JP2024512053A - 転写及び翻訳の二重調節を受ける腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスベクター - Google Patents

Abstract

転写及び翻訳制御の両方を有するヘルペスウイルスベクターが提供される。様々な実施形態において、ヘルペスウイルスベクターは、改変されたヘルペスウイルスをベースとしており、それぞれＣＥＡプロモーター及びｍｉＲＮＡ－１２４／１４３の制御下のＩＣＰ２７及びＩＣＰ３４．５の両方を有し、並びに効力を犠牲にすることなく安全性を増加させる、長い末端反復領域の少なくとも１つのコピーの欠失が提供される。ヘルペスウイルスベクターは、ＣＸＣＲ４プロモーターの制御下においてＩＬ－１２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲＡをコードするウイルス発現サイトカインカセットも組み込むことができる。

Description

全ての優先出願に対する参照による組み込み
外国又は国内の優先権主張が本願と共に提出される出願データシートにおいて特定されるあらゆる出願が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、概して、免疫システムを刺激する分子を発現する腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）ベクターに関する。
配列表、表、又はコンピュータプログラムに対する参照
配列表の公式なコピーが、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で、「ＶＩＲＯ４１３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のファイル名、２０２２年１月２４日の作成日付、及び１７．７ＫＢのサイズのＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとして本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で提出されたこの配列表は本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

悪性腫瘍は、人間の生命と健康に対する重大な脅威である。例えば、外科手術、放射線治療法、化学療法、標的療法、及び免疫療法（免疫チェックポイント阻害剤を含む）等の様々な標準的治療オプションが存在するが、腫瘍の進行した患者のほとんどは、依然として予後不良を有する。現在、腫瘍免疫療法は、腫瘍の治療におけるブレイクスルー進歩を遂げた。免疫標的化薬物療法（例えば、免疫チェックポイント抑制）及び免疫細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ））は、抗腫瘍療法の分野に変化をもたらした。しかしながら、チェックポイント阻害剤に対して現在承認されている適応の中で、単一薬剤有効率は、約３０％のみであり（Jiang et al., 2020, Progress and Challenges in Precise Treatment of Tumors With PD-1/L1 Blockade. Frontiers in Immunology, 11(March)）；その一方で、ＣＡＲ－Ｔ療法は、主に、表面抗原分類１９（ＣＤ１９）及びＢ細胞腫瘍によって高度に発現されるＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）のみを標的にする。固形腫瘍における臨床効果は、まだ確認されていない（Long et al., 2018, CAR T Cell Therapy of Non-hematopoietic Malignancies: Detours on the Road to Clinical Success. Frontiers in Immunology, 9(December), 2740）。それでもなお、免疫療法の恩恵に関して明確な長期間の証拠の存在する多くの悪性腫瘍が存在する。
標準的治療の後に再発するか又は標準的治療が無効である悪性腫瘍に対する臨床的に有効な治療は存在せず、この状態の患者は、広範の腫瘍転移又は重要な臓器の侵襲により、より早く死亡する可能性が高い。したがって、これらの患者は、有効な治療に対するまだ対処されていない非常に高い必要性を有しており、それは、疾患の進行を制御し患者の生存を延ばす新しい治療法を開発する緊急の必要性につながる。

本発明は、免疫療法等の現在のがん療法の短所を克服し、更に、予想されなかった更なる恩恵を提供する。
背景技術のセクションにおいて説明された主題の全ては、必ずしも従来技術であるわけではなく、単に背景技術のセクションにおける説明の結果だからとして従来技術であると想定されるべきではない。これらの考えに沿って、背景技術のセクションにおいて説明された先行技術における問題又はそのような主題に関連する問題についてのあらゆる認識は、従来技術であることが明記されない限り、従来技術として扱うべきではない。代わりに、背景技術のセクションにおける全ての主題の議論は、特定の問題に対する本発明者のアプローチの一部として扱われるべきであり、それ自体も、本発明であり得る。

簡潔に述べると、本発明は、組換えヘルペスウイルスベクターによってがんを治療するための組成物及び方法に関する。本発明の好ましい実施形態において、組換えベクターは、ウイルスの腫瘍溶解能のより精密な制御を提供するために、転写において及び転写後（翻訳）においての両方で制御される。
本発明の一実施形態において、改変された腫瘍溶解性ヘルペスウイルスゲノムを含む組換えヘルペスウイルスであって、改変されたヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーに作動可能に連結された少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが不活性化変異を含む、組換えヘルペスウイルスが提供される。様々な実施形態において、組換えウイルスは、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーに作動可能に連結された１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。
更なる実施形態において、ｍｉＲＮＡ標的配列は少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１２４^*、及びｍｉＲ－１４３のうちの少なくとも１つ又は複数）に結合することができる。

なお他の実施形態において、組換えヘルペスウイルスは、非ウイルスタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を更に含むことができる。非ウイルスタンパク質の例としては、免疫刺激因子、抗体、及びチェックポイント阻害ペプチドが挙げられ、少なくとも１つの核酸は、腫瘍特異的プロモーターに作動可能に連結されている。特定の好ましい実施形態において、非ウイルスタンパク質は、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１５受容体アルファサブユニットのうちの１つ又は全てである。
なお他の実施形態において、組換え単純ヘルペスウイルスは、増強された膜融合性（同様の野生型ウイルスと比較した場合）を有する糖タンパク質をコードする核酸配列を更に含む。その例としては、様々な導入遺伝子（例えば、テナガザル白血病ウイルス「ＧＡＬＶ」に由来する膜融合糖タンパク質）、並びに／又はＨＳＶ融合を高める変異、例えば、糖タンパク質Ｂ、糖タンパク質Ｋ、及び／若しくはＵＬ２０におけるトランケーション若しくは変異等、が挙げられる。
本明細書に記載される組換えヘルペスウイルスを含む治療組成物、並びに腫瘍細胞を溶解する方法、及び本明細書に記載される組換えヘルペスウイルスのうちの１種を対象に投与する工程を含む、対象におけるがんを治療する方法も提供される。

この簡潔な発明の概要は、下記の発明を実施するための形態において更に詳細に説明される簡易形態において、ある特定の概念を紹介するために提供された。明記される場合を除いて、この簡潔な発明の概要は、権利請求される主題の重要な又は必須の特徴を特定することを意図するものでも、権利請求される主題の範囲を限定することを意図するものでもない。
１つ又は複数の実施形態の詳細が、下記の記述において説明される。１つの例示的実施形態との関連において例示又は説明される特徴は、他の実施形態の特徴と組み合わせてもよい。したがって、本明細書に記載される様々な実施形態のいずれも、更なる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本明細書において特定される様々な特許、出願、及び刊行物の概念を用いる必要がある場合、更なる実施形態を提供するために、実施形態の態様を変更することができる。他の特徴、目的、及び利点は、説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
本発明は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明及び本明細書に含まれる実施例を参照することによって、より容易に理解され得る。

ＶＧ２０２５の二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エレメントの構造編成全体を図式的に表す図である。 転写及び翻訳の二重調節を受ける（ＴＴＤＲ）システムを図式的に表す図である。 多核性膜融合プラークがＶＧ２０２５感染Ａ５４９（腫瘍）細胞において観察されるが、ＭＲＣ－５（非腫瘍）細胞においては観察されないという実験の結果を示す画像である。 ＶＧ２０２５による感染後のウイルスコピー数に相関する、異なる腫瘍細胞株におけるＣＥＡ発現をグラフに示す。 ＶＧ２０２５による感染後のウイルスコピー数に相関する、異なる腫瘍細胞株におけるＣＥＡ発現をグラフに示す。 ＩＣＰ３４．５のｍｉＲ１２４／１４３調節をグラフに示す。 インビトロ培養による１１のヒト腫瘍細胞株（図６Ａ）における細胞生存率として測定された、ｈＶＧ２０２５の抗腫瘍活性を示す図である。 インビトロ培養による６つのマウス腫瘍細胞株（図６Ｂ）における細胞生存率として測定された、ｈＶＧ２０２５の抗腫瘍活性を示す図である。 ２つの腫瘍細胞株（それぞれＡ５４９及びＢｘＰＣ－３）における２つのウイルスの増殖曲線をグラフに示す。 ２つの腫瘍細胞株（それぞれＡ５４９及びＢｘＰＣ－３）における２つのウイルスの増殖曲線をグラフに示す。 ＩＬ－１２のペイロード発現をグラフに示す。 ＩＬ－１５のペイロード発現をグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５若しくはＶＧ１９０５に感染させた細胞又はウイルスに感染させていない細胞からのペイロード発現をグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５若しくはＶＧ１９０５に感染させた細胞又はウイルスに感染させていない細胞からのペイロード発現をグラフに示す。 ＰＨＡ刺激リンパ芽球からのヒトＩＦＮ－ｇ産生におけるペイロード生物活性をグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＡ５４９腫瘍サイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＡ５４９腫瘍サイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＡ５４９腫瘍サイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＡ５４９腫瘍サイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＡ５４９腫瘍サイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＡ５４９腫瘍サイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＡ５４９腫瘍サイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後の体重の変化をグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＢｘＰＣ３腫瘍のサイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＢｘＰＣ３腫瘍のサイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＢｘＰＣ３腫瘍のサイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＢｘＰＣ３腫瘍のサイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＢｘＰＣ３腫瘍のサイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＢｘＰＣ３腫瘍のサイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＢｘＰＣ３腫瘍のサイズをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５治療後のＢｘＰＣ３腫瘍モデルの体重をグラフに示す。 腫瘍サイズにおけるｈＶＧ２０２５及び３４．５（－）ＨＳＶ－１の比較をグラフに示す。 腫瘍サイズにおけるｈＶＧ２０２５及び３４．５（－）ＨＳＶ－１の比較をグラフに示す。 腫瘍サイズにおけるｈＶＧ２０２５及び３４．５（－）ＨＳＶ－１の比較をグラフに示す。 腫瘍サイズにおけるｈＶＧ２０２５及び３４．５（－）ＨＳＶ－１の比較をグラフに示す。 腫瘍サイズにおけるｈＶＧ２０２５及び３４．５（－）ＨＳＶ－１の比較をグラフに示す。 腫瘍サイズにおけるｈＶＧ２０２５及び３４．５（－）ＨＳＶ－１の比較をグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５を皮下注射したＤＢＡ／２マウスの体重をグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５を皮下注射したＤＢＡ／２マウスの生存パーセントをグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５を経鼻接種したＤＢＡ／２マウスの体重をグラフに示す。 ｈＶＧ２０２５を経鼻接種したＤＢＡ／２マウスの生存パーセントをグラフに示す。 ウイルス誘発性症状の臨床的知見を提供する写真である。 生存曲線をグラフに表す。 角膜乱切後の嗅球及び三叉神経節のＲＮＡ－ｓｅｑ分析をグラフに示す。 ガンシクロビルに対するｈＶＧ２０２５の感受性をグラフに示す。 最長１カ月間での４℃及び－８０℃におけるｈＶＧ２０２５の安定性をグラフに示す。 図２４Ａは、ＶＧ２０２５で治療した、Ｈｅｐ ３Ｂ－ｌｕｃ負担ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける体重変化をグラフに示す。 図２４Ｂは、ＶＧ２０２５を投与した後の腫瘍生物発光トレースを示す。 図２４Ｃは治療マウスの生存曲線のグラフである。 図２４Ｄは転移率を示すグラフである。 図２５Ａは、ＶＧ２０２５で治療したＡ２０－ｌｕｃ Ｂ細胞リンパ腫負担ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける体重変化をグラフに示す。 図２５Ｂは、ｍＶＧ２０２５を投与した後の腫瘍生物発光トレースを示すグラフである。 図２５Ｃは転移率を示すグラフである。 図２６Ａは、ｍＶＧ２０２５で治療した、Ａ２０－ｌｕｃ Ｂ細胞リンパ腫負担ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける体重変化をグラフに示す。 図２６Ｂは、ｍＶＧ２０２５を投与した後の腫瘍生物発光トレースを示すグラフである。 図２６Ｃは転移率を示すグラフである。 治療開始後９日目までの、治療後の治療腫瘍及び反対側非治療腫瘍の平均腫瘍体積をグラフに表す。 治療開始後９日目までの、治療後の治療腫瘍及び反対側非治療腫瘍の平均腫瘍体積をグラフに表す。 治療腫瘍及び反対側腫瘍の個々の腫瘍サイズをグラフに表す。 治療腫瘍及び反対側腫瘍の個々の腫瘍サイズをグラフに表す。 治療腫瘍及び反対側腫瘍の個々の腫瘍サイズをグラフに表す。 治療腫瘍及び反対側腫瘍の個々の腫瘍サイズをグラフに表す。 生存曲線をグラフに表す。 治療開始後１７日目までの、治療後の治療腫瘍及び反対側非治療腫瘍の平均腫瘍体積をグラフに表す。 治療開始後１７日目までの、治療後の治療腫瘍及び反対側非治療腫瘍の平均腫瘍体積をグラフに表す。 皮下腫瘍再移植の前後での個々の腫瘍サイズをグラフに表す。 皮下腫瘍再移植の前後での個々の腫瘍サイズをグラフに表す。 皮下腫瘍再移植の前後での個々の腫瘍サイズをグラフに表す。 皮下腫瘍再移植の前後での個々の腫瘍サイズをグラフに表す。 生存曲線をグラフに表す。 腫瘍におけるヒトＩＬ－１２ｐ７０及びＩＬ－１５／ＩＬ１５Ｒアルファ複合体のプロットをグラフに表す。 腫瘍におけるヒトＩＬ－１２ｐ７０及びＩＬ－１５／ＩＬ１５Ｒアルファ複合体のプロットをグラフに表す。 血清におけるヒトＩＬ－１２ｐ７０及びＩＬ－１５／ＩＬ１５Ｒアルファ複合体のプロットをグラフに表す。 血清におけるヒトＩＬ－１２ｐ７０及びＩＬ－１５／ＩＬ１５Ｒアルファ複合体のプロットをグラフに表す。

上述のように、本発明は、ウイルスの腫瘍溶解能のより精密な制御を提供するために転写において及び転写後（翻訳）の両方において制御される組換えヘルペスウイルスベクターを提供する。
本明細書の様々な実施形態の更なる理解のために、様々な実施形態：Ａ．腫瘍溶解性ヘルペスウイルス；Ｂ．特異的ヘルペスウイルス構築物－ＶＧ２０２５；Ｃ．治療組成物、及びＤ．投与、を説明する下記のセクションが提供される。

Ａ．腫瘍溶解性ヘルペスウイルス
簡潔に説明すると、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２は、ヒトに感染するヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーである。ＨＳＶゲノムは、長いユニーク（Ｕ_L）領域及び短いユニーク（Ｕ_S）領域と称される２つの独特な領域を含む。これらの領域のそれぞれには、１対の逆方向反復配列が隣接する。約７５の既知のオープンリーディングフレームが存在する。ウイルスゲノムは、例えばがん療法等において使用するための腫瘍溶解性ウイルスを生じるように操作されている。ＨＳＶの腫瘍選択的複製は、ＨＳＶ ＩＣＰ３４．５（γ３４．５とも呼ばれる）遺伝子の変異によって付与され得る。ＨＳＶはＩＣＰ３４．５の２つのコピーを含む。ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方又は両方のコピーを不活性化する変異体は、神経毒性を欠く、すなわち、無毒／非神経毒性であり、並びに腫瘍溶解性であることが知られている。ＨＳＶの腫瘍選択的複製も、主要なウイルス遺伝子、例えば、ＩＣＰ２７及び／又はＩＣＰ４等の発現を制御することによって付与され得る。

