TW202305123A - 轉錄及轉譯雙重調節之溶瘤單純疱疹病毒載體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種具有轉錄及轉譯控制之疱疹病毒載體。在各種實施例中，該疱疹病毒載體係基於經修飾疱疹病毒且分別在CEA啟動子及miRNA-124/143之控制下具有ICP27及ICP34.5，且提供長末端重複序列區之至少一個複本之缺失以增加安全性而不犧牲功效。疱疹病毒載體亦可在CXCR4啟動子之控制下併入編碼IL-12、IL-15/IL-15RA之病毒表現之細胞激素盒(virus-expressed cytokine cassette)。

Description

轉錄及轉譯雙重調節之溶瘤單純疱疹病毒載體
本發明大體上係關於表現刺激免疫系統之分子的溶瘤單純疱疹病毒(oHSV)載體。
惡性腫瘤是對人類生命及健康的嚴重威脅。儘管存在各種標準治療選項，諸如手術、放射療法、化學療法、靶向療法及免疫療法(包括免疫查核點抑制劑)，但大多數患有晚期腫瘤的患者仍具有不良預後。目前，腫瘤免疫療法在腫瘤之治療方面已取得突破性進展。靶向免疫之藥物療法(例如免疫檢查點抑制)及免疫細胞療法(例如嵌合抗原受體T細胞(CAR-T))已觸發抗腫瘤療法領域的變化。然而，在檢查點抑制劑之目前核準的適應症中，單藥物有效率僅為約30% (Jiang等人，2020，Progress and Challenges in Precise Treatment of Tumors With PD-1/L1 Blockade. Frontiers in Immunology，(3月) 11日)；而CAR-T療法主要僅靶向由B細胞腫瘤高度表現之分化簇19 (CD19)及B細胞成熟抗原(BCMA)。實體腫瘤中之臨床有效性尚未得到確認(Long等人，2018，CAR T Cell Therapy of Non-hematopoietic Malignancies: Detours on the Road to Clinical Success。Frontiers in Immunology，(12月) 9日，2740)。亦有許多惡性腫瘤，其中存在關於免疫療法之益處之明確長期證據。
標準治療後復發且難治愈之惡性腫瘤沒有臨床上有效的治療，且由於廣泛腫瘤轉移或重要器官之浸潤，因此具有此病狀的患者可能會更早死亡。因此，此等患者對於有效治療具有極高的未滿足的需求，導致迫切需要開發新穎治療方法以控制疾病之進展且延長患者之存活期。
本發明克服目前癌症療法(包括免疫療法)之缺點，且進一步提供另外意外益處。
[先前技術]部分中所討論的所有標的不一定是先前技術且不應僅因為其在[先前技術]部分中的討論而假設為先前技術。順著此等思路，除非先前技術明文地規定，否則[先前技術]部分中所討論或與此標的相關之先前技術中之問題之任何識別不應視為先前技術。相反地，[先前技術]部分中任何標的之討論應視為發明人針對特定問題之方法之一部分，其本身亦可為發明性的。
簡言之，本發明係關於用重組疱疹病毒載體治療癌症之組合物及方法。在本發明之較佳實施例中，重組載體經轉錄及轉錄後(轉譯)控制以更精確控制病毒之溶瘤潛力。
在本發明之一個實施例中，提供包含經修飾溶瘤疱疹病毒基因組之重組疱疹病毒，其中該經修飾疱疹病毒基因組包含至少一個可以操作方式連接至ICP34.5基因之第一複本之miRNA標靶序列，且該ICP34.5基因之第二複本包含不活化突變。在各種實施例中，重組病毒可包含可以操作方式連接至ICP34.5基因之第一複本之一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種miRNA標靶序列。
在其他實施例中，該等miRNA標靶序列可結合至少兩個不同miRNA (例如miR-124、miR-124*及miR-143中之一者或多者)。
又在其他實施例中，該重組疱疹病毒可進一步包含至少一種編碼非病毒蛋白質之核酸。非病毒蛋白質之實例包括免疫刺激因子、抗體及檢查點阻斷肽，其中該至少一種核酸可以操作方式連接至腫瘤特異性啟動子。在特佳實施例中，非病毒蛋白質為IL12、IL15、IL15受體α次單元中之一者或全部。
又在其他實施例中，該重組單純疱疹病毒進一步包含編碼具有增強之融合性之醣蛋白之核酸序列(與類似野生型病毒相比)。實例包括多種轉殖基因(例如來自長臂猿白血病病毒「GALV」之融合醣蛋白)、及/或增強HSV融合之突變，包括例如醣蛋白B、醣蛋白K及/或UL20中之截短或突變。
亦提供包含本文所述的重組疱疹病毒之治療性組合物、以及溶解腫瘤細胞之方法、及治療個體之癌症之方法，該方法包括對個體投與本文所述的重組疱疹病毒中之一者之步驟。
已提供此[發明內容]來以簡化形式引入某些概念，該等概念在以下[實施方式]中進一步詳細描述。除非另有明文地規定，否則此[發明內容]不欲識別所主張標的之關鍵或基本特徵，亦不欲限制所主張標的之範疇。
一或多個實施例之細節闡述於以下描述中。可將結合一個示例性實施例說明或描述的特徵與其他實施例之特徵組合。因此，本文所述的各種實施例中之任何者可經組合以提供其他實施例。若需要採用如本文所識別的各種專利、申請案及公開案之概念以提供再進一步的實施例，則可修改實施例之態樣。從描述、附圖及申請專利範圍當明瞭其他特徵、目標及優點。
以引用的方式併入至任何優先權申請案
在如與本申請案一起申請的申請資料表單(Application Data Sheet)中識別出外國或國內優先權技術方案之任何及所有申請案均以引用之方式併入本文中。
如上所述，本發明提供重組疱疹病毒載體，其經轉錄及轉錄後(轉譯)控制以更精確控制病毒之溶瘤潛力。
為了進一步理解本文中之各種實施例，提供描述各種實施例之以下部分：A. 溶瘤疱疹病毒；B. 特異性疱疹病毒構築體 – VG2025；C. 治療性組合物，及D. 投與 A.   溶瘤疱疹病毒
簡言之，單純疱疹病毒(HSV) 1及2為疱疹病毒科(Herpesviridae)的成員，其感染人類。HSV基因組含有兩個獨特區域，其命名為長獨特序列(U L)及短獨特序列(U S)區域。此等區域中之各者均側接一對反向重複序列。存在約75個已知開放閱讀框架。病毒基因組已經工程化以發展用於例如癌症療法中之溶瘤病毒。HSV之腫瘤選擇性複製可藉由HSV ICP34.5 (亦稱為γ34.5)基因之突變而賦予。HSV含有ICP34.5之兩個複本。已知使ICP34.5基因之一個或兩個複本不活化之突變體缺乏神經毒力，亦即為無毒力/非神經毒力且為溶瘤。HSV之腫瘤選擇性複製亦可藉由控制關鍵病毒基因諸如ICP27及/或ICP4之表現而賦予。
術語「溶瘤疱疹病毒」或「oHV」一般係指能夠在腫瘤細胞中複製且殺死腫瘤細胞之疱疹病毒。術語「溶瘤單純疱疹病毒」或「oHSV」係指能夠在腫瘤細胞中複製且殺死腫瘤細胞之單純疱疹病毒。
適宜溶瘤HSV可衍生自HSV-1或HSV-2，包括任何實驗室菌株或臨床分離株。在一些實施例中，oHSV可衍生自實驗室菌株HSV-1菌株17、HSV-1菌株F或HSV-2菌株HG52中之一者。在其他實施例中，其可衍生自非實驗室菌株JS-1。其他適宜HSV-1病毒包括HrrR3 (Goldstein及Weller， J. Virol.62，196-205，1988)、G2O7 (Mineta等人， Nature Medicine.1(9):938-943，1995；Kooby等人， The FASEB Journal，13(11):1325-1334，1999)；G47Δ (Todo等人， Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001；98(11):6396-6401)；HSV 1716 (Mace等人， Head & Neck ，2008；30(8):1045-1051；Harrow等人， Gene Therapy. 2004；11(22):1648-1658)；HF10 (Nakao等人， Cancer Gene Therapy. 2011；18(3):167-175)；NV1020 (Fong等人， Molecular Therapy，2009；17(2):389-394)；T-VEC (Andtbacka等人， Journal of Clinical Oncology，2015: 33(25):2780-8)；J100 (Gaston等人， PloS one，2013；8(11):e81768)；M002 (Parker等人， Proceedings of the National Academy of Sciences，2000；97(5):2208-2213)；NV1042 (Passer等人， Cancer Gene Therapy. 2013；20(1):17-24)；G2O7-IL2 (Carew等人， Molecular Therapy，2001；4(3):250-256)；rQNestin34.5 (Kambara等人， Cancer Research，2005；65(7):2832-2839)；G47Δ-mIL-18 (Fukuhara等人， Cancer Research，2005；65(23):10663-10668)；及揭示於題為「HSV Vectors with Enhanced Replication in Cancer Cells」之PCT申請案PCT/US2017/030308及題為「Compositions and Methods of Using Stat1/3 Inhibitors with Oncolytic Herpes Virus」之PCT/US2017/018539中之彼等載體，上述該等案均以其全文引用之方式併入。
溶瘤疱疹病毒之其他代表性實例描述於美國專利第7,223,593號、第7,537,924號、第7,063,835號、第7,063,851號、第7,118,755號、第8,216,564號、第8,277,818號及第8,680,068號，該等案件均以其全文引用之方式併入。
oHSV載體具有至少一個γ34.5基因，其如本文所揭示在其3’ UTR中經miRNA標靶序列修飾；該載體中不存在未經修飾之γ34.5基因。在一些實施例中，oHSV具有兩個經修飾之γ34.5基因；在其他實施例中，oHSV僅具有一個γ34.5基因，且其經修飾。在一些實施例中，經修飾之γ34.5基因在活體外建構且插入至oHSV載體中作為病毒基因的替換。當經修飾之γ34.5基因為僅一個γ34.5基因的替換時，缺失另一個γ34.5。可缺失任一天然γ34.5基因。在一個實施例中，缺失包含γ34.5基因及ICP4基因之末端重複區域。如本文所討論，經修飾γ34.5基因可包含諸如具有外源啟動子之另外變化。
oHSV可具有另外突變，其可包括禁用突變，例如缺失、取代、插入)，且可影響病毒之毒力或其複製能力。例如，可在ICP6、ICPO、ICP4、ICP27、ICP47、ICP24、ICP56中之任何一者或多者中做出突變。較佳地，此等基因中之一者中之突變(在適宜情況下，視需要在基因之兩個複本中)導致HSV表現相應功能性多肽之失能(或能力降低)。在一些實施例中，病毒基因之啟動子可經在標靶細胞中選擇性活化或可於誘導物之遞送後誘導或可於細胞事件或特定環境後誘導之啟動子取代。
在某些實施例中，ICP4或ICP27之表現藉由外源啟動子例如腫瘤特異性啟動子控制。示例性腫瘤特異性啟動子包括生存素(survivin)、CEA、CXCR4、PSA、ARR2PB或端粒酶；其他適宜腫瘤特異性啟動子可對單一腫瘤類型具有特異性且為此項技術中已知的。可存在其他元件。在一些情況下，存在增強子，諸如NFkB/oct4/sox2增強子。同樣地，5’UTR可為外源，諸如來自生長因子基因諸如FGF之5’UTR。關於示例性構築體，參見圖2。
oHSV亦可具有非HSV起源之基因及核苷酸序列。例如，編碼前藥之序列、編碼細胞激素或其他免疫刺激因子之序列、腫瘤特異性啟動子、可誘導之啟動子、增強子、與宿主細胞同源之序列等可含在oHSV基因組中。示例性序列編碼IL12、IL15、IL15受體α次單元、OX40L、PD-L1阻斷劑或PD-1阻斷劑。對於編碼產物之序列，其可以操作方式連接至表現所必需或期望的啟動子序列及其他調節序列(例如增強子、多腺苷酸化信號序列)。
可修飾病毒基因之調節區域以包含影響表現之反應元件。示例性反應元件包括用於NF-κB、Oct-3/4-SOX2、增強子、沉默子、cAMP反應元件、CAAT增強子結合序列及絕緣子之反應元件。亦可包括其他反應元件。病毒啟動子可改用不同啟動子替換。啟動子之選擇將取決於許多因素，諸如HSV載體之建議使用、患者之治療、疾病狀態或病狀、及誘導物(對於可誘導之啟動子)之應用容易度。對於癌症之治療，一般當啟動子經替換時，其將改用細胞特異性或組織特異性或腫瘤特異性啟動子替換。腫瘤特異性、細胞特異性及組織特異性啟動子為此項技術中已知的。亦可修飾其他基因元件。例如，病毒基因之5’ UTR可改用外源UTR替換。 B.   特異性疱疹病毒構築體 – VG2025
本發明之一個較佳構築體提供於圖1中。簡言之，圖1圖示性地描繪VG2025之雙股去氧核糖核酸(DNA)元件之整體結構組織。「CEA」意指癌胚抗原；「CXCR4」意指C-X-C模體趨化介素受體4；「gB」意指醣蛋白B；「ICP」意指受感染的細胞多肽；「IL」意指介白素；「R L」意指重複序列長；「RNA」意指核糖核酸；「miR」意指微型核糖核酸；「R S」意指重複序列短；「UL」意指長獨特序列；「US」意指短獨特序列。
VG2025為利用關鍵病毒基因之轉錄及轉譯雙重調節(「TTDR」 – 參見圖2)以限制病毒複製至腫瘤細胞且增強腫瘤特異性毒力而不損及安全性之重組HSV-1平臺。另外，VG2025表現由IL12、IL15及IL15受體α次單元組成之有效負載盒。該有效負載表現藉由CXCR4啟動子控制以用於腫瘤特異性免疫刺激。最後，VG2025中之病毒醣蛋白B (gB)經截短以促進病毒藉由增強之融合性傳播於腫瘤微環境中。 1.    轉錄後(轉譯)調節
在VG2025中，ICP34.5表現經轉錄後(轉譯)調節。簡言之，在野生型HSV-1中，存在ICP34.5基因之2個複本。在VG2025中，已缺失ICP34.5之一個複本。對於剩餘的ICP34.5基因，VG2025將miR124及miR143之結合域之多個複本插入於3’UTR區域中以調節其轉錄後表現。
ICP34.5藉由HSV晚期基因g-34.5編碼。其抑制宿主細胞(特別是神經元細胞)之抗病毒免疫以引起神經毒性之功能係熟知的。為了消除ICP34.5在神經元及其他正常細胞中之功能同時保留其在腫瘤細胞中之活性以進行可靠複製，而不是缺失基因或使用特異性啟動子以控制ICP34.5之表現來靶向神經膠瘤，VG2025使用微型核糖核酸作為轉錄後控制以達成ICP34.5在腫瘤細胞中之差異表現。簡言之，微型核糖核酸(亦稱為「miRNA」或「miR」)為約22個核苷酸(一種藉由miRNA基因編碼之非編碼小型RNA)，其藉由RNA聚合酶II轉錄以產生初級miRNA (pri-miRNA)。成熟單股(ss) miRNA形成miRNA相關RNA誘導之沉默複合體(miRISC)。miRISC中之miRNA可藉由結合至標靶mRNA中之3′-未轉譯區(3′-UTR)來影響基因表現。此區域由miRNA識別的序列組成。若miRNA:mRNA複合體之互補性是完全的，則mRNA藉由Ago2 (一種屬於Argonaute家族之蛋白質)降解。然而，若互補性不是完全的，則標靶mRNA之轉譯沒有完全降解，而是被抑制。
