CN113164484A - 具有降低的神经毒性的hsv载体 - Google Patents

Abstract

提供了具有修饰的溶瘤疱疹病毒基因组的重组单纯疱疹病毒，其中所述修饰的疱疹病毒基因组具有与ICP34.5基因的第一拷贝、或者第一拷贝和第二拷贝可操作地连接的至少一个miRNA靶序列。还提供了具有这种重组单纯疱疹病毒的药物组合物，以及使用这种组合物治疗患有癌症的对象的方法。

Description

具有降低的神经毒性的HSV载体

相关申请的交叉引用

本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年11月29日提交的美国临时专利申请号62/773,119的权益，所述申请通过引用整体并入本文用于所有目的。

发明领域

本发明一般涉及具有降低的神经毒性的HSV载体。

背景

溶瘤病毒疗法已经被认为是用于癌症治疗的有前景的新治疗方法，因为溶瘤病毒引起强的肿瘤溶瘤并诱导全身肿瘤特异性免疫，同时引起比化学疗法或放射治疗显著更少的副作用。

在各种OV中，基于单纯疱疹病毒1型(“HSV-1”)的OV是最先进的，例如，基于疱疹病毒的OV(T-Vec)已经被美国FDA批准用于治疗黑色素瘤。HSV载体的代表性实例包括美国专利号7,223,593、7,537,924、7,063,835、7,063,851、7,118,755、8,277,818和8,680,068中所述的那些。

溶瘤疱疹病毒载体的一个困难是HSV的亲神经性质。神经侵染性主要由病毒蛋白ICP34.5介导，产生了从用于溶瘤病毒疗法的载体中缺失ICP34.5的常见策略。然而，ICP34.5的完全缺失使病毒在宽范围的组织中复制的能力降低了大约10倍。本发明克服了与当前HSV载体相关的某些困难，并进一步提供了其它相关的优点。

在背景部分中讨论的所有主题不一定是现有技术，并且不应该仅仅因为其在背景部分中讨论就被认为是现有技术。按照这些方式，在背景部分讨论的现有技术中或与这种主题相关的问题的任何认识不应被视为现有技术，除非明确地陈述为现有技术。相反，对背景部分中的任何主题的讨论应当被视为发明人对特定问题的方法的一部分，这本身也可能是有创造性的。

发明内容

简而言之，本申请涉及包含至少一个ICP34.5基因的重组单纯疱疹病毒(也称为“oHSV载体”)，所述ICP34.5基因在ICP34.5的3'非翻译区中具有至少两个miRNA靶序列。在某些实施方案中，所述至少两个miRNA靶序列是相同miRNA的靶标。在其它实施方案中，所述至少两个miRNA靶序列是选自以下的miRNA的靶标：mIR-122、miR-124、miR-124*、miR-127、miR-128、miR-129、miR-129*、miR-132、mIR-133a、mIR133b、miR-135b、miR-136、miR-136*、miR-137、miR-139-5p、miR-143、mIR-145、miR-154、miR-184、miR-188、miR-204、mIR216a、miR-299、miR-300-3p、miR-300-5p、miR-323、miR-329、miR-337、miR-335、miR-341、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-376a、miR-376a*、miR-376b-3p、miR-376b-5p、miR-376c、miR-377、miR-379、miR-379*、miR-382、miR-382*、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-431、miR-433、miR-434、miR-451、miR-466b、miR-485、miR-495、miR-539、miR-541、miR-543*、miR-551b、miR-758和miR-873。按照惯例，更常被发现为最终产物的链被称为miRNA，较稀有的伴侣被称为miRNA*。

在其它实施方案中，重组单纯疱疹病毒还包含修饰的ICP27或ICP4基因，其中修饰是5'UTR、启动子调节区或5'UTR和启动子调节区的替代。在一些实施方案中，5'UTR来源于FGF基因。

在某些实施方案中，重组单纯疱疹病毒还包含编码至少一种免疫刺激因子、检查点阻断肽或两者的基因序列。

本公开内容还提供了治疗癌症的方法，其包括施用包含至少一个ICP34.5基因的重组单纯疱疹病毒，所述ICP34.5基因在ICP34.5的3'非翻译区中具有至少两个miRNA靶序列。

本发明内容已经被提供来以简化的形式介绍某些概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步详细描述。除非另有明确说明，否则本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键或必要特征，也不旨在限制所要求保护的主题的范围。

在下面的描述中阐述了一个或多个实施方案的细节。结合一个示例性实施方案示出或描述的特征可以与其它实施方案的特征组合。根据说明书，附图和权利要求书，其它特征，目的和优点将是显而易见的。另外，本文引用的所有专利和专利申请的公开内容通过引用以其整体并入。

附图的简要说明

从附图和以下对各种实施方案的详细描述中，本公开的示例性特征，其性质和各种优点将是显而易见的。参考附图描述了非限制性和非穷举的实施方案，其中除非另有说明，否则在各个视图中类似的标记或参考数字表示类似的部分。附图中的元件的尺寸和相对位置不必按比例绘制。例如，选择，放大和定位各种元件的形状以提高图的可读性。为了易于在附图中识别，已经选择了所绘制的元件的特定形状。在下文中参考附图描述一个或多个实施方案，其中：

图1是在ICP34.5的3'非翻译区中具有三个不同miRNA靶标的示例性HSV载体的示意图。

图2是具有修饰的γ34.5基因和修饰的ICP4或ICP27基因的示例性HSV载体的示意图。

图3是显示ICP27、ICP4和ICP47在正常小鼠和携带人脑肿瘤(U87)的小鼠的脑中的表达水平的图。

图4是显示ICP34.5和β-肌动蛋白在神经元和肿瘤细胞(LNCaP和A549)中表达的蛋白质印迹。

图5是转录和翻译双调节病毒的示意图。

图6描述了可以用于平台病毒的各种调节元件。

图7是颅内注射CXCR4-TF-Fc-h1215病毒或CXCR4-TF-Fc-h1215-miR病毒后鼠脑切片的照片。用兔多克隆抗HSV一抗和荧光大鼠抗兔二抗对脑切片进行染色。

图8A、8B和8C是在各种MOI下病毒感染后细胞存活的图。图8A显示肺肿瘤细胞A549和正常肺细胞BEAS-2b的细胞存活。图8B显示肺肿瘤细胞A549和正常肺细胞HPL1D的细胞存活。图8C显示肺肿瘤细胞A549、PC9、H460、H23S、H1975的细胞存活。

图9是显示VG182LF病毒在A549肺肿瘤细胞和BEAS-2b正常肺细胞中复制的图。

图10是显示用hVG161或hVG182LF感染后A549肺肿瘤细胞和LNCaP前列腺肿瘤细胞中IL-12增加(增加倍数)的条形图。

图11A、11B和11C描述了VG182LF病毒在各种肺肿瘤细胞中的复制。图11A：H1975细胞。图11B：H460细胞。图11C：PC9细胞。

图12是显示在用媒介物或VG182LF病毒处理后1周时携带H1975肿瘤的裸鼠中的肿瘤大小的图。

图13A和13B公开了肿瘤中微RNA的选择列表。这些微RNA可以在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed的PubMed和在http://www.mirbase.org/的微RNA数据库(“mIRBASE”)中找到，所有这些通过引用以其整体并入。

图14A、14B和14C分别是显示在293FT细胞中在感染后6小时miR-143的转染效率、在感染后6小时病毒基因表达和在感染后24小时病毒复制的图。

图15是显示鼠脑和脊髓切片的HSV-1免疫染色的照片。向小鼠皮下注射对照媒介物、野生型HSV-1、缺失ICP34.5的HSV-1变体(VG161)或编码ICP34.5的3'UTR中的miR-143和miR-124的结合位点以及gB的羧基末端中的融合突变(gB-876t)的变体(VG301)。

图16是显示皮下注射野生型HSV-1、缺失ICP34.5的HSV-1变体(VG161)或编码ICP34.5的3'UTR中的miR-143和miR-124的结合位点以及gB的羧基末端中的融合突变(gB-876t)的变体(VG301)的小鼠的存活曲线的图。

