TW202342758A - 轉錄及轉譯雙重調節之溶瘤單純疱疹病毒載體 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種具有在CXCR4啟動子控制下之ICP27及在miRNA-124/143控制下之ICP34.5的HSV載體，其中該載體具有病毒基因體之一個RL及一個RS區的缺失。在視情況存在之實施例中，突變為含有ICP34.5基因之第二複本的缺失。此等構築體能提供經提高之安全性而不會犧牲功效。該HSV載體亦併入在CMV啟動子之控制下的編碼IL-12、IL-15/IL-15RA之表現病毒的細胞介素卡匣。
Description
本發明大體上係關於表現刺激免疫系統之分子的溶瘤單純疱疹病毒(oncolytic herpes simplex virus，oHSV)載體。
惡性腫瘤嚴重威脅人類生命及健康。儘管存在各種標準治療選項，諸如手術、放射療法、化學療法、目標療法及免疫療法(包括免疫檢查點抑制劑)，但大部分患有晚期腫瘤之患者仍然預後不佳。目前，腫瘤免疫療法在治療腫瘤方面已獲得突破性進展。免疫目標藥物療法(例如免疫檢查點遏制)及免疫細胞療法(例如嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T))已引起抗腫瘤療法領域之變化。然而，在目前經批准之檢查點抑制劑之適應症中，單一藥物有效率僅為約30% (Jiang等人, 2020, Progress and Challenges in Precise Treatment of Tumors With PD-1/PD-L1 Blockade. Frontiers in Immunology, 11(3月))；而CAR-T療法僅主要以由B細胞腫瘤高度表現之分化叢集19 (Cluster of Differentiation 19，CD19)及B細胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)為目標。在實體腫瘤中之臨床有效性尚待確認(Long等人, 2018, CAR T Cell Therapy of Non-hematopoietic Malignancies: Detours on the Road to Clinical Success. Frontiers in Immunology, 9(12月), 2740)。在存在關於免疫療法之益處的明確長期跡象情況下仍然存在多種惡性腫瘤。
對於標準治療之後復發且用標準治療難以治療之惡性腫瘤。臨床上尚無有效的治療方法，因此這種情況下的患者可能由於腫瘤廣泛轉移或侵犯重要器官造成患者更快死亡。因此，此等患者對有效治療的需求極度未滿足，導致迫切需要開發新型治療方法來控制疾病進展及延長患者存活期。
本發明克服當前癌症療法(包括免疫療法)之缺點，且進一步提供另外的出人意料之益處。
[先前技術]部分中所論述之所有標的物並非必需為先前技術且不應假定為先前技術，僅作為其在[先前技術]部分中之論述的結果。沿著此等思路，除非明確陳述為先前技術，否則對[先前技術]部分中所論述或與此類標的物相關之先前技術中的問題之任何認知不應視為先前技術。替代地，[先前技術]部分中任何標的物之論述應視為本發明人對於特定問題之方法的部分，其自身亦可為發明性的。
簡言之，本發明係關於用重組單純疱疹病毒載體治療癌症之組合物及方法。在本發明之一個實施例中，提供重組單純疱疹病毒，其包含經修飾溶瘤疱疹病毒基因體，其中經修飾疱疹病毒基因體包含至少一個可操作地連接至ICP34.5基因之第一複本及該ICP34.5基因之包含失活突變的第二複本之miRNA目標序列。在各種實施例中，重組病毒可包含一至十個可操作地連接至ICP34.5基因之第一複本的miRNA目標序列。
在另外實施例中，miRNA目標序列可結合至少兩個不同miRNA (例如miR-124、miR-124*及miR-143中之一或多者)。在某些實施例中，miR目標序列包括SEQ ID NO. 2 (miR-124結合序列)；SEQ ID NO. 3 (miR-143結合序列)；SEQ ID NO. 9 (miR-223結合序列)；及SEQ ID NO. 10 (miR-125b結合序列)。可用於本發明之其他實施例中的其他miRNA目標序列包括如WO2020/113151中所述之例如mlR-122、miR-127、miR-128、miR-129、miR- 129*、miR-132、mlR-133a、mlR133b、miR-135b、miR-136、miR-136*、miR-137、miR-139-5p、mlR-145、miR-154、miR-184、miR-188、miR-204、mlR216a、miR-299、miR-300-3p、miR-300-5p、miR-323、miR-329、miR-337、miR-335、miR-341、miR-369-3p、miR-369-5p、miR- 376a、miR-376a*、miR-376b-3p、miR-376b-5p、miR-376c、miR-377、miR-379、miR-379*、miR- 382、miR-382*、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-431、miR-433、miR-434、miR-451、miR- 466b、miR-485、miR-495、miR-539、miR-541、miR-543*、miR-551b、miR-758及miR-873，其以全文引用之方式併入本文中。
在又其他實施例中，重組疱疹病毒可進一步包含至少一種編碼非病毒蛋白之核酸。非病毒蛋白之實例包括免疫刺激因子、抗體及檢查點阻斷肽，其中至少一種核酸可操作地連接至強啟動子(例如諸如CMV之病毒啟動子或諸如EF-1α或CAG之其他啟動子)。在尤其較佳實施例中，非病毒蛋白為IL12、IL15、IL15受體α亞單位中之一者或全部。此等序列之代表性實例包括SEQ ID NO. 4 (IL12)；SEQ ID NO. 5 (IL15)；及SEQ ID NO. 6 (IL15受體α亞單位)。
在又其他實施例中，重組單純疱疹病毒進一步包含編碼具有增強之融合性(與類似野生型病毒相比)的醣蛋白之核酸序列。實例包括廣泛多種轉殖基因(例如來自長臂猿白血病病毒「Gibbon Ape Leukemia Virus，GALV」之融合醣蛋白)及/或增強HSV融合之突變，包括(例如)醣蛋白B、醣蛋白K及/或UL20中之截斷或突變。
在又其他實施例中，重組疱疹病毒可進一步包含可操作地連接至ICP47基因之第一複本的ICP27啟動子序列，其中ICP47基因之天然啟動子包含失活缺失。
在又其他實施例中，重組疱疹病毒可在ICP4基因之至少一個複本中進一步包含失活突變。
在又其他實施例中，重組疱疹病毒可進一步包含可操作地連接至ICP27基因之第一複本的腫瘤特異性啟動子，其中天然ICP27啟動子包含失活突變。
亦提供包含本文所述之重組疱疹病毒的治療組合物以及使腫瘤細胞裂解之方法及治療個體之癌症的方法，其包含向個體投與本文所述之重組疱疹病毒中的一者之步驟。
已提供此[發明內容]以按簡化形式引入某些在下文[實施方式]中進一步詳細描述之概念。除另外明確陳述之外，此[發明內容]並不意欲識別所主張之標的物之關鍵特徵或基本特徵，亦不意欲限制所主張之標的物之範疇。
一或多個實施例之詳情闡述於以下實施方式中。結合一個例示性實施例所說明或描述之特徵可與其他實施例之特徵組合。因此，可併入本文所述之各種實施例中之任一者以提供另外實施例。必要時，可修改實施例之態樣以採用如本文所識別之各種專利、申請案及公開案之概念，從而提供又另外實施例。其他特徵、目標及優勢將自實施方式、圖式及申請專利範圍而顯而易見。
以參考任何優先權申請案之方式併入
在如本申請案所申請之申請案資料表單中確定國外或國內優先權要求之任何及所有申請案均以引用之方式併入本文中。
序列表、表或電腦程式之參考
序列表之正式複本係以ASCII格式化正文檔案形式經由EFS-Web與說明書同時提交，其中檔案名稱為「VIRO_416_SeqList_ST25」，創建日期為2022年1月27日，且大小為10.6KB。經由EFS-Web提交之序列表為說明書之一部分且以全文引用之方式併入本文中。
術語「溶瘤疱疹病毒」或「oHSV」一般係指能夠在腫瘤細胞中複製並殺死腫瘤細胞之疱疹病毒。在某些實施例中，病毒可經工程改造以便更加選擇性以腫瘤細胞為目標。溶瘤疱疹病毒之代表性實例描述於美國專利第7,223,593號、第7,537,924號、第7,063,835號、第7,063,851號、第7,118,755號、第8,216,564號、第8,277,818號及第8,680,068號中，其全部以全文引用之方式併入。
如本文所用，「治療(treat/treating/treatment)」意謂獲得有益或所需結果(包括臨床結果)之方法。有益或所需臨床結果可包括(但不限於)可偵測或不可偵測之一或多種症狀或病況之緩解或減輕、疾病程度之減弱、穩定的(亦即不惡化)疾病狀態、防止疾病擴散、疾病進展之延遲或減緩、疾病狀態之減輕或緩和、疾病復發之減弱以及改善(部分或完全)。術語「治療」亦可意謂與若不接受治療之預期存活期相比延長存活期。
癌症之代表性形式包括癌瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤及肉瘤。進一步實例包括(但不限於)膽管、大腦(例如神經膠母細胞瘤)、乳房、宮頸、結直腸、CNS (例如聽神經瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、神經膠母細胞瘤、血管母細胞瘤、神經管母細胞瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤、少突神經膠質瘤、松果體瘤及視網膜母細胞瘤)、子宮內膜內層、造血細胞(例如白血病及淋巴瘤)、腎、喉、肺、肝、口腔、卵巢、胰臟、前列腺、皮膚(例如黑色素瘤及鱗狀細胞癌)及甲狀腺之癌症。癌症可包含實體腫瘤(例如肉瘤，諸如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤及骨原性肉瘤)，為彌漫性(例如白血病)，或此等(例如具有實體腫瘤及播散性或彌漫性癌細胞之轉移癌)之某一組合。癌症亦可對習知治療(例如習知化學療法及/或放射療法)具有抗性。
尤其較佳的待治療癌症包括肺腫瘤、乳房及前列腺腫瘤、神經膠母細胞瘤、例如食道之胃腸道(及相關器官)的腫瘤、膽管癌瘤、肛門、胃、膀胱、腎、腸、胰臟、結腸及肝以及所有表面可注射腫瘤(例如黑色素瘤)。良性腫瘤及其他具有不希望的細胞增殖之病況亦可治療。更佳地，待治療之癌症表現可偵測量之C-X-C基序趨化激素受體4 (Motif Chemokine Receptor 4，CXCR4)。
為了進一步理解本文中之各種實施例，提供以下描述各種實施例之章節：A.溶瘤疱疹病毒；B.特異性疱疹病毒構築體-VG2062；C.轉錄後調節；D. ICP27在VG2062中之表現受轉錄控制；E. VG2062中之負載物表現增強；F.經截斷醣蛋白B；G.經修飾ICP47啟動子；H.治療組合物；及I.投與。
A.
