CN117224576A - 靶向CSF1R的miRNA与溶瘤单纯疱疹病毒的组合疗法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种用于治疗受试者的肿瘤的组合物，该组合物包含治疗有效量的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体和治疗有效量的溶瘤单纯疱疹病毒。

Description

靶向CSF1R的miRNA与溶瘤单纯疱疹病毒的组合疗法
技术领域
本申请涉及用于癌症的治疗的组合疗法，并且具体地，涉及包含携带靶向集落刺激因子1受体(CSF1R)的miRNA的外泌体和溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)的药物组合物或试剂盒，以及使用该药物组合物和该试剂盒以用于治疗肿瘤的方法。
背景技术
溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)正被广泛研究以用于实体瘤的治疗。作为一个群体，它们具有优于传统癌症疗法的许多优点。具体地，oHSV通常包含突变，该突变使它们对先天免疫的某些方面的抑制敏感。因此，它们在其中对感染的一种或多种先天免疫应答受损的癌细胞中复制；但它们在其中这些先天免疫应答完整的正常细胞中不复制。oHSV通常被直接递送到病毒可在其中复制的肿瘤块中。因为它被递送到靶组织，而不是全身性施用，所以不存在抗癌药物的副作用特征。病毒的一个特征是诱导适应性免疫应答，这会削弱多次施用的效果。而oHSV多次用于肿瘤后，没有发现效力丧失或诱导不良反应诸如炎症反应的证据。HSV是能够将外源DNA掺入到其基因组中并在施用于肿瘤时调节这些基因的表达的大DNA病毒。适合与oHSV一起使用的外源基因是那些有助于诱导针对肿瘤的适应性免疫应答的基因。
克服细胞先天免疫应答的缺陷决定了其中病毒表现出其溶瘤oHSV作为抗癌剂的肿瘤范围。缺失越广泛，则其中oHSV有效的癌细胞范围的限制性越大，这取决于所缺失的病毒基因的功能。最近的oHSV掺入至少一种细胞基因以增强其抗癌活性。
基于oHSV的疗法的成功取决于癌细胞的破坏程度。在开发oHSV的早期，人们认识到单独的HSV不能杀死实体瘤中的所有癌细胞，并且oHSV治疗不太可能有效地消除所有癌细胞，并且在临床试验中oHSV对肿瘤的破坏必须涉及针对肿瘤的适应性免疫应答。进一步的研究表明，由感染的肿瘤细胞碎片产生的抗肿瘤免疫应答可通过掺入细胞因子来增强。失去细胞因子基因的oHSV与掺入免疫刺激性细胞因子的oHSV的比较证实了这一假说，并且最终导致将GM-CSF掺入到为治疗黑素瘤而开发的oHSV中。
微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA分子，其通过与互补靶mRNA结合而在细胞分化、增殖和存活中起关键作用，导致mRNA翻译抑制或降解。仔细选择的miRNA靶向在疾病条件下改变的多种mRNA的能力使得这些分子成为作为治疗剂(以miRNA模拟物的形式)或作为治疗剂的靶标(以抗miR的形式)的令人感兴趣的候选物。同时，体内递送RNA分子的技术的进展使得基于miRNA的治疗剂可实行。这些构建体在其RNA骨架中具有各种修饰，以提供更高的稳定性和针对核酸酶的防护。
尽管在临床前和临床环境中进行了广泛的研究和测试，但对治疗肿瘤的方法仍然存在未满足的需求。
发明内容
在一个方面，本申请涉及一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体和治疗有效量的溶瘤单纯疱疹病毒I型(oHSV-1)。
在一些实施方案中，该外泌体包含外泌体包装相关基序(下文中也称为“外泌体基序”)，该外泌体基序任选地通过接头可操作地连接到靶向CSF1R的miRNA。在一个实施方案中，该外泌体包含抑制量的靶向CSF1R的miRNA和外泌体基序，其中该靶向CSF1R的miRNA具有与CSF1R的mRNA结合的种子序列；该外泌体基序可操作地连接到该靶向CSF1R的miRNA的种子序列，以增强将该靶向CSF1R的miRNA包装到外泌体中。在一些实施方案中，该外泌体基序位于该靶向CSF1R的miRNA的种子序列的下游，并且任选地通过接头与该种子序列共价连接。在一些实施方案中，该外泌体基序是通过使该靶向CSF1R的miRNA中除种子序列之外的一个或多个核酸突变而获得的。在一些实施方案中，该外泌体基序是通过组合两个单一外泌体基序而产生的双倍基序。在一些实施方案中，该靶向CSF1R的miRNA和该外泌体基序在可操作地连接时共享至少一个或两个核苷酸。
在一些实施方案中，oHSV-1有至少一个拷贝的γ34.5基因缺失或失活。
在一些实施方案中，oHSV-1是γ34.5缺陷型，其中有两个拷贝的γ34.5基因缺失或失活。
在一些实施方案中，将oHSV-1进一步工程化以有一个或多个来自UL或US组分的独特基因缺失或失活。
在一些实施方案中，oHSV-1是表达免疫刺激剂、免疫治疗剂或二者的重组溶瘤HSV-1，该免疫刺激剂选自IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27，该免疫治疗剂选自抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体。
在一些实施方案中，oHSV-1是HSV-1的F株，并且/或者oHSV-1具有P型基因组。
在一些实施方案中，oHSV-1的内部重复区域缺失，使得oHSV-1包含(i)所有双拷贝基因中的仅一个拷贝并且(ii)病毒DNA中所有现有开放阅读框(ORF)的表达所需的序列在缺失之后是完整的。在一些实施方案中，内部重复区域是天然主链的核苷酸序列117005至132096的片段。
本申请的另一个方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体、治疗有效量的oHSV-1和药学上可接受的载体。
本申请的另一个方面涉及一种试剂盒，该试剂盒包含携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体和oHSV-1。该试剂盒还可包括用于使用外泌体和oHSV-1以用于治疗肿瘤的说明书。
本申请的另一个方面涉及一种用于治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括向受试者同时或依次施用治疗有效量的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体和治疗有效量的oHSV-1。
本申请的另一个方面涉及一种增强oHSV-1疗法在受试者中的功效的方法，该方法除oHSV-1疗法之外还包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本申请的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体。
通过阅读下文的描述，本申请的其他方面将是容易获得的。
附图说明
图1.鉴定抑制CSF1R合成的具有外泌体基序的miR-mCSF1R。将HEK293细胞与表达miR-mCSF1R(1-5)或NT miRNA的质粒和编码带有His标签的mCSF1R的质粒共转染48小时。将mCSF1R的蛋白水平用蛋白质印迹(WB)检测。mCSF1R-His：带有His标签的小鼠CSF1R；miR-mCSF1R：针对小鼠CSF1R的miRNA。
图2.鉴定来源于稳定细胞系的递送miR-mCSF1R的外泌体。图2A示出了用针对外泌体阳性标记蛋白CD9和TSG101以及阴性标记蛋白钙联接蛋白的抗体进行对稳定细胞系和来源于稳定细胞系的外泌体的免疫印迹分析。图2B示出了通过纳米流式检测仪(FlowNanoAnalyzer)测量的从表达miR-mCSF1R的HEK-293工程化的稳定细胞系中提取的分离的外泌体的粒度分布和数量。图2C示出了通过qPCR分析对来自纯化的外泌体的miR-mCSF1R的定量。外泌体的miR-mCSF1R的量被定量并相对于18S rRNA的量被归一化。
图3.具有外泌体递送的miR-mCSF1R的治疗显示出抗肿瘤功效。对植入有平均体积为80mm3的CT-26肿瘤(A-B)或4T1(C)的Balb/c小鼠用来源于表达miR-CSF1R的稳定细胞系的外泌体进行瘤内注射。图3A和图3B表示CT26的个体小鼠肿瘤体积数据。图3C表示4T1的总肿瘤体积数据。每三天以10μg/动物注射外泌体，总共注射6次。每三天测量肿瘤大小。结果表示为平均肿瘤体积(mm3)±标准偏差(n＝6)。**表示与对照组相比p＜0.01。
图4.具有Exo-miR-mCSF1R和oHSV T3855的组合治疗增强了三阴性乳腺癌模型中的抗肿瘤功效。对植入有平均体积为80mm3的EMT-6肿瘤的Balb/c小鼠用来源于表达miR-CSF1R的稳定细胞系的外泌体进行瘤内注射。将EMT-6肿瘤细胞皮下注射到Balb/c小鼠的右侧腹部。在8只动物的组中，对平均为80mm3的EMT-6肿瘤用10μg的外泌体单独进行瘤内注射或者与50μl的1×107pfu T3855同时进行瘤内注射(A)。每组中8只动物的肿瘤体积以平均值±SEM表示(B)。**和***表示与对照组相比p＜0.01和p＜0.001。在研究结束时计算CR(完全缓解(complete response))率(C)。