MiRNA以組織特異性方式差異性表現。實例中之一者為miR124。雖然來自不同物種之miR-124之前驅物不同，但人類、小鼠、大鼠中成熟miR-124之序列完全相同。MiR-124為神經元細胞中最豐富地表現的miRNA且在免疫細胞及器官中高度表現(Qin等人，2016，miRNA-124 in immune system and immune disorders. Frontiers in Immunology，7(OCT)，1-8)。miRNA之差異表現之另一個實例為miR143 (Lagos-Quintana等人，2002，Identification of tissue-specific MicroRNAs from mouse。Current Biology，12(9)，735-739。MiR-143組成性地表現於正常組織中但在癌細胞中顯著下調(Michael等人，2003，Reduced Accumulation of Specific MicroRNAs in Colorectal Neoplasia.Molecular Cancer Research，1(12)，882-892。miR-124之核酸序列之一個代表性實例SEQ ID NO: 8所示，及miR-143之核酸序列之一個實例SEQ ID NO: 9所示。
VG2025中之ICP34.5基因之3’ UTR區域含有與miR124及miR143完全互補之結合域之多個複本(亦稱為「miRNA標靶序列」、「miRNA結合序列」或「miRNA結合位點」)。使miR124及miR143結合至ICP34.5 mRNA之3’UTR引起mRNA之降解；因此該基因在正常細胞而不是腫瘤細胞中轉錄後下調。此設計允許ICP34.5在腫瘤細胞中差異性表現。 2.    VG2025中ICP27之表現經轉錄控制
HSV-1病毒複製依賴於病毒基因之表現級聯，其中即時早期基因產物(特別是ICP4及ICP27)控制病毒早期基因及晚期基因之後續表現，該等基因支配病毒之溶解複製循環。ICP4或ICP27之缺失導致病毒複製完全消除及病毒基因表現顯著減少，此使ICP4及ICP27成為用於溶瘤HSV中腫瘤特異性調節之極佳標靶。
雖然ICP4為調節病毒基因表現之主要轉錄因子，ICP27為調節許多病毒基因之轉錄之多功能蛋白質。ICP27在藉由轉錄、RNA處理及輸出至轉譯之mRNA生物合成之所有階段中起作用。ICP27亦已參與核蛋白品質控制、細胞週期控制、壓力信號傳導路徑之活化及凋亡之預防。
在VG2025中，ICP27之天然啟動子改用用於人類癌胚抗原(CEA)之424bp啟動子替換(Beauchemin及Arabzadeh，2013，Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs) in cancer progression and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews，32(3–4)，643–671；Hammarström 1999，The carcinoembryonic antigent (CEA) family. Structures, suggested functions and expression in normal and malignant tissues. Seminars in cancer biology 9 (2)，第67-81頁；Kodera等人，1993，Expression of carcinoembryonic antigen (CEA) and nonspecific crossreacting antigen (NCA) in gastrointestinal cancer; the correction with degress of differentiation. In Br. J Cancer 68 (1)，第130-136頁)。CEA屬於稱為癌胚抗原細胞黏著分子(CEACAM)的12個基因之子組作為22個基因家族之一部分(Beauchemin及Arabzadeh，2013)。CEA在細胞過程(包括抑制分化程式、抑制失巢凋亡(anoikis)及凋亡、及破壞細胞極化及組織架構)中扮演主要角色(Beauchemin及Arabzadeh，2013)。 3.    VG2025之有效負載表現為腫瘤-增強
VG2025共同表現IL12、IL15及IL15受體α次單元以進一步刺激免疫調節反應。IL12之表現促進抗原將T細胞暴露於發炎及抗腫瘤T H1表現型之極化，而IL-15活化NK細胞以進一步增加抗原呈現細胞之腫瘤殺死及活化。除了IL15表現之外，VG2025編碼IL15Rα以進一步增強免疫刺激。例如，人類IL12可包含SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列；人類IL15可包含SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列；且該人類IL15受體α次單元可包含SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列。
IL-12、IL-15及IL-15Rα之轉錄藉由單一啟動子(CXCR4)驅動且將多肽與2A自裂解肽鍵聯(Z. Liu等人，2017，Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in polycistronic vector. Scientific Reports，7(2)，1-9)，該2A自裂解肽透過轉譯期間核糖體跳躍之機制產生3種個別蛋白質。例如，該2A蛋白質可包含SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列。雖然有效負載打算瘤內表現，但假如病毒「泄漏」至瘤外區域或當病毒全身性地遞送時，正常組織中之非所欲表現可發生。為了減輕腫瘤床外部的可能IL12/15表現風險，藉由CXC趨化介素受體4 (CXCR4)之單一啟動子驅動VG2025中有效負載之表現盒(Moriuchi等人，1997，Cloning and analysis of the promoter region of CXCR4, a coreceptor for HIV-1 entry. Journal of Immunology (Baltimore，Md. : 1950)，159(9)，4322-429；Caruz等人，1998，Genomic organization and promoter characterization of human CXCR4 gene. FEBS Letters，426(2)，271-278。CXCR4為七跨膜G蛋白偶聯受體，其最初從人類血液單核細胞分離，用作HIV病毒融合及T細胞進入之輔因子(Moriuchi等人，1997)。例如，CXCR4啟動子之胺基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
所選表現盒/載體之代表性實例亦描述於PCT公開案WO 2018/026872中，該案以其全文引用之方式併入。 4.    經截短之醣蛋白B (gB)
HSV-1膜融合為感染之關鍵步驟。其依賴於四種必需病毒醣蛋白(gB、gD、gH及gL)，其藉由將病毒包膜(viral envelope)與宿主細胞膜合併來介導至宿主細胞中之進入。核心融合蛋白為醣蛋白B (gB)，一種藉由HSV-1之UL27基因編碼之904個殘基醣基化跨膜蛋白。gB之胞質域內的多種類型之突變已產生超融合表現型，從而增加細胞-細胞融合(Chowdary及Heldwein，2010，Synctial Phenotype of C-Terminally Truncated Herpes Simplex Virus Type 1 gB is Associated with Diminished Membrane Interactions. Journal of Virology，84(10)，4923-4935。在一個實施例中，gB可藉由從全長蛋白質截短C端胺基酸877至904來修飾。例如，經截短之醣蛋白B之胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。 5.    概述
VG2025為在CEA啟動子及miRNA-124/143之控制下分別具有ICP27及ICP34.5之溶瘤病毒產物。hVG2025亦併入在CXCR4啟動子之控制下編碼IL-12、IL-15/IL-15RA之病毒表現細胞激素盒。VG2025中之表現控制機制設計成增加安全性而不犧牲功效。針對野生型-HSV-1菌株17+之特定修飾闡述於下表1中。
表1：     來自野生型HSV-1菌株17+之VG2025中之基因修飾
修飾 修飾類型 修飾位置 功能
含有ICP0及ICP34.5基因之長末端重複序列(TR L)之缺失 缺失 長末端重複序列(TR L) 野生型HSV-1含有TR L之兩個複本。移除一個複本可減弱毒力。
改用(CEA)啟動子替換天然ICP27啟動子 替換 ICP27基因啟動子 促進CEA陽性腫瘤細胞中之病毒複製
miR143及miR124之結合位點插入於ICP34.5 3’-UTR中 插入 ICP34.5基因3’-UTR 抑制具有miR143及/或miR124之高表現之細胞中ICP34.5之表現
缺失醣蛋白B (gB)編碼區的3’端中的84 bp 缺失 (gB)編碼區的3’端 使HSV-1 gB蛋白在其c端處經28個胺基酸截短以達成增強之融合性
於CXCR4啟動子下插入IL-12、IL-15及IL-15Rα之表現盒 插入 在UL3基因與UL4基因之間 使病毒在CXCR4陽性腫瘤細胞中表現IL-12、IL-15及IL-15Rα
CEA = 癌胚抗原；CXCR4 = C-X-C模體趨化介素受體4；gB = 醣蛋白B；HSV-1 = 單純疱疹病毒-1；ICP27 = 受感染的細胞多肽27；ICP34.5 = 受感染的細胞多肽34.5；IL = 介白素；miR = 微型核糖核酸；Rα = 受體α；TR L= 長末端重複序列；UL = 長獨特序列
VG2025是一種條件性複製溶瘤性HSV-1病毒。VG2025之基因組缺失含有ICP34.5、ICP0及LAT之一個複本的HSV-1之長末端重複(TR L)序列。ICP34.5之剩餘複本在其3’UTR區域中具有含有miRNA miR-124及miR-143之結合域之多個複本之插入，該miRNA miR-124及miR-143在神經元及正常組織中高度表現，但在腫瘤細胞中不是。產物藉由改用來自人類癌胚抗原(CEA)基因之腫瘤特異性啟動子替換編碼ICP27 (受感染的細胞多肽27)之基本病毒基因UL54之天然病毒啟動子進一步修飾。VG2025亦表現由IL-12、IL-15及IL-15Rα組成之強效免疫調節有效負載，該免疫調節有效負載藉由腫瘤選擇性C-X-C模體趨化介素受體4 (CXCR4)啟動子控制。最後，VG2025具有醣蛋白B (gB)截短以增強融合活性，以促進病毒傳播於腫瘤微環境內。mVG2025及hVG2025極其相似，除了hVG2025具有IL-12之人類形式與mVG2025中之鼠類形式。
如下文更詳細地描述，VG2025之臨床前藥理學研究已顯示在帶有BxPC3胰臟癌及A549 NSCLC腫瘤之小鼠模型中之顯著抗癌活性。 C.   治療性組合物
提供可用於預防、治療或改善疾病(諸如例如癌症)之效應之治療性組合物。更特別地，提供包含至少一種如本文所述的溶瘤病毒之治療性組合物。
在某些實施例中，該等組合物將進一步包含醫藥上可接受之載劑。片語「醫藥上可接受之載劑」意指包括不干擾溶瘤病毒之生物活性之有效性且對其所投與的個體無毒之任何載劑、稀釋劑或賦形劑(一般參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott Williams & Wilkins；第21版 (2005年5月1日)及美國藥典(The United States Pharmacopeia)：The National Formulary (USP 40 – NF 35及增刊)。
在如本文所述的溶瘤病毒之情況下，適宜醫藥載劑之非限制性實例包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型之潤濕劑、滅菌溶液等。另外醫藥上可接受之載劑包括凝膠、生物可吸收之基質材料、含有溶瘤病毒之植入元件、或任何其他適宜媒劑、遞送或分配手段或材料。此類載劑可藉由習知方法來調配且可以有效劑量投與至個體。另外醫藥上可接受之賦形劑包括(但不限於)水、鹽水、聚乙二醇、透明質酸及乙醇。醫藥上可接受之鹽亦可包括在其中，例如無機酸鹽(諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及類似者)及有機酸之鹽(諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙酸鹽、苯甲酸鹽及類似者)。可用於將oHSV遞送至癌細胞之此類醫藥上可接受之(醫藥級)載劑、稀釋劑及賦形劑將較佳不會在接受組合物(且將較佳在無過度毒性下投與)的個體(individual/subject)中誘導免疫反應。
本文所提供的組合物可以各種濃度提供。例如，可提供在約10 6至約10 9pfu的範圍內之溶瘤病毒劑量。在其他實施例中，該劑量可在約10 6至約10 8pfu/ml的範圍內，其中在治療的每2至3週將多達4 ml注射至具有大病灶(例如＞5 cm)的患者中及將更少量(例如多達0.1 ml)注射於具有小病灶(例如＜ 0.5 cm)的患者中。在本發明之其他實施例中，該病毒可以大於1x10 9pfu/kg之範圍提供以進行人類中之靜脈內遞送(例如2x10 9pfu/kg、3x10 9pfu/kg、4x10 9pfu/kg、或5x10 9pfu/kg或至多1x10 10pfu/kg)。對於瘤內注射，較佳劑量可在約10 4至約10 8pfu/ml的範圍內(其中注射體積為1至5 mls)。
在本發明之某些實施例中，可使用低於標準之劑量。因此，在某些實施例中，可將小於約10 6pfu/ml (其中每2至3週將至多4 ml注射至患者中)投與至患者。
可將該等組合物儲存於有利於穩定存放期且包括室溫(約20℃)、4℃、-20℃、-80℃之溫度下及液體N 2中。因為意欲在體內使用的組合物一般不具有防腐劑，故儲存將一般在更冷溫度下。組合物可經乾燥儲存(例如凍乾)或呈液體形式。 D.   投與
除了本文所述的組合物之外，提供使用此類組合物以治療或改善癌症之各種方法，包括對個體投與有效劑量或量之如本文所述的oHSV之步驟。
術語「有效劑量」及「有效量」係指足以實現靶向癌症之治療之溶瘤病毒之量，例如有效減少靶向腫瘤尺寸或負荷或以其他方式阻礙靶向腫瘤細胞之生長速率之量。更特別地，此等術語係指在必要劑量及治療期下有效實現所需結果之溶瘤病毒之量。例如，在治療癌症之情況下，本文所述的組合物之有效量為誘導緩解，減少腫瘤負荷，及/或防止腫瘤傳播或癌症之生長之量。有效量可根據因素諸如個體的疾病狀態、年齡、性別及體重、以及醫藥調配物、投與途徑及類似者而變化，但仍可由熟習此項技術者例行決定。
將治療性組合物投與至診斷患有癌症或疑似患有癌症的個體。個體可為人類或非人類動物。
