CN111936150A - 抗癌微小rna及其脂质制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含微小RNA的脂质制剂。该制剂包含可以与微小RNA形成脂质纳米颗粒的阳离子脂质。该制剂能够用于药物。

Description

抗癌微小RNA及其脂质制剂
技术领域
本发明涉及包含微小RNA的脂质制剂。该脂质包含可以与微小RNA形成脂质纳米颗粒的阳离子脂质。该制剂能够用于药物。
背景技术
微小RNA(miRNA)是天然存在的单链非编码小RNA分子，其通过与其靶mRNA中的互补序列结合来控制基因表达，从而抑制翻译或诱导mRNA降解。最近，miRNA已成为开发过程中基因表达的关键调节剂，并且在人疾病状态特别是癌症中经常错误表达。事实上，miRNA可用于沉默特定癌症基因。据报道，几种miRNA是有效的癌症调节剂。目前，研发miRNA疗法的主要挑战是缺乏有效的递送系统。miRNA对核酸酶降解敏感，并且显示出较低的生理稳定性，并且可能以其天然形式具有细胞毒性。迫切需要一种有效的递送系统，其保护miRNA免于核酸酶降解，同时在不产生任何不良影响的情况下将功能性miRNA分子或isomiR或模拟物或其来源递送至靶(癌)细胞的细胞质中。
有希望的递送系统是这样的：它们包含与细胞膜相同的材料，或相似的脂质或脂质样材料，允许包封的miRNA通过细胞膜进入细胞。在这类递送系统中，有所谓的脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒通常是小的复杂结构，直径为10-100nm，在生理条件下稳定，并且具有免疫学惰性(T.Admadzada等,Biophysical Reviews(2018)10:69-86)。虽然在递送其他类型的寡核苷酸方面具有优势，但是尚无使用脂质纳米颗粒成功递送miRNA的已知报道。持续需要有效的miRNA纳米颗粒制剂以改善包封的miRNA的作用。
持续需要改进的微小RNA疗法来治疗癌症，同时也需要对癌症微小RNA治疗机制更加深入了解，从而可以开辟新的治疗策略。持续需要调节癌症免疫应答。
实施方式的描述
出人意料地，发明人鉴别了在多种癌症适应症中展现出显著体内功效的miRNA纳米颗粒制剂。
组合物
发明人惊奇地发现，包含二氨基脂质的纳米颗粒制剂提供了优异的结果。因此，在第一方面，本发明提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含二氨基脂质和miRNA，安塔够妙(antagomiR)或其来源，其中
i)所述miRNA或安塔够妙是miRNA分子、isomiR或其模拟物，并且是抗癌miRNA，优选具有种子序列的寡核苷酸，所述种子序列包含SEQ ID NO:17-50所示种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，或是其安塔够妙，并且其中所述miRNA或安塔够妙优选自下组：miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157，miRNA-7，miRNA-135a，miRNA-135b和miRNA-196a，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙，和其中
ii)所述二氨基脂质为通式(I)
Figure BDA0002717738480000021
其中，
n是0、1或2，和
T1、T2和T3各自独立地是C10-C18链，其具有任选的不饱和基团并具有0、1、2、3或4个取代，其中所述取代选自下组：C1-C4烷基、C1-C4烯基和C1-C4烷氧基。
以下将这类组合物称之为根据本发明的组合物。以下将根据本发明的组合物中包含的纳米颗粒称之为根据本发明的纳米颗粒。以下将如i)所述的miRNA或其安塔够妙或来源称之为来自组合物的miRNA；来自组合物的miRNA优选是miRNA分子，isomiR，或其模拟物，或miRNA分子、isomiR或模拟物的前体。
在本申请的上下文中，纳米颗粒是尺寸在纳米范围内的颗粒，或者在某些情况下，微米范围内的颗粒。优选地，纳米颗粒的直径为至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多纳米，其中直径优选为纳米颗粒群体的平均直径。优选地，纳米颗粒的直径为至多100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、5000或10000纳米。更优选地，纳米颗粒的平均直径为40-300nm，甚至更优选50-200nm，甚至更优选50-150nm，最优选65-85nm，诸如约70nm。
根据本发明的纳米颗粒是进一步包含寡核苷酸的脂质纳米颗粒。寡核苷酸可以视为纳米颗粒的载物或有效载荷。因此，纳米颗粒可以是例如胶束，脂质体(liposome)，脂质复合物(lipoplex)，单层囊泡，多层囊泡或其交联变体。优选地，纳米颗粒是胶束，脂质体或脂质复合物。当述及纳米颗粒的组成时，旨在述及二氨基脂质和任选的其他赋形剂，而不是任何载物物质。作为非限制性示例，当述及纳米颗粒包含50mol％二氨基脂质和50mol％其他赋形剂时，该摩尔百分数仅涉及二氨基脂质以及那些其他赋形剂；不考虑寡核苷酸的摩尔分数或溶剂的摩尔分数。
当本发明涉及包含超过一种miRNA分子，isomiR，模拟物，或其来源或其安塔够妙的组合物时，其涵盖miRNA分子，isomiR，模拟物，或其来源或其安塔够妙各自可以存在于单独的组合物中。各组合物可以依次或同时给予对象，或在使用前混合成单一组合物。或者，还涵盖超过一种miRNA分子，isomiR，模拟物或其来源或其安塔够妙存在于如本文所定义的组合物中。
二氨基脂质
根据本发明的纳米颗粒包含通式(I)的二氨基脂质，但是其也可以包含其他脂质。在优选实施方式中，二氨基脂质以摩尔百分比计是纳米颗粒中最普遍的脂质。本文所用术语“脂质”指可溶于非极性溶剂的物质。用于本发明的二氨基脂质具有与间隔物连接的三个尾，并因此类似于天然产生的甘油三酯脂质。已知多种这类脂质(US8691750)。
通式(I)的二氨基脂质包含两个叔胺，其被具有不同长度的脂肪族间隔物隔开。间隔物有助于确定脂质的头基(headgroup)大小。n可以是0、1或2，因此间隔物实际上是1,2-乙烯，正-1,3-丙烯或正-1,4-丁烯间隔物。在特别优选的实施方式中，n是0。在特别优选的实施方式中，n是1。在特别优选的实施方式中，n是2。在最优选的实施方式中，n是1。因此，在优选实施方式中，本发明提供了根据本发明的组合物，其中二氨基脂质为通式(I)，其中n是1。因此，在优选实施方式中，本发明提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含二氨基脂质和miRNA，安塔够妙或其来源，其中
i)所述miRNA或安塔够妙是miRNA分子、isomiR或其模拟物，并且是具有种子序列的寡核苷酸，所述种子序列包含SEQ ID NO:17-50所示种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，或是其安塔够妙，并且其中所述miRNA或安塔够妙优选自下组：miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157，和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙，和其中
ii)所述二氨基脂质为通式(I-1)
Figure BDA0002717738480000041
其中，T1、T2和T3各自独立地是C10-C18链，其具有任选的不饱和基团并具有0、1、2、3或4个取代，其中所述取代选自下组：C1-C4烷基、C1-C4烯基和C1-C4烷氧基。
T1、T2和T3可以视为脂质的尾，并且是脂肪族C10-C18，其具有任选的不饱和基团和上至4个任选的取代。T1、T2和T3可以是独立选择的，或者T1、T2和T3中的两个或三个可以为相同的选择。在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中二氨基脂质为通式(I)，其中T1、T2和T3是相同的。相同不应当狭义地解构为暗示应当预期的同位素的天然丰度——相同应当优选表示分子结构将如所绘制的结构式所示。
较长的链通常将导致更刚性的脂质膜。在该申请中，C10-C18中的数字表示可以确定的最长的连续链，而不是总C含量。作为非限制性的示例，在6-位置处具有正丙基取代的正十二烷基链包含15个碳原子，但是由于最长的连续链具有12个碳原子的长度而为C12链。如果不饱和基团在链中为顺式，那么不饱和基团会导致膜的刚性降低，使其弯曲。优选的不饱和基团是顺式的。在优选实施方式中，T1、T2和T3包含0、1、2、3或4个不饱和基团。在更优选实施方式中，T1、T2和T3包含1、2、3或4个不饱和基团。在更优选实施方式中，T1、T2和T3包含1、2或3个不饱和基团，优选3个不饱和基团。
任选取代基选自下组：C1-C4烷基、C1-C4烯基和C1-C4烷氧基。优选的任选取代基是C1-C4烷基，更优选C1-C2烷基，最优选甲基(-CH3)。存在0、1、2、3或4个这类取代基，这表示可以不存在取代基。因此，取代基是任选的。优选地，存在0、1、2或3个这类取代基。
在优选实施方式中，T1、T2和T3各自独立地是C10-C16链，其具有任选的不饱和基团并具有0、1、2、3或4个取代，其中所述取代选自下组：C1-C4烷基、C1-C4烯基和C1-C4烷氧基。在更优选的实施方式中，T1、T2和T3各自独立地是C10-C14链，其具有任选的不饱和基团并具有0、1、2、3或4个取代，其中所述取代选自下组：C1-C4烷基、C1-C4烯基和C1-C4烷氧基。最优选地，T1、T2和T3各自独立地是C12链，其具有任选的不饱和基团并具有0、1、2、3或4个取代，其中所述取代选自下组：C1-C4烷基、C1-C4烯基和C1-C4烷氧基。
在优选实施方式中，T1、T2和T3各自独立地是C10-C18链，其具有1、2、3或4个不饱和基团并具有0、1、2、3或4个取代，其中所述取代选自下组：C1-C4烷基、C1-C4烯基和C1-C4烷氧基。
在优选实施方式中，T1、T2和T3各自独立地是C10-C18链，其具有1、2或3个不饱和基团并具有1、2、3或4个取代，其中所述取代选自下组：C1-C4烷基、C1-C4烯基和C1-C4烷氧基。
在优选实施方式中，T1、T2和T3各自独立地是C10-C18链，其具有1、2或3个不饱和基团并具有1、2、3或4个取代，其中所述取代选自下组：C1-C4烷基。
在优选实施方式中，T1、T2和T3各自独立地是C10-C14链，其具有1、2或3个不饱和基团并具有1、2或3个取代，其中所述取代选自下组：C1-C2烷基。
T1、T2和T3的优选实施方式如下所示，并将各种选择的名称在各结构式下方显示。在系统性Cn编号中，冒号后面的数字(如C12:3)表示不饱和的程度。
Figure BDA0002717738480000061
Figure BDA0002717738480000071
因此，在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中，所述二氨基脂质为通式(I)，其中T1、T2和T3各自独立地选自下组：法呢基(farnesyl)，月桂基(lauryl)，十三烷基(tridecyl)，肉豆蔻基(myristryl)，十五烷基(pentadecyl)，鲸蜡基(cetyl)，黄油基(margaryl)，硬脂基(stearyl)，α-亚油烯基(α-linolenyl)，γ-亚油烯基(γ-linolenyl)，亚油基(linoleyl)，硬脂四烯基(stearidyl)，11-十八碳烯基(vaccenyl)，油基(oleyl)，反式油基(elaidyl)，棕榈油基和3,7,11-三甲基十二烷基。优选地，T1、T2和T3各自独立地选自下组：法呢基，月桂基，十三烷基，肉豆蔻基，十五烷基，鲸蜡基，α-亚油烯基，γ-亚油烯基，亚油基，硬脂四烯基，油基，棕榈油基和3,7,11-三甲基十二烷基。更优选地，T1、T2和T3各自独立地选自下组：法呢基，月桂基，十三烷基，肉豆蔻基，硬脂四烯基，棕榈油基和3,7,11-三甲基十二烷基。甚至更优选地，T1、T2和T3各自独立地选自下组：法呢基，月桂基，十三烷基，肉豆蔻基和3,7,11-三甲基十二烷基。甚至更优选地，T1、T2和T3各自独立地选自下组：法呢基，月桂基和3,7,11-三甲基十二烷基。最优选地，T1、T2和T3各自独立地是法呢基，如(2E,6E)法呢基、(2E,6Z)法呢基、(2Z,6E)法呢基或(2Z,6Z)法呢基；优选它们各自是(2E,6E)法呢基。
法呢基也被称为3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基并且是不饱和线性C12链；其可以是(2E,6E)、(2E,6Z)、(2Z,6E)或(2Z,6Z)；优选其是(2E,6E)。月桂基也称为十二烷基并且是饱和线性C12链。十三烷基是饱和线性C13链。肉豆蔻基也称为十四烷基，是饱和线性C14链。十五烷基是饱和线性C15链。鲸蜡基也称为棕榈基(palmityl)并且是饱和线性C16链。黄油基也称为十七烷基并是饱和线性C17链。硬脂基也称为十八烷基并且是饱和的线性C18链。α-亚油酰基也称为(9Z,12Z,15Z)-9,12,15--十八碳三烯基并且是不饱和线性C18链。γ-亚油酰基也称为(6Z,9Z,12Z)-6,9,12-十八碳三烯基并且是不饱和线性C18链。亚油基也称为(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯基并且是不饱和线性C18链。硬脂四烯基也称为(6Z,9Z,12Z,15Z)-6,9,12,15-十八碳四烯基并且是不饱和线性C18链。异油基也称为(E)-十八烷基-11-烯基并且是不饱和线性C18链。油基也称为(9Z)-十八烷基-9-烯基并且是不饱和线性C18链。反式油基也称为(9E)-十八烷基-9-烯基并且是不饱和线性C18链。棕榈油基也称为(9Z)-十六烷基-9-烯基并且是不饱和线性C16链。3,7,11-三甲基十二烷基是饱和法呢基并且是饱和线性C12链。
抗癌miRNA、安塔够妙或其来源
在优选实施方式中，所述抗癌miRNA或安塔够妙选自下组：miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157，miRNA-135a，miRNA-135b和miRNA-196a，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙。在更优选实施方式中，所述miRNA或安塔够妙选自下组：miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙。在其他更优选实施方式中，所述miRNA或安塔够妙选自下组：miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3和miRNA-3157，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙。在其他更优选实施方式中，所述miRNA或安塔够妙是miRNA并且选自下组：miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3和miRNA-3157，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙。
根据本发明优选的纳米颗粒包含miRNA、安塔够妙或其来源，优选miRNA或其来源，其中所述miRNA或安塔够妙是miRNA分子、isomiR或其模拟物，并且是具有种子序列的寡核苷酸，所述种子序列包含SEQ ID NO:17-50所示种子序列中7个核苷酸中的至少6个核苷酸，或者是其安塔够妙，并且其中所述miRNA或安塔够妙选自下组：miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157，miRNA-7，miRNA-135a，miRNA-135b和miRNA-196a，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙。更优选地，根据本发明的纳米颗粒包含miRNA或其来源，其中，所述miRNA是miRNA分子、isomiR或其来源，并且是具有种子序列的寡核苷酸，所述种子序列包含SEQ ID NO:17-50所示种子序列中7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且其中所述miRNA选自下组：miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物。
微小RNA(miRNA)是17-25个核苷酸的小RNA，其作为真核细胞中基因表达的调控因子。miRNA在细胞核中最初表达为长初级转录本的部分，称之为初级miRNA(初-miRNA)。在细胞核中，初-miRNA被Drosha酶部分消化，形成65-120个核苷酸长的发夹前体miRNA(前-miRNA)，将其输出到细胞质中，通过Dicer进一步加工成较短的成熟miRNA，这些较短的成熟miRNA是活性分子。在动物中，这些短RNA包含5'近端“种子”区(通常为核苷酸2-8)，其似乎是miRNA与靶mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)的配对特异性的主要决定区。关于通用定义的部分中给出了更详细的解释。
下文所给出的关于miRNA分子，miRNA模拟物或miRNA isomiR或miRNA安塔够妙或它们之一的任何来源的各种定义将用于本申请所示各种miRNA，分子或模拟物或isomiR或安塔够妙或其来源：miRNA miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR或模拟物或安塔够妙或来源。在序列表中鉴定所述miRNA分子或其模拟物或isomiR各自的优选成熟序列(SEQ ID NO:51-57)，种子序列(SEQID NO:17-50，其中SEQ ID NO:17-23是典型miRNA的种子序列，而SEQ ID NO:24-50是isomiR的种子序列)，isomiR序列(SEQ ID NO:58-125)或来源序列(RNA前体为SEQ ID NO:1-8，或编码RNA前体的DNA为SEQ ID NO:9-16)。
在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中所述miRNA是：
i).miRNA-323-5p分子，miRNA-323-5p isomiR或miRNA-323-5p模拟物，或
ii).miRNA-342-5p分子，miRNA-324-5p isomiR或miRNA-324-5p模拟物，或
iii).miRNA-520f-3p分子，miRNA-520f-3p isomiR或miRNA-520f-3p模拟物，或
iv).miRNA-520f-3p-i3分子，miRNA-520f-3p-i3 isomiR或miRNA-520f-3p-i3模拟物，或
v).miRNA-3157-5p分子，miRNA-3157-5p isomiR或miRNA-3157-5p模拟物，或
vi).miRNA-193a-3p分子，miRNA-193a-3p isomiR或miRNA-193a-3p模拟物，或
vii).miRNA-7-5p分子，miRNA-7-5p isomiR或miRNA-7-5p模拟物。
在其他优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中所述miRNA或安塔够妙是miRNA-135a分子，miRNA-135b分子，miRNA-196a-5p分子，miRNA-135a的isomiR，miRNA-135b的isomiR，miRNA-196a-5p的isomiR，miRNA-135a的安塔够妙，miRNA-135b的安塔够妙，miRNA-196a-5p的安塔够妙，或其模拟物。
模拟物是与miRNA分子具有相似或相同活性的分子。在上下文中，赋予相似活性与可接受水平活性相同的含义。模拟物在功能测定中与安塔够妙相对。优选的模拟物是合成寡核苷酸，优选包含一种或多种核苷酸类似物，如锁核酸单体，和/或包含支架修饰的核苷酸和/或包含碱基修饰的核苷酸。模拟物可以是miRNA的模拟物或isomiR的模拟物，并且其还可以是安塔够妙的模拟物。优选的模拟物是miRNA的模拟物或isomiR的模拟物。
优选的模拟物是双链寡核苷酸，其包含正义链和反义链。在本文中将如其天然存在的典型miRNA定义为具有反义序列，因为其与天然存在的靶标的正义序列互补。由此得出结论：在双链模拟物中，如本发明组合物优选的模拟物中，存在两条链，其中一条称为正义链，而其中一条称为反义链。反义链可以具有与miRNA，或与miRNA的前体或isomiR相同的序列，或者其可以具有与其片段相同的序列，或者包含相同的序列，或者包含与其片段相同的序列。正义链与反义链至少部分反向互补，以允许形成双链模拟物。正义链本身不一定具有生物学活性，其重要功能之一是稳定反义链或防止其降解。成熟miRNA的正义链的示例为SEQ ID NO:126-132。isomiR的正义链的示例为SEQ ID NO:133-200。
在优选实施方式中，反义链包含至少一个修饰的核苷，其优选选自下组：桥接核酸核苷，如锁核酸(LNA)核苷；2'-O-烷基核苷，如2'-O-甲基核苷，2'-氟核苷和2'-叠氮核苷，优选2'-O-烷基核苷，如2'-O-甲基核苷。优选是这样的：至少一个修饰的核苷替代第一个或最后一个RNA核苷，或替代第二个或倒数第二个RNA核苷。在优选实施方式中，至少两个修饰的核苷替代前两个或最后两个RNA核苷。更优选地，第一个和最后一个RNA核苷被替换，甚至更优选地，前两个和后两个被替换。应该理解的是，替代修饰的核苷与其替换的核苷具有相同的配对能力，优选具有相同的核碱基。优选地，反义链在前两个或最后两个RNA核苷之外不包含修饰的核苷。在优选实施方式中，反义链的最后一个碱基是DNA核苷；更优选地，反义链的最后两个碱基是DNA核苷。优选地，当反义链与正义链形成一对时，反义链的最后一个或两个残基形成突出端；更优选地，反义链的最后两个残基形成这样的突出端。优选地，反义链在最后两个核苷之外或突出端之外不包含DNA核苷。优选地，正义链仅包含RNA核苷。
优选地，正义链和反义链不完全重叠，在其3'端处具有1、2、3或4个额外的碱基，优选在其3'端处具有2个额外的碱基，从而形成粘性末端。因此，在相应的反义链中，3'端的1、2、3或4个碱基优选在正义链中不具有反向互补碱基，也形成粘性末端；更优选地，正义链的前两个碱基形成粘性末端，在其反义链中不具有互补碱基。正义链不必具有生物学活性，其主要用作增强反义链的稳定性。模拟物正义/反义对的优选序列的示例为：对于正义链是SEQ ID NO:201-207、208、210、212、214、216、218和220，对于正义链更优选是SEQ ID NO:208、210、212、214、216、218和220；和对于反义链是SEQ ID NO:209、211、213、215、217、219和221。优选的对是SEQ ID NO:201或208和SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:202或210和SEQ IDNO:211、SEQ ID NO:203或212和SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:204或214和SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:205或216和SEQ ID NO:217，SEQ ID NO:206或218和SEQ ID NO:219以及SEQ IDNO:207或220和SEQ ID NO:221，更优选地，SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219。
在优选实施方式中，模拟物是包含正义链和反义链的双链寡核苷酸，其中两条链的长度为15-30个核苷酸，优选17-27个核苷酸，其中所述反义链与序列SEQ ID NO:51-125中任一项具有70,75,80,85,90,95,96,97,98,99或100％的序列相同性，其中所述正义链任选地与SEQ ID NO:126-200中任一项具有70,75,80,85,90,95,96,97,98,99或100％序列相同性，其中所述正义链和反义链优选可以退火以形成所述双链寡核苷酸，其中任选地，所述寡核苷酸的一个或两个末端是粘性末端，所述粘性末端具有1、2、3或4个(优选2个)核苷酸的重叠，其中所述正义链任选地包含化学修饰的核苷酸。优选的，双链模拟物的两条链的长度相同，或者长度相差1、2、3、4、5或6个核苷酸。
miRNA分子，isomiR，模拟物或其来源的安塔够妙是具有这样活性的分子，所述活性与衍生其的相应miRNA分子之一相对或相反。miRNA，isomiR或模拟物的安塔够妙还可以定义为能够使所述miRNA分子或isomiR或模拟物的活性拮抗或沉默或降低的分子。与衍生其的相应miRNA分子之一相对或相反的活性或者能够使衍生其的所述miRNA分子的活性拮抗的活性优选是这样的活性，其能够降低所述miRNA分子或isomiR或模拟物或其来源的活性。在上下文中，降低表示所述miRNA分子或isomiR或模拟物或其来源的活性降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。安塔够妙的模拟物可以是具有化学修饰(如本文后续所定义)的合成寡核苷酸。用于评估所述活性的优选活性和优选试验后续在本文中定义。
在本申请的全文内，除了另外指明，miRNA也可以称为miRNA分子，miR，isomiR，安塔够妙，或模拟物，或其来源或前体。可以将本文所述各序列表示为本申请文本中所用的SEQ ID NO或序列表中相应的SEQ ID NO。本申请中所述SEQ ID NO可以指所述miRNA，isomiR，安塔够妙，模拟物或其来源诸如前体的碱基序列。对于所有SEQ ID NO，本领域技术人员知晓一些碱基可以互换。例如，T的每个实例可以分别被U取代，反之亦然。为成熟miRNA提供的RNA序列可以例如使用DNA核苷酸而非RNA核苷酸合成为DNA寡核苷酸。在这类情况中，可以使用胸腺嘧啶碱基代替尿嘧啶碱基。或者，可以使用脱氧核糖支架上的胸腺嘧啶碱基。本领域技术人员理解的是，碱基配对行为比确切序列更重要，并且出于这种目的，T和U通常是可互换的。因此，安塔够妙可以是DNA或RNA分子，或者可以是如本文后续所定义的进一步修饰的寡核苷酸。因此，模拟物可以是DNA或RNA分子，或者可以是如本文后续所定义的进一步修饰的寡核苷酸。
MiRNA安塔够妙也在本发明提及。该术语涉及本发明的miRNA分子，其表达将不被上调/过表达/增加和/或其活性将不增加，从而用于本文所述治疗应用。相反，这些miRNA分子的内源表达需要被下调/降低和/或这类miRNA分子的活性需要被降低或减少或抑制以获得治疗所需效果。如本文后续所解释，优选使用安塔够妙进行。因此，在本发明中，当在治疗用途中提及任何这些miRNA分子时，总是指下述物质的用途：miRNA-135a，miRNA-135b或miRNA-196a-5p分子的安塔够妙或这些miRNA的安塔够妙的模拟物或这些miRNA的安塔够妙的来源。因此，当提及安塔够妙时，总是指如本文所述的miRNA-135a，miRNA-135b或miRNA-196a-5p分子的安塔够妙或其模拟物或来源的用途。本文所给出的关于miRNA分子或模拟物或isomiR或它们之一的来源的各种定义也可以适用于待用作该段落中所述的安塔够妙的任何miRNA分子。本文所给出的关于miRNA分子给定的安塔够妙的各种定义也适用于不同miRNA分子的其他安塔够妙，其各自如本文所定义。安塔够妙优选与miRNA，isomiR或其模拟物互补或反向互补。
在本发明的上下文中，miRNA分子或模拟物或isomiR或其安塔够妙可以是合成的或天然的或重组的或成熟的或成熟miRNA或人miRNA的部分或源自人miRNA，如关于通用定义的部分所进一步定义。人miRNA分子是存在于人细胞、组织、器官或体液的miRNA分子(即，内源性人miRNA分子)。人miRNA分子还可以是通过取代、缺失和/或添加核苷酸衍生自内源性人miRNA分子的人miRNA分子。miRNA分子或模拟物或isomiR或其安塔够妙可以是单链或双链RNA分子。
优选地，miRNA分子或其模拟物或isomiR的长度为6-30个核苷酸，优选长度为12-30个核苷酸，优选长度为15-28个核苷酸，更优选所述分子的长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。
优选地，miRNA分子的安塔够妙长度为8-30个核苷酸，优选长度为10-30个核苷酸，优选长度为12-28个核苷酸，更优选所述分子的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。
在优选实施方式中，miRNA分子或模拟物或isomiR包含存在于所述miRNA分子或其模拟物或isomiR的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸(SEQ ID NO:17-50)，或者是其安塔够妙。优选地，在该实施方式中，miRNA分子或模拟物或isomiR的长度为6-30个核苷酸并且更优选包含存在于所述miRNA分子或模拟物或isomiR的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，或者是其相同长度的安塔够妙。甚至更优选地是，miRNA分子或模拟物或isomiR的长度为15-28个核苷酸并且更优选包含存在于种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，甚至更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸的miRNA分子，或者是其相同长度的安塔够妙。
在上下文中，包含存在于种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸旨在指与种子序列在最多一个位置不相同的7个核苷酸的连续串。或者，这可以指代仅通过省略单个核苷酸不同于种子序列的6个核苷酸的连续串在整个申请中，更优选的miRNA分子，isomiR，模拟物或其前体包含存在于指定种子序列的7个核苷酸中的所有7个核苷酸，或者换言之，与所述种子序列具有100％序列相同性。优选地，当包含在miRNA，isomiR或模拟物中时，种子序列从核苷酸编号1、2或3开始并在核苷酸编号7、8、9、10或11结束；最优选地是，这类种子序列从核苷酸编号2开始并在核苷酸编号8结束。
优选的miRNA-135a、miRNA-135b和miRNA-196a分子，isomiR，或其模拟物述于EP17199997的表2、4、5和6中。其优选的前体述于EP17199997的表1和3中。优选的miRNA-135a、miRNA-135b和miRNA-196a分子，isomiR，或其模拟物包含存在于EP17199997表4或5中所鉴定的种子序列的7个核苷酸中的至少6个，并更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于EP17199997表4或5中所鉴定的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。miRNA-135a、miRNA-135b或miRNA-196a优选的安塔够妙与如上所述miRNA-135a、miRNA-135b或miRNA-196a分子，isomiR，或其模拟物互补或反向互补，并且优选如EP17199997表6所述。
优选的miRNA-323是miRNA-323-5p分子，isomiR或其模拟物，并包含存在于SEQ IDNO:17或24-28的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于SEQ ID NO:17或24-28的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。miRNA-323优选的安塔够妙与如上所述miRNA-323分子，isomiR或其模拟物互补或反向互补。
miRNA-323优选的模拟物具有正义链和反义链，其中所述反义链包含存在于SEQID NO:17或24-28的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸并且其中所述反义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，并且其中所述反义链优选与SEQ ID NO:51、58-68或209具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中正义链优选与SEQ ID NO:126、133-143、201或208具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中所述正义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。
优选的miRNA-342是miRNA-342-5p分子，isomiR或其模拟物，并包含存在于SEQ IDNO:18或29-42的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于SEQ ID NO:18或29-42的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。miRNA-342优选的安塔够妙与如上所述miRNA-342分子，isomiR或其模拟物互补或反向互补。
miRNA-342优选的模拟物具有正义链和反义链，其中所述反义链包含存在于SEQID NO:18或29-42的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸并且其中所述反义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，并且其中所述反义链优选与SEQ ID NO:52、69-113或211具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中正义链优选与SEQ ID NO:127、144-188、202或210具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中所述正义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。
优选的miRNA-520f是miRNA-520f-3p分子，isomiR或其模拟物，并包含存在于SEQID NO:19或43-44的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于SEQ ID NO:19或43-44的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。miRNA-520f优选的安塔够妙与如上所述miRNA-520f分子，isomiR或其模拟物互补或反向互补。
miRNA-520f优选的模拟物具有正义链和反义链，其中所述反义链包含存在于SEQID NO:19或43-44的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸并且其中所述反义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，并且其中所述反义链优选与SEQ ID NO:53、114、115,或213具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中正义链优选与SEQ ID NO:128、189、190、203或212具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中所述正义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。
另一优选的miRNA-520f是miRNA-520f-3p-i3分子或其模拟物，包含存在于SEQ IDNO:20的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于SEQ ID NO:20的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。miRNA-520f-3p-i3优选的安塔够妙与如上所述miRNA-520f-3p-i3分子或其模拟物互补或反向互补。
miRNA-520f-3p-i3优选的模拟物具有正义链和反义链，其中所述反义链包含存在于SEQ ID NO:20的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸并且其中所述反义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，并且其中所述反义链优选与SEQ ID NO:54或215具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中正义链优选与SEQ ID NO:129、204或214具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中所述正义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。
优选的miRNA-3157是miRNA-3157-5p分子，isomiR或其模拟物，并包含存在于SEQID NO:21或45-48的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于SEQ ID NO:21或45-48的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。
miRNA-3157优选的安塔够妙与如上所述miRNA-3157分子，isomiR或其模拟物互补或反向互补。
miRNA-3157优选的模拟物具有正义链和反义链，其中所述反义链包含存在于SEQID NO:21或45-48的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸并且其中所述反义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，并且其中所述反义链优选与SEQ ID NO:55、116-120或217具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中正义链优选与SEQ ID NO:130、191-195、205或216具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中所述正义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。
优选的miRNA-193a是miRNA-193a-3p，更优选miRNA-193a-3p分子、isomiR或其模拟物，并包含存在于SEQ ID NO:22或49的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于SEQ ID NO:22或49的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。miRNA-193a优选的安塔够妙与如上所述miRNA-193a分子，isomiR或其模拟物互补或反向互补。