具体实施方式
定义
应当注意的是，术语“一”或“一个”实体是指该实体中的一个或多个实体；例如，“一个外泌体”应理解为表示一个或多个外泌体。因此，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较可出于比较的目的而被比对的每条序列中的位置来确定。当所比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列具有的匹配或同源位置数量的函数。“不相关”或“非同源”序列与本公开的序列中的一条序列具有小于40％的同一性，但优选地小于25％的同一性。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一条序列具有一定百分比(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指当比对时，在比较两条序列时，碱基(或氨基酸)的百分比相同。这种比对和同源性或序列同一性百分比可使用本领域已知的软件程序来确定。
如本文所用的术语“接头”是指含有两个或更多个相同或不同核苷酸的核苷酸序列的短片段，其中这些核苷酸选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。
如本文所用，术语“治疗”是指治疗性治疗以及预防性或防御性措施两者，其中目标是防止或减缓(减轻)不期望的生理变化或疾症，诸如肿瘤进展。有益或期望的临床结果包括但不限于可检测的或不可检测的症状的减轻、疾病程度的减弱、肿瘤的稳定(即，未恶化)状态、肿瘤生长的抑制、减小肿瘤的体积、肿瘤进展的延迟或减缓、肿瘤状态的改善或缓和，以及(部分或完全)缓解。需要治疗的那些受试者包括已经患有肿瘤的那些受试者以及倾向于患有肿瘤的那些受试者。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、驯化动物、农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。本文的受试者优选是人。
如本文所用，短语诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”包括将受益于施用本公开的组合物以用于例如检测、诊断程序和/或治疗的受试者，诸如哺乳动物受试者。
其中本发明采用反义寡聚体和类似物质以用于调节编码CSF1R的核酸分子的功能或作用。本发明的寡聚体与其靶核酸的杂交通常被称为“反义”。因此，据信包括在本发明一些优选实施方案的实践中的优选机制在本文中被称为“反义抑制”。此类反义抑制通常基于寡核苷酸链或片段的基于氢键的杂交，使得至少一条链或片段被切割、降解或以其他方式变得不可操作。在这方面，目前优选靶向特定核酸分子及其功能以用于此类反义抑制。
待干扰RNA的功能可包括诸如以下功能：将RNA易位至蛋白质翻译位点、将RNA易位至细胞内远离RNA合成位点的位点、将RNA翻译成蛋白质、将RNA剪接以产生一种或多种RNA，以及涉及RNA的催化活性或复合物形成，这些催化活性或复合物可能由RNA参与或促进。此类对靶核酸功能的干扰的一个优选结果是调节CSF1R的表达。在本发明的上下文中，“调节”和“调节表达”是指编码基因的核酸分子(例如DNA或RNA)的量或水平的降低(抑制)。mRNA通常是优选的靶核酸。
在本发明的上下文中，“杂交”是指寡聚体的互补链的配对。在本发明中，优选的配对机制涉及寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的氢键，该氢键可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核碱基。杂交可发生在不同情况下。
在本发明中，短语“严格杂交条件”或“严格条件”是指本发明的化合物将与其靶序列杂交但与最少数量的其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下将是不同的，并且在本发明的上下文中，寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”由寡聚体的性质和组成以及研究它们的测定方法来确定。
如本文所用的“互补”是指寡聚化合物的两个核碱基之间精确配对的能力。例如，如果在寡核苷酸(寡聚化合物)的特定位置的核碱基能够与靶核酸的特定位置的核碱基氢键键合，所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，那么在该寡核苷酸和该靶核酸之间氢键键合的位置被认为是互补位置。当每个分子中足够数量的互补位置由能够彼此氢键键合的核碱基占据时，寡核苷酸和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互补。因此，“可特异性杂交”和“互补”是用于表示在足够数量的核碱基上具有足够程度的精确配对或互补性使得在寡核苷酸和靶核酸之间发生稳定且特异性结合的术语。
本领域应当理解，反义寡聚体的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补，以便能够特异性杂交。此外，寡核苷酸可在一个或多个片段上杂交，使得插入的或相邻的区段不参与杂交事件(例如，环结构或发夹结构)。优选地，本发明的反义化合物与靶核酸内的靶区域具有至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％的序列互补性；更优选地，反义化合物与反义化合物所靶向的靶核酸序列内的靶区域具有至少90％的序列互补性；甚至更优选地，反义化合物与反义化合物所靶向的靶核酸序列内的靶区域具有至少95％或至少99％的序列互补性。例如，其中反义寡聚体的20个核碱基中的18个与靶区域互补并因此特异性杂交的反义化合物将代表90％的互补性。在该示例中，剩余的非互补核碱基可以是成簇的或点缀有互补核碱基，并且不需要彼此邻接或与互补核碱基邻接。因此，长度为18个核碱基的反义寡聚体具有4(四)个非互补核碱基，这些非互补核碱基的侧翼是与靶核酸完全互补的两个区域，该反义化合物与靶核酸具有77.8％的总体互补性并将因此落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸区域的互补百分比通常可使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序来测定。
在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或它们的模拟物、嵌合体、类似物和同系物的寡聚体或多聚物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(骨架)键组成的寡核苷酸以及具有类似功能的非天然存在部分的寡核苷酸。此类经修饰或取代的寡核苷酸由于所需的性质(诸如例如增强的细胞摄取、增强的对靶核酸的亲和力以及在核酸酶的存在下增加的稳定性)通常优于天然形式。
如本文所用，术语“微小RNA”、“miRNA”或“miR”是指转录后发挥作用以调节基因表达的RNA，通常通过与靶信使RNA(mRNA)转录物的三个主要(3')非翻译区(3'UTR)中的互补序列结合，通常导致基因沉默。miRNA通常是小的调控RNA分子，例如21或22个核苷酸长。术语“微小RNA”、“miRNA”和“miR”可互换使用。
如本文所用，术语“肿瘤”是指包含生长不受控制的转化细胞的恶性组织(即，是过度增殖性疾病)。肿瘤包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、浆细胞瘤等；和实体瘤。根据本发明可被治疗的实体瘤的示例包括但不限于肉瘤和癌，诸如黑素瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing'stumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌和前胃癌。
如本文所用的术语“CSF1R”是指“集落刺激因子1受体”，它是充当CSF1和IL34的细胞表面受体的酪氨酸蛋白激酶，并且在对造血前体细胞(尤其是单核吞噬细胞，诸如巨噬细胞和单核细胞)的存活、增殖和分化的调节中起关键作用。CSF1R也被称为C-FMS、CSFR或CD115。人CSF1R基因ID是1436。小鼠CSF1R基因ID是12978。该蛋白质的基因中的突变与髓系恶性肿瘤的易感性有关。该基因的第一内含子含有以相反方向取向的转录失活的核糖体蛋白L7加工假基因。选择性剪接产生多个转录变体。LTR启动子的剪接变体的表达被发现于霍奇金淋巴瘤(HL)、HL细胞系和间变性大细胞淋巴瘤中。人CSF1R的mRNA转录变体可通过登录号NM_005211.4、NM_001288705.3、NR_109969.2、NR_164679.1或NM_001375321.1从NCBI获得。
