或相反的结果。因此，将特定基因或miR表征为“致癌基因”或“致癌miR”或“肿瘤抑制剂”或“肿瘤抑制性miR”不是二元区分法并且通常视情形而定。例如，miR-152b在绝大多数血液恶性病中起致癌miR作用，但在许多实体肿瘤中起肿瘤抑制性miR作用。此外，特定miR可在癌细胞和非癌症细胞中高度表达。例如，miR-155在正常细胞中高度表达，由此在巨噬细胞极化中起重要作用，而且也在癌细胞中高度表达。因此，本文所述的miR减毒、基因组编辑且微环境重塑的溶瘤病毒的研究是基于一个细胞群体或组织中一个特定miR或一组特定miR的表达与另一细胞群体或组织中的表达的差异。本领域技术人员应理解，术语肿瘤抑制性miR通常是指在非癌症细胞或组织中的表达量高于癌细胞或组织中的miR，且术语致癌miR通常是指在癌细胞或组织中的表达量高于非癌症细胞或组织中的miR。本领域技术人员还应理解，在一种类型的癌症中表征为肿瘤抑制性miR的miR在不同类型的癌症中可能起到或更可能不起到肿瘤抑制性miR作用，且在一种类型的癌症中表征为致癌miR的miR在不同类型的癌症中可能起到或更可能不起到致癌miR作用。
表1显示12个选择的oncomiR(9个肿瘤抑制子及3个致癌miRNA)与不同癌症之间的关系。表2中显示了3，410个oncomiR-癌症关系的清单。miRNA调控细胞增殖和细胞凋亡控制所涉及蛋白质的许多转录物。调控的蛋白质包括常规原癌蛋白和肿瘤抑制子，如Ras、Myc、Bcl2、PTEN及p53。因此，miRNA的异常表达通常涉及癌症的发生且在治疗上可以通过抑制致癌miRNA或替换耗尽的肿瘤抑制性miRNA进行校正。此外，癌细胞相对于非癌症细胞中特定oncomiR的差异表达可以用作使癌症治疗剂特异性靶向癌细胞的方式。因此，在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒载体可包含个别或组合的以下性质：将肿瘤抑制性miRNA靶序列插入病毒基因组中，由此将病毒载体复制限于癌症或肿瘤细胞；并入病毒基因组中的一个或多个聚核苷酸，该病毒基因组的产物破坏致癌miRNA和/或癌症细胞外基质的功能；和/或并入病毒颗粒中以使载体高度选择性靶向癌症和/或肿瘤细胞的蛋白酶活化的抗体。
本发明的一个方面包含重组溶瘤病毒(或病毒载体)，其包含一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列(例如选自表3或表8中所列miRNA的miRNA)的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中。在某些实施方案中，重组溶瘤病毒可包含肿瘤抑制性miRNA靶序列插入病毒复制所需的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个病毒基因的基因座中。在正常(非癌症)细胞中表达的肿瘤抑制性miRNA可结合至此类靶序列并抑制含有miRNA靶序列的病毒基因的表达，由此限制健康、非癌症细胞中的病毒复制。此类重组溶瘤病毒和/或载体在本文中称作“miR减毒”或“复制限制的”，因为它们使得表达能结合至并入的肿瘤抑制性miR靶序列的肿瘤抑制性miR的细胞中的病毒复制相较于不表达肿瘤抑制性miR或肿瘤抑制性miR表达减少的细胞中的病毒复制有所降低或衰减。通过将肿瘤抑制性miRNA并入病毒复制所需的关键基因中，可以有条件地抑制表达肿瘤抑制性miRNA的正常二倍体细胞中的病毒复制，且在不表达肿瘤抑制性miRNA的细胞中的病毒复制可正常地进行。在此类实施方案中，健康、非癌症细胞保护正常细胞免于由重组病毒载体感染的溶解效应。
在某些实施方案中，将一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列并入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’不翻译区(UTR)和/或3’UTR中。在正常二倍体细胞中，肿瘤抑制性miRNA可结合至包含肿瘤抑制性miRNA靶序列的工程改造的3’或5’非编码序列，但这些肿瘤抑制性miRNA在转化的细胞或恶性细胞中缺乏。因此，病毒复制可在缺乏肿瘤抑制性miRNA或肿瘤抑制性miRNA表达降低的细胞中进行。在一些实施方案中，将至少一个肿瘤抑制性miR靶序列并入复制所需的一个或多个病毒基因中。在一些实施方案中，溶瘤病毒载体可包含并入复制所需的一个病毒基因中的相同肿瘤抑制性miR靶序列的多个拷贝。例如，可在复制所需的病毒基因中并入肿瘤抑制性miR靶序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝。在特定实施方案中，在复制所需的病毒基因的3’或5’UTR中并入肿瘤抑制性miR靶序列的2至6个拷贝。在其它实施方案中，在复制所需的病毒基因的3’或5’UTR中并入肿瘤抑制性miR靶序列的4个拷贝。在一些实施方案中，溶瘤病毒载体可包含并入复制所需的多个病毒基因中的相同肿瘤抑制性miR靶序列的多个拷贝。例如，可在病毒复制所需的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基因中并入肿瘤抑制性miR靶序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个拷贝。在特定实施方案中，在复制所需的两个或更多个病毒基因的3’或5’UTR中并入肿瘤抑制性miR靶序列的2至6个拷贝。在其它实施方案中，在复制所需的两个或更多个病毒基因的3’或5’UTR中并入肿瘤抑制性miR靶序列的至少4个拷贝。
在一些实施方案中，溶瘤病毒载体可包含并入复制所需的一个病毒基因中的针对一个以上肿瘤抑制性miR的靶序列。例如，可在病毒复制所需的单一基因中并入针对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同肿瘤抑制性miR的靶序列。在一些实施方案中，溶瘤病毒载体可包含并入复制所需的多个病毒基因中的针对一个以上肿瘤抑制性miR的靶序列。例如，可在病毒复制所需的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多基因中并入针对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同肿瘤抑制性miR的靶序列。在一些实施方案中，溶瘤病毒载体可包含针对至少两个不同肿瘤抑制性miR(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个不同肿瘤抑制性miR)的多个靶序列(例如一个靶序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个拷贝)。在此类实施方案中，针对第一肿瘤抑制性miR的多个靶序列可并入复制所需的第一基因中，针对第二肿瘤抑制性miR的多个靶序列可并入复制所需的第二基因中，针对第三肿瘤抑制性miR的多个靶序列可并入复制所需的第三基因中，等等。在特定实施方案中，本文所述的溶瘤病毒载体包含并入复制所需的第一基因的3’或5’UTR中的第一肿瘤抑制性miR靶序列的至少2个到至少8个拷贝、并入复制所需的第二基因的3’或5’UTR中的第二肿瘤抑制性miR靶序列的至少2个到至少8个拷贝及并入复制所需的第三基因的3’或5’UTR中的第三肿瘤抑制性miR靶序列的至少2个到至少8个拷贝。
在一些实施方案中，本文所述的miR减毒的溶瘤病毒使表达能结合至一个或多个并入的miR-靶序列的肿瘤抑制性miR的细胞中的病毒复制减少。“病毒复制”是指在给定量的时间期间在一个特定细胞或细胞群体中发生的病毒复制循环的总数。在一些实施方案中，病毒复制可通过评价在给定量的时间过程中存在的总病毒效价或通过评价存在的病毒基因组拷贝的数目(例如通过测序)直接测量。在一些实施方案中，病毒载体可另外包含可检测标记，如荧光报导基因。在所述实施方案中，病毒复制可通过测量报导基因的荧光强度或表达报导基因的细胞的数目来评价。在一些实施方案中，病毒复制可通过评价在给定量的时间过程中活细胞的数目间接测量。例如，预期病毒复制水平与随时间变化的活细胞数目成逆相关。
如本文所用的“减少的病毒复制”是指第一细胞或第一细胞群体中的病毒复制水平低于第二细胞或第二细胞群体。在一些实施方案中，与第二细胞或细胞群体中的病毒复制水平相比，第一细胞或第一细胞群体中的病毒复制水平降低至少5％。在一些实施方案中，与第二细胞或细胞群体中的病毒复制水平相比，第一细胞或第一细胞群体中的病毒复制水平降低至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，与第二细胞或细胞群体中的病毒复制相比，第一细胞或第一细胞群体中的病毒复制完全受抑制。
在一些实施方案中，第一细胞或第一细胞群体中病毒复制的减少与能结合至并入复制所需的一个或多个病毒基因中的一个或多个miR-靶序列的肿瘤抑制性miR的表达相关。因此，在一些实施方案中，对应于并入的miR-靶序列的肿瘤抑制性miR的表达抑制或减少复制基因的表达，由此抑制或减少病毒复制。在一些实施方案中，第二细胞或第二细胞群体不表达肿瘤抑制性miR或其表达量降低。在一些实施方案中，对应于并入的miR-靶序列的肿瘤抑制性miR的不存在或其表达量降低(例如，在癌细胞中)容许进行病毒复制。在一些实施方案中，第二细胞或细胞群体中肿瘤抑制性miR的表达量比第一细胞或群体中肿瘤抑制性miR的表达量低至少5％。在一些实施方案中，与第一细胞或群体中肿瘤抑制性miR的表达量相比，第二细胞或细胞群体中肿瘤抑制性miR的表达量降低至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，第二细胞不表达肿瘤抑制性miR。在特定实施方案中，第一细胞是非癌症细胞且第二细胞是癌细胞。
在一些方面，将肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或更多个拷贝)串联插入病毒基因组中的基因座中。在此类实施方案中，靶序列的多个拷贝可由连接子序列或间隔序列间隔开。在一些实施方案中，连接子和/或间隔子序列包含4个或更多个聚核苷酸。例如，间隔或连接子序列可包含4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个聚核苷酸。在一些实施方案中，连接子序列或间隔子序列包含约5至约20个核苷酸。在其它实施方案中，连接子序列或间隔子序列包含约8至约16个核苷酸。作为示例性实施方案且不打算以任何方式限制本发明，溶瘤病毒可包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个以下亚基中的一种或多种串联插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中：(a)第一肿瘤抑制性miRNA的靶序列-连接子或间隔子序列-第一肿瘤抑制性miRNA的靶序列；或(b)第一肿瘤抑制性miRNA的靶序列-连接子或间隔子序列-第二肿瘤抑制性miRNA的靶序列。在一些实施方案中，miRNA靶序列是miRNA的反向补体。
在一些实施方案中，溶瘤病毒是单纯疱疹病毒(HSV)，且病毒复制所需的病毒基因是UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11和/或US12。在一些实施方案中，溶瘤病毒是单纯疱疹病毒(HSV)，且一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列被并入ICP0、ICP4、UL19及ICP27基因中的一种或多种中。在某些实施方案中，溶瘤病毒载体是包含一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列(例如，表3中所列举的肿瘤抑制性miR中的任一个)并入病毒复制所需的一个或多个基因(例如，UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11或US12)的5’或3’UTR中的HSV(例如，图39-49)。
在一些实施方案中，限制复制的病毒载体(例如，miR减毒的病毒载体)包含至少一个let-7靶序列且用于治疗肺癌。在一些实施方案中，限制复制的病毒载体包含至少一个miR-15a和/或至少一个miR-16A靶序列且用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方案中，限制复制的病毒载体包含至少一个miR-125b、至少一个miR-145、至少一个miR-21和/或至少一个miR-155靶序列且用于治疗乳癌。在其它实施方案中，限制复制的病毒载体包含至少一个miR-143和/或至少一个miR-145靶序列且用于治疗结肠直肠癌。在某些实施方案中，限制复制的病毒载体包含至少一个miR-181a、至少一个miR-181b和/或至少一个miR-181c靶序列且用于治疗成胶质细胞瘤。在一些实施方案中，限制复制的病毒载体包含至少一个miR-199a*、至少一个miR-195、至少一个miR-199a、至少一个miR-200a和/或至少一个miR-125a靶序列且用于治疗肝癌(例如肝细胞癌)。