溶瘤疱疹病毒
單純疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV) 1及2為感染人類之疱疹病毒科家族之成員。HSV基因體含有兩個唯一區，其被稱為唯一長(U
L)及唯一短(U
S)區。此等區中之各者由一對一致反向重複序列側接，其中側接U
L區之重複序列命名為R
L且側接U
S區之重複序列命名為R
S。存在約75個已知開放閱讀框。病毒基因體已經工程改造以開發溶瘤病毒用於例如癌症療法中。HSV之腫瘤選擇性複製可藉由HSV ICP34.5 (亦稱為γ34.5)基因之突變來賦予。HSV含有ICP34.5之兩個複本。已知使ICP34.5基因之一個或兩個複本失活之突變不具有神經毒性，亦即為無毒的/非神經毒性及為溶瘤的。HSV之腫瘤選擇性複製亦可藉由控制諸如ICP27及/或ICP4之關鍵病毒基因的表現來賦予。
適合之溶瘤HSV可來源於HSV-1或HSV-2，包括任何實驗室病毒株或臨床分離株。在一些實施例中，oHSV可來源於實驗室病毒株HSV-1病毒株17、HSV-1病毒株F或HSV-2病毒株HG52中之一者。在其他實施例中，其可來源於非實驗室病毒株JS-1。其他適合之HSV-1病毒包括HrrR3 (Goldstein及Weller,
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Cancer Research, 2005; 65(23):10663-10668)；及揭示於標題為「HSV Vectors with Enhanced Replication in Cancer Cells」之PCT申請案PCT/US2017/030308及標題為「Compositions and Methods of Using Stat1/3 Inhibitors with Oncolytic Herpes Virus」之PCT/US2017/018539中的彼等載體，以上全部以全文引用之方式併入。
oHSV載體具有至少一個如本文所揭示之在3' UTR中經miRNA目標序列修飾之γ34.5基因；在載體中不存在未經修飾的γ34.5基因。在一些實施例中，oHSV具有兩個經修飾γ34.5基因；在其他實施例中，oHSV僅具有一個γ34.5基因，且其經修飾。在一些實施例中，經修飾γ34.5基因係活體外構築且插入至oHSV載體中作為病毒基因之替代。當經修飾γ34.5基因為僅一個γ34.5基因之替代時，另一γ34.5缺失。天然γ34.5基因可缺失。在一個實施例中，包含γ34.5基因及ICP4基因之末端重複區缺失。如本文所論述，經修飾γ34.5基因可包含另外的變化，諸如具有外源性啟動子。
oHSV可具有另外的突變，其可包括可能影響病毒之毒性或其複製能力的失能突變(例如缺失、取代、插入)。舉例而言，突變可在ICP6、ICPO、ICP4、ICP27、ICP47、ICP24、ICP56中之任何一或多者中形成。較佳地，此等基因中之一者中的突變(在適當時視情況在基因之兩個複本中)引起HSV表現對應功能性多肽之無能(或能力減小)。在一些實施例中，病毒基因之啟動子可經一啟動子取代，該啟動子在目標細胞中為選擇性活性或在遞送誘導劑後為誘導性或在細胞事件後或特定環境為誘導性。
oHSV可具有另外的突變，其可包括可能降低病毒基因體之重複性及非唯一區中之重組合事件之風險的失能突變(例如缺失、取代、插入)。舉例而言，突變可在R
S區、R
L區、US1啟動子、US12啟動子中之任何一或多者中形成。在一些實施例中，病毒基因之啟動子可經不同病毒基因之啟動子取代，該啟動子降低自然(native)或天然(natural)啟動子之重複性及非唯一區中的重組合事件之風險。
在某些實施例中，ICP4或ICP27之表現受外源性啟動子(例如腫瘤特異性啟動子)控制。例示性腫瘤特異性啟動子包括存活素、CEA、CXCR4、PSA、ARR2PB或端粒酶；其他適合之腫瘤特異性啟動子可為對單一腫瘤類型具有特異性且為此項技術中已知的。可存在其他元件。在一些情況下，存在諸如NFkB/oct4/sox2強化子之強化子。同樣，5' UTR可為外源性，諸如來自諸如FGF之生長因子基因的5' UTR。例示性構築體參見圖1。CXCR4啟動子之代表性序列亦參見SEQ ID NO. 8。
oHSV亦可具有非HSV來源之基因及核苷酸序列。舉例而言，編碼前藥之序列、編碼細胞介素或其他免疫刺激因子之序列、腫瘤特異性啟動子、誘導性啟動子、強化子、與宿主細胞同源之序列，以及可在oHSV基因體中之其他序列。例示性序列編碼IL12、IL15、IL15受體α亞單位、OX40L、PD-L1阻斷劑或PD-1阻斷劑。對於編碼產物之序列，其可操作地連接至啟動子序列及其他表現所必需或需要的調節序列(例如強化子、多腺苷酸化信號序列)。
病毒基因之調節區可經修飾以包含影響表現之反應元件。例示性反應元件包括NF-κB之反應元件、Oct-3/4-SOX2、強化子、沉默子、cAMP反應元件、CAAT強化子結合序列及絕緣子。亦可包括其他反應元件。
病毒啟動子可由不同啟動子替代。啟動子之選擇將視多種因素而定，諸如提出使用HSV載體、患者之治療、疾病狀態或病況及易於應用誘導劑(對於誘導性啟動子)。對於癌症之治療，一般當啟動子經替代時其將由細胞特異性或組織特異性或腫瘤特異性啟動子替代。腫瘤特異性、細胞特異性及組織特異性啟動子為此項技術中已知的。其他基因元件同樣可經修飾。舉例而言，病毒基因之5' UTR可由外源性UTR替代。
B.
特異性疱疹病毒構築體 - VG2062
本發明之一個較佳構築體提供於圖1中。簡言之，圖1概略地描繪VG2062之雙股去氧核糖核酸(DNA)元件的總體結構組織。「CXCR4」意謂C-X-C基序趨化激素受體4；「CMV」意謂細胞巨大病毒；「gB」意謂醣蛋白B；「ICP」意謂受感染細胞多肽；「IL」意謂介白素；「R
L」意謂重複長；「RNA」意謂核糖核酸；「miR」及「miRNA」意謂微小RNA；「R
S」意謂重複短；「UL」意謂唯一長；「US」意謂唯一短。名稱「VG2062」及「VG203」係指同一構築體且可互換使用。
VG2062為重組HSV-1平台，其利用關鍵病毒基因之轉錄及轉譯雙重調節(「TTDR」-參見圖1)以限制病毒複製至腫瘤細胞及增強腫瘤特異性毒性而不損害安全性。另外，VG2062表現由IL12、IL15及IL15受體α亞單位組成之負載物卡匣。負載物表現在CMV啟動子控制下以便在並不遏制CMV啟動子功能之細胞中表現。最後，VG2062中之病毒醣蛋白B (gB)經截斷以促進病毒藉由增強之融合性而在腫瘤中擴散。
C.
轉錄後調節
在VG2062中，ICP34.5表現轉錄後調節。簡言之，在野生型HSV-1中，存在ICP34.5基因之2個複本。在VG2062中，ICP34.5之一個複本已缺失。對於剩餘ICP34.5基因，VG2062在3' UTR區中插入用於miR124及miR143之結合域之多個複本以轉錄後調節其表現。
ICP34.5由HSV晚期基因g-34.5編碼。其因其遏制宿主細胞(尤其神經元細胞)之抗病毒免疫力以造成神經毒性的功能而為眾所周知。為了消除ICP34.5在神經元及其他正常細胞中之功能同時保留其在腫瘤細胞中穩固複製之活性，VG2062使用微小RNA作為轉錄後控制以達成ICP34.5在腫瘤細胞中之不同表現，而不刪除基因或使用特異性啟動子來控制ICP34.5之表現從而以特異性腫瘤為目標。簡言之，miRNA為約22個非編碼由miRNA基因編碼之小RNA的核苷酸，miRNA基因藉由RNA聚合酶II轉錄以產生初級miRNA (pri-miRNA)。成熟單股(single-stranded，ss) miRNA形成miRNA相關RNA誘導沉默複合物(miRNA-associated RNA-induced silencing complex，miRISC)。miRISC中之miRNA可能藉由與目標mRNA中之3'-非轉譯區(3'-UTR)結合將影響基因表現。此區由藉由miRNA識別之序列組成。若miRNA:mRNA複合物之互補為完美的，則mRNA藉由Ago2 (一種屬於阿爾古(Argonaute)家族之蛋白)降解。然而，若互補並非完美的，則目標mRNA之轉譯並非完全降解，但仍受遏制。
miRNA以組織特異性方式不同地表現。實例中之一者為miR124。儘管來自不同物種之miR-124的前驅物不同，人類、小鼠、大鼠中的成熟miR-124之序列完全一致。MiR-124為神經元細胞中最充分表現之miRNA且在免疫細胞及器官中高度表現(Qin等人, 2016, miRNA-124 in immune system and immune disorders. Frontiers in Immunology, 7(10月), 1-8)。miRNA之不同表現之另一實例為miR143 (Lagos-Quintana等人, 2002, Identification of tissue-specific MicroRNAs from mouse. Current Biology, 12(9), 735-739)。MiR-143在正常組織中組成性表現但在癌細胞中顯著下調(Michael等人, 2003, Reduced Accumulation of Specific MicroRNAs in Colorectal Neoplasia. Molecular Cancer Research, 1(12), 882-891)。
VG2062中ICP34.5基因之3' UTR區含有結合域之多個複本(亦稱為「miRNA目標序列」、「miRNA結合序列」或「miRNA結合位點」)，其與miR124及miR143完全互補。miR124及miR143與ICP34.5 mRNA之3' UTR的結合導致mRNA之降解；因此基因在正常細胞而非腫瘤細胞中轉錄後下調。此設計允許ICP34.5在腫瘤細胞中之不同表現。
在各種實施例中，miRNA目標序列可結合至少兩個不同miRNA (例如miR-124、miR-124*及miR-143中之一或多者)。在某些實施例中，miR目標序列包括SEQ ID NO. 2 (miR-124結合序列)；SEQ ID NO. 3 (miR-143結合序列)；SEQ ID NO. 9 (miR-223結合序列)；及SEQ ID NO. 10 (miR-125b結合序列)。可用於本發明之其他實施例中的其他miRNA目標序列包括如WO2020/113151中所述之例如mlR-122、miR-127、miR-128、miR-129、miR- 129*、miR-132、mlR-133a、mlR133b、miR-135b、miR-136、miR-136*、miR-137、miR-139-5p、mlR-145、miR-154、miR-184、miR-188、miR-204、mlR216a、miR-299、miR-300-3p、miR-300-5p、miR-323、miR-329、miR-337、miR-335、miR-341、miR-369-3p、miR-369-5p、miR- 376a、miR-376a*、miR-376b-3p、miR-376b-5p、miR-376c、miR-377、miR-379、miR-379*、miR- 382、miR-382*、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-431、miR-433、miR-434、miR-451、miR- 466b、miR-485、miR-495、miR-539、miR-541、miR-543*、miR-551b、miR-758及miR-873，其以全文引用之方式併入本文中。
D
ICP27 在 VG2062 中之表現受轉錄控制
HSV-1病毒複製視病毒基因之表現的級聯而定，其中即刻早期基因產物(尤其ICP4及ICP27)控制病毒早期基因及晚期基因之後續表現，該後續表現管控病毒之裂解複製週期。ICP4或ICP27之缺失引起病毒複製之完全消除及病毒基因表現的顯著減少，其使得ICP4及ICP27極佳地以溶瘤HSV中之腫瘤特異性調節為目標。