該等組合物用於治療癌症。術語「治療(treat)」或「治療(treating)」或「治療(treatment)」如本文所用意指用於達成有益或所需結果(包括臨床結果)之方法。有益或所需臨床結果可包括(但不限於)緩解或改善一或多種症狀或病狀、減輕疾病程度、穩定(亦即不惡化)疾病狀態、防止疾病傳播、延遲或減慢疾病進展、改善或減輕疾病狀態、減輕疾病復發、及緩解(無論是部分或全部)，無論是可偵測或不可偵測。術語「治療(treating)」及「治療(treatment)」亦可意指與未接受治療情況下的預期存活期相比延長存活期。
癌症之代表性形式包括癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤及肉瘤。白血病之代表性形式包括急性骨髓性白血病(AML)及淋巴瘤之代表性形式包括B細胞淋巴瘤。其他實例包括(但不限於)膽管癌、腦癌(例如神經膠質母細胞瘤)、乳癌、子宮頸癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、CNS (例如聽神經瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、神經膠質母細胞瘤、血管母細胞瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、松果腺瘤及視網膜母細胞瘤)、子宮內膜內襯(endometrial lining)癌、造血細胞癌(例如白血病及淋巴瘤)、腎臟癌、喉頭癌、肺癌、肝癌、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌(例如黑色素瘤及鱗狀細胞癌)、GI (例如食道癌、胃癌及結腸癌)及甲狀腺癌。癌症可包括實體腫瘤(例如肉瘤，諸如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤及骨原肉瘤)、瀰漫性(例如白血病)、或此等之一些組合(例如具有實體腫瘤及播散性或瀰漫性癌細胞之轉移性癌症)。
在本發明之某些實施例中，該癌症可係習知療法(例如習知化學療法及/或輻射療法)抵抗或難治的。亦可治療良性腫瘤及非所欲細胞增殖之其他病狀。
待治療的特佳癌症包括彼等具有高水平之CEA表現之癌症。代表性實例包括肺部腫瘤、乳房及前列腺腫瘤、造血細胞腫瘤(例如白血病及淋巴瘤)、神經膠母細胞瘤、胃腸道(及相關器官)例如食道、膽管癌、肛門、胃、腸、胰臟、結腸及肝之腫瘤、及所有表面可注射腫瘤(例如黑色素瘤)。
本文所述的重組單疱疹病毒可藉由例如口腔、局部、非經腸、全身、靜脈內、肌肉內、眼內、鞘內、瘤內、皮下或經皮之途徑給與。在某些實施例中，溶瘤病毒可藉由套管、藉由導管或藉由直接注射來遞送。投與部位可直接進入腫瘤中、鄰近腫瘤，或在遠離腫瘤之部位。投與途徑經常將取決於所靶向的癌症之類型。
溶瘤病毒之最佳或適宜劑量方案很容易由主治醫生依據患者資料、患者觀測結果及各種臨床因素，包括例如個體的體型大小、體表面積、年齡、性別、及所投與的特定溶瘤病毒、投與之時間及路徑、所治療的癌症之類型、患者之一般健康、及患者所接受的其他藥物療法，在此項技術技藝內決定。根據某些實施例，使用本文所述的溶瘤病毒治療個體可與療法之另外類型諸如投與不同溶瘤病毒、放射療法、投與檢查點抑制劑、使用例如化療劑諸如依託泊苷(etoposide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、阿黴素(adriamycin)、長春新鹼(vincristine)、多西環素(doxycycline)等之化療法組合。
本文所述的重組單純疱疹病毒可調配為藥劑及醫藥組合物以供臨床使用且可與醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑組合。該調配物至少部分地取決於投與途徑。適宜調配物可包含含在無菌介質中之病毒及抑制劑。該等調配物可為流體、凝膠、糊劑或固體形式。調配物提供給個體或醫療專業人員。
較佳投與治療有效量。此係指足以顯示對個體之益處之量。所投與的實際量及投與之時程將至少部分地取決於癌症之性質、個體之狀況、遞送之部位及其他因素。
又在本發明之其他實施例中，溶瘤病毒可藉藉由各種方法來投與，例如瘤內、靜脈內或在手術切除腫瘤之後。 實例
概述：所有病毒誘變法可在大腸桿菌( Escherichia coli)中使用在選殖至細菌人工染色體(BAC)中之病毒基因組上實施的標準 λ Red介導之重組技術進行(大體上參見：Tischer BK、Smith GA、Osterrieder N. Methods Mol Biol. 2010；634:421-30。doi: 10.1007/978-1-60761-652-8_30. PMID：20677001；Tischer BK、von Einem J、Kaufer B及Osterrieder N.，BioTechniques 40:191-197，2006年2月(包括補充材料，doi: 10.2144/000112096；及Tischer BK、Smith, GA及Osterrieder N. 第30章，Jeff Braman (編)， In VitroMutagenesis Protocols：第三版，Methods in Molecular Biology，第634卷，doi: 10.1007/978-1-60761-652-8_30，Springer Science+Business Media，LLC 2010)。
BAC重組工程(recombineering)需要病毒基因組中存在外源BAC DNA以促進大腸杆菌( E. coli)中之誘變。BAC序列最常插入於病毒基因(諸如HSV基因US1/US2、UL3/UL4及/或UL50/UL51)之間、或插入於胸苷激酶(TK)基因中，其可破壞天然TK之表現。TK缺陷病毒載體可包括在插入至病毒基因組之非編碼區中之組成型啟動子之控制下之天然病毒胸苷激酶(TK)基因之複本之表現盒。或者，TK功能可藉由經由同源重組移除外源BAC序列以重建天然TK基因序列來復原。功能性TK基因之存在藉由讓病毒對鳥苷類似物諸如更昔洛韋及阿昔洛韋(acyclovir)之常見治療敏感來增強病毒安全性。
縮寫表
Akt 蛋白激酶B
Beclin1 人類抑癌基因(beclin) 1基因
BCMA B細胞成熟抗原
BLA 生物劑執照申請
CAR-T 嵌合抗原受體T細胞
CD 分化簇
CR 完全反應
CXCR4 C-X-C模體趨化介素受體4
DRG 背根神經節
eIF2a 真核轉譯起始因子2A
gB 醣蛋白B
HSV-1 單純疱疹病毒-1
ICP 受感染的細胞蛋白質
IE 感染性心內膜炎
IL 介白素
IND 研究性新藥物
IRF 干擾素調節因子
IT 瘤內
LAT 潛伏期相關轉錄本
miRNA 微型核糖核酸
NfκB 核因子κB
NSCLC 非小細胞肺癌
OS 總存活期
OV 致癌病毒
PD 進行性疾病
PFS 無疾病進展存活期
PHS 公共健康服務
PR 部分反應
RSC 兔皮膚細胞
Rα 受體α
R L 長重複序列
RNA 核糖核酸
SD 穩定疾病
TBK1 TANK-結合激酶
TME 腫瘤微環境
TR L 長末端重複序列
TTDR 轉錄及轉譯雙重調節
UL 長獨特序列
US 短獨特序列
UTR 未轉譯區
實例1 測試VG2025之融合性
目標：VG2025併入超融合突變，藉此缺失介於aa876與gB中之終止密碼子之間的所有胺基酸。本研究係證實該突變之超融合效應。
程序：VG2025用於在MOfI=0.1下感染A549腫瘤細胞及MRC-5非腫瘤細胞且在感染後於成像之前培養48小時。
結果：如圖3中所顯示，在受VG2025感染的A549細胞(腫瘤細胞)中觀測到多核融合斑但在MRC-5細胞(非腫瘤細胞)中沒有觀測到。
結論：VG2025為腫瘤選擇性且高度融合。 實例2 CEA表現水平與ICP27表現及病毒複製效率之相關性
目標 ：本研究係評估不同腫瘤細胞系中之CEA表現水平與hVG2025之ICP27表現水平及病毒複製效率之間的相關性。
程序：如供應商所建議將以下細胞系(表2)接種至12孔板中且在適當細胞培養基中培養過夜： 表2：     篩選細胞系之CEA-ICP27相關性
編號 細胞 來源 CEA (ng/ml)
1 A549 人類NSCLC 107.9
2 BxPC3 人類胰臟癌 180.5
3 U87 人類神經膠質母細胞瘤 0
4 HCC2935 人類肺癌 207.1
5 LS174T 人類結腸癌 154.2
6 N87 人類胃癌 109.8
7 SW1116 結腸直腸腺癌 18
8 SW48 人類結腸直腸腺癌 32.3
9 LOVO 人類結腸直腸腺癌 60.6
10 COLO 320DM 人類結腸直腸腺癌 0
11 SNU-1 人類胃癌 0
將VG2025稀釋且添加至在MOI 0.1或偽處理感染之細胞培養物中。在2小時培養後，更換培養基。在感染後6小時及18小時收集細胞以進行RNA及DNA提取，接著進行RT-qPCR以偵測CEA及ICP27 mRNAs之表現。一些樣本在感染後48小時收集且經處理以進行PCR來測定ICP27之DNA複本數。使用GAPDH以使各樣本標準化。未感染的細胞之其他樣本用於使用ELISA套組(Abcam，AB99992)測定細胞培養物之上清液中之CEA蛋白質脫落。
繪製CEA及ICP27 mRNA之標準化Ct (ΔCt)值。藉由利用EXCEL之回歸分析來計算R及P值。
結果：不同人類腫瘤細胞表現不同水平之CEA。此實驗之結果顯示於圖4A及4B中。簡言之，CEA及ICP27之mRNA水平藉由RT-qPCR表示為ΔCt值且進行繪製。回歸分析顯示ICP27 mRNA之ΔCt值與CEA mRNA之ΔCt值正相關，在p= 0.0082下，R=0.747。藉由ELISA，具有正CEA之受hVG2025感染的細胞中之病毒複本數測定為ΔCt值。亦顯示CEA蛋白脫落與病毒複本數之間的相關性。回歸分析顯示在p=0.0126下R=0.820。
結論：某些類型之腫瘤(包括胰臟癌、肺癌、胃腸癌)具有高水平之CEA表現。在一些腫瘤細胞中，來自hVG2025之ICP27之轉錄水平顯示與CEA之轉錄活性中等但顯著正相關。
藉由細胞培養物中之脫落測定的腫瘤細胞之CEA蛋白表現與感染hVG2025後的病毒複本數顯著相關。 實例3 ICP34.5表現之miR124/143轉錄控制，藉由評估經miR124/143轉導之HEK-293細胞中之ICP34.5表現證實
目標：本研究之目標係測試存在於hVG2025中之miRNA結合元件在控制ICP34.5之表現上之功能。
本揭示內容之病毒設計為具有存在於ICP34.5基因之3’ UTR區域處之miR結合元件/序列。在hVG2025中，用於miR調節之靶向域為miR124及miR143。前者在所有神經元細胞中高度表現及後者在大多數腫瘤細胞中表現不足。此將允許使用具有完整ICP34.5基因之病毒但ICP34.5之表現經由後轉錄調節進行差別控制。雖然ICP34.5之表現將在不表現miR之細胞及組織(腫瘤細胞)中不受影響，但ICP34.5之表現將在表現高水平之miRs之正常組織(例如神經元細胞)中受阻。
在本研究中，吾人使用293FT細胞、或經miR124及miR143模擬物或具有擾碼序列之miR前驅物轉染之相同細胞。然後用hVG2025重複感染該等細胞。此將允許在miR前驅物存在或不存在下直接測試及比較靶向基因之表現。此外，由於hVG2025中ICP34.5編碼區域下游的結合域之序列與miRs完全匹配，因此彼等域藉由miR之結合將導致mRNA (在該情況下為ICP34.5)之降解。因此，吾人可使用RT-qPCR以測定ICP34.5 mRNA之水平來測試hVG2025中miR調節之ICP34.5表現。
程序：使用Lipofectamine™ RNAiMAX轉染試劑，用miR124及miR143轉染293FT細胞培養物，接著用hVG2025重複感染。在病毒感染後24小時進行RT-qPCR以定量ICP27及ICP34.5表現及複本數。
實驗設計：用miR124/miR143前驅物一式三份轉染293FT細胞。對照細胞為經轉染之擾碼miR前驅物(Thermo Fisher AM17110)或經轉染之偽處理。
在轉染後二十四小時，用hVG2025在MOI=1下感染細胞。在37℃ 5% CO2下培養細胞6小時。
在病毒感染後6小時收穫細胞以進行進一步測試。純化RNA，且進行RT-qPCR以測定ICP27、ICP34.5、miR124、miR143及肌動蛋白之水平。
結果：此實驗之結果顯示於圖5中。雖然在已用miR 124/143、對照/擾碼miR、或非轉染細胞轉染之293FT細胞中ICP27之表現水平相當，但在已用miR124/143轉染之細胞中ICP34.5之水平顯著更低 (p值 = 0.0002)。
為了驗證經感染之細胞中miR124及miR143之存在，亦於經轉染之細胞(感染及未感染)上進行RT-qPCR。在經轉染之細胞中偵測到高水平之miR124及miR143。此外，亦觀測到病毒感染不影響或降低此等細胞中miR之水平： 表3:   感染期間之miR124/143水平
         CT 平均值
病毒 條件 重複 肌動蛋白 (CT 平均值 ) miR124 (CT 平均值 ) miR143 (CT 平均值 )
hVG2025, MOI = 1 miR124/143 1 17.633 14.193 15.785
2 17.763 14.242 16.223
無病毒 miR124/143 1 17.587 14.168 15.436
2 18.176 14.492 15.658
陰性 1 17.751 34.088 36.681
2 17.869 34.833 36.099
結論：結果顯示在miR124/143存在下ICP34.5之表現顯著降低(p = 0.0002)。另一方面，未受miRs調節之ICP27之表現水平在所有群組中均相同，表明ICP34.5之下調為miR124/143特異性。另外，病毒感染並未改變經處理之細胞中miR之水平。 實例4 各種腫瘤細胞系中之劑量依賴性、載體誘導之2種腫瘤細胞毒性
目標：本研究測試hVG2025之抗腫瘤活性，基於藉由活體外培養之11種人類腫瘤細胞系及6種小鼠腫瘤細胞系測定為細胞活力及半數最大抑制濃度(IC 50)。
程序：將以下細胞系以5E3個細胞/孔接種至孔板中且在如供應商所建議的各種細胞特異性適宜培養基中培養過夜：
A549 (人類NSCLC)、BxPC3 (人類胰臟癌)、Panc01 (人類胰臟癌)、Capan-1 (人類胰臟癌)、SW620 (人類結腸癌)、LnCAP及PC-3 (人類前列腺腫瘤細胞)、U2OS (人類脛骨肉瘤)、HepG2 (人類肝細胞癌)、Kato III (人類胃癌)、SH-SY5Y (人類神經母細胞瘤)、Panc02 (小鼠胰臟癌)、Cloudman S91 (小鼠黑色素瘤)、MB49-Luc (小鼠膀胱癌)、CT26 (小鼠結腸癌)、A20 (小鼠內質網肉瘤)、4T1 (小鼠乳癌)。
將hVG2025以在MOI 5、1、0.2、0.04及0 (MOI 0為僅作為媒劑對照的培養基)的範圍內之MOI稀釋且添加至細胞培養物中培養3天。在標準MTT檢定下，藉由MTT方法來檢定細胞活力
將各細胞系之細胞活力相對MOI繪製。藉由GraphPad Prism計算容許細胞系之IC 50。抗性細胞系之IC 50標記為無法判定(N.D.)