在特定实施方案中，限制复制的病毒载体包含至少一个miR-451a靶序列、至少一个miR-143-3p靶序列、至少一个miR-559靶序列及至少一个miR-124靶序列且用于治疗胰腺癌、肺癌和/或结肠癌。在此类实施方案中，在病毒复制所需的两个或更多个基因(例如ICP4和ICP27)中并入针对miR-451a、miR-143-3p、miR-559及miR-124的靶序列。在其它特定实施方案中，限制复制的病毒载体包含至少一个miR-451a靶序列、至少一个miR-145-5p靶序列、至少一个miR-559靶序列及至少一个miR-124靶序列且用于治疗本文所述的任何类型的癌症。在此类实施方案中，在病毒复制所需的两个或更多个基因(例如ICP4和ICP27)中并入针对miR-451a、miR-145-5p、miR-559及miR-124的靶序列。在其它特定实施方案中，限制复制的病毒载体包含至少一个miR-205p靶序列、至少一个miR-141-5p靶序列、至少一个miR-31-5p靶序列及至少一个miR-124靶序列且用于治疗神经鞘瘤。在此类实施方案中，在病毒复制所需的两个或更多个基因(例如ICP4和ICP27)中并入针对miR-205p、miR-141-5p、miR-31-5p及miR-124的靶序列。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：miR-136-3p、miR-432-5p、miR-1-3p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-493-5p、miR-223-5p、miR-223-5p、miR-136-5p、miR-451a、miR-487b-3p、miR-370-3p、miR-410-3p、miR-431-3p、miR-4485-3p、miR-4485-5p、miR-127-5p、miR-409-3p、miR-338-3p、miR-559、miR-411-5p、miR-133a-5p、miR-143-3p、miR-376b-3p、miR-758-3p、miR-1、miR-101、miR-1180、miR-1236、miR-124-3p、miR-125b、miR-126、miR-1280、miR-133a、miR-133b、miR-141、miR-143、miR-144、miR-145、miR-155、miR-16、miR-18a、miR-192、miR-195、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205、miR-214、miR-218、miR-23b、miR-26a、miR-29c、miR-320c、miR-34a、miR-370、miR-409-3p、miR-429、miR-451、miR-490-5p、miR-493、miR-576-3p和/或miR-99a。这一溶瘤病毒可用于治疗膀胱癌的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：miR-1251-5p、miR-219a-5p、miR-219a-2-3p、miR-124-3p、miR-448、miR-138-2-3p、miR-490-5p、miR-129-1-3p、miR-1264、miR-3943、miR-490-3p、miR-383-5p、miR-133b、miR-129-2-3p、miR-128-2-5p、miR-133a-3p、miR-129-5p、miR-1-3p、miR-885-3p、miR-124-5p、miR-759、miR-7158-3p、miR-770-5p、miR-135a-5p、miR-885-5p、let-7g-5p、miR-100、miR-101、miR-106a、miR-124、miR-124a、miR-125a、miR-125a-5p、miR-125b、miR-127-3p、miR-128、miR-129、miR-136、miR-137、miR-139-5p、miR-142-3p、miR-143、miR-145、miR-146b-5p、miR-149、miR-152、miR-153、miR-195、miR-21、miR-212-3p、miR-219-5p、miR-222、miR-29b、miR-31、miR-3189-3p、miR-320、miR-320a、miR-326、miR-330、miR-331-3p、miR-340、miR-342、miR-34a、miR-376a、miR-449a、miR-483-5p、miR-503、miR-577、miR-663、miR-7、miR-7-5p、miR-873、let-7a、let-7f、miR-107、miR-122、miR-124-5p、miR-139、miR-146a、miR-146b、miR-15b、miR-16、miR-181a、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b、miR-181b-1、miR-181b-2、miR-181c、miR-181d、miR-184、miR-185、miR-199a-3p、miR-200a、miR-200b、miR-203、miR-204、miR-205、miR-218、miR-23b、miR-26b、miR-27a、miR-29c、miR-328、miR-34c-3p、miR-34c-5p、miR-375、miR-383、miR-451、miR-452、miR-495、miR-584、miR-622、miR-656、miR-98、miR-124-3p、miR-181b-5p、miR-200b和/或miR-3189-3p。这一溶瘤病毒可用于治疗脑癌的方法和组合物中。在某些实施方案中，脑癌是星形细胞瘤、成胶质细胞瘤或胶质瘤。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：miR-10b-5p、miR-126-3p、miR-145-3p、miR-451a、miR-199b-5p、miR-5683、miR-3195、miR-3182、miR-1271-5p、miR-204-5p、miR-409-5p、miR-136-5p、miR-514a-5p、miR-559、miR-483-3p、miR-1-3p、miR-6080、miR-144-3p、miR-10b-3p、miR-6130、miR-6089、miR-203b-5p、miR-4266、miR-4327、miR-5694、miR-193b、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-100、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122、miR-124、miR-1258、miR-125a-5p、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-129、miR-130a、miR-132、miR-133a、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-149、miR-152、miR-153、miR-15a、miR-16、miR-17-5p、miR-181a、miR-1826、miR-183、miR-185、miR-191、miR-193a-3p、miR-195、miR-199b-5p、miR-19a-3p、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-205、miR-206、miR-211、miR-216b、miR-218、miR-22、miR-26a、miR-26b、miR-300、miR-30a、miR-31、miR-335、miR-339-5p、miR-33b、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-374a、miR-379、miR-381、miR-383、miR-425、miR-429、miR-450b-3p、miR-494、miR-495、miR-497、miR-502-5p、miR-517a、miR-574-3p、miR-638、miR-7、miR-720、miR-873、miR-874、miR-92a、miR-98、miR-99a、mmu-miR-290-3p和/或mmu-miR-290-5p。这一溶瘤病毒可用于治疗乳癌的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：miR-143、miR-145、miR-17-5p、miR-203、miR-214、miR-218、miR-335、miR-342-3p、miR-372、miR-424、miR-491-5p、miR-497、miR-7、miR-99a、miR-99b、miR-100、miR-101、miR-15a、miR-16、miR-34a、miR-886-5p、miR-106a、miR-124、miR-148a、miR-29a和/或miR-375。这一溶瘤病毒可用于治疗子宫颈癌的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：miR-133a-5p、miR-490-5p、miR-124-3p、miR-137、miR-655-3p、miR-376c-3p、miR-369-5p、miR-490-3p、miR-432-5p、miR-487b-3p、miR-342-3p、miR-223-3p、miR-136-3p、miR-136-3p、miR-143-5p、miR-1-3p、miR-214-3p、miR-143-3p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-451a、miR-127-3p、miR-133a-3p、miR-145-5p、miR-145-3p、miR-199a-5p、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-100、miR-101、miR-126、miR-142-3p、miR-143、miR-145、miR-192、miR-200c、miR-21、miR-214、miR-215、miR-22、miR-25、miR-302a、miR-320、miR-320a、miR-34a、miR-34c、miR-365、miR-373、miR-424、miR-429、miR-455、miR-484、miR-502、miR-503、miR-93、miR-98、miR-186、miR-30a-5p、miR-627、let-7a、miR-1、miR-124、miR-125a、miR-129、miR-1295b-3p、miR-1307、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-137、miR-138、miR-139、miR-139-5p、miR-140-5p、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150-5p、miR-154、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-18a、miR-191、miR-193a-5p、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-198、miR-199a-5p、miR-203、miR-204-5p、miR-206、miR-212、miR-218、miR-224、miR-24-3p、miR-26b、miR-27a、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-29b、miR-30a-3p、miR-30b、miR-328、miR-338-3p、miR-342、miR-345、miR-34a-5p、miR-361-5p、miR-375、miR-378、miR-378a-3p、miR-378a-5p、miR-409-3p、miR-422a、miR-4487、miR-483、miR-497、miR-498、miR-518a-3p、miR-551a、miR-574-5p、miR-625、miR-638、miR-7、miR-96-5p、miR-202-3p、miR-30a和/或miR-451。这一溶瘤病毒可用于治疗结肠或结肠直肠癌的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：miR-101、miR-130a、miR-130b、miR-134、miR-143、miR-145、miR-152、miR-205、miR-223、miR-301a、miR-301b、miR-30c、miR-34a、miR-34c、miR-424、miR-449a、miR-543和/或miR-34b。这一溶瘤病毒可用于治疗子宫内膜癌的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：miR-125b、miR-138、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-16-1、miR-16-1-3p、miR-16-2、miR-181a、miR-181b、miR-195、miR-223、miR-29b、miR-34b、miR-34c、miR-424、miR-10a、miR-146a、miR-150、miR-151、miR-155、miR-2278、miR-26a、miR-30e、miR-31、miR-326、miR-564、miR-27a、let-7b、miR-124a、miR-142-3p、let-7c、miR-17、miR-20a、miR-29a、miR-30c、miR-720、miR-107、miR-342、miR-34a、miR-202、miR-142-5p、miR-29c、miR-145、miR-193b、miR-199a、miR-214、miR-22、miR-137和/或miR-197。这一溶瘤病毒可用于治疗血液癌症的方法和组合物中。在一些实施方案中，血液癌是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：miR-1、miR-145、miR-1826、miR-199a、miR-199a-3p、miR-203、miR-205、miR-497、miR-508-3p、miR-509-3p、let-7a、let-7d、miR-106a*、miR-126、miR-1285、miR-129-3p、miR-1291、miR-133a、miR-135a、miR-138、miR-141、miR-143、miR-182-5p、miR-200a、miR-218、miR-28-5p、miR-30a、miR-30c、miR-30d、miR-34a、miR-378、miR-429、miR-509-5p、miR-646、miR-133b、let-7b、let-7c、miR-200c、miR-204、miR-335、miR-377和/或miR-506。