儘管ICP4為調節病毒基因表現之主要轉錄因子，但ICP27為調節多種病毒基因之轉錄的多功能蛋白。mRNA之所有層中之ICP27功能生物起源於轉錄、RNA處理及輸出至轉譯。ICP27亦已涉及細胞核蛋白品質控制、細胞週期控制、應激信號傳導路徑之活化及細胞凋亡之預防。
在VG2062中，ICP27之自然啟動子用279bp啟動子替代用於人類C-X-C基序趨化激素受體4 (CXCR4)以增強通常具有高含量CXCR4之泌尿腫瘤中的表現。
E
VG2062 之 負載物表現增強
VG2062共表現IL12、IL15及IL15受體α亞單位以進一步刺激免疫調節反應。IL12之表現促進曝露抗原之T細胞極化至發炎性及抗腫瘤T
H1表型，而IL-15活化NK細胞以進一步增加腫瘤殺死及抗原呈遞細胞之活化。除IL15表現以外，VG2062編碼IL15Rα以進一步增強免疫刺激。
IL-12、IL-15及IL-15Rα之轉錄可由單一強啟動子(例如諸如CMV之病毒啟動子，或諸如EF-1α或CAG之其他強啟動子)驅動且多肽與在轉譯期間經由核糖體跳躍機制生成3個獨立蛋白之2A自裂解肽(參見SEQ ID NO. 7；亦參見Z. Liu等人, 2017, Systemic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Scientific Reports, 7(1), 1-9)連接。
F
經截斷醣蛋白 B ( gB )
HSV-1膜融合為感染期間之關鍵步驟。視四個基本病毒醣蛋白(gB、gD、gH及gL)而定，其介導藉由合併病毒套膜與宿主細胞膜進入宿主細胞。核心融合蛋白為醣蛋白B (gB)，一由HSV-1之UL27基因編碼的904個殘基之醣基化跨膜蛋白。gB之細胞質域內的多種類型之突變已產生過度融合表現型，增加細胞-細胞融合(Chowdary及Heldwein, 2010, Syncytial Phenotype of C0Terminally Truncated Herpes Simplex Virus Type 1 gB Is Associated with Diminished Membrane Interactions. Journal of Virology, 84(10), 4923-4935)。在一個實施例中，gB可藉由自全長蛋白截斷C-末端胺基酸877至904來修飾。
G
經修飾 ICP47 啟動子
在HSV基因體中，控制編碼UL47之US12基因之表現的啟動子與控制位於來自US12基因之大約13k鹼基對的US1基因之表現的啟動子一致。另外，自然ICP47啟動子之較大區包括可能促進假性同源重組事件之重複序列。因此，預測用異源啟動子替代自然ICP47啟動子提高病毒之基因體穩定性。
在HSV中，ICP27及ICP47均由即刻早期基因(在感染之後極早表現)編碼且共用多個調控元件。因此，為了降低同源重組之風險同時維持天然表現模式，在VG2062構築體中將自然ICP47啟動子用自然ICP27啟動子替代。
在一些實施例中，自然ICP27啟動子包括位於UL53 (gK)與UL57 (ICP27)之編碼區之間的DNA之完整序列。在一個實施例中，ICP27啟動子包括SEQ ID NO. 1中所闡述之538bp序列。
在其他實施例中，ICP27啟動子序列可與任何已知的人類疱疹病毒1型病毒株或人類單純疱疹病毒2型病毒株(例如人類疱疹病毒1型病毒株17 (NCBI參考序列NC_001806.2)之ICP27啟動子序列90%、80%、70%、60%或50%一致。
hVG2062為ICP27在CXCR4啟動子控制下、ICP34.5在miRNA-124/143控制下及ICP47在ICP27啟動子控制下之溶瘤病毒產物。hVG2062亦合併編碼在CMV啟動子之控制下的IL-12、IL-15/IL-15RA之表現病毒的細胞介素卡匣。hVG2062中之表現控制機制經設計以增加安全性而不犧牲功效。針對野生型-HSV-1病毒株17+之特異性修飾闡述於下表1中。
CEA=癌胚抗原；CXCR4=C-X-C基序趨化激素受體4；gB=醣蛋白B；HSV-1=單純疱疹病毒-1；ICP0=受感染細胞多肽0；ICP27=受感染細胞多肽27；ICP47=受感染細胞多肽47；ICP34.5=受感染細胞多肽34.5；IL=介白素；miR=微小RNA；Rα=受體α；TR
L=末端重複長；TR
S=末端重複短；UL=唯一長；US=唯一短；LAT=潛伏相關轉錄物。
| 表 1 ： 來自野生型HSV -1 病毒株17 + 之VG2062 中的基因修飾 | |||
| 修飾 | 修飾類型 | 修飾位置 | 功能 |
| 含有ICP4、ICP0、ICP34.5及LAT基因之末端重複長(TR L)及短(TR S)均缺失 | 缺失 | 末端重複長(TR L)及短(TR S) | 野生型HSV-1含有TR L及TR S之兩個一致複本。移除一個複本可減弱毒性同時釋放基因體空間用於負載物插入。 |
| 用CXCR4啟動子替代自然ICP27啟動子 | 替代 | ICP27基因啟動子 | 促進CXCR4陽性腫瘤細胞中之病毒複製 |
| 在ICP34.5 3'-UTR中插入用於miR143及miR124之結合位點 | 插入 | ICP34.5基因3'-UTR | 抑制ICP34.5在高度表現miR143及/或miR124之細胞中之表現 |
| 醣蛋白B (gB)編碼區之3'端中84 bp之缺失 | 缺失 | (gB)編碼區之3'端 | 為了增強之融合性使HSV-1 gB蛋白在其C端處截斷28個胺基酸 |
| 以帶有CMV啟動子之表現卡匣形式插入IL-12、IL-15及IL-15Rα | 插入 | 在UL3與UL4基因之間 | 促進IL-12、IL-15及IL-15Rα在所有類型之不遏制CMV啟動子功能的感染細胞中之表現 |
| 用ICP27啟動子替代自然ICP47啟動子 | 替代 | ICP47基因啟動子 | 降低重複性及非唯一ICP47啟動子區中重組合事件之風險 |
VG2062為條件複製型溶瘤HSV-1病毒。VG2062之基因體使含有ICP34.5之一個複本、ICP0及LAT的HSV-1之末端重複長(TR
L)序列及含有ICP4之一個複本的HSV-1之末端重複短(TR
s)序列缺失。ICP34.5之剩餘複本在其含有用於miRNA miR-124及miR-143之結合域的多個複本之3'UTR區中具有插入，miRNA miR-124及miR-143在神經元及正常組織中而非在腫瘤細胞中高度表現。產物進一步藉由用來自腫瘤選擇性C-X-C基序趨化激素受體4 (CXCR4)基因之腫瘤特異性啟動子替代編碼ICP27 (受感染細胞多肽27)之基本病毒基因UL54之自然病毒啟動子來修飾。產物進一步藉由用驅動編碼ICP27 (受感染細胞多肽27)之即刻早期UL54基因之表現的自然病毒啟動子替代驅動編碼ICP47 (受感染細胞多肽47)之即刻早期US12基因之表現的自然病毒啟動子來修飾。VG2062亦表現由IL-12、IL-15及IL-15Rα組成之強效免疫調節負載物，該強效免疫調節負載物受細胞巨大病毒(CMV啟動子)控制。最後，VG2062具有醣蛋白B (gB)截斷以增強融合活性，從而促進病毒在腫瘤微環境內擴散。
H
治療組合物
提供可用於預防、治療或減輕疾病(諸如(例如)癌症)之作用的治療組合物。更特定言之，提供包含至少一種如本文所述之溶瘤病毒的治療組合物。
在某些實施例中，組合物將進一步包含醫藥學上可接受之載劑。片語「醫藥學上可接受之載劑」意欲涵蓋不干擾溶瘤病毒之生物活性的有效性且對於所投與之個體無毒性之任何載劑、稀釋劑或賦形劑(一般參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 第21版5月1日, 2005及The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 40 - NF 35及增刊)中)。
在如本文所述之溶瘤病毒情況下，適合的醫藥學載劑之非限制性實例包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑(諸如油/水乳劑)、各種類型之濕潤劑、無菌溶液及其他醫藥學載劑。另外的醫藥學上可接受之載劑包括凝膠、生物可吸收基質材料、含有溶瘤病毒之移植元件或任何其他適合的媒劑、遞送或分配構件或材料。此類載劑可藉由習知方法調配且可以有效劑量向個體投與。另外的醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)水、鹽水、聚乙二醇、玻尿酸及乙醇。醫藥學上可接受之鹽亦可包括於其中，例如無機酸鹽(諸如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及其類似鹽)及有機酸鹽(諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽及其類似鹽)。此類可用於遞送oHSV至癌細胞之醫藥學上可接受(醫藥學級別)載劑、稀釋劑及賦形劑較佳地不會在接受組合物之個體(個體)中誘導免疫反應(且較佳地係無過度毒性情況下投與)。
本文提供之組合物可以各種濃度提供。舉例而言，溶瘤病毒之劑量可以約10
6至約10
9pfu之範圍內提供。在另外實施例中，每2-3週的治療時，可將至多達4 ml之約10
6至約10
8pfu/ml之範圍內的劑量注射給具有較大病灶(例如＞5 cm)之患者中及將較小量(例如至多0.1ml)注射給具有較小病灶(例如＜0.5 cm)之患者中。
在本發明之某些實施例中，可採用比標準低之劑量。因此，在某些實施例中，可將少於約10
6pfu/ml (每2-3週至多4 ml注射至患者中)向患者投與。
組合物可在有利於穩定儲存期限之溫度下儲存，及包括室溫(約20℃)、4℃、-20℃、-80℃及在液體N
2中。因為組合物一般意欲活體內使用，通常不具有防腐劑，故儲存一般應在更冷的溫度下。組合物可乾燥(例如凍乾)或以液體形式儲存。
I
投與
除本文所述組合物以外，提供使用此類組合物治療或減輕癌症之各種方法，其包含向個體投與有效劑量或量的如本文所述之oHSV之步驟。
術語「有效劑量」及「有效量」係指足以有效治療目標癌症之溶瘤病毒的量，例如有效減小目標腫瘤大小或負載或者阻止目標腫瘤細胞生長率之量。更特定言之，此類術語係指為達成所需結果有效的(在必需劑量及治療時間段下)溶瘤病毒之量。舉例而言，在治療癌症之情形下，有效量之本文所述組合物為引起改善、減小腫瘤負荷及/或防止腫瘤擴散或癌症生長的量。有效量可根據以下因素而改變，諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重以及醫藥調配物、投與途徑及其類似因素，但仍然可由熟習此項技術者常規地判定。
該治療組合物係經投與給經診斷患有癌症或疑似患有癌症之個體。個體可為人類或非人類動物。
該組合物用於治療癌症。如本文所用，術語「治療(treat/treating/treatment)」意謂獲得有益或所需結果(包括臨床結果)之方法。有益或所需臨床結果可包括(但不限於)可偵測或不可偵測之一或多種症狀或病況之緩解或減輕、疾病程度之減弱、穩定的(亦即不惡化)疾病狀態、防止疾病擴散、疾病進展之延遲或減緩、疾病狀態之減輕或緩和、疾病復發之減弱以及改善(部分或完全)。術語「治療」亦可意指與若未接受治療之預期存活期相比具有延長的存活期。