图17是显示融合测定结果的照片，其中将细胞固定并且进行吉姆萨染色(Giemsastained)以使由病毒诱导的细胞融合产生的病毒蚀斑和合胞体可视化。用在gB的羧基末端有(+gB-876t)或没有(-gB-876t)融合突变的重组溶瘤HSV-1感染细胞。

发明的详细描述

通过参考本发明的优选实施方案的以下详细描述和本文包括的实施例，可以更容易地理解本发明。

本文所用的术语“微RNA”或“miRNA”是指在包括动物和植物在内的多种有机体中表达的短的(通常为21-25个核苷酸)内源性单链RNA家族。在人体中表达了超过1000种独特的miRNA。miRNA与在信使RNA(mRNA)中发现的特异性靶序列结合。与mRNA分子中的互补或部分互补序列(靶序列)的结合导致通过mRNA切割的基因表达的下调，由其多聚A尾的缩短而增加的降解以及直接的翻译阻抑。肿瘤中的微RNA的选择列表(连同相关的参照)提供在图13A和13B中，所述列表和相关的参照通过引用以其整体并入。

术语“溶瘤疱疹病毒”或“oHSV”通常是指能够在肿瘤细胞中复制并杀伤肿瘤细胞的疱疹病毒。在某些实施方案中，可以对病毒进行工程改造以便更选择性地靶向肿瘤细胞。溶瘤疱疹病毒的代表性实例描述于美国专利号7,223,593、7,537,924、7,063,835、7,063,851、7,118,755、8,216,564、8,277,818和8,680,068中，其全部通过引用以其整体并入。

本文所用的“治疗(treat)”或“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的临床结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病况、减少疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病传播、延缓或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态、减少疾病复发和缓解(无论是部分或全部)，无论是可检测的或不可检测的。术语“治疗”也可以指与未接受治疗的预期存活相比延长的存活。

癌症的代表性形式包括癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和肉瘤。其它实例包括但不限于胆管癌，脑癌(例如成胶质细胞瘤)，乳腺癌，子宫颈癌，结肠直肠癌，CNS(例如听神经瘤，星形细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，成胶质细胞瘤，成血管细胞瘤，成髓细胞瘤，脑膜细胞瘤，成神经细胞瘤，少突神经胶质瘤，松果体瘤和视网膜母细胞瘤)，子宫内膜癌，造血细胞癌(例如白血病和淋巴瘤)，肾癌，喉癌，肺癌，肝癌，口腔癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，皮肤癌(例如黑色素瘤和鳞状细胞癌)和甲状腺癌。癌症可以包括实体瘤(例如，肉瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤和成骨肉瘤)、弥漫性肿瘤(例如，白血病)或这些肿瘤的一些组合(例如，具有实体瘤和播散性或弥漫性癌细胞的转移性癌症)。癌症也可以耐受常规治疗(例如常规化学疗法和/或放射疗法)。

特别优选的待治疗的癌症包括肺肿瘤、乳腺和前列腺肿瘤、成胶质细胞瘤、胃肠道(和相关器官)的肿瘤，例如食道、胆管癌、肛门、胃、肠、胰腺、结肠和肝脏以及所有表面可注射肿瘤(例如黑色素瘤)。

良性肿瘤和其它不需要的细胞增殖病况也可被治疗。

为了进一步理解本文中的各种实施方案，提供了描述各种实施方案的以下部分：A.溶瘤疱疹病毒；B.微RNA；C.治疗组合物以及D.施用。

A.溶瘤疱疹病毒

单纯疱疹病毒(HSV)1和2是感染人的疱疹病毒科的成员。HSV基因组含有两个独特的区域，它们被命名为独特的长(U_L)区域和独特的短(U_S)区域。这些区域中的每一个的侧翼是一对反向末端重复序列。大约有75个已知的开放阅读框。已经对病毒基因组进行了工程改造以开发用于例如癌症治疗的溶瘤病毒。HSV的肿瘤选择性复制可以通过HSV ICP34.5(也称为γ34.5)基因的突变赋予。HSV含有两个拷贝的ICP34.5。已知灭活ICP34.5基因的一个或两个拷贝的突变体缺乏神经毒力，即是无毒力/非神经毒力的并且是溶瘤的。HSV的肿瘤选择性复制也可以通过控制关键病毒基因(如ICP27和/或ICP4)的表达来赋予。

合适的溶瘤HSV可以来源于HSV-1或HSV-2，包括任何实验室毒株或临床分离物。在一些实施方案中，oHSV可以是或可以来源于实验室毒株HSV-1毒株17,HSV-1毒株F或HSV-2毒株HG52中的一种。在其它实施方案中，它可以是或来源于非实验室毒株JS-1。其它合适的HSV-1病毒包括HrrR3(Goldstein和Weller,J.Virol.62，196-205，1988)，G2O7(Mineta等人，Nature Medicine.1(9):938-943,1995；Kooby等人，The FASEB Journal,13(11):1325-1334,1999)；G47Δ(Todo等人，Proceedings of the National Academy ofSciences.2001；98(11):6396-6401)；HSV 1716(Mace等人，Head&Neck,2008；30(8):1045-1051；Harrow等人，Gene Therapy.2004；11(22):1648-1658)；HF10(Nakao等人，CancerGene Therapy.2011；18(3):167-175)；NV1020(Fong等人，Molecular Therapy,2009；17(2):389-394)；T-VEC(Andtbacka等人，Journal of Clinical Oncology,2015:33(25):2780-8)；J100(Gaston等人，PloS one,2013；8(11):e81768)；M002(Parker等人，Proceedings of the National Academy of Sciences,2000；97(5):2208-2213)；NV1042(Passer等人，Cancer Gene Therapy.2013；20(1):17-24)；G2O7-IL2(Carew等人，Molecular Therapy,2001；4(3):250-256)；rQNestin34.5(Kambara等人，CancerResearch,2005；65(7):2832-2839)；G47Δ-mIL-18(Fukuhara等人，Cancer Research,2005；65(23):10663-10668)；以及题目为“HSV Vectors with Enhanced Replication inCancer Cells”的PCT公开PCT/US2017/030308和题目为“Compositions and Methods ofUsing Stat1/3Inhibitors with Oncolytic Herpes Virus”的PCT/US2017/018539中公开的那些载体，以上所有通过引用整体并入本文中。

oHSV载体具有至少一个γ34.5基因，其在如本文公开的其3'UTR中用miRNA靶序列修饰；载体中没有未修饰的γ34.5基因。在一些实施方案中，oHSV具有两个修饰的γ34.5基因；在其它实施方案中，oHSV仅具有一个γ34.5基因，并且其被修饰。在一些实施方案中，修饰的γ34.5基因是在体外构建的，并且作为病毒基因的替代物插入到oHSV载体中。当修饰的γ34.5基因仅是一个γ34.5基因的替代物时，另一个γ34.5被缺失。可以缺失天然γ34.5基因中的任一个。在一个实施方案中，缺失包含γ34.5基因和ICP4基因的末端重复。如本文所讨论的，修饰的γ34.5基因可以包含另外的变化，如具有外源启动子。

oHSV可以具有另外的突变，其可以包括失能突变(例如，缺失，取代，插入)，其可以影响病毒的毒力或其复制能力。例如，可在ICP6,ICPO,ICP4,ICP27,ICP47,ICP 24,ICP56中的任何一个或多个中进行突变。优选地，这些基因之一中的突变(任选地在基因的两个拷贝中，如果合适的话)导致HSV不能(或降低能力)表达相应的功能多肽。在一些实施方案中，病毒基因的启动子可以被在靶细胞中具有选择性活性的启动子取代，或者在递送诱导物时是可诱导的，或者在细胞事件或特定环境中是可诱导的。