这一溶瘤病毒可用于治疗肾癌的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-105、miR-122、miR-122a、miR-1236、miR-124、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-1271、miR-128-3p、miR-129-5p、miR-130a、miR-130b、miR-133a、miR-134、miR-137、miR-138、miR-139、miR-139-5p、miR-140-5p、miR-141、miR-142-3p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-148a、miR-148b、miR-150-5p、miR-15b、miR-16、miR-181a-5p、miR-185、miR-188-5p、miR-193b、miR-195、miR-195-5p、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a-5p、miR-199b、miR-199b-5p、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-203、miR-204-3p、miR-205、miR-206、miR-20a、miR-21、miR-21-3p、miR-211、miR-212、miR-214、miR-217、miR-218、miR-219-5p、miR-22、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-29b-1、miR-29b-2、miR-29c、miR-302b、miR-302c、miR-30a、miR-30a-3p、miR-335、miR-338-3p、miR-33a、miR-34a、miR-34b、miR-365、miR-370、miR-372、miR-375、miR-376a、miR-377、miR-422a、miR-424、miR-424-5p、miR-433、miR-4458、miR-448、miR-450a、miR-451、miR-485-5p、miR-486-5p、miR-497、miR-503、miR-506、miR-519d、miR-520a、miR-520b、miR-520c-3p、miR-582-5p、miR-590-5p、miR-610、miR-612、miR-625、miR-637、miR-675、miR-7、miR-877、miR-940、miR-941、miR-98、miR-99a、miR-132和/或miR-31。这一溶瘤病毒可用于治疗肝癌的方法和组合物中。在一些实施方案中，肝癌是肝细胞癌。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：miR-143-3p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-1266-3p、miR-6130、miR-6080、miR-511-5p、miR-143-5p、miR-223-5p、miR-199b-5p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-451a、miR-142-5p、miR-144、miR-150-5p、miR-142-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-199a-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-1297、miR-141、miR-145、miR-16、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-29b、miR-381、miR-409-3p、miR-429、miR-451、miR-511、miR-99a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-1、miR-101、miR-133b、miR-138、miR-142-5p、miR-144、miR-1469、miR-146a、miR-153、miR-15a、miR-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-182、miR-192、miR-193a-3p、miR-194、miR-195、miR-198、miR-203、miR-217、miR-218、miR-22、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-29c、miR-33a、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-365、miR-449a、miR-449b、miR-486-5p、miR-545、miR-610、miR-614、miR-630、miR-660、miR-7515、miR-9500、miR-98、miR-99b、miR-133a、let-7a、miR-100、miR-106a、miR-107、miR-124、miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-126、miR-126*、miR-129、miR-137、miR-140、miR-143、miR-146b、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-152、miR-154、miR-155、miR-17-5p、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b、miR-181b-1、miR-181b-2、miR-181c、miR-181d、miR-184、miR-186、miR-193b、miR-199a、miR-204、miR-212、miR-221、miR-224、miR-27a、miR-27b、miR-29a、miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-32、miR-335、miR-338-3p、miR-340、miR-342-3p、miR-361-3p、miR-373、miR-375、miR-4500、miR-4782-3p、miR-497、miR-503、miR-512-3p、miR-520a-3p、miR-526b、miR-625*和/或miR-96。这一溶瘤病毒可用于治疗肺癌的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：let-7b、miR-101、miR-125b、miR-1280、miR-143、miR-146a、miR-146b、miR-155、miR-17、miR-184、miR-185、miR-18b、miR-193b、miR-200c、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-20a、miR-211、miR-218、miR-26a、miR-31、miR-33a、miR-34a、miR-34c、miR-376a、miR-376c、miR-573、miR-7-5p、miR-9和/或miR-98。这一溶瘤病毒可用于治疗黑色素瘤的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：let-7d、miR-218、miR-34a、miR-375、miR-494、miR-100、miR-124、miR-1250、miR-125b、miR-126、miR-1271、miR-136、miR-138、miR-145、miR-147、miR-148a、miR-181a、miR-206、miR-220a、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-32、miR-323-5p、miR-329、miR-338、miR-370、miR-410、miR-429、miR-433、miR-499a-5p、miR-503、miR-506、miR-632、miR-646、miR-668、miR-877和/或miR-9。这一溶瘤病毒可用于治疗口腔癌的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：let-7i、miR-100、miR-124、miR-125b、miR-129-5p、miR-130b、miR-133a、miR-137、miR-138、miR-141、miR-145、miR-148a、miR-152、miR-153、miR-155、miR-199a、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-212、miR-335、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-409-3p、miR-411、miR-429、miR-432、miR-449a、miR-494、miR-497、miR-498、miR-519d、miR-655、miR-9、miR-98、miR-101、miR-532-5p、miR-124a、miR-192、miR-193a和/或miR-7。这一溶瘤病毒可用于治疗卵巢癌的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：miR-216a-5p、miR-802、miR-217、miR-145-3p、miR-143-3p、miR-451a、miR-375、miR-214-3p、miR-216b-3p、miR-432-5p、miR-216a-3p、miR-199b-5p、miR-199a-5p、miR-136-3p、miR-216b-5p、miR-136-5p、miR-145-5p、miR-127-3p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-559、miR-129-2-3p、miR-4507、miR-1-3p、miR-148a-3p、miR-101、miR-1181、miR-124、miR-1247、miR-133a、miR-141、miR-145、miR-146a、miR-148a、miR-148b、miR-150*、miR-150-5p、miR-152、miR-15a、miR-198、miR-203、miR-214、miR-216a、miR-29c、miR-335、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-373、miR-375、miR-410、miR-497、miR-615-5p、miR-630、miR-96、miR-132、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-126、miR-135a、miR-143、miR-144、miR-150、miR-16、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-217、miR-218、miR-337、miR-494和/或miR-98。这一溶瘤病毒可用于治疗胰腺癌的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：let-7a-3p、let-7c、miR-100、miR-101、miR-105、miR-124、miR-128、miR-1296、miR-130b、miR-133a-1、miR-133a-2、miR-133b、miR-135a、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-154、miR-15a、miR-187、miR-188-5p、miR-199b、miR-200b、miR-203、miR-205、miR-212、miR-218、miR-221、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-29b、miR-302a、miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d、miR-30e、miR-31、miR-330、miR-331-3p、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-374b、miR-449a、miR-4723-5p、miR-497、miR-628-5p、miR-642a-5p、miR-765和/或miR-940。这一溶瘤病毒可用于治疗前列腺癌的方法和组合物中。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含针对以下的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的5’UTR或3’UTR中：miR-101、miR-183、miR-204、miR-34a、miR-365b-3p、miR-486-3p和/或miR-532-5p。这一溶瘤病毒可用于治疗成视网膜细胞瘤的方法和组合物中。
在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒是单纯疱疹病毒且其中病毒复制所需的一个或多个病毒基因选自由以下组成的组：UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。
