ES2919953T3 - Vectores víricos oncolíticos y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación se relaciona con los vectores virales recombinantes para el tratamiento y la prevención del cáncer. Los vectores virales oncolíticos incorporan una o más de las siguientes características: restricción de replicación viral mediante la inserción de secuencias diana de microARN supresores de tumores (miRNA) en el genoma viral; interrupción de la función de miARN oncogénico; remodelación del microambiente cáncer; y focalización de células cancerosas mediante la incorporación de anticuerpos activados por proteasa en la partícula viral. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores víricos oncolíticos y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a vectores víricos recombinantes para el tratamiento y prevención del cáncer. Los vectores víricos utilizan uno o más de los siguientes aspectos: restricción de replicación vírica por inserción de secuencias diana de microARN (miARN) supresor tumoral en el genoma vírico; alteración de la función de miARN oncógeno; remodelado de microentorno canceroso; y/o acción dirigida a células cancerosas por incorporación de anticuerpos activados por proteasa en la partícula vírica.
Antecedentes de la invención
Los actuales fármacos contra el cáncer dirigidos son eficaces en solamente una estrecha serie de cánceres debido a la heterogeneidad de los perfiles de expresión de proteínas tumorales. Además, muchos tratamientos contra el cáncer, incluyendo los vectores víricos existentes, quimioterapia, radiación y cirugía, carecen de la especificidad de tratar selectivamente las células cancerosas, mientras se mantiene la salud y viabilidad de las células no cancerosas normales y pueden producir efectos inespecíficos indeseables. Por tanto, hay una necesidad en la técnica de tratamientos contra el cáncer que sean ampliamente eficaces en múltiples cánceres y puedan eliminar selectivamente las células cancerosas.
Los virus oncolíticos son virus que infectan preferentemente células cancerosas y se han usado en múltiples estudios preclínicos y clínicos para tratamiento del cáncer. El uso de virus oncolíticos porta el riesgo de infección vírica no específica de células sanas, que da lugar a la muerte de células y tejidos no cancerosos. Sin embargo, la manipulación genética de los virus para explotar las rutas, proteínas y genes que se expresan de forma diferencial en tejido normal frente a canceroso puede aumentar la especificidad de estos virus y limitar la infección inespecífica y muerte celular.
Los microARN (miARN o miR) son ARN endógenos no codificantes pequeños que regulan la expresión génica dirigiendo sus ARN mensajeros diana para degradación o represión traduccional. Los miARN se asocian íntimamente con procesos celulares normales y, por lo tanto, la deregulación de miARN contribuye a una amplia serie de enfermedades incluyendo cáncer. Muchos genes de miARN se localizan en regiones genómicas asociadas a cáncer, o en sitios frágiles, reforzando adicionalmente la evidencia de que los miARN desempeñan una función central en cáncer. Los miARN se expresan de forma diferencial en tejidos cancerosos en comparación con tejidos normales y pueden tener una relación causal con la oncogénesis. Explotando esta expresión diferencial de miARN en diversos tipos de tumor, los fármacos contra el cáncer descritos en este documento poseen un perfil de seguridad y eficacia de amplio espectro, en los que la replicación vírica oncolítica se regula basándose en la expresión de un miARN o grupos de miARN particular. Además, los virus oncolíticos descritos en este documento también pueden expresar proteínas que facilitan la propagación vírica por todo un tumor, tal como los que alteran la expresión de genes y proteínas que regulan la matriz extracelular, aumentando de ese modo su eficacia terapéutica.
Jhy-Ming Li et al. informa de que microARN-145 regula el virus del herpes simple-1 oncolítico para la destrucción selectiva de células de cáncer pulmonar no microcítico humano (Virology Journal, Vol. 10, n.° 1, página 241, 22 de julio de 2013).
Sumario de la invención
En un aspecto de la invención, se proporciona un virus del herpes simple (HSV) recombinante de acuerdo con la reivindicación 1.
La invención se refiere a vectores víricos recombinantes que son útiles para el tratamiento y prevención del cáncer. Los vectores víricos oncolíticos divulgados en este documento comprenden los siguientes aspectos individualmente o en combinación: restricción de la replicación del vector vírico a células cancerosas o tumorales insertando secuencias diana de microARN (miR) supresores tumorales en el genoma vírico; incorporación de uno o más genes en el genoma vírico cuyo producto o productos alteran la función del miARN oncógeno y/o la matriz extracelular cancerosa; y acción dirigida altamente selectiva de los vectores a células cancerosas/tumorales incorporando anticuerpos activados por proteasa en la partícula vírica.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral en el gen vírico distinto de ICP4 es una secuencia diana para un miR seleccionado de la tabla 3. En algunas realizaciones, una o más secuencias diana de miR supresor tumoral se incorpora en la región no traducida (UTR) 5' o UTR 3' de genes víricos requeridos para la replicación vírica.
En algunas realizaciones, la replicación del virus se reduce o atenúa en una primera célula en comparación con la replicación del virus en una segunda célula, en la que la primera célula es una célula no cancerosa y la segunda célula es una célula cancerosa. En algunas realizaciones, la primera célula tiene una expresión aumentada de un miR supresor tumoral que puede unirse a la una o más secuencias diana de miR supresor tumoral en comparación con la expresión del miR supresor tumoral en la segunda célula. En algunas realizaciones, el nivel de expresión del miR supresor tumoral en la primera célula es al menos un 5 % mayor que el nivel de expresión del miR supresor tumoral en la segunda célula. En algunas realizaciones, la segunda célula tiene una expresión reducida de un miR supresor tumoral que puede unirse a la una o más secuencias diana de miR supresor tumoral en comparación con la expresión del miR supresor tumoral en la primera célula. En algunas realizaciones, el nivel de expresión del miR supresor tumoral en la segunda célula es al menos un 5 % menor que el nivel de expresión del miR supresor tumoral en la primera célula. En algunas realizaciones, la segunda célula es una célula cancerosa.
En algunas realizaciones, el virus oncolítico recombinante de la presente invención comprende una o más copias de las secuencias diana de miR supresor tumoral para miR-124, miR-451a, miR-143-3p y miR-559. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para su uso en el tratamiento de cáncer pancreático, pulmonar y/o de colon. En algunas realizaciones, el virus oncolítico comprende las secuencias diana de miR supresor tumoral para miR-124, miR-451, miR-143-3p, miR-1 y miR-559. En algunas realizaciones, el virus oncolítico comprende las secuencias diana de miR supresor tumoral para miR-124, miR-451, miR-145-5p y miR-559. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para su uso en el tratamiento de un tumor derivado de cualquier tipo de cáncer. En algunas realizaciones, el virus oncolítico comprende las secuencias diana de miR supresor tumoral para miR-205p, miR-141-5p, miR-31-5p y miR-124. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para su uso en el tratamiento de schwannoma. En realizaciones de la invención, el locus de ICP4 comprende al menos una secuencia diana de miR-124, y en realizaciones adicionales, las secuencias diana de miR supresor tumoral se insertan en el locus de ICP27, UL19 y/o UL30.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-136-3p, miR-432-5p, miR-1-3p, miR-127-3p, miR-379-5p, miR-493-5p, miR-223-5p, miR-223-5p, miR-136-5p, miR-451a, miR-487b-3p, miR-370-3p, miR-410-3p, miR-431-3p, miR-4485-3p, miR-4485-5p, miR-127-5p, miR-409-3p, miR-338-3p, miR-559, miR-411-5p, miR-133a-5p, miR-143-3p, miR-376b-3p, miR-758-3p, miR-1, miR-101, miR-1180, miR-1236, miR-124-3p, miR-125b, miR-126, miR-1280, miR-133a, miR-133b, miR-141, miR-143, miR-144, miR-145, miR-155, miR-16, miR-18a, miR-192, miR-195, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-218, miR-23b, miR-26a, miR-29c, miR-320c, miR-34a, miR-370, miR-409-3p, miR-429, miR-451b, miR-490-5p, miR-493, miR-576-3p y/o miR-99a. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para su uso en el tratamiento de cáncer de vejiga.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-1251-5p, miR-219a-5p, miR-219a-2-3p, miR-124-3p, miR-448, miR-138-2-3p, miR-490-5p, miR-129-1-3p, miR-1264, miR-3943, miR-490-3p, miR-383-5p, miR-133b, miR-129-2-3p, miR-128-2-5p, miR-133a-3p, miR-129-5p, miR-1-3p, miR-885-3p, miR-124-5p, miR-759, miR-7158-3p, miR-770-5p, miR-135a-5p, miR-885-5p, let-7 g-5p, miR-100, miR-101, miR-106a, miR-124, miR-124a, miR-125a, miR-125a-5p, miR-125b, miR-127-3p, miR-128, miR-129, miR-136, miR-137, miR-139-5p, miR-142-3p, miR-143, miR-145, miR-146b-5p, miR-149, miR-152, miR-153, miR-195, miR-21, miR-212-3p, miR-219-5p, miR-222, miR-29b, miR-31, miR-3189-3p, miR-320, miR-320a, miR-326, miR-330, miR-331-3p, miR-340, miR-342, miR-34a, miR-376a, miR-449a, miR-483-5p, miR-503, miR-577, miR-663, miR-7, miR-7-5p, miR-873, let-7a, let-7f, miR-107, miR-122, miR-124-5p, miR-139, miR-146a, miR-146b, miR-15b, miR-16, miR-181a, miR-181a-1, miR-181a-2, miR-181b, miR-181b-1, miR-181b-2, miR-181c, miR-181d, miR-184, miR-185, miR-199a-3p, miR-200a, miR-200b, miR-203, miR-204, miR-205, miR-218, miR-23b, miR-26b, miR-27a, miR-29c, miR-328, miR-34c-3p, miR-34c-5p, miR-375, miR-383, miR-451, miR-452, miR-495, miR-584, miR-622, miR-656, miR-98, miR-124-3p, miR-181b-5p, miR-200b y/o miR-3189-3p. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para su uso en el tratamiento de cáncer cerebral.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-10b-5p, miR-126-3p, miR-145-3p, miR-451a, miR-199b-5p, miR-5683, miR-3195, miR-3182, miR-1271-5p, miR-204-5p, miR-409-5p, miR-136-5p, miR-514a-5p, miR-559, miR-483-3p, miR-1-3p, miR-6080, miR-144-3p, miR-10b-3p, miR-6130, miR-6089, miR-203b-5p, miR-4266, miR-4327, miR-5694, miR-193b, let-7a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7 g, let-7i, miR-100, miR-107, miR-10a, miR-10b, miR-122, miR-124, miR-1258, miR-125a-5p, miR-125b, miR-126, miR-127, miR-129, miR-130a, miR-132, miR-133a, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-146b, miR-147, miR-148a, miR-149, miR-152, miR-153, miR-15a, miR-16, miR-17-5p, miR-181a, miR-1826, miR-183, miR-185, miR-191, miR-193a-3p, miR-195, miR-199b-5p, miR-19a-3p, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-205, miR-206, miR-211, miR-216b, miR-218, miR-22, miR-26a, miR-26b, miR-300, miR-30a, miR-31, miR-335, miR-339-5p, miR-33b, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-374a, miR-379, miR-381, miR-383, miR-425, miR-429, miR-450b-3p, miR-494, miR-495, miR-497, miR-502-5p, miR-517a, miR-574-3p, miR-638, miR-7, miR-720, miR-873, miR-874, miR-92a, miR-98, miR-99a, mmu-miR-290-3p y/o mmu-miR-290-5p. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para su uso en el tratamiento de cáncer de mama.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-143, miR-145, miR-17-5p, miR-203, miR-214, miR-218, miR-335, miR-342-3p, miR-372, miR-424, miR-491-5p, miR-497, miR-7, miR-99a, miR-99b, miR-100, miR-101, miR-15a, miR-16, miR-34a, miR-886-5p, miR-106a, miR-124, miR-148a, miR-29a y/o miR-375. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para su uso en el tratamiento de cáncer cervicouterino.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-133a-5p, miR-490-5p, miR-124-3p, miR-137, miR-655-3p, miR-376c-3p, miR-369-5p, miR-490-3p, miR-432-5p, miR-487b-3p, miR-342-3p, miR-223-3p, miR-136-3p, miR-136-3p, miR-143-5p, miR-1-3p, miR-214-3p, miR-143-3p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-451a, miR-127-3p, miR-133a-3p, miR-145-5p, miR-145-3p, miR-199a-5p, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7 g, let-7i, miR-100, miR-101, miR-126, miR-142-3p, miR-143, miR-145, miR-192, miR-200c, miR-21, miR-214, miR-215, miR-22, miR-25, miR-302a, miR-320, miR-320a, miR-34a, miR-34c, miR-365, miR-373, miR-424, miR-429, miR-455, miR-484, miR-502, miR-503, miR-93, miR-98, miR-186, miR-30a-5p, miR-627, let-7a, miR-1, miR-124, miR-125a, miR-129, miR-1295b-3p, miR-1307, miR-130b, miR-132, miR-133a, miR-133b, miR-137, miR-138, miR-139, miR-139-5p, miR-140-5p, miR-148a, miR-148b, miR-149, miR-150-5p, miR-154, miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-18a, miR-191, miR-193a-5p, miR-194, miR-195, miR-196a, miR-198, miR-199a-5p, miR-203, miR-204-5p, miR-206, miR-212, miR-218, miR-224, miR-24-3p, miR-26b, miR-27a, miR-28-3p, miR-28-5p, miR-29b, miR-30a-3p, miR-30b, miR-328, miR-338-3p, miR-342, miR-345, miR-34a-5p, miR-361-5p, miR-375, miR-378, miR-378a-3p, miR-378a-5p, miR-409-3p, miR-422a, miR-4487, miR-483, miR-497, miR-498, miR-518a-3p, miR-551a, miR-574-5p, miR-625, miR-638, miR-7, miR-96-5p, miR-202-3p, miR-30a y/o miR-451. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para su uso en el tratamiento de cáncer de colon o colorrectal.
En ejemplos también divulgados en este documento, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-101, miR-130a, miR-130b, miR-134, miR-143, miR-145, miR-152, miR-205, miR-223, miR-301a, miR-301 b, miR-30c, miR-34a, miR-34c, miR-424, miR-449a, miR-543 y/o miR-34b insertada en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. El virus oncolítico puede usarse para tratar cáncer endometrial.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-125b, miR-138, miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-16-1, miR-16-1-3p, miR-16-2, miR-181a, miR-181b, miR-195, miR-223, miR-29b, miR-34b, miR-34c, miR-424, miR-10a, miR-146a, miR-150, miR-151, miR-155, miR-2278, miR-26a, miR-30e, miR-31, miR-326, miR-564, miR-27a, let-7b, miR-124a, miR-142-3p, let-7c, miR-17, miR-20a, miR-29a, miR-30c, miR-720, miR-107, miR-342, miR-34a, miR-202, miR-142-5p, miR-29c, miR-145, miR-193b, miR-199a, miR-214, miR-22, miR-137 y/o miR-197 insertada en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para su uso en el tratamiento de cáncer hemático.
En ejemplos también divulgados en este documento, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-1, miR-145, miR-1826, miR-199a, miR-199a-3p, miR-203, miR-205, miR-497, miR-508-3p, miR-509-3p, let-7a, let-7d, miR-106a*, miR-126, miR-1285, miR-129-3p, miR-1291, miR-133a, miR-135a, miR-138, miR-141, miR-143, miR-182-5p, miR-200a, miR-218, miR-28-5p, miR-30a, miR-30c, miR-30d, miR-34a, miR-378, miR-429, miR-509-5p, miR-646, miR-133b, let-7b, let-7c, miR-200c, miR-204, miR-335, miR-377 y/o miR-506 insertada en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. El virus oncolítico puede usarse para tratar cáncer renal.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7f-1, let-7f-2, let-7 g, let-7i, miR-1, miR-100, miR-101, miR-105, miR-122, miR-122a, miR-1236, miR-124, miR-125b, miR-126, miR-127, miR-1271, miR-128-3p, miR-129-5p, miR-130a, miR-130b, miR-133a, miR-134, miR-137, miR-138, miR-139, miR-139-5p, miR-140-5p, miR-141, miR-142-3p, miR-143, miR-144, miR-145, miR-146a, miR-148a, miR-148b, miR-150-5p, miR-15b, miR-16, miR-181a-5p, miR-185, miR-188-5p, miR-193b, miR-195, miR-195-5p, miR-197, miR-198, miR-199a, miR-199a-5p, miR-199b, miR-199b-5p, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-202, miR-203, miR-204-3p, miR-205, miR-206, miR-20a, miR-21, miR-21 -3p, miR-211, miR-212, miR-214, miR-217, miR-218, miR-219-5p, miR-22, miR-223, miR-26a, miR-26b, miR-29a, miR-29b-1, miR-29b-2, miR-29c, miR-302b, miR-302c, miR-30a, miR-30a-3p, miR-335, miR-338-3p, miR-33a, miR-34a, miR-34b, miR-365, miR-370, miR-372, miR-375, miR-376a, miR-377, miR-422a, miR-424, miR-424-5p, miR-433, miR-4458, miR-448, miR-450a, miR-451, miR-485-5p, miR-486-5p, miR-497, miR-503, miR-506, miR-519d, miR-520a, miR-520b, miR-520c-3p, miR-582-5p, miR-590-5p, miR-610, miR-612, miR-625, miR-637, miR-675, miR-7, miR-877, miR-940, miR-941, miR-98, miR-99a, miR-132 y/o miR-31 insertada en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para uso en el tratamiento de cáncer hepático. En otras realizaciones, el cáncer hepático es carcinoma hepatocelular.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-143-3p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-1266-3p, miR-6130, miR-6080, miR-511-5p, miR-143-5p, miR-223-5p, miR-199b-5p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-451a, miR-142-5p, miR-144, miR-150-5p, miR-142-3p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-199a-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-1297, miR-141, miR-145, miR-16, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-29b, miR-381, miR-409-3p, miR-429, miR-451, miR-511, miR-99a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7 g, let-7i, miR-1, miR-101, miR-133b, miR-138, miR-142-5p, miR-144, miR-1469, miR-146a, miR-153, miR-15a, miR-15b, miR-16-1, miR-16-2, miR-182, miR-192, miR-193a-3p, miR-194, miR-195, miR-198, miR-203, miR-217, miR-218, miR-22, miR-223, miR-26a, miR-26b, miR-29c, miR-33a, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-365, miR-449a, miR-449b, miR-486-5p, miR-545, miR-610, miR-614, miR-630, miR-660, miR-7515, miR-9500, miR-98, miR-99b, miR-133a, let-7a, miR-100, miR-106a, miR-107, miR-124, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-126, miR-126*, miR-129, miR-137, miR-140, miR-143, miR-146b, miR-148a, miR-148b, miR-149, miR-152, miR-154, miR-155, miR-17-5p, miR-181a-1, miR-181a-2, miR-181b, miR-181b-1, miR-181b-2, miR-181c, miR-181d, miR-184, miR-186, miR-193b, miR-199a, miR-204, miR-212, miR-221, miR-224, miR-27a, miR-27b, miR-29a, miR-30a, miR-30b, miR-30c, miR-30d, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-32, miR-335, miR-338-3p, miR-340, miR-342-3p, miR-361-3p, miR-373, miR-375, miR-4500, miR-4782-3p, miR-497, miR-503, miR-512-3p, miR-520a-3p, miR-526b, miR-625* y/o miR-96 insertada en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para uso en el tratamiento de cáncer pulmonar.