在某些实施方案中，ICP4或ICP27的表达由外源启动子，例如肿瘤特异性启动子控制。示例性的肿瘤特异性启动子包括存活素、CEA、CXCR4、PSA、ARR2PB或端粒酶；其它合适的肿瘤特异性启动子可以是对单一肿瘤类型特异的，并且是本领域已知的。可以存在其它元件。在一些情况下，存在增强子如NFkB/oct4/sox2增强子。同样，5'UTR可以是外源的，如来自生长因子基因如FGF的5'UTR。对于示例性构建体，参见图2。

oHSV也可以具有非HSV起源的基因和核苷酸序列。例如，编码前药的序列、编码细胞因子或其它免疫刺激因子的序列、肿瘤特异性启动子、诱导型启动子、增强子、与宿主细胞同源的序列等可以在oHSV基因组中。示例性序列编码IL12、IL15、IL15受体α亚基、OX40L、PD-L1阻断剂或PD-1阻断剂。对于编码产物的序列，它们与启动子序列和表达所必需或期望的其它调节序列(例如，增强子、聚腺苷酸化信号序列)可操作地连接。

病毒基因的调节区可以被修饰以包含影响表达的响应元件。示例性响应元件包括NF-κB的响应元件、Oct-3/4-SOX2、增强子、沉默子、cAMP响应元件、CAAT增强子结合序列和绝缘体。也可包括其它响应元件。病毒启动子可以用不同的启动子替代。启动子的选择将取决于许多因素，例如所提议的HSV载体的使用，患者的治疗，疾病状态或病症，以及应用诱导物(对于诱导型启动子)的容易性。为了治疗癌症，通常当启动子被替代时，它将被细胞特异性或组织特异性或肿瘤特异性启动子替代。肿瘤特异性、细胞特异性和组织特异性启动子是本领域已知的。也可修饰其它基因元件。例如，病毒基因的5'UTR可以被外源UTR替代。

B.微RNA

如上所述，本发明提供了具有至少两个miRNA靶序列的oHSV。简而言之，miRNA与其在mRNA中的靶序列结合，所述靶序列通常在3'-非翻译区(3'-UTR)中。结合可以起始或需要称为“种子区”的区域，该区域位于miRNA的5'末端约核苷酸2-8的位置。当存在部分互补性时，5'-末端倾向于比3'-末端与靶序列具有更多的同一性。较高量的互补性可以增强mRNA的阻抑，尤其是通过mRNA切割。

单独的miRNA和miRNA组可以在某些组织类型中唯一地或优先地表达。神经元细胞富含或独享的miRNA包括mIR-122、miR-124、miR-124*、miR-127、miR-128、miR-129、miR-129*、miR-132、mIR-133a、mIR133b、miR-135b、miR-136、miR-136*、miR-137、miR-139-5p、miR-143、mIR-145、miR-154、miR-184、miR-188、miR-204、mIR216a、miR-299、miR-300-3p、miR-300-5p、miR-323、miR-329、miR-337、miR-335、miR-341、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-376a、miR-376a*、miR-376b-3p、miR-376b-5p、miR-376c、miR-377、miR-379、miR-379*、miR-382、miR-382*、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-431、miR-433、miR-434、miR-451、miR-466b、miR-485、miR-495、miR-539、miR-541、miR-543*、miR-551b、miR-758和miR-873。按照惯例，更常被发现为最终产物的链被称为miRNA，较稀有的伴侣被称为miRNA*。肿瘤中的微RNA的选择列表(连同相关的参照)提供在图13A和13B中，所述列表和相关的参照通过引用以其整体并入。

将miRNA靶序列插入到γ34.5基因的3'UTR中。存在至少两个串联插入的miRNA靶序列。可以存在至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少十个等靶序列。在其它实施方案中，存在少于10、20、50或100个靶序列。可以通过测定ICP34.5的表达水平来确定靶序列的最佳数目。需要低至不存在水平的ICP34.5。多个miRNA靶序列可以全部结合相同的miRNA或可以结合不同的miRNA。靶序列可以是成簇的(例如，图1)，其中例如，存在至少两个串联的结合第一miRNA的靶序列，随后存在至少两个串联的结合第二miRNA的靶序列，随后存在至少两个结合第三miRNA的靶序列。可选地，结合不同miRNA的多个miRNA靶序列可以不是特定的顺序。同样，每个miRNA靶序列可能只有一个拷贝。在一些实施方案中，存在3-5种不同的miRNA靶标。在其它实施方案中，每个靶序列有3-5个拷贝。在其它实施方案中，存在3-5种不同的miRNA靶标，以及这些成簇靶序列中的每一个有3-5个拷贝。对于示例性构建体，参见图1。

多个miRNA靶序列可以是相邻的而没有介于中间的核苷酸，或者具有1至约25个、或1至约20个、或1至约15个、或1至约10个、或1至约5个、或3至约10个、或5至约10个介于中间的核苷酸。可以选择具有与3'UTR类似的G+C含量的介于中间的核苷酸，并且优选不含有聚腺苷酸化信号序列。选择介于中间的核苷酸的其它考虑是本领域已知的。

在本发明的某些实施方案中，如本文所述的oHSV被构建成使用转录和翻译双调节(也称为“TTDR”)。这种载体的一个示例性说明提供在图5中。简而言之，在某些优选的实施方案中，ICP34.5基因的翻译控制是通过在ICP34.5基因的3'-UTR中插入5个拷贝的miR-124和miR-143结合位点而获得的。平台病毒载体的关键元件也可以包括使用肿瘤特异性启动子对ICP27基因(病毒复制所必需的基因)的转录控制。

多种HSV-1毒株可以用作构建重组溶瘤病毒的主链，包括毒株17、毒株KOS、毒株F和毒株McKrae。可以使用在克隆到细菌人工染色体(BAC)中的HSV-1基因组上实施的标准λRed介导的重组工程技术在大肠杆菌中进行所有病毒诱变(一般参见：Tischer BK,SmithGA,Osterrieder N.Methods Mol Biol.2010；634:421-30.doi:10.1007/978-1-60761-652-8_30.PMID:20677001；Tischer BK,von Einem J,Kaufer B和Osterrieder N.,BioTechniques 40:191-197,Feb.2006(包括补充材料，doi:10.2144/000112096；以及Tischer BK,Smith,GA和Osterrieder N.Chapter 30,Jeff Braman(ed.),In VitroMutagenesis Protocols:Third Edition,Methods in Molecular Biology,vol.634,doi:10.1007/978-1-60761-652-8_30,Springer Sceince+Business Media,LLC2010)。

肿瘤特异性启动子也可以用于驱动编码免疫调节剂IL12/IL15/IL15RA(其加强抗肿瘤免疫应答)的盒的表达。免疫调节剂表达盒可以由hCEA、hCXCR4或PSA启动子控制，并插入到病毒基因组中对病毒基因表达和复制没有负面影响的位置，如在病毒基因US1/US2、UL3/UL4和/或UL50/UL51之间。为了促进在多种小鼠模型中进行体内测试，可以构建表达鼠IL12而不是人IL12的其它重组病毒。人IL15由于其在小鼠细胞中的活性而可以被保留在小鼠特异性溶瘤病毒中。

载体可以包含编码缺乏C-末端R肽的长臂猿白血病病毒(GALV)env蛋白的融合形式的表达盒，其增强了病毒的细胞毒性。在其它实施方案中，表达盒可以编码融合形式的HSV-1糖蛋白B。在某些优选的实施方案中，糖蛋白B可以被截短(例如，在gB的氨基酸876之后发生缺失(“gB-876t”)。可以将该盒插入到病毒基因组中对病毒基因表达和复制没有负面影响的位置，如在病毒基因US1/US2、UL3/UL4和/或UL50/UL51之间。

BAC重组工程需要病毒基因组中存在外源BAC DNA以促进大肠杆菌中的诱变。BAC序列最通常地插入病毒基因如US1/US2、UL3/UL4和/或UL50/UL51之间，或插入胸苷激酶(TK)基因中，其可以破坏天然TK的表达。TK缺陷型病毒载体可以包含在插入病毒基因组的非编码区的组成型启动子控制下的HSV-1胸苷激酶(TK)基因的表达盒。外源TK基因的存在通过使病毒对鸟苷类似物(如更昔洛韦和阿昔洛韦)的常见治疗敏感来增强病毒安全性。