結果：此實驗之結果顯示hVG2025之抗腫瘤活性，基於藉由活體外培養之11種人類腫瘤細胞系(圖6A)及6種小鼠腫瘤細胞系(圖6B)測定為細胞活力。更具體言之，HepG2、A549、LnCap及BxPC3對hVG2025最敏感，其中IC 50低於MOI 1。發現Capan-1、PC3及SW620對hVG2025具有抗性。發現其他人類腫瘤細胞對hVG2025具有中等容許度。發現此研究中測試的所有小鼠腫瘤細胞對hVG2025具有抗性。
結論：在MOI ＜ 1下之hVG2025對代表胰臟(BxPC3)、肺(A549)、前列腺(LnCaP)及肝細胞癌(HepG2)之幾種細胞系具有細胞毒性。小鼠腫瘤細胞系不易受hVG2025誘導之細胞毒性影響。 實例5 與ICP34.5- oHSV-1相比，VG2025在腫瘤細胞中之病毒複製效率
目標：此研究係比較hVG2025病毒及ICP34.5(-) oHSV-1菌株(VG160)在A549及BxPC3細胞中之複製效率。
研究設計 ：用6孔板製備A549及BxPC3。在過夜培養之後，hVG2025及ICP34.5-oHSV-1在MOI=0.5下感染該等細胞。在感染後兩小時，培養基用無病毒新鮮培養基更換。在感染後6小時、24小時及48小時，將細胞及培養基收集在一起且儲存在-80℃中，接著於Vero細胞上進行斑塊檢定。每次收集兩個樣本/病毒/細胞系。
測量：基於SOP製備所有樣本以進行斑塊測試。
結果：生長於A549及BxPC3中之hVG2025之效價顯示於表4中。兩種腫瘤細胞系中兩種病毒之生長曲線顯示於圖7A及7B中。 表4：2種細胞系中48小時感染之病毒效價
時間點 效價(PFU/ml)
A549 BXPC3
ICP34.5(-) hVG2025 ICP34.5(-) hVG2025
0 478 890 1 1
6 2020 4960 1 1
24 20200 1790000 54000 207000
48 220000 2690000 310000 2600000
結論：該等結果顯示，在A549及BXPC3細胞(二者在感染後48小時為CEA高表現子)中，與VG160 (ICP34.5-)相比，hVG2025之複製高約10倍。此乃因與此檢定相關的兩種病毒之主要差異為a)病毒必需基因ICP27由hVG2025之CEA啟動子控制但相同基因由其VG160之天然病毒啟動子控制；b) ICP34.5基因藉由hVG2025中之miR124及miR143調節但在VG160中缺失。因此，藉由hVG2025在兩種腫瘤細胞系中顯示的複製優點可歸屬於增加之ICP27轉錄及功能性ICP34.5。 實例6 HVG2025病毒感染腫瘤細胞之人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra表現人IL-12p70及人IL-15/IL-15Ra表現
目標：測定hVG2025病毒感染腫瘤細胞系之人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra有效負載分泌。
程序：在37℃下，將A549 (NSCLC)及MRC-5 (纖維母細胞)細胞系接種於12孔板中過夜且於隨後用hVG2025病毒在MOI = 1下感染24小時。在相同條件下感染VG1905主鏈病毒(無人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra)的細胞系用作陰性對照。病毒感染後二十四小時，從細胞收穫上清液且藉由ELISA檢定定量人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra分泌。
結果：在hVG2025病毒感染的24小時後，在A549及MRC-5細胞中觀測到有效負載表現。然而，A549細胞產生與MRC-5細胞相比顯著更高的人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra有效負載(分別為3.6倍的人類IL-12p70及14.6倍的人類IL-15/IL-15Ra。(圖8A及8B及表5)。 表 5 ：ELISA檢定之原始數據
75. 76. A549 77. MRC5
78. 平均值 79. SD 80.平均值 81.SD
82.L-12p70 83.VG1905 84.1.2 85.2.39 86.0 87.0
88.hVG2025 89.5085.8 90.1690.17 91.1395.3 92.35.83
93.L-15/ IL15Ra 94.VG1905 95.14.4 96.2.95 97.16.7 98.2.11
99.hVG2025 100.655.2 101.294.88 102.44.9 103.3.35
結論：與受感染的MRC5細胞相比，感染hVG2025病毒的A549細胞產生更多人類IL-12p70及IL-15/IL-15Ra有效負載。 實例7 hVG2025有效負載之生物功能：人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra
目標：用產生自hVG2025病毒感染細胞的人類IL-15/IL-15Ra有效負載測試人類IL-12p70之生物功能。
程序：人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra有效負載表現hVG2025或VG1905主鏈(無人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra)病毒用於在1之MOI下感染Vero細胞。在感染後48小時收集受感染的Vero細胞培養物之上清液且在用於以下程序之前藉由ELISA檢定測定有效負載表現。在37℃培養箱下用0.25 mg/mL絲裂原植物血球凝集素(PHA)預刺激人類PBMC 24小時。第二天，將經PHA刺激之人類淋巴母細胞與不同體積之病毒感染Vero上清液共培養48小時。收穫來自共培養之上清液且藉由人類IFN-g ELISA檢定定量分泌自免疫細胞之人類IFN-g。
結果：在檢查有效負載生物活性之前，藉由ELISA測定病毒感染Vero上清液中之有效負載表現。僅收穫自hVG2025感染細胞之上清液產生人類IL-12及IL-15/IL-15Ra但不在VG1905感染或無病毒感染上清液中產生(圖9A及9B及表6)。
接下來，吾人測試基於PBMC之人類IFN-g分泌之有效負載生物活性。結果顯示，將從經PHA刺激之淋巴母細胞產生的劑量依賴性人類IFN-g與收穫自hVG2025病毒感染細胞之上清液共培養而從暴露於來自感染hVG2025、VG1905或無病毒之細胞之上清液之經PHA刺激之淋巴母細胞未偵測到IFN-g分泌(圖10及表7)。 表6
   人類 IL-12p70 人類 IL-15/IL-15Ra
AVG SD AVG SD
hVG2025 2031.8 128.3 1242.0 149.9
VG1905 0 0 0.0 0.0
無病毒感染 0 0 8.5 12.1
表6：     經PHA刺激之淋巴母細胞之人類IFN-g產生之原始數據
      上清液收穫自
      hVG2025 VG1905-TK #1 無感染
      AVG SD AVG SD AVG SD
用於與經PHA刺激之淋巴母細胞共培養之上清液之體積 100 ml 10224 1832.8 0 0 0 0
25 ml 6748 676.0 0 0 0 0
6.25 ml 3477.5 597.5 0 0 0 0
結論：人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra有效負載由hVG2025病毒感染Vero細胞分泌。含有以上分泌自hVG2025之有效負載感染細胞之上清液刺激人類PBMC以產生IFN-g。 實例8 A549及MRC5細胞中hVG2025之TCID50
目標：藉由TCID50檢定測定A549及MRC5細胞中hVG2025之病毒效價，及尋找腫瘤及正常細胞系中hVG2025之感染及複製差異。
研究設計：病毒的6次重複稀釋如下：將來自-80℃儲存之10 μl病毒hVG2025添加於990 μl DMEM培養基中以產生100倍稀釋的第一管，於藉由添加100 μl病毒於900 μl DMEM培養基中之含在10倍連續稀釋中之7管後，總共48管病毒稀釋製劑。由兩人重複病毒之相同稀釋。在96孔板中添加100 ul/孔之經稀釋病毒以感染A549或MRC5細胞，每種細胞系感染總共96個孔。每個稀釋組感染12個重複孔。在37℃ 5% CO 2下接種3至5天後，在顯微鏡下可視化及計算TCID 50。
測量：藉由觀測用病毒稀釋液培養的孔，在倒裝顯微鏡(inverted microscope)下可視化細胞病變效應(CPE)。基於Reed法及Muench法來計算TCID50。
結果：此實驗之結果提供於下表8中： 表7：     A549及MRC5上VG2025之TCID50
細胞系 TCID50 MRC5 與 A549 之比較
A549 7.00E-08 N/A
MRC5 5.35E-06 MRC5高出76.43倍
結論：非腫瘤MRC5細胞中hVG2025之TCID50遠高於A549細胞中76.43倍的差異，指示VG2025在A549腫瘤細胞中之複製效率顯著較高。 實例9 用hVG2025治療A549負荷BALB/c裸小鼠
目標：此研究係測定無胸腺小鼠中A549肺癌異種移植模型中瘤內遞送之hVG2025病毒之劑量依賴性抗腫瘤功效及存活效益。
研究設計：將29隻SPF級公Balb/c裸小鼠皮下注射5x10^6 A549個細胞/小鼠且隨機分成6個組，每個病毒處理組5隻小鼠(媒劑組中4隻小鼠)。組1為媒劑(PBS)對照。組2至5為測試組，以10^2、10^3、10^4、10^5、10^6 PFU/小鼠之劑量分別經瘤內注射投與單次劑量之hVG2025。所有動物均根據標準協定，藉由標記於不同身體部位上、圈養、餵食來進行適宜識別。
測量：所有小鼠在投與後每天至少兩次觀測臨床發現。在基線時測定體重及腫瘤尺寸且然後每週2至3次。數據表示為平均值 ± SEM。
若腫瘤生長至1500 mm 3(藉由測徑規測定)或顯示5級臨床症狀，則處死動物。
結果：與媒劑對照組相比，在10^3、10^4、10^5、10^6 PFU/小鼠之hVG2025之瘤內處理後觀測到腫瘤生長抑制(參見圖11A至11G)。在一些媒劑對照動物中，在植入後測量腫瘤尺寸直至第40天且由於自發腫瘤消退而終止。小鼠存活至第54天且如所計劃預定處死。未於腫瘤尺寸上進行統計分析，因為樣本尺寸過於小而無法確定其是否為正常分佈。相反地，利用Gehan-Breslow-Wilcoxon檢定分析各組中腫瘤抑制之持續時間。表8提供各組中腫瘤消退之總結，及圖12圖示性地描繪hVG2025處理後體重之變化。 表8：     各組中腫瘤消退小鼠的概述
組 具有完全腫瘤退化之小鼠的數量 整體反應及腫瘤控制
媒劑 0 / 4 0/4
10^2 PFU/小鼠 0 / 5 1/5
10^3 PFU/小鼠 0 / 5 5/5
10^4 PFU/小鼠 0 / 5 4/5
10^5 PFU/小鼠 1 / 5 5/5
10^6 PFU/小鼠 2 / 5 5/5
結論：在以劑量依賴性方式異種移植人類肺癌的小鼠模型中顯示hVG2025之抗腫瘤活性。高於10^3 PFU/小鼠之病毒劑量似乎足以顯示抑制效應。但較高劑量使得更多小鼠具有完全腫瘤消退。在任何組的小鼠中均未看到毒性症狀。 實例10 用hVG2025處理BxPC3負荷BALB/c裸小鼠
目標：此研究係測定無胸腺小鼠之BxPC3胰臟癌異種移植模型中可瘤內注射之hVG2025病毒之抗腫瘤功效及存活效益。
研究設計：30隻SPF級母Balb/c裸小鼠經皮下注射5x10^6 BxPC3個細胞/小鼠且隨機分為6個組，每組5隻小鼠。組1為經瘤內注射PBS之媒劑對照。組2至5為測試組，以10^2、10^3、10^4、10^5、10^6 PFU/小鼠分別經瘤內注射投與單次劑量之hVG2025。所有動物均根據標準協定，藉由標記於不同身體部位上、圈養、餵食來進行適宜識別。
測量：所有小鼠在投與後每天至少兩次觀測臨床症狀。在基線時測定體重及腫瘤尺寸且然後每週2至3次。數據表示為個別腫瘤尺寸。
若腫瘤生長至1500 mm 3(藉由測徑規測定)或顯示5級臨床症狀，則處死動物。
結果：提供於圖13A至13G中。與媒劑對照組相比，在10^3、10^4、10^5、10^6 PFU/小鼠之hVG2025之瘤內處理後觀測到BxPC3腫瘤生長抑制。僅因腫瘤腫瘤負荷而使小鼠安樂死且允許其餘小鼠存活至植入後第89天。媒劑對照組中的2/5動物中腫瘤無法生長。
未於腫瘤尺寸上進行統計分析，因為樣本尺寸過於小而無法確定其是否為正常分佈。相反地，利用Gehan-Breslow-Wilcoxon檢定分析各組中腫瘤抑制之持續時間(圖14)。各組小鼠體重無顯著差異。未觀測到臨床症狀。
結論：在異種移植人類胰臟癌的裸小鼠中hVG2025之抗腫瘤活性顯著。一些接受hVG2025的動物顯示完全腫瘤消退。由於動物中腫瘤生長變化很大，故需要較大樣本尺寸以顯示顯著功效。在帶有腫瘤之裸小鼠中hVG2025為安全。 實例11 肺癌((A549)模型中缺失hVG2025及ICP34.5之HSV-1之抗腫瘤功效之比較
目標：實驗目標係比較無胸腺A549異種移植小鼠模型中hVG2025及ICP34.5(-) oHSV-1之抗腫瘤功效。
研究設計：30隻SPF級母無胸腺裸小鼠經皮下注射2.5 x 10 6A549個細胞/小鼠且隨機分為5個組，每組6隻小鼠。組1為經瘤內注射含有1x DPBS + 7.5%甘油之媒劑之媒劑對照。組2至5為測試組；組2至4分別以5x10 3、5x10 5及5x10 7PFU/小鼠投與單次劑量之hVG2025。最後，組5以5x10 7PFU/小鼠投與單次劑量之ICP34.5基因缺失HSV-1載體。所有測試組投與均係經瘤內注射。所有動物均根據標準方案適宜地圈養及餵食且藉由於不同身體部位上標記進行適宜識別。
測量：所有小鼠在投與後每天至少兩次觀測臨床發現。在基線時測定體重及腫瘤尺寸且然後每週2至3次。利用GraphPad Prism 7.03進行統計分析。使用游標卡尺(長度 x 寬度 x 深度 x 0.5236)來測量腫瘤體積。所顯示的資料為腫瘤體積(mm3)且值為平均值 ± SEM。使用多重t-檢定來確定腫瘤回歸統計顯著性(P＜0.05)。若腫瘤生長至1000 mm3或顯示5級臨床症狀，則處死動物。
結果 ：結果提供於圖15A、15B、15C、15D、15E及15F中。簡言之，與媒劑對照組相比，在5x10 5及5x10 7PFU/小鼠之單次瘤內處理之後，觀測到在處理後39天時之統計顯著腫瘤生長抑制。結果顯示，與在5x10 7PFU/小鼠之劑量下ICP34.5-缺失突變體之腫瘤抑制效應相比，hVG2025證實甚至在比ICP34.5-突變體低100倍之劑量下功效亦好得多。
結論 ：在以劑量依賴性方式異種移植人類肺癌的小鼠模型中確認hVG2025之抗腫瘤效應。在5x10 5及5x10 7PFU/小鼠之劑量下顯著地控制腫瘤生長。與ICP34.5基因缺失HSV-1載體相比，藉由hVG2025觀測到顯著增強之抗腫瘤效應。 實例12 皮下接種VG2025後幼年DBA/2小鼠之存活
目標：此研究係測定幼年DBA/2小鼠中於皮下接種後hVG2025之毒性。
研究設計 ：將4週齡幼年30隻SPF級母DBA/2小鼠隨機分為6個組，每組5隻小鼠。組1為經皮下注射PBS之媒劑對照。組2至4為測試組，投與單次劑量或多次劑量，以不同劑量經如表9中所示的皮下注射連續5天投與(僅組4)測試物品。組5至6為陽性組，投與單次劑量野生型17+ HSV病毒。 表9：     分組以於DBA/2小鼠上皮下注射hVG2025
組 測試物品 劑量(PFU/小鼠) 頻率
1 媒劑 0 D1
2 hVG2025 10^6 D1
3 hVG2025 10^8 D1
4 hVG2025 10^8 D1至D5
5 野生型17+ 10^5 D1
6 野生型17+ 10^6 D1
所有動物均根據標準協定，藉由標記於不同身體部位上、圈養、餵食來進行適宜識別。
測量：所有小鼠在投與後每天至少兩次觀測臨床發現。在基線時及然後每週2至3次測量體重。數據表示為平均體重。各組中顯示存活曲線。
若體重降低20%或顯示5級臨床症狀，則處死動物。
結果 ：在整個實驗期間，未觀測到一般行為活動異常。與媒劑對照組相比，各組小鼠體重無顯著差異，如圖16中所顯示。17+ 10^6 PFU/小鼠治療組中僅一隻小鼠在接種後5天發現體重損失及致病率，儘管給予特殊照護，但仍發現小鼠已死亡。存活率百分比顯示於圖17中。
結論 ：在17+菌株中在10^6 PFU/小鼠下看到一些毒性，導致一例動物死亡。在皮下注射hVG2025的任何動物中均未觀測到毒性，甚至在100倍高於野生型之效價下且在連續5天每天一次注射10^8 PFU下(組4)。因此，hVG2025在透過皮下途徑投與的幼年DBA/2小鼠中是安全的。 實例13 VG2025之藉由在幼年DBA/2小鼠中鼻接種之神經毒力檢定
目標：此研究係測定與野生型親本菌株17+及VG161 (ICP34.5(-)溶瘤HSV-1)相比，透過在幼年DBA/2小鼠中鼻接種，hVG2025之毒性。由於鼻部位受三叉神經節及嗅球支配，因此此模型極其敏感於測試HSV神經毒力。
研究設計：將4週齡幼年30隻SPF級母DBA/2小鼠隨機分為6個組，每組5隻小鼠。組1為鼻接種PBS之媒劑對照。組2為經接種致死劑量之野生型ICP34.5陽性17+菌株之陽性對照。組4至6為經鼻接種投與單次劑量之2種水平之hVG2025或VG161之測試組。(表10)。 表10：   DBA/2小鼠之鼻接種之分組
測試物品 劑量(PFU/小鼠) 頻率
媒劑 0 D1
17+ 10^5 D1
VG161(ICP34.5-) 10^5 D1
hVG2025 10^5 D1
VG161(ICP34.5-) 10^7 D1
hVG2025 10^7 D1
所有動物均根據標準協定，藉由標記於不同身體部位上、圈養、餵食來進行適宜識別。
測量 ：所有小鼠在投與後每天至少兩次觀測臨床發現。在基線時及然後每週2至3次測量體重。數據表示為平均體重。各組中顯示存活曲線。
若體重降低20%或顯示5級臨床症狀，則處死動物。
結果：在整個實驗期間，在hVG2025及VG161治療組中未觀測到一般行為活動異常。與媒劑對照組相比，VG161及hVG2025組中小鼠體重沒有顯著差異且兩種劑量水平之所有小鼠存活，如圖18中所顯示。17+治療組中的所有小鼠在接種後3天顯示致病率及體重損失且必須在第6天處死。存活曲線顯示於圖19中。
結論 ：10^5 PFU/小鼠之17+菌株在所有小鼠接種後3天顯示毒性且必須在第6天殺死。hVG2025及ICP34.5(-) VG161組(包括10^7 PFU/小鼠治療組)沒有顯示任何毒性。在幼年DBA/2小鼠中，不論ICP34.5狀態之差異，hVG2025及VG161均顯示良好安全性，。
證實hVG2025在神經系統中之miR124/143調節之ICP34.5表現之安全性。 實例14 在暴露於VG2025的BALB/c小鼠之三叉神經節中之存活及病毒基因表現，經由角膜劃痕法來評估神經毒力
目標：此研究係在正常BALB/c小鼠中使用角膜劃痕法模型評估hVG2025之神經毒力
研究設計：所測試的病毒為a) hVG161，一種缺失ICP34.5基因之兩個複本之HSV-1；b) hVG2025，一種具有CEA啟動子驅動ICP27及miR124/143調節ICP34.5之HSV-1。兩種病毒菌株亦表現IL12/IL15；c) HSV-1 17+野生型，係hVG161及hVG2025之親本病毒。將總共140隻6週齡BALB/c小鼠隨機分為8個組：1)偽處理(n=10)，2) 17+ (10^5 pfu/眼睛，n=30)，3) hVG161 10^5 pfu/眼睛(n=30)，4) hVG161 10^6 pfu/眼睛(n=10)，5) hVG161 10^7 pfu/眼睛(n=10)，6) hVG2025 10^5 pfu/眼睛(n=30)，7) hVG2025 10^6 pfu/眼睛(n=10)，8) hVG2025 10^7 pfu/眼睛(n=10)。所有動物均透過角膜劃痕法接受5 ul PBS或指定劑量之病毒溶液。在感染後第5天殺死來自組1)、2)、3)及6)之3隻動物且收集三叉神經節(TG)及嗅球(OB)以用於RNAseq分析。允許其餘動物在處死前存活至第28天。
結果：類似於偽處理感染動物，hVG161及hVG2025接種小鼠均未顯示可觀測症狀，而野生型17 +在感染後28天內展現嚴重角膜病灶(圖20A中之代表性圖片)及約75%致死率(圖20B)。