En ejemplos también divulgados en este documento, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para let-7b, miR-101, miR-125b, miR-1280, miR-143, miR-146a, miR-146b, miR-155, miR-17, miR-184, miR-185, miR-18b, miR-193b, miR-200c, miR-203, miR-204, miR-205, miR-206, miR-20a, miR-211, miR-218, miR-26a, miR-31, miR-33a, miR-34a, miR-34c, miR-376a, miR-376c, miR-573, miR-7-5p, miR-9 y/o miR-98 insertada en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. El virus oncolítico puede usarse para tratar melanoma.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para let-7d, miR-218, miR-34a, miR-375, miR-494, miR-100, miR-124, miR-1250, miR-125b, miR-126, miR-1271, miR-136, miR-138, miR-145, miR-147, miR-148a, miR-181a, miR-206, miR-220a, miR-26a, miR-26b, miR-29a, miR-32, miR-323-5p, miR-329, miR-338, miR-370, miR-410, miR-429, miR-433, miR-499a-5p, miR-503, miR-506, miR-632, miR-646, miR-668, miR-877 y/o miR-9 insertada en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para uso en el tratamiento de cáncer bucal.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para let-7i, miR-100, miR-124, miR-125b, miR-129-5p, miR-130b, miR-133a, miR-137, miR-138, miR-141, miR-145, miR-148a, miR-152, miR-153, miR-155, miR-199a, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-212, miR-335, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-409-3p, miR-411, miR-429, miR-432, miR-449a, miR-494, miR-497, miR-498, miR-519d, miR-655, miR-9, miR-98, miR-101, miR-532-5p, miR-124a, miR-192, miR-193a y/o miR-7 insertada en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para uso en el tratamiento de cáncer ovárico.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-216a-5p, miR-802, miR-217, miR-145-3p, miR-143-3p, miR-451a, miR-375, miR-214-3p, miR-216b-3p, miR-432-5p, miR-216a-3p, miR-199b-5p, miR-199a-5p, miR-136-3p, miR-216b-5p, miR-136-5p, miR-145-5p, miR-127-3p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-559, miR-129-2-3p, miR-4507, miR-1-3p, miR-148a-3p, miR-101, miR-1181, miR-124, miR-1247, miR-133a, miR-141, miR-145, miR-146a, miR-148a, miR-148b, miR-150*, miR-150-5p, miR-152, miR-15a, miR-198, miR-203, miR-214, miR-216a, miR-29c, miR-335, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-373, miR-375, miR-410, miR-497, miR-615-5p, miR-630, miR-96, miR-132, let-7a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7 g, let-7i, miR-126, miR-135a, miR-143, miR-144, miR-150, miR-16, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-217, miR-218, miR-337, miR-494 y/o miR-98 insertada en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para uso en el tratamiento de cáncer pancreático.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para let-7a-3p, let-7c, miR-100, miR-101, miR-105, miR-124, miR-128, miR-1296, miR-130b, miR-133a-1, miR-133a-2, miR-133b, miR-135a, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-154, miR-15a, miR-187, miR-188-5p, miR-199b, miR-200b, miR-203, miR-205, miR-212, miR-218, miR-221, miR-224, miR-23a, miR-23b, miR-25, miR-26a, miR-26b, miR-29b, miR-302a, miR-30a, miR-30b, miR-30c-1, miR-30c-2, miR-30d, miR-30e, miR-31, miR-330, miR-331-3p, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-374b, miR-449a, miR-4723-5p, miR-497, miR-628-5p, miR-642a-5p, miR-765 y/o miR-940 insertada en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para uso en el tratamiento de cáncer de próstata.
En ejemplos también divulgados en este documento, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-101, miR-183, miR-204, miR-34a, miR-365b-3p, miR-486-3p y/o miR-532-5p insertada en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. El virus oncolítico puede usarse para tratar retinoblastoma.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-143-3p, miR-133b, miR-1264, miR-448, miR-1298-5p, miR-490-5p, miR-138-2-3p, miR-144-3p, miR-144-5p, miR-150-5p, miR-129-1 -3p, miR-559, miR-1-3-p, miR-143-5p, miR-223-3p, miR-3943, miR-338-3p, miR-124-3p, miR-219a-5p, miR-219a-2-3p, miR-451a, miR-142-5p, miR-133a-3p, miR-145-5p y/o miR-145-3p. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para su uso en el tratamiento de glioblastoma.
En ejemplos también divulgados en este documento, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-143-3p, miR-223-3p, miR-6080, miR-208b-3p, miR-206, miR-133a-5p, miR-133b, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-142-3p, miR-144-3p, miR-144-5p, miR-338-3p, miR-214-3p, miR-559, miR-133a-3p, miR-1-3p, miR-126-3p, miR-142-5p, miR-451a, miR-199a-3p y/o miR-199b-3p. El virus oncolítico puede usarse para tratar cáncer de cabeza y cuello.
En algunas realizaciones, la secuencia diana de miR supresor tumoral es una secuencia diana para miR-133b, miR-208b-3p, miR-6130, miR-141-5p, miR-31-3p, miR-1293, miR-129-2-3p, miR-129-5p, miR-124-3p, miR-219a-5p, miR219a-2-3p, miR-490-3p, miR-488-3p, miR-935, miR-124-5p, miR-122-3p, miR-122-5p, miR-1-3p, miR-133a-3p, miR-375, miR-141-3p, miR-31-5p, miR-205-5p, miR-200c-3p y/o miR-203a-3p. En otras realizaciones, el virus oncolítico es para su uso en el tratamiento de un schwannoma.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona virus oncolíticos recombinantes que comprenden además uno o más de (a) uno o más polinucleótidos que codifican una o más proteínas u oligonucleótidos, en los que las proteínas u oligonucleótidos reducen la expresión o inhiben la función de un miR, un gen o un TIMP; (b) al menos un anticuerpo activado por proteasa; y/o (c) un polinucleótido que codifica al menos un anticuerpo activado por proteasa. En algunas realizaciones, el miR es un miR oncógeno o un miR remodelador del microentorno. En algunas realizaciones, el miR oncógeno se selecciona de los miR enumerados en la tabla 4. En algunas realizaciones, el gen es un gen oncógeno. En algunas realizaciones, el gen oncógeno se selecciona de los genes enumerados en la tabla 7. En algunas realizaciones, el miR remodelador del microentorno se selecciona de los miR enumerados en la tabla 5. En algunas realizaciones, el TIMP se selecciona de TIMP1, TIMP2, TIMP3 y TIMP4. En algunas realizaciones, el oligonucleótido de (b) es un ARNhc o un oligonucleótido de señuelo. En algunas realizaciones,
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona virus oncolíticos recombinantes que comprenden además uno o más de (a) uno o más polinucleótidos que codifican una o más proteínas u oligonucleótidos, en los que las proteínas u oligonucleótidos reducen la expresión o inhiben la función de un miR, un gen o un TIMP; (b) al menos un anticuerpo activado por proteasa; y/o (c) un polinucleótido que codifica al menos un anticuerpo activado por proteasa; en los que la proteína es una nucleasa, un acoplador de linfocitos T biespecífico (BiTE), una proteína antiinmunosupresora o un antígeno inmunógeno. En algunas realizaciones, la nucleasa se selecciona de una endonucleasa asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas intercaladas de forma regular (CRISPR), una nucleasa de dedos de cinc (ZFN) o una nucleasa de efector similar a activador de la transcripción (TALEN). En algunas realizaciones, la endonucleasa asociada a CRISPR se selecciona de SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9-HF4, SaCas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9, C2C1, C2C3, Cpf1, Cas1, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csxl5, Csf1, Csf2, Csf3 y Csf4. En otras realizaciones, el virus oncolítico comprende además un polinucleótido heterólogo que codifica un ARNcrtra (ARNtr) y un ARNcrispr (ARNcr), en el que el ARNcr se dirige a una secuencia de ADN genómica que codifica un miR o un TIMP y en el que el ARNtr facilita la unión y activación de una endonucleasa asociada a CRISPR.
En algunas realizaciones, la proteína antiinmunosupresora es una proteína antilinfocito T regulador (Treg) o una proteína anticélula supresora derivada mielocítica (MDSC). En algunas realizaciones, la proteína antiinmunosupresora es un bloqueante derivado de VHH o un BiTE derivado de VHH.
En algunas realizaciones, la proteína induce una respuesta inmunitaria antitumoral. En otras realizaciones, la proteína se selecciona de EpCAM, folato, IFNp, anti-CTLA-4, anti-PD1, A2A, anti-FGF2, anti-FGFR/FGFR2b, anti-SEMA4D, CCL5, CD137, CD200, CD38, CD44, CSF-1R, CXCL10, CXCL13, receptor de endotelina B, IL-12, IL-15, IL-2, IL-21, IL-35, ISRE7, LFA-1, NG2 (también conocida como SPEG4), una proteína SMAD, STING, TGFp y VCAM1.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona virus oncolíticos recombinantes que comprenden además uno o más de (a) uno o más polinucleótidos que codifican una o más proteínas u oligonucleótidos, en los que las proteínas u oligonucleótidos reducen la expresión o inhiben la función de un miR, un gen o un TIMP; (b) al menos un anticuerpo activado por proteasa; y/o (c) un polinucleótido que codifica al menos un anticuerpo activado por proteasa, en los que el al menos un anticuerpo activado por proteasa se incorpora en una envuelta glucoproteínica vírica. En algunas realizaciones, el anticuerpo activado por proteasa se activa por una proteasa seleccionada de una catepsina de cisteína, una catepsina aspártica, una calicreína (hK), una serina proteasa, una caspasa, una metaloproteinasa de matriz (MMP) y una metaloproteinasa disintegrina (ADAM). En algunas realizaciones, la proteasa se selecciona de catepsina K, catepsina B, catepsina L, catepsina E, catepsina D, hK1, PSA (hK3), hK10, hK15, uPA, uPAR, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-23A, MMP-23B, MMP-24, MMP-25, MMP-26, MMP-27, MMP-28 o una proteasa enumerada en la tabla 6.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activado por proteasa se une a una proteína expresada más elevadamente por una célula cancerosa o en un microentorno canceroso que por una célula no cancerosa o en un microentorno no canceroso. En algunas realizaciones, el anticuerpo activado por proteasa se une a NKG2D, c-met, HGFR, CD8, sulfato de heparano, VSPG4 (también conocido como NG2), EGFR, eGf Rv III, CD133, CXCR4, antígeno carcinoembrionario (CEA), CLC-3, anexina II, receptor de transferrina humana o EpCAM.
En algunas realizaciones, el uno o más polinucleótidos se insertan en un locus génico del genoma vírico. En algunas realizaciones, el al menos un polinucleótido se inserta en o entre uno o más locus génicos víricos seleccionados del grupo que consiste en la región de unión de repeticiones internas (que comprende una copia de cada uno de los genes diploides ICP0, ICP34,5, LAT, ICP4 y el promotor de ICP47), ICP0, LAT, UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26,5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, gamma-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 y US12.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un virus oncolítico de la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona una reserva vírica de un virus oncolítico de la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende un virus oncolítico de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un virus oncolítico de la invención, o composiciones del mismo, para su uso en un método de tratamiento del cáncer, en el que el método comprende destruir una célula cancerosa, que comprende exponer la célula cancerosa a dicho virus oncolítico o composiciones del mismo en condiciones suficientes para que el virus oncolítico infecte y se replique dentro de dicha célula cancerosa, y en el que la replicación del virus oncolítico dentro de la célula cancerosa provoca muerte celular. En algunas realizaciones, la célula cancerosa tiene una expresión reducida de un miR supresor tumoral que puede unirse a la una o más secuencias diana de miR supresor tumoral en comparación con la expresión del miR supresor tumoral en una célula cancerosa. En algunas realizaciones, el nivel de expresión del miR supresor tumoral en la célula cancerosa es al menos un 5 % menor que el nivel de expresión del miR supresor tumoral en la célula no cancerosa. En algunas realizaciones, la replicación del virus oncolítico se aumenta o mantiene en células cancerosas con una expresión reducida del miR supresor tumoral que puede unirse a la una o más secuencias diana de miR supresor tumoral. En algunas realizaciones, la replicación vírica es al menos un 5 % mayor en las células cancerosas en comparación con la replicación vírica en la célula no cancerosa. En algunas realizaciones, la célula está in vivo. En algunas realizaciones, la célula está dentro de un tumor.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un virus oncolítico de la invención, o composiciones del mismo, para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar dicho virus oncolítico o composiciones del mismo al sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un ratón, una rata, un conejo, un gato, un perro, un caballo, un primate no humano o un ser humano. En algunas realizaciones, el virus oncolítico o composiciones del mismo se administran por vía intravenosa, subcutánea, intratumoral, intramuscular o intranasal. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer cervicouterino, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer tiroideo, glioma maligno, glioblastoma, melanoma, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL) y linfoma de zona marginal (MZL). En algunas realizaciones, el cáncer pulmonar es cáncer pulmonar microcítico o cáncer pulmonar no microcítico. En algunas realizaciones, el cáncer hepático es carcinoma hepatocelular (HCC).
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra un mapa término de un perfil de expresión de miARN en tejido cerebral canceroso y no canceroso correspondiente a 25 miARN seleccionados.
La figura 2 ilustra un mapa término de un perfil de expresión de miARN en tejido de vejiga canceroso y no canceroso correspondiente a 25 miARN seleccionados.
La figura 3 ilustra un mapa término de un perfil de expresión de miARN en tejido de mama canceroso y no canceroso correspondiente a 25 miARN seleccionados.
La figura 4 ilustra un mapa término de un perfil de expresión de miARN en tejido de colon canceroso y no canceroso correspondiente a 25 miARN seleccionados.
La figura 5 ilustra un mapa término de un perfil de expresión de miARN en tejido cerebral de glioblastoma y no canceroso correspondiente a 25 miARN seleccionados.
La figura 6 ilustra un mapa término de un perfil de expresión de miARN en tejido de cabeza y cuello canceroso y no canceroso correspondiente a 25 miARN seleccionados.
La figura 7 ilustra un mapa término de un perfil de expresión de miARN en tejido pulmonar canceroso y no canceroso correspondiente a 25 miARN seleccionados.
La figura 8 ilustra un mapa término de un perfil de expresión de miARN en tejido pancreático canceroso y no canceroso correspondiente a 25 miARN seleccionados.
La figura 9 ilustra un mapa término de un perfil de expresión de miARN en tejido de schwannoma y no de schwannoma correspondiente a 25 miARN seleccionados.
La figura 10 ilustra la regulación por disminución de la expresión de miR-451a en todos los tipos de tumor (CA) en comparación con tejido no canceroso (Norm).
La figura 11 ilustra la regulación por disminución de la expresión de miR-1 en todos los tipos de tumor (CA), la expresión moderada de miR-1 en tejido no canceroso (Norm) y la elevada expresión de miR-1 en tejido de cabeza y cuello (C y C) no canceroso.
La figura 12 ilustra la regulación por disminución de la expresión de miR-559 en todos los tipos de tumor (CA), la baja expresión de miR-559 en tejido no canceroso (Norm) y la elevada expresión de miR-559 en tejido pulmonar no canceroso.
La figura 13 ilustra la regulación por disminución de la expresión de miR-145-5p en todos los tipos de tumor (CA) y la elevada expresión de miR-145-5p en la mayoría de tejido no canceroso (Norm).
La figura 14 ilustra la regulación por disminución de la expresión de miR-143-3p en tipos de tumor de colon, pulmonar y pancreático (CA) y la elevada expresión de miR-143-3p en la mayoría de tejido no canceroso (Norm).
La figura 15A-figura 15C ilustran un sistema de gen indicador de expresión y atenuación de miARN descrito en el ejemplo 2. La figura 15A muestra un esquema de un plásmido represor de tet pTetR que induce expresión de un plásmido de expresión de miARN. La figura 15B muestra un esquema de un plásmido de expresión de miARN pTF-002 que contiene un casete de expresión de mCherry inducible por tet y miARN. La figura 15C muestra un esquema de un indicador de atenuación de miARN de pTF-004 que posibilita la lectura de GFP desestabilizado (dsGFP). La figura 16 ilustra la expresión y atenuación de miR-122 usando el sistema indicador mostrado en la figura 15 y descrito en el ejemplo 2.
La figura 17 ilustra la atenuación de GFP mediada por miR-122, miR-184, miR-34a y Let7a usando el sistema indicador mostrado en la figura 15 y descrito en el ejemplo 2. Los pocillos rodeados por un círculo indican niveles reducidos de expresión de GFP.
La figura 18 ilustra la expresión de miR-122, miR-184, miR-34a y Let7a, indicada por la expresión de mCherry, usando el sistema indicador mostrado en la figura 15 y descrito en el ejemplo 2.
La figura 19 ilustra la atenuación de GFP mediada por miR-122, miR-124, miR-145, miR-199 y miR-451 usando el sistema indicador mostrado en la figura 15 y descrito en el ejemplo 2. Los pocillos rodeados por un círculo indican niveles reducidos de expresión de GFP.
La figura 20 ilustra la expresión de miR-122, miR-124, miR-145, miR-199 y miR-451, indicada por la expresión de mCherry, usando el sistema indicador mostrado en la figura 15 y descrito en el ejemplo 2.
La figura 21 muestra la cuantificación de fluorescencia de GFP atenuada por miR-122 y miR-184.
La figura 22 muestra la cuantificación de fluorescencia de GFP atenuada por miR-34a y miR-184.
La figura 23 muestra la cuantificación de fluorescencia de GFP atenuada por Let7a y miR-184.
La figura 24 muestra la cuantificación de fluorescencia de GFP atenuada por miR-124 y miR-184.
La figura 25 muestra la cuantificación de fluorescencia de GFP atenuada por miR-145 y miR-184.
La figura 26 muestra la cuantificación de fluorescencia de GFP atenuada por miR-199 y miR-451.
La figura 27 muestra la cuantificación de fluorescencia de GFP atenuada por miR-125 y miR-451.
La figura 28 muestra la cuantificación de fluorescencia de GFP atenuada por miR-126 y miR-451.
La figura 29 muestra la cuantificación de fluorescencia de GFP atenuada por miR-127 y miR-451.
La figura 30 muestra la cuantificación de fluorescencia de GFP atenuada por miR-133 y miR-451.
La figura 31 muestra la cuantificación de fluorescencia de GFP atenuada por miR-223 y miR-451.
La figura 32 muestra construcciones de HSV atenuadas por miR con secuencias diana para diversos miARN insertados en los genes ICP27 e ICP4.
La figura 33 ilustra la atenuación de HSV por miR-125 en células no cancerosas (pulmón posmitótico) y cancerosas (A253).