miRNA-193a优选的模拟物具有正义链和反义链，其中所述反义链包含存在于SEQID NO:22或49的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸并且其中所述反义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，并且其中所述反义链优选与SEQ ID NO:56、121、122或219，优选SEQ ID NO:56或219，更优选SEQ ID NO:219具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中正义链优选与SEQ ID NO:131、196、197、206或218，更优选SEQ ID NO:218具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中所述正义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。
优选的miRNA-7是miRNA-7-5p分子，isomiR或其模拟物，并包含存在于种子序列SEQ ID NO:23或50的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于SEQ ID NO:23或50的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。miRNA-7优选的安塔够妙与如上所述miRNA-7分子，isomiR或其模拟物互补或反向互补。
miRNA-7优选的模拟物具有正义链和反义链，其中所述反义链包含存在于SEQ IDNO:23或50的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸并且其中所述反义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，并且其中所述反义链优选与SEQ ID NO:57、123-125或221具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中正义链优选与SEQ ID NO:132、198-200、207或220具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，并且其中所述正义链优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。
优选地，miRNA分子，isomiR或其模拟物长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，包含存在于SEQ ID NO:17-50中任一项的给定种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且与SEQID NO:51-125中任一项的完整成熟序列具有至少70％相同性。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。
或者优选地，miRNA分子，isomiR或其模拟物长度为不超过6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸，包含存在于SEQ ID NO:17-50中任一项的给定种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且与SEQ ID NO:51-125中任一项的完整成熟序列具有至少70％相同性。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。
在另一优选实施方式中，miRNA分子的isomiR与SEQ ID NO:58-125中任一项的完整isomiR序列具有至少70％相同性。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％或更高。优选地，在该实施方式中，miRNA分子的isomiR或其模拟物的长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。
因此，优选的miRNA-323分子，isomiR或其模拟物是miRNA-323-5p分子，isomiR或其模拟物并包含存在于以SEQ ID NO:17、24-28表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或与SEQ ID NO:51、58-68具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。
因此，优选的miRNA-323分子，isomiR或其模拟物是miRNA-323-5p分子，isomiR或其模拟物并包含存在于以SEQ ID NO:17、24-28表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或与SEQ ID NO:51、58-68具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。
因此，优选的miRNA-342分子，isomiR或其模拟物是miRNA-342-5p分子，isomiR或其模拟物并包含存在于以SEQ ID NO:18、29-42表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或与SEQ ID NO:52、69-113具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。
因此，优选的miRNA-520f分子，isomiR或其模拟物是miRNA-520f-3p分子，isomiR或其模拟物并包含存在于以SEQ ID NO:19、43-44表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或与SEQ ID NO:53、114-115具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。另一优选的miRNA 520f分子，isomiR或其模拟物是miRNA-520f-3p-i3分子或其模拟物并包含存在于以SEQ ID NO:20表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或与SEQ ID NO:54具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。
因此，优选的miRNA-3157分子，isomiR或其模拟物是miRNA-3157-5p分子，isomiR或其模拟物并包含存在于以SEQ ID NO:21、45-48表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或与SEQ ID NO:55、116-120具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。
因此，优选的miRNA-193a分子，isomiR或其模拟物是miRNA-193a-3p分子，isomiR或其模拟物并包含存在于以SEQ ID NO:22或49表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或与SEQ ID NO:56、121-122具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。
因此，优选的miRNA-7分子，isomiR或其模拟物是miRNA-7-5p分子，isomiR或其模拟物并包含存在于以SEQ ID NO:23或50表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或与SEQ ID NO:57、123-125具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。
另一优选的miRNA分子，isomiR或其模拟物与SEQ ID NO:17-50中任一项的种子序列，或与SEQ ID NO:51-57中任一项的成熟序列，或与SEQ ID NO:1-16中任一项(优选SEQID NO:1-8中任一项)的前体序列，或与SEQ ID NO:9-16中任一项的编码RNA前体的DNA，或与SEQ ID NO:58-125中任一项的isomiR序列具有至少60％相同性。相同性可以是至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。优选在给定SEQ ID NO中所示的完整SEQ ID NO评估相同性。然而，也可以在给定SEQ ID NO的部分评估相同性。部分可以表示至少50％的SEQ ID NO长度，至少60％、70％、80％、90％或100％。
取决于成熟过程，前体序列可以产生超过一种isomiR序列——参见例如miRNA-323(成熟序列SEQ ID NO:51)，其中在某种组织中已经鉴定了多种isomiR(SEQ ID NO:58-68)。miRNA分子的isomiR来自相同前体，并且相反地，前体可以产生多种miRNA分子，其一称之为经典miRNA(如miRNA-323-5p，SEQ ID NO:51)，而其他称之为isomiR(如SEQ ID NO:58-68所示的寡核苷酸)。可以说经典miRNA和其isomiR之间的差异仅在于其普遍性——通常，最普遍的分子称为经典miRNA，而其他是isomiR。取决于类型，环境，在其生命周期的位置，或细胞的病理状态，各种isomiR或miRNA可以不同水平表达；群组或性别之间的表达甚至可以不同(Loher等,Oncotarget(2014)DOI:10.18632/oncotarget.2405)。
miRNA分子或模拟物或isomiR或其来源的安塔够妙可以是核酸，优选与相应miRNA分子或isomiR或其模拟物互补或反向互补的RNA。安塔够妙优选与相应miRNA分子或isomiR或其模拟物的部分杂交。优选的安塔够妙与SEQ ID NO:51-125的成熟miRNA或isomiR的序列的部分互补或反向互补。部分可以表示至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％的SEQ ID NO长度。在优选实施方式中，安塔够妙或其模拟物与miRNA分子或isomiR或其模拟物的种子序列或所述种子序列的部分互补或反向互补。部分可以表示至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％的种子序列长度。
miRNA分子或模拟物或其来源的安塔够妙或miRNA或isomiR的模拟物中正义链或反义链的核苷酸的化学结构可以经修饰以增加稳定性，结合亲和力和/或特异性。所述安塔够妙或正义链或反义链可以包含RNA分子或优选经修饰的RNA分子或由其组成。优选的经修饰的RNA分子包含修饰的糖。这类修饰的一个实例是在核酸上引入2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基或2'氟化物基团，以改善核酸酶抗性和对RNA的结合亲和力。这类修饰的另一个实例是引入连接核酸2'-O原子和4'-C原子的亚甲基桥以锁定构象(锁核酸(LNA))以改善对互补单链RNA的亲和力。第三个实例是引入硫代磷酸酯基团作为RNA链中核酸之间的接头以改善针对核酸酶攻击的稳定性。第四个修饰是分子3'端上亲脂性部分如胆固醇的偶联，以改善稳定性和细胞递送。在优选实施方式中，miRNA分子的安塔够妙由完全LNA修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸组成。本文所定义的安塔够妙可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖修饰。本发明还涵盖在一种安塔够妙中引入一个以上的不同糖修饰。
在一个优选实施方式中，模拟物正义链的前两个碱基具有经修饰的糖，优选2’-O-甲基修饰。在一个优选实施方式中，模拟物正义链的后四个碱基的前两个碱基具有经修饰的糖，优选2'-O-甲基修饰。在一个优选实施方式中，模拟物正义链的前两个碱基和后四个碱基的前两个碱基具有经修饰的糖，优选2'-O-甲基修饰。在一个优选实施方式中，模拟物正义链的后两个碱基具有经修饰的糖，优选2’-O-甲基修饰。在一个优选实施方式中，模拟物正义链的前两个和后两个碱基具有经修饰的糖，优选2'-O-甲基修饰。在一个优选实施方式中，模拟物正义链的后两个碱基是DNA碱基。在一个优选实施方式中，模拟物正义链的前两个碱基和后四个碱基的前两个碱基具有经修饰的糖，优选2'-O-甲基修饰，并且所述正义链的后两个碱基是DNA碱基。在一个优选实施方式中，模拟物正义链的前两个碱基具有经修饰的糖，优选2'-O-甲基修饰，并且所述正义链的后两个碱基是DNA碱基。在一个优选实施方式中，模拟物正义链的后四个碱基的前两个碱基具有经修饰的糖，优选2'-O-甲基修饰，并且所述正义链的后两个碱基是DNA碱基。
在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中所述miRNA与SEQ IDNO:51-125、209、211、213、215、217、219或221中任一项具有至少70％序列相同性，和/或其中所述miRNA长度为15-30个核苷酸，和/或其中miRNA的所述来源是所述miRNA的前体并且与SEQ ID NO:1-16中任一项，优选与SEQ ID NO:1-8中任一项具有至少70％序列相同性。
在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中所述miRNA与SEQ IDNO:51-125、209、211、213、215、217、219或221中任一项具有至少70％序列相同性，并且其中所述miRNA长度为15-30个核苷酸。在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中所述miRNA与SEQ ID NO:51-125、209、211、213、215、217、219或221中任一项具有至少70％序列相同性，和其中所述miRNA长度为15-30个核苷酸，和其中miRNA的所述来源是所述miRNA的前体并且与SEQ ID NO:1-16中任一项，优选与SEQ ID NO:1-8中任一项具有至少70％序列相同性。在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中所述miRNA与SEQ ID NO:51-125,209,211,213,215,217,219或221中任一项具有至少70％序列相同性，和其中miRNA的所述来源是所述miRNA的前体并且与SEQ ID NO:1-16中任一项，优选与SEQ ID NO:1-8中任一项具有至少70％序列相同性。
miRNA分子的来源或模拟物或isomiR的来源可以是任何分子，其能够诱导产生如本文所示的miRNA分子或模拟物或isomiR，并且其优选包含发夹样结构和/或双链核酸分子。发夹样结构的存在可以使用RNAshapes程序(Steffen P.等2006)评估，使用80、100和120nt或更大的滑动窗(sliding window)。发夹样结构通常存在于miRNA分子的天然或内源性来源，然而双链核酸分子通常存在于miRNA分子或isomiR或其模拟物的重组或合成来源。
miRNA分子的安塔够妙的来源或miRNA分子的安塔够妙的模仿物的来源可以是能够诱导产生所述安塔够妙的任何分子，如合适的载体。
miRNA分子或模拟物或isomiR或其安塔够妙的来源可以是单链，双链RNA或部分双链的RNA或者可以包含三种链，其实例述于WO2008/10558。本文所用部分双链指在5'端和/或在3'端处还包含单链结构的双链结构。当miRNA分子的各链长度不同时，可能会发生这种情况。通常，这类部分双链的miRNA分子可以具有小于75％的双链结构和大于25％的单链结构，或小于50％的双链结构且大于50％的单链结构，或更优选小于25％、20％或15％的双链结构和大于75％、80％、85％的单链结构。
或者，miRNA分子或其模拟物或isomiR的来源是DNA分子，所述DNA分子编码miRNA分子或其模拟物或isomiR的前体。上下文优选的DNA分子在SEQ ID NO:9-16所示。本发明涵盖DNA分子的用途，所述DNA分子编码miRNA分子的前体，所述miRNA分子与所述SEQ ID NO:9-16具有至少70％相同性。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。优选地，在该实施方式中，DNA分子的长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个，并且与DNA序列SEQ ID NO:9-16具有至少70％相同性。
当使用下述定义的一种试验将所述来源引入细胞中时，优选获得产生给定miRNA分子或模拟物或isomiR的诱导，或者产生其给定安塔够妙的诱导。后续定义本发明涵盖的细胞。
miRNA分子或其模拟物或isomiR的优选来源是其前体，更优选编码所述miRNA分子或其模拟物或isomiR的核酸。优选前体是天然存在的前体。前体可以是合成或重组前体。合成或重组前体可以是可以表达天然存在的前体的载体。在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中miRNA的来源是miRNA的前体并且是长度为至少50个核苷酸的寡核苷酸。
给定miRNA分子的优选前体具有通过SEQ ID NO:1-16中任一项表示的序列。本发明涵盖与所述序列具有至少70％相同性的miRNA分子或其isomiR或模拟物的前体的用途。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。优选地，在该实施方式中，DNA分子的长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个，并且与通过SEQ ID NO:1-16中任一项表示的序列具有至少70％相同性。优选地，在该实施方式中，前体包含种子序列，其与选自SEQ ID NO:17-50所表示的组的种子序列共享7个核苷酸中的至少6个核苷酸。更优选地，前体包含选自SEQ IDNO:17-50表示的组的种子序列。给定miRNA分子更优选的前体具有通过SEQ ID NO:1-8中任一项表示的序列。本发明涵盖与所述序列具有至少70％相同性的miRNA分子或其isomiR或模拟物的前体的用途。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。优选地，在该实施方式中，DNA分子的长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个，并且与通过SEQ ID NO:1-8中任一项表示的序列具有至少70％相同性。优选地，在该实施方式中，前体包含种子序列，其与选自SEQ ID NO:17-50所表示的组的种子序列共享7个核苷酸中的至少6个核苷酸。更优选地，前体包含选自SEQ ID NO:17-50所表示的组的种子序列。
因此，miRNA-323分子的优选来源与SEQ ID NO:1或9，优选SEQ ID NO:1具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和任选地，长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个核苷酸，和任选地，包含种子序列，其共享SEQ ID NO:17或24-28中任一项的7个核苷酸中的至少6个核苷酸。这类来源是miRNA-323分子和miRNA-323isomiR的前体。
因此，miRNA-342分子的优选来源与SEQ ID NO:2或10，优选SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和任选地，长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个核苷酸，和任选地，包含种子序列，其共享SEQ ID NO:18或29-42中任一项的7个核苷酸中的至少6个核苷酸。这类来源是miRNA-342分子和miRNA-342isomiR的前体。
因此，miRNA-520f分子的优选来源与SEQ ID NO:3或11，优选SEQ ID NO:3具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和任选地，长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个核苷酸，和任选地，包含种子序列，其共享SEQ ID NO:19、20、43或44中任一项的7个核苷酸中的至少6个核苷酸。这类来源是miRNA-520f分子和miRNA-520f isomiR如miRNA-520f-3p-i3的前体。
因此，miRNA-3157分子的优选来源与SEQ ID NO:4或12，优选SEQ ID NO:4具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和任选地，长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个核苷酸，和任选地，包含种子序列，其共享SEQ ID NO:21或45-48中任一项的7个核苷酸中的至少6个核苷酸。这类来源是miRNA-3157分子和miRNA-3157isomiR的前体。
因此，miRNA-193a分子的优选来源与SEQ ID NO:5或13，优选SEQ ID NO:5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和任选地，长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个核苷酸，和任选地，包含种子序列，其共享SEQ ID NO:22或49中任一项的7个核苷酸中的至少6个核苷酸。这类来源是miRNA-193a分子和miRNA-193a isomiR的前体。
因此，miRNA-7分子的优选来源与SEQ ID NO:6-8或14-16，优选SEQ ID NO:6-8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和任选地，长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个核苷酸，和任选地，包含种子序列，其共享SEQ ID NO:23或50中任一项的7个核苷酸中的至少6个核苷酸。这类来源是miRNA-7分子和miRNA-7isomiR的前体。
在该上下文中，指出的是给定的成熟miRNA分子的几种前体可能导致相同的miRNA分子。例如，miRNA-7可能源自前体miRNA-7-1或miRNA-7-2或miRNA-7-3(优选分别表示为SEQ ID NO:6、8或8)。也在该上下文中，指出的是给定的成熟miRNA分子的几种isomir可能导致具有相同种子序列的miRNA分子。例如，成熟miRNA-323-5p(SEQ ID NO:51)以及至少具有SEQ ID NO:58或59的isomir全部共享相同的种子序列(优选表示为SEQ ID NO:17)。
本文他处定义了优选的来源或前体。优选的来源包括或包含表达构建体，其包含核酸，即编码所述miRNA的所述前体或编码所述安塔够妙的DNA，更优选地，所述表达构建体是选自下述的病毒基因治疗载体：基于腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒，痘病毒和逆转录病毒的基因治疗载体。优选病毒基因治疗载体是AAV或慢病毒载体。其他优选载体是溶瘤病毒载体。这类载体在下文进一步描述。或者，来源可以是合成miRNA分子或化学模拟物，如关于通用定义的部分所进一步定义。
在更优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的纳米颗粒组合物，其还包含选自下组的另一个miRNA或安塔够妙：miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙。因此，在优选实施方式中，该方面提供了还包含下述内容的组合物：
i)miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙中的一个或多个，或
ii)miRNA-193a，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙中的一个或多个，或
iii)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙中的一个或多个，或
iv)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙中的一个或多个，或
v)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙中的一个或多个，或
vi)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙中的一个或多个，或
vii)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3和miRNA-3157，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙中的一个或多个，或
viii)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙中的一个或多个。
因此，在更优选实施方式中，该方面提供了还包含下述内容的组合物：
i)miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物中的一个或多个，或
ii)miRNA-193a，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物中的一个或多个，或
iii)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物中的一个或多个，或
iv)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物中的一个或多个，或
v)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物中的一个或多个，或
vi)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物中的一个或多个，或
vii)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3和miRNA-3157，或其isomiR，或其模拟物中的一个或多个，或
viii)miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，或其安塔够妙中的一个或多个。
纳米颗粒组合物
该组合物可进一步包含溶剂和/或赋形剂，优选药学上可接受的赋形剂。优选的溶剂是水溶液，如药学上可接受的缓冲液，例如PBS或柠檬酸盐缓冲液。优选的柠檬酸盐缓冲液包含50mM柠檬酸盐，pH为2.5-3.5，如pH 3，优选使用NaOH调节。优选的PBS的pH为7-8，如pH 7.4。PBS优选不包含二价阳离子，例如Ca2+和Mg2+。另一优选的药学上可接受的赋形剂是乙醇。最优选地，组合物包含生理缓冲液，如PBS或古德氏(Good’s)缓冲液或Hepes缓冲盐水或汉克斯(Hank’s)平衡盐溶液或林格氏(Ringer’s)平衡盐溶液或Tris缓冲液优选的组合物是药物组合物。
组合物可以包含其他赋形剂。这些其他赋形剂可包含在纳米颗粒中。
在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其还包含甾醇，优选选自下组：阿多甾醇(adosterol)，菜子甾醇(brassicasterol)，芸苔甾醇(campesterol)，胆钙化醇(cholecalciferol)，胆甾烯二酮(cholestenedione)，胆甾烯醇(cholestenol)，胆固醇(cholesterol)，δ-7-豆甾醇(delta-7-stigmasterol)，δ-7-燕麦甾醇(delta-7-avenasterol)，二氢速甾醇(dihydrotachysterol)，二甲基胆固醇(dimethylcolesterol)，麦角钙化甾醇(ergocalciferol)，麦角甾醇(ergosterol)，麦角甾烯醇(ergostenol)，麦角甾三烯醇(ergostatrienol)，麦角甾二烯醇(ergostadienol)，乙基胆甾烯醇(ethylcholestenol)，梭链孢酸(fusidic acid)，羊毛甾醇(lanosterol)，非胆甾二烯醇(norcholestadienol)，β-谷甾醇(β-sitosterol)，菠菜甾醇(spinasterol)，豆甾烷醇(stigmastanol)，豆甾烯醇(stigmastenol)，豆甾二烯醇(stigmastadienol)，豆甾二烯酮(stigmastadienone)，豆甾醇(stigmasterol)和豆甾烯酮(stigmastenone)，更优选胆固醇。更具体地，在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中所述纳米颗粒还包含甾醇，优选选自下组：阿多甾醇，菜子甾醇，芸苔甾醇，胆钙化醇，胆甾烯二酮，胆甾烯醇，胆固醇，δ-7-豆甾醇，δ-7-燕麦甾醇，二氢速甾醇，二甲基胆固醇，麦角钙化甾醇，麦角甾醇，麦角甾烯醇，麦角甾三烯醇，麦角甾二烯醇，乙基胆甾烯醇，梭链孢酸，羊毛甾醇，非胆甾二烯醇，β-谷甾醇，菠菜甾醇，豆甾烷醇，豆甾烯醇，豆甾二烯醇，豆甾二烯酮，豆甾醇和豆甾烯酮，更优选胆固醇。
优选地，这类进一步包含的甾醇不与任何部分偶联。也可以包含偶联的甾醇，如本文后面将解释的。因此，可以包含偶联的和未偶联的甾醇。除非另外明确指出，否则提及甾醇旨在表示未偶联的甾醇。
当组合物中包含甾醇时，其优选包含在纳米颗粒中，并且优选包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70mol％的甾醇；优选包含至多80、75、70、65、60、65、50、45、40、35或30mol％的甾醇。如上解释，该摩尔百分比仅涉及构成脂质纳米颗粒的物质，而不涉及溶剂或载物如寡核苷酸。当组合物包含甾醇时，优选包含5-70mol％，15-60mol％，25-60mol％，35-60mol％，40-60mol％或45-55mol％；更优选包含40-60mol％或45-55mol％，最优选包含45-55mol％，如48mol％或54mol％。
在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其还包含磷脂，优选地，其选自下组：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)，二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，1,2-二油酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺(DOP)，蛋磷脂酰胆碱(EggPC)，大豆磷脂酰胆碱(SoyPC)，更优选二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。更具体地，在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中纳米颗粒还包含磷脂，优选地，其选自下组：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)，二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，1,2-二油酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺(DOP)，蛋磷脂酰胆碱(EggPC)，大豆磷脂酰胆碱(SoyPC)，更优选二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
优选地，这类进一步包含的磷脂不与任何部分偶联。也可以包含偶联的磷脂，如本文后面将解释的。因此，可以包含偶联的和未偶联的磷脂。
当组合物中包含磷脂时，其优选包含在纳米颗粒中，并且优选包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60mol％的磷脂；优选包含至多65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5mol％的磷脂。如上解释，该摩尔百分比仅涉及构成脂质纳米颗粒的物质，而不涉及溶剂或载物如寡核苷酸。当组合物包含磷脂时，优选包含0-40mol％，0-35mol％，0-30mol％，5-30mol％，5-25mol％或5-20mol％；更优选包含5-20mol％或5-15mol％，最优选包含5-15mol％，如10mol％或11mol％。
在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其还包含水溶性聚合物和亲脂性锚固物的偶联物，其中：
i)所述水溶性聚合物选自下组：聚(乙二醇)(PEG)，聚(羟乙基-1-天冬酰胺)(PHEA)，聚(羟乙基-L-谷氨酰胺)(PHEG)，聚(谷氨酸)(PGA)，聚甘油(PG)，聚(丙烯酰胺)(PAAm)，聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)，聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(PHPMA)和聚(2-噁唑啉)(POx)，如聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMeOx)和聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEtOx)或其共聚物，
且其中：
ii)所述亲脂性锚固物选自下组：甾醇、脂质和维生素E衍生物。优选地，亲脂性锚固物是脂质，更优选甘油二酯。
更具体地，在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中纳米颗粒还包含水溶性聚合物和亲脂性锚固物的偶联物，如上所述。水溶性聚合物通常增加纳米颗粒的胶体稳定性，以此其通过亲脂性锚固物连接。通常，亲脂性锚固物包埋于脂质双层或胶束中，并因此将水溶性聚合物与纳米颗粒的表面连接。水溶性聚合物出于该目的的用途为本领域所知(Knop等,2010,doi:10.1002/anie.200902672)。优选的水溶性聚合物是聚(乙二醇)。优选地，水溶性聚合物的分子量范围为约750Da-约15000Da，更优选约1000Da-约6000Da，甚至更优选约1000Da-约3000Da，最优选约1500Da-约3000Da，如大约2000Da。因此，PEG-2000是优选的水溶性聚合物，用于如上所述的偶联物。水溶性聚合物优选线性聚合物，并且优选在其两个末端之一处偶联。另一个末端优选在生理条件下不带电荷，如羟基基团或甲基或乙基醚。优选地，非偶联的末端是甲基醚或羟基基团，最优选地是甲基醚。
与水溶性聚合物偶联的亲脂性锚固物通常用于确保水溶性聚合物与纳米颗粒之间的连接。偶联聚合物与锚固物的方法并不重要，本领域技术人员可以选择任何合适的化学键，如酯键，酰胺键，醚键，三唑或由偶联水溶性聚合物与亲脂性锚固物所产生的任何其他部分。还设想使用小接头，如琥珀酸或戊二酸。所述亲脂性锚固物选自下组：甾醇、脂质和维生素E衍生物。优选的甾醇如上描述。选的维生素E衍生物是生育酚和生育三烯酚，例如α-生育酚，β-生育酚，γ-生育酚，δ-生育酚和相应的生育三烯酚。优选地，亲脂性锚固物是脂质，更优选甘油二酯或磷脂。优选的脂质的示例如上所述，优选的甘油二酯的示例为二硬脂酰甘油，优选为1,2-二硬脂酰-sn-甘油，二棕榈酰甘油，优选1,2-二棕榈酰-sn-甘油，二油酰甘油，优选1,2-二油酰-sn-甘油，和二花生油酰甘油，优选1,2-二花生油酰-sn-甘油。最优选的甘油二酯是二硬脂酰甘油，优选1,2-二硬脂酰-sn-甘油。
如上所述偶联物的合适示例为：(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-2000)]醚，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-1500)]醚，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-3000)]醚，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[羟基(聚乙二醇-2000)]醚，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[羟基(聚乙二醇-1500)]醚，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[羟基(聚乙二醇-3000)]醚，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-2000)羧酸酯]，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-1500)羧酸酯]，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-3000)羧酸酯]，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[羟基(聚乙二醇-2000)羧酸酯]，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[羟基(聚乙二醇-1500)羧酸酯]，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[羟基(聚乙二醇-3000)羧酸酯]，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-2000)氨基甲酸酯]，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-1500)氨基甲酸酯]，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-3000)氨基甲酸酯],(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[羟基(聚乙二醇-2000)氨基甲酸酯]，(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[羟基(聚乙二醇-1500)氨基甲酸酯]，和(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[羟基(聚乙二醇-3000)氨基甲酸酯]，其中任选地，所述硬脂酰部分可以被其他脂肪酸替代，优选被其他C10-C20脂肪酸替代。对于如上所述的氨基甲酸酯和酯，也可以改变母体胺和母体醇以及母体羧酸，例如可以使PEG-醇与甘油二酯的羧酸类似物反应。偶联物最优选的示例为：(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-2000)]醚，其也被称为DSG-PEG(CAS#：308805-39-2)，和其酯类似物(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-2000)羧酸酯]，和其氨基甲酸酯类似物(1,2-二硬脂酰-sn-甘油)-[甲氧基(聚乙二醇-2000)氨基甲酸酯]或1,2-二硬脂酰氧基丙胺3-N-甲氧基(聚乙二醇)-2000氨基甲酰，其也被称为DSA-PEG，和其酰胺类似物。
当组合物包含如上所述偶联物时，其优选包含在纳米颗粒中，并且优选包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0mol％的偶联物；优选包含至多6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6或0.5mol％的偶联物。如上解释，该摩尔百分比t仅涉及构成脂质纳米颗粒的物质，而不涉及溶剂或载物如寡核苷酸。当组合物包含偶联物时，优选包含0-4mol％，0-3mol％，0.3-3mol％，0.5-3mol％，0.5-2.5mol％或1-2.5mol％；更优选包含0.5-2.5mol％或0.7-2.5mol％，最优选包含0.8-2.4mol％，如1mol％或2mol％。