在感染後第5天，在三叉神經節及嗅球中沒有偵測到來自hVG161或hVG2025感染小鼠之HSV-1轉錄本，而17+菌株在三叉神經節中表現高量之基本上所有HSV-1轉錄本且在嗅球中的表現程度較低(圖21)。
結論：1. 角膜劃痕法模型有效測試HSV-1誘導之神經毒力，因為野生型菌株17+在10^5 pfu病毒感染/小鼠下引起嚴重角膜發炎、組織損傷及高死亡率。
2. 藉由ICP34.5缺失(hVG161)或藉由轉錄及轉譯雙重調節(hVG2025)之工程化HSV-1菌株甚至在比野生型高100倍之劑量下亦沒有在眼睛及CNS中顯示任何毒力。
3. 在角膜感染野生型HSV-1 17+之在感染後第5天以10^5 pfu感染的動物中，在三叉神經節中容易偵測到所有病毒基因之表現。在此早期感染階段，亦可在嗅球中偵測到低水平之轉錄活性(比TG低約200倍)，表明病毒在腦中迅速且廣泛地傳播。
4. 角膜中之hVG161及hVG2025感染均未導致三叉神經節或嗅球中之任何可偵測病毒基因表現，指示在急性感染期CNS中沒有任何病毒複製。
5. 具有經調節ICP34.5表現之hVG2025至少如神經系統中之ICP34.5 (-) hVG161般安全。 實例15 對更昔洛韋之敏感性
目標：本研究之目標係測試hVG2025 #9對更昔洛韋之敏感性。
研究設計：hVG2025 (tk+)及其親本菌株VG1925#2-1 (tk-)之原液以2000、400及80 pfu/ml使用以在不同濃度之更昔洛韋(GCV)存在下感染Vero細胞。板中的斑塊數量計數為對GCV之敏感性的測量。
測量：將hVG2025或VG1925#2-1病毒稀釋至指定病毒溶液，接著在12孔板中的Vero細胞中以500、100或20 pfu/孔之最終濃度感染。在室溫下培養1小時後，將不同濃度之GCV添加於指定孔中且在37℃ 5% CO 2下培養該等細胞。在培養3天後，用2%結晶紫(Crystal Violet)染色該等板且計數板塊數量。以上實驗重複3次。
結果：結果提供於下表11及12及圖22中。 表 11 ： hVG2025 之 GCV 敏感性
hVG2025 #9 斑塊計數(pfu/孔)平均值      
接種的病毒(PFU/孔) GCV濃度(ug/ml) 運行1 運行2 運行3 平均值 SD %，與GCV 0 ug/ml比較 抑制%
100 0 49 63.5 72.5 61.67 11.86 100.00% 0.00%
0.098 19 32.5 33.5 28.33 8.1 45.95% 54.05%
0.195 7 13 10.5 10.17 3.01 16.49% 83.51%
0.391 0 0 0 0 0 0.00% 100.00%
0.781 0 0 0 0 0 0.00% 100.00%
1.563 0 0 0 0 0 0.00% 100.00%
20 0 13.5 14 16.5 14.67 1.61 100.00% 0.00%
0.098 4 8 3.5 5.17 2.47 35.23% 64.77%
0.195 0 0 2 0.67 1.15 4.55% 95.45%
0.391 0 0 0 0 0 0.00% 100.00%
0.781 0 0 0 0 0 0.00% 100.00%
1.563 0 0 0 0 0 0.00% 100.00%
表12：   tk(-) VG1925之GCV敏感性
VG1925 #2-1 (TK-) 板塊計數(pfu/孔)平均值      
病毒濃度(PFU/孔) GCV濃度(ug/ml) 運行1 運行2 運行3 平均值 SD %，與GCV 0 ug/ml比較 抑制%
100 0 77.5 87 119.5 94.67 22.02 100.00% 0.00%
0.098 73 81 78 77.33 4.04 81.69% 18.31%
0.195 65.5 82 100.5 82.67 17.51 87.32% 12.68%
0.391 59 76 111 82 26.51 86.62% 13.38%
0.781 60.5 69 94.5 74.67 17.69 78.87% 21.13%
1.563 56.5 65 92 71.17 18.54 75.18% 24.82%
20 0 14.5 21 23 19.5 4.44 100.00% 0.00%
0.098 13.5 18 10.05 13.85 3.99 71.03% 28.97%
0.195 11.5 15 22 16.17 5.35 82.91% 17.09%
0.391 13 26.5 20.5 20 6.76 102.56% -2.56%
0.781 16 15.5 19 16.83 1.89 86.32% 13.68%
1.563 13 17 20 16.67 3.51 85.47% 14.53%
結論：TK(+) hVG2025對更昔洛韋高度敏感。GCV抑制hVG2025之IC50為＜ 0.195 ug/ml且＜0.39 ug/ml之GCV引起100%病毒抑制。上述hVG2025對GCV之敏感性與其親本菌株VG1925 #2-1 (TK-)形成對比，其中在1.563 ug/ml (所測試的最大濃度)下之GCV可僅引起病毒複製中約20%的抑制。
因此，抑制hVG2025所需的濃度遠低於人類中更昔洛韋之臨床劑量(參見例如Toxicity等人，2017，Ganciclovir Injection [包裝插頁]。Lenoir：EXELA Pharma Sciences，NC；2017；其中在人類中更昔洛韋之臨床劑量提供9 ug/ml之Cmax)。 實例16 病毒穩定性
使用分別儲存於4℃及-80℃下的VG2025病毒之試用批次收集穩定性數據長達1個月。將各者之效價與小瓶化前的效價進行比較。在兩種溫度下，歷時長達1個月沒有顯著病毒效價損失(圖23)。 實例17 肝癌(Hep 3B-luc)模型中hVG2025病毒之抗腫瘤功效之評估
目標：此研究之目標係評估在Hep 3B-luc之原位人類肝癌異種移植模型中之母BALB/c裸小鼠中經靜脈內(i.v.)投與的VG2025之抗腫瘤功效。
研究設計：hVG2025之抗腫瘤功效研究之實驗設計概述於表13中。 表 13 ：功效研究設計
組 N 治療組 劑量(PFU/小鼠) 劑量體積(µL) 途徑 時間表
1 8 媒劑 -- 100 i.v. 在PG-D1下給藥
2 8 VG2025 2.40E+04 100 i.v. 在PG-D1、PG-D9、PG-D11、PG-D13下給藥
3 8 VG2025 2.40E+05 100 i.v. 在PG-D1、PG-D9、PG-D11、PG-D13下給藥
4 8 VG2025 2.40E+06 100 i.v. 在PG-D1下給藥
5 8 VG2025 2.40E+07 100 i.v. 在PG-D1下給藥
N：每組的動物數量 劑量體積：給藥體積為100 µL/小鼠
結果：將VG2025投與至帶有原位Hep 3B-luc建立之腫瘤的母BALB/c裸小鼠之後的體重變化顯示於圖24A中。數據點表示組平均體重。誤差槓表示平均值的標準誤差(SEM)。
給與VG2025的帶有原位Hep 3B-luc異種移植物的母BALB/c裸小鼠中隨著時間的平均生物發光顯示於表14及圖24B中。 表14 隨著時間的平均生物發光(x 107個光子/秒) a
處理 媒劑 VG2025 (2.4×10^4 PFU/ 100 μL/小鼠) VG2025 (2.4×10^5 PFU/ 100 μL/小鼠) VG2025 (2.4×10^6 PFU/ 100 μL/小鼠) VG2025 (2.4×10^7 PFU/ 100 μL/小鼠)
0 2 ±1 2 ±1 2 ±1 2 ±1 2 ±1
7 20 ± 6 21± 10 42 ± 13 2 ±1 2 ±1
14 134 ± 52 220 ± 91 373 ± 117 12 ± 9 5 ± 2
21 468 ± 121 487 ± 189 689 ± 171 103 ± 100 23 ± 12
28 1120 ± 297 830 ± 390 901 ± 253 182 ± 176 84 ± 53
a平均值 +/- SEM，n = 8
投與VG2025至帶有原位Hep 3B-luc建立之腫瘤的母BALB/c裸小鼠之後的存活曲線顯示於圖24C中。
此等小鼠之轉移率顯示於表15及圖24D中。基於藉由IVIS機器偵測到的安樂死動物計算生物發光強度。在任何組中均未偵測到顯著轉移。 表15 轉移率(%)
轉移率(%) 媒劑 VG2025 (2.4×10^4 PFU/100 μL/小鼠) VG2025 (2.4×10^5 PFU/100 μL/小鼠) VG2025 (2.4×10^6 PFU/100 μL/小鼠) VG2025 (2.4×10^7 PFU/100 μL/小鼠)
胃及十二指腸 0 25 0 0 0
脾臟 20 0 0 0 0
胰臟 0 0 0 0 0
腎臟 0 0 0 0 0
隔膜 20 25 0 0 0
肺 0 0 20 0 0
心臟 0 0 0 0 0
腦 0 0 0 0 0
結論：在此種異種移植人類肝癌細胞的小鼠模型中確認經靜脈內遞送之hVG2025之抗腫瘤效應。與媒劑對照組相比，VG2025 (2.4×10^6 PFU/100 μL/小鼠)及VG2025 (2.4×10^7 PFU/100 μL/描述)之治療在此種肝癌模型中顯示顯著抗腫瘤效應。顯著地，在任何治療組中沒有觀測到顯著轉移。 實例18 B細胞淋巴瘤(A20-luc)模型中mVG2025之抗腫瘤功效之評估
目標：此研究之目標係評估原位人類B細胞淋巴瘤異種移植模型中之母BALB/c裸小鼠中經靜脈內(i.v.)投與的VG2025之抗腫瘤功效。
研究設計 ：在用淋巴瘤細胞接種之前，利用以10^6PFU/小鼠兩次皮下注射mVG2025來預免疫小鼠(8隻/組)。然後用A20-Luc B細胞淋巴瘤細胞經靜脈內接種小鼠。實驗設計之詳細內容闡明於表16中。 表16 功效研究設計
組 N 處理 劑量(PFU/小鼠) 劑量體積(µL) 途徑 時間表
1 8 媒劑 - 100 i.v. 單次
2 8 mVG2025 2.40E+05 100 i.v. 單次
3 8 mVG2025 2.40E+06 100 i.v. 單次
4 8 mVG2025 2.40E+07 100 i.v. 單次
54 8 mVG2025 2.40E+07 100 i.v. 單次
N：每組的動物數量 劑量體積：給藥體積為100 µL/小鼠
結果：將mVG2025投與至帶有原位A20-luc建立之腫瘤的母BALB/c小鼠之後的體重變化顯示於圖25A中。數據點表示組平均體重。誤差槓表示平均值的標準誤差(SEM)。
給藥mVG2025的帶有原位A20-luc異種移植腫瘤的母BALB/c小鼠中隨時間的平均生物發光顯示於表17及圖25B中。 表17 隨時間的平均生物發光(x10 6個光子/秒)
處理 媒劑 mVG2025 （2.4×10^5 PFU/ 100 μL/小鼠） 非免疫 mVG2025 （2.4×10^6 PFU/ 100 μL/小鼠） 非免疫 mVG2025 （2.4×10^7 PFU/ 100 μL/小鼠） 非免疫 mVG2025 （2.4×10^7 PFU/ 100 μL/小鼠） 免疫前
0 1.8 ± 0.1 1.8 ± 0.1 1.8 ± 0.2 1.8 ± 0.1 1.8 ± 0.1
4 23.7 ± 5.9 12.3 ± 2.8 8.2 ± 2.1 3.7 ± 0.7 2.7 ± 0.8
7 55.9 ± 14.3 37.2 ± 10.4 35.9 ± 11.7 22.1 ± 4.80 2.5± 0.6
11 126.2 ± 30.6 97.8 ± 29.6 76.4 ± 20.3 59.3 ± 9.5 3.9 ± 1.1
14 289.3 ± 76.7 232.0 ± 58.0 161.7 ± 50.1 110.7 ± 16.9 10.8 ± 4.8
18 708.6 ± 220.4 843.1 ± 162.2 783.6 ± 249.6 540.2 ± 105.1 23.6 ± 10.9
21 1224.6 ± 308.4 1375.5 ± 356.1 1118.6 ± 259.8 780.9 ± 176.3 68.1 ± 33.5
的轉移率顯示於表18及圖25C中。基於藉由IVIS機器偵測到的安樂死動物計算生物發光強度。 表18 轉移率(%)
轉移率(%) 媒劑 mVG2025 (2.4×10^5 PFU/100 μL/小鼠，非免疫) mVG2025 (2.4×10^6 PFU/100 μL/小鼠 非免疫) mVG2025 (2.4×10^7 PFU/100 μL/小鼠， 非免疫) mVG2025 (2.4×10^7 PFU/100 μL/小鼠， 免疫前)
肝臟 100.0 85.7 100.0 100.0 50.0
胃及腸 71.4 100.0 50.0 50.0 0.0
脾臟 42.9 85.7 62.5 25.0 0.0
胰臟 42.9 71.4 75.0 37.5 0.0
腎臟 28.6 57.1 50.0 37.5 2.0
卵巢 57.1 71.4 50.0 50.0 0.0
隔膜 71.4 71.4 50.0 50.0 0.0
肺 100.0 85.7 100.0 100.0 37.5
腦 0.0 14.3 12.5 0.0 0.0
心臟 0.0 14.3 12.5 12.5 0.0
結論：在此研究中，在原位A20-luc B細胞淋巴瘤異種移植模型中評估mVG2025之治療功效。與對照(媒劑)組相比，在此B細胞淋巴瘤模型中mVG2025 (在2.4×10^7 PFU/100 μL/小鼠下，免疫前)之治療顯示顯著抗腫瘤活性。 實例19 B細胞淋巴瘤(A20-luc)模型中低劑量mVG2025病毒之抗腫瘤功效之評估
目標 ：此研究之目標係評估原位人類B細胞淋巴瘤異種移植模型中之母BALB/c裸小鼠中經靜脈內(i.v.)投與的VG2025之抗腫瘤功效。
研究設計 ：在用淋巴瘤細胞接種之前，利用以10^6PFU/小鼠兩次皮下注射mVG2025來預免疫小鼠。然後用A20-Luc B細胞淋巴瘤細胞經靜脈內接種小鼠。實驗設計之詳細內容闡明於表19中。 表19 功效研究設計
組 N 處理 劑量(PFU/小鼠) 劑量體積(µL) 途徑 時間表
1 8 媒劑 - 100 i.v. 單次
2 8 mVG2025 1.00E+05 100 i.v. 單次
3 8 mVG2025 1.00E+06 100 i.v. 單次
4 8 mVG2025 1.00E+05 100 i.v. 單次
5 8 mVG2025 1.00E+06 100 i.v. 單次
結果：將mVG2025投與至帶有原位A20-luc建立之腫瘤的母BALB/c小鼠之後的體重變化顯示於圖26A中。數據點表示組平均體重。誤差槓表示平均值的標準誤差(SEM)。
給藥mVG2025的帶有原位A20-luc異種移植腫瘤的母BALB/c小鼠中隨時間的平均生物發光顯示於表20及圖26B中。 表20 隨時間的平均生物發光(x10 6個光子/秒)
媒劑 mVG2025 （1.0×10^5 PFU/ 100 μL/小鼠） 非免疫 mVG2025 （1.0×10^6 PFU/ 100 μL/小鼠） 非免疫 mVG2025 （1.0×10^5 PFU/ 100 μL/小鼠） 免疫前 mVG2025 （1.0×10^6 PFU/ 100 μL/小鼠） 免疫前
0 1.36 ± 0.051 1.36 ± 0.05 1.36 ± 0.11 1.60± 0.09 1.60 ± 0.17
4 7.09 ± 1.34 9.97 ± 1.52 7.78 ± 1.57 6.49 ± 0.92 6.69 ± 1.48
7 33.53 ± 7.34 43.21 ± 9.39 41.15 ± 8.92 9.85 ± 2.49 9.28 ± 2.62
11 66.58 ± 25.84 103.26 ± 18.24 99.81 ± 23.43 15.94 ± 5.26 23.03 ± 10.71
14 108.95 ± 40.83 208.17 ± 37.84 198.82 ± 55.72 36.31 ± 12.39 38.82 ± 16.39
18 403.03 ± 121.77 806.50 ± 137.66 723.5 ± 195.14 178.59 ± 52.42 186.4 ± 65.57
21 647.68 ± 205.44 1235.31 ± 191.10 1240.76 ± 319.15 307.81 ± 73.77 307.84 ± 117.85
轉移率顯示於表21及圖26C中。 表21 轉移率(%)
轉移率(%) 媒劑 mVG2025 (2.4×10^5 PFU/100 μL/小鼠，非免疫) mVG2025 (2.4×10^6 PFU/100 μL/小鼠， 非免疫) mVG2025 (2.4×10^7 PFU/100 μL/小鼠， 免疫前) mVG2025 (2.4×10^7 PFU/100 μL/小鼠， 免疫)
肝臟 100.00 100.00 100.00 100.00 75.00
胃及腸 100.00 100.00 100.00 100.00 87.50
脾臟 100.00 100.00 100.00 87.50 62.50
胰臟 100.00 87.50 75.00 87.50 62.50
腎臟 75.00 100.00 75.00 62.50 75.00
卵巢 100.00 100.00 75.00 75.00 62.50
隔膜 100.00 100.00 87.50 62.50 62.50
肺 100.00 100.00 100.00 87.50 87.50
腦 87.50 87.50 100.00 37.50 50.00
心臟 75.00 87.50 87.50 25.00 12.50
結論 ：在此研究中，在原位A20-luc B細胞淋巴瘤異種移植模型中評估mVG2025之治療功效。與對照(媒劑)組相比，在此B細胞淋巴瘤模型中mVG2025 (在2.4×10^6 PFU/100 μL/小鼠下，免疫前)及mVG2025 (在2.4×10^5 PFU/100 μL/小鼠下，免疫前)之治療顯示顯著抗腫瘤活性。 實例20 靈長類動物中hVG2025急性毒性之評估
實施該研究以在恆河猴中經皮下注射或靜脈內注射單次劑量投與之後，評估hVG2025之急性毒性。
公及母恆河猴經皮下投與投與0 PFU/kg、1.0 × 10 9PFU/kg，及經靜脈內投與以單次劑量投與2.0 × 10 9PFU/kg。將六隻恆河猴隨機分配至3個組(1隻動物/性別/組)，靜脈內投與之輸注速率為2 mL/min，及劑量體積分別為皮下投與及靜脈內投與之5 mL/kg及10 mL/kg。
評估以下參數及終點：致病率及死亡率；臨床觀測；體重；攝食量；體溫；心電圖檢查；血液學及凝血；臨床化學；免疫功能及大體病理學。
所有動物均存活至計劃預定的處死。沒有注意到於臨床觀測、體重、攝食量、體溫、心電圖檢查、血液學及凝血、臨床化學、免疫功能及大體病理學上之與測試物品有關的效應。
結論：公及母恆河猴經皮下投與投與0 PFU/kg、1.0 × 10 9PFU/kg，且經靜脈內投與以單次劑量投與2.0 × 10 9PFU/kg。所有動物均存活至計劃預定的處死。沒有注意到於臨床觀測、體重、攝食量、體溫、心電圖檢查、血液學、凝血、臨床化學、免疫功能及大體病理學上之與hVG2025有關的異常變化。因此，恆河猴中經皮下注射hVG2025之最大耐受劑量(MTD)經測定為1.0 × 10 9PFU/kg。恆河猴中經靜脈內注射hVG2025之最大耐受劑量(MTD)經測定為2.0 × 10 9PFU/kg。 實例21 鼠類結腸癌(CT26)小鼠模型中mVG2025之遠位(Abscopal)抗腫瘤功效
目標 ：實驗目的係確定併入接種至小鼠相對側中之原發性腫瘤及繼發性腫瘤之雙重CT26同基因小鼠結腸癌模型中mVG2025之功效及安全性，此為表現鼠類IL-12之hVG2025之替代形式。
研究設計：24隻母SPF級BALB/c小鼠以5x10^5 CT26細胞/小鼠經皮下注射兩次，一次進入至各側中，且隨機分為兩個組，每組12隻小鼠。組1為經瘤內注射PBS之媒劑對照。組2為測試組，基於連續5天之mVG2025以每劑1x10^8 PFU/小鼠經瘤內注射投與5劑。每一小鼠進行注射至單個腫瘤中，其中相對側上的第二腫瘤保持未注射。所有動物均根據標準協定，藉由標記於不同身體部位上、圈養、餵食來進行適宜識別。