La figura 34 muestra la cuantificación basada en qPCR de la atenuación de HSV por miR-125 en células pulmonares no cancerosas (pulmón PM) y cancerosas (A253).
La figura 35 ilustra la cuantificación basada en fluorescencia de la atenuación de HSV por miR-145 en células HCC1395 frente a A253.
La figura 36 muestra la cuantificación basada en qPCR de la atenuación de HSV por miR-145 en células HCC1395 frente a A253.
La figura 37 ilustra la cuantificación basada en fluorescencia de la atenuación de HSV por miR-199a-5p frente a miR-143-3p en células pulmonares normales.
La figura 38 muestra la cuantificación basada en qPCR de la atenuación de HSV en células pulmonares normales por miR-199a-5p frente a miR-143-3p.
La figura 39 ilustra un esquema de un vector de HSV atenuado por ICP4-TmiARN para el tratamiento de cáncer o trastornos hiperproliferativos benignos.
La figura 40 muestra un esquema de un vector de HSV atenuado por ICP27-TmiARN para el tratamiento de cáncer o trastornos hiperproliferativos benignos.
La figura 41 muestra un esquema de un vector de HSV atenuado por UL19-TmiARN para el tratamiento de cáncer o trastornos hiperproliferativos benignos.
La figura 42 muestra un esquema de un vector de HSV atenuado por UL19-TmiARN e ICP27-TmiARN para el tratamiento de cáncer o trastornos hiperproliferativos benignos.
La figura 43 muestra un esquema de un vector de HSV atenuado por UL19-TmiARN e ICP4-TmiARN para el tratamiento de cáncer o trastornos hiperproliferativos benignos.
La figura 44 muestra un esquema de un vector de HSV atenuado por UL19-TmiARN, ICP27-TmiARN e ICP4-TmiARN para el tratamiento de cáncer o trastornos hiperproliferativos benignos.
La figura 45 muestra un esquema de un vector de HSV editor del genoma atenuado por ICP4-TmiARN para el tratamiento de cáncer.
La figura 46 muestra un esquema de un vector de HSV remodelador del microentorno, editor del genoma atenuado por ICP4-TmiARN para el tratamiento de cáncer.
La figura 47 muestra un esquema de un vector de HSV atenuado por ICP4-TmiARN e ICP27-TmiARN para el tratamiento de cáncer pancreático, pulmonar y de colon.
La figura 48 muestra un esquema de un vector de HSV atenuado por ICP4-TmiARN e ICP27-TmiARN para el tratamiento de múltiples tipos de cáncer.
La figura 49 muestra un esquema de un vector de HSV atenuado por ICP4-TmiARN e ICP27-TmiARN para el tratamiento de schwannoma.
Descripción detallada de la invención
En algunos aspectos, la presente invención utiliza perfiles de expresión diferencial de miARN para restringir de forma eficaz la replicación del vector vírico a células tumorales. En algunas realizaciones, los vectores víricos descritos en este documento también alteran la expresión de miARN específicos para proliferación tumoral, metástasis y/o remodelado del microentorno tumoral reducidos para posibilitar la propagación vírica potenciada. En algunas realizaciones, los vectores víricos descritos en este documento abarcan el uso de moléculas de superficie sobre vectores víricos para facilitar la acción dirigida a células tumorales. Estos aspectos pueden aplicarse individualmente o en combinación para desarrollar vectores víricos potencialmente con capacidad de tratar una amplia serie de tipos de cáncer con un solo vector vírico. Por tanto, la invención abarca además vectores víricos oncolíticos recombinantes para su uso en el tratamiento y prevención de enfermedades y trastornos (por ejemplo, cáncer). En algunas realizaciones, esta invención utiliza microARN (miARN) endógenos para posibilitar un vector vírico recombinante seguro y eficaz para tratar una amplia serie de cánceres.
Los títulos de las secciones usados en este documento son solo con propósitos organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita. La mención a cualquier referencia, artículo, publicación, patente, publicación de patente y solicitud de patente citada en este documento no es, y no debe aceptarse como, reconocimiento, o cualquier forma de sugerencia, de que constituyen técnica anterior válida o forman parte del conocimiento general común en cualquier país del mundo.
En la presente descripción, debe entenderse que cualquier intervalo de concentraciones, intervalo de porcentajes, intervalo de relaciones o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo indicado y, cuando sea apropiado, fracciones de los mismos (tal como una décima parte y una centésima parte de un número entero), salvo que se indique de otro modo. Debe entenderse que los términos "un/o" y "una", como se usan en este documento, se refieren a "uno o más" de los componentes enumerados salvo que se indique de otro modo. Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, "o") significa uno, ambos o cualquier combinación de los mismos de las alternativas. Como se usa en este documento, el término "incluye" y "comprende" se usan como sinónimos. Como se usa en este documento, "pluralidad" puede referirse a uno o más componentes (por ejemplo, una o más secuencias diana de miARN).
Virus oncolíticos
La presente divulgación proporciona virus oncolíticos recombinantes, en los que una o más copias de una o más secuencias diana de microARN (miR) supresor tumoral se insertan en un locus de uno o más genes víricos requeridos para la replicación vírica. Como se usa en este documento, la expresión "virus oncolítico" se refiere a un virus que se ha modificado para infectar preferentemente células cancerosas, o lo hace de manera natural. Son conocidos ejemplos de virus oncolíticos en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, virus del herpes simple, un adenovirus, un poliovirus, un virus de la variolovacuna, un virus del sarampión, un virus de la estomatitis vesicular, un ortomixovirus, un parvovirus, un virus maraba o un coxsackievirus. En realizaciones de la invención, el virus oncolítico es un virus del herpes simple recombinante. En algunas realizaciones, los virus oncolíticos descritos en este documento se incorporan en un vector vírico. El término "vector" se usa en este documento para referirse a una molécula de ácido nucleico que puede transferir o transportar otra molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico transferido en general se ligar a, por ejemplo, se inserta en, la molécula de ácido nucleico de vector. Un vector puede incluir secuencias que dirigen la replicación autónoma en una célula, o pueden incluir secuencias suficientes para permitir la integración en el ADN de la célula hospedadora. Un vector vírico a veces puede denominarse "virus recombinante" o "virus." Las expresiones "virus oncolítico" y "vector oncolítico" se usan indistintamente en este documento. En realizaciones particulares, el vector vírico recombinante es un virus del herpes simple que tiene capacidad de replicación del vector selectiva de tumor como se describe en la publicación PCT internacional n.° WO 2015/066042.
Los términos "microARN", "miARN" y "miR" se usan indistintamente en este documento y se refieren a ARN endógenos no codificantes pequeños que regulan la expresión génica dirigiéndose a sus ARN mensajeros (ARNm) diana para la degradación o represión traduccional. Los miR se expresan de forma diferencial en una amplia serie de estados patológicos, incluyendo múltiples tipos de cáncer. En algunos aspectos, las células cancerosas de un tipo de cáncer o tejido dado demuestran expresión diferencial de miR en comparación con células de control no cancerosas. Como se usa en este documento, el término "oncomiR" se refiere a miR que se asocian (positiva o negativamente) con carcinogénesis, transformación maligna o metástasis. En algunos aspectos, el nivel de expresión de un oncomiR particular se asocia con el desarrollo o mantenimiento de un cáncer particular. Dichos miR se denominan en este documento "miR oncógenos".
En algunas realizaciones, la expresión de un miR oncógeno está aumentada en células o tejidos cancerosos en comparación con controles no cancerosos. Por ejemplo, la expresión de un miR oncógeno en una célula cancerosa puede estar aumentada en al menos un 5 % en comparación con la expresión del miR oncógeno en una célula o tejido no canceroso. En algunas realizaciones, la expresión de un miR oncógeno está aumentada en al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 % o más en comparación con la expresión del miR oncógeno en una célula o tejido no canceroso. En algunos aspectos, una célula o tejido canceroso puede expresar un miR oncógeno que no se expresa en células o tejidos de control no cancerosos. En algunas realizaciones, la expresión de un miR oncógeno está aumentada en células o tejidos cancerosos en comparación con células cancerosas derivadas de un tipo de cáncer diferente. Por ejemplo, la expresión de un miR oncógeno en una célula cancerosa puede estar aumentada en al menos un 5 % en comparación con células cancerosas derivadas de un tipo de cáncer diferente. En algunas realizaciones, la expresión de un miR oncógeno está aumentada en al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 % o más en comparación con células cancerosas derivadas de un tipo de cáncer diferente. Ejemplos de miARN oncógenos que se sobreexpresan frecuentemente en tejidos cancerosos incluyen, aunque sin limitación, miR-21, miR-155 y miR-17-92. Ejemplos adicionales de miR oncógenos se enumeran en la tabla 4.
En algunas realizaciones, la expresión de un oncomiR particular se asocia con la prevención y/o retardo de la carcinogénesis y/o metástasis. Dichos oncomiR se denominan en este documento "miR supresores tumorales" o "miR supresores tumorales", ya que su expresión previene o suprime el desarrollo de cáncer. En algunas realizaciones, la subexpresión de miR supresores tumorales puede dar lugar a cáncer. Por tanto, en algunos aspectos, se expresan miR supresores tumorales en células sanas y no se expresan en células cancerosas. En algunos aspectos, la expresión de un miR supresor tumoral particular está aumentada en una célula sana en comparación con una célula cancerosa. Por ejemplo, la expresión de un miR supresor tumoral en una célula sana (por ejemplo, no cancerosa) puede estar aumentada en al menos un 5 % en comparación con la expresión de un miR supresor tumoral en una célula cancerosa. En algunas realizaciones, la expresión de un miR supresor tumoral está amentada en al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 % o más en comparación con la expresión del miR supresor tumoral en una célula cancerosa. En algunas realizaciones, la expresión de un miR supresor tumoral está aumentada en células o tejidos normales en comparación con células normales derivadas de un tipo de tejido o localización diferente en el organismo. Por ejemplo, la expresión de un miR supresor tumoral en una célula normal puede estar aumentada en al menos un 5 % en comparación con células normales derivadas de un tipo de tejido o localización diferente en el organismo. En algunas realizaciones, la expresión de un miR supresor tumoral en una célula normal está aumentada en al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 % o más en comparación con células normales derivadas de un tipo de tejido o localización diferente en el organismo. Ejemplos de miARN supresores tumorales incluyen, aunque sin limitación, miR-15a, miR-16-1, miR-34, así como miARN de la familia de let-7. Ejemplos adicionales de miR supresores tumorales se enumeran en la tabla 3 y tabla 8.
La patogenia del cáncer es un proceso heterogéneo y multigénico. Por tanto, la activación de rutas particulares y la expresión de genes particulares puede dar lugar al desarrollo de cáncer en un contexto, y provocar resultados distintos u opuestos cuando se activan o expresan en un contexto diferente. Por lo tanto, la caracterización de un gen o miR particular como "oncogén" o "miR oncógeno" o como "supresor tumoral" o "miR supresor tumoral" no es una distinción binaria y a menudo depende de contexto. Por ejemplo, miR-152b funciona como miR oncógeno en la inmensa mayoría de neoplasias hemáticas, pero funciona como miR supresor tumoral en muchos tumores sólidos. Además, un miR particular puede expresarse elevadamente tanto en células cancerosas como en no cancerosas. Por ejemplo, miR-155 se expresa elevadamente en células normales, desempeñando una función esencial en la polarización de macrófagos, y también se expresa elevadamente en células cancerosas. Por tanto, el desarrollo de los virus oncolíticos editores del genoma y remodeladores del microentorno atenuados por miR descritos en este documento se basa en la expresión diferencial de un miR o grupo de miR particular en una población de células o tejido en comparación con otra población de células o tejido. Un experto en la materia entenderá que la expresión miR supresor tumoral en general se refiere a un miR que se expresa más elevadamente en una célula o tejido no canceroso en comparación con una célula o tejido canceroso, y que la expresión miR oncógeno en general se refiere a un miR que se expresa más elevadamente en una célula o tejido canceroso en comparación con una célula o tejido no canceroso. Un experto en la materia entenderá además que un miR caracterizado como miR supresor tumoral en un tipo de cáncer puede funcionar o puede no funcionar como miR supresor tumoral en un tipo diferente de cáncer, y que un miR caracterizado como miR oncógeno en un tipo de cáncer puede funcionar o puede no funciona como miR oncógeno en un tipo diferente de cáncer.
La tabla 1 muestra la relación entre 12 oncomiR seleccionados (9 supresores tumorales y 3 miARN oncógenos) y numerosos cánceres. Se muestra una lista de 3410 relaciones de oncomiR-cáncer en la tabla 2. Los miARN regulan mucho transcritos de proteínas que están implicadas en el control de la proliferación celular y apoptosis. Las proteínas reguladas incluyen protoncoproteínas y supresores tumorales convencionales tales como Ras, Myc, Bcl2, PTEN y p53. Por lo tanto, la expresión aberrante de miARN a menudo está implicada en el desarrollo de cáncer y puede corregirse terapéuticamente inhibiendo los miARN oncógenos o remplazando el miARN supresor tumoral reducido. Además, la expresión diferencial de oncomiR particulares en células cancerosas frente a no cancerosas puede explotarse como medio para dirigir tratamientos contra el cáncer específicamente a células cancerosas. Por tanto, los vectores víricos oncolíticos descritos en este documento pueden comprender las siguientes propiedades individualmente o en combinación: inserción de secuencias diana de miARN supresor tumoral en el genoma vírico, restringiendo de ese modo la replicación del vector vírico a células cancerosas o tumorales; uno o más polinucleótidos incorporados en el genoma vírico cuyo producto o productos alteran la función de un miARN oncógeno y/o la matriz extracelular cancerosa; y/o anticuerpos activados por proteasa incorporados en la partícula vírica para dirigir de forma elevadamente selectiva los vectores a células cancerosas y/o tumorales.
En este documento se describe un virus oncolítico (o vector vírico) recombinante que comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral (por ejemplo, un miARN seleccionado de los miARN enumerados en la tabla 3 o tabla 8) insertadas en un locus de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. En determinadas realizaciones, un virus oncolítico recombinante puede comprender secuencias diana de miARN supresor tumoral insertadas en un locus de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez genes víricos requeridos para replicación vírica. Los miARN supresores tumorales expresados en células normales (no cancerosas) pueden unirse a dichas secuencias diana y suprimir la expresión del gen vírico que contiene la secuencia diana de miARN, limitando de ese modo la replicación vírica en células sanas no cancerosas. Dichos virus oncolíticos y/o vectores recombinantes se denominan en este documento "atenuados por miR" o "de replicación restringida" ya que provocan replicación vírica reducida o atenuada en células que expresan un miR supresor tumoral que puede unirse a la secuencia diana de miR supresor tumoral incorporada en comparación con células que no expresan, o tienen expresión reducida de, el miR supresor tumoral. Incorporando los miARN supresores tumorales en genes clave requeridos para replicación vírica, puede suprimirse de forma condicional la replicación vírica en células diploides normales que expresan los miARN supresores tumorales y puede proceder normalmente en células que no expresan los miARN supresores tumorales. En dichas realizaciones, las células sanas no cancerosas se protegen de los efectos líticos de infección por el vector vírico recombinante.
En determinadas realizaciones, la una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral se incorporan en la región no traducida (UTR) 5' y/o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. En células diploides normales, os miARN supresores tumorales pueden unirse a la secuencia no codificante 3' o 5' manipulada que comprende una secuencia diana de miARN supresor tumoral, pero estos miARN supresores tumorales están ausentes en células transformadas o malignas. Por tanto, la replicación vírica puede proceder en las células que carecen, o tienen expresión reducida de, los miARN supresores tumorales. En algunas realizaciones, el vector vírico oncolítico puede comprender múltiples copias de una secuencia diana de miR supresor tumoral idéntica incorporada en un gen vírico requerido para replicación. Por ejemplo, puede incorporarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más copias de una secuencia diana de miR supresor tumoral en un gen vírico requerido para replicación. En realizaciones particulares, se incorporan de 2 a 6 copias de una secuencia diana de miR supresor tumoral en la UTR 3' o 5' de un gen vírico requerido para replicación. En otras realizaciones, se incorporan 4 copias de una secuencia diana de miR supresor tumoral en la UTR 3' o 5' de un gen vírico requerido para replicación. En algunas realizaciones, el vector vírico oncolítico puede comprender múltiples copias de la misma secuencia diana de miR supresor tumoral incorporada en una pluralidad de genes víricos requeridos para replicación. Por ejemplo, puede incorporarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más copias de una secuencia diana de miR supresor tumoral en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más genes requeridos para replicación vírica. En realizaciones particulares, se incorporan de 2 a 6 copias de una secuencia diana de miR supresor tumoral en la UTR 3' o 5' de dos o más genes víricos requeridos para replicación. En otras realizaciones, se incorporan al menos 4 copias de una secuencia diana de miR supresor tumoral en la UTR 3' o 5' de dos o más genes víricos requeridos para replicación.
En algunas realizaciones, el vector vírico oncolítico puede comprender secuencias diana para más de un miR supresor tumoral incorporado en un gen vírico requerido para replicación. Por ejemplo, pueden incorporarse secuencias diana para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más miR supresores tumorales diferentes en un solo gen requerido para replicación vírica. En realizaciones de la invención, el vector vírico oncolítico comprende secuencias diana para más de un miR supresor tumoral incorporado en una pluralidad de genes víricos requeridos para replicación. Por ejemplo, pueden incorporarse secuencias diana para 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más miR supresores tumorales diferentes en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más genes requeridos para replicación vírica. En algunas realizaciones, el vector vírico oncolítico puede comprender múltiples secuencias diana (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 copias de una secuencia diana) para al menos dos miR supresores tumorales diferentes (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 diferentes miR supresores tumorales). En dichas realizaciones, las múltiples secuencias diana para un primer miR supresor tumoral pueden incorporarse en un primer gen requerido para replicación, las múltiples secuencias diana para un segundo miR supresor tumoral pueden incorporarse en un segundo gen requerido para replicación, las múltiples secuencias diana para un tercer miR supresor tumoral pueden incorporarse en un tercer gen requerido para replicación, etc. En realizaciones particulares, los vectores víricos oncolíticos descritos en este documento comprenden de al menos 2 a al menos 8 copias de la secuencia diana del primer miR supresor tumoral incorporada en la UTR 3' o 5' de un primer gen requerido para replicación, de al menos 2 a al menos 8 copias de la secuencia diana del segundo miR supresor tumoral incorporada en la UTR 3' o 5' de un segundo gen requerido para replicación, y de al menos 2 a al menos 8 copias de la secuencia diana de un tercer miR supresor tumoral incorporada en la UTR 3' o 5' de un tercer gen requerido para replicación.