如本文所用的术语“IL-12”是指“白细胞介素12”，它是具有强效抗肿瘤作用的细胞因子。因此IL-12诱导TH-1型免疫应答，这可以提供持久的抗肿瘤作用。IL-12已被报道具有体内抗血管生成活性，这也有助于其抗肿瘤作用。最后，IL-12已被报道可刺激高水平IFN-γ的产生，该IFN-γ具有多种免疫调节作用，包括刺激CTL、自然杀伤细胞和巨噬细胞的活化并且诱导/增强II类MHC抗原表达的能力。IFN-γ在诱导T细胞迁移至肿瘤位点的过程中起重要作用。肿瘤内IFN-γ水平的增加与肿瘤负荷大小的减小相关。
程序性细胞死亡1(PD-1)是50kDa至55kDa的I型跨膜受体，其最初通过对经历细胞凋亡的小鼠T细胞系进行减法杂交来鉴定(Ishida等人，1992年，Embo J.，第11卷：第3887-95页)。CD28基因家族的成员PD-1在活化的T细胞、B细胞和髓系细胞上表达(Greenwald等人，2005年，Annu.Rev.Immunol.第23卷：第515-48页；Sharpe等人，2007年，Nat.Immunol.第8卷：第239-45页)。人和鼠PD-1共享约60％的氨基酸同一性，并保留了四个潜在的N-糖基化位点和定义Ig-V结构域的残基。PD-1负调节T细胞活化，并且这种抑制功能与其细胞质结构域的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)相关(Parry等人，2005年，Mol.Cell.Biol.第25卷：第9543-53页)。PD-1的这种抑制功能的破坏可导致自身免疫。
如本文所用，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别一种或多种抗原并与该一种或多种抗原结合的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整抗体及其任何抗原结合片段或单链。因此，术语“抗体”包括含有分子的任何蛋白质或肽，该分子包含具有与抗原结合的生物活性的免疫球蛋白分子的至少一部分。其示例包括但不限于重链或轻链的互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区、或其任何部分、或结合蛋白的至少一部分。术语抗体还涵盖在活化后具有抗原结合能力的多肽或多肽复合物。
“治疗有效量”是指本公开的溶瘤病毒和/或外泌体以足以用于如上所述的“治疗”的量施用。在治疗特定个体的病症或病状中使治疗有效的量将取决于疾病的症状和严重性，并且可通过标准临床技术来确定。此外，可任选地采用体外或体内测定以帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中采用的精确剂量还取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并且应当根据医师的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可从体外或动物模型测试系统得出的剂量-应答曲线来推断。
如本文所用的术语“失活的”或“失活”是指所指的基因被修饰，使得该基因不能表达、以最低水平表达或者表达为产生非功能性蛋白质。例如，基因可通过缺失、插入或替换一个或多个导致移码突变的核苷酸而失活。例如，基因还可通过调节序列诸如启动子序列的突变或缺失而失活。
靶向CSF1R的miRNA
本文的术语“靶向CSF1R的miRNA”是指小的非编码RNA(微小RNA或miRNA)，其被设计为靶向或特异性结合编码蛋白CSF1R的mRNA，使得细胞中CSF1R的转录、翻译和进而的表达受损、降低或消除。如上所述，miRNA不一定以100％的特异性与靶mRNA结合。已知miRNA具有种子序列(从5'端起2至8个核苷酸)，该种子序列决定了与靶mRNA结合的特异性，而其余核苷酸不一定与靶mRNA精确互补。
在一些实施方案中，miRNA具有种子序列，该种子序列具有示于SEQ ID NO.1至5中的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1至5的核苷酸序列中的任何核苷酸序列具有一个或两个核苷酸差异的核苷酸序列。
在一个实施方案中，miRNA具有种子序列，该种子序列具有示于SEQ ID NO.1中的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1的核苷酸序列具有一个或两个核苷酸差异的核苷酸序列。
在一个实施方案中，miRNA具有种子序列，该种子序列具有示于SEQ ID NO.2中的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2的核苷酸序列具有一个或两个核苷酸差异的核苷酸序列。
在一个实施方案中，miRNA具有种子序列，该种子序列具有示于SEQ ID NO.3中的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.3的核苷酸序列具有一个或两个核苷酸差异的核苷酸序列。
在一个实施方案中，miRNA具有种子序列，该种子序列具有示于SEQ ID NO.4中的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.4的核苷酸序列具有一个或两个核苷酸差异的核苷酸序列。
在一个实施方案中，miRNA具有种子序列，该种子序列具有示于SEQ ID NO.5中的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.5的核苷酸序列具有一个或两个核苷酸差异的核苷酸序列。
当存在一个或两个核苷酸差异时，不同的核苷酸优选地位于核苷酸序列的最5'末端、最3'末端或这两个末端。
在一些实施方案中，如通过CSF1R的mRNA水平所测量的，与未引入miRNA的细胞相比，靶向CSF1R的miRNA在递送到肿瘤细胞后，阻断细胞中CSF1R蛋白的表达至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。
携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体
外泌体是来源于细胞膜的小的、大小相对均匀的囊泡。例如，外泌体可具有约30nm至约150nm的直径。它们含有几种关键蛋白质(例如CD9、CD63、CD81、CD82、膜联蛋白(Annexin)、浮舰蛋白(Flotillin)等)，并且除此之外它们还包装蛋白质、mRNA、长的非编码RNA和miRNA。外泌体将有效载荷(payload)从细胞运输到细胞。当进入受体细胞中时，将外泌体有效载荷释放到细胞质中。
在一些实施方案中，将靶向CSF1R的miRNA经由外泌体递送到细胞。因此，在一个实施方案中，提供携带如上所述的靶向CSF1R的miRNA中的任一种的外泌体。本发明使用核苷酸序列的片段(本文中称为“外泌体基序”)，以促进或增强将miRNA包装到外泌体中。在一个实施方案中，外泌体基序选自表1中鉴定的任何序列。
表1.与本发明的miRNA一起使用的外泌体基序的序列。
序列ID 核苷酸序列 序列ID 核苷酸序列
SEQ ID NO.11 5’-GGAG-3’ SEQ ID NO.26 5’-CGCC-3’
SEQ ID NO.12 5’-GGAC-3’ SEQ ID NO.27 5’-CGGG-3’
SEQ ID NO.13 5’-GGCG-3’ SEQ ID NO.28 5’-CGGC-3’
SEQ ID NO.14 5’-GGCC-3’ SEQ ID NO.29 5’-CCCU-3’
SEQ ID NO.15 5’-GGGG-3’ SEQ ID NO.30 5’-CCCG-3’
SEQ ID NO.16 5’-GGGC-3’ SEQ ID NO.31 5’-CCCA-3’
SEQ ID NO.17 5’-UGAG-3’ SEQ ID NO.32 5’-UCCU-3’
SEQ ID NO.18 5’-UGAC SEQ ID NO.33 5’-UCCG-3’
SEQ ID NO.19 5’-UGCG SEQ ID NO.34 5’-UCCA-3’
SEQ ID NO.20 5’-UGCC SEQ ID NO.35 5’-GCCU-3’
SEQ ID NO.21 5’-UGGG SEQ ID NO.36 5’-GCCG-3’
SEQ ID NO.22 5’-UGGC SEQ ID NO.37 5’-GCCA-3’
SEQ ID NO.23 5’-CGAG SEQ ID NO.38 5’-GGAGGAC-3’
SEQ ID NO.24 5’-CGAC SEQ ID NO.39 5’-GGACUGGGAG-3’
SEQ ID NO.25 5’-CGCG-3’ SEQ ID NO.40 5’-GGAGGAG-3’
SEQ ID NO.41 5’-GGACGGAG-3’ SEQ ID NO.42 5’-GGAGGCGGAG-3’