优选的纳米颗粒包含二氨基脂质和甾醇。进一步优选的纳米颗粒包含二氨基脂质和磷脂。进一步优选的纳米颗粒包含二氨基脂质和水溶性聚合物与亲脂性锚固物的偶联物。优选的纳米颗粒包含二氨基脂质和甾醇和磷脂。优选的纳米颗粒包含二氨基脂质和甾醇和水溶性聚合物和亲脂性锚固物的偶联物。优选的纳米颗粒包含二氨基脂质和磷脂和水溶性聚合物和亲脂性锚固物的偶联物。最优选的纳米颗粒包含二氨基脂质和甾醇和磷脂和水溶性聚合物和亲脂性锚固物的偶联物。
在优选实施方式中，该方面提供了根据本发明的组合物，其中所述纳米颗粒包含：
i)20-60mol％的二氨基脂质，和
ii)0-40mol％的磷脂，和
iii)30-70mol％的甾醇，优选胆固醇，和
iv)0-10mol％如上所限定的水溶性聚合物和亲脂性锚固物的偶联物。
在进一步优选的实施方式中，纳米颗粒包含：
i)25-55mol％的二氨基脂质，和
ii)1-30mol％的磷脂，和
iii)35-65mol％的甾醇，优选胆固醇，和
iv)0.1-4mol％如上所限定的水溶性聚合物和亲脂性锚固物的偶联物。
在进一步优选的实施方式中，纳米颗粒包含：
i)30-50mol％的二氨基脂质，和
ii)5-15mol％的磷脂，和
iii)40-60mol％的甾醇，优选胆固醇，和
iv)0.5-2.5mol％如上所限定的水溶性聚合物和亲脂性锚固物的偶联物。
在进一步优选的实施方式中，纳米颗粒包含：
i)约38-42mol％的二氨基脂质，和
ii)约8-12mol％的磷脂，和
iii)约46-50mol％的甾醇，优选胆固醇，和
iv)约1.8-2.2mol％如上所限定的水溶性聚合物和亲脂性锚固物的偶联物。
医疗用途
本发明提供了这些纳米颗粒以及来自组合物的miRNA的医学用途。因此，该方面提供了根据本发明的组合物用作药物的用途。因此，该方面提供了来自组合物的miRNA用作药物的用途。这种用途也可以是组合物或miRNA在制备药物中的用途。在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用作药物，优选用于治疗癌症。这可以用作预防、治疗、逆转、治愈和/或延迟癌症的药物，或换言之，用于获得抗肿瘤作用。本文在此之后将这样用途的组合物称之为根据本发明用途的组合物。对于本文所述的医疗用途，来自组合物的优选miRNA是miRNA-193a或模拟物或isomiR或其前体，并且根据本发明优选的组合物包含miRNA-193a或模拟物或isomiR或其前体。
在该情况中优选的癌症是结直肠癌，结肠癌，头颈癌，胶质母细胞瘤，脑瘤，宫颈癌，癌，造血和淋巴恶性肿瘤，肝癌，乳腺癌，如三阴性乳腺癌，前列腺癌，膀胱癌，卵巢癌，肺癌，肾细胞癌，胰腺癌，或黑素瘤，更优选结直肠癌，结肠癌，头颈癌，成胶质细胞瘤，脑肿瘤，宫颈癌，癌，造血和淋巴恶性肿瘤，肝癌，乳腺癌，如三阴性乳腺癌，或黑素瘤，仍更优选为癌，造血和淋巴恶性肿瘤，肝癌，乳腺癌，如三阴性乳腺癌，或黑素瘤，甚至更优选为肝癌，如肝细胞癌(HCC)，肺癌，如非小细胞肺癌(NSCLC)，造血和淋巴恶性肿瘤，如白血病或淋巴瘤或骨髓瘤，其中优选白血病，乳腺癌，如三阴性乳腺癌(TNBC)，黑素瘤，胰腺癌，结肠癌，肾细胞癌(RCC)，鳞状细胞癌如头颈癌等乳腺癌(HNSCC)，前列腺癌和癌，如肝细胞癌(HCC)或非小细胞肺癌或鳞状细胞癌。白血病的示例为：急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、慢性髓性白血病(CML)、骨髓增生异常综合征和急性单核细胞白血病(AMoL)，其中优选AML。淋巴瘤的示例是皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，B细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(所有四个亚型，即结节性硬化型，混合细胞型，富含淋巴细胞型和淋巴细胞贫乏型)和非霍奇金淋巴瘤(及其亚型)。骨髓瘤也被称为多发性骨髓瘤，也称为浆细胞骨髓瘤。
在优选实施方式中，在对象的肿瘤细胞中评估抗肿瘤活性。更优选地，所述肿瘤细胞是HNSCC细胞(头颈鳞状细胞癌)，即鳞状细胞癌或上呼吸消化道的粘膜或上皮细胞，包括唇，内唇，口腔(口)，舌，口底，牙龈，硬腭，鼻腔(鼻内)，鼻旁窦，咽，包括鼻咽，口咽，下咽和喉(即喉癌，包括声门，声门上和声门下癌)，气管。或者，所述肿瘤细胞可以是结直肠细胞，结肠细胞，脑细胞，成胶质细胞瘤细胞，乳腺细胞，宫颈细胞。
在优选实施方式中，癌症是结直肠癌。在优选实施方式中，癌症是结肠癌。在优选实施方式中，癌症是头颈癌。在优选实施方式中，癌症是成胶质细胞瘤。在优选实施方式中，癌症是脑肿瘤。在优选实施方式中，癌症是乳腺癌，如三阴性乳腺癌。在优选实施方式中，癌症是子宫颈癌。在优选实施方式中，癌症是癌。在优选实施方式中，癌症是造血或淋巴恶性肿瘤。在优选实施方式中，癌症是肝癌。在优选实施方式中，癌症是前列腺癌。在优选实施方式中，癌症是膀胱癌。在优选实施方式中，癌症是卵巢癌。在优选实施方式中，癌症是肺癌。在优选实施方式中，癌症是肾细胞癌。在优选实施方式中，癌症是胰腺癌。在优选实施方式中，癌症是黑素瘤。
除非另有说明，否则优选在治疗前和至少一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更多时间之后评估或检测经治疗对象中的抗肿瘤作用。优选在对象中将抗肿瘤作用鉴定为：
-抑制肿瘤细胞的增殖或肿瘤细胞增殖可检测的减少或肿瘤细胞或黑素细胞细胞活力降低，和/或
-增加肿瘤细胞的分化能力，和/或
-肿瘤细胞死亡增加，这等同于肿瘤细胞存活减少，和/或
-转移和/或肿瘤细胞迁移发生延迟，和/或
-抑制或预防或延迟肿瘤重量或生长增加，和/或
-延长患者存活至少一个月，几个月或更长时间(相较于未经治疗或用对照治疗的那些，或者相较于治疗开始时的对象)，和/或
-肿瘤大小或体积减小。
在本发明的上下文中，患者可以存活和可以被认为是无病的。或者，该疾病或病症可能已经停止或延缓或退化。肿瘤细胞增殖的抑制可以是至少20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更高。可以使用已知技术评估细胞的增殖。肿瘤细胞或黑素细胞的细胞活力降低可以是至少20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多的降低。在用给定miRNA分子、其等价物或来源转染后4天，可以评估这种降低。可以通过已知技术诸如MTS试验评估细胞活力。
癌症的治疗可以是减少肿瘤体积或降低肿瘤细胞活力。肿瘤体积的减少可以使用卡尺评估。肿瘤体积或细胞活力或存活率的降低可以是至少降低至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更高。肿瘤细胞中凋亡的诱导或肿瘤细胞死亡的诱导可以是至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更高。可以使用技术人员已知的技术评估肿瘤细胞活力或存活或死亡。肿瘤细胞活力和死亡可以使用常规的成像方法，如MRI、CT或PET及其衍生产品，或在活检中进行评估。可通过在几个时间点对病灶的扩展进行视检来评估肿瘤细胞活力。至少一次观察到病灶减少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更高被认为是肿瘤细胞活力下降。
肿瘤细胞增殖的抑制可以是至少1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更高。可以使用已知技术作为标准增殖试验来评估细胞的增殖。这类增殖试验可以使用活体染料，如Cell Titer Blue(普洛麦格公司(Promega))。这包括通过代谢酶转化为荧光分子的底物分子。然后，荧光的水平反映了存活的代谢活性细胞的数量。或者，这类增殖试验可以确定有丝分裂指数。有丝分裂指数基于处于增殖阶段的肿瘤细胞数量与总肿瘤细胞数量的比较。对增殖细胞的标记可以通过使用抗体Ki-67和免疫组织化学染色进行。当有丝分裂指数降低至少20％、至少30％、至少50％或更多时，可以观测到肿瘤细胞增殖的抑制(如Kearsley J.H.,等,1990,PMID:2372483中所述)。
延迟转移和/或肿瘤细胞迁移的发生可以是至少一周、一个月、几个月，一年或更长时间的延迟。可使用MRI、CT或Echography或允许检测循环肿瘤细胞(CTC)的技术来评估转移的存在。后一种测试的示例是CellSearch CTC测试(Veridex公司)，其是对来自外周血的CTC的基于EpCam的磁性分选。
在某些实施方式中，肿瘤重量抑制或降低或肿瘤生长延迟或肿瘤生长抑制可为至少1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更高。肿瘤重量或体积肿瘤生长可以使用技术人员已知的技术来评估。通过使用葡萄糖类似物2-[18F]-氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG-PET))或[18F]-'3-氟-'3-脱氧-L-胸苷PET的正电子发射断层摄影术，可以通过测量葡萄糖利用的变化对肿瘤生长的检测或肿瘤细胞增殖的检测进行体内评估。离体替代方法可能是用Ki67对肿瘤活检进行染色。
肿瘤细胞分化能力的增加可以使用特定的分化标志物并在经治疗的细胞上存在这种标志物之后进行评估。优选的标志物或参数是p16，Trp-1和PLZF，c-Kit，MITF，酪氨酸酶和黑色素。这可以使用RT-PCR、western印迹或免疫组织化学来完成。在使用任何已鉴定的技术治疗至少一周后，分化能力的增加可以是至少可检测的增加。优选地，1％、5％、10％、15％、20％、25％或更多的增加表示给定样品中分化的细胞的数目将相应地增加。在某些实施方式中，肿瘤生长可以延迟至少一周、一个月、两个月或更长时间。在某个实施方式中，转移的发生被延迟至少一周，两周，三周，四周，一个月，两个月，三个月，四个月，五个月，六个月或更长时间
实施例中显示了这些方法或医疗用途的示例性实施方式的付诸实施。
本发明提供了用于刺激miRNA的细胞摄取的体内、体外或离体方法，该方法包括使细胞与根据本发明的组合物接触的步骤。该方法可以进一步包括允许本发明的纳米颗粒主动地或被动地进入细胞，优选地通过穿过细胞膜。该方法优选用于增加miRNA的效率，用于治疗。实施例中显示了这些方法或医疗用途的示例性实施方式的付诸实施。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗癌症。因此，本发明提供了来自组合物的miRNA用于治疗癌症，如miRNA分子，isomiR，模拟物，或miRNA分子、isomiR或模拟物的前体，如本文之前所述。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗化疗抗性癌症，如索拉非尼抗性癌症。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗癌。更优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗化疗抗性癌，如索拉非尼抗性癌。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗肝细胞癌(HCC)。更优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗化疗抗性HCC，如对受体酪氨酸激酶抑制剂如VEGF受体抑制剂具有抗性的肝细胞癌(HCC)，所述抑制剂为例如阿西替尼(axitinib)，西地尼布(cediranib)，乐伐替尼(lenvatinib)，尼达尼布(nintedanib)，帕唑帕尼(pazopanib)，雷戈非尼(regorafenib)，司马沙尼(semaxanib)，索拉非尼(sorafenib)，舒尼替尼(sunitinib)，替沃扎尼(tivozanib)，托西尼布(toceranib)或凡德他尼(vandetanib)，优选索拉非尼。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。更优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗化疗抗性NSCLC，如对基于铂的细胞周期非特异性抗肿瘤剂(例如，卡铂，顺铂，双环铂，奈达铂，奥沙利铂或赛特铂，优选顺铂或卡铂)具有抗性，或对紫杉烷(例如，卡巴他赛，多西他赛，拉罗他赛，奥他他赛，紫杉醇或替塞他赛，优选紫杉醇或多西他赛，更优选紫杉醇)具有抗性，或对基于嘧啶的抗代谢物(例如，氟尿嘧啶，卡培他滨，多西氟尿啶，喃氟啶，卡莫氟，氟尿苷，阿糖胞苷，吉西他滨，阿扎胞苷或地西他滨，优选吉西他滨)具有抗性，或对长春花碱生物碱(例如，长春花碱，长春新碱，长春氟宁，长春地辛或长春瑞滨，优选长春瑞滨)具有抗性，或对叶酸抗代谢物(氨基蝶呤，甲氨蝶呤，培美曲塞，普拉曲沙或雷替曲塞，优选培美曲塞)具有抗性的NSCLC。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)。更优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗化疗抗性TNBC，如对蒽环霉素(anthracyclin)具有抗性的TNBC，例如，对阿柔比星(aclarubicin)、道诺霉素(daunorubicin)，多柔比星(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(idarubicin)，氨柔比星(amrubicin)，吡柔比星(pirarubicin)，戊柔比星(valrubicin)或佐柔比星(zorubicin)，优选多柔比星具有抗性的TNBC。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗黑素瘤。更优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗化疗抗性黑素瘤，诸如对非经典细胞周期非特异性抗肿瘤剂(例如，甲基苄肼，达卡巴嗪，替莫唑胺，六甲蜜胺(altretamine)，二溴甘露醇(mitobronitol)或哌泊溴烷(pipobroman)，优选达卡巴嗪或替莫唑胺)具有抗性，或对紫杉烷(例如，卡巴他赛，多西他赛，拉罗他赛，奥他他赛，紫杉醇或替塞他赛，优选紫杉醇，如白蛋白结合的紫杉醇)具有抗性，或对基于铂的细胞周期非特异性抗肿瘤剂(例如，卡铂，顺铂，双环铂，奈达铂，奥沙利铂或赛特铂，优选顺铂或卡铂)具有抗性，或对长春花碱生物碱(例如，长春花碱，长春新碱，长春氟宁，长春地辛或长春瑞滨，优选长春瑞滨)具有抗性的黑素瘤。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗胰腺癌。更优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗化疗抗性胰腺癌，如对紫杉烷(例如，卡巴他赛，多西他赛，拉罗他赛，奥他他赛，紫杉醇或替塞他赛，优选紫杉醇，如白蛋白结合的紫杉醇)具有抗性，或对基于嘧啶的抗代谢物(例如，氟尿嘧啶，卡培他滨，多西氟尿啶，喃氟啶，卡莫氟，氟尿苷，阿糖胞苷，吉西他滨，阿扎胞苷或地西他滨，优选氟尿嘧啶或吉西他滨)具有抗性，或对拓扑异构酶抑制剂(例如，喜树碱，卡斯替康(cositecan)，贝洛替康(belotecan)，吉马替康(gimatecan)，依喜替康(exatecan)伊立替康(irinotecan)，勒托替康(lurtotecan)，斯拉替康(silatecan)，拓扑替康，鲁比替康(rubitecan)，优选伊立替康)具有抗性的胰腺癌。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗结肠癌。更优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗化疗抗性结肠癌，如对基于嘧啶的抗代谢物(例如，氟尿嘧啶，卡培他滨，多西氟尿啶，喃氟啶，卡莫氟，氟尿苷，阿糖胞苷，吉西他滨，阿扎胞苷或地西他滨，优选氟尿嘧啶或吉西他滨)具有抗性，或对拓扑异构酶抑制剂(例如，喜树碱，卡斯替康，贝洛替康，吉马替康，依喜替康伊立替康，勒托替康，斯拉替康，拓扑替康，鲁比替康，优选伊立替康)具有抗性，或对基于铂的细胞周期非特异性抗肿瘤剂(例如，卡铂，顺铂，双环铂，奈达铂，奥沙利铂或赛特铂，优选奥沙利铂)具有抗性，或对三氟尿苷或替普希立(tipiracil)或三氟尿苷和替普希立的组合具有抗性的结肠癌。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗肾细胞癌(RCC)。更优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗化疗抗性RCC，如对受体酪氨酸激酶抑制剂如VEGF受体抑制剂具有抗性的RCC，所述抑制剂为例如阿西替尼，西地尼布，乐伐替尼，尼达尼布，帕唑帕尼，雷戈非尼，司马沙尼，索拉非尼，舒尼替尼，替沃扎尼，托西尼布或凡德他尼，优选舒尼替尼(suntinib)、索拉非尼或帕唑帕尼，更优选索拉非尼。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗头颈癌(HNSCC)。更优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗化疗抗性HNSCC，如对紫杉烷(例如，卡巴他赛，多西他赛，拉罗他赛，奥他他赛，紫杉醇或替塞他赛，优选紫杉醇或多西他赛)具有抗性，或对基于嘧啶的抗代谢物(例如，氟尿嘧啶，卡培他滨，多西氟尿啶，喃氟啶，卡莫氟，氟尿苷，阿糖胞苷，吉西他滨，阿扎胞苷或地西他滨，优选氟尿嘧啶)具有抗性，或对叶酸抗代谢物(氨基蝶呤，甲氨蝶呤，培美曲塞，普拉曲沙或雷替曲塞，优选甲氨蝶呤)具有抗性，或对基于铂的细胞周期非特异性抗肿瘤剂(例如，卡铂，顺铂，双环铂，奈达铂，奥沙利铂或赛特铂，优选顺铂)具有抗性，或对蒽环霉素(例如，阿柔比星，道诺霉素，多柔比星，表柔比星，伊达比星，氨柔比星，吡柔比星，戊柔比星或佐柔比星，优选多柔比星)具有抗性，或对插入交联剂(intercalating crosslinking agent)(例如放线菌素(actinomycin)，博来霉素(bleomycin)，丝裂霉素，普卡霉素(plicamycin)，优选博来霉素或丝裂霉素)具有抗性的HNSCC。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗前列腺癌。更优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗化疗抗性前列腺癌，如对紫杉烷(例如，卡巴他赛，多西他赛，拉罗他赛，奥他他赛，紫杉醇或替塞他赛，优选紫杉醇)具有抗性，或对蒽二酮(anthracenedione)(例如，米托蒽醌(mitoxantrone)或匹克生琼(pixantrone)，优选米托蒽醌)具有抗性，或对烷基化抗肿瘤剂(例如基于雌激素的烷基化抗肿瘤剂，如艾司莫司汀(alestramustine)，阿司莫司汀(atrimustine)，赛斯特乙酸(cytestrol acetate)，雌二醇(estradiol)苯芥(mustard)，雌莫司汀(estramustine)，艾莫司汀(estromustine)，斯替波萨(stilbostat)；或酚斯特(phenestrol)，优选雌莫司汀)具有抗性的前列腺癌。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗造血和淋巴恶性肿瘤。更优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗造血和淋巴恶性肿瘤的化疗抗性肿瘤，如对硼替佐米具有抗性，或对来那度胺(lenalidomide)具有抗性的骨髓瘤，或如对CHOP或利妥昔单抗具有抗性的淋巴瘤，如对环磷酰胺(cyclophosphamide)或蒽环类药物(anthracycline)如羟基道诺霉素(hydroxydaunorubicin)或对oncovin或对泼尼松具有抗性，或如对长春新碱，蒽环类药物如多柔比星，L-天冬酰胺酶，环磷酰胺，甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，苯丁酸氮芥，环磷酰胺，皮质类固醇如强的松或泼尼松龙，氟达拉滨，喷司他丁或克拉屈滨具有抗性的白血病。当发现化疗如索拉非尼治疗无效或疗效低于预期或所需时，本文所述化疗抗性癌症如索拉非尼抗性癌症的治疗可以作为二线治疗。
实体瘤通常来源于上皮细胞(即，癌)。对于患者肿瘤样品，包括前列腺癌，已知上皮细胞标志物(例如，E-钙粘蛋白)的缺失和间充质细胞标志物(例如，N-钙粘蛋白和波形蛋白)的获得。癌细胞可以通过这种所谓的上皮向间质转化(EMT)去分化。在EMT期间，胞间细胞连接被破坏，从而使肿瘤细胞能够迁移并侵入周围组织或穿过血管壁。这类表型改变在疾病的传播中起主要作用，并最终导致疾病的进展，这通常与患者的不良预后有关。
E-钙粘蛋白表达的丧失被认为是EMT的分子标志。肿瘤细胞中的EMT来自细胞的转录重编程。具体地，已证明E-钙粘蛋白(CDH1)基因启动子的转录抑制触发EMT表型。E-钙粘蛋白是介导上皮细胞/组织中细胞间接触的最重要的钙粘蛋白分子之一。通过将转录抑制因子，SNAI1，SNAI2，TCF3，TWIST，ZEB1，ZEB2或KLF8与CDH1近端启动子区域中三个所谓的E-盒(E-box)结合而抑制CDH1。抑制这些阻遏物与CDH1启动子的结合可以逆转EMT(也称为间充质向上皮转化(MET))，并抑制肿瘤细胞浸润和肿瘤进展。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或该组合物的miRNA用于治疗、预防、延缓或改善与EMT相关的疾病或病症。在本文中，miRNA优选miRNA-518b分子，miRNA-520f分子，或miRNA-524分子；或其isomiR或模拟物，或其前体。EMT相关疾病或病症优选癌症，更优选为膀胱癌或前列腺癌。这种用途优选通过诱导间质向上皮的转变。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或该组合物的miRNA用于通过下调免疫抑制性肿瘤微环境来治疗、预防、延缓或改善癌症。在相关优选实施方式中，根据本发明的组合物或该组合物的miRNA用于通过预防或减少因肿瘤而致的宿主免疫逃避来治疗、预防、延缓或改善癌症。这类用途优选用于预防、抑制或减少腺苷产生，例如，通过抑制或减少细胞表面胞外酶的活性，如使ATP去磷酸化以产生腺苷的那些。这种用途更优选用于减少NT5E表达和/或减少ENTPD1表达和/或抑制腺苷生成。更优选地，根据本发明的组合物或该组合物的miRNA用于减少NT5E表达；在此，组合物的miRNA优选miRNA-193a。更优选地，根据本发明的该组合物或组合物的miRNA用于减少ENTPD1表达。更优选地，根据本发明的该组合物或组合物的miRNA用于抑制腺苷生成。在甚至更优选的实施方式中，根据本发明的该组合物或该组合物的miRNA用于减少癌细胞迁移，优选用于减少腺苷诱导的癌细胞迁移，最优选用于减少与NT5E表达相关的腺苷诱导的癌细胞迁移。NT5E或ENTPD1表达的减少优选通过荧光素酶试验或通过RT-PCR来评估，更优选如实施例中所述。癌细胞迁移的减少优选通过体外跨孔(transwell)试验来评估，更优选如实施例中所述。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于通过促进或增加癌细胞中优选在肝癌细胞中，在肺癌细胞中，在胰腺癌细胞中，在癌细胞中或在黑素瘤细胞中，更优选在肝癌细胞中，在癌细胞中或在黑素瘤细胞中，甚至更优选在肝细胞癌细胞或黑素瘤细胞中的G2/M停滞(arrest)来治疗、预防、延缓或改善癌症。这类用途优选地用于通过与细胞骨架关联来减少调节细胞分裂和/或增殖的因子的表达或活性，如MPP2和/或STMN1。这类用途优选用于促进或增加结合和/或螯合细胞周期蛋白依赖性激酶的因子，如YWHAZ和/或CCNA2。优选地，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于通过减少MPP2、STMN1、YWHAZ和CCNA2中至少一种的表达或活性来治疗、预防、延缓或改善癌症，更优选通过减少至少YWHAZ或STMN1，甚至更优选至少YWHAZ，最优选MPP2、STMN1、YWHAZ和CCNA2各自的表达或活性。优选地，G2/M停滞的增加是相较于未经处理的细胞增加，并且优选增加至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50％或更多。优选通过DNA染色，然后通过显微镜成像来评估，以基于DNA含量来确定核强度。优选使用RT-PCR评估MPP2、STMN1、YWHAZ和CCNA2中至少一种的表达或活性的降低，更优选如实施例中所述。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于通过减少或降低癌细胞迁移，癌细胞粘附或癌细胞增殖或通过增加或促进癌细胞凋亡来治疗，预防，延迟或改善癌症。这些癌细胞优选是肺癌细胞，肝癌细胞，乳腺癌细胞，黑素瘤细胞或癌细胞，更优选肺癌细胞，肝癌细胞，乳腺癌细胞或黑素瘤细胞，甚至更优选肺癌细胞如A549和H460，肝癌细胞如Hep3B和Huh7，乳腺癌细胞如BT549和皮肤癌细胞如A2058。在更优选的实施方式中，治疗、预防、延缓或改善癌症的这种用途是通过减少选自下组的至少一种基因的表达或活性：FOXRED2、ERMP1、NT5E、SHMT2、HYOU1、TWISTNB、AP2M1、CLSTN1、TNFRSF21、DAZAP2、C1QBP、STARD7、ATP5SL、DCAF7、DHCR24、DPY19L1、AGPAT1、SLC30A7、AIMP2、UBP1、RUSC1、DCTN5、ATP5F1、CCDC28A、SLC35D2、WSB2、SEC61A1、MPP2、FAM60A、PITPNB和POLE3，甚至更优选选自NT5E和TNFRSF21；优选地，如上所述对于凋亡、细胞迁移、粘附和增殖的用途是用于与这些基因中的至少一个相关的凋亡、细胞迁移、粘附和/或增殖的用途。优选通过RT-PCR评估表达，更优选如实施例中所述。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于治疗、预防、延缓或改善癌症，其通过增加或促进癌细胞的凋亡，优选通过增加或促进与选自下组的至少一种基因有关的凋亡：KCNMA1、NOTCH2、TNFRSF21、YWHAZ、CADM1、NOTCH1、CRYAA、ETS1、AIMP2、SQSTM1、ZMAT3、TGM2、CECR2、PDE3A、STRADB、NIPA1、MAPK8、TP53INP1、PRNP、PRT1、GCH1、DHCR24、TGFB2、NET1、PHLDA2和TPP1，更优选选自下组：NOTCH2、TNFRSF21、YWHAZ、ETS1、TGFB2和MAPK8。基因的表达或活性优选通过根据本发明的组合物或组合物的miRNA来减少，如通过miRNA-193a。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于治疗、预防、延缓或改善癌症，其通过减少或抑制血管新生，优选与癌细胞相关的血管新生，更优选通过减少或抑制与选自下组的至少一种基因相关的血管新生：CRKL、CTGF、ZMIZ1、TGM2、ELK3、LOX、UBP1、PLAU、CYR61和TGFB2，甚至更优选CRKL、TGFB2或PLAU，最优选PLAU。基因的表达或活性优选通过根据本发明的组合物或组合物的miRNA来减少，如通过miRNA-193a。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于治疗、预防、延缓或改善癌症，其通过调节癌细胞中未折叠的蛋白应答，更优选通过调节与选自下组的至少一种基因相关的未折叠的蛋白应答：ERMP1、NCEH1、SEC31A、CLSTN1、FOXRED2、SEPN1、EXTL2、HYOU1、SLC35D1、SULF2、PTPLB、HHAT、ERAP2、FAF2、DPM3、PDZD2、SEC61A1、DHCR24、IDS、MOSPD2、DPM、PRNP和AGPAT1。基因的表达或活性优选通过根据本发明的组合物或组合物的miRNA来减少，如通过miRNA-193a。调节未折叠的蛋白应答优选是抑制或减少未折叠蛋白应答。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于治疗、预防、延缓或改善癌症，其通过减少或抑制癌细胞的趋化性，更优选减少或抑制与选自下组的至少一种基因相关的趋化性：CXCL1、RAC2、CXCL5、CYR61、PLAUR、KCNMA1、ABI2和HPRT1，最优选PLAUR。基因的表达或活性优选通过根据本发明的组合物或组合物的miRNA来减少，如通过miRNA-193a。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于治疗、预防、延缓或改善癌症，其通过减少或抑制癌细胞中的蛋白质转运，优选通过减少或抑制与选自下组的至少一种基因相关的蛋白质转运：STON2、RAB11FIP5、SRP54、YWHAZ、SYNRG、GCH1、THBS4、SRP54、TOMM20、SEC31A、TPP1、SLC30A7、TGFB2、AKAP12、AP2M1、ITGB3、GNAI3、SORL1、KRAS、SLC15A1、SEC61A1、APPL1、LRP4、PLEKHA8、STRADB、SCAMP4、HFE、CADM1、ZMAT3、ARF3、VAMP8、NUP50、DHCR24、RAB11FIP5、ATP6V1B2、SQSTM1和WNK4，甚至更优选YWHAZ、TGFB2或KRAS，最优选YWHAZ。基因的表达或活性优选通过根据本发明的组合物或组合物的miRNA来减少，如通过miRNA-193a。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于治疗、预防、延缓或改善癌症，其通过减少或抑制癌细胞中的核苷代谢，更优选减少或抑制与选自下组的至少一种基因相关的核苷代谢：NUDT3、NUDT15、NUDT21、DERA、NT5E、GCH1和HPRT1，最优选NT5E。基因的表达或活性优选通过根据本发明的组合物或组合物的miRNA来减少，如通过miRNA-193a。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于治疗、预防、延缓或改善癌症，其通过减少或抑制癌细胞的糖基化，更优选减少或抑制与选自下组的至少一种基因相关的糖基化：SLC35D1、ST3GAL5、SULF2、LAT2、GALNT1、NCEH1、ST3GAL4、CHST14、B3GNT3、DPM3、GALNT13、DHCR24、NUDT15、IDH2、PPTC7、HPRT1、EXTL2、SEC61A1、ERAP2和GALNT14。基因的表达或活性优选通过根据本发明的组合物或组合物的miRNA来减少，如通过miRNA-193a。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于治疗、预防、延缓或改善瘤形成，其通过减少或抑制癌发生，优选通过减少或抑制与选自下组的至少一种基因相关的瘤形成：CCND1、CBL、CXCL1、CRKL、MAX、KCNMA1、TBL1XR1、GNAI3、YWHAZ、RAC2、ETS1、PTCH1、MAPK8、LAMC2、PIK3R1、CDK6、CBL、APPL1、GNAI3、PDE3A、TGFB2、ABI2、MAX、ITGB3、LOX、CXCL5、ARPC5、PPARGC1A和THBS4，甚至更优选选自：CRKL、TGFB2、YWHAZ、ETS1、MAPK8和CDK6，最优选选自：YWHAZ、ETS1、MAPK8和CDK6。基因的表达或活性优选通过根据本发明的组合物或组合物的miRNA来减少，如通过miRNA-193a。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于治疗、预防、延缓或改善癌症，其通过减少或抑制功能障碍伤口愈合，更优选通过减少或抑制与选自下组的至少一种基因相关的功能障碍伤口愈合：NOTCH2、KCNMA1、CXCL1、ITGB3、PLAU、CCND1、ZMIZ1、ELK3、YWHAZ、IL11、PLAUR、LOX、CTGF和TGFB2，甚至更优选选自：TGFB2、NOTCH2、PLAU、YWHAZ和PLAUR，最优选选自：NOTCH2、PLAU、YWHAZ，和任选地PLAUR。基因的表达或活性优选通过根据本发明的组合物或组合物的miRNA来减少，如通过miRNA-193a。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA用于治疗、预防、延缓或改善癌症，其通过增加或促进免疫激活，优选与针对癌症的免疫应答相关的免疫激活，更优选通过增加或促进与选自下组的至少一种基因相关的免疫激活：NOTCH2、LAT2、CRKL、LRRC8A、YWHAZ、PIK3R1、IRF1、TGFB2、IL11、UNG、CDK6和HPRT1，甚至更优选选自：CRKL、TGFB2、NOTCH2、YWHAZ和CDK6，最优选选自：NOTCH2、YWHAZ和CDK6。基因的表达或活性优选通过根据本发明的组合物或组合物的miRNA来减少，如通过miRNA-193a。
本发明还提供了获自对象的T细胞，所述对象经组合物的miRNA或经根据本发明的组合物处理，优选经miRNA-193a或包含miRNA-193a的根据本发明的组合物。如本文其他地方所述，这类T细胞可用于治疗癌症。在其使用中，T细胞优选预先获自经组合物的miRNA或经根据本发明的组合物处理的对象。T细胞优选获自人对象。其优选用作疫苗，或用于预防癌症复发或转移。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA，优选miRNA-193a或包含miRNA-193a的根据本发明的组合物，用于治疗、预防、延缓或改善与选自下组的至少一种基因相关的癌症：CDK6、EIF4B、ETS1、IL17RD、MCL1、MAPK8、NOTCH2、NT5E、PLAU、PLAUR、TNFRSF21和YWHAZ，更优选选自：NOTCH2、NT5E、PLAU、PLAUR和YWHAZ。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA，优选miRNA-193a或包含miRNA-193a的根据本发明的组合物，用于治疗、预防、延缓或改善与选自下组的至少一种基因相关的癌症：CDK4、CDK6、CRKL、NT5E、HMGB1、IL17RD、KRAS、KIT、HDAC3、RTK2、TGFB2、TNFRSF21、PLAU、NOTCH1、NOTCH2和YAP1。已知这些基因涉及抗肿瘤免疫。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA，优选miRNA-193a或包含miRNA-193a的根据本发明的组合物，用于治疗、预防、延缓或改善与选自下组的至少一种基因相关的癌症：ETS1、YWHAZ、MPP2、PLAU、CDK4、CDK6、EIF4B、RAD51、CCNA2、STMN1和DCAF7。这些基因涉及细胞周期调节。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或组合物的miRNA，优选miRNA-193a或包含miRNA-193a的根据本发明的组合物，用于治疗、预防、延缓或改善癌症，其中优选的癌症选自下组：结肠癌如结肠癌，肺癌如肺癌，黑素瘤，淋巴瘤如网状细胞肉瘤，胰腺癌如胰腺腺癌，肝癌如肝细胞癌或肝癌，乳腺癌如乳腺癌，前列腺癌，肾癌如肾腺癌，癌如腺癌或结肠、肺、肝、胰腺、肾或乳腺癌，和腺癌如胰腺癌或肾腺癌。更优选的癌症是选自：结肠癌如结肠癌，肺癌如肺癌，黑素瘤，淋巴瘤如网状细胞肉瘤，胰腺癌如胰腺腺癌，肝癌如肝细胞癌，乳腺癌的癌症如乳腺癌，前列腺癌，癌如腺癌或结肠、肺、肝、胰腺、肾或乳腺癌，和腺瘤如胰腺瘤。甚至更优选的癌症选自：结肠癌如结肠癌，肺癌如肺癌，黑素瘤，淋巴瘤如网状细胞肉瘤，和癌如结肠或肺癌。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗癌症，其中所述组合物与其他化疗剂组合，如索拉非尼。在下文中，将这称为根据本发明的组合。根据本发明的组合优选如上所述用于本发明使用的组合物。
根据本发明的组合是这样的组合，其包含根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA并且包含适用于治疗癌症的化疗剂如激酶抑制剂药物的组合，例如这样的组合，其包含根据本发明组合物并且包含索拉非尼，或例如包含来自组合物的miRNA并包含索拉非尼。
合适的化疗剂是激酶抑制剂药物，如索拉非尼或B-raf抑制剂或MEK抑制剂或RNR抑制剂或AURKB抑制剂。优选的B-raf抑制剂是维莫非尼(vemurafenib)和/或达拉菲尼(dabrafenib)。优选的MEK抑制剂是曲美替尼和/或司美替尼。优选的RNR抑制剂选自下组：吉西他滨，羟基脲，克罗拉滨氯法拉滨(clolar clofarabine)和三平胺(triapine)
B-raf抑制剂是特异性抑制B-raf蛋白的化合物，BRAF基因的突变形式为其编码。已知BRAF基因的多个突变会导致黑素瘤，并且已经开发出了抑制B-raf蛋白突变形式的特定化合物。B-raf抑制剂为本领域已知并且包括但不限于，维莫非尼，达拉菲尼，曲美替尼，GDC-0879，PLX-4720，索拉非尼，SB590885，PLX4720，XL281和RAF265。B-raf抑制剂描述于例如Wong K.K.,等中。根据本发明，一种B-raf抑制剂可以使用或与其他B-raf抑制剂联用。用于本发明优选的B-raf抑制剂是维莫非尼，达拉菲尼或维莫非尼和达拉菲尼的混合物。维莫非尼也称为RG7204或N-(3-{[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]羰基}-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺，并以Zelboraf销售。达拉非尼也称为N-{3-[5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(1,1-二甲基乙基)噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺。
MEK抑制剂是特异性抑制MEK蛋白的化合物。几种MEK抑制剂为本领域已知并包括但不限于，曲美替尼(GSK1120212)，司美替尼(AZD-6244)，XL518，CI-1040，PD035901。曲美替尼也称为N-(3-(3-环丙基-5-(2-氟-4-碘代苯基氨基)-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-1(2H)-基)苯基)乙酰胺。司美替尼也称为：6-(4-溴-2-氯苯基氨基)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基-3H苯并[d]咪唑-5-羧酰胺。MEK抑制剂描述于例如Wong K.K.,等(PMID:19149686)中。根据本发明，一种MEK抑制剂可以使用或与其他MEK抑制剂联用。几种MEK抑制剂与几种不同的MEK抑制剂同义。用于本发明的优选MEK抑制剂是曲美替尼和/或司美替尼。
RNR和/或AURKB抑制剂是特异性抑制RNR和/或AURKB蛋白的化合物。RNR是核糖核苷酸还原酶(RNR)，因此是唯一负责将核糖核苷二磷酸(NDP)从头转化为脱氧核糖核苷二磷酸(dNDP)的酶(Zhou等，2013)。RNR是胞内dNTP供应的关键调节剂。维持平衡的dNTP库是基本的细胞功能，因为DNA合成和修复中底物失衡的后果包括诱变和细胞死亡。人RNR是这样组成：亚基(RRM1)，其包含酶调节剂的两个结合位点和催化位点，和b亚基(RRM2)，其具有生成催化所需的稳定酪氨酸基团的双核铁辅因子。RNR的抑制剂可以抑制RRM1和/或RRM2。优选的RNR抑制剂选自下组：吉西他滨，羟基脲，氯法拉滨和三平胺