En algunas realizaciones, los virus oncolíticos atenuados con miR descritos en este documento provocan replicación vírica reducida en una célula que expresa un miR supresor tumoral que puede unirse a una o más de las secuencias diana de miR incorporadas. "Replicación vírica" se refiere al número total de ciclos de replicación vírica que se producen en una célula o población de células particular durante una cantidad dada de tiempo. En algunas realizaciones, la replicación vírica puede medirse directamente evaluando la concentración vírica total presente durante el transcurso de la cantidad de tiempo dada, o evaluando el número de copias del genoma vírico presentes (por ejemplo, por secuenciación). En algunas realizaciones, el vector vírico puede comprender adicionalmente un marcador detectable, tal como un indicador fluorescente. En dichas realizaciones, la replicación vírica puede evaluarse midiendo la intensidad de fluorescencia del indicador, o el número de células que expresan el indicador. En algunas realizaciones, la replicación vírica puede medirse indirectamente evaluando el número de células viable durante el transcurso de la cantidad de tiempo dada. Por ejemplo, se esperaría que el nivel de replicación vírica se correlacionara inversamente con el número de células viables a lo largo del tiempo.
"Replicación vírica reducida", como se usa en este documento, se refiere a un nivel de replicación vírica que es menor en una primera célula o primera población de células en comparación con una segunda célula o segunda población de células. En algunas realizaciones, el nivel de replicación vírica en la primera célula o primera población de células se reduce en al menos un 5 % en comparación con el nivel de replicación vírica en la segunda célula o población de células. En algunas realizaciones, el nivel de replicación vírica en la primera célula o primera población de células se reduce en al menos un 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en comparación con el nivel de replicación vírica en la segunda célula o población de células. En algunas realizaciones, la replicación vírica en la primera célula o primera población de células se inhibe completamente en comparación con la replicación vírica en la segunda célula o población de células.
En algunas realizaciones, la replicación vírica reducida en la primera célula o primera población de células se correlaciona con la expresión de un miR supresor tumoral que puede unirse a la una o más secuencias diana de miR incorporadas en uno o más genes víricos requeridos para replicación. En algunas realizaciones, la expresión de un miR supresor tumoral correspondiente a la secuencia diana de miR incorporada, por lo tanto, inhibe o reduce la expresión del gen de replicación, inhibiendo o reduciendo de ese modo la replicación vírica. En algunas realizaciones, la segunda célula o segunda población de células no expresa, o tiene un nivel de expresión reducido, del miR supresor tumoral. En algunas realizaciones, la expresión ausente o reducida de un miR supresor tumoral (por ejemplo, en una célula cancerosa) correspondiente a la secuencia diana de miR incorporada permite que proceda la replicación vírica. En algunas realizaciones, el nivel de expresión del miR supresor tumoral en la segunda célula o población de células es al menos un 5 % menor que el nivel de expresión del miR supresor tumoral en la primera célula o población. En algunas realizaciones, el nivel de expresión del miR supresor tumoral en la segunda célula o población de células se reduce al menos un 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en comparación con el nivel de expresión del miR supresor tumoral en la primera célula o población. En algunas realizaciones, la segunda célula no expresa el miR supresor tumoral. En realizaciones particular, la primera célula es una célula no cancerosa y la segunda célula es una célula cancerosa.
En algunos aspectos, las múltiples copias (por ejemplo, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 o más copias) de una secuencia diana de miARN supresor tumoral se insertan en un locus en el genoma vírico en tándem. En dichas realizaciones, las múltiples copias de la secuencia diana pueden estar separadas por una secuencia conectora o una secuencia espaciadora. En algunas realizaciones, la secuencia conectora y/o espaciadora comprende 4 o más nucleótidos. Por ejemplo, una secuencia espaciadora o conectora puede comprender 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia conectora o la secuencia espaciadora comprende de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nucleótidos. En otras realizaciones, la secuencia conectora o la secuencia espaciadora comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 16 nucleótidos. Como realización ilustrativa, y sin intención de limitar la presente invención de ninguna manera, un virus oncolítico puede comprender al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez de una o más de las siguientes subunidades insertadas en tándem en un locus de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica: (a) secuencia diana para un primer miARN supresor tumoral - secuencia conectora o espaciadora - secuencia diana para el primer miARN supresor tumoral; o (b) secuencia diana para un primer miARN supresor tumoral - secuencia conectora o espaciadora - secuencia diana para un segundo miARN supresor tumoral. En algunas realizaciones, la secuencia diana de miARN es el complemento inverso del miARN.
En realizaciones de la invención, un virus oncolítico es un virus del herpes simple (HSV), y los genes víricos requeridos para replicación vírica son ICP4 y UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26,5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP22, ICP27, ICP47, gamma-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 y/o US12. En algunas realizaciones, un virus oncolítico es un virus del herpes simple (HSV), y la una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral se incorpora en ICP4 y uno o más de los genes ICP0, UL19 e ICP27. En determinadas realizaciones, un vector vírico oncolítico es un HSV que comprende una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral (por ejemplo, cualquiera de los miR supresores tumorales enumerados en la tabla 3) incorporadas en la UTR 5' o 3' de uno o más genes (por ejemplo, UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26,5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP22, ICP27, ICP47, gamma-34.5, US3, US4, US5, US6, u S7, US8, US9, US10, US11 o US12) que se requieren para replicación vírica (por ejemplo, figuras 39-49).
En algunos ejemplos también divulgados en este documento, un vector vírico de replicación restringida (por ejemplo, un vector vírico atenuado por miR) comprende al menos una secuencia diana de let-7 y se usa para tratar cáncer pulmonar. En algunos ejemplos, un vector vírico de replicación restringida comprende al menos una secuencia diana de miR-15a y/o al menos una de miR-16A y se usa para tratar leucemia linfocítica crónica de linfocitos B. En algunos ejemplos, un vector vírico de replicación restringida comprende al menos una secuencia diana de miR-125b, al menos una de miR-145, al menos una de miR-21 y/o al menos una de miR-155 y se usa para tratar cáncer de mama. En otros ejemplos, un vector vírico de replicación restringida comprende al menos una secuencia diana de miR-143 y/o al menos una de miR-145 y se usa para tratar cáncer colorrectal. En determinados ejemplos, un vector vírico de replicación restringida comprende al menos una secuencia diana de miR-181a, al menos una de miR-181b y/o al menos una de miR-181c y se usa para tratar glioblastoma. En algunos ejemplos, un vector vírico de replicación restringida comprende al menos una secuencia diana de miR-199a*, al menos una de miR-195, al menos una de miR-199a, al menos una de miR-200a y/o al menos una de miR-125a y se usa para tratar cáncer de hígado (por ejemplo, carcinoma hepatocelular).
En todas las realizaciones de la invención, un locus de ICP4 del genoma de HSV recombinante comprende al menos una secuencia diana de miR-124. En realizaciones particulares, un vector vírico de replicación restringida comprende al menos una secuencia diana de miR-451a, al menos una secuencia diana de miR-143-3p, al menos una secuencia diana de miR-559 y al menos una secuencia diana de miR-124 y es adecuado para usarse para el tratamiento de cáncer pancreático, pulmonar y/o de colon. En dichas realizaciones, las secuencias diana para miR-451a, miR-143-3p, miR-559 y miR-124 se incorporan en dos o más genes requeridos para replicación vírica (por ejemplo, ICP4 e ICP27). En realizaciones particulares adicionales, un vector vírico de replicación restringida comprende al menos una secuencia diana de miR-451a, al menos una secuencia diana de miR-145-5p, al menos una secuencia diana de miR559 y al menos una secuencia diana de miR-124 y es adecuado para usarse para el tratamiento de cualquier tipo de cáncer descrito en este documento. En dichas realizaciones, las secuencias diana para miR-451a, miR-145-5p, miR-559 y miR-124 se incorporan en dos o más genes requeridos para replicación vírica (por ejemplo, ICP4 e ICP27). En realizaciones particulares adicionales, un vector vírico de replicación restringida comprende al menos una secuencia diana de miR-205p, al menos una secuencia diana de miR-141-5p, al menos una secuencia diana de miR-31-5p y al menos una secuencia diana de miR-124 y es adecuado para usarse para el tratamiento de schwannoma. En dichas realizaciones, las secuencias diana para miR-205p, miR-141-5p, miR-31-5p y miR-124 se incorporan en dos o más genes requeridos para replicación vírica (por ejemplo, ICP4 e ICP27).
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para miR-136-3p, miR-432-5p, miR-1-3p, miR-127-3p, miR-379-5p, miR-493-5p, miR-223-5p, miR-223-5p, miR-136-5p, miR-451a, miR-487b-3p, miR-370-3p, miR-410-3p, miR-431-3p, miR-4485-3p, miR-4485-5p, miR-127-5p, miR-409-3p, miR-338-3p, miR-559, miR-411-5p, miR-133a-5p, miR-143-3p, miR-376b-3p, miR-758-3p, miR-1, miR-101, miR-1180, miR-1236, miR-124-3p, miR-125b, miR-126, miR-1280, miR-133a, miR-133b, miR-141, miR-143, miR-144, miR-145, miR-155, miR-16, miR-18a, miR-192, miR-195, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-218, miR-23b, miR-26a, miR-29c, miR-320c, miR-34a, miR-370, miR-409-3p, miR-429, miR-451, miR-490-5p, miR-493, miR-576-3p y/o miR-99a insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer de vejiga.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para miR-1251-5p, miR-219a-5p, miR-219a-2-3p, miR-124-3p, miR-448, miR-138-2-3p, miR-490-5p, miR-129-1-3p, miR-1264, miR-3943, miR-490-3p, miR-383-5p, miR-133b, miR-129-2-3p, miR-128-2-5p, miR-133a-3p, miR-129-5p, miR-1-3p, miR-885-3p, miR-124-5p, miR-759, miR-7158-3p, miR-770-5p, miR-135a-5p, miR-885-5p, let-7 g-5p, miR-100, miR-101, miR-106a, miR-124, miR-124a, miR-125a, miR-125a-5p, miR-125b, miR-127-3p, miR-128, miR-129, miR-136, miR-137, miR-139-5p, miR-142-3p, miR-143, miR-145, miR-146b-5p, miR-149, miR-152, miR-153, miR-195, miR-21, miR-212-3p, miR-219-5p, miR-222, miR-29b, miR-31, miR-3189-3p, miR-320, miR-320a, miR-326, miR-330, miR-331-3p, miR-340, miR-342, miR-34a, miR-376a, miR-449a, miR-483-5p, miR-503, miR-577, miR-663, miR-7, miR-7-5p, miR-873, let-7a, let-7f, miR-107, miR-122, miR-124-5p, miR-139, miR-146a, miR-146b, miR-15b, miR-16, miR-181a, miR-181a-1, miR-181a-2, miR-181b, miR-181b-1, miR-181 b-2, miR-181c, miR-181d, miR-184, miR-185, miR-199a-3p, miR-200a, miR-200b, miR-203, miR-204, miR-205, miR-218, miR-23b, miR-26b, miR-27a, miR-29c, miR-328, miR-34c-3p, miR-34c-5p, miR-375, miR-383, miR-451, miR-452, miR-495, miR-584, miR-622, miR-656, miR-98, miR-124-3p, miR-181b-5p, miR-200b y/o miR-3189-3p insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer cerebral. En determinadas realizaciones, el cáncer cerebral es astrocitoma, glioblastoma o glioma.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para miR-10b-5p, miR-126-3p, miR-145-3p, miR-451a, miR-199b-5p, miR-5683, miR-3195, miR-3182, miR-1271-5p, miR-204-5p, miR-409-5p, miR-136-5p, miR-514a-5p, miR-559, miR-483-3p, miR-1-3p, miR-6080, miR-144-3p, miR-10b-3p, miR-6130, miR-6089, miR-203b-5p, miR-4266, miR-4327, miR-5694, miR-193b, let-7a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7 g, let-7i, miR-100, miR-107, miR-10a, miR-10b, miR-122, miR-124, miR-1258, miR-125a-5p, miR-125b, miR-126, miR-127, miR-129, miR-130a, miR-132, miR-133a, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-146b, miR-147, miR-148a, miR-149, miR-152, miR-153, miR-15a, miR-16, miR-17-5p, miR-181a, miR-1826, miR-183, miR-185, miR-191, miR-193a-3p, miR-195, miR-199b-5p, miR-19a-3p, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-205, miR-206, miR-211, miR-216b, miR-218, miR-22, miR-26a, miR-26b, miR-300, miR-30a, miR-31, miR-335, miR-339-5p, miR-33b, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-374a, miR-379, miR-381, miR-383, miR-425, miR-429, miR-450b-3p, miR-494, miR-495, miR-497, miR-502-5p, miR-517a, miR-574-3p, miR-638, miR-7, miR-720, miR-873, miR-874, miR-92a, miR-98, miR-99a, mmu-miR-290-3p y/o mmu-miR-290-5p insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer de mama.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para miR-143, miR-145, miR-17-5p, miR-203, miR-214, miR-218, miR-335, miR-342-3p, miR-372, miR-424, miR-491-5p, miR-497, miR-7, miR-99a, miR-99b, miR-100, miR-101, miR-15a, miR-16, miR-34a, miR-886-5p, miR-106a, miR-124, miR-148a, miR-29a y/o miR-375 insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer cervicouterino.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para miR-133a-5p, miR-490-5p, miR-124-3p, miR-137, miR-655-3p, miR-376c-3p, miR-369-5p, miR-490-3p, miR-432-5p, miR-487b-3p, miR-342-3p, miR-223-3p, miR-136-3p, miR-136-3p, miR-143-5p, miR-1-3p, miR-214-3p, miR-143-3p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-451a, miR-127-3p, miR-133a-3p, miR-145-5p, miR-145-3p, miR-199a-5p, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7 g, let-7i, miR-100, miR-101, miR-126, miR-142-3p, miR-143, miR-145, miR-192, miR-200c, miR-21, miR-214, miR-215, miR-22, miR-25, miR-302a, miR-320, miR-320a, miR-34a, miR-34c, miR-365, miR-373, miR-424, miR-429, miR455, miR-484, miR-502, miR-503, miR-93, miR-98, miR-186, miR-30a-5p, miR-627, let-7a, miR-1, miR-124, miR-125a, miR-129, miR-1295b-3p, miR-1307, miR-130b, miR-132, miR-133a, miR-133b, miR-137, miR-138, miR-139, miR-139-5p, miR-140-5p, miR-148a, miR-148b, miR-149, miR-150-5p, miR-154, miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-18a, miR-191, miR-193a-5p, miR-194, miR-195, miR-196a, miR-198, miR-199a-5p, miR-203, miR-204-5p, miR-206, miR-212, miR-218, miR-224, miR-24-3p, miR-26b, miR-27a, miR-28-3p, miR-28-5p, miR-29b, miR-30a-3p, miR-30b, miR-328, miR-338-3p, miR-342, miR-345, miR-34a-5p, miR-361-5p, miR-375, miR-378, miR-378a-3p, miR-378a-5p, miR-409-3p, miR-422a, miR-4487, miR-483, miR-497, miR-498, miR-518a-3p, miR-551a, miR-574-5p, miR-625, miR-638, miR-7, miR-96-5p, miR-202-3p, miR-30a y/o miR-451 insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer de colon o colorrectal.
En ejemplos también divulgados en este documento, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para miR-101, miR-130a, miR-130b, miR-134, miR-143, miR-145, miR-152, miR-205, miR-223, miR-301a, miR-301b, miR-30c, miR-34a, miR-34c, miR-424, miR-449a, miR-543 y/o miR-34b insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer endometrial.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para miR-125b, miR-138, miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-16-1, miR-16-1 -3p, miR-16-2, miR-181a, miR-181b, miR-195, miR-223, miR-29b, miR-34b, miR-34c, miR-424, miR-10a, miR-146a, miR-150, miR-151, miR-155, miR-2278, miR-26a, miR-30e, miR-31, miR-326, miR-564, miR-27a, let-7b, miR-124a, miR-142-3p, let-7c, miR-17, miR-20a, miR-29a, miR-30c, miR-720, miR-107, miR-342, miR-34a, miR-202, miR-142-5p, miR-29c, miR-145, miR-193b, miR-199a, miR-214, miR-22, miR-137 y/o miR-197 insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer hemático. En algunas realizaciones, el cáncer hemático es leucemia, linfoma o mieloma.
En ejemplos también divulgados en este documento, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para miR-1, miR-145, miR-1826, miR-199a, miR-199a-3p, miR-203, miR-205, miR-497, miR-508-3p, miR-509-3p, let-7a, let-7d, miR-106a*, miR-126, miR-1285, miR-129-3p, miR-1291, miR-133a, miR-135a, miR-138, miR-141, miR-143, miR-182-5p, miR-200a, miR-218, miR-28-5p, miR-30a, miR-30c, miR-30d, miR-34a, miR-378, miR-429, miR-509-5p, miR-646, miR-133b, let-7b, let-7c, miR-200c, miR-204, miR-335, miR-377 y/o miR-506 insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer renal.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7f-1, let-7f-2, let-7 g, let-7i, miR-1, miR-100, miR-101, miR-105, miR-122, miR-122a, miR-1236, miR-124, miR-125b, miR-126, miR-127, miR-1271, miR-128-3p, miR-129-5p, miR-130a, miR-130b, miR-133a, miR-134, miR-137, miR-138, miR-139, miR-139-5p, miR-140-5p, miR-141, miR-142-3p, miR-143, miR-144, miR-145, miR-146a, miR-148a, miR-148b, miR-150-5p, miR-15b, miR-16, miR-181a-5p, miR-185, miR-188-5p, miR-193b, miR-195, miR-195-5p, miR-197, miR-198, miR-199a, miR-199a-5p, miR-199b, miR-199b-5p, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-202, miR-203, miR-204-3p, miR-205, miR-206, miR-20a, miR-21, miR-21-3p, miR-211, miR-212, miR-214, miR-217, miR-218, miR-219-5p, miR-22, miR-223, miR-26a, miR-26b, miR-29a, miR-29b-1, miR-29b-2, miR-29c, miR-302b, miR-302c, miR-30a, miR-30a-3p, miR-335, miR-338-3p, miR-33a, miR-34a, miR-34b, miR-365, miR-370, miR-372, miR-375, miR-376a, miR-377, miR-422a, miR-424, miR-424-5p, miR-433, miR-4458, miR-448, miR-450a, miR-451, miR-485-5p, miR-486-5p, miR-497, miR-503, miR-506, miR-519d, miR-520a, miR-520b, miR-520c-3p, miR-582-5p, miR-590-5p, miR-610, miR-612, miR-625, miR-637, miR-675, miR-7, miR-877, miR-940, miR-941, miR-98, miR-99a, miR-132 y/o miR-31 insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer hepático. En algunas realizaciones, el cáncer hepático es carcinoma hepatocelular.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para miR-143-3p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-1266-3p, miR-6130, miR-6080, miR-511-5p, miR-143-5p, miR-223-5p, miR-199b-5p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-451a, miR-142-5p, miR-144, miR-150-5p, miR-142-3p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-199a-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-1297, miR-141, miR-145, miR-16, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-29b, miR-381, miR-409-3p, miR-429, miR-451, miR-511, miR-99a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7 g, let-7i, miR-1, miR-101, miR-133b, miR-138, miR-142-5p, miR-144, miR-1469, miR-146a, miR-153, miR-15a, miR-15b, miR-16-1, miR-16-2, miR-182, miR-192, miR-193a-3p, miR-194, miR-195, miR-198, miR-203, miR-217, miR-218, miR-22, miR-223, miR-26a, miR-26b, miR-29c, miR-33a, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-365, miR-449a, miR-449b, miR-486-5p, miR-545, miR-610, miR-614, miR-630, miR-660, miR-7515, miR-9500, miR-98, miR-99b, miR-133a, let-7a, miR-100, miR-106a, miR-107, miR-124, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-126, miR-126*, miR-129, miR-137, miR-140, miR-143, miR-146b, miR-148a, miR-148b, miR-149, miR-152, miR-154, miR-155, miR-17-5p, miR-181a-1, miR-181a-2, miR-181b, miR-181b-1, miR-181b-2, miR-181c, miR-181d, miR-184, miR-186, miR-193b, miR-199a, miR-204, miR-212, miR-221, miR-224, miR-27a, miR-27b, miR-29a, miR-30a, miR-30b, miR-30c, miR-30d, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-32, miR-335, miR338-3p, miR-340, miR-342-3p, miR-361-3p, miR-373, miR-375, miR-4500, miR-4782-3p, miR-497, miR-503, miR-512-3p, miR-520a-3p, miR-526b, miR-625* y/o miR-96 insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer pulmonar.