在一些情形下，本发明的重组病毒载体是单纯疱疹病毒(HSV)且进一步包含内部重复(接头)区的缺失，所述内部重复区包含二倍体基因ICP0、ICP34.5、LAT和ICP4以及ICP47基因的启动子各一个拷贝。
在某些实施方案中，本发明的重组病毒载体是展现通过直接感染和/或侧向扩散来促进进入细胞中的HSV。在一方面，本发明的HSV载体可通过与除HSV感染的典型介体外(例如除连接素-1、HVEM或硫酸乙酰肝素/硫酸软骨素蛋白多糖外)的细胞蛋白质相互作用来直接感染细胞。在某些实施方案中，本发明的重组病毒载体是HSV且进一步包含有利于载体通过非典型受体进入的gB或gH基因的突变。在另一方面，本发明提供HSV载体，该载体进一步包含在通常对HSV侧向扩散具有抗性的细胞，如缺乏gD受体的细胞中展现侧向扩散的突变体gH糖蛋白。在一些实施方案中，本发明的HSV载体包含如美国专利公开第2013/0096186号中所述的突变体gB或gH蛋白质中的一种或多种，该案以引用方式并入本文中。在某些方面，HSV载体内的突变体进入蛋白是与病毒进入有关的糖蛋白，如gB、gH，并且突变体HSV载体可包含二者的突变形式。然而，突变体进入蛋白可以是实现HSV载体进入细胞中的任何蛋白质。在某些实施方案中，突变体进入蛋白不是gD，不过，HSV载体可另外包含突变体gD，如含有配体或其它期望突变的突变体gD。用于本发明的HSV载体中的gB或gH糖蛋白的非限制性突变出现在以下残基中的一个或多个处：gB：D285、gB：A549、gB：S668、gH：N753及gH：A778。在一些实施方案中，本发明的HSV载体包含在gB：D285和gB：A549处、在gH：N753和gH：A778处，和/或在gB：S668、gH：N753和gH：A778中每一个处的突变。在某些实施方案中，HSV载体含有这些突变中的两个或更多个(例如3个或更多个、4个或更多个)，并且HSV载体可包含全部五个所述残基的突变。在一个实施方案中，HSV载体具有在gB：285、gB；549、gH：753及gH：778处的突变。突变在本文中是相对于HSV-1病毒株KOS衍生物K26GFP的gD、gB和gH基因的密码子(氨基酸)编号来提及。K26GFP的gB和gH序列不同于GenBank(编号AF311740(以引用方式并入本文中))中所公开的gB序列和下表中所反映的gH序列(GenBank编号X03896(以引用方式并入本文中))：
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然而，K26GFP可以在对应于GenBank X03896的核苷酸2,079-2,102的基因区域中含有额外差异。因此，应理解，KOS衍生物K26GFP或GenBank登录号AF311740的序列可用作本文论述的gB突变的参照序列。另外KOS衍生物K26GFP或GenBank登录号X03896可用作本文论述的gH突变的参照序列。然而，本发明的HSV载体可包括任何HSV病毒株的gB和gH中的同源突变。
在一些方面，纳入HSV载体中的进入蛋白的突变是取代突变；然而，突变不限于取代突变体。在某些实施方案中，用于HSV载体中的突变体gB或gH糖蛋白选自由以下组成的取代突变组：gB：D285N、gB：A549T、gB：S668N、gH：N753K、gH：A778V。在某些方面，HSV载体包括这些取代的组合(如这些取代中的两个或更多个(例如3个或更多个、4个或更多个，或全部))，其中gB：D285N/gB：A549T双重突变体、gH：N753K/gH：A778V双重突变体和gB：S668N/gH：N753K/gH：A778V三重突变体是实施方案的实例。在一个实施方案中，HSV载体包含gB：D285N/gB：A549T/gH：N753K/gH：A778V。
在某些方面，HSV载体包含突变体gB和/或突变体gH糖蛋白，其中糖蛋白中的突变是至少2个残基的取代突变，其中当载体是HSV-1K26GFP时，所述至少2个残基选自由gB：D285、gB：A549、gB：S668、gH：N753及gH：A778组成的组，或其中当载体是同源HSV时，所述至少2个残基选自与gB：D285、gB：A549、gB：S668、gH：N753及gH：A778相关的氨基酸，其中gB：D285残基与VYPYXEFVL(SEQ ID NO：1)中的X相关，gB：A549残基与KLNPNXIAS(SEQ ID NO：2)中的X相关，gB：S668残基与ITTVXTFID(SEQ ID NO：3)中的X相关，gH：N753残基与VDTDXTQQQ(SEQ ID NO：4)中的X相关，且gH：A778残基与VPSTXLLLF(SEQ ID NO：5)中的X相关；并且其中HSV载体是HSV-1或HSV-2载体。
在一方面，本发明涵盖一种重组溶瘤病毒，其包含至少一个编码蛋白质或寡核苷酸(例如shRNA、诱饵寡核苷酸或antagomir)的聚核苷酸，该蛋白质或寡核苷酸降低miRNA、基因或金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的表达或抑制其功能。此类重组溶瘤病毒在本文中称作“基因组编辑”或“微环境重塑”病毒或载体。所编码的蛋白质或寡核苷酸可以通过多种方式降低miRNA、基因或TIMP的表达或抑制其功能，这些方式包括靶向蛋白质(例如TIMP)以实现降解(例如，通过泛素化和蛋白酶体降解或靶向溶酶体降解)；阻断与同源受体的相互作用(例如阻断抗体或其抗原结合片段或肽抑制剂)；降解信使RNA转录物(例如短干扰RNA或短发夹RNA)；和/或改变编码特定miR、基因或蛋白质的基因组DNA序列(例如，通过内切核酸酶)。
在特定实施方案中，蛋白质或寡核苷酸降低致癌作用或转移所涉及的miR或基因(例如致癌miR或致癌基因)的表达。在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含至少一个编码蛋白质或寡核苷酸的聚核苷酸，该蛋白质或寡核苷酸降低作为致癌miRNA的miRNA(例如表4中所列miRNA中的一个或多个)的表达或功能。在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个编码降低致癌miRNA的表达或功能的蛋白质或寡核苷酸的聚核苷酸。在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个编码降低多个致癌miRNA的表达或功能的多种蛋白质或寡核苷酸的聚核苷酸。在一些实施方案中，所述蛋白质或寡核苷酸降低miR-17-92的表达且用于治疗肺癌(例如小细胞肺癌)。在其它实施方案中，所述蛋白质或寡核苷酸降低miR-221和/或miR-21的表达且用于治疗成胶质细胞瘤。在某些实施方案中，所述蛋白质或寡核苷酸降低miR-155和/或miR-17-92的表达且用于治疗淋巴瘤(例如伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤或慢性淋巴细胞性白血病)。在一些实施方案中，所述蛋白质或寡核苷酸降低miR-221、miR-222和/或miR-146的表达且用于治疗甲状腺癌。在一些实施方案中，所述蛋白质或寡核苷酸降低miR-372和/或miR-373的表达且用于治疗睾丸癌(例如睾丸生殖细胞肿瘤)。在一些实施方案中，所述蛋白质或寡核苷酸降低miR-18和/或miR-224的表达且用于治疗肝癌(例如肝细胞癌)。
在一些实施方案中，本文所述的重组病毒载体可用于降解肿瘤细胞外基质(ECM)，在一些方面，其使病毒扩散增加。基质金属蛋白酶(MMP)是锌依赖性蛋白酶，基于其活性可分类成胶原酶、明胶酶、基质降解酶及基质溶解因子。这些蛋白酶一般以前酶(酶原)形式分泌并通过蛋白水解移除前肽前结构域而被活化。MMP在癌症中的主要作用是降解ECM，由此促进肿瘤侵袭和转移。MMP也参与肿瘤进展、上皮间质转化(EMT)和血管生成。MMP是通过miRNA以及TIMP进行调控，TIMP包含由四种蛋白酶抑制剂(TIMP1、TIMP2、TIMP3及TIMP4)构成的家族。通过利用本发明的重组病毒载体破坏负调控MMP家族的miRNA或TIMP，可以降解多种肿瘤微环境。miRNA/MMP相互作用的实例示于表5中。这些相互作用中有许多显示，多种MMP是由单一miRNA调控的：例如let-7调控MMP-2、MMP-9及MMP-14；miR-143调控MMP-2、MMP-9及MMP-13；miR-218调控MMP-2、MMP-7及MMP-9。此外，绝大多数MMP可由单一TIMP主开关调控：例如，已知TIMP1可抑制几乎所有已知的MMP，而且还促进多种细胞类型的细胞增殖；TIMP2与MMP-14和MMP-2相互作用。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含至少一个编码蛋白质或寡核苷酸的聚核苷酸，该蛋白质或寡核苷酸降低作为微环境重塑miRNA的miRNA(例如表5中所列举的miRNA中的一个或多个)的表达或功能。在一些实施方案中，所述蛋白质或寡核苷酸降低一种微环境重塑miRNA的表达或功能。在一些实施方案中，所述蛋白质或寡核苷酸降低至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种微环境重塑miRNA的表达或功能。在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含了编码多种蛋白质或寡核苷酸的多种聚核苷酸，该多种蛋白质或寡核苷酸降低多种微环境重塑miRNA的表达或功能。在一些实施方案中，本发明的重组病毒载体可以利用本文所述的策略敲减或破坏负调控MMP的miRNA或TIMP的表达或功能。在一些实施方案中，重组溶瘤病毒降低选自TIMP1、TIMP2、TIMP3及TIMP4的TIMP的表达。
在一些实施方案中，本文所述的重组溶瘤病毒包含至少一个编码降低基因的表达或功能的蛋白质或寡核苷酸的聚核苷酸。在一些方面，基因是致癌基因(例如选自表7中所列举的基因的基因)。在一些方面，基因编码致癌miR(例如表4中所列举的miRNA)、微环境重塑miR(例如表5中所列举的miRNA)或ECM降解的负调控剂(例如TIMP)。基因表达和/或功能的降低可在转录水平上(例如，使基因组DNA序列突变、缺失或沉默)或在翻译水平上(例如，通过经由mRNA降解抑制基因产物的产生)实现。在一些实施方案中，本文所述的重组溶瘤病毒包含一个或多个编码核酸酶的聚核苷酸，该核酸酶通过实现基因序列的突变、缺失或转录阻遏来降低基因的表达或功能。在具体实施方案中，核酸酶选自成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关内切核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)。在非限制性实施例中，CRISPR相关内切核酸酶选自SpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9-HF2、SpCas9-HF3、SpCas9-HF4、SaCas9、FnCpf、FnCas9、eSpCas9、C2C1、C2C3、Cpf1、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1及Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csxl5、Csf1、Csf2、Csf3及Csf4。
本发明的重组病毒载体可利用CRISPR(成簇规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)核酸酶系统，该系统是基于可用于哺乳动物基因组工程改造的细菌系统的经过工程改造的核酸酶系统。通常，所述系统包含Cas核酸酶和向导RNA(gRNA)。gRNA包括两个部分；对靶基因组DNA序列具有特异性的crispr-RNA(crRNA)及有利于Cas结合的tracr RNA(trRNA)。crRNA和trRNA可以单独RNA寡核苷酸形式存在，或可存于同一RNA寡核苷酸中，称作单一向导-RNA(sgRNA)。如本文所使用的术语“向导RNA”或“gRNA”是指个别trRNA与个别crRNA或sgRNA的组合。例如，参见Jinek等人(2012)Science 337：816-821；Cong等人(2013)Science 339：819-823；Mali等人(2013)Science 339：823-826；Qi等人(2013)Cell 152：1173-1183；Jinek等人(2013)，eLife 2：e00471；David Segal(2013)eLife 2：e00563；Ran等人(2013)Nature Protocols 8(11)：2281-2308；Zetsche等人(2015)Cell 163(3)：759-771；PCT公开第WO 2007/025097号、第WO 2008/021207号、第WO 2010/011961号、第WO2010/054108号、第WO 2010/054154号、第WO 2012/054726号、第WO 2012/149470号、第WO2012/164565号、第WO 2013/098244号、第WO 2013/126794号、第WO 2013/141680号及第WO2013/142578号；美国专利公开第2010-0093617号、第2013-0011828号、第2010-0257638号、第2010-0076057号、第2011-0217739号、第2011-0300538号、第2013-0288251和第2012-0277120号；及美国专利第8，546，553号，其各自以全文引用方式并入本文中。