測量：所有小鼠在投與後每天至少兩次觀測臨床症狀。每週三次測量小鼠體重及腫瘤尺寸。使用卡尺(長度 x 寬度 x 深度 x 0.5236)來測量腫瘤體積。
結果 ：與媒劑對照組相比，在治療開始後9天時用mVG2025進行五次連續瘤內治療之後觀測到統計學顯著腫瘤生長抑制(圖27A)。雖然與對照組相比，在經治療之小鼠中觀測到平均腫瘤尺寸傾向於下降，但在相同時間點，於對側遠位未治療腫瘤上之腫瘤生長抑制並未達到統計顯著性(圖27B)。在治療開始後30天時，mVG2025治療組中12隻小鼠中的7隻顯示完全反應，如藉由經病毒治療之腫瘤及對側遠位腫瘤之完全消退證明。相反地，到治療開始後34天，12隻對照組小鼠中的10隻因腫瘤負荷而被安樂死(參見圖28A、28B、28C及28D)。
與媒劑對照治療之小鼠相比，經mVG2025治療之小鼠展現存活百分比統計學上顯著增加。具體而言，經mVG2025治療之12隻小鼠中的8隻存活直至實驗終點(治療開始後58天)。另一方面，對照組中12隻小鼠中的10隻在達到實驗終點之前因腫瘤負荷而達到人道終點(圖29)。
結論：在同基因雙重CT26鼠類結腸癌模型中確認mVG2025之治療之遠位抗腫瘤免疫功效及存活效益，導致來自12隻小鼠中的7隻中注射側及未注射側之植入腫瘤完全清除。此外，未觀測到與HSV-1有關的毒性之臨床徵兆。 實例22 鼠類B細胞淋巴瘤(A20)小鼠模型中mVG2025之遠位抗腫瘤功效
目標：實驗目的係測定併入接種至小鼠相對側中之原發性腫瘤及繼發性腫瘤之雙重A20同基因小鼠B細胞淋巴瘤模型中mVG2025之功效及安全性，此為表現鼠類IL-12之hVG2025之替代形式。
研究設計：19隻SPF級BALB/c小鼠以2.5x10^6 A20細胞/小鼠經皮下注射兩次，一次進入至各側中，且隨機分為兩個組。組1為由經瘤內注射PBS之9隻小鼠組成之媒劑對照。組2為測試組，由基於連續5天之mVG2025以每劑1 x 10^8 PFU/小鼠經瘤內注射投與5劑之10隻小鼠組成。每一小鼠進行注射至單個腫瘤中，其中相對側上的第二腫瘤保持未注射。所有動物均根據標準協定，藉由標記於不同身體部位上、圈養、餵食來進行適宜識別。
測量：所有小鼠在投與後每天至少兩次觀測臨床症狀。每週三次測量小鼠體重及腫瘤尺寸。使用卡尺(長度 x 寬度 x 深度 x 0.5236)來測量腫瘤體積。
結果：與媒劑對照組相比，在治療開始後17天時用mVG2025進行五次連續瘤內治療之後觀測到經治療之腫瘤統計學顯著腫瘤生長抑制(圖30A)。在相同時間點，於對側未治療腫瘤上之腫瘤生長抑制並未達到統計顯著性(圖30B)，雖然到治療開始後75天，但mVG2025治療組中10隻小鼠中的4隻顯示完全反應，如藉由經病毒治療之腫瘤及對側遠位腫瘤之完全消退證明。相反地，到治療開始後42天，所有對照組小鼠因腫瘤負荷而被安樂死(參見圖31A、31B、31C及31D)。
為了進一步證實經mVG2025治療之四隻無腫瘤小鼠能夠產生抗腫瘤免疫反應，在初始處理後77天時，將其用A20腫瘤細胞再攻毒。到治療開始後107天，在4隻小鼠中的3隻中，新建立的腫瘤緩慢地消退，而無需進一步的mVG2025治療(圖32)，其表明存在抗A20腫瘤細胞之免疫反應。
經mVG2025治療之10隻小鼠中的4隻存活直至實驗終點(治療開始後107天)。另一方面，到治療開始後42天，所有對照組小鼠因腫瘤負荷達到人道終點。
結論：在同基因雙重A20鼠類B細胞淋巴瘤模型中確認mVG2025之治療之遠位抗腫瘤免疫功效及存活效益，導致來自10隻小鼠中的4隻中注射側及未注射側之植入腫瘤完全清除。在4隻小鼠中進一步證實抗腫瘤免疫記憶之存在，其中完全反應藉由將其用A20腫瘤細胞再攻毒，導致4隻小鼠中的3隻中完全腫瘤清除。此外，未觀測到與HSV-1有關的毒性之臨床徵兆。 實例23 IL-12及IL-15有效負載之瘤內及全身偵測
目標 ：實驗目的係確定人類肺癌(A549)異種移植小鼠模型中經瘤內遞送之hVG2025病毒之有效負載水平。
研究設計 ：23隻母SPF級無胸腺裸小鼠每一小鼠經皮下注射2.5x10^6 A549細胞且隨機分為兩個組。組1為由3隻經瘤內注射經溶解於PBS中之7.5%甘油之小鼠組成之媒劑對照。組2為由20隻以5x10^7 PFU/小鼠經瘤內注射投與單次劑量之hVG2025之小鼠組成之測試組。在治療後2天將所有媒劑注射小鼠安樂死，而在治療後1天、2天、3天、7天及14天時將病毒注射小鼠中的4隻安樂死。從各小鼠收穫腫瘤及血液血清且用於ELISA以偵測IL-12及IL-15/IL-15RA。
測量：每週三次測量小鼠體重及腫瘤尺寸。使用卡尺(長度 x 寬度 x 深度 x 0.5236)來測量腫瘤體積。收穫整個腫瘤且在使動物人道安樂死之後立即快速冷凍。亦收集血液樣本以提取血清。腫瘤及血清均經過ELISA檢定以根據ELISA套組的供應商所提供的方案測定IL-12及IL-15濃度。
結果：從經瘤內注射hVG2025或媒劑對照之裸小鼠收集A549腫瘤及血清樣本。在注射後24小時、48小時、72小時、7天及15天時使用ELISA檢定分析腫瘤組織中人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra複合體產生之動力學(圖33A及33B)及血清(圖34 A及34B)。在腫瘤組織中，人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra之偵測在hVG2025注射後24小時時峰值化且保持可偵測直至注射後15天。在24小時時間點，人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Ra係血清樣本中可偵測的，但在腫瘤組織中偵測到處於小於1%之濃度，且在隨後的時間點，其快速下降至血清中不可偵測之水平。
結論：大多數人類IL-12p70及人類IL-15/IL-15Rα經定位至腫瘤，沒有全身釋放之證據，顯示從經瘤內注射之hVG2025之有效負載泄露不是安全性問題。
本發明已在本文中經廣泛且一般地描述。落在一般揭示內容(generic disclosure)內的各個較窄的種類與亞屬組(species and subgeneric groupings)亦構成本發明之一部分。此包括本發明之一般性描述(generic description)，帶有從屬中刪除任何標的之附帶條件(proviso)或負面限制，不論本文中是否具體地引用了刪除的材料(excised material)。
亦應理解，如本文及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物，除非本文另外明確指示，否則術語「X及/或Y」意指「X」或「Y」或「X」及「Y」二者，及名詞後面的字母「s」指代該名詞的複數及單數形式。此外，在本發明之特徵及態樣係根據馬庫西群組(Markush groups)進行描述之情況下，意欲且熟習此項技術者將認識到，本發明涵蓋且亦由此根據馬庫西群組之任何個別成員或成員之任何子組進行描述，且申請人保留修改申請案或申請專利範圍的權利以特別指馬庫西群組之任何個別成員或成員之任何子組。
應理解，本文所用的術語僅用於描述特定實施例之目的而不欲具限制性。應進一步理解，除非本文中另作具體定義，否則本文所用的術語應被賦予其如相關技術中已知的傳統含義。
整個說明書中提及「一個實施例」或「一實施例」及其變型時意指結合該實施例描述之特定特徵、結構或特性係包括在至少一個實施例中。因此，在整個說明書中的不同位置出現片語「在一個實施例中」或「在一實施例中」時不一定均指相同實施例。此外，在一或多個實施例中，特定特徵、結構或特性可以任何適宜方式組合。
以下為本揭示內容之一些示例性編號實施例。 1. 一種包含經修飾溶瘤疱疹病毒基因組之重組疱疹病毒，其中該經修飾疱疹病毒基因組包含至少一個可以操作方式連接至ICP34.5基因之第一複本之miRNA標靶序列，且該ICP34.5基因之第二複本包含不活化突變。在某些實施例中，該重組疱疹病毒為重組單純疱疹病毒(諸如HSV-1或HSV-2)。 2. 如實施例1之重組疱疹病毒，其中該突變為病毒基因組之至少一個長末端重複序列區之缺失及/或短末端重複序列區之缺失。實例包括病毒基因組之單獨長末端重複序列區(R L)之缺失、及/或伴隨短末端重複序列區(R S)之缺失。在其他實施例中，該突變可包括內部長重複序列區及/或內部短重複序列區之至少一個缺失。在本發明之較佳實施例中，該缺失為單獨一個長末端重複序列區且與在長末端重複序列區及短末端重複序列區中均具有缺失之HSV相比具有增強之通過後(upon passage)穩定性。在可選實施例中，該突變為含有ICP34.5基因之第二複本之缺失。 3. 根據實施例1或2中任一項之重組疱疹病毒，其中該疱疹病毒為單純疱疹病毒，且進一步包含可以操作方式連接至該ICP34.5 基因之該第一複本之二個至十個miRNA標靶序列。 4. 根據實施例1、2或3中任一項之重組單純疱疹病毒，其中將該等miRNA標靶序列插入至該ICP34.5基因之該第一複本之3'未轉譯區域中。在另一個實施例中，將該等miRNA標靶序列以串接方式插入至3’未轉譯區中。在各種實施例中，可在不同miRNA結合位點之間插入相同或不同長度之連接子DNA。在某些實施例中，該等連接子在1至50個鹼基對的範圍內。在其他實施例中，該連接子為小於10個鹼基對。 5. 根據實施例1、2、3或4中任一項之重組單純疱疹病毒，其中該兩個至十個miRNA標靶序列結合至少兩個不同miRNAs。 6. 根據實施例1、2、3、4或5中任一項之重組單純疱疹病毒，其中該等miRNA標靶序列靶向選自由miR-124、miR-124*及miR-143組成之群之miRNA。 7. 根據實施例1、2、3、4、5或6中任一項之重組疱疹病毒，其中該疱疹病毒為單純疱疹病毒且其中該經修飾疱疹病毒基因組包含病毒基因ICP4及/或ICP27中之另外突變或修飾。 8. 根據實施例1、2、3、4、5、6或7中任一項之重組疱疹病毒，其中該修飾包括以腫瘤特異性啟動子替換天然病毒啟動子。 9. 根據實施例1、2、3、4、5、6、7或8中任一項之重組疱疹病毒，其中該修飾為視需要以腫瘤特異性啟動子替換ICP4或ICP27之整個啟動子調節區域。 10. 根據實施例1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一項之重組疱疹病毒，其中該ICP27啟動子經hCEA啟動子替換。 11. 根據實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一項之重組疱疹病毒，其進一步包含至少一種核酸，該至少一種核酸編碼選自由免疫刺激因子、抗體及檢查點阻斷肽組成之群之非病毒蛋白質，其中該至少一種核酸係可以操作方式連接至通用或腫瘤特異性啟動子。一般啟動子之實例包括組成型啟動子諸如SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK及CAG。 12. 根據實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9或11中任一項之重組疱疹病毒，其中該非病毒蛋白質選自由IL12、IL15、IL15受體α次單元組成之群。 13. 根據實施例11或12中任一項之重組疱疹病毒，其中該啟動子為腫瘤特異性CXCR4啟動子。 14. 根據實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13中任一項之重組疱疹病毒，其具有編碼具有增強之融合性之醣蛋白之核酸序列(與類似野生型病毒相比)。實例包括多種轉殖基因(例如來自長臂猿白血病病毒「GALV」之融合醣蛋白)、及/或增強HSV融合之突變，包括例如醣蛋白B、醣蛋白K及/或UL20中之截短或突變。在一個較佳實施例中，該核酸序列編碼醣蛋白B之融合形式(例如在胺基酸876後截短的醣蛋白B)。 15. 根據實施例14之重組單純疱疹病毒，其中該醣蛋白B可以在胺基酸876後發生缺失而截短。 16. 根據實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中任一項之重組疱疹病毒，其中該溶瘤疱疹病毒為HSV-1。
在本發明之特佳實施例中，該重組疱疹病毒包含溶瘤疱疹病毒HSV-1，其中：a)存在含有ICP0及ICP34.5基因之長末端重複之缺失；b)具有CEA啟動子之天然ICP27之替換；c) ICP34.5 3’ UTR中miR-143及miR-124之結合位點之插入；d)醣蛋白B編碼區域的3’端之一部分之缺失(例如84 bp缺失)；及e)可在CXCR4啟動子之控制下表現L-12、IL-15及IL-15Rα之表現盒之插入。 17. 一種用於抑制或溶解腫瘤細胞之方法，該方法包括提供治療有效量之根據實施例1至16中任一項之重組疱疹病毒。 18. 一種治療性組合物，其包含根據實施例1至16中任一項之重組疱疹病毒及醫藥上可接受之載劑。 19. 一種用於治療罹患癌症的個體之癌症之方法，該方法包括投與治療有效量之如實施例18之組合物之步驟。 20. 根據實施例19之方法，其中該癌症表現高水平之生物標誌物，根據前述實例中之一個實施例，其啟動子用於驅動ICP4及/或ICP27基因。在其他實施例中，該癌症表現高水平之生物標誌物諸如例如hCEA。在相關實施例中，在投與如本文所述的疱疹病毒之前，測試該個體之高水平之hCEA(例如大於2.5 ng/ml)之表現。大於10 ng/ml或甚至大於20 ng/ml之hCEA水平指示癌症顯著進展。 在某些實施例中，該癌症選自由子宮頸部、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、膽管癌及胰臟癌組成之群。在其他實施例中，該癌症選自由乳房及前列腺腫瘤、及神經膠母細胞瘤組成之群。在其他實施例中，該癌症為白血病或淋巴瘤。在其他實施例中，該癌症為急性骨髓性白血病(AML)或B細胞淋巴瘤。在其他實施例中，該癌症為表面可注射腫瘤。在其他實施例中，該癌症表現高水平之CEA。 21. 根據實施例19之方法，其中該投與治療有效量之如實施例18之組合物之步驟包括靜脈內投與。在其他實施例中，該投與治療有效量之如實施例18之組合物之步驟包括瘤內及/或皮下投與。
如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，除非本文及上下文清楚地另作指明，否則單數形式「一」及「該」包括複數個指示物，亦即一或多個。亦應注意，除非本文及上下文清楚地指示可能的包容性或排他性，否則連接術語「及」及「或」一般以最廣義意義用於包括「及/或」。因此，使用替代(例如「或」)應理解為意指替代中之任一者、二者或其任何組合。此外，「及」及「或」之組合當在本文中列為「及/或」時意欲涵蓋包括所有相關項目或想法之實施例及包括少於所有相關項目或想法之一或多個其他替代實施例。
除非上下文另外要求，否則在隨後的說明書及申請專利範圍中，詞語「包含(comprise)」及其同義語及變型諸如「具有(have)」及「包括(include)」)以及其變化形式諸如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」應以開放、包容意義來解釋，例如「包括(但不限於)」。術語「基本上由...組成」將申請專利範圍之範疇限制於指定材料或步驟、或彼等實質上不影響所主張發明之基本及新穎特性之材料或步驟。
用於此文件中的任何標題僅用於加速其被閱讀者審查，且不應解釋為以任何方式限制本發明或申請專利範圍。因此，本文所提供的揭示內容之標題及摘要僅為方便起見且不解釋實施例之範疇或含義。
在本文中提供值範圍之情況下，應理解，在該範圍之上限與下限之間的各插入值除非上下文清楚地另作指明否則至下限之十分之一之單位及在該規定範圍內的任何其他規定或插入值包括在本發明內。可獨立地包括在較小範圍內的此等較小範圍之上限及下限亦涵蓋在本發明內，接受規定範圍內的任何具體排除的限值。在規定範圍包括限值中之一者或二者之情況下，排除彼等包括限值者中之任一者或二者之範圍包括亦包括在本發明中。
例如，除非另有指示，否則本文所提供的任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括所列舉範圍內的任何整數的值，且在適宜時，包括其分數(諸如整數的十分之一及一百分之一)。此外，除非另有指示，否則本文所列舉的與任何物理特徵諸如聚合物次單元、尺寸或厚度有關的任何數字範圍應理解為包括所列舉範圍內的任何整數。如本文所用，除非另有指示，否則術語「約」意指範圍、值或結構之平均值 ± 20%。
在本說明書中提及及/或在申請資料表(Application Data Sheet)中列出之所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利公開案以其全文引用之方式併入本文中。此類文件可藉由參考而併入以針對描述及揭示例如描述於該等公開案中之材料及方法之目的，該等材料及方法可與當前描述的發明結合使用。以上及整篇文章所討論的公開案僅提供給其在本申請案之申請日期之前的揭示內容。本文概不解釋為承認本發明人無權憑藉先前的發明而先於任何參考公開案。
本文參考或提及的所有專利、公開案、科學文章、網站及其他文件及材料均指示熟習本發明所屬技術者之技術水平，且各此類參考文件及材料均以引用之方式併入本文中，引用程度如同其已個別地以其全文引用之方式併入或以其全文闡明於本文中般。申請人保留將來自任何此類專利、公開案、科學文章、網站、可以電子方式取得之資訊、及其他參考材料及文件之任何及所有材料及資訊實體併入至本說明書中之權利。
一般而言，在隨後申請專利範圍中，所使用的術語不應解釋為將申請專利範圍限制於揭示於本說明書及申請專利範圍中之特定實施例，但應解釋為包括所有可能實施例以及此類申請專利範圍所享有的等效例之全部範疇。因此，申請專利範圍不受本揭示內容限制。
此外，此專利之書面描述部分包括所有申請專利範圍。此外，所有申請專利範圍，包括所有原始申請專利範圍以及來自任何及所有優先文件之所有申請專利範圍均以其全文引用之方式併入至本說明書之書面描述部分中，且申請人保留將任何及所有此類申請專利範圍實體併入至本申請案之書面描述或任何其他部分中之權利。因此，例如，在任何情況下，該專利均不得被釋釋為據稱不提供申請專利範圍之書面描述，據聲稱申請專利範圍之精確措辭未在該專利之書面描述部分中以此等文字( haec verba)闡述。
申請專利範圍將依法解釋。然而且儘管宣稱或認為容易或難以解釋任一技術方案或其部分，但在任何情況下，在追訴申請案期間的任何調整或修正技術方案或其任何部分導致此專利不得解釋為已放棄對其不構成先前技術之一部分之任何及所有等效例之任何權利。
其他非限制性實施例在隨後申請專利範圍內。該專利不得解釋為受限於本文具體及/或明確地揭示的特定實例或非限制性實施例或方法。在任何情況下，除非此種聲明申請人以回應性書面形式明確採納且無資格或保留，否則該專利均不得解釋為受任何審查員或專利及商標局之任何其他官員或僱員所作的任何聲明限制。
藉由參照本發明之較佳實施例之以下詳細描述及其中所包括的實例，可更容易地理解本發明。
圖1圖示性地描繪VG2025之雙股去氧核糖核酸(DNA)元件之整體結構組織。
圖2圖示性地描繪轉錄及轉譯雙重調節(「TTDR」)系統。
圖3顯示實驗之結果，其中在受VG2025感染的A549 (腫瘤)細胞中觀測到多核融合斑但在MRC-5 (非腫瘤)細胞中沒有觀測到。
圖4A及4B圖示性地顯示不同腫瘤細胞系中之CEA表現，此與感染VG2025後的病毒複本數相關。
圖5圖示性地顯示ICP34.5之miR124/143調節。
圖6A及6B顯示hVG2025之抗腫瘤活性，以對於藉由活體外培養之11種人類腫瘤細胞系(圖6A)及6種小鼠腫瘤細胞系(圖6B)的細胞活力所測定。
圖7A及7B圖示性地顯示兩種腫瘤細胞系(分別為A549及BxPC-3)中兩種病毒之生長曲線。
圖8A及8B圖示性地顯示IL-12 (圖8A)及IL-15 (圖8B)之有效負載表現。
圖9A及9B圖示性地顯示從感染hVG2025、VG1905或無病毒之細胞之有效負載表現。
圖10圖示性地顯示對於PHA刺激之淋巴母細胞之人類IFN-g產生之有效負載生物活性。
圖11A、11B、11C、11D、11E、1F及11G圖示性地顯示hVG2025治療後的A549腫瘤尺寸。
圖12圖示性地顯示hVG2025治療後體重之變化。
圖13A、13B、13C、13D、13E、13F及13G圖示性地顯示hVG2025治療後BxPC3腫瘤之尺寸。
圖14圖示性地顯示hVG2025治療後之BxPC3腫瘤模型體重。
圖15A、15B、15C、15D、15E及15F圖示性地顯示hVG2025及34.5(-) HSV-1關於腫瘤尺寸之比較。