En ejemplos también divulgados en este documento, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para let-7b, miR-101, miR-125b, miR-1280, miR-143, miR-146a, miR-146b, miR-155, miR-17, miR-184, miR-185, miR-18b, miR-193b, miR-200c, miR-203, miR-204, miR-205, miR-206, miR-20a, miR-211, miR-218, miR-26a, miR-31, miR-33a, miR-34a, miR-34c, miR-376a, miR-376c, miR-573, miR-7-5p, miR-9 y/o miR-98 insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar melanoma.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para let-7d, miR-218, miR-34a, miR-375, miR-494, miR-100, miR-124, miR-1250, miR-125b, miR-126, miR-1271, miR-136, miR-138, miR-145, miR-147, miR-148a, miR-181a, miR-206, miR-220a, miR-26a, miR-26b, miR-29a, miR-32, miR-323-5p, miR-329, miR-338, miR-370, miR-410, miR-429, miR-433, miR-499a-5p, miR-503, miR-506, miR-632, miR-646, miR-668, miR-877 y/o miR-9 insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer bucal.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para let-7i, miR-100, miR-124, miR-125b, miR-129-5p, miR-130b, miR-133a, miR-137, miR-138, miR-141, miR-145, miR-148a, miR-152, miR-153, miR-155, miR-199a, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-212, miR-335, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-409-3p, miR-411, miR-429, miR-432, miR-449a, miR-494, miR-497, miR-498, miR-519d, miR-655, miR-9, miR-98, miR-101, miR-532-5p, miR-124a, miR-192, miR-193a y/o miR-7 insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer ovárico.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para miR-216a-5p, miR-802, miR-217, miR-145-3p, miR-143-3p, miR-451a, miR-375, miR-214-3p, miR-216b-3p, miR-432-5p, miR-216a-3p, miR-199b-5p, miR-199a-5p, miR-136-3p, miR-216b-5p, miR-136-5p, miR-145-5p, miR-127-3p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-559, miR-129-2-3p, miR-4507, miR-1 -3p, miR-148a-3p, miR-101, miR-1181, miR-124, miR-1247, miR-133a, miR-141, miR-145, miR-146a, miR-148a, miR-148b, miR-150*, miR-150-5p, miR-152, miR-15a, miR-198, miR-203, miR-214, miR-216a, miR-29c, miR-335, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-373, miR-375, miR-410, miR-497, miR-615-5p, miR-630, miR-96, miR-132, let-7a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7 g, let-7i, miR-126, miR-135a, miR-143, miR-144, miR-150, miR-16, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-217, miR-218, miR-337, miR-494 y/o miR-98 insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer pancreático.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para let-7a-3p, let-7c, miR-100, miR-101, miR-105, miR-124, miR-128, miR-1296, miR-130b, miR-133a-1, miR-133a-2, miR-133b, miR-135a, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-154, miR-15a, miR-187, miR-188-5p, miR-199b, miR-200b, miR-203, miR-205, miR-212, miR-218, miR-221, miR-224, miR-23a, miR-23b, miR-25, miR-26a, miR-26b, miR-29b, miR-302a, miR-30a, miR-30b, miR-30c-1, miR-30c-2, miR-30d, miR-30e, miR-31, miR-330, miR-331-3p, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-374b, miR-449a, miR-4723-5p, miR-497, miR-628-5p, miR-642a-5p, miR-765 y/o miR-940 insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar cáncer de próstata.
En ejemplos también divulgados en este documento, un virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de copias de una o más secuencias diana de miARN supresor tumoral para miR-101, miR-183, miR-204, miR-34a, miR-365b-3p, miR-486-3p y/o miR-532-5p insertadas en la UTR 5' o UTR 3' de uno o más genes víricos requeridos para replicación vírica. Este virus oncolítico puede usarse en métodos y composiciones para tratar retinoblastoma.
En realizaciones de la invención, un virus oncolítico descrito en este documento es un virus del herpes simple y en el que los genes víricos requeridos para replicación vírica son ICP4 y se seleccionan del grupo que consiste en UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26,5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP22, ICP27, ICP47, gamma-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 y US12.
En algunos casos, el vector vírico recombinante de la invención es un virus del herpes simple (HSV) y comprende además una eliminación de la región (unión) de repeticiones internas que comprende una copia de cada uno de los genes diploides ICP0, ICP34,5, LAT e ICP4 junto con el promotor para el gen ICP47.
En determinadas realizaciones, el vector vírico recombinante de la invención es un HSV que muestra entrada potenciada en las células, a través de infección directa y/o propagación lateral. En un aspecto, los vectores de HSV de la presente invención pueden infectar directamente células a través de interacción con proteínas celulares distintas de mediadores típicos de infección por HSV (por ejemplo, distintas de nectina-1, HVEM o proteoglucanos de sulfato de heparano/sulfato de condroitina). En determinadas realizaciones, el vector vírico recombinante de la invención es un HSV y comprende además una mutación del gen gB o gH que facilita la entrada del vector a través de receptores no canónicos. En otro aspecto, la invención proporciona un vector de HSV que comprende además glucoproteínas gH mutantes que muestran propagación lateral en células típicamente resistentes a propagación lateral de HSV, tales como células que carecen de receptores de gD. En algunas realizaciones, un vector de HSV de la invención comprende una o más de las proteínas gB o gH mutantes como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2013/0096186. En determinados aspectos, la proteína de entrada mutante dentro de un vector de HSV es una glucoproteína implicada con la entrada vírica, tal como gB, gH, y el vector de HSV mutante puede comprender versiones mutadas de ambas. Sin embargo, la proteína de entrada mutante puede ser cualquier proteína que logre la entrada del vector de HSV en las células. En determinadas realizaciones, la proteína de entrada mutante es distinta de gD, aunque el vector de HSV puede comprender adicionalmente una gD mutante, tal como conteniendo un ligando u otra mutación deseada. Mutaciones no limitantes de glucoproteína gB o gH para su uso en el vector de HSV innovador se producen en uno o más de los siguientes residuos: gB:D285, gB:A549, gB:S668, gH:N753 y gH:A778. En algunas realizaciones, el vector de HSV innovador comprende mutaciones tanto en gB:D285 como en gB:A549, tanto en gH:N753 como en gH:A778, y/o en cada una de gB:S668, gH:N753 y gH:A778. En determinadas realizaciones, el vector de HSV contiene dos o más de dichas mutaciones (por ejemplo, 3 o más, 4 o más), y el vector de HSV puede comprender mutaciones en estos cinco residuos. En una realización, un vector de HSV tiene mutaciones en gB:285, gB;549, gH:753 y gH:778. Las mutaciones se denominan en este documento con respecto a la numeración de codones (aminoácidos) de los genes de gD, gB y gH del derivado K26GFP de la cepa KOS de HSV-1. Las secuencias para gB y gH de K26GFP difieren de las secuencias para gB divulgadas en GenBank (n.° AF311740) y para gH (GenBank n.° X03896) reflejadas en la siguiente tabla:
Figure imgf000017_0001
Sin embargo, K26GFP puede contener diferencias adicionales en la región del gen correspondiente a los nucleótidos 2079-2102 de GenBank X03896. Por tanto, se entenderá que la secuencia del derivado K26GFP de KOS o el n.° de acceso a GenBank AF311740 puede servir como secuencia de referencia para las mutaciones de gB analizadas en este documento. Además, la secuencia del derivado K26GFP de KOS o el n.° de acceso a GenBank X03896 puede servir como secuencia de referencia para las mutaciones de gH analizadas en este documento. Sin embargo, los vectores de HSV de la invención pueden incluir mutaciones homólogas en gB y gH de cualquier cepa de HSV.
En algunos aspectos, la mutación de la proteína de entrada para su inclusión en un vector de HSV es una mutación de sustitución; sin embargo, las mutaciones no se limitan a mutantes de sustitución. En determinadas realizaciones, las glucoproteínas gB o gH mutantes para su uso en un vector de HSV se seleccionan del grupo de mutaciones de sustitución que consiste en gB:D285N, gB:A549T, gB:S668N, gH:N753K, gH:A778V. En determinados aspectos, un vector de HSV incluye combinaciones de estas sustituciones (tal como dos o más de dichas sustituciones (por ejemplo, 3 o más, 4 o más, o todas)), siendo el mutante doble gB:D285N/gB:A549T, el mutante doble gH:N753K/gH:A778V y el mutante triple gB:S668N/gH:N753K/gH:A778V ejemplos de realizaciones. En una realización, un vector de HSV comprende gB:D285N/gB:A549T/gH:N753K/gH:A778V.
En determinados aspectos, un vector de HSV comprende una glucoproteína gB mutante y/o gH mutante, en el que las mutaciones en las glucoproteínas son mutaciones de sustitución en al menos dos residuos, en el que, cuando el vector es HSV-1 K26GFP, los al menos dos residuos se seleccionan del grupo que consiste en gB:D285, gB:A549, gB:S668, gH:N753 y gH:A778, o en el que, cuando el vector es un HSV homólogo, los al menos dos residuos se seleccionan de aminoácidos que se correlacionan con gB:D285, gB:A549, gB:S668, gH:N753 y gH:A778, en el que el residuo gB:D285 se correlaciona con X en VYPYXEFVL (SEQ ID NO:1), el residuo gB:A549 se correlaciona con X en KLNPNXIAS (SEQ ID NO:2), el residuo gB:S668 se correlaciona con X en ITTVXTFID (SEQ ID NO:3), el residuo gH:N753 se correlaciona con X en VDTDXTQQQ (SEQ ID NO:4) y el residuo gH:A778 se correlaciona con X en VPSTXLLLF (SEQ ID NO:5); y en el que el vector de HSV es un vector de HSV-1 o HSV-2.
En un aspecto, la invención abarca un virus oncolítico recombinante que comprende al menos un polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido (por ejemplo, un ARNhc, un oligonucleótido de señuelo o un antagomir) que reduce la expresión o inhibe la función de un miARN, un gen o un inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP). Dichos virus oncolíticos recombinantes se denominan en este documento virus o vectores "editores del genoma" o "remodeladores del microentorno''. La proteína codificada u oligonucleótido puede reducir la expresión o inhibir la función de un miARN, gen o TIMP de innumerables maneras, incluyendo acción dirigida de la proteína (por ejemplo, un TIMP) para degradación (por ejemplo, por ubiquitinación y degradación proteosómica o acción dirigida para degradación lisosómica), bloqueo de interacciones con receptores análogos (por ejemplo, anticuerpos bloqueantes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos o inhibidores peptídicos), degradación de transcritos de ARN mensajero (por ejemplo, un ARN interferente corto o ARN en horquilla corto) y/o alteración de la secuencia de ADN genómica que codifica el miR, gen o proteína específica (por ejemplo, mediante una endonucleasa).
En realizaciones particulares, la proteína u oligonucleótido reduce la expresión de un miR o un gen implicado en carcinogénesis o metástasis (por ejemplo, un miR oncógeno o un oncogén). En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende al menos un polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido que reduce la expresión o función de un miARN que es un miARN oncógeno (por ejemplo, uno o más de los miARN enumerados en la tabla 4). En algunas realizaciones, el virus oncolítico recombinante comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más polinucleótidos que codifican una proteína u oligonucleótido que reduce la expresión o función de un miARN oncógeno. En algunas realizaciones, el virus oncolítico recombinante comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más polinucleótidos que codifican una pluralidad de proteínas u oligonucleótidos que reducen la expresión o función de una pluralidad de miARN oncógenos. En algunas realizaciones, la proteína u oligonucleótido reduce la expresión de miR-17-92 y se usa para tratar cáncer pulmonar (por ejemplo, cáncer pulmonar microcítico). En otras realizaciones, la proteína u oligonucleótido reduce la expresión de miR-221 y/o miR-21 y se usa para tratar glioblastoma. En determinadas realizaciones, la proteína u oligonucleótido reduce la expresión de miR-155 y/o miR-17-92 y se usa para tratar linfoma (por ejemplo, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de zona marginal o leucemia linfocítica crónica). En algunas realizaciones, la proteína u oligonucleótido reduce la expresión de miR-221, miR-222 y/o miR-146 y se usa para tratar cáncer tiroideo. En algunas realizaciones, la proteína u oligonucleótido reduce la expresión de miR-372 y/o miR-373 y se usa para tratar cáncer testicular (por ejemplo, tumores de células germinales testiculares). En algunas realizaciones, la proteína u oligonucleótido reduce la expresión de miR-18 y/o miR-224 y se usa para tratar cáncer hepático (por ejemplo, carcinoma hepatocelular).
En algunas realizaciones, un vector vírico recombinante descrito en este documento puede usarse para degradar la matriz extracelular (ECM) tumoral, que en algunos aspectos da lugar a propagación vírica potenciada. Las metaloproteinasas de matriz (MMP) son proteasas dependientes de cinc que se clasifican, basándose en su actividad, en colagenasas, gelatinasas, estromelisinas y matrilisinas. Estas proteasas en general se secretan como proenzimas (zimógenos) y se activan por eliminación proteolítica del prodominio propeptídico. La función principal que las MMP desempeñan en cáncer es en la degradación de la ECM, que facilita la invasión y metástasis tumoral. Las MMP también están implicadas en la progresión tumoral, la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) y la angiogénesis. Las MMP se regulan por miARN, así como TIMP, que comprenden una familia de cuatro inhibidores de proteasa (TIMP1, TIMP2, TIMP3 y TIMP4). Puede degradarse una amplia serie de microentornos tumorales alteran los miARN o TIMP que regulan negativamente la familia de MMP con los vectores víricos recombinantes de la invención. Ejemplos de interacciones de miARN/MMP se muestran en la tabla 5. Muchas de estas interacciones muestran que múltiples MMP se regulan mediante un solo miARN: por ejemplo, let-7 regula MMP-2, MMP-9 y MMP-14; miR-143 regula MMP-2, MMP-9 y MMP-13; miR-218 regula MMP-2, MMP-7 y MMP-9. Además, la inmensa mayoría de las MMP pueden regularse mediante un solo conmutador fundamental de TIMP: por ejemplo, se sabe que TIMP1 inhibe casi todas las MMP conocidas y también promueve toda la proliferación en una amplia gama de tipos celulares; TIMP2 interactúa con MMP-14 y MMP-2.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende al menos un polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido que reduce la expresión o función de un miARN que es un miARN remodelador del microentorno (por ejemplo, uno o más de los miARN enumerados en la tabla 5). En algunas realizaciones, la proteína u oligonucleótido reduce la expresión o función de un miARN remodelador del microentorno. En algunas realizaciones, la proteína u oligonucleótido reduce la expresión o función de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más miARN remodeladores del microentorno. En algunas realizaciones, el virus oncolítico recombinante comprende una pluralidad de polinucleótidos que codifican una pluralidad de proteínas u oligonucleótidos que reducen la expresión o función de una pluralidad de miARN remodeladores del microentorno. En algunas realizaciones, las estrategias descritas en este documento pueden utilizarse mediante vectores víricos recombinantes de la presente invención para atenuar o alterar la expresión o función de miARN o TIMP que regulan negativamente MMP. En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante reduce la expresión de un TIMP seleccionado de TIMP1, TIMP2, TIMP3 y TIMP4.
En algunas realizaciones, los virus oncolíticos recombinantes descritos en este documento comprenden al menos un polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido que reduce la expresión o función de un gen. En algunos aspectos, el gen es un gen oncógeno (por ejemplo, un gen seleccionado de los genes enumerados en la tabla 7). En algunos aspectos, el gen codifica un miR oncógeno (por ejemplo, un miARN enumerado en la tabla 4), un miR remodelador del microentorno (por ejemplo, un miARN enumerado en la tabla 5) o un regulador negativo de la degradación de ECM (por ejemplo, un TIMP). La reducción de la expresión génica y/o función puede conseguirse a nivel de transcripción (por ejemplo, mutando, eliminando o silenciando la secuencia de ADN genómica) o a nivel de traducción (por ejemplo, inhibiendo la producción del producto génico a través de degradación de ARNm). En algunas realizaciones, los virus oncolíticos recombinantes descritos en este documento comprenden uno o más polinucleótidos que codifican nucleasas que reducen la expresión o función de un gen posibilitando la mutación, eliminación o represión de la transcripción de una secuencia génica. En realizaciones específicas, la nucleasa se selecciona de una endonucleasa asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas intercaladas de forma regular (CRISPR), una nucleasa de dedos de cinc (ZFN) o una nucleasa de efector similar a activador de la transcripción (TALEN). En ejemplos no limitantes, una endonucleasa asociada a CRISPR se selecciona de SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9-HF4, SaCas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9, C2C1, C2C3, Cpf1, Cas1, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocida como Csnl y Csx12), Cas10, CsyI, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3 y Csf4.