已鉴别出多种1类CRISPR-Cas系统，包括I型和III型系统，并在功能上详细表征，揭露出效应物复合物的复杂架构和动力学(Brouns等人，2008，Marraffini及Sontheimer，2008，Hale等人，2009，Sinkunas等人，2013，Jackson等人，2014，Mulepati等人，2014)。另外，也已鉴别出利用Cas9家族的同源RNA引导的内切核酸酶作为效应物的若干2类-II型CRISPR-Cas系统，并以实验方式表征(Barrangou等人，2007，Gameau等人，2010，Deltcheva等人，2011，Sapranauskas等人，2011，Jinek等人，2012，Gasiunas等人，2012)。最近在若干细菌基因组中鉴别出另一推定的2类-V型CRISPR-Cas系统。推定的V型CRISPR-Cas系统含有约1,300个氨基酸的较大蛋白质，称作Cpf1(来自普氏菌(Prevotella)和弗朗西斯氏菌属1(Francisella1))的CRISPR)。
在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒还包含至少一个编码靶向miRNA或TIMP的trRNA和crRNA的聚核苷酸。在一些情形中，至少一个编码trRNA和crRNA的聚核苷酸插入病毒基因组上的基因座中。在一些实施方案中，聚核苷酸是构成合成隔离物(syntheticinsulator)或天然病毒(例如HSV)隔离物的隔离序列。在某些实施方案中，溶瘤病毒是单纯疱疹病毒且至少一个编码RNA结合位点的聚核苷酸被插入一个或多个基因座中或其间，所述基因座包括内部重复接头区(包含二倍体基因ICP0、ICP34.5、LAT、ICP4、以及ICP47启动子各一个拷贝)、ICP0、LAT、UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。在一个实施方案中，溶瘤病毒是单纯疱疹病毒(HSV)且至少一个编码RNA结合位点的聚核苷酸被插入UL3与UL4开放阅读框之间的基因座中(例如图45和图46)。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含至少一个编码蛋白质的聚核苷酸，该蛋白质是双特异性T细胞接合器(BiTE)、抗免疫抑制性蛋白或免疫原性抗原。如本文所用的“抗免疫抑制性蛋白”是抑制免疫抑制路径的蛋白质。本发明涵盖表达抗免疫抑制性蛋白的溶瘤病毒，该抗免疫抑制性蛋白是抗调节T细胞(Treg)蛋白或抗骨髓源性抑制性细胞(MDSC)蛋白。在一些实施方案中，抗免疫抑制性蛋白是VHH源性阻断剂或VHH源性BiTE。如本文所用，“免疫原性抗原”是指增加发炎性或免疫原性免疫反应的蛋白质。在特定实施方案中，抗免疫抑制性和免疫原性抗原诱导抗肿瘤免疫反应。此类蛋白质的实例包括结合并抑制免疫检查点受体(例如CTLA4、LAG3、PD1、PDL1等)的抗体或其抗原结合片段；促炎性细胞因子(例如IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8、GM-CSF等)；或结合活化受体(例如FcγRI、FcγIIa、FcγIIIa、共刺激受体等)并使其活化的蛋白质。在特定实施方案中，所述蛋白质选自EpCAM、叶酸、IFNβ、抗CTLA_4、抗PD1、A2A、抗FGF2、抗FGFR/FGFR2b、抗SEMA4D、CCL5、CD137、CD200、CD38、CD44、CSF-1R、CXCL10、CXCL13、内皮素B受体、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-35、ISRE7、LFA-1、NG2(也称为SPEG4)、SMAD、STING、TGFβ及VCAM1。
在某些实施方案中，将编码被靶向以降低miRNA、基因或TIMP的表达的蛋白质或寡核苷酸的聚核苷酸插入重组溶瘤病毒的病毒基因组上的基因座中。在一些实施方案中，所述聚核苷酸是包含合成隔离物或天然病毒(例如HSV)隔离物的隔离序列。在某些实施方案中，溶瘤病毒是单纯疱疹病毒且至少一个编码RNA结合位点的聚核苷酸被插入一个或多个基因座中或其间，所述基因座包括内部重复接头区(包含二倍体基因ICP0、ICP34.5、LAT、ICP4以及ICP47启动子各一个拷贝)、ICP0、LAT、UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。在一个实施方案中，病毒是单纯疱疹病毒(HSV)且所述至少一个聚核苷酸被插入UL3与UL4开放阅读框之间的基因座中(例如参见图45和图46)。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含至少一种蛋白酶活化的抗体。所述蛋白酶活化的抗体，如Metz等人(Protein Eng Des Sel，25(10)：571-80，2012)所述的那些抗体，被活化并在蛋白酶裂解保护盖之后仅结合至靶标。在一些情况下，肿瘤微环境具有与周围健康组织充分区分开的一系列蛋白酶。例如，蛋白酶组织蛋白酶B在多种癌症中过度表达，包括乳癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及甲状腺癌。包括人类细胞所合成的蛋白酶的完整清单的人类降解组由至少569种蛋白酶构成，这些蛋白酶分成五个广泛类别(按数目从最大到最少排序)：金属蛋白酶(MMP)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶及天冬氨酸蛋白酶(Lopez-Otin等人，Nat Rev Cancer，7(10)：800-8，2007)。确切地说，被MMP特异性裂解的蛋白酶抗体可用作使本文所述的重组病毒载体靶向肿瘤微环境的一种优良方式，因为在细胞的细胞外区域和细胞周围区域中都发现MMP。表6概述了在癌症中过度表达的蛋白酶，这些蛋白酶可用于实现用蛋白酶活化的抗体假型化的重组病毒载体的特异性结合。
在某些实施方案中，将蛋白酶活化的抗体并入病毒糖蛋白包膜中。蛋白酶活化的抗体可并入本发明的重组病毒载体(例如HSV载体)的糖蛋白包膜中以增加治疗指数并减少脱靶感染。在HSV载体的情形中，在一些实施方案中，糖蛋白可以是gC或gD。在一些实施方案中，本文所述的重组溶瘤病毒包含至少一个编码蛋白酶活化的抗体的聚核苷酸。在某些实施方案中，所述蛋白酶活化的抗体被选自以下的蛋白酶活化：半胱氨酸组织蛋白酶、天冬氨酸组织蛋白酶、激肽释放酶(hK)、丝氨酸蛋白酶、半胱天冬酶、基质金属蛋白酶(MMP)及解整合素和金属蛋白酶(ADAM)。在一些实施方案中，蛋白酶选自组织蛋白酶K、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、组织蛋白酶E、组织蛋白酶D、hK1、PSA(hK3)、hK10、hK15、uPA、uPAR、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-18、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP-23A、MMP-23B、MMP-24、MMP-25、MMP-26、MMP-27、MMP-28或表6中所列举的蛋白酶。
在一些实施方案中，蛋白酶活化的抗体结合癌细胞或在癌症微环境中表达的蛋白质，所述癌细胞或在癌症微环境中该蛋白质的表达量高于非癌症细胞或在非癌症微环境中。在某些方面，蛋白酶活化的抗体结合NKG2D、c-met、HGFR、CD8、硫酸乙酰肝素、VSPG4(也称为NG2)、EGFR、EGFRvIII、CD133、CXCR4、癌胚抗原(CEA)、CLC-3、膜联蛋白II、人类运铁蛋白受体或EpCAM。在某些情况下，多种蛋白酶活化的抗体可并入单一病毒载体粒子中以确保靶向不同肿瘤组织型。例如，至少1、2、3、4、6、7、8、9、10种或更多种蛋白酶活化的抗体可并入病毒糖蛋白包膜中。在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种蛋白酶活化的抗体的聚核苷酸。在一些实施方案中，溶瘤病毒包含第一蛋白酶活化的抗体，该抗体结合癌细胞或在癌症微环境中的表达量高于非癌症细胞或在非癌症微环境中的第一蛋白质；以及第二蛋白酶活化的抗体，该抗体结合癌细胞或在癌症微环境中的表达量高于非癌症细胞或在非癌症微环境中的第二蛋白质。在其它实施方案中，溶瘤病毒包含多种蛋白酶活化的抗体，这些抗体结合癌细胞或在癌症微环境中的表达量高于非癌症细胞或在非癌症微环境中的多种蛋白质。溶瘤病毒包含的蛋白酶活化的抗体例如是人类抗体、人类化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，溶瘤病毒包含的抗体是全长免疫球蛋白、scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、双价抗体、三价抗体、微型抗体、单结构域抗体或多特异性抗体。
在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含以下一种或多种：插入病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中的一个或多个肿瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列；一个或多个编码一种或多种蛋白质或寡核苷酸的聚核苷酸，其中所述蛋白质或寡核苷酸降低miR、基因或TIMP的表达或抑制其功能；至少一种蛋白酶活化的抗体；和/或编码至少一种蛋白酶活化的抗体的聚核苷酸。在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含：插入非癌症细胞中病毒复制所需的病毒基因的基因座中的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝；和/或编码被靶向以降低致癌miRNA或致癌基因的表达的蛋白质或寡核苷酸的第一聚核苷酸；和/或编码被靶向以降低微环境重塑miRNA或TIMP的表达的蛋白质或寡核苷酸的第二聚核苷酸。在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含：插入非癌症细胞中病毒复制所需的病毒基因的基因座中的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝；和/或编码被靶向以降低致癌miRNA或致癌基因的表达的蛋白质或寡核苷酸的聚核苷酸；和/或至少一种蛋白酶活化的抗体。在其它实施方案中，重组溶瘤病毒包含插入非癌症细胞中病毒复制所需的病毒基因的基因座中的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝；和/或编码被靶向以降低微环境重塑miRNA或TIMP的表达的蛋白质或寡核苷酸的聚核苷酸；和/或至少一种蛋白酶活化的抗体。在一个实施方案中，重组溶瘤病毒包含插入非癌症细胞中病毒复制所需的病毒基因的基因座中的一个或多个肿瘤抑制性miRNA靶序列的多个拷贝；和/或编码被靶向以降低致癌miRNA或致癌基因的表达的蛋白质或寡核苷酸的第一聚核苷酸；和/或编码被靶向以降低微环境重塑miRNA或TIMP的表达的蛋白质或寡核苷酸的第二聚核苷酸；和/或至少一种蛋白酶活化的抗体。在一些具体实施方案中，本段中所述的溶瘤病毒是单纯疱疹病毒并且非癌症细胞中病毒复制所需的病毒基因是UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。
在某些方面，本发明涉及重组溶瘤病毒，其包含编码被靶向以降低致癌miRNA或致癌基因的表达的蛋白质或寡核苷酸的第一聚核苷酸；以及编码被靶向以降低微环境重塑miRNA或TIMP的表达的蛋白质或寡核苷酸的第二聚核苷酸。在其它实施方案中，重组溶瘤病毒包含了编码被靶向以降低致癌miRNA或致癌基因的表达的蛋白质或寡核苷酸的聚核苷酸；和至少一种蛋白酶活化的抗体。在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含编码被靶向以降低微环境重塑miRNA或TIMP的表达的蛋白质或寡核苷酸的聚核苷酸；和至少一种蛋白酶活化的抗体。在一个实施方案中，重组溶瘤病毒包含了编码被靶向以降低致癌miRNA或致癌基因的表达的蛋白质或寡核苷酸的第一聚核苷酸；和/或编码被靶向以降低微环境重塑miRNA或TIMP的表达的蛋白质或寡核苷酸的第二聚核苷酸；和/或至少一种蛋白酶活化的抗体。
在某些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒是疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒(例如HSV-1或HSV-2))、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒、正粘液病毒、小病毒、马拉巴病毒或柯萨奇病毒。基于HSV的载体及其构筑方法描述于以下中：例如美国专利第7,078,029号、第6,261,552号、第5,998,174号、第5,879,934号、第5,849,572号、第5,849,571号、第5,837,532号、第5,804,413号及第5,658,724号及国际专利申请WO91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637及WO 99/06583，其以全文引用方式并入本文中。已公开HSV的序列(NCBI登录号NC_001806；也参见McGoech等人，J.Gen.Virol，69(PT 7)，1531-1574(1988))，该序列可有利于设计本发明的基于HSV的载体。
本发明也涵盖编码本文所述的溶瘤病毒的核酸分子。
组合物及使用方法
本发明的某些方面涉及包含本文所述的溶瘤病毒的原液和组合物。在一些方面，本发明涉及包含本文所述的溶瘤病毒的病毒原液。在一些实施方案中，病毒原液是均相原液。病毒原液的制备和分析是本领域众所周知的。例如，病毒原液可在含有被病毒载体转导的细胞的滚瓶中制造。随后，可将病毒原液以连续nycodenze梯度纯化，并且分成数等份并储存待用。病毒原液的效价变化相当大，这在很大程度上取决于病毒基因型以及用于制备这些原液的方案和细胞系。