用語「腫瘍溶解性ヘルペスウイルス」又は「ｏＨＶ」は、概して、腫瘍細胞において複製することができ、腫瘍細胞を死滅させることができるヘルペスウイルスを意味する。用語「腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス」又は「ｏＨＳＶ」は、腫瘍細胞において複製することができ、腫瘍細胞を死滅させることができる単純ヘルペスウイルスを意味する。
好適な腫瘍溶解性ＨＳＶは、全ての実験室株又は臨床分離株を含むＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２のいずれかから得られ得る。いくつかの実施形態において、ｏＨＳＶは、実験室株ＨＳＶ－１株１７、ＨＳＶ－１株Ｆ、又はＨＳＶ－２株ＨＧ５２のうちの１種から得られ得る。他の実施形態において、ｏＨＳＶは、非実験室株ＪＳ－１から得ることができる。他の好適なＨＳＶ－１ウイルスとしては、ＨｒｒＲ３（Goldstein and Weller, J. Virol. 62, 196-205, 1988）、Ｇ２Ｏ７Mineta et al. Nature Medicine. 1(9):938-943, 1995; Kooby et al. The FASEB Journal, 13(11):1325-1334, 1999）；Ｇ４７Ｄｅｌｔａ（Todo et al. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001; 98(11):6396-6401）；ＨＳＶ １７１６（Mace et al. Head & Neck, 2008; 30(8):1045-1051; Harrow et al. Gene Therapy. 2004; 11(22):1648-1658）；ＨＦ１０（Nakao et al. Cancer Gene Therapy. 2011; 18(3):167-175）；ＮＶ１０２０（Fong et al. Molecular Therapy, 2009; 17(2):389-394）；Ｔ－ＶＥＣ（Andtbacka et al. Journal of Clinical Oncology, 2015: 33(25):2780-8）；Ｊ１００（Gaston et al. PloS one, 2013; 8(11):e81768）；Ｍ００２（Parker et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000; 97(5):2208-2213）；ＮＶ１０４２（Passer et al. Cancer Gene Therapy. 2013; 20(1):17-24）；Ｇ２Ｏ７－ＩＬ２（Carew et al. Molecular Therapy, 2001; 4(3):250-256）；ｒＱＮｅｓｔｉｎ３４．５（Kambara et al. Cancer Research, 2005; 65(7):2832-2839）；Ｇ４７Δ－ｍＩＬ－１８（Fukuhara et al. Cancer Research, 2005; 65(23):10663-10668）；並びにＰＣＴ出願の、「ＨＳＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ」の名称のＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０３０８及び「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｔ１／３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ」の名称のＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１８５３９において開示されるベクターが挙げられ、上記の文献は全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

腫瘍溶解性ヘルペスウイルスの他の代表的な例は、米国特許第７，２２３，５９３号、同第７，５３７，９２４号、同第７，０６３，８３５号、同第７，０６３，８５１号、同第７，１１８，７５５号、同第８，２１６，５６４号、同第８，２７７，８１８号、及び同第８，６８０，０６８号に記載され、これらの文献の全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｏＨＳＶベクターは、本明細書において開示されるようにその３’ＵＴＲにおいてｍｉＲＮＡ標的配列によって改変された少なくとも１つのγ３４．５遺伝子を有し；ベクター中に未改変のγ３４．５遺伝子は存在しない。いくつかの実施形態において、ｏＨＳＶは、２つの改変されたγ３４．５遺伝子を有し；他の実施形態において、ｏＨＳＶは、１つのγ３４．５遺伝子のみを有し、それは改変されている。いくつかの実施形態において、改変されたγ３４．５遺伝子は、インビトロにおいて構築され、ウイルス遺伝子に対する置換としてｏＨＳＶベクターに挿入されている。改変されたγ３４．５遺伝子が、１つのγ３４．５遺伝子のみの置換である場合、他のγ３４．５は欠失される。いずれかの天然γ３４．５遺伝子を欠失させることができる。一実施形態において、γ３４．５遺伝子及びＩＣＰ４遺伝子を含む末端反復領域は欠失される。本明細書に記載されるように、改変されたγ３４．５遺伝子は外因性プロモーターを有する等の追加の変更を含んでもよい。

ｏＨＳＶは、追加の変異を有することができ、それは、無効化変異（例えば、欠失、置換、挿入）を含んでよく、それらは、ウイルスの病毒性又はその複製する能力に影響を及ぼし得る。例えば、変異は、ＩＣＰ６、ＩＣＰＯ、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ２４、ＩＣＰ５６のうちのいずれか１つ又は複数においてなされ得る。好ましくは、これらの遺伝子のうちの１つ（適切であれば遺伝子の両方のコピーであってもよい）における変異は、ＨＳＶが対応する機能性ポリペプチドを発現することができなくなる（又はその能力が減少する）。いくつかの実施形態において、ウイルス遺伝子のプロモーターは、標的細胞において選択的に活性であるか又は誘発物質の送達に関して誘導的であるか又は細胞事象又は特定の環境に関して誘導的であるようなプロモーターで置換され得る。
ある特定の実施形態において、ＩＣＰ４又はＩＣＰ２７の発現は、外因性プロモーター、例えば、腫瘍特異的プロモーターによって制御される。例示的な腫瘍特異的プロモーターとしては、サバイビン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＰＳＡ、ＡＲＲ２ＰＢ、又はテロメラーゼが挙げられ；他の好適な腫瘍特異的プロモーターは、単一の腫瘍タイプに対して特異的であってよく、当技術分野において公知である。他のエレメントが存在してもよい。いくつかの場合において、ＮＦｋＢ／ｏｃｔ４／ｓｏｘ２エンハンサー等のエンハンサーが存在する。その上、５’ＵＴＲは、例えば、ＦＧＦ等の成長因子遺伝子からの５’ＵＴＲ等、外因性であり得る。例示的構築物については図２を参照されたい。

ｏＨＳＶは、非ＨＳＶ起源である遺伝子及びヌクレオチド配列も有し得る。例えば、中でも特に、プロドラッグをコードする配列、サイトカイン又は他の免疫刺激因子をコードする配列、腫瘍特異的プロモーター、誘導プロモーター、エンハンサー、宿主細胞に対して相同な配列は、ｏＨＳＶゲノム中に存在し得る。例示的配列は、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１５受容体アルファサブユニット、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ－Ｌ１ブロッカー、又はＰＤ－１ブロッカーをコードする。産物をコードする配列の場合、それらは、プロモーター配列及び発現にとって必要か又は望ましい他の調節配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列）に動作可能に連結されている。
ウイルス遺伝子の調節領域は、発現に影響を及ぼす応答エレメントを含むように改変され得る。例示的応答エレメントとしては、ＮＦκＢに対する応答エレメント、Ｏｃｔ－３／４－ＳＯＸ２、エンハンサー、サイレンサー、ｃＡＭＰ応答エレメント、ＣＡＡＴエンハンサー結合配列、及びインシュレーターが挙げられる。他の応答エレメントも、含まれ得る。ウイルスプロモーターは、異なるプロモーターで置換され得る。プロモーターの選択は、いくつかの要因、例えば、提案されたＨＳＶベクターの使用、患者の治療、病状又は状態、及びインデューサー（誘導プロモーターの場合）の適用の容易さ等に依存するであろう。がんの治療の場合、概して、プロモーターが置換される場合、それは、細胞特異的又は組織特異的又は腫瘍特異的プロモーターによってであろう。腫瘍特異的、細胞特異的、及び組織特異的プロモーターは、当技術分野において公知である。他の遺伝子エレメントも改変され得る。例えば、ウイルスゲノムの５’ＵＴＲは、外因性ＵＴＲによって置換され得る。

Ｂ．特異的ヘルペスウイルス構築物－ＶＧ２０２５
本発明の好ましい構築物の１つが図１において提供される。簡潔に説明すると、図１は、ＶＧ２０２５の二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エレメントの構造編成全体を図式的に表す。「ＣＥＡ」は癌胎児性抗原を意味し；「ＣＸＣＲ４」は、Ｃ－Ｘ－Ｃ Ｍｏｔｉｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４を意味し；「ｇＢ」は、糖タンパク質Ｂを意味し；「ＩＣＰ」は、感染細胞ポリペプチドを意味し；「ＩＬ」は、インターロイキンを意味し；「Ｒ_L」は、長い反復領域を意味し；「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味し；「ｍｉＲ」は、ｍｉｃｒｏＲＮＡを意味し；「Ｒ_S」は短い反復領域を意味し；「ＵＬ」は、長いユニーク領域を意味し；「ＵＳ」は、短いユニーク領域を意味する。

ＶＧ２０２５は、腫瘍細胞へのウイルス複製を制限し、安全を損なうことなく腫瘍特異的病毒性を高めるために、主要なウイルス遺伝子の転写及び翻訳の両方の二重調節（「ＴＴＤＲ」－図２を参照されたい）を利用する組換えＨＳＶ－１プラットホームである。更に、ＶＧ２０２５は、ＩＬ１２、ＩＬ１５、及びＩＬ１５受容体アルファサブユニットで構成されるペイロードカセットを発現する。このペイロードカセットは、腫瘍特異的免疫刺激のためにＣＸＣＲ４プロモーターによって制御される。最後に、ＶＧ２０２５におけるウイルス性糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）は、増強された膜融合性によって腫瘍内微小環境でのウイルス伝播を促進するために短縮された。

１．転写後（翻訳）調節
ＶＧ２０２５において、ＩＣＰ３４．５発現は転写後（翻訳）に調節される。簡潔に説明すると、野生型ＨＳＶ－１には、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが存在する。ＶＧ２０２５において、ＩＣＰ３４．５の１つのコピーは欠失されている。残りのＩＣＰ３４．５遺伝子に対して、ＶＧ２０２５は、転写後にその発現を調節するために、３’ＵＴＲ領域におけるｍｉＲ１２４及びｍｉＲ１４３のために結合ドメインの複数のコピーを挿入する。

ＩＣＰ３４．５は、ＨＳＶ後期遺伝子ｇ－３４．５によってコードされる。宿主細胞、特に神経細胞の抗ウイルス性免疫を抑制するその機能が神経毒性作用を引き起こすことは周知である。神経膠腫を標的にするようにＩＣＰ３４．５の発現を制御するために、遺伝子を欠失するか又は特定のプロモーターを使用する代わりに、ロバストな複製のために腫瘍細胞におけるその活性は維持したまま、ニューロン及び他の正常細胞においてＩＣＰ３４．５の機能を無効にするために、ＶＧ２０２５は、腫瘍細胞におけるＩＣＰ３４．５の示差的発現を達成するために、転写後調節としてｍｉｃｒｏＲＮＡを使用する。簡潔に説明すると、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」又は「ｍｉＲ」とも呼ばれる）は、約２２のヌクレオチドの、ｍｉＲＮＡ遺伝子によってコードされたノンコーディング低分子ＲＮＡであり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されて一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を生じる。成熟一本鎖（ｓｓ）ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ関連ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）を形成する。ｍｉＲＩＳＣにおけるｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡにおける３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）に結合することによって、遺伝子発現に影響を及ぼし得る。この領域は、ｍｉＲＮＡによって認識される配列からなる。ｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ複合体の相補性が完璧である場合、ｍＲＮＡは、アルゴノートファミリーに属するタンパク質であるＡｇｏ２によって分解される。しかしながら、相補性が完璧ではない場合、標的ｍＲＮＡの翻訳は完全には破壊されないが抑制される。

ＭｉＲＮＡは、組織特異的方式において差次的に発現される。その例の１つは、ｍｉＲ１２４である。異なる種に由来するｍｉＲ－１２４の前駆体は異なっているが、ヒト、マウス、ラットにおける成熟ｍｉＲ－１２４の配列は、完全に同一である。ＭｉＲ－１２４は、神経細胞において最も豊富に発現されるｍｉＲＮＡであり、免疫細胞及び器官において高度に発現される（Qin et al., 2016, miRNA-124 in immune system and immune disorders. Frontiers in Immunology, 7(OCT), 1-8）。ｍｉＲＮＡの示差的発現の別の例は、ｍｉＲ１４３である（Lagos-Quintana et al., 2002, Identification of tissue-specific MicroRNAs from mouse. Current Biology, 12(9), 735-739）。ＭｉＲ－１４３は、正常組織において構成的に発現されるが、がん細胞においてはかなり下方制御される（Michael et al., 2003, Reduced Accumulation of Specific MicroRNAs in Colorectal Neoplasia. Molecular Cancer Research, 1(12), 882-892）。ｍｉＲ－１２４の核酸配列の代表的な例は、配列番号８に記載される通りであり、ｍｉＲ－１４３の核酸配列の例は、配列番号９に記載される通りである。
ＶＧ２０２５におけるＩＣＰ３４．５遺伝子の３’ＵＴＲ領域は、ｍｉＲ１２４及びｍｉＲ１４３に対して完全に相補的である結合ドメイン（「ｍｉＲＮＡ標的配列」、「ｍｉＲＮＡ結合配列」、又は「ｍｉＲＮＡ結合部位」とも呼ばれる）の複数のコピーを含む。ＩＣＰ３４．５ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲへのｍｉＲ１２４及びｍｉＲ１４３の結合は、ｍＲＮＡの分解を引き起こし、その結果、遺伝子は、正常細胞において転写後に下方制御されるが、腫瘍細胞においては下方制御されない。この設計は、腫瘍細胞におけるＩＣＰ３４．５の示差的発現を可能にする。

２．ＶＧ２０２５におけるＩＣＰ２７の発現は転写制御される
ＨＳＶ－１ウイルスの複製はウイルス遺伝子の発現の連続発生に依存し、前初期遺伝子産物（特にＩＣＰ４及びＩＣＰ２７）が、ウイルスの溶解複製周期を支配するウイルス初期遺伝子及び後期遺伝子の後続の発現を制御する。ＩＣＰ４又はＩＣＰ２７の欠失は、ウイルス複製の完全な抑止とウイルス遺伝子発現におけるかなりの減少とを生じ、それは、ＩＣＰ４及びＩＣＰ２７を腫瘍溶解性ＨＳＶにおける腫瘍特異的調節のための素晴らしい標的にする。
ＩＣＰ４は、ウイルス遺伝子発現を調節する主要な転写因子であるが、その一方で、ＩＣＰ２７は、多くのウイルス遺伝子の転写を調節する多機能タンパク質である。ＩＣＰ２７は、転写、ＲＮＡプロセシング、及びエクスポートから翻訳までのｍＲＮＡバイオジェネシスの全ての段階において機能する。ＩＣＰ２７は、核タンパク質の品質制御、細胞周期の制御、ストレスシグナル伝達経路の活性化、及びアポトーシスの予防にも関与している。

ＶＧ２０２５において、ＩＣＰ２７の天然のプロモーターは、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の４３２ｂｐのプロモーターで置換される（Beauchemin and Arabzadeh, 2013, Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs) in cancer progression and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews, 32(3-4), 643-671; Hammarstrom 1999, The carcinoembryonic antigent (CEA) family. Structures, suggested functions and expression in normal and malignant tissues. In Seminars in cancer biology 9 (2), pp. 67-81; Kodera et al. 1993, Expression of carcinoembryonic antigen (CEA) and nonspecific crossreacting antigen (NCA) in gastrointestinal cancer; the correction with degress of differentiation. In Br. J Cancer 68 (1), pp 130-136）。ＣＥＡは、２２の遺伝子ファミリーの一部としての癌胎児性抗原細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）と呼ばれる１２の遺伝子のサブグループに属する（Beauchemin & Arabzadeh, 2013）。ＣＥＡは、分化プログラムの阻害、アノイキス及びアポトーシスの阻害、並びに細胞の極性化及び組織構造の破壊等の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす（Beauchemin & Arabzadeh, 2013）。例えば、ＣＥＡプロモーターの核酸配列は、配列番号１に記載される通りである。