在一些实施方案中，将外泌体基序组合使用。例如，将如该表中所鉴定的两个或更多个外泌体基序组合，以形成双倍外泌体基序。这些基序可通过将一个外泌体基序的5'末端与另一个外泌体基序的3'末端连接而被线性组合。在此上下文中，当一个外泌体基序的5'末端的第一个核苷酸与另一个外泌体基序的3'末端的最后一个核苷酸相同时，可将相同核苷酸中的一个核苷酸设计为省略。例如，“GGAG”(SEQ ID NO.11)与“GGAC”(SEQ IDNO.12)组合，以形成双倍外泌体基序“GGAGGAC”(SEQ ID NO.38)。当一个外泌体基序的5'末端的第一个核苷酸与另一个外泌体基序的3'末端的最后一个核苷酸不同时，这两个外泌体基序可通过接头或直接通过共价键连接。例如，“GGAC”(SEQ ID NO.12)可通过接头“TG”与“GGAG”(SEQ ID NO.11)组合以形成双倍外泌体基序“GGACUGGGAG”(SEQ ID NO.39)，“GGAC”(SEQ ID NO.12)还可通过共价键与“GGAG”(SEQ ID NO.11)组合以形成双倍外泌体基序“GGACGGAG”(SEQ ID NO.41)。本发明还考虑了三倍或更多倍的外泌体基序，即，由SEQ IDNO.11至SEQ ID NO.37的三个或更多个基序组成的外泌体基序。因此，本文所用的术语“外泌体基序”是指包括能够增强或促进将miRNA包装到外泌体中的核苷酸序列，该外泌体基序包括SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.37的单个外泌体基序中的任一种以及任何双倍(例如，SEQID NO.38至42中的任一种)、三倍或更多倍的通过组合单一基序而产生的外泌体基序。
在本发明中，外泌体基序可操作地连接到miRNA的种子序列。术语“可操作地连接”是指调控序列(例如外泌体基序)和核酸序列(例如miRNA的种子序列)之间的功能性连接，这导致增强或促进将miRNA包装到外泌体中。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。可操作地连接的RNA序列可彼此邻接或者可用接头连接。
在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游。在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的上游。在一些实施方案中，miRNA的种子序列的侧翼为外泌体基序。在一个实施方案中，外泌体基序可操作地连接到miRNA的种子序列。在一个实施方案中，外泌体基序是通过使miRNA中除种子序列之外的核苷酸序列中的一者或多者突变而获得的。在一个实施方案中，具有外泌体基序的靶向CSF1R的miRNA含有SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的核苷酸序列，或与SEQ IDNO.6至10中的任一者具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，具有外泌体基序的靶向CSF1R的miRNA具有SEQ ID NO.6、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的核苷酸序列。
在一些实施方案中，当外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游时，种子序列的3'末端最后一个核苷酸和外泌体基序的5'末端第一个核苷酸共享相同的核苷酸，例如鸟嘌呤核苷酸“G”。在一些实施方案中，当外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游时，种子序列的3'末端最后两个核苷酸和外泌体基序的5'末端前两个核苷酸共享相同的两个核苷酸，例如两个鸟嘌呤核苷酸“GG”。
在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游，并通过接头例如“GC”与miRNA的种子序列连接。
除种子序列和外泌体基序之外，miRNA还包括另外的核酸序列以促进与mRNA的靶区域结合。这些另外的核酸通常位于外泌体基序的下游，长度为几个核苷酸，例如1至10个核苷酸。这些另外的核酸序列优选地与靶mRNA的相应片段互补，但如上所述，不一定100％互补。
用于将miRNA转移到外泌体中的方法是本领域可获得的，诸如通过用miRNA表达载体和编码CSF1R的质粒来共转染细胞，如实施例中所述。外泌体的分离、鉴定或表征在本领域中是技术上可行的。几种蛋白质，例如CD9、CD63、CD81、Syntenin-1、TSG101、膜联蛋白、浮舰蛋白等，可用作外泌体的标志物。用于将miRNA包装到外泌体中的其他方法也可适用于本发明。
本发明的外泌体含有抑制量的靶向CSF1R的miRNA。抑制量是指只要所讨论的miRNA经由外泌体被递送到肿瘤细胞中便足以抑制蛋白CSF1R表达的量。
下表列出了本申请的实施例中使用的含有种子序列和外泌体基序的miRNA的核酸序列。
表2.种子序列和具有外泌体基序的miRNA的核酸序列
溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV-1)
如本文所用的溶瘤单纯疱疹病毒I型(oHSV-1)是指本领域已知的设计的、可用的或有效破坏肿瘤细胞的任何溶瘤性单纯疱疹病毒1型(HSV-1)。此外，还可将本公开中使用的oHSV基因工程化，使得野生型oHSV-1的特征中的一种或多种特征失活。此外或另选地，可将天然存在的oHSV-1基因工程化以向病毒的基因组中引入一个或多个编码序列的外源片段，从而提供病毒的一种或多种另外的功能，诸如本文所述的免疫治疗或免疫刺激性质。
在一些实施方案中，oHSV-1有至少一个拷贝的γ34.5基因缺失或失活。在一些实施方案中，oHSV-1有一个拷贝的γ34.5基因缺失或失活，并且另一个拷贝的γ34.5基因是完整的。
在一些实施方案中，oHSV-1是γ34.5缺陷型，其中有两个拷贝的γ34.5基因缺失或失活。在这些实施方案中，oHSV-1不表达可检测水平的功能性ICP34.5蛋白。
在一些实施方案中，将oHSV-1工程化以有一个或多个来自UL或US成分的独特基因缺失或失活。例如，来自UL组分的独特基因可以是UL1至UL56中的任一种，并且来自US组分的独特基因可以是US1至US12中的任一种。
在一些实施方案中，oHSV-1有至少一个拷贝的γ34.5基因和至少一个来自UL或US组分的独特基因缺失或失活。在一些实施方案中，oHSV-1有两个拷贝的γ34.5基因缺失或失活，并且至少一个来自UL或US组分的独特基因缺失或失活。
有两个拷贝的γ34.5基因缺失或失活的例示性oHSV-1包括但不限于HSV1716、R3616、G207、G47Δ、M032、ONCR-177、C134和RP1/2。仅有一个拷贝的γ34.5基因缺失或失活的例示性oHSV-1包括但不限于NV1020和T3011。(参见例如Koch,M.S.、Lawler,S.E.和Chiocca,E.A.(2020年)，“HSV-1溶瘤病毒从实验室到临床：对当前临床试验的综述(HSV-1Oncolytic Viruses from Bench to Bedside:An Overview of Current ClinicalTrials.)”，Cancers，第12卷(第12期)，第3514页；以及Aldrak,N.、Alsaab,S.、Algethami,A.、Bhere,D.、Wakimoto,H.、Shah,K.、Alomary,M.N.和Zaidan,N.(2021年)，“基于溶瘤单纯疱疹病毒的癌症疗法(Oncolytic Herpes Simplex Virus-Based Therapies forCancer.)”，Cells，第10卷(第6期)，第1541页。)
在一些实施方案中，将oHSV-1基因工程化以表达选自IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27的免疫刺激剂。在一些实施方案中，将oHSV-1基因工程化以表达选自抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体的免疫治疗剂。
在一些实施方案中，将oHSV-1基因工程化以表达免疫刺激剂和免疫治疗剂两者，该免疫刺激剂选自IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27；该免疫治疗剂选自抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体。
例如，在一个实施方案中，将oHSV-1基因工程化以表达IL-2。在另一个实施方案中，将oHSV-1基因工程化以表达IL-12。在另一个实施方案中，将oHSV-1基因工程化以表达抗PD-1抗体。在另一个实施方案中，将oHSV-1基因工程化以表达抗CTLA-4抗体。在另一个实施方案中，将oHSV-1基因工程化以表达IL-12和抗PD-1抗体两者。
抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体通常含有抗体可变区。此类抗体片段包括但不限于(i)Fab片段，由VH、VL、CH和CL结构域组成的单价片段；(ii)Fab2片段，在铰链区由二硫键连接的包含两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体的单个臂的VH和VL结构域组成；(v)dAb片段，其包含VH或VL结构域；(vi)scAb，含有VH和VL以及C1或CH1的抗体片段；和(vii)基于蛋白质支架的人工抗体，包括但不限于纤连蛋白(fibronectin)III型多肽抗体(例如，参见美国专利号6,703,199)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但可使用重组方法通过合成接头来连接它们，使它们能够被制成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子，称为单链Fv(scFv)。因此，抗体可变区可存在于重组衍生物中。重组衍生物的示例包括单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体和小抗体。抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体还可含有一个或多个识别相同或不同表位的可变区。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体由使用重组核酸技术产生的溶瘤病毒编码。不同的抗PD-1抗体可通过不同的技术产生，包括：例如含有通过接头序列连接的VH区和VL区的单链蛋白，诸如scFv以及抗体或其片段；以及在单独的多肽上含有VH和VL区的多链蛋白质。重组核酸技术涉及构建用于蛋白质合成的核酸模板。合适的重组核酸技术是本领域公知的。(参见例如Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley，2005年；Harlow等人，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988年)。编码抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体的重组核酸可在已经感染有溶瘤病毒的细胞中表达，并且在病毒裂解时释放到肿瘤微环境中。该细胞实际上充当所编码的蛋白质的工厂。
包含编码抗PD-1或抗CTLA-4剂VH区或VL区中的一者或两者的一个或多个重组基因的核酸可用于产生与PD-1/CTLA-4结合的完整蛋白质/多肽。例如，可使用单个基因以编码含有通过接头连接的VH区和VL区的单链蛋白(诸如scFv)，或者使用多个重组区域以例如产生VH区和VL区两者，来提供完全结合剂。
可用于本公开的示例性抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体或它们的片段或衍生物是本领域可获得的。参见例如WO 2006/121168、WO 2014/055648、WO 2008/156712、US2014/0234296或美国专利号6,984,720。
在一些实施方案中，oHSV-1的内部重复区域缺失，使得oHSV-1包含(i)所有双拷贝基因中的仅一个拷贝并且(ii)病毒DNA中所有现有开放阅读框(ORF)的表达所需的序列在缺失之后是完整的。本领域已知至少五个具有双拷贝的开放阅读框，其蛋白质分别被命名为ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O。
在本公开中，以精确的方式进行缺失以确保病毒DNA中所有现有开放阅读框(ORF)的表达所需的序列在缺失之后是完整的。在此上下文中，“所有现有开放阅读框的表达所需的序列”包括ORF本身和表达每个ORF所必需的调节序列，诸如启动子和增强子，以确保ORF的表达是成功的并且这样翻译的蛋白质是有功能的。“完整的”是指这样定义的序列至少是功能性的，但不意味着这些序列必须与天然存在的序列100％相同。通过包括例如保守取代或在“非必需”区域处的改变，这些序列可在核苷酸序列上与天然存在的序列稍有不同。在此上下文中，这些序列可与天然存在的序列90％、95％、98％或99％相同。
本领域技术人员应当理解，根据本公开待缺失的核苷酸的精确起始和终止位置取决于HSV-1病毒的毒株和基因组异构体，并且可通过本领域已知技术容易地确定。应当理解本公开并不旨在限于HSV-1病毒的任何特定基因组异构体或毒株。在一个实施方案中，缺失导致F株P型基因组中核苷酸117005至132096的切除。本领域技术人员还将理解，只要基因组DNA被测序，其他株也是可能的。测序技术很容易在文献和市场上获得。例如，在另一个实施方案中，缺失可在HSV-1株17上进行，该株的基因组可通过GenBank登录号NC_001806.2获得。在另一个实施方案中，缺失可在株KOS1.1上进行，该株的基因组可通过GenBank登录号KT899744获得。在又一个实施方案中，缺失可在株F上进行，该株的基因组可通过GenBank登录号GU734771.1获得。
在一些实施方案中，缺失在预先确定的位置精确进行，使得在原始型(P)基因组的情况下，实现从L组分(诸如UL56)中最后已知基因的终止密码子开始至S组分(诸如US1)中第一已知基因的启动子序列的DNA片段切除。以这种反式，UL组分中从UL1到UL56基因的所有ORF和US组分中从US1到US12的所有ORF以及ORF的表达所需的序列都是完整的。在缺失之后精确切除并保留病毒DNA中所有现有开放阅读框(ORF)的表达所需的序列具有许多优点。“保存”是指经修饰的载体含有独特序列(UL和US)中的所有基因和所有双拷贝基因中的仅一个拷贝，例如ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因。应当注意，大部分缺失序列不编码蛋白质，而是在缺失区域之间间隔的重复非编码序列，例如ICP0的内含子、LAT结构域、“a”序列等。本发明的专性载体还旨在包括重复的非编码序列的仅一个拷贝。
在掺入所插入的外源基因之前或之后，所有ORF的保存提供了更强的病毒，即，最大程度地耐受环境因素，诸如温度、压力、UV光等。这还使其中溶瘤HSV-1有效的癌细胞的范围最大化。
本领域已知的各种基因操作方法可被用于获得如本公开所述的经修饰的HSV-1载体。例如，使用细菌人工染色体(BAC)技术。参见例如Horsburgh BC、Hubinette MM、Qiang D等人，“等位基因替换：一种允许快速操作单纯疱疹病毒基因组1型的应用(Allelereplacement:an application that permits rapid manipulation of herpes simplexvirus type 1genome.)”，Gene Ther，1999年，第6卷(第5期)：第922-30页。作为另一个示例，可将COS质粒用于本公开。参见例如，van Zijl M.、Quint W、Briaire J等人，“从分子克隆的亚基因组片段再生疱疹病毒(Regeneration of herpes viruses from molecularlycloned subgenomic fragments)”，J Virol，1988年，第62卷(第6期)：第2191-5页。
可插入到野生型病毒中的外源DNA序列的量是受限的，因为它干扰将DNA包装到病毒粒子中。指定区域中的精确缺失为外源DNA序列的插入提供了理想的空间。根据本公开的一个实施方案，该缺失移除至少15Kbp的溶瘤病毒载体，以便能够容纳相似量的外源DNA序列。其他研究表明野生型基因组耐受另外7KB的DNA。
当插入编码免疫刺激剂和免疫治疗剂中的仅一者的异源核酸序列时，优选地将该异源核酸序列掺入基因组的缺失区域。在一个实施方案中，免疫刺激剂或免疫治疗剂的多核苷酸序列具有与缺失区域相似的长度。在一个实施方案中，异源核酸序列具有比缺失区域长或短20％的长度。在另一个实施方案中，异源核酸序列具有比缺失区域长或短15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的长度。
在一个实施方案中，异源核酸序列具有小于约18Kbp、约17Kbp或约16Kbp的长度。在一个实施方案中，异源核酸序列具有大于约10Kbp、11Kbp、12Kbp、13Kbp或14Kbp的长度。在一个实施方案中，异源核酸序列具有约14Kbp至约16Kbp的长度。在一个实施方案中，异源核酸序列具有约15Kbp的长度。
当掺入多于一种编码免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的异源核酸序列时，优选地将第一异源核酸序列插入到基因组的缺失区域中。可将第二或另外的异源核酸序列插入到基因组的L组分中。在一个实施方案中，将第二异源核酸序列插入在L组分的UL3和UL4基因之间。在一个实施方案中，将第二异源核酸序列插入在L组分的UL37和UL38基因之间。
在一个实施方案中，将第一异源核酸序列插入到基因组的缺失区域中，并且将第二异源核酸序列插入在UL3和UL4基因之间。在一个实施方案中，将第一异源核酸序列插入到基因组的缺失的内部反向重复区域中，并且将第二异源核酸序列插入在L组分的UL37和UL38基因之间。
应当理解，将一种或多种异源核酸序列插入到溶瘤性HSV-1基因组中不会干扰天然HSV-1基因的表达，并且将这些异源核酸序列稳定地掺入到经修饰的HSV-1基因组中使得能够预期这些异源核酸序列的功能性表达。
在一些实施方案中，异源核酸序列可操作地连接到启动子，例如CMV启动子或Egr启动子。在一个实施方案中，编码mIL12的核苷酸序列可操作地连接到Egr启动子。在另一个实施方案中，编码scFv-抗hPD1的核苷酸序列可操作地连接到CMV启动子。