Los vectores víricos recombinantes de la invención pueden utilizar el sistema de CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas intercaladas de forma regular)/nucleasa Cas (asociada a CRISPR), que es un sistema de nucleasa manipulado basado en un sistema bacteriano que puede usarse para manipulación genómica en mamíferos. En general, el sistema comprende una nucleasa Cas y un ARN guía (ARNg). El ARNg está compuesto de dos partes; un ARNcrispr (ARNcr) que es específico para una secuencia de ADN genómica diana y un ARNcrtra (ARNtr) que facilita la unión de Cas. El ARNcr y ARNtr pueden estar presentes como oligonucleótidos de ARN separados, o pueden estar presentes en el mismo oligonucleótido de ARN, denominado ARN guía sencillo (ARNgs). Como se usa en este documento, la expresión "ARN guía" o "ARNg" se refiere a la combinación de un ARNtr individual y un ARNcr individual o un ARNgs. Véase, por ejemplo, Jinek et al. (2012) Science 337:816-821; Cong et al. (2013) Science 339:819-823; Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Qi et al. (2013) Cell 152:1173-1183; Jinek et al. (2013), eLife 2:e00471; David Segal (2013) eLife 2:e00563; Ran et al. (2013) Nature Protocols 8(11):2281 -2308; Zetsche et al. (2015) Cell 163(3):759-771; publicaciones PCT n.2 WO 2007/025097, WO 2008/021207, WO 2010/011961, WO 2010/054108, WO 2010/054154, WO 2012/054726, WO 2012/149470, WO 2012/164565, WO 2013/098244, WO 2013/126794, WO 2013/141680 y WO 2013/142578; publicaciones de patente de Estados Unidos n.22010-0093617, 2013-0011828, 2010-0257638, 2010-0076057, 2011 -0217739, 2011 -0300538, 2013-0288251 y 2012-0277120; y patente de Estados Unidos n.28.546.553.
Múltiples sistemas de CRISPR-Cas de clase 1, que incluyen los sistemas de tipo I y tipo III, se han identificado y caracterizado funcionalmente en detalle, revelando la compleja arquitectura y dinámica de los complejos efectores (Brouns et al., 2008, Marraffini y Sontheimer, 2008, Hale et al., 2009, Sinkunas et al., 2013, Jackson et al., 2014, Mulepati et al., 2014). Además, varios sistemas de CRISPR-Cas de clase 2-tipo II que emplean endonucleasas guiadas por ARN homólogo de la familia de Cas9 como efectores también se han identificado y caracterizado experimentalmente (Barrangou et al., 2007, Garneau et al., 2010, Deltcheva et al., 2011, Sapranauskas et al., 2011, Jinek et al., 2012, Gasiunas et al., 2012). Un segundo supuesto sistema de CRISPR-Cas de clase 2-tipo V se ha identificado recientemente en varios genomas bacterianos. Los supuestos sistemas de CRISPR-Cas de tipo V contienen una proteína grande de ~1300 aminoácidos llamada Cpf1 (CRISPR de Prevotella y Francisella 1).
En algunas realizaciones, un virus oncolítico descrito en este documento comprende además al menos un polinucleótido que codifica un ARNtr y ARNcr dirigido al miARN o el TIMP. En algunos casos, el al menos un polinucleótido que codifica un ARNtr y ARNcr se inserta en un locus en el genoma vírico. En algunas realizaciones, el polinucleótido es una secuencia aislada que comprende un aislante sintético o un aislante vírico natural (por ejemplo, HSV). En determinadas realizaciones, un virus oncolítico es un virus del herpes simple y el al menos un polinucleótido que codifica un sitio de unión a ARN se inserta en o entre uno o más locus, incluyendo la región de unión de repeticiones internas (que comprende una copia de cada uno de los genes diploides ICP0, ICP34,5, LAT, ICP4 y el promotor de ICP47), ICP0, LAT, UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26,5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, gamma-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 y US12. En una realización, un virus oncolítico es un virus del herpes simple (HSV) y el al menos un polinucleótido que codifica un sitio de unión a ARN se inserta en un locus entre los marcos abiertos de lectura de UL3 y UL4 (por ejemplo, figura 45 y figura 46).
En algunas realizaciones, el virus oncolítico recombinante comprende al menos un polinucleótido que codifica una proteína que es un acoplador de linfocitos T biespecífico (BiTE), una proteína antiinmunosupresora o un antígeno inmunógeno. Como se usa en este documento una "proteína antiinmunosupresora" es una proteína que inhibe una ruta inmunosupresora. La invención abarca un virus oncolítico que expresa una proteína antiinmunosupresora que es una proteína antilinfocito T regulador (Treg) o una proteína anticélula supresora derivada mielocítica (MDSC). En algunas realizaciones, la proteína antiinmunosupresora es un bloqueante derivado de VHH o un BiTE derivado de VHH. Como se usa en este documento, un "antígeno inmunógeno" se refiere a una proteína que aumenta una respuesta inmunitaria inflamatoria o inmunógena. En realizaciones particulares, los antígenos antiinmunosupresores e inmunógenos inducen una respuesta inmunitaria antitumoral. Ejemplos de dichas proteínas incluyen anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a e inhiben receptores del punto de control inmunitario (por ejemplo, CTLA4, LAG3, PD1, PDL1 y otros), citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IFNy, IFNa, IFNp, TNFa, IL-12, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF y otras) o proteínas que se unen a y activan un receptor activador (por ejemplo, FcyRI, FcYlIa, FcYlIIa, receptores coestimuladores y otros). En realizaciones particulares, la proteína se selecciona de EpCAM, folato, IFNp, anti-CTLA-4, anti-PD1, A2A, anti-FGF2, anti-FGFR/FGFR2b, anti-SEMA4D, CCL5, CD137, CD200, CD38, CD44, CSF-1R, CXCL10, CXCL13, receptor de endotelina B, IL-12, IL-15, IL-2, IL-21, IL-35, ISRE7, LFA-1, NG2 (también conocida como SPEG4), SMAD, STING, TGFp y VCAM1.
En determinadas realizaciones, un polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN, un gen o un TIMP se inserta en un locus en el genoma vírico de un virus oncolítico recombinante. En algunas realizaciones, el polinucleótido es una secuencia aislada que comprende un aislante sintético o un aislante vírico natural (por ejemplo, HSV). En determinadas realizaciones, el virus oncolítico es un virus del herpes simple y el al menos un polinucleótido que codifica un sitio de unión a ARN se inserta en o entre uno o más locus, incluyendo la región de unión de repeticiones internas (que comprende una copia de cada uno de los genes diploides ICP0, ICP34,5, LAT, ICP4 y el promotor de ICP47), ICP0, LAT, UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26,5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, gamma-34.5, US3, US4, US5, US6, u S7, US8, US9, US10, US11 y US12. En una realización, el virus es un virus del herpes simple (HSV) y el al menos un polinucleótido se inserta en un locus entre los marcos abiertos de lectura de UL3 y UL4 (véase, por ejemplo, figura 45 y figura 46).
En algunas realizaciones, el virus oncolítico recombinante comprende al menos un anticuerpo activado por proteasa. Los anticuerpos activados por proteasa, tales como los descritos por Metz et al. (Protein Eng Des Sel, 25(10):571-80, 2012) se activan y se unen solamente a dianas después de escisión por proteasa de un capuchón protector. En algunos casos, los microentornos tumorales poseen una serie de proteasas que están bien diferenciadas de los tejidos sanos circundantes. Por ejemplo, la proteasa catepsina B se sobreexpresa en numerosos cánceres, incluyendo cáncer de mama, cervicouterino, de colon, colorrectal, gástrico, de cabeza y cuello, hepático, pulmonar, melanoma, ovárico, pancreático, de próstata y tiroideo. El degradoma humano, compuesto de una lista completa de proteasas sintetizadas por células humanas, está formado de al menos 569 proteasas que se distribuyen en cinco amplias clases (en orden de máximo a mínimo número): metaloproteinasas (MMP), serina, cisteína, treonina y aspártico proteasas (Lopez-Otin et al., Nat Rev Cancer, 7(10):800-8, 2007). En particular, los anticuerpos de proteasa escindidos específicamente por MMP pueden servir como excelente medio de acción dirigida de vectores víricos recombinantes descritos en este documento al microentorno tumoral, ya que las MMP se encuentran en las zonas extracelular y pericelular de la célula. La tabla 6 resume las proteasas que se sobreexpresan en cánceres, que puede explotarse para posibilitar la unión específica de vectores víricos recombinantes seudotipados con anticuerpos activados por proteasa.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo activado por proteasa se incorpora en la envuelta glucoproteínica vírica. Los anticuerpos activados por proteasa pueden incorporarse en la envuelta glucoproteínica de un vector vírico recombinante de la invención (por ejemplo, un vector de HSV) para aumentar el índice terapéutico y reducir la infección inespecífica. En el caso de un vector de HSV, en algunas realizaciones, la glucoproteína puede ser gC o gD. En algunas realizaciones, los virus oncolíticos recombinantes descritos en este documento comprenden al menos un polinucleótido que codifica un anticuerpo activado por proteasa. En determinadas realizaciones, un anticuerpo activado por proteasa se activa por una proteasa seleccionada de una catepsina de cisteína, una catepsina aspártica, una calicreína (hK), una serina proteasa, una caspasa, una metaloproteinasa de matriz (MMP) y una disintegrina y metaloproteinasa (ADAM). En algunas realizaciones, una proteasa se selecciona de catepsina K, catepsina B, catepsina L, catepsina E, catepsina D, hK1, PSA (hK3), hK10, hK15, uPA, uPAR, MMP-1, m Mp -2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-23A, MMP-23B, MMP-24, MMP-25, MMP-26, MMP-27, MMP-28 o una proteasa enumerada en la tabla 6.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activado por proteasa se une a una proteína expresada más elevadamente por células cancerosas o en microentornos cancerosos que por células no cancerosas o en microentornos no cancerosos. En determinados aspectos, un anticuerpo activado por proteasa se une a NKG2D, c-met, HGFR, CD8, sulfato de heparano, VSPG4 (también conocido como NG2), EGFR, EGFRvIII, CD133, CXCR4, antígeno carcinoembrionario (CEA), CLC-3, anexina II, receptor de transferrina humana o EpCAM. En determinados casos, pueden incorporarse múltiples anticuerpos activados por proteasa en una sola partícula de vector vírico para garantizar que se abordan diversos histotipos tumorales. Por ejemplo, puede incorporarse al menos 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10 o más anticuerpos activados por proteasa en la envuelta glucoproteínica vírica. En algunas realizaciones, el virus oncolítico recombinante comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más polinucleótidos que codifican al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más anticuerpos activados por proteasa. En algunas realizaciones, un virus oncolítico comprende un primer anticuerpo activado por proteasa que se une a una primera proteína expresada más elevadamente por células cancerosas o en microentornos cancerosos que por células no cancerosas o en microentornos no cancerosos, y un segundo anticuerpo activado por proteasa que se una a una segunda proteína expresada más elevadamente por células cancerosas o en microentornos cancerosos que por células no cancerosas o en microentornos no cancerosos. En otras realizaciones, un virus oncolítico comprende una pluralidad de anticuerpos activados por proteasa que se unen a una pluralidad de proteínas expresadas más elevadamente por células cancerosas o en microentornos cancerosos que por células no cancerosas o en microentornos no cancerosos. Un virus oncolítico comprende, por ejemplo, un anticuerpo activado por proteasa que es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, un virus oncolítico comprende un anticuerpo que es una inmunoglobulina de longitud completa, un scFv, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un diacuerpo, un triacuerpo, un minicuerpo, un anticuerpo de un solo dominio o un anticuerpo multiespecífico.
En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende además uno o más de: uno o más polinucleótidos que codifican una o más proteínas u oligonucleótidos, en el que las proteínas u oligonucleótidos reducen la expresión o inhiben la función de un miR, un gen o un TIMP; al menos un anticuerpo activado por proteasa; y/o un polinucleótido que codifica al menos un anticuerpo activado por proteasa. En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende además: un primer polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN oncógeno o un gen oncógeno; y/o un segundo polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN remodelador del microentorno o un TIMP. En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende además: un polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN oncógeno o un gen oncógeno; y/o al menos un anticuerpo activado por proteasa. En otras realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende además un polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN remodelador del microentorno o un TIMP; y/o al menos un anticuerpo activado por proteasa. En una realización, un virus oncolítico recombinante comprende además: un primer polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN oncógeno o un gen oncógeno; y/o un segundo polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN remodelador del microentorno o un TIMP; y/o al menos un anticuerpo activado por proteasa. En algunas realizaciones específicas, un virus oncolítico descrito en este párrafo es un virus del herpes simple y el gen vírico requerido para replicación vírica en células no cancerosas es UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26,5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, gamma-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 y US12.
En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a un virus oncolítico recombinante que comprende un primer polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN oncógeno o un gen oncógeno; y un segundo polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN remodelador del microentorno o un TIMP. En otros ejemplos, un virus oncolítico recombinante comprende un polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN oncógeno o un gen oncógeno; y al menos un anticuerpo activado por proteasa. En algunos ejemplos, un virus oncolítico recombinante comprende un polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN remodelador del microentorno o un TIMP; y al menos un anticuerpo activado por proteasa. En un ejemplo, un virus oncolítico recombinante comprende: un primer polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN oncógeno o un gen oncógeno; y/o un segundo polinucleótido que codifica una proteína o un oligonucleótido dirigido para reducir la expresión de un miARN remodelador del microentorno o un TIMP; y/o al menos un anticuerpo activado por proteasa.
En determinados ejemplos, un virus oncolítico descrito en este documento es un herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple (por ejemplo, HSV-1 o HSV-2)), un adenovirus, un poliovirus, un virus de la variolovacuna, un virus del sarampión, un virus de la estomatitis vesicular, un ortomixovirus, un parvovirus, un virus maraba o un coxsackievirus. Se describen vectores basados en HSV y métodos para su construcción en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.27.078.029, 6.261.552, 5.998.174, 5.879.934, 5.849.572, 5.849.571, 5.837.532, 5.804.413 y 5.658.724, y solicitudes de patente internacional WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637 y WO 99/06583. La secuencia de HSV está publicada (n.° de acceso a NCBI NC_001806; véase también McGoech et al., J. Gen. Virol, 69 (PT 7), 1531­ 1574 (1988)), que puede facilitar el diseño de vectores basados en HSV de la invención.
La invención también abarca una molécula de ácido nucleico que codifica un virus oncolítico de la invención.
Composiciones y métodos de uso
Determinados aspectos de la invención se refieren a reservas y composiciones que comprenden los virus oncolíticos de la invención. En algunos aspectos, la invención se refiere a una reserva vírica que comprende un virus oncolítico de la invención. En algunas realizaciones, una reserva vírica es una reserva homogénea. La preparación y análisis de reservas víricas es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, una reserva vírica puede fabricarse en frascos rodantes que contienen células transducidas con el vector vírico. La reserva vírica entonces puede purificarse en un gradiente continuo de nycodenz, y dividirse en alícuotas y almacenarse hasta que sea necesario. Las reservas víricas varían considerablemente en valor cuantitativo, dependiendo en gran medida del genotipo vírico y el protocolo y líneas celulares usadas para prepararlas.
En realizaciones particulares, el valor cuantitativo de la reserva vírica (por ejemplo, una reserva vírica de vector basado en HSV) contemplado en este documento es de al menos aproximadamente 105 unidades formadoras de placas (pfu), tal como al menos aproximadamente 106 pfu o incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 107 pfu. En determinadas realizaciones, el valor cuantitativo puede ser de al menos aproximadamente 108 pfu, o al menos aproximadamente 109 pfu, y reservas de elevado valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1010 pfu o al menos aproximadamente 1011 pfu son las más preferidas.
La invención contempla además una composición que comprende un virus oncolítico o una molécula de ácido nucleico de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa alérgica o similar cuando se administran a un sujeto (por ejemplo, un ser humano). El término "composición", como se usa en este documento, se refiere a una formulación de uno o más virus oncolíticos o moléculas de ácido nucleico descritas en este documento que pueda administrarse o suministrarse a un sujeto y/o una célula. Típicamente, las formulaciones incluyen todas las composiciones fisiológicamente aceptables incluyendo derivados y/o profármacos, solvatos, estereoisómeros, racematos o tautómeros de los mismos con cualquier vehículo, diluyente y/o excipiente fisiológicamente aceptable. Una "composición terapéutica" o "composición farmacéutica" (usadas indistintamente en este documento) es una composición de uno o más agentes que pueden administrarse o suministrarse a un paciente y/o sujeto y/o célula para el tratamiento de una enfermedad o trastorno particular.
Las composiciones divulgadas en este documento pueden formularse en una forma neutra o salina. "Sal farmacéuticamente aceptable" incluye tanto sales de adición de ácido como de base. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como, aunque sin limitación, ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido alcanfórico, ácido alcanfor-10-sulfónico, ácido cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido carbónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclámico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido glucoheptónico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutámico, ácido glutárico, ácido 2-oxoglutárico, ácido glicerofosfórico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido isobutírico, ácido láctico, ácido lactobiónico, ácido láurico, ácido maleico, ácido málico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido múcico, ácido naftaleno-1,5-disulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido nicotínico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido propiónico, ácido piroglutámico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tiociánico, ácido p-toluenosulfónico, ácido trifluoroacético, ácido undecilénico y similares. También pueden obtenerse sales formadas con los grupos carboxilo libres a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, cinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, aunque sin limitación, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como amoniaco, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, dietanolamina, etanolamina, deanol, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, benetamina, benzatina, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromo, trietanolamina, trometamina, purinas, piperazina, piperidina, W-etilpiperidina, resinas de poliamina y similares. Bases orgánicas particularmente preferidas son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclohexilamina, colina y cafeína. T ras la formulación, se administrarán soluciones de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas farmacéuticas tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.
Como se usa en este documento, "vehículo" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tampones, soluciones transportadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos complementarios a las composiciones.
Como se usa en este documento "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye sin limitación cualquier adyuvante, vehículo, excipiente, emoliente, agente edulcorante, diluyente, conservante, tinte/colorante, potenciador del aroma, tensioactivo, agente humectante, agentes dispersante, agente de suspensión, estabilizante, agente isotónico, disolvente, tensioactivo, medio de dispersión, recubrimiento, agente antibacteriano y antifúngico, agente isotónico y retardador de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles, incluyendo medios de cultivo celular farmacéuticamente aceptables y/o emulsionante que se haya aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos estadounidense como aceptable para su uso en seres humanos y/o animales domésticos. Vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares incluyen, aunque sin limitación, glúcidos, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetil celulosa de sodio, etil celulosa y acetato de celulosa; tragacanto; malta; gelatina; talco; manteca de cacao, ceras, grasas animales y vegetales, parafinas, siliconas, bentonitas, ácido silícico, óxido de cinc; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua apirógena; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones de tampón fosfato; y cualquier otra sustancia compatible empleada en formulaciones farmacéuticas. Excepto en la medida en que cualquier medio y/o agente convencional sea incompatible con los agentes de la presente divulgación, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse ingredientes activos complementarios a las composiciones.
También pueden estar presentes en las composiciones humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, saborizantes y aromatizantes, conservantes y antioxidantes.
Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes liposolubles, tales como palmitato de ascorbilo, butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
En una realización, una composición que comprende un vehículo es adecuada para administración parenteral, por ejemplo, administración intravascular (intravenosa o intraarterial), intraperitoneal o intramuscular. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación improvisada de una dispersión o soluciones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con un vector vírico o molécula de ácido nucleico, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención.
Las composiciones de la invención pueden comprender uno o más polipéptidos, polinucleótidos, vectores que comprenden los mismos, células infectadas, etc., como se describe en este documento, formulados en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para administración a una célula o un animal, en solitario o en combinación con uno o más modalidades de tratamiento distintas. También se entenderá que, si se desea, las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con otros agentes también, tales como, por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, micromoléculas o diversos agentes farmacéuticamente activos. Casi no hay límite a otros componentes que pueden incluirse también en las composiciones, con la condición de que los agentes adicionales no afecten de forma adversa a la capacidad de la composición de suministrar el tratamiento pretendido.