圖16圖示性地顯示經皮下注射hVG2025的DBA/2小鼠之體重。
圖17圖示性地顯示經皮下注射hVG2025的DBA/2小鼠之存活率百分比。
圖18圖示性地顯示經鼻接種hVG2025的DBA/2小鼠之體重。
圖19圖示性地顯示經鼻接種hVG2025的DBA/2小鼠之存活率百分比。
圖20A為提供病毒誘發之症狀之臨床觀測結果的照片。
圖20B圖示性地描繪存活率曲線。
圖21圖示性地提供角膜劃痕法後嗅球及三叉神經節之RNA-seq分析。
圖22圖示性地顯示hVG2025對更昔洛韋(Ganciclovir)之敏感性。
圖23圖示性地顯示hVG2025在4℃及-80℃下持續長達1個月之穩定性。
圖24A圖示性地顯示經VG2025治療的Hep 3B-luc負荷BALB/c裸小鼠中之體重變化；圖24B顯示投與VG2025後的腫瘤生物發光跡線；圖24C提供經治療的小鼠之存活曲線；及圖24D顯示轉移率。
圖25A圖示性地顯示經mVG2025治療的A20-luc B細胞淋巴瘤負荷BALB/c裸小鼠中之體重變化；圖25B顯示投與mVG2025後的腫瘤生物發光跡線；及圖25C顯示轉移率。
圖26A圖示性地顯示經mVG2025治療的A20-luc B細胞淋巴瘤負荷BALB/c裸小鼠中之體重變化；圖26B顯示投與mVG2025後的腫瘤生物發光跡線；及圖26C顯示轉移率。
圖27A及27B圖示性地描繪經治療之腫瘤及未治療的對側腫瘤在治療後直至治療開始後第9天之平均腫瘤體積。
圖28A、28B、28C及28D圖示性地描繪經治療之腫瘤及對側腫瘤中之個別腫瘤尺寸。
圖29圖示性地描繪存活曲線。
圖30A及30B圖示性地描繪經治療之腫瘤及未治療的對側腫瘤在治療後直至治療開始後第17天之平均腫瘤體積。
圖31A、31B、31C及31D圖示性地描繪皮下腫瘤再植入之前及之後的個別腫瘤尺寸。
圖32圖示性地描繪存活曲線。
圖33A及33B圖示性地描繪腫瘤中人類IL-12p70、及IL-15/IL-15Rα複合體之曲線。
圖34A及34B圖示性地描繪血清中人類IL-12p70、及IL-15/IL-15Rα複合體之曲線。
 
<![CDATA[<110>  加拿大商復諾健生物科技加拿大有限公司(VIROGIN BIOTECH CANADA LTD)]]>
          <![CDATA[<120>  轉錄及轉譯雙重調節之溶瘤單]]>純疱疹病毒載體
          <![CDATA[<130>  VIRO.413P2]]>
          <![CDATA[<140>  TW 111111148]]>
          <![CDATA[<141>  2022-03-24]]>
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          <![CDATA[<151>  2021-03-24]]>
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          <![CDATA[<151>  2022-01-24]]>
          <![CDATA[<160>  9     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
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          aaataatccc cctggtgtga cagacccaag gacagaacac agcagaggtc agcactgggg      120
          aagacaggtt gtcctcccag gggatggggg tccatccacc ttgccgaaaa gatttgtctg      180
          aggaactgaa aatagaaggg aaaaaagagg agggacaaaa gaggcagaaa tgagagggga      240
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                      20                  25                  30          
          Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn 
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          Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Thr 
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          Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Pro Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala Thr 
                          85                  90                  95      
          Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn Thr Asp Ala Asn 
                      100                 105                 110         
          Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val Val Gln Phe Glu 
                  115                 120                 125             
          Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln Asn Tyr Thr Glu 
              130                 135                 140                 
          Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro Tyr Lys Phe Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln Val Trp Phe Gly 
                          165                 170                 175     
          His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ala Pro Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys Gly Val Cys Arg 
                  195                 200                 205             
          Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr Ala Phe His 
              210                 215                 220                 
          Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro Ala Asn Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu Lys Tyr Asn Pro 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr Val Asn Cys Ile 
                      260                 265                 270         
          Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Glu Phe Val 
                  275                 280                 285             
          Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr Gly Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala Asp Arg Phe Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr Lys Ala Arg Ala 
                          325                 330                 335     
          Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr Met Thr Lys 
                  355                 360                 365             
          Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Ser Phe 
              370                 375                 380                 
          Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr Thr Asn Leu Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys Ile Gly Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg Tyr Asn Ala Thr 
                      420                 425                 430         
          His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn Gly Gly Phe 
                  435                 440                 445             
          Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu Ala Glu Leu Tyr 
              450                 455                 460                 
          Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Pro Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val Glu Arg Ile Lys 
                          485                 490                 495     
          Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asn His 
                      500                 505                 510         
          Ile Gln Arg His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala Ile Ala Trp 
                  515                 520                 525             
          Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn Glu Ala Arg Lys 
              530                 535                 540                 
          Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly Arg Arg Val Ser 
          545                 550                 555                 560 
          Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr Cys Val Pro Val 
                          565                 570                 575     
          Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg Ile Ser Ser Arg 
                      580                 585                 590         
          Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg Tyr Glu Asp 
                  595                 600                 605             
          Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu Arg 
              610                 615                 620                 
          Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly His Arg Arg Tyr 
          625                 630                 635                 640 
          Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu Tyr Ala Tyr Ser 
                          645                 650                 655     
          His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr Phe Ile Asp 
                      660                 665                 670         
          Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val Pro Leu Glu Val 
                  675                 680                 685             
          Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Thr Glu 
              690                 695                 700                 
          Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg Phe Ala Asp Ile Asp 
          705                 710                 715                 720 
          Thr Val Ile His Ala Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe Ala Gly Leu Gly 
                          725                 730                 735     
          Ala Phe Phe Glu Gly Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala Val Gly Lys Val 
                      740                 745                 750         
          Val Met Gly Ile Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val Ser Gly Val Ser 
                  755                 760                 765             
          Ser Phe Met Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val Gly Leu Leu Val 
              770                 775                 780                 
          Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala Phe Arg Tyr Val Met Arg 
          785                 790                 795                 800 
          Leu Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Leu Thr Thr Lys Glu 
                          805                 810                 815     
          Leu Lys Asn Pro Thr Asn Pro Asp Ala Ser Gly Glu Gly Glu Glu Gly 
                      820                 825                 830         
          Gly Asp Phe Asp Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Arg Glu Met Ile Arg 
                  835                 840                 845             
          Tyr Met Ala Leu Val Ser Ala Met Glu Arg Thr Glu His Lys Ala Lys 