AURKB(极光B激酶)是这样的蛋白质，其具有将有丝分裂纺锤体连接到着丝粒的功能。激酶和磷酸酶调节有丝分裂和减数分裂过程中的染色体分离。极光激酶在染色体运动和分离过程中与微管结合。在癌细胞中，这些酶的过表达会导致遗传信息分布不均，产生非整倍体细胞(癌症的标志)。
化疗剂是能够诱导或促进本文定义的抗癌作用的药物。优选的化疗剂是激酶抑制剂或RNR抑制剂或AURKB抑制剂。这类抑制剂的示例是特异性抑制RNR和/或AURKB蛋白的化合物。为了评估治疗性化合物抑制RNR和/或AURKB蛋白的能力，可以用RNR(RRM1和/或RRM2)或AURKB蛋白作为读出进行western印迹。将细胞在6孔板中铺板，并用0.01、0.1和1uM的所述化合物处理72小时。处理后，将细胞刮入裂解缓冲液作为RIPA裂解缓冲液。通过使用10％SDS PAGE分离等量的蛋白质提取物，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。在含有0.1％吐温20和5％脱脂牛奶的Tris缓冲盐水中封闭1小时后，用RNR(即RRM1和/或RRM2)和/或AURKB一抗探测，然后通过与辣根过氧化物酶偶联的二抗探测，用于薄膜上进行化学发光检测。微管蛋白用作加载对照。使用的优选RRM2抗体来自圣克鲁兹公司(Santa Cruz)(产品号sc-10846)和/或优选的AURKB抗体来自细胞信号转导公司(Cell Signaling)(产品号3094)所述RNR和/或AURKB抑制剂的治疗能力的评估还可以通过进行Nothern印迹或通过PCR在RNA水平上评估。
根据本发明优选的组合包括：
i).根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA，其中组合物优选包含miRNA-193a或模拟物或isomiR或其前体，或者其中来自组合物的miRNA是miRNA-193a或模拟物或isomiR或其前体，和
ii).选自下组的至少一种化疗剂：
a.受体酪氨酸激酶抑制剂如VEGF受体抑制剂，例如，阿西替尼，西地尼布，乐伐替尼，尼达尼布，帕唑帕尼，雷戈非尼，司马沙尼，索拉非尼，舒尼替尼，替沃扎尼，托西尼布或凡德他尼，优选舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼，更优选索拉非尼；
b.基于铂的细胞周期非特异性抗肿瘤剂，例如，卡铂，顺铂，双环铂，奈达铂，奥沙利铂或赛特铂，优选顺铂或卡铂或奥沙利铂；
c.紫杉烷，例如，卡巴他赛，多西他赛，拉罗他赛，奥他他赛，紫杉醇或替塞他赛，优选紫杉醇或多西他赛，更优选紫杉醇或多西他赛；
d.基于嘧啶的抗代谢物，例如，氟尿嘧啶，卡培他滨，多西氟尿啶，喃氟啶，卡莫氟，氟尿苷，阿糖胞苷，吉西他滨，阿扎胞苷或地西他滨，优选氟尿嘧啶或吉西他滨或卡培他滨；
e.长春花碱生物碱，例如，长春花碱，长春新碱，长春氟宁，长春地辛或长春瑞滨，优选长春瑞滨或长春花碱；
f.叶酸抗代谢物，氨基蝶呤，甲氨蝶呤，培美曲塞，普拉曲沙或雷替曲塞，优选培美曲塞或甲氨蝶呤；
g.蒽环霉素，例如，阿柔比星，道诺霉素，多柔比星，表柔比星，伊达比星，氨柔比星，吡柔比星，戊柔比星或佐柔比星，优选多柔比星；
h.非经典细胞周期非特异性抗肿瘤剂，例如，甲基苄肼，达卡巴嗪，替莫唑胺，六甲蜜胺，二溴甘露醇或哌泊溴烷，优选达卡巴嗪或替莫唑胺；
i.紫杉烷，例如，卡巴他赛，多西他赛，拉罗他赛，奥他他赛，紫杉醇或替塞他赛，优选紫杉醇，如白蛋白结合的紫杉醇；
j.拓扑异构酶抑制剂，例如，喜树碱，卡斯替康，贝洛替康，吉马替康，依喜替康伊立替康，勒托替康，斯拉替康，拓扑替康，鲁比替康，优选伊立替康；
k.三氟尿苷或替普希立或三氟尿苷和替普希立的组合；
l.插入交联剂，例如，放线菌素，博来霉素，丝裂霉素，普卡霉素，优选博来霉素或丝裂霉素；
m.蒽二酮，例如，米托蒽醌或匹克生琼，优选米托蒽醌；和
n.烷基化抗肿瘤剂，例如基于雌激素的烷基化抗肿瘤剂，如艾司莫司汀，阿司莫司汀，赛斯特乙酸，雌二醇苯芥，雌莫司汀，艾莫司汀，斯替波萨；或酚斯特，优选雌莫司汀。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗癌症，其中组合物增加对癌细胞的免疫应答。这可能意味着在没有免疫应答的情况下，它会引发免疫应答。
在增加免疫应答的优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于增加免疫系统活化细胞因子如IL-2的产生。优选地，细胞因子产生增加1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多，并且优选通过FACS检测，更优选如实施例所示。如实施例所示，在治疗一周后，三阴性乳腺癌(TNBC)的4T1小鼠模型中免疫系统激活的细胞因子增加。细胞因子的增加导致癌症的免疫抑制增加，并且可能导致在其他情况下不易受免疫抑制影响的癌症的免疫抑制或部分免疫抑制。在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于增加T细胞功能，如增加IFNγ和IL-2的产生。
在增加免疫应答的优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于减少调节性T细胞群。调节性T细胞(Treg)是免疫抑制性T调节性细胞，并且减少Treg增加对癌症的免疫应答。优选地，Treg减少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多。可以通过确定FOXP3或LAG3来确定Treg的减少，例如如实施例中所述。如上所述，该作用优选与细胞因子产生增加同时。
如实施例所示，治疗两周后，三阴性乳腺癌(TNBC)的4T1小鼠模型中，CD8+T效应细胞的募集增加，并且诱导T细胞功能，同时减少Treg群。因此，在用于增加免疫应答的优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于增加T细胞频率。优选地，这类增加是1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多。这类增加可以通过测量CD8来确定，例如，如实施例中所进行的。在增加免疫应答的优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于诱导T细胞功能，优选用于通过诱导IFNγ产生来诱导T细胞功能。最优选地，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于增加T细胞频率并同时诱导T细胞功能，优选同时减少调节性T细胞群。Treg降低CD8+T效应细胞增加的肿瘤称为“热”肿瘤，其是没有免疫抑制的微环境的肿瘤。相反，免疫抑制的微环境中的肿瘤称为“冷”肿瘤。
此外，根据本发明的组合物可以减少免疫抑制靶基因如ENTPD1(CD39)或TIM-3的表达。优选地，这类减少是1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多。TIM-3或ENTPD1表达可通过qPCR确定，例如，如实施例所示。ENTPD1是胞外核苷酸酶，其催化三磷酸核苷和二磷酸核苷的γ和β磷酸残基水解为单磷酸核苷衍生物。通过产生大量腺苷，其具有免疫抑制作用。减少ENTPD1表达增加了针对肿瘤细胞的免疫应答。TIM-3也称为甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)，并且是一种免疫检查点，一种作为免疫抑制标志物的抑制受体。TIM-3主要在活化的CD8+T细胞上表达并抑制巨噬细胞活化。减少TIM-3表达增加了针对肿瘤细胞的免疫应答。在优选实施方式中，本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于减少ENTPD1或TIM-3的表达或用于减少ENTPD1和TIM-3的表达。
当其涉及肿瘤细胞和癌细胞时，根据本发明的组合物和来自组合物的miRNA对免疫系统的积极作用导致本发明适用于预防新肿瘤的生长，预防转移或减少肿瘤的生长，所述肿瘤的大小例如已通过手术移除。例如，如实施例4.4中所示，用根据本发明的组合物进行的治疗减少了手术切除的肿瘤的再生长，并减少了这类肿瘤的转移，增加了受影响对象的存活。转移所源自的肿瘤被称为原发性肿瘤。此外，当用已经治疗的相同类型的新肿瘤细胞再次攻击时，具有已经本发明的组合物或来自组合物的miRNA治疗的特定肿瘤类型的对象显示出有限的肿瘤发生(tumor take)。在有限的肿瘤发生后，肿瘤完全消退。当受到不同类型的肿瘤攻击时，肿瘤会完全发生，但随后也会完全消退。
因此，在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用作药物，用于预防、减少或延缓癌症或转移性癌症。在这种情况下，优选癌症是乳腺癌、癌和肝癌，更优选乳腺癌和肝癌。
因此，在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用作癌症疫苗，优选用作预防或治疗癌症的癌症疫苗。这类疫苗优选用于预防或减少原发性肿瘤的再生长或复发。优选地，再生长减少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多。在另一用途中，这类疫苗优选用于减少或治疗转移性癌症。优选地，转移性癌症减少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多，或者癌细胞的运动性减少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多。在这种情况下，优选癌症是乳腺癌、癌和肝癌，更优选乳腺癌和肝癌。
因此，在优选实施方式中，根据本发明的组合物和来自组合物的miRNA用作药物，其中该药物用于预防、减少或治疗转移性癌症，优选其中原发性肿瘤已经外科手术切除或已经消退，更优选其中原发性肿瘤已经手术切除。优选地，转移性癌症减少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多。在这种情况下，优选癌症是乳腺癌、癌和肝癌，更优选乳腺癌和肝癌。
因此，在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用作药物，其中该药物用于预防、减少或治疗外科切除后癌症的再生长和复发。优选地，再生长或复发减少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多。在这种情况下，优选癌症是乳腺癌、癌和肝癌，更优选乳腺癌和肝癌。
因此，在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用作药物，其中该药物用于预防、减少或治疗癌症已经消退或已经成功治疗后所述癌症的再生长和复发。优选地，再生长或复发减少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多。在这种情况下，优选癌症是乳腺癌、癌和肝癌，更优选乳腺癌和肝癌。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自该组合物的miRNA用于抑制肿瘤细胞的增殖。如实施例所示，根据本发明的组合物可以减少K-RAS和MCL1表达，导致肿瘤细胞的增殖减少。K-RAS，也称为KRAS、K-ras、Ki-ras，是本领域已知的原癌基因。MCL1也称为诱导型髓样白血病细胞分化蛋白Mcl-1。它可以通过抑制细胞凋亡来增加癌细胞存活。K-RAS和MCL1增强癌细胞的增殖。在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于减少K-RAS或MCL1的表达或用于减少K-RAS和MCL1的表达。在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于减少K-RAS和MCL1和ENTPD1和TIM-3的表达。
增殖的抑制优选通过诱导凋亡。如实施例中所证明的，根据本发明的组合物通过胱天蛋白酶活化和通过PARP裂解的PARP失活诱导癌细胞凋亡。优选的胱天蛋白酶活化是胱天蛋白酶3/7的活化。PARP也称为聚(ADP-核糖)聚合酶并表示程序性细胞死亡中所涉及的蛋白质家族。它在体内被胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7裂解，从而触发凋亡可以通过印迹技术确定PARP的裂解，并且可以通过确定PARP裂解来测定胱天蛋白酶活化，其通过印迹或通过qPCR，例如，如在实施例中所述。在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自该组合物的miRNA用于诱导癌细胞中的细胞凋亡。在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自该组合物的miRNA用于激活胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7。在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自该组合物的miRNA用于使PARP失活。优选地，使PARP失活1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多。可以通过如实施例中所示印迹技术监测PARP的失活，检测未切割的酶的较小片段。优选地，胱天蛋白酶活性增加1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多。
在进一步优选的实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于减少选自下组的至少一种基因的表达：K-RAS，MCL1，ENTPD1，TIM-3，c-Kit，细胞周期蛋白D1(CyclinD1)和CD73。c-Kit是一种原癌基因，也称为酪氨酸蛋白激酶Kit或CD117，并且编码受体酪氨酸激酶蛋白。细胞周期蛋白D1过表达与早期癌症发作和肿瘤进展相关。CD73也称为5'-核苷酸酶(5'-NT)和胞外-5'-核苷酸酶。CD73编码的酶是胞外5-末端核苷酸酶(5-末端-核糖核苷酸磷酸水解酶；EC 3.1.3.5)并催化嘌呤5-末端单核苷酸在中性pH下向核苷的转化，优选的底物是AMP。这类基因的表达优选减少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多，例如可以通过如实施例中证实的qPCR技术确定。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自该组合物的miRNA用于调节腺苷A2A受体途径。腺苷A2A受体，也称为ADORA2A，是可以抑制免疫细胞的腺苷受体。如上所述，根据本发明的组合物在降低CD73和/或ENTPD1表达的活性干扰A2A受体途径，降低免疫抑制。这导致抗肿瘤作用，因为肿瘤细胞逃避免疫监视的能力降低。在优选实施方式中，根据本发明的组合物或来自该组合物的miRNA用于增加肿瘤细胞对免疫监视的敏感性。优选地，这类增加导致肿瘤体积减少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更高。在更优选的实施方式中，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于增加肿瘤细胞对免疫监视的敏感性，同时增加CD8+T效应细胞的募集，优选同时减少Treg，诸如通过减少LAG3或FoxP3或两者的表达。增加对免疫监视的敏感性优选导致肿瘤体积减小。
根据本发明的组合物和来自该组合物的miRNA促进肿瘤细胞中的细胞周期停滞。在优选实施方式中，本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗癌症，其中该用途用于诱导细胞周期停滞。可以测量细胞周期停滞概况，例如通过进行核成像或流式细胞术，优选如实施例中所示。在这种情况下，细胞周期停滞优选是诱导G2/M或SubG1细胞周期停滞概况。优选地，1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多的肿瘤细胞经历细胞周期停滞。优选地，当根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于治疗黑素瘤、肝癌、癌、肺癌或胰腺癌时，根据本发明的组合物或来自组合物的miRNA用于增加细胞周期停滞概况。
通用定义
在本文件以及其权利要求中，动词“包括/包含”及其变化形式以其非限制性意义使用，表示包括该词之后的项目，但不排除未特别提及的项目。此外，用“一个”或“一种”指示“一个种元素”时不排除存在多于一个/种元素的情形，除非明确要求仅有或仅为一个/种元素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常表示“至少一个”。
词语“约”或“近似”当与数值(例如，约10)联用时优选表示该值可以是给定值或比该值多或少1％。在述及分子的部分或亚结构相同时，不考虑同位素的自然丰度分布。相同的性质指将要绘制的结构式。
如本文所用，mol％指摩尔百分比，其也称为摩尔分数或摩尔分数或摩尔百分比或量分数。其涉及一种成分的摩尔量除以混合物中所有成分的总量，也以摩尔表示。
当本领域技术人员据信结构式或化学名称理解为具有手性中心但未指示手性时，对于各手性中心，单独参考消旋混合物、纯R型对映异构体和纯S型对映异构体的全部三种。
每当在本发明的上下文中讨论物质的参数时，除非另有说明，否则假定参数是在生理条件下确定、测量或显示的。生理条件为本领域技术人员所已知并且包括水性溶剂体系，大气压，pH值介于6和8之间，温度范围从室温到大约37℃(大约20℃到大约40℃)，和适当浓度的缓冲盐或其他成分。应当理解的是，电荷通常与平衡有关。述及带有或具有电荷的部分是这样的部分，所述部分带有或具有这种电荷的状态多于其不带有或具有这种电荷的状态。因此，如本领域技术人员所理解的，在本公开中指示为带电荷的原子可以在特定条件下不带电荷，并且中性部分可以在特定条件下带电。
在本发明的上下文中，待评估参数的减少或增加指对应该参数的值改变至少5％。更优选地，值的减小或增加表示改变至少10％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％或至少100％。在后一种情况中，可能是不再有与该参数相关的可检测值的情况。
如该文件中所述的物质作为药物的用途也可以解释为所述物质在制备药物中的用途。相似的，每当将物质用于治疗或用作药物时，其也可以用于制备用于治疗的药物。产品的使用适合用于治疗方法。
通过引用多个示例性实施方式，上文描述了本发明。一些部件或元件的修改和替代性实施方案是可能的，并且包括在所附权利要求书所限定的保护范围内。文献和专利文件的所有引文通过引用纳入。
本文所述一般定义和一般技术
微小RNA分子("miRNA")通常长度为21-22个核苷酸，虽然已经报道了长度为17和上至25个核苷酸。因此，本发明涵盖了17、18、19、20、21、22、23、24、25中的任意长度。miRNA各自由较长的前体RNA分子加工而成("前体miRNA")。前体miRNA转录自非蛋白质编码的基因。前体的长度可以是至少50、70、75、80、85、100、150、200个核苷酸或更多个核苷酸。前体miRNA具有能够形成茎-环样或折回样结构的两个互补区域，它们在动物中被称为Dicer和Drosha的酶切割。Dicer和Drosha是核糖核酸酶Ill样核酸酶。加工的miRNA通常是茎的部分。
加工的miRNA(也称之为“成熟miRNA”)成为大型复合物(称为RNA诱导沉默复合物(RISC)复合物)的部分，以调节(下调)特定靶基因。动物miRNA的实例包括与mRNA靶标完美或不完美碱基配对的动物miRNA，分别导致mRNA降解或翻译抑制(Olsen等，1999；Seggerson等，2002)。SiRNA分子也由Dicer加工，但来自长双链RNA分子。SiRNA在动物细胞中不是天然存在的，但是它们可以在这类细胞中，在RNA诱导的沉默复合物(RISC)中发挥功能，以指导mRNA靶标的序列特异性切割(Denli等，2003)。
SIROCCO是一个EU联盟，其研究沉默RNA作为真核生物体中复杂性的组织者和协调者(例如，参见cordis.europa.eu/pub/lifescihealth/docs/sirocco.pdf和www.sirocco-project.eu)。作为一个联盟，SIROCCO维护miRNA序列信息的数据库。SIROCCO数据库中所列出的各miRNA条目基于观测和验证的所述miRNA表达。
内源性miRNA分子的研究述于美国专利申请号60/575,743内。当成熟的单链RNA与调节mRNA翻译的蛋白质复合物结合时，miRNA在细胞中显然具有活性，所述mRNA与miRNA杂交。引入以与内源性表达的miRNA相同方式影响细胞的外源性RNA分子需要具有与内源性成熟miRNA相同序列的单链RNA分子被促进翻译控制的蛋白质复合物所摄取。已经评估了多种RNA分子设计。已经鉴定了三种一般设计，它们可以通过miRNA途径使所需单链miRNA的摄取最大化。具有这样miRNA序列的RNA分子可以称之为合成miRNA，所述miRNA序列具有三种设计中的至少一种。
本发明的miRNA分子可以替代或补充内源性miRNA的基因沉默活性。这类分子的实例，这类分子和包含这类分子的组合物的优选特征和修饰述于WO2009/091982中。
在一些实施方式中，本发明的miRNA分子或其isomiR或模拟物或来源包含两种RNA分子，其中一种RNA与天然产生的成熟miRNA相同。与成熟miRNA相同的RNA分子称之为活性链或反义链。第二RNA分子称之为互补链或正义链，其与活性链至少部分互补。将活性链和互补链杂交以产生双链RNA，该双链NRA与天然产生的miRNA前体相似，所述天然产生的miRNA前体刚好在细胞中miRNA激活之前与蛋白质复合物结合。使所述miRNA的活性最大化需要通过在翻译水平上调节基因表达的miRNA蛋白质复合物使活性链的摄取最大化并使互补链的摄取最小化。提供最佳miRNA活性的分子设计涉及互补链的修饰。两种设计将互补链的化学修饰纳入。
第一种修饰涉及产生互补RNA，在其5'末端具有除了磷酸基团或羟基以外的基团。5'修饰的存在明显消除了互补链的摄取，并随后有利于miRNA蛋白复合物对活性链的摄取。5'修饰可以是多种分子的任一种，包括NH2、NHCOCH3、生物素和其他。通过显著减少miRNA途径对互补链摄取的第二种化学修饰策略是在互补链的前2-6个核苷酸中纳入具有糖修饰的核苷酸。应当注意的是，可以将与第二设计策略一致的糖修饰和与第一设计策略一致的5'末端修饰结合，以进一步增强miRNA活性。第三种miRNA设计涉及在与活性链并不互补的互补链的3'端纳入核苷酸。所得活性和互补RNA的杂交体在活性链的3'端非常稳定但是在活性链的5'端相对不稳定。siRNA的研究表明5'杂交体稳定性是支持RNA干扰的蛋白质复合物摄取RNA的关键指标，其至少与细胞中的miRNA途径相关。发明人已经发现，在互补RNA链中明智地使用错配可以显著增强所述miRNA的活性。
核酸
本发明涉及也称为miRNA来源或前体的核酸分子，其可以将miRNA引入培养的细胞或对象中。核酸可以通过纯化的酶在细胞中或体外产生，虽然它们优选通过化学合成产生。它们可以是粗制的或纯化的。除非另有说明，术语“miRNA”指在已经从其前体切割后经加工的miRNA。经常将miRNA的名称缩写，并且不使用前缀，并且将根据上下文理解。除非另有说明，本申请中所述miRNA是表示为mir-X或let-X的人序列，其中X是数字和/或字母。
应当理解的是，miRNA源自基因组序列或非编码基因。在该方面中，术语“基因”用于指代编码给定miRNA的前体miRNA的基因组序列。然而，本发明的实施方式可涉及涉及其表达的miRNA的基因组序列，如启动子或其他调节序列。
可以使用术语“重组”，并且其通常指这样的分子，所述分子已经被体外操纵或者是该分子的复制或表达的产物。
术语“核酸”为本领域所熟知。本文所用“核酸”通常指包含核碱基的DNA、RNA或其衍生物或类似物的分子(一条或多条链)。例如，核碱基包括DNA(例如，腺嘌呤“A”，鸟嘌呤“G”，胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(例如，A，G，尿嘧啶“U”或C)中天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”涵盖术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，其各自为术语“核酸”的亚属。
术语“miRNA”通常指单链分子，但是在具体实施方式中，在本发明中实施的分子还将涵盖与同一单链核酸另一区域或与另一核酸部分(整个链长度上互补10-50％)，基本上(整个链长度上互补大于50％但是小于100％)或完全互补的区域或另一链。因此，核酸可以涵盖这样的分子，所述分子包含具有分子的特定序列的一个或多个互补或自互补链或“互补体”。例如，前体miRNA可以具有自互补区域，其具有高达100％的互补性。
如本文所用，“杂交”，“进行杂交”或“能够杂交”应当理解为意指使用本领域技术人员已知的技术如southern印迹过程形成双链或三链分子或具有部分双链或三链性质的分子。本文所用术语“退火”与“杂交”是同义词。术语“杂交”，“进行杂交”或“能够杂交”可以表示“低”，“中”或“高”杂交条件，如下所定义。
低到中至高严格条件表示这样的预杂交和杂交：以42℃在5X SSPE，0.3％SDS，200pg/m剪切和变性的鲑鱼精子DNA，以及25％、35％或50％甲酰胺(分别对于低到中至高严格条件)。然后，将杂交反应洗涤3次，每次30分钟，使用2XSSC，0.2％SDS和55℃、65℃或75℃(对于低到中至高严格条件)。
在一些实施方式中，本发明的核酸或其衍生物将包含SEQ ID NO:51-125中所述任一miRNA的miRNA序列。设想了源自SEQ ID NO:51-125的本发明的核酸序列可以具有，具有至少，或具有至多来自SEQ ID NO:51-125的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个连续核苷酸(或其中可衍生的任何范围)。在其他实施方式中，核酸与SEQ IDNO:51-125的miRNA序列有，有至少或有至多80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％相同性。
核碱基
如本文所用，“核碱基”指杂环碱基，例如至少一种天然核酸(即DNA和RNA)中天然存在的核碱基(即A、T、G、C或U)，以及此类核碱基的天然或非天然存在的衍生物和类似物。核碱基通常可以替代天然存在的核碱基配对(例如，A与T，G和C，和A和U之间的氢键)的方式与至少一种天然存在的核碱基形成一个或多个氢键(“退火”或“杂交”)。
“嘌呤”和/或“嘧啶”核碱基涵盖天然存在的嘌呤和/或嘧啶核碱基以及其衍生物和类似物，包括但不限于，被一个或多个烷基，羧基烷基(caboxyalkyl)，氨基，羟基，卤素(即氟，氯，溴或碘)，硫醇或烷基硫醇部分取代的嘌呤或嘧啶。优选的烷基(例如，烷基，羧基烷基等)部分包含约1，约2，约3，约4，约5至约6个碳原子。嘌呤或嘧啶的其他非限制性实例包括：脱氮嘌呤(deazapurine)，2,6-二氨基嘌呤，5-氟尿嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，8-溴鸟嘌呤，8-氯鸟嘌呤，溴胸腺嘧啶，8-氨基鸟嘌呤，8-羟基鸟嘌呤，8-甲基鸟嘌呤，8-硫鸟嘌呤，氮鸟嘌呤，2-氨基嘌呤，5-乙基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-乙基尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-丙基尿嘧啶，硫尿嘧啶，2-甲基腺嘌呤，甲基硫代腺嘌呤，N,N-二甲基腺嘌呤，氮杂鸟嘌呤，8-溴腺嘌呤，8-羟基腺嘌呤，6-羟基氨基嘌呤，6-硫嘌呤，4-(6-氨基己基/胞嘧啶)等。其他实例是本领域普通技术人员所熟知的。
使用本文所述或本领域普通技术人员已知的任何化学或天然合成方法，核碱基可包含在核苷或核苷酸中。这样的核碱基可以被标记，或者可以是被标记并包含核碱基的分子的部分。
核苷
如本文所用，“核苷”指包含共价连接核碱基接头部分的核碱基的单个化学单元。“核碱基接头部分”的非限制性实例是包含5-碳原子的糖(即“5-碳糖”)，包括但不限于，脱氧核糖，核糖，阿拉伯糖或5碳糖的类似物或衍生物。5-碳糖的衍生物或类似物的非限制性实例包括2'-氟-2'-脱氧核糖或碳环糖，其中碳取代了糖环中的氧原子。
不同类型的核碱基与核碱基接头部分的共价连接是本领域已知的。作为非限制性的实例，包含嘌呤(即，A或G)或7-脱氮嘌呤核碱基的核苷通常将嘌呤或7-脱氮嘌呤的9位共价连接5-碳糖的l'-位。在另一非限制性的实例中，包含嘧啶核碱基(即，C、T或U)的核苷通常将嘧啶的1位共价连接5-碳糖的l'位(Kornberg和Baker,1992)。
核苷酸
如本文所用，“核苷酸”指还包含“主链部分”的核苷。主链部分通常将核苷酸共价连接至包含核苷酸的另一分子，或至另一核苷酸以形成核酸。天然存在的核苷酸中的“主链部分”通常包含磷部分，其共价连接5-碳糖。主链部分的连接通常发生在5-碳糖的3'-或5'-位置。然而，其他类型的连接在本领域中是已知的，特别是当核苷酸包含天然存在的5-碳糖或磷部分的衍生物或类似物时。
核酸类似物
核酸可以包含或完全由天然存在的核酸中可能存在的核碱基，核碱基接头部分和/或主链部分的衍生物或类似物组成。具有核酸类似物的RNA也可以根据本发明的方法进行标记。如本文所用，“衍生物”指天然存在的分子的化学修饰或改变的形式，而术语“模拟物”或“类似物”指这样的分子，其在结构上可能或可能不与天然存在的分子或部分相似，但是具有类似的功能。如本文所用，“部分”通常指较大化学或分子结构的较小化学或分子组分。核碱基，核苷和核苷酸类似物或衍生物为本领域所熟知，并且已经被描述(参见例如Scheit，1980)。
包含5-碳糖和/或主链部分衍生物或类似物的核苷、核苷酸或核酸的其他非限制性实例包括述于下述内容中的那些：美国专利号5,681,947，其描述了包含嘌呤衍生物的寡核苷酸，其与dsDNA形成三螺旋和/或防止dsDNA表达；美国专利号5,652,099和5,763,167，其描述了这样的核酸，所述纳入DNA或RNA中存在的核苷的荧光类似物，特别用作荧光核酸探针；美国专利号5,614,617，其描述了在嘧啶环上具有取代的寡核苷酸类似物，其具有增强的核酸酶稳定性；美国专利号5,670,663、5,872,232和5,859,221，其描述了具有修饰的5-碳糖(即，修饰的T-脱氧呋喃糖基部分)的寡核苷酸类似物用于核酸检测；美国专利号5,446,137，其描述了这样的寡核苷酸，其包含至少一个5-碳糖部分，在4'位置被氢以外的取代基取代，可用于杂交测定中；美国专利号5,886,165，其描述了这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有带有3'-5'核苷酸间连接的脱氧核糖核苷酸和带有2'-5'核苷酸间连接的核糖核苷酸；美国专利号5,714,606，其描述了修饰的核苷酸间连接，其中核苷酸间连接的3'位氧被碳替代以增强核酸的核酸酶抗性；美国专利号5,672,697，其描述了包含增强核酸酶抗性的一个或多个5'亚甲基膦酸酯核苷酸间连接的寡核苷酸；美国专利号5,466,786和5,792,847，其描述了可能包含药物或标记物的取代基与寡核苷酸2'碳的连接，以提供增强的核酸酶稳定性和递送药物或检测部分的能力；美国专利号5,223,618，描述了具有2'或3'碳主链连接的寡核苷酸类似物，其连接相邻5碳糖部分的4'位和3'位，以增强细胞摄取，对核酸酶的抵抗力以及与靶RNA杂交；美国专利号5,470,967，其描述了包含包含至少一个氨基磺酸酯或磺酰胺核苷酸间键的寡核苷酸，可用作核酸杂交探针；美国专利号5,378,825、5,777,092、5,623,070、5,610,289和5,602,240，其描述了具有三个或四个原子接头部分替代磷酸二酯主链部分的寡核苷酸，用于改善核酸酶抗性，细胞摄取和调节RNA表达；美国专利号5,858,988，其描述了连接寡核苷酸2'-0位以增强其膜通透性和稳定性的疏水性载体剂；美国专利号5,214,136，其描述了在5'末端偶联蒽醌的寡核苷酸，其与DNA或RNA杂交增强；或对核酸酶稳定性增强；美国专利号5,700,922，其描述了PNA-DNA-PNA嵌合体，其中DNA包含2'-脱氧-赤-戊呋喃糖基核苷酸，用于增强核酸酶抗性，结合亲和力，以及激活RNA酶H的能力；和WO98/39352、WO99/14226、WO2003/95467和WO2007/085485，其描述了修饰的RNA核苷酸，其中核糖部分经连接2'氧和4'碳的额外的桥修饰。锁定的核糖显著增加了结合亲和力和特异性；和WO2008/147824，其描述了修饰的RNA核苷酸，称之为UNA(解锁核酸)。UNA是RNA的无环类似物，其中C2'和C3'原子之间的键已被切割，从而降低了对互补链的结合亲和力。UNA与RNA酶H识别和RNA切割兼容并改善siRNA介导的基因沉默；WO2008/036127描述了吗啉代核酸类似物，其包含不带电荷和阳离子的亚单位间连接；WO/2007/069092和EP2075342描述了Zip核酸(ZNA)，其包含偶联精胺衍生物作为阳离子部分(Z单元)与寡核苷酸；美国专利5,708,154，其描述了与DNA连接的RNA以形成DNA-RNA杂合体；美国专利5,728,525，其描述了使用通用荧光标记物对核苷类似物进行标记。
核苷类似物和核酸类似物的其他教导是美国专利5,728,525，其描述了末端标记的核苷类似物；美国专利5,637,683，6,251,666(L-核苷酸取代)，和5,480,980(7-脱氮2'-脱氧鸟苷核苷酸及其核酸类似物)。特别设想了其他类似物在本发明上下文中使用的用途。这类类似物可以用于本发明的合成核酸分子，在整个分子中或在选定的核苷酸中。它们包括但不限于：
1)核糖修饰(如2'F，2'NH2、2'N3、4'硫代或2'O-CH3)和
2)磷酸修饰(例如在硫代磷酸酯，甲基膦酸酯和磷硼酸酯中发现的那些)。
通过减少或消除其被核糖核酸酶切割的能力，已经创建了这类类似物以赋予RNA稳定性。当这些核苷酸类似物存在于RNA中时，它们可以对动物中RNA的稳定性产生深远的积极影响。设想了核苷酸类似物的用途可以单独使用或者与本发明任何核酸的合成miRNA的任何设计修饰联用。
修饰的核苷酸
本发明的miRNA具体地设想了经修饰以增强其活性的核苷酸的用途。这类核苷酸包括在RNA的5'或3'末端的那些以及在分子内部的那些。在所述miRNA互补链中使用的修饰的核苷酸阻断RNA的5'OH或磷酸或引入内部糖修饰，其增加miRNA活性链的摄取。对于miRNA的修饰包括内部糖修饰，其增加杂交以及稳定细胞内分子，和进一步稳定细胞内核酸的末端修饰。进一步设想可以通过显微镜或其他方法检测的修饰以鉴定含有合成miRNA的细胞。
核酸的制备
核酸可以通过本领域普通技术人员已知的任何技术来制备，例如，化学合成，酶促产生或生物产生。
miRNA的设计
miRNA通常包含两条链，一条活性链与正在研究的成熟miRNA的序列相同，一条互补链与该活性链至少部分互补。活性链是生物学上相关的分子，并且应优选被细胞中通过mRNA降解或翻译控制来调节翻译的复合物摄取。活性链的优选摄取产生两个重要结果：(1)观察到的所述miRNA的活性急剧增加，和(2)基本上消除由互补链的摄取和激活所诱导的非预期作用。根据本发明，可以使用多种miRNA设计来确保优先摄取活性链。
5'阻断剂
在互补链的5'端引入除了磷酸基团或羟基以外的稳定部分将削弱其在miRNA途径中的活性。这确保了将仅使用miRNA的活性链调节细胞中的翻译。5'修饰包括但不限于，NH2，生物素，胺基团，低级烷基胺基团，乙酰基团，2'O-Me，DMTO，荧光素，硫醇或吖啶或这类功能的任何其他基团。
其它正义链修饰。将核苷酸修饰引入miRNA的互补链可以消除互补链的活性并增强miRNA活性链的摄取，所述核苷酸修饰如2'-O Me，2'-脱氧，T-脱氧-2'-氟代，2'-O-甲基，2'-O-甲氧乙基(2'-0-MOE)，2'-O-氨丙基(2'-0-AP)，2'-O-二甲基氨乙基(2'-0-DMAOE)，2'-O-二甲基氨丙基(2'-0-DMAP)，2'-O-二甲基氨乙氧基乙基(2'-0-DMAEOE)或2'-ON-甲基乙酰胺基(2'-0-NMA)，NH2，生物素，胺基团，低级烷基胺基团，乙酰基团，DMTO，荧光素，硫醇或吖啶或具有这类功能的任何其他基团。
正义链中的碱基错配。与siRNA一样(Schwarz 2003)，miRNA活性链5'和3'端的相对稳定性显然决定了miRNA途径活性成分的活化和摄取。通过策略性定位合成miRNA互补链3'端中的碱基错配使miRNA活性链5'端不稳定增强了活性链的活性并基本消除了互补链的活性。
宿主细胞和靶细胞
引入了miRNA或其来源或评估了miRNA的存在的细胞可以源自或包含在任何生物体中。优选地，细胞是脊椎动物细胞。更优选地，细胞是哺乳动物细胞。甚至更优选地，细胞是人细胞。
哺乳动物细胞可以来自种系或体细胞，全能或多能，分裂或非分裂，上皮，永生化或转化等。细胞可以是未分化的细胞，如干细胞，或者分化的细胞，如来自器官或组织的细胞。或者，细胞可以被鉴定为上皮或内皮细胞，基质细胞，脑，乳腺，子宫颈，结肠，胃肠道，心脏，肾脏，大肠，肝，肺，卵巢，胰腺，心脏，前列腺，膀胱，小肠，胃，睾丸或子宫。
如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语还包括它们的后代，它们是由细胞分裂形成的任何和所有后代。应当理解的是，由于故意或无意的突变，所有后代可能不相同。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，这指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。如本文所用，术语“工程改造”和“重组”细胞或宿主细胞旨在指代其中已经引入了外源性核酸序列如小干扰RNA或编码报告基因的模板构建体的细胞。因此，重组细胞可以与不包含重组引入的核酸的天然存在的细胞相互区分。
组织可以包含这样的一种或多种宿主细胞，其待转化或与核酸递送组合物和/或其他试剂接触。组织可以是生物体的部分或与之分离。在某些实施方式中，组织及其组成细胞可以包括但不限于：脑，小脑，脊髓，臂神经，肋间神经，肌皮神经，肋下神经，腰丛，神经丛，股神经，下颌神经，坐骨神经，股神经肌肉束，隐静脉(saphnous)神经，胫神经，桡神经，正中神经，髂下腹(iliophypogastric)神经，生殖股神经，闭孔神经，尺神经，腓总神经，腓深神经，腓浅神经，神经节，视神经，神经细胞，干细胞。
在某些实施方式中，宿主细胞或组织可包含在至少一种生物体中。在某些实施方式中，生物体可以是哺乳动物，人，灵长类动物或鼠。本领域技术人员将进一步理解孵育所有上述宿主细胞以维持它们并允许其分裂形成后代的条件。
递送方法
RNA分子可以由载体中包含的核酸分子编码。术语“载体”用于指这样的运载体核酸分子，其中可以插入核酸序列，用于引入到其中可以被复制的细胞中。核酸序列可以是“外源性”，这意味着其对引入载体的细胞而言是外来的，或者该序列与细胞中的序列同源，但是在宿主细胞核酸内通常找不到该序列的某个位置。载体包括质粒，粘粒，病毒(噬菌体，动物病毒，慢病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。通过标准重组技术本领域技术人员将能够很好地构建载体，所述重组技术述于Sambrook等，1989和Ausubel等，1996，二者通过引用纳入本文。除了编码修饰的多肽，如修饰的白树毒素(gelonin)，载体可以编码未修饰的多肽序列，如标签或靶向分子。靶向分子是将所需核酸引导至对象体内特定器官，组织，细胞或其他位置的分子。