癌症之代表性形式包括癌瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤及肉瘤。白血病之代表性形式包括急性骨髓白血病(acute myeloid leukemia，AML)及淋巴瘤之代表性形式包括B細胞淋巴瘤。進一步實例包括(但不限於)膽管、大腦(例如神經膠母細胞瘤)、乳房、宮頸、結直腸、CNS (例如聽神經瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、神經膠母細胞瘤、血管母細胞瘤、神經管母細胞瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤、少突神經膠質瘤、松果體瘤及視網膜母細胞瘤)、子宮內膜內層、造血細胞(例如白血病及淋巴瘤)、腎、膀胱、喉、肺、肝、口腔、卵巢、胰臟、前列腺、皮膚(例如黑色素瘤及鱗狀細胞癌)、GI (例如食道、胃及結腸)及甲狀腺之癌症。癌症可包含實體腫瘤(例如肉瘤，諸如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤及骨原性肉瘤)，為彌漫性(例如白血病)，或此等(例如具有實體腫瘤及播散性或彌漫性癌細胞之轉移癌)之某一組合。癌症亦可對習知治療(例如習知化學療法及/或放射療法)具有抗性。良性腫瘤及其他具有不希望的細胞增殖之病況亦可治療。
尤其較佳的待治療癌症包括具有高含量CXCR4表現之彼等癌症。代表性實例包括肺腫瘤、乳房及前列腺腫瘤、神經膠母細胞瘤、例如食道之胃腸道(及相關器官)的腫瘤、膽管癌瘤、肛門、胃、膀胱、腸、胰臟、結腸及肝以及所有表面可注射腫瘤(例如黑色素瘤)。
本文所述之重組單純疱疹病毒可藉由例如口服、局部、非經腸、全身性、靜脈內、肌肉內、眼內、鞘內、腫瘤內、皮下或經皮之途徑提供。在某些實施例中，溶瘤病毒可藉由插管、藉由導管或藉由直接注射遞送。投與部位可直接投與至腫瘤中、靠近腫瘤或在遠離腫瘤之部位。投與途徑通常應視所針對之癌症類型而定。
在此項技術內溶瘤病毒之最佳或適當劑量方案可容易地由主治醫師基於患者資料、患者觀測結果及各種臨床因素確定，臨床因素包括(例如)個體之身材、體表面積、年齡、性別以及待投與之特定溶瘤病毒、投與時間及途徑、所治療之癌症類型、患者之一般健康及患者所經受之其他藥物療法。
本文所述之重組單純疱疹病毒可調配為用於臨床用途之藥劑及醫藥組合物且可與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑組合。調配物將(至少部分)視投與途徑而定。適合的調配物可包含於無菌介質中之病毒及抑制劑。調配物可為流體、凝膠、膏體或固體形式。可向個體或醫療專業人士提供至調配物。
較佳投與治療有效量。此為足以展示對個體之益處的量。投與之實際量及投與時程應至少部分視癌症之性質、個體之病況、遞送部位及其他因素而定。
在本發明之又其他實施例中，本文所提供之溶瘤病毒可與阻斷、結合或者抑制PD-1或其配體的治療劑一起(例如之前、同時或之後)投與。簡言之，PD-1 (或「計劃性細胞死亡蛋白1」，且亦稱為CD279)為T及B細胞之表面上的蛋白，其具有下調免疫系統進而遏制T細胞發炎性活性及阻止或降低免疫系統殺死腫瘤細胞之能力的作用。
PD-1具有兩個配體：PD-L1及PD-L2。PD-1、PD-L1及PD-L2拮抗劑之代表性實例包括以統計學上顯著之方式阻斷、結合或者抑制PD-1或其配體的結合進而抑制或減弱其活性之肽及抗體。PD-L1拮抗劑之代表性實例包括：阿特珠單抗(Atezolizumab) (TECENTRIQ-人源化抗-PD-L1抗體)；阿維魯單抗(Avelumab) (BAVENCIO-全人類抗-PD-L1抗體)；度伐魯單抗(Durvalumab) (IMFINZI-人類抗-PD-L1抗體)；度伐魯單抗(IMFINZI-全人類igG1抗體)；KN035；科西貝利單抗(Cosibelimab) (Checkpoint Therapeutics之CK-301)；AUNP12 (Aurigene及Laboratoires Pierre Fabre之肽PD-1/PD-L1抑制劑)；CA-170；及BMC-986189 (巨環肽)。
PD-1拮抗劑之代表性實例包括以下代表性抗PD-1抗體：納武單抗(Nivolumab) (OPDIVO-人類抗PD-1抗體)；帕博利珠單抗(Pembrolizumab) (KEYTRUDA-人源化抗PD-1抗體)；西米普利單抗(Cemiplimab) (LIBTAYO-抗PD-1抗體)；多塔利單抗(Dostarlimab) (JEMPERLI-抗PD-1抗體)；Jounce Therapeutics之沃普瑞單抗(Vopratelimab) (JTX-4014)；Novartis之斯巴達珠單抗(Spartalizumab) (PDR001)；卡瑞利珠單抗(Camrelizumab) (SHR1210)-Jiangsu HengRui Medicine有限公司之抗PD-1單株抗體；信迪利單抗(Sintilimab) (IBI308)，Innovent及Eli Lilly研發之人類抗PD-1抗體；替雷利珠單抗(Tislelizumab) (BGB-A317)-人源化IgG4抗PD-1單株抗體；特瑞普利單抗(Toripalimab) (JS 001)，對抗PD-1之人源化IgG4單株抗體；INCMGA00012 (MGA012)，Incyte及MacroGenics研發之人源化IgG4單株抗體；AstraZeneca/MedImmune及GlaxoSmithKline之AMP-224；及AstraZeneca之AMP-514 (MEDI0680)。
描述PD-1、PD-L1及PD-L2拮抗劑及評定其活性之方法的代表性專利及專利申請案包括例如：美國專利第7,595,048號、第7,943,743號、第8,952,136號、第8,217,149號、第8,609,089號、第8,735,553號、第8,779,105號、第8,779,108號、第8993731號及第9,815,897號；美國公開案第2010/0203056號、第2010/0266617號、第2011/0229461號、第2013/0017199號、第2014/341917號、第2015/0203579號、第2016/0311903號、第2016/0376367號、第2016/0311903號、第2017/0044259號及第2018/0346569號；及PCT公開案第WO2012145493號；其全部以全文引用之方式併入。
根據某些實施例，使用如本文所述之溶瘤病毒及PD-1、PD-L1或PD-L2拮抗劑治療個體可與另外類型的療法組合，諸如手術切除、投與不同溶瘤病毒、放射療法、投與檢查點抑制劑、使用例如化學治療劑(諸如依託泊苷(etoposide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、阿黴素(adriamycin)、長春新鹼(vincristine)、多西環素(doxycycline))之化學療法及其他療法。
實例
綜述： 所有病毒突變誘發均可在大腸桿菌(
Escherichia coli)中使用實施於選殖入細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)之病毒基因體上的標準λ紅介導之重組工程技術執行(一般參見：Tischer BK, Smith GA, Osterrieder N. Methods Mol Biol. 2010;634:421-30. doi: 10.1007/978-1-60761-652-8_30. PMID: 20677001；Tischer BK, von Einem J, Kaufer B及Osterrieder N., BioTechniques 40:191-197, 2006年2月(包括補充材料), doi: 10.2144/000112096；及Tischer BK, Smith, GA及Osterrieder N. Chapter 30, Jeff Braman (編), In Vitro Mutagenesis Protocols: 第三版, Methods in Molecular Biology, 第634卷, doi: 10.1007/978-1-60761-652-8_30, Springer Science+Business Media, LLC 2010)。
BAC重組工程需要在病毒基因體內存在外源性BAC DNA以促進
E . coli中之突變誘發。BAC序列最常插入病毒基因之間(諸如HSV基因US1/US2、UL3/UL4及/或UL50/UL51)或插入可破壞自然TK之表現的胸苷激酶(thymidine kinase，TK)基因中。TK缺陷型病毒載體可包括用於自然病毒胸苷激酶(TK)基因之複本的表現卡匣，其在插入病毒基因體之非編碼區中的組成型啟動子之控制下。或者，TK功能可藉由經由同源重組移除外源性BAC序列以復原自然TK基因序列來恢復。功能性TK基因之存在藉由使得病毒對使用鳥苷類似物(諸如更昔洛韋(ganciclovir)及阿昔洛韋(acyclovir))之常用治療敏感而增強病毒安全性。
實例1
研發TTDR病毒平台VG203
如圖1中所示，轉錄調節係藉由利用腫瘤特異性CXCR4啟動子控制基本HSV-1反式活化蛋白ICP27之表現來實現。轉譯調節採用插入關鍵HSV-1神經毒性因子ICP34.5之3'-UTR中的微小RNA結合位點之多個串聯複本，ICP34.5促進在正常細胞中充足而在腫瘤細胞中下調的微小RNA之結合。該等微小RNA之連接引起正常細胞中轉譯減少及ICP34.5 mRNA轉錄物之降解增加，同時允許在腫瘤細胞中在幾乎野生型水平下繼續產生ICP34.5。另外，醣蛋白B經截斷以增加融合性且將編碼IL-12、IL-15及IL-15α受體之CMV啟動子驅動細胞介素表現卡匣插入HSV-1基因UL3與UL4之間。驅動ICP47之表現的自然啟動子亦由HSV-1 ICP27啟動子替代以降低重複性及非唯一ICP47啟動子區中之重組合事件之風險。野生型HSV-1含有RL (含有ICP0及ICP34.5)及RS (含有ICP4)之兩個一致複本，其在病毒複製期間促進重組合事件，在US及UL區之方向反轉處產生HSV-1基因體之四個大致等莫耳的異構體(一般參見Slobedman B, Zhang X, Simmons A. Herpes simplex virus genome isomerization: origins of adjacent long segments in concatemeric viral DNA. J Virol. 1999年1月;73(1):810-3. doi: 10.1128/JVI.73.1.810-813.1999. PMID: 9847394; PMCID: PMC103895)。基因體線性化發生在RL-RS接合處，且側接基因體之分開的RL及RS通常稱為TRL (末端重複長)及TRS (末端重複短)，而未分開的RL及RS內部組稱為IRL (內部重複長)及IRS (內部重複短)。吾人移除RL及RS之一個複本以降低內部重組合之機率且將病毒基因體固定至單一穩定組態中，而同時減弱毒性並釋放基因體空間以便負載物插入。
CXCR4=C-X-C基序趨化激素受體4；gB=醣蛋白B；HSV-1=單純疱疹病毒-1；ICP0=受感染細胞多肽0；ICP27=受感染細胞多肽27；ICP47=受感染細胞多肽47；ICP34.5=受感染細胞多肽34.5；IL=介白素；miR=微小RNA；TRL=末端重複長；TRS=末端重複短；UL=唯一長；US=唯一短。VG2062為VG203之歷史名稱且可互換使用。
實例2
病毒基因表現之微小RNA介導之控制
目的 ：研究微小RNA控制病毒基因之表現的能力。
程序 ：將293T細胞用miR-124及miR-143或miR-223及miR-125b之前驅物轉染。用錯義miR轉染充當陰性對照。轉染後24小時，細胞重複感染VG17 (野生型)、VG161、mVG2031-TK、VG2062-TK或VG21224-TK之兩種不同選殖株。VG17及VG161因其並不併入外源性miR結合位點而充當陰性對照，而mVG2031-TK為含有小鼠IL-12而非人類IL-12之VG2062的鼠類版本。VG21224-TK為VG21224之別名(參見PCT/CN2023/073525)，及VG2062-tk為VG2062之別名。VG21224與VG2062之間的差異在於位於VG21224中之ICP27的3-'UTR中之miR-223之結合位點的5個串聯複本及miR-125b之結合位點的5個串聯複本之存在。感染後6小時將RNA分離且進行RT-qPCR以量測ICP27及ICP34.5轉錄物之含量。