              850                 855                 860                 
          Lys Lys Gly Thr Ser Ala Leu Leu Ser Ala Lys Val 
          865                 870                 875     
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  277]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          ttaccgacca cccgcaaaca gcagggtccc ctgggcttcc caagccgcgc acctctccgc       60
          cccgcccctg cgccctcctt cctcgcgtct gcccctctcc cccaccccgc cttctccctc      120
          cccgccccag cggcgcatgc gccgcgctcg gagcgtgttt ttataaaagt ccggccgcgg      180
          ccagaaactt cagtttgttg gctgcggcag caggtagcaa agtgacgccg agggcctgag      240
          tgctccagta gccaccgcat ctggagaacc agcggtt                               277
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  554]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 
                      20                  25                  30          
          Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 
                  35                  40                  45              
          Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 
              50                  55                  60                  
          Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 
                          85                  90                  95      
          Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 
                      100                 105                 110         
          Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 
                  115                 120                 125             
          Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 
              130                 135                 140                 
          Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 
                      180                 185                 190         
          Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 
                  195                 200                 205             
          Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr 
              210                 215                 220                 
          Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 
                          245                 250                 255     
          Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 
                      260                 265                 270         
          Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 
                  275                 280                 285             
          Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 
              290                 295                 300                 
          Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Met 
                          325                 330                 335     
          Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu Asp 
                      340                 345                 350         
          His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly 
                  355                 360                 365             
          Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser 
              370                 375                 380                 
          Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu 
                      420                 425                 430         
          Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser 
                  435                 440                 445             
          Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu 
              450                 455                 460                 
          Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala 
                          485                 490                 495     
          Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val 
                      500                 505                 510         
          Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile 
                  515                 520                 525             
          Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile 
              530                 535                 540                 
          Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser 
          545                 550                 
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  162]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 
                      20                  25                  30          
          Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 
                  35                  40                  45              
          Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 
              50                  55                  60                  
          Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 
                          85                  90                  95      
          Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 
                  115                 120                 125             
          Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 
              130                 135                 140                 
          Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Ser 
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 
          1               5                   10                  15      
          Pro Gly Pro 
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  267]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr 
                      20                  25                  30          
          Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys 
              50                  55                  60                  
          Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp 
                          85                  90                  95      
          Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr 
                      100                 105                 110         
          Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser 
                          165                 170                 175     
          Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln 
                      180                 185                 190         
          Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile 
                  195                 200                 205             
          Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu 
              210                 215                 220                 
          Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg 
                          245                 250                 255     
          Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu 
                      260                 265         
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          ggcattcacc gcgtgcctta                                                   20
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          tgagctacag tgcttcatct ca                                                22
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012

Claims (24)

  1. 一種包含經修飾溶瘤疱疹病毒基因組之重組疱疹病毒，其中該經修飾疱疹病毒基因組包含至少一個可以操作方式連接至ICP34.5基因之第一複本之miRNA標靶序列，且該ICP34.5基因之第二複本包含不活化突變。
  2. 如請求項1之重組疱疹病毒，其中該突變為該病毒基因組之至少一個末端重複區域缺失。
  3. 如請求項1之重組疱疹病毒，其中該疱疹病毒為單純疱疹病毒，且進一步包含可以操作方式連接至該ICP34.5基因之該第一複本之二個至十個miRNA標靶序列。
  4. 如請求項3之重組單純疱疹病毒，其中將該等miRNA標靶序列插入至該ICP34.5基因之該第一複本之3'未轉譯區中。
  5. 如請求項3之重組單純疱疹病毒，其中該二個至十個miRNA標靶序列結合至少兩個不同miRNA。
  6. 如請求項5之重組單純疱疹病毒，其中該miRNA標靶序列靶向選自由miR-124、miR-124*及miR-143組成之群之miRNA。
  7. 如請求項1之重組疱疹病毒，其中該疱疹病毒為單純疱疹病毒且該經修飾疱疹病毒基因組包含病毒基因ICP4及/或ICP27中之另外突變或修飾。
  8. 如請求項1之重組疱疹病毒，其中該病毒藉由改用腫瘤特異性啟動子替換天然病毒啟動子來修飾。
  9. 如請求項1之重組疱疹病毒，其中該疱疹病毒為單純疱疹病毒且該修飾是改用腫瘤特異性啟動子替換ICP 4或ICP27之整個啟動子調節區域。
  10. 如請求項9之重組單純疱疹病毒，其中該ICP27啟動子改用hCEA啟動子替換。
  11. 如請求項1之重組疱疹病毒，其進一步包含至少一種核酸，該至少一種核酸編碼選自由免疫刺激因子、抗體及檢查點阻斷肽組成之群之非病毒蛋白質，其中該至少一種核酸係可以操作方式連接至通用或腫瘤特異性啟動子。
  12. 如請求項11之重組疱疹病毒，其中該非病毒蛋白質選自由IL12、IL15、IL15受體α次單元組成之群。
  13. 如請求項12之重組疱疹病毒，其中該腫瘤特異性啟動子為CXCR4啟動子。
  14. 如請求項1之重組疱疹病毒，其中該疱疹病毒為單純疱疹病毒，且進一步包含編碼醣蛋白B之融合形式之核酸序列。
  15. 如請求項14之重組單純疱疹病毒，其中該醣蛋白B可以在胺基酸876之後發生缺失而截短。
  16. 如請求項1至15中任一項之重組疱疹病毒，其中該溶瘤疱疹病毒為HSV-1。
  17. 一種抑制腫瘤細胞之方法，該方法包括提供治療有效量之如請求項1至16中任一項之重組疱疹病毒。
  18. 一種治療性組合物，其包含如請求項1至16中任一項之重組疱疹病毒及醫藥上可接受之載劑。
  19. 一種治療罹患癌症的個體之癌症之方法，該方法包括投與治療有效量之如請求項18之組合物之步驟。
  20. 如請求項19之方法，其中該癌症表現高水平之生物標誌物。
  21. 如請求項19之方法，其中該癌症選自由子宮頸癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、膽管癌及胰臟癌組成之群。
  22. 如請求項19之方法，其中該癌症為白血病或淋巴瘤。
  23. 如請求項22之方法，其中該癌症為急性骨髓性白血病(AML)或B細胞淋巴瘤。
  24. 如請求項19之方法，其中該投與治療有效量之如請求項18之組合物之步驟包括靜脈內(i.v.)或瘤內投與。
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