在替代实施方案中，最初被破坏的TK可以被恢复，而不是插入另一个TK，或者TK基因可以被破坏并且根本不被替代或恢复，以便进一步降低神经毒性(因为TK无效病毒不能从潜伏期重新激活)。即使TK被破坏，病毒仍将对用功能不依赖于TK的药物的治疗敏感。例如，膦甲酸和西多福韦抑制病毒DNA聚合酶并且不是TK依赖性的。

驱动关键HSV-1转录调节子ICP27表达的启动子可以被肿瘤特异性启动子如hCEA、hCXCR4、PSA或Probasin(ARR2PB)替代。编码神经毒力因子ICP34.5的病毒基因的3'UTR也可以通过插入多拷贝的微RNA识别元件来修饰，以消除在含有高水平的相应微RNA的组织中产生ICP34.5。在示例性实施方案中，可以将5个拷贝的miR-124和5个拷贝的miR-143识别元件串联插入ICP34.5的3'UTR中。

可以完全缺失病毒基因组的末端重复区，以减小整体基因组大小并且为转基因插入创造更多的空间；对缺失的TR进行工程改造以避免破坏ICP47基因的天然启动子，其通常是末端重复的一部分。可以通过缺失内部重复区而不是末端重复区来进行类似的修饰。本文讨论的示例性元件的进一步细节示出在图6中。

C.治疗组合物

提供了可以用于预防，治疗或改善疾病(例如癌症)的影响的治疗组合物。更具体地，提供了包含至少一种如本文所述的溶瘤病毒的治疗组合物。

在某些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。短语“药学上可接受的载体”是指包括任何载体，稀释剂或赋形剂，其不干扰溶瘤病毒的生物活性的有效性并且对其施用的对象无毒(一般参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日和在美国PharmacopE1A中：国家配方(USP 40-NF 35和补充剂)。

在本文所述的溶瘤病毒的情况下，合适的药物载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液，水，乳剂(如油/水乳剂)，各种类型的润湿剂，无菌溶液等。其它药学上可接受的载体包括凝胶，生物可吸附的基质材料，含有溶瘤病毒的植入元件，或任何其它合适的媒介物，递送或分配装置或材料。这样的载体可以通过常规方法配制并且可以以有效剂量施用于对象。其它药学上可接受的赋形剂包括但不限于水，盐水，聚乙二醇，透明质酸和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括在其中，例如无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等)和有机酸的盐(例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等)。可用于将oHSV递送至癌细胞的这种药学上可接受的(药物级)载体，稀释剂和赋形剂将优选不在接受组合物的个体(对象)中诱导免疫应答(并且将优选在没有过度毒性的情况下施用)。

本文提供的组合物可以以各种浓度提供。例如，可以提供约10⁶至约10⁹pfu的溶瘤病毒剂量。在进一步的实施方案中，剂量可以在约10⁶至约10⁸pfu/ml的范围内，在每2-3周的治疗中，向具有大病变(例如，>5cm)的患者中注射多达4ml和具有小病变(例如，<0.5cm)的患者中注射较小量(例如，多达0.1ml)。

在本发明的某些实施方案中，可以使用低于标准的剂量。因此，在某些实施方案中，可以向患者施用小于约10⁶pfu/ml(每2-3周将多达4ml注射到患者中)。

组合物可以在有助于稳定储存寿命的温度下储存，并且包括室温(约20℃)、4℃、-20℃、-80℃和在液N2中。因为预期用于体内使用的组合物通常不含防腐剂，所以储存通常在较冷的温度下进行。组合物可以干燥(例如冻干)或以液体形式储存。

D.施用

除了本文所述的组合物之外，还提供了使用这种组合物治疗或改善癌症的各种方法，包括向对象施用有效剂量或有效量的本文所述的oHSV的步骤。

术语“有效剂量”和“有效量”是指足以实现目标癌症的治疗的溶瘤病毒的量，例如，有效降低目标肿瘤大小或负荷或以其它方式阻碍目标肿瘤细胞生长速率的量。更具体地，此术语是指在必要的剂量和治疗期下有效获得所需结果的溶瘤病毒的量。例如，在治疗癌症的上下文中，本文所述的组合物的有效量是诱导缓解、减轻肿瘤负荷和/或防止肿瘤扩散或癌症生长的量。有效量可根据诸如对象的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物制剂、施用途径等因素而变化，但仍可由本领域技术人员常规确定。

将治疗组合物施用于诊断患有癌症或怀疑患有癌症的对象。对象可以是人或非人动物。

组合物用于治疗癌症。本文所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的临床结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病症、减少疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病传播、延缓或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态、减少疾病复发和缓解(无论是部分或全部)，无论是可检测的或不可检测的。术语“治疗”也可以指与未接受治疗的预期存活相比延长的存活。

癌症的代表性形式包括癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和肉瘤。其它实例包括但不限于胆管癌，脑癌(例如成胶质细胞瘤)，乳腺癌，子宫颈癌，结肠直肠癌，CNS(例如听神经瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、成血管细胞瘤、成髓细胞瘤、脑膜细胞瘤、成神经细胞瘤、少突神经胶质瘤、松果体瘤和视网膜母细胞瘤)，子宫内膜衬癌，造血细胞癌(例如白血病和淋巴瘤)，肾癌，喉癌，肺癌，肝癌，口腔癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，皮肤癌(例如黑色素瘤和鳞状细胞癌)、GI(例如食道癌、胃癌和结肠癌)和甲状腺癌。癌症可以包括实体瘤(例如，肉瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤和成骨肉瘤)、弥漫性肿瘤(例如，白血病)或这些肿瘤的一些组合(例如，具有实体瘤和播散性或弥漫性癌细胞的转移性癌症)。癌症也可以耐受常规治疗(例如常规化学疗法和/或放射疗法)。

特别优选的待治疗的癌症包括肺肿瘤、乳腺和前列腺肿瘤、成胶质细胞瘤、胃肠道(和相关器官)的肿瘤，例如食道、胆管癌、肛门、胃、肠、胰腺、结肠和肝脏以及所有表面可注射肿瘤(例如黑色素瘤)。良性肿瘤和其它不需要的细胞增殖病症也可被治疗。

本文所述的重组单纯疱疹病毒可以通过例如口服，局部，肠胃外，全身，静脉内，肌内，眼内，鞘内，肿瘤内，皮下或透皮途径给药。在某些实施方案中，溶瘤病毒可以通过套管，导管或直接注射来递送。施用部位可以是肿瘤内或远离肿瘤的部位。施用途径通常取决于所靶向的癌症的类型。

溶瘤病毒的最佳或合适的剂量方案在本领域技术的范围内，由主治医师基于患者数据，患者观察结果和各种临床因素，包括例如对象的大小，体表面积，年龄，性别和所施用的具体溶瘤病毒，施用时间和途径，所治疗的癌症的类型，患者的一般健康状况以及患者所接受的其它药物疗法容易地确定。根据某些实施方案，使用本文所述的溶瘤病毒的对象的治疗可以与其他类型的治疗组合，例如使用例如化学治疗剂如依托泊苷、异环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强力霉素等的化学疗法。

本文所述的重组单纯疱疹病毒可以配制为用于临床使用的药物和药物组合物，并且可以与药学上可接受的载体，稀释剂，赋形剂或佐剂组合。制剂将至少部分地取决于施用途径。合适的制剂可以包含在无菌介质中的病毒和抑制剂。制剂可以是液体，凝胶，糊剂或固体形式。可将制剂提供给对象或医学专业人员。

优选施用治疗有效量。这是足以对对象显示益处的量。施用的实际量和施用的时程至少部分取决于癌症的性质，对象的状况，递送的部位和其它因素。

在本发明的其它实施方案中，溶瘤病毒可以通过多种方法施用，例如肿瘤内，静脉内或在肿瘤手术切除后施用。

本文中已经广泛和一般地描述了本发明。落入一般性公开内容内的较窄种类和次一般性分组中的每一个也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述，其条件或负面限制将任何主题从类中去除，而不管所去除的材料是否在本文中具体陈述。