結果 ：如圖2中所示，對於所有在ICP34.5之3'-UTR中併入miR-124及miR-143結合位點之病毒(mVG2031-TK、VG2062-TK及VG21224-TK)而言miR-124及miR-143之存在均使得ICP34.5轉錄物減少大致50%。使用miR-223及miR-125b調節ICP27甚至更有效，使得VG21224-TK之兩種測試選殖株中ICP27表現幾乎完全減少。引起關注地，在VG21224-TK中miR-223及miR-125b在下調ICP34.5轉錄物方面甚至比miR-124及miR-143更有效，儘管在ICP34.5之3'-UTR中缺少miR-223及miR-125b結合位點，可能由於在VG21224-TK中經由miR-223及miR-125b有效調節ICP27。ICP27為其他病毒基因(包括ICP34.5)之關鍵反式活化子，解釋為何下調ICP27表現亦將使得其他病毒基因之表現減少，最終引起表現高含量之miR-223及miR-125b的非腫瘤細胞中複製效率降低。
結論 ：在此實驗系統中微小RNA能夠有效控制病毒基因之表現。
實例3
細胞-細胞融合表現型之比較
目的 ：評估不同重組HSV引起活體外細胞-細胞融合之能力。
程序 ：將Vero細胞單層接種於96孔盤中且用VG21224 (VG202)、VG2062 (VG203)及VG2063感染。感染後3天病毒溶菌斑以10x放大率成像。VG2063在保留自然ICP47啟動子方面不同於VG2062，而VG2062及VG21224均用HSV-1 ICP27啟動子替代自然ICP47啟動子。
結果 ：如圖3中所示，VG2063僅展現輕微融合性。然而，如由經VG21224及VG2062感染之Vero細胞中多種多核巨細胞(融合細胞)之存在所證明，當用ICP27啟動子替代自然ICP47啟動子時吾人觀測到細胞-細胞融合之顯著及未預期增加。此結果為顯著的，因為ICP47在細胞-細胞融合中無已知作用且未曾記載ICP47中之融合突變。
結論 ：用自然ICP27啟動子替代自然ICP47啟動子得到融合細胞形成之未預期增加。
實例4
歷經多次活體外傳代後HSV基因體穩定性
目的 ：評估在使位於基因UL1與US12 (ICP47)之間的RL之一個複本及RS之一個複本缺失之後UL-US接合點之穩定性。吾人假設替代自然ICP47啟動子應對HSV基因體穩定性具有正面效果，因為驅動編碼ICP47之US12基因的啟動子與位於離US區之對側上的US12大約13kbp之US1基因之啟動子一致。此外，大部分自然ICP47啟動子包含可促進假性同源重組事件之重複性序列。
程序 ：含有位於基因UL1與US12之間的RL之一個複本及RS之一個複本之缺失及用ICP27啟動子替代US12 (ICP47)啟動子的VG2062病毒在Vero細胞上傳代多次。位於基因UL1與US12之間的DNA區之穩定性藉由使用黏合至UL1及US12的引子來確定，UL1及US12編碼區且藉由PCR擴增位於基因UL1與US12之間的區。將PCR結果與對照病毒的PCR結果相比，該對照病毒亦含有位於基因UL1與US12之間的RL之一個複本及RS之一個複本之缺失但保留自然US12 (ICP47)啟動子。對照病毒亦在Vero細胞上經受多次傳代。
結果 ：即使在多次活體外傳代之後吾人亦未觀測到對應於VG2062中之UL-US接合點的經PCR擴增之DNA片段之電泳活動性之變化。亦對經PCR擴增之DNA片段進行定序且未觀測到傳代之間DNA序列中之變化。此結果與對照病毒相反，在於在若干次活體外傳代之後UL-US接合點無法藉由PCR擴增。
結論 ：在使來自該UL-US接合點的RL之一個複本及RS之一個複本缺失之後用ICP27啟動子替代自然ICP47啟動子增加HSV UL-US接合點之基因體穩定性，其中UL-US接合點由UL1及US12 (ICP47)側接。
實例5
在VG2062中對藉由CXCR4啟動子調節HSV-1 ICP27基因進行分析
目的 ：C-X-C基序趨化激素受體4 (CXCR4)與腫瘤生長及其在整個身體中之轉移有關。作為VG2062中所採用之轉錄及轉譯雙重調節(TTDR)策略之部分，將HSV-1基因ICP27之自然啟動子用腫瘤特異性CXCR4啟動子替代。此研究藉由偵測ICP27基因DNA以使VG2062複製與各細胞株中之CXCR4表現相關及藉由利用溶菌斑檢定定量感染細胞中的VG2062生長來評估9種泌尿癌瘤細胞株。
程序 ：細胞株T24、DU145、UM-UC-3、HT-1376、786-0、LNCap、J82、PC3及22Rv1係在具有適當生長介質之T182培養瓶中生長。在第0天，將細胞用胰蛋白酶處理並接種至24孔盤中。在第1天之0 h，將細胞用VG2062以MOI=0.001感染2小時(對於各樣品重複進行三次)。在2小時、24小時、48小時、72小時及96小時收集樣品。將細胞裂解物用於DNA/mRNA萃取且將上清液用於病毒滴定。按照套組供應商提供之方案分離DNA及mRNA，且將經純化DNA及mRNA在30 μl無核酸酶水中溶離。使mRNA (200ng)反轉錄並在20 μl ddH2O中收集cDNA且之後用180 μl ddH2O 1:10稀釋。對cDNA進行qPCR以量測相對於管家基因GAPDH之表現的CXCR4基因表現，而亦對DNA進行qPCR以量測相對於GAPDH之ICP27基因複本數。
為了溶菌斑檢定，用無血清培養基對受感染細胞上清液進行連續10倍稀釋，且將500 μl經稀釋之樣品用於在12孔盤中感染Vero細胞。在培育2小時之後用500 μl凝膠狀介質(MEM+1.5%甲基纖維素+1%FBS)覆蓋受感染Vero細胞。隨後將盤保持在CO2保溫箱中3天，此時抽取並丟棄凝膠狀介質。藉由添加500 μl 4%戊二醛2小時來固定細胞。將500 μl 0.5%結晶紫溶液添加至各孔中，並將盤洗滌及風乾。自各孔統計並記錄溶菌斑之數量。
結果 ：將自受VG2062感染之細胞分離的RNA樣品用於量測CXCR4基因及細胞GAPDH之mRNA表現量，而將自受VG2062感染之細胞分離的DNA樣品用於量測病毒ICP27及細胞GAPDH之DNA含量。自24孔盤中之3個複製孔收集樣品。自各樣品之2個複製孔確定平均循環閾值(Ct)。CXCR4之Ct值減去GAPDH之Ct值用於獲得ΔCt (CXCR4-GAPDH，0 h)。ICP27之Ct值減去GAPDH之Ct值用於獲得各時間點之ΔCt (ICP27-GAPDH)，且72小時時間點減去2小時時間點之ΔCt (ICP27-GAPDH)用於計算ΔCt (ICP27-GAPDH，72 h-2 h)，其對應於病毒DNA複本數之增加的變化。
在平均來自各細胞株之3次平行資料集之後以統計方式分析資料。使用GraphPad Prism軟體8.0確定ICP27 DNA與CXCR4 mRNA之間的各別相關性(R)及P值。基於如圖4中所描繪之線性擬合將9種細胞株分為2組。A組由T24、DU145、J82及PC3細胞株組成。在感染後72 h，病毒ICP27 DNA含量與各細胞株中CXCR4 mRNA之背景含量正相關(R=0.98，P=0.0237)。B組由UM-UC-3、HT-1376、786-0、LNCap及22Rv1細胞株組成。在感染後72 h，病毒ICP27 DNA含量亦與各細胞株中CXCR4 mRNA之背景含量正相關(R=0.96，P=0.0087)。
藉由溶菌斑檢定來定量5個時間點下9種測試細胞株中VG2062之複製動力學(圖5)。VG2062在T24細胞上傳播不充分(低於溶菌斑檢定之偵測限：10 PFU/mL)，其與圖4中所觀測到的結果(來自T24細胞樣品之ICP27及CXCR4之qPCR反應中的高CT數值)相符。VG2062能夠在其餘8種腫瘤細胞株上傳播。
總體而言，所觀測到之受感染細胞中VG2062病毒DNA產生與CXCR4表現量之間的穩固相關性強有力地支持吾人之用於重組OV建構的轉錄及轉譯雙重調節(TTDR)策略。
實例6
不同泌尿腫瘤細胞株中VG2062之細胞毒性
目的 ：比較一組10種不同泌尿腫瘤細胞株中TTDR病毒VG2062與非TTDR病毒VG161之細胞毒性。
程序 ：將T24、DU145、ACHN、UMUC-3、HT1376、786-0、LNCap、J82、PC3及Caki-1細胞接種至96孔盤中並用VG161或VG2062之不同MOI處理。讀取OD450nm以評估感染之後24 h、48 h及96 h之細胞存活率。
結果 ：結果提供於圖6中。LNCap細胞在所有測試時間點均對兩種病毒之HSV介導之細胞毒性高度敏感，而J82細胞及Caki-1細胞甚至在96 h時間點對HSV介導之細胞殺死具有抗性。在具有可量測細胞毒性(IC50 MOI＜25)之所有細胞株及時間點中，當與VG161相比時VG2062病毒持續展現增加之細胞殺死，其中VG2062 IC50 MOI值範圍在比VG161低2倍與超過15倍之間。
實例7
細胞介素負載物表現之定量
目的 ：量測來自受VG161及VG2062病毒感染之泌尿腫瘤細胞株之人類IL-12及人類IL-15負載物分泌。
程序 ：在37℃下將T24、DU145、ACHN、UMUC-3、HT1376、786-0、LNCap、J82、PC3及Caki-1細胞接種於12孔盤中整夜且接著分別用VG161 (非TTDR病毒)或VG2062 (TTDR病毒)以MOI=0.01感染48小時。收集細胞上清液並藉由ELISA定量人類IL 12p70及人類IL-15/IL-15Rα。
結果 ：在所有測試病毒及細胞株中均觀測到可偵測水平之IL-12及IL15，但與來自受VG161感染之細胞的IL-12及IL-15相比受VG2062感染之細胞中之IL-12及IL-15含量普遍更高(圖7)。
實例8
評估A549人類肺癌異種移植模型中之VG2062功效
目的 ：評估以腫瘤內(i.t.)方式投與VG2062在雌性BALB/c裸鼠之A549人類肺癌異種移植模型的抗腫瘤功效。
程序 ：對12隻雌性BALB/c裸鼠進行皮下移植A549細胞。將小鼠隨機分為2組，其中治療組8隻小鼠而對照組4隻小鼠。將隨機分組之日定義為第0天。第2組投與DPBS+7.5%丙三醇(媒劑對照)。第1組在第1、2及3天以腫瘤內方式接受3次劑量之VG2062 (2.4×10
7PFU/小鼠/劑量，0.1 mL/動物)。所有動物均藉由在不同身體部位上標記來適當地識別，且根據標準方案圈養及餵食。至少2次/週藉由數位卡尺來量測腫瘤之最長直徑(mm)及最短直徑(mm)。腫瘤體積按TV=0.5×a×b
2計算，其中：TV=腫瘤體積，mm
3；a=最長直徑，mm；b=最短直徑，mm。計算各組之平均腫瘤體積且以平均值±平均值之標準誤差(standard error of mean，SEM)表示。小於0.05之P值被視為在統計學上具有顯著性。
結果 ：隨機分組時間(第0天)，腫瘤體積在統計學上沒有差異。實驗期間，媒劑對照組(第2組)小鼠之腫瘤體積繼續增大，而用3次劑量之2.4×10
7PFU/小鼠/劑量的VG2062處理之小鼠之腫瘤體積保持相對穩定(圖8)。與媒劑對照組相比，病毒處理組在注射後14天及其後之每個時間點均展示對腫瘤生長之統計學上顯著的抑制(P＜0.05)。在此研究期間小鼠對VG2062耐受良好，且此等資料指示VG2062在諸如A549之肺癌細胞中具有顯著抗腫瘤效應。
實例9
攜帶前列腺癌PC3之小鼠中之劑量遞增研究
目的 ：評估不同劑量之VG2062對異種移植有PC3細胞株(人類前列腺癌)之小鼠的抗腫瘤活性。
程序 ：對40隻SPF級雄性裸鼠(4-5週大)進行皮下移植5×10
6個PC3細胞/小鼠。接種部位為小鼠之靠近腋窩之背部的右側。將小鼠隨機分為5組，其中每組8隻小鼠。分組給藥之日定義為第0天。第5組投與DPBS+7.5%丙三醇(媒劑對照)。第1至4組係以腫瘤內注射方式接受單次不同劑量之VG2062 (0.1 mL/動物)的測試組。第1組接受2.4×10
7PFU/小鼠之劑量，第2組接受2.4×10