方法和疗法
本公开的一个方面提供了一种用于治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体和治疗有效量的如本文所述的oHSV-1。
本公开的一个方面提供了一种增强如本文所述的oHSV-1疗法在受试者中的功效的方法，该方法除oHSV-1疗法之外还包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体。
在一些实施方案中，在本公开的方法中，施用如本文所述的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体和如本文所述的oHSV-1通过向受试者施用药物组合物来进行，该药物组合物包含治疗有效量的如本文所述的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体和治疗有效量的如本文所述的oHSV-1以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，在本公开的方法中，施用如本文所述的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体和如本文所述的oHSV-1通过向受试者单独施用如本文所述的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体和如本文所述的oHSV-1来进行。在一些实施方案中，携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体在施用oHSV-1之前、同时或之后施用。在此类情况下，可考虑可在彼此相隔约12至72小时内对受试者施用两种模态。然而，在一些情况下，可能需要显著延长治疗的时间段，其中在相应施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在一些实施方案中，携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体与施用oHSV-1同时施用。在一些实施方案中，携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体以包含治疗有效量的如本文所述的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体和药学上可接受的载体的药物组合物的形式施用，并且oHSV-1以包含治疗有效量的如本文所述的oHSV-1和药学上可接受的载体的药物组合物的形式施用。在此类实施方案中，可将包含治疗有效量的如本文所述的携带靶向CSF1R的miRNA的外泌体和药学上可接受的载体的药物组合物，以及包含治疗有效量的如本文所述的oHSV-1和药学上可接受的载体的药物组合物包装在单个试剂盒中。
在特定实施方案中，经胃肠外或非胃肠外施用任何药物组合物，例如肿瘤内、静脉内、肌内、经皮或皮内施用。在一些实施方案中，优选地是肿瘤内施用任何药物组合物。
在特定实施方案中，治疗肿瘤的方法是增强oHSV-1疗法的抗肿瘤功效，例如在抑制肿瘤生长以及/或者减小肿瘤体积方面。因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种用于治疗肿瘤的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如上所述的治疗有效量的外泌体与治疗有效量的oHSV-1的组合。在特定实施方案中，治疗肿瘤的方法预防与肿瘤相关的症状的发作、进展和/或复发。因此，在一些实施方案中，用于预防与受试者的肿瘤相关的症状的方法包括向有需要的受试者施用如上所述的治疗有效量的外泌体和治疗有效量的oHSV-1。
本公开的方法被考虑用于治疗各种肿瘤，尤其是实体瘤。根据本发明可被治疗的实体瘤的示例包括但不限于肉瘤和癌，诸如黑素瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌和前胃癌。
药物组合物和试剂盒
本公开的一个方面提供了一种药物组合物，该药物组合物包含如上所述的治疗有效量的外泌体、治疗有效量的oHSV-1和药学上可接受的载体。该药物组合物可用于预防或治疗受试者的肿瘤。可将该药物组合物制备在合适的药学上可接受的载体或赋形剂中。
本公开的另一个方面提供了第一药物组合物，该第一药物组合物包含如上所述的治疗有效量的外泌体和药学上可接受的载体。此外，本发明还提供了第二药物组合物，该第二药物组合物包含如上所述的治疗有效量的oHSV-1和药学上可接受的载体。在该方面，提供一种试剂盒以在单个包装中包含第一药物组合物和第二药物组合物。该试剂盒还可包含医师在临床使用期间可以参考的使用说明书。
在常规的储存和使用条件下，这些制剂/组合物含有防腐剂以阻止微生物的生长。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，剂型必须是无菌的，并且必须是容易注射程度的流体。其在生产和储存条件下必须是稳定的，并且必须被保存以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。
载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适的混合物和/或植物油。例如，通过使用包衣，诸如卵磷脂，通过在分散液的情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。微生物作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，其将优选包括等渗剂，例如糖、氯化钠或磷酸盐缓冲盐水。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射的组合物的延长吸收。
例如，对于水溶液中的肠胃外施用，如果需要，溶液应该适当地缓冲，并且首先用足量的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液尤其适于静脉内、肌内、皮下、肿瘤内和腹膜内施用。在这方面，根据本公开，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，一个剂量可以溶解在1mL等渗NaCl溶液中，并且添加到1000mL皮下灌注流体中或者在建议的输注部位注射(参见例如“Remington's Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。根据所治疗的受试者的病状，剂量将必然发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定个体受试者的合适剂量。此外，对于人体施用，制剂应符合FDA要求的无菌、致热性、一般安全性和纯度标准。
通过根据需要，将活性化合物以所需量与上述列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入到无菌溶媒中来制备分散体，其中无菌溶媒包含基本分散介质和来自以上列举的那些其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何其他所需成分的粉末。
可将本文所公开的组合物配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括(由蛋白质的游离氨基基团形成的)酸加成盐，以及由无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐。由游离羧基基团形成的盐也可来源于无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式施用，并且以诸如治疗有效的量施用。该制剂易于以各种剂型施用，例如注射溶液、药物释放胶囊等。
如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、溶媒、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类媒介和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除了与活性成分不相容的任何常规媒介或试剂之外，还考虑其在治疗组合物中的用途。也可将补充活性成分掺入组合物中。
短语“药学上可接受的”是指当施用于人体时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备是本领域公知的。通常，可将此类组合物制备为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液；也可制备为适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。
实施例
材料和方法
细胞系和病毒