３．ＶＧ２０２５のペイロード発現は、腫瘍において増強される
ＶＧ２０２５は、ＩＬ１２、ＩＬ１５、及びＩＬ１５受容体アルファサブユニットを共発現することにより、免疫調整反応を更に刺激する。ＩＬ１２の発現は、炎症性及び抗腫瘍性Ｔ_H１表現型へと抗原曝露Ｔ細胞の極性化を促進するが、その一方で、ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞を活性化することにより、腫瘍致死及び抗原提供細胞の活性化を更に増加させる。ＩＬ１５発現に加えて、ＶＧ２０２５は、ＩＬ１５Ｒαをコードすることにより、免疫刺激を更に増強する。例えば、ヒトＩＬ１２は、配列番号４に記載されるようなアミノ酸配列を含み得；ヒトＩＬ１５は配列番号５に記載されるようなアミノ酸配列を含むことができ、ヒトＩＬ１５受容体アルファサブユニットは配列番号７に記載されるようなアミノ酸配列を含み得る。

ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１５Ｒαの転写は、単一のプロモーター（ＣＸＣＲ４）によって駆動され、ポリペプチドは、翻訳の際にリボソームスキッピングのメカニズムによって３つの個別のタンパク質を生じる２Ａ自己切断ペプチドで連結されている（Z. Liu et al., 2017, Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in polycistronic vector. Scientific Reports, 7(2), 1-9）。例えば、２Ａペプチドは配列番号６に記載されるようなアミノ酸配列を含み得る。ペイロードは、腫瘍内において発現されることが意図されるが、ウイルスが腫瘍外エリアに「漏れた」場合、又はウイルスが全身に送達された場合、求められていない発現が正常組織において生じ得る。腫瘍床の外側でのＩＬ１２／１５発現の潜在的リスクを緩和するために、ＶＧ２０２５におけるペイロードの発現カセットは、ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）の単一のプロモーターによって駆動される（Moriuchi et al., 1997, Cloning and analysis of the promoter region of CXCR4, a coreceptor for HIV-1 entry. Journal of Immunology (Baltimore, Md. : 1950), 159(9), 4322-429; Caruz et al., 1998, Genomic organization and promoter characterization of human CXCR4 gene. FEBS Letters, 426(2), 271-278）。ＣＸＣＲ４は、元々はＴ細胞のＨＩＶウイルス融合及び侵入のための補助因子としてヒト血中単球から単離された７膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体である（Moriuchi et al. 1997）。例えば、ＣＸＣＲ４プロモーターの核酸配列は、配列番号３に記載される通りである。
選択された発現カセット／ベクターの代表的な例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願のＷＯ２０１８／０２６８７２にも記載されている。

４．短縮された糖タンパク質Ｂ（ＧＢ）
ＨＳＶ－１膜融合は感染の重要な段階である。それは、４つの必須ウイルス糖タンパク質（ｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、及びｇＬ）に依存し、ウイルスエンベロープを宿主細胞膜と融合させることによって宿主細胞への侵入を媒介する。コア融合タンパク質は、ＨＳＶ－１のＵＬ２７の遺伝子によってコードされる９０４残基のグリコシル化膜貫通タンパク質である糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）である。ｇＢの細胞質ドメイン内の複数のタイプの変異は融合能亢進表現型をもたらし、細胞－細胞融合を増加させる（Chowdary & Heldwein, 2010, Synctial Phenotype of C-Terminally Truncated Herpes Simplex Virus Type 1 gB is Associated with Diminished Membrane Interactions. Journal of Virology, 84(10), 4923-4935）。一実施形態において、ｇＢは、完全長タンパク質からＣ末端アミノ酸８８７～９０４を切り詰めることによって改変され得る。例えば、短縮された糖タンパク質Ｂのアミノ酸配列は配列番号２に記載される通りである。

５．まとめ
ＶＧ２０２５は、それぞれＣＥＡプロモーター及びｍｉＲＮＡ－１２４／１４３の制御下にあるＩＣＰ２７及びＩＣＰ３４．５を有する腫瘍溶解性ウイルス産物である。ｈＶＧ２０２５は、ＣＸＣＲ４プロモーターの制御下においてＩＬ－１２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲＡをコードするウイルス発現サイトカインカセットも取り込んでいる。ＶＧ２０２５における発現制御メカニズムは、効力を損なうことなく安全性を増加させるように設計されている。野生型ＨＳＶ－１株１７＋の具体的な改変は下記の表１に記載される。

ＶＧ２０２５は、条件付き複製性の腫瘍溶解性ＨＳＶ－１ウイルスである。ＶＧ２０２５のゲノムは、ＩＣＰ３４．５、ＩＣＰ０、及びＬＡＴの１つのコピーを含むＨＳＶ－１の長い末端反復（ＴＲ_L）配列を欠失している。ＩＣＰ３４．５の残りのコピーはその３’ＵＴＲ領域に、ｍｉＲＮＡ ｍｉＲ－１２４及びｍｉＲ－１４３に対する結合ドメインの複数のコピーを含む挿入を有する。ｍｉＲ－１２４及びｍｉＲ－１４３は神経組織及び正常組織において高度に発現されるが腫瘍組織においてはそうではない。この生成物は、ＩＣＰ２７（感染細胞ポリペプチド２７）をコードする必須ウイルス遺伝子ＵＬ５４の天然ウイルスプロモーターを、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子に由来する腫瘍特異的プロモーターで置き換えることによって更に改変される。ＶＧ２０２５は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１５Ｒαからなる強力な免疫調節ペイロードも発現し、それらは、腫瘍選択的Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）プロモーターによって制御される。最後に、ＶＧ２０２５は、融合活性を高める糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）末端短縮を有し、それにより、腫瘍内微小環境内でのウイルス伝播を促進する。ｍＶＧ２０２５及びｈＶＧ２０２５は、ｍＶＧ２０２５のマウス型ＩＬ－１２に対してｈＶＧ２０２５はＩＬ－１２のヒト型を有することを除いて、非常に似ている。
下記においてより詳細に記載されるように、ＶＧ２０２５の前臨床薬理研究は、ＢｘＰＣ３膵がん、Ｈｅｐ ３Ｂ肝臓がん、Ａ２０ Ｂ－細胞リンパ腫、ＣＴ２６大腸がん、及びＡ５４９ ＮＳＣＬＣ担がんマウスモデルにおいて著しい抗がん活性を示した。

Ｃ．治療組成物
疾患、例えば、がん等の影響を予防、治療、又は改善するために使用され得る治療組成物が提供される。より詳細には、本明細書に記載される少なくとも１種の腫瘍溶解性ウイルスを含む治療組成物が提供される。
ある特定の実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含むであろう。語句「薬学的に許容される担体」は、腫瘍溶解性ウイルスの生物活性の有効性を妨げず、投与された対象に対して毒性ではない、任意の担体、希釈剤、又は賦形剤を包含することが意図される（概して、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005 and in The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 40 - NF 35 and Supplements)。

本明細書に記載される腫瘍溶解性ウイルスの場合、好適な薬学的担体の非限定的な例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルション等）、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液剤、及び他のものが挙げられる。追加の薬学的に許容される担体としては、ゲル剤、生体吸収性マトリックス材料、腫瘍溶解性ウイルスを含む移植素子、或いは任意の他の好適なビヒクル、送達若しくは分配手段又は材料が挙げられる。そのような担体は、従来の方法によって製剤化することができ、有効用量で対象に投与することができる。追加の薬学的に許容される賦形剤としては、これらに限定されるわけではないが、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、及びエタノールが挙げられる。薬学的に許容される塩、例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、及び同様のもの）及び有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、及び同様のもの）も、それらに含まれ得る。ｏＨＳＶをがん細胞に送達するために使用することができる、薬学的に許容される（製薬グレード）担体、希釈剤、及び賦形剤は、好ましくは、組成物を受ける個体（対象）において免疫反応を誘発しないであろう（及び、好ましくは、過度の毒性なしに投与されるであろう）。

本明細書において提供される組成物は、様々な濃度において提供することができる。例えば、約１０⁴ｐｆｕ～約１０¹⁰ｐｆｕの範囲の腫瘍溶解性ウイルスの投薬量を提供することができる。更なる実施形態において、投薬量は、約１０⁶ｐｆｕ～約１０⁷ｐｆｕ、又は約１０⁷ｐｆｕ～約１０⁸ｐｆｕ、又は約１０⁸ｐｆｕ～１０⁹ｐｆｕの範囲とすることができ、単回用量として又は一定期間にわたって複数回用量として投与することもできる。用量は、毎日、毎週、隔週、毎月、又は隔月において投与することができ、投薬頻度は、周期的であってもよく、各サイクルは、反復投薬パターンを含む（例えば、約２４サイクルまで反復する、１サイクルを含む約４週間にわたる１週間又は２週間に１回の用量投与）。本発明の他の実施形態において、ウイルスは、ヒトにおける静脈内送達のために約５ｘ１０⁴ｐｆｕ／ｋｇ～約２ｘ１０⁹ｐｆｕ／ｋｇの範囲において提供することができる。腫瘍内注射の場合、好ましい投薬量は、用量あたり約１０⁶ｐｆｕ～約１０⁹ｐｆｕの範囲であり得る（約０．１ｍＬ～約５ｍＬの範囲の注射可能な容量による）。

本発明のある特定の実施形態において、標準より少ない又は多い投薬量を利用してもよい。したがって、ある特定の実施形態において、約１０⁶ｐｆｕ未満又は約１０⁹ｐｆｕ超を、患者に投与することができる。
組成物は、安定した貯蔵期限をもたらす温度において貯蔵することができ、その温度は、室温（約２０℃）、４℃、－２０℃、－８０℃、及び液体Ｎ₂中を含む。インビボでの使用が意図される組成物は一般に保存料を含まないため、貯蔵は一般に低い温度でなされるであろう。組成物は乾燥形態（例えば、凍結乾燥されて）又は液体形態において貯蔵することができる。

Ｄ．投与
本明細書に記載される組成物に加えて、がんを治療又は改善するためにそのような組成物を使用する様々な方法であって、対象に本明細書に記載されるｏＨＳＶの有効用量又は有効量を投与する工程を含む方法が提供される。
用語「有効用量」及び「有効量」は、標的のがんの治療を達成するのに十分な腫瘍溶解性ウイルスの量、例えば、標的の腫瘍サイズ又は腫瘍負荷を減少させるかさもなければ、標的の腫瘍細胞の生長速度を妨げるのに効果的な量を意味する。より詳細には、そのような用語は、必要な投薬量及び治療期間において、所望の結果を達成するのに効果的な腫瘍溶解性ウイルスの量を意味する。例えば、がんの治療の文脈において、本明細書に記載される組成物の有効量は、寛解を生じさせる量、腫瘍負荷を減少させる量、及び／又は腫瘍の拡大又はがんの生長を防ぐ量である。有効量は、例えば、対象の病状、年齢、性別、及び体重、並びに医薬製剤、投与経路等の要因に従って変り得るが、それにもかかわらず、当業者は日常業務的に決定することができる。
治療組成物は、がんと診断された対象又はがんを有する疑いのある対象に投与される。対象はヒト又は非ヒト動物であり得る。

組成物は、がんを治療するために使用される。用語「治療する」又は「治療すること」又は「治療」は、本明細書に使用される場合、臨床結果を含む有益な結果又は所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益な又は所望の臨床結果は、これらに限定されるわけではないが、検出可能であるか又は検出不能にかかわらず、１種又は複数の症状又は状態の緩和又は改善、疾患の程度の減少、疾患の安定化された（すなわち、非悪化）状態、疾患の拡大の予防、疾患の進行の遅延又は鈍化、疾患状態の改善又は軽減、疾患の再発の減少、及び寛解（一部又は全部にかかわらず）を含み得る。用語「治療すること」及び「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存と比較して生存を長引かせることも意味し得る。
がんの代表的形態としては、癌腫、白血病系、リンパ腫、骨髄腫、及び肉腫が挙げられる。白血病系の代表的形態としては、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）が挙げられ、リンパ腫の代表的形態としては、Ｂ細胞リンパ腫が挙げられる。更なる例としては、これらに限定されるわけではないが、胆道、脳（例えば、グリア芽腫）、乳房、頚、結腸直腸、ＣＮＳ（例えば、聴神経腫、星状細胞腫、蓋咽頭腫、上衣細胞腫、グリア芽腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、稀突起神経膠腫、松果体腫、及び網膜胚種細胞腫）、子宮内膜、造血細胞（例えば、白血病及びリンパ腫）、腎臓、喉頭、肺、肝臓、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚（例えば、黒色腫及び扁平上皮癌）、ＧＩ（例えば、食道、胃、及び結腸）、及び甲状腺のがんが挙げられる。がんは、固形腫瘍（例えば、肉腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫；及び骨形成性肉腫等）、びまん性のもの（例えば、白血病系）、又はこれらの何らかの組合せ（例えば、固型腫瘍及び散在性若しくはびまん性のがん細胞の両方を有する転移がん）を含み得る。

本発明のある特定の実施形態において、がんは、従来の治療（例えば、従来の化学療法及び／又は、放射線療法）に対して抵抗性であるか又は難治性であり得る。良性腫瘍及び求められていない細胞増殖の他の状態も治療され得る。
治療される特に好ましいがんとしては、高レベルのＣＥＡ発現を伴うものが挙げられる。代表的な例としては、肺腫瘍、乳房及び前立腺腫瘍、造血細胞腫瘍（例えば、白血病及びリンパ腫）、グリア芽腫、胃腸管（及び随伴器官）、例えば、食道、胆管癌、肛門、胃、腸管、膵臓、結腸、及び肝臓の腫瘍、並びに全ての表面注射可能な腫瘍（例えば、黒色腫）が挙げられる。
本明細書に記載される組換え単純ヘルペスウイルスは、例えば、経口、局所、非経口、全身性、静脈内、筋肉内、眼内、髄腔内、腫瘍内、皮下、又は経皮等の経路によって与えることができる。ある特定の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、カニューレによって、カテーテルによって、又は直接注射によって送達され得る。投与の部位は、腫瘍に直接、腫瘍に隣接して、又は腫瘍から離れた部位であり得る。投与の経路は、多くの場合、標的にされるがんのタイプに依存するであろう。

腫瘍溶解性ウイルスの最適な又は適切な投薬レジメンは、患者データ、患者の観察、及び、様々な臨床学的因子、例えば、対象のサイズ、体表面積、年齢、性別、及び、投与される特定の腫瘍溶解性ウイルス、投与の時間及び経路、治療されるがんのタイプ、患者の健康全般、並びに、患者が受けている他の薬物療法等に基づいて、主治医によって、当技術分野の技能内において容易に決定可能である。ある特定の実施形態に従って、本明細書に記載される腫瘍溶解性ウイルスを使用した対象の治療は、追加タイプの療法、例えば、異なる腫瘍溶解性ウイルスの投与、放射線治療法、チェックポイント阻害剤の投与、例えば、化学療法剤、例えば、エトポシド、イホスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、ドキシサイクリン等を使用する化学治療法等と組み合わせられ得る。

本明細書に記載される組換え単純ヘルペスウイルスは、臨床用途のための医薬及び医薬組成物として製剤化することができ、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は助剤と組み合わせることができる。本製剤は、少なくとも部分的には、投与の経路に依存するであろう。好適な製剤は、無菌媒体中におけるウイルス及び阻害剤を含み得る。本製剤は、液体形態、ゲル形態、ペースト形態、又は固体形態であり得る。本製剤は、対象又は医学専門家に提供され得る。
好ましくは、治療有効量が投与される。これは、対象に対して恩恵を示すのに十分な量である。投与される実際の量、及び投与の時間－コースは、少なくとも部分的には、がんの性質、対象の状態、送達の部位、及び他の要因に依存するであろう。
本発明の更なる他の実施形態において、本腫瘍溶解性ウイルスは様々な方法、例えば、腫瘍内若しくは静脈内によって、又は腫瘍の外科切除後に投与することができる。