6PFU/小鼠之劑量，第3組接受2.4×10
5PFU/小鼠之劑量及第4組接受2.4×10
4PFU/小鼠之劑量。所有動物均藉由在不同身體部位上標記來適當地識別，且根據標準方案圈養及餵食。至少2次/週藉由數位卡尺來量測腫瘤之最長直徑(mm)及最短直徑(mm)。腫瘤體積按TV=0.5×a×b
2計算，其中：TV=腫瘤體積，mm
3；a=最長直徑，mm；b=最短直徑，mm。計算各組之平均腫瘤體積且以平均值±平均值之標準誤差(SEM)表示。小於0.05之P值被視為在統計學上具有顯著性。
結果 ：隨機分組時間(第0天)，腫瘤體積在統計學上沒有差異。實驗期間，媒劑對照組(第5組)小鼠之腫瘤體積繼續增大——第0天之腫瘤體積為149.85±2.18 mm
3，其在第28天生長至3151.38±325.33 mm
3(圖9)。在第1組(2.4×10
7PFU/小鼠)中，腫瘤體積在第28天為1297.80±196.40 mm
3。在第2組(2.4×10
6PFU/小鼠)中，腫瘤體積在第28天為1913.91±246.23 mm
3。在第3組(2.4×10
5PFU/小鼠)中，腫瘤體積在第28天為2175.27±4292.09 mm
3。在第4組(2.4×10
4PFU/小鼠)中，腫瘤體積在第28天為3032.35±422.25 mm
3。與媒劑對照組相比，第1組及第2組均展示對腫瘤生長之統計學上顯著的抑制(P＜0.05)。在此研究期間小鼠對VG2062耐受良好，且此等資料指示以2.4×10
6PFU/小鼠之劑量起始的VG2062在諸如PC3之前列腺癌細胞中具有顯著抗腫瘤效應。
實例10
攜帶前列腺癌DU145之小鼠中的劑量遞增研究
目的 ：評估不同劑量之VG2062對異種移植有DU145細胞株(人類前列腺癌)之小鼠的抗腫瘤活性。
程序 ：對40隻SPF級裸鼠進行皮下移植DU145細胞。將小鼠隨機分為5組，其中每組有8隻小鼠。分組給藥之日定義為第0天。第5組投與DPBS+7.5%丙三醇(媒劑對照)。第1至4組係以腫瘤內注射方式接受單次不同劑量含量之VG2062 (0.1 mL/動物)的測試組。第1組接受2.4×10
7PFU/小鼠之劑量，第2組接受2.4×10
6PFU/小鼠之劑量，第3組接受2.4×10
5PFU/小鼠之劑量及第4組接受2.4×10
4PFU/小鼠之劑量。所有動物均藉由在不同身體部位上標記來適當地識別，且根據標準方案圈養及餵食。至少2次/週藉由數位卡尺來量測腫瘤之最長直徑(mm)及最短直徑(mm)。腫瘤體積按TV=0.5×a×b
2計算，其中：TV=腫瘤體積，mm
3；a=最長直徑，mm；b=最短直徑，mm。計算各組之平均腫瘤體積且以平均值±平均值之標準誤差(SEM)表示。小於0.05之P值被視為在統計學上具有顯著性。
結果 ：隨機分組時間(第0天)，腫瘤體積在統計學上沒有差異。實驗期間，媒劑對照組(第5組)小鼠之腫瘤體積以比用VG2062處理之小鼠之腫瘤體積更高的速率增大(圖10)。與媒劑對照組相比，第1組、第2組及第3組全部展示對腫瘤生長之統計學上顯著的抑制(P＜0.05)。在此研究期間小鼠對VG2062耐受良好，且此等資料指示以2.4×10
5PFU/小鼠之劑量起始的VG2062在諸如DU145之前列腺癌細胞中具有顯著抗腫瘤效應。
實例11
攜帶膀胱癌UM-UC-3之裸鼠的處理
目的 ：評估VG2062在UM-UC-3人類膀胱癌細胞之異種移植模型中的功效。
程序 ：對24隻SPF級雌性裸鼠進行皮下移植5×10
6個UM-UC -3細胞/小鼠(5×10
7個細胞/mL，0.1 mL/小鼠)且隨機分為3組，其中每組8隻小鼠。第1組投與DPBS+7.5%丙三醇(媒劑對照)。第2組及第3組為分別以2.4×10
7PFU/小鼠或2.4×10
5PFU/小鼠接受單次劑量之VG2062的高及低劑量測試組。所有測試組投與均經由腫瘤內注射方式進行。所有動物均藉由在不同身體部位上標記來適當地識別，且根據標準方案圈養及餵食。至少3次/週藉由數位卡尺來量測腫瘤之最長直徑(mm)及最短直徑(mm)。腫瘤體積按TV=0.5×a×b
2計算，其中：TV=腫瘤體積，mm
3；a=最長直徑，mm；b=最短直徑，mm。計算各組之平均腫瘤體積且表示為平均值±平均值之標準誤差(SEM)。小於0.05之P值被視為在統計學上具有顯著性。
結果 ：基於第17天之腫瘤體積結果，G2 (VG2062，2.40×10
7)組與媒劑對照組(P=0.000)之間存在統計學上顯著的腫瘤體積差異(圖11)。第2組小鼠中之所有8隻及第3組小鼠中之7隻在第17天已完全腫瘤消退，而第1組動物中無一者展現腫瘤消退。在此研究期間小鼠對VG2062耐受良好，且此等資料指示VG2062在諸如UM-UC-3之膀胱癌細胞中具有顯著抗腫瘤效應。
實例12
評估VG2062在BT-474人類乳癌異種移植模型中之功效
目的 ：CXCR4廣泛性地涉及乳癌及其他惡性病之進展。乳癌中CXCR4表現與侵襲性及預後不佳相關。此研究目的為評估以腫瘤內方式(i.t.)投與VG2062在雌性BALB/c裸鼠之BT-474人類乳癌異種移植模型的抗腫瘤功效。
程序 ：對24隻雌性BALB/c裸鼠進行皮下移植BT-474細胞。將小鼠隨機分為3組，其中每組8隻小鼠。將隨機分組之日定義為第0天。第1組投與DPBS+7.5%丙三醇(媒劑對照)。第2組及第3組係以腫瘤內注射方式接受多次兩種不同劑量含量之VG2062 (0.1 mL/動物)的測試組。第2組在第1、2及3天接受3次劑量之1×10
5PFU/小鼠/劑量。第3組在第1、2及3天接受3次劑量之1×10
7PFU/小鼠/劑量。所有動物均藉由在不同身體部位上標記來適當地識別，且根據標準方案圈養及餵食。至少2次/週藉由數位卡尺來量測腫瘤之最長直徑(mm)及最短直徑(mm)。腫瘤體積按TV=0.5×a×b
2計算，其中：TV=腫瘤體積，mm
3；a=最長直徑，mm；b=最短直徑，mm。計算各組之平均腫瘤體積且表示為平均值±平均值之標準誤差(SEM)。小於0.05之P值被視為在統計學上具有顯著性。
結果 ：隨機分組時間(第0天)，腫瘤體積在統計學上沒有差異。實驗期間，媒劑對照組(第1組)小鼠之腫瘤體積繼續增大，而用3次劑量之1×10
5PFU/小鼠/劑量及3次劑量之1×10
7PFU/小鼠/劑量的VG2062處理之小鼠之腫瘤體積分別保持相對穩定及減小(圖12)。與媒劑對照組相比，第2組及第3組均展示對腫瘤生長之統計學上顯著的抑制(P＜0.05)。在此研究期間小鼠對VG2062耐受良好，且此等資料指示VG2062在諸如BT-474之乳癌細胞中具有顯著抗腫瘤效應。
實例13
用mVG2031處理攜帶乳癌EMT-6之小鼠
目的 ：評估mVG2031在具有免疫能力的BALB/c小鼠經皮下移植鼠類乳癌細胞株EMT-6後之抑制生長的作用。mVG2031為VG2062之鼠類版本，其中人類IL-12由鼠類IL-12替代。
程序 ：對24隻雌性具有免疫能力的BALB/c小鼠進行皮下移植EMT-6細胞。將小鼠隨機分為3組，其中每組有8隻小鼠。將隨機分組之日定義為第0天。第1組投與DPBS+7.5%丙三醇(媒劑對照)。第2組及第3組係以腫瘤內(i.t.)注射方式接受多次兩種不同劑量含量之mVG2031 (0.1 mL/動物)的測試組。第2組在第1、2及3天接受3次劑量之1×10
6PFU/小鼠/劑量。第3組在第1、2及3天接受3次劑量之1×10
7PFU/小鼠/劑量。所有動物均藉由在不同身體部位上標記來適當地識別，且根據標準方案圈養及餵食。至少2次/週藉由數位卡尺來量測腫瘤之最長直徑(mm)及最短直徑(mm)。腫瘤體積按TV=0.5×a×b
2計算，其中：TV=腫瘤體積，mm
3；a=最長直徑，mm；b=最短直徑，mm。計算各組之平均腫瘤體積且以平均值±平均值之標準誤差(SEM)表示。小於0.05之P值被視為在統計學上具有顯著性。
結果 ：隨機分組時間(第0天)，腫瘤體積在統計學上沒有差異。實驗期間，媒劑對照組(第1組)小鼠之腫瘤體積繼續增大，而用3次劑量之1×10
6PFU/小鼠/劑量及3次劑量之1×10
7PFU/小鼠/劑量的mVG2031處理之小鼠之腫瘤體積保持相對穩定(圖13)。與媒劑對照組相比，第2組及第3組均展示對腫瘤生長之統計學上顯著的抑制(P＜0.05)。在此研究期間小鼠對mVG2031耐受良好，且此等資料指示mVG2031在諸如EMT-6之乳癌細胞中具有顯著抗腫瘤效應。
實例14
用mVG2031與抗PD-1之組合處理攜帶乳癌EMT-6之小鼠
目的 ：共投與OV與檢查點抑制劑是一種新興的治療模式，有望增強溶瘤病毒療法之功效。此研究旨在評估將mVG2031與檢查點抑制劑(抗PD-1抗體)組合使用於具有免疫能力的BALB/c小鼠經皮下移植鼠類乳癌細胞株EMT-6後之抑制生長的作用。mVG2031為VG2062之鼠類版本，其中人類IL-12由鼠類IL-12替代。
程序 ：對32隻雌性具有免疫能力的BALB/c小鼠進行皮下移植EMT-6細胞。將小鼠隨機分為4組，其中每組8隻小鼠。將隨機分組之日定義為第0天。第一組以腫瘤內方式投與DPBS+7.5%丙三醇(媒劑對照)。第二組在第1、2及3天用3次劑量之mVG2031(1×10
6PFU/小鼠/劑量)以腫瘤內方式處理。第三組以10 mg/kg每週兩次以腹膜內方式注射抗PD-1抗體。第四(組合治療)組在第1、2及3天用3次劑量之mVG2031 (1×10
6PFU/小鼠/劑量)以腫瘤內方式處理且亦以10 mg/kg每週兩次以腹膜內方式注射抗PD-1抗體。所有動物均藉由在不同身體部位上標記來適當地識別，且根據標準方案圈養及餵食。至少2次/週藉由數位卡尺來量測腫瘤之最長直徑(mm)及最短直徑(mm)。腫瘤體積按TV=0.5×a×b
2計算，其中：TV=腫瘤體積，mm
3；a=最長直徑，mm；b=最短直徑，mm。計算各組之平均腫瘤體積且以平均值±平均值之標準誤差(SEM)表示。小於0.05之P值被視為在統計學上具有顯著性。
結果 ：隨機分組時間(第0天)，腫瘤體積在統計學上沒有差異。實驗期間，不含病毒(媒劑及僅抗PD-1)之兩個對照組的腫瘤體積持續增大，而用mVG2031 (存在及不存在抗PD-1之共投與)處理的小鼠之腫瘤體積則大大減小(圖14)。與非病毒處理對照組相比，兩個病毒處理組均顯示對腫瘤生長具有統計學上顯著的抑制(P＜0.05)。值得注意地，病毒+抗PD-1之組合會產生比僅用病毒治療更強的抗腫瘤效應，一如在用病毒與檢查點抑制劑之組合處理之動物中腫瘤幾乎完全緩解所證明。在此研究期間小鼠對mVG2031耐受良好，且此等資料表明，組合mVG2031與諸如抗PD-1抗體之檢查點抑制劑在諸如EMT-6之乳癌細胞中具有顯著抗腫瘤效應。
實例15
用mVG2031處理攜帶腎癌Renca之小鼠
目的 ：評估mVG2031在具有免疫能力的BALB/c小鼠經皮下移植鼠類腎癌細胞株Renca後之抑制生長的作用。mVG2031為VG2062之鼠類版本，其中人類IL-12由鼠類IL-12替代。
程序 ：對50隻SPF級雌性裸鼠(5-6週大)進行皮下移植1×10
6個Renca細胞/小鼠。接種部位為小鼠之靠近腋窩之背部的右側。監測腫瘤生長，且當腫瘤生長至平均體積為約100-120 mm
3時，將25隻攜帶腫瘤之小鼠根據腫瘤體積及體重隨機分為5個組，每組5隻小鼠。分組給藥之日定義為第0天。第5組投與DPBS+7.5%丙三醇(媒劑對照)。第1至4組係以腫瘤內注射方式接受一劑或三劑兩種不同mVG2031劑量含量的測試組。第1組在第0天接受單次劑量之5.2×10
5PFU/小鼠。第2組在第0天接受單次劑量之5.2×10
7PFU/小鼠。第3組在第0、1及2天接受3次劑量之5.2×10
5PFU/小鼠。第4組在第0、1及2天接受3次劑量之5.2×10
7PFU/小鼠。所有動物均藉由在不同身體部位上標記來適當地識別，且根據標準方案圈養及餵食。至少2次/週藉由數位卡尺來量測腫瘤之最長直徑(mm)及最短直徑(mm)。腫瘤體積按TV=0.5×a×b
2計算，其中：TV=腫瘤體積，mm
3；a=最長直徑，mm；b=最短直徑，mm。計算各組之平均腫瘤體積且以平均值±平均值之標準誤差(SEM)子表示。小於0.05之P值被視為在統計學上具有顯著性。