En las composiciones farmacéuticas de la invención, la formulación de excipientes y soluciones transportadoras farmacéuticamente aceptables es bien conocida por los expertos en la materia, así como el desarrollo de pautas de dosificación y tratamiento adecuadas para usar las composiciones particulares descritas en este documento en una diversidad de pautas de tratamiento. Tras la formulación, se administran soluciones de una manera compatible con la formulación de dosificación y una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz para provocar una mejora o remediación de los síntomas. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas farmacéuticas tales como soluciones ingeribles, cápsulas de liberación de fármacos y similares. Puede producirse alguna variación en la dosificación dependiendo del estado del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración puede determinar, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir normas de esterilidad, seguridad general y pureza requeridas por las normas del Centro para Evaluación e Investigación de Productos Biológicos de la FDA. La vía de administración variará, naturalmente, con la ubicación y naturaleza de la enfermedad que se esté tratando, y puede incluir, por ejemplo, administración intradérmica, transdérmica, subdérmica, parenteral, nasal, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutánea, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intratumoral, por perfusión, por lavado, por inyección directa y oral.
En determinadas circunstancias, será deseable suministrar las composiciones, vectores víricos recombinantes y moléculas de ácido nucleico divulgadas en este documento por vía parenteral, intravenosa, intramuscular o incluso intraperitoneal como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5.543.158; patente de Estados Unidos n.° 5.641.515 y patente de Estados Unidos n.° 5.399.363. Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacéuticamente aceptables en agua mezcladas adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles (patente de Estados Unidos n.° 5.466.468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que sea fácil de inyectar. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar conservada contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tiomersal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, glúcidos o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como ingrediente activo es bien comprendida en la técnica. Típicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de su inyección. La preparación también puede emulsionarse.
Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente si fuera necesario y el diluyente líquido en primer lugar de volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, un medio acuoso estéril que puede emplearse será conocido por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.a edición. Baltimore, MD Lippincott Williams & Wilkins, 2000). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación dependiendo del estado del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenia y seguridad y pureza general requeridas por las normas del Departamento de Productos Biológicos de la FDA.
Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con los otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada a esterilidad del mismo.
En determinadas realizaciones, las composiciones pueden suministrarse mediante pulverizadores intranasales, inhalación y/u otros vehículos de suministro en aerosol. Se han descrito métodos para suministrar polinucleótidos y composiciones peptídicas directamente a los pulmones mediante pulverizadores de aerosol nasal, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5.756.353 y patente de Estados Unidos n.° 5.804.212. Asimismo, el suministro de fármacos usando resinas de micropartículas intranasales (Takenaga et al., 1998) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (patente de Estados Unidos n.° 5.725.871) también es bien conocido en las técnicas farmacéuticas. Asimismo, el suministro de fármacos a través de la mucosa en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.780.045.
En determinadas realizaciones, el suministro puede producirse mediante el uso de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas, opcionalmente mezclando con polipéptidos CPP, y similares, para la introducción de las composiciones de la presente invención en células hospedadoras adecuadas. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para suministro encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula o similares. La formulación y uso de dichos vehículos de suministro puede realizarse usando técnicas conocidas y convencionales. Las formulaciones y composiciones de la invención pueden comprender uno o más polipéptidos, polinucleótidos y micromoléculas, como se describe en este documento, formulados en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables (por ejemplo, medio de cultivo) para administración a una célula o un animal, en solitario, o en combinación con una o más modalidades de tratamiento distintas. También se entenderá que, si se desea, las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con otros agentes también, tales como, por ejemplo, células, otras proteínas o polipéptidos o diversos agentes farmacéuticamente activos.
En una realización particular, una formulación o composición de acuerdo con la presente invención comprende una célula en contacto con una combinación de muchísimos polinucleótidos o vectores víricos, como se contempla en este documento.
En determinados aspectos, la presente invención proporciona formulaciones o composiciones adecuadas para el suministro de sistemas de vector vírico.
Las formulaciones ejemplares para suministro ex vivo también pueden incluir el uso de diversos agentes de transfección conocidos en la técnica, tal como fosfato de calcio, electroporación, choque térmico y diversas formulaciones de liposomas (es decir, transfección mediada por lípidos). Los liposomas son bicapas lipídicas que atrapan una fracción de líquido acuoso. El ADN se asocia espontáneamente con la superficie externa de liposomas catiónicos (en virtud de su carga) y estos liposomas interactuarán con la membrana celular.
Realizaciones particulares de la invención pueden comprender otras formulaciones, tales como las que son bien conocidas en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.a edición. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000.
En determinados aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más vectores víricos o polinucleótidos, como se describe en este documento, formuladas junto con uno o más vehículos (aditivos) farmacéuticamente aceptables y/o diluyentes (por ejemplo, medio de cultivo celular farmacéuticamente aceptable). Como se usa en este documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una composición o virus recombinante descrito en este documento requerida para conseguir un resultado fisiológico y/o biológico deseado. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un virus, una reserva vírica o una composición puede variar de acuerdo con factores tales como el estado patológico, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de las células madre y progenitoras de provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en que cualquier efecto tóxico o perjudicial del virus o células terapéuticas transducidas se compensa por los efectos terapéuticamente beneficiosos. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" incluye una cantidad que es eficaz para "tratar" a un sujeto (por ejemplo, un paciente). La cantidad terapéuticamente eficaz puede cuantificarse por el número total de unidades formadoras de placas (pfu) (por ejemplo, de al menos le 1 a al menos 1e20, particularmente de aproximadamente 1e4 a aproximadamente 1e15, más particularmente de aproximadamente 1e6 a aproximadamente 1e12 pfu), o el número de genomas víricos (por ejemplo, de al menos 1e1 a al menos 1e20, particularmente de aproximadamente 1e4 a aproximadamente 1e15, más particularmente de aproximadamente 1e6 a aproximadamente 1e12 genomas víricos). Un experto en la materia entenderá que la cantidad terapéuticamente eficaz variará basándose en el tipo de virus que se esté administrando, la naturaleza de la formulación, la vía de administración, la naturaleza y/o gravedad de la enfermedad a tratar y/o la salud general y bien estar del sujeto.
Algunos aspectos de la invención abarcan un virus oncolítico de la invención para su uso en un método de tratamiento del cáncer, comprendiendo el método destruir una célula cancerosa, que comprende exponer la célula cancerosa a dicho virus oncolítico o composiciones del mismo en condiciones suficientes para que el virus oncolítico infecte y se replique dentro de dicha célula cancerosa, y en el que la replicación del virus oncolítico dentro de la célula cancerosa provoca muerte celular. En determinadas realizaciones, la célula cancerosa tiene una expresión reducida de un miR supresor tumoral en comparación con una célula no cancerosa. En algunas realizaciones, una célula cancerosa destruida por este método está in vivo. En determinadas realizaciones, una célula cancerosa destruida por este método está dentro de un tumor.
La invención se refiere a un virus oncolítico, una reserva vírica o una composición de la invención para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad profilácticamente eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho virus oncolítico, una reserva vírica o una composición al sujeto. Un "sujeto", como se usa en este documento, incluye cualquier animal que muestre un síntoma de una enfermedad, trastorno o afección que pueda tratarse con los vectores víricos recombinantes, composiciones y métodos divulgados en este documento. Los sujetos adecuados (por ejemplo, pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como ratón, rata, conejo o cobaya), animales de granja (tales como caballo o vaca) y animales domésticos o mascotas (tales como gato o perro). Se incluyen primates no humanos y, preferiblemente, pacientes humanos.
"Administración" se refiere en este documento a introducir un virus oncolítico, una reserva vírica o una composición del mismo en un sujeto o poner en contacto un virus oncolítico, una reserva vírica o una composición del mismo con una célula y/o tejido. La administración puede producirse por inyección, irrigación, inhalación, consumo, electroósmosis, hemodiálisis, iontoforesis y otros métodos conocidos en la técnica. La vía de administración variará, naturalmente, con la ubicación y naturaleza de la enfermedad que se esté tratando, y puede incluir, por ejemplo, perfusión, lavado, inyección directa auricular, bucal, conjuntival, cutánea, dental, endocervical, endosinusal, endotraqueal, enteral, epidural, intersticial, intraarticular, intraarterial, intraabdominal, intraauricular, intrabiliar, intrabronquial, intrabursal, intracavernosa, intracerebral, intracisternal, intracorneana, intrafrontal, intracoronaria, intracraneal, intradérmica, intradiscal, intraductal, intraduodenal, intraduodenal, intradural, intraepicárdica, intraepidérmica, intraesofágica, intragástrica, intragingival, intrahepática, intraileal, intralesional, intralingual, intraluminal, intralinfática, intramamaria, intramedular, intrameníngea, instramuscular, intranasal, intranodal, intraocular, intraepiploica, intraovárica, intraperitoneal, intrapericárdica, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarruminal, intrasinusal, intrarraquídea, intrasinovial, intratendinosa, intratesticular, intratraqueal, intratecal, intratorácica, intratubular, intratumoral, intratimpánica, intrauterina, intraperitoneal, intravascular, intraventricular, intravesical, intravestibular, intravenosa, intravítrea, laríngea, nasal, nasogástrica, oral, oftálmica, orofaríngea, parenteral, percutánea, periarticular, peridural, perineural, periodontal, respiratoria, retrotubular, rectal, raquídea, subaracnoidea, subconjuntival, subcutánea, subdérmica, subgingival, sublingual, submucosa, subretiniana, tópica, transdérmica, transendocárdica, transmucosa, transplacentaria, transtraqueal, transtimpánica, ureteral, uretral y/o vaginal, y administración oral.
El término "tratar" y "tratamiento", como se usa en este documento se refiere a administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus recombinante o composición del mismo como se describe en este documento de modo que el sujeto tenga una mejora en una enfermedad o afección, o un síntoma de la enfermedad o afección. La mejora es cualquier mejora o remediación de la enfermedad o afección, o síntoma de la enfermedad o afección. La mejora es una mejora observable o medible, o puede ser cualquier mejora en la sensación general de bien estar del sujeto. Por tanto, un experto en la materia advierte que un tratamiento puede mejorar el estado patológico, pero puede no ser una cura completa para la enfermedad. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un virus, una reserva vírica o una composición eficaz para conseguir el resultado profiláctico deseado. Como se usa en este documento, "profilaxis" puede significar prevención completa de los síntomas de una enfermedad, un retardo en la aparición de los síntomas de una enfermedad, o una reducción en la gravedad de síntomas de enfermedad desarrollados posteriormente. Típicamente, pero no necesariamente, como se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes de o en un estadio anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz es menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
"Cáncer" en este documento se refiere a o describe el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, aunque sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluyendo liposarcoma, sarcoma osteógeno, angiosarcoma, endoteliosarcoma, leiomiosarcoma, cordoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, rabdomiosarcoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, condrosarcoma), tumores neuroendocrinos, mesotelioma, sinovioma, schwannoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o neoplasias linfáticas. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer escamocelular (por ejemplo, cáncer escamocelular epitelial), cáncer pulmonar incluyendo cáncer pulmonar microcítico, cáncer pulmonar no microcítico, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, carcinoma pulmonar microcítico, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervicouterino, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de la glándula salival, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, cáncer testicular, cáncer esofágico, tumores del conducto biliar, tumor de Ewing, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de la glándula sudorípara, carcinoma de la glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncógeno, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de la vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad mielodisplásica, enfermedad de la cadena pesada, tumores neuroendocrinos, schwannoma y otros carcinomas, así como cáncer de cabeza y cuello.
En determinadas realizaciones, un virus oncolítico (por ejemplo, un HSV), una reserva vírica o una composición de la invención son para su uso en un método para tratar un cáncer seleccionado de cáncer pulmonar (por ejemplo, cáncer pulmonar microcítico o cáncer pulmonar no microcítico), cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer cervicouterino, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer hepático (por ejemplo, carcinoma hepatocelular (HCC)), cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer tiroideo, glioma maligno, glioblastoma, melanoma, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL) y linfoma de zona marginal (MZL).
También se divulga un vector vírico oncolítico como se muestra en una cualquiera de las figuras o realizaciones divulgadas en este documento.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos son con el fin de ilustrar diversas realizaciones de la invención y no pretenden limitar la presente invención de ninguna manera. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en este documento son ejemplares y no se pretenden como limitaciones del alcance de la invención. Se contemplan específicamente alteraciones, modificaciones y otros cambios a las realizaciones descritas.
Ejemplo 1- Análisis de secuencia de miR de células normales y malignas
La expresión diferencial de miR es una característica distintiva de muchos cánceres (Lu et al, Nature, 2005). Se realizaron experimentos para determinar los miR que se expresaban principalmente de forma altamente diferencial en ocho líneas celulares cancerosas diferentes. La expresión diferencial se determinó mediante comparaciones con tejidos de control no cancerosos. En total, se secuenciaron 108 muestras. Se proporcionan detalles de las muestras en la siguiente tabla.
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Para facilitar la identificación de secuencias diana de miARN apropiadas adecuadas para atenuación de HSV en tipos celulares seleccionados, se realizó identificación de perfiles de secuencia de miARN de líneas cancerosas y tejido de control no canceroso. Se generaron colecciones de secuenciación de ARN procesados por dicer para células cancerosas y no cancerosas, incluyendo vejiga, colon, mama, páncreas, pulmón, cabeza y cuello, schwannoma, glioblastoma, cerebro, hígado y médula ósea. Estas colecciones de secuenciación de miARN se normalizaron al ARN total, y se secuenciaron usando un sistema de secuenciación de rendimiento ultraelevado HiSeq 2500 con reactivos de química HiSeq V4 para secuenciar lecturas hasta 3e8 lecturas/ciclo (Illumina). Se analizaron los archivos FASTQ de los ciclos de secuenciación usando la herramienta de análisis de miARN en Basespace (Illumina). Se realizaron clasificaciones calculando la media de normal, la media de cáncer y clasificando la relación de normal/cáncer de alta a baja. Se generaron mapas térmicos con valores logarítmicos naturales con los valores cero y negativos convertidos a cero (escale: negro es alta expresión, blanco es baja expresión). Los datos normalizados entre las muestras se expresaron como recuentos de lecturas de miARN normalizados en una muestra dada. La normalización se refiere al número total de lecturas en una muestra dada con respecto a otras muestras en la comparación.
La figura 1 ejemplifica el mapa térmico del perfil de expresión de miARN en tejido cerebral no canceroso y canceroso de veinticinco miARN. Se muestran ejemplos adicionales de mapas térmicos de perfil de expresión de miARN para tejido no canceroso y canceroso de vejiga (figura 2), mama (figura 3), colon (figura 4), cerebro (figura 5), cabeza y cuello (figura 6), pulmón (vejiga 7), páncreas (vejiga 8) y schwannoma (vejiga 9) correspondientes a veinticinco miARN en cada ejemplo. La figura 10 muestra que los niveles de miR-451 a están regulados por disminución en todos los tipos de tumor en comparación con tejido no canceroso, lo que representa un miARN supresor pantumoral. La figura 11 muestra que miR-1 está regulado por disminución en todos los tipos de tumor ensayados, presente a niveles moderados en tejido no canceroso y presente a elevados niveles en tejido de cabeza y cuello. La figura 12 muestra que miR-559 está regulado por disminución en todos los tipos de tumor ensayados, presente en general a bajos niveles en tejido no canceroso y presente a elevados niveles en tejido pulmonar no canceroso. La figura 13 muestra que miR-145-5p está regulado por disminución en todos los tipos de tumor ensayados y presente en general a elevados niveles en la mayoría de tipos de tejido no canceroso ensayados. La figura 14 muestra que miR-143-3p está regulado por disminución en tumores de colon, pulmonares y pancreáticos, y está presente a elevados niveles en todos los tipos de tejido normales y algunas líneas de tumor de mama. El análisis de datos de miARN reveló al menos once miARN que representan perfiles de expresión de miARN novedosos e inesperados no identificados previamente en la bibliografía.
Muchos de estos miARN identificados son específicos pantumorales o multitumorales. Por ejemplo, la expresión de miR-451 a, miR-559, miR-1, miR-145-3p y miR-143-3p en general estaba regulada por disminución entre todas las líneas celulares cancerosas ensayadas en comparación con tejidos de control. Esto fue particularmente notable para miR-451a, que se expresaba elevadamente en todos los tipos de tejido normal y estaba sustancialmente regulado por disminución en todos los tipos de cáncer, representando, por tanto, un miARN supresor tumoral panespecífico. La expresión de miR-559 fue menor en tipos de tejido normales, excepto para tejido pulmonar normal, y la expresión de miR-1 y miR-145-3p en tejido normal fue variable. A pesar de la variabilidad en la magnitud de diferencias y niveles absolutos de expresión, la expresión media de cada miR en líneas celulares cancerosas fue sustancialmente menor en comparación con los niveles en los correspondientes tejidos normal. Estos miARN son candidatos para generar viriones de HSV pantumorales que puedan tratar ampliamente una diversidad de tipos de cáncer.
Aunque la expresión media para miR-451a, miR-559, miR-1, miR-145-3p y miR-143-3p fue menor en líneas celulares cancerosas en comparación con controles normales, la expresión disminuida no fue completamente penetrante entre todas las líneas celulares cancerosas. Por ejemplo, 2/3 de las muestras de vejiga normal ensayadas mostró expresión aumentada de miR-145-3p, mientras que la expresión en la muestra restante fue sustancialmente similar al promedio observado en las líneas celulares cancerosas. Se observaron resultados similares en líneas celulares de cáncer de mama. Aunque el recuento promedio de lecturas para todas las muestras de cáncer de mama fue 106, 5/12 muestras tenían un recuento de lecturas normalizado de > 1000 recuentos, de los que 2 de ellos eran > 40 000 recuentos.
Estos datos indican el potencial para generar un solo virus oncolítico atenuado por miR que puede dirigirse a una amplia serie de tipos de tumor. Por ejemplo, una construcción que comprende secuencias diana para miR-124, miR-451a, miR-559, miR-1 y miR-145-3p puede usarse en el tratamiento de todos los tipos de tumor ensayados (por ejemplo, vejiga, colon, mama, pancreático, pulmonar, cabeza y cuello, schwannoma y glioblastoma). La variabilidad en los niveles de expresión de miR en diferentes tipos de cáncer indica la posible necesidad de estratificar los pacientes por la expresión de miR o a través del uso de un biomarcador adicional.