术语“表达载体”指这样的载体，其包含编码至少部分能够被转录的基因产物的核酸序列。表达载体可以包含各种“控制序列”，其指特定宿主生物体中可操作连接的编码序列的转录以及可能的翻译所必需的核酸序列。除了管理转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体可以包含还具有其他功能的核酸序列，并进行了描述这类载体可以包封于根据本发明的脂质纳米颗粒中。
纳米颗粒官能化
多种化合物已连接纳米颗粒的外围以促进其跨细胞膜的运输。HIV TAT、HSVVP22、果蝇触角足突变(Drosphila antennapedia)和其他蛋白质中发现的短信号肽已被发现能够使生物分子跨膜快速转移(由Schwarze 2000综述)。称之为蛋白质转导结构域(PTD)的这些信号肽已连接寡核苷酸，以促进其递送到培养的细胞中(Eguchi A,Dowdy SF,Trends Pharmacol Sci.,2009,7:341-5)。同样，多聚-L-赖氨酸已与寡核苷酸偶联，以减少净负电荷并改善摄取到细胞中(Leonetti 1990)。多种信号肽或配体或转导肽或配体可以连接根据本发明的纳米颗粒表面，例如通过将肽或配体偶联于本文之前定义的亲脂性锚固物。
治疗性应用
影响表型性状的miRNA为治疗应用以及诊断应用提供干预点(通过筛选特定miRNA的存在与否)。特别设想了本发明的RNA分子可以用于治疗前述部分中所讨论的任何疾病或病症。此外，就本发明的治疗和诊断方面而言，也可以采用上述任何方法。例如，关于检测miRNA或对其进行筛选的方法也可以用于诊断环境中。在治疗应用中，将有效量的本发明的miRNA给予细胞，该细胞可以在或可以不在动物中。在一些实施方式中，将治疗有效量的本发明的miRNA给予个体用于治疗疾病或病症。本文所用术语“有效量”定义为这样的本发明的分子的量，其是在给予本发明的分子的细胞或组织中导致所需的生理变化所必需的。本文所用术语“治疗有效量”定义为这样的本发明的分子的量，其就如之前所定义的与血管新生(neo-angiogenesis)相关的疾病或病症而言，实现所需效果。本领域技术人员容易认识到的是，在许多情况下，分子可能无法提供治愈，但可以提供部分益处，如缓解或改善至少一种症状。在一些实施方式中，具有某些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些实施方式中，提供生理变化的分子的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。
在某些实施方式中，药物组合物可包含，例如，至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方式中，活性化合物可以包含2％-75％单位重量，或者25％-60％，例如，其中可衍生的任何范围。在其他非限制性实例中，每次给药的剂量可以还包含少于1微克/kg/体重，或1微克/kg/体重，从5微克/kg/体重，10微克/kg/体重，50微克/kg/体重，100微克/kg/体重，200微克/kg/体重，350微克/kg/体重，500微克/kg/体重，1毫克/kg/体重，5毫克/kg/体重，10毫克/kg/体重，50毫克/kg/体重，100毫克/kg/体重，200毫克/kg/体重，350毫克/kg/体重或500毫克/kg/体重至1000mg/kg/体重或更多，和其他可从中衍生的任何范围。在本文列举的数字衍生范围的非限定实例中，基于上述数字，可以给予的范围是5mg/kg/体重-100mg/kg/体重，5微克/kg/体重-500毫克/kg/体重等。
在任何情况下，组合物可包含各种抗氧化剂以延迟一种或多种组分的氧化。此外，预防微生物作用可以通过防腐剂如各种抗菌和抗真菌剂来实现，包括但不限于对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞或其组合。
分子可以以游离碱，中性或盐形式配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如，由蛋白质组合物的游离氨基团形成的那些，或由无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸诸如乙酸，草酸，酒石酸或扁桃酸形成的盐。由游离羧基基团形成的盐还可以衍生自无机碱，例如，钠，钾，铵，钙或铁氢氧化物；或有机碱诸如异丙胺，三甲胺，组氨酸或普鲁卡因。
组合物通常是纳米颗粒在水性介质中的悬浮液。然而，可以将其冻干并以粉末形式提供，其中粉末包含纳米颗粒和任选的缓冲盐或其他赋形剂。
有效剂量
本发明的分子通常将以有效实现预期目的的量使用。为了用于治疗或预防疾病病症，以治疗有效量给予或施用本发明的分子或其药物组合物。治疗有效量是有效改善或预防症状或延长经治疗患者存活的量。治疗有效量的测定在本领域技术范围内，由其是在本发明的详细公开内容的教导下。对于全身给药，最初可以从体外测定估计治疗有效剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量，以实现包括细胞培养中确定的EC50的循环浓度范围。可利用这类信息更精确地确定人用剂量。也可以使用本领域所熟知的技术，由体内数据，例如动物模型，估计初始剂量。本领域普通技术人员可以根据动物数据容易地优化对人的给药。剂量和间隔可以单独调节以提供足以维持治疗效果的分子的血浆水平。通过注射给药的常规患者剂量为0.01至0.1mg/kg/天，或0.1至5mg/kg/天，优选0.5至1mg/kg/天或更高。治疗有效的血清水平可以通过每天给予多个剂量实现。
在局部给药或选择性摄取的情况下，蛋白质有效的局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。当然，给予的分子的量将取决于接受治疗的对象，对象的体重，患病的严重程度，给药方式和处方医生的判断。可在可检测到症状甚至在无法检测到症状时，间歇性地重复治疗。治疗可以单独提供，也可以与其他药物或治疗(包括手术)联用。
试剂盒
本文所述的任何组合物可以包含在试剂盒中。在非限制性实例中，试剂盒中包含单个miRNA，还包含二氨基脂质。试剂盒可以进一步包含一种或多种阴性对照合成miRNA，其可以用于控制合成miRNA递送的作用。试剂盒可进一步包含水和杂交缓冲液以促进合成miRNA两条链的杂交。试剂盒还可以包含一种或多种转染试剂以促进miRNA向细胞的递送。
序列相同性
“序列相同性”在本文中定义为通过比较序列确定的两个或更多个核酸(核苷酸，多核苷酸，RNA，DNA)序列之间的关系。在本领域中，“相同性”还表示核酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，这取决于这类序列串之间的匹配。“相同性”和“相似性”可以通过已知的方法容易地计算，包括但不限于《计算机分子生物学》(Computational MolecularBiology),Lesk,A.M.,等,牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约,1988；《生物运算：信息学和基因组工程》(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),Smith,D.W.编著,学术出版社(Academic Press),纽约,1993；《序列数据的计算机分析》(ComputerAnalysis of Sequence Data),第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著,胡马纳出版社(Humana Press),新泽西州,1994；《分子生物学的序列分析》(Sequence Analysis inMolecular Biology),von Heine,G.,学术出版社,1987；和《序列分析引物》(SequenceAnalysis Primer),Gribskov,M.和Devereux,J.编著,M斯托克顿出版社(M StocktonPress),纽约,1991；和Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中所述的那些。在一实施方式中，在给定的SEQ ID NO.的全长上评估相同性。
确定相同性的优选方法旨在为经测试的序列之间给出最大的匹配。鉴定相同性和相似性的方法已编入可公开获得的计算机程序中。确定两条序列之间的相同性和相似性的优选计算机程序包括，例如，GCG程序包(Devereux,J.,等,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))，BestFit，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Altschul,S.F.等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。BLAST X程序可由NCBI和其他来源公开获得(《BLAST手册》(BLASTManual),Altschul,S.,等,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894；Altschul,S.,等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。也可以将熟知的Smith Waterman算法用于确定相同性。
用于核酸比较的优选参数包括：算法：Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比较矩阵：匹配＝+10，错配＝0；缺口罚分：50；缺口长度罚分：3。作为Gap程序可由位于威斯康星州麦迪逊市的Genetics Computer Group获得。上述给出的是用于核酸比较的默认参数。
化疗剂
用于根据本发明组合的化疗剂的示例包括烷化试剂，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌酰硫烷(piposulfan)；吖丙啶，如苄替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine)包含六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三轻甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；聚乙酰精宁(acetogenins)(特别是膨松素(bullatacin)和布鲁啉酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是自念珠藻环肽1和自念珠藻环肽8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包含合成类似物、KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；软海绵素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲，例如卡莫司汀、吡葡亚硝脲、福莫司汀(foremustine)、洛莫司丁、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素、特别是卡奇霉素γ和卡奇霉素Ω；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素(dynemicinA)；二膦酸盐，例如氯屈膦酸(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；和新抑癌蛋白(neocarzinostatin)发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿柔比星(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素(authrarnycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马赛罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、甲基丝裂霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁多柔比星、罗多比星、链黑霉素、链佐星、块菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢剂，例如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤，氨蝶并蝶呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他宾、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他宾、氮尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；二氢嘧啶脱氢酶灭活剂；安吖啶；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群；乙茎去氮氨蝶呤(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；亚丝醌；依氟鸟氨酸碱盐酸盐(elfornithine)；依利醋铵；大环内酯；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇菌多糖；氯尼达明；类美坦西醇，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢菌毒素(特别是T-2毒素、疣孢漆斑霉素A、露湿漆斑霉素A和蛇形菌素(anguidine))；氨基钾酸酯；长春地辛；达卡巴嗪；盐酸甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；胍血生；加西托新(gacytosine)；阿糖胞苷("Ara-C")；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂配合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vancristine)；长春瑞滨(Navelbine)；米托蒽醌；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeoloda)；伊班膦酸钠；伊立替康(例如，CPT-Il)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；吉非替尼和上述任何一个的药学可接受盐、酸或衍生物。
该定义还包括用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素试剂，如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，克沃昔芬(keoxifene)，LYl17018，奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抑制芳香化酶的芳香化酶抑制剂，其调节肾上腺的雌激素产生，例如，例如4(5)-咪唑，氨鲁米特(aminoglutethimide)，乙酸甲地孕酮，依西美坦，福美司坦(formestanie)，法倔唑(fadrozole)，伏氯唑(vorozole)，来曲唑(letrozole)，和阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素，如氟他胺(flutamide)，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，具体地，抑制涉及异常细胞增殖的信号转导途径中基因表达的那些，例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，如基因治疗疫苗和上述任何一种药用上可接受的盐、酸或衍生物。可以在万维网网址accessdata.fda.gov/scripts/cder/onctools/druglist.cfm上找到美国FDA批准的肿瘤学药物清单及其批准的适应症。合适的RNR抑制剂选自下组：吉西他滨，羟基脲，克罗拉滨(clolar)，氯法拉滨(clofarabine)和三平胺。合适的AURKB抑制剂选自下组：AZD1152、VX-680、MLN8054、MLN8237、PHA680632、PH739358、橙皮素(Hesperidin)、ZM447439、JNJ770621、SU6668、CCT129202、AT9283、MP529、SNS314、R763、ENMD2076、XL228、TTP687、PF03814735和CYC116。另一种合适的抗癌药是吉非替尼(gefitinib)。
此外，考虑到也可以比较在某些途径的活性上具有差异的样品。这类细胞途径包括但不限于以下：任何粘附或运动途径，包括但不限于涉及下述的那些：环状AMP，蛋白激酶A，G蛋白偶联受体，腺苷酸环化酶，L-选择素，E-选择素，PECAM，VCAM-1，α-肌动蛋白，桩蛋白(paxillin)，钙粘蛋白，AKT，整联蛋白-α，整联蛋白-β，RAF-1，ERK，PI-3激酶，黏着斑蛋白(vinculin)，基质金属蛋白酶，Rho GTP酶，p85，三叶因子，抑制蛋白(profilin)，FAK，MAP激酶，Ras，小窝蛋白(caveolin)，钙蛋白酶-1，钙蛋白酶-2，表皮生长因子受体，ICAM-1，ICAM-2，丝切蛋白(cofilin)，肌动蛋白，凝溶胶蛋白，Rho A，Rac，肌球蛋白轻链激酶，血小板源性生长因子受体或埃兹蛋白(ezrin)；任何凋亡途径，包括但不限于涉及下述的那些：AKT，AKT，Fas配体，NFKB，胱天蛋白酶-9，PB激酶，胱天蛋白酶-3，胱天蛋白酶-7，ICAD，CAD，EndoG，颗粒酶B，Bad，Bax，Bid，Bak，APAF-I，细胞色素C，p53，ATM，Bcl-2，PARP，Chk1，Chk2，Rho-21，c-Jun，Rho73，Rad51，Mdm2，Rad50，c-Abl，BRCA-1，穿孔素，胱天蛋白酶-4，胱天蛋白酶-8，胱天蛋白酶-6，胱天蛋白酶-1，胱天蛋白酶-2，胱天蛋白酶-10，Rho，Jun激酶，Jun激酶激酶，Rip2，核纤层蛋白-A，核纤层蛋白-B1，核纤层蛋白-B2，Fas受体，H2O2，颗粒酶A，NADPH氧化酶，HMG2，CD4，CD28，CD3，TRADD，IKK，FADD，GADD45，DR3死亡受体，DR4/5死亡受体，FLIP，APO-3，GRB2，SHC，ERK，MEK，RAF-1，环状AMP，蛋白激酶A，E2F，成视网膜细胞瘤蛋白，Smac/Diablo，ACH受体，14-3-3，FAK，SODD，TNF受体，RTP，细胞周期蛋白-D1，PCNA，Bcl-XL，PIP2，PIP3，PTEN，ATM，Cdc2，蛋白激酶C，钙调神经磷酸酶，IKKα，IKKβ，IKKγ，SOS-1，c-FOS，Traf-1，Traf-2，IκBβ或蛋白酶体；任何细胞激活途径，包括但不限于涉及下述的那些：蛋白激酶A，一氧化氮，小窝蛋白-1，肌动蛋白，钙，蛋白激酶C，Cdc2，细胞周期蛋白B，Cdc25，GRB2，SRC蛋白激酶，ADP-核糖基化因子(ARF)，磷脂酶D，AKAP95，p68，Aurora B，CDK1，Eg7，组蛋白H3，PKAc，CD80，PI3激酶，WASP，Arp2，Arp3，p34，p20，PP2A，血管紧张素，血管紧张素转化酶，蛋白酶激活受体-1，蛋白酶激活受体-4，Ras，RAF-1，PLCβ，PLCγ，COX-1，G蛋白偶联受体，磷脂酶A2，IP3，SUMO1，SUMO 2/3，泛素，Ran，Ran-GAP，Ran-GEF，p53，糖皮质激素，糖皮质激素受体，SWI/SNF复合物的组分，RanBP1，RanBP2，输入蛋白，输出蛋白，RCCl，CD40，CD40配体，p38，DCKα，IKKβ，NFKB，TRAF2，TRAF3，TRAF5，TRAF6，IL-4，IL-4受体，CDK5，AP-1转录因子，CD45，CD4，T细胞受体，MAP激酶，神经生长因子，神经生长因子受体，c-Jun，c-Fos，Jun激酶，GRB2，SOS-I，ERK-I，ERK，JAK2，STAT4，IL-12，IL-12受体，一氧化氮合酶，TYK2，IFNγ，弹性蛋白酶，IL-8，上皮素，IL-2，IL-2受体，CD28，SMAD3，SMAD4，TGFβ或TGFβ受体；任何细胞周期调控、信号传导或分化途径，包括但不限于涉及下述的那些：TNF，SRC蛋白激酶，Cdc2，细胞周期蛋白B，Grb2，Sos-1，SHC，p68，Aurora激酶，蛋白激酶A，蛋白激酶C，Eg7，p53，细胞周期蛋白，细胞周期蛋白依赖性激酶，神经生长因子，表皮生长因子，成视网膜细胞瘤蛋白，ATF-2，ATM，ATR，AKT，CHK1，CHK2、14-3-3，WEEl，CDC25 CDC6，起源识别复合物蛋白，pl5，pl6，p27，p21，ABL，c-ABL，SMAD，泛素，SUMO，热休克蛋白，Wnt，GSK-3，血管紧张素，p73任何PPAR，TGFα，TGFβ，p300，MDM2，GADD45，Notch，cdc34，BRCA-1，BRCA-2，SKP1，蛋白酶体，CUL1，E2F，pi 07，类固醇激素，类固醇激素受体，IκBα，IκBβ，Sin3A，热休克蛋白，Ras，Rho，ERK，IKK，PI3激酶，Bcl-2，Bax，PCNA，MAP激酶，动力蛋白(dynein)，RhoA，PKAc，细胞周期蛋白AMP，FAK，PIP2，PIP3，整联蛋白，血小板生成素，Fas，Fas配体，PLK3，MEK，JAK，STAT，乙酰胆碱，桩蛋白磷酸酶(paxillin calcineurin)，p38，输入蛋白，输出蛋白，Ran，Rad50，Rad51，DNA聚合酶，RNA聚合酶，Ran-GAP，Ran-GEF，NuMA，Tpx2，RCCl，音猬因子(Sonic Hedgehog)，Crml，Patched(Ptc-1)，MPF，CaM激酶，微管蛋白，肌动蛋白，线粒体相关蛋白，着丝粒结合蛋白，端粒酶，TERT，PP2A，c-MYC，胰岛素，T细胞受体，B细胞受体，CBP，1KB，NFKB，RAC1，RAF1，EPO，二酰基甘油，c-Jun，c-Fos，Jun激酶，缺氧诱导因子，GATA4，β-连环蛋白，α-连环蛋白，钙，抑制蛋白，生存素(survivin)，胱天蛋白酶，前体胱天蛋白酶(procaspase)，CREB，CREM，钙粘蛋白，PECAM，皮质类固醇，刺激集落的因子，钙蛋白酶，腺苷酸环化酶，生长因子，一氧化氮，跨膜受体，类维生素A，G蛋白，离子通道，转录激活因子，转录共激活因子，转录阻遏物，白介素，维生素，干扰素，转录共抑制因子，核孔，氮，毒素，蛋白水解或磷酸化；或任何代谢途径，包括但不限于涉及涉及下述的那些：氨基酸的生物合成，脂肪酸的氧化，神经递质和其他细胞信号分子的生物合成，多胺的生物合成，脂质和鞘脂的生物合成，氨基酸和营养物质的分解代谢，核苷酸合成，类花生酸，电子传递反应，内质网相关降解，糖酵解，纤维蛋白溶解，酮体形成，吞噬体形成，胆固醇代谢，食物摄入调节，能量稳态，凝血酶原活化，乳糖和其他糖类的合成，多药耐药性，合成磷脂酰胆碱，蛋白酶体，淀粉样前体蛋白，Rab GTP酶，淀粉合成，糖基化，合成磷脂酰甘油，维生素，柠檬酸循环，IGF-1受体，尿素循环，囊泡运输或挽救途径。进一步考虑到本发明的核酸分子可以用于上述任何途径或因素的诊断和治疗方法中。因此，在本发明的一些实施方式中，miRNA抑制、消除、激活、诱导、增加或以其他方式调节上述途径或因素中的一种或多种被认为是本发明方法的部分。基于该miRNA与上述任何途径的关系，核酸可用于诊断疾病或病症。
附图说明
图1.在每日3次以3mg/kg连续注射siHPRT1的最后一次注射后47-49小时时皮下(subq)人A2058黑素瘤肿瘤中的HPRT1 mRNA表达。
图2.治疗开始后12天的相对肿瘤体积。携带皮下人A2058黑素瘤的小鼠在第1周中连续5天用3mg/kg在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miRNA-193a处理，然后每周两次注射(星期一/星期四)。数据代表中位数+IQR(n＝8)。
图3.携带原位Hep3b肿瘤的小鼠的AFP水平(第42天，左)和肿瘤重量(第49天，右)，所述小鼠在第1周中连续3或5天用不同剂量的Nov340中或二氨基脂质纳米颗粒中配制的miR-7和miR-193a处理，然后每周两次注射两次(星期一/星期四)，持续3周，相较于经PBS或索拉非尼处理的小鼠。数据代表中位数+IQR(n＝6-16)。*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001。
图4.治疗开始后1(A)和2(B)周的CD8+T细胞/Treg细胞的比率。miRNA-193a处理导致从免疫抑制性转变为免疫刺激性4T1肿瘤微环境(CD8+T细胞/Treg细胞>1，miRNA-193a处理开始后2周)。
图5.CD45+肿瘤细胞群中免疫细胞和胞内细胞因子的百分比。第1周：A)miRNA-193a处理导致T细胞功能显著增加(IFNγ和IL-2的产生)，B)和调节性T细胞群体(FOXP3+/LAG3+)显著减少。
图5C.第2周：miRNA-193a处理导致T细胞频率(CD8+)显著增加，同时T细胞功能(IFNγ)受轻度诱导。
图5D.第2周：miRNA-193a处理导致调节性T细胞群(FOXP3+/LAG3+)显著减少。数据代表中位数+IQR。*＝p<0.05，**＝p<0.01。
图6.免疫细胞中CD73(NT5E)表达水平的百分比。经miRNA-193a处理后，免疫细胞中CD73表达水平下调。数据代表中位数+IQR。*＝p<0.05，**＝p<0.01。A)第1周，第2次给药后48小时；B)第2周，第4次给药后第48周。
图7.4T1肿瘤切除后显示出原发性肿瘤再生的小鼠百分比。在乳腺脂肪垫中用4T1细胞注射小鼠，每周两次处理(静脉内)，在细胞注射后1周开始，在细胞注射后第20天去除原发性肿瘤。将原发肿瘤切除后，以10mg/kg在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miR-193a每周两次对小鼠进行另外6周处理，相较于PBS或抗-PD1处理的小鼠，或进行组合处理。
图8.4T1肿瘤切除后，具有原发性肿瘤再生的个别小鼠。在乳腺脂肪垫中用4T1细胞注射小鼠，每周两次处理(静脉内)，在细胞注射后1周开始，在细胞注射后第20天去除原发性肿瘤。将原发肿瘤切除后，以10mg/kg在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miR-193a每周两次对小鼠进行另外6周处理，相较于PBS或抗-PD1处理的小鼠，或进行组合处理。1、2、3和4组中分别有11只中有5只，10只中的1只，12只中的6只和11只中的3只小鼠在原发肿瘤切除后(随访至处理后的指定日期)显示出肿瘤再生。A)用PBS处理的组；B)用在二氨基脂质纳米颗粒中的miRNA-193a处理的组；C)用抗-PD-1治疗的组；D)用二氨基脂质纳米颗粒中的miRNA-193a和抗PD-1的组合治疗的组。
图9.4T1肿瘤切除后(第66天)显示出原发性肿瘤再生的小鼠百分比。在乳腺脂肪垫中用4T1细胞注射小鼠，每周两次处理(静脉内)，在细胞注射后1周开始，在细胞注射后第20天去除原发性肿瘤。将原发肿瘤切除后，以10mg/kg在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miR-193a每周两次对小鼠进行另外6周处理，相较于PBS或抗-PD1处理的小鼠。
图10.如左图所示，在第75天(治疗结束后第14天)用4T1细胞再次攻击存活的经miRNA-193a处理的小鼠。中图和右图显示了肿瘤体积，相较于未经4T1细胞攻击的原初小鼠。***＝p<0.001。
图11.3只经miRNA-193a处理的小鼠的详细肿瘤体积(来自图10)，其显示了在用4T1细胞再次攻击时相较于原初小鼠的肿瘤发生。
图12.A)在第101天(治疗结束后第38天)用H22细胞再次攻击存活的经miRNA-193a处理的小鼠。B)与用H22细胞攻击的原初小鼠相比的肿瘤体积。***＝p<0.001。C)经miRNA-193a处理的小鼠的详细肿瘤体积，其显示了在用H22细胞再次攻击时相较于原初小鼠的肿瘤发生(100％)，以及所有经miRNA-193a处理的动物在1周后的明显的时间依赖性肿瘤消退。
图13.处理开始后21天的相对肿瘤体积。用不同剂量和不同方案在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miRNA-193a或维莫非尼处理携带皮下人A2058黑素瘤的小鼠。数据代表中位数+IQR。*＝p<0.05。
图14.以10mg/kg静脉内注射QDx2(每天一次，连续两天)后肿瘤中随时间变化的miRNA-193a靶基因表达水平。对携带原位4T1肿瘤的小鼠进行相似地处理，并在不同时间点移出肿瘤进行药效学分析(见表13)。显示了个体肿瘤表达值。不同的靶基因在不同的时间点显著下调。数据代表中位数+IQR。*＝p<0.05，**＝P<0.01。轴上的小时表示最终miRNA-193a剂量后的时间。A)mKRAS；B)mMCL-1；C)mTIM3；D)mENTPD1。
图15.miRNA-193a-3p直接靶向NT5E基因，并在不同细胞系中下调NT5E和ENTPD1的基因表达。A)存在10nM miRNA-193a-3p、模拟和加扰对照的情况下，Hela细胞中NT5E野生型报告基因相较于NT5E突变型报告基因的荧光素酶活性。相较于突变型NT5E报道基因和对照，NT5E野生型报道基因降低荧光素酶活性。B)相较于模拟对照，存在10nM miRNA-193a-3p的情况下，A2058黑素瘤细胞系中NT5E mRNA下调。C)相较于突变型miRNA-193a-3p、模拟和加扰对照，给予10nM miRNA-193a-3p后24小时和48小时后，A2058黑素瘤细胞系中NT5E蛋白质下调。微管蛋白用作加载对照。突变型miR-193a-3p在其种子序列处包含3个核苷酸突变。D)存在10nM miRNA-193a-3p、模拟对照和加扰对照(未显示)的情况下，指定癌细胞系中的ENTPD1 mRNA下调。将所有mRNA值标准化为模拟值(模拟值设为1)。
图16.miRNA-193a-3p处理影响腺苷生成途径。A)相较于对照条件(未经处理(UT)、模拟、加扰)，在用10nM miRNA-193a-3p处理后，A2058黑素瘤细胞中的游离磷酸盐生成(对于腺苷生成间接读出)减少。针对NT5E的siRNA表型复制(phenocoy)相同的表型。B)相较于对照条件(未经处理(UT)、模拟、加扰)，在用10nM miRNA-193a-3p处理后，A2058黑素瘤细胞中的腺苷生成减少。针对NT5E的siRNA表型复制相同的表型。C)相较于加扰，在用10nMmiRNA-193a-3p处理后A2058黑素瘤细胞中A2058细胞的迁移能力降低。针对NT5E的siRNA表型复制相同的表型。
图17.相较于模拟对照，miRNA-193a-3p以浓度依赖性方式增强癌细胞中的G2/M停滞(A：HEP3B；B：SNU449；C：A2058)，如通过细胞核成像所确定。G0、G1、S、G2/M是细胞周期的不同阶段。
图18.相较于不同时间点(以小时计)的模拟，在不同癌细胞(A：HEP3B；B：SNU449；C：H1975)中给予10nM的miRNA-193a-3p后，G2/M相关miRNA-193a-3p靶基因(MPP2、STMN1、YWHAZ和CCNA2)下调，如RT-PCR所确定。
图19.A)用4T1细胞再次攻击存活的经miRNA-193a处理的小鼠和周龄匹配的原初小鼠。B)经miRNA-193a处理4T1再次攻击的幸存者和一组周龄匹配的原初小鼠的T细胞被耗尽，再次攻击4T1肿瘤细胞，然后进行肿瘤生长。
图19C.小鼠具有T细胞，由经miRNA-193a处理4T1再次攻击的幸存者转移至原初小鼠中，通过4T1再次攻击，然后进行肿瘤生长(miR-193a是指miR-193a-3p及其制剂)。
图20.相较于PBS或索拉非尼处理的小鼠，用在Nov340中配制的不同的微小RNA以3周的周期每隔一天处理的携带原位Hep3b肿瘤的小鼠的AFP水平(第39天，左)和肿瘤重量(第39天，右)。数据代表中位数。*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001。
实施例
实施例1-二氨基脂质的提供
提供通式(I)二氨基脂质的一般方法
相应式T1-OH、T2-OH或T3-OH的醇通常可商购。可以使用本领域已知的方法，如使用氯铬酸吡啶鎓，将这些醇转化为对应的醛，或者甚至可以商购获得醛。然后，当n＝1时，醛可与所需二胺如与N-,乙基-1,3-二氨基丙烷反应形成亚胺，随后在T1、T2和T3部分的还原胺化反应中将其还原为对应的胺。下述是非限制性示例：
法呢醛(或法呢基醛)
向法呢醇(或法呢基醇)(10.0g，44.9mmol，1当量)、碳酸钠(2.38g，22.5mmol，0.5当量)和分子筛
Figure BDA0002717738480000771
(5g)的500mL二氯甲烷混合物中添加氯铬酸吡啶鎓(PCC，14.5g，67.4mmol，1.5当量)。将悬浮液在室温下搅拌1小时。然后将250mL的二氯甲烷加入到混合物中，并将悬浮液通过250mL的硅胶(硅胶60，0.04-0.063mm，230-400目)过滤。减压蒸发溶剂，获得的残余物是醛，其无需进一步纯化即可使用。通过TLC板对化合物进行分析，使用10％乙酸乙酯的环己烷溶剂体系(Rf＝0.5)和10％硫酸的甲醇用于染色。
(N'-甲基-N’,N”,N”-三((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷基-2,6,10-三烯-1-基)丙烷-1,3-二胺)(通式(I)的化合物，其中n＝1且T1、T2和T3各自为法呢基)：
在室温下，向法呢醛(8.75g，39.7mmol，3.5当量)和N-甲基-1,3-二氨基丙烷(1g，11.3mmol，1.0当量)的100mL 1,2-二氯乙烷溶液中添加NaBH(OAc)3(10.9g，51.4mmol，4.55当量)和乙酸(2.94mL，51.4mmol，4.55当量)。反应混合物在室温下搅拌18小时。用氢氧化钠2M溶液淬灭反应，并将混合物用二氯甲烷(100mL)萃取两次。合并的有机层用盐水(氯化钠的饱和水溶液)洗涤，并经Na2SO4干燥。减压除去溶剂，并将粗产物在硅胶(300mL硅胶60，0.04-0.063mm，230-400目)上进行快速层析。采用从乙酸乙酯到4％甲醇(MeOH)的乙酸乙酯溶液(含0.5％三甲胺)的梯度在10个柱体积中洗脱产物。在洗脱所需化合物时，收集20mL部分，然后收集化合物洗脱物50-100mL部分。在TLC板上分析收集到的部分，使用5％MeOH的二氯甲烷溶剂系统和10％硫酸的甲醇溶液用于染色(Rf＝0.4)。获得浅黄色油状标题化合物(约4.6g，6.6mmol，产率60％；化学式：C49H84N2；精确质量：700.66)，通过RP-HPLC测定的典型纯度≥96％。
实施例2-纳米颗粒的提供
一般方法
使用前，所有塑料小瓶和塑料瓶用无菌过滤的去离子水冲洗。以g为单位的重量的标准误差为0.01g，以mg为单位的重量的标准误差为0.001g。
50mM柠檬酸缓冲液pH 3
向800mL无菌去离子水添加10.51g柠檬酸一水合物和0.93g NaOH。测量pH，并且如果需要，用2M NaOH将其调节至pH 3。添加无菌去离子水至1升。将缓冲液通过0.2μm的瓶顶过滤器过滤，样品过滤前，所述过滤器用20mL无菌过滤的去离子水冲洗。
1X PBS缓冲液pH 7.4
将10g的PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+溶解于10L无菌去离子水。
颗粒产生
在乙醇中以50mM的浓度制备二氨基脂质，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，胆固醇和PEG2000-DSG的储液，并混合以分别产生40:10:48:2的摩尔比。用乙醇将最终脂质混合物溶液稀释至33.8mM的浓度。将H2O中浓度为20mg/mL的核酸(RNA)储液在pH3的50mM柠檬酸钠缓冲液中稀释为最终浓度0.65mg/mL。总脂质与RNA的质量比为10.3。
为了制备脂质纳米颗粒，将有机脂质混合物溶液注入RNA水溶液中，以得到包含25％乙醇的最终悬浮液。使用HPLC泵(泵P-900，GE医疗公司，德国)以3：1的相对体积流量(18.75mL/分钟水溶液：6.25mL/分钟有机溶液)注射溶液，并通过T型接头(PEEK低压Tee组合1/16"PEEK，020通孔，美国IDEX健康和科学公司(IDEX Health&Science LLC))混合。
使用MWCO为10kD的70mL Slide-A-Lyzer，立即将纳米颗粒悬浮液针对PBS缓冲液pH 7.4以200倍体积的纳米颗粒溶液透析2次，以去除乙醇并实现缓冲液交换。第一次透析在室温下进行4小时，然后将制剂在4℃透析过夜。通过使用VIVASPIN 20浓缩器离心将所得纳米颗粒悬浮液浓缩。在填充制剂(最大20mL制剂)前，用2mL 1X PBS pH 7.4冲洗浓缩器。用摆动转子在Heraeus Multifuge X3 FR离心机(赛默飞世尔科技公司，德国)上于4℃以1000g旋转浓缩器，直至实现所需浓度(例如，2mg/mL)。通过用无菌过滤的1X PBS缓冲液pH7.4稀释浓缩的制剂(例如，2mg/L)来制备不同浓度的等分试样。通过0.2μm无菌过滤器将所得纳米微粒悬浮液过滤到玻璃小瓶中，并用卷边封口密封。表1显示了制备的其他纳米颗粒的实例。
表1—以mol％计的纳米颗粒组合物
Figure BDA0002717738480000801
使用Zetasizer Nano ZSP，ZEN5600(英国马尔文仪器股份有限公司(MalvernInstruments Ltd.)和He-Ne激光(633nm)，通过动态光散射(DLS)技术测量颗粒的尺寸和多分散性指数(PDI)。DLS测量布朗运动下运动的颗粒的扩散，并使用Stokes-Einstein关系将其转换为尺寸和尺寸分布。在25℃下以173°散射角并使用透明一次性比色皿(10x 10x48mm，萨斯特德公司(Sarstedt))一式三份进行测量。在测量前，将样品用PBS缓冲液pH 7.4稀释100倍。使用Malvern软件(DTS v 7.11，英国马尔文仪器公司)以多种窄模式分析进行分析。结果是三次重复测量的平均值，并表示为z平均直径和PDI。
使用M3-PALS技术通过相同的Zetasizer测量纳米颗粒的ζ电位。通过确定颗粒的电泳迁移率并应用亨氏方程(Henry’s equation)来计算颗粒的ζ电位。通过测量颗粒因电泳移动时的速度来获得电泳迁移率。使用斯莫鲁霍夫斯基近似法(Smoluchowskiapproximation)，在水性介质中确定电泳迁移率。在透明一次性折叠式毛细管池(DTS1070，英国马尔文仪器公司)中于25℃下一式三份进行测量。在测量前，将样品用0.1x PBS缓冲液pH 7.4稀释100倍。使用Malvern软件(DTS v 7.11，英国马尔文仪器公司)以自动模式分析进行分析。结果是三次重复测量的平均值，并表示为ζ电位。
使用DU 800分光光度计(Beckman Coulter，加利福尼亚州布雷亚贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter,Inc.))，通过UV-Vis分光光度法确定核酸浓度(测量总RNA)。在260nm处测量稀释的RNA样品的吸光度，并使用比尔朗伯定律(Beer-Lambert law)计算浓度。简言之，将100μL在1X PBS中稀释的制剂添加到900μL甲醇和氯仿4:1(v/v)混合物中，以溶解LNP。混合后，使用石英比色皿(路径长度10mm，12.5x 12.5x 45mm，Hellma)在230nm至330nm之间记录溶液的吸收光谱。根据制剂中使用的RNA的消光系数以及260波长处的吸光度和330nm波长处的基线校正值之间的差异来计算制剂中的RNA浓度。RNA的消光系数这样确定：通过测量浓度范围为0.005-0.05mg/mL的不同浓度的6种RNA溶液在260nm处的吸光度，并采用比尔朗伯定律。
通过Quant-iTTM