以下是本公开内容的另外的示例性实施方案：

1)重组单纯疱疹病毒，其包含在ICP34.5的3'非翻译区中具有至少两个miRNA靶序列的至少一个ICP34.5基因。在相关的实施方案中，提供了包含修饰的溶瘤疱疹病毒基因组的重组单纯疱疹病毒，其中所述修饰的疱疹病毒基因组包含与ICP34.5基因的第一拷贝、或者第一拷贝和第二拷贝可操作地连接的至少一个miRNA靶序列。

2)如实施方案1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述至少两个miRNA靶序列是相同miRNA的靶标。

3)如实施方案1或2中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述至少两个miRNA靶序列是选自以下的miRNA的靶标：mIR-122、miR-124、miR-124*、miR-127、miR-128、miR-129、miR-129*、miR-132、mIR-133a、mIR133b、miR-135b、miR-136、miR-136*、miR-137、miR-139-5p、miR-143、mIR-145、miR-154、miR-184、miR-188、miR-204、mIR216a、miR-299、miR-300-3p、miR-300-5p、miR-323、miR-329、miR-337、miR-335、miR-341、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-376a、miR-376a*、miR-376b-3p、miR-376b-5p、miR-376c、miR-377、miR-379、miR-379*、miR-382、miR-382*、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-431、miR-433、miR-434、miR-451、miR-466b、miR-485、miR-495、miR-539、miR-541、miR-543*、miR-551b、miR-758和miR-873。按照惯例，更常被发现为最终产物的链被称为miRNA，较稀有的伴侣被称为miRNA*。在本发明的某些实施方案中，提供了根据实施方案1、2或3的重组单纯疱疹病毒，其中miRNA靶位点包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个拷贝的miR-124和miR-143结合位点。

4)如实施方案1-3中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其还包含修饰的ICP27或ICP4基因，其中修饰是5'UTR的替代。在其它实施方案中，通过天然启动子替代而修饰ICP27或ICP4基因。在本发明的特别优选的实施方案中，通过用hCEA启动子或hCXCR4启动子替代天然启动子来修饰ICP27。

5)如实施方案1、2、3或4中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其还包含修饰的ICP27，其中修饰是ICP27的整个启动子调节区的替代。在上述进一步的实施方案中，单纯疱疹病毒是HSV-1。在实施方案1、2、3或4中任一项所述的进一步的实施方案中，重组单纯疱疹病毒在编码糖蛋白B(gB)的基因中还包含融合突变。在相关的实施方案中，编码糖蛋白B(gB)的基因编码在氨基酸876之后终止的糖蛋白B变体。在其它实施方案中，提供了如实施方案1、2、3或4中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述基因组还包含编码糖蛋白B(gB)的修饰基因，其中所述修饰基因编码在氨基酸876之后终止的糖蛋白B变体。在更进一步的实施方案中，重组单纯疱疹病毒在选自ICP6、ICP0、ICP4、ICP27、ICP47、ICP24和ICP56的至少一个病毒基因中包含另外的突变或修饰。在某些优选的实施方案中，另外的突变或修饰在病毒基因的非编码区中。

6)如实施方案1、2、3、4或5中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其还包含编码至少一种免疫刺激因子的基因序列。代表性的免疫刺激因子包括IL12、IL15、IL15受体α亚基、OX40L和PD-L1阻断剂。

7)如实施方案1、2、3、4、5或6中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其还包含编码免疫刺激因子或检查点阻断肽的基因序列。在实施方案1、2、3、4或5的进一步方面中，重组单纯疱疹病毒还包含编码非病毒蛋白的至少一种核酸，所述非病毒蛋白选自免疫刺激因子、抗体和检查点阻断肽。在相关的实施方案中，至少一种核酸与肿瘤特异性启动子可操作地连接。

8)治疗癌症的方法，其包括施用实施方案1-7中任一项所述的重组单纯疱疹病毒。特别优选的待治疗的癌症包括肺肿瘤、乳腺和前列腺肿瘤、成胶质细胞瘤、胃肠道(和相关器官)的肿瘤，例如食道、胆管癌、肛门、胃、肠、胰腺、结肠和肝脏以及所有表面可注射肿瘤(例如黑色素瘤)。

以下是本发明的进一步实施方案：

9)重组单纯疱疹病毒，其包含修饰的溶瘤疱疹病毒基因组，其中所述修饰的疱疹病毒基因组包含与ICP34.5基因的第一拷贝、或者第一拷贝和第二拷贝可操作地连接的至少一个miRNA靶序列。在优选的实施方案中，与肿瘤细胞相比，单纯疱疹病毒在未转化的细胞中产生显著降低水平的功能性ICP34.5蛋白。

10)如实施方案9所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述ICP34.5基因的第二拷贝包含失活突变。

11)如实施方案9所述的重组单纯疱疹病毒，其包含与所述ICP34.5基因的第一拷贝、或者第一拷贝和第二拷贝可操作地连接的2至10个miRNA靶序列。

12)如实施方案10或11所述的重组单纯疱疹病毒，其包含与所述ICP34.5基因的第一拷贝、或者第一拷贝和第二拷贝可操作地连接的两个miRNA靶序列。

13)如实施方案10或11所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述miRNA靶序列插入所述ICP34.5基因的第一拷贝、或者第一拷贝和所述第二拷贝的3'非翻译区。

14)如实施方案13所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述miRNA靶序列串联插入所述3'非翻译区。

15)如实施方案10或11所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述2至10个miRNA靶序列结合单一miRNA。

16)如实施方案10或11所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述2至10个miRNA靶序列结合至少两种不同的miRNA。

17)如实施方案15或16所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述miRNA选自mIR-122、miR-124、miR-124*、miR-127、miR-128、miR-129、miR-129*、miR-132、mIR-133a、mIR133b、miR-135b、miR-136、miR-136*、miR-137、miR-139-5p、miR-143、mIR-145、miR-154、miR-184、miR-188、miR-204、mIR216a、miR-299、miR-300-3p、miR-300-5p、miR-323、miR-329、miR-337、miR-335、miR-341、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-376a、miR-376a*、miR-376b-3p、miR-376b-5p、miR-376c、miR-377、miR-379、miR-379*、miR-382、miR-382*、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-431、miR-433、miR-434、miR-451、miR-466b、miR-485、miR-495、miR-539、miR-541、miR-543*、miR-551b、miR-758和miR-873。按照惯例，更常被发现为最终产物的链被称为miRNA，较稀有的伴侣被称为miRNA*。

18)如实施方案17所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述miRNA靶位点包含5个拷贝的miR-124和miR-143结合位点。

19)如实施方案9所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述溶瘤疱疹病毒是HSV-1。

20)如实施方案9所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述修饰的疱疹病毒基因组在选自ICP6、ICP0、ICP4、ICP27、ICP47、ICP24和ICP56的至少一个病毒基因中包含另外的突变或修饰。在优选的实施方案中，编码序列保持完整，并且所述病毒基因通过用肿瘤特异性启动子替代天然启动子而被修饰。

21)如实施方案20所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述另外的突变或修饰影响所述病毒的毒力或其复制能力。

22)如实施方案20所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述突变或修饰的病毒基因是ICP4和/或ICP27。

23)如实施方案22所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述突变或修饰包含ICP4和ICP27基因与外源5'非翻译区的可操作连接。

24)如实施方案23所述的重组单纯疱疹病毒，其还包含修饰的ICP27或ICP4基因，其中修饰是所述5'UTR的替代。

25)如实施方案22所述的重组单纯疱疹病毒，其还包含修饰的ICP27，其中修饰是ICP27的整个启动子调节区的替代。在某些实施方案中，ICP27启动子被hCEA或hCXCR4启动子替代。在某些实施方案中，只有一部分启动子区被替代，并且天然5'UTR被保留。