Ejemplo 2- Construcción y uso de un sistema indicador para ensayar rápidamente la atenuación génica basada en miARN
Se desarrolló un sistema indicador para evaluar la atenuación génica basada en miARN usando casi cualquier secuencia diana de miARN y miARN análogo. En este sistema (mostrado en la figura 15), la secuencia diana reconocida por los miARN (es decir hsa-miR-122) se insertó en la UTR 3' de proteína fluorescente verde desestabilizada (dsGFP). El miARN análogo entonces se expresión mediante un promotor inducible por tetraciclina (tet) usando mCherry como control para la expresión de miARN. Todos los vectores de expresión se clonaron en un vector reprimible por tet pcDNA5 Frt/To que también expresa mCherry (pTF002). Se generaron todos los miARN para expresión por síntesis génica a partir de ADN genómico humano y se clonaron en pTF002. Para generar vectores indicadores de atenuación, se clonó dsGFP en cDNA3.1+, generando el vector pTF004. Los vectores de atenuación contienen cuatro repeticiones en tándem del complemento inverso de la secuencia de miARN de interés separadas por 8-16 nucleótidos. Se construyeron plásmidos mediante inserción de oligonucleótidos generados sintéticamente en la UTR 3' del gen de dsGFP de pTF004 usando técnicas convencionales de biología molecular. En el día uno, las células HEK293TetR se transfectaron con los plásmidos de expresión de atenuación e indicadores de miARN (0,15 pg cada uno, para un total de 0,3 pg de plásmido que contiene promotor de CMV) usando Lipofectamine 2000 según el protocolo del fabricante (Invitrogen). En el día dos, las células se trataron con tetraciclina a 5 ng/ml y se dejaron incubar durante hasta 72 horas. Después de incubación, se detectaron las señales de fluorescencia de GFP y mCherry diariamente usando un lector de microplacas multimodo SpectraMax® i3x Minimax (Molecular Devices) y se analizaron usando el programa informático de imágenes Softmax Pro o Metamorph (Molecular Devices). Se adquirieron imágenes de fase con una exposición de 5-6 ms, GFP (canal de 541 nm) exposición de 10 ms y mCherry (canal de 713 nm) 200-1500 ms.
La figura 16 ejemplifica la atenuación mediada por miR-122 de la expresión de GFP tras inducción de la expresión de miR-122 mediante tet a las 24 horas. Las construcciones de control miR-184, miR-34a y Let7a no atenúan los niveles de GFP, ni se observa atenuación de GFP en ausencia de tet. La figura 17 muestra la expresión de miR-122, miR-184, miR-34a y Let7a y la atenuación de GFP usando cada secuencia diana de miR individualmente y en combinaciones de casete de miR-122/Let7a, miR-122/Let7a/miR-34a o miR-122/Let7a/miR-184. La Gf P disminuida se observa solamente cuando el miR apropiado y la secuencia diana análoga están presentes conjuntamente (pocillos rodeados por un círculo). La figura 18 sirve como control no atenuado y muestra la expresión de miR-122, miR-184, miR-34a y Let7a y la expresión de mCherry.
La figura 19 muestra la expresión de miR-122, miR-124, miR-145, miR-199 y miR-451 y la atenuación de GFP usando cada secuencia diana individualmente (pocillos rodeados por un círculo). La figura 20 sirve como control no atenuado para el ejemplo anterior y muestra la expresión de miR-122, miR-124, miR-145, miR-199 y miR-451 y la expresión de mCherry usando cada secuencia diana individualmente. La figura 21 muestra que miR-122 y miR-184 atenúan la fluorescencia de GFP a las 72 horas después de la transfección cuando están presentes las secuencias diana de miR-122 o miR-184 análogas. La figura 22 muestra que miR-34a y miR-184 atenúan la fluorescencia de GFP a las 72 horas después de la transfección cuando están presentes las secuencias diana de miR-34a o miR-184 análogas. La figura 23 muestra que Let-7a y miR-184 atenúan la fluorescencia de GFP a las 72 horas después de la transfección cuando están presentes las secuencias diana de Let-7a o miR-184 análogas. La figura 24 muestra que miR-124 y miR-184 atenúan la fluorescencia de GFP a las 72 horas después de la transfección cuando están presentes las secuencias diana de miR-124 o miR-184 análogas. La figura 25 muestra que miR-145 y miR-184 atenúan la fluorescencia de GFP a las 72 horas después de la transfección cuando están presentes las secuencias diana de miR-145 o miR-184 análogas. La figura 26 muestra que miR-199 y miR-451 atenúan la fluorescencia de GFP a las 72 horas después de la transfección cuando están presentes las secuencias diana de miR-199 o miR-451 análogas. La figura 27 muestra que miR-125 y miR-451 atenúan la fluorescencia de GFP a las 72 horas después de la transfección cuando están presentes las secuencias diana de miR-125 o miR-451 análogas. La figura 28 muestra que miR-126 y miR-451 atenúan la fluorescencia de GFP a las 72 horas después de la transfección cuando están presentes las secuencias diana de miR-126 o miR-451 análogas. La figura 29 muestra que miR-127 y miR-451 atenúan la fluorescencia de GFP a las 72 horas después de la transfección cuando están presentes las secuencias diana de miR-127 o miR-451 análogas. La figura 30 muestra que miR-133 y miR-451 atenúan la fluorescencia de GFP a las 72 horas después de la transfección cuando están presentes las secuencias diana de miR-133 o miR-451 análogas. La figura 31 muestra que miR-223 y miR-451 atenúan la fluorescencia de GFP a las 72 horas después de la transfección cuando están presentes las secuencias diana de miR-223 o miR-451 análogas.
Por tanto, estos datos indican que la expresión de miR puede provocar una atenuación específica de genes que expresan la secuencia diana de miR análoga.
Ejemplo 3- Generación de HSV atenuado por miARN
Después de la validación basada en gen indicador de las secuencias diana de miARN y pares de miARN análogos, se generaron virus basados en HSV que contenían casetes de atenuación de miARN. Se generó una serie de modificaciones en KOS-37 BAC, un clon genómico de longitud completa de la cepa KOS de HSV-1 en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) como se describe (Mazzacurati et al., Mol Ther., 2015). El producto, KGBAC, se eliminó para la región (unión) de repeticiones internas que contiene una copia de cada uno de los genes diploides ICP0, ICP34,5, LAT e ICP4 junto con el promotor para el gen ICP47. Esta eliminación facilita la manipulación de las copias restantes de los 4 genes eliminados, proporciona espacio abundante para la posible incorporación de transgenes que potencien la actividad oncolítica del virus, y aumenta la especificidad tumoral reduciendo la expresión del factor de neurovirulencia ICP34.5; la eliminación de la expresión de ICP47 beneficia el reconocimiento inmunitario de las células cancerosas infectadas por los linfocitos T específicos de virus. KGBAC también contiene el marco abierto de lectura (ORF) de GFP fusionado al ORF de la glucoproteína C (gC) mediante una secuencia peptídica 2A para permitir el control de la expresión génica vírica tardía (posreplicación). Finalmente, KGBAC contiene un par de mutaciones en el gen gB que ha demostrado potenciar la entrada de HSV a través de receptores no canónicos. Los casetes de secuencia diana de miARN se recombinaron en la UTR 3' de los genes ICP4 y/o ICP27 de 2A5B-MMP9 para generar ONCR-003, ONCR-010, ONCR-011, ONCR-012, ONCR-013, ONCR-014, ONCR-015, ONCR-016, ONCR-017, ONCR-018, ONCR-019, ONCR-020, ONCR-021 y ONCR-022 como se muestra en la figura 32. Todas las construcciones BAC se convirtieron en partículas víricas con eliminación simultánea de las secuencias BAC localizadas entre sitios loxP por transfección de células Vero-Cre. Después de la purificación de placas, se prepararon reservas víricas y se valoraron en células Vero.
Ejemplo 4- Ensayo de infectividad vírica usando HSV atenuado por miARN
Para ensayar la infectividad vírica y la replicación en células normales y cancerosas, se ensayaron partículas de HSV atenuadas por miARN en el siguiente ensayo in vitro. En el día uno, para cada tipo celular infectado, se introdujeron partículas de HSV para conseguir una multiplicidad de infección (moi) de 0,01. En los días dos a cinco, se ensayó la infectividad vírica mediante detección de GFP usando un lector de microplacas multimodo SpectraMax® i3x Minimax (Molecular Devices) y se analizaron usando el programa informático de imágenes Softmax Pro o Metamorph (Molecular Devices). Se adquirieron imágenes de fase con una exposición de 5-6 ms, GFP (canal de 541 nm) exposición de 10 ms y se usó mCherry (canal de 713 nm) 200-1500 ms para evaluar cualquier posible señal de autofluorescencia no específica.
La replicación de ONCR-011 se atenuó significativamente en tejido pulmonar posmitótico debido a la presencia del casete de miR-125 en el gen ICP27 y los elevados niveles de miR-125a (>3000 recuentos) en estas células, como se muestra en la figura 33 (lectura por cuantificación de células GFP positivas) y figura 34 (lectura por PCR cuantitativa). Aunque ONCR-011 y el virus de control, ONCR-003, contienen secuencias diana de miR-124 en el gen ICP4, miR-124 está presente a bajos niveles (<100 recuentos) que fueron insuficientes para atenuar la replicación vírica. Tanto ONCR-011 como ONCR-003 se replicaron libremente en células de cáncer de cabeza y cuello (A253) porque estas células contienen bajos niveles tanto de miR-125a como de miR-124 (<100 recuentos). La replicación de ONCR-013 se atenuó significativamente en células HCC1395, pero no en células A253 como se muestra en la figura 35 (lectura por cuantificación de células GFP positivas) y figura 36 (lectura por PCR cuantitativa). La replicación de ONCR-014 se atenuó significativamente en tejido pulmonar no canceroso como se muestra en la figura 37 (lectura por cuantificación de células GFP positivas) y figura 38 (lectura por PCR cuantitativa).
Ejemplo 5- Tratamiento de un paciente que padece cáncer pancreático, cáncer pulmonar o cáncer de colon
Un paciente que padece cáncer pancreático, cáncer pulmonar o cáncer de colon se trata usando las composiciones y métodos divulgados en este documento. Pueden generarse reservas víricas basadas en HSV que se atenúan incorporando una o más secuencias diana de miARN en UL19, ICP4, ICP27 (u otros genes víricos) como se muestra en las figuras 39-44. En algunos casos, se manipulan las capacidades editoras del genoma para destrucción del tumor y/o remodeladoras del microentorno en el virus además de las secuencias diana de miARN, como se muestra en las figuras 45-46. En un ejemplo específico, se genera una reserva basada en HSV que contiene casetes de atenuación de miR-124, miR-451a, miR-143-3p y miR-559 incorporados en ICP4 e ICP27 de acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo 3. Los casetes de secuencia diana de miARN se introducen en la UTR 3' de los genes ICP4 (miR-124) e ICP27 (miR-451a, miR-143-3p, miR-559) como se muestra en la figura 47. Las construcciones BAC se convierten en partículas víricas con eliminación simultánea de las secuencias BAC localizadas entre sitios loxP por transfección de células Vero-Cre. Después de la purificación de placas, las reservas víricas se purifican adicionalmente, se les intercambia el tampón y se valoran en células Vero. Para administración in vivo a un paciente que padece cáncer pancreático, cáncer pulmonar o cáncer de colon, se preparan partículas de HSV en solución tamponada con fosfato (PBS) junto con agentes estabilizantes farmacéuticamente aceptables. En el día del tratamiento, se administran 109 genomas de vector en un volumen de 1,0 ml de vehículo farmacéuticamente aceptable mediante infusión intratumoral. Se controla al paciente para regresión tumoral usando procedimientos de tratamiento habituales a un intervalo de tiempo apropiado basado en el pronóstico particular de ese paciente.
Ejemplo 6- Tratamiento de un paciente que padece cáncer cerebral, cáncer de vejiga, cáncer de mama o cáncer de cabeza y cuello
Un paciente que padece cáncer cerebral, cáncer de vejiga, cáncer de mama o cáncer de cabeza y cuello se trata usando las composiciones y métodos divulgados en este documento. Se genera una reserva vírica basada en HSV que contiene casetes de atenuación de miR-124, miR-451a, miR-145-3p y miR-559 de acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo 3. Los casetes de secuencia diana de miARN se introducen en la UTR 3' de los genes ICP4 (miR-124) e ICP27 (miR-451a, miR-145-3p, miR-559) como se muestra en la figura 48. Las construcciones BAC se convierten en partículas víricas con eliminación simultánea de las secuencias BAC localizadas entre sitios loxP por transfección de células Vero-Cre. Después de la purificación de placas, las reservas víricas se purifican adicionalmente, se les intercambia el tampón y se valoran en células Vero. Para administración in vivo a un paciente que padece cáncer cerebral, cáncer de vejiga, cáncer de mama o cáncer de cabeza y cuello, se preparan partículas de HSV en solución tamponada con fosfato (PBS) junto con agentes estabilizantes farmacéuticamente aceptables. En el día del tratamiento, se administran 109 genomas de vector en un volumen de 1,0 ml de vehículo farmacéuticamente aceptable mediante infusión intratumoral. Se controla al paciente para regresión tumoral usando procedimientos de tratamiento habituales a un intervalo de tiempo apropiado basado en el pronóstico particular de ese paciente.
Ejemplo 7- Tratamiento de un paciente que padece schwannoma
Un paciente que padece schwannoma se trata usando las composiciones y métodos divulgados en este documento. Se genera una reserva vírica basada en HSV que contiene casetes de atenuación de miR-124-3p, miR-205-5p, miR-141-5p y miR-31-5p de acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo 3. Los casetes de secuencia diana de miARN se recombinaron en la UTR 3' de los genes ICP4 (miR-124) e ICP27 (miR-205-5p, miR-141-5p, miR-31-5p) como se muestra en la figura 49. Las construcciones BAC se convierten en partículas víricas con eliminación simultánea de las secuencias BAC localizadas entre sitios loxP por transfección de células Vero-Cre. Después de la purificación de placas, las reservas víricas se purificaron adicionalmente, se les intercambió el tampón y se valoraron en células Vero. Para administración in vivo a un paciente que padece schwannoma, se preparan partículas de HSV en solución tamponada con fosfato (PBS) junto con agentes estabilizantes farmacéuticamente aceptables. En el día del tratamiento, se administran 109 genomas de vector en un volumen de 1,0 ml de vehículo farmacéuticamente aceptable mediante infusión intratumoral. Se controla al paciente para regresión tumoral usando procedimientos de tratamiento habituales a un intervalo de tiempo apropiado basado en el pronóstico particular de ese paciente.
Aunque se muestran y describen realizaciones preferidas de la presente invención en este documento, será obvio para los expertos en la materia que dichas realizaciones se proporcionan a modo de ejemplo únicamente. Los expertos en la materia pueden implementar numerosas variaciones, cambios y sustituciones. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas.
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Tabla 5. Sumario de interacciones vinculadas de microARN/MMP en cáncer.
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Tabla 6. Proteasas diana y cánceres asociados con su sobreexpresión.
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Tabla 7. Lista de oncogenes seleccionados asociados con neoplasia humana
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TiilrJtf 8. ¡VILK s u p rc st ire s In m o r a le s q u e e stá n re p u k id u s p a r d is m in u c ió n en U pus de c á n c e r e sp e c íf ic a s
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un virus del herpes simple (HSV) recombinante que comprende al menos dos secuencias diana de miR diferentes, en el que un locus de ICP4 del genoma de HSV recombinante comprende al menos una secuencia diana de miR-124, en el que un locus de un gen vírico distinto del ICP4 comprende al menos una secuencia diana de miR, y en el que el gen vírico distinto del ICP4 se selecciona del grupo que consiste en UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26,5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP22, ICP27, ICP47, gamma-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 y US12.
2. El HSV recombinante de la reivindicación 1, en el que la al menos una secuencia diana de miR-124 se incorpora en la región no traducida (UTR) 5' o UTR 3' del locus de ICP4.
3. El HSV recombinante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que:
(i) dos o más secuencias diana de miR-124 se insertan en el locus de ICP4 del genoma de HSV recombinante; o (ii) el gen vírico distinto de ICP4 es ICP27.
4. El HSV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la replicación del HSV recombinante se reduce o atenía en una primera célula en comparación con la replicación del HSV recombinante en una segunda célula, y en el que la primera célula es una célula no cancerosa y la segunda célula es una célula cancerosa.
5. El HSV recombinante de la reivindicación 4, en el que la expresión endógena de miR-124 en la segunda célula se reduce en comparación con la expresión endógena de miR-124 en la primera célula; opcionalmente en el que la replicación del HSV recombinante en la primera célula se reduce en al menos un 50 % en comparación con la replicación del HSV recombinante en la segunda célula.
6. El HSV recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en el que el cáncer de la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer bucal, cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer cerebral, cáncer cervicouterino y cáncer pulmonar.
7. El HSV recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, que comprende:
(i) al menos una secuencia diana de miR adicional incorporada en el locus de ICP4, en el que la secuencia diana de miR adicional es una secuencia distinta de la secuencia diana de miR-124; o
(ii) al menos una secuencia diana de miR-122 incorporada en el locus de ICP27.
8. El HSV recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además una secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica una proteína seleccionada de una citocina y proteína antiinmunosupresora; opcionalmente en el que la citocina es IL-12 y en el que la proteína antiinmunosupresora se selecciona de una proteína anti-PD1 y una proteína anti-CTLA4; y opcionalmente en el que la secuencia polinucleotídica heteróloga se inserta en el genoma de HSV recombinante entre los marcos abiertos de lectura de UL3 y UL4.
9. El HSV recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, que comprende además una eliminación en la región de unión interna de modo que el genoma de HSV recombinante comprende una copia de cada uno de los genes ICPO, y34.5, LAT e ICP4.
10. Una molécula de ácido nucleico que codifica el HSV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
11. Una reserva vírica que comprende el HSV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9.
12. Una composición que comprende el HSV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. El HSV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9 o composición de la reivindicación 12, para su uso como medicamento.
14. El HSV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9 o composición de la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer.
15. El HSV recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 o una composición del mismo para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, en el que:
(i) el tratamiento o prevención comprende exponer una célula cancerosa a condiciones suficientes para que el HSV recombinante infecte y se replique dentro de dicha célula cancerosa, y en el que la replicación del HSV recombinante dentro de la célula cancerosa provoca muerte celular; o
(ii) el sujeto es un ratón o un ser humano; o
(iii) el HSV recombinante o composición del mismo se administra por vía intravenosa, subcutánea, intratumoral o intramuscular; o
(iv) el cáncer se selecciona de cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer cervicouterino, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer tiroideo, glioma maligno, glioblastoma, melanoma, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL) y linfoma de zona marginal (MZL).
16. El HSV recombinante o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que:
(i) el tratamiento o prevención comprende exponer una célula cancerosa a condiciones suficientes para que el HSV recombinante infecte y se replique dentro de dicha célula cancerosa, y en el que la replicación del HSV recombinante dentro de la célula cancerosa provoca muerte celular; o
(ii) el sujeto es un ratón o un ser humano; o
(iii) el HSV recombinante o composición del mismo se administra por vía intravenosa, subcutánea, intratumoral o intramuscular; o
(iv) el cáncer se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer bucal, cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer cerebral, cáncer cervicouterino y cáncer pulmonar.
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