Figure BDA0002717738480000811
RNA试验评估RNA包封效率。简言之，将样品在Tris-EDTA(TE)缓冲液pH 7.5中稀释至大约5ng/mL的浓度。将50μL稀释的样品转移至聚苯乙烯96孔板中，然后添加50μL的TE缓冲液(测量未包封的RNA)或50μL的2％曲通X-100溶液(测量总RNA，均包封在LNP中和未包封的“游离”RNA)。一式三份制备样品。将板在37℃的温度下孵育15分钟。将RiboGreen试剂在TE缓冲液中以1：100稀释，将100μL的该溶液添加到各孔中。使用荧光板读数器(Wallac Victor 1420Multilablel计数器；珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)，马塞诸塞州沃尔瑟姆)在约480nm的激发波长和约520nm的发射波长下测量荧光强度。由各样品的荧光值减去试剂空白的荧光值，并按以下方法确定包封效率：
包封效率＝(1-([未包封的RNA]/[总RNA]))*100。
表2显示了所得纳米颗粒的分析值，包括其多分散性(PDI)。
表2–纳米颗粒的性质；条目编号对应表1中的条目编号
Figure BDA0002717738480000821
参比纳米颗粒
作为参比物，还制备了所谓的Nov340脂质纳米颗粒。已在US9737482中已描述了Nov340脂质纳米颗粒的组成，其包含下述类型的脂质：两性脂质对(阳离子和阴离子脂质)和中性脂质。Nov340脂质-纳米颗粒的脂质组成如下：
○POPC 棕榈酰基-油酰基磷脂酰胆碱
○DOPE 二油酰基磷脂酰乙醇胺
○CHEMS 胆固醇半琥珀酸酯
○MoChol 4-(2-氨乙基)-吗啉代-胆固醇半琥珀酸酯
Nov340脂质混合物由下述比例的mol％组成：6(POPC)、24(DOPE)、23(CHEMS)和47(Mochol)。Nov340脂质纳米颗粒的制剂基于US6843942中所述的方法。
将脂质(POPC、Chems和DOPE)溶解在55℃加热柜中的无水EtOH中。在完全溶解脂质后，将该溶液定量转移到已经称重MoChol的另一个瓶子中。将脂质混合物在55℃下搅拌，直到MoChol溶解。MOChol和Chems获自默克公司(Merck)，而POPC和POPE获自阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipid)。完成两步溶解脂质以减少MoChol向Chol的降解。然后，将最终的脂质溶液通过孔径为0.2μm的过滤器过滤到在55℃下预热的制备系统中。平行地，在室温(RT)下将寡核苷酸溶于乙酸钠/蔗糖pH 4缓冲液中，并通过0.2μm孔径的过滤器直接过滤到API瓶中。
使用US6843942中所述方法，脂质体在脂质溶液和API溶液合并时于注射部位形成。脂质体形成后，立即用NaCl/Na2HPO4 pH 9.0缓冲液稀释悬浮液，以将制剂的pH增至pH7.5。注射缓冲液和稀释缓冲液均保持在室温。将生成的脂质体(中等体积)收集在瓶中。挤出之前将脂质体在室温下搅拌30分钟。
将中间体积通过200nm孔径的聚碳酸酯膜挤出，以精炼其尺寸和尺寸分布。这两个参数对于允许最终进行0.2μm无菌过滤和减少产品损失都很重要。
进行使用中空纤维膜(100kDa MWCO；默克密理博公司(Merck Millipore))的超滤/渗滤，以由脂质体样品中去除游离的RNA和EtOH。在超滤过程中，将样品浓缩至目标体积(以实现目标RNA浓度)，然后在渗滤过程中，用PB蔗糖pH 7.5进行10个体积交换，以确保完全去除EtOH和游离寡核苷酸并交换外部缓冲液。使用注射器滤器对脂质体进行0.2μm过滤，并装入无菌小瓶中。小瓶保持密封并在2-8℃下避光保存。
尺寸测量：通过使用Zetasizer Nano ZS(马尔文公司)的动态激光光散射(DLS)进行脂质体的尺寸/PdI的测量。该系统装配了633nm波长的4mW氦/氖激光器，并用无侵入性反向散射技术以173°的检测角度测量脂质体样品。将脂质体在纯水中稀释，以达到最佳脂质体浓度，并在25℃下进行实验。
ζ电位：使用Zetasizer Nano ZS(马尔文公司)测量脂质体的ζ电位。
RNA的定量：通过在OD：260nm处进行分光光度法来完成RNA的定量。首先用纯净水稀释配制的脂质-纳米颗粒，然后用甲醇/氯仿稀释，以溶解脂质体并释放一定量包封的RNA。
脂质的定量：使用HPLC方法由总体积(bulk volume)测量样品中的脂质浓度。
实施例3-寡核苷酸的提供
对于本发明中使用的所有miRNA和siRNA分子，例如miR-193a-3p，miR-7-5p和HPRT1 siRNA，随从链和引导链都是通过固相合成使用市售的合成仪如Oligopilot 400寡核苷酸合成仪化学合成的。用于生产单链的方法通常用于工业以产生si-/miRNA寡核苷酸。合成后，由固体支持物切割寡核苷酸单链，并将其去保护。使用HPLC纯化粗制单寡核苷酸链。此后，将单链脱盐、浓缩、退火和冻干。在这些实施例中，除非上下文明确表明没有其他意图，否则miR-193a指SEQ ID NO：218的miRNA-193a-3p(模拟，正义)与SEQ ID NO：219的反义链的双链体。将其在体外研究中单独使用，或与制剂一起在体内研究中使用。
实施例4–临床前体内小鼠实验
材料和方法
·RNA分离
按照制造商的说明，使用TriZol(赛默飞世尔科技公司)由肿瘤分离总RNA。分离的RNA重悬于无核酸酶的水(NFW)中。
·RT-qPCR
为了制备cDNA，首先将100ng总RNA与随机六聚物(凯杰公司(Qiagen)；最终浓度2μM)在最终体积为12.5μl的NFW中混合，在70℃下变性5分钟，然后立即在冰上冷却。然后，添加7.5μl cDNA合成混合物，其由以下组成：4μl 5xRT缓冲液(普洛麦格公司(Promega))、0.4μl 25mM dNTP(普洛麦格公司)、1μl 200U/μL MMLV RT酶(普洛麦格公司)、0.5μL 40U/μLRNA酶抑制剂(普洛麦格公司)和1.6μL NFW。使用下述cDNA合成方案：
Figure BDA0002717738480000841
对于单qPCR反应，制备下述混合物：
Figure BDA0002717738480000851
使用下述qPCR方案：
1.一个循环：5分钟 95℃
2.40个循环：15s 95℃+30s 60℃
将各个样品在CFX96实时qPCR仪(伯乐公司)技术上一式三份进行分析。使用2-(CtHPRT1–GEOMEAN(CtUBC；CtGUSB))计算HPRT1表达。qPCR中使用的引物如下所示：
Figure BDA0002717738480000852
Figure BDA0002717738480000861
·确定肿瘤生长抑制(TGI)作用：
为了确定TGI作用，通过计算各组各只小鼠的TV(肿瘤体积)的相对百分比增加(随机化当日的TV作为参照点)来确定T/C(肿瘤/对照)比，然后用处理组的TV的组中位数相对增加值除以PBS组的组中位数相对增加值。通过使用公式Q1–1.5×IQR(下限)和Q3+1.5×IQR(上限)确定各处理组中的异常值(相对于单个TV)。
·统计学分析：
使用Graphpad Prism 7进行统计分析。使用两尾无参数曼-惠特尼检验来计算相对肿瘤体积的差异(第“X”天的TV除以随机化当日的TV)。在所有统计学检验中，将检验项目的作用与PBS组进行比较。P值<0.05被认为具有统计学显著性。
对于本发明中使用的所有miRNA和siRNA分子，例如miR-193a-3p，miR-7-5p和HPRT1 siRNA，随从链和引导链都是通过固相合成使用市售的合成仪如Oligopilot 400寡核苷酸合成仪化学合成的。用于生产单链的方法通常用于工业以产生si-/miRNA寡核苷酸。合成后，由固体支持物切割寡核苷酸单链，并将其去保护。使用HPLC纯化粗制单寡核苷酸链。此后，将单链脱盐、浓缩、退火和冻干。
·肿瘤样品的FACS分析
制备新鲜分离的原位4T1肿瘤，当其达到300mm3的最小肿瘤体积(TV)时用于miRNA-193a处理后第5天(第1周)和第12天(第2周)的FACS分析。使用来自美天旎公司(Miltenyi)(目录号130-096-730)的鼠肿瘤解离试剂盒消化肿瘤样品。肿瘤细胞消化后，将细胞重悬于200μl染色缓冲液和1μg/ml Fc-Block(小鼠BD Fc BlockTM，目录号553141)中，并在4℃下黑暗孵育15分钟。已经将不同的标志物(CD45、CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD335、F4/80、CD11b、Gr-1、CD73、LAG3/CD223、IL-2、IFN-r、PD-1、L/D染色)用于FACS分析。对于各个样品，将除IL-2、IFN-r和LAG3以外所有标志物的抗体混合物在Fc封闭缓冲液中稀释并在黑暗中于冰上进行30分钟染色。然后，通过向各管添加2ml冰冷PBS轻轻洗涤细胞。将各管以300g离心5分钟，并丢弃上清液。为了检测胞内标志物(IL-2、IFN-r和LAG3)，对消化的细胞进行刺激。为此，使用具有BD GolgiPlugTM的白细胞活化混合物(Leukocyte ActivationCocktail)。将混合物于37℃在水浴中快速解冻，并且对于每1mL细胞培养物(例如，约106个细胞/mL)，添加2μL混合物并充分混合。为了刺激，将细胞培养混合物置于37℃潮湿CO2培养箱中4-6小时。然后收获细胞并用FACS染色缓冲液洗涤。为了染色，将细胞沉淀物用脉冲涡旋重悬，并将200ul制备的固定液/透化液添加到各个样品中。将样品在室温下黑暗中孵育10分钟。然后，通过添加1ml的1X透化缓冲液(由10X透化缓冲液制成，经蒸馏的H2O稀释)洗涤样品两次，然后离心并倾析上清液，和将各样品与含有FoxP3、IFN-r和IL-2的抗体混合物在1X透化缓冲液中孵育，并于室温在黑暗中孵育30分钟。最后，将细胞重悬于150μl的染色缓冲液中，并在流式细胞仪上分析。通过Kaluza流式细胞仪软件(来自布雷亚贝克曼库尔特公司)分析数据。
·全血的T细胞消耗和FACS分析
在所有情况下，通过腹膜内注射200μl磷酸盐缓冲盐水将单克隆抗体递送至小鼠。对于消耗和中和实验，同时使用CD4(克隆GK1.5)和CD8(克隆2.43)抗体。消耗或中和在接种肿瘤细胞前一周开始。对于CD4+和CD8+T细胞消耗，第一周以QODx3计划递送250μg所示抗体，然后以Q3D计划进行额外3周。通过流式细胞术确认全血中所需T细胞群的消耗(数据未显示)。在肿瘤细胞接种后第0天和第14天(第0天＝QOD x3后24小时，第14天：QOD x3+Q3D后24小时，持续2周)采集各只动物的100μL全血。然后与抗体混合。在轻柔地涡旋后，将混合物于室温(RT)在黑暗中孵育30分钟。将2ml的1X FACS裂解缓冲液添加到溶液，并于RT下孵育10分钟。然后将溶液混合物离心5分钟并除去上清液。最后，将细胞重悬于150μl的染色缓冲液中，并在流式细胞仪上分析。所有流式细胞术抗体(抗-CD45-PerCP-cy55(克隆：30-F11)、抗-CD3-FITC(克隆：17A2)抗-CD4-APC(克隆：RM4-4)、抗-CD8-PE(克隆53-6.7)购自白乐津公司(Biolegend)，除了抗-CD3来自BD生物科学公司(BD Biosciences)。(QOD x3：每隔一天持续3天，Q3D：每3天(星期一至星期四))。
·过继T细胞转移
在脾脏、辅助淋巴结、臂淋巴结和腹股沟淋巴结切除后，进行将CD3+T细胞由存活小鼠至幼稚小鼠的过继转移。由所示器官制成细胞悬液并汇集。然后，根据制造商的方案(美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotech))使用磁珠由库中分离CD3+T细胞。每只小鼠静脉内注射1x107个CD3+T细胞。
·MTS试验
取决于癌细胞类型，将3000-6000个细胞接种到96孔板中。细胞附着后，将它们用不同浓度的miRNA-193a转染，并在不同时间点测量活力。使用CellTiter 96AQueous OneSolution细胞增殖试验(普洛麦格公司)进行活力测量。将20μL的MTS试剂添加到96孔板各孔的100μL培养基中，并在37℃下孵育2小时。对于96孔板读数器中的各样品，在490nM处测量吸光度。
·胱天蛋白酶GLO胱天蛋白酶3/7试验(凋亡试验)
取决于癌细胞类型，将3000-6000个细胞接种到96孔板中。细胞附着后，将它们用不同浓度的miRNA-193a转染，并在不同时间点测量凋亡诱导。该试验使用普洛麦格公司试剂盒进行。将100μL的胱天蛋白酶试剂添加到96孔板各孔的100μL培养基中，并于室温黑暗中孵育2小时。在发光板读数器上读取发光信号。
·博伊登室(Boyden chamber)试验
为了检查细胞的迁移能力，进行了博伊登室试验，其基于被0.8μm孔径的膜(BDfalcon公司)分隔的两个充满介质的隔室组成的腔室。在该试验中，取决于细胞类型，将60,000-120,000个细胞接种在无血清培养基中的膜的上部隔室中，并使其通过膜的孔迁移到下部隔室中，其中的血清存在于培养基中。血清作为趋化剂起作用。在适当的孵育时间后，将两个隔室之间的膜固定，染色并拍摄各膜6个不同的图像。使用Image J分析对迁移细胞的数目进行计数。
·核成像(测量细胞周期概况)
取决于癌细胞类型，将3000-6000个细胞接种到96孔板中。细胞附着后，将它们用不同浓度的miRNA-193a转染，并在不同时间点测量细胞周期概况。在选定的时间点由孔中吸出培养基，并将DNA染色溶液(Hoescht33342/Saponin/PFA)添加到各孔中，并在37℃下孵育2小时。然后，使用Thermo CellInsite拍摄细胞图像，在其中指定细胞核并测量细胞核强度。使用程序R分析细胞核强度，以根据DNA含量确定细胞周期的不同阶段(G0/G1、S、G2/M)。
·膜联蛋白V/碘化丙啶凋亡试验(流式细胞术)
为了特异性地检测经历凋亡的细胞，使用了FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒(BD法敏进公司(BD pharmingen))。取决于癌细胞类型，将不同数量的细胞接种到6孔板中，以在测量时达到约70％的融合度。细胞附着后，将它们用不同浓度的miRNA-193a转染，并按照制造商的方案在不同时间点测量凋亡试验。藉由该试验，我们已经检测到表明细胞周期的SubG1期的凋亡细胞百分比。
·3'UTR荧光素酶试验
将含有NT5E(CD73)3'非翻译区(UTR)的萤火虫荧光素酶报告物构建体与10nMmiRNA-193a-3p或加扰对照一起转染到Hela细胞中。转染后24小时制备细胞提取物，并使用双荧光素酶报告物试验系统(Dual Luciferase Reporter Assay System)(普洛麦格公司)测量荧光素酶活性。如果3'UTR是miRNA的靶标，那么miRNA将与3'UTR相互作用并提供较低的荧光素酶信号。
·Western印迹
收获大约1x106个细胞，并在免疫沉淀RIPA裂解缓冲液中裂解，并将裂解物印迹到PVDF膜上。将膜用一抗探测过夜，并使用HRP连接的二抗(细胞信号转导公司(Cell-Signalling))显示结合的抗体。用于western印迹的抗体包括来自细胞信号转导科技公司(Cell Signaling Technology)的抗NT5E(D7F9A)和来自圣克鲁兹公司的抗-α微管蛋白。将α微管蛋白用作western印迹实验的加载对照。
·孔雀石绿磷酸试验
将2000个A2058黑素瘤细胞接种到96孔板中的各孔中。接种后24小时，用不同浓度的下述物质转染细胞：miRNA-193a-3p、加扰对照、siNT5E和siPool作为对照。孔雀石绿磷酸试验(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))用于测量转染后24小时和48小时抑制作为miRNA-193a-3p靶基因的CD39(ENTPD1)和CD73(NT5E)后来自核苷三磷酸ATP的磷酸释放。可以在板读数器(600-660nm)上方便地测量反应迅速形成的颜色。
·腺苷试验
将4000个A2058黑素瘤细胞接种到96孔板中的各孔中。接种后4小时，用不同浓度的下述物质转染细胞：miRNA-193a-3p、加扰对照、siNT5E和siPool作为对照。转染后24小时，用500μM AMP处理细胞，并在处理后24小时按照腺苷测量试剂盒(BioVision公司)的步骤进行腺苷试验。
·用于RNA测序的细胞制备
在适当的培养基中培养6个人癌细胞系(表3-细胞系详情)，并在使用Lipofectamine RNAiMAX(赛默飞世尔公司)用10nM的miRNA-193a-3p或模拟转染前24小时接种到6孔板中。转染后16小时吸出试剂，并将细胞传代至新的6孔板中。转染后24小时吸出培养基，并将板保存在-80℃。对各细胞系进行三个独立的重复。
表3-细胞系详情
Figure BDA0002717738480000911
FBS：胎牛血清，P/S：青霉素链霉素
·用于RNA测序的RNA分离
使用miRNeasy迷你试剂盒(凯杰公司)分离RNA。该过程包括柱上DNA酶处理。在NanodropOne上测量RNA浓度。将150ng各自独立的重复样品汇集，并将450ng样品(表4-用于RNA测序的RNA样品)提交给GenomeScan BV公司(荷兰莱顿)。
表4-用于RNA测序的RNA样品
Figure BDA0002717738480000912
Figure BDA0002717738480000921
·RNA测序程序
进行多聚A富集，然后在GenomeScan BV公司使用Illumina NovaSeq 6000进行下一代RNA测序。数据处理工作流程包括原始数据质量控制，衔接体修剪和短读出比对。将参考GRCh37.75.dna.primary_assembly用于比对各样品的读出。基于比对文件中的映射位置，确定读出在转录本上映射的频率(功能计数)。将计数保存到计数文件中，将其用作下游RNA-Seq差异性表达分析的输入。
·用于RNA测序的数据分析
由GenomeScan BV公司对短读出数据集进行差异性表达分析。将读出计数加载到DESeq软件包v1.30.0中，其是R平台v3.4.4中的统计软件包。DESeq是专门开发的，用于在对于具有较小样本量和过度分散的RNA-Seq数据的两个条件(模拟相对miRNA-193a-3p)之间寻求差异性表达基因。表中提供了差异性表达比较分组。
表5-表达比较设置
Figure BDA0002717738480000922
实施例4.1：在携带皮下人A2058黑素瘤肿瘤的小鼠中比较LNP功效
向四至六周龄雌性无胸腺裸鼠(Crl:NU(NCr)-Foxn1nu；查尔斯河公司(CharlesRiver))单侧皮下注射1x107个A2058细胞的50％基质胶(0.2mL/小鼠)。在随机化时，TV的范围为134.5-538.7mm3(中位数213.4，IQR178.3-265.9)。每周三次确定体重和TV(卡尺测量)。
随机化后，小鼠接受总共三次静脉注射，每次在连续三天上给予(QDx3)。对于给药方案，参见表6。Dx3＝每天注射一次，连续3天。
表6–给药方案；对于各组ID静脉给药
Figure BDA0002717738480000931
在最后一次给药后47至49小时之间收集肿瘤。首先使用异氟烷麻醉小鼠，然后通过颈脱位法处死小鼠。将肿瘤在液氮中速冻并储存在-80℃。图1显示了在3次每日3mg/kg连续注射siHPRT1的最后一次注射后47-49小时时皮下人A2058黑素瘤肿瘤中的HPRT1 mRNA表达。
结论：
根据本发明的纳米颗粒介导siHPRT1向皮下肿瘤的功能性递送，而NOV340没有(图1)。
实施例4.2：在二亚氨基脂质纳米颗粒中配制的miRNA-193a在携带皮下人A2058黑素瘤肿瘤的小鼠中的肿瘤生长抑制作用
向四至六周龄雌性无胸腺裸鼠(Crl:NU(NCr)-Foxn1nu；查尔斯河公司(CharlesRiver))单侧皮下注射1x107个A2058细胞的50％基质胶(0.2mL/小鼠)。在随机化时，TV(肿瘤体积)的范围为139.4-245.5mm3(中位数161.3，IQR＝149.9-175.1)。每周三次确定体重和TV(卡尺测量)。
随机化后，小鼠在第一周总共接受了五次每日连续静脉注射，之后接受了BIW维持剂量。对于给药方案，参见表7。*QDx5＝每天注射一次，连续5天；BIW＝一周两次。
表7.给药方案研究P508C－对于各组ID的途径是静脉内注射
Figure BDA0002717738480000941
处理开始后12天的相对肿瘤体积示于图2。在此阶段，对于用根据本发明的组合物处理的组，观察到T/C为0.44。我们注意到，在研究的其余时间中，BIW维持剂量不足以支持显著的TGI作用。图2显示了开始处理后12天的相对肿瘤体积；在该图中，miR-193a指脂质纳米颗粒制剂中的miR-193a-3p。携带皮下人A2058黑素瘤的小鼠在第1周中连续5天用3mg/kg在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miRNA-193a处理，然后每周两次注射(星期一/星期四)。
结论：
在根据本发明的纳米颗粒中配制的miRNA-193a在人A2058黑素瘤肿瘤的皮下小鼠模型中介导显著的TGI作用。
实施例4.3：在二氨基脂质纳米颗粒或在NOV340中配制的miRNA-193a或miRNA-7在携带原位人Hep3b肝细胞癌的小鼠中的肿瘤生长抑制作用
向7-8周龄的雌性SCID/Beige小鼠(上海凌昌生物技术有限公司(ShanghaiLingchang Bio-Technology Co.Ltd)，中国上海)经原位植入一块2x2x2 mm的皮下生长的Hep3b肿瘤到左肝叶。根据第21天AFP水平将小鼠随机化。在随机化时，AFP水平(ng/ml血浆)介于1019和19779ng/ml之间(中位数5203，IQR＝2690-9498)。处理在第22天开始，并持续三周(给药方案参见表8)。每周测量一次AFP(总共4次)，每周测量两次BW。在研究结束时，还确定了肿瘤重量。QDx3,QDx5＝每天注射一次，连续3或5天；BIW＝每周两次；BID＝每天两次；po＝口服。
表8.实施例4.3的给药方案
Figure BDA0002717738480000951
图3显示了第42天血浆AFP水平和最终处死后确定的肿瘤重量。
结论：
在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miR-193a在人Hep3b HCC(肝细胞癌)肿瘤的原位小鼠模型中介导显著的TGI作用，而在二氨基脂质纳米颗粒或在NOV340中配制的miR-7分别显示非常轻微的作用或无作用。
实施例4.4：在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miRNA-193a在植入乳腺脂肪垫中的4T1三阴性乳腺癌肿瘤的同系小鼠模型中的肿瘤生长抑制作用和长期免疫
向6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(上海凌昌生物技术有限公司，中国上海)注射含3x105个4T1肿瘤细胞的PBS(0.1mL/小鼠)到乳腺脂肪垫。在随机化时，TV的范围为69.9-173.9mm3(中位数105.7，IQR＝100.7-125.4)。每周2-3次确定体重和TV(卡尺测量)。
随机化后(肿瘤接种后第9天)，小鼠在不同的给药方案下接受了不同处理(给药方案参见表9)。对于所有组，在第一周和第二周注射第二miRNA-193a后48小时处死4只小鼠。在接种后第20天，将原发性肿瘤由乳腺脂肪垫手术切除。在3天的恢复期后，继续处理6周，直到第63天为止。除了BW外，还监测(远端)肿瘤的重新生长，并且如果达到终点，那么处死小鼠。
为了研究miRNA-193a处理的小鼠针对4T1细胞的长期免疫力，在接种后第75天，通过皮下注射含3x105个4T1小鼠肿瘤细胞的PBS(0.1mL/小鼠)到右前肋再次攻击经miRNA-193a处理的小鼠和8只原初(不具有肿瘤)小鼠。监测TV和BW三周。然后，为了研究miRNA-193a处理的小鼠针对其他细胞类型的免疫状态，在第101天，通过皮下注射含H22(小鼠肝肿瘤细胞)细胞的PBS(0.1mL/小鼠)到右下肋再次攻击经miRNA-193a处理的小鼠和8只原初(不具有肿瘤)小鼠。
表9.实施例4.4的给药方案-*BIW：一周两次；ip＝腹膜内
Figure BDA0002717738480000961
Figure BDA0002717738480000971
图4显示了处理开始后1(A)和2(B)周的CD8+T细胞/Treg细胞的比率。miRNA-193a处理导致从免疫抑制性转变为免疫刺激性4T1肿瘤微环境(CD8+T细胞/Treg细胞>1，miRNA-193a处理开始后2周)。
图5显示了CD45+肿瘤细胞群中免疫细胞和胞内细胞因子的百分比。1周后，miRNA-193a处理导致T细胞功能显著增加(IFNγ和IL-2的产生)，和调节性T细胞群体(FOXP3+/LAG3+)显著减少。2周后，miRNA-193a处理导致T细胞频率(CD8+)显著增加，同时T细胞功能(IFNγ)受轻度诱导和调节性T细胞群(FOXP3+/LAG3+)显著减少。
图6显示了免疫细胞中CD73(NT5E)表达水平的百分比。经miRNA-193a处理后，免疫细胞中CD73表达水平下调。
总之，通过在第一周增强T细胞功能并在第二周诱导T细胞频率，miRNA-193a处理导致从免疫抑制性转变为免疫刺激性4T1肿瘤微环境。该免疫肿瘤学概况表明，miRNA-193a能够将冷肿瘤微环境转变为热肿瘤微环境。
图7显示了4T1肿瘤切除后显示出原发性肿瘤再生的小鼠百分比。在乳腺脂肪垫中用4T1细胞注射小鼠，每周两次处理(静脉内)，在细胞注射后1周开始，在细胞注射后第20天去除原发性肿瘤。将原发肿瘤切除后，以10mg/kg在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miR-193a每周两次对小鼠进行另外6周处理，相较于PBS或抗-PD1处理的小鼠，或进行组合处理。图8显示了4T1肿瘤切除后，具有原发性肿瘤再生的个别小鼠的结果。
结论
用在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miRNA-193a处理减少了肿瘤切除后的肿瘤再生长。
图9显示了4T1肿瘤切除后(第66天)显示出原发性肿瘤再生长的小鼠百分比。图10显示了用4T1细胞再次攻击存活的miRNA-193a处理的小鼠的结果。图11显示了3只经miRNA-193a处理的小鼠的详细肿瘤体积(来自图10)，其显示了在用4T1细胞再次攻击时相较于原初小鼠的肿瘤发生。
结论：
用在二氨基纳米颗粒中配制的miRNA-193a的处理减少了肿瘤切除后且用4T1肿瘤再次攻击后肿瘤的再生长，并且还正向影响小鼠存活。如所期望，再次移植的鼠4T1细胞能够在原初动物中形成皮下肿瘤。经miRNA-193a处理的动物中明显预防肿瘤发生/生长强烈表明针对4T1细胞的长期免疫。
图12显示了如何在第101天(处理结束后第38天)用H22细胞再次攻击存活的经miRNA-193a处理的小鼠，并且显示了相较于用H22细胞再次攻击的原初小鼠的肿瘤体积。经miRNA-193a处理的小鼠的详细肿瘤体积，其显示了在用H22细胞再次攻击时相较于原初小鼠显示出肿瘤发生(100％)，以及所有经miRNA-193a处理的动物1周后明显的时间依赖性肿瘤消退。
结论
如所期望，移植的鼠H22细胞能够在原初动物中形成皮下肿瘤。经miRNA-193a处理的动物中出现了高效的(100％)肿瘤发生，但是发现了H22肿瘤生长的快速抑制，这导致了时间依赖性消退。这强烈表明了针对无关H22细胞的长期免疫(交叉抗原反应)。
总之，用在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miRNA-193a处理：
·减少了肿瘤切除后的肿瘤再生长，正向影响小鼠存活
·导致从免疫抑制性向免疫刺激性4T1肿瘤微环境的转变
·经miRNA-193a处理的动物中明显预防肿瘤发生/生长强烈表明针对4T1细胞的长期免疫(CD8+T细胞/Treg细胞>1)。
·经miRNA-193a处理的动物中高效的(100％)肿瘤发生，但是快速抑制H22肿瘤生长，导致了时间依赖性消退——表明针对无关H22细胞的长期免疫(交叉抗原“疫苗接种”)。
实施例4.5：在二亚氨基纳米颗粒中配制的不同浓度的miRNA-193a在携带皮下人A2058黑素瘤肿瘤的小鼠中的肿瘤生长抑制作用
向6-8周龄的雌性BALB/c裸鼠(上海凌昌生物技术有限公司，中国上海))在右肋单侧皮下注射含5x106个A2058肿瘤细胞的PBS(0.1mL/小鼠)。在随机化时，TV的范围为50.3-156.3mm3(中位数104.8，IQR＝91.9-127.1)。随机化后，小鼠在不同的给药方案下接受不同的miRNA-193a给药浓度(给药方案参见表10)。也包括BRAF抑制剂维莫非尼。每周三次确定体重和TV(卡尺测量)。*QDx3、QDx4＝每天注射一次，连续3或4天；BIW＝每周两次，BID＝每天两次，Po＝口服。
表10–实施例4.5的给药方案
Figure BDA0002717738480000991
图13显示了处理开始后21天的相对肿瘤体积。用不同剂量和不同方案在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miRNA-193a或维莫非尼处理携带皮下人A2058黑素瘤的小鼠。
结论：
对于在根据本发明的纳米颗粒中配制的QDx3 6.7mg/kg miRNA-193a，观察到肿瘤生长显著降低，而其他给药方案仅显示出轻度趋势。
实施例4.6：在不同时间点研究miRNA-193a处理在原位4T1小鼠乳腺癌同基因模型中的PD作用
向6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(上海凌昌生物技术有限公司，中国上海)注射含3x105个4T1肿瘤细胞的PBS(0.1mL/小鼠)到乳腺脂肪垫。在随机化时，肿瘤体积(TV)的范围为252.30-370.45mm3。
随机化后，小鼠接受采用相似给药方案的相似处理(见表11)。在预定的时间点处死小鼠(参见表11)。收集各小鼠的肿瘤，在液氮中速冻，然后保存在-80℃。
表11–实施例4.6的给药方案；QD每天一次；给药是静脉内
Figure BDA0002717738480001001
为了研究miRNA-193a对已发现是miRNA-193a靶基因的几个重要基因的mRNA表达水平的影响(药代动力学作用)，使用上述qPCR和引物对肿瘤中不同时间点的表达水平进行定量。评估的基因包括：K-Ras、MCL1、ENTPD1(CD39)和TIM-3。表12简要讨论了这些靶基因的作用和生物学重要性。结果如图14所示。
表12-所示miRNA-193a靶基因的作用和生物学重要性的总结
Figure BDA0002717738480001011
图14显示了以10mg/kg静脉内注射QDx2(每天一次，连续两天)后肿瘤中随时间变化的miRNA-193a靶基因表达水平。对携带原位4T1肿瘤的小鼠进行相似地处理，并在不同时间点移出肿瘤进行药效学分析(见表11)。显示了个体肿瘤表达值。不同的靶基因在不同的时间点显著下调。
结论
以10mg/kg的剂量和QDx2方案进行的miRNA-193a处理导致在不同时间点涉及凋亡和免疫途径的靶标mRNA表达显著降低。
实施例4.7：miRNA-193a在所用体外环境中的作用方式
已在各种癌细胞系中测试了miRNA-193a-3p的不同生物学作用(参见表13)。为此，用不同浓度(1、3、10nM)的miRNA-193a处理各种细胞。对于所有实验，测量对照(未处理、模拟和加扰)。所有试验在24小时、48小时和72小时时间点进行。表13中显示的数据是在指示的时间点以10nM浓度的miRNA-193a的结果。将所有结果均定量并标准化至模拟对照。已证明10nM是miRNA-193a体外处理的合适浓度，因为在该浓度下细胞没有显示毒性作用的迹象。
表13-miRN-193a体外作用模式的总结
Figure BDA0002717738480001021
↓↓活力<50％↓活力>50％↑↑诱导>2x↑诱导<2x
通过MTS分析或细胞计数测量，各种癌细胞系中的miRNA-193a处理随时间降低细胞活力。通过胱天蛋白酶3/7凋亡试验，其随时间增强凋亡诱导。通过进行核成像或流式细胞术来测量细胞周期停滞概况。取决于细胞系，miRNA-193a处理诱导G2/M或SubG1细胞周期阻滞概况。虽然在Huh7、H1299和HCT116中，按照所示方法未观察到明显的细胞周期停滞概况，但是在这些细胞系中进行miRNA-193a处理后观测到凋亡增加，这通过Caspase 3/7激活和western印迹上裂解的parp蛋白增加所示(数据未显示)。该结果表明miRNA-193a处理通过诱导凋亡来影响癌细胞的活力。值得注意的是，由于各细胞系的固有特征和基因突变状态，进行一种方法以检测凋亡并不总是适用于所有细胞系。通过博登室试验所评估，miRNA-193a处理后，几种癌细胞系的细胞运动性显著降低。
结论
对癌细胞系进行miRNA-193a处理将部分通过诱导凋亡和通过增强细胞周期停滞概况来降低细胞活力。miRNA-193a处理还降低了癌细胞的细胞运动性，这表明其在抑制癌细胞迁移中的作用。
实施例4.8：miRNA-193a部分通过调节CD73和CD39来影响腺苷生成途径
腺苷的生成是某些肿瘤逃避宿主免疫的途径之一。CD39(ENTPD1)和CD73(NT5E)是两种细胞表面胞外酶，它们使ATP脱磷酸以生成腺苷，从而控制胞外空间中的腺苷和ATP水平。已经证明胞外腺苷通过限制抗肿瘤T细胞免疫来促进肿瘤生长和转移。CD73和CD39在大多数肿瘤细胞中高度过表达，导致肿瘤微环境中的腺苷水平升高。
为了验证作为miRNA-193a-3p靶标的CD73，进行了3'UTR试验，其中miRNA-193a-3p在Hela细胞中过表达，导致相较于模拟和加扰对照含有NT5E3'UTR区的报告物构建体的活性下调。然而miRNA-193a-3p的过表达并不影响包含CD73 3'UTR突变形式的报告物构建体的荧光素酶活性(图15A)。这表明CD73的3'UTR与miRNA-193a-3p完全互补，而CD73是miRNA-193a-3p的有效靶标之一。
如图15B-D所示，miRNA-193a-3p处理在mRNA和蛋白质水平上下调了涉及多种细胞系中腺苷生成途径的两种酶的表达。为了评估miRNA-193a-3p对腺苷生成的影响，测量A2058黑素瘤细胞中游离磷酸的释放，作为上清液中ATP、ADP和AMP脱磷酸作用的读出。如图16A所示，miRNA-193a-3p处理降低游离磷酸产生的水平。通过测量细胞培养上清液中腺苷的直接量发现了相似的结果(图16B)。此外，研究了miRNA-193a在A2058癌细胞迁移中的作用。使用体外transwell分析，我们证明了miRNA-193a-3p处理将显著抑制A2058细胞的迁移能力(图16C)。有趣的是，在所有这些实验中，siRNA介导的NT5E消耗表型复制了miRNA-193a处理的作用，这强烈表明miRNA-193a可能至少部分通过靶向NT5E发挥其对腺苷生成和迁移的作用(图16A、16B和16C)。
结论
miRNA-193a部分通过靶向NT5E和ENTPD1和抑制腺苷生成在下调免疫抑制性肿瘤微环境中发挥作用。miRNA-193a还通过靶向NT5E来部分降低腺苷诱导的癌细胞迁移能力。
实施例4.9：在最佳时间点于不同细胞系中进行miRNA-193a处理后的细胞周期分布
为了研究miRNA-193a的抗增殖特性，我们对以不同浓度(1nM、3nM和10nM)和时间点(48小时、72小时和96小时)进行miRNA-193a-3p处理后不同癌细胞的细胞周期进行了概述，并与作为对照的模拟比较。miRNA-193a-3p处理在Hep3B和SNU449的HCC细胞系和黑素瘤A2058细胞中导致G2/M停滞表型(图17)，而这最终导致细胞死亡(数据未显示)。在Panc1(胰腺癌细胞)以及H1975(肺癌细胞)中观察到相似的表型(数据未显示)。为了部分解决miRNA-193a依赖性G2/M停滞表型，在不同时间点(24小时、48小时和72小时)研究了可能在G2/M停滞中起作用的几种miRNA-193a靶基因的表达水平，并证明其在Hep3B、SNU449和H1975癌细胞中下调(图18)。这些基因的表达水平在其他显示G2/M停滞表型的细胞系中也下调(数据未显示)。MPP2和STMN1与细胞骨架相关，并且因此在G2/M期调节细胞分裂和增殖，而YWHAZ和CCNA2通过结合和螯合细胞周期蛋白依赖性激酶在调节G2/M期检查点中起作用。
结论
在所有测试的癌细胞系中，miRNA-193a的表达触发癌细胞死亡，这至少部分是由于其对诱导G2/M停滞表型和使细胞分裂停止的作用。该表型是由与细胞骨架和细胞分裂相关的微小RNA药物抑制基因所部分导致的。
实施例4.10：6种不同癌细胞系中miRNA-193a处理后的RNA测序、基因组富集分析和途径分析
实施高通量RNA测序已成为在基因和外显子水平上全面表征整个转录组的强大工具，并且具有以高分辨率和高效率鉴定差异表达基因、新基因和转录本的独特能力。然而，迄今为止，很少有miRNA针对其在癌症发展中的特定作用被表征。因此，我们在以10nM进行miRNA-193a-3p处理后24小时，在6种不同的癌细胞系中过表达miRNA-193a-3p后使用了高通量RNA测序，所述6种不同的癌细胞系包括A540和H460(均为肺癌)，Huh7和Hep3B(均为肝癌)，A2058(皮肤癌)和BT549(乳腺癌)。将基因表达与作为对照的模拟进行比较，并且我们鉴定了差异表达的基因及其生物学途径。
为所有6个细胞系创建转染后24小时下调基因(相对表达miRNA-193a-3p/相对表达模拟<1)列表。随后，我们生成了在至少一个细胞系中或在多个细胞系中显著下调(调整后的P<0.1)的基因列表(表14)。根据TargetScan工具(一种miRNA靶标预测工具)，在至少两种细胞系中被下调的基因中超过65％的基因被预测为miRNA-193a-3p靶标。
表14-至少一种或多达6种细胞系中被miRNA-193a下调的基因数
Figure BDA0002717738480001051
考虑到调整后的P<0.1，miRNA-193a在所有6个细胞系中下调了35个基因(表15)，它们有望在细胞凋亡、细胞迁移、粘附、增殖和其他致癌功能的调节中起作用。
表15-在所有6个细胞系中下调的基因
Figure BDA0002717738480001061