在特定实施方案中，本文涵盖的病毒原液(例如基于HSV的载体病毒原液)的效价是至少约105个噬菌斑形成单位(pfu)，例如至少约106pfu或甚至更优选至少约107pfu。在某些实施方案中，效价可以是至少约108pfu或至少约109pfu，并且最优选至少约1010pfu或至少约1011pfu的高效价原液。
本发明进一步涵盖包含本文所述的溶瘤病毒或核酸分子和药学上可接受的载剂的组合物。短语“药学上可接受的”是指在施用给受试者(例如人类)时不会产生过敏或类似不利反应的分子实体和组合物。如本文所使用的术语“组合物”是指一种或多种本文所述的能施用或递送给受试者和/或细胞的溶瘤病毒或核酸分子的配制物。通常，配制物包括所有生理上可接受的组合物，包括其衍生物和/或前药、溶剂化物、立体异构体、外消旋物或互变异构体与任何生理上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。“治疗组合物”或“药物组合物”(在本文中可互换使用)是用于治疗特定疾病或病症的一种或多种能施用或递送给患者和/或受试者和/或细胞的剂的组合物。
本文公开的组合物可以中性或盐形式配制。“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两种。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且是与以下酸形成：无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等；和有机酸，如但不限于乙酸、2，2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1，2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖醛酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲磺酸、粘酸、萘-1，5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、柳酸、4-氨基柳酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等等。与游离羧基形成的盐还可衍生自无机碱，例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等等。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下各物的盐：伯胺、仲胺和叔胺；包括天然存在的被取代胺在内的被取代的胺；环状胺和碱性离子交换树脂，如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、地阿诺(deanol)、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因(caffeine)、普鲁卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星青霉素、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。在配制时，溶液将以与剂量配制物相容的方式并且以治疗有效的量施用。这些配制物易于以多种剂型，如以可注射溶液、药物释放胶囊等等形式施用。
如本文所用，“载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶体等等。本领域众所周知这些介质和剂用于药物活性物质的应用。除非任何常规介质或剂与活性成份不相容，否则涵盖其于治疗组合物中的应用。也可将补充活性成分并入组合物中。
如本文所用“药学上可接受的载剂”包括但不限于生理上相容的任何佐剂、载剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等，包括已被美国食品药品管理局(United States Food and DrugAdministration)批准为可接受用于人类和/或家畜中的药学上可接受的细胞培养基和/或乳化剂。示例性药学上可接受的载剂包括但不限于糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂、蜡、动物和植物脂肪、石蜡、硅酮、膨润土、硅酸、氧化锌；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原质水；等渗生理盐水；林格氏溶液(Ringer′s solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及用于药物配制物中的任何其它相容的物质。除非任何常规介质和/或试剂与本公开的剂都不相容，否则本发明涵盖其在治疗组合物中的应用。也可将补充活性成分并入组合物中。
润湿剂、乳化剂和润滑剂(如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、释放剂、包衣、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血基酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等；及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。
在一个实施方案中，包含载剂的组合物适于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌肉内施用。药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散液以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。本领域众所周知这些介质和剂在药物活性物质中的使用。除非任何常规介质或剂与病毒载体或核酸分子不相容，否则涵盖其于本发明的药物组合物中的使用。
本发明的组合物可包含被配制成药学上可接受或生理上可接受的溶液形式的一种或多种如本文所述的多肽、聚核苷酸、包含其的载体、受感染细胞等，以单独施用或与一种或多种其它治疗方法组合施用给细胞或动物。还应理解，必要时，本发明的组合物也可与其它剂，如细胞因子、生长因子、激素、小分子或各种药物活性剂组合施用。关于也可包括在组合物中的其它组分实质上无限制，只要这些其它剂不会不利地影响组合物递送预定疗法的能力即可。
在本发明的药物组合物中，药学上可接受的赋形剂和载剂溶液的配制，以及有关在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的适合投药和治疗方案的开发是本领域技术人员众所周知的。在配制时，溶液是以与剂量配制物相容的方式并且以在治疗上有效改善或医治症状的量施用。所述配制物易于以多种剂型，如以可摄取溶液、药物释放胶囊等等形式施用。取决于所治疗受试者的疾患，在剂量上可发生一定变化。无论在何种情况下，负责用药的人员均可确定个别受试者的适当剂量。此外，对于人类施用，制剂应满足由FDA生物制品评估和研究中心(FDA Center for Biologics Evaluation and Research)标准所要求的无菌性、总体安全性和纯度标准。施用途径通常将随所治疗疾病的位置和性质而变化，并且可包括例如真皮内、经皮、真皮下、肠胃外、经鼻、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、透皮、气管内、腹膜内、肿瘤内、灌注、灌洗、直接注射及经口施用。
在某些情况下，如例如美国专利第5,543,158号、美国专利第5,641,515号和美国专利第5,399,363号(其各自以全文引用方式明确地并入本文中)中所述，需要肠胃外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内递送本文公开的组合物、重组病毒载体和核酸分子。呈游离碱或药理学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液可在适当地混有表面活性剂如羟丙基纤维素的水中制备。分散液也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备。在常规储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于即时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利第5,466,468号，其以全文引用方式明确并入本文中)。在所有情况下，该形式应当是无菌的并且其流动性应使其易于注射。其应在制造和储存条件下稳定并且应防止如细菌和真菌等微生物的污染作用。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)、其适宜混合物，和/或植物油。适当流动性可通过例如使用如卵磷脂等包衣、在分散液的情形下通过维持所需粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等来促进对微生物作用的防护。在许多情形中，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用吸收延迟剂，例如单硬脂酸铝和明胶)可以延长可注射组合物的吸收。含有蛋白质作为活性成份的水性组合物的制备是本领域中充分了解的。通常，此类组合物被制备成呈液体溶液或悬浮液形式的可注射剂；也可制备成适于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂还可被乳化。
对于肠胃外施用水溶液，例如，溶液应在必要时适当地被缓冲且液体稀释剂先用足够生理盐水或葡萄糖等渗。这些特定水溶液特别适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就这一点来说，根据本公开，本领域技术人员将了解可以采用的无菌水性介质。例如，可将一次剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中并添加至1000ml皮下灌注液中或在指定输注部位注射(例如，参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版Baltimore，MD：Lippincott Williams&Wilkins，2000)。取决于所治疗受试者的疾患，剂量必然会发生一定变化。无论在何种情况下，负责施用的人员都将确定个别受试者的适当剂量。此外，对于人类施用，制剂应满足由FDA生物制品办公室(FDA Office of Biologics)标准所要求的无菌性、致热原性以及总体安全性和纯度标准。
无菌可注射溶液可通过以下方式制备：将所需量的活性化合物并入视需要含有上文所列举多种其它成份的适当溶剂中，随后进行过滤灭菌。一般来说，分散液是通过将各种灭菌的活性成份并入含有碱性分散介质和所需的来自上文所列举成份的其它成份的无菌媒剂中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术由先前无菌过滤的溶液得到活性成份加任何所需额外成份的粉末。
在某些实施方案中，组合物可通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气雾剂递送媒剂递送。通过鼻气雾剂喷雾将聚核苷酸和肽组合物直接递送至肺的方法描述于例如美国专利第5，756，353号和美国专利第5，804，212号(各自以全文引用方式明确并入本文中)中。同样，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等人，1998)和溶血磷脂酰基-甘油化合物(美国专利第5，725，871号，以全文引用方式明确并入本文中)递送药物也是制药领域众所周知的。同样，呈聚四氟乙烯载体基质形式的经粘膜药物递送描述于美国专利第5，780，045号(以全文引用方式明确并入本文中)中。
在某些实施方案中，递送可通过使用任选地与CPP多肽混合的脂质体、纳米胶囊、微粒、微球体、脂质粒子、囊泡等等进行以将本发明组合物引入适合宿主细胞中。确切地说，本发明组合物可被配制成囊封于脂质粒子、脂质体、囊泡、纳米球、纳米粒子等等中进行递送。此类递送媒剂的配制和使用可以使用已知的常规技术来实施。本发明的配制物和组合物可包含一种或多种如本文所述的多肽、聚核苷酸和小分子，其被配制成药学上可接受或生理上可接受的溶液(例如培养基)形式以单独或与一种或多种其它治疗方法组合施用给细胞或动物。还应理解，必要时，本发明的组合物也可与其它剂，例如细胞、其它蛋白质或多肽或各种药物活性剂组合施用。
在特定实施方案中，本发明的配制物或组合物包含与多种如本文所涵盖的聚核苷酸或病毒载体的组合接触的细胞。
在某些方面，本发明提供适于递送病毒载体系统的配制物或组合物。
用于离体递送的示例性配制物也可包括使用本领域中已知的各种转染剂(如磷酸钙)、电穿孔、热休克及各种脂质体配制物(即，脂质介导的转染)。脂质体是截留一部分水性流体的脂质双层。DNA与阳离子脂质体的外表面自发缔合(根据其电荷)并且这些脂质体将与细胞膜相互作用。
本发明的特定实施方案可包含其它配制物，如制药领域中众所周知且在例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Baltimore，MD：LippincottWilliams&Wilkins，2000描述的那些。