26)如实施方案25所述的重组单纯疱疹病毒，其还包含编码非病毒蛋白的至少一种核酸，所述非病毒蛋白选自免疫刺激因子、抗体和检查点阻断肽，其中所述至少一种核酸与肿瘤特异性启动子可操作地连接。

27)如实施方案26所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述非病毒蛋白选自IL12、IL15、IL15受体α亚基、OX40L和PD-L1阻断剂。

28)如实施方案1至27中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其还包含表达盒，所述表达盒具有编码缺乏C-末端R肽的长臂猿白血病病毒env蛋白的融合变体的核酸序列和任选地编码HSV-1胸苷激酶的核酸。在其它实施方案中，提供了如实施方案1至27中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其包含具有编码融合形式的HSV-1糖蛋白B的核酸序列的表达盒。在某些优选的实施方案中，糖蛋白B可以被截短(例如，在gB的氨基酸876之后发生缺失)。

29)如实施方案1至28中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述病毒基因组的至少一个内部或末端重复区被缺失。在某些进一步的实施方案中，实施方案1至28中任一项所述的重组疱疹病毒在ICP34.5的3'UTR中具有5×miR-124和5×miR-143结合位点，其中末端重复缺失(其也缺失ICP0、ICP4和ICP34.5的第二拷贝)。

30)裂解肿瘤细胞的方法，其包括提供治疗有效量的上述实施方案1至29中任一项所述的重组单纯疱疹病毒。

31)治疗组合物，其包含上述实施方案1至29中任一项所述的重组单纯疱疹病毒和药学上可接受的载体。

32)用于治疗患有癌症的患者中的癌症的方法，其包括施用治疗有效量的实施方案31所述的组合物的步骤。特别优选的待治疗的癌症包括肺肿瘤、乳腺和前列腺肿瘤、成胶质细胞瘤、胃肠道(和相关器官)的肿瘤，例如食道、胆管癌、肛门、胃、肠、胰腺、结肠和肝脏以及所有表面可注射肿瘤(例如黑色素瘤)。

实施例

实施例1

正常小鼠脑和人脑肿瘤U87中Hsv-1立即早期基因表达

在本实施例中，在用微RNA调节的病毒注射之后24小时，比较正常小鼠脑和人脑肿瘤U87之间的HSV-1立即早期基因表达。向5只无肿瘤的裸鼠和5只在颅腔内携带人U87脑肿瘤的裸鼠颅内注射总计1×10^6PFU/小鼠的CXCR4-miR病毒或对照CXCR4病毒一次。CXCR4-miR病毒经工程改造以在ICP34.5的3'UTR内串联插入5个miR-124/143结合位点，以及修饰病毒ICP27基因，使得天然ICP27启动子调节区被肿瘤特异性CXCR4启动子替代。构建体还包含可分泌IL12/IL15/IL15RA的表达盒和抑制PD-1与PD-L1结合的可分泌肽的表达盒。CXCR4病毒含有缺乏微RNA结合位点的野生型ICP34.5基因，但在其它方面与CXCR4-miR病毒相同。

在感染后24小时使用RT-qPCR测量病毒立即早期基因ICP27、ICP4和ICP47在正常脑组织和肿瘤组织中的表达。通过与CXCR4病毒中的基因表达进行比较来确定CXCR4-miR病毒的基因表达水平的变化。肌动蛋白的表达用于归一化。使用

方法计算调整的p值。

图3显示了用CXCR4-miR病毒处理的小鼠表现出所有测试的病毒基因在正常脑组织中表达的高度显著(p<0.01)降低，同时在肿瘤内保持高水平的病毒基因表达。这些结果表明，相对于脑肿瘤组织，miRNA依赖性下调ICP34.5基因表达降低了HSV-1在正常脑组织中的复制。

实施例2

ICP34.5在神经元细胞和肿瘤细胞中的表达

本实施例显示了在用CXCR4-miR病毒或对照CXCR4病毒感染后，ICP34.5蛋白在神经元细胞和肿瘤细胞中的表达。用CXCR4-miR病毒或CXCR4病毒处理小鼠神经元细胞、LNCap细胞和A549细胞。感染后16小时，将细胞沉淀，用杜尔贝科(Dulbecco’s)磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并通过在RIPA缓冲液(10mM Tris-Cl(pH 8.0),1mM EDTA,1％Triton X-100,0.1％脱氧胆酸钠,0.1％SDS,140mM NaCl)中与1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂混合物在冰上孵育40分钟来裂解。然后，将裂解物在4℃以13,000rpm离心10分钟，并收集上清液。

通过蛋白质印迹分析测定各样品中ICP34.5蛋白的水平。使用BSA测定测量总蛋白浓度。将蛋白质裂解物(30-40μg)与4×SDS上样染料混合，随后在95℃加热10分钟。然后将样品上样并在10％SDS-PAGE中电泳，随后转移到硝化纤维素膜上。随后在室温下，将膜在含有5％BSA的Tris-缓冲盐水+吐温20(TBST)中封闭1小时。将封闭的膜与抗ICP34.5或β-肌动蛋白抗体在4℃下孵育过夜，然后将膜用TBST洗涤3×10分钟，并与相应的二抗在室温下孵育1小时。使用TBST进行三次10分钟洗涤之后，将膜与增强的化学发光(ECL)试剂孵育1分钟，然后在BIO-RAD ChemiDoc XRS+成像系统中曝光。使用ImageJ定量条带强度。

在图4中，显示了蛋白质印迹的结果。标记为“miRNA”的行表示细胞是否被在ICP34.5基因的3'UTR中包含(+)或缺乏(-)miRNA结合元件的病毒感染。发现ICP34.5的表达在感染了含有miRNA结合元件的病毒的神经元细胞较低。相比之下，在肿瘤细胞中，在感染了包含或缺乏miRNA结合元件的病毒构建体的细胞中表达是类似的。

实施例3

基于微RNA的溶瘤病毒平台

本实施例呈现了具有一些示例性工程改造的病毒基因组的基于微RNA的溶瘤病毒平台。所述平台在本文中被称为“转录和翻译双调节”(TTDR)。基于HSV-1的载体的基本平台显示在图5中。平台HSV-1病毒的关键特征是通过在ICP34.5基因的3'-UTR中插入5个拷贝的miR-124和miR-143结合位点而翻译控制ICP34.5基因。平台病毒载体的关键元件也可以包括使用肿瘤特异性启动子对ICP27基因(病毒复制所必需的基因)的转录控制。

多种HSV-1毒株可以用作构建重组溶瘤病毒的主链，包括毒株17、毒株KOS、毒株F、毒株McKrae等。可以使用在克隆到细菌人工染色体(BAC)中的HSV-1基因组上实施的标准λRed介导的重组工程技术在大肠杆菌中进行所有病毒诱变(一般参见：Tischer BK,SmithGA,Osterrieder N.Methods Mol Biol.2010；634:421-30.doi:10.1007/978-1-60761-652-8_30.PMID:20677001；Tischer BK,von Einem J,Kaufer B和Osterrieder N.,BioTechniques 40:191-197,Feb.2006(包括补充材料，doi:10.2144/000112096；以及Tischer BK,Smith,GA和Osterrieder N.Chapter 30,Jeff Braman(ed.),In VitroMutagenesis Protocols:Third Edition,Methods in Molecular Biology,vol.634,doi:10.1007/978-1-60761-652-8_30,Springer Sceince+Business Media,LLC2010)。

肿瘤特异性启动子也可以用于驱动编码免疫调节剂IL12/IL15/IL15RA(其加强抗肿瘤免疫应答)的盒的表达。免疫调节剂表达盒可以由hCEA、hCXCR4或PSA启动子控制，并插入到病毒基因组中对病毒基因表达和复制没有负面影响的位置，如在病毒基因US1/US2、UL3/UL4和/或UL50/UL51之间。为了促进在多种小鼠模型中进行体内测试，可以构建表达鼠IL12而不是人IL12的其它重组病毒。人IL15由于其在小鼠细胞中的活性而可以被保留在小鼠特异性溶瘤病毒中。