概要：全てのウイルス変異導入は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）へクローン化されたウイルスゲノムにおいて実施される標準的ラムダＲｅｄ媒介組換え技術を使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において実施することができる（概して、：Tischer BK, Smith GA, Osterrieder N. Methods Mol Biol. 2010;634:421-30. doi: 10.1007/978-1-60761-652-8_30. PMID: 20677001; Tischer BK, von Einem J, Kaufer B, and Osterrieder N., BioTechniques 40:191-197, Feb. 2006 (including the Supplementary Material, doi: 10.2144/000112096;及びTischer BK, Smith, GA and Osterrieder N. Chapter 30, Jeff Braman (ed.), In Vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 634, doi: 10.1007/978-1-60761-652-8_30, Springer Science+Business Media, LLC 2010を参照されたい）。
ＢＡＣ組換え法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での変異導入を促進するために、ウイルスゲノム内における外因性ＢＡＣ ＤＮＡの存在を必要とする。ＢＡＣ配列は、最も一般的には、ウイルス遺伝子、例えば、ＨＳＶ遺伝子ＵＳ１／ＵＳ２、ＵＬ３／ＵＬ４、及び／若しくはＵＬ５０／ＵＬ５１の間、又は、天然ＴＫの発現を妨害することができるチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子中のどちらかに挿入される。ＴＫ欠損ウイルスベクターは、ウイルスゲノムの非コーディング領域に挿入された構成的プロモーターの制御下の天然ウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のコピーに対する発現カセットを含み得る。或いは、ＴＫ機能は、相同的組換えを介して外因性ＢＡＣ配列を除去して天然ＴＫ遺伝子配列を再構成することによって回復され得る。機能的ＴＫ遺伝子の存在は、ウイルスを、グアノシン類似体、例えば、ガンシクロビル及びアシクロビア等による一般的な治療に対して感受性にすることによって、ウイルスの安全性を高める。

（実施例１）
ＶＧ２０２５の膜融合性の試験
目的：ＶＧ２０２５は、ｇＢにおけるａａ８７６と停止コドンとの間の全てのアミノ酸が欠失され、融合能亢進変異が組み込まれている。この研究は、前記変異の融合能亢進効果を実証するためのものである。
手順：ＶＧ２０２５を使用して、ＭＯｆＩ＝０．１においてＡ５４９腫瘍細胞及びＭＲＣ－５非腫瘍細胞に感染させ、感染後に４８時間インキュベートし、その後に撮像した。
結果：図３に示されるように、ＶＧ２０２５感染Ａ５４９細胞（腫瘍細胞）では多核性膜融合プラークが観察されたが、ＭＲＣ－５細胞（非腫瘍細胞）では観察されなかった。
結論：ＶＧ２０２５は腫瘍選択的であり、高度に膜融合性である。

（実施例２）
ＣＥＡ発現レベルとＩＣＰ２７発現及びウイルス複製効率との相関関係
目的：この研究は、異なる腫瘍細胞株におけるＣＥＡ発現レベルと、ＩＣＰ２７発現レベル及びｈＶＧ２０２５のウイルス複製効率との間の相関関係を評価するためのものである。
手順：下記の細胞株表２を１２ウェルプレートに播種し、ベンダーによって提案される適切な細胞培養培地中で一晩インキュベートした。

ＶＧ２０２５を希釈して、ＭＯＩ ０．１において細胞培養物に加えるか、又は模擬感染させた。２時間のインキュベーション後、培地を交換した。ＲＮＡ及びＤＮＡ抽出のために感染の６時間後及び１８時間後に細胞を採取し、その後にＲＴ－ｑＰＣＲによってＣＥＡ及びＩＣＰ２７ ｍＲＮＡの発現を検出した。感染の４８時間後にいくらかの試料を採取し、ＰＣＲために処理して、ＩＣＰ２７のＤＮＡコピー数を測定した。各試料を正規化するためにＧＡＰＤＨを使用した。ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、ＡＢ９９９９２）を使用して細胞培養物の上清においてＣＥＡタンパク質シェディングを測定するために、非感染細胞の他の試料を使用した。
ＣＥＡ及びＩＣＰ２７ ｍＲＮＡの正規化されたＣｔ（ΔＣｔ）値をプロットした。Ｒ及びＰ値はＥＸＣＥＬを用いて回帰分析によって計算した。

結果：異なるヒト腫瘍細胞は異なるレベルのＣＥＡを発現する。この実験の結果は、図４Ａ及び４Ｂに示される。簡潔に説明すると、ＣＥＡ及びＩＣＰ２７のｍＲＮＡレベルは、ＲＴ－ｑＰＣＲによってΔＣｔ値として表現されプロットされる。回帰分析は、ＩＣＰ２７ ｍＲＮＡのΔＣｔ値が、ＣＥＡ ｍＲＮＡのΔＣｔ値に対して正に相関し、ｐ＝０．００８２においてＲ＝０．７４７であることを示した。ＥＬＩＳＡによってＣＥＡ陽性のｈＶＧ２０２５感染細胞におけるウイルスコピー数をΔＣｔ値として測定した。ＣＥＡタンパク質シェディングとウイルスコピー数との間の相関も示された。回帰分析は、ｐ＝０．０１２６においてＲ＝０．８２０を示した。
結論：膵臓、肺、消化器のがんを含むあるタイプの腫瘍は、高レベルのＣＥＡ発現を有する。ｈＶＧ２０２５からのＩＣＰ２７の転写レベルは、いくつかの腫瘍細胞において、ＣＥＡの転写活性に対して中程度だが有意な正の相関を示した。
細胞培養物におけるシェディングによって測定された腫瘍細胞のＣＥＡタンパク質発現は、ｈＶＧ２０２５による感染後のウイルスコピー数と非常に相関した。

（実施例３）
ｍｉＲ１２４／１４３で形質導入されたＨＥＫ－２９３細胞におけるＩＣＰ３４．５発現の評価によって実証される、ＩＣＰ３４．５発現のｍｉＲ１２４／１４３転写制御
目的：この研究の目的は、ＩＣＰ３４．５の発現の制御における、ｈＶＧ２０２５に存在するｍｉＲＮＡ結合エレメントの機能を調べることである。
本開示のウイルスは、ＩＣＰ３４．５遺伝子の３’ＵＴＲ領域に存在するｍｉＲ結合エレメント／配列を有するように設計した。ｈＶＧ２０２５において、ｍｉＲ調節のためのターゲッティングドメインはｍｉＲ１２４及びｍｉＲ１４３である。前者は、全ての神経細胞において高度に発現され、後者はほとんどの腫瘍細胞において過少発現される。これは、完全なＩＣＰ３４．５遺伝子を有するウイルスの使用を可能にするであろうが、ＩＣＰ３４．５の発現は、転写後調節によって示差的に制御される。ＩＣＰ３４．５の発現は、ｍｉＲを発現しない細胞及び組織（腫瘍細胞）において影響されないであろうが、ＩＣＰ３４．５の発現は、高レベルのｍｉＲを発現する正常組織（例えば、神経細胞）において妨げられるであろう。

この研究において、本発明者らは、２９３ＦＴ細胞、又は、ｍｉＲ１２４及びｍｉＲ１４３模倣物又はスクランブル化された配列を有するｍｉＲ前駆体をトランスフェクトされた同じ細胞を使用した。次いで、細胞を、ｈＶＧ２０２５によって重複感染させた。これは、ｍｉＲ前駆体の存在下又は非存在下での標的遺伝子の発現の直接試験及び比較を可能にするであろう。更に、ｈＶＧ２０２５におけるＩＣＰ３４．５コード領域の下流の結合ドメインの配列はｍｉＲと完全に一致するので、ｍｉＲによるこれらのドメインの結合は結果としてｍＲＮＡ（この場合はＩＣＰ３４．５）の分解を生じるであろう。したがって、本発明者らは、ｈＶＧ２０２５におけるｍｉＲ調節ＩＣＰ３４．５発現を試験するために、ＩＣＰ３４．５ ｍＲＮＡのレベルを測定するためにＲＴ－ｑＰＣＲを使用することができる。
手順：２９３ＦＴ細胞培養物に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを使用してｍｉＲ１２４及びｍｉＲ１４３をトランスフェクトし、その後に、ｈＶＧ２０２５によって多重感染させた。ＩＣＰ２７及びＩＣＰ３４．５の発現並びにコピー数を定量化するために、ウイルス感染後２４時間にＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。

実験設計：２９３ＦＴ細胞に、トリプリケートにおいて、ｍｉＲ１２４／ｍｉＲ１４３前駆体のどちらかをトランスフェクトした。コントロール細胞に、スクランブル化ｍｉＲ前駆体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＡＭ１７１１０）をトランスフェクトするか、又は模擬トランスフェクトした。
トランスフェクト後２４時間に、ＭＯＩ＝１において細胞にｈＶＧ２０２５を感染させた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２において６時間インキュベートした。
更なる試験のために、ウイルス感染後６時間に細胞を採取した。ＲＮＡを精製し、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ｍｉＲ１２４、ｍｉＲ１４３、及びアクチンのレベルを測定するためにＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。
結果：この実験の結果は図５に示される。ＩＣＰ２７の発現レベルは、ｍｉＲ１２４／１４３、コントロール／スクランブル化ｍｉＲのいずれかをトランスフェクトした２９３ＦＴ細胞、又は非トランスフェクト細胞で同等であったが、ＩＣＰ３４．５のレベルは、ｍｉＲ１２４／１４３をトランスフェクトされた細胞において著しく低かった（ｐ値＝０．０００２）。

トランスフェクトされた細胞におけるｍｉＲ１２４及びｍｉＲ１４３の存在を検証するために、トランスフェクトされた細胞（感染及び非感染）においてＲＴ－ｑＰＣＲも実施した。高レベルのｍｉＲ１２４及びｍｉＲ１４３がトランスフェクトされた細胞において検出された。その上、ウイルス感染はこれらの細胞のｍｉＲのレベルに影響を及ぼさないか又は低下させなかったことも観察された。

結論：結果は、ｍｉＲ１２４／１４３の存在下でＩＣＰ３４．５の発現の著しい減少を示している（ｐ＝０．０００２）。その一方で、ＩＣＰ２７の発現レベルはｍｉＲによって調節されず、全ての群において同じであり、このことは、ＩＣＰ３４．５の下方制御がｍｉＲ１２４／１４３特異的であることを示唆している。更に、ウイルス感染は治療された細胞におけるｍｉＲのレベルを変更しなかった。

（実施例４）
様々な腫瘍細胞株における用量依存性のベクター誘導性腫瘍細胞毒性
目的：この研究は、インビトロ培養による１１のヒト腫瘍細胞株及び６のマウス腫瘍細胞株において、細胞生存率及び５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）として測定された、ｈＶＧ２０２５の抗腫瘍活性を試験した。
手順：下記の細胞株を、５×１０³個細胞／ウェルにおいてウェルプレートに播種し、ベンダーによって提案される様々な好適な細胞特異的培養培地において一晩インキュベートした：
Ａ５４９（ヒトＮＳＣＬＣ）、ＢｘＰＣ３（ヒト膵臓がん）、Ｐａｎｃ０１（ヒト膵臓がん）、Ｃａｐａｎ－１（ヒト膵臓がん）、ＳＷ６２０（ヒト結腸がん）、ＬｎＣＡＰ及びＰＣ－３（ヒト前立腺腫瘍細胞）、Ｕ２ＯＳ（ヒト脛骨肉腫）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌腫）、Ｋａｔｏ ＩＩＩ（ヒト胃がん）、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽腫）、Ｐａｎｃ０２（マウス膵臓がん）、クラウドマンＳ９１（マウスメラノーマ）、ＭＢ４９－Ｌｕｃ（マウス膀胱がん）、ＣＴ２６（マウス結腸がん）、Ａ２０（マウス細網肉腫）、４Ｔ１（マウス乳がん）。

ｈＶＧ２０２５を希釈し、ＭＯＩ ５、１、０．２、０．０４、及び０の範囲のＭＯＩにおいて細胞培養物に加えた（ＭＯＩ ０は、ビヒクルコントロールとして培地のみである）。３日間インキュベートした。細胞生存率を標準的ＭＴＴアッセイ下のＭＴＴ法によって評価した。
細胞生存率を、各細胞株において、ＭＯＩに対してプロットした。許容的細胞株のＩＣ₅₀を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって計算した。耐性細胞株のＩＣ₅₀は判定不能（Ｎ．Ｄ．）として記した。
結果：この実験の結果は、ｈＶＧ２０２５の抗腫瘍活性を示しており、インビトロ培養による１１のヒト腫瘍細胞株（図６Ａ）及び６つのマウス腫瘍細胞株（図６Ｂ）における細胞生存率として測定された。より詳細には、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、ＬｎＣａｐ、及びＢｘＰＣ３はｈＶＧ２０２５に対して最も高感受性であり、ＭＯＩ １より低いＩＣ₅₀を有していた。Ｃａｐａｎ－１、ＰＣ３、及びＳＷ６２０は、ｈＶＧ２０２５に対して抵抗性であることがわかった。他のヒト腫瘍細胞は、ｈＶＧ２０２５に対して中程度の許容性を有することがわかった。この研究において試験した全てのマウス腫瘍細胞は、ｈＶＧ２０２５に対して抵抗性であることがわかった。
結論：ＭＯＩ＜１でのｈＶＧ２０２５は、膵臓（ＢｘＰＣ３）、肺（Ａ５４９）、前立腺（ＬｎＣａＰ）、及び肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）に代表されるいくつかの細胞株に対して細胞傷害性である。マウス腫瘍細胞株はｈＶＧ２０２５誘導細胞傷害性に対して感受性ではなかった。

（実施例５）
ＩＣＰ３４．５－ｏＨＳＶ－１との比較における腫瘍細胞中のＶＧ２０２５のウイルス複製効率
目的：この研究は、Ａ５４９及びＢｘＰＣ３細胞におけるｈＶＧ２０２５ウイルス及びＩＣＰ３４．５（－）ｏＨＳＶ－１株（ＶＧ１６０）の複製効率を比較することが目的である。
研究設計：Ａ５４９及びＢｘＰＣ３を６ウェルプレートにおいて調製した。一晩のインキュベーションの後、ｈＶＧ２０２５及びＩＣＰ３４．５－ｏＨＳＶ－１を、ＭＯＩ＝０．５において細胞に感染させた。感染後２時間後、培地を無ウイルスの新鮮な培地と交換した。感染後６時間、２４時間、及び４８時間で、細胞及び培地を一緒に採取して、－８０℃において貯蔵し、その後にＶｅｒｏ細胞においてプラークアッセイを行った。その都度、２つの試料／ウイルス／細胞株を採取した。

測定：全ての試料は、ＳＯＰに基づくプラークアッセイのために調製した。
結果：Ａ５４９及びＢｘＰＣ３細胞において増殖したｈＶＧ２０２５の力価を表４に示す。２種の腫瘍細胞株における２種のウイルスの増殖曲線は図７Ａ及び７Ｂに示した。