HEK-293细胞系(人胚胎肾293细胞)购自中国科学院(Chinese Academy ofSciences)(上海，中国)的代表性培养物保藏委员会的细胞库。4T1(小鼠乳腺癌细胞)和CT26(小鼠结直肠癌细胞)由中国科学院的干细胞库慷慨提供。EMT6(小鼠乳腺癌细胞)购自南京科佰生物科技公司(Nanjing Cobioer Biosciences)(南京，中国)。将HEK-293细胞维持在含有10％(体积/体积)FBS的DMEM(高葡萄糖)中。将4T1和CT26维持在含有10％(体积/体积)FBS的RPMI-1640(Life Technologies)中。将EMT6细胞培养在含有2mM L-谷氨酰胺和15％(体积/体积)FBS的Waymouth's MB 752/1培养基中。所有培养基都补充有100U/mL青霉素(penicillin)和100μg/mL链霉素(streptomycin)。将细胞孵育在37℃的含有5％ CO2的潮湿环境中。
溶瘤疱疹病毒(oHSV-1)T3855是同时表达IL-12和抗PD-1抗体的HSV-1F株。具体地，T3855的构建体涉及重组溶瘤单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，其包含(a)经修饰的HSV-1基因组，其中该修饰包括野生型HSV-1基因组中的缺失修饰，使得(i)所有双拷贝基因中的一个拷贝缺失，并且(ii)病毒DNA中所有现有开放阅读框(ORF)的表达所需的序列在缺失之后是完整的；和(b)编码IL-12和抗PD-1抗体的异源核酸序列，其中将IL-12稳定掺入到经修饰的HSV-1基因组的缺失区域中，并且将抗PD-1抗体稳定地掺入在UL3和UL4之间。对溶瘤单纯疱疹病毒1型(oHSV-1)的构建和性质的更详细描述可从WO2017/181420获得。
抗体
本研究中使用的抗体是抗6X His(目录号#ab1818，Abcam)、抗GAPDH(目录号#KM9002；Sungene Biotech)、抗CD9(目录号#13174s；Cell Signaling Technology)和抗TSG101(目录号#ab125011，Abcam)和抗钙联接蛋白(目录号#AC018；Beyotime)。
质粒构建
使用BLOCK-iTTMRNAi设计器(Life Technologies)设计靶向CSF1R基因的miRNA序列，并由Ige Biotechnology(广州，中国)合成。将合成的miRNA片段用限制性酶BamHI和XhoI消化，并克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg对照质粒(Invitrogen)中的相应位点。用外泌体基序修饰的成熟的miRNA序列示于表3中。
表3.靶向CSF1R的具有外泌体基序的miRNA的设计。使用BLOCK-iTTMRNAi设计器(Life Technologies)描述并设计靶向小鼠CSF1R基因的miRNA(miR-mCSF1R)和miR-NT(非靶标)的核苷酸序列。
miRNA的编号 成熟的miRNA序列
miR-NT 5’-AAAGCTCTCCGGCAGAAATGC-3’
miR-mCSF1R-1 5’-CCCTAGCATACAGgAgTACAA-3’
miR-mCSF1R-2 5’-CACATTCAAGCcCTTTCTGAg-3’
miR-mCSF1R-3 5’-CTTCAAGTGACcCCTTCTTTA-3’
miR-mCSF1R-4 5’-GCATCTTTGACTGgGaCTACA-3’
miR-mCSF1R-5 5’-TCCTAGTGAACAAggAGTTCT-3’
产生了含有CSF1R基因的3'-UTR序列的鼠CSF1R表达质粒。首先，通过PCR扩增带有His标签的mCSF1R编码序列，然后将PCR片段亚克隆到pcDNA3.1(+)中以产生pmCSF1R-His。3'-UTR序列由Ige Biotechnology(广州，中国)合成，用NotI和XbaI限制性酶消化，并被克隆到pmCSF1R-His中的相应位点中。
稳定细胞系的产生
通过将miR-CSF1R-1#质粒转染到HEK-293细胞中，产生表达靶向CSF1R的miRNA的稳定细胞系293-miR-CSF1R。转染后四十八小时，细胞通过加入杀稻瘟菌素(blasticidin)(Solarbio Life Sciences)至终浓度6μg/ml来选择。选择具有绿色荧光蛋白(GFP)表达的单细胞集落，并培养在含有6μg/ml杀稻瘟菌素的完全培养基中。监测稳定细胞系的GFP和miR-CSF1R-1#的表达。
外泌体分离
将稳定的细胞系接种在T150烧瓶中24小时，用PBS充分冲洗，并在无血清培养基中再孵育48小时。通过在300×g离心10分钟以除去细胞来收获含有外泌体的无细胞胞外培养基。然后将上清液在10,000×g离心30分钟以除去死细胞和细胞碎片。然后，将澄清的上清液在100,000×g离心70分钟以沉淀外泌体。最后，将外泌体沉淀重悬并在100,000×g离心另外70分钟。所有离心步骤均在4℃下进行。
外泌体的表征
经由免疫印迹(WB)进行外泌体标记蛋白分析
为了检测外泌体标记蛋白，将纯化的外泌体用补充有1mM蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF；Beyotime)和磷酸酶抑制剂(Beyotime)的RIPA裂解缓冲液(Beyotime)裂解，然后热变性，通过SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜(Millipore，MA，USA)上。这些蛋白质通过与合适的一抗孵育，随后与缀合HRP的二抗(Invitrogen)孵育来检测。然后使用增强的化学发光试剂(Millipore，MA，USA)使膜可视化。
通过纳米流式细胞术(nFCM)进行外泌体颗粒浓度和大小分布分析
通过nFCM(NanoFCM公司，厦门，中国)分析外泌体的颗粒浓度和大小分布(Tian等人，2018)。nFCM分析使用两个单光子计数雪崩光电二极管(APD)以同时检测单个颗粒的侧向散射(SSC)和荧光。首先，将外泌体沉淀重悬于100μL PBS中并制备，以用于分析。然后，为了校准仪器，使用200nm缀合PE和AF488荧光团的聚苯乙烯珠用于颗粒浓度以及二氧化硅纳米球混合物(NanoFCM公司，厦门，中国)用于粒度分布。检测器记录在每个测试中在1分钟间隔期间通过的颗粒。将每个样品稀释至颗粒计数在3000至9,000个颗粒/分钟的最佳范围内。使用NanoFCM软件(NanoFCM专业V2.0)将流速和侧向散射强度转换为囊泡浓度和大小。
经由RT-qPCR对外泌体中负载的miR-CSF1R的定量
使用TRIzol LS试剂(Thermo Fisher Scientific)根据制造商的说明书从悬浮的外泌体中分离总RNA。所测试的miRNA如TaqMan miRNA逆转录试剂盒说明书(AppliedBiosystems公司)所述进行逆转录。然后，通过qPCR使用TaqMan Universal Master Mix II试剂盒(Applied Biosystems公司)测量miRNA表达。miRNA拷贝数相对于细胞18S rRNA的拷贝数被归一化。特定于miR-CSF1R-1#的引物如下：
miR-CSF1R-1#茎环引物，
5′-GTCGGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCCTCCT-3′；
正向引物，5′-TgTCATCgAgCCTAgTggC-3′；
反向引物，5′-ggTCCAAggTCCAgTAggg-3′；
探针，5′-(6-FAM)TGGAATGAATCATC(MGB)-3’。
质粒转染
使用Lipofectamine 2000试剂(Thermo Fisher Scientific)，按照制造商的说明书，用编码带有His标签的HER2的质粒和表达miR-CSF1R-1#-5#或非靶向(NT)miRNA的质粒以2.5×105个/孔的密度共转染HEK293细胞。转染后72小时收获细胞，并用于免疫印迹分析。
动物模型
仅用Exo-miR-CSF1R-1#治疗
6至7周龄的BALB/c小鼠购自维通利华实验动物技术有限公司(Vital RiverLaboratory Animal Technologies Co.,Ltd)(北京，中国)并分别在侧腹皮下注射5×106个CT-26或4T1细胞。对平均肿瘤体积为90mm3的荷瘤小鼠瘤内注射10μg外泌体，这可将miR-CSF1R-1#递送到肿瘤中。每只荷瘤动物在第1、4、7、10、13和16天注射，总共注射6次。肿瘤的大小在第1、4、7、10、13、16、19和22天测量，并将体积计算为(长度×宽度^2)×0.5。
用T3855和Exo-miR-CSF1R-1#组合治疗
六周龄的雌性BALB/c小鼠购自维通利华实验动物技术有限公司。通过将5×106个细胞皮下植入小鼠侧腹来产生EMT6肿瘤模型。一旦平均肿瘤体积达到约80mm3至100mm3，就将BALB/c小鼠(每组n＝8)随机分组。仅用oHSV T3855治疗的组(1×107PFU/小鼠)分别在第1、8、15天肿瘤内施用。仅用Exo-miR-CSF1R-1#治疗的组在第1、4、7、10、13和16天注射，总共注射6次。组合治疗组包括3次oHSV T3855注射和6次外泌体注射。以二维测量肿瘤生长，使用数字卡尺记录最大长度和宽度，并且肿瘤体积等于长度×(宽度)^2×1/2。将肿瘤大小绘制为每组的平均大小，并计算完全缓解(CR)率。