载体可以包含编码缺乏C-末端R肽的长臂猿白血病病毒(GALV)env蛋白的融合形式的表达盒，其增强了病毒的细胞毒性。可选地，表达盒可以编码融合形式的糖蛋白B(例如，截短的gB 876t)。可以将该盒插入到病毒基因组中对病毒基因表达和复制没有负面影响的位置，如在病毒基因US1/US2、UL3/UL4和/或UL50/UL51之间。

病毒载体还可以包含插入在病毒基因US1/US2、UL3/UL4和/或UL50/UL51之间的HSV-1胸苷激酶(TK)基因的表达盒。如果将BAC序列插入到病毒基因组中以促进大肠杆菌中的诱变，则破坏天然的TK基因。外源TK基因的存在通过使病毒对鸟苷类似物(如更昔洛韦和阿昔洛韦)的常见治疗敏感来增强病毒安全性。

驱动关键HSV-1转录调节子ICP27表达的启动子可以被肿瘤特异性启动子如hCEA、hCXCR4、PSA或Probasin(ARR2PB)替代。编码神经毒力因子ICP34.5的病毒基因的3'UTR也可以通过插入多拷贝的微RNA识别元件来修饰，以消除在含有高水平的相应微RNA的组织中产生ICP34.5。在示例性实施方案中，可以将5个拷贝的miR-124和5个拷贝的miR-143识别元件串联插入ICP34.5的3'UTR中。

可以完全缺失病毒基因组的末端重复区，以减小整体基因组大小并且为转基因插入创造更多的空间；对缺失的TR进行工程改造以避免破坏ICP47基因的天然启动子，其通常是末端重复的一部分。本文讨论的示例性元件的进一步细节示出在图6中。

可以使用Qiagen HiSpeed MidiPrep试剂盒分离所得的重组病毒，并将其转染到Vero细胞中以回收病毒，例如使用Lipofectamine2000。所有修饰区域的靶向测序和限制分析可以用于验证基因组完整性。最终重组病毒的稳定性可以通过连续传代和通过蛋白质印迹和ELISA定期验证转基因表达来证实。

下表中列出了该平台的五个示例性实施方案。将两种病毒进行工程改造以用于肺癌(或其它上皮细胞来源的癌症，例如肾癌和乳腺癌)的治疗以及将三种用于前列腺癌的治疗。

实施例4

微RNA介导的ICP34.5表达的调节导致降低的体内神经毒力

向小鼠颅内注射单剂量(5x10^7PFU/mL)的CXCR4-TF-Fc-h1215-miR病毒(其中将5个miR-124和miR-143元件插入ICP34.5a基因的3'UTR中)或缺乏该插入的对照CXCR4-TF-Fc-h1215病毒。两种病毒构建体还包含CXCR4启动子驱动的ICP27基因，插入在UL3与UL4之间的TF+Fc PD-L1阻断剂表达盒以及用表达人IL12、IL15和IL15受体α亚基的盒替代的末端重复区。

感染后，通过用兔多克隆抗HSV一抗和与AlexaFluor 488缀合的大鼠抗兔二抗对鼠脑切片进行染色来使HSV-1感染的程度可视化。如图7所示，用含有miR-控制的ICP34.5的病毒感染的小鼠仅沿着针路径显示出可检测的病毒，而含有野生型ICP34.5的病毒广泛散布在整个脑中。

实施例5

VG182LF病毒在体外选择性杀伤肺癌细胞。

将肺癌细胞(A549)或正常肺细胞(BEAS-2b和HPL1D)与渐增的MOI的VG182LF病毒一起孵育72小时。感染后，使用MTT测定测量细胞活力。如图8A和8B所示，相对于正常肺细胞，VG182LF病毒显示出以剂量依赖性对肺癌细胞的增加的杀伤。

下表呈现了针对每种细胞系确定的IC50值，并且显示了与肺癌细胞系A549相比，正常肺细胞HPL1D和BEAS-2b的IC50分别增加6.54倍和18.93倍。

这些数据表明，增加的肿瘤细胞杀伤与ICP34.5基因表达的微RNA控制和肿瘤特异性启动子驱动ICP27和IL12/IL15/IL15RA基因表达的用途有关。

用另外的肺癌细胞系重复该实验。如图8C所示，VG182LF病毒有效地杀伤多种商业上可获得的肺癌细胞。下表中列出了针对每种细胞系的计算IC50值。

实施例6

VG182LF在体外肺癌细胞中选择性复制

用MOI为0.1的VG182LF病毒处理肺癌细胞(A549)和正常肺细胞(BEAS-2b)不同的时间。感染后，收获病毒并在Vero细胞上滴定。如图9所示，VG182LF病毒在肺癌细胞中成功复制，但在正常肺细胞中不复制。在48小时的时间点，从A549肺癌细胞获得大于6×10⁶个病毒颗粒的滴度；尽管没有从BEAS-2b正常肺细胞中获得显著的病毒，但表明ICP34.5的微RNA控制以及肿瘤特异性启动子驱动ICP27和IL12/IL15/IL15Ra表达的用途在正常细胞中负面影响病毒复制，同时促进肿瘤细胞中的病毒复制。

研究了VG182LF病毒在A549肺肿瘤细胞或LNCaP前列腺肿瘤细胞中的复制。简而言之，用VG161(对照)或VG182LF病毒感染细胞12或24小时。随后收获细胞并用抗人IL-12p70抗体进行细胞内染色。通过流式细胞术检测人IL-12阳性细胞，并计算人IL-12的倍数增加。如图10所示，人IL-12增加的表达与增强的病毒复制直接相关。

评估了VG182LF病毒在各种不同的肺癌细胞系中复制的能力。用MOI为0.1的VG182LF病毒处理来自肺癌细胞系H1975、PC9和H460的细胞，并在感染后0、6、24和48小时收获上清液。在Vero细胞上滴定来自每个样品的病毒。来自该实验的数据显示在图11A-C中，其中滴度值代表3个生物学重复的平均值。这些数据表明在感染后48，病毒能够在每种肺癌细胞系中复制到显著水平。

实施例7

VG182LF在H1975肺癌模型中的体内抗肿瘤功效

在植入后一周用VG182LF处理携带H1975肿瘤的裸鼠。将5.65x10^7PFU/小鼠的VG182LF以2天的间隔注射3次。媒介物处理的小鼠达到人道的终点并在处理开始之后12天处死。如图12所示，与媒介物处理的对照相比，用VG182LF病毒处理的小鼠显示出显著降低的肿瘤生长，并且在处理开始后29天仍存活。

实施例8

miR介导的ICP34.5在培养的转染细胞中表达的控制

HSV-1蛋白ICP34.5对于在神经元中有效的病毒复制是必需的，但对于培养的非神经元细胞，如293FT细胞中的复制在很大程度上是非必要的。在本实施例中，评估了miR-143影响293FT细胞中ICP34.5表达的能力。

最初在第0天用miR-143转染细胞。作为对照，293FT细胞用杂乱的miR转染或根本不转染。转染后20小时，洗涤细胞，然后用重组溶瘤HSV-1(MOI＝1)感染，所述重组溶瘤HSV-1编码ICP34.5的3'UTR中的miR-143和miR-124结合位点以及gB的羧基末端中的融合突变(gB-876t)。在感染后6小时收获细胞用于RNA分离以测量基因表达和转染效率，并且在感染后0小时和24小时收获细胞用于DNA分离以测量病毒复制。

如图14A所示，在感染后6小时，通过RT-qPCR在用miR-143转染的细胞中检测到高水平的miR-143，而未转染的细胞和用杂乱的miR转染的细胞显示出可忽略水平的miR-143。如图14B所示，通过RT-qPCR在感染后6小时评价的病毒基因表达显示了先前用miR-143转染的样品中ICP34.5表达的显著降低，而不含miR结合位点的另一个病毒基因(ICP27)未观察到类似的降低。通过使用qPCR测量ICP27的拷贝，在感染后24小时定量病毒复制，每个拷贝对应于离散的病毒基因组。如图14C所示，当比较用miR-143或用杂乱的miR转染的样品时，病毒复制水平没有显著差异，表明在用miR-143转染的样品中观察到的ICP34.5表达的显著降低不是由于降低的病毒拷贝数。