結論：結果は、ｈＶＧ２０２５の複製は、Ａ５４９及びＢＸＰＣ３細胞においてＶＧ１６０（ＩＣＰ３４．５－）より約１０倍高いことを示した（両方とも、感染後４８時間においてＣＥＡ高発現細胞である）。このアッセイとの関連における２種のウイルスの主な違いは、ａ）ウイルス必須遺伝子ＩＣＰ２７は、ｈＶＧ２０２５の場合、ＣＥＡプロモーターによって制御されるが、ＶＧ１６０の場合、同じ遺伝子は、その天然のウイルスプロモーターによって制御されること；ｂ）ＩＣＰ３４．５遺伝子は、ｈＶＧ２０２５においてｍｉＲ１２４及びｍｉＲ１４３によって制御されるが、ＶＧ１６０では欠失されること、である。したがって、この２種の腫瘍細胞株においてｈＶＧ２０２５によって示される複製利点は、増加したＩＣＰ２７転写及び機能的ＩＣＰ３４．５の両方に起因し得る。

（実施例６）
腫瘍細胞に感染させたＨＶＧ２０２５ウイルスからのヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ発現
目的：腫瘍細胞に感染させたウイルスｈＶＧ２０２５からのヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａペイロード分泌を測定すること。
手順：Ａ５４９（ＮＳＣＬＣ）及びＭＲＣ－５（繊維芽細胞）細胞株を、３７℃で１２ウェルプレートに播種し、一晩の後に、ＭＯＩ＝１で２４時間、ｈＶＧ２０２５ウイルスに感染させた。同じ条件でＶＧ１９０５バックボーンウイルス（非ヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ）に感染させた細胞株をネガティブコントロールとして使用した。ウイルス感染の２４時間後、細胞から上清を採取し、ヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ分泌を、ＥＬＩＳＡアッセイによって定量化した。

結果：ｈＶＧ２０２５ウイルス感染の２４時間後、ペイロード発現がＡ５４９及びＭＲＣ－５細胞において観察された。しかしながら、Ａ５４９細胞は、ＭＲＣ－５細胞よりも著しく高いヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａペイロードを産生した（それぞれ、３．６倍のヒトＩＬ－１２ｐ７０及び１４．６倍のヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ）（図８Ａ及び８Ｂ並びに表５）。

結論：ｈＶＧ２０２５ウイルスを感染させたＡ５４９細胞は、感染ＭＲＣ５細胞と比較して、より多くのヒトＩＬ－１２ｐ７０及びＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａペイロードを産生する。

（実施例７）
ｈＶＧ２０２５ペイロード：ヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａの生物学的機能
目的：ｈＶＧ２０２５ウイルスを感染させた細胞から産生されるヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａを伴うヒトＩＬ－１２ｐ７０ペイロードの生物学的機能を調べること。
手順：ヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａペイロード発現ｈＶＧ２０２５又はＶＧ１９０５バックボーン（ヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ無し）ウイルスを使用して、１のＭＯＩにおいてＶｅｒｏ細胞に感染させた。感染Ｖｅｒｏ細胞培養物の上清を感染後４８時間で採取し、ペイロードの発現をＥＬＩＳＡアッセイによって測定し、その後に以下の手順のために使用した。ヒトＰＢＭＣを、３７℃のインキュベーターにおいて０．２５ｍｇ／ｍＬのマイトジェンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）によって、２４時間予め刺激した。翌日、ＰＨＡ刺激ヒトリンパ芽球を、異なる容量のウイルス感染Ｖｅｒｏ上清と共に４８時間共インキュベーションした。共インキュベーションから上清を採取し、免疫細胞から分泌されたヒトＩＦＮ－γを、ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡアッセイによって定量化した。

結果：ウイルス感染Ｖｅｒｏ上清におけるペイロード発現をＥＬＩＳＡによって判定し、その後、ペイロードの生理活性を調べた。ｈＶＧ２０２５感染細胞から採取した上清のみが、ヒトｈｕｍａｎＩＬ－１２及びＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａを産生したが、ＶＧ１９０５感染細胞又はウイルス感染のない上清では産生されなかった（図９Ａ及び９Ｂ並びに表６）。
次に、ＰＢＭＣによるヒトＩＦＮ－γ分泌に基づいてペイロードの生理活性を調べた。結果は、ｈＶＧ２０２５ウイルス感染細胞から採取した上清と共に共インキュベートされたＰＨＡ刺激リンパ芽球からの用量依存性ヒトＩＦＮ－γ産生を示したが、その一方で、ｈＶＧ２０２５、ＶＧ１９０５に感染させた細胞又はウイルスに感染させていない細胞からの上清に曝露させたＰＨＡ刺激リンパ芽球からＩＦＮ－γ分泌は検出されなかった（図１０及び表７）。

結論：ｈＶＧ２０２５ウイルス感染Ｖｅｒｏ細胞からヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａペイロードが分泌された。ｈＶＧ２０２５感染細胞から分泌された上記のペイロードを含む上清は、ヒトＰＢＭＣを刺激してＩＦＮ－γを産生させる。

（実施例８）
Ａ５４９及びＭＲＣ５細胞におけるｈＶＧ２０２５のＴＣＩＤ５０
目的：ＴＣＩＤ５０アッセイによってＡ５４９及びＭＲＣ５細胞におけるｈＶＧ２０２５のウイルス力価を判定すること、並びに、腫瘍細胞株及び正常細胞株におけるｈＶＧ２０２５の感染及び複製の違いを見出すこと。
研究設計：以下のようなウイルスの６回の反復希釈：第１の管において、９９０μｌのＤＭＥＭ培地に－８０℃のストックから１０μｌのウイルスｈＶＧ２０２５を加えることによって１００倍の希釈を作製し、次いで、７つの管において９００μｌのＤＭＥＭ培地に１００μｌのウイルスを加えることによって１０倍の段階希釈を作製し、合計で４８本の管のウイルス希釈調製物を作製した。同じ希釈のウイルスを２人の人によって繰り返した。９６ウェルプレートにおいてＡ５４９又はＭＲＣ５細胞に１００ｕｌ／ウェルの希釈したウイルスを加えて、合計で９６ウェルの各細胞株を感染させた。各希釈群を、１２回繰り返してウェルに感染させた。３７℃及び５％のＣＯ₂での接種の３～５日後に、顕微鏡下において可視化してＴＣＩＤ₅₀を計算した。

測定：ウイルス希釈物を接種したウェルを観察することによって、細胞変性効果（ＣＰＥ）を倒立顕微鏡下において可視化した。Ｒｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈの方法に基づいて、ＴＣＩＤ５０を計算した。
結果：この実験の結果は、下記の表８において提供する。

結論：非腫瘍ＭＲＣ５細胞におけるｈＶＧ２０２５のＴＣＩＤ５０は、７６．４３倍の差においてＡ５４９細胞よりはるかに高く、このことは、Ａ５４９腫瘍細胞におけるＶＧ２０２５の複製効率が著しく高いことを示している。

（実施例９）
ｈＶＧ２０２５によるＡ５４９負担ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの治療
目的：この研究は、無胸腺症マウスにおけるＡ５４９肺がん異種移植モデルにおける、用量依存性の抗腫瘍有効性及び腫瘍内送達ｈＶＧ２０２５ウイルスの生存利益を判定することである。
研究設計：２９匹のＳＰＦグレードの雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに、５×１０⁶ Ａ５４９細胞／マウスを皮下注射し、各ウイルス治療群に５匹のマウス（ビヒクル群には４匹のマウス）となるように６つの群に無作為化した。群１はビヒクル（ＰＢＳ）コントロールであった。群２～５は試験群であり、腫瘍内注射によって、それぞれ、１０²、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶ＰＦＵ／マウスの用量においてｈＶＧ２０２５の単回用量を投与した。全ての動物を、標準プロトコールに従って異なる体の部位にマークを付けることによって適切に特定し、収容し、給餌した。
測定：臨床所見のために、投与後に全てのマウスを少なくとも１日２回観察した。体重及び腫瘍サイズをベースラインにおいて測定し、その後、１週間に２～３回測定した。データは平均±ＳＥＭとして表現した。
腫瘍が１５００ｍｍ³に生長するか（キャリパーによって測定）又はグレード５の臨床的症状を示した場合、動物を犠牲にした。

結果：ビヒクルコントロール群と比較することにより、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶ＰＦＵ／マウスのｈＶＧ２０２５による腫瘍内治療の後の腫瘍生長阻害を観察した（図１１Ａ～１１Ｇを参照されたい）。移植後最長４０日まで腫瘍サイズを測定し、いくつかのビヒクルコントロールの動物では、自然発生的な腫瘍の退縮により終了した。マウスは５４日目まで生存させ、スケジュールに従って犠牲にした。標本サイズが小さすぎて正常に分散しているかどうか判定できないため、腫瘍サイズに対して統計的分析は実施しなかった。代わりに、各群における腫瘍阻害の持続期間を、Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定によって分析した。表８は各群での腫瘍退縮のまとめを提供し、図１２はｈＶＧ２０２５治療後の体重の変化をグラフに表している。

結論：用量依存性の様式で、ｈＶＧ２０２５の抗腫瘍活性がヒト肺がんを異種移植したマウスモデルにおいて示された。１０³ＰＦＵ／マウスを超えるウイルス用量は、阻害効果を示すのに十分であると考えられる。しかし、より多い用量では、完全な腫瘍退縮を有するマウスが多くいた。いずれの群のマウスにも毒性症状は見られなかった。

（実施例１０）
ｈＶＧ２０２５によるＢｘＰＣ３負担ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの治療
目的：この研究は、無胸腺症マウスにおけるＢｘＰＣ３膵臓がん異種移植モデルでの、抗腫瘍有効性及び腫瘍内注射可能なｈＶＧ２０２５ウイルスの生存利益を判定することである。
研究設計：３０匹のＳＰＦグレードの雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに、５×１０⁶ＢｘＰＣ３細胞／マウスを皮下注射し、各群に５匹のマウスとなるように６つの群に無作為化した。群１はビヒクルコントロールであり、ＰＢＳを腫瘍内注射した。群２～５は試験群であり、腫瘍内投与によって、それぞれ、１０²、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶ＰＦＵ／マウスにおいてｈＶＧ２０２５の単回用量を投与した。全ての動物を、標準プロトコールに従って異なる体の部位にマークを付けることによって適切に特定し、収容し、給餌した。
測定：臨床的症状に対して、投与後に全てのマウスを少なくとも１日２回観察した。体重及び腫瘍サイズを、ベースラインにおいて測定し、その後、１週間に２～３回測定した。データは、個々の腫瘍サイズとして表現した。
腫瘍が１５００ｍｍ³に生長するか（キャリパーによって測定）又はグレード５の臨床的症状を示した場合には動物を犠牲にした。

結果：結果は図１３Ａ～１３Ｇにおいて提供する。ビヒクルコントロール群と比較することにより、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶ＰＦＵ／マウスのｈＶＧ２０２５による腫瘍内治療の後のＢｘＰＣ３腫瘍生長阻害を観察した。腫瘍負荷にのみ起因してマウスを安楽死させ、残りは移植後８９日目まで生存させた。腫瘍は、ビヒクルコントロール群では５匹中２匹の動物において生長しなかった。
標本サイズが小さすぎて正常に分散しているかどうか判定できないため、腫瘍サイズに対して統計的分析は実施しなかった。代わりに、各群における腫瘍阻害の持続期間を、Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定によって分析した（図１４）。全ての群間において、マウスの体重に有意な差はなかった。臨床的症状は観察されなかった。
結論：ｈＶＧ２０２５の抗腫瘍活性は、ヒト膵臓がんを異種移植したヌードマウスにおいて明らかだった。ｈＶＧ２０２５を受けた何匹かの動物は、完全な腫瘍退縮を示した。動物における腫瘍生長に大きなばらつきがあるため、有意な効力を示すためにはより大きな標本サイズが必要である。ｈＶＧ２０２５は担腫瘍ヌードマウスにおいて安全であった。

（実施例１１）
肺がん（Ａ５４９）モデルにおけるｈＶＧ２０２５及びＩＣＰ３４．５を欠失したＨＳＶ－１の抗腫瘍有効性の比較
目的：実験目標は、無胸腺症Ａ５４９異種移植マウスモデルにおいてｈＶＧ２０２５及びＩＣＰ３４．５（－） ｏＨＳＶ－１の抗腫瘍有効性を比較することである。
研究設計：３０匹のＳＰＦグレードの雌の無胸腺症ヌードマウスに、２．５×１０⁶Ａ５４９細胞／マウスを皮下注射し、各群に６匹のマウスとなるように５つの群に無作為化した。群１はビヒクルコントロールであり、１×ＤＰＢＳ＋７．５％グリセリンを含むビヒクルを腫瘍内注射した。群２～５は試験群であり；群２～４には、それぞれ、５ｘ１０³、５ｘ１０⁵、及び５ｘ１０⁷ＰＦＵ／マウスにてｈＶＧ２０２５の単回用量を投与した。最後に、群５には、５ｘ１０⁷ＰＦＵ／マウスにおいてＩＣＰ３４．５遺伝子欠失ＨＳＶ－１ベクターの単回用量を投与した。全ての試験群の投与は腫瘍内注射によって行った。全ての動物は標準プロトコールに従って適切に収容及び給餌し、異なる体の一部にマーキングすることによって適切に特定した。

測定：臨床所見のために、投与後に全てのマウスを少なくとも１日２回観察した。体重及び腫瘍サイズをベースラインにおいて測定し、その後、１週間に２～３回測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３によって統計分析を実施した。腫瘍の体積は副尺付きノギスを使用して測定した（長さ×幅×深さ×０．５２３６）。示されるデータは、腫瘍の体積（ｍｍ³）であり、値は平均±ＳＥＭである。腫瘍退縮の統計学的有意性（Ｐ＜０．０５）は、多重ｔ検定を使用して決定した。腫瘍が１０００ｍｍ³に生長するか又はグレード５の臨床的症状を示した場合、動物を犠牲にした。
結果：結果は、図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｅ、及び１５Ｆにおいて提供される。簡潔に説明すると、ビヒクルコントロール群と比較して、５ｘ１０⁵及び５ｘ１０⁷ＰＦＵ／マウスによる１回の腫瘍内治療の後、治療後３９日における統計的に有意な腫瘍生長阻害が観察された。結果は、５ｘ１０⁷ＰＦＵ／マウスの用量でのＩＣＰ３４．５欠失変異体の腫瘍阻害効果と比較して、ｈＶＧ２０２５は、ＩＣＰ３４．５変異体より１００分の１の低い用量でさえ、はるかに良好な効力を実証した。
結論：ｈＶＧ２０２５の抗腫瘍効果が、用量依存性の様式でヒト肺がんを異種移植されたマウスモデルにおいて確認された。腫瘍の生長は、５ｘ１０⁵及び５ｘ１０⁷ＰＦＵ／マウスの用量において有意に制御された。ＩＣＰ３４．５遺伝子欠失ＨＳＶ－１ベクターと比較して、ｈＶＧ２０２５により著しく増大した抗がん効果が観察される。

（実施例１２）
ＶＧ２０２５による皮下接種の後の若いＤＢＡ／２マウスの生存
目的：この研究は、若いＤＢＡ／２マウスにおける皮下接種後のｈＶＧ２０２５の毒性を判定することを目的とする。
研究設計：４週齢の若い３０匹のＳＰＦグレードの雌のＤＢＡ／２マウスを、各群あたり５匹のマウスとなるように６つの群に無作為化した。群１はビヒクルコントロールであり、ＰＢＳを皮下注射した。群２～４は試験群であり、表９に示されるように、皮下注射によって異なる用量で、試験物質の単回用量又は５日間連続で投与される複数回用量（群４のみ）を投与した。群５～６は単回用量の野生型１７＋ＨＳＶウイルスを投与されたポジティブ群である。