对于聚类和途径分析，需要更大的基因集。因此，我们使用了在至少3个细胞系中下调的242个基因(调整后的p<0.1)作为DAVID功能分类工具的输入，其能够使基因聚类到功能相关的组中(表16)。该分析表明，最富集的簇包括调节细胞凋亡的基因。其他簇包含的基因在血管新生，未折叠的蛋白质反应，趋化性，蛋白质转运，核苷代谢，糖基化，肿瘤发生，伤口愈合中起作用。有趣的是，调节免疫激活的基因也受到miRNA-193a的影响。在至少3个癌细胞系中下调的242个重要基因中(调整后的P<0.1)，对于miRNA-193a-3p有161个基因是令人感兴趣的，因为它们也已被不同的靶标预测程序预测为miRNA-193a-3p的靶标。这161个基因是：ERMP1、MCL1、ZDHHC18、KIAA1147、IDS、EIF4B、ETS1、TXLNA、NT5E、WSB2、PLAUR、LRRC40、PTPLB、SLC15A1、NCEH1、IL17RD、STMN1、AIMP2、PHACTR2、GALNT1、LAMC2、SCP2、SLC26A2、LUZP1、SHMT2、UBP1、PHLDA2、ST5、ENDOD1、CGNL1、MARCKSL1、RAB11FIP5、CCND1、RUSC1、FAM168B、ZC3H7B、PPTC7、SLC39A5、ACSS2、TPP1、HYOU1、DCTN5、CRKL、WDFY2、WDR82、SLC6A12、CDK6、SULF2、TWISTNB、ATP5F1、ALDH9A1、TOR4A、NET1、RSF1、NUP50、ZMAT3、AP2M1、MPP2、ITGB3、GALNT14、SLC35D1、PPARGC1A、TBL1XR1、MSANTD3、CLSTN1、PITPNB、CECR2、KIAA1644、ARHGAP29、KIAA1191、GREB1、PIK3R1、TNFRSF21、SEPN1、SYNRG、LRP4、ZNF365、CRYAA、MED21、GNAI3、ATP5SL、UBE2L6、ANKRD13A、GCH1、NIPA1、TRIM62、USP39、HEG1、DCAF7、LRRC8A、SOX5、IRF1、MORC4、UNC119B、FAF2、SLC30A1、C1QBP、ST3GAL4、TRIB2、TBC1D5、TMPPE、MAPK8、CBX1、CADM1、CCDC28A、YWHAZ、ERAP2、STON2、AP5M1、TGFB2、CYTH1、FAM20B、DPY19L1、ARHGAP19、LPAR3、LMLN、NUDT15、PLAU、VAMP8、HHAT、AGPAT1、ATP8B2、ACPL2、SCAMP4、LAT2、OSMR、NUDT21、HPRT1、STARD7、GABPA、CDC42EP2、THBS4、ATP6V1B2、PRNP、GFPT1、MAX、KRAS、CNOT6、NUDT3、RFWD3、APPL1、SLC23A2、BOD1、PDE3A、SLC30A7、CEP41、NOTCH2、RGS2、CDC42EP4、TP53INP1、SQSTM1、DDAH1、SLC35D2、FOCAD、GPATCH11、CBL、TMEM30B、HFE、PLEKHB2、ARPC5和ABI2。在这些基因中，对NT5E、TNFRSF21、YWHAZ、MAPK8、PLAU、PLAURO、NOTCH2、ETS1、IL17RD、CDK6、EIF4B和MCL1是特别感兴趣，因为它们在细胞周期途径、免疫激活以及细胞运动中均至关重要。在已经显著下调的所有基因中(P<0.05)，CDK4、CDK6、CRKL、NT5E、HMGB1、IL17RD、KRAS、KIT、HDAC3、RTK2、TGFB2、TNFRSF21、PLAU、NOTCH1、NOTCH2和YAP1是特别令人感兴趣的，因为已知它们涉及抗肿瘤免疫。ETS1、YWHAZ、MPP2、PLAU、CDK4、CDK6、EIF4B、RAD51、CCNA2、STMN1和DCAF7特别令人感兴趣，因为它们涉及细胞周期的调控。
表16-受miRNA-193a-3p调控的前十大途径。使用DAVID软件进行注释聚类。示出最富集的功能簇及其基因。
Figure BDA0002717738480001081
Figure BDA0002717738480001091
结论：
6种不同癌细胞系中的miR-193a过表达导致抑制影响不同途径的多种靶标。虽然在所有6种不同的癌细胞中都有一些共同的基因被明显靶向，但是也有一些独特基因仅在各种细胞系中被靶向，这表明环境依赖性作用。对在至少3种不同癌细胞系被靶向的基因进行途径富集分析显著地显示了血管新生、未折叠的蛋白质反应、趋化性、蛋白质转运、核苷代谢、糖基化、肿瘤发生、伤口愈合和免疫激活的基因特征。这些数据表明，miR-193a是肿瘤进展中的关键调节剂，并且由于其靶向多种途径的能力，其作为抗癌药物的治疗潜力具有吸引力。
实施例4.11：在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miRNA-193a在植入乳腺脂肪垫中的4T1三阴性乳腺癌肿瘤的同系小鼠模型中的T细胞介导的免疫力。
为了研究经miRNA-193a处理的小鼠中针对4T1癌细胞的T细胞介导的长期免疫力，进行与实施例4.4相似条件的新研究。肿瘤接种后5天，将小鼠随机分为两组，并接受与实施例4.4中相似的处理和给药方案(参见表9，仅第1-2组)。当该组平均肿瘤体积达到800mm3时手术切除原发性肿瘤后，恢复处理并持续至第58天。
由于相较于PBS对照，经miRNA-193A处理的小鼠没有肿瘤再生长(对于该研究未示出，在图8B中示出了实施例4.4相似的数据)，我们重新研究经miRNA-193a处理的小鼠针对4T1细胞的长期免疫力。为此，在肿瘤接种后第76天，经miRNA-193a处理的小鼠和原初(周龄匹配的无肿瘤)小鼠再次受到4T1小鼠肿瘤细胞的攻击。再次攻击后跟踪肿瘤再生长至3周。相较于原初小鼠，之前用miRNA-193a处理的小鼠没有发展出任何明显的肿瘤(图19)。为了研究我们对于这些小鼠中T细胞介导的长期免疫的假设，在肿瘤细胞接种后第103天，在用抗-CD4和抗CD8抗体处理后，对4T1再次攻击的之前用miRNA-193a处理的小鼠和原初小鼠进行T细胞消耗(处理方案参见表17)。对所有组的小鼠血液样品所进行的FACS分析已经证实了T细胞消耗的结果。CD8+细胞显示了完全耗尽，而CD4+细胞显示部分耗尽(数据未显示)。消耗处理后5天，用4T1小鼠肿瘤细胞(3x105于0.1mL PBS中，前肋)再次攻击所有组的小鼠，并跟踪肿瘤生长至4周。有趣的是，类似于原初小鼠，之前用miRNA-193a处理的小鼠中的T细胞消耗导致4T1肿瘤生长，而并未消耗T细胞的之前用miRNA-193a处理的小鼠没有显示明显的4T1肿瘤(图19)。
为了进一步证实之前用miRNA-193a处理的小鼠中的T细胞依赖性长期免疫力，由周龄匹配的原初小鼠中未发展出明显肿瘤的存活小鼠进行T细胞转移(表17，第2b组)。在肿瘤细胞接种后第133天，由存活动物的脾、辅助、臂和腹股沟淋巴结回收CD3+T细胞。将T细胞汇集并静脉内转移至6只周龄匹配的原初小鼠(在第0天，1x107个CD3+T细胞/小鼠)。T细胞转移后一天，用含3x105个4T1细胞的PBS(0.1mL/小鼠)于6只周龄相匹配的原初小鼠(作为对照组)和接受CD3+T细胞的6只小鼠的右乳脂垫中再次攻击动物。对肿瘤生长进行约5周的跟踪。有趣的是，相较于对照原初小鼠，接受T细胞的原初小鼠没有表现出任何4T1肿瘤生长(图19)。
表17.实施例4.11的给药方案-*BIW：每周两次；ip＝腹膜内，QOD＝每隔一天注射一次，Q3D＝每3天注射一次
Figure BDA0002717738480001101
结论：
用miRNA-193a(在这种情况下，miRNA-193a-3p在二氨基脂质纳米颗粒中配制)处理降低在用4T1肿瘤细胞再次攻击后的肿瘤生长，并提高小鼠存活。如所期望，再次移植的鼠4T1细胞能够在原初动物中形成皮下肿瘤。经miRNA-193a处理的动物中明显预防肿瘤发生/生长强烈表明针对4T1的长期免疫。之前经miRNA193a处理的小鼠是重新移植鼠4T1细胞后的存活者，显示肿瘤再生长仅发生在T细胞消耗后，相较于未消耗的组。该结果强烈地表明了T细胞依赖性免疫。此外，将T细胞由之前经miRNA-193a处理的再次攻击的存活小鼠转移到原初小鼠中使其在用4T1肿瘤再次攻击后废除了肿瘤的再生长。这强烈地表明了经miRNA-193a处理的小鼠中的T细胞介导的免疫力。
实施例4.12：在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miRNA-193a在12种同系肿瘤模型中对原发性肿瘤生长的功效
在该研究中，在12种同系肿瘤模型中，研究了在二氨基脂质纳米颗粒中配制的miRNA-193a对原发性肿瘤生长的作用。向6-8周龄的小鼠(上海凌昌生物技术有限公司，中国上海)皮下注射适当数量的同系癌细胞，这取决于癌症模型(见表18)。在随机化时，肿瘤体积(TV)为约80-120mm3。每周2-3次确定体重和TV(卡尺测量)。随机化后(指示为第0天)，小鼠接受PBS或miR-193a(在二氨基脂质纳米颗粒中配制)处理，如表19所示。各肿瘤模型有两组，如表19所示。计划在最多四周的处理后的两周跟踪后对小鼠实施安乐死。然而，取决于各种处理和实验肿瘤模型的肿瘤生长速率，一些小鼠在比计划更早的人道终点实施安乐死(当平均TV/组达到2000mm3或单个小鼠的TV为3000mm3时)。在H22、Pan02、B16-BL6、RM-1、B16F10、MC38、A20和EMT-6模型中，miRNA-193a显著诱导了肿瘤生长抑制(TGI)。在CT26、Renca和Hepa1-6模型中，miR-193a处理不诱导显著TGI(表20)。在表20中，使用处理组之间最近的可比较时间点的中值肿瘤体积，计算相较于PBS，miRNA-193a所致百分比肿瘤生长抑制(TGI)。
表18.各细胞系的接种详情
编号 细胞系 癌症类型 细胞 接种位点 小鼠品系 性别
1 CT26 结肠 5×10e5 右下肋 BALB/c 雌性
2 H22 肝 1×10e6 右前肋 BALB/c 雌性
3 Pan02 胰 3×10e6 右前肋 C57BL/6J 雌性
4 B16BL6 黑素瘤 2×10e5 右下肋 C57BL/6J 雌性
5 RM-1 前列腺 1×10e6 右下肋 C57BL/6J 雄性
6 Renca 肾 1×10e6 右下肋 BALB/c 雌性
7 B16F10 黑素瘤 2×10e5 右下肋 C57BL/6J 雌性
8 MC38 结肠 1×10e6 右下肋 C57BL/6J 雌性
9 Hepa 1-6 肝 5×10e6 右前肋 C57BL/6J 雌性
10 LL/2 肺 3×10e5 右下肋 C57BL/6J 雌性
11 A20 淋巴瘤 5×10e5 右下肋 BALB/c 雌性
12 EMT-6 乳腺 5×10e5 右前肋 BALB/c 雌性
表19.各模型的实验组
Figure BDA0002717738480001121
表20.miRNA-193a在同基因模型中的肿瘤生长抑制
Figure BDA0002717738480001122
Figure BDA0002717738480001131
结论：
miRNA-193a处理在多种同系肿瘤模型(即H22、Pan02，B16-BL6，RM-1，B16-F10，MC38，A20和EMT-6)中导致对原发性肿瘤的显著肿瘤生长抑制。这些结果表明，在广泛的同系模型中，miRNA-193a对已建立的皮下原发性肿瘤的生长具有抑制作用。
实施例4.13：在其他脂质纳米颗粒中配制的miRNA在携带原位人Hep3b肝细胞癌肿瘤的小鼠中不抑制肿瘤生长
向6-8周龄的雌性SCID/Beige小鼠(上海凌昌生物技术有限公司(ShanghaiLingchang Bio-Technology Co.Ltd)，中国上海)经原位植入一块2x2x2mm的皮下生长的Hep3b肿瘤到左肝叶。根据第21天AFP水平将小鼠随机化。在随机化时，AFP水平(ng/ml血浆)介于401和40628ng/ml之间(中位数2536，IQR＝1037-5510)。处理使用索拉非尼、载剂对照或者包封于NO340脂质纳米颗粒的各组miRNA(或加扰miRNA对照)(Simonson和Das,MiniRev Med Chem,2015,15(6):467-474,PMID:25807941)。处理在第22天开始，并持续三周(给药方案参见表21)。每周测量一次AFP，进行4周，并且每周测量两次BW。在研究结束时，还确定了肿瘤重量。QODx9＝每隔一天注射一次，进行9次；BID＝每天两次；po＝口服。
表21.给药方案-8只小鼠/组。
Figure BDA0002717738480001132
Figure BDA0002717738480001141
在第39天终末期处死后，确定AFP水平和肿瘤重量。通过AFP和肿瘤重量测量，含有不同miRNA(miR-7；miR-34a或miR-193a-3p)的NOV340纳米颗粒不抑制人Hep3b HCC(肝细胞癌)肿瘤的生长，而索拉非尼(10mg/kg，BID)可以。这些结果示于图20。
结论：
相较于索拉非尼，用不同的NOV340纳米颗粒配制的miRNA处理无法抑制肿瘤生长和/或体重。
参考文献
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<210> 1
<211> 86
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-mir-323前体
<400> 1
uugguacuug gagagaggug guccguggcg cguucgcuuu auuuauggcg cacauuacac 60
ggucgaccuc uuugcaguau cuaauc 86
<210> 2
<211> 99
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-mir-342前体
<400> 2
gaaacugggc ucaaggugag gggugcuauc ugugauugag ggacaugguu aauggaauug 60
ucucacacag aaaucgcacc cgucaccuug gccuacuua 99
<210> 3
<211> 87
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-mir-520f前体
<400> 3
ucucaggcug ugacccucua aagggaagcg cuuucugugg ucagaaagaa aagcaagugc 60
uuccuuuuag aggguuaccg uuuggga 87
<210> 4
<211> 85
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157前体
<400> 4
gggaagggcu ucagccaggc uagugcaguc ugcuuugugc caacacuggg gugaugacug 60
cccuagucua gcugaagcuu uuccc 85
<210> 5
<211> 88
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a前体
<400> 5
cgaggauggg agcugagggc ugggucuuug cgggcgagau gagggugucg gaucaacugg 60
ccuacaaagu cccaguucuc ggcccccg 88
<210> 6
<211> 110
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-1前体
<400> 6
uuggauguug gccuaguucu guguggaaga cuagugauuu uguuguuuuu agauaacuaa 60
aucgacaaca aaucacaguc ugccauaugg cacaggccau gccucuacag 110
<210> 7
<211> 110
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-2前体
<400> 7
cuggauacag aguggaccgg cuggccccau cuggaagacu agugauuuug uuguugucuu 60
acugcgcuca acaacaaauc ccagucuacc uaauggugcc agccaucgca 110
<210> 8
<211> 110
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-3前体
<400> 8
agauuagagu ggcugugguc uagugcugug uggaagacua gugauuuugu uguucugaug 60
uacuacgaca acaagucaca gccggccuca uagcgcagac ucccuucgac 110
<210> 9
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-mir-323 DNA序列筛选
<400> 9
ttcctggtat ttgaagatgc ggttgaccat ggtgtgtacg ctttatttgt gacgtaggac 60
acatggtcta cttcttctca atatcacatc tcgccttgga agacttccag gaggtgatat 120
cagctttgcg gaagagccac tgtcctggtg tcagtacggc tgctgcttgg tacttggaga 180
gaggtggtcc gtggcgcgtt cgcttttttt atggcgcaca ttacacggtc gacctctttg 240
cagtatctaa tcccgccttg caagctttcc tggagctaac atcaactgcg ggggtggggg 300
ccactaggtc tgcgctcagt gcgacccagc ggggtttgtg atgtgtctgt cttgtgtgtg 360
acgataactc acgtgtggca gccctcttct cagcacactg ctctggcttg gcagcagggt 420
taacttgcgg acgaggagcg tggtgtcagc acgtgcctgg atacatgaga tggttgacca 480
gag 483
<210> 10
<211> 488
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-mir-342 DNA序列筛选
<400> 10
cctgaagaga gactgacaca tcagaggtgt cyggtgactg aacaagctcc cagcttgcgc 60
ccatgtcata ttgtgtgcct ctcatagcct ggcacttcct gccattgcat ccttctctgc 120
agactaagat ggagttcctg aaccaagacc gcttgctggc caacctgtga aactgggctc 180
aaggtgaggg gtgctatctg tgattgaggg acatggttaa tggaattgtc tcacacagaa 240
atcgcacccg tcaccttggc ctacttatca ccaccccaaa cagaggaaca cgccttctcc 300
agccacagcc tatggaaggg ccttcagctg ctgtggcccc gaggtgtgca tactgtggaa 360
ggaacttcgg acgtgaactc ggatctggtt ccagtaccag ctgtgccagg agtgcccttg 420
ggcatgtcac tgacctaaga ctcagtttcg ccatctgtga aatggctgaa tcagactcac 480
ctcacagg 488
<210> 11
<211> 214
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-mir-520f DNA序列筛选
<400> 11
tgtgtccatt taaacctggt caaggaagat tcccacaaaa aatccacggt gctggagcaa 60
gaggatctca ggctgtgacc ctctaaaggg aagcgctttc tgtggtcaga aagaaaagca 120
agtgcttcct tttagagggt taccgtttgg gaaaagcaat gttgaagttg atgctgatct 180
tggtaaaata tttgcagagc gtgcttatca tcag 214
<210> 12
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-3157 DNA序列筛选
<400> 12
acaacttctc aatgagtctg ccctcactgt ccaacaattg agctgagaat ataagaaggg 60
aagggcttca gccaggctag tgcagtctgc tttgtgccaa cactggggtg atgactgccc 120
tagtctagct gaagcttttc ccttctttct acacccagct caagtcccag gtccataaaa 180
cctttagaaa ctcttcagaa actctttaga gcttcagaag ctcttgagaa ttggaagatg 240
<210> 13
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-193a DNA序列筛选
<400> 13
agggacaccc agagcttcgg cggagcggag cgcggtgcac agagccggcg accggaccca 60
gccccgggaa gcccgtcggg gacgcacccc gaactccgag gatgggagct gagggctggg 120
tctttgcggg cgagatgagg gtgtcggatc aactggccta caaagtccca gttctcggcc 180
cccgggacca gcgtcttctc cccggtcctc gccccaggcc ggcttcctcc cgggctggcg 240
tgcgctccgg ccaggctgcc tctcaggtcc acgctggaga aggagtggtg aggt 294
<210> 14
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-7-1 DNA序列筛选
<400> 14
gccttaacca agcaaacttc tcatttctct ggtgaaaact gctgccaaaa ccacttgtta 60
aaaattgtac agagcctgta gaaaatatag aagattcatt ggatgttggc ctagttctgt 120
gtggaagact agtgattttg ttgtttttag ataactaaat cgacaacaaa tcacagtctg 180
ccatatggca caggccatgc ctctacagga caaatgattg gtgctgtaaa atgcagcatt 240
tcacacctta ctagc 255
<210> 15
<211> 239
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-7-2 DNA序列筛选
<400> 15
tgaaggagca tccagaccgc tgacctggtg gcgaggggag gggggtggtc ctcgaacgcc 60
ttgcagaact ggcctggata cagagtggac cggctggccc catctggaag actagtgatt 120
ttgttgttgt cttactgcgc tcaacaacaa atcccagtct acctaatggt gccagccatc 180
gcagcggggt gcaggaaatg ggggcagccc ccctttttgg ctatccttcc acgtgttct 239
<210> 16
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-7-3 DNA序列筛选
<400> 16
tcatagcttg gctcaggtga gaaggaggag ctgggcaggg gtctcagaca tggggcagag 60
ggtggtgaag aagattagag tggctgtggt ctagtgctgt gtggaagact agtgattttg 120
ttgttctgat gtactacgac aacaagtcac agccggcctc atagcgcaga ctcccttcga 180
ccttcgcctt caatgggctg gccagtgggg gagaaccggg gaggtcgggg aagaatcgct 240
tccactcgga gtgggggggc tggctcactc caggcgatac ag 282
<210> 17
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p种子
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<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p种子
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<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> has-miR-520f-3p 种子
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<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-mir-520f-3p-i3种子
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<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p种子
<400> 21
ucagcca 7
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<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a-3p种子
<400> 22
acuggcc 7
<210> 23
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p种子
<400> 23
ggaagac 7
<210> 24
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR种子
<400> 24
cugcuug 7
<210> 25
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR种子
<400> 25
ugcuugg 7
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<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR种子
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gcugcuu 7
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<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR种子
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agguggu 7
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<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
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guggucc 7
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<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR种子
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gggugcu 7
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<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR种子
<400> 30
gcuaucu 7
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<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR种子
<400> 31
ggugcua 7
<210> 32
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR种子
<400> 32
ugugaaa 7
<210> 33
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
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<223> hsa-miR-342-5p isomiR种子
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gugcuau 7
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<211> 7
<212> RNA
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ugaaacu 7
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<211> 7
<212> RNA
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<223> hsa-miR-342-5p isomiR种子
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cugugaa 7
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<211> 7
<212> RNA
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<223> hsa-miR-342-5p isomiR种子
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cuaucug 7
<210> 37
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
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<211> 7
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<223> hsa-miR-342-5p isomiR种子
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augguua 7
<210> 39
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
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<223> hsa-miR-342-5p isomiR种子
<400> 39
aucugug 7
<210> 40
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR种子
<400> 40
gaaacug 7
<210> 41
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
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<400> 41
uaucugu 7
<210> 42
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR种子
<400> 42
gugaaac 7
<210> 43
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
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<223> has-miR-520f-3p isomiR种子
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agugcuu 7
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<211> 7
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<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
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aagugcu 7
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<211> 7
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ucagcca 7
<210> 46
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR种子
<400> 46
uucagcc 7
<210> 47
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR种子
<400> 47
cagccag 7
<210> 48
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR种子
<400> 48
uucagcc 7
<210> 49
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a-3p isomiR种子
<400> 49
acuggcc 7
<210> 50
<211> 7
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p isomiR种子
<400> 50
ggaagac 7
<210> 51
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p成熟miRNA
<400> 51
aggugguccg uggcgcguuc gc 22
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p成熟miRNA
<400> 52
aggggugcua ucugugauug a 21
<210> 53
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> has-miR-520f-3p 成熟miRNA
<400> 53
aagugcuucc uuuuagaggg uu 22
<210> 54
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-mir-520f-3p-i3成熟miRNA
<400> 54
caagugcuuc cuuuuagagg guu 23
<210> 55
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p成熟miRNA
<400> 55
uucagccagg cuagugcagu cu 22
<210> 56
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a-3p成熟miRNA
<400> 56
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<210> 57
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p成熟miRNA
<400> 57
uggaagacua gugauuuugu ugu 23
<210> 58
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR
<400> 58
aggugguccg uggcgcguuc 20
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR
<400> 59
aggugguccg uggcgcguuc g 21
<210> 60
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR
<400> 60
gcugcuuggu acuuggagag 20
<210> 61
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR
<400> 61
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<210> 62
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR
<400> 62
cugcuuggua cuuggagag 19
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR
<400> 63
ugcugcuugg uacuuggaga g 21
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR
<400> 64
gagguggucc guggcgcguu c 21
<210> 65
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR
<400> 65
aggugguccg uggcgcguuc gcu 23
<210> 66
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR
<400> 66
ggugguccgu ggcgcguu 18
<210> 67
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR
<400> 67
aggugguccg uggcgcgu 18
<210> 68
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR
<400> 68
gagguggucc guggcgcguu 20
<210> 69
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 69
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<210> 70
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 70
ggggugcuau cugugauuga gggac 25
<210> 71
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 71
ggggugcuau cugugauuga ggga 24
<210> 72
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 72
ggggugcuau cugugauuga gg 22
<210> 73
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 73
ugcuaucugu gauugaggga ca 22
<210> 74
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 74
aggggugcua ucugugauug agg 23
<210> 75
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 75
ggggugcuau cugugauuga ggg 23
<210> 76
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 76
aggggugcua ucugugauug agggaca 27
<210> 77
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 77
aggggugcua ucugugauug aggga 25
<210> 78
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 78
ggggugcuau cugugauuga 20
<210> 79