结果
鉴定抑制CSF1R合成的具有外泌体基序的miR-mCSF1R
如“材料和方法”中所述，将HEK293细胞与表达miR-mCSF1R(1-5)或NT miRNA的质粒和编码带有His标签的mCSF1R的质粒共转染48小时。用WB检测mCSF1R的蛋白水平。图1表明所有5种miRNA有效抑制CSF1R合成。
鉴定来源于稳定细胞系的递送miR-mCSF1R的外泌体
如“材料和方法”中所述，用针对外泌体阳性标记蛋白CD9和TSG101以及阴性标记蛋白钙联接蛋白的抗体进行对稳定细胞系和来源于稳定细胞系的外泌体的免疫印迹分析。图2A表明外泌体相关膜蛋白CD9和管腔(luminal)蛋白TSG101存在于来源于稳定细胞系的纯化的外泌体中，但在这些外泌体中未检测到细胞相关蛋白钙联接蛋白。
如“材料和方法”中所述，通过纳米流式检测仪测量从表达miR-mCSF1R的HEK-293工程化的稳定细胞系中提取的分离的外泌体的粒度分布和数量。图2B表明由转染细胞产生的外泌体具有40nm至120nm的直径范围。
如“材料和方法”中所述，通过qPCR分析进行来自纯化的外泌体的miR-mCSF1R的定量，并且外泌体miR-mCSF1R的量被定量并相对于18S rRNA的量被归一化。图2C表明外泌体产生显著量的miR-mCSF1R。
外泌体递送的miR-mCSF1R的抗肿瘤治疗活性
如“材料和方法”中所述，对植入有平均体积为80mm3的CT-26肿瘤(图3A至图3B)或4T1(图3C)的Balb/c小鼠用来源于表达miR-CSF1R的稳定细胞系(miR-CSF1R-1#)的外泌体进行瘤内注射。图3A和图3B表示CT26的个体小鼠肿瘤体积数据。图3C表示4T1的总肿瘤体积数据。每三天以10μg/动物注射外泌体，总共注射6次。每三天测量肿瘤大小。这些结果表明，来源于表达miR-CSF1R的稳定细胞系的外泌体能够有效抑制肿瘤生长，包括结直肠癌，尤其是三阴性乳腺癌。
用oHSV和外泌体组合治疗
如“材料和方法”中所述，对植入有平均体积为80mm3的EMT-6肿瘤的Balb/c小鼠用来源于表达miR-CSF1R的稳定细胞系(miR-CSF1R-1#)的外泌体进行瘤内注射。将EMT-6肿瘤细胞皮下注射到Balb/c小鼠的右侧腹部。在8只动物的组中，对平均80mm3的EMT-6肿瘤用10μg外泌体单独进行瘤内注射或者与50μl 1×107pfu T3855同时进行瘤内注射(图4A)。图4B和图4C的结果共同表明，用Exo-miR-mCSF1R和oHSV-1T3855组合治疗以协同方式进一步增强了三阴性乳腺癌模型中的抗肿瘤治疗活性。
应当理解，尽管本公开已通过优选的实施方案和可选特征具体公开，但本领域技术人员可对本文中实施的公开内容进行修改、改进和更改，并且此类修改、改进和更改应认为是在本公开的范围内。本文提供的材料、方法和实施例是优选的实施方案的代表，仅为示例性，并不旨在作为对本公开的范围进行限制。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均明确地通过引用方式整体并入，其程度如同每一者均单独以引用方式并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。在缺少本文未具体公开的任一个或多个要素、任一个或多个限制的情况下，可以适当地实施本文示例性描述的本公开。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广义地而非限制性地理解。另外，本文所采用的术语和表达已作为描述性术语而非限制性术语使用，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但应认识到，在所要求保护的本公开的范围内，各种修改是可能的。

Claims (20)

1.一种用于治疗受试者的肿瘤的药物组合物或试剂盒，所述药物组合物或试剂盒包含
(a)治疗有效量的外泌体，
(b)治疗有效量的溶瘤单纯疱疹病毒I型(oHSV-1)，和
(c1)用于所述药物组合物的药学上可接受的载体，或(c2)任选的用于所述试剂盒的使用说明书，
其中所述外泌体包含抑制量的靶向CSF1R的miRNA和外泌体基序，所述外泌体基序可操作地连接到所述靶向CSF1R的miRNA的种子序列，以增强将所述靶向CSF1R的miRNA包装到所述外泌体中。
2.根据权利要求1所述的药物组合物或试剂盒，其中所述靶向CSF1R的miRNA的种子序列含有SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5的核酸序列中的任一个，或与SEQ ID NO.1至5的核苷酸序列中的任一个具有一个或两个核苷酸差异的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物或试剂盒，其中所述外泌体基序选自SEQ IDNO.11至SEQ ID NO.42的核酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述外泌体基序位于所述靶向CSF1R的miRNA的种子序列的下游并且与其共价连接。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述外泌体基序是通过使所述靶向CSF1R的miRNA中除所述种子序列之外的一个或多个核酸突变而获得的。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述外泌体基序是通过组合两个单一外泌体基序而产生的双倍基序，其中所述两个单一外泌体基序中的任何一个选自SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.37的核酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述靶向CSF1R的miRNA和所述外泌体基序在可操作地连接时共享至少一个核苷酸或两个核苷酸或者通过接头连接。
8.根据权利要求7所述的药物组合物或试剂盒，其中所述接头由两个或更多个选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的核苷酸组成。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述靶向CSF1R的miRNA和所述外泌体基序在可操作地连接时具有SEQ ID NO.6至SEQ ID NO.10的核酸序列中的任一个。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述oHSV-1有至少一个拷贝的γ34.5基因缺失或失活。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述oHSV-1是γ34.5缺陷型，其中有两个拷贝的γ34.5基因缺失或失活。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述oHSV-1被进一步工程化以有一个或多个来自UL或US组分的独特基因缺失或失活。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述oHSV-1表达免疫刺激剂、免疫治疗剂或两者，所述免疫刺激剂选自IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27，所述免疫治疗剂选自抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述oHSV-1是HSV-1的F株，并且/或者所述oHSV-1具有P型基因组。
15.根据权利要求1至10、13或14中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述oHSV-1的内部重复区域缺失，使得所述oHSV-1包含(i)所有双拷贝基因中的仅一个拷贝并且(ii)病毒DNA中所有现有开放阅读框(ORF)的表达所需的序列在所述缺失之后是完整的。
16.根据权利要求15所述的药物组合物或试剂盒，其中所述内部重复区域是天然主链的核苷酸序列117005至132096的片段。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述肿瘤是实体瘤。
18.根据权利要求17所述的药物组合物或试剂盒，其中所述实体瘤选自黑素瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌和前胃癌。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述肿瘤是三阴性乳腺癌。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述受试者是人。
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