全ての動物を、標準プロトコールに従って異なる体の部位にマークを付けることによって適切に特定し、収容し、給餌した。
測定：臨床所見のために、投与後に全てのマウスを少なくとも１日２回観察した。体重をベースラインにおいて測定し、その後、１週間に２～３回測定した。データは、平均体重として表現した。各群の生存曲線を示した。
体重が２０％減少するか又はグレード５の臨床的症状を示した場合、動物を犠牲にした。
結果：実験全体の間、一般的な行動の活動において異常性は観察されなかった。ビヒクルコントロール群と比較して、図１６に示されるように群間においてマウスの体重に有意な差はなかった。１７＋ １０⁶ＰＦＵ／マウスの処置群における１匹のマウスのみ、接種後の５日に体重減少及び病的状態を示し、マウスは特別なケアが与えられたにもかかわらず死亡した。生存パーセントは図１７に示される。

結論：１０⁶ＰＦＵ／マウスにて１７＋株においていくらかの毒性が見られ、結果として１匹の動物が死亡した。野生型より１００倍も高い力価においてさえ、ｈＶＧ２０２５を皮下に注射された全ての動物において、及び、連続５日間にわたって１０⁸ＰＦＵを１日１回注射された全ての動物において、毒性は観察されなかった（群４）。したがって、ｈＶＧ２０２５は皮下経路によって投与された若いＤＢＡ／２マウスにおいて安全である。

（実施例１３）
若齢ＤＢＡ／２マウスでの経鼻接種によるＶＧ２０２５の神経毒性アッセイ
目的：この研究は、若いＤＢＡ／２マウスでの経鼻接種により、野生型親株１７＋及びＶＧ１６１、ＩＣＰ３４．５（－）腫瘍溶解性ＨＳＶ－１と比較して、ｈＶＧ２０２５の毒性を判定することである。鼻部位は、三叉神経節及び嗅球の両方によって神経支配されるため、このモデルは、試験ＨＳＶ神経毒性に対して非常に高感受性である。
研究設計：４週齢の若い３０匹のＳＰＦグレードの雌のＤＢＡ／２マウスを、各群が５匹のマウスとなるように６つの群に無作為化した。群１はビヒクルコントロールであり、ＰＢＳを経鼻接種した。群２はポジティブコントロールであり、野生型ＩＣＰ３４．５ポジティブ１７＋株の致死用量を接種した。群４～６は経鼻接種によってｈＶＧ２０２５又はＶＧ１６１の２レベルの単回用量を投与した試験群であった（表１０）。

全ての動物を、標準プロトコールに従って異なる体の部位にマークを付けることによって適切に特定し、収容し、給餌した。
測定：臨床所見のために投与後に全てのマウスを少なくとも１日２回観察した。体重をベースラインにおいて測定し、その後、１週間に２～３回測定した。データは平均体重として表現した。各群の生存曲線を示した。
体重が２０％減少するか又はグレード５の臨床的症状を示した場合、動物を犠牲にした。
結果：実験全体の間、ｈＶＧ２０２５及びＶＧ１６１治療群において、一般的な行動の活動に異常性は観察されなかった。図１８に示されるように、ビヒクルコントロール群と比較することにより、ＶＧ１６１及びｈＶＧ２０２５群間においてマウスの体重に有意な差はなく、両方の用量レベルの全てのマウスは生存した。１７＋処置群の全てのマウスは接種後３日で病的状態及び体重の減少を示し、６日目に犠牲にしなければならなかった。生存曲線を図１９に示した。

結論：１０⁵ＰＦＵ／マウスでの１７＋株は、全てのマウスに対して接種後３日で毒性を示し、６日目に死亡させなければならなかった。１０⁷ＰＦＵ／マウスの治療群を含めたｈＶＧ２０２５及びＩＣＰ３４．５（－）ＶＧ１６１の群は、いかなる毒性も示さなかった。ｈＶＧ２０２５及びＶＧ１６１の両方は、ＩＣＰ３４．５状態の差にかかわらず、若いＤＢＡ／２マウスにおいて良好な安全性を示した。
神経系におけるｈＶＧ２０２５によるｍｉＲ１２４／１４３調節ＩＣＰ３４．５発現の安全性が実証される。

（実施例１４）
神経毒性を評価するために角膜乱切によってＶＧ２０２５に曝露させたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存及び三叉神経節におけるウイルス遺伝子の発現
目的：この研究は、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの角膜乱切モデルを使用してｈＶＧ２０２５の神経毒性を評価することを目的とする。
研究設計：試験したウイルスは、ａ）ｈＶＧ１６１、ＩＣＰ３４．５遺伝子の両方のコピーが欠失されたＨＳＶ－１；ｂ）ｈＶＧ２０２５、ＩＣＰ２７及びｍｉＲ１２４／１４３によるＩＣＰ３４．５の調節を駆動するＣＥＡプロモーターを有するＨＳＶ－１であった。両方のウイルス株は、ＩＬ１２／ＩＬ１５；ｃ）ＨＳＶ－１ １７＋野生型、ｈＶＧ１６１及びｈＶＧ２０２５の親ウイルスも発現する。合計１４０匹の６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、８つの群：１）模擬感染（ｎ＝１０匹）、２）１７＋（１０⁵ｐｆｕ／眼、ｎ＝３０匹）、３）ｈＶＧ１６１ １０⁵ｐｆｕ／眼（ｎ＝３０匹）、４）ｈＶＧ１６１ １０⁶ｐｆｕ／眼（ｎ＝１０匹）、５）ｈＶＧ１６１ １０⁷ｐｆｕ／眼（ｎ＝１０匹）、６）ｈＶＧ２０２５ １０⁵ｐｆｕ／眼（ｎ＝３０匹）、７）ｈＶＧ２０２５ １０⁶ｐｆｕ／眼（ｎ＝１０匹）、８）ｈＶＧ２０２５ １０⁷ｐｆｕ／眼（ｎ＝１０匹）にランダムに分けた。全ての動物は、角膜乱切によって、示された用量において５ｕｌのＰＢＳ又はウイルス溶液を受けた。群１）、２）、３）、及び６）の３匹の動物を感染後５日目に死亡させ、ＲＮＡｓｅｑ分析のために三叉神経節（ＴＧ）及び嗅球（ＯＢ）を採取した。残りの動物は２８日目まで生存させ、その後に犠牲にした。

結果：模擬感染動物と同様に、ｈＶＧ１６１及びｈＶＧ２０２５を接種した両方のマウスは、観察可能な症状を示さなかったが、その一方で、野生型１７＋は、感染後２８日以内に重度の角膜病巣（図２０Ａに代表的な写真）及び約７５％の致死率を示した（図２０Ｂ）。
ｈＶＧ１６１又はｈＶＧ２０２５感染マウスいずれからも、ＨＳＶ－１転写物は感染後５日目において三叉神経節及び嗅球では検出できなかったが、その一方で、１７＋株は、三叉神経節において、及びより少ない程度で嗅球において、実質的に全てのＨＳＶ－１転写物を高レベルにおいて発現する（図２１）。
結論：１．野生型１７＋株は、マウス１匹あたり１０⁵ｐｆｕのウイルス感染において、重度の角膜炎症、組織障害、及び高死亡率を引き起こすため、角膜乱切モデルはＨＳＶ－１誘発神経毒性を試験するために効果的であった。
２．ＩＣＰ３４．５欠失（ｈＶＧ１６１）、又は、転写及び翻訳の二重調節（ｈＶＧ２０２５）のいずれによって操作されたＨＳＶ－１株も、野生型より１００倍高い用量においてさえ、眼及びＣＮＳの両方においていかなる病原性も示さなかった。

３．感染後５日目に、１０⁵ｐｆｕにおいて感染させた野生型ＨＳＶ－１ １７＋を角膜感染させた動物の三叉神経節において、全てのウイルス遺伝子の発現は容易に検出可能であった。低レベルの転写活性（ＴＧの約２００分の１）も、この初期感染段階に嗅球において検出することができ、このことは、脳におけるウイルスの急速で広範囲の伝播を示唆している。
４．角膜におけるｈＶＧ１６１も、ｈＶＧ２０２５感染のどちらも、三叉神経節又は嗅球においていかなる検出可能なウイルス遺伝子発現も生じず、このことは、どちらのウイルスも急性感染相においてＣＮＳで複製しないことを示している。
５．ＩＣＰ３４．５発現の制御されたｈＶＧ２０２５は、神経系において、少なくともＩＣＰ３４．５（－）ｈＶＧ１６１と同程度に安全である。

（実施例１５）
ガンシクロビルに対する感受性
目的：この研究の目的は、ガンシクロビルに対するｈＶＧ２０２５ ＃９の感受性を調べることである。
研究設計：異なる濃度のガンシクロビル（ＧＣＶ）の存在下においてＶｅｒｏ細胞に感染させるために、ｈＶＧ２０２５（ｔｋ＋）及びその親株ＶＧ１９２５＃２－１（ｔｋ－）のストックを、２０００ｐｆｕ／ｍｌ、４００ｐｆｕ／ｍｌ、及び８０ｐｆｕ／ｍｌにおいて使用した。ＧＣＶに対する感受性の測定値として、プレートにおけるプラークの数をカウントした。

測定：ｈＶＧ２０２５又はＶＧ１９２５＃２－１ウイルスを指定されたウイルス溶液に希釈し、その後に、１２ウェルプレートにおいて、５００ｐｆｕ／ウェル、１００ｐｆｕ／ウェル、又は２０ｐｆｕ／ウェルの最終濃度でＶｅｒｏ細胞に感染させた。室温で１時間のインキュベーションの後、示されたウェルに異なる濃度のＧＣＶを加え、細胞を３７℃ ５％ＣＯ₂においてインキュベートした。インキュベーションの３日後、プレートを２％のクリスタルバイオレットで染色し、プラークの数をカウントした。上記の実験を３回繰り返した。

結果：結果は、下記の表１１及び１２並びに図２２において提供される。

結論：ＴＫ（＋）ｈＶＧ２０２５は、ガンシクロビルに対して高感受性である。ｈＶＧ２０２５を阻害するＧＣＶのＩＣ₅₀は、＜０．１９５μｇ／ｍｌであり、＜０．３９μｇ／ｍｌのＧＣＶは、１００％のウイルス阻害を生じる。ｈＶＧ２０２５によるＧＣＶに対する上記の感受性は、その親株ＶＧ１９２５＃２－１（ＴＫ－）に対して対照的であり、１．５６３μｇ／ｍｌ（試験した最大濃度）のＧＣＶは、ウイルス複製において約２０％のみの阻害を生じることができた。
したがって、ｈＶＧ２０２５を阻害するために必要な濃度は、ヒトにおけるガンシクロビルの臨床用量よりはるかに低い（例えば、Toxicity et al., 2017, Ganciclovir Injection [package insert]. Lenoir: EXELA Pharma Sciences, NC; 2017を参照されたく；この場合、ガンシクロビルの臨床用量はヒトにおいて９μｇ／ｍｌのＣｍａｘを提供する。

（実施例１６）
ウイルス安定性
安定性データは、最長１カ月までそれぞれ４℃及び－８０℃で貯蔵したＶＧ２０２５ウイルスのパイロットバッチを使用して収集した。それぞれの力価を、バイアル瓶に詰める前のものと比較した。両方の温度下で最長１カ月まで著しいウイルス力価の低下はなかった（図２３）。

（実施例１７）
肝臓がん（Ｈｅｐ ３Ｂ－ｌｕｃ）モデルにおけるｈＶＧ２０２５ウイルスの抗腫瘍有効性の評価
目的：この研究の目的は、雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＨｅｐ ３Ｂ－ｌｕｃの同所ヒト肝臓がん異種移植モデルにおいて、静脈内（ｉ．ｖ．）投与されたＶＧ２０２５の抗腫瘍有効性を評価することである。

研究設計：ｈＶＧ２０２５の抗腫瘍有効性研究の実験設計は、表１３にまとめる。

結果：同所Ｈｅｐ ３Ｂ－ｌｕｃの樹立した腫瘍を担持した雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへＶＧ２０２５を投与した後の体重変化が図２４Ａに示される。データ点は、群の平均体重を表す。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。

ＶＧ２０２５を投与された同所Ｈｅｐ ３Ｂ－ｌｕｃ異種移植片を担持した雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均生物発光は表１４及び図２４Ｂに示される。

同所Ｈｅｐ ３Ｂ－ｌｕｃの樹立した腫瘍を有する雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにＶＧ２０２５を投与した後の生存曲線が図２４Ｃに示される。

これらのマウスの転移率が表１５及び図２４Ｄに示される。生物発光強度は、ＩＶＩＳマシンによって検出される安楽死させた動物に基づいて計算した。いずれの群においても有意な転移は検出されなかった。

結論：静脈内送達されたＶＧ２０２５の抗腫瘍効果が、ヒト肝臓がん細胞を異種移植されたこのマウスモデルにおいて確認された。ビヒクルコントロール群と比較して、ＶＧ２０２５（２．４×１０⁶ＰＦＵ／１００μＬ／マウス）及びＶＧ２０２５（２．４×１０⁷ＰＦＵ／１００μＬ／マウス）による治療は肝臓がんのこのモデルにおいて明白な抗腫瘍効果を示した。特に、いずれの治療群においても有意な転移は観察されなかった。

（実施例１８）
Ｂ細胞リンパ腫（Ａ２０－ｌｕｃ）モデルにおけるｍＶＧ２０２５抗腫瘍有効性の評価
目的：この研究の目的は、雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける同所ヒトＢ細胞リンパ腫異種移植モデルにおいて、静脈内（ｉ．ｖ．）投与されたＶＧ２０２５の抗腫瘍有効性を評価することであった。
研究設計：リンパ腫細胞による接種の前に、マウス（群あたり８匹）を１０⁶ＰＦＵ／マウスにおいてｍＶＧ２０２５の２回の皮下注射によって予め（プレ）免疫した。次いで、マウスにＡ２０－Ｌｕｃ Ｂ細胞リンパ腫細胞を静脈内により接種した。実験設計の詳細は、表１６に記載される。

結果：樹立した同所Ａ２０－ｌｕｃ腫瘍を有する雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにｍＶＧ２０２５を投与した後の体重変化が図２５Ａに示される。データ点は群の平均体重を表す。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。

ｍＶＧ２０２５を投与された同所Ａ２０－ｌｕｃ異種移植腫瘍を保持する雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける経時的な平均生物発光は表１７及び図２５Ｂに示される。

この研究において観察された転移率は表１８及び図２５Ｃに示される。生物発光強度は、ＩＶＩＳマシンによって検出される安楽死させた動物に基づいて計算した。
結論：この研究において、ｍＶＧ２０２５の治療有効性を、同所Ａ２０－ｌｕｃ Ｂ細胞リンパ腫異種移植モデルにおいて評価した。コントロール（ビヒクル）群と比較して、ｍＶＧ２０２５（２．４×１０⁷ＰＦＵ／１００μＬ／マウスにおいて、プレ免疫）による治療は、Ｂ細胞リンパ腫のこのモデルにおいて明白な抗腫瘍活性を示した。

（実施例１９）
Ｂ細胞リンパ腫（Ａ２０－ｌｕｃ）モデルにおける低用量ｍＶＧ２０２５ウイルスの抗腫瘍有効性の評価
目的：この研究の目的は、雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける同所ヒトＢ細胞リンパ腫異種移植モデルにおいて、静脈内（ｉ．ｖ．）投与されたＶＧ２０２５の抗腫瘍有効性を評価することである。
研究設計：リンパ腫細胞の接種の前に、マウスを１０⁶ＰＦＵ／マウスにおいてｍＶＧ２０２５の２回の皮下注射によって予め免疫した。次いで、マウスにＡ２０－Ｌｕｃ Ｂ細胞リンパ腫細胞を静脈内において接種した。実験設計の詳細は表１９に記載される。