結果 ：實驗期間，腫瘤體積在第0天在統計學上沒有差異。媒劑對照組(第5組)之腫瘤體積繼續增大，且在第21天第5組之腫瘤體積達到1204.23±253.76 mm
3(圖15)。此顯示小鼠腎癌細胞株Renca在使用BALB/c小鼠之皮下移植腫瘤模型中成功建立。mVG2031亦展示以劑量依賴性方式抑制Renca模型中之腫瘤生長。在第1組(5.2×10
5PFU/動物，單次劑量)中，腫瘤體積在第21天達到911.45±143.31 mm
3。在第2組(5.2×10
7PFU/動物，單次劑量)中，腫瘤體積在第21天達到542.27±174.45 mm
3。在第3組(5.2×10
5PFU/動物，3次劑量)中，腫瘤體積在第21天達到567.49±133.36 mm
3。在第4組(5.2×10
7PFU/動物，3次劑量)中，腫瘤體積在第21天達到337.03±95.93 mm
3。第1組中腫瘤體積在統計學上沒有顯著之差異，但第2組、第3組及第4組中所觀測到之腫瘤體積的減小統計顯著性超過臨限值(P＜0.05)。此等資料指示mVG2031在諸如Renca之腎癌細胞中具有顯著抗腫瘤效應。
實例16
用mVG2031與抗PD-1之組合處理攜帶雙側腎癌Renca之小鼠
目的 ：共投與OV與檢查點抑制劑是一種新興治療模式，有望增強溶瘤病毒療法之功效。此研究旨在評估mVG2031與檢查點抑制劑(抗PD-1抗體)組合使用於具有免疫能力的BALB/c小鼠經皮下移植鼠類腎癌細胞株Renca後之抑制生長的作用。雙側Renca腫瘤模型用於評估遠端腫瘤清除率。mVG2031為VG2062之鼠類版本，其中人類IL-12由鼠類IL-12替代。
程序 ：對24隻雌性具有免疫能力的BALB/c小鼠在左及右側腹中進行皮下移植Renca細胞。將小鼠隨機分為4組，其中每組6隻小鼠。將隨機分組之日定義為第0天。一個組係以腫瘤內方式投與DPBS+7.5%丙三醇(媒劑對照)至右側腹腫瘤中。第二組每週兩次以腹膜內方式投與10 mg/kg之抗PD-1抗體。第三組在第1、2及3天以腫瘤內方式注射(至右側腫瘤中) 3次mVG2031 (5×10
7PFU/小鼠/劑量)。第四組同樣地在第1、2及3天以腫瘤內方式注射(至右側腫瘤中) 3次mVG2031 (5×10
7PFU/小鼠/劑量)，且亦每週兩次以腹膜內方式投與10 mg/kg之抗PD-1抗體。所有動物均藉由在不同身體部位上標記來適當地識別，且根據標準方案圈養及餵食。至少2次/週藉由數位卡尺來量測腫瘤之最長直徑(mm)及最短直徑(mm)。腫瘤體積按TV=0.5×a×b
2計算，其中：TV=腫瘤體積，mm
3；a=最長直徑，mm；b=最短直徑，mm。計算各組之平均腫瘤體積且表示為平均值±平均值之標準誤差(SEM)。小於0.05之P值被視為在統計學上具有顯著性。
結果 ：隨機分組(第0天)時間，兩個側腹上之腫瘤體積在統計學上均沒有差異。實驗期間，非注射側上之所有腫瘤體積及注射側上之不含病毒的兩個對照組(媒劑組及抗PD-1基團)之腫瘤體積繼續增大，但僅用抗PD-1處理之注射側上的腫瘤保持顯著小於用媒劑對照處理之腫瘤(圖16A及16B)。用mVG2031 (存在及不存在抗PD-1之共投與)處理的小鼠中注射側上之腫瘤體積大大減小。與非病毒治療對照組相比，用mVG2031處理之兩組在注射側上展示對腫瘤生長之統計學上顯著的抑制(P＜0.05)。當與用媒劑對照處理之小鼠相比時，僅用mVG2031與抗PD-1兩者處理之組在非注射側上達到腫瘤統計顯著性減小。在此研究期間小鼠對mVG2031耐受良好，且此等資料表明組合mVG2031與諸如抗PD-1抗體之檢查點抑制劑在諸如Renca之腎癌細胞中具有顯著抗腫瘤效應。
實例17
處理攜帶腎癌A498之裸鼠
目的 ：評估VG2062在人類腎癌A498細胞株衍生之異種移植(CDX)模型中之抗腫瘤活性。
程序 ：對24隻SPF級雌性裸鼠進行皮下移植1×10
7個A498細胞/小鼠並隨機分為3組，其中每組8隻小鼠。將隨機分組之日標註為第0天。第1組投與DPBS+7.5%丙三醇(媒劑對照)。第2組及第3組為分別以2.4×10
5PFU/小鼠/劑量或2.4×10
7PFU/小鼠/劑量接受多次劑量之VG2062的低及高劑量測試組。劑量在第0天、第7天、第10天、第11天及第12天投與。所有測試組投與均經由腫瘤內注射方式進行。所有動物均藉由在不同身體部位上標記來適當地識別，且根據標準方案圈養及餵食。至少2次/週藉由數位卡尺來量測腫瘤之最長直徑(mm)及最短直徑(mm)。腫瘤體積按TV=0.5×a×b
2計算，其中：TV=腫瘤體積，mm
3；a=最長直徑，mm；b=最短直徑，mm。計算各組之平均腫瘤體積且表示為平均值±平均值之標準誤差(SEM)。小於0.05之P值被視為在統計學上具有顯著性。
結果 ：在第一次處理投與之後第21天完成實驗，且媒劑對照組中之攜帶腫瘤之小鼠的平均腫瘤體積記錄為1873.58±261.30 mm
3。VG2062高劑量組及VG2062低劑量組中之腫瘤體積分別為1068.56±157.43 mm
3及1284.69±108.84 mm
3(圖17)。與媒劑對照組相比，各病毒處理組展示對腫瘤生長之統計學上顯著的抑制(P＜0.05)。在此研究期間小鼠對VG2062耐受良好，且此等資料指示VG2062在諸如A498之腎癌細胞中具有顯著抗腫瘤效應。
實例18
BALB/c小鼠模型中之角膜接種
目的 ：在BALB/c小鼠模型之角膜接種之後評估VG2062眼部致病性。
程序 ：將SPF級8週齡雌性BALB/c小鼠隨機分為4組。藉由注射10 mg鹽酸氯胺酮/100 g體重至後腿肌肉中使小鼠麻醉。用胰島素針輕輕將左及右角膜劃破以避免使角膜斷裂。將5 μl病毒溶液投與至劃破的左眼及右眼中。一個組接受10
5PFU/小鼠之VG2062，另一組接受10
7PFU/小鼠之VG2062，第三組接受10
5PFU/小鼠之野生型HSV-1對照病毒株17+，及第四組接受由Vero細胞上清液組成的媒劑對照(5 μl/眼)。
結果 ：角膜劃痕為建立HSV-1感染之有效方式。在此研究中，接種10
5PFU/小鼠之野生型HSV-1 17+導致嚴重眼部發炎，包括難以睜開眼睛及眼睛周圍脫毛。相比之下，受VG2062感染之小鼠即使在10
7PFU/小鼠之高得多的劑量下亦展現極少眼病，與用媒劑對照處理之小鼠相比眼部病理學無顯著差異(圖18)。
以下為本發明之一些例示性經編號實施例。
1. 一種重組單純疱疹病毒，其包含經修飾溶瘤疱疹病毒基因體，其中該經修飾疱疹病毒基因體包含至少一個可操作地連接至ICP34.5基因之第一複本及該ICP34.5基因之包含失活突變的第二複本之miRNA目標序列，且進一步包含用即刻早期基因啟動子(諸如可操作地連接至ICP47基因之ICP4、ICP0或ICP27調節序列)替代ICP47啟動子，且其中該ICP47基因包含天然ICP47調節序列中之失活缺失。在另外實施例中，該即刻早期基因啟動子可選自HSV-1或HSV-2。
2. 如實施例1之重組單純疱疹病毒，其進一步包含該病毒基因體之一個RL及一個RS區之缺失。在視情況存在之實施例中，該突變為含有該ICP34.5基因之該第二複本的缺失。
3. 如實施例1或2中任一項之重組單純疱疹病毒，其包含二至十個可操作地連接至該ICP34.5基因之該第一複本的miRNA目標序列。在另外實施例中，miRNA目標序列串聯插入至3'非轉譯區中。在各種實施例中，一致或不同長度之連接子DNA可插入於不同miRNA結合位點之間。在某些實施例中，該等連接子在1至50個鹼基對範圍內。在其他實施例中，該連接子小於10個鹼基對。
4. 如實施例1、2或3中任一項之重組單純疱疹病毒，其中使該等miRNA目標序列插入至該ICP34.5基因之該第一複本的3'非轉譯區中。
5. 如實施例1、2、3或4中任一項之重組單純疱疹病毒，其中該等二至十個miRNA目標序列結合至少兩個不同miRNA。
6. 如實施例1、2、3、4或5中任一項之重組單純疱疹病毒，其中該等miRNA係選自由miR-124、miR-124*及miR-143組成之群。
7. 如實施例1、2、3、4、5或6中任一項之重組單純疱疹病毒，其中在病毒基因ICP4及/或ICP27中該經修飾疱疹病毒基因體包含另外的突變或修飾。在另外實施例中，該等突變或修飾可包含RL或RS之一個複本之缺失。
8. 如實施例1、2、3、4、5、6或7中任一項之重組單純疱疹病毒，其中該修飾包含用腫瘤特異性啟動子替代自然病毒啟動子。
9. 如實施例1、2、3、4、5、6、7、或8中任一項之重組單純疱疹病毒，其中該修飾為視情況用腫瘤特異性啟動子替代ICP27之整個啟動子調節區。
10. 如實施例1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一項之重組單純疱疹病毒，其中用CXCR4啟動子替代該ICP27啟動子。
11. 如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一項之重組單純疱疹病毒，其進一步包含至少一種編碼非病毒蛋白之核酸，該非病毒蛋白選自由免疫刺激因子、抗體及檢查點阻斷肽組成之群，其中該至少一種核酸可操作地連接至通用或腫瘤特異性啟動子。通用啟動子之實例包括組成型啟動子，諸如SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK及CAGG。
12. 如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9或11中任一項之重組單純疱疹病毒，其中該非病毒蛋白選自由IL12、IL15、IL15受體α亞單位組成之群。
13. 如實施例11或12中任一項之重組單純疱疹病毒，其中該啟動子為CMV啟動子。
14. 如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13中任一項之重組單純疱疹病毒具有編碼具有增強之融合性(與類似野生型病毒相比)的醣蛋白之核酸序列。實例包括廣泛多種轉殖基因(例如來自長臂猿白血病病毒「GALV」之融合醣蛋白)及/或增強HSV融合之突變，包括(例如)醣蛋白B、醣蛋白K及/或UL20中之截斷或突變。在一較佳實施例中，該核酸序列編碼醣蛋白B之融合形式(例如胺基酸876之後截斷之醣蛋白B)。在另外實施例中，用ICP27啟動子替代ICP47啟動子可用以增加融合性。
15. 如實施例14之重組單純疱疹病毒，其中該醣蛋白B可經截斷，其中缺失發生在胺基酸876之後。
16. 如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中任一項之重組單純疱疹病毒，其中該溶瘤疱疹病毒為HSV-1。在本發明之尤其較佳實施例中，該重組單純疱疹病毒包含溶瘤HSV-1，其中：a)存在含有編碼ICP0及ICP34.5之基因的一個RL之缺失及含有編碼ICP4之基因的一個RS之缺失；b)用CXCR4啟動子替代自然ICP27啟動子；c)在ICP34.5 3' UTR中插入用於miR-143及miR-124之結合位點；d)醣蛋白B編碼區之3'端之一部分的缺失(例如84 bp缺失)；e)插入在CMV啟動子之控制下之可表現IL-12、IL-15及IL-15Rα的表現卡匣；及f)用ICP27調節序列替代自然ICP47調節序列。
其中該突變為該病毒基因體之一個RL及一個RS區的缺失。在視情況存在之實施例中，該突變為含有該ICP34.5基因之該第二複本的缺失。
17. 一種抑制或裂解腫瘤細胞之方法，其包含提供治療有效量的如實施例1至16中任一項之重組單純疱疹病毒。
18. 一種抑制腫瘤細胞之方法，其包含提供治療有效量的如實施例1至17中任一項之重組單純疱疹病毒至腫瘤細胞。
19. 如實施例18之方法，其進一步包含提供PD-1、PD-L1及/或PD-L2拮抗劑至該等細胞之步驟。在某些實施例中，該拮抗劑選自由帕博利珠單抗、西米普利單抗、多塔利單抗、沃普瑞單抗、斯巴達珠單抗及卡瑞利珠單抗組成之群。