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 79
ugcuaucugu gauugaggga c 21
<210> 80
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 80
gggugcuauc ugugauugag gga 23
<210> 81
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 81
aggggugcua ucugugauug aggg 24
<210> 82
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 82
gggugcuauc ugugauugag ggac 24
<210> 83
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 83
aggggugcua ucugugauug ag 22
<210> 84
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 84
gggugcuauc ugugauugag gg 22
<210> 85
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 85
gggugcuauc ugugauugag g 21
<210> 86
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 86
ugcuaucugu gauugaggga 20
<210> 87
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 87
gggugcuauc ugugauugag ggaca 25
<210> 88
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 88
aggggugcua ucugugauug agggac 26
<210> 89
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 89
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<210> 90
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 90
aggggugcua ucugugauug 20
<210> 91
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 91
ggggugcuau cugugauuga g 21
<210> 92
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 92
ugcuaucugu gauugaggga cau 23
<210> 93
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 93
cugugaaacu gggcucaagg uga 23
<210> 94
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 94
ggugcuaucu gugauugagg gac 23
<210> 95
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 95
gugaaacugg gcucaaggug 20
<210> 96
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 96
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<210> 97
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 97
ggggugcuau cugugauug 19
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 98
gcuaucugug auugagggac a 21
<210> 99
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 99
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<210> 100
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 100
gugcuaucug ugauugaggg ac 22
<210> 101
<211> 28
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 101
aggggugcua ucugugauug agggacau 28
<210> 102
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 102
ugcuaucugu gauugaggg 19
<210> 103
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 103
gggugcuauc ugugauug 18
<210> 104
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 104
caugguuaau ggaauuguc 19
<210> 105
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 105
ggggugcuau cugugauuga gggacau 27
<210> 106
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 106
gggugcuauc ugugauuga 19
<210> 107
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 107
uaucugugau ugagggaca 19
<210> 108
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 108
gugaaacugg gcucaaggug a 21
<210> 109
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 109
ccugugaaac ugggcucaag guga 24
<210> 110
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 110
ggugcuaucu gugauugagg 20
<210> 111
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 111
cuaucuguga uugagggaca 20
<210> 112
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 112
ugaaacuggg cucaaggug 19
<210> 113
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p isomiR
<400> 113
ugugaaacug ggcucaaggu ga 22
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-mir-520f-3p isomiR
<400> 114
aagugcuucc uuuuagaggg u 21
<210> 115
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-mir-520f-3p isomiR
<400> 115
caagugcuuc cuuuuagagg gu 22
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR
<400> 116
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<210> 117
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR
<400> 117
cuucagccag gcuagugcag uc 22
<210> 118
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR
<400> 118
ucagccaggc uagugcaguc u 21
<210> 119
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR
<400> 119
uucagccagg cuagugcagu 20
<210> 120
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR
<400> 120
cuucagccag gcuagugcag ucug 24
<210> 121
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a-3p isomiR
<400> 121
aacuggccua caaaguccca 20
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a-3p isomiR
<400> 122
aacuggccua caaaguccca g 21
<210> 123
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p isomiR
<400> 123
uggaagacua gugauuuugu uguu 24
<210> 124
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p isomiR
<400> 124
uggaagacua gugauuuugu ug 22
<210> 125
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p isomiR
<400> 125
uggaagacua gugauuuugu uguuc 25
<210> 126
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p成熟miRNA正义
<400> 126
gcgaacgcgc cacggaccac cu 22
<210> 127
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p成熟miRNA正义
<400> 127
ucaaucacag auagcacccc u 21
<210> 128
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> has-miR-520f-3p 成熟miRNA正义
<400> 128
aacccucuaa aaggaagcac uu 22
<210> 129
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-mir-520f-3p-i3成熟miRNA正义
<400> 129
aacccucuaa aaggaagcac uug 23
<210> 130
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p成熟miRNA正义
<400> 130
agacugcacu agccuggcug aa 22
<210> 131
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a-3p成熟miRNA正义
<400> 131
acugggacuu uguaggccag uu 22
<210> 132
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p成熟miRNA正义
<400> 132
acaacaaaau cacuagucuu cca 23
<210> 133
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR正义
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> n是a、c、g或u
<400> 133
acgcgccacg gaccaccunn 20
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p isomiR正义
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n是a、c、g或u
<400> 134
aacgcgccac ggaccaccun n 21
<210> 135
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
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<220>
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<222> (19)..(20)
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<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n是a、c、g或u
<400> 191
cugcacuagc cuggcugaan n 21
<210> 192
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR正义
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(22)
<223> n是a、c、g或u
<400> 192
cugcacuagc cuggcugaag nn 22
<210> 193
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR正义
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n是a、c、g或u
<400> 193
acugcacuag ccuggcugan n 21
<210> 194
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR正义
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> n是a、c、g或u
<400> 194
ugcacuagcc uggcugaann 20
<210> 195
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p isomiR正义
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(24)
<223> n是a、c、g或u
<400> 195
gacugcacua gccuggcuga agnn 24
<210> 196
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a-3p isomiR正义
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> n是a、c、g或u
<400> 196
ggacuuugua ggccaguunn 20
<210> 197
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a-3p isomiR正义
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n是a、c、g或u
<400> 197
gggacuuugu aggccaguun n 21
<210> 198
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p isomiR正义
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(24)
<223> n是a、c、g或u
<400> 198
caacaaaauc acuagucuuc cann 24
<210> 199
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p isomiR正义
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(22)
<223> n是a、c、g或u
<400> 199
acaaaaucac uagucuucca nn 22
<210> 200
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p isomiR正义
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> n是a、c、g或u
<400> 200
acaacaaaau cacuagucuu ccann 25
<210> 201
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p模拟正义
<400> 201
gaacgcgcca cggaccaccu uu 22
<210> 202
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p模拟正义
<400> 202
aaucacagau agcaccccuu u 21
<210> 203
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> has-miR-520f-3p 模拟正义
<400> 203
cccucuaaaa ggaagcacuu 20
<210> 204
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-mir-520f-3p-i3模拟正义
<400> 204
cccucuaaaa ggaagcacuu g 21
<210> 205
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p模拟正义
<400> 205
agacugcacu agccuggcug aa 22
<210> 206
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a-3p模拟正义
<400> 206
ugggacuuug uaggccaguu 20
<210> 207
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p模拟正义
<400> 207
aacaaaauca cuagucuucc a 21
<210> 208
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p模拟正义
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (1)..(2)
<400> 208
gaacgcgcca cggaccaccu uu 22
<210> 209
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-323-5p模拟反义
<400> 209
aggugguccg uggcgcguuc gc 22
<210> 210
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p模拟正义
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (1)..(2)
<400> 210
aaucacagau agcaccccuu u 21
<210> 211
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-342-5p模拟反义
<400> 211
aggggugcua ucugugauug a 21
<210> 212
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-520f-3p模拟正义
<220>
<221> RNA
<222> (1)..(20)
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (1)..(2)
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (19)..(20)
<220>
<221> DNA
<222> (21)..(22)
<400> 212
cccucuaaaa ggaagcacuu tt 22
<210> 213
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-520f-3p模拟反义
<400> 213
aagugcuucc uuuuagaggg uu 22
<210> 214
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-520-i3-3p模拟正义
<220>
<221> RNA
<222> (1)..(21)
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (1)..(2)
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (20)..(21)
<220>
<221> DNA
<222> (22)..(23)
<400> 214
cccucuaaaa ggaagcacuu gtt 23
<210> 215
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-520-i3-3p模拟反义
<400> 215
caagugcuuc cuuuuagagg guu 23
<210> 216
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p模拟正义
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (1)..(1)
<400> 216
agacugcacu agccuggcug aa 22
<210> 217
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-3157-5p模拟反义
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (22)..(24)
<400> 217
uucagccagg cuagugcagu cuua 24
<210> 218
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a-3p模拟正义
<220>
<221> RNA
<222> (1)..(20)
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (1)..(2)
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (19)..(20)
<220>
<221> DNA
<222> (21)..(22)
<400> 218
ugggacuuug uaggccaguu tt 22
<210> 219
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-193a-3p模拟反义
<400> 219
aacuggccua caaaguccca gu 22
<210> 220
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p模拟正义
<220>
<221> RNA
<222> (1)..(21)
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (1)..(2)
<220>
<221> 2'-O-甲基核苷
<222> (20)..(21)
<220>
<221> DNA
<222> (22)..(23)
<400> 220
aacaaaauca cuagucuucc att 23
<210> 221
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hsa-miR-7-5p模拟反义
<400> 221
uggaagacua gugauuuugu ugu 23
<210> 222
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPRT1正向引物
<400> 222
tccaaagatg gtcaaggtcg c 21
<210> 223
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPRT1反向引物
<400> 223
cacgaagatc tgcattgtca agt 23
<210> 224
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UBS正向引物
<400> 224
cagccgggat ttgggtcg 18
<210> 225
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UBS反向引物
<400> 225
cacgaagatc tgcattgtca agt 23
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GUSB正向引物
<400> 226
tgcgtaggga caagaaccac 20
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GUSB反向引物
<400> 227
gggaggggtc caaggatttg 20
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mPPIH正向引物
<400> 228
aatcgagctc tttgcagacg 20
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mPPIH反向引物
<400> 229
tatcctatcg gaacgccatc 20
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mSDHA正向引物
<400> 230
gaggaagcac accctctcat 20
<210> 231
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mSDHA反向引物
<400> 231
ggagcggata gcaggaggta 20
<210> 232
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mMCL-1正向引物
<400> 232
taaggacgaa acgggactgg 20
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mMCL-1反向引物
<400> 233
cgccttctag gtcctgtacg 20
<210> 234
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mENTPD1正向引物
<400> 234
gccgaatgca tggaactgtc 20
<210> 235
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mENTPD1反向引物
<400> 235
ctgccgattg ttcgctttcc 20
<210> 236
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mKRAS正向引物
<400> 236
gtggatgagt atgaccctac ga 22
<210> 237
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mKRAS反向引物
<400> 237
ctcctcttga cctgctgtgt 20
<210> 238
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mTIM3正向引物
<400> 238
gcaggataca gttccctggt 20
<210> 239
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mTIM3反向引物
<400> 239
tctgagctgg agtgaccttg 20
<210> 240
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hMpp2正向引物
<400> 240
ccaggatgat gccaactggt 20
<210> 241
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hMpp2反向引物
<400> 241
atgctttccg cttctcctcc 20
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSTMN1正向引物
<400> 242
ccagaattcc ccctttcccc 20
<210> 243
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSTMN1反向引物
<400> 243
ccagctgctt caagacctca 20
<210> 244
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hYWHAZ正向引物
<400> 244
agaaaattga gacggagcta agaga 25
<210> 245
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hYWHAZ反向引物
<400> 245
agaagacttt gctctctgct tgtg 24
<210> 246
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCCNA2正向引物
<400> 246
cggtactgaa gtccgggaac 20
<210> 247
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCCNA2反向引物
<400> 247
tgctttccaa ggaggaacgg 20
<210> 248
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hNT5E正向引物
<400> 248
aacaacctga gacacacgga 20
<210> 249
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hNT5E反向引物
<400> 249
tggattccat tgttgcgttc a 21
<210> 250
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hENTPD1正向引物
<400> 250
gcttcttgtg ctatgggaag ga 22
<210> 251
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hENTPD1反向引物
<400> 251
gatgaaagca tgggtccctg a 21

Claims (18)

1.一种包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含二氨基脂质和miRNA或miRNA的来源，其中
i)所述miRNA是miRNA分子、isomiR或其模拟物，并且是抗癌miRNA，其中优选地，其是具有种子序列的寡核苷酸，所述种子序列包含SEQ ID NO:17-50所示种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且其中优选地，所述miRNA选自下组：miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物，和其中
ii)所述二氨基脂质为通式(I)
Figure FDA0002717738470000011
其中，
n是0、1或2，和
T1、T2和T3各自独立地是C10-C18链，其具有任选的不饱和基团并具有0、1、2、3或4个取代，其中所述取代选自下组：C1-C4烷基、C1-C4烯基和C1-C4烷氧基。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述miRNA是：
i).miRNA-323-5p分子，miRNA-323-5p isomiR或miRNA-323-5p模拟物，或
ii).miRNA-342-5p分子，miRNA-324-5p isomiR或miRNA-324-5p模拟物，或
iii).miRNA-520f-3p分子，miRNA-520f-3p isomiR或miRNA-520f-3p模拟物，或
iv).miRNA-520f-3p-i3分子，miRNA-520f-3p-i3 isomiR或miRNA-520f-3p-i3模拟物，或
v).miRNA-3157-5p分子，miRNA-3157-5p isomiR或miRNA-3157-5p模拟物，或
vi).miRNA-193a-3p分子，miRNA-193a-3p isomiR或miRNA-193a-3p模拟物，或
vii).miRNA-7-5p分子，miRNA-7-5p isomiR或miRNA-7-5p模拟物。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中miRNA的来源是miRNA的前体并且是长度为至少50个核苷酸的寡核苷酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，
其中所述miRNA与SEQ ID NO:51-125、209、211、213、215、217、219或221中任一项具有至少70％序列相同性，
和/或其中所述miRNA的长度为15-30个核苷酸，
并且其中所述miRNA的来源是所述miRNA的前体并且与SEQ ID NO:1-16中任一项，优选与SEQ ID NO:1-8中任一项具有至少70％序列相同性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其还包含其他miRNA或其前体，其中所述miRNA选自下组：miRNA-193a，miRNA-323，miRNA-342，miRNA-520f，miRNA-520f-i3，miRNA-3157，和miRNA-7，或其isomiR，或其模拟物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，所述二氨基脂质为通式(I)，其中T1、T2和T3各自独立地选自下组：法呢基，月桂基，十三烷基，肉豆蔻基，十五烷基，鲸蜡基，黄油基，硬脂基，α-亚油烯基，γ-亚油烯基，亚油基，硬脂四烯基，11-十八碳烯基，油基，反式油基，棕榈油基和3,7,11-三甲基十二烷基。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，所述二氨基脂质为通式(I)，其中n是1。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中，所述二氨基脂质为通式(I)，其中T1、T2和T3相同。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其还包含甾醇，优选选自下组：阿多甾醇，菜子甾醇，芸苔甾醇，胆钙化醇，胆甾烯二酮，胆甾烯醇，胆固醇，δ-7-豆甾醇，δ-7-燕麦甾醇，二氢速甾醇，二甲基胆固醇，麦角钙化甾醇，麦角甾醇，麦角甾烯醇，麦角甾三烯醇，麦角甾二烯醇，乙基胆甾烯醇，梭链孢酸，羊毛甾醇，非胆甾二烯醇，β-谷甾醇，菠菜甾醇，豆甾烷醇，豆甾烯醇，豆甾二烯醇，豆甾二烯酮，豆甾醇和豆甾烯酮，更优选胆固醇。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其还包含磷脂，优选地，其选自下组：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)，二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，1,2-二油酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺(DOP)，蛋磷脂酰胆碱(EggPC)，大豆磷脂酰胆碱(SoyPC)，更优选二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其还包含水溶性聚合物和亲脂性锚固物的偶联物，其中：
i).所述水溶性聚合物选自下组：聚(乙二醇)(PEG)，聚(羟乙基-1-天冬酰胺)(PHEA)，聚(羟乙基-L-谷氨酰胺)(PHEG)，聚(谷氨酸)(PGA)，聚甘油(PG)，聚(丙烯酰胺)(PAAm)，聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)，聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(PHPMA)和聚(2-噁唑啉)(POx)，优选聚(乙二醇)，
且其中：
ii).所述亲脂性锚固物选自下组：甾醇、脂质和维生素E衍生物。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中，所述纳米颗粒包含：
i).20-60mol％的二氨基脂质，和
ii).0-40mol％的磷脂，和
iii).30-70mol％的甾醇，和
iv).0-10mol％如权利要求11中所限定的水溶性聚合物和亲脂性锚固物的偶联物。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其用作药物。
14.如权利要求13所述用途的组合物，其用于治疗、预防、延缓或改善癌症。
15.如权利要求13或14所述用途的组合物，或如权利要求1所限定的抗癌miRNA，其用于通过下调免疫抑制性肿瘤微环境来治疗、预防、延缓或改善癌症。
16.如权利要求15所述用途的组合物或所述用途的抗癌miRNA，其中，所述抗癌miRNA是miRNA-193a，或其isomiR，或其模拟物，或其前体。
17.如权利要求15或16所述用途的组合物或所述用途的抗癌miRNA，用于通过促进或增加癌细胞中的G2/M停滞来治疗、预防、延缓或改善癌症。
18.一种用于刺激miRNA细胞摄取的体内、体外或离体方法，所述方法包括将细胞与如权利要求1-12中任一项中所限定的组合物接触的步骤。
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