結果：樹立した同所Ａ２０－ｌｕｃ腫瘍を有する雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにｍＶＧ２０２５を投与した後の体重変化が図２６Ａに示される。データ点は群の平均体重を表す。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。

ｍＶＧ２０２５を投与された同所Ａ２０－ｌｕｃ異種移植腫瘍を有する雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける経時的な平均生物発光は表２０及び図２６Ｂに示される。

転移率が表２１及び図２６Ｃに示される。
結論：この研究において、ｍＶＧ２０２５の治療有効性を、同所Ａ２０－ｌｕｃ Ｂ細胞リンパ腫異種移植モデルにおいて評価した。コントロール（ビヒクル）群と比較して、ｍＶＧ２０２５（２．４×１０⁶ＰＦＵ／１００μＬ／マウス、プレ免疫）及びｍＶＧ２０２５（２．４×１０⁵ＰＦＵ／１００μＬ／マウス、プレ免疫）による治療はＢ細胞リンパ腫のこのモデルにおいて明白な抗腫瘍活性を示した。

（実施例２０）
霊長類におけるｈＶＧ２０２５急性毒性の評価
皮下注射又は静脈内注射によるアカゲザルにおける単回用量投与の後に、ｈＶＧ２０２５の急性毒性を評価するために、この研究を行った。
雄及び雌のアカゲザルに、単回用量として、皮下投与により０ＰＦＵ／ｋｇ、１．０×１０⁹ＰＦＵ／ｋｇを投与し、静脈内投与により２．０×１０⁹ＰＦＵ／ｋｇを投与した。６匹のアカゲザルを、３つの群にランダムに割り当て（１匹動物／性別／群）、静脈内投与の注入速度は２ｍＬ／分であり、投与容量は、それぞれ皮下投与及び静脈内投与の５ｍＬ／ｋｇ及び１０ｍＬ／ｋｇであった。
以下のパラメータ及び終了点を評価した：罹患率及び死亡率；臨床的知見；体重；飼料消費；体温；心電図検査；血液学及び血液凝固；臨床化学；免疫機能及び肉眼所見。
全ての動物が、予定された犠牲時まで生存した。臨床的知見、体重、飼料消費、体温、心電図検査、血液学及び血液凝固、臨床化学、免疫機能、又は肉眼所見に対する試験物質関連効果は、指摘されなかった。

結論：雄及び雌のアカゲザルに、皮下投与により０ＰＦＵ／ｋｇ、１．０×１０⁹ＰＦＵ／ｋｇを、及び単回用量として静脈内投与により２．０×１０⁹ＰＦＵ／ｋｇを投与した。全ての動物が、予定された犠牲時まで生存した。臨床的知見、体重、飼料消費、体温、心電図検査、血液学、血液凝固、臨床化学、免疫機能、又は肉眼所見におけるｈＶＧ２０２５関連の異常な変化は見られなかった。したがって、皮下注射によるアカゲザルにおけるｈＶＧ２０２５の最大耐量（ＭＴＤ）は１．０×１０⁹ＰＦＵ／ｋｇであると決定した。静脈内注射によるアカゲザルにおけるｈＶＧ２０２５の最大耐量（ＭＴＤ）は、２．０×１０⁹ＰＦＵ／ｋｇであると決定した。

（実施例２１）
マウス結腸がん（ＣＴ２６）マウスモデルにおけるｍＶＧ２０２５のアブスコパル抗腫瘍効果
目的：実験目標は、マウスの反対側の脇腹に接種した一次及び二次腫瘍の両方を組み込む二重ＣＴ２６同系マウス結腸がんモデルにおける、マウスＩＬ－１２を発現するｈＶＧ２０２５の代替バージョンであるｍＶＧ２０２５の効力及び安全性を判定することであった。
研究設計：２４匹の雌のＳＰＦグレードのＢＡＬＢ／ｃマウスに、マウス１匹あたり５×１０⁵のＣＴ２６細胞を、各脇腹に１回ずつ、２回皮下注射し、各群に１２匹のマウスとなるように２つの群にランダムに分けた。群１はビヒクルコントロールであり、ＰＢＳを腫瘍内注射した。群２は試験群であり、腫瘍内投与によって、各用量に対して１×１０⁸ＰＦＵ／マウスにおいて連続５日間によるｍＶＧ２０２５の５回用量を投与した。注射はマウスあたり１つの腫瘍へと実施し、反対側の脇腹の第２の腫瘍は注射しないままにした。全ての動物を、標準プロトコールに従って異なる体の部位にマークを付けることによって適切に特定し、収容し、給餌した。
測定：臨床的症状のために、投与後に全てのマウスを少なくとも１日２回観察した。マウスの体重及び腫瘍サイズを１週間に３回測定した。腫瘍の体積はキャリパーを使用して測定した（長さ×幅×深さ×０．５２３６）。

結果：治療開始後９日におけるｍＶＧ２０２５による５回連続の腫瘍内治療の後に、ビヒクルコントロール群と比較して、統計的に有意な腫瘍生長阻害が観察された（図２７Ａ）。対側アブスコパル未治療腫瘍に対する腫瘍生長阻害は、同じ時点において統計的有意に達しなかったが、平均腫瘍サイズは、コントロール群と比較して治療されたマウスにおいて低下傾向にあることが観察された（図２７Ｂ）。治療開始後３０日に、ウイルス治療腫瘍及び対側アブスコパル腫瘍の両方の完全退縮によって証明されるように、ｍＶＧ２０２５治療群の１２匹中７匹のマウスが完全奏効を示した。対照的に、コントロール群のマウスの１２匹中１０匹は治療開始後３４日までに腫瘍負荷により安楽死させた（図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃ、及び２８Ｄを参照されたい）。
ｍＶＧ２０２５で治療したマウスは、ビヒクルコントロールで治療したマウスと比較して、生存パーセントにおいて統計的に有意な増加を示した。詳細には、ｍＶＧ２０２５で治療した１２匹中８匹のマウスが実験の終了点（治療開始後５８日）まで生き残った。その一方で、コントロール群の１２匹中１０匹のマウスは実験の終了点に達する前に腫瘍負荷により、人道的終了点に達した（図２９）。
結論：ｍＶＧ２０２５による治療のアブスコパル抗腫瘍免疫効力及び生存利益が同系二重ＣＴ２６マウス結腸がんモデルにおいて確認され、その結果として、１２匹中７匹のマウスにおいて注射側及び非注射側の両方からの移植腫瘍の完全な除去を生じた。その上、ＨＳＶ－１関連毒性の臨床徴候は観察されなかった。

（実施例２２）
マウスＢ細胞リンパ腫（Ａ２０）マウスモデルにおけるｍＶＧ２０２５のアブスコパル抗腫瘍有効性
目的：実験目標は、マウスの反対側の脇腹に接種した一次及び二次腫瘍の両方を取り込ませた二重Ａ２０同系マウスＢ細胞リンパ腫モデルにおける、マウスＩＬ－１２を発現するｈＶＧ２０２５の代替バージョンであるｍＶＧ２０２５の効力及び安全性を判定することであった。
研究設計：１９匹のＳＰＦグレードのＢＡＬＢ／ｃマウスに、マウス１匹あたり２．５×１０⁶のＡ２０細胞を各脇腹に１回ずつ２回皮下注射し、２つの群に無作為化した。群１はＰＢＳを腫瘍内注射した９匹のマウスからなるビヒクルコントロールであった。群２は、各用量について１×１０⁸ＰＦＵ／マウスで、連続５日間にわたってｍＶＧ２０２５の５回用量を腫瘍内注射によって投与した１０匹のマウスからなる試験群であった。注射は、マウスあたり単一の腫瘍へ実施し、反対側の脇腹の第２の腫瘍は注射しないままにした。全ての動物を、標準プロトコールに従って異なる体の部位にマークを付けることによって適切に特定し、収容し、給餌した。

測定：臨床的症状のために、投与後に全てのマウスを少なくとも１日２回観察した。マウスの体重及び腫瘍サイズを１週間に３回測定した。腫瘍の体積はキャリパーを使用して測定した（長さ×幅×深さ×０．５２３６）。
結果：治療開始後１７日におけるｍＶＧ２０２５による５回連続の腫瘍内治療の後に、ビヒクルコントロール群と比較して、治療された腫瘍に対する統計的に有意な腫瘍生長阻害が観察された（図３０Ａ）。対側未治療腫瘍に対する腫瘍生長阻害は、同じ時点において統計的有意に達しなかったが（図３０Ｂ）、治療開始後７５日までに、ウイルス治療腫瘍及び対側アブスコパル腫瘍の両方の完全退縮によって証明されるように、ｍＶＧ２０２５治療群の１０匹中４匹のマウスが完全奏効を示した。対照的に、全てのコントロール群のマウスは治療開始後４２日までに腫瘍負荷により安楽死させた（図３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ、及び３１Ｄを参照されたい）。

ｍＶＧ２０２５で治療した４匹の無腫瘍マウスが抗腫瘍免疫反応を生じることができることを更に実証するために、これらのマウスを初期治療後７７日にＡ２０腫瘍細胞を再びチャレンジ感染させた。新たに樹立した腫瘍は、更なるｍＶＧ２０２５治療なしに、治療開始後１０７日までに、４匹中３匹のマウスにおいてゆっくり退縮し（図３２）、このことは、Ａ２０腫瘍細胞に対する免疫反応の存在を示唆している。
ｍＶＧ２０２５で治療した１０匹中４匹のマウスが、実験終了点（治療開始後１０７日）まで生存した。その一方で、全てのコントロール群のマウスは治療開始後４２日までに腫瘍負荷により、人道的終了点に達した。
結論：ｍＶＧ２０２５による治療のアブスコパル抗腫瘍免疫効力及び生存利益が、同系二重Ａ２０マウスＢ細胞リンパ腫モデルにおいて確認され、その結果として、１０匹中４匹のマウスにおいて注射側及び非注射側の両方からの移植腫瘍の完全な除去を生じた。抗腫瘍性免疫記憶の存在が、Ａ２０腫瘍細胞でそれらを再びチャレンジ感染させることにより完全奏効を有する４匹のマウスにおいて更に実証され、その結果として４匹中３匹のマウスにおいて腫瘍の完全な除去を生じた。その上、ＨＳＶ－１関連毒性の臨床徴候は観察されなかった。

（実施例２３）
ＩＬ－１２及びＩＬ－１５ペイロードの腫瘍内及び全身性検出
目的：実験目標は、ヒト肺がん（Ａ５４９）異種移植マウスモデルにおいて、腫瘍内送達されたｈＶＧ２０２５ウイルスのペイロードレベルを判定することであった。
研究設計：２３匹の雌のＳＰＦグレードの無胸腺症ヌードマウスに、２．５×１０⁶Ａ５４９細胞／マウスを皮下注射し、２つの群に無作為化した。群１は、ＰＢＳに溶解させた７．５％グリセロールを腫瘍内注射した３匹のマウスからなるビヒクル群であった。群２は、腫瘍内投与によって、５×１０⁷ＰＦＵ／マウスでｈＶＧ２０２５の単回用量を投与された２０匹のマウスからなる試験群であった。全てのビヒクル注射したマウスは治療後２日で安楽死させ、ウイルス注射したマウスのうちの４匹は、治療後１日、２日、３日、７日、及び１４日で安楽死させた。腫瘍及び血清を各マウスから採取し、ＩＬ－１２及びＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲＡを検出するためにＥＬＩＳＡに使用した。

測定：マウスの体重及び腫瘍サイズを１週間に３回測定した。腫瘍の体積はキャリパーを使用して測定した（長さ×幅×深さ×０．５２３６）。腫瘍全体を採取し、動物を人道的に安楽死させた後に即座に急速凍結した。血清を抽出するために血液試料も採取した。ＥＬＩＳＡキットのベンダーによって提供されるプロトコールに従ってＩＬ－１２及びＩＬ－１５の濃度を決定するために、腫瘍及び血清の両方をＥＬＩＳＡアッセイに供した。
結果：Ａ５４９腫瘍及び血清試料を、ｈＶＧ２０２５又はビヒクルコントロールのどちらかを腫瘍内注射したヌードマウスから採取した。腫瘍組織（図３３Ａ及び３３Ｂ）及び血清（図３４Ａ及び３４Ｂ）におけるヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体産物の動態を、注射後２４時間、４８時間、７２時間、７日、及び１５日においてＥＬＩＳＡを使用して分析した。腫瘍組織において、ヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａの検出はｈＶＧ２０２５注射後２４時間において最大となり、注射後１５日まで検出可能のままであった。ヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａは、２４時間の時点において血清試料において検出可能であったが、腫瘍組織において検出された濃度の１％未満であり、それらは、その後の時点で、血清中において検出不能なレベルまで急速に低下した。
結論：ヒトＩＬ－１２ｐ７０及びヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαの大部分は腫瘍に局在し、全身放出の証拠はなく、それは、腫瘍内注射されたｈＶＧ２０２５からのペイロード漏出が安全に対する懸念ではないことを示している。

本発明は、本明細書において広く全般的に説明された。一般開示内に含まれるより狭い種及びサブゼネリック的群分けも、本発明の一部を形成する。これは、削除された材料が本明細書に明確に列挙されているかどうかにかかわらず、属から全ての主題を除去する但し書又は消極的な限定を伴う本発明の一般的説明を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈において明記されない限り、複数の指示対象を含み、用語「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ」又は「Ｙ」又は「Ｘ」と「Ｙ」との両方を意味し、並びに名詞に続く文字「ｓ」は、その名詞の複数形及び単数形の両方を指定することも理解すべきである。更に、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、本発明は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバー及びメンバーのサブグループを包含し並びにその観点からも記載されることが意図され、当業者によって認識され、並びに、出願人は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーの任意のサブ群を明確に意味するために、本願又は特許請求の範囲を修正する権利を保有する。

本明細書において使用される専門用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、制限であることを意図しないことは理解されるべきである。本明細書において明確に定義されない限り、本明細書において使用される専門用語は、関連技術分野において知られている従来の意味を与えるためのものであることも更に理解されるべきである。
本明細書全体における「一実施形態」又は「ある実施形態」及びその変形に対する参照は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、又は特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所における語句「一実施形態において」又は「ある実施形態において」の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を意味しているものではない。その上、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ又は複数の実施形態において任意の好適な方式において組み合わせてもよい。

以下は、付番された本開示のいくつかの例示的実施形態である。
１．改変された腫瘍溶解性ヘルペスウイルスゲノムを含む組換えヘルペスウイルスであって、前記改変されたヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーに作動可能に連結された少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが不活性化変異を含む、組換えヘルペスウイルス。ある特定の実施形態において、組換えヘルペスウイルスは組換え単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２等）である。

２．変異が、少なくとも１つの長い末端反復（Ｒ_L）領域の欠失又はウイルスゲノムの長い末端反復領域の欠失及び短い末端反復（Ｒ_S）領域の欠失である、実施形態１に記載の組換えヘルペスウイルス。例としては、ＨＳＶ－１ ＩＣＰ０及びＩＣＰ３４．５と機能的に同等な遺伝子の１つのコピーをコードするウイルスゲノムの長い末端反復（Ｒ_L）領域の欠失、又はＨＳＶ－１ ＩＣＰ４と機能的に同等な遺伝子の１つのコピーをコードするウイルスゲノムの長い末端反復（Ｒ_L）領域の欠失及び短い末端反復（ＲＳ）領域の欠失が挙げられる。他の実施形態において、変異は、長い内部反復領域の少なくとも１つの欠失、又は長い内部反復領域及び短い内部反復領域の欠失を含み得る。他の実施形態において、変異は、１つの長い反復（Ｒ_L）領域の欠失、又はウイルスゲノムの１つの長い反復（Ｒ_L）領域の欠失及び１つの短い反復（Ｒ_S）領域の欠失を含み得る。本発明の好ましい実施形態において、欠失は、１つの長い末端反復領域の欠失のみであり、長い末端反復領域及び短い末端反復領域の両方に欠失を有するＨＳＶと比較して、継代における高められた安定性を有する。任意の実施例の中で変異はＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーを含む欠失である。