实施例9

ICP34.5的miR调节通过阻断神经毒力来改善安全性

在本实施例中，向DBA/2小鼠(每组N＝3)皮下注射媒介物对照、野生型HSV-1、具有缺失的ICP34.5且没有融合突变的VG161病毒变体，或者编码ICP34.5的3'UTR中的miR-143和miR-124结合位点以及gB的羧基末端的融合突变(gB-876t)的VG301病毒变体。在注射后6天收获样品用于HSV-1免疫染色。如图15所示，在注射有野生型HSV-1的小鼠的脑和脊髓中都观察到了稳健的病毒复制模式。相比之下，在注射有VG161或VG301变体的小鼠的神经元组织中没有观察到病毒复制，表明ICP34.5的miR调节在预防神经毒力方面与ICP34.5的完全缺失一样有效。

如图16所示，用野生型HSV-1注射的其余小鼠迅速发展神经症状并且必须使其安乐死，而用VG161或VG301变体处理的所有其余小鼠在整个实验期间保持健康。这些结果提供了支持使用ICP34.5的miR调节预防OV诱导的神经毒力的安全性和功效的另外的证据。此外，可以推断VG301中的融合突变不会导致增加的发病率或死亡率。

实施例10

溶瘤HSV-1中融合突变的评估

在本实施例中，用重组溶瘤HSV-1感染A549wt和BPH1细胞，所述重组溶瘤HSV-1编码gB的羧基末端的融合突变(+gB-876t)。作为对照，用缺乏融合突变(-gB-876t)的HSV-1感染A549wt和BPH1细胞。在感染后48小时，将细胞固定并且进行吉姆萨染色以使由病毒诱导的细胞融合产生的病毒蚀斑和合胞体可视化。如图17所示，在用携带融合突变的病毒感染的细胞中观察到大量的细胞间融合，而在用缺乏融合突变的病毒感染的细胞中，最小融合是明显的。

本文中已经广泛和一般地描述了本发明。落入一般性公开内容内的较窄种类和次一般性分组中的每一个也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述，其条件或负面限制将任何主题从类中去除，而不管所去除的材料是否在本文中具体陈述。

还应理解，如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用，除非上下文另外清楚地规定，术语“X和/或Y”意指“X”或“Y”或“X”和“Y”两者，并且跟随名词的字母“s”表示该名词的复数和单数形式。此外，在本发明的特征或方面是根据马库什组描述的情况下，预期地并且本领域技术人员将认识到，本发明也包括并由此根据马库什组的任何单个成员和任何成员亚组描述，并且申请人保留修改申请或权利要求的权利以具体地指代马库什组的任何单个成员或任何成员亚组。

应理解，本文使用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，并非旨在是限制性的。还应理解，除非本文特别定义，否则本文所用的术语被赋予其相关领域中已知的传统含义。

贯穿本说明书提及的“一个实施方案”或“实施方案”及其变型意指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书的各个地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定都指相同的实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定的特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合。

如本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该(the)”包括复数指示物，即一个或多个/一种或多种，除非内容和上下文另外清楚地规定。还应注意，除非内容和上下文清楚地指出情况可能是包括性或排他性的，否则连接术语“和”和“或”通常用在最广泛的意义上以包括”和/或“。因此，替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。另外，“和”和“或”的组成当在本文作为“和/或”叙述时，旨在涵盖包括所有相关的项或构思的实施方案，以及包括比所有相关的项或构思更少的的一个或多个其它替代实施方案。

除非上下文另有要求，否则在整个说明书和所附权利要求书中，词语“包括(comprise)”及其同义词和变型(如“具有(have)”和“包括(include)”)以及其变型(如“包括(comprises)”和“包含(comprising)”)应被解释为开放式的，包括性的含义，例如“包括，但不限于”。术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤，或者限制为不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特性的那些。

在本文件中使用的任何标题仅用于加快读者的回顾，而不应被解释为以任何方式限制本发明或权利要求。因此，本文提供的公开内容的标题和摘要仅是为了方便，而不解释实施方案的范围或含义。

在本文提供一系列数值的情况下，应理解，除非上下文另有清楚地规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个介于中间的数值(至下限单位的十分之一)以及在所述范围内的任何其它陈述的或介于中间的数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在也涵盖在本发明中的较小范围内，受制于所述范围内受任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除那些包括的极限中的一个或两个的范围也包括在本发明中。

例如，除非另有说明，否则本文提供的任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包括所述范围内的任何整数的数值，并且在适当时，包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。另外，除非另有说明，否则本文所述的与任何物理特征相关的任何数值范围，如聚合物亚单元、尺寸或厚度，应被理解为包括所述范围内的任何整数。如本文所用，除非另有说明，否则术语“约”意指所示范围、数值或结构的±20％。

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此外，本专利的书面描述部分包括所有权利要求。此外，所有权利要求，包括所有原始权利要求以及来自任何和所有优先权文件的所有权利要求，在此通过引用整体并入到说明书的书面描述部分中，并且申请人保留了将任何和所有这样的权利要求物理并入本申请的书面描述或任何其它部分中的权利。因此，例如，在任何情况下，该专利都不能被解释为声称没提供关于权利要求书的书面描述，声称该权利要求书的精确措辞在该专利的书面描述部分中没有用同样的措辞示出。

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Claims (13)

1.重组单纯疱疹病毒，其包含修饰的溶瘤疱疹病毒基因组，其中所述修饰的疱疹病毒基因组包含与ICP34.5基因的第一拷贝、或者第一拷贝和第二拷贝可操作地连接的至少一个miRNA靶序列。

2.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述miRNA选自mIR-122、miR-124、miR-124*、miR-127、miR-128、miR-129、miR-129*、miR-132、mIR-133a、mIR133b、miR-135b、miR-136、miR-136*、miR-137、miR-139-5p、miR-143、mIR-145、miR-154、miR-184、miR-188、miR-204、mIR216a、miR-299、miR-300-3p、miR-300-5p、miR-323、miR-329、miR-337、miR-335、miR-341、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-376a、miR-376a*、miR-376b-3p、miR-376b-5p、miR-376c、miR-377、miR-379、miR-379*、miR-382、miR-382*、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-431、miR-433、miR-434、miR-451、miR-466b、miR-485、miR-495、miR-539、miR-541、miR-543*、miR-551b、miR-758和miR-873。

3.如权利要求2所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述miRNA靶位点包含miR-124和miR-143的5个拷贝的结合位点。

4.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述溶瘤疱疹病毒是HSV-1。

5.如权利要求4所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述基因组还包含在编码糖蛋白B(gB)的基因中的融合突变。

6.如权利要求5所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述编码糖蛋白B(gB)的基因编码在氨基酸876之后终止的糖蛋白B变体。

7.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述修饰的溶瘤疱疹病毒基因组在选自ICP6、ICP0、ICP4、ICP27、ICP47、ICP24和ICP56的至少一个病毒基因中包含另外的突变或修饰。

8.如权利要求7所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述至少一个病毒基因通过天然启动子替代而被修饰。

9.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其还包含编码非病毒蛋白的至少一种核酸，所述非病毒蛋白选自免疫刺激因子和检查点阻断肽，其中所述至少一种核酸与肿瘤特异性启动子可操作地连接。

10.如权利要求9所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述非病毒蛋白选自IL12、IL15、IL15受体α亚基、OX40L和PD-L1阻断剂。

11.裂解肿瘤细胞的方法，其包括提供治疗有效量的权利要求1-9中任一项所述的重组单纯疱疹病毒。

12.治疗组合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的重组单纯疱疹病毒和药学上可接受的载体。

13.用于治疗患有癌症的对象中的癌症的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求12所述的组合物的步骤。

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