20. 一種治療組合物，其包含如實施例1至17中任一項之重組單純疱疹病毒及醫藥學上可接受之載劑。
21. 如實施例20之治療組合物，其進一步包含PD-1、PD-L1及/或PD-L2拮抗劑。在某些實施例中，該拮抗劑選自由帕博利珠單抗、西米普利單抗、多塔利單抗、沃普瑞單抗、斯巴達珠單抗及卡瑞利珠單抗組成之群。
22. 一種治療罹患癌症之個體的癌症之方法，其包含投與治療有效量的如實施例20之組合物之步驟。
23. 如實施例22之方法，其中該癌症表現高含量之生物標記物，諸如CXCR4。在另外實施例中，該癌症表現高含量之生物標記物，其啟動子用於驅動如前述實施例中任一項之ICP4及/或ICP27基因。在其他實施例中，該癌症表現高含量之生物標記物，諸如(例如) CEA或CXCR4。在某些實施例中，該癌症選自由泌尿系統、宮頸、食道、肺、結腸直腸、胃、膽管癌瘤及胰臟之癌症組成之群。在其他實施例中，該癌症選自由乳房及前列腺腫瘤以及神經膠母細胞瘤組成之群。在其他實施例中，癌症為白血病或淋巴瘤。在其他實施例中，癌症為急性骨髓白血病(AML)或B細胞淋巴瘤。在其他實施例中，癌症為表面可注射腫瘤。在又其他實施例中，癌症表現高含量之CXCR4。
24. 如實施例22之方法，其中該癌症為泌尿癌症。
25. 如實施例22之方法，其進一步包含向該個體投與PD-1、PD-L1及/或PD-L2拮抗劑之步驟。在某些實施例中，該拮抗劑選自由帕博利珠單抗、西米普利單抗、多塔利單抗、沃普瑞單抗、斯巴達珠單抗及卡瑞利珠單抗組成之群。
26. 如實施例19之方法，其中該癌症表現高含量之生物標記物，其啟動子用於驅動如前述實施例中任一項之ICP4及/或ICP27基因。在其他實施例中，該癌症表現高含量之生物標記物，諸如(例如) CEA或CXCR4。在某些實施例中，該癌症選自由泌尿系統、宮頸、食道、肺、結腸直腸、胃、膽管癌瘤及胰臟之癌症組成之群。在其他實施例中，該癌症選自由乳房及前列腺腫瘤以及神經膠母細胞瘤組成之群。在其他實施例中，癌症為白血病或淋巴瘤。在其他實施例中，癌症為急性骨髓白血病(AML)或B細胞淋巴瘤。在其他實施例中，癌症為表面可注射腫瘤。在又其他實施例中，癌症表現高含量之CXCR4。
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在本說明書通篇提及的「一個實施例(one embodiment)」或「一實施例(an embodiment)」及其變體意謂，結合該實施例描述的特定特性、結構或特徵係包括在至少一個實施例中。因此，片語「在一個實施例中」或「在一實施例中」在本說明書通篇中各處出現未必皆指同一實施例。此外，可在一或多個實施例中以任何適合方式組合特定特性、結構或特徵。
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當本文提供值範圍時，應理解除非上下文另外明確規定，否則在彼範圍之上限與下限之間的各個中間值(至下限之單位的十分之一)及在彼規定範圍內之任何其他規定值或中間值均涵蓋於本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內，亦涵蓋於本發明內，在規定範圍內受到任何特定排除限制。在規定範圍包括界限中之一者或兩者時，不包括彼等所包括之界限中之任一者或兩者之範圍亦包括於本發明中。
舉例而言，除非另外指示，否則本文所提供之任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所敍述範圍內之任何整數值及(在適當時)其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。此外，除非另外指示，否則本文所敍述之與諸如聚合物亞單位、尺寸或厚度之任何物理特性相關之任何數值範圍應理解為包括所敍述範圍內之任何整數。如本文所用，除非另外指示，否則術語「約」意謂指定範圍、值或結構之±20%。
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此外，此專利之書面描述部分包括所有申請專利範圍。此外，所有申請專利範圍(包括所有原始申請專利範圍以及來自任何及所有優先文獻之所有申請專利範圍)均以全文引用之方式併入本說明書之書面描述部分中，且申請人保留將任何及所有此類申請專利範圍實體併入至本申請案之書面描述或任何其他部分中的權力。因此，舉例而言，在任何情形下專利均不可假設地解釋為不提供關於申請專利範圍之書面描述，確證申請專利範圍之確切措辭不用同樣的話闡述在專利之書面描述部分中。
申請專利範圍將根據法律解釋。然而，且不管宣稱或察覺之解釋任何申請專利範圍或其部分之容易或困難，在任何情形下在本申請案之審查期間申請專利範圍或其任何部分之任何調整或修正均不可致使此專利解釋為已喪失其任何及所有等效物並不形成先前技術之部分的任何權力。
其他非限制性實施例在以下申請專利範圍內。專利不可解釋為受限於本文所特定及/或清楚揭示之特定實例或者非限制性實施例或方法 在任何情況下，專利均不可解釋為受到專利及商標局(Patent and Trademark Office)任何審查員或任何其他官員或雇員所進行之任何陳述的限制，除非此類陳述特定地且在無檢核或保留之情況下清楚地由申請人在回應文件中採用。
本發明之例示性特徵，其性質及各種優勢將自隨附圖式及以下各種實施例之實施方式而顯而易見。參考隨附圖式描述非限制性及非詳盡性實施例，其中除非另外規定，否則類似標籤或參考編號係指各種視圖中之類似部分。圖式中之元件的大小及相對位置未必按比例繪製。舉例而言，各種元件之形狀經選擇、放大並定位以提高圖式清晰度。已選擇所繪製之元件之特定形狀以易於圖式中之識別。下文參考隨附圖式描述一或多個實施例，其中：
圖1概略地描繪如由VG2062 (亦稱為VG203)之雙股去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)元件之總體結構組織所例示的轉錄及轉譯雙重調節之(「Transcription and Translation Dual Regulated，TTDR」)系統。
圖2為展現病毒基因表現之微小RNA介導的控制之圖表(上部小圖)及表格(下部小圖)。
圖3為三個重組溶瘤HSV之間的細胞-細胞融合表現型之比較。
圖4描繪9種不同泌尿腫瘤細胞株中VG2062 ICP27 DNA及宿主細胞CXCR4 mRNA之基於qPCR之定量。
圖5描繪在一組9種不同泌尿腫瘤細胞株上VG2062之複製動力學。
圖6描繪在一組10種不同泌尿腫瘤細胞株上VG2062及VG161之IC50細胞毒性值(以MOI量測)。
圖7描繪在感染一組10種不同泌尿腫瘤細胞株之後由VG2062及VG161分泌之人類IL-12及人類IL-15負載物之基於ELISA的定量。
圖8描繪來自用三次劑量注射之VG2062處理的負載A549腫瘤之免疫功能不全小鼠之腫瘤體積。
圖9描繪來自用遞增單次劑量之VG2062處理之負載PC3腫瘤之免疫功能不全小鼠的腫瘤體積。
圖10描繪用遞增單次劑量之VG2062處理的負載DU145腫瘤之免疫功能不全小鼠之腫瘤體積。
圖11描繪來自用低劑量或高劑量單次注射之VG2062處理之負載UM-UC-3腫瘤之免疫功能不全小鼠的腫瘤體積。
圖12描繪來自用低劑量或高劑量單次注射之VG2062處理之負載BT-474腫瘤之免疫功能不全小鼠的腫瘤體積。
圖13描繪來自用低劑量或高劑量三次注射之mVG2031處理之負載EMT-6腫瘤之具有免疫能力之小鼠的腫瘤體積。
圖14描繪來自用mVG2031、用抗PD-1抗體或用mVG2031與抗PD-1抗體兩者之組合處理之負載EMT-6腫瘤的具有免疫能力之小鼠之腫瘤體積。
圖15描繪來自用低劑量單次注射之mVG2031、高劑量單次注射之mVG2031、低劑量三次注射之mVG2031或高劑量三次注射之mVG2031處理的負載Renca腫瘤之具有免疫能力之小鼠的腫瘤體積。
圖16A及圖16B描繪來自在左側(圖16B)及右側(圖16A)脅腹兩側植入有Renca腫瘤且用mVG2031、用抗PD-1抗體或mVG2031與抗PD-1抗體兩者之組合處理的具有免疫能力之小鼠之腫瘤體積。
圖17描繪來自用低劑量或高劑量單次注射之VG2062處理之負載A-498腫瘤之免疫功能不全小鼠的腫瘤體積。
圖18描繪角膜劃破且接種野生型HSV-1病毒株17+或者低劑量或高劑量VG2062之後的小鼠眼睛。
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Claims (25)
- 一種包含經修飾溶瘤疱疹病毒基因體之重組單純疱疹病毒，其中該經修飾疱疹病毒基因體包含至少一個可操作地連接至ICP34.5基因之第一複本的miRNA目標序列，且該ICP34.5基因之第二複本包含失活突變；且進一步包含用諸如可操作地連接至ICP47基因之ICP4、ICP0或ICP27調節序列之即刻早期基因啟動子替代ICP47啟動子，且其中該ICP47基因包含天然ICP47調節序列中之失活缺失。
- 如請求項1之重組單純疱疹病毒，其進一步包含該病毒基因體之一個RL及一個RS區之缺失。
- 如請求項1之重組單純疱疹病毒，其包含二至十個可操作地連接至該ICP34.5基因之該第一複本的miRNA目標序列。
- 如請求項3之重組單純疱疹病毒，其中該等miRNA目標序列係插入至該ICP34.5基因之該第一複本的3'非轉譯區中。
- 如請求項3之重組單純疱疹病毒，其中該二至十個miRNA目標序列結合至少兩個不同miRNA。
- 如請求項5之重組單純疱疹病毒，其中該等miRNA係選自由miR-124、miR-124*及miR-143組成之群。
- 如請求項1之重組單純疱疹病毒，其中該經修飾疱疹病毒基因體在病毒基因ICP4及/或ICP27中包含另外的突變或修飾。
- 如請求項1之重組單純疱疹病毒，其中該病毒藉由以腫瘤特異性啟動子替代自然病毒啟動子來修飾。
- 如請求項1之重組單純疱疹病毒，其中該修飾係以腫瘤特異性啟動子替代ICP27之整個啟動子調節區。
- 如請求項9之重組單純疱疹病毒，其中該ICP27啟動子係以CXCR4啟動子替代。
- 如請求項7之重組單純疱疹病毒，其中該修飾為RL或RS之一個複本之缺失。
- 如請求項1之重組單純疱疹病毒，其進一步包含至少一種編碼非病毒蛋白之核酸，該非病毒蛋白選自由免疫刺激因子、抗體及檢查點阻斷肽組成之群，其中該至少一種核酸可操作地連接至通用或腫瘤特異性啟動子。
- 如請求項11之重組單純疱疹病毒，其中該非病毒蛋白選自由IL12、IL15、IL15受體α亞單位組成之群。
- 如請求項12之重組單純疱疹病毒，其中該通用啟動子為CMV。
- 如請求項1之重組單純疱疹病毒，其進一步包含編碼醣蛋白B之融合形式的核酸序列。
- 如請求項14之重組單純疱疹病毒，其中該醣蛋白B可經發生於胺基酸876之後的缺失截斷。
- 如請求項1至15中任一項之重組單純疱疹病毒，其中該溶瘤疱疹病毒為HSV-1。
- 一種抑制腫瘤細胞之方法，其包含向腫瘤細胞提供治療有效量的如請求項1至17中任一項之重組單純疱疹病毒。
- 如請求項18之方法，其進一步包含向該等細胞提供PD-1、PD-L1及/或PD-L2拮抗劑之步驟。
- 一種治療組合物，其包含如請求項1至17中任一項之重組單純疱疹病毒及醫藥學上可接受之載劑。
- 如請求項20之治療組合物，其進一步包含PD-1、PD-L1及/或PD-L2拮抗劑。
- 一種治療罹患癌症個體的癌症之方法，其包含投與治療有效量的如請求項20之組合物之步驟。
- 如請求項22之方法，其中該癌症表現高含量之生物標記物，諸如CXCR4。
- 如請求項22之方法，其中該癌症為泌尿癌症。
- 如請求項22之方法，其進一步包含向該個體投與PD-1、PD-L1及/或PD-L2拮抗劑之步驟。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202263304584P | 2022-01-29 | 2022-01-29 | |
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