在某些方面，本发明提供药学上可接受的组合物，这些组合物包含与一种或多种药学上可接受的载剂(添加剂)和/或稀释剂(例如药学上可接受的细胞培养基)配制在一起的治疗有效量的一种或多种如本文所述的病毒载体或聚核苷酸。如本文所用，“治疗有效量”是指获得期望的生理和/或生物结果所需的本文所述的组合物或重组病毒的量。病毒、病毒原液或组合物的“治疗有效量”可根据以下因素变化：如疾病状态；个体的年龄、性别和体重；以及干细胞和祖细胞在个体内引起期望的反应的能力。治疗有效量也是治疗有益作用胜过病毒或被转导的治疗细胞的任何有毒或有害作用的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如患者)的量。治疗有效量可通过噬菌斑形成单位(pfu)的总数(例如至少1e1到至少1e20，特别是约1e4至约1e15，更特定地约1e6至约1e12pfu)，或病毒基因组的数目(例如至少1e1到至少1e20，特别是约1e4至约1e15，更特定地约1e6至约1e12个病毒基因组)来定量。本领域技术人员应了解，治疗有效量将基于所施用病毒的类型、配制物的性质、施用途径、待治疗的疾病的性质和/或严重程度，和/或受试者的一般健康和身体状况而变化。
本发明的一些方面涵盖一种杀死癌细胞的方法，该方法包括在足以使溶瘤病毒感染该癌细胞并在该癌细胞内复制的条件下，使该癌细胞暴露于本文所述的溶瘤病毒或其组合物，且其中溶瘤病毒在癌细胞内的复制引起细胞死亡。在某些实施方案中，与非癌症细胞相比，癌细胞中肿瘤抑制性miR的表达量降低。在一些实施方案中，通过此方法杀死的癌细胞是在体内进行的。在某些实施方案中，通过此方法杀死的癌细胞是在肿瘤内进行的。
本发明涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用预防有效量或治疗有效量的如本文所述的溶瘤病毒、病毒原液或组合物。如本文所用，“受试者”包括展现可用本文公开的重组病毒载体、组合物和方法治疗的疾病、病症或疾患的症状的任何动物。适宜受试者(例如患者)包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物(如马或牛)和家畜或宠物(如猫或狗)。包括非人类灵长类动物且优选包括人类患者。
“施用”在本文中是指将溶瘤病毒、病毒原液或其组合物引入受试者体内，或使溶瘤病毒、病毒原液或其组合物与细胞和/或组织接触。施用可通过注射、冲洗、吸入、消耗、电渗透、血液透析、离子电渗以及本领域中已知的其它方法进行。施用途径通常将随所治疗疾病的位置和性质而变化，并且可包括例如经耳、经颊、结膜、经皮、经牙、子宫颈内、窦内(endosinusial)、气管内、经肠、硬膜外、间质、关节内、动脉内、腹内、耳内、胆道内、支气管内、粘液囊内、海绵窦内、大脑内、脑池内、角膜内、冠内、冠状动脉内、颅内、真皮内、盘内、导管内、十二指肠内、十二指肠内、硬膜内、心外膜内、表皮内、食管内、胃内、齿龈内、肝内、回肠内、病灶内、舌内、管腔内、淋巴内、乳房内、髓内、脑膜内、肌肉内、鼻内、结内、眼内、网膜内、卵巢内、腹膜内、心包内、胸膜内、前列腺内、肺内、瘤胃内、窦内(intrasinal)、脊椎内、滑膜内、腱内、睾丸内、气管内、鞘内、胸廓内、小管内、肿瘤内、鼓室内、子宫内、腹膜内、血管内、室内、膀胱内、前庭内、静脉内、玻璃体内、喉内、经鼻、鼻胃、经口、经眼、口咽、肠胃外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、呼吸、眼球后(retrotubular)、直肠、脊椎、蛛网膜下、结膜下、皮下、真皮下、龈下、舌下、粘膜下、视网膜下、局部、经皮、心内膜内、经粘膜、经胎盘、经气管、经鼓膜、输尿管、尿道和/或阴道灌注、灌洗、直接注射及经口施用。
如本文所使用的术语“治疗”(“treating/treatment”)是指向受试者施用治疗有效量的如本文所述的重组病毒或其组合物，以使该受试者的疾病或疾患，或者疾病或疾患的症状有所改善。所述改善是疾病或疾患，或者疾病或疾患的症状的任何改善或医治。所述改善是可观察或可测量的改善，或者可以是受试者健康状况的总体感觉。因此，本领域技术人员认识到，治疗可以改善疾病状况，但可能不是疾病的完全治愈。“预防有效量”是指有效实现期望的预防结果的病毒、病毒原液或组合物的量。如本文所用，“预防”可以指疾病症状的完全预防、疾病症状发作的延迟，或随后发生的疾病症状的严重程度的减轻。通常但不是必然地，由于预防剂量是在患病之前或患病早期用于受试者，故预防有效量小于治疗有效量。
“癌症”在本文中是指或描述哺乳动物的通常以细胞生长失调为特征的生理疾患。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤、骨源性肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、平滑肌肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、软骨肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、滑膜瘤、神经鞘瘤、脑脊髓膜瘤、腺癌、黑色素瘤以及白血病或淋巴类恶性病。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌(small-cell lung cancer)、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺鳞癌、小细胞肺癌瘤)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric/stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney/renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤、尤恩氏肿瘤(Ewing′stumor)、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏瘤(Wilms′tumor)、睾丸肿瘤、肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、寡树突神经胶细胞瘤、脑脊髓膜瘤、黑色素瘤、神经胚细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)、脊髓发育不良疾病、重链病、神经内分泌肿瘤、神经鞘瘤和其它癌瘤，以及头颈癌。
在某些实施方案中，使用如本文所述的溶瘤病毒(例如HSV)、病毒原液或组合物治疗选自以下的癌症：肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、乳癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠直肠癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌(HCC))、胃癌、头颈癌、甲状腺癌、恶性胶质瘤、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)及边缘区淋巴瘤(MZL)。
在某些方面，本发明涉及如本文所公开的附图或实施方案中的任一个所示的溶瘤病毒载体。
实施例
以下实施例是出于说明本发明各个实施方案的目的，并不打算以任何方式限制本发明。本发明的实施例以及本文所述方法都是示例性的，并不打算限制本发明的范围。明确地涵盖在由权利要求书范围所界定的本发明的精神内所涵盖的所述实施方案的变化、修改及其它改变。
实施例1-正常细胞和恶性细胞的miR序列分析
差异miR表达是许多癌症的标志(Lu等人，Nature，2005)。进行实验以测定在八个不同癌细胞系中表达差异最大的miR。差异表达是通过与非癌症对照组织比较来测定。对总共108个样品进行测序。样品详情提供于下表中。
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*神经鞘瘤和成胶质细胞瘤分析使用相同对照样品
为便利鉴别适于使选定细胞类型中HSV减毒的适当miRNA靶序列，进行癌症细胞系和非癌症对照组织的miRNA序列剖析。产生癌症和非癌症细胞，包括膀胱、结肠、乳房、胰腺、肺、头颈、神经鞘瘤、成胶质细胞瘤、脑、肝及骨髓中dicer处理的RNA的测序文库。将这些miRNA测序文库针对总RNA正规化，并使用HiSeq 2500超高通量测序系统，利用实现高达3e8个读段/轮的HiSeq V4化学试剂(Illumina)测序读段进行测序。使用Basespace中的miRNA分析工具(Illumina)分析来自每轮测序的FASTQ文件。通过计算正常的平均值、癌症的平均值并从高至低分选正常/癌症的比率进行分级。利用具有零和转化为零的负值的自然对数值生成热图(标度：黑色是高表达量，白色是低表达量)。整个样品的正规化数据表示为给定样品中正规化的miRNA读段计数。正规化与给定样品中的读段总数相对于供比较的其它样品中的读段数有关。
图1例示非癌症和患癌脑组织中25个miRNA的miRNA表达谱热图。显示出非癌症和患癌膀胱(图2)、乳房(图3)、结肠(图4)、脑(图5)、头颈(图6)、肺(图7)、胰腺(图8)及神经鞘瘤(图9)组织中对应于各实施例中的25个miRNA的miRNA表达谱热图的其它实例。图10显示，与非癌症组织相比，miR-451a含量在所有肿瘤类型中都下调，表明全肿瘤抑制性miRNA。图11显示，miR-1在所测试的所有肿瘤类型中都下调，在非癌症组织中以中等含量存在，并且在头颈组织中以高含量存在。图12显示，miR-559在所测试的所有肿瘤类型中都下调，通常在非癌症组织中以低含量存在，并且在非癌症肺组织中以高含量存在。图13显示，miR-145-5p在所测试的所有肿瘤类型中都下调，并且通常在大多数所测试的非癌症组织类型中以高含量存在。图14显示，miR-143-3p在结肠、肺及胰腺肿瘤中下调，并且在所有正常组织类型和一些乳房肿瘤细胞系中以高含量存在。miRNA数据分析披露了代表先前文献中未鉴别的新颖并且超出预期的miRNA表达谱的至少11个miRNA。
这些所鉴别的miRNA中有许多具有全肿瘤或多肿瘤特异性。例如，相较于对照组织，miR-451a、miR-559、miR-1、miR-145-3p及miR143-3p的表达通常在所测试的所有癌细胞系中都下调。对于miR-451a来说，这一点特别值得注意，miR-451a在所有正常组织类型中都高度表达，而在所有癌症类型中大体上下调，由此代表全特异性肿瘤抑制性miRNA。miR-559的表达在除正常肺组织外的其它正常组织类型中都较低，而miR-1和mir-145-3p在正常组织中的表达是变化的。尽管差异和绝对表达量的量值是变化的，但癌细胞系中各miR的平均表达量大体上低于相应正常组织中的表达量。这些miRNA是用于产生能广泛治疗多种癌症类型的全肿瘤HSV病毒粒子的候选物。
尽管癌细胞系中miR-451a、miR-559、miR-1、miR-145-3p及miR143-3p的平均表达低于对照，但并非在所有癌细胞系中都表达降低。例如，所测试的正常膀胱样品中有2/3显示miR-145-3p表达增加，而其余样品中的表达大体上类似于在癌细胞系中观察到的平均值。在乳癌细胞系中观察到类似结果。尽管所有乳癌样品的平均读段计数是106，但有5/12样品具有＞1000个计数的正规化读段计数，其中有2个＞40,000个计数。
这些数据指示有可能产生能够靶向多种肿瘤类型的单一miR减毒的溶瘤病毒。例如，包含针对miR-124、miR-451a、miR-559、miR-1及miR-145-3p的靶序列的构筑体可用于治疗所测试的所有肿瘤类型(例如膀胱、结肠、乳房、胰腺、肺、头颈、神经鞘瘤及成胶质细胞瘤)。不同癌症类型中miR表达量的变化指示可能需要通过miR表达或通过使用其它生物标记物对患者进行分层。
实施例2-用以快速分析基于miRNA的基因减毒的报导基因系统的构筑和使用
开发报导基因系统以评价使用实质上任何miRNA靶序列和同源miRNA进行的基于miRNA的基因减毒。在此系统(示于图15中)中，由miRNA识别的靶序列(即hsa-miR-122)被插入去稳定绿色荧光蛋白(dsGFP)的3’UTR中。随后使用mCherry作为miRNA表达的对照，通过四环素(tet)诱导型启动子使同源miRNA表达。将所有表达载体克隆至tet抑制型载体pcDNA5 Frt/To中，该载体也表达mCherry(pTF002)。用于表达的所有miRNA是由人类基因组DNA通过基因合成产生，并将其克隆至pTF002中。为产生减毒报导基因载体，将dsGFP克隆至cDNA3.1+中，由此产生载体pTF004。减毒载体含有由8-16个核苷酸隔开的相关miRNA序列的反向补体的四个串联重复序列。通过使用标准分子生物技术将合成产生的寡核苷酸插入pTF004的dsGFP基因的3′UTR中来构筑质粒。第一天，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，根据制造商方案，用miRNA减毒和报导基因表达质粒(各0.15μg，总共0.3μg含有CMV启动子的质粒)转染HEK293TetR细胞。第二天，用5 ng/ml四环素处理细胞并将其培育72小时。培育后，每日使用i3x Minimax多模式微板读数仪(MolecularDevices)检测GFP和mCherry荧光信号并使用Softmax Pro或Metamorph成像软件(Molecular Devices)进行分析。利用5-6ms曝光、GFP(541nm信道)曝光10ms和mCherry(713nm信道)曝光200-1500ms获得相位图像。
图16例示在通过tet诱导miR-122表达后24小时，miR-122介导的GFP表达减少。对照构筑体miR-184、miR-34a和Let7a不减少GFP含量，在无tet存在下也未观察到GFP减弱。图17显示使用单独miR-122/Let7a、miR-122/Let7a/miR-34a或miR-122/Let7a/miR-184和呈其盒组合形式的每一miR靶序列的miR-122、miR-184、miR-34a和Let7a表达以及GFP减少。仅在适当miR和同源靶序列一起存在时观察到GFP减弱(加圆圈的孔)。图18用作未减毒对照并且显示miR-122、miR-184、miR-34a和Let7a表达以及mCherry表达。