３．ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーに作動可能に連結された２～１０のｍｉＲＮＡ標的配列を更に含む、単純ヘルペスウイルスである、実施形態１又は２に記載の組換えヘルペスウイルス。
４．ｍｉＲＮＡ標的配列が、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーの３’非翻訳領域に挿入されている、実施形態１、２，又は３のいずれか１つに記載の組換え単純ヘルペスウイルス。更なる実施形態において、ｍｉＲＮＡ標的配列は、３’非翻訳領域にタンデム式において挿入されている。様々な実施形態において、同じ又は様々な長さのリンカーＤＮＡを、異なるｍｉＲＮＡ結合部位間に挿入することができる。ある特定の実施形態において、リンカーは、１～５０の範囲の塩基対である。他の実施形態において、リンカーは１０未満の塩基対である。
５．２～１０のｍｉＲＮＡ標的配列が、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡに結合する、実施形態１、２、３、又は４のいずれか１つに記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
６．ｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１２４^*、及びｍｉＲ－１４３からなる群から選択されるｍｉＲＮＡを標的にする、実施形態１、２、３、４、又は５のいずれか１つに記載の組換え単純ヘルペスウイルス。

７．ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルスであり、改変されたヘルペスウイルスゲノムが、ウイルス遺伝子ＩＣＰ４及び／又はＩＣＰ２７における追加の変異又は改変を含む、実施形態１、２、３、４、５、又は６のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルス。
８．改変が、腫瘍特異的プロモーターによる天然ウイルスプロモーターの置換を含む、実施形態１、２、３、４、５、６、又は７のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルス。
９．改変が、ＩＣＰ４又はＩＣＰ２７のプロモーター－調節領域全体の置換、任意に、腫瘍特異的プロモーターによる置換、である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、又は８のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルス。
１０．ＩＣＰ２７プロモーターがｈＣＥＡプロモーターによって置換される、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、又は９のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルス。

１１．免疫刺激因子、抗体、及びチェックポイント阻害ペプチドからなる群から選択される非ウイルスタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を更に含み、少なくとも１つの核酸が一般的プロモーター又は腫瘍特異的プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルス。一般的プロモーターの例としては、構成的プロモーター、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１ａｌｐｈａ、ＰＧＫ、及びＣＡＧ等が挙げられる。
１２．非ウイルスタンパク質が、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１５受容体アルファサブユニットからなる群から選択される、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１１のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルス。
１３．プロモーターが腫瘍特異的ＣＸＣＲ４プロモーターである、実施形態１１又は１２に記載の組換えヘルペスウイルス。

１４．増強された膜融合性（同様の野生型ウイルスと比較した場合）を有する糖タンパク質をコードする核酸配列を有する、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルス。例としては、様々な導入遺伝子（例えば、テナガザル類人猿白血球ウイルス由来の膜融合性糖タンパク質「ＧＡＬＶ］）、並びに／又はＨＳＶ融合を増強する変異、例えば、糖タンパク質Ｂ、糖タンパク質Ｋ、及び／若しくはＵＬ２０におけるトランケーション若しくは変異等、が挙げられる。好ましい実施形態において、核酸配列は糖タンパク質Ｂの融合性型（例えば、アミノ酸８７６の後で短縮される糖タンパク質Ｂ）をコードする。
１５．糖タンパク質Ｂがアミノ酸８７６の後ろにある欠失によって短縮されていてもよい、実施形態１４に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
１６．腫瘍溶解性ヘルペスウイルスがＨＳＶ－１である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルス。

本発明の特に好ましい実施形態において、組換えヘルペスウイルスは腫瘍溶解性ヘルペスウイルスＨＳＶ－１を含み、ここで、ａ）ＩＣＰ０及びＩＣＰ３４．５遺伝子を含む長い末端反復の欠失_;ｂ）ＣＥＡプロモーターによる天然ＩＣＰ２７プロモーターの置換；ｃ）ＩＣＰ３４．５ ３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ－１４３及びｍｉＲ－１２４に対する結合部位の挿入；ｄ）糖タンパク質Ｂコード領域の３’末端の一部の欠失（例えば、８４ｂｐの欠失）；及びｅ）ＣＸＣＲ４プロモーターの制御下においてＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１５Ｒαを発現することができる発現カセットの挿入、が存在する。
１７．腫瘍細胞を阻害又は溶解する方法であって、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスの治療有効量を提供する工程を含む方法。
１８．実施形態１～１６のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルス及び薬学的に許容される担体を含む治療組成物。好ましい実施形態において、ヘルペスウイルは、上記の表１に記載されるＶＧ２０２５、又はより詳細にはｈＶＧ２０２５である。
１９．対象の患うがんを治療する方法であって、実施形態１８の組成物の治療有効量を投与する工程を含む方法。

２０．前記がんが、高レベルのバイオマーカーを発現し、そのプロモーターが、実施形態１～１９のいずれか１つに記載のＩＣＰ４及び／又はＩＣＰ２７遺伝子を駆動するために使用される、実施形態１９に記載の方法。他の実施形態において、がんは、高レベルのバイオマーカー、例えば、ｈＣＥＡ等を発現する。関連実施形態において、対象は、本明細書に記載されるヘルペスウイルスの投与の前に、高レベルのｈＣＥＡ（例えば、２．５ｎｇ／ｍｌ超）の発現について試験される。１０ｎｇ／ｍｌを超える、又更には２０ｎｇ／ｍｌを超えるｈＣＥＡのレベルは、がんの著しい進行を示している。ある特定の実施形態において、がんは、頚部、食道、肺、結腸直腸、肝臓 胃、胆管癌、及び膵臓のがんからなる群から選択される。他の実施形態において、がんは、乳房及び前立腺腫瘍、並びにグリア芽腫からなる群から選択される。他の実施形態において、がんは、白血病又はリンパ腫である。他の実施形態において、がんは、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）又はＢ細胞リンパ腫である。他の実施形態において、がんは、表面注射可能な腫瘍である。なお他の実施形態において、がんは、高レベルのＣＥＡを発現する。
２１．実施形態１８の組成物の治療有効量を投与する前記工程が、静脈内又は腫瘍内投与を含む、実施形態１９に記載の方法。好ましい実施形態において、組成物は、約１０⁴ｐｆｕ～約１０¹⁰ｐｆｕの範囲の投薬量において投与することができる。更なる実施形態において、投薬量は、約１０⁶ｐｆｕ～約１０⁷ｐｆｕ、又は約１０⁷ｐｆｕ～約１０⁸ｐｆｕ、又は約１０⁸ｐｆｕ～約１０⁹ｐｆｕの範囲でよく、単回用量として、又は経時的に広がる複数回用量として投与してもよい。用量は、上記においてより詳細に記載されるように投与してもよい。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は内容及び文脈において明記されない限り、複数の指示対象、すなわち、１つ又は複数の目的物を包含する。内容及び文脈から場合により包括的又は排他的であることが示されない限り、接続語「及び」及び「又は」は、概して、「及び／又は」を含む広い意味において用いられることにも留意すべきである。したがって、選択肢の使用（例えば、「又は」）は、選択肢の一方、両方、又はそれらの組合せのいずれかを意味すると理解されるべきである。更に、本明細書において「及び／又は」として列挙される場合の「及び」及び「又は」の組成は、関連する項目又はアイデアの全てを含む実施形態並びに関連する項目又はアイデアの全てより少ない関連する項目又はアイデアを含む１つ又は複数の他の代替の実施形態を包含することが意図される。

文脈において明記されない限り、本明細書及び以下の特許請求の範囲全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びにその同義語及び変形、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」等、並びにその変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、例えば、「例えば、これらに限定されないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」等、オープン形式の包括的な意味において解釈されるべきである。用語「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、請求項の範囲を、特定された材料若しくは工程、又は特許請求の範囲に記載の本発明の基本的な新規の特性に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
この文書内において使用される全ての見出しは、読み手によるその再考察を促進するためにのみ利用され、いかなる方式においても本発明又は特許請求の範囲を限定するとして解釈すべきではない。したがって、本明細書において提供される見出し及び開示の要約は、便宜だけのためのものであって、実施形態の範囲又は意味を説明するものではない。

本明細書において値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈において明記されない限り下限の単位の１０分の１までのそれぞれの介在値、並びに任意の他の言及された値又はその言及された範囲における介在値も、本発明内に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれ得、当該より小さい範囲も本発明内に含まれ、言及した範囲におけるいずれかの具体的に排除された範囲に従う。言及された範囲が、上限、下限の一方又は両方を含む場合、これらの含まれる上限、下限の一方又は両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
例えば、本明細書において提供される、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、又は整数範囲は、特に明記されない限り、列記された範囲内の任意の整数の値、及び適切であればその分率（例えば、整数の１０分の１及び１００分の１等）を含むと理解されるべきである。更に、任意の物理的特徴、例えば、ポリマーのサブユニット、サイズ、又は厚さ等に関連して本明細書において列挙されるいずれかの数値範囲も、特に明記されない限り、列挙された範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書において使用される場合、用語「約」は、特に明記されない限り、示された範囲、値、又は構造の±２０％を意味する。

本明細書において言及される、及び／又は出願データシートに一覧される、全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような文献は、例えば、ここで記載される本発明に関連して使用され得る刊行物に記載される材料及び方法論を説明及び開示する目的のために参照により組み込まれる。上記及び本文を通して議論される刊行物は、本願の出願日より前に、それらの開示のためのみに提供される。いずれも、本明細書において、本発明者らに先願発明によるいずれの参照された刊行物にも先行する権利を与える資格のないことの承認として解釈されるべきではない。
本明細書において参照又は言及される全ての特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、及び他の文献及び材料は、本発明が属する技術分野の当業者の技術レベルの指標であり、そのような参照される文献及び材料のそれぞれは、あたかも個別に参照によりその全体が本明細書に組み込まれるか又はその全体が本明細書に記載される場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、任意のそのような特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、電子的に利用可能な情報、及び他の参照された材料又は文献からのあらゆる材料及び情報を物理的にこの明細書に組み込まれる権利を保有する。

一般的に、下記の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲において開示される特定の実施形態に限定すると解釈するべきではないが、そのような特許請求の範囲が資格を与えられる均等物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示に限定されない。
更に、本特許における記載された説明の一部は、全ての特許請求の範囲を含む。更に、全ての元の特許請求の範囲並びにあらゆる優先権文献からの全ての特許請求の範囲を含む、全ての特許請求の範囲は、本明細書により、参照によってその全体が本明細書における記載された説明の一部に組み込まれ、出願人は、あらゆるそのような特許請求の範囲を物理的に、記載された説明又は本願の任意の他の部分に組み込む権利を保有する。したがって、例えば、いかなる状況下でも、本特許は、特許請求の範囲の正確な言葉遣いが本明細書の記載の一部においてその通りの言葉で記載されないことについて、請求項についての記載を提供しないとして解釈してはならない。

特許請求の範囲は、法に従って解釈されるであろう。しかしながら、それにもかかわらず、いずれかの請求項又はその一部を解釈することの、主張された又は認識された容易さ又は困難さは、いかなる状況下においても、本願（１つ又は複数）の出願の際の請求項又はその任意の一部の任意の調節又は修正が、先行技術の一部を形成しないあらゆるその均等物に対するあらゆる権利を本特許が放棄したとして解釈させ得ない。
他の非限定的な実施形態は、下記の特許請求の範囲内である。本特許は、本明細書において具体的に及び／又は明確に開示される、特定の実施例若しくは非限定的な実施形態又は方法に制限されるとは解釈され得ない。いかなる状況下においても、本特許は、そのような申し立てが、具体的かつ条件又は制限なく、出願人による応答書面において明確に採用されない限り、特許商標局のいかなる試験官又はいかなる他の職員若しくは従業員によって制限されると解釈され得ない。

Claims (24)

1. 改変された腫瘍溶解性ヘルペスウイルスゲノムを含む組換えヘルペスウイルスであって、前記改変されたヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーに作動可能に連結された少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが不活性化変異を含む、組換えヘルペスウイルス。
2. 変異が、ウイルスゲノムの少なくとも１つの長い末端反復領域の欠失である、請求項１に記載の組換えヘルペスウイルス。
3. ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーに作動可能に連結された２～１０のｍｉＲＮＡ標的配列を更に含む、単純ヘルペスウイルスである、請求項１に記載の組換えヘルペスウイルス。
4. ｍｉＲＮＡ標的配列がＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーの３’非翻訳領域に挿入されている、請求項３に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
5. ２～１０のｍｉＲＮＡ標的配列が少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡに結合する、請求項３に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
6. ｍｉＲＮＡ標的配列がｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１２４^*、及びｍｉＲ－１４３からなる群から選択されるｍｉＲＮＡを標的にする、請求項５に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
7. 改変されたヘルペスウイルスゲノムが、ウイルス遺伝子ＩＣＰ４及び／又はＩＣＰ２７における追加の変異又は改変を含む、単純ヘルペスウイルスである、請求項１に記載の組換えヘルペスウイルス。
8. 天然ウイルスプロモーターを腫瘍特異的プロモーターで置換することによって改変される、請求項１に記載の組換えヘルペスウイルス。
9. ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルスであり、改変が、腫瘍特異的プロモーターによるＩＣＰ４又はＩＣＰ２７のプロモーター－調節領域全体の置換である、請求項１に記載の組換えヘルペスウイルス。
10. ＩＣＰ２７プロモーターがｈＣＥＡプロモーターによって置換される、請求項９に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
11. 免疫刺激因子、抗体、及びチェックポイント阻害ペプチドからなる群から選択される非ウイルスタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を更に含み、前記少なくとも１つの核酸が一般的プロモーター又は腫瘍特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の組換えヘルペスウイルス。
12. 非ウイルスタンパク質が、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１５受容体アルファサブユニットからなる群から選択される、請求項１１に記載の組換えヘルペスウイルス。
13. 腫瘍特異的プロモーターがＣＸＣＲ４プロモーターである、請求項１２に記載の組換えヘルペスウイルス。
14. 糖タンパク質Ｂの膜融合性型をコードする核酸配列を更に含む、単純ヘルペスウイルスである、請求項１に記載の組換えヘルペスウイルス。
15. 糖タンパク質Ｂが、アミノ酸８７６の後ろにある欠失によって短縮されていてもよい、請求項１４に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
16. 腫瘍溶解性ヘルペスウイルスがＨＳＶ－１である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルス。
17. 腫瘍細胞を阻害する方法であって、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスの治療有効量を提供する工程を含む方法。
18. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスと薬学的に許容される担体とを含む治療組成物。
19. がんを患う対象においてがんを治療する方法であって、請求項１８に記載の組成物の治療有効量を投与する工程を含む方法。
20. がんが高レベルのバイオマーカーを発現する、請求項１９に記載の方法。
21. がんが、頚部、食道、肺、結腸直腸、肝臓、胃、胆管癌、及び膵臓のがんからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
22. がんが白血病又はリンパ腫である、請求項１９に記載の方法。
23. がんが急性骨髄白血病（ＡＭＬ）又はＢ細胞リンパ腫である、請求項２２に記載の方法。
24. 請求項１８に記載の組成物の治療有効量を投与する工程が、静脈内（ｉ．ｖ．）又は腫瘍内投与を含む、請求項１９に記載の方法。

Images