图19显示单独地使用每一靶序列的miR-122、miR-124、miR-145、miR-199和miR-451表达以及GFP减弱(加圆圈的孔)。图20用作上述实例的未减毒对照并且显示单独地使用每一靶序列的miR-122，miR-124，miR-145，miR-199和miR-451表达以及mCherry表达。图21显示在同源miR-122或miR-184靶序列存在时，在转染后72小时，miR-122和miR-184减弱GFP荧光。图22显示在同源miR-34a或miR-184靶序列存在时，在转染后72小时，miR-34a和miR-184减弱GFP荧光。图23显示在同源Let-7a或miR-184靶序列存在时，在转染后72小时，Let-7a和miR-184减弱GFP荧光。图24显示在同源miR-124或miR-184靶序列存在时，在转染后72小时，miR-124和miR-184减弱GFP荧光。图25显示在同源miR-145或miR-184靶序列存在时，在转染后72小时，miR-145和miR-184减弱GFP荧光。图26显示在同源miR-199或miR-451靶序列存在时，在转染后72小时，miR-199和miR-451减弱GFP荧光。图27显示在同源miR-125或miR-451靶序列存在时，在转染后72小时，miR-125和miR-451减弱GFP荧光。图28显示在同源miR-126或miR-451靶序列存在时，在转染后72小时，miR-126和miR-451减弱GFP荧光。图29显示在同源miR-127或miR-451靶序列存在时，在转染后72小时，miR-127和miR-451减弱GFP荧光。图30显示在同源miR-133或miR-451靶序列存在时，在转染后72小时，miR-133和miR-451减弱GFP荧光。图31显示在同源miR-223或miR-451靶序列存在时，在转染后72小时，miR-223和miR-451减弱GFP荧光。
因此，这些数据指示，miR表达可引起表达同源miR靶序列的基因的特异性衰减。
实施例3-miRNA减毒的HSV的产生
在基于报导基因进行的miRNA靶序列和同源miRNA对验证后，产生含有miRNA减毒盒的基于HSV的病毒。如(Mazzacurati等人，Mol Ther.，2015)所述，对KOS-37 BAC，即基于细菌人工染色体(BAC)的HSV-1 KOS株的全长基因组克隆进行一系列修饰。产物KGBAC缺失含有二倍体基因ICP0、ICP34.5、LAT和ICP4以及ICP47基因启动子各一个拷贝的内部重复(接头)区。这一缺失有利于操作该4个缺失基因的其余拷贝，为潜在地并入增强病毒溶瘤活性的转基因提供充足空间，并通过降低神经毒力因子ICP34.5的表达来增加肿瘤特异性；ICP47表达的消除有益于病毒特异性T细胞免疫识别受感染癌细胞。KGBAC也含有通过2A肽序列与糖蛋白C(gC)开放阅读框(ORF)融合的GFP ORF以允许监测后期(复制后)病毒基因表达。最后，KGBAC在gB基因中含有一对突变，经显示，该对突变可通过非典型受体促进HSV进入。将miRNA靶序列盒重组至2A5B-MMP9的ICP4和/或ICP27基因的3′UTR中以产生如图32中所示的ONCR-003、ONCR-010、ONCR-011、ONCR-012、ONCR-013、ONCR-014、ONCR-015、ONCR-016、ONCR-017、ONCR-018、ONCR-019、ONCR-020、ONCR-021及ONCR-022。所有BAC构筑体都转化成病毒粒子，同时通过Vero-Cre细胞的转染移除位于loxP位点之间的BAC序列。在噬菌斑纯化后，制备病毒原液并在Vero细胞上进行滴定。
实施例4-使用miRNA减毒的HSV进行的病毒感染性分析
为分析正常细胞和癌细胞中的病毒感染性和复制，在以下体外分析中测试miRNA减毒的HSV粒子。第一天，对于感染的每一细胞类型，引入HSV粒子以实现0.01的感染复数(moi)。在第2天至第5天，通过使用i3x Minimax多模式微板读数仪(Molecular Devices)进行的GFP检测分析病毒感染性并使用Softmax Pro或Metamorph成像软件(Molecular Devices)进行分析。利用5-6ms的曝光获得相位图像，使用GFP(541nm信道)曝光10ms和mCherry(713nm信道)曝光200-1500ms评估任何潜在非特异性自体荧光信号。
由于ICP27基因中存在miR-125盒并且这些细胞中的miR-125a含量高(＞3000个计数)，如图33(通过GFP阳性细胞定量读出)和图34(通过定量PCR读出)中所示，ONCR-011复制在有丝分裂后肺组织中明显减少。尽管ONCR-011和对照病毒ONCR-003在ICP4基因中含有miR-124靶序列，但miR-124是以不足以减少病毒复制的低含量(＜100个计数)存在。ONCR-011和ONCR-003二者在头颈癌细胞(A253)中都自由复制，因为这些细胞含有低含量的miR-125a和miR-124(＜100个计数)。如图35(通过GFP阳性细胞定量读出)和图36(通过定量PCR读出)中所示，ONCR-013复制在HCC1395细胞中明显减少，但在A253细胞中未明显减少。如图37(通过GFP阳性细胞定量读出)和图38(通过定量PCR读出)中所示，ONCR-014复制在非癌症肺组织中明显减少。
实施例5-患有胰腺癌、肺癌或结肠癌的患者的治疗
使用本文公开的组合物和方法治疗患有胰腺癌、肺癌或结肠癌的患者。如图39-44中所示，可通过在UL19、ICP4、ICP27(或其它病毒基因)中并入一个或多个miRNA靶序列产生减毒的基于HSV的病毒原液。在一些情形中，如图45-46中所示，除了miRNA靶序列以外，还将用于肿瘤破坏和/或微环境重塑的基因组编辑能力工程改造至病毒中。在具体实施例中，根据实施例3中所述的方法产生基于HSV的原液，其中含有已并入ICP4和ICP27中的miR-124、miR-451a、miR-143-3p和miR-559减毒盒。如图47中所示，将miRNA靶序列盒引入ICP4(miR-124)和ICP27(miR-451a、miR-143-3p、miR-559)基因的3′UTR中。BAC构筑体转化成病毒粒子，同时通过Vero-Cre细胞的转染，移除位于loxP位点之间的BAC序列。在噬菌斑纯化后，对病毒原液进一步纯化，更换缓冲液，并在Vero细胞上进行滴定。当向患有胰腺癌、肺癌或结肠癌的患者体内施用时，在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，使用药学上可接受的稳定剂一起制备HSV粒子。在治疗当天，通过肿瘤内输注施用包含在1.0mL体积药学上可接受的载剂中的109个载体基因组。使用标准护理程序，基于患者的特定预后，以适当时间间隔监测患者的肿瘤消退情况。
实施例6-患有脑癌、膀胱癌、乳癌或头颈癌的患者的治疗
使用本文公开的组合物和方法治疗患有脑癌、膀胱癌、乳癌或头颈癌的患者。根据实施例3中所述的方法，产生基于HSV的原液，其中含有miR-124、miR-451a、miR-145-3p和miR-559减毒盒。如图48中所示，将miRNA靶序列盒引入ICP4(miR-124)和ICP27(miR-451a、miR-145-3p、miR-559)基因的3′UTR中。BAC构筑体转化成病毒粒子，同时通过Vero-Cre细胞的转染，移除位于loxP位点之间的BAC序列。在噬菌斑纯化后，对病毒原液进一步纯化，更换缓冲液，并在Vero细胞上进行滴定。当向患有脑癌、膀胱癌、乳癌或头颈癌的患者体内施用时，在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，使用药学上可接受的稳定剂一起制备HSV粒子。在治疗当天，通过肿瘤内输注施用包含在1.0mL体积药学上可接受的载剂中的109个载体基因组。使用标准护理程序，基于患者的特定预后，以适当时间间隔监测患者的肿瘤消退情况。
实施例7-患有神经鞘瘤的患者的治疗
使用本文公开的组合物和方法治疗患有神经鞘瘤的患者。根据实施例3中所述的方法，产生基于HSV的原液，其中含有miR-124-3p、miR-205-5p、miR-141-5p和miR-31-5p减毒盒。如图49中所示，将miRNA靶序列盒重组至ICP4(miR-124)和ICP27(miR-205-5p、miR-141-5p、miR-31-5p)基因的3′UTR中。BAC构筑体转化成病毒粒子，同时通过Vero-Cre细胞的转染，移除位于loxP位点之间的BAC序列。在噬菌斑纯化后，对病毒原液进一步纯化，更换缓冲液，并在Vero细胞上进行滴定。对于向患有神经鞘瘤的患者体内施用，在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，使用药学上可接受的稳定剂一起制备HSV粒子。在治疗当天，通过肿瘤内输注施用包含在1.0mL体积药学上可接受的载剂中的109个载体基因组。使用标准护理程序，基于患者的特定预后，以适当时间间隔监测患者的肿瘤消退情况。
尽管在本文中显示并描了本发明的优选实施方案，但本领域技术人员将显而易见的是，这些实施方案只是作为实施例提供。本领域技术人员可以在不背离本发明的情况下实施许多变化、改变和替代。应了解，可在本发明实践中采用本文所述的本发明各实施方案的各种替代。所附权利要求意图界定本发明范围并且由此覆盖在这些权利要求和其等效内容的范围内的方法和结构。
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Claims (27)

1.重组单纯疱疹病毒(HSV)，其包含第一miRNA(miR)的靶序列和第二miR的靶序列，其中所述重组HSV基因组的ICP4基因座包含所述第一miR的靶序列，并且所述重组HSV基因组的ICP27基因座包含所述第二miR的靶序列。
2.如权利要求1所述的重组HSV，其中所述第一miR和所述第二miR是表3或表8中所列的肿瘤抑制性miR。
3.如权利要求1或2所述的重组HSV，其中所述第一miR和所述第二miR的靶序列被并入ICP4基因座或ICP27基因座的5’非翻译区(UTR)或3’UTR。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组HSV，其中所述第一miR是miR-124。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组HSV，其中所述第二miR是miR-122。
6.如权利要求1-5中任一项所述的重组HSV，其中所述第一miR的靶序列的两个或更多个拷贝被插入到ICP4基因座中。
7.如权利要求1-6中任一项所述的重组HSV，其中所述第二miR的靶序列的两个或更多个拷贝被插入到ICP27基因座中。
8.如权利要求1-7中任一项所述的重组HSV，其中ICP4基因座包含除所述第一miR和所述第二miR之外的一个或多个miR的靶序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的重组HSV，其中ICP27基因座包含除所述第一miR和所述第二miR之外的一个或多个miR的靶序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的重组HSV，其中所述重组HSV在第一细胞中的复制相较于所述重组HSV在第二细胞中的复制有所减少或减弱，并且其中所述第一细胞是非癌细胞和所述第二细胞是癌细胞。
11.如权利要求10所述的重组HSV，其中所述重组HSV在所述第一细胞中的复制相较于所述重组HSV在所述第二细胞中的复制减少至少50％。
12.如权利要求10或11所述的重组HSV，其中所述癌细胞的癌症选自：结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、口腔癌、卵巢癌、前列腺癌、脑癌、宫颈癌和肺癌。
13.如权利要求1-12中任一项所述的重组HSV，其包含编码选自细胞因子和抗免疫抑制性蛋白的异源多核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的重组HSV，其中所述蛋白包括IL-12。
15.如权利要求13或14所述的重组HSV，其中所述蛋白包括抗PD1蛋白和抗CTLA-4蛋白。
16.如权利要求13-15中任一项所述的重组HSV，其中所述异源多核苷酸序列被插入UL3与UL4开放阅读框之间的所述重组HSV基因组中。
17.如权利要求1-16中任一项所述的重组HSV，其包括内部接头区的缺失，使得所述重组HSV基因组包含ICP0、γ34.5、LAT和ICP4基因的各一个拷贝。
18.重组溶瘤病毒，其包含插入到病毒复制所需的一个或多个病毒基因的基因座中的一个或多个肿瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列的一个或多个拷贝。
19.核酸分子，其编码权利要求1-18中任一项所述的重组病毒。
20.病毒原液，其包含权利要求1-18中任一项所述的重组病毒。
21.组合物，其包含权利要求1-18中任一项所述的重组病毒和药学上可接受的载剂。
22.权利要求1-18中任一项所述的重组病毒或权利要求21所述的组合物在制备用于治疗或预防受试者的癌症的药物中的用途。
23.如权利要求22所述的用途，其中治疗或预防包括将癌细胞暴露在足以使所述重组病毒在所述癌细胞内感染和复制的条件下，并且其中所述重组病毒在所述癌细胞内的复制导致细胞死亡。
24.如权利要求22或23所述的用途，其中所述受试者是小鼠或人类。
25.如权利要求22-24中任一项所述的用途，其中所述重组病毒或所述组合物是经静脉内、皮下、肿瘤内或肌肉内施用。
26.如权利要求22-25中任一项所述的用途，其中所述癌症选自：结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、口腔癌、卵巢癌、前列腺癌、脑癌、宫颈癌和肺癌。
27.权利要求1-18中任一项所述的重组病毒或权利要求21所述的组合物在制备药物中的用途。
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